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技術 VI型CRISPRオルソログ及び系

出願人 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッドマサチューセッツインスティテュートオブテクノロジープレジデントアンドフェロウズオヴハーヴァードカレッジ
発明者 チャンフェンアブデイェーオマールオーグーテンバーグジョナサンランダーエリックエス
出願日 2017年6月19日 (2年10ヶ月経過) 出願番号 2018-566199
公開日 2019年9月5日 (7ヶ月経過) 公開番号 2019-524072
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 影響付与 ゲートアセンブリ 強度モード FS領域 スピンディスク 結合ツール 不活性化システム 熱ストレス耐性
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年9月5日)のものです。
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課題・解決手段

本発明は、核酸を標的化する系、方法、及び組成物を提供する。詳細には、本発明は、新規RNAターゲティングRISPRエフェクタータンパク質と、少なくとも1つのガイドRNAのようなターゲティング核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたRNAターゲティング系を提供する。かかる系の作製及び使用方法並びに使用、方法、及び組成物並びにかかる方法及び使用からの産物もまた開示及び特許請求される。

概要

背景

ゲノムシーケンシング技法及び解析方法の最近の進歩により、様々な生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子カタログ化し及びマッピングする能力は急速に向上している。個々の遺伝エレメントを選択的に摂動させることによる原因遺伝的変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能にするとともに合成生物学、バイオテクノロジー的、及び医学的応用を進歩させるには、正確なゲノムターゲティング技術が必要である。標的化したゲノム摂動を生じさせるためにデザイナージンクフィンガー転写アクチベーターエフェクター(TALE)、又はホーミングメガヌクレアーゼなどのゲノム編集技法が利用可能であるものの、新規戦略及び分子機構を利用した、且つ安価で、セットアップし易く、スケーリングが可能で、及び真核生物ゲノム及びトランスクリプトーム内の複数の位置を標的化するのに適した新規のゲノム及びトランスクリプトームエンジニアリング技術が依然として必要とされている。それは、ゲノムエンジニアリング及びバイオテクノロジーにおける新規適用の主要なリソースとなるであろう。

細菌及び古細菌適応免疫のCRISPR−Cas系は、タンパク質組成及びゲノム遺伝子座構成に関して極めて高度な多様性を示す。CRISPR−Cas系遺伝子座は50を超える遺伝子ファミリーを有し、厳密な意味で普遍的な遺伝子はないことから、急速な進化及び遺伝子座構成の極めて高度な多様性が示唆される。これまでのところ、多方向からの手法をとることにより、93個のCasタンパク質について約395個のプロファイルのcas遺伝子が包括的に同定されている。分類に含まれるのは、シグネチャ遺伝子プロファイル+遺伝子座構成のシグネチャである。CRISPR−Cas系の新規分類が提案されており、ここではこれらの系が大まかに2つのクラス、マルチサブユニットエフェクター複合体を有するクラス1と、Cas9タンパク質に例示される単一サブユニットエフェクターモジュールを有するクラス2とに分けられる。クラス2 CRISPR−Cas系に関連する新規エフェクタータンパク質は、強力なゲノムエンジニアリングツールとして開発することができ、推定上の新規エフェクタータンパク質の予測並びにそれらのエンジニアリング及び最適化が重要である。

CRISPR−Cas適応免疫系は微生物をDNA又はRNA−DNA干渉によって外来遺伝要素から防御する。最近になって、クラス2 VI型単一成分CRISPR−CasエフェクターC2c2(Shmakov et al.(2015)「多様なクラス2 CRISPR−Cas系の発見及び機能的特徴付け(Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR−Cas Systems)」;Molecular Cell 60:1−13;doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008)がRNAガイドRNアーゼとして特徴付けられた(Abudayyeh et al.(2016),Science,[Epub ahead of print],June 2;「C2c2は単一成分プログラム可能RNAガイド下RNAターゲティングCRISPRエフェクターである(C2c2 is a single−component programmable RNA−guided RNA−targeting CRISPR effector)」;doi:10.1126/science.aaf5573)。C2c2(例えばレプトリキアシャーイイ(Leptotrichia shahii)由来)はRNAファージ感染に対してロバストな干渉をもたらすことが実証された。インビトロ生化学分析及びインビボアッセイを通じて、3’H(非G)PAMが隣接するプロトスペーサーを有するssRNA標的を切断するようにC2c2をプログラムできることが示された。切断は、C2c2の2つの保存されたHEPNドメインにある触媒残基によって媒介され、それらのドメインにおける突然変異触媒不活性RNA結合タンパク質を生じさせる。C2c2は単一のガイドによって案内され、インビボで特定のmRNA枯渇させるように再プログラムされることができる。LshC2c2は目的の特異的部位に標的化することができ、且つひとたびコグネイト標的RNAでプライミングされると非特異的RNアーゼ活性を実行できることが示された。これらの結果はCRISPR−Cas系に関する我々の理解を広げるとともに、C2c2を生かして一連の広範なRNAターゲティングツールを開発できる可能性を示している。

現在、C2c2はCas13aとして知られる。本明細書における用語「C2c2」が「Cas13a」と同義的に使用されることは理解されるであろう。

本願における任意の文書引用又は特定は、かかる文書が本発明の先行技術として利用可能であることを承認するものではない。

概要

本発明は、核酸を標的化する系、方法、及び組成物を提供する。詳細には、本発明は、新規RNAターゲティングCRISPRエフェクタータンパク質と、少なくとも1つのガイドRNAのようなターゲティング核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされたRNAターゲティング系を提供する。かかる系の作製及び使用方法並びに使用、方法、及び組成物並びにかかる方法及び使用からの産物もまた開示及び特許請求される。

目的

本発明はまた、30以上、40以上又は50以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する

効果

実績

技術文献被引用数
- 件
牽制数
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請求項1

目的の哺乳類標的遺伝子座改変する方法であって、1つ以上の局在化シグナルに融合したC2c2エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座送達することを含み、ここで少なくとも前記1つ以上の核酸成分はエンジニアリングされ、前記1つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、方法。

請求項2

1つ以上の局在化シグナルに融合したC2c2エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、ここで少なくとも前記1つ以上の核酸成分は目的の哺乳類標的遺伝子座の改変における使用のためにエンジニアリングされ、前記1つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、組成物。

請求項3

1つ以上の局在化シグナルに融合したC2c2エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の使用であって、ここで少なくとも前記1つ以上の核酸成分は目的の哺乳類標的遺伝子座を改変するためにエンジニアリングされ、前記1つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、使用。

請求項4

前記目的の標的遺伝子座がRNAを含む、請求項1〜3又は58〜59のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項5

前記局在化シグナルが核局在化シグナルNLS)又は核外移行シグナル(NES)、好ましくはNESである、請求項1〜4又は58〜59のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項6

前記目的の標的遺伝子座の前記改変が鎖切断を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

前記C2c2エフェクタータンパク質が哺乳類細胞での発現コドン最適化される、請求項1〜6又は58〜59のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項8

前記C2c2エフェクタータンパク質が1つ以上の機能ドメイン会合し;及び任意選択で前記エフェクタータンパク質が、R597A、H602A、R1278A、及び/又はH1283Aなど、1つ以上の突然変異を任意選択でHEPNドメイン内に含み、それにより前記複合体はエピジェネティックモディファイヤー又は転写若しくは翻訳活性化若しくは抑制シグナルを送達することができる、請求項1〜7又は58〜59のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項9

前記機能ドメインが前記標的遺伝子座の転写又は翻訳を改変する、請求項8に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項10

前記目的の標的遺伝子座が細胞内の核酸分子に含まれる、請求項1〜9又は58〜59のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項11

前記改変がインビボ又はエキソビボである、請求項1〜10又は58〜59のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項12

前記エフェクタータンパク質と複合体化したとき、1つ又は複数の前記核酸成分が、前記目的の標的遺伝子座の標的配列に対する前記複合体の配列特異的結合を生じさせる能力を有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項13

1つ又は複数の前記核酸成分がデュアルダイレクトリピート配列を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項14

前記エフェクタータンパク質及び1つ又は複数の前記核酸成分が、前記ポリペプチド及び/又は1つ又は複数の前記核酸成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供され、及び前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が前記ポリペプチド及び/又は1つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項15

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が、前記ポリペプチド及び/又は1つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成された1つ以上の調節エレメントを含み、任意選択で前記1つ以上の調節エレメントが1つ又は複数のプロモーター又は1つ又は複数の誘導性プロモーターを含む、請求項14に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項16

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が1つ以上のベクター内に含まれる、請求項14又は15に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項17

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が1つのベクター内に含まれる、請求項14又は15に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項18

前記1つ以上のベクターがウイルスベクターを含む、請求項16又は17に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項19

前記1つ以上のウイルスベクターが、1つ以上のレトロウイルスレンチウイルスアデノウイルスアデノ随伴又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項18に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項20

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が送達系に含まれる、請求項14又は15に記載の方法、組成物、又は使用、又は前記1つ以上のベクターが送達系に含まれる、請求項16又は17に記載の方法、組成物、又は使用、又は前記アセンブルされた複合体が送達系に含まれる、請求項1〜13又は58〜59のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項21

前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が、1つ又は複数のリポソーム、1つ又は複数の粒子、1つ又は複数のエキソソーム、1つ又は複数の微小胞遺伝子銃又は1つ以上のウイルスベクターを含む送達媒体によって送達される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項22

請求項1〜21のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する組成物である、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。

請求項23

1つ以上のNLS又はNESに融合したC2c2エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、ここで少なくとも前記1つ以上の核酸成分はエンジニアリングされ、前記1つ以上の核酸成分が複合体を目的の哺乳類標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、組成物。

請求項24

前記目的の標的遺伝子座がRNAを含む、請求項23に記載の組成物。

請求項25

前記目的の標的遺伝子座の前記改変が鎖切断を含む、請求項23又は24に記載の組成物。

請求項26

前記C2c2エフェクタータンパク質が哺乳類細胞での発現にコドン最適化される、請求項23又は24に記載の組成物。

請求項27

前記C2c2エフェクタータンパク質が1つ以上の機能ドメインに会合し;及び任意選択で前記エフェクタータンパク質が、R597A、H602A、R1278A、及び/又はH1283Aなど、1つ以上の突然変異を任意選択でHEPNドメイン内に含み、それにより前記複合体はエピジェネティックモディファイヤー又は転写若しくは翻訳活性化若しくは抑制シグナルを送達することができる、請求項23又は24に記載の組成物。

請求項28

前記機能ドメインが前記標的遺伝子座の転写又は翻訳を改変する、請求項27に記載の組成物。

請求項29

前記目的の標的遺伝子座が細胞内の核酸分子に含まれる、請求項27又は28に記載の組成物。

請求項30

前記エフェクタータンパク質と複合体化したとき、1つ又は複数の前記核酸成分が、前記目的の標的遺伝子座の標的配列に対する前記複合体の配列特異的結合を生じさせる能力を有する、請求項27〜29のいずれか一項に記載の組成物。

請求項31

1つ又は複数の前記核酸成分がデュアルダイレクトリピート配列を含む、請求項27〜30のいずれか一項に記載の組成物。

請求項32

前記エフェクタータンパク質及び1つ又は複数の前記核酸成分が、前記ポリペプチド及び/又は1つ又は複数の前記核酸成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供され、及び前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が前記ポリペプチド及び/又は1つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成される、請求項27〜31のいずれか一項に記載の組成物。

請求項33

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が、前記ポリペプチド及び/又は1つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成された1つ以上の調節エレメントを含み、任意選択で前記1つ以上の調節エレメントが1つ又は複数のプロモーター又は1つ又は複数の誘導性プロモーターを含む、請求項32に記載の組成物。

請求項34

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が1つ以上のベクター内に含まれる、請求項32又は33に記載の組成物。

請求項35

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が1つのベクター内に含まれる、請求項32又は33に記載の組成物。

請求項36

前記1つ以上のベクターがウイルスベクターを含む、請求項34又は35に記載の組成物。

請求項37

前記1つ以上のウイルスベクターが、1つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項36に記載の組成物。

請求項38

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が送達系に含まれる、請求項32又は33に記載の組成物、又は前記1つ以上のベクターが送達系に含まれる、請求項34又は35に記載の組成物、又は前記アセンブルされた複合体が送達系に含まれる、請求項23〜31のいずれか一項に記載の組成物。

請求項39

前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が、1つ又は複数のリポソーム、1つ又は複数の粒子、1つ又は複数のエキソソーム、1つ又は複数の微小胞、遺伝子銃又は1つ以上のウイルスベクターを含む送達媒体によって送達される、請求項1〜38のいずれか一項に記載の組成物。

請求項40

1つ以上のベクターを含むベクター系であって、前記1つ以上のベクターが、請求項1〜39のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、ベクター系。

請求項41

請求項1〜40のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する組成物である、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物のC2c2エフェクタータンパク質及び1つ以上の核酸成分を送達するように構成された送達系。

請求項42

1つ以上のベクター又は1つ以上のポリヌクレオチド分子を含み、前記1つ以上のベクター又はポリヌクレオチド分子が、請求項1〜41のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の前記C2c2エフェクタータンパク質及び1つ以上の核酸成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、請求項41に記載の送達系。

請求項43

治療的処置方法における使用のための先行する又は後続の請求項のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系。

請求項44

先行する又は後続の請求項のいずれか一項に記載の方法により改変された、又は組成物又はその構成成分を任意選択で誘導可能に又は構成的に含む又は発現するようにエンジニアリングされた哺乳類細胞。

請求項45

前記改変が、−少なくとも1つのRNA産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞;−少なくとも1つのRNA産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞であって、前記少なくとも1つの産物の発現が増加するもの;又は−少なくとも1つのRNA産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞であって、前記少なくとも1つ産物の発現が低下するものをもたらす、請求項44に記載の哺乳類細胞。

請求項46

哺乳類細胞におけるインビボ又はエキソビボでの使用:−RNA配列特異的干渉、−RNA配列特異的遺伝子調節、−RNA又はRNA産物又はlincRNA又は非コードRNA、又は核RNA、又はmRNAスクリーニング、−突然変異誘発、−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、−育種、−インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞成長及び/又は細胞増殖の低減、−インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は−インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導のための、請求項1〜45のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系。

請求項47

請求項44又は45に記載の細胞、又はその子孫の、又はそれを含む細胞株

請求項48

請求項44又は45に記載の1つ以上の細胞を含む哺乳類。

請求項49

請求項44又は45に記載の1つ以上の細胞を含む哺乳類モデルであって;1つ又は複数の前記細胞が、請求項1〜48のいずれか一項に記載の組成物又はその構成成分を任意選択で誘導可能に又は構成的に発現する、哺乳類モデル。

請求項50

請求項44又は45に記載の細胞、又は請求項47又は48に記載の細胞株又は生物又は請求項49に記載の哺乳類モデルからの産物であって;前記細胞又は前記細胞株若しくは哺乳類若しくは哺乳類モデルの1つ又は複数の細胞が、請求項1〜49のいずれか一項に記載の組成物又はその構成成分を任意選択で誘導可能に又は構成的に発現する、産物。

請求項51

産物量が、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法又は組成物による変化又は改変を有していない細胞からの産物量より多い又は少ない、請求項50に記載の産物。

請求項52

前記産物が、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法又は組成物による変化又は改変を有していない前記細胞からの産物と比較して変化する、請求項50に記載の産物。

請求項53

先行する又は後続の請求項のいずれか一項に記載の系又は方法又は細胞を含むアッセイスクリーニング方法又は突然変異誘発方法。

請求項54

RNAベースのアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法における、向上が含み、RNAを使用する代わりに、前記方法が、請求項1〜53のいずれか一項に記載の組成物を使用することを含む、方法

請求項55

前記RNAベースのアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法がRNAi又は蛍光インサイチュハイブリダイゼーション方法である、請求項53に記載の方法。

請求項56

好ましくはインビボ又はエキソビボでの、哺乳類細胞における−RNA配列特異的干渉、−RNA配列特異的遺伝子調節、−RNA又はRNA産物又はlincRNA又は非コードRNA、又は核RNA、又はmRNAのスクリーニング、−突然変異誘発、−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、−育種、−インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞成長及び/又は細胞増殖の低減、−インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は−インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導;のための、請求項1〜55のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系の使用。

請求項57

前記方法が、−RNA配列特異的干渉、−RNA配列特異的遺伝子調節、−RNA又はRNA産物又はlincRNA又は非コードRNA、又は核RNA、又はmRNAのスクリーニング、−突然変異誘発、−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、−育種、−インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞成長及び/又は細胞増殖の低減、−インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は−インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導をもたらす、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法又は使用。

請求項58

哺乳類細胞における−RNA配列特異的干渉、−RNA配列特異的遺伝子調節、−RNA又はRNA産物又はlincRNA又は非コードRNA、又は核RNA、又はmRNAのスクリーニング、−突然変異誘発、−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、−育種、−インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞成長及び/又は細胞増殖の低減、−インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は−インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導のための方法であって、請求項1〜57のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系をインビトロ、エキソビボ、又はインビボで標的細胞に導入又は誘導することを含む、方法。

請求項59

目的の哺乳類標的遺伝子座の翻訳を調節する方法であって、1つ以上の局在化シグナル並びに翻訳アクチベーター又は翻訳リプレッサーなどの(異種)翻訳調節因子に融合したC2c2エフェクタータンパク質と;1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで少なくとも前記1つ以上の核酸成分はエンジニアリングされ、前記1つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合し、好ましくは前記異種ドメインEIF4EなどのEIF4である、方法。

請求項60

前記C2c2エフェクタータンパク質が触媒不活性である、請求項59に記載の方法。

請求項61

前記C2c2が、レプトリキアシャーイイ(Leptotrichiashahii)C2c2、レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichiawadei)F0279(Lw2)C2c2、リステリア・ゼーリゲリ(Listeriaseeligeri)C2c2、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌MA2020C2c2、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179C2c2、クロストリジウムアミノフィルム(Clostridiumaminophilum)DSM10710C2c2、カルバクテリウム・ガリナルム(Carnobacteriumgallinarum)DSM4847C2c2、カルノバクテリウム・ガリナルム(Carnobacteriumgallinarum)DSM4847C2c2、パルディバクター・プロピニシゲネス(Paludibacterpropionicigenes)WB4C2c2、リステリア・ウェイヘンステファネンシス(Listeriaweihenstephanensis)FSLR9−0317、C2c2、リステリア科(Listeriaceae)細菌FSLM6−0635C2c2、レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichiawadei)F0279C2c2、ロドバクターカプスラータス(Rhodobactercapsulatus)SB1003C2c2、ロドバクター・カプスラータス(Rhodobactercapsulatus)R121C2c2、ロドバクター・カプスラータス(Rhodobactercapsulatus)DE442C2c2を含む群から選択される、請求項1〜60のいずれか一項に記載の方法、組成物、使用、ベクター系、送達系、細胞、哺乳類、哺乳類モデル、産物、又はアッセイ。

請求項62

前記C2c2が、レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichiawadei)F0279(Lw又はLw2)C2c2又はリステリア・ニューヨーケンシス(Listerianewyorkensis)FSLM6−0635(LbFSL)C2c2である、請求項1〜59のいずれか一項に記載の方法、組成物、使用、ベクター系、送達系、細胞、哺乳類、哺乳類モデル、産物、又はアッセイ。

請求項63

試料中の標的RNAを検出する方法であって、(a)前記試料をi)RNAを切断する能力を有するVI型RISPR−Casエフェクタータンパク質、ii)前記標的RNAにハイブリダイズする能力を有するガイドRNA、及びiii)前記エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するRNAベースの切断誘導可能レポーターインキュベートすること、(b)前記RNAベースの切断誘導可能レポーターの切断によって生成されるシグナルに基づき前記標的RNAを検出することを含む方法。

請求項64

前記VI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質がC2c2エフェクタータンパク質である、請求項63に記載の方法。

請求項65

前記RNAベースの切断誘導可能レポーター構築物蛍光色素及び消光剤を含む、請求項63に記載の方法。

請求項66

前記試料が無細胞生体試料を含む、請求項63に記載の方法。

請求項67

前記試料が細胞試料を含む、請求項63に記載の方法。

請求項68

前記細胞試料が植物細胞を含む、請求項67に記載の方法。

請求項69

前記細胞試料が動物細胞を含む、請求項67に記載の方法。

請求項70

前記細胞試料が癌細胞を含む、請求項67に記載の方法。

請求項71

前記標的RNAが病原体RNAを含む、請求項63に記載の方法。

請求項72

前記病原体が、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫を含む、請求項71に記載の方法。

請求項73

標的RNAの一塩基変異多型又はRNA転写物スプライス変異体を検出するように設計されたガイドRNAを含む、請求項63に記載の方法。

請求項74

前記ガイドRNAが標的RNAとのミスマッチヌクレオチドを1つ以上含む、請求項63に記載の方法。

請求項75

前記ガイドRNAが、疾患状態診断指標となる標的分子に結合する、請求項63に記載の方法。

請求項76

前記疾患状態が癌を含む、請求項75に記載の方法。

請求項77

前記疾患状態が自己免疫疾患を含む、請求項75に記載の方法。

請求項78

前記C2c2エフェクタータンパク質が、レプトトリキア属(Leptotrichia)、リステリア属(Listeria)、コリネバクター属(Corynebacter)、ステレラ属(Sutterella)、レジオネラ属(Legionella)、トレポネーマ属(Treponema)、フィリファクター属(Filifactor)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、バクテロイデス属(Bacteroides)、フライボラ属(Flaviivola)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、スフェロヘータ属(Sphaerochaeta)、アゾスピリラム属(Azospirillum)、グルコンアセトバクター属(Gluconacetobacter)、ナイセリア属(Neisseria)、ロゼブリア属(Roseburia)、パルビバクラム属(Parvibaculum)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ニトラチフラクター属(Nitratifractor)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)及びカンピロバクター属(Campylobacter)からなる群から選択される生物由来である、請求項63に記載の方法。

請求項79

リボ核酸(RNA)検出系であって、a)RNAを切断する能力を有するVI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質、b)標的RNAに結合する能力を有するガイドRNA、及びc)前記エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するRNAベースの切断誘導可能レポーターを含む、RNA検出系。

請求項80

前記VI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質がC2c2エフェクタータンパク質である、請求項79に記載のRNA検出系。

請求項81

前記RNAベースの切断誘導可能レポーター構築物が蛍光色素及び消光剤を含む、請求項79に記載のRNA検出系。

請求項82

前記VI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質が、レプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichiashahii)C2c2、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌MA2020C2c2、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179C2c2、クロストリジウム・アミノフィルム(Clostridiumaminophilum)(DSM10710)C2c2、カルノバクテリウム・ガリナルム(Carnobacteriumgallinarum)(DSM4847)C2c2、パルディバクター・プロピオニシゲネス(Paludibacterpropionicigenes)(WB4)C2c2、リステリア・ウェイヘンステファネンシス(Listeriaweihenstephanensis)(FSLR9−0317)C2c2、リステリア科(Listeriaceae)細菌(FSLM6−0635)C2c2、リステリア・ニューヨーケンシス(Listerianewyorkensis)(FSLM6−0635)C2c2、レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichiawadei)(F0279)C2c2、ロドバクター・カプスラータス(Rhodobactercapsulatus)(SB1003)C2c2、ロドバクター・カプスラータス(Rhodobactercapsulatus)(R121)C2c2、ロドバクター・カプスラータス(Rhodobactercapsulatus)(DE442)C2c2、レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichiawadei)(Lw2)C2c2、又はリステリア・ゼーリゲリ(Listeriaseeligeri)C2c2のうちのいずれかの野生型配列と少なくとも80%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項63に記載の方法又は請求項79に記載のRNA検出系。

請求項83

前記VI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質が少なくとも1つのHEPNドメインを含む、請求項63に記載の方法又は請求項79に記載のRNA検出系。

請求項84

前記VI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質が2つのHEPNドメインを含む、請求項63に記載の方法又は請求項79に記載のRNA検出系。

請求項85

前記VI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質が、RxxxxHモチーフを含む少なくとも1つの触媒活性HEPNドメインを含む、請求項63に記載の方法又は請求項79に記載のRNA検出系。

請求項86

前記VI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質が、RxxxxHモチーフを各々含む2つの触媒活性HEPNドメインを含む、請求項63に記載の方法又は請求項79に記載のRNA検出系。

請求項87

前記VI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質が、野生型RxxxxHモチーフのR又はHのうちの少なくとも一方の突然変異から得られる少なくとも1つの触媒不活性HEPNドメインを含む、請求項63に記載の方法又は請求項79に記載のRNA検出系。

請求項88

前記VI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質が、野生型RxxxxHモチーフのR又はHのうちの少なくとも一方の突然変異から各々得られる2つの触媒不活性HEPNドメインを含む、請求項63に記載の方法又は請求項79に記載のRNA検出系。

請求項89

a)RNAを切断する能力を有するVI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質、及びb)前記エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するRNAベースの切断誘導可能レポーターを含む、キット

請求項90

2つの異なる触媒不活性C2c2エフェクタータンパク質を含む組成物。

請求項91

前記異なるC2c2エフェクタータンパク質の各々が異なるレポーター分子に連結される、請求項90に記載の組成物。

請求項92

前記レポーター分子が、異なるエピトープタグ及び/又は蛍光(flourescent)分子から個別に選択される、請求項90又は91に記載の組成物。研究及び診断用途並びに好ましくは多色イメージングのための、請求項90〜92のいずれか一項に記載の組成物の使用。

請求項93

1つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基を有するC2c2エフェクタータンパク質であって、前記1つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基が、C2c2コンセンサス付番に基づいて、K2、K39、V40、E479、L514、V518、N524、G534、K535、E580、L597、V602、D630、F676、L709、I713、R717(HEPN)、N718、H722(HEPN)、E773、P823、V828、I879、Y880、F884、Y997、L1001、F1009、L1013、Y1093、L1099、L1111、Y1114、L1203、D1222、Y1244、L1250、L1253、K1261、I1334、L1355、L1359、R1362、Y1366、E1371、R1372、D1373、R1509(HEPN)、H1514(HEPN)、Y1543、D1544、K1546、K1548、V1551、I1558に対応するC2c2のアミノ酸残基のうちの1つ以上であり、好ましくは、C2c2コンセンサス付番に基づいて、K2、K39、V40、E479、L514、V518、N524、G534、K535、E580、D630、F676、L709、I713、R717(HEPN)、N718、H722(HEPN)、E773、P823、V828、I879、Y880、F884、Y997、L1001、F1009、L1013、Y1093、L1099、L1111、Y1114、L1203、D1222、Y1244、L1250、L1253、K1261、I1334、L1355、L1359、R1362、Y1366、E1371、R1372、D1373、R1509(HEPN)、H1514(HEPN)、Y1543、D1544、K1546、K1548、V1551、I1558に対応するC2c2のアミノ酸残基のうちの1つ以上から選択されるか;前記1つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基が、図67に示されるとおりのコンセンサス配列に基づいて、M35、K36、T38、K39、I57、E65、G66、L68、N84、T86、E88、I103、N105、E123、R128、R129、K139、L152、L194、N196、K198、N201、Y222、D253、I266、F267、S280、I303、N306、R331、Y338、K389、Y390、K391、I434、K435、L458、D459、E462、L463、I478、E479、K494、R495、N498、S501、E519、N524、Y529、V530、G534、K535、Y539、T549、D551、R577、E580、A581、F582、I587、A593、L597、I601、L602、E611、E613、D630、I631、G633、K641、N646、V669、F676、S678、N695、E703、A707、I709、I713、I716、R717、H722、F740、F742、K768、I774、K778、I783、L787、S789、V792、Y796、D799、F812、N818、P820、F821、V822、P823、S824、F825、Y829、K831、D837、L852、F858、E867、A871、L875、K877、Y880、Y881、F884、F888、F896、N901、V903、N915、K916、R918、Q920、E951、P956、Y959、Q964、I969、N994、F1000、I10001、Q1003、F10005、K1007、G1008、F1009、N1019、L1020、K1021、I1023、N1028、E1070、I1075、K1076、F1092、K1097、L1099、L1104、L1107、K1113、Y1114、E1149、E1151、I1153、L1155、L1158、D1166、L1203、D1222、G1224、I1228、R1236、K1243、Y1244、G1245、D1255、K1261、S1263、L1267、E1269、K1274、I1277、E1278、L1289、H1290、A1294、N1320、K1325、E1327、Y1328、I1334、Y1337、K1341、N1342、K1343、N1350、L1352、L1355、L1356、I1359、L1360、R1362、V1363、G1364、Y1365、I1369、R1371、D1372、F1385、E1391、D1459、K1463、K1466、R1509、N1510、I1512、A1513、H1514、N1516、Y1517、L1529、L1530、E1534、L1536、R1537、Y1543、D1544、R1545、K1546、L1547、K1548、N1549、A1550、K1553、S1554、D1557、I1558、L1559、G1563、F1568、I1612、L1651、E1652、K1655、H1658、L1659、K1663、T1673、S1677、E1678、E1679、C1681、V1684、K1685、E1689に対応するC2c2のアミノ酸残基のうちの1つ以上であるか;又は前記1つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基が、図66に示されるとおりのコンセンサス配列に基づいて、K28、K31、R44、E162、E184、K262、E288、K357、E360、K338、R441(HEPN)、H446(HEPN)、E471、K482、K525、K558、D707、R790、K811、R833、E839、R885、E894、R895、D896、K942、R960(HEPN)、H965(HEPN)、D990、K992、K994に対応するC2c2のアミノ酸残基のうちの1つ以上である、C2c2エフェクタータンパク質。

