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技術 置換N−[2−(4−フェノキシピペリジン−1−イル)−2−(1,3−チアゾール−5−イル)エチル]ベンズアミドおよびN−[2−(4−ベンジルオキシピペリジン−1−イル)−2−(1,3−チアゾール−5−イル)エチル]ベンズアミド誘導体P2X7受容体アンタゴニスト

出願人 エーエックスエックスエーエムソシエタペルアツィオーニ
発明者 ペヴァレッリョ,パオロプランディ,アドルフォ
出願日 2017年8月9日 (2年7ヶ月経過) 出願番号 2019-503211
公開日 2019年9月5日 (6ヶ月経過) 公開番号 2019-524750
状態 未査定
技術分野 複数複素環系化合物 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 勾配係数 分割物 制限型 持ち越し汚染 マルチホール 進化性 注入組成物 開口型
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (2)

課題・解決手段

本発明は、P2X7受容体(P2X7)アンタゴニスト特性を有する式(I)の新規置換フェノキシおよびベンジルオキシピペリジン化合物、これらの化合物を含む医薬組成物、これらの化合物を調製する化学的方法および動物の、特にヒトのP2X7受容体活性に関連する疾患治療または予防でのそれらの使用に関する。

化1】

概要

背景

P2X7は、P2Xイオンチャネル型受容体ファミリーに属する。P2X7は、細胞外ヌクレオチド、特に、アデノシン三リン酸ATP)により活性化される。P2X7は、特定の局在化(特に、CNSおよび免疫担当細胞)により、これを活性化するのに高濃度のATPを必要とすることにより(mM域内において)、および長期または反復刺激時に大きな気孔を形成する能力により、その他のP2Xファミリーメンバーとは区別される。P2X7は、リガンド開口型イオンチャネルであり、種々の細胞型上に存在し、ほとんどのものは、炎症性過程および/または免疫過程に、特に、マクロファージマスト細胞およびリンパ球(TおよびB)に関与することが知られている。細胞外ヌクレオチド、例えば、ATPによるP2X7受容体の活性化は、インターロイキン−1β(IL−1β)の放出および巨細胞形成(マクロファージ/ミクログリア細胞)、脱顆粒(マスト細胞)およびL−セレクチン排出(リンパ球)を生じる。P2X7受容体はまた、抗原提示細胞APC)、ケラチノサイト唾液腺腺房細胞耳下腺細胞)、肝細胞赤血球赤白血病細胞、単球線維芽細胞骨髄細胞ニューロン、および腎臓糸球体間質細胞上にも存在する。P2X7受容体は、神経系の痛みセンサーとしても知られる。P2X7欠損マウスを使った実験で、これらのマウスが、アジュバント誘導炎症性疼痛および神経部分結紮誘導神経障害性疼痛の両方の発生から保護されたことから、P2X7の痛みの発生における役割が実証されている。また、P2X7またはIL−1βなどのその下流側エフェクターが、アルツハイマー病などのいくつかの神経障害病態生理学に関与しているという証拠も増えてきた(J.I.Diaz−Hernandez et al.,Neurobiol.Aging 2012,1816−1828:In vivo P2X7 inhibition reduces Aβ plaques in AD through GSK3β)。P2X7は、シナプス後のおよび/またはシナプス前のニューロンおよびグリアに対するその活性化により、CNS内の神経伝達において重要な役割を有すると考えられている。インサイツハイブリダイゼーションを用いて、P2X7受容体mRNAは、ラットの脳全体にわたり広く分布しているというデータが明らかになった。特に高いP2X7mRNA発現は、前嗅核、大脳皮質梨状葉皮質(Pir)、外側中隔核(LS)、CA1、CA3、CA4の海馬錐体細胞層橋核外側楔状束核、および前庭神経内側核で認められた。P2X7ハイブリダイゼーションシグナルはまた、三叉神経運動核顔面神経核舌下神経核、および脊髄前角でも観察された。

したがって、種々の病態治療にP2X7アンタゴニストを使用するための治療根拠が存在する。これらの状態には、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病ハンチントン病筋萎縮性側索硬化症脊髄損傷脳虚血頭部外傷髄膜炎睡眠障害、気分不安障害HIV誘導神経炎症、および慢性神経障害性および炎症性疼痛などのCNSに関連する疾患が挙げられる。さらに、限定されないが、関節リウマチ変形性膝関節炎乾癬アレルギー性皮膚炎喘息慢性閉塞性肺疾患気道過敏性敗血性ショック気管支炎糸球体腎炎過敏性腸症候群脂肪性肝疾患肝線維症皮膚損傷肺気腫筋ジストロフィー、繊維化、アテローム性動脈硬化症火傷クローン病潰瘍性大腸炎加齢黄斑変性悪性細胞の増殖および転移シェーグレン症候群骨髄芽球性白血病糖尿病骨粗鬆症虚血性心疾患を含む末梢炎症性疾患および自己免疫疾患は、全て、P2X7受容体の関与が結びつけられている疾患例である。P2X7の臨床的重要性を考慮すると、P2X7受容体機能を調節する化合物の特定は、新しい治療薬の開発に向けた魅力的な手段である。

P2X7阻害剤は、P2X7受容体のベンズアミド阻害剤および炎症性疾患の治療でのその使用について開示しているWO2004/099146(特許文献1)などの種々の特許出願に記載されている。

WO2009/108551(特許文献2)は、ヘテロアリールアミド類似体およびP2X7受容体媒介状態でのそれらの使用について開示している。

WO2009/132000(特許文献3)は、キノリンおよびイソキノリン置換P2X7受容体アンタゴニストおよびP2X7受容体媒介状態でのそれらの使用について開示している。

WO2015/119018(特許文献4)は、P2X7受容体アンタゴニストとしてのチアゾールおよびオキサゾール誘導体およびP2X7受容体媒介状態でのそれらの使用について開示している。

概要

本発明は、P2X7受容体(P2X7)アンタゴニスト特性を有する式(I)の新規置換フェノキシおよびベンジルオキシピペリジン化合物、これらの化合物を含む医薬組成物、これらの化合物を調製する化学的方法および動物の、特にヒトのP2X7受容体活性に関連する疾患治療または予防でのそれらの使用に関する。

目的

本発明はまた、P2X7受容体媒介状態または疾患から選択される状態または疾患の治療のための薬物の製造のための式(I)の化合物または薬学的に許容可能なその塩の使用も提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

次式(I):の化合物またはその薬学的に許容可能な塩であって、その任意の立体化学的異性体型を含み、式中、nは0または1であり;R1は、C1−C4アルキルヒドロキシルまたはハロゲン置換されてもよい)、好ましくは、メチルフルオロメチルジフルオロメチルトリフルオロメチルであり;それぞれのR2、R3およびR4は、独立に、水素、ハロゲンであるか、またはR2、R3およびR4の内の少なくとも1つが水素ではないという条件下で、前記R2とR4基は一緒窒素原子を含有する6員ヘテロ環を形成し;ぞれぞれのR5およびR6は、R5およびR6の少なくとも1つがハロゲンであるという条件下で、水素またはハロゲンである

請求項2

任意の立体化学的異性体型を含む、請求項1に記載の式(I)の化合物、または薬学的に許容可能なその塩であって、式中、nは0または1であり;R1はメチル、またはジフルオロメチルであり;それぞれのR2、R3およびR4は、独立に、水素、フッ素塩素であるか、またはR2、R3およびR4の内の少なくとも1つが水素ではないという条件下で、前記R2とR4基は一緒に窒素原子を含有する6員ヘテロ環を形成し;ぞれぞれのR5およびR6は、R5およびR6の少なくとも1つがハロゲンであるという条件下で、水素、フッ素または塩素である。

請求項3

任意の立体化学的異性体型を含む、請求項1に記載の式(I)の化合物、または薬学的に許容可能なその塩であって、式中、nは0または1であり;R1はメチル、またはジフルオロメチルであり;ぞれぞれのR2、R3,およびR4は、R2、R3,およびR4の内の少なくとも1つが水素ではないという条件下で、水素、フッ素または塩素であり、ぞれぞれのR5およびR6は、R5およびR6の少なくとも1つがハロゲンであるという条件下で、水素、フッ素または塩素である。

請求項4

任意の立体化学的異性体型を含む、請求項1に記載の式(I)の化合物、または薬学的に許容可能なその塩であって、式中、nは0または1であり;R1はメチル、またはジフルオロメチルであり;R3は水素であり、前記R2およびR4基は一緒に6員ヘテロ環を形成し、前記6員ヘテロ環はフェニル基と一緒にキノリン環を形成する。

請求項5

任意の立体化学的異性体型を含む、請求項1に記載の式(I)の化合物、または薬学的に許容可能なその塩であって、下記の群から選択される。

請求項6

請求項1で定められる式(I)の化合物の調製方法であって、i)式(II):(式中、n、R1、R5およびR6の意味は上記で定義された通りである。)の化合物を、式(III):(式中、R2、R3およびR4の意味は上記で定義された通りである。)の化合物または式(IIIa):(式中、R2、R3およびR4は上記で定義された通りであり、Wは好適な脱離基である。)の化合物と反応させるステップ、および、必要に応じ、前記得られた式(I)の化合物をその付加塩に変換するステップ、および/またはその立体化学的異性体型を調製するステップ、を含む、方法。

