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技術 除草剤耐性の増加した植物

出願人 ビーエーエスエフソシエタス・ヨーロピア
発明者 シャハトシャベル,ドリーンホレンバッハ,エーファシセイ,ミヒレットテケステシュタインハルト,ビルギットハンツリーク,クリスティントレシュ,シュテファンフォクト,フロリアンゲールディンク,ダニー
出願日 2017年7月13日 (2年8ヶ月経過) 出願番号 2019-501593
公開日 2019年9月5日 (6ヶ月経過) 公開番号 2019-524096
状態 未査定
技術分野 植物の育種及び培養による繁殖 捕獲、駆除 突然変異または遺伝子工学 種実、スープ、その他の食品 微生物、その培養処理 農薬・動植物の保存 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 生産ステップ 適用パラメータ ない接ぎ 切り取り部分 褐変色 種まき機 パーフォレータ 生長過程
関連する未来課題
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課題・解決手段

変異型TriAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する植物体もしくは植物部位が与えられる。前記ポリヌクレオチドの発現は、その植物体もしくは植物部位に除草剤耐性を付与する。

概要

背景

微生物は、環境中への生体異物投入に対して、そうした異物栄養源、ならびに増殖のためのエネルギー源として利用できるメカニズム進化させることによって対処することが多い。s-トリアジン環を基本とする除草剤の構造は、天然に存在する化合物とは異なるので(Esser et al. 1975)、微生物はそれらを分解することができる酵素および経路をゆっくりと進化させた。アミドヒドロラーゼスーパーファミリーは、炭素中心およびリン中心にアミドもしくはエステル官能基を有する、広範な基質加水分解触媒する注目すべき酵素群を含む。すべての場合において、単核もしくは二核金属中心との錯体形成によって求核性水分子活性化される。単核金属中心において、基質は活性部位からのプロトン移動により活性化され、水は金属のライゲーションおよび一般塩基触媒反応によって活性化される。金属中心は、(βα)8構造ドメイン内のβバレルコアC末端にある。顕著な一例が、除草剤であるアトラジン加水分解性脱塩素反応を触媒して、除草活性のない生成物2-ヒドロキシアトラジン(de Souza et al. 1996; Seffernick et al. 2002; Sadowsky and Wackett 2000)を生じる、アトラジンクロヒドロラーゼ(AtzA)Fe(II)依存性ホモヘキサマー(Seffernick et al. 2002; Wackett et al. 2002a)である。AtzAの既知のもっとも近い類縁体は、メラミンデアミナーゼシュードモナス属一種(Pseudomonas sp.)NRRL B-12227株に由来するTriA;98%配列同一性)である。配列類似性が高いにもかかわらず、AtzAおよびTriAは触媒性が異なる;TriAはデアミナーゼであって、その生理的なデアミナーゼ活性より何桁も低いデクロリナーゼ活性を伴うのに対して、AtzAは検出可能なデアミナーゼ活性を持たないデクロリナーゼである。先行研究によれば、2つのタンパク質の間で異なっている9つのアミノ酸のうち3つ(S331C;N328D;およびF84I AtzA)が、触媒特異性相違に大きな役割を果たす。

概要

変異型TriAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する植物体もしくは植物部位が与えられる。前記ポリヌクレオチドの発現は、その植物体もしくは植物部位に除草剤耐性を付与する。なし

目的

本発明は、除草剤、具体的にはアジンと命名されたセルロース生合成阻害剤、を生分解する標的タンパク質をコードする細菌遺伝子の導入によって、植物における除草剤耐性を高めることができる、新たな方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

変異型TriAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物又は植物部分であって、前記ポリヌクレオチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物又は植物部分に付与する、植物又は植物部分。

請求項2

除草剤が、セルロース生合成阻害する化合物を含む、請求項1に記載の植物又は植物部分。

請求項3

変異型TriAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号1に記載の核酸配列、又はそのホモログ変異体若しくは誘導体を含む、請求項1または2に記載の植物又は植物部分。

請求項4

変異型TriAポリペプチドが、変異体の全長にわたって、配列番号2と少なくとも約60%、例として、少なくとも約80%、90%、95%、98%、又は99%以上のアミノ酸配列同一性を有する機能性変異体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の植物又は植物部分。

請求項5

変異型TriAが配列番号2の配列を含むTriAポリペプチド、そのオルソログパラログ、又はホモログを指し、そのアミノ酸配列は、配列番号2の位置69、70、71、74、82、84、85、87、88、89、91、92、93、96、126、128、129、130、131、155、157、160、167、170、174、180、182、216、217、219、220、246、247、248、249、250、251、298、301、302、304及び328に対応する1つ以上の位置で野生型アミノ酸配列と異なる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の植物又は植物部分。

請求項6

植物細胞作動可能プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物へと、発することができる種子であって、前記プロモーターは、前記ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する、種子。

請求項7

植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物の、又はその植物を再生することができる、植物細胞であって、前記プロモーターは、前記ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与し、前記植物細胞はプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む、植物細胞。

請求項8

細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む植物細胞であって、前記プロモーターは、前記ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する、植物細胞。

請求項9

植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物又は植物部分から調製された、植物産品であって、前記プロモーターは、前記ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する、植物産品。

請求項10

植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物に由来する、子孫又は後裔植物であって、前記プロモーターは、前記ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、子孫又は後裔植物はその細胞の少なくとも一部に、前記プロモーターに作動可能に連結された前記ポリヌクレオチドを含み、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を子孫又は後裔植物に付与する、子孫又は後裔植物。

請求項11

植物の成長のための場所で雑草防除する方法であって、(a)除草剤を含む除草剤組成物を前記場所に適用するステップ、及び(b)種子を前記場所に植え付けるステップを含み、種子は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物を生成することができ、前記プロモーターは、前記ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する、方法。

請求項12

除草剤組成物を、雑草、及び種子により生成された植物に適用する、請求項11に記載の方法。

請求項13

除草剤がセルロース生合成を阻害する化合物を含む、請求項11又は12に記載の方法。

請求項14

除草剤に対する耐性を有する植物を生成する方法であって、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結された組換えポリヌクレオチド形質転換された植物細胞から植物を再生するステップを含み、前記プロモーターは、前記ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する、方法。

請求項15

除草剤に対する耐性を有する子孫植物を生成する方法であって、除草剤に耐性の第1の植物を第2の植物と交配して、除草剤に耐性の子孫植物を生成するステップを含み、第1の植物及び子孫植物はそれらの細胞の少なくとも一部に、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記プロモーターは、前記ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する、方法。

請求項16

植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物又は植物部分であって、前記プロモーターは、前記ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与し、前記植物又は植物部分が第2又は第3の除草剤耐性形質をさらに示す、植物又は植物部分。

請求項17

(a) 配列番号2の配列、またはそのバリアント、パラログ、オルソログ、もしくはホモログを含む変異型TriAポリペプチドをコードする核酸分子;(b) 配列番号1の配列、またはそのバリアント、パラログ、オルソログ、もしくはホモログを含む核酸分子;(c)遺伝暗号縮重の結果として、配列番号2のTriAポリペプチド配列、またはそのバリアント、パラログ、オルソログ、もしくはホモログから導き出すことができる核酸分子であって、対応する、たとえば形質転換されていない、野生型の植物細胞、植物体または植物部位と比べて、増加した除草剤耐性もしくは抵抗性を与える前記核酸分子;(d) 配列番号1の核酸分子、またはそのバリアント、パラログ、オルソログ、もしくはホモログを含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と、30%以上の同一性を有し、好ましくは40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、もしくはそれ以上の同一性を有する核酸分子であって、対応する、たとえば形質転換されていない、野生型の植物細胞、植物体または植物部位と比べて、増加した除草剤耐性もしくは抵抗性を与える前記核酸分子;(e) 配列番号2のTriAポリペプチド配列のアミノ酸配列と、30%以上の同一性を有し、好ましくは40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、もしくはそれ以上の同一性を有する、変異型TriAポリペプチドをコードする核酸分子であって、対応する、たとえば形質転換されていない、野生型の植物細胞、植物体または植物部位と比べて、増加した除草剤耐性もしくは抵抗性を与える前記核酸分子;(f)ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で(a)、(b)、(c)、(d)もしくは(e)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子であって、対応する、たとえば形質転換されていない、野生型の植物細胞、植物体または植物部位と比べて、増加した除草剤耐性もしくは抵抗性を与える前記核酸分子;からなる一群から選択される、変異型TriAポリペプチドをコードする核酸を含む、単離された、および/または組換え技術で作製された、および/または合成の、核酸分子であって、その変異型TriAポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号2の次の位置:69、70、71、74、82、84、85、87、88、89、91、92、93、96、126、128、129、130、131、155、157、160、167、170、174、180、182、216、217、219、220、246、247、248、249、250、251、298、301、302、304、328に対応する1か所もしくは複数か所において、TriAポリペプチドの野生型アミノ酸配列とは異なる、前記核酸分子。

請求項18

請求項17に記載の核酸分子、および植物細胞において作動しうるプロモーターを含有する発現カセット

請求項19

プロモーターが、根に特異的なプロモーターである、請求項18に記載の発現カセット。

請求項20

請求項17に記載の核酸分子、または請求項18もしくは19に記載の発現カセットを含有するベクター

請求項21

請求項17に記載の核酸配列によりコードされる、単離された、組換えの、および/または化学合成された、変異型TriAポリペプチド、または配列番号2の配列に対して少なくとも80%、90%、95%、98%、99%の同一性を有するポリペプチド又はそのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログもしくはホモログであって、その変異型TriAポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号2の次の位置:69、70、71、74、82、84、85、87、88、89、91、92、93、96、126、128、129、130、131、155、157、160、167、170、174、180、182、216、217、219、220、246、247、248、249、250、251、298、301、302、304、328に対応する1か所もしくは複数か所において、TriAポリペプチドの野生型アミノ酸配列とは異なる、前記ポリペプチド。

請求項22

請求項1に記載の植物から植物産品を生産する方法であって、植物又はその植物部分を加工して植物産品を得るステップを含む方法。

請求項23

植物産品が飼料、種子ミール、油、又は種子処理コーティングした種子である、請求項22に記載の方法。

請求項24

植物又はその植物部分から得られた植物産品であって、植物又は植物部分はその細胞の少なくとも一部に、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、前記プロモーターは、前記ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与し、植物又は植物部分はさらに第2又は第3の除草剤耐性形質を示す、植物産品。

請求項25

前記産品が飼料、種子ミール、油、又は種子処理コーティングした種子である、請求項24に記載の植物産品。

技術分野

0001

本発明は、全体として、除草剤に対する農業ベル耐性を植物に付与する方法に関する。特に、本発明は、除草剤、より詳細には、セルロース生合成阻害し、したがって細胞壁生合成を妨害する除草剤に対して増大した耐性を有する植物に関する。

背景技術

0002

微生物は、環境中への生体異物投入に対して、そうした異物栄養源、ならびに増殖のためのエネルギー源として利用できるメカニズム進化させることによって対処することが多い。s-トリアジン環を基本とする除草剤の構造は、天然に存在する化合物とは異なるので(Esser et al. 1975)、微生物はそれらを分解することができる酵素および経路をゆっくりと進化させた。アミドヒドロラーゼスーパーファミリーは、炭素中心およびリン中心にアミドもしくはエステル官能基を有する、広範な基質加水分解触媒する注目すべき酵素群を含む。すべての場合において、単核もしくは二核金属中心との錯体形成によって求核性水分子活性化される。単核金属中心において、基質は活性部位からのプロトン移動により活性化され、水は金属のライゲーションおよび一般塩基触媒反応によって活性化される。金属中心は、(βα)8構造ドメイン内のβバレルコアC末端にある。顕著な一例が、除草剤であるアトラジン加水分解性脱塩素反応を触媒して、除草活性のない生成物2-ヒドロキシアトラジン(de Souza et al. 1996; Seffernick et al. 2002; Sadowsky and Wackett 2000)を生じる、アトラジンクロヒドロラーゼ(AtzA)Fe(II)依存性ホモヘキサマー(Seffernick et al. 2002; Wackett et al. 2002a)である。AtzAの既知のもっとも近い類縁体は、メラミンデアミナーゼシュードモナス属一種(Pseudomonas sp.)NRRL B-12227株に由来するTriA;98%配列同一性)である。配列類似性が高いにもかかわらず、AtzAおよびTriAは触媒性が異なる;TriAはデアミナーゼであって、その生理的なデアミナーゼ活性より何桁も低いデクロリナーゼ活性を伴うのに対して、AtzAは検出可能なデアミナーゼ活性を持たないデクロリナーゼである。先行研究によれば、2つのタンパク質の間で異なっている9つのアミノ酸のうち3つ(S331C;N328D;およびF84I AtzA)が、触媒特異性相違に大きな役割を果たす。

0003

本発明は、除草剤、具体的にはアジンと命名されたセルロース生合成阻害剤、を生分解する標的タンパク質をコードする細菌遺伝子の導入によって、植物における除草剤耐性を高めることができる、新たな方法を提供する。細菌酵素TriAは、アミドヒドロラーゼ活性のままであるか、もしくはアミドヒドロラーゼ活性を増大させる形で、ならびにより大きな基質の受入に向けて酵素ポケットを拡大する形で操作された。本発明の発明者らは、驚くべきことに、野生型もしくは変異型メラミンデアミナーゼTriA型の過剰発現が、植物において、それぞれ非形質転換および/または非変異誘発植物もしくは植物細胞と比べて、特定の種類の除草剤に対する耐性/抵抗性を与えることを見いだした。より詳細には、本発明の発明者らは、TriA発現がアジンに対する耐性/抵抗性を与えることを見いだした。