請求項94

目的の標的遺伝子座を改変する方法であって、請求項93に記載のC2c2エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここで少なくとも前記1つ以上の核酸成分はエンジニアリングされ、前記1つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、方法。

請求項95

請求項1に記載のC2c2エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、ここで少なくとも前記1つ以上の核酸成分は目的の標的遺伝子座の改変における使用のためにエンジニアリングされ、前記1つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、組成物。

請求項96

請求項93に記載のC2c2エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の使用であって、ここで少なくとも前記1つ以上の核酸成分は目的の標的遺伝子座を改変するためにエンジニアリングされ、前記1つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、使用。

請求項97

前記目的の標的遺伝子座がRNAを含む、請求項93〜96のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項98

前記目的の標的遺伝子座の前記改変が鎖切断を含む、請求項93〜97のいずれか一項に記載の方法。

請求項99

前記C2c2エフェクタータンパク質が真核細胞での発現にコドン最適化される、請求項93〜98のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項100

前記C2c2エフェクタータンパク質が1つ以上の機能ドメインに会合し;及び任意選択で前記エフェクタータンパク質が、R597A、H602A、R1278A、及び/又はH1283Aなど、1つ以上の突然変異を任意選択でHEPNドメイン内に含み、それにより前記複合体はエピジェネティックモディファイヤー又は転写若しくは翻訳活性化若しくは抑制シグナルを送達することができる、請求項93〜99のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項101

前記機能ドメインが前記標的遺伝子座の転写又は翻訳を改変する、請求項100に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項102

前記C2c2エフェクタータンパク質が少なくとも1つ以上の核局在化シグナル又は核外移行シグナルを含む、請求項93〜101のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項103

前記目的の標的遺伝子座がインビトロで核酸分子に含まれる、請求項93〜102のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項104

前記目的の標的遺伝子座が細胞内の核酸分子に含まれる、請求項93〜10のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項105

前記細胞が原核細胞を含む、請求項104に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項106

前記細胞が真核細胞を含む、請求項12に記載の方法。

請求項107

前記改変がインビトロ、インビボ又はエキソビボである、請求項93〜106のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項108

前記エフェクタータンパク質と複合体化したとき、1つ又は複数の前記核酸成分が、前記目的の標的遺伝子座の標的配列に対する前記複合体の配列特異的結合を生じさせる能力を有する、請求項93〜107のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項109

1つ又は複数の前記核酸成分がデュアルダイレクトリピート配列を含む、請求項93〜108のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項110

前記エフェクタータンパク質及び1つ又は複数の前記核酸成分が、前記ポリペプチド及び/又は1つ又は複数の前記核酸成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供され、及び前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が前記ポリペプチド及び/又は1つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成される、請求項93〜109のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項111

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が、前記ポリペプチド及び/又は1つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成された1つ以上の調節エレメントを含み、任意選択で前記1つ以上の調節エレメントが1つ又は複数のプロモーター又は1つ又は複数の誘導性プロモーターを含む、請求項110に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項112

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が1つ以上のベクター内に含まれる、請求項110又は111に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項113

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が1つのベクター内に含まれる、請求項110又は111に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項114

前記1つ以上のベクターがウイルスベクターを含む、請求項112又は113に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項115

前記1つ以上のウイルスベクターが、1つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項114に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項116

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が送達系に含まれる、請求項110又は111に記載の方法、組成物、又は使用、又は前記1つ以上のベクターが送達系に含まれる、請求項112又は113に記載の方法、組成物、又は使用、又は前記アセンブルされた複合体が送達系に含まれる、請求項93〜109のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項117

前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が、1つ又は複数のリポソーム、1つ又は複数の粒子、1つ又は複数のエキソソーム、1つ又は複数の微小胞、遺伝子銃又は1つ以上のウイルスベクターを含む送達媒体によって送達される、請求項93〜116のいずれか一項に記載の方法、組成物、又は使用。

請求項118

請求項93〜117のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する組成物である、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物。

請求項119

C2c2エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、ここで少なくとも前記1つ以上の核酸成分はエンジニアリングされ、前記1つ以上の核酸成分が複合体を前記目的の標的に導き、及び前記エフェクタータンパク質が前記1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、及び前記複合体が前記目的の標的遺伝子座に結合する、組成物。

請求項120

前記目的の標的遺伝子座がRNAを含む、請求項119に記載の組成物。

請求項121

前記目的の標的遺伝子座の前記改変が鎖切断を含む、請求項119又は120に記載の組成物。

請求項122

前記C2c2エフェクタータンパク質が真核細胞での発現にコドン最適化される、請求項119又は120に記載の組成物。

請求項123

前記C2c2エフェクタータンパク質が1つ以上の機能ドメインに会合し;及び任意選択で前記エフェクタータンパク質が、R597A、H602A、R1278A、及び/又はH1283Aなど、1つ以上の突然変異を任意選択でHEPNドメイン内に含み、それにより前記複合体はエピジェネティックモディファイヤー又は転写若しくは翻訳活性化若しくは抑制シグナルを送達することができる、請求項119又は120に記載の組成物。

請求項124

前記機能ドメインが前記標的遺伝子座の転写又は翻訳を改変する、請求項123に記載の組成物。

請求項125

前記C2c2エフェクタータンパク質が少なくとも1つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項119〜124のいずれか一項に記載の組成物。

請求項126

前記目的の標的遺伝子座がインビトロで核酸分子に含まれる、請求項119に記載の組成物。

請求項127

前記目的の標的遺伝子座が細胞内の核酸分子に含まれる、請求項119に記載の組成物。

請求項128

前記細胞が原核細胞を含む、請求項127に記載の組成物。

請求項129

前記細胞が真核細胞を含む、請求項127に記載の組成物。

請求項130

前記エフェクタータンパク質と複合体化したとき、1つ又は複数の前記核酸成分が、前記目的の標的遺伝子座の標的配列に対する前記複合体の配列特異的結合を生じさせる能力を有する、請求項119〜129のいずれか一項に記載の組成物。

請求項131

1つ又は複数の前記核酸成分がデュアルダイレクトリピート配列を含む、請求項119〜130のいずれか一項に記載の組成物。

請求項132

前記エフェクタータンパク質及び1つ又は複数の前記核酸成分が、前記ポリペプチド及び/又は1つ又は複数の前記核酸成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供され、及び前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が前記ポリペプチド及び/又は1つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成される、請求項119〜127のいずれか一項に記載の組成物。

請求項133

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が、前記ポリペプチド及び/又は1つ又は複数の前記核酸成分を発現するように作動可能に構成された1つ以上の調節エレメントを含み、任意選択で前記1つ以上の調節エレメントが1つ又は複数のプロモーター又は1つ又は複数の誘導性プロモーターを含む、請求項128に記載の組成物。

請求項134

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が1つ以上のベクター内に含まれる、請求項132又は133に記載の組成物。

請求項135

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が1つのベクター内に含まれる、請求項132又は133に記載の組成物。

請求項136

前記1つ以上のベクターがウイルスベクターを含む、請求項134又は135に記載の組成物。

請求項137

前記1つ以上のウイルスベクターが、1つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項136に記載の組成物。

請求項138

前記1つ以上のポリヌクレオチド分子が送達系に含まれる、請求項132又は133に記載の組成物、又は前記1つ以上のベクターが送達系に含まれる、請求項134又は135に記載の組成物、又は前記アセンブルされた複合体が送達系に含まれる、請求項119〜127のいずれか一項に記載の組成物。

請求項139

前記天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が、1つ又は複数のリポソーム、1つ又は複数の粒子、1つ又は複数のエキソソーム、1つ又は複数の微小胞、遺伝子銃又は1つ以上のウイルスベクターを含む送達媒体によって送達される、請求項1〜138のいずれか一項に記載の組成物。

請求項140

1つ以上のベクターを含むベクター系であって、前記1つ以上のベクターが、請求項1〜139のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成要素をコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、ベクター系。

請求項141

請求項1〜140のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する組成物である、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物のC2c2エフェクタータンパク質及び1つ以上の核酸成分を送達するように構成された送達系。

請求項142

請求項141に記載の送達系であって、1つ以上のベクター又は1つ以上のポリヌクレオチド分子を含み、前記1つ以上のベクター又はポリヌクレオチド分子が、請求項1〜141のいずれか一項に定義されるとおりの特徴を有する天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の前記C2c2エフェクタータンパク質及び1つ以上の核酸成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子を含む、送達系。

請求項143

治療的処置方法における使用のための先行する又は後続の請求項のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系。

請求項144

先行する又は後続の請求項のいずれか一項に記載の方法により改変された、又は組成物若しくはその構成成分を任意選択で誘導可能に又は構成的に含む若しくは発現するようにエンジニアリングされた細胞。

請求項145

前記改変が、−少なくとも1つのRNA産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞;−少なくとも1つのRNA産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞であって、前記少なくとも1つの産物の発現が増加するもの;又は−少なくとも1つのRNA産物の転写又は翻訳の変化を含む前記細胞であって、前記少なくとも1つ産物の発現が低下するものをもたらす、請求項144に記載の細胞。

請求項146

真核細胞を含む、請求項145に記載の細胞。

請求項147

哺乳類細胞を含む、請求項144又は145に記載の細胞。

請求項148

原核細胞を含む、請求項144に記載の細胞。

請求項149

−RNA配列特異的干渉、−RNA配列特異的遺伝子調節、−RNA又はRNA産物又はlincRNA又は非コードRNA、又は核RNA、又はmRNAのスクリーニング、−突然変異誘発、−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、−育種、−インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞成長及び/又は細胞増殖の低減、−インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は−インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導における使用のための、請求項1〜148のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系。

請求項150

請求項144〜148のいずれか一項に記載の細胞、又はその子孫の、又はそれを含む細胞株。

請求項151

請求項146又は147に記載の1つ以上の細胞を含む多細胞生物

請求項152

請求項144〜147のいずれか一項に記載の1つ以上の細胞を含む植物又は動物モデルであって;1つ又は複数の前記細胞が、請求項1〜151のいずれか一項に記載の組成物又はその構成成分を任意選択で誘導可能に又は構成的に発現する、植物又は動物モデル。

請求項153

請求項144〜148、150〜152のいずれか一項に記載の細胞、又は細胞株又は生物、又は植物若しくは動物モデルからの産物であって;前記細胞又は細胞株又は生物又は植物若しくは動物モデルの1つ又は複数の細胞が、請求項1〜152のいずれか一項に記載の前記組成物又はその構成成分を任意選択で誘導可能に又は構成的に発現する、産物。

請求項154

産物量が、請求項1〜153のいずれか一項に記載の方法又は組成物による変化又は改変を有していない細胞からの産物量より多い又は少ない、請求項153に記載の産物。

請求項155

前記産物が、請求項1〜154のいずれか一項に記載の方法又は組成物による変化又は改変を有していない前記細胞からの産物と比較して変化する、請求項153に記載の産物。

請求項156

先行する又は後続の請求項のいずれか一項に記載のシステム又は方法又は細胞を含むアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法。

請求項157

RNAベースのアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法における、向上が含み、RNAを使用する代わりに、前記方法が、請求項1〜156のいずれか一項に記載の組成物を使用することを含む、方法。

請求項158

前記RNAベースのアッセイ、スクリーニング方法又は突然変異誘発方法がRNAi又は蛍光インサイチュハイブリダイゼーション方法である、請求項157に記載の方法。

請求項159

−RNA配列特異的干渉、−RNA配列特異的遺伝子調節、−RNA又はRNA産物又はlincRNA又は非コードRNA、又は核RNA、又はmRNAのスクリーニング、−突然変異誘発、−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、−育種、−インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞成長及び/又は細胞増殖の低減、−インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は−インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導のための、請求項1〜158のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系の使用。

請求項160

前記方法が、−RNA配列特異的干渉、−RNA配列特異的遺伝子調節、−RNA又はRNA産物又はlincRNA又は非コードRNA、又は核RNA、又はmRNAのスクリーニング、−突然変異誘発、−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、−育種、−インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞成長及び/又は細胞増殖の低減、−インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は−インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導をもたらす、請求項93〜117のいずれか一項に記載の方法又は使用。

請求項161

−RNA配列特異的干渉、−RNA配列特異的遺伝子調節、−RNA又はRNA産物又はlincRNA又は非コードRNA、又は核RNA、又はmRNAのスクリーニング、−突然変異誘発、−蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、−育種、−インビトロ又はインビボでの細胞の休眠の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞周期停止の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞成長及び/又は細胞増殖の低減、−インビトロ又はインビボでの細胞アネルギーの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞アポトーシスの誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞壊死の誘導、−インビトロ又はインビボでの細胞死の誘導、又は−インビトロ又はインビボでのプログラム細胞死の誘導のための方法であって、請求項1〜160のいずれか一項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系をインビトロ、エキソビボ、又はインビボで標的細胞に導入又は誘導することを含む、方法。

技術分野

0001

関連出願及び参照による援用
本願は、2016年6月17日に出願された米国仮特許出願第62/351,662号明細書及び同第62/351,803号明細書、2016年8月17日に出願された米国仮特許出願第62/376,377号明細書、2016年10月19日に出願された米国仮特許出願第62/410,366号明細書、2016年12月9日に出願された米国仮特許出願第62/432,240号明細書、2017年3月15日に出願された米国仮特許出願第62/471,792号明細書、及び2017年4月12日に出願された米国仮特許出願第62/484,786号明細書に対する優先権を主張する。

0002

2017年3月15日に出願された米国仮特許出願第62/471,710号明細書(発明の名称「Novel Cas13B Orthologues CRISPR Enzymes and Systems」、代理人整理番号:BI−10157 VP 47627.04.2149)が参照される。更に、2016年12月9日に出願された米国仮特許出願第62/432,553号明細書、2017年2月8日に出願された米国仮特許出願第62/456,645号明細書、及び2017年3月15日に出願された米国仮特許出願第62/471,930号明細書(発明の名称「CRISPR Effector System Based Diagnostics」、代理人整理番号BI−10121 BROD0842P)及び2017年4月12日に出願された譲渡予定の米国仮特許出願(発明の名称「CRISPR Effector System Based Diagnostics」、代理人整理番号BI−10121 BROD 0843P)が参照される。

0003

本明細書に引用される文献中で引用又は参照される全ての文献は、本明細書で言及されるか又は本明細書に参照によって援用される任意の文献中にある任意の製品に関する任意の製造者指示書説明書製品仕様書、及びプロダクトシートと共に、本明細書によって参照により本明細書に援用され、且つ本発明の実施に用いられ得る。より具体的には、参照される全ての文献は、各個別の文献について参照によって援用されることが具体的且つ個別に指示されたものとするのと同程度に参照によって援用される。

0004

連邦政府支援研究に関する記載事項
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)から付与された助成金MH100706号及び第MH110049号に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。

0005

本発明は、概して、遺伝子転写物摂動又は核酸編集など、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復(CRISPR)及びその構成成分に関するベクター系を使用し得る配列ターゲティングを含む遺伝子発現の制御に用いられる系、方法及び組成物に関する。

背景技術

0006

ゲノムシーケンシング技法及び解析方法の最近の進歩により、様々な生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子カタログ化し及びマッピングする能力は急速に向上している。個々の遺伝エレメントを選択的に摂動させることによる原因遺伝的変異の体系的なリバースエンジニアリングを可能にするとともに合成生物学、バイオテクノロジー的、及び医学的応用を進歩させるには、正確なゲノムターゲティング技術が必要である。標的化したゲノム摂動を生じさせるためにデザイナージンクフィンガー転写アクチベーターエフェクター(TALE)、又はホーミングメガヌクレアーゼなどのゲノム編集技法が利用可能であるものの、新規戦略及び分子機構を利用した、且つ安価で、セットアップし易く、スケーリングが可能で、及び真核生物ゲノム及びトランスクリプトーム内の複数の位置を標的化するのに適した新規のゲノム及びトランスクリプトームエンジニアリング技術が依然として必要とされている。それは、ゲノムエンジニアリング及びバイオテクノロジーにおける新規適用の主要なリソースとなるであろう。

0007

細菌及び古細菌適応免疫のCRISPR−Cas系は、タンパク質組成及びゲノム遺伝子座構成に関して極めて高度な多様性を示す。CRISPR−Cas系遺伝子座は50を超える遺伝子ファミリーを有し、厳密な意味で普遍的な遺伝子はないことから、急速な進化及び遺伝子座構成の極めて高度な多様性が示唆される。これまでのところ、多方向からの手法をとることにより、93個のCasタンパク質について約395個のプロファイルのcas遺伝子が包括的に同定されている。分類に含まれるのは、シグネチャ遺伝子プロファイル+遺伝子座構成のシグネチャである。CRISPR−Cas系の新規分類が提案されており、ここではこれらの系が大まかに2つのクラス、マルチサブユニットエフェクター複合体を有するクラス1と、Cas9タンパク質に例示される単一サブユニットエフェクターモジュールを有するクラス2とに分けられる。クラス2 CRISPR−Cas系に関連する新規エフェクタータンパク質は、強力なゲノムエンジニアリングツールとして開発することができ、推定上の新規エフェクタータンパク質の予測並びにそれらのエンジニアリング及び最適化が重要である。

0008

CRISPR−Cas適応免疫系は微生物をDNA又はRNA−DNA干渉によって外来遺伝要素から防御する。最近になって、クラス2 VI型単一成分CRISPR−CasエフェクターC2c2(Shmakov et al.(2015)「多様なクラス2 CRISPR−Cas系の発見及び機能的特徴付け(Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR−Cas Systems)」;Molecular Cell 60:1−13;doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008)がRNAガイドRNアーゼとして特徴付けられた(Abudayyeh et al.(2016),Science,[Epub ahead of print],June 2;「C2c2は単一成分プログラム可能RNAガイド下RNAターゲティングCRISPRエフェクターである(C2c2 is a single−component programmable RNA−guided RNA−targeting CRISPR effector)」;doi:10.1126/science.aaf5573)。C2c2(例えばレプトリキアシャーイイ(Leptotrichia shahii)由来)はRNAファージ感染に対してロバストな干渉をもたらすことが実証された。インビトロ生化学分析及びインビボアッセイを通じて、3’H(非G)PAMが隣接するプロトスペーサーを有するssRNA標的を切断するようにC2c2をプログラムできることが示された。切断は、C2c2の2つの保存されたHEPNドメインにある触媒残基によって媒介され、それらのドメインにおける突然変異触媒不活性RNA結合タンパク質を生じさせる。C2c2は単一のガイドによって案内され、インビボで特定のmRNA枯渇させるように再プログラムされることができる。LshC2c2は目的の特異的部位に標的化することができ、且つひとたびコグネイト標的RNAでプライミングされると非特異的RNアーゼ活性を実行できることが示された。これらの結果はCRISPR−Cas系に関する我々の理解を広げるとともに、C2c2を生かして一連の広範なRNAターゲティングツールを開発できる可能性を示している。

0009

現在、C2c2はCas13aとして知られる。本明細書における用語「C2c2」が「Cas13a」と同義的に使用されることは理解されるであろう。

0010

本願における任意の文書の引用又は特定は、かかる文書が本発明の先行技術として利用可能であることを承認するものではない。

課題を解決するための手段

0011

多岐にわたる適用、詳細には真核生物系、より詳細には哺乳類系における適用を持つ、核酸又はポリヌクレオチド(例えばDNA又はRNA又はこれらの任意のハイブリッド若しくは誘導体)を標的化するための代替的且つロバストなシステム及び技法が喫緊に必要とされている。本発明はこの必要性に応え、関連する利点を提供する。本願の新規RNAターゲティング系がゲノム、トランスクリプトーム、及びエピゲノムターゲティング技術のレパートリーに加わることにより、詳細には真核生物系、より詳細には哺乳類系(細胞器官組織、又は生物を含む)及び植物系における、直接的な検出、分析及び操作を通じた特定の標的部位の研究及び摂動又は編集が変わり得る。本願のRNAターゲティング系を有害作用なしにRNAターゲティングに有効に利用するためには、これらのRNAターゲティングツールのエンジニアリング及び最適化の側面を理解することが決定的に重要である。

0012

CRISPR−Cas13ファミリーは、CRISPR系のシグネチャに関する細菌ゲノムコンピュータマイニングによって発見されたもので(Shmakov,S.et al.「多様なクラス2 CRISPR−Cas系の発見及び機能的特徴付け(Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR−Cas Systems)」.Mol Cell 60,385−397,doi:10.1016/j.molcel.2015.10.008(2015))、シングルエフェクターRNAガイド下RNアーゼCas13a/C2c2(Abudayyeh,O.O.et al.「C2c2は単一成分プログラム可能RNAガイド下RNAターゲティングCRISPRエフェクターである(C2c2 is a single−component programmable RNA−guided RNA−targeting CRISPR effector)」.Science 353,aaf5573,doi:10.1126/science.aaf5573(2016))及び後にシングルエフェクターRNAガイド下RNアーゼCas13b(Shmakov,S.et al.「クラス2 CRISPR−Cas系の多様性と進化(Diversity and evolution of class 2 CRISPR−Cas systems)」.Nat Rev Microbiol 15,169−182,doi:10.1038/nrmicro.2016.184(2017);Smargon,A.A.et al.「Cas13bは、アクセサリータンパク質Csx27及びCsx28によって差次的に調節されるVI−B型CRISPR関連RNAガイド下RNアーゼである(Cas13b Is a Type VI−B CRISPR−Associated RNA−GuidedRNaseDifferentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28)」.Mol Cell 65,618−630 e617,doi:10.1016/j.molcel.2016.12.023(2017))が明らかとなった。Cas13aとしても知られるクラス2 VI型エフェクタータンパク質C2c2は、ssRNAを分解するように効率的にプログラムすることのできるRNAガイド下RNアーゼである。C2c2(Cas13a)は、CRISPR−Cas系に見られる他の公知のRNアーゼの触媒機構対照的に、その2つのHEPNドメイン内にある保存された塩基性残基によってRNA切断を実現する。HEPNドメインが4つの予測HEPNドメイン触媒残基のいずれかで(例えばアラニン置換など突然変異すると、C2c2は不活性プログラム可能RNA結合タンパク質(dCas9と似た、dC2c2)に変換される。

0013

RNAガイド下RNアーゼCas13は、そのプログラム可能性及び特異性により、トランスクリプトーム操作の理想的なプラットフォームとなり得る。本出願人らは、哺乳類転写物ノックダウン及び結合ツールとしての使用に向けたCas13aを開発する。レプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)由来のCas13a(LshCas13a)は、プログラム可能crRNAを使用して触媒不活性バージョンでロバストなRNA切断及び結合が可能であり、当該の切断はアイデンティティH(非グアニン)のプロトスペーサー隣接部位(PFS)として知られる直接3’側に隣接するモチーフに依存した(Abudayyeh,O.O.et al.「C2c2は単一成分プログラム可能RNAガイド下RNAターゲティングCRISPRエフェクターである(C2c2 is a single−component programmable RNA−guided RNA−targeting CRISPR effector)」.Science 353,aaf5573,doi:10.1126/science.aaf5573(2016))。RNAが切断されると、活性化したLshCas13aは、構成的RNアーゼ活性によって非標的RNAが切断される「コラテラル活性(collateral activity)」に関与する(Abudayyeh,O.O.et al.「C2c2は単一成分プログラム可能RNAガイド下RNAターゲティングCRISPRエフェクターである(C2c2 is a single−component programmable RNA−guided RNA−targeting CRISPR effector)」.Science 353,aaf5573,doi:10.1126/science.aaf5573(2016))。このcrRNAによってプログラムされるコラテラル活性は、細菌によるインビボプログラム細胞死を可能にすることにより感染の伝播を防止し(Abudayyeh,O.O.et al.「C2c2は単一成分プログラム可能RNAガイド下RNAターゲティングCRISPRエフェクターである(C2c2 is a single−component programmable RNA−guided RNA−targeting CRISPR effector)」.Science 353,aaf5573,doi:10.1126/science.aaf5573(2016))、及びインビトロで核酸の特異的検出に適用されている(Abudayyeh,O.O.et al.「C2c2は単一成分プログラム可能RNAガイド下RNAターゲティングCRISPRエフェクターである(C2c2 is a single−component programmable RNA−guided RNA−targeting CRISPR effector)」.Science 353,aaf5573,doi:10.1126/science.aaf5573(2016);East−Seletsky,A.et al.「CRISPR−C2c2の2つの異なるRNアーゼ活性がガイド−RNAプロセシング及びRNA検出を可能にする(Two distinctRNaseactivities of CRISPR−C2c2 enable guide−RNA processing and RNA detection)」.Nature 538,270−273,doi:10.1038/nature19802(2016))。コラテラル活性は、最近では、多くの臨床診断に有用なSHERLOCKと称される高感度・高特異性核酸検出プラットフォームに利用された(Gootenberg,J.S.et al.「CRISPR−Cas13a/C2c2による核酸検出(Nucleic acid detection with CRISPR−Cas13a/C2c2)」.Science 356,438−442(2017))。

0014

細菌学的及び続く生化学的特徴付けにおけるCas13aオルソログスクリーニングを経て、本出願人らはRNAエンドヌクレアーゼ活性に最適なオルソログ、レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadeii)のCas13a(LwaCas13a)を選択する。LwaCas13aは哺乳類細胞で安定に発現し、細胞においてレポーター及び内因性転写物の両方を有効にノックダウンするように再標的化することができ、観察可能なコラテラル活性なしにRNAiと比較して高度なターゲティング特異性のレベルを達成する。更に、本出願人らは、触媒不活性LwaCas13a(dCas13a)がインビボでRNA転写物にプログラム可能に結合し、細胞内の転写物のイメージングに使用し得ることを示す。dCas13aをベースとしたネガティブフィードバックイメージングシステムをエンジニアリングすることにより、生細胞においてストレス顆粒の形成を追跡することができる。

0015

dC2c2(dCas13a)が指定した配列に結合可能であれば、その能力を本発明に係る幾つかの態様に用いることにより、(i)エフェクターモジュールを特異的転写物に持ち込んで機能又は翻訳を調節する(これは大規模スクリーニング、合成調節回路構築及び他の目的に用い得る可能性がある);(ii)特異的RNAに蛍光タグを付加してその輸送及び/又は局在可視化する;(iii)特異的細胞内区画に親和性のあるドメインによってRNA局在を変化させる;及び(iv)特異的転写物を(dC2c2を直接プルダウンするか、又はdC2c2を用いてビオチンリガーゼ活性を特異的転写物に局在させることにより)捕捉してRNA及びタンパク質を含めた近接分子パートナーエンリッチすることができる。

0016

活性C2c2にもまた、多くの適用があるはずである。本発明のある態様は、ここでのRFPと同様に、特異的転写物を破壊の標的にすることを含む。加えて、C2c2は、ひとたびコグネイト標的によってプライミングされると、インビトロで他の(非相補的RNA分子を切断することができ、及びインビボで細胞成長阻害することができる。生物学的には、この雑多なRNアーゼ活性は、VI型CRISPR−Cas系のプログラム細胞死/休眠(PCD/D)に基づく防御機構を反映し得る。従って、本発明のある態様では、C2c2は、特異的細胞−例えば特定の転写物を発現する癌細胞所与のクラスのニューロン、特異的病原体に感染した細胞、又は他の異常な細胞若しくはその存在が他に望ましくない細胞にPCD又は休眠を惹起するために使用し得る可能性がある。