請求項7

任意の立体化学的異性体型を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の式(I)の化合物、または薬学的に許容可能なその塩、および薬学的に許容可能な希釈剤および/またはキャリアを含む医薬製剤

請求項8

任意の立体化学的異性体型を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の式(I)の化合物、または薬学的に許容可能なその塩の薬物としての使用。

請求項9

P2X7受容体媒介状態または疾患から選択される状態または疾患の予防および/または治療における使用のための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の式(I)の化合物。

請求項10

神経変性障害認知障害精神障害神経障害性疼痛慢性疼痛筋肉骨格組織炎症過程胃腸系障害泌尿生殖器系障害、眼疾患の予防および/または治療における使用のための、請求項9に記載の式(I)の化合物。

技術分野

0001

本発明は、P2X7受容体(P2X7)アンタゴニスト特性を有する式(I)の新規置換フェノキシおよびベンジルオキシピペリジン化合物、これらの化合物を含む医薬組成物、これらの化合物を調製する化学的方法および動物の、特にヒトのP2X7受容体活性に関連する疾患治療または予防でのそれらの使用に関する。

背景技術

0002

P2X7は、P2Xイオンチャネル型受容体ファミリーに属する。P2X7は、細胞外ヌクレオチド、特に、アデノシン三リン酸ATP)により活性化される。P2X7は、特定の局在化(特に、CNSおよび免疫担当細胞)により、これを活性化するのに高濃度のATPを必要とすることにより(mM域内において)、および長期または反復刺激時に大きな気孔を形成する能力により、その他のP2Xファミリーメンバーとは区別される。P2X7は、リガンド開口型イオンチャネルであり、種々の細胞型上に存在し、ほとんどのものは、炎症性過程および/または免疫過程に、特に、マクロファージマスト細胞およびリンパ球(TおよびB)に関与することが知られている。細胞外ヌクレオチド、例えば、ATPによるP2X7受容体の活性化は、インターロイキン−1β(IL−1β)の放出および巨細胞形成(マクロファージ/ミクログリア細胞)、脱顆粒(マスト細胞)およびL−セレクチン排出(リンパ球)を生じる。P2X7受容体はまた、抗原提示細胞APC)、ケラチノサイト唾液腺腺房細胞耳下腺細胞)、肝細胞赤血球赤白血病細胞、単球線維芽細胞骨髄細胞ニューロン、および腎臓糸球体間質細胞上にも存在する。P2X7受容体は、神経系の痛みセンサーとしても知られる。P2X7欠損マウスを使った実験で、これらのマウスが、アジュバント誘導炎症性疼痛および神経部分結紮誘導神経障害性疼痛の両方の発生から保護されたことから、P2X7の痛みの発生における役割が実証されている。また、P2X7またはIL−1βなどのその下流側エフェクターが、アルツハイマー病などのいくつかの神経障害病態生理学に関与しているという証拠も増えてきた(J.I.Diaz−Hernandez et al.,Neurobiol.Aging 2012,1816−1828:In vivo P2X7 inhibition reduces Aβ plaques in AD through GSK3β)。P2X7は、シナプス後のおよび/またはシナプス前のニューロンおよびグリアに対するその活性化により、CNS内の神経伝達において重要な役割を有すると考えられている。インサイツハイブリダイゼーションを用いて、P2X7受容体mRNAは、ラットの脳全体にわたり広く分布しているというデータが明らかになった。特に高いP2X7mRNA発現は、前嗅核、大脳皮質梨状葉皮質(Pir)、外側中隔核(LS)、CA1、CA3、CA4の海馬錐体細胞層橋核外側楔状束核、および前庭神経内側核で認められた。P2X7ハイブリダイゼーションシグナルはまた、三叉神経運動核顔面神経核舌下神経核、および脊髄前角でも観察された。

0003

したがって、種々の病態治療にP2X7アンタゴニストを使用するための治療根拠が存在する。これらの状態には、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病ハンチントン病筋萎縮性側索硬化症脊髄損傷脳虚血頭部外傷髄膜炎睡眠障害、気分不安障害HIV誘導神経炎症、および慢性神経障害性および炎症性疼痛などのCNSに関連する疾患が挙げられる。さらに、限定されないが、関節リウマチ変形性膝関節炎乾癬アレルギー性皮膚炎喘息慢性閉塞性肺疾患気道過敏性敗血性ショック気管支炎糸球体腎炎過敏性腸症候群脂肪性肝疾患肝線維症皮膚損傷肺気腫筋ジストロフィー、繊維化、アテローム性動脈硬化症火傷クローン病潰瘍性大腸炎加齢黄斑変性悪性細胞の増殖および転移シェーグレン症候群骨髄芽球性白血病糖尿病骨粗鬆症虚血性心疾患を含む末梢炎症性疾患および自己免疫疾患は、全て、P2X7受容体の関与が結びつけられている疾患例である。P2X7の臨床的重要性を考慮すると、P2X7受容体機能を調節する化合物の特定は、新しい治療薬の開発に向けた魅力的な手段である。

0004

P2X7阻害剤は、P2X7受容体のベンズアミド阻害剤および炎症性疾患の治療でのその使用について開示しているWO2004/099146(特許文献1)などの種々の特許出願に記載されている。

0005

WO2009/108551(特許文献2)は、ヘテロアリールアミド類似体およびP2X7受容体媒介状態でのそれらの使用について開示している。

0006

WO2009/132000(特許文献3)は、キノリンおよびイソキノリン置換P2X7受容体アンタゴニストおよびP2X7受容体媒介状態でのそれらの使用について開示している。

0007

WO2015/119018(特許文献4)は、P2X7受容体アンタゴニストとしてのチアゾールおよびオキサゾール誘導体およびP2X7受容体媒介状態でのそれらの使用について開示している。

先行技術

0008

国際公開第2004/099146号
国際公開第2009/108551号
国際公開第2009/132000号
国際公開第2015/119018号

発明が解決しようとする課題

0009

しかし、P2X7を効率的にアンタゴナイズでき、P2X7媒介症状の部位である脳を含む異なる標的器官送達できる化合物に対するまだ満たされない必要性が存在する。

課題を解決するための手段

0010

このような化合物が本明細書で提供される。本発明の各種実施形態が以降で提示される。

0011

本発明は、任意の立体化学的異性体型を含む、次式(I)のチアゾール化合物

0012

またはその薬学的に許容可能な塩に関し、式中、nは0または1であり;
R1は、C1−C4アルキルヒドロキシルまたはハロゲンで置換されてもよい)、好ましくは、メチルフルオロメチルジフルオロメチルトリフルオロメチルであり;
それぞれのR2、R3およびR4は、独立に、水素、ハロゲンであるか、またはR2、R3およびR4の内の少なくとも1つが水素ではないという条件下で、R2とR4基は一緒窒素原子を含有する6員ヘテロ環を形成し;
ぞれぞれのR5およびR6は、R5およびR6の少なくとも1つがハロゲンであるという条件下で、水素またはハロゲンである。

図面の簡単な説明

0013

パッチクランプ法におけるBzATP単独およびBzATPに濃度を順次高めた本発明の化合物を加えた場合のプレインキュベーション期間を示す図である。

実施例

0014

前述の定義で使用される場合、同義で用いられる用語の「ハロ」、「ハロゲン」および「ハライド」は、置換基フルオロクロロ、ブロモ、またはヨードを意味する。

0015

上記で使用される用語の「立体化学的異性体型」は、式(I)の化合物が有し得る全ての可能な異性体型として定義される。別義が言及または示されない限り、化合物の化学的表記は、全ての可能な立体化学的異性体型の混合物を意味し、前記混合物は、基本的分子構造の全てのジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む。より具体的には、不斉中心は、RまたはS立体配置を有し得、二価の環状(部分)飽和ラジカルの置換基は、シスまたはトランス立体配置を有し得る。

0016

式(I)の化合物の立体化学的異性体型は、本発明の範囲内に包含されることが明白に意図されている。

0017

式(I)およびその調製に使用される中間体の化合物の絶対立化学的配置は、例えば、X線回折などのよく知られた方法を用いて当業者により容易に決定され得る。

0018

さらに、式(I)およびその調製に用いられるいくつかの中間体は、多型を示し得る。本発明は、本明細書で前述の状態の治療に有用な特性を有するいずれの多形をも包含することを理解されたい。