0004

本発明の課題は、その操作によって植物を除草剤に対して耐性にする標的ポリペプチドを同定することによる新規形質の提供と見ることができる。

0005

植物を除草剤に対して耐性にするために3つの主要な方策利用可能である:すなわち、(1)例えばブロモキシニル又はバスタに対する耐性のための酵素(EP242236、EP337899)のような、除草剤又はその活性な代謝産物無毒の生成物に変換する酵素で、除草剤を解毒すること、(2)例えばグリホセートに対する耐性のための酵素のような標的酵素を、除草剤又はその活性な代謝産物に対して感受性がより低い機能性の酵素に変異させること(EP293356、Padgette S. R. et al., J. Biol. Chem., 266, 33, 1991)、又は(3)その阻害剤の存在にも関わらず利用可能な十分な機能性の酵素を有するように、この酵素の速度定数を考慮して除草剤に対して充分な量の標的酵素を植物内に生成させるように感受性の酵素を過剰発現させること。

課題を解決するための手段

0006

上記課題は本発明の主題によって解決される。

0007

したがって、1つの態様において、本発明は、変異型TriAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物又は植物部分を提供し、前記ポリヌクレオチドの発現は、除草剤に対する耐性をその植物又は植物部分に付与する。

0008

幾つかの態様において、本発明は、植物細胞で作動可能プロモーターに作動可能に結合された(機能的に連結された)ポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物へと、発することができる種子を提供し、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する。

0009

1つの態様において、本発明は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物を再生することができる植物細胞を提供し、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与し、ここで本植物細胞は当該プロモーターに作動可能に結合した当該ポリヌクレオチドを含む。

0010

別の態様において、本発明は、細胞中で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む植物細胞を提供し、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する。

0011

他の態様において、本発明は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物又は植物部分から調製された植物産品(plant product)を提供し、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する。

0012

幾つかの態様において、本発明は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物に由来する子孫又は後裔植物を提供し、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、ここで子孫又は後裔植物は、その細胞の少なくとも一部に、当該プロモーターに作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドを含んでおり、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を子孫又は後裔植物に付与する。

0013

他の態様において、本発明は、植物の成長のための場所で雑草防除する方法を提供し、この方法は、(a)除草剤を含む除草剤組成物をその場所に適用し、(b)その場所に種子を植え付けるステップを含み、ここで種子は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物を生成することができ、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する。

0014

幾つかの態様において、本発明は、植物の成長のための場所で雑草を防除する方法を提供する。本方法は、除草剤を含む除草剤組成物をその場所に適用するステップを含み、ここで前記場所は、(a)植物若しくは前記植物を生成することができる種子を含有する場所、又は(b)前記適用後植物若しくは種子を含有することになる場所であり、ここで植物又は種子は、その細胞の少なくとも一部に、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する。

0015

1つの態様において、ステップ(a)はステップ(b)の前、後、又は同時に起こる。

0016

他の態様において、本発明は、除草剤に対する耐性を有する植物を生成する方法を提供する。本方法は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドで形質転換された植物細胞から植物を再生するステップを含み、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する。

0017

1つの態様において、本発明は、除草剤に対する耐性を有する子孫植物を生成する方法を提供する。本方法は、第1の除草剤に耐性の植物を第2の植物と交配して、除草剤に耐性の子孫植物を生成させるステップを含み、ここで第1の植物及び子孫植物は、それらの細胞の少なくとも一部に、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する。

0018

さらに、本発明は、配列番号1のヌクレオチド配列、又はその変異体ホモログパラログ若しくはオルソログを含む核酸によりコードされている本発明の野生型又は変異型TriAを使用することによって、除草剤を同定する方法に関する。

0019

前記方法は、
a)本発明の変異型TriAをコードする核酸を含み、本発明の変異型TriAが発現しているトランスジェニック細胞又は植物を作製するステップ、
b)除草剤を、a)のトランスジェニック細胞又は植物及び同じ変種(variety)の対照細胞又は植物に適用するステップ、
c)トランスジェニック細胞又は植物及び対照細胞又は植物の、前記試験化合物の適用後の成長又は生存能力を判定するステップ、及び
d)トランスジェニック細胞又は植物の成長と比較して低下した成長を対照細胞又は植物にもたらす試験化合物を選択するステップ
を含む。

0020

別の目的は、除草剤に対して抵抗性又は耐性の変異型TriAをコードするヌクレオチド配列を同定する方法に関する。この方法は、
a)変異型TriAをコードする核酸のライブラリーを作製するステップ、
b)得られた変異型TriAをコードする核酸の集団を、前記核酸の各々を細胞又は植物内で発現させ、前記細胞又は植物を、除草剤で処理することによってスクリーニングするステップ、
c)前記変異型TriAをコードする核酸の集団によりもたらされる除草剤に対する耐性のレベルを対照のTriAをコードする核酸によりもたらされる除草剤に対する耐性のレベルと比較するステップ、
d) 対照のTriAをコードする核酸によりもたらされるレベルと比較して有意に増大したレベルの除草剤に対する耐性をもたらす少なくとも1つの変異型TriAをコードする核酸を選択するステップ
を含む。

0021

好ましい実施形態において、ステップd)で選択される変異型TriAをコードする核酸は、対照のTriAをコードする核酸によりもたらされる耐性と比較して除草剤に対する少なくとも2倍の耐性をもたらす。

0022

抵抗性又は耐性は、ステップa)のライブラリーの核酸配列を含むトランスジェニック植物を作製し、前記トランスジェニック植物を対照植物と比較することによって判定することができる。

0023

別の目的は、変異型TriAをコードする単離された、組換え及び/又は化学合成された核酸に関し、この核酸は、配列番号1の配列、又は以下で定義されるようなその変異体を含む。

0024

好ましい実施形態は:
(a) 配列番号2の配列、またはそのバリアント、パラログ、オルソログ、もしくはホモログを含む変異型TriAポリペプチドをコードする核酸分子
(b) 配列番号1の配列、またはそのバリアント、パラログ、オルソログ、もしくはホモログを含む核酸分子;
(c)遺伝暗号縮重の結果として、配列番号2のTriAポリペプチド配列、またはそのバリアント、パラログ、オルソログ、もしくはホモログから導き出すことができる核酸分子であって、対応する、たとえば形質転換されていない、野生型の植物細胞、植物体または植物部位と比べて、増加した除草剤耐性もしくは抵抗性を与える前記核酸分子;
(d) 配列番号1の核酸分子、またはそのバリアント、パラログ、オルソログ、もしくはホモログを含むポリヌクレオチドの核酸分子配列と、30%以上の同一性を有し、好ましくは40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、もしくはそれ以上の同一性を有する核酸分子であって、対応する、たとえば形質転換されていない、野生型の植物細胞、植物体または植物部位と比べて、増加した除草剤耐性もしくは抵抗性を与える前記核酸分子;
(e) 配列番号2のTriAポリペプチド配列のアミノ酸配列と、30%以上の同一性を有し、好ましくは40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、もしくはそれ以上の同一性を有する、変異型TriAポリペプチドをコードする核酸分子であって、対応する、たとえば形質転換されていない、野生型の植物細胞、植物体または植物部位と比べて、増加した除草剤耐性もしくは抵抗性を与える前記核酸分子;
(f)ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で(a)、(b)、(c)、(d)もしくは(e)の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子であって、対応する、たとえば形質転換されていない、野生型の植物細胞、植物体または植物部位と比べて、増加した除草剤耐性もしくは抵抗性を与える前記核酸分子;
からなる一群から選択される変異型TriAポリペプチドをコードする核酸を含む、単離された、および/または組換え技術で作製された、および/または合成の、核酸分子に関するものであって、この変異型TriAポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号2の次の位置:69、70、71、74、82、84、85、87、88、89、91、92、93、96、126、128、129、130、131、155、157、160、167、170、174、180、182、216、217、219、220、246、247、248、249、250、251、298、301、302、304、328に対応する(相当する)1か所もしくは複数か所において、TriAポリペプチドの野生型アミノ酸配列と異なる。

0025

もう一つの目的は、本発明の核酸分子および植物細胞において作動しうるプロモーターを含有する発現カセットである。

0026

好ましくは、プロモーターはダイズ(Glycine max)由来の根に特異的な又は根において増強されたプロモーターである。

0027

もう1つの目的は、単離された、組換えの、および/または化学合成された、変異型TriAポリペプチドに関するが、そのポリペプチドは、以下に定義するように、配列番号2に記載の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログもしくはホモログを含む。

0028

好ましくは、変異型TriAポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号2の次の位置:69、70、71、74、82、84、85、87、88、89、91、92、93、96、126、128、129、130、131、155、157、160、167、170、174、180、182、216、217、219、220.、246、247、248、249、250、251、298、301、302、304、328に対応する1か所もしくは複数か所において、TriAポリペプチドの野生型アミノ酸配列と異なる。

0029

さらに別の態様において、本発明は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物又は植物部分を提供し、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与し、ここで、植物又は植物部分は第2又は第3の除草剤耐性形質をさらに示す。

0030

別の実施形態において、本発明は、本発明の野生型若しくは変異型TriA核酸により形質転換され、これを発現する植物細胞、又は本発明の野生型若しくは変異型TriA核酸を発現し、好ましくは過剰発現する植物を得るように突然変異した植物に関する。ここで、植物細胞内での前記核酸の発現は、植物細胞の野生型変種(wild type variety)と比較して除草剤に対する増大した抵抗性又は耐性をもたらす。

0031

別の実施形態において、本発明は、本発明の植物細胞を含む植物に関し、ここで、植物内での核酸の発現は、植物の野生型変種と比較して除草剤に対するその植物の増大した抵抗性をもたらす。

0032

好ましくは、植物における本発明の核酸の発現の結果、植物の野生型変種と比較して除草剤に対するその植物の増大した抵抗性が得られる。

0033

別の実施形態において、本発明は、本発明の植物細胞を含むトランスジェニック植物により生産される種子に関し、ここで、種子は、種子の野生型変種と比較して除草剤に対する増大した抵抗性について純育種系(true breeding)である。

0034

別の実施形態において、本発明は、野生型変種の植物細胞と比較して除草剤に対する増大した抵抗性を有するトランスジェニック植物細胞を生成する方法に関し、この方法は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む発現カセットで植物細胞を形質転換するステップを含み、当該プロモーターは当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができる。

0035

別の実施形態において、本発明は、トランスジェニック植物を生成する方法に関し、この方法は、(a)植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む発現カセットで植物細胞を形質転換させるステップであって、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができる、ステップ、及び(b)植物細胞から、除草剤に対する増大した抵抗性を有する植物を作製するステップ、を含む。

0036

好ましくは、発現カセットはさらに、植物で機能性の転写開始調節領域及び翻訳開始調節領域を含む。

図面の簡単な説明

0037

アジン類で処理されたダイズ植物体の発芽前耐性評価を示す。野生型(A)、ならびに4か所のアミノ酸置換、すなわちL92A_Y93L_M155T_F157Lを含有する配列番号2のtriA変異型バリアントを発現する遺伝子導入イベント(B)の表現型に関する生育結果。表示された値は、6-シクロペンチル-N4-(2,3,4,5,6-ペンタフルオロフェニル)-1,3,5-トリアジン-2,4-ジアミンの[g/ha]量を示す。各植物の上部は傷んだシュートを示し、下部は根の損傷を示す。
アジン類で処理されたトウモロコシ植物体の発芽前耐性評価を示す。野生型(A)、ならびに4か所のアミノ酸置換、すなわちL92A_Y93L_M155T_F157Lを含有する配列番号2のtriA変異型バリアントを発現する遺伝子導入イベント(B)の表現型に関する生育結果。表示された値は、6-シクロペンチル-N4-(2,3,4,5,6-ペンタフルオロフェニル)-1,3,5-トリアジン-2,4-ジアミンの[g/ha]量を示す。

0038

詳細な説明
明細書中詞「 a(1つの)」及び「an(1つの)」は、冠詞の文法上の対象の1つ以上(すなわち、少なくとも1つ)を指すために使用される。例を挙げると、「an element(要素)」とは1つ以上の要素を意味する。

0039

本明細書中で使用される場合、単語「含む(comprising)」又は「含む(comprises)」若しくは「含むこと(comprising)」のようなその変化形は陳述されている要素、整数若しくはステップ、又は一群の要素、複数の整数若しくはステップを包含することを示すが、他の要素、整数若しくはステップ、又は一群の要素、複数の整数若しくはステップを排除しないものと理解される。