0017

本発明は、目的の標的遺伝子座、詳細には真核細胞、組織、器官、又は生物、より詳細には哺乳類細胞、組織、器官、又は生物の目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある核酸配列改変する方法を提供し、この方法は、VI型CRISPR−Cas遺伝子座エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここでエフェクタータンパク質は1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列はRNAを含み、及びエフェクタータンパク質はVI型CRISPR−Cas遺伝子座によってコードされる。複合体はインビトロ又はエキソビボで形成されて細胞に導入されるか、又はRNAと接触させてもよく;又はインビボで形成されてもよい。

0018

用語のCas酵素、CRISPR酵素、CRISPRタンパク質、Casタンパク質及びCRISPR Casは概して同義的に用いられ、Cas9に具体的に言及することによるなど、特に明らかでない限り、本明細書で言及する際は常に類推から本願に更に記載される新規CRISPRエフェクタータンパク質を指すことが理解されるであろう。本明細書に記載されるCRISPRエフェクタータンパク質は、好ましくはC2c2エフェクタータンパク質である。

0019

本発明は、目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列を標的化(改変など)する方法を提供し、この方法は、C2c2遺伝子座エフェクタータンパク質(これは触媒活性であっても、或いは触媒不活性であってもよい)と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を遺伝子座に関連する又はそこにある前記配列に送達することを含み、ここでC2c2エフェクタータンパク質は1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。好ましい実施形態において、C2c2エフェクタータンパク質は1つの核酸成分;有利にはエンジニアリングされた又は天然に存在しない核酸成分と複合体を形成する。複合体はインビトロ又はエキソビボで形成されて細胞に導入されるか、又はRNAと接触させてもよく;又はインビボで形成されてもよい。目的の標的遺伝子座に関連する又はそこにある配列の改変の誘導は、C2c2エフェクタータンパク質−核酸ガイド下であり得る。好ましい実施形態において、1つの核酸成分はCRISPR RNA(crRNA)である。好ましい実施形態において、1つの核酸成分は成熟crRNA又はガイドRNAであり、ここで成熟crRNA又はガイドRNAはスペーサー配列(又はガイド配列)及びダイレクトリピート配列又はこれらの誘導体を含む。好ましい実施形態において、スペーサー配列又はその誘導体はシード配列を含み、ここでシード配列は、標的遺伝子座における配列の認識及び/又はそれとのハイブリダイゼーションに決定的に重要である。

0020

本発明の態様は、1つ以上の天然に存在しない又はエンジニアリングされた又は改変された又は最適化された核酸成分を有するC2c2エフェクタータンパク質複合体に関する。好ましい実施形態において、この複合体の核酸成分は、ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含むことができ、ここでダイレクトリピート配列は1つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピートは16nt、例えば少なくとも28ntの最小長さ及び単一のステムループを有する。更なる実施形態において、ダイレクトリピートは長さが16ntより長く、好ましくは17ntより長く、例えば少なくとも28ntであり、且つ2つ以上のステムループ又は最適化された二次構造を有する。詳細な実施形態において、ダイレクトリピートは、25nt以上、例えば、26nt、27nt、28nt以上、及び1つ以上のステムループ構造を有する。好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは1つ以上のタンパク質結合RNAアプタマーを含むように改変されてもよい。好ましい実施形態において、ダイレクトリピートは1つ以上のタンパク質結合RNAアプタマーを含むように改変されてもよい。好ましい実施形態において、1つ以上のアプタマーは、最適化された二次構造の一部として含まれてもよい。かかるアプタマーはバクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。バクテリオファージコートタンパク質は、Qβ、F2、GA、fr、JP501、MS2、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、φCb5、φCb8r、φCb12r、φCb23r、7s及びPRR1を含む群から選択され得る。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質はMS2である。本発明はまた、30以上、40以上又は50以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する。

0021

本発明は、VI型エフェクタータンパク質及び/又はガイド及び/又はその標的核酸との複合体を含む細胞を提供する。特定の実施形態において、この細胞は、限定はされないが、酵母細胞植物細胞、哺乳類細胞、動物細胞、又はヒト細胞を含めた真核細胞である。

0022

本発明はまた、目的の標的遺伝子座、詳細には真核細胞、組織、器官、又は生物、より詳細には哺乳類細胞、組織、器官、又は生物の目的の標的遺伝子座を改変する方法も提供し、この方法は、C2c2遺伝子座エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここでC2c2エフェクタータンパク質は1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。複合体はインビトロ又はエキソビボで形成されて細胞に導入されるか、又はRNAと接触させてもよく;又はインビボで形成されてもよい。

0023

かかる方法において目的の標的遺伝子座はRNA分子(moledule)内に含まれてもよい。また、目的の標的遺伝子座はDNA分子内、及び特定の実施形態では転写されたDNA分子内に含まれてもよい。かかる方法において目的の標的遺伝子座はインビトロで核酸分子に含まれてもよい。

0024

かかる方法において目的の標的遺伝子座は、細胞内、詳細には真核細胞、例えば哺乳類細胞又は植物細胞内の核酸分子に含まれてもよい。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類ウシブタげっ歯類又はマウス細胞であってもよい。細胞は、家禽魚類又はエビなどの非哺乳類真核細胞であってもよい。植物細胞は、キャッサバトウモロコシモロコシコムギ、又はコメなどの作物植物であってもよい。植物細胞はまた、藻類樹木又は野菜であってもよい。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプンアルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のため細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。

0025

哺乳類細胞は、非ヒト哺乳動物、例えば、霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、げっ歯類、ウサギ科(Leporidae)、例えば、サル雌ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウサギラット又はマウス細胞であってもよい。細胞は、非哺乳類真核細胞、例えば、家禽類のトリ(例えば、ニワトリ)、脊椎動物魚類(例えば、サケ)又は甲殻類(例えば、カキハマグリ(claim)、ロブスター、エビ)細胞であってもよい。細胞はまた、植物細胞であってもよい。植物細胞は、単子葉植物又は双子葉植物のもの又は作物又は穀物植物のもの、例えば、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、ダイズ、コムギ、オートムギ又はコメであってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木又は生産植物、果実又は野菜のもの(例えば、柑橘類の木、例えば、オレンジグレーフルーツ又はレモンの木などの木;モモ又はネクタリンの木;リンゴ又はセイヨウナシの木;アーモンド又はクルミ又はピスチオの木などの堅果類の木;ナス科植物アブラナ属(Brassica)の植物;アキノノゲシ属(Lactuca)の植物;ホウレンソウ属(Spinacia)の植物;トウガラシ属(Capsicum)の植物;綿、タバコアスパラガスニンジンキャベツブロッコリーカリフラワートマトナスコショウレタス、ホウレンソウ、イチゴブルーベリーラズベリーブラックベリーブドウコーヒーココア等)であってもよい。

0026

本発明は、目的の標的遺伝子座を改変する方法を提供し、この方法は、VI型CRISPR−Cas遺伝子座エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここでエフェクタータンパク質は1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。

0027

本発明はまた、目的の標的遺伝子座を改変する方法も提供し、この方法は、C2c2遺伝子座エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、ここでC2c2エフェクタータンパク質は1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。好ましい実施形態において、改変は鎖切断の導入である。

0028

かかる方法において目的の標的遺伝子座はインビトロで核酸分子に含まれてもよい。かかる方法において目的の標的遺伝子座は細胞内の核酸分子に含まれてもよい。好ましくは、かかる方法において目的の標的遺伝子座はインビトロでRNA分子に含まれてもよい。また好ましくは、かかる方法において目的の標的遺伝子座は細胞内のRNA分子に含まれてもよい。細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。細胞は哺乳類細胞であってもよい。細胞はげ歯類細胞であってもよい。細胞はマウス細胞であってもよい。

0029

記載される方法の任意のものにおいて、目的の標的遺伝子座は目的のゲノム又はエピゲノム遺伝子座であってもよい。記載される方法の任意のものにおいて、複合体は、多重化した使用向けに複数のガイドと共に送達されてもよい。記載される方法の任意のものにおいて、2つ以上のタンパク質が用いられてもよい。

0030

本発明の更なる態様において、核酸成分はCRISPR RNA(crRNA)配列を含み得る。限定なしに、本出願人らは、かかる例において、pre−crRNAが、成熟crRNAを生じさせるプロセシング並びにエフェクタータンパク質へのcrRNAのローディングに十分な二次構造を含み得ると仮定する。例として、及び限定ではなく、かかる二次構造は、pre−crRNA内、より詳細にはダイレクトリピート内にあるステムループを含んでもよく、それから本質的になってもよく、又はそれからなってもよい。

0031

記載される方法の任意のものにおいて、エフェクタータンパク質及び核酸成分は、そのタンパク質及び/又は1つ又は複数の核酸成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子によって提供されてもよく、及びここで1つ以上のポリヌクレオチド分子は、タンパク質及び/又は1つ又は複数の核酸成分を発現するように作動可能に構成されている。1つ以上のポリヌクレオチド分子は、タンパク質及び/又は1つ又は複数の核酸成分を発現するように作動可能に構成された1つ以上の調節エレメントを含み得る。1つ以上のポリヌクレオチド分子は1つ以上のベクター内に含まれ得る。記載される方法のいずれにおいても、目的の標的遺伝子座は目的のゲノム又はエピゲノム遺伝子座であってもよい。記載される方法のいずれにおいても、複合体は多重化用途のため複数のガイドを伴い送達されてもよい。記載される方法のいずれにおいても、2つ以上のタンパク質が用いられてもよい。

0032

調節エレメントは誘導性プロモーターを含み得る。ポリヌクレオチド及び/又はベクター系は誘導性系を含み得る。

0033

記載される方法の任意のものにおいて、1つ以上のポリヌクレオチド分子は送達系に含まれてもよく、又は1つ以上のベクターが送達系に含まれてもよい。

0034

記載される方法の任意のものにおいて、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物は、リポソームナノ粒子を含む粒子エキソソーム微小胞遺伝子銃又は1つ以上のウイルスベクターによって送達されてもよい。

0035

本発明はまた、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供する。

0036

特定の実施形態において、従って本発明は、特に目的の標的遺伝子座を改変する能力を有する又は改変するように構成されている組成物など、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供し、前記組成物はVI型CRISPR−Cas遺伝子座エフェクタータンパク質と1つ以上の核酸成分とを含み、ここでエフェクタータンパク質は1つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が目的の遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質が目的の標的遺伝子座の改変を誘導する。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はC2c2遺伝子座エフェクタータンパク質であってもよい。

0037

本発明はまた、更なる態様において、特に目的の標的遺伝子座を改変する能力を有する又は改変するように構成されている組成物など、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供し、前記組成物は、(a)ガイドRNA分子(又は多重化のためなどの、ガイドRNA分子の組み合わせ、例えば、第1のガイドRNA分子及び第2のガイドRNA分子)又はガイドRNA分子をコードする核酸(又はガイドRNA分子の組み合わせをコードする1つ以上の核酸);(b)VI型CRISPR−Cas遺伝子座エフェクタータンパク質又はVI型CRISPR−Cas遺伝子座エフェクタータンパク質をコードする核酸を含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はC2c2遺伝子座エフェクタータンパク質であってもよい。

0038

本発明はまた、更なる態様において、(a)ガイドRNA分子(又はガイドRNA分子の組み合わせ、例えば、第1のガイドRNA分子及び第2のガイドRNA分子)又はガイドRNA分子をコードする核酸(又はガイドRNA分子の組み合わせをコードする1つ以上の核酸);(b)C2c2遺伝子座エフェクタータンパク質を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も提供する。

0039

本発明はまた、1つ以上のベクターを含むベクター系も提供し、この1つ以上のベクターは、本明細書に記載される方法に定義されるとおりの特徴を有する組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。

0040

本発明はまた、1つ以上のベクター又は1つ以上のポリヌクレオチド分子を含む送達系も提供し、この1つ以上のベクター又はポリヌクレオチド分子は、本明細書で考察するとおりの特徴を有するか又は本明細書に記載される方法のいずれかに定義される組成物である天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。

0041

本発明はまた、療法的治療方法に用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター又は送達系も提供する。療法的治療方法には、遺伝子若しくはトランスクリプトーム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。

0042

本発明はまた、エフェクタータンパク質の1つ以上のアミノ酸残基が改変されていてもよい方法及び組成物、例えば、エンジニアリングされた又は天然に存在しないエフェクタータンパク質又はC2c2も提供する。ある実施形態において、改変は、エフェクタータンパク質の1つ以上のアミノ酸残基の突然変異を含み得る。1つ以上の突然変異は、エフェクタータンパク質の1つ以上の触媒活性ドメインにあってもよい。このエフェクタータンパク質は、前記1つ以上の突然変異を欠くエフェクタータンパク質と比較してヌクレアーゼ活性が低下し又は消失していてもよい。このエフェクタータンパク質は、目的の標的遺伝子座におけるRNA鎖の切断を誘導しないことがあり得る。好ましい実施形態において、1つ以上の突然変異は2つの突然変異を含み得る。好ましい実施形態において、C2c2エフェクタータンパク質、例えば、エンジニアリングされた又は天然に存在しないエフェクタータンパク質又はC2c2において1つ以上のアミノ酸残基が改変される。詳細な実施形態において、1つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、突然変異R597A、H602A、R1278A及びH1283Aなど、R597、H602、R1278及びH1283(Lsh C2c2アミノ酸を基準とする)に対応するC2c2のアミノ酸残基のうちの1つ以上、又はLsh C2c2オルソログの対応するアミノ酸残基である。

0043

詳細な実施形態において、1つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、C2c2コンセンサス付番に基づいてK2、K39、V40、E479、L514、V518、N524、G534、K535、E580、L597、V602、D630、F676、L709、I713、R717(HEPN)、N718、H722(HEPN)、E773、P823、V828、I879、Y880、F884、Y997、L1001、F1009、L1013、Y1093、L1099、L1111、Y1114、L1203、D1222、Y1244、L1250、L1253、K1261、I1334、L1355、L1359、R1362、Y1366、E1371、R1372、D1373、R1509(HEPN)、H1514(HEPN)、Y1543、D1544、K1546、K1548、V1551、I1558に対応するC2c2のアミノ酸残基のうちの1つ以上である。特定の実施形態において、1つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、R717及びR1509に対応するC2c2のアミノ酸残基のうちの1つ以上である。特定の実施形態において、1つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、K2、K39、K535、K1261、R1362、R1372、K1546及びK1548に対応するC2c2のアミノ酸残基のうちの1つ以上である。特定の実施形態において、前記突然変異は、活性が変化した又は改変されたタンパク質を生じさせる。特定の実施形態において、前記突然変異は、特異性が増加するなど、活性が増加したタンパク質を生じさせる。特定の実施形態において、前記突然変異は、特異性が低下するなど、活性が低下したタンパク質を生じさせる。特定の実施形態において、前記突然変異は、触媒活性を有しないタンパク質(即ち「デッド」C2c2)を生じさせる。ある実施形態において、前記アミノ酸残基は、Lsh C2c2アミノ酸残基、又は別の種のC2c2タンパク質の対応するアミノ酸残基に対応する。

0044

特定の実施形態において、1つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、図3に示されるとおりの、即ちレプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)F0279(「Lew2」又は「Lw2」)とリステリアニューヨーケンシス(Listeria newyorkensis)FSL M6−0635(リステリア科(Listeriaceae)細菌FSL M6−0635としても知られる(「Lib」又は「LbFSL」))とのアラインメントに基づくコンセンサス配列を基準として、M35、K36、T38、K39、I57、E65、G66、L68、N84、T86、E88、I103、N105、E123、R128、R129、K139、L152、L194、N196、K198、N201、Y222、D253、I266、F267、S280、I303、N306、R331、Y338、K389、Y390、K391、I434、K435、L458、D459、E462、L463、I478、E479、K494、R495、N498、S501、E519、N524、Y529、V530、G534、K535、Y539、T549、D551、R577、E580、A581、F582、I587、A593、L597、I601、L602、E611、E613、D630、I631、G633、K641、N646、V669、F676、S678、N695、E703、A707、I709、I713、I716、R717、H722、F740、F742、K768、I774、K778、I783、L787、S789、V792、Y796、D799、F812、N818、P820、F821、V822、P823、S824、F825、Y829、K831、D837、L852、F858、E867、A871、L875、K877、Y880、Y881、F884、F888、F896、N901、V903、N915、K916、R918、Q920、E951、P956、Y959、Q964、I969、N994、F1000、I10001、Q1003、F10005、K1007、G1008、F1009、N1019、L1020、K1021、I1023、N1028、E1070、I1075、K1076、F1092、K1097、L1099、L1104、L1107、K1113、Y1114、E1149、E1151、I1153、L1155、L1158、D1166、L1203、D1222、G1224、I1228、R1236、K1243、Y1244、G1245、D1255、K1261、S1263、L1267、E1269、K1274、I1277、E1278、L1289、H1290、A1294、N1320、K1325、E1327、Y1328、I1334、Y1337、K1341、N1342、K1343、N1350、L1352、L1355、L1356、I1359、L1360、R1362、V1363、G1364、Y1365、I1369、R1371、D1372、F1385、E1391、D1459、K1463、K1466、R1509、N1510、I1512、A1513、H1514、N1516、Y1517、L1529、L1530、E1534、L1536、R1537、Y1543、D1544、R1545、K1546、L1547、K1548、N1549、A1550、K1553、S1554、D1557、I1558、L1559、G1563、F1568、I1612、L1651、E1652、K1655、H1658、L1659、K1663、T1673、S1677、E1678、E1679、C1681、V1684、K1685、E1689に対応するC2c2のアミノ酸残基のうちの1つ以上である。先に指摘したとおり、特定の実施形態では、上記のアミノ酸残基リストの中で、R597、H602、R1278及びH1283(Lsh C2c2アミノ酸を基準とする)に対応する残基は除外される。

0045

特定の実施形態において、1つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、1つ以上の保存された荷電アミノ酸残基である。特定の実施形態において、前記アミノ酸残基はアラニンに突然変異していてもよい。

0046

特定の実施形態において、1つ以上の改変された又は突然変異したアミノ酸残基は、図2に示されるとおりの、即ち図1に示されるとおりのC2c2オルソログのアラインメントに基づくコンセンサス配列を基準として、K28、K31、R44、E162、E184、K262、E288、K357、E360、K338、R441(HEPN)、H446(HEPN)、E471、K482、K525、K558、D707、R790、K811、R833、E839、R885、E894、R895、D896、K942、R960(HEPN)、H965(HEPN)、D990、K992、K994に対応するC2c2のアミノ酸残基のうちの1つ以上である。先に指摘したとおり、特定の実施形態では、上記のアミノ酸残基リストの中で、R597、H602、R1278及びH1283(Lsh C2c2アミノ酸を基準とする)に対応する残基は除外される。

0047

本発明はまた、エフェクタータンパク質の触媒活性ドメインにある1つ以上の突然変異又は2つ以上の突然変異も提供する。特定の実施形態において、1つ以上の突然変異又は2つ以上の突然変異は、HEPNドメインを含むエフェクタータンパク質の触媒活性ドメイン、又はHEPNドメインと相同な触媒活性ドメインにあってもよい。エフェクタータンパク質は1つ以上の異種機能ドメインを含み得る。1つ以上の異種機能ドメインは1つ以上の核局在化シグナル(NLS)ドメインを含み得る。1つ以上の異種機能ドメインは少なくとも2つ以上のNLSドメインを含み得る。1つ以上のNLSドメインはエフェクタータンパク質(例えばC2c2)の末端に又はその近傍に又はそれに近接して位置してもよく、及び2つ以上のNLSの場合、それらの2つの各々がエフェクタータンパク質(例えばC2c2)の末端に又はその近傍に又はそれに近接して位置してもよい。1つ以上の異種機能ドメインは1つ以上の翻訳活性化ドメインを含み得る。他の実施形態において、機能ドメインは転写活性化ドメイン、例えばVP64を含み得る。1つ以上の異種機能ドメインは1つ以上の転写抑制ドメインを含み得る。特定の実施形態において、転写抑制ドメインはKRABドメイン又はSIDドメイン(例えばSID4X)を含み得る。1つ以上の異種機能ドメインは1つ以上のヌクレアーゼドメインを含み得る。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼドメインはFok1を含む。

0048

本発明はまた、1つ以上の異種機能ドメインが以下の活性:メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、翻訳活性化活性、翻訳抑制活性転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖RNA切断活性二本鎖RNA切断活性、一本鎖DNA切断活性、二本鎖DNA切断活性及び核酸結合活性のうちの1つ以上を有することも提供する。本発明の特定の実施形態において、1つ以上の異種機能ドメインはエピトープタグ又はレポーターを含み得る。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン(His)タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザヘマグルチニンHA)タグ、Mycタグ、VSV−Gタグ、及びチオレドキシン(Trx)タグが挙げられる。レポーターの例としては、限定はされないが、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、西ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼCATβ−ガラクトシダーゼβ−グルクロニダーゼルシフェラーゼ緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、及び自己蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパク質(BFP)が挙げられる。

0049

少なくとも1つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質のアミノ末端にあるか又はその近傍にあってもよく、及び/又はここで少なくとも1つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質のカルボキシ末端にあるか又はその近傍にある。1つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質に融合されてもよい。1つ以上の異種機能ドメインはエフェクタータンパク質に繋留されてもよい。1つ以上の異種機能ドメインはリンカー部分を介してエフェクタータンパク質に連結されてもよい。

0050

本発明はまた、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、カンピロバクター属(Campylobacter)、ニトラチフラクター属(Nitratifractor)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、パルバクラム属(Parvibaculum)、ロゼブリア属(Roseburia)、ナイセリア属(Neisseria)、グルコンアセトバクター属(Gluconacetobacter)、アゾスピリラム属(Azospirillum)、スフェロヘータ属(Sphaerochaeta)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)、コリネバクター属(Corynebacter)、カルバクテリウム属(Carnobacterium)、ロドバクター属(Rhodobacter)、リステリア属(Listeria)、パルディバクター属(Paludibacter)、クロストリジウム属(Clostridium)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)、クロストリジアリジウム属(Clostridiaridium)、レプトトリキア属(Leptotrichia)、フランシセラ属(Francisella)、レジオネラ属(Legionella)、アリシクロバチルス属(Alicyclobacillus)、メタノメチオフィラス属(Methanomethyophilus)、ポルフィロモナス属(Porphyromonas)、プレボテラ属(Prevotella)、バクテロイデス門(Bacteroidetes)、ヘルココッカス属(Helcococcus)、レプトスピラ属(Letospira)、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)、デスルホナトロヌム属(Desulfonatronum)、オピツツス科(Opitutaceae)、ツベリバチルス属(Tuberibacillus)、バチルス属(Bacillus)、ブレビバチルス属(Brevibacilus)、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)又はアシダミノコッカス属(Acidaminococcus)を含む属の生物由来のエフェクタータンパク質を含むエフェクタータンパク質も提供する。エフェクタータンパク質は、第1のエフェクタータンパク質オルソログ由来の第1の断片と第2のエフェクタータンパク質オルソログ由来の第2の断片とを含むキメラエフェクタータンパク質を含むことができ、ここで第1及び第2のエフェクタータンパク質オルソログは異なる。第1及び第2のエフェクタータンパク質オルソログのうちの少なくとも一方は、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、カンピロバクター属(Campylobacter)、ニトラチフラクター属(Nitratifractor)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、パルビバクラム属(Parvibaculum)、ロゼブリア属(Roseburia)、ナイセリア属(Neisseria)、グルコンアセトバクター属(Gluconacetobacter)、アゾスピリラム属(Azospirillum)、スフェロヘータ属(Sphaerochaeta)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)、コリネバクター属(Corynebacter)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)、ロドバクター属(Rhodobacter)、リステリア属(Listeria)、パルディバクター属(Paludibacter)、クロストリジウム属(Clostridium)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)、クロストリジアリジウム属(Clostridiaridium)、レプトトリキア属(Leptotrichia)、フランシセラ属(Francisella)、レジオネラ属(Legionella)、アリシクロバチルス属(Alicyclobacillus)、メタノメチオフィラス属(Methanomethyophilus)、ポルフィロモナス属(Porphyromonas)、プレボテラ属(Prevotella)、バクテロイデス門(Bacteroidetes)、ヘルココッカス属(Helcococcus)、レプトスピラ属(Letospira)、デスルホビブリオ属(Desulfovibrio)、デスルホナトロヌム属(Desulfonatronum)、オピツツス科(Opitutaceae)、ツベリバチルス属(Tuberibacillus)、バチルス属(Bacillus)、ブレビバチルス属(Brevibacilus)、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)又はアシダミノコッカス属(Acidaminococcus)を含む生物由来のエフェクタータンパク質を含むことができる。

0051

特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にVI型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはC2c2pは、分類群アルファプロテオバクテリア門(alpha−proteobacteria)、バチルス綱(Bacilli)、クロストリジウム(Clostridia)、フソバクテリウム門(Fusobacteria)及びバクテロイデス門(Bacteroidetes)に属する細菌種から生じるものであってもよく、それから単離されてもよく、又はそれに由来してもよい。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にVI型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはC2c2pは、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)、クロストリジウム属(Clostridium)、カルノバクテリウム属(Carnobacterium)、パルディバクター属(Paludibacter)、リステリア属(Listeria)、レプトトリキア属(Leptotrichia)、及びロドバクター属(Rhodobacter)からなる群から選択される属に属する細菌種から生じるものであってもよく、それから単離されてもよく、又はそれに由来してもよい。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にVI型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはC2c2pは、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌MA2020、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179、クロストリジウム・アミノフィルム(Clostridium aminophilum)(例えば、DSM10710)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A144、カルノバクテリウム・ガリナルム(Carnobacterium gallinarum)(例えば、DSM 4847株MT44)、パルディバクター・プロピニシゲネス(Paludibacter propionicigenes)(例えば、WB4)、リステリア・ゼーリゲリ(Listeria seeligeri)(例えば、血清型1/2b株SLCC3954)、リステリア・ウェイヘンステファネンシス(Listeria weihenstephanensis)(例えば、FSL R9−0317 c4)、リステリア・ニューヨーケンシス(Listeria newyorkensis)(例えば、株FSL M6−0635:また「LbFSL」)、レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)(例えば、F0279:また「Lw」又は「Lw2」)、レプトトリキア・ブッカリス(Leptotrichia buccalis)(例えば、DSM 1135)、レプトトリキア属種(Leptotrichia sp.)口腔細菌分類群225(例えば、株F0581)、レプトトリキア属種(Leptotrichia sp.)口腔細菌分類群879(例えば、株F0557)、レプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)(例えば、DSM 19757)、ロドバクター・カプスラータス(Rhodobacter capsulatus)(例えば、SB 1003、R121、又はDE442)からなる群から選択される細菌種から生じるものであってもよく、それから単離されてもよく、又はそれに由来してもよい。特定の好ましい実施形態において、C2c2エフェクタータンパク質は、リステリア科(Listeriaceae)細菌(例えばFSL M6−0635:また「LbFSL」)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌MA2020、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179、クロストリジウム・アミノフィルム(Clostridium aminophilum)(例えば、DSM 10710)、カルノバクテリウム・ガリナルム(Carnobacterium gallinarum)(例えば、DSM 4847)、パルディバクター・プロピオニシゲネス(Paludibacter propionicigenes)(例えば、WB4)、リステリア・ゼーリゲリ(Listeria seeligeri)(例えば、血清型1/2b株SLCC3954)、リステリア・ウェイヘンステファネンシス(Listeria weihenstephanensis)(例えば、FSL R9−0317 c4)、レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)(例えば、F0279:また「Lw」又は「Lw2」)、レプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)(例えば、DSM 19757)、ロドバクター・カプスラータス(Rhodobacter capsulatus)(例えば、SB 1003、R121、又はDE442);好ましくはリステリア科(Listeriaceae)細菌FSL M6−0635(即ちリステリア・ニューヨーケンシス(Listeria newyorkensis)FSL M6−0635:図4〜図7の「LbFSL」)又はレプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)F0279(また「Lw」又は「Lw2」)から生じるものである。

0052

特定の実施形態において、本明細書で意図されるとおりのVI型遺伝子座は、Cas1、Cas2、及びC2c2pエフェクタータンパク質をコードし得る。

0053

特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にVI型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細には天然C2c2pなどのC2c2pは、約1000〜約1500アミノ酸長、例えば約1100〜約1400アミノ酸長、例えば、約1000〜約1100、約1100〜約1200アミノ酸長、又は約1200〜約1300アミノ酸長、又は約1300〜約1400アミノ酸長、又は約1400〜約1500アミノ酸長、例えば、約1000、約1100、約1200、約1300、約1400又は約1500アミノ酸長であってもよい。

