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技術 ジカ感染の予防および/または治療方法における使用のためのデング熱に対する中和抗体

出願人 インペリアルイノベーションズリミテッドアンスティテュパストゥール
発明者 レイ,フェリックスバルバスペース,ジョヴァンナヴァニー,マリー‐クリスティーヌルビンスキー,アレクサンダースクリートン,ギャヴィンモンコンサパヤ,ジュタティップ
出願日 2017年6月9日 (2年10ヶ月経過) 出願番号 2018-564238
公開日 2019年8月29日 (8ヶ月経過) 公開番号 2019-523647
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 収容レベル 補正振幅 熱蛍光 標識色 接続アーム 中和曲線 表面格子 負荷センサー
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年8月29日)のものです。
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図面 (20)

課題・解決手段

1つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種する際に使用するためのフラビウイルスエンベロープ二量体エピトープ(EDE)であって、EDEは、安定化組換えフラビウイルス、任意に、デングウイルスおよび/またはジカエンベロープ糖タンパク質細胞外ドメイン(sE)二量体であり、二量体は、2つのsE単量体間で少なくとも1つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化される、ならびに/または各単量体の二量体界面で、またはドメイン1(D1)/ドメイン3(D3)リンカーにおいて、少なくとも1つのsE単量体のアミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基を、少なくとも1つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって、非共有結合的に安定化され、2つのsE単量体間で少なくとも1つのスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化される、ならびに/または任意に、sE配列を分離する、リンカー領域、任意に、グリシンセリンリッチリンカー領域を有する単一ポリペプチド鎖として形成されることによって共有結合的に安定化される、ならびに/または改変糖類を介して2つのsE単量体を連結することによって共有結合的に安定化される、ならびに/または、二量体は、DENV−1、DENV−2、DENV−3、DENV−4、ジカ、または他のフラビウイルスのうちのいずれか1つまたは2つからの天然および/または変異エンベロープポリペプチドホモ二量体またはヘテロ二量体であり、1つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、EDE。EDEは、DENV−1、DENV−2、DENV−3、DENV−4、およびジカのうちのいずれか1つまたは2つからの天然および/または変異エンベロープポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。請求項1〜29のいずれか一項に記載のEDEに対する単離された中和抗体またはその抗原結合断片であって、任意に、当該抗体またはその断片が、残基67〜74、残基97〜106、残基307〜314、残基148〜159、および残基243〜251、またはフラビウイルスもしくはジカウイルス糖タンパク質E細胞外ドメインの対応する残基からなるか、あるいはジカPF13残基67〜77、残基97〜106、残基313〜315、残基243〜253、残基K373、またはフラビウイルス糖タンパク質E細胞外ドメインの対応する残基からなる、デングウイルス糖タンパク質E細胞外ドメイン(sE)の5つのポリペプチドセグメントに結合し、任意に、結合が、デングN153(ジカN154)グリカンまたは対応する残基の存在もしくは不在によって影響を受けず、1つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および/または治療のための方法における使用のためのものであり、1つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、単離された中和抗体またはその抗原結合断片。

概要

背景

フラビウイルスの負担
フラビウイルス属ウイルスは、最も重要な節足動物媒介性のヒト病原体であり、予防的治療治癒的治療が利用できない米における現在のジカ爆発などのますます深刻な蔓延を引き起こしている。ジカVの現在のメディアへの影響に加えて、社会に最も高い報酬課すフラビウイルス疾患は、アミノ酸配列が30〜35%異なる血清型DENV1〜4と呼ばれる4つの異なるウイルスによって引き起こされるデング熱である。世界の年間発生率は、3億9000万の症例であり、このうち、9600万人は、臨床的に明らかであり1、約25000人が死亡していると推定されている。グローバリゼーションAedesベクター広がり都市計画の不十分な計画、最近まで認可されたワクチンまたは抗デング治療薬がなかったことなど、いくつかの要因パンデミックを引き起こしている2。ジカVはまた、Aedes蚊によっても広がり、フラビウイルスの中でそのエンベロープタンパク質は他のフラビウイルスよりもDENV(42〜46%発散、図1A)のアミノ酸配列に最も近い。