0040

用語「望まれていない植生又は雑草の防除(control)」は、雑草を死滅させること、及び/又はさもなければ雑草の通常の成長を遅らせる又は阻害することを意味すると理解される。雑草とは、最も広い意味で、それが望まれていない場所で生育するあらゆる植物を意味すると理解される。本発明でいう雑草には、例えば、双子葉植物及び単子葉植物の雑草が含まれる。双子葉植物の雑草としては、限定されることはないが、シロガラシ属(Sinapis)、レピジウム属(Lepidium)、ガリウム属(Galium)、ハコベ属(Stellaria)、マトリカリア属(Matricaria)、アンセミス属(Anthemis)、コゴメギク属(Galinsoga)、アカザ属(Chenopodium)、イラクサ属(Urtica)、キオン属(Senecio)、アマランサス属(Amaranthus)、スベリヒユ属(Portulaca)、オナモミ属(Xanthium)、コンボルブルス属(Convolvulus)、サツマイモ属(Ipomoea)、タデ属(Polygonum)、セスバニア属(Sesbania)、アンブロシア属(Ambrosia)、アザミ属(Cirsium)、ヒレアザミ属(Carduus)、ノゲシ属(Sonchus)、ナス属(Solanum)、イヌガラシ属(Rorippa)、キカシグサ属(Rotala)、アゼナ属(Lindernia)、ラミウム属(Lamium)、ベロニカ属(Veronica)、アブチロン属(Abutilon)、エメックス属(Emex)、チョウセンアサガオ属(Datura)、ビオラ属(Viola)、ガレオプシス属(Galeopsis)、ケシ属(Papaver)、ヤグルマギク属(Centaurea)、シャジクソウ属(Trifolium)、キンポウゲ属(Ranunculus)、及びタンポポ属(Taraxacum)の雑草がある。単子葉植物の雑草としては、限定されることはないが、ヒエ属(Echinochloa)、エノコログサ属(Setaria)、キビ属(Panicum)、メヒシバ属(Digitaria)、アワガエリ属(Phleum)、イチゴツナギ属(Poa)、ウシノケグサ属(Festuca)、オヒシバ属(Eleusine)、ブラキアリア属(Brachiaria)、ドクムギ属(Lolium)、スズメノチャヒキ属(Bromus)、カラスムギ属(Avena)、カヤツリグサ属(Cyperus)、モロコシ属(Sorghum)、コムギダマシ属(Agropyron)、ギョウギシバ属(Cynodon)、ミズアオイ属(Monochoria)、テンツキ属(Fimbristyslis)、オモダカ属(Sagittaria)、ハリイ属(Eleocharis)、ホタルイ属(Scirpus)、スズメノヒエ属(Paspalum)、カモノハシ属(Ischaemum)、ナガボノウルシ属(Sphenoclea)、タツノツメガヤ属(Dactyloctenium)、ヌカボ属(Agrostis)、スズメノテッポウ属(Alopecurus)、及びアペラ属(Apera)の雑草がある。加えて、本発明の雑草には、例えば、望まれていない場所で生育する作物植物が含まれ得る。例えば、主としてダイズ植物が生育する自生トウモロコシ植物は、ダイズ植物の畑でトウモロコシ植物が望まれていない場合雑草であると考えることができる。

0041

用語「植物」は、有機材料に関するものとしてその最も広い意味で使用されており、植物界(Kindom Plantae)の一員である真核生物を包含することが意図されており、その例としては、限定されることはないが、維管束植物野菜穀類、花、木、草、低木芝生つる植物シダコケ菌類及び藻類など、並びにクローン側枝、及び無性繁殖に使われる植物の一部(例えば、切り取り部分管状構造(piping)、シュート、根茎地下茎塊根(clump)、樹冠球根球茎塊茎、根茎、組織培養で生産された植物/組織、等)がある。用語「植物」はさらに、植物全体、植物及び植物部分の祖先及び子孫、例えば、種子、シュート、、葉、根(塊茎を含む)、花、小花果実、柄、花柄雄しべ柱頭花柱子房花弁萼片心皮根端根冠根毛、葉毛、種子毛、花粉粒小胞子子葉胚軸上胚軸木部師部柔組織内胚乳伴細胞孔辺細胞、並びに植物の任意のその他公知の器官、組織、及び細胞、並びに組織及び器官を包含し、ここで上記のものは各々が対象の遺伝子/核酸を含む。また、用語「植物」は、植物細胞、懸濁培養物、カルス組織、分裂組織部位、配偶体胞子体花粉及び小胞子も包含し、ここでも上記のものは各々が対象の遺伝子/核酸を含む。

0042

本発明の方法で特に有用な植物には、スーパーファミリー緑色植物亜界(Viridiplantae)に属するあらゆる植物、中でも特にカエデ属種 (Acer spp.)、マタタビ属種(Actinidia spp.)、トロロアオイ属種(Abelmoschus spp.)、サイザルアサ(Agave sisalana)、コムギダマシ属種(Agropyron spp.)、ハイコヌカグサ(Agrostis stolonifera)、ネギ属種(Allium spp.)、アマランサス属種(Amaranthus spp.)、アンモフィラ・アレナリア(Ammophila arenaria)、パイナップル(Ananas comosus)、バンレイシ属種(Annona spp.)、セロリ(Apium graveolens)、ナンキンマメ属種(Arachis spp)、パンノキ属種(Artocarpus spp.)、アスパラガス(Asparagus officinalis)、カラスムギ属種(Avena spp.)(例えば、エンバク(Avena sativa)、カラスムギ(Avena fatua)、ビザンチンエンバク(Avena byzantina)、アベナファツア・バルサティバ(Avena fatua var. sativa)、アベナ・ヒブリダ(Avena hybrida))、スターフルーツ(Averrhoa carambola)、ホウライチク属種(Bambusa sp.)、トウガン(Benincasa hispida)、ブラジルナッツ(Bertholletia excelsea)、テンサイ(Beta vulgaris)、アブラナ属種(Brassica spp.)(例えば、セイヨウアブラナ(Brassica napus)、ブラッシカ・ラパ属種(Brassica rapa ssp.)[カノーラナタネアブラナ])、カダバ・ファリノサ(Cadaba farinosa)、チャノキ(Camellia sinensis)、ダンドク(Canna indica)、アサ(Cannabis sativa)、トウガラシ属種(Capsicum spp.)、カレックスエラタ(Carex elata)、パパイア(Carica papaya)、オオバナカリッサ(Carissa macrocarpa)、ペカン属種(Carya spp.)、ベニバナ(Carthamus tinctorius)、クリ属種(Castanea spp.)、カポック(Ceiba pentandra)、エンダイブ(Cichorium endivia)、ニッケイ属種(Cinnamomum spp.)、スイカ(Citrullus lanatus)、ミカン属種(Citrus spp.)、ココヤシ属種(Cocos spp.)、コーヒー属種(Coffea spp.)、サトイモ(Colocasia esculenta)、コラノキ属種(Cola spp.)、ツナソ属種(Corchorus sp.)、コリアンダー(Coriandrum sativum)、ハシバミ属種(Corylus spp.)、サンザシ属種(Crataegus spp.)、サフラン(Crocus sativus)、カボチャ属種(Cucurbita spp.)、キュウリ属種(Cucumis spp.)、チョウセンアザミ属種(Cynara spp.)、ニンジン(Daucus carota)、ヌスビトハギ属種(Desmodium spp.)、リュウガン(Dimocarpus longan)、ヤマノイモ属種(Dioscorea spp.)、カキノキ属種(Diospyros spp.)、ヒエ属種(Echinochloa spp.)、アブラヤシ属(Elaeis)(例えば、ギニアアブラヤシ(Elaeis guineensis)、アメリカアブラヤシ(Elaeis oleifera))、シコクビエ(Eleusine coracana)、テフ(Eragrostis tef)、エリアンサス属種(Erianthus sp.)、ビワ(Eriobotrya japonica)、ユーカリ属種(Eucalyptus sp.)、ピタンガ(Eugenia uniflora)、ソバ属種(Fagopyrum spp.)、ブナ属種(Fagus spp.)、オニウシノケグサ(Festuca arundinacea)、イチジク(Ficus carica)、キンカン属種(Fortunella spp.)、オランダイチゴ属種(Fragaria spp.)、イチョウ(Ginkgo biloba)、ダイズ属種(Glycine spp.)(例えば、ダイズ(Glycine max)、Soja hispida又はSoja max)、ワタ(Gossypium hirsutum)、ヒマワリ属種(Helianthus spp.)(例えば、ヒマワリ(Helianthus annuus))、ワスレグサ(Hemerocallis fulva)、フヨウ属種(Hibiscus spp.)、オオムギ属種(Hordeum spp.)(例えば、オオムギ(Hordeum vulgare))、サツマイモ(Ipomoea batatas)、クルミ属種(Juglans spp.)、レタス(Lactuca sativa)、レンリソウ属種(Lathyrus spp.)、レンズマメ(Lens culinaris)、アマ(Linum usitatissimum)、レイシ(Litchi chinensis)、ミヤコグサ属種(Lotus spp.)、トカドヘチマ(Luffa acutangula)、ルピナス属種(Lupinus spp.)、オオスズメノヤリ(Luzula sylvatica)、トマト属種(Lycopersicon spp.)(例えば、トマト(Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme)、マクロチロマ属種(Macrotyloma spp.)、リンゴ属種(Malus spp.)、アセロラ(Malpighia emarginata)、マメイリンゴ(Mammea americana)、マンゴー(Mangifera indica)、イモノキ属種(Manihot spp.)、サポジラ(Manilkara zapota)、ムラサキウマゴヤシ(Medicago sativa)、シナガワハギ属種(Melilotus spp.)、ハッカ属種(Mentha spp.)、ススキ(Miscanthus sinensis)、ツルレイシ属種(Momordica spp.)、クロミグワ(Morus nigra)、バショウ属種(Musa spp.)、タバコ属種(Nicotiana spp.)、オリーブ属種(Olea spp.)、ウチワサボテン属種(Opuntia spp.)、オルニソバス属種(Ornithopus spp.)、イネ属種(Oryza spp.)(例えば、イネ(Oryza sativa, Oryza latifolia))、キビ(Panicum miliaceum)、スイッチグラス(Panicum virgatum)、パッションフルーツ(Passiflora edulis)、パースニップ(Pastinaca sativa)、チカラシバ属種(Pennisetum sp.)、ワニナシ属種(Persea spp.)、パセリ(Petroselinum crispum)、クサヨシ(Phalaris arundinacea)、インゲンマメ属種(Phaseolus spp.)、オオアワガエリ(Phleum pratense)、ナツメヤシ属種(Phoenix spp.)、ヨシ(Phragmites australis)、ホオズキ属種(Physalis spp.)、マツ属種(Pinus spp.)、ピスチオ(Pistacia vera)、エンドウ属種(Pisum spp.)、イチゴツナギ属種(Poa spp.)、ポプラ属種(Populus spp.)、プロソピス属種(Prosopis spp.)、サクラ属種(Prunus spp.)、バンジロウ属種(Psidium spp.)、ザクロ(Punica granatum)、セイヨウナシ(Pyrus communis)、カシ属種(Quercus spp.)、ハツカダイコン(Raphanus sativus)、ダイオウ(Rheum rhabarbarum)、スグリ属種(Ribes spp.)、トウゴマ(Ricinus communis)、キイチゴ属種(Rubus spp.)、サトウキビ属種(Saccharum spp.)、ヤナギ属種(Salix sp.)、ニワトコ属種(Sambucus spp.)、ライムギ(Secale cereale)、ゴマ属種(Sesamum spp.)、シロガラシ属種(Sinapis sp.)、ナス属種(Solanum spp.)(例えば、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、アカナス(Solanum integrifolium)又はトマト(Solanum lycopersicum))、モロコシ(Sorghum bicolor)、ホウレンソウ属種(Spinacia spp.)、フトモモ属種(Syzygium spp.)、コウオウソウ属種(Tagetes spp.)、タマリンド(Tamarindus indica)、カカオ(Theobroma cacao)、シャジクソウ属種(Trifolium spp.)、トリプサクム・ダクチロイデス(Tripsacum dactyloides)、トリチコセカレ・リンパウイ(Triticosecale rimpaui)、コムギ属種(Triticum spp.)(例えば、パンコムギ(Triticum aestivum)、デュラムコムギ(Triticum durum)、マカロニコムギ(Triticum turgidum)、トリチカム・ハイベルナム(Triticum hybernum)、トリチカム・マチャ(Triticum macha)、コムギ(Triticum sativum)、ヒトツブコムギ(Triticum monococcum)又はトリチカム・ブルガレ(Triticum vulgare))、トロパオルム・ミヌス(Tropaeolum minus)、キンレンカ(Tropaeolum majus)、スノキ属種(Vaccinium spp.)、ソラマメ属種(Vicia spp.)、ササゲ属種(Vigna spp.)、ニオイスミレ(Viola odorata)、ビティス属種(Vitis spp.)、トウモロコシ(Zea mays)、ワイルドライス(Zizania palustris)、ナツメ属種(Ziziphus spp.)、アマランスアーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリ芽キャベツキャベツ、カノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、カラードグリーン(collard green)、亜麻ケール、レンズマメ、ナタネ、オクラタマネギ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、イチゴサトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、カボチャチャ及び藻類を含むリストから選択される飼料若しくは飼い葉用マメ科植物観賞用植物食用作物、木又は潅木を含めた単子葉及び双子葉植物が包含される。本発明の好ましい実施形態によると、植物は作物植物である。作物植物の例には、とりわけ、ダイズ、ヒマワリ、カノーラ、アルファルファ、ナタネ、ワタ、トマト、ジャガイモ又はタバコがある。さらに好ましくは、植物はサトウキビのような単子葉植物である。さらに好ましくは、植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、キビ、ライムギ、モロコシ又はオートムギのような穀類である。