0054

特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にVI型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはC2c2pは、少なくとも1つ及び好ましくは少なくとも2つ、例えばより好ましくは正確に2つの保存されたRxxxxHモチーフを含む。触媒RxxxxHモチーフは、HEPN(Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide−binding:高等真核生物及び原核生物ヌクレオチド結合)ドメインに特有である。従って、特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にVI型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはC2c2pは、少なくとも1つ及び好ましくは少なくとも2つ、例えばより好ましくは正確に2つのHEPNドメインを含む。特定の実施形態において、HEPNドメインはRNアーゼ活性を有し得る。他の実施形態において、HEPNドメインはDNアーゼ活性を有し得る。

0055

特定の実施形態において、本明細書で意図されるとおりのVI型遺伝子座は、30〜40bp長、より典型的には35〜39bp長、例えば、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、又は40bp長のCRISPRリピートを含み得る。詳細な実施形態において、ダイレクトリピートは少なくとも25nt長である。

0056

特定の実施形態では、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)又はPAM様モチーフが、本明細書に開示されるとおりのエフェクタータンパク質複合体による目的の標的遺伝子座への結合を導く。一部の実施形態において、PAMは5’PAMであってもよい(即ち、プロトスペーサーの5’末端の上流に位置する)。他の実施形態において、PAMは3’PAMであってもよい(即ち、プロトスペーサーの5’末端の下流に位置する)。用語「PAM」は、用語「PFS」又は「プロトスペーサー隣接部位」又は「プロトスペーサー隣接配列」と同義的に用いられ得る。

0057

好ましい実施形態において、エフェクタータンパク質、特にVI型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはC2c2pは、3’PAMを認識し得る。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質、特にVI型遺伝子座エフェクタータンパク質、より詳細にはC2c2pは、5’H(式中、HはA、C又はUである)である3’PAMを認識し得る。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、レプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)C2c2p、より好ましくはレプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)DSM19757 C2c2であってもよく、及び5’PAMは5’Hである。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はレプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)F0279(Lw2)C2c2であってもよく、及び5’PAMはH(式中、HはC、U又はAである)である。

0058

特定の実施形態において、CRISPR酵素はエンジニアリングされ、ヌクレアーゼ活性を低下又は消失させる1つ以上の突然変異を含むことができる。突然変異はまた、隣接残基、例えばヌクレアーゼ活性に関与する上記に示したものの近傍にあるアミノ酸に作られてもよい。一部の実施形態では1つのHEPNドメインのみが不活性化され、他の実施形態では第2のHEPNドメインが不活性化される。

0059

本発明の特定の実施形態において、ガイドRNA又は成熟crRNAは、ダイレクトリピート配列及びガイド配列又はスペーサー配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。特定の実施形態において、ガイドRNA又は成熟crRNAは、ガイド配列又はスペーサー配列に連結されたダイレクトリピート配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。特定の実施形態において、ガイドRNA又は成熟crRNAは、19ntの部分的ダイレクトリピートと、続く18、19、20、21、22、23、24、25nt、又はそれ以上のガイド配列、例えば18〜25、19〜25、20〜25、21〜25、22〜25、又は23〜25ntのガイド配列又はスペーサー配列を含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質はC2c2エフェクタータンパク質であり、検出可能なDNA切断を達成するのに少なくとも16ntのガイド配列が必要で、及びインビトロで効率的なDNA切断を達成するのに最低でも17ntのガイド配列が必要である。詳細な実施形態において、エフェクタータンパク質はC2c2タンパク質であり、検出可能なRNA切断を達成するのに少なくとも19ntのガイド配列が必要である。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列はガイド配列又はスペーサー配列の上流(即ち5’側)に位置する。好ましい実施形態において、C2c2ガイドRNAのシード配列(即ち、標的遺伝子座の配列の認識及び/又はそれとのハイブリダイゼーションに必須の重要な配列)は、ガイド配列又はスペーサー配列の5’末端上の最初の約5nt以内にある。

0060

本発明の好ましい実施形態において、成熟crRNAはステムループ又は最適化ステムループ構造又は最適化二次構造を含む。好ましい実施形態において、成熟crRNAはダイレクトリピート配列中にステムループ又は最適化ステムループ構造を含み、ここでステムループ又は最適化ステムループ構造は切断活性に重要である。特定の実施形態において、成熟crRNAは好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態において、ダイレクトリピート配列は好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質複合体の切断活性は、ステムループRNA二重鎖構造に影響を及ぼす突然変異を導入することによって改変される。好ましい実施形態において、ステムループのRNA二重鎖を維持する突然変異が導入されてもよく、それによってエフェクタータンパク質複合体の切断活性が維持される。他の好ましい実施形態において、ステムループのRNA二重鎖構造を破壊する突然変異が導入されてもよく、それによってエフェクタータンパク質複合体の切断活性が完全に無効にされる。

0061

詳細な実施形態において、C2c2タンパク質はLsh C2c2エフェクタータンパク質であり、成熟crRNAはステムループ又は最適化ステムループ構造を含む。詳細な実施形態において、crRNAのダイレクトリピートは、ステムループを含む少なくとも25ヌクレオチドを含む。詳細な実施形態において、ステムは個別の塩基スワップが可能であるが、活性はcrRNAのほとんどの二次構造変化又はトランケーションによって破壊される。破壊性の突然変異の例としては、ステムヌクレオチドのうち3個以上のスワッピング、ステムにおける非対合ヌクレオチドの付加、ステムの短縮(対合ヌクレオチドの一方の除去による)又はステムの伸長(一組の対合ヌクレオチドの付加による)が挙げられる。しかしながら、crRNAは、本明細書に記載される特定の適用に想定されるとおりの非機能性RNA配列を含めるため5’及び/又は3’伸長が可能であってもよい。

0062

本発明はまた、本明細書に記載される方法又は組成物のいずれかにおける真核生物又は真核細胞での発現にコドン最適化されたエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列も提供する。本発明のある実施形態において、コドン最適化されたエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書で考察されるいずれかのC2c2をコードし、真核細胞又は生物、例えば、本明細書の他の部分で挙げるような細胞又は生物、例えば、限定なしに、酵母細胞、又は哺乳類細胞又は生物、例えば、マウス細胞、ラット細胞、及びヒト細胞又は非ヒト真核生物、例えば植物における作動性に関してコドン最適化される。

0063

本発明の特定の実施形態において、C2c2エフェクタータンパク質をコードする核酸配列に少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)が付加される。好ましい実施形態において、少なくとも1つ以上のC末端又はN末端NLSが付加される(従ってC2c2エフェクタータンパク質をコードする1つ又は複数の核酸分子が1つ又は複数のNLSのコーディングを含むことができ、そのため発現した産物には1つ又は複数のNLSが付加又は接続されていることになる)。本発明の特定の実施形態において、C2c2エフェクタータンパク質をコードする核酸配列に少なくとも1つの核外移行シグナル(NES)が付加される。好ましい実施形態では、少なくとも1つ以上のC末端又はN末端NESが付加される(ひいてはC2c2エフェクタータンパク質をコードする核酸分子が1つ又は複数のNESのコーディングを含むことができ、発現産物が付加又は接続された1つ又は複数のNESを有することになる)。好ましい実施形態では、真核細胞、好ましくはヒト細胞における最適発現及び核ターゲティングのため、C末端及び/又はN末端NLS又はNESが付加される。好ましい実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はC2c2であり、ガイドRNAのスペーサー長さは15〜35ntである。特定の実施形態において、ガイドRNAのスペーサー長さは少なくとも16ヌクレオチド、例えば少なくとも17ヌクレオチド、好ましくは少なくとも18nt、例えば好ましくは少なくとも19nt、少なくとも20nt、少なくとも21nt、又は少なくとも22ntである。特定の実施形態において、スペーサー長さは15〜17nt、17〜20nt、20〜24nt、例えば、20、21、22、23、又は24nt、23〜25nt、例えば、23、24、又は25nt、24〜27nt、27〜30nt、30〜35nt、又は35nt又はそれ以上である。本発明の特定の実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はC2c2であり、且つガイドRNAのダイレクトリピート長さは少なくとも16ヌクレオチドである。特定の実施形態において、コドン最適化エフェクタータンパク質はC2c2であり、且つガイドRNAのダイレクトリピート長さは16〜20nt、例えば、16、17、18、19、又は20ヌクレオチドである。特定の好ましい実施形態において、ガイドRNAのダイレクトリピート長さは19ヌクレオチドである。

0064

本発明はまた、複数の核酸成分を送達する方法も包含し、ここで各核酸成分は異なる目的の標的遺伝子座に特異的であり、それにより複数の目的の標的遺伝子座を改変する。複合体の核酸成分は1つ以上のタンパク質結合RNAアプタマーを含み得る。1つ以上のアプタマーはバクテリオファージコートタンパク質との結合能を有し得る。バクテリオファージコートタンパク質は、Qβ、F2、GA、fr、JP501、MS2、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、φCb5、φCb8r、φCb12r、φCb23r、7s及びPRR1を含む群から選択され得る。好ましい実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質はMS2である。本発明はまた、30以上、40以上又は50以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分も提供する。

0065

従って、本発明の目的は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に公知の製品、プロセス、又は方法のディスクレーマー(disclaimer)を本明細書によって開示するような以前に公知のいかなる製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないことである。更に、本発明は、本出願人らが権利を留保し、且つ任意の以前に記載された製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法のディスクレーマー(disclaimer)を本明細書によって開示するような、米国特許商標(USPTO)(米国特許法第112条第一段落)又は欧州特許庁(EPO)(EPC第83条)の明細書の記載及び実施可能要件を満たさないいかなる製品、製品の作製プロセス、又は製品の使用方法も本発明の範囲内に包含しないよう意図されることが注記される。本発明の実施においては、第53条(c)EPC及び規則28(b)及び(c)EPCに準拠することが有利であり得る。本明細書におけるいかなる事項も、見込み(promise)であると解釈されてはならない。

0066

この開示及び特に特許請求の範囲及び/又は段落において、「〜を含む(comprises)」、「〜を含んだ(comprised)」、「〜を含んでいる(comprising)」などの用語は、米国特許法においてそれに帰される意味を有し得る;例えばこれらは、「〜を含む(includes)」、「〜を含んだ(included)」、「〜を含んでいる(including)」などを意味し得ること;及び「〜から本質的になっている(consisting essentially of)」及び「〜から本質的になる(consists essentially of)」などの用語が米国特許法におけるそれらに帰される意味を有し、例えばこれらの用語は明示的に記載されていない要素を許容するが、先行技術に見られる要素又は本発明の基本的な若しくは新規の特徴に影響を及ぼす要素は除外することが注記される。

0067

更なる態様において、本発明は、目的の標的遺伝子座の改変を確実にする本明細書に記載されるCRISPR系をコードするヌクレオチド配列を含む真核細胞を提供し、ここで目的の標的遺伝子座は、本明細書に記載される方法のいずれかにより改変される。更なる態様は、前記細胞の細胞株を提供する。別の態様は、1つ以上の前記細胞を含む多細胞生物を提供する。

0068

特定の実施形態において、目的の標的遺伝子座の改変は、少なくとも1つの遺伝子産物の(タンパク質)発現の変化を含む真核細胞;少なくとも1つの遺伝子産物の(タンパク質)発現の変化を含む真核細胞であって、少なくとも1つの遺伝子産物の(タンパク質)発現が増加するもの;少なくとも1つの遺伝子産物の(タンパク質)発現の変化を含む真核細胞であって、少なくとも1つの遺伝子産物の(タンパク質)発現が減少するもの;又は編集されたトランスクリプトームを含む真核細胞をもたらし得る。

0069

特定の実施形態において、真核細胞は哺乳類細胞又はヒト細胞であってもよい。

0070

更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、発現(アイソフォーム特異的発現を含む)、安定性、局在、機能性(例えばリボソームRNA又はmiRNA)等のRNA配列特異的干渉、RNA配列特異的改変;又はかかるプロセスの多重化に用いられ得る。

0071

更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、生体試料などの試料のRNA検出及び/又は定量化に用いられ得る。特定の実施形態において、RNA検出は細胞におけるものである。ある実施形態において、本発明は、試料中の標的RNAを検出する方法を提供し、この方法は、(a)試料を、i)RNAを切断する能力を有するVI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質、ii)標的RNAにハイブリダイズする能力を有するガイドRNA、及びiii)エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するRNAベースの切断誘導可能レポーターと共にインキュベートすること、(b)前記RNAベースの切断誘導可能レポーターの切断によって生成されるシグナルに基づき前記標的RNAを検出することを含む。

0072

ある実施形態において、VI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質はC2c2エフェクタータンパク質である。ある実施形態において、RNAベースの切断誘導可能レポーター構築物蛍光色素及び消光剤を含む。特定の実施形態において、試料は無細胞生体試料を含む。他の実施形態において、試料は細胞試料、例えば、限定なしに植物細胞、又は動物細胞を含む。本発明のある実施形態において、標的RNAは、限定はされないが、ウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫からの標的RNAを含め、病原体RNAを含む。ある実施形態において、ガイドRNAは、一塩基変異多型を含む標的RNA又はRNA転写物のスプライス変異体を検出するように設計される。ある実施形態において、ガイドRNAは、標的RNAとの1つ以上のミスマッチヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ガイドRNAは、限定はされないが、癌、又は免疫疾患など、疾患状態診断指標となる標的分子にハイブリダイズする。

0073

本発明は、a)RNAを切断する能力を有するVI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質、b)標的RNAに結合する能力を有するガイドRNA、及びc)エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するRNAベースの切断誘導可能レポーターを含むリボ核酸(RNA)検出系を提供する。更に、本発明は、a)RNAを切断する能力を有するVI型CRISPR−Casエフェクタータンパク質、及びb)エフェクタータンパク質によって非特異的且つ検出可能に切断される能力を有するRNAベースの切断誘導可能レポーターを含むRNA検出用キットを提供する。特定の実施形態において、RNAベースの切断誘導可能レポーター構築物は蛍光色素及び消光剤を含む。

0074

更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、疾患モデル及び/又はスクリーニングシステムの作成に用いられ得る。

0075

更なる実施形態において、本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、ベクター系、又は送達系は、部位特異的トランスクリプトーム編集又は摂動(purturbation);核酸配列特異的干渉;又は多重ゲノムエンジニアリングに用いられ得る。

0076

また、本明細書に記載されるとおりの細胞、細胞株、又は生物からの遺伝子産物も提供される。特定の実施形態では、遺伝子産物の発現量が、変化した発現又は編集されたゲノムを有しない細胞からの遺伝子産物の量より多くても又は少なくてもよい。特定の実施形態では、遺伝子産物は、変化した発現又は編集されたゲノムを有しない細胞からの遺伝子産物と比較して変化してもよい。

0077

上記及び他の実施形態が開示され、又は以下の詳細な説明から明らかで、それに包含される。

0078

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に示される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及びその添付の図面を参照することにより、本発明の特徴及び利点の更なる理解が得られるであろう。