0019

本明細書で前述の薬学的に許容可能な塩は、式(I)の化合物が形成可能な治療的に活性な非毒性酸付加塩を含むことを意図している。これらの薬学的に許容可能酸付加塩は、好都合にも、塩基型をこのような適切な酸で処理することにより得ることができる。適切な酸には、例えば、ハロゲン化水素酸、例えば、塩酸または臭化水素酸硫酸硝酸リン酸などの無機酸;または例えば、酢酸プロパン酸ヒドロキシ酢酸乳酸ピルビン酸シュウ酸(すなわち、エタン二酸)、マロン酸コハク酸(すなわち、ブタン二酸)、マレイン酸フマル酸リンゴ酸酒石酸クエン酸メタンスルホン酸トリフルオロメタンスルホン酸エタンスルホン酸ベンゼンスルホン酸p−トルエンスルホン酸シクラミン酸サリチル酸p−アミノサリチル酸、パモ酸などの有機酸が含まれる。

0020

逆に、前記塩型は、適切な塩基で処理して、遊離塩基型に変換できる。

0021

式(I)の化合物は、非溶媒和型および溶媒和型の両方で存在し得る。本明細書で使われる場合、用語の「溶媒和物」は、本発明の化合物および1つまたは複数の薬学的に許容可能な溶媒分子、例えば、水またはエタノールを含む分子会合物をいう。用語の「水和物」は、前記溶媒が水の場合に使用される。

0022

本発明の好ましい実施形態は、上記で定義の式(I)の化合物に関し、式中、
nは0または1であり;
R1はメチル、またはジフルオロメチルであり;
それぞれのR2、R3およびR4は、独立に、水素、フッ素塩素であるか、またはR2、R3およびR4の内の少なくとも1つが水素ではないという条件下で、R2とR4基は一緒に窒素原子を含有する6員ヘテロ環を形成し;
ぞれぞれのR5およびR6は、R5およびR6の少なくとも1つがハロゲンであるという条件下で、水素、フッ素または塩素である。

0023

別の本発明の実施形態は、上記で定義の式(I)の化合物に関し、式中;
nは0または1であり;
R1はメチル、またはジフルオロメチルであり;
ぞれぞれのR2、R3,およびR4は、R2、R3,およびR4の内の少なくとも1つが水素ではないという条件下で、独立に、水素、フッ素、塩素である。
ぞれぞれのR5およびR6は、R5およびR6の少なくとも1つがハロゲンであるという条件下で、水素、フッ素または塩素である。

0024

別の本発明の実施形態は、上記で定義の式(I)の化合物に関し、式中;
nは0または1であり;
R1はメチル、またはジフルオロメチルであり;
R3は水素であり、R2およびR4基は一緒に6員ヘテロ環を形成し、6員ヘテロ環はフェニル基と一緒にキノリン環を形成する。

0025

最も好ましくは、本発明による式(I)の化合物は、下記からなる群より選択される。

0026

0027

0028

0029

0030

式(I)の化合物は、一般に、式(II):

0031

(式中、n、R1、R5およびR6の意味は上記で定義された通りである。)の化合物を、式(III):

0032

(式中、R2、R3およびR4の意味は上記で定義された通りである。)の化合物または
式(IIIa):

0033

(式中、R2、R3およびR4は上記で定義された通りであり、Wは好適な脱離基である。)の化合物と反応させて、必要に応じ、得られた式(I)の化合物をその付加塩に変換する、および/またはその立体化学的異性体型を調製することにより作製できる。

0034

式(II)の化合物と式(III)の化合物との反応は、少なくとも1種の反応に不活性な溶媒中で、および必要に応じ、少なくとも1種の好適なカップリング試薬および/またはその好適な塩基の存在下で、実施され得る。有効量の反応促進剤を加えることにより、式(III)のカルボン酸を活性化するのが好都合であり得る。このような反応促進剤の非限定例には、カルボニルジイミダゾール、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミドまたは1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミドヒドロキシベンゾトリアゾールベンゾトリアゾリルオキシトリス(ジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートテトラピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ブロモトリピロリジーノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、またはD.Hudson,(J.Org.Chem.(1988),53,617)により記載のものなどのこれらの機能性誘導体が挙げられる。

0035

式(IIIa)の化合物中のWは、例えば、ハロ、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードなどの適切な脱離基であり、またはいくつかの事例では、Wはまた、スルホニルオキシ基、例えば、メタンスルホニルオキシトリフルオロメタンスルホニルオキシベンゼンスルホニルオキシなどの反応性脱離基であってもよい。式(II)の化合物と式(III)の化合物との反応は、例えば、アセトニトリルジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドンまたはDMFなどの反応に不活性な溶媒中で、および必要に応じ、例えば、炭酸ナトリウム炭酸カリウムまたはトリエチルアミンなどの好適な塩基の存在下で、実施され得る。撹拌により、反応速度を高め得る。好都合にも、反応は、室温〜反応混合物還流温度の範囲の温度で実施し得る。

0036

式(III)および(IIIa)の化合物は当技術分野において既知であり、または実施例で報告される方法に従い調製できる。

0037

式(II)の化合物は、次のスキームに従って調製できる。

0038

0039

一級アミン(II)は、窒素水素結合形成反応の、それぞれのニトリル誘導体(IV)の還元により得ることができる。このような反応の非限定例としては、下記との反応が含まれる:
触媒としての、ニッケル白金パラジウムおよびコバルトまたはラネーニッケル酸化白金酸化パラジウムまたはラネーコバルトなどのその誘導体などの存在下での水素または水素源
水素化物リチウムアルミニウム水素化ジイソブチルアルミニウム(DIBAL)、水素化ホウ素またはその機能性誘導体などの水素化物。

0040

反応は、メタノールテトラヒドロフラン、酢酸、ジエチルエーテルトルエンまたはメタノール性アンモニア溶液などの好適な溶媒中、−78℃〜室温の温度で実施され得る。

0041

R1、R5およびR6が式(I)で定義されている、式(IV)の化合物は、TMSCNなどのシアン化物(V)またはその機能性誘導体の存在下で、AcOHまたはMeCNなどの溶媒中、好ましくは0℃〜室温の温度で、アルデヒド(VI)から、それぞれのヘテロシクリル中間体(VII)とのストレッカー縮合反応により調製できる。

0042

0043

あるいは、式(II)の化合物は、上記の2段階法により調製することもできる。ニッケル(II)クロリド六水和物またはコバルト(II)クロリド六水和物およびBoc2Oの存在下、MeOHなどの溶媒中、好ましくは0℃〜室温の温度で、式(IV)の化合物と、還元剤、好ましくはホウ化水素ナトリウムとの反応により、式(VIII)のBoc保護一級アミンが得られる。好適な酸、好ましくはTFAによる脱保護により、化合物(II)が得られる。

0044

式(VI)の化合物の例は、次のスキームで表される。

0045

0046

撹拌により、ストレッカー縮合反応の反応速度を高め得る。出発材料およびいくつかの中間体は既知の化合物であり、市販品として入手可能であるか、または当該技術分野において既知の従来の反応の手順により調製できる。

0047

前記方法は、場合により、キラル助剤ベース合成法炭水化物キラルアミン、または環状ケチミンを用いて)および/または触媒の不斉ストレッカー合成法(グアニジンキラルシッフ塩基またはBINOL系触媒)を用いる不斉反応を含む。

0048

上記の方法で調製した式(I)の化合物は、エナンチオマーのラセミ混合物の形で合成され得る。このラセミ混合物は、当該技術分野で既知の分離方法で相互に分離できる。ラセミ体として得られるこれらの式(I)化合物は、好適なキラル酸との反応により、対応するジアステレオマー塩型に変換し得る。前記ジアステレオマー塩型は、その後、例えば、選択的または分別再結晶により分離され、アルカリによりそこからエナンチオマーが遊離する。式(I)の化合物のエナンチオマー型を分離する別の方法には、キラル固定相を用いた液体クロマトグラフィーが含まれる。前記の純粋な立体化学的異性体型はまた、反応が立体特異的に起こる限りにおいて、対応する適切な出発材料の純粋な立体化学的異性体型から誘導し得る。特定の立体異性体が望まれる場合、前記化合物は立体特異的調製方法により合成されるのが好ましい。これらの方法は、鏡像異性的に純粋な出発材料を用いるのが好都合である。