0043

一般に、本明細書中で、用語「除草剤」は、植物を死滅させ、防除し、又はさもなければ植物の成長を不利に変更する活性成分を意味して使用されている。除草剤の好ましい量又は濃度は「有効な量」又は「有効な濃度」である。「有効な量」及び「有効な濃度」とは、それぞれ、同様な野生型の植物、植物組織、植物細胞、又は宿主細胞の成長を死滅させる又は阻害するのに充分な量及び濃度を意味するが、前記量は本発明の除草剤に抵抗性の植物、植物組織、植物細胞、及び宿主細胞を死滅させるか又はその成長をひどく阻害することはない。通例、除草剤の有効量は、農業生産システムにおいて対象の雑草を死滅させるために日常的に使用される量である。そのような量は当業者に公知である。除草活性は、本発明に有用な除草剤を直接植物に、又は任意の成長段階の若しくは植え付け前若しくは出芽前の植物の場所に適用したとき、その除草剤によって示される。観察される効果は、防除される植物種、植物の成長段階、希釈度及び噴霧液滴サイズの適用パラメーター、固体成分の粒度、使用時の環境条件、使用される具体的な化合物、使用される特定のアジュバント及び担体土壌の種類、など、並びに適用される化学品の量に依存する。これら及びその他の要因は、非選択的又は選択的な除草作用増進するために当技術分野で公知のようにして調節することができる。一般に、除草剤処置は、PPIプレ−植物組込み)、PPSA(ポスト植物表面適用)、発芽前若しくは発芽後により適用することができる。発芽後処置は典型的には、比較的未成熟な望ましくない植生になされ雑草の最大の防除を達成する。

0044

「除草剤耐性」又は「除草剤抵抗性」の植物とは、正常又は野生型の植物を通常死滅させるか又はその成長を阻害するレベルの少なくとも1種の除草剤に対して耐性又は抵抗性の植物を意味する。非耐性植物の成長を通常阻害する除草剤のレベルは当業者に公知であり、容易に決定することができる。例として、製造業者が適用のために推奨する量がある。最大の割合は、非耐性植物の成長を通常阻害する除草剤の量の一例である。本発明において、用語「除草剤耐性の」及び「除草剤抵抗性の」は同義に使用され、同等の意味及び同等の範囲を有することが意図されている。同様に、用語「除草剤耐性」及び「除草剤抵抗性」は同義に使用され、同等の意味及び同等の範囲を有することが意図されている。同様に、用語「耐性」及び「抵抗性」は同義に使用され、同等の意味及び同等の範囲を有することが意図されている。本明細書中で使用される場合、その様々な実施形態で有用な除草剤組成物について、除草剤、などのような用語は、当技術分野で認識されている農学的許容される除草剤活性成分(A.I.)を指す。同様に、殺菌剤殺線虫剤殺虫剤、などのような用語は当技術分野で認められている他の農学的に許容される活性成分を指す。

0045

特定の突然変異体酵素又はポリペプチドに関連して使用されるとき、除草剤耐性の及び除草剤耐性のような用語は、そのような酵素又はポリペプチドが、前記酵素又はポリペプチドの野生型(非突然変異)の活性を通常不活性化又は阻害する量の除草剤A.I.の存在下でその生理学的な活性を発揮する能力に関する。他方、特にTriA酵素に関して使用されるときは、この用語は具体的に、セルロース生合成を阻害する除草剤、いわゆるセルロース生合成阻害剤(CBI)を代謝しそれにより不活化する能力をいう。「除草剤耐性の変異型TriAタンパク質」又は「除草剤抵抗性の変異型TriAタンパク質」とは、そのようなTriAタンパク質が、セルロース生合成を妨げることが知られている少なくとも1種の除草剤の存在下、セルロース生合成を阻害することが知られている該除草剤の濃度又はレベルで、野生型TriAタンパク質の代謝活性と比べて、より高い代謝活性を示すことを意味している。また、そのような除草剤耐性又は除草剤抵抗性の変異型TriAタンパク質のTriA活性は本明細書中で「除草剤耐性の」又は「除草剤抵抗性の」TriA活性ということがある。

0046

本明細書中で使用される場合、核酸又はポリペプチドに関連して「組換え」とは、そのような物質が、ポリヌクレオチドの制限切断及び連結、ポリヌクレオチドの重複伸長、又はゲノムの挿入若しくは形質転換によるような組換え技術のヒト適用の結果として変更されていることを示す。遺伝子配列オープンリーディングフレームは、そのヌクレオチド配列がその天然の文字列から取り出され、何らかの種類の人工核酸ベクタークローン化されている場合は組換え体である。用語組換えはまた組換え物質を有する生物も指すことができ、例えば、組換え核酸を含む植物は組換え植物と考えることができる。

0047

用語「トランスジェニック植物」は異種のポリヌクレオチドを含む植物をいう。好ましくは、異種のポリヌクレオチドはゲノム内に安定に組み込まれているので、このポリヌクレオチドは代々引き継がれる。異種のポリヌクレオチドは単独で、又は組換え発現カセットの一部としてゲノム内に組み込まれ得る。「トランスジェニック」は、本明細書中で、最初にそのように変更されたトランスジェニック生物又は細胞、及びその最初のトランスジェニック生物又は細胞から交配又は無性繁殖によって創出されたものを含めて、異種の核酸の存在によりそのように変更されている遺伝子型を有するあらゆる細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分又は植物を指すのに使用されている。幾つかの実施形態において、「組換え」生物は「トランスジェニック」生物である。用語「トランスジェニック」は、本明細書中で使用される場合、慣用植物育種方法(例えば、交配)又は例えば自家受精無作為交雑受精、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位、若しくは自然突然変異のような天然事象によるゲノム(染色体又は染色体外)の変更を包含することを意図していない。

0048

本明細書中で使用される場合、「突然変異誘発された」とは、対応する野生型の生物又はDNAの遺伝物質の配列と比較してその天然の遺伝物質の生体分子の配列に変更を有する生物又はそのDNAに関連し、ここで遺伝物質の変更はヒトの行為によって誘発及び/又は選抜されたものである。突然変異誘発された生物又はDNAを生成させるのに使用することができるヒトの行為の例として、限定されることはないが、EMSのような化学的突然変異原による処理及びその後の除草剤による選抜、又は植物細胞のX線による処理及びその後の除草剤による選抜がある。当技術分野で公知のあらゆる方法を使用して突然変異を誘発することができる。突然変異を誘発する方法は遺伝物質のランダムな位置で突然変異を誘発することができ、又はジェノプラスティ(genoplasty)技術を使用するといったように遺伝物質の特定の位置に突然変異を誘発することができる(すなわち、定方向突然変異誘発技術であってよい)。

0049

本明細書中で使用される場合、「遺伝子改変された生物」(GMO)は、その遺伝子特性が、別の若しくは「起源生物由来の遺伝物質又は合成若しくは改変された天然の遺伝物質による、標的生物の形質転換という結果となるトランスフェクションを起こすヒトの努力により生成した変更を含有する生物、又はその後裔であって挿入された遺伝物質を保持する生物である。起源生物は異なる種類の生物である(例えば、GMO植物は細菌性遺伝物質を含有することができる)又は同じ種類の生物である(例えば、GMO植物は別の植物の遺伝物質を含有することができる)ことができる。植物及び他の生物に関して本明細書中で使用される場合、「組換え」、「トランスジェニック」及び「GMO」は同義語と考えられ、異なる起源由来の遺伝物質の存在を示す。対照的に、「突然変異誘発された」は、そのようなトランスジェニック物質が存在するが、天然の遺伝物質が対応する野生型生物又はDNAとは異なるように突然変異させられている植物若しくは他の生物、又はそのDNAを指して使用される。

0050

本明細書中で使用される場合、「野生型」又は「対応する野生型植物」は、通常存在するように、例えば突然変異誘発された及び/又は組換え形態とは識別される典型的な形態の生物又はその遺伝物質を意味する。同様に、「対照細胞」又は「同様な野生型の植物、植物組織、植物細胞又は宿主細胞」とは、それぞれ、本明細書中に開示されている本発明の除草剤抵抗特性及び/又は特定のポリヌクレオチドを欠く植物、植物組織、植物細胞、又は宿主細胞を意味する。したがって、用語「野生型」の使用は、植物、植物組織、植物細胞、若しくは他の宿主細胞が、そのゲノム内に組換えDNAを欠く、及び/又は本明細書中に開示されているものとは異なる除草剤抵抗特性を保有しないことを示す意図はない。

0051

本明細書中で使用される場合、「後裔」とはあらゆる世代の植物をいう。幾つかの実施形態において、後裔は第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、又は第10世代の植物である。

0052

本明細書中で使用される場合、「子孫」とは第1世代の植物をいう。

0053

用語「種子」は、例えば真の種子、穀果そう果、果実、塊茎、苗木及び類似の形態のようなあらゆる種類の種子を含む。アブラナ属(Brassica)及びシナピス属種の関連で、「種子」は他に特定されない限り真の種子をいう。例えば、種子は、トランスジェニック植物又は従来の育種方法により得られる植物の種子であってよい。従来の育種方法の例として、当技術分野で公知のように、交雑育種、自植、戻し交配、胚救出、系内交配(in-crossing)、異系交配同系交配、選抜、無性繁殖、及びその他従来の技術を挙げることができる。

0054

特定の植物又は植物変種及びそれらの雑種に関連して例示されているが、様々な実施形態において、本明細書に記載されている除草剤を用いる方法は商業的に価値のある植物の変種で使用することができる。本発明に有用であるとして記載されている除草剤に耐性の植物系統は、雑草防除方法において、直接又は間接に、すなわち除草剤処理のための作物として、又は、そのような1以上の形質を含有する他の変種及び/又は雑種作物を作製するために、成長のための除草剤に耐性の形質ドナー系統として、使用することができる。そのようにして得られた、先祖の除草剤に耐性の1以上の形質を含有する変種又は雑種作物は全て、本発明で、先祖の除草剤に耐性の系統の子孫又は後裔ということができる。そのように得られる植物は先祖の植物の「除草剤耐性特性」を保持するということができ、すなわち、それらがその形質を担う先祖の遺伝的分子成分を保有し発現することを意味する。

0055

1つの態様において、本発明は、変異型TriAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物又は植物部分を提供し、前記ポリヌクレオチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物又は植物部分に付与する。

0056

好ましい実施形態において、本植物は、以下により詳細に記載するように、本発明の野生型又は変異型TriA導入遺伝子を導入し過剰発現させることによって、組換えにより植物を作製するステップを含む方法により前もって生産されている。

0057

別の実施形態において、変異型TriAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1に記載の核酸配列、又はその変異体若しくは誘導体を含む。

0058

他の実施形態において、本発明に従って使用される変異型TriAポリペプチドは、変異体の全長にわたって、配列番号2に対して少なくとも約80%、例として、少なくとも約80%、90%、95%、98%、又は99%以上のアミノ酸配列同一性を有する機能性変異体である。

0059

別の実施形態において、本発明に従って使用される変異型TriAポリペプチドは、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能性断片である。

0060

本発明のTriAポリヌクレオチド分子及びTriAポリペプチドは、配列番号1に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号2に記載のアミノ酸配列と充分に同一であるヌクレオチド又はアミノ酸配列を含むポリヌクレオチド分子及びポリペプチドを包含することが分かる。用語「充分に同一」は、本明細書中で、第1及び第2のアミノ酸又はヌクレオチド配列が共通の構造ドメイン及び/又は共通の機能活性を有するように第2のアミノ酸又はヌクレオチド配列に対して充分な又は最小の数の同一又は等価な(例えば、類似の側鎖を有する)アミノ酸残基又はヌクレオチドを含有する第1のアミノ酸又はヌクレオチド配列を指すのに使用されている。

0061

一般に、「配列同一性」とは、2つの最適に整列させたDNA又はアミノ酸配列が構成成分、例えばヌクレオチド又はアミノ酸のアラインメントウインドー枠内で不変である程度をいう。試験配列及び基準配列の整列させたセグメントに対する「同一性の割合」は、2つの整列させた配列が共有する同一の構成成分の数を、基準配列セグメント、すなわち基準配列全体又は基準配列のより小さい定められた部分内の構成成分の総数で割った値である。「同一性パーセント」は同一性の割合×100である。比較ウインドー枠を整列させるための配列の最適のアラインメントは当業者に周知であり、Smith及びWatermanのローカルホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunschのホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson及びLipmanの類似性検索法のような手段により、好ましくはGCG. Wisconsin Package (Accelrys Inc. Burlington, Mass.)の一部として入手可能なGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTAのようなこれらのアルゴリズムのコンピューター化された実行により実施することができる。

0062

ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド
DNA、RNA、又はこれらの組合せ、一本鎖又は二本鎖センス若しくはアンチセンス配向又は両方の組合せ、dsRNAその他を含めて「単離されたポリヌクレオチド」とは、その天然の状態では会合又は結合しているポリヌクレオチド配列から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、天然では会合している他の成分を少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、最も好ましくは少なくとも90%含まない。熟練者には分かるように、単離されたポリヌクレオチドは、例えば、生来そのポリヌクレオチドを含まないトランスジェニック生物内に存在する外因性のポリヌクレオチドであることができる。また、用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」は本明細書中で同義に使用されており、任意の長さのポリマー性分岐してない形態のリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド又は両者の組合せのいずれかであるヌクレオチドを指す。