図面の簡単な説明

0079

図1A図1D.C2c2オルソログの細胞局在。(A)HEK293細胞に、核局在化シグナル(NLS)又は核外移行シグナル(NES)を有する又は有しないmCherryに融合した種々のC2c2オルソログをトランスフェクトした。(B)レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotricia wadei)F0279 C2c2(B1)及びラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179 C2c2(B2)のNES融合物細胞質に位置する。(C)レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotricia wadei)F0279 C2c2(C1)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179 C2c2(C2)、及びレプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)C2c2(C3)のNLS融合物は核に位置し、及び不定核小体に位置する。(C)NLS又はNESに融合していないレプトトリキア・ウエイデイ(Leptotricia wadei)F0279 C2c2(D1)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179 C2c2(D2)、及びレプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)C2c2(D3)は不定に核及び細胞質に位置する。(D)評価した4つの哺乳類LwaCas13a構築物の概略図(左)及び設計の各々の局在及び発現を示すイメージング(右)。
図1A図1D.C2c2オルソログの細胞局在。(A)HEK293細胞に、核局在化シグナル(NLS)又は核外移行シグナル(NES)を有する又は有しないmCherryに融合した種々のC2c2オルソログをトランスフェクトした。(B)レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotricia wadei)F0279 C2c2(B1)及びラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179 C2c2(B2)のNES融合物は細胞質に位置する。(C)レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotricia wadei)F0279 C2c2(C1)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179 C2c2(C2)、及びレプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)C2c2(C3)のNLS融合物は核に位置し、及び不定に核小体に位置する。(C)NLS又はNESに融合していないレプトトリキア・ウエイデイ(Leptotricia wadei)F0279 C2c2(D1)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179 C2c2(D2)、及びレプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)C2c2(D3)は不定に核及び細胞質に位置する。(D)評価した4つの哺乳類LwaCas13a構築物の概略図(左)及び設計の各々の局在及び発現を示すイメージング(右)。
図1A図1D.C2c2オルソログの細胞局在。(A)HEK293細胞に、核局在化シグナル(NLS)又は核外移行シグナル(NES)を有する又は有しないmCherryに融合した種々のC2c2オルソログをトランスフェクトした。(B)レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotricia wadei)F0279 C2c2(B1)及びラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179 C2c2(B2)のNES融合物は細胞質に位置する。(C)レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotricia wadei)F0279 C2c2(C1)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179 C2c2(C2)、及びレプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)C2c2(C3)のNLS融合物は核に位置し、及び不定に核小体に位置する。(C)NLS又はNESに融合していないレプトトリキア・ウエイデイ(Leptotricia wadei)F0279 C2c2(D1)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179 C2c2(D2)、及びレプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)C2c2(D3)は不定に核及び細胞質に位置する。(D)評価した4つの哺乳類LwaCas13a構築物の概略図(左)及び設計の各々の局在及び発現を示すイメージング(右)。
図1A図1D.C2c2オルソログの細胞局在。(A)HEK293細胞に、核局在化シグナル(NLS)又は核外移行シグナル(NES)を有する又は有しないmCherryに融合した種々のC2c2オルソログをトランスフェクトした。(B)レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotricia wadei)F0279 C2c2(B1)及びラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179 C2c2(B2)のNES融合物は細胞質に位置する。(C)レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotricia wadei)F0279 C2c2(C1)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179 C2c2(C2)、及びレプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)C2c2(C3)のNLS融合物は核に位置し、及び不定に核小体に位置する。(C)NLS又はNESに融合していないレプトトリキア・ウエイデイ(Leptotricia wadei)F0279 C2c2(D1)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179 C2c2(D2)、及びレプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)C2c2(D3)は不定に核及び細胞質に位置する。(D)評価した4つの哺乳類LwaCas13a構築物の概略図(左)及び設計の各々の局在及び発現を示すイメージング(右)。
図2A〜図2C.哺乳類細胞におけるC2c2ノックダウン効率を評価するアッセイ。(A)C2c2のノックダウン効率の決定に用いる二重ルシフェラーゼレポータースキームの概略図。細胞に以下の種々のプラスミドをトランスフェクトした:ガウシアルシフェラーゼ(Gluc)及びウミホタルルシフェラーゼ(Cluc)をコードするプラスミド;C2c2(NLS又はNESを有する又は有しない)をコードするプラスミド;及びガウシアルシフェラーゼを標的とするgRNAをコードするプラスミド。Glucのノックダウン効率はGluc及びClucの比に基づき決定される。(B)ガウシアルシフェラーゼmRNAを標的とする種々のgRNAの位置。(C)哺乳類細胞におけるC2c2ノックダウン効率を評価するアッセイ。細胞に以下の種々のプラスミドをトランスフェクトした:EGFPをコードするプラスミド;C2c2(NLS又はNESを有する又は有しない)をコードするプラスミド;及びEGFPを標的とするgRNAをコードするプラスミド。EGFPのノックダウン効率はフローサイトメトリーによって決定される。
図2A〜図2C.哺乳類細胞におけるC2c2ノックダウン効率を評価するアッセイ。(A)C2c2のノックダウン効率の決定に用いる二重ルシフェラーゼレポータースキームの概略図。細胞に以下の種々のプラスミドをトランスフェクトした:ガウシアルシフェラーゼ(Gluc)及びウミホタルルシフェラーゼ(Cluc)をコードするプラスミド;C2c2(NLS又はNESを有する又は有しない)をコードするプラスミド;及びガウシアルシフェラーゼを標的とするgRNAをコードするプラスミド。Glucのノックダウン効率はGluc及びClucの比に基づき決定される。(B)ガウシアルシフェラーゼmRNAを標的とする種々のgRNAの位置。(C)哺乳類細胞におけるC2c2ノックダウン効率を評価するアッセイ。細胞に以下の種々のプラスミドをトランスフェクトした:EGFPをコードするプラスミド;C2c2(NLS又はNESを有する又は有しない)をコードするプラスミド;及びEGFPを標的とするgRNAをコードするプラスミド。EGFPのノックダウン効率はフローサイトメトリーによって決定される。
図3A〜図3Q.RNA切断活性に関するVI型CRISPR Cas13aファミリーの特徴付け。(A)Cas13aオルソログに関するPFS特徴付けスクリーンの概略図。(B)Cas13aタンパク質及びcrRNAの発現用構築物の概略図。示される長さ及び残基番号はLwaCas13aのものである。(C)Cas13aインビボ活性の定量化。(D)(C)からのインビボ活性の比。(E、F)生存大腸菌(E.coli)集団におけるエンリッチ後プラスミドの次世代シーケンシングによって決定したときの、LshC2c2及びLwaC2c2のPFSモチーフ決定。(G)ターゲティング及びノンターゲティング試料におけるLshCas13a及びLwaCas13aのPFSエンリッチメントの分布。(H)インビボPFSスクリーニングは、LwaCas13aが最小限のPFS優先性を有することを示す。(I)LshC2c2及びLwC2c2のターゲティング及びノンターゲティングバイオレプリケート(n=2)についての正規化PFSカウントの分布を示す箱ひげ図。箱は第1〜第3四分位数まで延び、ひげは四分位範囲の1.5倍を表す。平均値は赤色の水平のバーによって示される。(J)精製タンパク質を使用したLshC2c2及びLwC2c2 RNA切断活性の比較。LwaCas13aはLshCas13aよりも高活性のRNアーゼ活性を有する。5’標識RNA標的をC2c2及び対応するcrRVAと30分間インキュベートし、産物をゲル電気泳動によって分析した。(K)LwaCas13aはL.ウエイデイ(L.wadeii)CRISPR遺伝子座からのCRISPRアレイ転写物をプロセシングすることができる。2スペーサーLwaアレイをLwC2c2と30分間インキュベートし、次に反応物をゲル電気泳動によって分離した。(L)評価した哺乳類LwaCas13a構築物の概略図並びに設計の各々の局在及び発現を示すイメージング。スケールバー、10μm。(M)ルシフェラーゼタンパク質リードアウトによるノックダウンの評価に使用した哺乳類レポーター系の概略図。(N)LwaCas13aのエンジニアリングされた変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ(Gluc)のノックダウン。ガイド及びshRNAの配列を上に示す。(O)対応するRNAi構築物と比較したLwaCas13aによる3つの異なる内因性転写物のノックダウン。(P)コメ(イネ(Oryza sativa))プロトプラストにおける転写物のLwaCas13aノックダウンの概略図。(Q)各転写物につき3つのターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドを使用したイネ(Oryza sativa)プロトプラストにおける3つの転写物のLwaCas13aノックダウン。特に注記されない限り、値は全て、n=3での平均値±SEMである。
図3A〜図3Q.RNA切断活性に関するVI型CRISPR Cas13aファミリーの特徴付け。(A)Cas13aオルソログに関するPFS特徴付けスクリーンの概略図。(B)Cas13aタンパク質及びcrRNAの発現用構築物の概略図。示される長さ及び残基番号はLwaCas13aのものである。(C)Cas13aインビボ活性の定量化。(D)(C)からのインビボ活性の比。(E、F)生存大腸菌(E.coli)集団におけるエンリッチ後プラスミドの次世代シーケンシングによって決定したときの、LshC2c2及びLwaC2c2のPFSモチーフ決定。(G)ターゲティング及びノンターゲティング試料におけるLshCas13a及びLwaCas13aのPFSエンリッチメントの分布。(H)インビボPFSスクリーニングは、LwaCas13aが最小限のPFS優先性を有することを示す。(I)LshC2c2及びLwC2c2のターゲティング及びノンターゲティングバイオレプリケート(n=2)についての正規化PFSカウントの分布を示す箱ひげ図。箱は第1〜第3四分位数まで延び、ひげは四分位範囲の1.5倍を表す。平均値は赤色の水平のバーによって示される。(J)精製タンパク質を使用したLshC2c2及びLwC2c2 RNA切断活性の比較。LwaCas13aはLshCas13aよりも高活性のRNアーゼ活性を有する。5’標識RNA標的をC2c2及び対応するcrRVAと30分間インキュベートし、産物をゲル電気泳動によって分析した。(K)LwaCas13aはL.ウエイデイ(L.wadeii)CRISPR遺伝子座からのCRISPRアレイ転写物をプロセシングすることができる。2スペーサーLwaアレイをLwC2c2と30分間インキュベートし、次に反応物をゲル電気泳動によって分離した。(L)評価した哺乳類LwaCas13a構築物の概略図並びに設計の各々の局在及び発現を示すイメージング。スケールバー、10μm。(M)ルシフェラーゼタンパク質のリードアウトによるノックダウンの評価に使用した哺乳類レポーター系の概略図。(N)LwaCas13aのエンジニアリングされた変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ(Gluc)のノックダウン。ガイド及びshRNAの配列を上に示す。(O)対応するRNAi構築物と比較したLwaCas13aによる3つの異なる内因性転写物のノックダウン。(P)コメ(イネ(Oryza sativa))プロトプラストにおける転写物のLwaCas13aノックダウンの概略図。(Q)各転写物につき3つのターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドを使用したイネ(Oryza sativa)プロトプラストにおける3つの転写物のLwaCas13aノックダウン。特に注記されない限り、値は全て、n=3での平均値±SEMである。
図3A〜図3Q.RNA切断活性に関するVI型CRISPR Cas13aファミリーの特徴付け。(A)Cas13aオルソログに関するPFS特徴付けスクリーンの概略図。(B)Cas13aタンパク質及びcrRNAの発現用構築物の概略図。示される長さ及び残基番号はLwaCas13aのものである。(C)Cas13aインビボ活性の定量化。(D)(C)からのインビボ活性の比。(E、F)生存大腸菌(E.coli)集団におけるエンリッチ後プラスミドの次世代シーケンシングによって決定したときの、LshC2c2及びLwaC2c2のPFSモチーフ決定。(G)ターゲティング及びノンターゲティング試料におけるLshCas13a及びLwaCas13aのPFSエンリッチメントの分布。(H)インビボPFSスクリーニングは、LwaCas13aが最小限のPFS優先性を有することを示す。(I)LshC2c2及びLwC2c2のターゲティング及びノンターゲティングバイオレプリケート(n=2)についての正規化PFSカウントの分布を示す箱ひげ図。箱は第1〜第3四分位数まで延び、ひげは四分位範囲の1.5倍を表す。平均値は赤色の水平のバーによって示される。(J)精製タンパク質を使用したLshC2c2及びLwC2c2 RNA切断活性の比較。LwaCas13aはLshCas13aよりも高活性のRNアーゼ活性を有する。5’標識RNA標的をC2c2及び対応するcrRVAと30分間インキュベートし、産物をゲル電気泳動によって分析した。(K)LwaCas13aはL.ウエイデイ(L.wadeii)CRISPR遺伝子座からのCRISPRアレイ転写物をプロセシングすることができる。2スペーサーLwaアレイをLwC2c2と30分間インキュベートし、次に反応物をゲル電気泳動によって分離した。(L)評価した哺乳類LwaCas13a構築物の概略図並びに設計の各々の局在及び発現を示すイメージング。スケールバー、10μm。(M)ルシフェラーゼタンパク質のリードアウトによるノックダウンの評価に使用した哺乳類レポーター系の概略図。(N)LwaCas13aのエンジニアリングされた変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ(Gluc)のノックダウン。ガイド及びshRNAの配列を上に示す。(O)対応するRNAi構築物と比較したLwaCas13aによる3つの異なる内因性転写物のノックダウン。(P)コメ(イネ(Oryza sativa))プロトプラストにおける転写物のLwaCas13aノックダウンの概略図。(Q)各転写物につき3つのターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドを使用したイネ(Oryza sativa)プロトプラストにおける3つの転写物のLwaCas13aノックダウン。特に注記されない限り、値は全て、n=3での平均値±SEMである。
図3A〜図3Q.RNA切断活性に関するVI型CRISPR Cas13aファミリーの特徴付け。(A)Cas13aオルソログに関するPFS特徴付けスクリーンの概略図。(B)Cas13aタンパク質及びcrRNAの発現用構築物の概略図。示される長さ及び残基番号はLwaCas13aのものである。(C)Cas13aインビボ活性の定量化。(D)(C)からのインビボ活性の比。(E、F)生存大腸菌(E.coli)集団におけるエンリッチ後プラスミドの次世代シーケンシングによって決定したときの、LshC2c2及びLwaC2c2のPFSモチーフ決定。(G)ターゲティング及びノンターゲティング試料におけるLshCas13a及びLwaCas13aのPFSエンリッチメントの分布。(H)インビボPFSスクリーニングは、LwaCas13aが最小限のPFS優先性を有することを示す。(I)LshC2c2及びLwC2c2のターゲティング及びノンターゲティングバイオレプリケート(n=2)についての正規化PFSカウントの分布を示す箱ひげ図。箱は第1〜第3四分位数まで延び、ひげは四分位範囲の1.5倍を表す。平均値は赤色の水平のバーによって示される。(J)精製タンパク質を使用したLshC2c2及びLwC2c2 RNA切断活性の比較。LwaCas13aはLshCas13aよりも高活性のRNアーゼ活性を有する。5’標識RNA標的をC2c2及び対応するcrRVAと30分間インキュベートし、産物をゲル電気泳動によって分析した。(K)LwaCas13aはL.ウエイデイ(L.wadeii)CRISPR遺伝子座からのCRISPRアレイ転写物をプロセシングすることができる。2スペーサーLwaアレイをLwC2c2と30分間インキュベートし、次に反応物をゲル電気泳動によって分離した。(L)評価した哺乳類LwaCas13a構築物の概略図並びに設計の各々の局在及び発現を示すイメージング。スケールバー、10μm。(M)ルシフェラーゼタンパク質のリードアウトによるノックダウンの評価に使用した哺乳類レポーター系の概略図。(N)LwaCas13aのエンジニアリングされた変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ(Gluc)のノックダウン。ガイド及びshRNAの配列を上に示す。(O)対応するRNAi構築物と比較したLwaCas13aによる3つの異なる内因性転写物のノックダウン。(P)コメ(イネ(Oryza sativa))プロトプラストにおける転写物のLwaCas13aノックダウンの概略図。(Q)各転写物につき3つのターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドを使用したイネ(Oryza sativa)プロトプラストにおける3つの転写物のLwaCas13aノックダウン。特に注記されない限り、値は全て、n=3での平均値±SEMである。
図3A〜図3Q.RNA切断活性に関するVI型CRISPR Cas13aファミリーの特徴付け。(A)Cas13aオルソログに関するPFS特徴付けスクリーンの概略図。(B)Cas13aタンパク質及びcrRNAの発現用構築物の概略図。示される長さ及び残基番号はLwaCas13aのものである。(C)Cas13aインビボ活性の定量化。(D)(C)からのインビボ活性の比。(E、F)生存大腸菌(E.coli)集団におけるエンリッチ後プラスミドの次世代シーケンシングによって決定したときの、LshC2c2及びLwaC2c2のPFSモチーフ決定。(G)ターゲティング及びノンターゲティング試料におけるLshCas13a及びLwaCas13aのPFSエンリッチメントの分布。(H)インビボPFSスクリーニングは、LwaCas13aが最小限のPFS優先性を有することを示す。(I)LshC2c2及びLwC2c2のターゲティング及びノンターゲティングバイオレプリケート(n=2)についての正規化PFSカウントの分布を示す箱ひげ図。箱は第1〜第3四分位数まで延び、ひげは四分位範囲の1.5倍を表す。平均値は赤色の水平のバーによって示される。(J)精製タンパク質を使用したLshC2c2及びLwC2c2 RNA切断活性の比較。LwaCas13aはLshCas13aよりも高活性のRNアーゼ活性を有する。5’標識RNA標的をC2c2及び対応するcrRVAと30分間インキュベートし、産物をゲル電気泳動によって分析した。(K)LwaCas13aはL.ウエイデイ(L.wadeii)CRISPR遺伝子座からのCRISPRアレイ転写物をプロセシングすることができる。2スペーサーLwaアレイをLwC2c2と30分間インキュベートし、次に反応物をゲル電気泳動によって分離した。(L)評価した哺乳類LwaCas13a構築物の概略図並びに設計の各々の局在及び発現を示すイメージング。スケールバー、10μm。(M)ルシフェラーゼタンパク質のリードアウトによるノックダウンの評価に使用した哺乳類レポーター系の概略図。(N)LwaCas13aのエンジニアリングされた変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ(Gluc)のノックダウン。ガイド及びshRNAの配列を上に示す。(O)対応するRNAi構築物と比較したLwaCas13aによる3つの異なる内因性転写物のノックダウン。(P)コメ(イネ(Oryza sativa))プロトプラストにおける転写物のLwaCas13aノックダウンの概略図。(Q)各転写物につき3つのターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドを使用したイネ(Oryza sativa)プロトプラストにおける3つの転写物のLwaCas13aノックダウン。特に注記されない限り、値は全て、n=3での平均値±SEMである。
図3A〜図3Q.RNA切断活性に関するVI型CRISPR Cas13aファミリーの特徴付け。(A)Cas13aオルソログに関するPFS特徴付けスクリーンの概略図。(B)Cas13aタンパク質及びcrRNAの発現用構築物の概略図。示される長さ及び残基番号はLwaCas13aのものである。(C)Cas13aインビボ活性の定量化。(D)(C)からのインビボ活性の比。(E、F)生存大腸菌(E.coli)集団におけるエンリッチ後プラスミドの次世代シーケンシングによって決定したときの、LshC2c2及びLwaC2c2のPFSモチーフ決定。(G)ターゲティング及びノンターゲティング試料におけるLshCas13a及びLwaCas13aのPFSエンリッチメントの分布。(H)インビボPFSスクリーニングは、LwaCas13aが最小限のPFS優先性を有することを示す。(I)LshC2c2及びLwC2c2のターゲティング及びノンターゲティングバイオレプリケート(n=2)についての正規化PFSカウントの分布を示す箱ひげ図。箱は第1〜第3四分位数まで延び、ひげは四分位範囲の1.5倍を表す。平均値は赤色の水平のバーによって示される。(J)精製タンパク質を使用したLshC2c2及びLwC2c2 RNA切断活性の比較。LwaCas13aはLshCas13aよりも高活性のRNアーゼ活性を有する。5’標識RNA標的をC2c2及び対応するcrRVAと30分間インキュベートし、産物をゲル電気泳動によって分析した。(K)LwaCas13aはL.ウエイデイ(L.wadeii)CRISPR遺伝子座からのCRISPRアレイ転写物をプロセシングすることができる。2スペーサーLwaアレイをLwC2c2と30分間インキュベートし、次に反応物をゲル電気泳動によって分離した。(L)評価した哺乳類LwaCas13a構築物の概略図並びに設計の各々の局在及び発現を示すイメージング。スケールバー、10μm。(M)ルシフェラーゼタンパク質のリードアウトによるノックダウンの評価に使用した哺乳類レポーター系の概略図。(N)LwaCas13aのエンジニアリングされた変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ(Gluc)のノックダウン。ガイド及びshRNAの配列を上に示す。(O)対応するRNAi構築物と比較したLwaCas13aによる3つの異なる内因性転写物のノックダウン。(P)コメ(イネ(Oryza sativa))プロトプラストにおける転写物のLwaCas13aノックダウンの概略図。(Q)各転写物につき3つのターゲティングガイド及びノンターゲティングガイドを使用したイネ(Oryza sativa)プロトプラストにおける3つの転写物のLwaCas13aノックダウン。特に注記されない限り、値は全て、n=3での平均値±SEMである。
図4A〜図4B.Gluc.に対する種々のgRNA別及びNLS、NESと融合した、又はタグなしのC2c2オルソログ(orthogue)別のルシフェラーゼの正規化タンパク質発現。(A)C2c2オルソログ(orthogue)はレプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)F0279(Lw2)である。これらの実験に使用したスペーサー配列は、(ガイド1)ATCAGGGCAAACAGAACTTTGACTCCCA;(ガイド2)AGATCCGTGGTCGCGAAGTTGCTGGCCA;(ガイド3)TCGCCTTCGTAGGTGTGGCAGCGTCCTG;及び(ガイドNP)TAGATTGCTGTTCTACCAAGTAATCCATである。(B)C2c2オルソログ(orthogue)はリステリア・ニューヨーケンシス(Listeria newyorkensis)FSL M6−0635(LbFSL)である。これらの実験に使用したスペーサー配列は、(ガイド1)TCGCCTTCGTAGGTGTGGCAGCGTCCTG及び(ガイドNT)tagattgctgttctaccaagtaatccatである。
図5A〜図5B.EGPFに対する種々のgRNA別及びNLS、NESと融合した、又はタグなしのC2c2オルソログ(orthogue)別のGFPの正規化タンパク質発現。(A)C2c2オルソログ(orthogue)はレプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)F0279(Lw2)である。これらの実験に使用したスペーサー配列は、(ガイド1)tgaacagctcctcgcccttgctcaccat;(ガイド2)tcagcttgccgtaggtggcatcgccctc;(ガイド3)gggtagcggctgaagcactgcacgccgt;(ガイド4)ggtcttgtagttgccgtcgtccttgaag;(ガイド5)tactccagcttgtgccccaggatgttgc;(ガイド6)cacgctgccgtcctcgatgttgtggcgg;(ガイド7)tctttgctcagggcggactgggtgctca;(ガイド8)gacttgtacagctcgtccatgccgagag;及び(ガイドNT)tagattgctgttctaccaagtaatccatである。(B)C2c2オルソログ(orthogue)はリステリア・ニューヨーケンシス(Listeria newyorkensis)FSL M6−0635(LbFSL)である。これらの実験に使用したスペーサー配列は、(ガイド2)tcagcttgccgtaggtggcatcgccctc;(ガイド3)gggtagcggctgaagcactgcacgccgt;(ガイド4)ggtcttgtagttgccgtcgtccttgaag;(ガイド5)tactccagcttgtgccccaggatgttgc;(ガイド6)cacgctgccgtcctcgatgttgtggcgg;(ガイド7)tctttgctcagggcggactgggtgctca;(ガイド8)gacttgtacagctcgtccatgccgagag;及び(ガイドNT)tagattgctgttctaccaagtaatccatである。
図6A〜図6E.哺乳類ノックダウンのためのLwaCas13aのエンジニアリング及び最適化。(A)A375細胞にトランスフェクトした様々なガイドを使用したLwCas13aによるGluc転写物のノックダウン:(B)LwaCas13aのエンジニアリングした変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ(Gluc)のノックダウン。(C)LwaCas13a及び様々な長さのGluc crRNA 1スペーサーによるガウシアルシフェラーゼ(Gluc)のノックダウン。(D)様々なガイドを使用したLwaCas13aによるKRAS転写物のノックダウン。(E)様々なガイドを使用したLwaCas13aによるPPIB転写物のノックダウン。
図6A〜図6E.哺乳類ノックダウンのためのLwaCas13aのエンジニアリング及び最適化。(A)A375細胞にトランスフェクトした様々なガイドを使用したLwCas13aによるGluc転写物のノックダウン:(B)LwaCas13aのエンジニアリングした変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ(Gluc)のノックダウン。(C)LwaCas13a及び様々な長さのGluc crRNA 1スペーサーによるガウシアルシフェラーゼ(Gluc)のノックダウン。(D)様々なガイドを使用したLwaCas13aによるKRAS転写物のノックダウン。(E)様々なガイドを使用したLwaCas13aによるPPIB転写物のノックダウン。
図6A〜図6E.哺乳類ノックダウンのためのLwaCas13aのエンジニアリング及び最適化。(A)A375細胞にトランスフェクトした様々なガイドを使用したLwCas13aによるGluc転写物のノックダウン:(B)LwaCas13aのエンジニアリングした変異体を使用したガウシアルシフェラーゼ(Gluc)のノックダウン。(C)LwaCas13a及び様々な長さのGluc crRNA 1スペーサーによるガウシアルシフェラーゼ(Gluc)のノックダウン。(D)様々なガイドを使用したLwaCas13aによるKRAS転写物のノックダウン。(E)様々なガイドを使用したLwaCas13aによるPPIB転写物のノックダウン。
図7.それぞれの標的遺伝子に対するgRNA及びNESと融合したC2c2レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)F0279による標的遺伝子の正規化タンパク質発現。それぞれの標的遺伝子に対するgRNAは、ctgctgccacagaccgagaggcttaaaa(CTNNB1);tccttgattacacgatggaatttgctgt(PPIB);tcaaggtggggtcacaggagaagccaaa(mAPK14);atgataatgcaatagcaggacaggatga(CXCR4);gcgtgagccaccgcgcctggccggctgt(TINCR);ccagctgcagatgctgcagtttttggcg(PCAT1);ctggaaatggaagatgccggcatagcca(CAPN1);gatgacacctcacacggaccacccctag(LETMD1);taatactgctccagatatgggtgggcca(MAPK14);catgaagaccgagttatagaatactata(RB1);ggtgaaatattctccatccagtggtttc(TP53);及びaatttctcgaactaatgtatagaaggca(KRAS)である。
図8.Gluc.に対する種々のgRNA別及びNLS、NESと融合した、又はタグなしのC2c2オルソログ(orthogue)別のルシフェラーゼの正規化タンパク質発現。C2c2オルソログ(orthogue)は、レプトトリキア・シャーイイ(Leptotrichia shahii)(Lsh)、レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)F0279(Lw2)、クロストリジウム・アミノフィルム(Clostridium aminophilum)(Ca)、リステリア・ニューヨーケンシス(Listeria newyorkensis)FSL M6−0635(LbFSL)、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌NK4A179(LbNk)、及びラクノスピラ科(Lachnospiraceae)細菌MA2020(LbM)である。
図9.Lw2は複数の細胞株で機能する。293FT細胞についての正規化したルシフェラーゼ活性を示す
図10A〜図10B.Gluc.に対するgRNA別及び触媒不活性C2c2オルソログ(orthogue)別のルシフェラーゼの相対タンパク質発現。(A)dC2c2レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)(LwC2c2)をEIF4Eに融合し、EIF4E及びNESに融合し、又はタグなしとした。(B)dC2c2リステリア・ニューヨーケンシス(Listeria newyorkensis)FSL M6−0635(LbFSL)をNLS及びEIF4Eに融合し、又はタグなしとした。
図11A〜図11C.細胞をNaAsO2で処理すると、βアクチンを標的とするレプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)C2c2の細胞局在はストレス顆粒に局在する;
図12.哺乳類細胞におけるRNAノックダウン。C2c2は2つの標的部位でshRNAより優れている。
図13.crRNAトランスフェクション量が増加するとノックダウンが増加する。
図14.NESを有するLw2C2c2(NES−Lw2C2c2)はtRNA及びU6ノックダウンのRNAを有効に切断する。
図15A〜図15B.(A)タンパク質トランスフェクション量がノックダウンを飽和させる。(B)Gluc crRNA 1及び様々な量のトランスフェクトLwaCas13aプラスミドによるGluc転写物のノックダウン。
図16.U6ドライブDR−スペーサー−DR−スペーサーターゲティング構築物
図17内因性遺伝子上の対応する標的に対してC2c2が最適化shRNAよりも優れている。
図18.dLw2C2c2−EIF4E融合物は3つの遺伝子の翻訳;ウエスタンブロットでのバンド強度によって計測したときのタンパク質レベル上方制御することができる。
図19.個別の転写物のノックダウン。Lw2は、より低い変動性及びより高い特異性を示す。
図20.哺乳類細胞におけるRNAノックダウン。
図21.GFPのスーパーフォルダー誘導体(sfGFP)によってイメージングが向上する。HEK293FT細胞及びマウス胚性幹細胞(mESC)でC2c2−mCherry及びsfGFP−C2c2融合タンパク質を比較する。
図22A.msfGFP−C2c2はノックダウンを向上させる。C2c2とmCherry又はmsfGFPとの様々な融合タンパク質であって、NLS又はNESを更に含む融合タンパク質によるルシフェラーゼノックダウンを示す。図22B〜図22Dは、C2c2によって転写を調節するタンパク質タグ付加系を例示し、改変C2c2に含まれる短鎖ペプチド配列に結合する転写開始因子が連結されたscFvのエレメントを示す(SunTag)。図22C〜図22Dは、この系の転写効果を示す。
図22A.msfGFP−C2c2はノックダウンを向上させる。C2c2とmCherry又はmsfGFPとの様々な融合タンパク質であって、NLS又はNESを更に含む融合タンパク質によるルシフェラーゼノックダウンを示す。図22B〜図22Dは、C2c2によって転写を調節するタンパク質タグ付加系を例示し、改変C2c2に含まれる短鎖ペプチド配列に結合する転写開始因子が連結されたscFvのエレメントを示す(SunTag)。図22C〜図22Dは、この系の転写効果を示す。
図22A.msfGFP−C2c2はノックダウンを向上させる。C2c2とmCherry又はmsfGFPとの様々な融合タンパク質であって、NLS又はNESを更に含む融合タンパク質によるルシフェラーゼノックダウンを示す。図22B〜図22Dは、C2c2によって転写を調節するタンパク質タグ付加系を例示し、改変C2c2に含まれる短鎖ペプチド配列に結合する転写開始因子が連結されたscFvのエレメントを示す(SunTag)。図22C〜図22Dは、この系の転写効果を示す。
図23A〜図23B.レポータータンパク質(GFP、Venus、Cre等)のスプリッティング。各パートがC2c2に融合される(スライド、例えばカスパーゼを含む概略図を参照)。転写物を標的とする2つのガイドを互いの近くに設計することにより、その転写物の存在下でスプリットタンパク質が再構成される。
図24A〜図24C.C2c2コラテラルRNアーゼ活性による迅速RNA検出。(A)左側のパネル:C2c2 crRNAのガイド配列に相補的な標的RNAによるC2c2コラテラル非特異的RNアーゼ活性が活性化すると、レポーターが切断される。右側のパネル:標的RNAの非存在下では、コラテラル非特異的RNアーゼ活性は誘導されず、従ってレポーターの切断はない。(B)LwaCas13aによるコラテラル効果の活性を検出するアッセイの概略図。(C)標的RNAの存在下又は非存在下でLwaCas13a−crRNA複合体とインキュベートした後のコラテラルRNA標的のゲル電気泳動。
図24A〜図24C.C2c2コラテラルRNアーゼ活性による迅速RNA検出。(A)左側のパネル:C2c2 crRNAのガイド配列に相補的な標的RNAによるC2c2コラテラル非特異的RNアーゼ活性が活性化すると、レポーターが切断される。右側のパネル:標的RNAの非存在下では、コラテラル非特異的RNアーゼ活性は誘導されず、従ってレポーターの切断はない。(B)LwaCas13aによるコラテラル効果の活性を検出するアッセイの概略図。(C)標的RNAの存在下又は非存在下でLwaCas13a−crRNA複合体とインキュベートした後のコラテラルRNA標的のゲル電気泳動。
図25.様々な濃度のC2c2を使用したコラテラル効果によるレンチウイルス検出。
図26.コラテラル効果によるレンチウイルス検出の経時的変化
図27.C2c2コラテラルRNアーゼ活性によるまれなRNA種の検出。標的濃度及び標的切断の増加に伴い非特異的オフターゲットRNアーゼ活性が増加する。
図28A図28B.Lw2C2c2とLbuC2c2とのアラインメント。
図28A図28B.Lw2C2c2とLbuC2c2とのアラインメント。
図29A〜図29C.(A)スペーサー配列にシングル塩基対ミスマッチを有するルシフェラーゼmRNAノックダウンを標的とするβLwC2c2。(B)スペーサー配列にシングル塩基対ミスマッチを有するCXCR4 mRNAノックダウンを標的とするLwC2c2。(C)スペーサー配列にシングル及び連続ダブル塩基対ミスマッチを有するルシフェラーゼmRNAノックダウンを標的とするLwC2c2。 図29D−A〜図29D−C.(A)ルシフェラーゼレポーターmRNAのノックダウンの特異性。C2c2はルシフェラーゼレポーターmRNAのノックダウンに関してRNAiよりも特異的が高い。左:shRNAについてのルシフェラーゼノックダウン条件と比べたノンターゲティングトランスフェクト対照(全てのグラフのx軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率TPM))値による発現レベル。右:C2c2についてのルシフェラーゼノックダウン条件と比べたノンターゲティングトランスフェクト対照(全てのグラフのx軸)のRNA−seqライブラリにおける検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。ノックダウンの標的となる標的ルシフェラーゼ転写物は赤色の点で示す。n=3のバイオロジカルレプリケートからの平均を示す。(B)内因性KRAS mRNAのノックダウンの特異性。C2c2は内因性KRASのノックダウンに関してRNAiよりも特異的が高い。標的転写物は赤色の点で示す。(C)内因性PPIB mRNAのノックダウンの特異性。C2c2は内因性PPIBのノックダウンに関してRNAiよりも特異的が高い。標的転写物は赤色の点で示す。 図29E〜図29G.(E)3つの異なる遺伝子におけるLwaCas13aノックダウンをshRNAノックダウンと比較する6つのRNA−seqライブラリの遺伝子発現差異解析(各々3回のバイオロジカルレプリケート)。遺伝子は、それがノンターゲティング対照と比べて平均変化倍数>2又は<0.75を有し、且つ発見率(FDR)<0.10を有する場合に有意に差次的に発現したと見なされる。(F)RNA seqライブラリからの標的遺伝子に関して定量化した平均ノックダウンレベル。(G)左:細胞成長の計測に先立つ抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞のルシフェラーゼノックダウン。中央:抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞の細胞生存度。右:抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞のGFP蛍光。値は全て、n=3での平均値±SEMである。
図29A〜図29C.(A)スペーサー配列にシングル塩基対ミスマッチを有するルシフェラーゼmRNAノックダウンを標的とするβLwC2c2。(B)スペーサー配列にシングル塩基対ミスマッチを有するCXCR4 mRNAノックダウンを標的とするLwC2c2。(C)スペーサー配列にシングル及び連続ダブル塩基対ミスマッチを有するルシフェラーゼmRNAノックダウンを標的とするLwC2c2。 図29D−A〜図29D−C.(A)ルシフェラーゼレポーターmRNAのノックダウンの特異性。C2c2はルシフェラーゼレポーターmRNAのノックダウンに関してRNAiよりも特異的が高い。左:shRNAについてのルシフェラーゼノックダウン条件と比べたノンターゲティングトランスフェクト対照(全てのグラフのx軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。右:C2c2についてのルシフェラーゼノックダウン条件と比べたノンターゲティングトランスフェクト対照(全てのグラフのx軸)のRNA−seqライブラリにおける検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。ノックダウンの標的となる標的ルシフェラーゼ転写物は赤色の点で示す。n=3のバイオロジカルレプリケートからの平均を示す。(B)内因性KRAS mRNAのノックダウンの特異性。C2c2は内因性KRASのノックダウンに関してRNAiよりも特異的が高い。標的転写物は赤色の点で示す。(C)内因性PPIB mRNAのノックダウンの特異性。C2c2は内因性PPIBのノックダウンに関してRNAiよりも特異的が高い。標的転写物は赤色の点で示す。 図29E〜図29G.(E)3つの異なる遺伝子におけるLwaCas13aノックダウンをshRNAノックダウンと比較する6つのRNA−seqライブラリの遺伝子発現差異解析(各々3回のバイオロジカルレプリケート)。遺伝子は、それがノンターゲティング対照と比べて平均変化倍数>2又は<0.75を有し、且つ偽発見率(FDR)<0.10を有する場合に有意に差次的に発現したと見なされる。(F)RNA seqライブラリからの標的遺伝子に関して定量化した平均ノックダウンレベル。(G)左:細胞成長の計測に先立つ抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞のルシフェラーゼノックダウン。中央:抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞の細胞生存度。右:抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞のGFP蛍光。値は全て、n=3での平均値±SEMである。
図29A〜図29C.(A)スペーサー配列にシングル塩基対ミスマッチを有するルシフェラーゼmRNAノックダウンを標的とするβLwC2c2。(B)スペーサー配列にシングル塩基対ミスマッチを有するCXCR4 mRNAノックダウンを標的とするLwC2c2。(C)スペーサー配列にシングル及び連続ダブル塩基対ミスマッチを有するルシフェラーゼmRNAノックダウンを標的とするLwC2c2。 図29D−A〜図29D−C.(A)ルシフェラーゼレポーターmRNAのノックダウンの特異性。C2c2はルシフェラーゼレポーターmRNAのノックダウンに関してRNAiよりも特異的が高い。左:shRNAについてのルシフェラーゼノックダウン条件と比べたノンターゲティングトランスフェクト対照(全てのグラフのx軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。右:C2c2についてのルシフェラーゼノックダウン条件と比べたノンターゲティングトランスフェクト対照(全てのグラフのx軸)のRNA−seqライブラリにおける検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。ノックダウンの標的となる標的ルシフェラーゼ転写物は赤色の点で示す。n=3のバイオロジカルレプリケートからの平均を示す。(B)内因性KRAS mRNAのノックダウンの特異性。C2c2は内因性KRASのノックダウンに関してRNAiよりも特異的が高い。標的転写物は赤色の点で示す。(C)内因性PPIB mRNAのノックダウンの特異性。C2c2は内因性PPIBのノックダウンに関してRNAiよりも特異的が高い。標的転写物は赤色の点で示す。 図29E〜図29G.(E)3つの異なる遺伝子におけるLwaCas13aノックダウンをshRNAノックダウンと比較する6つのRNA−seqライブラリの遺伝子発現差異解析(各々3回のバイオロジカルレプリケート)。遺伝子は、それがノンターゲティング対照と比べて平均変化倍数>2又は<0.75を有し、且つ偽発見率(FDR)<0.10を有する場合に有意に差次的に発現したと見なされる。(F)RNA seqライブラリからの標的遺伝子に関して定量化した平均ノックダウンレベル。(G)左:細胞成長の計測に先立つ抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞のルシフェラーゼノックダウン。中央:抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞の細胞生存度。右:抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞のGFP蛍光。値は全て、n=3での平均値±SEMである。
図30A〜図30E.RNAノックダウンのレベル及び特異性の比較。C2c2はRNAiと同程度のノックダウンを維持しつつ特異性の増加を実証する。(A):解析した各RNA−seqライブラリにおいて有意に差次的に調節された遺伝子の数。3つの異なる遺伝子におけるLwaCas13aノックダウンをshRNAノックダウンと比較する6つのRNA−seqライブラリの遺伝子発現差異解析(各々3回のバイオロジカルレプリケート)。遺伝子は、それがノンターゲティング対照と比べて平均変化倍数>2又は<0.75を有し、且つ偽発見率(FDR)<0.10を有する場合に有意に差次的に発現したと見なされる。(B):RNA seqライブラリからの標的遺伝子に関して定量化した平均ノックダウンレベル。正規化発現は、ターゲティング条件における標的遺伝子のTPMをノンターゲット条件における標的遺伝子のTPMで除したものとして計算する。プロットは、図28のRNA−seqプロットの累積データを表す。オフターゲットは、有意に上方制御される(unregulated)(>2倍)又は下方制御される(<0.75倍)遺伝子として決定する。(C)非選択可能バージョン及びブラストサイジン(blastcidin)選択可能バージョンのC2c2を含むLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞のルシフェラーゼノックダウン。(D)抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞の細胞生存度。(E)抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞のGFP蛍光。
図30A〜図30E.RNAノックダウンのレベル及び特異性の比較。C2c2はRNAiと同程度のノックダウンを維持しつつ特異性の増加を実証する。(A):解析した各RNA−seqライブラリにおいて有意に差次的に調節された遺伝子の数。3つの異なる遺伝子におけるLwaCas13aノックダウンをshRNAノックダウンと比較する6つのRNA−seqライブラリの遺伝子発現差異解析(各々3回のバイオロジカルレプリケート)。遺伝子は、それがノンターゲティング対照と比べて平均変化倍数>2又は<0.75を有し、且つ偽発見率(FDR)<0.10を有する場合に有意に差次的に発現したと見なされる。(B):RNA seqライブラリからの標的遺伝子に関して定量化した平均ノックダウンレベル。正規化発現は、ターゲティング条件における標的遺伝子のTPMをノンターゲット条件における標的遺伝子のTPMで除したものとして計算する。プロットは、図28のRNA−seqプロットの累積データを表す。オフターゲットは、有意に上方制御される(unregulated)(>2倍)又は下方制御される(<0.75倍)遺伝子として決定する。(C)非選択可能バージョン及びブラストサイジン(blastcidin)選択可能バージョンのC2c2を含むLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞のルシフェラーゼノックダウン。(D)抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞の細胞生存度。(E)抗生物質選択有り及び無しでLwaCas13aを72時間トランスフェクトした細胞のGFP蛍光。
図31C2c2は多重ノックダウン能を有する。crRNAは、PPIB、CXCR4、KRAS、TINCR、及びPCATを標的とするように設計した。上のパネルは、色分けされたmRNAの正規化発現レベルを、図示される多重化crRNA転写物と左から右に同じ順番で示す。下のパネルは、単一で投与したガイドを多重化したガイド及びプールしたガイドと比較する。
図32A〜図32D.gLuc又はcLucの長さに沿ってガイドをタイリングすると、リターゲティング能力及び転写物上の脆弱性領域が示される。(A)LwaCas13aアレイ化スクリーニングの概略図。(B)186個のガイドを転写物の長さにわたって均等にタイリングしたLwC2c2によるガウシアルシフェラーゼmRNAのノックダウン効率。(C)ガイドを転写物の長さにわたって均等にタイリングしたLwC2c2によるウミホタルルシフェラーゼのアレイ化ノックダウンスクリーン。(D)アレイ化ノックダウンスクリーンからの上位3つのcrRNAのshRNA比較による検証。
図33A図33B.RNA免疫沈降(RIP)は標的結合のエンリッチメントを示す。HAタグを含むdC2c2−msfGFPがタンパク質−RNA複合体沈殿をもたらした。結合したRNAをqPCRによって定量化し、入力RNA(免疫沈降なしの試料)及び陰性対照抗体による免疫沈降と比較してエンリッチメントを決定した。パネルAは、β−アクチンRNA標的のエンリッチメントを示す。パネルBは、ルシフェラーゼ標的のエンリッチメントを示す。
図33A図33B.RNA免疫沈降(RIP)は標的結合のエンリッチメントを示す。HAタグを含むdC2c2−msfGFPがタンパク質−RNA複合体の沈殿をもたらした。結合したRNAをqPCRによって定量化し、入力RNA(免疫沈降なしの試料)及び陰性対照抗体による免疫沈降と比較してエンリッチメントを決定した。パネルAは、β−アクチンRNA標的のエンリッチメントを示す。パネルBは、ルシフェラーゼ標的のエンリッチメントを示す。
図34.3T3L1線維芽細胞におけるβ−アクチンのC2c2イメージング。ターゲティング条件では(上のフレーム)、C2c2複合体はアクチンmRNAに結合して核を離れ、細胞質β−アクチンmRNAを明らかにする。ノンターゲティング条件では、NLSタグ付加C2c2が核に観察される。左右のカラムは異なる視野に相当する。
図35.HEK293FT細胞におけるβ−アクチンのC2c2イメージング。ターゲティング条件では(上のフレーム)、C2c2複合体はアクチンmRNAに結合して核を離れ、細胞質β−アクチンmRNAを明らかにする。ノンターゲティング条件では、NLSタグ付加C2c2が核に観察される。左右のカラムは異なる視野に相当する。
図36.Lw2Cas13aのRNA切断動態のインビトロでの特徴付け。半対数段階で系列希釈したLwaCas13a−crRNA複合体を使用した5’末端標識標的1の0.5時間のRNA切断後の変性ゲル
図37.Lw2Cas13aのRNA切断動態のインビトロでの特徴付け。5’末端標識標的1を使用したLw2Cas13a ssRNA切断の時系列の変性ゲル(denutaring gel)。
図38.Lw2C2c2及びcrRNAはRNAガイド下ssRNA切断を媒介する。1時間のインキュベーション後におけるLw2 C2c2によるcrRNA媒介性ssRNA切断を示す変性ゲル。ssRNA標的はIRDye 800で5’標識する。切断にはcrRNAの存在が必要であり、EDTAを加えると切断はなくなる。
図39A〜図39B.Lw2C2c2及びcrRNAはRNAガイド下ssRNA切断を媒介する。(A)crRNAによって標的化されているssRNA基質の概略図。プロトスペーサー領域を青色で強調表示し、PFSをマゼンタ色のバーで示す。(B)3時間のインキュベーション後におけるPFSの必要性を示す変性ゲル。PFS(概略図中、マゼンタ色のXで示す)を除いて同一の4つのssRNA基質をインビトロ切断反応に使用した。ssRNA切断活性は標的部位の直ちに3’側にあるヌクレオチドに依存する。
図40.ダイレクトリピート長さがLw2C2c2のRNAガイド下RNアーゼ活性に影響を及ぼす。3時間のインキュベーション後におけるダイレクトリピート長さに応じたssRNA 1のcrRNAガイド下切断を示す変性ゲル。
図41.スペーサー長さがLw2C2c2のRNAガイド下RNアーゼ活性に影響を及ぼす。3時間のインキュベーション後におけるスペーサー長さに応じたssRNA 1のcrRNAガイド下切断を示す変性ゲル。
図42A〜図42C.Lw2C2c2切断部位は標的RNAの二次構造及び配列によって決まる。(A)LwCas13a及びcrRNA 1とインキュベートした後のssRNA 4及びssRNA 5を示す変性ゲル。(B)ssRNA 4(青色)及び(C)ssRNA 5;(緑色)は同じプロトスペーサーを共有するが、異なる配列が隣接する。同一のプロトスペーサーにも関わらず、フランキング配列が異なるため、異なる切断パターンとなる。
図43A〜図43C.(A)4つの可能なヌクレオチドの各々について強調表示したループ(赤色)においてホモポリマーストレッチで改変されたssRNA 4の概略図。crRNAスペーサー配列は青色で強調表示する。(B).4つの可能なホモポリマー標的の各々について3時間のインキュベーション後におけるLw2C2c2−crRNA媒介性切断を示す変性ゲル。Lw2C2c2はC及びUを切断する。(C)LwaCas13aはL.ウエイデイ(L.wadeii)CRISPR−Cas遺伝子座からのpre−crRNAをプロセシングすることができる。
図44A〜図44K.触媒不活性LwaCas13a(dCas13a)は哺乳類細胞において転写物への結合能を有する。(A)dCas13a結合のイメージング及び評価に使用されるdCas13a−GFP構築物の概略図。(B)dCas13a結合を定量化するためのRNA免疫沈降の概略図。(C)gLuc転写物を標的とするdCas13aはノンターゲティング対照と比較して有意にエンリッチされる。対照抗体又は入力ライセートのいずれかに対して正規化したRIPによるガウシア(gaussian)ルシフェラーゼmRNAについてのdC2c2−msfGFP結合の定量化。値はノンターゲティングガイドに対して正規化する。(n=3、*、p<0.05;****、p<0.0001、t検定による)。(D)ネガティブフィードバックイメージングに使用されるdCas13a−GFP−KRAB構築物の概略図。標的及びガイドが存在しない場合、レポータータンパク質はそれ自身の転写を阻害する。(E)Gluc、Cluc、PPIB、及びKRASノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。(F)b−アクチンのイメージングのためのdCas13−GFP構築物とdCas13a−GFP−KRAB構築物との局在間の比較。(G)HEK293細胞におけるb−アクチンを標的とする複数のガイドによるdCas13a−GFP−KRABイメージングの代表的な画像。(H)ACTBを標的とする複数のガイドによるdCas13a−GFP−KRABイメージングの代表的な画像。(I)核対全細胞シグナル比によって計測したときの、dCas13a−GFP−KRABの細胞質移行の定量化。(J)400uM亜ヒ酸ナトリウムで処理した293FT細胞の代表的な固定免疫蛍光像。マーカーG3BP1を染色することによりストレス顆粒が示される。スケールバー、5μm。スケールバー、5μm。(K)ピアソン相関によって細胞当たりに定量化したG3BP1及びdCas13a−GFP−KRABの共局在。値は全て、n=3での平均値±SEMである。****p<0.0001;***p<0.001;**p<0.01;*p<0.05。ns=有意差なし。(a)の比較には片側スチューデントt検定を使用し、及び(I)及び(K)の比較には両側スチューデントt検定を使用した。