0049

式(I)の化合物、薬学的に許容可能な塩およびその立体異性体は、薬理学的実施例で示されるようなP2X7受容体拮抗性特性を有する。当該分野で既知の、式(I)を式(I)の他の化合物に変換する基変換反応の他の例を次に示す:カルボン酸エステルの対応するカルボン酸またはアルコールへの加水分解アミドの対応するカルボン酸またはアミンへの加水分解;アルコールのエステルおよびエーテルへの変換;一級アミンの、二級または三級アミンへの変換;二重結合水素添加による対応する単結合への変換。出発材料およびいくつかの中間体は既知の化合物であり、市販品として入手可能であるか、または当該技術分野において既知の従来の反応の手順により調製できる。上記の方法で調製した式(I)の化合物は、エナンチオマーのラセミ混合物の形で合成され得る。このラセミ混合物は、当該技術分野で既知の分離方法で相互に分離できる。ラセミ体として得られるこれらの式(I)化合物は、好適なキラル酸との反応により、対応するジアステレオマー塩型に変換し得る。前記ジアステレオマー塩型は、その後、例えば、選択的または分別再結晶により分離され、アルカリによりそこからエナンチオマーが遊離する。式(I)の化合物のエナンチオマー型を分離する別の方法には、キラル固定相を用いた液体クロマトグラフィーが含まれる。前記の純粋な立体化学的異性体型はまた、反応が立体特異的に起こる限りにおいて、対応する適切な出発材料の純粋な立体化学的異性体型から誘導し得る。特定の立体異性体が望まれる場合、前記化合物は立体特異的調製方法により合成されるのが好ましい。これらの方法は、鏡像異性的に純粋な出発材料を用いるのが好都合である。本明細書に記載の式(I)の化合物および出発材料および/または中間体の調製では、反応条件の影響を受けやすい特定の基を保護することが有用な場合がある。本発明の化合物の調製で実施される反応および保護される官能基に応じた、任意選択の保護の有用性、および好適な保護剤の選択の評価は、当業者の一般的な知識の範囲内のものである。任意選択の保護基の除去は、従来技術に従って実施される。有機化学における保護基の使用に対する全般的文献としては、Theodora W.Greene and Peter G.M.Wuts “Protective groups in organic synthesis”,John Wiley & Sons,Inc.,II Ed.,1991を参照されたい。

0050

式(I)の化合物の塩の調製は、既知の方法により実施される。このように、式(I)の本化合物は、医薬、特にP2X7受容体、特にP2X7受容体アンタゴニスト活性により媒介される状態または疾患の治療における医薬として有用である。さらに、本化合物は、P2X7受容体活性、特にP2X7受容体アンタゴニスト活性により媒介される状態または疾患の治療のための医薬の製造に使用し得る。

0051

本発明はまた、P2X7受容体媒介状態または疾患から選択される状態または疾患の治療のための薬物の製造のための式(I)の化合物または薬学的に許容可能なその塩の使用も提供する。ある実施形態では、本発明は、P2X7受容体媒介状態または疾患から選択される状態または疾患の治療における医薬としての使用のための、またはその治療における使用のための、式(I)の化合物を提供する。さらに、本発明はまた、哺乳動物対象の、P2X7受容体活性により媒介される状態の治療の方法を提供し、該方法は、このような治療を必要としている哺乳動物に治療有効量の式(I)の化合物または薬学的に許容可能なその塩を投与することを含む。上記の作用機序を考慮すると、本発明の化合物は、アルツハイマー病およびその他の認知症状態、例えば、レビー小体前頭側頭認知症およびタウオパチー;筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病およびその他のパーキンソン症候群;HIV誘発性神経炎症;本態性振戦;その他の脊髄小脳変性症およびシャルコー・マリー・トゥース病などの種々の起源神経変性障害の治療に有用である。本発明の化合物はまた、単純部分発作、複雑部分発作、二次性般化発作を含み、欠神発作ミオクローヌス発作、間代性てんかん発作強直性発作強直間代発作および弛緩性発作をさらに含む、てんかんなどの神経学的状態の治療にも有用である。

0052

本発明の化合物はまた、認知障害および精神障害の治療にも有用である。精神障害には、限定されないが、大うつ病気分変調症、躁病双極性障害(双極性障害I型、双極性障害II型など)、気分循環性障害、急速交代型、日内交代型、躁病、軽躁病統合失調症統合失調症様障害、統合失調感情障害人格障害多動性の伴うまたは伴わない注意障害妄想性障害、短期精神病共有精神病性障害一般身体疾患による精神病性障害、物質誘発性精神病性障害または特定不能の精神病性障害、全般性不安障害などの不安障害、パニック障害外傷後ストレス障害衝動制御障害、恐怖症解離状態、さらに、喫煙薬物依存およびアルコール中毒が挙げられる。特に、双極性障害、精神障害、不安症および依存症

0053

本発明の化合物は、神経障害性疼痛の予防または治療に有用である。神経障害性疼痛症候群には、限定されないが、糖尿病性神経障害坐骨神経痛;非特異的腰痛;多発性硬化症疼痛線維筋痛症;HIV関連神経障害;神経痛、例えば、帯状疱疹後神経痛および三叉神経痛モートン神経痛灼熱痛;および身体外傷、肢切断、幻肢、癌、毒素または慢性炎症状態から生じた疼痛;中枢性疼痛、例えば、視床症候群で観察される疼痛;中枢および末梢混合型の疼痛、例えば、反射性交感神経性ジストロフィーとも呼ばれる複合性局所疼痛症候群(CRPS)が挙げられる。

0054

本発明の化合物はまた、慢性疼痛の治療にも有用である。慢性疼痛には、限定されないが、炎症または炎症性の関連状態、変形性膝関節炎、関節リウマチ、急性傷害または外傷が原因の慢性疼痛、上背部痛または腰痛(全身的、局所的または原発的な脊椎疾患、例えば、神経根症から生じた)、骨痛変形性関節症、骨粗鬆症、骨転移または未知の理由による)、骨盤痛、脊髄傷害関連疼痛、心臓性胸痛非心臓性胸痛、中枢性脳卒中後疼痛、筋筋膜痛、鎌状赤血球疼痛、癌性疼痛ファブリー病AIDS疼痛、老人性疼痛、または頭痛顎関節症候群、痛風、繊維化または胸郭出口症候群、特に、関節リウマチおよび変形性関節症によって引き起こされる疼痛が挙げられる。

0055

本発明の化合物はまた、急性傷害により引き起こされる急性疼痛疾病スポーツ医学傷害、手根管症候群熱傷筋骨格捻挫、および筋挫傷、筋挫傷、頸腕疼痛症候群消化不良胃潰瘍十二指腸潰瘍月経困難症子宮内膜症または手術直視下心臓手術またはバイパス手術など)、術後疼痛腎結石疼痛、胆嚢疼痛、胆石疼痛、陣痛または歯痛の治療に有用である。

0056

本発明の化合物はまた、片頭痛緊張型頭痛変容性片頭痛または進化性頭痛、群発頭痛、ならびに二次頭痛障害、例えば、感染症代謝障害またはその他の全身性疾病に由来する頭痛、および上述原発性および二次頭痛の悪化に由来するその他の急性頭痛、発作性片側頭痛などの頭痛の治療に有用である。

0057

本発明の化合物はまた、めまい耳鳴り筋痙攣、および、限定されないが、心臓血管疾患心不整脈心臓梗塞または狭心症高血圧心臓虚血、脳虚血など)、内分泌障害末端肥大症または尿崩症など)、障害の病態生理学が過度のまたは分泌過剰のあるいは適切でない内在性物質(例えば、カテコールアミンホルモンまたは増殖因子)の細胞分泌を伴う疾患を含むその他の障害などの疾患の治療にも有用である。

0058

本発明の化合物はまた、炎症性肝疾患、例えば、慢性B型ウイルス性肝炎、慢性C型ウイルス性肝炎アルコール性肝障害原発性胆汁性肝硬変自己免疫性肝炎、肝線維症、非アルコール性脂肪性肝炎および肝移植拒絶反応などの肝疾患の選択的治療にも有用である。

0059

本発明の化合物は全ての体組織に影響する炎症過程阻害する。したがって、筋肉骨格組織の炎症過程の治療に有用であり、次記に例を記載するが全ての当該障害を網羅するものではない:強直性脊椎炎頸部関節炎、線維筋痛症、痛風、若年性関節リウマチ腰仙骨関節炎変形性関節症、変形性関節症、骨粗鬆症、乾癬性関節炎リウマチ性疾患などの関節炎状態;皮膚および関連組織に影響を与える障害:湿疹、乾癬、皮膚炎および日焼けなどの炎症状態呼吸系の障害:喘息、アレルギー性鼻炎および呼吸促迫症候群、喘息および気管支炎などの炎症を伴う肺障害;慢性閉塞性肺疾患;免疫および内分泌系障害:結節性動脈周囲炎甲状腺炎再生不良性貧血強皮症重症筋無力症、多発性硬化症およびその他の脱髄疾患脳脊髄炎サルコイドーシス腎炎症候群ベーチェット症候群多発性筋炎歯肉炎

0060

本発明の化合物はまた、胃腸GI)管障害、例えば、限定されないが、潰瘍性大腸炎、クローン病、回腸炎直腸炎セリアック病腸疾患顕微鏡的またはコラーゲン大腸炎好酸球胃腸炎、または直腸結腸切除術後のおよび回腸吻合後に生じる回腸嚢炎、および幽門痙攣神経性消化不良痙性結腸大腸痙攣痙攣性腸、腸神経症、機能性大腸炎、粘液結腸炎下痢性腸炎および機能性消化不良などの腹痛および/または腹部不快感に関連する任意の障害を含む過敏性腸症候群を含む炎症性大腸疾患の治療に有用であるが、また、萎縮性胃炎胃炎バリアロホルム、潰瘍性大腸炎、消化性潰瘍胸やけ、および、例えば、ヘリコバクター・ピロリ、胃食道逆流症糖尿病性胃不全麻痺などの胃不全麻痺によるGI管へのその他の損傷;および非潰瘍性胃腸障害(NUD);嘔吐下痢、および内臓炎症などのその他の機能性腸障害の治療にも有用である。