重度のデング疾患の特徴は、毛細血管浸透性を高め、血漿漏出および出血を引き起こし、血流力学的妥協およびデングショック症候群をもたらす。未治療の重度の疾患は、死亡率が最大20%になり得るが、専門家の管理、主に補液により、これは、1%未満に減らすことができる2。デング熱は爆発的な蔓延を引き起こし、風土病国の医療制度に大きなストレスを与え、いくつかのデング熱管理戦略が評価されているが、一般的に、すべての年齢層に有効なワクチンが疾患の負担に深刻に参入することが必要である。ジカウイルスの場合、ほぼ70年前に発見されたが、最近になって、ミコセファリーおよびギランバレー症候群を含む重度の神経学後遺症が記載されている3〜6。

フラビウイルスビリオン
フラビウイルスは、カプシド(C)前駆体膜タンパク質(prM)およびエンベロープ(E)、ならびに7つの非構造タンパク質(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5)の3つの構造タンパク質を有する直径50nmである、比較的単純なポジティブセンス一本鎖RNAウイルスである(図1B)。EおよびprMは、ウイルスの糖タンパク質の殻を形成し、Eは宿主細胞の結合および細胞への侵入7に関与する。ウイルス粒子の組み立ておよび成熟は、DENVについて最も徹底的に研究されている。小胞体中の粒子形態形成中、Eの180個のコピーは、1:1の様式で、prMの180個のコピーと会合して、「未成熟ビリオン」をそれらの特徴となるスパイク状外観7〜9を与える、60三量体(ヘテロ六量体スパイクを形成する(図2A)。トランスゴルジネットワーク内のprMは、それが分泌されるまで、ビリオンと会合したままの状態で膜アンカー型Mの切り株およびPRを生成し、宿主がコードされたフリンプロテアーゼによって切断される8、10、11。宿主細胞から分泌されると、prは、離れて、「成熟ビリオン」を残し、Eの180個のコピーを含む平滑な構造は、2、3、および5倍軸の周りに20面体対称を有する90ヘッドトゥーテール二量体に配置される(図2B)。

DENVでは、prMの切断は、すべてのビリオンにおいて完全ではなく、割合の中間体の状態のままで、ウイルス粒子が様々な量の切断された、かつ切断されないprM12〜15を含む。prMの切断は、昆虫細胞またはベロなどの腫瘍細胞株で産生されるウイルスと比較して、ある特定の細胞型、特に樹状細胞などの初代ヒト細胞でより効率的である16、17。

免疫増強
1種の血清型のデングによる感染は、その血清型との再感染への終生免疫の世代をもたらすが、他の血清型ではもたらさない18〜20。4種すべてのデング血清型がしばしば共循環するか、または周期的に互いに置き換わるので、複数の感染が流行国では典型的である。十分に管理された疫学研究は、大部分の重度のデング熱感染が、二次的または連続的なデング熱感染を経験している個体において生じることを示している21〜23。

抗体依存性増強(ADE)の理論は、一次感染に対して生成された既存の異種抗体が、二次的に遭遇するウイルスを中和するのに十分な結合活性または濃度ではないことを仮定しており、エンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、30〜35%変化し得る。その代わりに、ウイルスは、インビボでDENV複製の主要部位である、単球およびマクロファージなどのFc受容体(FcR)を担持する細胞に取り組むために、オプソニン化および標的化され、そのため、ウイルス産生の増加をもたらし得る24〜27。

デングワクチン
過去数十年にわたるデング熱感染の指数関数的増加は、デングワクチンの探索を必要であるが、この目標を達成することは非常に困難であることを示している。成功したワクチンは、デング熱にさらされていないか、またはこれまでにデング熱感染を経験している個体において、4種すべてのデング血清型、好ましくは1または2用量で保護的で耐久性のある免疫応答誘導する必要があるであろう。同時に、ワクチンは上記の増強または病原性免疫応答を誘発することを避ける必要があり得る。