図44A〜図44K.触媒不活性LwaCas13a(dCas13a)は哺乳類細胞において転写物への結合能を有する。(A)dCas13a結合のイメージング及び評価に使用されるdCas13a−GFP構築物の概略図。(B)dCas13a結合を定量化するためのRNA免疫沈降の概略図。(C)gLuc転写物を標的とするdCas13aはノンターゲティング対照と比較して有意にエンリッチされる。対照抗体又は入力ライセートのいずれかに対して正規化したRIPによるガウシア(gaussian)ルシフェラーゼmRNAについてのdC2c2−msfGFP結合の定量化。値はノンターゲティングガイドに対して正規化する。(n=3、*、p<0.05;****、p<0.0001、t検定による)。(D)ネガティブフィードバックイメージングに使用されるdCas13a−GFP−KRAB構築物の概略図。標的及びガイドが存在しない場合、レポータータンパク質はそれ自身の転写を阻害する。(E)Gluc、Cluc、PPIB、及びKRASノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。(F)b−アクチンのイメージングのためのdCas13−GFP構築物とdCas13a−GFP−KRAB構築物との局在間の比較。(G)HEK293細胞におけるb−アクチンを標的とする複数のガイドによるdCas13a−GFP−KRABイメージングの代表的な画像。(H)ACTBを標的とする複数のガイドによるdCas13a−GFP−KRABイメージングの代表的な画像。(I)核対全細胞シグナル比によって計測したときの、dCas13a−GFP−KRABの細胞質移行の定量化。(J)400uM亜ヒ酸ナトリウムで処理した293FT細胞の代表的な固定免疫蛍光像。マーカーG3BP1を染色することによりストレス顆粒が示される。スケールバー、5μm。スケールバー、5μm。(K)ピアソン相関によって細胞当たりに定量化したG3BP1及びdCas13a−GFP−KRABの共局在。値は全て、n=3での平均値±SEMである。****p<0.0001;***p<0.001;**p<0.01;*p<0.05。ns=有意差なし。(a)の比較には片側スチューデントt検定を使用し、及び(I)及び(K)の比較には両側スチューデントt検定を使用した。
図44A〜図44K.触媒不活性LwaCas13a(dCas13a)は哺乳類細胞において転写物への結合能を有する。(A)dCas13a結合のイメージング及び評価に使用されるdCas13a−GFP構築物の概略図。(B)dCas13a結合を定量化するためのRNA免疫沈降の概略図。(C)gLuc転写物を標的とするdCas13aはノンターゲティング対照と比較して有意にエンリッチされる。対照抗体又は入力ライセートのいずれかに対して正規化したRIPによるガウシア(gaussian)ルシフェラーゼmRNAについてのdC2c2−msfGFP結合の定量化。値はノンターゲティングガイドに対して正規化する。(n=3、*、p<0.05;****、p<0.0001、t検定による)。(D)ネガティブフィードバックイメージングに使用されるdCas13a−GFP−KRAB構築物の概略図。標的及びガイドが存在しない場合、レポータータンパク質はそれ自身の転写を阻害する。(E)Gluc、Cluc、PPIB、及びKRASノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。(F)b−アクチンのイメージングのためのdCas13−GFP構築物とdCas13a−GFP−KRAB構築物との局在間の比較。(G)HEK293細胞におけるb−アクチンを標的とする複数のガイドによるdCas13a−GFP−KRABイメージングの代表的な画像。(H)ACTBを標的とする複数のガイドによるdCas13a−GFP−KRABイメージングの代表的な画像。(I)核対全細胞シグナル比によって計測したときの、dCas13a−GFP−KRABの細胞質移行の定量化。(J)400uM亜ヒ酸ナトリウムで処理した293FT細胞の代表的な固定免疫蛍光像。マーカーG3BP1を染色することによりストレス顆粒が示される。スケールバー、5μm。スケールバー、5μm。(K)ピアソン相関によって細胞当たりに定量化したG3BP1及びdCas13a−GFP−KRABの共局在。値は全て、n=3での平均値±SEMである。****p<0.0001;***p<0.001;**p<0.01;*p<0.05。ns=有意差なし。(a)の比較には片側スチューデントt検定を使用し、及び(I)及び(K)の比較には両側スチューデントt検定を使用した。
図44A〜図44K.触媒不活性LwaCas13a(dCas13a)は哺乳類細胞において転写物への結合能を有する。(A)dCas13a結合のイメージング及び評価に使用されるdCas13a−GFP構築物の概略図。(B)dCas13a結合を定量化するためのRNA免疫沈降の概略図。(C)gLuc転写物を標的とするdCas13aはノンターゲティング対照と比較して有意にエンリッチされる。対照抗体又は入力ライセートのいずれかに対して正規化したRIPによるガウシア(gaussian)ルシフェラーゼmRNAについてのdC2c2−msfGFP結合の定量化。値はノンターゲティングガイドに対して正規化する。(n=3、*、p<0.05;****、p<0.0001、t検定による)。(D)ネガティブフィードバックイメージングに使用されるdCas13a−GFP−KRAB構築物の概略図。標的及びガイドが存在しない場合、レポータータンパク質はそれ自身の転写を阻害する。(E)Gluc、Cluc、PPIB、及びKRASノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。(F)b−アクチンのイメージングのためのdCas13−GFP構築物とdCas13a−GFP−KRAB構築物との局在間の比較。(G)HEK293細胞におけるb−アクチンを標的とする複数のガイドによるdCas13a−GFP−KRABイメージングの代表的な画像。(H)ACTBを標的とする複数のガイドによるdCas13a−GFP−KRABイメージングの代表的な画像。(I)核対全細胞シグナル比によって計測したときの、dCas13a−GFP−KRABの細胞質移行の定量化。(J)400uM亜ヒ酸ナトリウムで処理した293FT細胞の代表的な固定免疫蛍光像。マーカーG3BP1を染色することによりストレス顆粒が示される。スケールバー、5μm。スケールバー、5μm。(K)ピアソン相関によって細胞当たりに定量化したG3BP1及びdCas13a−GFP−KRABの共局在。値は全て、n=3での平均値±SEMである。****p<0.0001;***p<0.001;**p<0.01;*p<0.05。ns=有意差なし。(a)の比較には片側スチューデントt検定を使用し、及び(I)及び(K)の比較には両側スチューデントt検定を使用した。
図45.図43に示されるとおりのC2c2−GFPイメージングタンパク質を使用したβ−アクチンの検出。dC2c2−eGFP−ZF−KRAB−NLSをターゲティングガイド(左側のパネル)又はノンターゲティングガイド(右側のパネル)と共に使用してβ−アクチンをイメージングした。
図46.GFPタグ付加G3BP1を使用したストレス顆粒の検出。
図47.ストレス顆粒及びストレス顆粒部分構造(「コア」)におけるアクチン(acting)の検出。ターゲティング構築物有り及び無しで、且つコア部分構造を安定化させるNaAsO2処理有り又は無しで、C2c2−eGFP−ZF−KRABを使用してアクチンmRNAをイメージングした。ストレス顆粒は抗G3BP1を使用して標識した。
図48A〜図48F:dCas13aは生細胞のストレス顆粒形成をイメージングすることができる。(A)ネガティブフィードバックdCas13a−msfGFP−KRAB構築物を使用して亜ヒ酸ナトリウム処理時のβ−アクチンmRNAのストレス顆粒への局在化をイメージングすることに関する概略図。(B)400uM亜ヒ酸ナトリウムで処理した293FT細胞の代表的な固定免疫蛍光像。β−アクチンmRNAターゲティングガイドと共にトランスフェクトされたdCas13a−msfGFP−KRABはストレス顆粒に局在する。ストレス顆粒のG3BP1マーカーに対する抗体で免疫染色した固定HEK293細胞の代表的な画像を示す。(C)条件当たり約20細胞のピアソン相関分析によるストレス顆粒局在の定量化。(D):条件当たり約20細胞のマンダースの共局在解析によるストレス顆粒局在の定量化。(E)400uM亜ヒ酸ナトリウム処理に応答したストレス顆粒形成の生細胞解析からの代表的な画像。(F)亜ヒ酸ナトリウム処理に応答したストレス顆粒形成の定量化。
図48A〜図48F:dCas13aは生細胞のストレス顆粒形成をイメージングすることができる。(A)ネガティブフィードバックdCas13a−msfGFP−KRAB構築物を使用して亜ヒ酸ナトリウム処理時のβ−アクチンmRNAのストレス顆粒への局在化をイメージングすることに関する概略図。(B)400uM亜ヒ酸ナトリウムで処理した293FT細胞の代表的な固定免疫蛍光像。β−アクチンmRNAターゲティングガイドと共にトランスフェクトされたdCas13a−msfGFP−KRABはストレス顆粒に局在する。ストレス顆粒のG3BP1マーカーに対する抗体で免疫染色した固定HEK293細胞の代表的な画像を示す。(C)条件当たり約20細胞のピアソン相関分析によるストレス顆粒局在の定量化。(D):条件当たり約20細胞のマンダースの共局在解析によるストレス顆粒局在の定量化。(E)400uM亜ヒ酸ナトリウム処理に応答したストレス顆粒形成の生細胞解析からの代表的な画像。(F)亜ヒ酸ナトリウム処理に応答したストレス顆粒形成の定量化。
図48A〜図48F:dCas13aは生細胞のストレス顆粒形成をイメージングすることができる。(A)ネガティブフィードバックdCas13a−msfGFP−KRAB構築物を使用して亜ヒ酸ナトリウム処理時のβ−アクチンmRNAのストレス顆粒への局在化をイメージングすることに関する概略図。(B)400uM亜ヒ酸ナトリウムで処理した293FT細胞の代表的な固定免疫蛍光像。β−アクチンmRNAターゲティングガイドと共にトランスフェクトされたdCas13a−msfGFP−KRABはストレス顆粒に局在する。ストレス顆粒のG3BP1マーカーに対する抗体で免疫染色した固定HEK293細胞の代表的な画像を示す。(C)条件当たり約20細胞のピアソン相関分析によるストレス顆粒局在の定量化。(D):条件当たり約20細胞のマンダースの共局在解析によるストレス顆粒局在の定量化。(E)400uM亜ヒ酸ナトリウム処理に応答したストレス顆粒形成の生細胞解析からの代表的な画像。(F)亜ヒ酸ナトリウム処理に応答したストレス顆粒形成の定量化。
図49A〜図49O LwaCas13aは内因性哺乳類コード及び非コードRNA標的を標的とするように再プログラムすることができる。(A)KRAS転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(B)PPIB転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(C)LwaCas13aアレイ化スクリーニングの概略図。(D)Gluc転写物にわたって均等にタイリングした186個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(E)ウミホタル(Cypridinia)ルシフェラーゼ(Cluc)転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(F)KRAS転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(G)PPIB転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(H)内因性アレイ化ノックダウンスクリーンからの上位3個のガイドのshRNA比較による検証。値は全て、n=3での平均値±SEMである。***p<0.001;**p<0.01。比較には両側スチューデントt検定を使用した。(I)MALAT1転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(J)内因性アレイ化MALAT1ノックダウンスクリーンからの上位3個のガイドのshRNA比較による検証。(K)単一プロモーターの発現下にある5つの異なる内因性遺伝子に対するCRISPRアレイ内の5つのガイドの多重送達はロバストなノックダウンが可能である。(L)3つの異なる内因性遺伝子に対する3つのガイドの多重送達又はガイドの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。値は全て、n=3での平均値±SEMである。(M)対応するRNAi構築物と比較したLwaCas13aによる3つの異なる内因性転写物のノックダウン。(N)LwaCas13aは核lncRNA転写物MALAT1のノックダウン能を有する。(O)3つの異なる内因性遺伝子に対する3つのガイドの多重送達又はcrRNAの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。
図49A〜図49O LwaCas13aは内因性哺乳類コード及び非コードRNA標的を標的とするように再プログラムすることができる。(A)KRAS転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(B)PPIB転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(C)LwaCas13aアレイ化スクリーニングの概略図。(D)Gluc転写物にわたって均等にタイリングした186個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(E)ウミホタル(Cypridinia)ルシフェラーゼ(Cluc)転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(F)KRAS転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(G)PPIB転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(H)内因性アレイ化ノックダウンスクリーンからの上位3個のガイドのshRNA比較による検証。値は全て、n=3での平均値±SEMである。***p<0.001;**p<0.01。比較には両側スチューデントt検定を使用した。(I)MALAT1転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(J)内因性アレイ化MALAT1ノックダウンスクリーンからの上位3個のガイドのshRNA比較による検証。(K)単一プロモーターの発現下にある5つの異なる内因性遺伝子に対するCRISPRアレイ内の5つのガイドの多重送達はロバストなノックダウンが可能である。(L)3つの異なる内因性遺伝子に対する3つのガイドの多重送達又はガイドの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。値は全て、n=3での平均値±SEMである。(M)対応するRNAi構築物と比較したLwaCas13aによる3つの異なる内因性転写物のノックダウン。(N)LwaCas13aは核lncRNA転写物MALAT1のノックダウン能を有する。(O)3つの異なる内因性遺伝子に対する3つのガイドの多重送達又はcrRNAの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。
図49A〜図49O LwaCas13aは内因性哺乳類コード及び非コードRNA標的を標的とするように再プログラムすることができる。(A)KRAS転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(B)PPIB転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(C)LwaCas13aアレイ化スクリーニングの概略図。(D)Gluc転写物にわたって均等にタイリングした186個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(E)ウミホタル(Cypridinia)ルシフェラーゼ(Cluc)転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(F)KRAS転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(G)PPIB転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(H)内因性アレイ化ノックダウンスクリーンからの上位3個のガイドのshRNA比較による検証。値は全て、n=3での平均値±SEMである。***p<0.001;**p<0.01。比較には両側スチューデントt検定を使用した。(I)MALAT1転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(J)内因性アレイ化MALAT1ノックダウンスクリーンからの上位3個のガイドのshRNA比較による検証。(K)単一プロモーターの発現下にある5つの異なる内因性遺伝子に対するCRISPRアレイ内の5つのガイドの多重送達はロバストなノックダウンが可能である。(L)3つの異なる内因性遺伝子に対する3つのガイドの多重送達又はガイドの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。値は全て、n=3での平均値±SEMである。(M)対応するRNAi構築物と比較したLwaCas13aによる3つの異なる内因性転写物のノックダウン。(N)LwaCas13aは核lncRNA転写物MALAT1のノックダウン能を有する。(O)3つの異なる内因性遺伝子に対する3つのガイドの多重送達又はcrRNAの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。
図49A〜図49O LwaCas13aは内因性哺乳類コード及び非コードRNA標的を標的とするように再プログラムすることができる。(A)KRAS転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(B)PPIB転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(C)LwaCas13aアレイ化スクリーニングの概略図。(D)Gluc転写物にわたって均等にタイリングした186個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(E)ウミホタル(Cypridinia)ルシフェラーゼ(Cluc)転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(F)KRAS転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(G)PPIB転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(H)内因性アレイ化ノックダウンスクリーンからの上位3個のガイドのshRNA比較による検証。値は全て、n=3での平均値±SEMである。***p<0.001;**p<0.01。比較には両側スチューデントt検定を使用した。(I)MALAT1転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。(J)内因性アレイ化MALAT1ノックダウンスクリーンからの上位3個のガイドのshRNA比較による検証。(K)単一プロモーターの発現下にある5つの異なる内因性遺伝子に対するCRISPRアレイ内の5つのガイドの多重送達はロバストなノックダウンが可能である。(L)3つの異なる内因性遺伝子に対する3つのガイドの多重送達又はガイドの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。値は全て、n=3での平均値±SEMである。(M)対応するRNAi構築物と比較したLwaCas13aによる3つの異なる内因性転写物のノックダウン。(N)LwaCas13aは核lncRNA転写物MALAT1のノックダウン能を有する。(O)3つの異なる内因性遺伝子に対する3つのガイドの多重送達又はcrRNAの各々をノンターゲティング配列で置き換えた構築物では、標的の遺伝子の特異的ノックダウンが示される。
図50.21個のC2c2オルソログからのHEPN配列モチーフ。
図51.33個のC2c2オルソログからのHEPN配列モチーフ。
図52エフェクタードメインの例示的連結位置。C末端又はN末端で異種機能ドメイン(示されるmCherry及びmsfGFP)に連結したC2c2タンパク質は、ルシフェラーゼノックダウンによって示されるとおりの機能を保持している。
図53A〜図53L.(A〜K)C2c2オルソログの配列アラインメント。(L)HEPNドメインの配列アラインメント。
図53A〜図53L.(A〜K)C2c2オルソログの配列アラインメント。(L)HEPNドメインの配列アラインメント。
図53A〜図53L.(A〜K)C2c2オルソログの配列アラインメント。(L)HEPNドメインの配列アラインメント。
図53A〜図53L.(A〜K)C2c2オルソログの配列アラインメント。(L)HEPNドメインの配列アラインメント。
図53A〜図53L.(A〜K)C2c2オルソログの配列アラインメント。(L)HEPNドメインの配列アラインメント。
図53A〜図53L.(A〜K)C2c2オルソログの配列アラインメント。(L)HEPNドメインの配列アラインメント。
図53A〜図53L.(A〜K)C2c2オルソログの配列アラインメント。(L)HEPNドメインの配列アラインメント。
図53A〜図53L.(A〜K)C2c2オルソログの配列アラインメント。(L)HEPNドメインの配列アラインメント。
図53A〜図53L.(A〜K)C2c2オルソログの配列アラインメント。(L)HEPNドメインの配列アラインメント。
図53A〜図53L.(A〜K)C2c2オルソログの配列アラインメント。(L)HEPNドメインの配列アラインメント。
図53A〜図53L.(A〜K)C2c2オルソログの配列アラインメント。(L)HEPNドメインの配列アラインメント。
図54.C2c2オルソログのツリーアラインメント。
図55A図55B.C2c2及びCas13bオルソログのツリーアラインメント。
図55A図55B.C2c2及びCas13bオルソログのツリーアラインメント。
図56A〜図56F:哺乳類ノックダウンのためのLwaCas13aのエンジニアリング及び最適化。(A)Gluc crRNA 1及び様々な量のトランスフェクトLwaCas13aプラスミドによるGluc転写物のノックダウン。(B)LwaCas13a及び様々な量のトランスフェクトGluc crRNA 1及び2プラスミドによるGluc転写物のノックダウン。(C)U6プロモーター又はtRNAValプロモーターのいずれかから発現するcrRNAを使用したGluc転写物のノックダウン。(D)U6プロモーター又はtRNAValプロモーターのいずれかから発現するcrRNAを使用したKRAS転写物のノックダウン。(E)U6プロモーター又はtRNAValプロモーターのいずれかから発現するガイドを使用したKRAS転写物のノックダウン。(F)XIST転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。
図56A〜図56F:哺乳類ノックダウンのためのLwaCas13aのエンジニアリング及び最適化。(A)Gluc crRNA 1及び様々な量のトランスフェクトLwaCas13aプラスミドによるGluc転写物のノックダウン。(B)LwaCas13a及び様々な量のトランスフェクトGluc crRNA 1及び2プラスミドによるGluc転写物のノックダウン。(C)U6プロモーター又はtRNAValプロモーターのいずれかから発現するcrRNAを使用したGluc転写物のノックダウン。(D)U6プロモーター又はtRNAValプロモーターのいずれかから発現するcrRNAを使用したKRAS転写物のノックダウン。(E)U6プロモーター又はtRNAValプロモーターのいずれかから発現するガイドを使用したKRAS転写物のノックダウン。(F)XIST転写物にわたって均等にタイリングした93個のガイドのアレイ化ノックダウンスクリーン。
図57A〜図57E:LwaCas13a PFS優先性の評価及びLshCas13aとの比較。(A)本研究で評価した15個のCas13aオルソログの配列比較ツリー。(B)様々な枯渇閾値について枯渇閾値を上回るLshCas13a及びLwaCas13a PFS配列の数。(C)ターゲティング試料におけるLshCas13a及びLwaCas13aのPFSエンリッチメントの分布、ノンターゲティング試料に対して正規化した。(D)様々なエンリッチメントカットオフ閾値でのLshCas13a切断後の残りのPFS配列の配列ロゴ及びカウント。(E)様々なエンリッチメントカットオフ閾値でのLwaCas13a切断後の残りのPFS配列の配列ロゴ及びカウント。
図57A〜図57E:LwaCas13a PFS優先性の評価及びLshCas13aとの比較。(A)本研究で評価した15個のCas13aオルソログの配列比較ツリー。(B)様々な枯渇閾値について枯渇閾値を上回るLshCas13a及びLwaCas13a PFS配列の数。(C)ターゲティング試料におけるLshCas13a及びLwaCas13aのPFSエンリッチメントの分布、ノンターゲティング試料に対して正規化した。(D)様々なエンリッチメントカットオフ閾値でのLshCas13a切断後の残りのPFS配列の配列ロゴ及びカウント。(E)様々なエンリッチメントカットオフ閾値でのLwaCas13a切断後の残りのPFS配列の配列ロゴ及びカウント。
図58A図58D:LwaCas13aターゲティング効率は転写物に沿った接近可能性の影響を受ける。(A)第1列:上位ノックダウンガイドを標的転写物に沿った位置毎にプロットする。Glucについては上位20%のガイドを選択し、Cluc、KRAS、及びPPIBについては上位30%のガイドを選択する。第2列:ランダムな帰無分布(赤色)と比較した各転写物の隣接する上位ガイド間ペアワイズ距離(青色)のヒストグラム。挿入図は、これらのヒストグラムの累積度数曲線を示す。青色の曲線(実際の計測距離)から左の赤色の曲線(距離の帰無分布)へのシフトは、ガイドが偶然から予想されるよりも互いに近いことを示す。(B)Gluc、Cluc、PPIB、及びKRASノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。(C)標的の接近可能性(ある領域が塩基対合する確率)とLwaCas13aによるノックダウン後の標的発現との間の相関を示すカーネル密度推定プロット。(D)第1列:種々のウィンドウサイズ(W)で種々のk−mer長さについて計測した、標的発現と標的の接近可能性(ある領域が塩基対合する確率)との間の相関。第2列:種々のウィンドウサイズ(W)で種々のk−mer長さについて計測した標的発現と標的の接近可能性(ある領域が塩基対合する確率)との間の相関のp値。カラースケールは、p値>0.05に赤色の陰影が付され、p値<0.05に青色の陰影が付されるように設計される。
図58A図58D:LwaCas13aターゲティング効率は転写物に沿った接近可能性の影響を受ける。(A)第1列:上位ノックダウンガイドを標的転写物に沿った位置毎にプロットする。Glucについては上位20%のガイドを選択し、Cluc、KRAS、及びPPIBについては上位30%のガイドを選択する。第2列:ランダムな帰無分布(赤色)と比較した各転写物の隣接する上位ガイド間のペアワイズ距離(青色)のヒストグラム。挿入図は、これらのヒストグラムの累積度数曲線を示す。青色の曲線(実際の計測距離)から左の赤色の曲線(距離の帰無分布)へのシフトは、ガイドが偶然から予想されるよりも互いに近いことを示す。(B)Gluc、Cluc、PPIB、及びKRASノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。(C)標的の接近可能性(ある領域が塩基対合する確率)とLwaCas13aによるノックダウン後の標的発現との間の相関を示すカーネル密度推定プロット。(D)第1列:種々のウィンドウサイズ(W)で種々のk−mer長さについて計測した、標的発現と標的の接近可能性(ある領域が塩基対合する確率)との間の相関。第2列:種々のウィンドウサイズ(W)で種々のk−mer長さについて計測した標的発現と標的の接近可能性(ある領域が塩基対合する確率)との間の相関のp値。カラースケールは、p値>0.05に赤色の陰影が付され、p値<0.05に青色の陰影が付されるように設計される。
図58A図58D:LwaCas13aターゲティング効率は転写物に沿った接近可能性の影響を受ける。(A)第1列:上位ノックダウンガイドを標的転写物に沿った位置毎にプロットする。Glucについては上位20%のガイドを選択し、Cluc、KRAS、及びPPIBについては上位30%のガイドを選択する。第2列:ランダムな帰無分布(赤色)と比較した各転写物の隣接する上位ガイド間のペアワイズ距離(青色)のヒストグラム。挿入図は、これらのヒストグラムの累積度数曲線を示す。青色の曲線(実際の計測距離)から左の赤色の曲線(距離の帰無分布)へのシフトは、ガイドが偶然から予想されるよりも互いに近いことを示す。(B)Gluc、Cluc、PPIB、及びKRASノックダウンは、転写物の予測されるフォールディングによって計測したときの標的の接近可能性と部分的に相関する。(C)標的の接近可能性(ある領域が塩基対合する確率)とLwaCas13aによるノックダウン後の標的発現との間の相関を示すカーネル密度推定プロット。(D)第1列:種々のウィンドウサイズ(W)で種々のk−mer長さについて計測した、標的発現と標的の接近可能性(ある領域が塩基対合する確率)との間の相関。第2列:種々のウィンドウサイズ(W)で種々のk−mer長さについて計測した標的発現と標的の接近可能性(ある領域が塩基対合する確率)との間の相関のp値。カラースケールは、p値>0.05に赤色の陰影が付され、p値<0.05に青色の陰影が付されるように設計される。
図59A〜図59K:様々なスペーサー長さのcrRNA:標的二重鎖におけるミスマッチに対するLwaCas13a感受性の詳細な評価。(A)スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むcrRNAで評価したKRASのノックダウン。(B)スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むcrRNAで評価したPPIBのノックダウン。(C)スペーサー配列の様々な位置に非連続ダブルミスマッチを含むガイドで評価したGlucのノックダウン。野生型配列を一番上に示し、ミスマッチのアイデンティティを下に示す。(D)様々なスペーサー長さについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(E)(D)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(F)スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む28ntスペーサーcrRNAについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(G)(F)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(H)スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む23ntスペーサーcrRNAについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(I)(H)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(J)スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む20ntスペーサーcrRNAについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(K)(J)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。
図59A〜図59K:様々なスペーサー長さのcrRNA:標的二重鎖におけるミスマッチに対するLwaCas13a感受性の詳細な評価。(A)スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むcrRNAで評価したKRASのノックダウン。(B)スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むcrRNAで評価したPPIBのノックダウン。(C)スペーサー配列の様々な位置に非連続ダブルミスマッチを含むガイドで評価したGlucのノックダウン。野生型配列を一番上に示し、ミスマッチのアイデンティティを下に示す。(D)様々なスペーサー長さについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(E)(D)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(F)スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む28ntスペーサーcrRNAについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(G)(F)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(H)スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む23ntスペーサーcrRNAについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(I)(H)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(J)スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む20ntスペーサーcrRNAについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(K)(J)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。
図59A〜図59K:様々なスペーサー長さのcrRNA:標的二重鎖におけるミスマッチに対するLwaCas13a感受性の詳細な評価。(A)スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むcrRNAで評価したKRASのノックダウン。(B)スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むcrRNAで評価したPPIBのノックダウン。(C)スペーサー配列の様々な位置に非連続ダブルミスマッチを含むガイドで評価したGlucのノックダウン。野生型配列を一番上に示し、ミスマッチのアイデンティティを下に示す。(D)様々なスペーサー長さについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(E)(D)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(F)スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む28ntスペーサーcrRNAについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(G)(F)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(H)スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む23ntスペーサーcrRNAについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(I)(H)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(J)スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む20ntスペーサーcrRNAについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(K)(J)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。
図59A〜図59K:様々なスペーサー長さのcrRNA:標的二重鎖におけるミスマッチに対するLwaCas13a感受性の詳細な評価。(A)スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むcrRNAで評価したKRASのノックダウン。(B)スペーサー配列の様々な位置にシングルミスマッチを含むcrRNAで評価したPPIBのノックダウン。(C)スペーサー配列の様々な位置に非連続ダブルミスマッチを含むガイドで評価したGlucのノックダウン。野生型配列を一番上に示し、ミスマッチのアイデンティティを下に示す。(D)様々なスペーサー長さについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(E)(D)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(F)スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む28ntスペーサーcrRNAについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(G)(F)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(H)スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む23ntスペーサーcrRNAについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(I)(H)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(J)スペーサーに沿ってタイリングした合成ミスマッチを含む20ntスペーサーcrRNAについてのssRNA 1及び2に対するコラテラル切断活性。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。(K)(J)で試験したcrRNAの特異性比。特異性比は、オフターゲットRNA(ssRNA 2)コラテラル切断に対するオンターゲットRNA(ssRNA 1)コラテラル切断の比として計算する。(n=4テクニカルレプリケート;バーは平均値±s.e.m.を表す)。
図60A〜図60F:LwaCas13aは内因性標的に対してshRNAノックダウンよりも特異性が高く、生物学的ノイズに相当する変動がほとんどない。(A)左:KRASターゲティングshRNA(y軸)と比べたノンターゲティングshRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。KRAS転写物データ点には赤色を付ける。右:KRASターゲティングLwaCas13a−crRNA(y軸)と比べたノンターゲティングLwaCas13a−crRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。KRAS転写物データ点には赤色を付ける。(B)左:PPIBターゲティングshRNA(y軸)と比べたノンターゲティングshRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。PPIB転写物データ点には赤色を付ける。右:PPIBターゲティングLwaCas13a−crRNA(y軸)と比べたノンターゲティングLwaCas13a−crRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。PPIB転写物データ点には赤色を付ける。(C)ノンターゲティングshRNA条件(第1列)及びGlucターゲティングshRNA条件(第2列)の個別のレプリケートの比較。(D)ノンターゲティングcrRNA条件(第1列)及びGluc−ターゲティングcrRNA条件(第2列)の個別のレプリケートの比較。(E)ノンターゲティングshRNA条件とGlucターゲティングshRNA条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。(F)ノンターゲティングcrRNA条件とGlucターゲティングcrRNA条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。
図60A〜図60F:LwaCas13aは内因性標的に対してshRNAノックダウンよりも特異性が高く、生物学的ノイズに相当する変動がほとんどない。(A)左:KRASターゲティングshRNA(y軸)と比べたノンターゲティングshRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。KRAS転写物データ点には赤色を付ける。右:KRASターゲティングLwaCas13a−crRNA(y軸)と比べたノンターゲティングLwaCas13a−crRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。KRAS転写物データ点には赤色を付ける。(B)左:PPIBターゲティングshRNA(y軸)と比べたノンターゲティングshRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。PPIB転写物データ点には赤色を付ける。右:PPIBターゲティングLwaCas13a−crRNA(y軸)と比べたノンターゲティングLwaCas13a−crRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。PPIB転写物データ点には赤色を付ける。(C)ノンターゲティングshRNA条件(第1列)及びGlucターゲティングshRNA条件(第2列)の個別のレプリケートの比較。(D)ノンターゲティングcrRNA条件(第1列)及びGluc−ターゲティングcrRNA条件(第2列)の個別のレプリケートの比較。(E)ノンターゲティングshRNA条件とGlucターゲティングshRNA条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。(F)ノンターゲティングcrRNA条件とGlucターゲティングcrRNA条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。
図60A〜図60F:LwaCas13aは内因性標的に対してshRNAノックダウンよりも特異性が高く、生物学的ノイズに相当する変動がほとんどない。(A)左:KRASターゲティングshRNA(y軸)と比べたノンターゲティングshRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。KRAS転写物データ点には赤色を付ける。右:KRASターゲティングLwaCas13a−crRNA(y軸)と比べたノンターゲティングLwaCas13a−crRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。KRAS転写物データ点には赤色を付ける。(B)左:PPIBターゲティングshRNA(y軸)と比べたノンターゲティングshRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。PPIB転写物データ点には赤色を付ける。右:PPIBターゲティングLwaCas13a−crRNA(y軸)と比べたノンターゲティングLwaCas13a−crRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。PPIB転写物データ点には赤色を付ける。(C)ノンターゲティングshRNA条件(第1列)及びGlucターゲティングshRNA条件(第2列)の個別のレプリケートの比較。(D)ノンターゲティングcrRNA条件(第1列)及びGluc−ターゲティングcrRNA条件(第2列)の個別のレプリケートの比較。(E)ノンターゲティングshRNA条件とGlucターゲティングshRNA条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。(F)ノンターゲティングcrRNA条件とGlucターゲティングcrRNA条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。
図60A〜図60F:LwaCas13aは内因性標的に対してshRNAノックダウンよりも特異性が高く、生物学的ノイズに相当する変動がほとんどない。(A)左:KRASターゲティングshRNA(y軸)と比べたノンターゲティングshRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。KRAS転写物データ点には赤色を付ける。右:KRASターゲティングLwaCas13a−crRNA(y軸)と比べたノンターゲティングLwaCas13a−crRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。KRAS転写物データ点には赤色を付ける。(B)左:PPIBターゲティングshRNA(y軸)と比べたノンターゲティングshRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。PPIB転写物データ点には赤色を付ける。右:PPIBターゲティングLwaCas13a−crRNA(y軸)と比べたノンターゲティングLwaCas13a−crRNAトランスフェクト対照(x軸)のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM))値による発現レベル。3回のバイオロジカルレプリケートの平均値が示される。PPIB転写物データ点には赤色を付ける。(C)ノンターゲティングshRNA条件(第1列)及びGlucターゲティングshRNA条件(第2列)の個別のレプリケートの比較。(D)ノンターゲティングcrRNA条件(第1列)及びGluc−ターゲティングcrRNA条件(第2列)の個別のレプリケートの比較。(E)ノンターゲティングshRNA条件とGlucターゲティングshRNA条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。(F)ノンターゲティングcrRNA条件とGlucターゲティングcrRNA条件の個別のレプリケートのペアワイズ比較。
図61A〜図61C:全試料にわたるLwaCas13a及びRNAiノックダウン変動性(標準偏差)の詳細な分析。(A)ルシフェラーゼレポーター又は内因性遺伝子のいずれかを標的とするshRNA又はcrRNAのターゲティングレプリケートとノンターゲティングレプリケートとの間のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM+1))値についての相関(ケンドールタウ)のヒートマップ。(B)全てのレプリケート及び摂動間のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM+1))値についての相関(ケンドールのタウ)のヒートマップ。(C)shRNA又はcrRNAのいずれかについて標的化された各遺伝子のターゲティング及びノンターゲティングレプリケートの間でのRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM+1))値の標準偏差分布。
図61A〜図61C:全試料にわたるLwaCas13a及びRNAiノックダウン変動性(標準偏差)の詳細な分析。(A)ルシフェラーゼレポーター又は内因性遺伝子のいずれかを標的とするshRNA又はcrRNAのターゲティングレプリケートとノンターゲティングレプリケートとの間のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM+1))値についての相関(ケンドールのタウ)のヒートマップ。(B)全てのレプリケート及び摂動間のRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM+1))値についての相関(ケンドールのタウ)のヒートマップ。(C)shRNA又はcrRNAのいずれかについて標的化された各遺伝子のターゲティング及びノンターゲティングレプリケートの間でのRNA−seqライブラリで検出された全ての遺伝子のlog2(転写物百万分率(TPM+1))値の標準偏差分布。
図62A〜図62J:LwaCas13aノックダウンは標的転写物に特異的であり、計測されるオフターゲット転写物に対して活性を有しない。(A)Glucにタイリングする最初の96スペーサーの絶対Glucシグナルのヒートマップ。(B)Glucにタイリングする最初の96スペーサーの絶対Clucシグナルのヒートマップ。(C)Glucタイリングガイドの絶対Glucシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。(D)Glucタイリングガイドの絶対Clucシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。(E)Clucタイリングガイドの絶対Clucシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。(F)Clucタイリングガイドの絶対Glucシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。(G)PPIBタイリングガイドのPPIB 2−CtレベルとPPIBノックダウンとの間の関係。(H)PPIBタイリングガイドのGAPDH 2−CtレベルとPPIBノックダウンとの間の関係。(I)PPIB KRASガイドのKRAS 2−CtレベルとKRASノックダウンとの間の関係。(J)PPIB KRASガイドのGAPDH 2−CtレベルとKRASノックダウンとの間の関係。
図62A〜図62J:LwaCas13aノックダウンは標的転写物に特異的であり、計測されるオフターゲット転写物に対して活性を有しない。(A)Glucにタイリングする最初の96スペーサーの絶対Glucシグナルのヒートマップ。(B)Glucにタイリングする最初の96スペーサーの絶対Clucシグナルのヒートマップ。(C)Glucタイリングガイドの絶対Glucシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。(D)Glucタイリングガイドの絶対Clucシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。(E)Clucタイリングガイドの絶対Clucシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。(F)Clucタイリングガイドの絶対Glucシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。(G)PPIBタイリングガイドのPPIB 2−CtレベルとPPIBノックダウンとの間の関係。(H)PPIBタイリングガイドのGAPDH 2−CtレベルとPPIBノックダウンとの間の関係。(I)PPIB KRASガイドのKRAS 2−CtレベルとKRASノックダウンとの間の関係。(J)PPIB KRASガイドのGAPDH 2−CtレベルとKRASノックダウンとの間の関係。
図62A〜図62J:LwaCas13aノックダウンは標的転写物に特異的であり、計測されるオフターゲット転写物に対して活性を有しない。(A)Glucにタイリングする最初の96スペーサーの絶対Glucシグナルのヒートマップ。(B)Glucにタイリングする最初の96スペーサーの絶対Clucシグナルのヒートマップ。(C)Glucタイリングガイドの絶対Glucシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。(D)Glucタイリングガイドの絶対Clucシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。(E)Clucタイリングガイドの絶対Clucシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。(F)Clucタイリングガイドの絶対Glucシグナルと正規化ルシフェラーゼとの間の関係。(G)PPIBタイリングガイドのPPIB 2−CtレベルとPPIBノックダウンとの間の関係。(H)PPIBタイリングガイドのGAPDH 2−CtレベルとPPIBノックダウンとの間の関係。(I)PPIB KRASガイドのKRAS 2−CtレベルとKRASノックダウンとの間の関係。(J)PPIB KRASガイドのGAPDH 2−CtレベルとKRASノックダウンとの間の関係。
図63A〜図63F:dCas13aはレポーター遺伝子発現を抑制し、内因性遺伝子に結合する。(A)ClucとGlucとを分ける合成HBG1イントロンにわたってタイリングしたdCas13aは、翻訳開始部位から特定の距離におけるGluc翻訳を抑制する能力を有する。(B)dCas13a並びに2つのターゲティングcrRNA及び1つのノンターゲティングcrRNAによって標的化されるβ−アクチンmRNAのRNA免疫沈降エンリッチメント。(C)ACTBをイメージングするためのdCas13−GFP構築物とdCas13a−GFP−KRAB構築物との局在間の比較。(D)ノンターゲティングガイドで送達したdCas13a−NLS−msfGFPネガティブフィードバック構築物の更なる視野。(E)ACTBガイドで送達したdCas13a−NLS−msfGFPネガティブフィードバック構築物の更なる視野。(F)ACTBガイドで送達したdCas13a−NLS−msfGFPネガティブフィードバック構築物の更なる視野。
図63A〜図63F:dCas13aはレポーター遺伝子発現を抑制し、内因性遺伝子に結合する。(A)ClucとGlucとを分ける合成HBG1イントロンにわたってタイリングしたdCas13aは、翻訳開始部位から特定の距離におけるGluc翻訳を抑制する能力を有する。(B)dCas13a並びに2つのターゲティングcrRNA及び1つのノンターゲティングcrRNAによって標的化されるβ−アクチンmRNAのRNA免疫沈降エンリッチメント。(C)ACTBをイメージングするためのdCas13−GFP構築物とdCas13a−GFP−KRAB構築物との局在間の比較。(D)ノンターゲティングガイドで送達したdCas13a−NLS−msfGFPネガティブフィードバック構築物の更なる視野。(E)ACTBガイドで送達したdCas13a−NLS−msfGFPネガティブフィードバック構築物の更なる視野。(F)ACTBガイドで送達したdCas13a−NLS−msfGFPネガティブフィードバック構築物の更なる視野。
図63A〜図63F:dCas13aはレポーター遺伝子発現を抑制し、内因性遺伝子に結合する。(A)ClucとGlucとを分ける合成HBG1イントロンにわたってタイリングしたdCas13aは、翻訳開始部位から特定の距離におけるGluc翻訳を抑制する能力を有する。(B)dCas13a並びに2つのターゲティングcrRNA及び1つのノンターゲティングcrRNAによって標的化されるβ−アクチンmRNAのRNA免疫沈降エンリッチメント。(C)ACTBをイメージングするためのdCas13−GFP構築物とdCas13a−GFP−KRAB構築物との局在間の比較。(D)ノンターゲティングガイドで送達したdCas13a−NLS−msfGFPネガティブフィードバック構築物の更なる視野。(E)ACTBガイドで送達したdCas13a−NLS−msfGFPネガティブフィードバック構築物の更なる視野。(F)ACTBガイドで送達したdCas13a−NLS−msfGFPネガティブフィードバック構築物の更なる視野。
図63A〜図63F:dCas13aはレポーター遺伝子発現を抑制し、内因性遺伝子に結合する。(A)ClucとGlucとを分ける合成HBG1イントロンにわたってタイリングしたdCas13aは、翻訳開始部位から特定の距離におけるGluc翻訳を抑制する能力を有する。(B)dCas13a並びに2つのターゲティングcrRNA及び1つのノンターゲティングcrRNAによって標的化されるβ−アクチンmRNAのRNA免疫沈降エンリッチメント。(C)ACTBをイメージングするためのdCas13−GFP構築物とdCas13a−GFP−KRAB構築物との局在間の比較。(D)ノンターゲティングガイドで送達したdCas13a−NLS−msfGFPネガティブフィードバック構築物の更なる視野。(E)ACTBガイドで送達したdCas13a−NLS−msfGFPネガティブフィードバック構築物の更なる視野。(F)ACTBガイドで送達したdCas13a−NLS−msfGFPネガティブフィードバック構築物の更なる視野。
図64A〜図64B dCas13a−NFは生細胞のストレス顆粒形成をイメージングすることができる。(A)対応するACTBターゲティング及びノンターゲティングガイドによるdCas13a−NF−発現細胞におけるACTB転写物の代表的なRNA FISH画像。細胞の輪郭破線で示す。(B)マンダースのオーバーラップ係数(左)及びピアソン相関(右)によって定量化したACTB RNA FISHシグナルとdCas13a−NFとの間の全体的なシグナルオーバーラップ。相関及びシグナルオーバーラップは1細胞当たりで画素毎に計算する。値は全て、n=3での平均値±SEMである。****p<0.0001;***p<0.001;**p<0.01。比較には両側スチューデントt検定を使用した。
図65A〜図65C.直接の転写物及びコラテラル転写物発現ノックダウン(knockdowu)。(A)活性対デッドCas13aによるルシフェラーゼのノックダウン。(B)活性対デッドCas13aによる内因性遺伝子発現のノックダウン。デッドCas13aによるノックダウンは、結合に起因する翻訳の遮断又は転写物(tramscript)の不安定化によるものであり得る。(C)哺乳類細胞におけるデッドCas13aによるコラテラル活性の欠如。(A)のデッドCas13a並びにルシフェラーゼに対するガイド1及び2を使用しても、ノンターゲティング対照と比較して転写物分布サイズの変化は観察されない。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図66A図66O.指示されるコンセンサス配列との図53の種々のC2C2オルソログの配列アラインメント。
図67A図67C.レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)F0279 C2c2(「Lew2C2c2」)とリステリア・ニューヨーケンシス(Listeria newyorkensis)FSL M6−0635 C2c2(「LibC2c2」)とのアラインメント。
図67A図67C.レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)F0279 C2c2(「Lew2C2c2」)とリステリア・ニューヨーケンシス(Listeria newyorkensis)FSL M6−0635 C2c2(「LibC2c2」)とのアラインメント。
図67A図67C.レプトトリキア・ウエイデイ(Leptotrichia wadei)F0279 C2c2(「Lew2C2c2」)とリステリア・ニューヨーケンシス(Listeria newyorkensis)FSL M6−0635 C2c2(「LibC2c2」)とのアラインメント。
図68.RNアーゼ活性を示すC2c2 HEPNドメインのアラインメント。上のアラインメントブロックは、これまでに記載されている選択のHEPNドメインを含み、下のブロックはC2c2エフェクタータンパク質からの触媒モチーフを含む。各ドメイン構造の下には、それぞれのタンパク質ファミリーの選択された代表における保存モチーフのアラインメント。触媒残基は黒色背景に白色の文字で示す;保存された疎水性残基は黄色で強調表示する;保存された小さい残基は緑色で強調表示する;ブリッジヘリックスアラインメントでは、正電荷残基は赤色である。アラインメントされた配列の下に二次構造予測を示す:Hはα−ヘリックスを表し、Eは伸長したコンホメーション(βストランド)を表す。アラインメントブロック間でほとんど保存されていないスペーサーは数字で示す。