0061

本発明の化合物はまた、過活動膀胱前立腺炎(慢性細菌性前立腺炎および慢性非細菌性前立腺炎)、前立腺痛間質性膀胱炎尿失禁および前立腺肥大付属器炎骨盤炎症、バルトリン腺炎および腟炎などの尿生殖器の障害の治療にも有用である。特に、過活動膀胱および尿失禁。

0062

本発明の化合物はまた、網膜炎網膜症、ぶどう膜炎および眼組織に対する急性傷害、加齢黄斑変性または緑内障結膜炎などの眼疾患の治療にも有用である。

0063

本発明の化合物はまた、サブタイプ制限型およびむちゃ食い/排出型を含む神経性食欲不振症などの摂食障害;サブタイプの排出型および非排出型を含む神経性過食症肥満症過食症;気晴らし食い症候群;および特定不能の摂食障害の治療にも有用である。

0064

本発明の化合物はまた、アレルギー性皮膚炎、気道過敏性、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気管支炎、敗血性ショック、シェーグレン症候群、糸球体腎炎、アテローム性動脈硬化症、悪性細胞の増殖と転移、骨髄芽球性白血病、糖尿病、髄膜炎、骨粗鬆症、熱傷、虚血性心疾患、脳卒中、末梢血管疾患静脈瘤、緑内障の治療にも有用である。

0065

本明細書で使用される場合、用語の、「治療すること」および「治療」は、このような用語が適用される疾患、障害または状態の進展、もしくはこのような疾患、障害または状態の1つまたは複数の症状の逆転、軽減、阻害、または予防を含む、治癒的対症療法的および予防的処置を意味する。

0066

さらに、本発明は、少なくとも1種の薬学的に許容可能なキャリアおよび治療有効量の式(I)の化合物を含む医薬組成物を提供する。

0067

本発明の医薬組成物を調製するために、有効成分としての有効量の塩基または酸付加塩型の特定の化合物が、少なくとも1種の薬学的に許容可能なキャリアと均質な混合物に混合され、このキャリアは、投与にとって望ましい剤形に応じて、多種多様の形態を取り得る。これらの医薬組成物は、好ましくは、経口投与直腸投与経皮投与または非経口注入に好適する単一の剤形であることが望ましい。

0068

例えば、経口剤形組成物の調製では、懸濁剤シロップ剤エリキシル剤および液剤などの経口液体製剤の場合には、例えば、水、グリコール、油、アルコールなどの任意の通常の液体医薬キャリアを使用し得、または粉剤丸薬カプセル剤および錠剤の場合には、デンプン、糖類、カオリン潤滑剤、結合物質崩壊剤などの固体医薬キャリアを使用し得る。錠剤およびカプセル剤は、投与におけるそれらの容易さのために、最も都合のよい経口単位剤形であり、この場合、固形の医薬キャリアを当然用いる。非経口注入組成物では、医薬キャリアは主に、滅菌水を含むことになるが、その他の成分も有効成分の溶解度を改善するために含め得る。

0069

注入可能な液剤は、例えば、食塩水グルコース溶液またはこれらの混合物を含む医薬キャリアを用いて調製し得る。注射可能な懸濁液を調製することもでき、その場合、適切な液体キャリア懸濁化剤などを用い得る。経皮投与に好適する組成物では、医薬キャリアは、必要に応じ、浸透促進剤および/または好適な湿潤剤を、必要に応じ、皮膚に大きな有害作用を生じない少量の好適な添加剤と組み合わせて含み得る。前記添加剤は、有効成分の皮膚への投与を容易にするようにおよび/または目的の組成物の調製を助けるように選択し得る。これらの局所適用組成物は、種々の手段、例えば、経皮貼付剤スポットオンまたは軟膏として、投与し得る。式(I)の化合物の付加塩は、対応する塩基型に比べてこれらの水溶性が増加しているために、当然ながら水性組成物の製剤としてより好適する。

0070

投与を容易にするために、また投薬量を一様にするために、本発明の医薬組成物を投与単位剤形として処方することが特に有利である。

0071

本明細書で使用される場合、「投与単位剤形」は、単位投与量として好適する物理的に別々の単位を意味し、各単位は、必要な医薬キャリアと組み合わせた目的の治療効果を生ずるように計算された所定の量の有効成分を含有する。このような投与単位剤形の例は、錠剤(分割錠または被覆錠剤を含む)、カプセル剤、丸薬、粉剤小包ウエハ、注入可能な液剤または懸濁剤、さじ量、大さじ量など、およびこれらの複数個分割物である。

0072

経口投与の場合、本発明の医薬組成物は、結合剤(例えば、アルファ化トウモロコシデンプンポリビニルピロリドンヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)、充填剤(例えば、ラクトース結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウムなど)、潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウムタルク、またはシリカなど)、崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウムなど)、または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に許容可能な賦形剤およびキャリアを用いて従来の手段により調製された固体投与剤形、例えば、錠剤(飲み込み型および咀嚼型の両方)、カプセル剤またはジェルカプセル剤の形態を取り得る。このような錠剤はまた、当該技術分野において周知の方法により被覆し得る。

0073

経口投与用の液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤、もしくは懸濁剤の形態をとることが可能であり、またはそれらの製剤は、使用前に水および/または別の適切な液体キャリアを用いて混合するための乾燥製品として処方し得る。このような液体製剤は、必要に応じ、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたは水素化食用油脂)、乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)、非水性キャリア(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール)、甘味料香味料マスキング剤および防腐剤(例えば、メチルもしくはプロピルp−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸)などのその他の薬学的に許容可能な添加剤を用いて、従来の方法により調製し得る。

0074

本発明の医薬組成物で有用な薬学的に許容可能な甘味料は、好ましくは少なくとも1種の高甘味度甘味料、例えば、アスパルテームアセスルファムカリウムシクラミン酸ナトリウムアリタームジヒドロカルコン甘味料、モネリンステビオシドスクラロース(4,1’,6’−トリクロロ−4,1’,6’−トリデオキシガラクトスクロース)または、好ましくはサッカリン、ナトリウムまたはカルシウムサッカリン、および場合により、少なくとも1種のバルク甘味料、例えば、ソルビトールマンニトールフルクトースショ糖マルトースイソマルトグルコース、水素添加グルコースシロップキシリトールカラメルまたは蜂蜜を含む。高甘味度甘味料は、低濃度で使用されるのは好都合である。例えば、ナトリウムサッカリンの場合では、前記濃度は、最終製剤の約0.04%〜0.1%(重量/体積)の範囲であり得る。バルク甘味料は、約10%〜約35%、好ましくは約10%〜約15%(重量/体積)の範囲のより高い濃度で効果的に使用できる。低投与量配合で苦味成分マスクできる薬学的に許容可能な香味料は、サクランボラズベリーカシスまたはストロベリー香味料を含むのが好ましい。2種の香味料の組み合わせが非常に良好な結果を生じ得る。高投与量配合では、より強力な薬学的に許容可能な香味料、例えば、カラメルチョコレートミントクール、ファンタジーなどが必要となり得る。

0075

それぞれの香味料は、最終組成物中に、約0.05%〜1%(重量/体積)の範囲の濃度で存在し得る。前記強力香味料の組み合わせが使用されるのが好都合である。製剤の環境下で、何らの変化を受けないまたは味覚および/または色の消失がない香味料が使用されるのが好ましい。

0076

式(I)の化合物は、注入による非経口投与、都合よく静脈内、筋肉内または皮下注射のための、例えば、ボーラス注入または連続的な静脈内注入のための投与用として処方し得る。注入用の製剤は、単位剤形、例えば、アンプル、または防腐剤を添加した複数回投与容器で提供し得る。製剤は、懸濁液、溶液または油もしくは水ビークル中の乳剤などの形態を取ってよく、等張化剤、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤などの製剤化剤を含めてもよい。あるいは、有効成分は、好適なビークル、例えば、無菌発熱性物質非含有水を使用前に用いて混合するための粉末形態で存在してもよい。

0077

式(I)の化合物は、例えば、ココアバターおよび/または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を含む、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物として処方してもよい。

0078

リガンド開口型イオンチャネルの媒介と関連する疾患の治療の当業者なら、以降で提示する試験結果から、式(I)の化合物の治療有効量を容易に決定するであろう。一般に、治療有効量は、約0.001mg/(治療患者kg体重)〜約50mg/(治療患者のkg体重)、より好ましくは、約0.01mg/(治療患者のkg体重)〜約10mg/(治療患者のkg体重)となるであろうということが意図されている。治療有効量を、2つ以上の分割用量の形で、その日全体を通して適切な間隔で投与するのが適切であり得る。前記分割用量は、例えば、単位剤形当たり、約0.1mg〜約1000mg、より具体的には、約1〜約500mgの有効成分を含む単位剤形として、処方し得る。