0063

用語「変異型TriA核酸」は、野生型TriA核酸から突然変異しており、除草剤に対する増大した耐性を、これが発現している植物に付与する配列を有するTriA核酸をいう。また、用語「変異型メラミンデアミナーゼ(変異型TriA)」は、配列番号2の野生型一次配列又はその変異体、誘導体、ホモログ、オルソログ、若しくはパラログのアミノ酸の別のアミノ酸による置換を指していう。「突然変異アミノ酸」という表現は以下で別のアミノ酸で置換されるアミノ酸を指称するために使用され、したがってタンパク質の一次配列中の突然変異の部位を指す。

0064

好ましい実施形態において、変異型TriAをコードするTriAヌクレオチド配列は配列番号1の配列、又はその変異体若しくは誘導体を含む。

0065

また、当業者には理解されるように、TriAヌクレオチド配列は以下で定義されるように配列番号1のホモログ、パラログ及びオルソログを包含する。

0066

配列(例えば、ポリペプチド又は、例えば本発明の転写調節ヌクレオチド配列のような核酸配列)に関して用語「変異体」とは、実質的に類似の配列を意味することが意図されている。オープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列について、変異体は遺伝子コードの縮重のため天然のタンパク質と同一のアミノ酸配列をコードする配列を含む。これらのような天然に存在する対立遺伝子変異体は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及びハイブリダイゼーション技術のような周知の分子生物学技術を用いて同定することができる。変異体ヌクレオチド配列はまた、例えば部位特異的突然変異誘発を用いることにより作製され、オープンリーディングフレームが配列番号2の配列を含む天然のタンパク質をコードするもの、及び天然のタンパク質と比べてアミノ酸置換を有するポリペプチド、例えば本明細書に開示されているような本発明の変異型TriAをコードするもののような合成誘導されたヌクレオチド配列も含む。一般に、本発明のヌクレオチド配列変異体は、配列番号1のヌクレオチド配列と少なくとも30、40、50、60、から70%まで、例えば、好ましくは71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、から79%まで、一般に少なくとも80%、例えば、81%〜84%、少なくとも85%、例えば、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、から98%及び99%までのヌクレオチド「配列同一性」を有する。ポリヌクレオチドの同一性%はギャップ生成ペナルティー=5、及びギャップ伸長ペナルティー=0.3のGAP(Needleman及びWunsch、1970)解析(GCGプログラム)で決定される。他に断らない限り、問合せ配列は長さが少なくとも45ヌクレオチドであり、GAP解析は少なくとも45ヌクレオチドの領域にわたって2つの配列を整列させる。好ましくは、問合せ配列が少なくとも150ヌクレオチドの長さであり、GAP解析は少なくとも150ヌクレオチドの領域にわたって2つの配列を整列させる。より好ましくは、問合せ配列が少なくとも300ヌクレオチドの長さであり、GAP解析は少なくとも300ヌクレオチドの領域にわたって2つの配列を整列させる。さらにより好ましくは、GAP解析で2つの配列をそれらの全長にわたって整列させる。

0067

ポリペプチド
「実質的に精製されたポリペプチド」又は「精製された」とは、その天然の状態では会合している1つ以上の脂質、核酸、他のポリペプチド、又はその他の夾雑分子から分離されているポリペプチドを意味する。実質的に精製されたポリペプチドは生来会合している他の構成成分を少なくとも60%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%含まないことが好ましい。熟練者には分かるように、精製されたポリペプチドは組換え生産されたポリペプチドであることができる。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は一般に同義に使用されており、非アミノ酸基の付加により改変されていてもいなくてもよい単一のポリペプチド鎖を指す。そのようなポリペプチド鎖は他のポリペプチド若しくはタンパク質又は補因子のような他の分子と会合していてもよいと理解される。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、本明細書に記載されている本発明のポリペプチドの変異体、突然変異体、修飾体類似体及び/又は誘導体も含む。

0068

ポリペプチドの同一性%はギャップクリエーションペナルティー=5、及びギャップ伸長ペナルティー=0.3のGAP(Needleman及びWunsch、1970)解析(GCGプログラム)により決定される。問合せ配列は長さが少なくとも25アミノ酸であり、GAP解析は少なくとも25アミノ酸の領域にわたって2つの配列を整列させる。より好ましくは、問合せ配列が少なくとも50アミノ酸の長さであり、GAP解析は少なくとも50アミノ酸の領域にわたって2つの配列を整列させる。より好ましくは、問合せ配列ば少なくとも100アミノ酸の長さであり、GAP解析で2つの配列を少なくとも100アミノ酸の領域にわたって整列させる。さらにより好ましくは、問合せ配列が少なくとも250アミノ酸長であり、GAP解析で2つの配列を少なくとも250アミノ酸の領域にわたって整列させる。さらにより好ましくは、GAP解析では2つの配列をそれらの全長にわたって整列させる。

0069

定められたポリペプチドに関して、上記よりも大きい同一性%の数字は好ましい実施形態を包含することが了解される。したがって、該当する場合、最小の同一性%の数字の観点から、本発明のTriAポリペプチドは、配列番号2と少なくとも40%、より好ましくは少なくとも45%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも55%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも91%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも93%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、より好ましくは少なくとも99.1%、より好ましくは少なくとも99.2%、より好ましくは少なくとも99.3%、より好ましくは少なくとも99.4%、より好ましくは少なくとも99.5%、より好ましくは少なくとも99.6%、より好ましくは少なくとも99.7%、より好ましくは少なくとも99.8%、さらにより好ましくは少なくとも99.9%同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。

0070

「変異体(バリアント)」ポリペプチドとは、天然のタンパク質のN末端及び/又はC末端への1つ以上のアミノ酸の欠失(いわゆるトランケーション)若しくは付加、天然のタンパク質の1つ以上の部位における1つ以上のアミノ酸の欠失若しくは付加、又は天然のタンパク質の1つ以上の部位における1つ以上のアミノ酸の置換によって配列番号2のタンパク質から誘導されたポリペプチドを意味する。そのような変異体は、例えば遺伝子多型又はヒトの操作の結果であってもよい。そのような操作の方法は当技術分野で広く知られている。

0071

タンパク質の「誘導体」は、問題の未改変タンパク質と比べてアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を有し、由来元の未改変タンパク質と同様な生物学的及び機能的活性を有するペプチドオリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を包含する。したがって、TriAポリペプチドの機能性の変異体及び断片、並びにそれらをコードする核酸分子も、特に他に記載しない限り前記ポリペプチドの起源に関わりなく、また天然に存在するか否かに関わりなく本発明の範囲内である。TriAポリペプチドの機能性のための様々なアッセイを使用することができる。例えば、TriAポリペプチドの機能性変異体又は断片をアッセイして、その除草剤に対する解毒作用を付与する能力を判定することができる。例として、除草剤に対する解毒速度は、TriAポリペプチドの変異体又は断片をコードする組換えポリヌクレオチドを含む植物又は植物部分において、除草剤に対する耐性の判定可能な増大を提供するのに充分な、触媒反応速度と定義することができ、ここで植物又は植物部分は、変異体又は断片を発現しない同様に処理された対照植物と比べて全細胞タンパク質の約0.5%まで、例として約0.05〜約0.5%、約0.1〜約0.4%、及び約0.2〜約0.3%の変異体又は断片を発現する。

0072

好ましい実施形態において、変異型TriAポリペプチドは配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するメラミンデアミナーゼの機能性の変異体又は断片であり、ここで機能性の変異体又は断片は配列番号2に対して少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する。

0073

他の実施形態において、機能性変異体又は断片はさらに、除草剤解毒速度を有しており、これは、変異体又は断片をコードする組換えポリヌクレオチドを含む植物又は植物部分(ここで植物又は植物部分は、変異体又は断片を発現しない同様に処理された対照植物と比べて全細胞タンパク質の約0.5%までの変異体又は断片を発現する)において、除草剤に対する耐性の判定可能な増大を提供するのに充分な、触媒反応速度と定義される。

0074

タンパク質の「ホモログ」は、問題の未改変タンパク質と比べてアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入を有し、由来元の未改変タンパク質と同様な生物学的及び機能的活性を有するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を包含する。

0075

加えて、当業者にはさらに理解されるように、突然変異によって本発明のヌクレオチド配列に変更を導入することにより、コードされているタンパク質の生物学的な活性を変化させることなくそのタンパク質のアミノ酸配列を変更することができる。したがって、例えば、1つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失がコードされているタンパク質に導入されるように1つ以上のヌクレオチド置換、付加、又は欠失を対応するヌクレオチド配列に導入することによって、配列番号2の配列と異なるアミノ酸配列を有する変異型TriAポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を創出することができる。突然変異は部位特異的突然変異誘発及びPCR媒介突然変異誘発のような標準的な技術によって導入することができる。そのような変異体ヌクレオチド配列も本発明に包含される。例えば、好ましくは、1つ以上の予測される好ましくは非必須のアミノ酸残基に保存的なアミノ酸置換を起こしてもよい。「非必須の」アミノ酸残基は生物学的な活性を変更することなくタンパク質の野生型配列から変更することができる残基であり、「必須の」アミノ酸残基は生物学的な活性に必要である。

0076

欠失とは、1つ以上のアミノ酸のタンパク質からの除去をいう。

0077

挿入とは、1つ以上のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位に導入されることをいう。挿入はN末端及び/又はC末端融合並びに単一又は複数のアミノ酸の配列内挿入を含み得る。一般に、アミノ酸配列内への挿入はN-又はC末端融合より約1〜10残基程度小さい。N-又はC末端融合タンパク質又はペプチドの例としては、酵母ツーハイブリッド系で使用される転写活性化因子結合ドメイン又は活性化ドメインファージコートタンパク質、(ヒスチジン)-6-タグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ-タグ、プロテインAマルトース結合タンパク質ジヒドロ葉酸レダクターゼ、タグ100エピトープ、c-mycエピトープ、FLAG(登録商標)-エピトープ、lacZ、CMP(カルモジュリン結合ペプチド)、HAエピトープ、プロテインCエピトープ及びVSVエピトープがある。

0078

置換とは、タンパク質のアミノ酸の、類似の性質(例えば、類似の疎水性親水性抗原性、α-らせん構造又はβ-シート構造を形成又は破壊する傾向)を有する他のアミノ酸による置換をいう。アミノ酸置換は通例単一の残基であるが、ポリペプチドに課せられる機能性の制約に応じてクラスターになってもよく、1〜10のアミノ酸の範囲であり得、挿入は通常約1〜10のアミノ酸残基の程度である。保存的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定められている。これらのファミリーには、塩基性側鎖をもつアミノ酸(例えば、リジンアルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アスパラギン酸グルタミン酸)、非荷電で極性の側鎖をもつアミノ酸(例えば、グリシンアスパラギングルタミンセリンスレオニンチロシンシステイン)、非極性の側鎖をもつアミノ酸(例えば、アラニンバリンロイシンイソロイシンプロリンフェニルアラニンメチオニントリプトファン)、ベータ-分岐した側鎖をもつアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖をもつアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。そのような置換は保存アミノ酸残基、又は保存モチーフ内にあるアミノ酸残基に対しては行われない。保存的置換の表は当技術分野で周知である(例えば、Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds)参照)。

0079

アミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入は、固相ペプチド合成などのような当技術分野で周知のペプチド合成技術を用いて、又は組換えDNA操作によって容易に行うことができる。タンパク質の置換、挿入又は欠失変異体を生成するためのDNA配列操作方法は当技術分野で周知である。例えば、DNAの所定の部位に置換突然変異を起こす技術は当業者に周知であり、M13突然変異誘発、T7-Genインビトロ突然変異誘発(USB, Cleveland, OH)、QuickChange部位特異的突然変異誘発(Stratagene, San Diego, CA)、PCR媒介部位特異的突然変異誘発又はその他の部位特異的突然変異誘発プロトコルがある。

0080

「誘導体」はさらに、対象のタンパク質のようなタンパク質の天然に存在する形態のアミノ酸配列と比較して、天然に存在しないアミノ酸残基によるアミノ酸の置換、又は天然に存在しないアミノ酸残基の付加を含み得るペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。タンパク質の「誘導体」はまた、ポリペプチドの天然に存在する形態のアミノ酸配列と比較して天然に存在する変化した(グリコシル化アシル化プレニル化リン酸化ミリストイル化硫酸化等)又は非天然の変化したアミノ酸残基を含むペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドも包含する。また、誘導体は、由来元のアミノ酸配列と比較して1つ以上の非アミノ酸置換基又は付加、例えば、その検出を容易にするために結合されたレポーター分子のような、アミノ酸配列に共有結合又は非共有結合で結合したレポーター分子又は他のリガンド、及び天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と比べて天然に存在しないアミノ酸残基を含んでいてもよい。また、「誘導体」は、天然に存在する形態のタンパク質とFLAG、HIS6又はチオレドキシンのようなタグペプチドとの融合体も含む(タグペプチドの総説としては、Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533, 2003を参照されたい)。