0080

本明細書の図は例示を目的としているに過ぎず、及び必ずしも一定の尺度で描かれているとは限らない。

0081

発明の詳細な説明
一般に、国際公開第2014/093622号パンフレット(PCT/US2013/074667号明細書)などの前述の文書で用いられているとおりのCRISPR−Cas又はCRISPR系は、Cas遺伝子をコードする配列、tracr(トランス活性化CRISPR)配列(例えばtracrRNA又は活性部分的tracrRNA)、tracrメイト配列(内因性CRISPR系の文脈では「ダイレクトリピート」及びtracrRNAによってプロセシングされる部分的ダイレクトリピートを包含する)、ガイド配列(内因性CRISPR系の文脈では「スペーサー」とも称される)、又はこの用語が本明細書において使用されるとおりの「RNA」(例えば、Cas9などのCasをガイドするRNA、例えばCRISPR RNA及びトランス活性化(tracr)RNA又はシングルガイドRNA(sgRNA)(キメラRNA))又はCRISPR遺伝子座からの他の配列及び転写物を含めた、CRISPR関連(「Cas」)遺伝子の発現に関与し又はその活性を導く転写物及び他のエレメントをまとめて指す。一般に、CRISPR系は、標的配列(内因性CRISPR系の文脈ではプロトスペーサーとも称される)の部位においてCRISPR複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。CRISPRタンパク質がC2c2タンパク質である場合、tracrRNAは不要である。

0082

CRISPR複合体の形成の文脈では、「標的配列」とは、ガイド配列がそれに対して相補性を有するように設計される配列を指し、ここでは標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがCRISPR複合体の形成を促進する。標的配列はRNAポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は細胞の核又は細胞質に位置する。一部の実施形態において、ダイレクトリピートは、以下の基準の一部又は全部を満たす繰り返しモチーフを検索することによりインシリコで同定されてもよい:1.II型CRISPR遺伝子座に隣接する2Kbウィンドウゲノム配列に存在する;2.20〜50bpにわたる;及び3.20〜50bpの間隔が空いている。一部の実施形態では、これらの基準のうち2つ、例えば1及び2、2及び3、又は1及び3が用いられてもよい。一部の実施形態では、3つの基準の全てが用いられてもよい。

0083

一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。用語「ターゲティング配列」は、標的配列と十分な相補性(complemenarity)を有するガイド配列の一部分を意味する。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントしたとき、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%以上であるか、又はそれより高い。最適アラインメントは、配列のアラインメントに好適な任意のアルゴリズムを用いて決定することができ、その非限定的な例としては、スミス・ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン・ブンシュアルゴリズム、バローズホイーラー変換に基づくアルゴリズム(例えば、バローズ・ホイーラーアライナー)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies;www.novocraft.comにおいて利用可能)、ELAND(Illumina、San Diego,CA)、SOAP(soap.genomics.org.cnにおいて利用可能)、及びMaq(maq.sourceforge.netにおいて利用可能)が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75ヌクレオチド長以上であるか、又はそれより長い。一部の実施形態において、ガイド配列は、約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12ヌクレオチド長未満か、又はそれより短い。好ましくはガイド配列は10 30ヌクレオチド長である。ガイド配列が標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を導く能力は、任意の好適なアッセイによって評価し得る。例えば、CRISPR複合体を形成するのに十分なCRISPR系の構成成分が、試験しようとするガイド配列を含め、CRISPR配列の構成成分をコードするベクターのトランスフェクションなどにより対応する標的配列を有する宿主細胞に提供されてもよく、続いて本明細書に記載されるとおりのSurveyorアッセイなどにより、標的配列内における優先的な切断を評価し得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験しようとするガイド配列を含めたCRISPR複合体の構成成分、及び供試ガイド配列と異なる対照ガイド配列を提供して、供試ガイド配列と対照ガイド配列との反応間の標的配列における結合又は切断速度を比較することにより試験管内で判定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者には想起されるであろう。