0079

本明細書で使用される場合、化合物の「治療有効量」は、個体または動物に投与した場合、個体または動物中に充分に高レベルのその化合物をもたらし、識別可能なP2X7受容体アンタゴニスト反応を生じる化合物の量である。

0080

正確な投与量および投与頻度は、当業者によく知られているように、使用される特定の式(I)の化合物、治療される特定の状態、治療される状態の重症度、特定の患者の年齢、体重および全身健康状態ならびにその患者が服用しているその他の薬物に依存する。さらに、前記「治療有効量」は、治療された患者の反応に応じておよび/または本発明の化合物の処方医師の評価に応じて、減少または増加され得る。したがって、上述の効果的な毎日の量の範囲は、ガイドラインにすぎない。

0081

命名法および構造
一般に、本出願で使われる命名法は、ChemSketch(登録商標)(ACDLabs)に基づいており、IUPAC系統的命名法に従って生成される。本明細書で示す化学構造は、ISIS(登録商標)バージョン2.2を用いて作成した。特に指示がない限り、本明細書の構造中の炭素酸素硫黄、または窒素原子上に現れるいずれの開放原子価水素原子の存在を示す。窒素含有ヘテロアリール環が窒素原子上の開放原子価で示され、R1、R2、R3などの変数がヘテロアリール環上で示される場合、このような変数は、開放原子価の窒素に結合または連結してよい。キラル中心が構造中に存在するが、キラル中心に関する特定の立体化学が示されない場合、そのキラル中心に関連する両方のエナンチオマーがその構造により包含される。本明細書で示される構造が複数の互変異性型で存在し得る場合、全てのこのような互変異性体がその構造により包含される。本明細書で、構造中に表される原子は、このような原子の全ての天然同位体を包含することが意図されている。したがって、例えば、本明細書で表される水素原子は、重水素およびトリチウムを含むことが意図され、炭素原子は、13Cおよび14C同位体を含むことが意図されている。

0082

略語
以降のスキームおよび実施例の記載で使用され得る略語は下記の通りである。
AcOH:酢酸
Anh:無水
AcONa:酢酸ナトリウム
Boc:tert−ブチルカーボネート
Boc2O:ジ−tert−ブチルジカーボネート
CC:カラムクロマトグラフィー
ASTジエチルアミノサルファートリフルオリド
DCM:ジクロロメタン
DEA:ジエチルアミン
DIAD:ジイソプロピルアゾジカルボキシレート
DIBAL:ジイソブチルアルミニウムヒドリド
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
DMAP:ジメチルアミノピリジン
DMF:ジメチルホルムアミド
DMSO:ジメチルスルホキシド
Et2O:ジエチルエーテル
EtOAc:酢酸エチル
EtOH:エタノール
ESI:エレクトロスプレーイオン化
HBTU:N,N,N’,N’−テトラメチル−O−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
h:時間
Hrs:時間
M:モル
MeCN:アセトニトリル
MeOH:メタノール
Min:分
Ni−Raney:ラネーニッケル
MR核磁気共鳴
rt:室温
TFA:トリフルオロ酢酸
THF:テトラヒドロフラン
TLC薄層クロマトグラフィー
TMSCN:トリメチルシリルシアニド
PLC−MS:超高速液体クロマトグラフィー−質量分析計
XPhos:4,5−ビスジフェニルホスフィノ)−9,9−ジメチルキサンテン

0083

実験
次の実施例は、本発明を例示するものである。明示的に別義が示されない限り、全ての詳細事項(特にパーセンテージおよび量)は重量基準である。

0084

合成実施例
A.中間体1b〜1dの合成

0085

0086

塩化スルフリル(1.23mL、15.2mmol、1.01当量)を、エチル4,4−ジフルオロアセトアセテート(2.5g、15.0mmol、1当量)に窒素雰囲気下、0℃で滴加し、室温で一晩撹拌した。反応物をEtOAc(20mL)で希釈し、水混合物(20mL)に注ぎ込んだ。有機層を無水Na2SO4上で乾燥後、濾過および留去して3.2gの粗製2−クロロ−4,4−ジフルオロアセトアセテートを黄色油として得た。粗製物をエタノール(10mL)中に溶解し、チオ尿素(3.2g、30mmol、2当量)で処理し、マイクロ波反応器中、100℃で1時間加熱した。その後、溶媒を減圧下で除去し、残留物をNaHCO3(10mL)とEtOAc(10mL)の間で分配した。有機層をブライン(20mL)で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥後、濾過、留去した。粗製物をジエチルエーテルで処理し、濾過後減圧下で乾燥して、1.37g(収率41%)の中間体1bを黄色固体として得た。

0087

0088

中間体1b(1.37g、6.16mmol、1当量)をジオキサン(35mL)中に溶解し、亜硝酸イソアミル(2.24mL、16.64mmol、2.7当量)を加え、反応混合物を80℃で1時間加熱した。溶媒を減圧下で留去し、残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(EtOAc/石油エーテル10/90)で精製して中間体1c(1.02g、収率80%)を黄色固体として得た。

0089

0090

中間体1c(0.758g、3.66mmol、1当量)をアルゴン雰囲気下で乾燥DCM(18.5mL)中に溶解し、−75℃に冷却した。DCM中1Mのジイソブチルアルミニウムヒドリド(4.1mL、4.1mmol、1.12当量)を滴加し、反応混合物を−70℃で撹拌した。1.5時間後、DCM中1Mのジイソブチルアルミニウムヒドリド(2.5mL、2.5mmol、0.68当量)を滴加し、反応混合物を−70℃でさらに1時間撹拌した。反応物を0℃に温め、水(0.264mL)、15%NaOH(0.264mL)および水(0.66mL)をこの順序で処理した。その後、これを0℃で5分間撹拌した後、室温で30分間攪拌した。水(0.24mL)、続けて15%NaOH(0.130mL)を順次加え、室温で沈殿物が形成されるまで反応物を撹拌した。混合物を濾過した後、溶媒を濃縮した。残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(DCM/石油エーテル80/20 → 100%DCM)で精製して中間体1d(純度約70%)を含有する黄色油(0.34mg、収率40%)を得て、これをそのまま使用した。

0091

B.中間体:α−アミノニトリルの合成
出発材料
出発材料として使用した下記の全ての、置換4−フェニルオキシピペリジンまたは4−ベンジルオキシピペリジン誘導体および4−メチル−1,3−チアゾール−5−カルバルデヒド化学薬品提供者から購入した。

0092

0093

一般的手順
4−置換ピペリジン誘導体の塩酸塩(1当量)を2〜3mLのDCMに懸濁し、TEA(1.1〜2当量)を加えた。混合物を数分間撹拌し、溶媒をロータリーエバポレーター蒸発させ、残留物を40℃で15分間、真空乾燥した。塩酸塩不含アミン(1当量)、チアゾリルアルデヒド(180〜300mg、1.2〜1.5当量)、およびAcONa(3.5当量)を氷酢酸(5〜8mL)に溶解した。混合物をアルゴン下、室温で3時間攪拌した後、0℃に冷却した。TMSCN(3〜12当量)を滴加し、混合物を室温まで暖め、1〜3日間撹拌した。その間に、LC−MS分析の結果から必要があれば、TMSCN(3〜6当量)を加え(TMSCNが12当量になるまで)、反応物を24時間撹拌した。その後、溶媒を40〜45℃でロータリーエバポレーターを用いて蒸発させた。NaHCO3の飽和溶液(20〜50mL)を残留物に加えた。必要に応じ、pHを8に高めるために、固体NaHCO3および水を加えた。混合物をDCMで抽出した(5mLx3〜5)。合わせた有機相を乾燥し(無水Na2SO4)、留去した。粗製物を、ヘキサンアセトン混合物(0→30%)を用いてフラッシュクロマトグラフィー(SiO2)で精製し、純粋なα−アミノニトリル(28〜68%収率)を得た。

0094

この手順を用いて、中間体A0018_42_01(収率54%)、A0018_42_02(収率55%)、A0018_42_03(収率55%)、A0018_42_04(収率42%)、A0018_42_05(収率63%)、A0018_42_06(収率50%)、A0018_41_01(収率45%)、A0018_41_02(収率60%)、A0018_41_03(収率46%)、A0018_41_04(収率68%)、A0018_41_05(収率65%)、A0018_41_06(収率43%)、A00FF_42_04(収率30%)、A00FF_42_05(収率56%)、A00FF_42_06(収率36%)、A00FF_41_01(収率31%)、A00FF_41_02(収率57%)、A00FF_41_03(収率53%)、A00FF_41_04(収率53%)、A00FF_41_05(収率28%)を、4−メチル−1,3−チアゾール−5−カルバルデヒドまたは、それぞれ、4−ジフルオロメチル−1,3−チアゾール−5−カルバルデヒドおよび4−(4−フルオロベンジルオキシピペリジン)、4−(4−クロロベンジルオキシピペリジン)、4−(3−フルオロベンジルオキシピペリジン)、4−(2−フルオロベンジルオキシピペリジン)、4−(3,5−ジフルオロベンジルオキシピペリジン)、4−(3,4−ジフルオロベンジルオキシピペリジン)、4−(4−フルオロフェニルオキシピペリジン)、4−(4−クロロフェニルオキシピペリジン)、4−(3−フルオロフェニルオキシピペリジン)、4−(2−フルオロフェニルオキシピペリジン)、4−(3,5−ジフルオロフェニルオキシピペリジン)または4−(3,4−ジフルオロフェニルオキシピペリジン)から調製した。