0081

「オルソログ」及び「パラログ」は遺伝子の先祖の血縁関係を記載するために使用される進化概念を包含する。パラログは、先祖の遺伝子の複製を通じて生成した同一の種内の遺伝子である。オルソログは、種形成を通じて生成した異なる生物由来の遺伝子であり、同様に共通の先祖の遺伝子に由来する。

0082

本発明により包含される配列番号2のバリアント、オルソログ及びパラログとしては、例えば配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、又は31を含むポリペプチドが示されるが、これに限らない。

0083

当技術分野では周知のように、パラログ及びオルソログは、特定の基質のための結合ポケット又は他のタンパク質との相互作用のための結合モチーフのような、適切なアミノ酸残基を所与の部位にもつ明確なドメインを共有することがある。

0084

用語「ドメイン」とは、進化的に関連しているタンパク質の配列のアラインメントに沿って特定の位置に保存された1セットのアミノ酸をいう。他の位置のアミノ酸はホモログ間で変化することができるが、特定の位置に高度に保存されているアミノ酸はタンパク質の構造、安定性又は機能に必須である可能性が高いアミノ酸であることを示す。タンパク質ホモログのファミリーの整列させた配列に高度の保存が同定されると、問題のいずれのポリペプチドが既に同定されたポリペプチドファミリーに属するかどうかを決定するために識別子として使用することができる。

0085

用語「モチーフ」又は「コンセンサス配列」は進化的に関連するタンパク質の配列中の短い保存領域をいう。モチーフはドメインの高度に保存された部分であることが極めて多いが、ドメインの一部のみを含んでいてもよく、又は保存されたドメインの外に位置してもよい(そのモチーフのアミノ酸の全てが定められたドメインの外にある場合)。

0086

ドメインの同定のためのスペシャリストデータベース、例えば、SMART(Schultz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 5857-5864; Letunic et al. (2002) Nucleic AcidsRes 30, 242-244)、InterPro (Mulder et al., (2003) Nucl. Acids. Res. 31, 315-318)、Prosite (Bucher and Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In)ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds.. pp53-61, AAAIPress、Menlo Park; Hulo et al., Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137, (2004))、又はPfam (Bateman et al.、Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002))が存在する。タンパク質配列のコンピューターによる解析のための1組の手段がExPASyプロテオミクスサーバーから入手可能である(Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003))。ドメイン又はモチーフはまた、配列アラインメントのようなルーチンの技術を用いて同定することもできる。

0087

比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知であり、そのような方法にはGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及びTFASTAが含まれる。GAPは、Needleman及びWunschのアルゴリズム((1970) J Mol Biol 48: 443-453)を使用して、2つの配列の一致の数を最大にし、ギャップの数を最小にする広範囲の(すなわち、完全な配列にわたる)アラインメントを見出す。BLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10)は配列同一性パーセントを計算し、2つの配列間の類似性の統計解析を実行する。BLAST解析を実行するためのソフトウェアはNational Centre for Biotechnology Information(NCBI)を通じて公に利用可能である。ホモログは、例えばデフォルトペアワイズアラインメントパラメーター、及びパーセントでのスコアリグ方法を用いるClustalW複数配列アラインメントアルゴリズム(1.83バージョン)を使用して容易に同定することができる(図1参照)。類似性及び同一性のグローバルパーセントは、MatGATソフトウェアパッケージ内で利用可能な方法の1つを使用して決定してもよい(Campanella et al.,BMCBioinformatics. 2003 Jul 10;4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.)。当業者には明らかなようにちょっとした手作業を行って保存モチーフ間のアラインメントを最適化することができる。また、ホモログの同定のために全長の配列を使用する代わりに、特定のドメインも使用できる。配列同一性の値は、デフォルトパラメーターを用いて上述のプログラムを使用して核酸若しくはアミノ酸配列全体にわたり、又は選択されたドメイン若しくは保存モチーフで決定することができる。ローカルアラインメントには、Smith-Watermanアルゴリズムがi特に有用である(Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1);195-7)。

0088

本発明のタンパク質はアミノ酸の置換、欠失、トランケーション、及び挿入を始めとする様々な方法で変化させることができる。そのような操作の方法は当技術分野で広く知られている。例えば、アミノ酸配列の変異体はDNAの突然変異によって調製することができる。突然変異誘発及びヌクレオチド配列の変更の方法は当技術分野で周知である。例えば、Kunkel (1985) PNAS, 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methodsin Enzymol. 154:367-382;米国特許第4,873,192号; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)及びそこで引用されている文献を参照されたい。対象のタンパク質の生物学的な活性に影響を及ぼさない適当なアミノ酸置換に関する指針は、参照により本明細書に含まれるDayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C)のモデルに見られる。類似の性質を有する別のアミノ酸による1つのアミノ酸の交換のような保存的な置換が好ましいであろう。

0089

あるいは、飽和突然変異誘発のようにコード配列の全部又は一部に沿ってランダムに突然変異を導入することによって変異体ヌクレオチド配列を作製することができ、得られる突然変異体をスクリーニングして活性を保持するタンパク質をコードする突然変異体を同定することができる。例えば、突然変異誘発の後、コードされているタンパク質を組換えにより発現させることができ、そのタンパク質の活性を標準的なアッセイ技術を用いて測定することができる。

0090

本発明の発明者らは、例えば上記方法の1つを使用することにより、配列番号2のTriA酵素の重要なアミノ酸残基1つ以上を置換してTriAをコードする核酸を突然変異させることによって、特定の除草剤に対する耐性又は抵抗性を顕著に増大させることができるということを見出した。変異型TriAの好ましい置換は、植物の除草剤耐性を増大させるが、デアミナーゼ活性の生物学的活性は実質的に影響されないままにするものである。

0091

したがって、本発明の別の目的は、配列番号2の配列を含む変異されたTriAポリペプチド、その変異体、誘導体、オルソログ、パラログ又はホモログに関し、その重要なアミノ酸残基は他の任意のアミノ酸により置換されている。

0092

当業者には理解されるように、以下に述べるアミノ酸の位置にごく近接した位置のアミノ酸も置換され得る。したがって、別の実施形態において、配列番号2の変異体、その変異体、誘導体、オルソログ、パラログ又はホモログは変異型TriAを含み、ここで重要なアミノ酸から±3、±2又は±1アミノ酸の位置のアミノ酸は他の任意のアミノ酸で置換されている。

0093

当技術分野で周知の技術に基づいて、極めて特徴的な配列パターンを明らかにすることができ、これを用いて所望の活性を有するさらなる変異型TriA候補を探索することができる。

0094

適切な配列パターンを適用することによるさらなる変異型TriA候補の探索も本発明に包含される。熟練した読者には理解されるように、本配列パターンは、前記パターンの2つの隣接するアミノ酸残基間の正確な間隔に限定されない。例えば、上記パターンの2つの隣接する残基間の間隔の各々は、互いに独立して、所望の活性に実質的に影響を及ぼすことなく±10、±5、±3、±2又は±1アミノ酸位置まで変化してもよい。

0095

また、部位特異的突然変異誘発、例えば飽和突然変異誘発(例えば、Schenk et al., Biospektrum 03/2006, 277-279頁参照)の方法を適用することによって、本発明の発明者らは特定のアミノ酸置換及びその組合せを同定し生成させた。これは、及びそれぞれの変異型TriAをコードする核酸は形質転換及び発現させることにより植物に導入されると、除草剤に対する増大した除草剤抵抗性又は耐性を前記植物に付与する。

0096

したがって、特に好ましい実施形態において、変異型TriAのバリアントもしくは誘導体は、配列番号2、そのオルソログ、パラログ、もしくはホモログを含むTriAポリペプチドを指し、そのアミノ酸配列は、配列番号2の次の位置:69、70、71、74、82、84、85、87、88、89、91、92、93、96、126、128、129、130、131、155、157、160、167、170、174、180、182、216、217、219、220、246、247、248、249、250、251、298、301、302、304、328位に対応する1か所または複数か所においてTriAポリペプチドの野生型アミノ酸配列と異なる。

0097

これらのアミノ酸位置における差異の例として、次のうち1つもしくは2つ以上が挙げられるが、それらに限定されない:
69位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
70位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
71位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
74位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
82位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
84位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
85位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
87位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
88位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
89位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
91位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
92位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
93位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
96位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
126位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
128位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
129位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
130位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
131位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
155位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
157位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
160位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
167位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
170位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
174位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
180位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
182位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
216位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
217位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
219位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
220位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
246位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
247位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
248位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
249位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
250位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
251位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
298位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
301位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
302位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
304位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている;
328位に対応するアミノ酸がそれ以外の任意のアミノ酸で置換されている。

0098

これらのアミノ酸位置における差異の例として、次のうち1つもしくは2つ以上が挙げられるが、それらに限定されない:
69位に対応するアミノ酸がバリン以外である;
70位に対応するアミノ酸がアスパラギン以外である;
71位に対応するアミノ酸がグルタミン以外である;
74位に対応するアミノ酸がロイシン以外である;
82位に対応するアミノ酸がアルギニン以外である;
84位に対応するアミノ酸がロイシン以外である;
85位に対応するアミノ酸がチロシン以外である;
87位に対応するアミノ酸がトリプトファン以外である;
88位に対応するアミノ酸がロイシン以外である;
89位に対応するアミノ酸がフェニルアラニン以外である;
91位に対応するアミノ酸がバリン以外である;
92位に対応するアミノ酸がロイシン以外である;
93位に対応するアミノ酸がチロシン以外である;
96位に対応するアミノ酸がグルタミン以外である;
126位に対応するアミノ酸がアスパラギン以外である;
128位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸以外である;
129位に対応するアミノ酸がセリン以外である;
130位に対応するアミノ酸がアラニン以外である;
131位に対応するアミノ酸がイソロイシン以外である;
155位に対応するアミノ酸がメチオニン以外である;
157位に対応するアミノ酸がフェニルアラニン以外である;
160位に対応するアミノ酸がメチオニン以外である;
167位に対応するアミノ酸がチロシン以外である;
170位に対応するアミノ酸がアラニン以外である;
174位に対応するアミノ酸がリジン以外である;
180位に対応するアミノ酸がロイシン以外である;
182位に対応するアミノ酸がセリン以外である;
216位に対応するアミノ酸がアラニン以外である;
217位に対応するアミノ酸がイソロイシン以外である;
219位に対応するアミノ酸がプロリン以外である;
220位に対応するアミノ酸がアラニン以外である;
246位に対応するアミノ酸がグルタミン酸以外である;
247位に対応するアミノ酸がセリン以外である;
248位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸以外である;
249位に対応するアミノ酸がヒスチジン以外である;
250位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸以外である;
251位に対応するアミノ酸がグルタミン酸以外である;
298位に対応するアミノ酸がグルタミン以外である;
301位に対応するアミノ酸がセリン以外である;
302位に対応するアミノ酸がアスパラギン以外である;
304位に対応するアミノ酸がチロシン以外である;
328位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸以外である。

0099

好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その70位に対応するアミノ酸はThr、Cys、Gly、Val、またはSerである。

0100

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はThr、Val、Gly、Cys、またはSerである。

0101

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その70位に対応するアミノ酸はVal、71位に対応するアミノ酸はValである。

0102

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その70位に対応するアミノ酸はVal、71位に対応するアミノ酸はThrである。

0103

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その70位に対応するアミノ酸はThr、71位に対応するアミノ酸はValである。

0104

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その70位に対応するアミノ酸はThr、71位に対応するアミノ酸はThrである。

0105

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その155位に対応するアミノ酸はLeuである。

0106

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その128位に対応するアミノ酸はGly、Pro、またはValである。

0107

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その70位に対応するアミノ酸はVal、155位に対応するアミノ酸はValである。

0108

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その70位に対応するアミノ酸はVal、155位に対応するアミノ酸はValであり、128位に対応するアミノ酸はSerである。

0109

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その70位に対応するアミノ酸はVal、155位に対応するアミノ酸はValであり、128位に対応するアミノ酸はThrである。

0110

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その157位に対応するアミノ酸はThr、Ala、Met、またはSerである。

0111

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その157位に対応するアミノ酸はAla、70位に対応するアミノ酸はLeuであり、71位に対応するアミノ酸はLeuである。

0112

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その157位に対応するアミノ酸はAla、70位に対応するアミノ酸はIleであり、71位に対応するアミノ酸はIleである。

0113

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その88位に対応するアミノ酸はVal、92位に対応するアミノ酸はIleである。

0114

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その88位に対応するアミノ酸はVal、92位に対応するアミノ酸はValである。

0115

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その157位に対応するアミノ酸はVal、88位に対応するアミノ酸はValであり、92位に対応するアミノ酸はIleである。

0116

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その157位に対応するアミノ酸はAla、88位に対応するアミノ酸はValであり、92位に対応するアミノ酸はIleである。

0117

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その96位に対応するアミノ酸はValである。

0118

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はVal、92位に対応するアミノ酸はVal、155位に対応するアミノ酸はAlaであり、157位に対応するアミノ酸はAlaである。

0119

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その128位に対応するアミノ酸はIle、155位に対応するアミノ酸はVal、70位に対応するアミノ酸はLeuであり、71位に対応するアミノ酸はIleである。