0084

古典的なCRISPR−Cas系において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、又は100%以上であってもよく;ガイド又はRNA又はsgRNAは、約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75ヌクレオチド長以上であるか、又はそれより長くてもよく;又はガイド又はRNA又はsgRNAは約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12ヌクレオチド長未満であるか、又はそれより短くてもよい。しかしながら、本発明のある態様は、オフターゲット相互作用を低下させること、例えば、ガイドが相補性の低い標的配列と相互作用するのを低下させることである。実際、例において、80%〜約95%超の相補性、例えば、83%〜84%又は88〜89%又は94〜95%の相補性を有する標的配列とオフターゲット配列との間を区別する(例えば、18ヌクレオチドを有する標的を、1、2又は3個のミスマッチを有する18ヌクレオチドのオフターゲットと区別する)ことが可能なCRISPR−Cas系をもたらす突然変異が本発明に関わることが示される。従って、本発明との関連において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、94.5%又は95%又は95.5%又は96%又は96.5%又は97%又は97.5%又は98%又は98.5%又は99%又は99.5%又は99.9%超、又は100%である。オフターゲットはその配列とガイドとの間で100%又は99.9%又は99.5%又は99%又は99%又は98.5%又は98%又は97.5%又は97%又は96.5%又は96%又は95.5%又は95%又は94.5%又は94%又は93%又は92%又は91%又は90%又は89%又は88%又は87%又は86%又は85%又は84%又は83%又は82%又は81%又は80%未満の相補性であり、有利には、オフターゲットはその配列とガイドとの間で100%又は99.9%又は99.5%又は99%又は99%又は98.5%又は98%又は97.5%又は97%又は96.5%又は96%又は95.5%又は95%又は94.5%の相補性である。

0085

特定の実施形態において、スペーサー配列と標的配列との間にミスマッチ、例えば1つ又は2つのミスマッチなど1つ以上のミスマッチを導入することにより、スペーサー/標的に沿ったミスマッチの位置を含め、切断効率の調節を利用することができる。例えばダブルミスマッチが中央寄りであるほど(即ち3’寄り又は5’寄りでない)、切断効率がより大きい影響を受ける。従って、スペーサーに沿ってミスマッチ位置を選択することにより、切断効率を調節することができる。例として、標的の100%未満の切断が(例えばある細胞集団において)所望される場合、スペーサー配列にスペーサーと標的配列との間の1つ以上、例えば好ましくは2つのミスマッチが導入されてもよい。スペーサーに沿ってミスマッチ位置が中央寄りであるほど、切断割合が低くなる。

0086

本明細書に記載されるとおりの本発明に係る方法は、本明細書に考察されるとおりのベクターを細胞に送達することを含む、本明細書に考察されるとおりの真核細胞において(インビトロで、即ち単離された真核細胞において)1つ以上のヌクレオチド改変を誘導することを包含する。この1つ又は複数の突然変異には、1つ又は複数のガイド1つ又は複数のRNA又は1つ又は複数のsgRNAを介した1つ又は複数の細胞の各標的配列における1つ以上のヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。この突然変異には、1つ又は複数のガイド1つ又は複数のRNAを介した1つ又は複数の前記細胞の各標的配列における1〜75ヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。この突然変異には、1つ又は複数のガイド1つ又は複数のRNAを介した1つ又は複数の前記細胞の各標的配列における1、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、又は75ヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。この突然変異には、1つ又は複数のガイド1つ又は複数のRNAを介した1つ又は複数の前記細胞の各標的配列における5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、又は75ヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。この突然変異には、1つ又は複数のガイド1つ又は複数のRNAを介した1つ又は複数の前記細胞の各標的配列における10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、又は75ヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。この突然変異には、1つ又は複数のガイド1つ又は複数のRNAを介した1つ又は複数の前記細胞の各標的配列における20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、又は75ヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。この突然変異には、1つ又は複数のガイド1つ又は複数のRNAを介した1つ又は複数の前記細胞の各標的配列における40、45、50、75、100、200、300、400又は500ヌクレオチドの導入、欠失、又は置換が含まれ得る。

0087

毒性及びオフターゲット効果を最小限に抑えるため、送達されるCasmRNA又はタンパク質及びガイドRNAの濃度を制御することが重要となり得る。Cas mRNA又はタンパク質及びガイドRNAの最適濃度は、細胞モデル又は非ヒト真核生物動物モデルにおける種々の濃度の試験、及びディープシーケンシングを用いた潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度の分析によって決定することができる。

0088

典型的には、内因性CRISPR系の文脈では、CRISPR複合体(標的配列にハイブリダイズし、且つ1つ以上のCasタンパク質と複合体を形成したガイド配列を含む)が形成されると、標的配列又はその近傍(例えば標的配列から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50塩基対、又はそれ以上の範囲内)に切断が生じるが、特にRNA標的の場合には、例えば二次構造に依存し得る。

0089

Casをコードする核酸分子は、有利にはコドン最適化されたCasである。コドン最適化された配列の例は、この場合、真核生物、例えばヒトでの発現に最適化されるか(即ちヒトでの発現に最適化されている)、又は本明細書で考察されるとおりの別の真核生物、動物若しくは哺乳動物に最適化された配列である;例えば、国際公開第2014/093622号パンフレット(PCT/US2013/074667号明細書)のSaCas9ヒトコドン最適化配列を参照のこと。これが好ましいが、他の例が可能であることが理解され、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化、又は特定の器官に対するコドン最適化が公知である。一部の実施形態において、Casをコードする酵素コード配列が、特定の細胞、例えば真核細胞での発現にコドン最適化される。真核細胞は、特定の生物、例えば、限定はされないがヒトを含めた哺乳動物、又は本明細書で考察されるとおりの非ヒト真核生物又は動物又は哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト哺乳動物又は霊長類のものであるか、又はそれに由来し得る。一部の実施形態において、ヒト又は動物に対するいかなる実質的な医学的利益もなくそれらに苦痛を生じさせる可能性のあるヒトの生殖細胞系列遺伝子アイデンティティの改変方法及び/又は動物の遺伝子アイデンティティの改変方法、更にかかる方法から得られる動物は除外され得る。一般に、コドン最適化とは、天然配列の少なくとも1つのコドン(例えば、約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個以上、又はそれより多いコドン)を、天然のアミノ酸配列を維持しつつ、当該の宿主細胞の遺伝子においてより高頻度で又は最も高頻度で使用されるコドンに置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を増強するための核酸配列の改変方法を指す。様々な種が、特定のアミノ酸のある種のコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンバイアス(生物間でのコドン使用の違い)は、多くの場合にメッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率と相関し、次にはそれが、数ある中でも特に、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーRNA(tRNA)分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞において選択のtRNAが優勢であることは、概して、ペプチド合成で最も高頻度に使用されるコドンを反映するものである。従って、コドン最適化に基づき所与の生物における最適な遺伝子発現に合わせて遺伝子を調整することができる。コドン使用表が、例えば、www.kazusa.orjp/codon/で利用可能な「コドン使用データベース(Codon Usage Database)」で容易に利用可能であり、これらの表を幾つもの方法で適合させることができる。Nakamura,Y.,et al.「国際的DNA配列データベースから表にしたコドン使用:2000年の状況(Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases:status for the year 2000)」Nucl.AcidsRes.28:292(2000)を参照のこと。特定の配列を特定の宿主細胞における発現にコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムもまた利用可能であり、Gene Forge(Aptagen;Jacobus,PA)などもまた利用可能である。一部の実施形態において、Casをコードする配列中の1つ以上のコドン(例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50以上、又は全てのコドン)が、特定のアミノ酸について最も高頻度に使用されるコドンに対応する。

0090

特定の実施形態において、本明細書に記載されるとおりの方法は、1つ以上の目的の遺伝子のプロモーターを含む調節エレメントと細胞内で作動可能に接続した1つ以上のガイドRNAをコードする1つ以上の核酸が提供又は導入されるCasトランスジェニック細胞を提供することを含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「Casトランスジェニック細胞」は、Cas遺伝子がゲノム的に組み込まれている真核細胞などの細胞を指す。細胞の性質、タイプ、又は起源は、本発明によれば特に限定されない。また、Casトランス遺伝子を細胞に導入する方法も様々であってよく、当該技術分野において公知のとおりの任意の方法であり得る。特定の実施形態において、Casトランスジェニック細胞は、単離細胞にCasトランス遺伝子を導入することによって得られる。特定の他の実施形態において、Casトランスジェニック細胞は、Casトランスジェニック生物から細胞を単離することによって得られる。例として、及び限定なしに、本明細書において言及されるとおりのCasトランスジェニック細胞は、Casノックイン真核生物など、Casトランスジェニック真核生物に由来してもよい。国際公開第2014/093622号パンフレット(PCT/US13/74667号明細書)(参照により本明細書に援用される)が参照される。Rosa遺伝子座のターゲティングに関するSangamo BioSciences,Inc.に譲渡された米国特許出願公開第20120017290号明細書及び同第20110265198号明細書の方法を、本発明のCRISPR Cas系を利用するように改変し得る。Rosa遺伝子座の標的化に関するCellectisに譲渡された米国特許出願公開第20130236946号明細書の方法もまた、本発明のCRISPR Cas系を利用するように改変し得る。更なる例として、Cas9ノックインマウスについて記載しているPlatt et.al.(Cell;159(2):440−455(2014))(参照により本明細書に援用される)が参照される。Casトランス遺伝子はLox−Stop−ポリA−Lox(LSL)カセットを更に含んでもよく、それによりCas発現をCreリコンビナーゼによって誘導可能なものにすることができる。或いは、Casトランスジェニック細胞は、単離細胞にCasトランス遺伝子を導入することによって得てもよい。トランス遺伝子の送達系は当該技術分野において周知である。例として、Casトランス遺伝子は、同様に本明細書の他の部分に記載されるとおり、例えば真核細胞においてベクター(例えば、AAV、アデノウイルス、レンチウイルス)及び/又は粒子及び/又はナノ粒子送達を用いて送達し得る。

0091

当業者は、本明細書において参照されるとおりのCasトランスジェニック細胞などの細胞が、例えば、及び限定なしに、Platt et al.(2014),Chen et al.,(2014)又はKumar et al..(2009)に記載されるとおり、組み込まれたCas遺伝子を有することに加えて更なるゲノム変化を含み、又はCasを標的遺伝子座にガイドすることが可能なRNAと複合体を形成したときCasの配列特異的作用によって生じる突然変異、例えば1つ以上の発癌突然変異などを含み得ることを理解するであろう。

0092

一部の実施形態において、Cas配列は、1個以上の核局在化配列(NLS)又は核外移行配列(NES)、例えば約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上、又はそれより多いNLS又はNESに融合される。一部の実施形態において、Casは、アミノ末端又はその近傍に約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上、又はそれより多いNLS又はNESを含むか、カルボキシ末端又はその近傍に約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上、又はそれより多いNLS又はNESを含むか、又はこれらの組み合わせ(例えば、アミノ末端にゼロ個又は少なくとも1個以上のNLS又はNES及びカルボキシ末端にゼロ個又は1個以上のNLS又はNES)である。2個以上のNLS又はNESが存在する場合、各々を他と独立して選択してもよく、従って単一のNLS又はNESが2つ以上のコピーで存在してもよく、及び/又は1つ以上のコピーで存在する1つ以上の他のNLS又はNESとの組み合わせで存在してもよい。本発明の好ましい実施形態において、Casは高々6個のNLSを含む。一部の実施形態において、NLS又はNESは、NLS又はNESの最も近いアミノ酸がN末端又はC末端からポリペプチド鎖に沿って約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、又はそれより多いアミノ酸の範囲内にあるとき、N末端又はC末端の近傍にあると見なされる。NLSの非限定的な例としては、アミノ酸配列PKKKRKV(配列番号X)を有するSV40ウイルスラージT抗原のNLS;ヌクレオプラスミンのNLS(例えば、配列KRPAATKKAGQAKKKK)(配列番号X)を有するヌクレオプラスミンビパルタイトNLS;アミノ酸配列PAAKRVKLD(配列番号X)又はRQRRNELKRSP(配列番号X)を有するc−myc NLS;配列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(配列番号X)を有するhRNPA1 M9 NLS;インポーチン−αのIBBドメインの配列RMRIZFKNKGKDTAERRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(配列番号X);筋腫Tタンパク質の配列VSRKRPRP(配列番号X)及びPPKKARED(配列番号X);ヒトp53の配列POPKKKPL(配列番号X);マウスc−abl IVの配列SALIKKKKKMAP(配列番号X);インフルエンザウイルスNS1の配列DRLRR(配列番号X)及びPKQKKRK(配列番号X);肝炎ウイルスデルタ抗原の配列RKLKKKIKKL(配列番号X);マウスMx1タンパク質の配列REKKKFLKRR(配列番号X);ヒトポリ(ADPリボースポリメラーゼの配列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(配列番号X);及びステロイドホルモン受容体(ヒト)グルココルチコイドの配列RKCLQGMNLEARKTKK(配列番号X)に由来するNLS配列が挙げられる。NESの非限定的な例としては、NES配列LYPERLRRILT(ctgtaccctgagcggctgcggcggatcctgacc)が挙げられる。一般に、1つ以上のNLS又はNESは、真核細胞のそれぞれ核又は細胞質における検出可能な量のCasの蓄積をドライブするのに十分な強度である。一般に、核局在化/核外移行活性の強度は、Cas内のNLS/NESの数、用いられる詳細なNLS又はNES、又はこれらの組み合わせ要因から導き出すことができる。核/細胞質内での蓄積の検出は任意の好適な技法によって実施し得る。例えば、検出可能なマーカーをCasに融合してもよく、それにより、核(例えば、DAPIなど、核に特異的な染色)又は細胞質の位置を検出する手段と組み合わせるなどして細胞内での位置を可視化してもよい。細胞核はまた、細胞から単離してもよく、次にその内容物を、免疫組織化学、ウエスタンブロット、又は酵素活性アッセイなど、任意の好適なタンパク質検出方法によって分析してもよい。核内における蓄積はまた、CRISPR複合体形成の効果に関するアッセイ(例えば、標的配列におけるDNA切断又は突然変異に関するアッセイ、又はCRISPR複合体形成及び/又はCas酵素活性の影響を受けて変化した遺伝子発現活性に関するアッセイ)によるなどして、Cas又は複合体に曝露されていない対照、又は1つ以上のNLS又はNESを欠くCasに曝露された対照と比較して間接的に決定してもよい。特定の実施形態において、限定なしに、オルガネラ、例えば、ミトコンドリアプラスチド葉緑体小胞ゴルジ、(核又は細胞)膜、リボソーム、核小体、ER、細胞骨格液胞中心体ヌクレオソーム、顆粒、中心小体などの細胞内の特定の部位にCasを局在化させるためなど、他の局在化タグがCasタンパク質に融合されてもよい。

0093

特定の態様において、本発明は、例えばCas及び/又はCasを標的遺伝子座に案内する能力を有するRNA(即ちガイドRNA)を細胞に送達又は導入するための、またこれらの成分を(例えば原核細胞において)増殖させるための、ベクターに関する。本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、ある実体を一つの環境から別の環境に移すことを可能にする又は促進するツールである。これは、別のDNAセグメントが挿入されて挿入セグメントの複製をもたらし得るレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドである。概して、ベクターは適切な制御エレメント会合しているとき複製能を有する。一般に、用語「ベクター」は、それに連結されている別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、限定はされないが、一本鎖二本鎖、又は部分的二本鎖の核酸分子;1つ以上の遊離末端を含む、遊離末端のない(例えば環状の)核酸分子;DNA、RNA、又は両方を含む核酸分子;及び当該技術分野において公知の他の各種ポリヌクレオチドが挙げられる。ある種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術によるなどして追加のDNAセグメントを挿入することができる環状二本鎖DNAループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、ここでベクターには、ウイルス(例えば、レトロウイルス複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス(AAV))へのパッケージングのためのウイルス由来DNA又はRNA配列が存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスが担持するポリヌクレオチドも含む。特定のベクターは、それが導入される宿主細胞での自己複製能を有する(例えば、細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター)。他のベクター(例えば非エピソーム哺乳類ベクター)は宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、特定のベクターは、それが作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えDNA技法において有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。

0094

組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態で本発明の核酸を含むことができ、これはつまり、組換え発現ベクターが、発現させる核酸配列に作動可能に連結された1つ以上の調節エレメント(これは、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択されてもよい)を含むことを意味する。組換え発現ベクターの範囲内において、「作動可能に連結された」は、ヌクレオチド配列の(例えば、インビトロ転写翻訳系における、又はベクターが宿主細胞に導入される場合に宿主細胞における)発現が可能となる形で目的のヌクレオチド配列が1つ又は複数の調節エレメントに連結されていることを意味するように意図される。組換え及びクローニング方法に関しては、2004年9月2日に米国特許出願公開第2004−0171156 A1号明細書として公開された米国特許出願第10/815,730号明細書(この内容は、本明細書において全体として参照により援用される)が挙げられる。

0095

1つ又は複数のベクターが、1つ又は複数の調節エレメント、例えば1つ又は複数のプロモーターを含み得る。1つ又は複数のベクターはCasコード配列、及び/又は単一の、しかし少なくとも3又は8又は16又は32又は48又は50個を含み得る可能性もあるガイドRNA(例えばsgRNA)コード配列、例えば、1〜2、1〜3、1〜4 1〜5、3〜6、3〜7、3〜8、3〜9、3〜10、3〜8、3〜16、3〜30、3〜32、3〜48、3〜50個のRNA(例えばsgRNA)を含み得る。単一のベクターには、有利には約16個以下のRNAがある場合、各RNA(例えばsgRNA)にプロモーターがあってもよく;及び、単一のベクターが16個より多いRNAを提供する場合、1つ以上のプロモーターがそれらのRNAのうちの2個以上の発現をドライブしてもよく、例えば、32個のRNAがある場合、各プロモーターが2個のRNAの発現をドライブしてもよく、及び48個のRNAがある場合、各プロモーターが3個のRNAの発現をドライブしてもよい。単純な算術的な十分に確立されたクローニングプロトコル及び本開示の教示により、当業者は、例えばAAVなどの好適な例示的ベクターに対するRNA、及びU6プロモーターなどの好適なプロモーターに関して本発明を容易に実施することができる。例えば、AAVのパッケージング限界は約4.7kbである。単一のU6−gRNA(+クローニング用の制限部位)の長さは361bpである。従って、当業者は、単一のベクターに約12〜16個、例えば13個のU6−gRNAカセットを容易に収めることができる。これは、TALEアセンブリに用いられるゴールデンゲート戦略(http://www.genome−engineering.org/taleffectors/)など、任意の好適な手段によってアセンブルすることができる。当業者はまた、U6−gRNAの数を約1.5倍増加させるため、例えば、12〜16、例えば13から約18〜24、例えば約19個のU6−gRNAに増加させるため、タンデムガイド戦略も用いることができる。従って、当業者は、単一のベクター、例えばAAVベクター中に約18〜24個、例えば約19個のプロモーター−RNA、例えばU6−gRNAに容易に至ることができる。ベクター中のプロモーター及びRNAの数を増加させる更なる手段は、単一のプロモーター(例えばU6)を使用して、切断可能な配列によって分離されたRNAのアレイを発現させることである。及びベクター中のプロモーター−RNAの数を増加させる更に別の手段は、コード配列又は遺伝子のイントロンにおいて切断可能な配列によって分離されたプロモーター−RNAのアレイを発現させることである;及び、この場合、ポリメラーゼIIプロモーターを使用することが有利であり、それにより発現が増加し、組織特異的様式での長いRNAの転写が可能となり得る(例えば、http://nar.oxfordjournals.org/content/34/7/e53.short、http://www.nature.com/mt/journal/v16/n9/abs/mt2008144a.htmlを参照)。有利な実施形態において、AAVは、最大約50遺伝子を標的とするU6タンデムgRNAをパッケージングし得る。従って、当該技術分野における知識及び本開示の教示から、当業者は、1つ以上のプロモーターの制御下にあるか、又はそれに作動可能に若しくは機能的に連結された複数のRNA又はガイドを発現する1つ又は複数のベクター、例えばシングルベクターを(特に本明細書で考察されるRNA又はガイドの数に関して)いかなる過度の実験もなく容易に作製及び使用することができる。

0096

1つ又は複数のガイドRNAのコード配列及び/又はCasコード配列は1つ又は複数の調節エレメントに機能的に又は作動可能に連結されてもよく、従って1つ又は複数の調節エレメントが発現をドライブする。1つ又は複数のプロモーターは構成的プロモーター及び/又は条件的プロモーター及び/又は誘導性プロモーター及び/又は組織特異的プロモーターであってもよい。プロモーターは、RNAポリメラーゼ、pol I、pol II、pol III、T7、U6、H1、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーターホスホグリセロールキナーゼPGK)プロモーター、及びEF1αプロモーターからなる群から選択されてもよい。有利なプロモーターは、プロモーターはU6である。

0097

本発明の態様は、クラス2 CRISPR−Cas系に関連する新規エフェクタータンパク質の同定及びエンジニアリングに関する。好ましい実施形態において、このエフェクタータンパク質はシングルサブユニットエフェクターモジュールを含む。更なる実施形態において、エフェクタータンパク質は、インビトロ、インビボ又はエキソビボ適用において原核細胞又は真核細胞で機能する。本発明のある態様は、新規クラス2 CRISPR−Cas系を予想し、且つその中の構成成分を同定するための計算方法及びアルゴリズムを包含する。

0098

一実施形態において、新規クラス2 CRISPR−Cas遺伝子座を同定する計算方法は、以下のステップ:Cas1タンパク質をコードする全てのコンティグを検出するステップ;cas1遺伝子の20kBの範囲内、より詳細にはcas1遺伝子の始端から領域20kb及びcas1遺伝子の終端から20kbの範囲内にある全ての予測タンパク質コード遺伝子を同定するステップ;同定された遺伝子をCasタンパク質特異的プロファイルと比較してCRISPRアレイを予測するステップ;500アミノ酸より大きい(>500aa)タンパク質を含有する部分的及び/又は未分類の候補CRISPR−Cas遺伝子座を選択するステップ;PSI−BLAST及びHHPredを用いて選択候補を分析し、それにより新規クラス2 CRISPR−Cas遺伝子座を単離及び同定するステップを含む。上述のステップに加えて、更なるホモログに関してメタゲノミクスデータベースを検索することによって候補の更なる分析が行われ得る。

0099

一態様において、Cas1タンパク質をコードする全てのコンティグを検出するステップは、「GeneMarkS:遺伝子予測のための自己訓練法が微生物ゲノムで始まる。調節領域における配列モチーフの発見への影響(GeneMarkS:a self−training method for prediction of gene starts in microbial genomes.Implications for finding sequence motifs in regulatory regions)」John Besemer,Alexandre Lomsadze and Mark Borodovsky,Nucleic AcidsResearch (2001)29,pp 2607−2618(本明細書において参照により援用される)に更に記載されるとおりの遺伝子予測プログラムであるGenemarkSによって実施される。

0100

一態様において、全ての予測タンパク質コード遺伝子を同定するステップは、同定された遺伝子をCasタンパク質特異的プロファイルと比較し、古いドメイン及び完全長タンパク質の十分にアノテートされた多重配列アラインメントモデルコレクションからなるタンパク質アノテーションリソースであるNCBI保存ドメインデータベース(CDD)に従いそれらをアノテートすることによって行われる。これらは、RPS−BLASTによってタンパク質配列における保存されたドメインを迅速に同定するための位置特異的スコア行列(PSSM)として利用可能である。CDDの内容には、三次元構造情報を用いてドメイン境界を明示的に定義し、且つ配列/構造/機能の関係について洞察を提供するNCBIのキュレーションによるドメイン、並びに幾つもの外部ソースのデータベース(Pfam、SMARTCOG、PRK、TIGRFAM)からインポートされたドメインモデルが含まれる。更なる態様において、CRISPRアレイは、「PILER−CR:CRISPRリピートの高速且つ正確な同定(PILER−CR:fast and accurate identification of CRISPR repeats)」,Edgar,R.C.,BMCBioinformatics,Jan 20;8:18(2007)(本明細書において参照により援用される)に記載されるとおりの、CRISPRリピートを見つけ出すための公開されているドメインソフトウェアであるPILER−CRプログラムを用いて予測した。

0101

更なる態様では、PSI−BLAST(位置特異的反復的基本局所アラインメント検索ツール)を用いてケースバイ・ケース分析が実施される。PSI−BLASTは、タンパク質間BLASTを用いて所与のスコア閾値を上回って検出された配列の多重配列アラインメントから位置特異的スコアリング行列(PSSM)又はプロファイルを導出する。このPSSMは新規マッチに関するデータベースの更なる検索に用いられ、続いてこれらの新規に検出された配列で反復するためアップデートされる。従って、PSI−BLASTは、タンパク質間の遠縁の関係性を検出する手段を提供する。

0102

別の態様において、BLAST又はPSI−BLASTと同じように使用し易いと同時に離れたホモログを見つけ出すのにはるかに感受性が高い配列データベース検索及び構造予測方法であるHHpredを用いてケース・バイ・ケース分析が実施される。実際に、HHpredの感受性は、現在利用可能な最も強力な構造予測サーバー匹敵する。HHpredは、プロファイル隠れマルコフモデル(HMM)のペアワイズ比較をベースとする最初のサーバーである。最も従来的な配列検索方法はUniProt又はNRなどの配列データベースを検索するが、HHpredは、Pfam又はSMARTなどのアラインメントデータベースを検索する。これによりヒットのリストが雑然とした単一配列の山でなく、何個かの配列ファミリーへと大幅に単純化される。主要な公的に利用可能なプロファイル及びアラインメントデータベースは全てHHpredで利用可能である。HHpredは入力として単一のクエリ配列又は多重アラインメントを受け入れる。HHpredは僅か数分以内にPSI−BLASTと同様の読み易いフォーマットで検索結果を返す。検索オプションには、局所又は大域アラインメント及び二次構造類似性スコアリングが含まれる。HHpredは、ペアワイズのクエリ鋳型配列アラインメント、合成クエリ−鋳型多重アラインメント(例えば推移的検索のため)、並びにHHpredアラインメントからMODELLERソフトウェアによって計算される三次元構造モデルを生成することができる。

0103

核酸がDNA又はRNAであり、及び一部の態様においてDNA−RNAハイブリッド(hybird)又はその誘導体もまた指し得る用語「核酸ターゲティング系」は、まとめて、DNA又はRNAターゲティングCRISPR関連(「Cas」)遺伝子の発現に関与するか又はその活性を誘導する転写物及び他のエレメントを指し、この遺伝子は、DNA又はRNAターゲティングCasタンパク質をコードする配列及びCRISPR RNA(crRNA)配列と(全ての系ではないが、一部において)トランス活性化CRISPR−Cas系RNA(tracrRNA)配列とを含むDNA又はRNAターゲティングガイドRNA、又はDNA又はRNAターゲティングCRISPR遺伝子座からの他の配列及び転写物を含み得る。一般に、RNAターゲティング系は、標的DNA又はRNA配列の部位におけるDNA又はRNAターゲティング複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。DNA又はRNAターゲティング複合体の形成の文脈では、「標的配列」は、DNA又はRNAターゲティングガイドRNAがそれと相補性を有するように設計されるDNA又はRNA配列を指し、ここで標的配列とRNAターゲティングガイドRNAとの間のハイブリダイゼーションが、RNAターゲティング複合体の形成を促進する。一部の実施形態において、標的配列は細胞の核又は細胞質に位置する。

0104

本発明のある態様において、本願のRNA−又はRNAターゲティングCRISPR/Cas又はCRISPR−Cas系RNAターゲティング系とも称される新規RNAターゲティング系は同定されたVI型Casタンパク質をベースとし、これは特異的RNA配列を標的化するのにカスタマイズしたタンパク質を作成する必要はなく、むしろ単一の酵素をRNA分子によって特異的RNA標的を認識するようにプログラムすることができ、換言すれば前記RNA分子を用いて酵素を特異的RNA標的に動員することができる。

0105

本発明のある態様において、本願のDNA−又はDNAターゲティングCRISPR/Cas又はCRISPR−Cas系RNAターゲティング系とも称される新規DNAターゲティング系は同定されたVI型Casタンパク質をベースとし、これは特異的RNA配列を標的化するのにカスタマイズしたタンパク質を作成する必要はなく、むしろ単一の酵素をRNA分子によって特異的DNA標的を認識するようにプログラムすることができ、換言すれば前記RNA分子を用いて酵素を特異的DNA標的に動員することができる。

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