0095

0096

C.ジアミンの調製(一般的手順)
シアン化物誘導体(100〜270mg、1当量)をアルゴン雰囲気下で乾燥DCM中に溶解し、氷塩中で冷却した。DCM中の1MのDIBAL(3当量)の溶液をゆっくりと添加し(30分毎に1当量ずつを何度かに分けて)、混合物をさらに1時間撹拌した。この溶液(0℃)に、水(1mL)を滴加し、混合物を沈殿物の形成が完了するまで撹拌した。DCMを減圧下で除去し、残留物をAcOEt中に懸濁した。得られた固体を濾過し、AcOEtで4〜6回洗浄した。合わせた有機層をNa2SO4上で乾燥し、留去して油状残留物を得て、減圧下、38〜40℃で1時間以上乾燥した。粗生成物(68〜97%収率)を追加の精製をすることなく次の合成ステップで使用した。

0097

この手順を用いて、
中間体A0017_59_01(収率94%)を、A0018_42_01から出発して調製した;
中間体A0017_59_02(収率83%)を、A0018_42_02から出発して調製した;
中間体A0017_59_03(収率87%)を、A0018_42_03から出発して調製した;
中間体A0017_59_04(収率97%)を、A0018_42_04から出発して調製した;
中間体A0017_59_05(収率65%)を、A0018_42_05から出発して調製した;
中間体A0017_59_06(収率88%)を、A0018_42_06から出発して調製した;
中間体A0017_58_01(収率62%)を、A0018_41_01から出発して調製した;
中間体A0017_58_02(収率95%)を、A0018_41_02から出発して調製した;
中間体A0017_58_03(収率67%)を、A0018_41_03から出発して調製した;
中間体A0017_58_04(収率89%)を、A0018_41_04から出発して調製した;
中間体A0017_58_05(収率80%)を、A0018_41_05から出発して調製した;
中間体A0017_58_06(収率95%)を、A0018_41_06から出発して調製した;
中間体A00FF_59_04(収率87%)を、A00FF_42_04から出発して調製した;
中間体A00FF_59_05(収率81%)を、A00FF_42_05から出発して調製した;
中間体A00FF_59_06(収率80%)を、A00FF_42_06から出発して調製した;
中間体A00FF_58_01(収率89%)を、A00FF_41_01から出発して調製した;
中間体A00FF_58_02(収率94%)を、A00FF_41_02から出発して調製した;
中間体A00FF_58_03(収率88%)を、A00FF_41_03から出発して調製した;
中間体A00FF_58_04(収率92%)を、A00FF_41_04から出発して調製した;
中間体A00FF_58_05(収率93%)を、A00FF_41_05から出発して調製した。

0098

0099

D.最終化合物の合成のための一般的手順
化合物1〜38の調製
カルボン酸(25〜115mg、1当量)、HATU(1.1当量)またはEDCl(1当量)/HOBt(1当量)およびDIPEA(2〜3当量)の無水DMFまたはDCM(1〜2mL)中混合物を、アルゴン雰囲気下で10〜30分間撹拌した。その後、粗製アミン(1当量)の無水DCMまたはDMF(1〜3mL)中の溶液を加え、反応混合物を一晩撹拌した。水および飽和NaHCO3を加え、生成物をDCMで4〜6回抽出した。合わせた有機層をNa2SO4上で乾燥し、留去した。生成物をFCC(SiO2、DCM→AcOEt→0〜10MeOH/AcOEt)またはSFC(5〜10%MeOH/scCO2)により精製し、目的の生成物を含む画分を留去し、高真空下で16〜72時間乾燥した。収率8〜71%。

0100

この手順を用いて、
化合物1(収率19%)を、DMF+DCM中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA0017_59_01から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物2(収率19%)を、DMF中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA0017_59_02から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物3(収率23%)を、DCM中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、EDCl/HOBtおよびA0017_59_03から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物4(収率30%)を、DMF中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA0017_59_04から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物5(収率16%)を、DMF中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA0017_59_05から出発し、FCCに続けてSFCで精製して調製した;
化合物6(収率12〜18%)を、DCMまたはDMF+DCM中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、EDCl/HOBtまたはHATUおよびA0017_59_06から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物7(収率16%)を、DMF+DCM中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA0017_58_01から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物8(収率13〜16%)を、DMF+DCMまたはDMF中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA0017_58_02から出発し、SFCに続けてFCCで精製して調製した;
化合物9(収率48%)を、DMF中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA0017_58_03から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物10(収率12%)を、DMF中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA0017_58_04から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物11(収率8%)を、DMF中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA0017_58_05から出発し、FCCに続けてSFCで精製して調製した;
化合物12(収率29%)を、DMF+DCM中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA0017_58_06から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物13(収率28%)を、DCM中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA0017_59_01から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物14(収率25%)を、DMF中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA0017_59_02から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物15(収率32%)を、DMF+DCM中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA0017_59_03から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物16(収率31%)を、DMF+DCM中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA0017_59_04から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物17(収率29%)を、DMF中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA0017_59_05から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物18(収率20%)を、DCM中のキノリン−5−カルボン酸、EDCl/HOBtおよびA0017_59_06から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物19(収率28%)を、DMF中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA0017_58_01から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物20(収率27%)を、DMF中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA0017_58_02から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物21(収率71%)を、DMF中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA0017_58_03から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物22(収率25%)を、DMF中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA0017_58_04から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物23(収率15%)を、DCM中のキノリン−5−カルボン酸、EDCl/HOBtおよびA0017_58_05から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物24(収率17〜27%)を、DCMまたはDMF+DCM中のキノリン−5−カルボン酸、EDCl/HOBtまたはHATUおよびA0017_58_06から出発し、FCCで精製して調製した;
化合物25(収率30%)を、DMF+DCM中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA00FF_59_04から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物26(収率19%)を、DMF+DCM中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA00FF_59_05から出発し、二つのFCCで精製して調製した;
化合物27(収率26%)を、DMF+DCM中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA00FF_59_06から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物28(収率19%)を、DMF+DCM中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA00FF_58_02から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物29(収率22%)を、DMF+DCM中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA00FF_58_03から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物30(収率30%)を、DMF+DCM中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA00FF_58_04から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物31(収率29%)を、DMF+DCM中の2−クロロ−6−フルオロ安息香酸、HATUおよびA00FF_58_05から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物32(収率30%)を、DMF+DCM中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA00FF_59_04から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物33(収率31%)を、DMF+DCM中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA00FF_59_05から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物34(収率34%)を、DMF+DCM中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA00FF_58_01から出発し、FCCに続けてSFCで精製して調製した;
化合物35(収率19%)を、DMF+DCM中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA00FF_58_02から出発し、SFCに続けてFCCで精製して調製した;
化合物36(収率22%)を、DMF+DCM中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA00FF_58_03から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物37(収率22%)を、DMF+DCM中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA00FF_58_04から出発し、SFCで精製して調製した;
化合物38(収率35%)を、DMF+DCM中のキノリン−5−カルボン酸、HATUおよびA00FF_58_05から出発し、SFCで精製して調製した;

0101

表11−18は、実施例1に記載した実験手順に従って調製および試験した最終化合物を示す。

0102

0103

0104

0105

0106

0107

0108

0109

0110

精製システム
フラッシュクロマトグラフィー(FCC)
FCC分離は、紫外検出器を備えた、Interchim puriFlash(登録商標)430、Interchim puriFlash(登録商標)450またはInterchim puriFlash(登録商標)4250−250で実施した。シリカカラムのタイプ:Interchim puriFlash(登録商標)SiHP(高性能シリカ)50μm、4〜25g。

0111

超臨界流体クロマトグラフィー(SFC);
FCC分離は、フォトダイオードおよびMS QDa検出器を備えたWaters Prep100q SFC Systemで実施した。シリカカラムのタイプ:Viridis Prep Silica 2−EP(2−エチルピリジン)OBD、19x100mm、5μm。使用した方法:溶媒(A)CO2、溶媒(B)メタノール;勾配条件:5%〜10%のBを8分間;ABPR 120バール;T=40℃。