0120

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はLeu、91位に対応するアミノ酸はAlaである。

0121

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はLeu、91位に対応するアミノ酸はAlaであり、92位に対応するアミノ酸はValである。

0122

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はLeu、91位に対応するアミノ酸はAla、92位に対応するアミノ酸はValであり、88位に対応するアミノ酸はAlaである。

0123

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その88位に対応するアミノ酸はAla、157位に対応するアミノ酸はIleである。

0124

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その88位に対応するアミノ酸はAla、157位に対応するアミノ酸はLeuである。

0125

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その69位に対応するアミノ酸はAla、Leu、またはSerである。

0126

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その74位に対応するアミノ酸はVal、またはAlaである。

0127

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その74位に対応するアミノ酸はAla、70位に対応するアミノ酸はLeuであり、71位に対応するアミノ酸はIleである。

0128

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その82位に対応するアミノ酸はLeu、Met、またはGlyである。

0129

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その96位に対応するアミノ酸はGlu、Asp、Ala、Thr、またはAsnである。

0130

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その126位に対応するアミノ酸はAla、Met、Ser、またはAspである。

0131

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その128位に対応するアミノ酸はSer、Ala、またはAsnである。

0132

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その155位に対応するアミノ酸はGly、Ala、またはGluである。

0133

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その157位に対応するアミノ酸はMet、またはAlaである。

0134

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その167位に対応するアミノ酸はIle、88位に対応するアミノ酸はAlaである。

0135

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その167位に対応するアミノ酸はIle、88位に対応するアミノ酸はAlaであり、84位に対応するアミノ酸はValである。

0136

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その167位に対応するアミノ酸はIle、88位に対応するアミノ酸はAlaであり、84位に対応するアミノ酸はThrである。

0137

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その216位に対応するアミノ酸はSer、またはGlyである。

0138

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その217位に対応するアミノ酸はAla、Ser、またはThrである。

0139

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その219位に対応するアミノ酸はGly、249位に対応するアミノ酸はAsnである。

0140

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その219位に対応するアミノ酸はGly、249位に対応するアミノ酸はAsnであり、217位に対応するアミノ酸はValである。

0141

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その220位に対応するアミノ酸はThr、Ser、またはGlyである。

0142

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その220位に対応するアミノ酸はGly、157位に対応するアミノ酸はAlaである。

0143

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その246位に対応するアミノ酸はSer、Thr、Gln、またはAspである。

0144

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その247位に対応するアミノ酸はAla、Asn、Val、Gly、またはProである。

0145

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その248位に対応するアミノ酸はSer、Asn、またはGlyである。

0146

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その249位に対応するアミノ酸はVal、Ile、またはAsnである。

0147

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その250位に対応するアミノ酸はGlu、またはAsnである。

0148

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その251位に対応するアミノ酸はAspである。

0149

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その251位に対応するアミノ酸はAsp、248位に対応するアミノ酸はGluである。

0150

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その298位に対応するアミノ酸はCys、Asn、Thr、またはSerである。

0151

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その301位に対応するアミノ酸はAla、Thr、またはValである。

0152

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その302位に対応するアミノ酸はGluである。

0153

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その304位に対応するアミノ酸はLysである。

0154

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その87位に対応するアミノ酸はThrである。

0155

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAlaである。

0156

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAlaであり、88位に対応するアミノ酸はAlaである。

0157

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAlaであり、93位に対応するアミノ酸はLeuである。

0158

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAlaであり、93位に対応するアミノ酸はPheである。

0159

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAlaであり、128位に対応するアミノ酸はGlyである。

0160

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAlaであり、128位に対応するアミノ酸はAlaである。

0161

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAla、88位に対応するアミノ酸はAlaであり、93位に対応するアミノ酸はLeuである。

0162

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAla、88位に対応するアミノ酸はAlaであり、93位に対応するアミノ酸はPheである。

0163

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAla、88位に対応するアミノ酸はAlaであり、128位に対応するアミノ酸はGlyである。

0164

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAla、88位に対応するアミノ酸はAlaであり、128位に対応するアミノ酸はAlaである。

0165

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はPheであり、128位に対応するアミノ酸はGlyである。

0166

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はPheであり、128位に対応するアミノ酸はAlaである。

0167

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAla、155位に対応するアミノ酸はThrであり、157位に対応するアミノ酸はLeuである。

0168

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAla、155位に対応するアミノ酸はThrであり、157位に対応するアミノ酸はValである。

0169

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAla、155位に対応するアミノ酸はValであり、157位に対応するアミノ酸はLeuである。

0170

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAla、155位に対応するアミノ酸はValであり、157位に対応するアミノ酸はValである。

0171

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAlaであり、328位に対応するアミノ酸はGlyである。

0172

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その92位に対応するアミノ酸はAla、89位に対応するアミノ酸はAlaである。

0173

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その92位に対応するアミノ酸はAla、89位に対応するアミノ酸はAlaであり、93位に対応するアミノ酸はAlaである。

0174

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その92位に対応するアミノ酸はAla、89位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はAlaであり、160位に対応するアミノ酸はGlyである。

0175

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はAlaである。

0176

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はLeuである。

0177

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はPheである。

0178

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その89位に対応するアミノ酸はAla、Val、またはLeuである。

0179

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その93位に対応するアミノ酸はAla、Val、Leu、またはPheである。

0180

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その217位に対応するアミノ酸はGlyである。

0181

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その160位に対応するアミノ酸はGlyである。

0182

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その250位に対応するアミノ酸はSerである。

0183

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その328位に対応するアミノ酸はGly、またはAlaである。

0184

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その129位および/または130位に対応するアミノ酸が欠失している。

0185

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その130位および/または131位に対応するアミノ酸が欠失している。

0186

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その170位および/または182位に対応するアミノ酸が欠失している。

0187

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その174位および/または180位に対応するアミノ酸が欠失している。

0188

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その89位に対応するアミノ酸はAla、92位に対応するアミノ酸はAlaであり、93位に対応するアミノ酸はLeuである。

0189

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その89位に対応するアミノ酸はLeu、92位に対応するアミノ酸はAlaであり、93位に対応するアミノ酸はLeuである。

0190

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その85位に対応するアミノ酸はLeu、92位に対応するアミノ酸はAlaであり、93位に対応するアミノ酸はLeuである。

0191

別の好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その85位に対応するアミノ酸はLeu、92位に対応するアミノ酸はAlaであり、93位に対応するアミノ酸はValである。

0192

特に好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はVal、155位に対応するアミノ酸はThrであり、157位に対応するアミノ酸はLeuである。

0193

別の特に好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はLeu、155位に対応するアミノ酸はThrであり、157位に対応するアミノ酸はLeuである。

0194

別の特に好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はLeu、155位に対応するアミノ酸はValであり、157位に対応するアミノ酸はLeuである。

0195

別の特に好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はLeuであり、157位に対応するアミノ酸はLeuである。

0196

別の特に好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はPhe、96位に対応するアミノ酸はThrであり、128位に対応するアミノ酸はGlyである。

0197

別の特に好ましい実施形態において、変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、もしくはホモログを含み、その71位に対応するアミノ酸はAsn、92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はLeu、96位に対応するアミノ酸はThrであり、128位に対応するアミノ酸はGlyである。
他の好ましい実施形態、すなわち変異の組み合わせを、次の表1に示す。

0198

0199

配列番号1によってコードされる、ホモログ、オルソログおよびパラログの間で共有される保存された領域およびモチーフの同定は、当業者の知識の範囲内と考えられる。好適な結合モチーフを示す可能性のある、こうした保存領域が同定されたので、配列番号2を参考として用いて、任意の他のアミノ酸、たとえば保存されたアミノ酸、好ましくは上記のアミノ酸置換で置換されるべきアミノ酸を選択することができる。

0200

もう一つの目的は、除草剤抵抗性もしくは除草剤耐性である変異型TriAをコードするヌクレオチド配列を同定する方法に関するものであって、その方法は下記を含む:
a) 変異型TriAをコードする核酸のライブラリーを作製すること、
b) その結果得られた変異型TriAをコードする核酸のそれぞれを細胞もしくは植物において発現させ、当該細胞もしくは植物を除草剤で処理することによって、前記核酸集団をスクリーニングすること、
c) 前記の変異型TriAをコードする核酸集団によって与えられる除草剤耐性レベルを、対照TriAをコードする核酸により与えられる除草剤耐性レベルと比較すること、
d) 対照TriAをコードする核酸によって与えられる、より有意に増加したレベルの除草剤に対する耐性を与える、少なくとも1つの変異型TriAをコードする核酸を選択すること。

0201

除草剤耐性レベルは、細胞、組織、または植物において解毒速度を測定することによって判定することもできる。

0202

解毒速度は、それぞれの組織における一定時間内の除草剤分解速度である。分解および産物生成は、たとえば、高分解能(HR)質量分析計(MS)と接続した液体クロマトグラフィー(LC)によって分析的に測定することができる。生成物は標準との比較によって、および/または構造の解明によって測定することができる。

0203

好ましい実施形態において、ステップd)で選択される変異型TriAをコードする核酸は、対照TriAコード核酸によって与えられる抵抗性もしくは耐性と比べて、除草剤に対して少なくとも2倍の、細胞もしくは植物の抵抗性または耐性を与える。

0204

他の好ましい実施形態において、ステップd)で選択される変異型TriAをコードする核酸は、対照TriAコード核酸によって与えられる抵抗性もしくは耐性と比べて、除草剤に対して少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍の、細胞もしくは植物の抵抗性または耐性を与える。

0205

抵抗性もしくは耐性は、ステップa)のライブラリの核酸配列を含有するトランスジェニック植物または宿主細胞、好ましくは植物細胞を作製し、前記トランスジェニック植物を、対照植物もしくは宿主細胞、好ましくは植物細胞と比較することによって測定することができる。

0206

微生物、植物、真菌、藻類、混合培養物などを含む、さまざまな、起源となりうる生物、ならびに、土壌などのDNAの環境起源から、変異型TriAをコードするヌクレオチド配列を同定するための適当な候補核酸を得るために、当業者によく知られている多くの方法が利用できる。こうした方法には、特に、cDNAもしくはゲノムDNAライブラリの調製、適切に縮重したオリゴヌクレオチドプライマーの使用、既知の配列または相補性検定に基づくプローブの使用(たとえば、チロシンでの増殖に関する)、ならびに組換えもしくはシャッフルされた変異型TriAコード配列を提供するための変異誘発およびシャフリングの使用がある。

0207

候補および対照のTriAコード配列を含む核酸は、酵母、細菌宿主株、藻類、または高等植物、たとえばタバコもしくはシロイヌナズナにおいて発現させることが可能であり、TriAコード配列に備わる耐性の相対レベルは、異なる濃度の選択された除草剤の存在下における、形質転換された菌株もしくは植物の、目にみえる指標となる表現型によって検査することができる。用量反応、ならびに上記の指標となる表現型(褐色の生成、生育阻害除草効果など)に関連する用量反応の相対的変化は、便宜上GR50(生育を50%減少させるための濃度)またはMIC最小発育阻止濃度)の値によって表され、この値の上昇は、発現されたTriAに備わる耐性の増加に対応する。たとえば、大腸菌(E. coli)などの細菌の形質転換に基づく比較的迅速なアッセイ系において、それぞれの変異型TriAコード配列は、たとえば、lacZプロモーターなどの制御可能なプロモーターの発現制御下のDNA配列として発現させることができ、さらに、異なるTriA配列について、できる限り同等レベルの発現を得るために、たとえば合成DNAの使用によってコドン使用頻度のような問題を適切に考慮して、発現させることができる。別の候補TriA配列を含む核酸を発現する、このような菌株を、必要に応じてチロシンを添加した培地において、さまざまな濃度の選択された除草剤上に蒔き、発現されたTriA酵素に備わる耐性の相対レベルを、褐色褐変色素形成の阻害に関する程度およびMICに基づいて、またはLC-HRMS(液体クロマトグラフィー高分解能質量分析)で除草剤の分解を測定することによって、評価することができる。

0208

別の実施形態において、候補の核酸を形質転換により植物材料に導入して、トランスジェニック植物を作製し、形態学的に正常な稔性植物となるよう再生させて、その植物の、選択された除草剤に対する耐性の差異を、下記の実施例の項に記載のように測定する。カナマイシンなどの適当な選択マーカーアグロバクテリウム(Agrobacterium)由来などのバイナリベクター、ならびに、たとえばタバコのリーフディスクからの再生のような植物体再生を用いた、形質転換のための多くの適当な方法が当技術分野でよく知られている。植物の対照集団は適宜、同様に対照TriAを発現する核酸で形質転換される。一連の当初の植物形転換イベント、またはそれらの後代の、上記除草剤に対する除草剤耐性レベルの平均および分布は、さまざまな除草剤濃度において、植物体の損傷、分裂組織の白化徴候などに基づく通常の方法で評価される。これらのデータは、たとえば、x軸上に「用量」をプロットし、「死滅パーセント」、「除草効果」、「出芽する緑色植物の数」などをy軸上にプロットした用量/反応曲線から導き出されるGR50値によって表され、このGR50値の増加は、発現されたTriAに備わる耐性のレベルの増加に対応する。除草剤は、出芽前または出芽後に適切に施用することができる。

0209

本発明のもう1つの目的は、単離された、組換えの、および/または化学合成された、上記の変異型TriAをコードする核酸に関するが、その核酸は配列番号1のヌクレオチド配列、またはそのバリアントもしくは誘導体を含む。

0210

上記のアミノ酸位置での差異の例には、次のうち1つもしくはいくつかが含まれる:
69位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
70位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
71位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
74位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
82位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
84位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
85位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
87位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
88位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
89位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
91位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
92位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
93位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
96位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
126位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
128位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
129位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
130位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
131位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
155位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
157位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
160位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
167位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
170位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
174位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
180位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
182位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
216位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
217位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
219位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
220位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
246位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
247位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
248位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
249位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
250位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
251位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
298位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
301位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
302位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
304位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている;
328位に対応するアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている。

0211

好ましい実施形態において、コードされる変異型TriAは配列番号2のバリアントであって、これには次のうち1つもしくはいくつかが含まれる:
69位に対応するアミノ酸がバリン以外である;
70位に対応するアミノ酸がアスパラギン以外である;
71位に対応するアミノ酸がグルタミン以外である;
74位に対応するアミノ酸がロイシン以外である;
82位に対応するアミノ酸がアルギニン以外である;
84位に対応するアミノ酸がロイシン以外である;
85位に対応するアミノ酸がチロシン以外である;
87位に対応するアミノ酸がトリプトファン以外である;
88位に対応するアミノ酸がロイシン以外である;
89位に対応するアミノ酸がフェニルアラニン以外である;
91位に対応するアミノ酸がバリン以外である;
92位に対応するアミノ酸がロイシン以外である;
93位に対応するアミノ酸がチロシン以外である;
96位に対応するアミノ酸がグルタミン以外である;
126位に対応するアミノ酸がアスパラギン以外である;
128位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸以外である;
129位に対応するアミノ酸がセリン以外である;
130位に対応するアミノ酸がアラニン以外である;
131位に対応するアミノ酸がイソロイシン以外である;
155位に対応するアミノ酸がメチオニン以外である;
157位に対応するアミノ酸がフェニルアラニン以外である;
160位に対応するアミノ酸がメチオニン以外である;
167位に対応するアミノ酸がチロシン以外である;
170位に対応するアミノ酸がアラニン以外である;
174位に対応するアミノ酸がリジン以外である;
180位に対応するアミノ酸がロイシン以外である;
182位に対応するアミノ酸がセリン以外である;
216位に対応するアミノ酸がアラニン以外である;
217位に対応するアミノ酸がイソロイシン以外である;
219位に対応するアミノ酸がプロリン以外である;
220位に対応するアミノ酸がアラニン以外である;
246位に対応するアミノ酸がグルタミン酸以外である;
247位に対応するアミノ酸がセリン以外である;
248位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸以外である;
249位に対応するアミノ酸がヒスチジン以外である;
250位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸以外である;
251位に対応するアミノ酸がグルタミン酸以外である;
298位に対応するアミノ酸がグルタミン以外である;
301位に対応するアミノ酸がセリン以外である;
302位に対応するアミノ酸がアスパラギン以外である;
304位に対応するアミノ酸がチロシン以外である;
328位に対応するアミノ酸がアスパラギン酸以外である。

0212

特に好ましい実施形態において、本発明の核酸によってコードされる変異型TriAは、配列番号2のバリアントを含んでなり、その配列番号2の92、93、155、および157位に対応する位置にあるアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている。

0213

特に好ましい実施形態において、コードされる変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、またはホモログを含み:
その92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はVal、155位に対応するアミノ酸はThrであり、157位に対応するアミノ酸はLeuである。

0214

別の特に好ましい実施形態において、コードされる変異型TriAは、配列番号2の配列、そのバリアント、誘導体、オルソログ、パラログ、またはホモログを含み:
その92位に対応するアミノ酸はAla、93位に対応するアミノ酸はLeu、155位に対応するアミノ酸はThrであり、157位に対応するアミノ酸はLeuである。

0215

他の態様において、本発明は、本発明の除草剤に耐性の植物の子孫又は後裔、並びに本発明の除草剤に耐性の植物に由来する種子及び本発明の除草剤に耐性の植物に由来する細胞を包含する。

0216

幾つかの実施形態において、本発明は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物に由来する子孫又は後裔植物を提供し、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、ここで子孫又は後裔植物はその細胞の少なくとも一部に、プロモーターに作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドを含み、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を子孫又は後裔植物に付与する。

0217

1つの実施形態において、本発明の種子は好ましくは除草剤に耐性の植物の除草剤に耐性の特性を含む。他の実施形態において、種子は植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物に発芽することができ、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を子孫又は後裔植物に付与する。

0218

幾つかの実施形態において、本発明の植物細胞は、植物又は植物部分を再生することができる。他の実施形態において、植物細胞は、植物又は植物部分を再生することができない。植物を再生することができない細胞の例としては、限定されることはないが、内胚乳、種皮(種皮及び果皮)、及び根冠がある。

0219

別の実施形態において、本発明は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを、その細胞の少なくとも一部に含む植物を再生することができる植物細胞を提供し、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与し、ここで植物細胞はプロモーターに作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドを含む。

0220

他の実施形態において、本発明は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む植物細胞を提供し、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を細胞に付与する。

0221

別の実施形態において、本発明は、本発明の変異型TriAポリペプチドをコードする核酸により形質転換された植物細胞に関し、ここで植物細胞における核酸の発現はその植物細胞の野生型変種と比較して増大した除草剤に対する抵抗性又は耐性をもたらす。好ましくは、変異型TriAポリペプチドをコードする核酸は、a)配列番号1に示されているポリヌクレオチド、又はその変異体若しくは誘導体、b)配列番号2に示されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はその変異体若しくは誘導体、c)a)又はb)のいずれかの少なくとも60の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、及びd)a)〜c)のいずれかのポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

0222

幾つかの態様において、本発明は、本発明の除草剤に耐性の植物から調製される植物産品を提供する。幾つかの実施形態において、植物産品の例として、限定することはないが、穀粒、油、及びミールがある。一実施形態において、植物産品は植物穀粒(例えば、飼料としての使用又は加工に適した穀粒)、植物油(例えば、食品又はバイオディーゼルとしての使用に適した油)、又は植物ミール(例えば、飼料としての使用に適したミール)である。

0223

一実施形態において、植物又は植物部分から調製された植物産品が提供され、本植物又は植物部分はその細胞の少なくとも一部に、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物又は植物部分に付与する。

0224

別の実施形態において、本発明は、植物細胞の野生型変種と比較して増大した除草剤に対する増大した抵抗性を有するトランスジェニック植物細胞を生産する方法に関し、この方法は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む発現カセットで植物細胞を形質転換するステップを含み、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができる。

0225

別の実施形態において、本発明は、トランスジェニック植物を生成する方法に関し、この方法は、(a)植物細胞で作動可能であり、ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができるプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む発現カセットで植物細胞を形質転換するステップ、及び(b)植物細胞から、除草剤に対して増大した抵抗性を有する植物を作製するステップを含む。

0226

幾つかの態様において、本発明は、除草剤に耐性の植物を生成する方法を提供する。一実施形態において、本方法は、植物細胞で作動可能なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドで形質転換された植物細胞から植物を再生するステップを含み、当該プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによりコードされている変異型TriAポリペプチドを発現させることができ、変異型TriAポリペプチドの発現は、除草剤に対する耐性を植物に付与する。

0227

用語「発現/発現する」又は「遺伝子発現」とは、1以上の特定の遺伝子又は特定の遺伝子構築物転写を意味する。用語「発現」又は「遺伝子発現」は特に、1以上の遺伝子又は遺伝子構築物の構造RNA(rRNAtRNA)又はmRNAへの転写を意味し、その後の後者のタンパク質への翻訳を伴っても伴わなくてもよい。本方法はDNAの転写及び得られたmRNA産物のプロセッシングを含む。

0228

本発明の所望の効果、すなわち除草剤の誘導体である除草剤に対して耐性又は抵抗性である植物を得るためには、少なくとも1つの核酸を当業者に公知の方法及び手段により「過剰発現させる」ことが理解される。

0229

用語「増大した発現」又は「過剰発現」は、本明細書中で使用される場合、野生型発現レベルに追加される何らかの形態の発現を意味する。遺伝子又は遺伝子産物の発現を増大する方法は当技術分野の文書に十分に記載されており、例えば、適当なプロモーターにより駆動される過剰発現、転写エンハンサー若しくは翻訳エンハンサーの使用がある。プロモーター又はエンハンサー要素として働く単離された核酸を、対象のポリペプチドをコードする核酸の発現をアップレギュレートするように非異種の形態のポリヌクレオチドの適当な位置(通例上流)に導入してもよい。例えば、内因性のプロモーターを突然変異、欠失、及び/又は置換によりインビボで改変してもよいし(Kmiec、US5,565,350、Zarling et al.、WO9322443参照)、又は単離されたプロモーターを、遺伝子の発現を制御するように本発明の遺伝子から正確な配向及び間隔で植物細胞に導入してもよい。ポリペプチドの発現が所望であれば、一般にポリヌクレオチドコード領域の3'-末端ポリアデニル化領域を含ませるのが望ましい。ポリアデニル化領域は天然の遺伝子由来、様々な他の植物遺伝子由来、又はT-DNA由来であることができる。付加すべき3'末端配列は、例えば、ノパリンシンターゼ若しくはオクトピンシンターゼ遺伝子由来でもよいし、あるいは別の植物遺伝子由来でもよいし、又は好ましさは少ないが他の任意の真核性遺伝子由来でもよい。また、イントロン配列を5'非翻訳領域(UTR)又は部分コード配列のコード配列に付加して、サイトゾル蓄積する成熟メッセージの量を増大することもできる。植物及び動物両方の発現構築物転写ユニットスプライス可能なイントロンを含ませると遺伝子発現がmRNA及びタンパク質の両方のレベルで1000倍まで増大することが示されている(Buchman and Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callis et al. (1987) Genes Dev 1:1183-1200)。そのような遺伝子発現のイントロン増強は通例転写ユニットの5'末端付近に置かれたときに最大である。トウモロコシイントロンAdh1-Sイントロン1、2、及び6、Bronze-1イントロンの使用は当技術分野で公知である。一般的な情報については、The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, N.Y. (1994)を参照されたい。

0230

適切な場合には、核酸配列を形質転換された植物での増大した発現に関して最適化してもよい。例えば、植物での改良された発現のための植物に好適なコドンを含むコード配列を提供することができる。例えば宿主に好適なコドン利用の考察として、Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol., 92: 1-11を参照されたい。植物に好適な遺伝子を調製するための方法も当技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書に含まれる米国特許第5,380,831号、及び同第5,436,391号、並びにMurray et al. (1989) Nucleic AcidsRes. 17:477-498を参照されたい。

0231

したがって、本発明の野生型/変異型TriA核酸は、対象の植物での発現用の発現カセット中で提供される。このカセットは本発明の野生型又は変異型TriA核酸配列に作動可能に連結された調節配列を含む。用語「調節要素」は、本明細書中で使用される場合、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節することができるポリヌクレオチドを指し、限定されることはないが、プロモーター、エンハンサー、イントロン、5'UTR、及び3'UTRを含む。「作動可能に連結された」とは、プロモーターと第2の配列との間の機能性の結合を意味し、プロモーター配列は第2の配列に対応するDNA配列の転写を開始させ媒介する。一般に、作動可能に連結されたとは、結合される核酸配列が連続しており、2つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合、連続しており、かつ同じ読み枠にあることを意味する。カセットはさらに、生物に同時形質転換される少なくとも1つの追加の遺伝子を含有していてもよい。あるいは、追加の遺伝子は複数の発現カセットに載せて提供されることができる。

0232

そのような発現カセットは、調節領域の転写制御下になるように野生型/変異型TriA核酸配列を挿入するための複数の制限部位を備えている。発現カセットはさらに選択マーカー遺伝子を含有していてもよい。本発明の発現カセットは、転写の5'-3'方向に、植物で機能性の転写及び翻訳開始領域(すなわち、プロモーター)、本発明の野生型/変異型TriAをコードする核酸配列、並びに転写及び翻訳終結領域(すなわち、終結領域)を含む。プロモーターは植物宿主及び/又は本発明の野生型/変異型TriA核酸配列に対して天然若しくは類似、又は外来若しくは異種でよい。さらに、プロモーターは天然の配列であっても、あるいは合成の配列であってもよい。プロモーターが植物宿主に対して「外来」又は「異種」である場合、プロモーターはプロモーターが導入される天然の植物中には見られないことが意図されている。プロモーターが本発明の野生型/変異型TriA核酸配列に対して「外来」又は「異種」である場合、プロモーターは本発明の作動可能に連結された野生型/変異型TriA核酸配列に対して天然でも天然に存在するプロモーターでもないことが意図されている。本明細書中で使用される場合、キメラ遺伝子は、コード配列に対して異種の転写開始領域に作動可能に連結されたコード配列を含む。異種のプロモーターを使用して本発明の野生型/変異型TriA核酸を発現させることが好ましい可能性があるが、天然のプロモーター配列を使用してもよい。そのような構築物は植物又は植物細胞での野生型/変異型TriAタンパク質の発現レベルを変化させる。したがって、植物又は植物細胞の表現型が変化する。

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