0112

分析
LCMSの一般的手順
HPLC測定を、脱ガス装置を有するクォータリポンプ、オートサンプラーカラムオーブン(25℃に設定)、ダイオードアレー検出器DAD(通常、200nmの波長を使用)およびカラムKinetex XB Cl8 4.6x50mm 2.6μmを備えたDionex Ultimate 3000モジュールを用いて実施した。溶離液の流量は0.5mL/分であった。2種の移動相、移動相A:水(ミリQ)中0.1%ギ酸溶液;移動相B:アセトニトリル(HPLCJ.T.Baker)中0.1%ギ酸溶液、を使用し、これらを用いて、20%B→80%の勾配条件で6.7分、80%Bで1.3分保持、80B%→95%の勾配条件で0.3分、95%Bで保持および→20%Bの勾配条件で0.5分の条件で実施し、また、カラムを再平衡化するために、これらの条件で2分保持する。1.0μLの注入量を使用した。カラムからの流れをMS分光計に分割した。MS検出器(HCT Bruker)をエレクトロスプレーイオン化源用として構成した。質量スペクトルを、100〜1000Daを走査することにより取得した。キャピラリーニードル電圧ポジティブイオン化モードでは4kVで、イオン源温度は365℃に維持した。窒素を噴霧ガスとして使用し、ガス流量は9.0l/分であった。データ取得は、Data Analysis Brukerプログラムを使って実施した。

0113

LCMS法による保持時間(Rt)分、[M+H]+ピーク

0114

0115

MR特性評価
1H NMRおよび13CNMRスペクトルを、CDCl3またはCD3ODを溶媒として用いて、Bruker Avance III HD 400MHz分光計で記録した。化学シフト(δ)は、CHCl3では7.26ppmおよびCHD2ODでは3.31ppmに帰属される1H NMR用に選択された完全には重水素化されていない溶媒の残留シグナルに対して、またはCHCl3では77.16ppmおよびCD3ODでは49.00ppmに帰属される13C NMR用に選択された重水素化溶媒のシグナルに対して、100万分率(ppm)で報告される。

0116

0117

0118

0119

0120

0121

0122

0123

0124

0125

0126

0127

0128

0129

0130

0131

薬理学的実施例
本発明の化合物は、自動化パッチクランプによるヒトP2X7チャネルアッセイに対し活性であることが明らかになった。

0132

P2X7チャネルの遮断を直接モニターするために、電気生理学的アッセイを開発し、QPatch 16X自動化電気生理学的測定器で実施した。

0133

P2X7チャネルを発現しているHEK−293細胞を改良EMEM中で培養した。

0134

実験の72時間前に、5百万個の細胞をT225フラスコ播種した。実験直前に細胞を2回洗浄し、トリプシンEDTAを用いてフラスコから剥離し、懸濁溶液に再懸濁し、QPatch 16X上に置いた。

0135

−20℃で保存した化合物(100%DMSO中の20mM)を実験の日に調製した(100%DMSO中の1:20の第1の希釈を行って1mMストック溶液を調製し、その後、外液系列希釈1:10として1マイクロモル溶液を調製した)。

0136

標準ホールセル電圧クランプ実験を室温で実施した。これらの実験では、マルチホール技術を使用し、データを2KHzでサンプリングした。

0137

細胞内液には、(mM)135 CsF、10 NaCl、1 EGTA、10HEPES、(CsOHでpH7.2にする)、一方、細胞外液には、(mM)145 NaCl、4 KCl、0.5 MgCl2、1 CaCl2、10 HEPES、10 Glc(NaOHでpH7.4にする)を含めた。

0138

ホールセル配置でシールおよび流路確立後、細胞を−80mVで保持した。P2XR7電流を、100マイクロモルのBzATP単独(4回)を適用して誘導し、その後、調査対象化合物の漸増濃度(1、10、100および1000nM)の存在下で誘導した。

0139

図に示すように、プレインキュベーションの5〜8は、目的の化合物の漸増濃度を含む(1、10、100および1000nM)。

0140

漸増濃度調査化合物の非存在または存在下でのBzATPにより誘導された最大内向き電流を測定し、正規化した。潜在的調節効果を対照の%として測定し、また、次の式を用いて、用量反応曲線データの当てはめにより決定したIC50として測定した。

0141

0142

式中、
X:濃度のlog
Y:正規化反応、100%から0%まで、Xが増加すると減少する。
LogIC50:Xと同じlog単位
ヒルスロープ勾配係数またはHS、無単位

0143

0144

Screen Quest(登録商標)Fluo−8 No Wash Calcium Assay Kitを用いて、本発明の化合物が、ラットP2X7阻害剤であることが明らかになった。

0145

Screen Quest(登録商標)Fluo−8 No Wash Calcium Assay Kit(AAt Bioquest(登録商標))を用いて、その受容体を安定して遺伝子導入したHEK−293細胞でCa2+流入を測定した。簡単に説明すると、細胞内で、Fluo−8の親油性ブロック基が非特異的細胞エステラーゼにより切断されると、細胞内にとどまる負電荷蛍光染料が生じる。その蛍光はカルシウムに結合すると増大する。HEK−293/P2X7細胞がBzATPに刺激されると、Ca2+は細胞に入り、Fluo−8 NWの蛍光が増大する。染料吸収スペクトルは、アルゴンレーザー源による488nmでの励起と一致し、その発光波長は515〜575nmの範囲であった。

0146

化合物を規定通りに試験するために、安定してラットP2X7Rを遺伝子導入したHEK−293細胞を、384ウェルプレートを用いて、解凍後の反応のレベルに応じて、10000、15000または20000個の細胞/ウェル増殖培地中、一晩播種した。24時間後、培地を除去し、細胞に、Ca2+/Mg2+不含タイロード0.3mM中で調製した20μL/wのFluo−8 NWを室温で1時間プリロードした

0147

本発明の化合物を次の8種の濃度で同じプレート中で試験した(各濃度で4回繰り返した):10−3.16−1−0.316−0.1−0.0316−0.01および0.00316μM。

0148

FLIPRTETRAを用いて、次の方法により化合物を試験した:
・最初に、FLIPRTETRAに10μLの3x試験化合物(タイロード緩衝液0.3mM(Ca2+/Mg2+不含)+DMSO 0.5%の最終濃度)を注入
・5分間の培養
・第2の注入として、FLIPRTETRAに約EC80の15μLの3xBzATP(タイロード緩衝液0.3mM(Ca2+/Mg2+不含)+BSA 0.0003%の最終濃度)を注入
・3分間の蛍光記録

0149

1つのプレートと次のプレートとの間で、チップを水に続けて100%DMSOで、さらに最後に水で徹底的に洗浄し、チップ内持ち越し汚染を回避した。

0150

試験化合物の効果を基準アンタゴニストに対するパーセント抑制として測定し、IC50値をそれに応じて計算した。

0151

0152

本発明の化合物は、表37に記載のように、意外にも、国際公開第2015/118019号に極めて近い実施例の場合より強力であることが明らかになった。

0153

0154

ヒト肝ミクロソームを用いた試験化合物の代謝安定性インビトロ評価
ヒト(マウス)肝臓ミクロソーム試験システム
テスト化合物濃度:1μM
試験時点:0、5、10、30および60分
最終タンパク質濃度:1mg/mL
繰り返し数:2回
リン酸カリウム緩衝液:pH7.4、100mM
評価項目:試験化合物の残留%、半減期、Clint、LC−MS/MSによるバイオアナリシス

0155

試験化合物の調製と希釈
試験化合物の10mMのストック溶液をDMSO中で調製し、水:アセトニトリル(1:1)で1mMの濃度に希釈した。100μMの作用濃度を、水:アセトニトリル(1:1)でさらに希釈することにより調製した。

0156

pH7.4のリン酸カリウム緩衝液の調製
100mLのミリQ水をK2HPO4(1.398g)およびKH2PO4(0.27g)に加え、最終pH7.4を得る。

0157

アッセイ手順:
プレインキュベーション混合物:2.5μLの試験化合物+75μLの3.33mg/mLの肝臓ミクロソーム+85μLの100mMのリン酸カリウム緩衝液(37℃で10分間プレインキュベート
補助因子なしの60分:32.5μLのプレインキュベーション混合物+17.5μLの100mMのリン酸カリウム緩衝液(37℃で60分インキュベート
0分試料:16.25μLのプレインキュベーション混合物+200μLの内部標準含有アセトニトリル+8.75μLの補助因子インキュベーション混合物<62μLの補助因子(2.5mM)+残りのインキュベーション混合物(37℃で60分インキュベート)

0158

試料調製:25μLのインキュベーション混合物+200μLの内部標準含有アセトニトリル+ボルテックスを1200rpmで5分+遠心分離を4000rpmで10分。上清を水で2倍に希釈し、LC−MS/MSに注入する。

0159

バイオアナリシス:LC−MS/MS方法:LC一般的勾配条件を用い、詳細は報告書に示す。

0160

計算:試験物質の残留%=[試験時点(分)でのピーク面積/0分でのピーク面積]*100;Ke1:Log%残留量対時間(分)のプロットから得た傾斜;半減期:t1/2(分)=0.693/Ke1;
固有クリアランス(μL/分/mg)=ABS(Ke1/タンパク質濃度)*1000;

0161

本発明の実施例は、表38に記載のように、意外にも、ヒト肝臓マイクロソーム安定性試験において、国際公開第2015/118019号の極めて類似の化合物より2〜4倍安定であることが明らかになった。

0162

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