初回のデング熱感染が他の3つのウイルス血清型の再感染に対する長期的な予防を与えないため18、19、ワクチンは四価製剤を要求する4種すべての血清型に対して防御型特異的応答を誘導する必要があると一般に認められている。ワクチン開発の取り組みは、タイで始まったおよそ50年間、4種の血清型を表すウイルス株の連続継代によって生きた弱毒化デングワクチン(LATV)を産生する作業を追求されてきた28。特定の課題は、過度に弱毒化されていない顕性デング疾患を誘発し、防御免疫応答を誘発することができない弱毒化形態のウイルスを開発することであった。別の課題は、4つすべてのウイルスが一緒送達される、四価製剤を生産し、均等に複製し、いくつかの血清型に対して良好な応答であるが、1種以上の血清型に対して不良な応答をもたらした血清型間の競合ではなく、4種すべての血清型に対してバランスのとれた応答を誘導することであった。

最先端のデングワクチンは、Sanofi PasteurワクチンCYD−TDVである。これは、黄熱病17Dワクチン株を骨格とし、デングprMおよびE遺伝子を黄熱病のものに置き換えキメラである。ワクチンは、各血清型(CYD1〜4)を表す4種の組換えウイルスの混合物を含む29〜32。最初の臨床試験は、ワクチンに対する良好な血清反応が示され、血清陽性率は66.5〜100%であった。アジアおよびラテンアメリカにおけるこのワクチンの第III相試験は、35〜78%の準最適有効性を示し、デング2に対する有効性は最も低かった30、32。

さらなる分析により、ワクチンはワクチン接種前にすでに1種以上の血清型に対して既に免疫されたワクチンに対してより良好な保護を与えたことが明らかになった。最近、最初の2〜3年の長期追跡調査暫定的結果が発表され、有効性が立証されたが、プラセボと比較して9未満のワクチン接種群で増加した入院デング熱病に関するシグナルが明らかになった33。ワクチンプライミングによる免疫増強が不完全な防御をもたらす可能性があるという強い疑いがあり、これは予防接種時に未熟なデング熱の若いワクチンでおそらく起こる。しかしながら、このワクチンは、いくつかのデング熱帯諸国で認可されているが、9〜45歳に制限されており、リスクのある個人の大半が適格ではないことを意味する。TakedaおよびNIHのLATVのうち2つ以上のLATVが第III相評価に近く、これらが優れた有効性を達成するかどうかが決定されるであろう。

デングエピトープが、最もヒト中和抗体標的物であるかについては、これまでのところ明らかではなく、例えば、de Alwis(de Alwis et al 2012 Identification of human neutralizing antibodies that bind to complex epitopes on dengue virions.Proc Natl Acad Sci USA 109:7439−7444)は、エピトープが形成のためにウイルスの組み立てを必要とすることを示唆しているが、一方、Rey(Rey 2013 Nature 497:443−444)は、エンベロープ二量体自体が標的物であると示唆している。

本発明者らが関与する以前の研究は、デングエンベロープ二量体の一部を標的とするヒト中和抗体を同定する。例えば、WO2016/012800、Rouvinski et al(2015)Nature 520,109−113、Dejnirattisai et al(2015)Nature Immunol 16,170−177を参照されたく、これらは、4種の血清型のデングウイルス(DENV)に対する強力な交差中和ヒト抗体の単離および構造的特徴付けに関連する。これらの抗体は、E−二量体−エピトープ(EDE)と呼ばれる高度に保存されたエピトープに結合する。

Dai et al(2016)Cell Host&Microbe19,1−9は、融合ループエピトープを認識するフラビウイルス広範な防御抗体として記載されている抗体とのジカウイルスエベロープタンパク質およびその複合体の構造を報告している。Dai et al(2016)は、5頁、第2欄に
「EDE特異的中和抗体の構造研究により、融合ループの露出した主鎖および2つの保存されたグリカン鎖(N67およびN153結合グリカン)を含む、認識決定基がE二量体界面で血清型不変部位に見出されることが明らかになったことを言及する(Rouvinski et al.,2015)。これらの2つのグリコシル化部位は、他のフラビウイルスにおいて高度に保存されていない。さらに、ZIKVは、N67結合グルレーション部位を持たず、N154結合グリコシル化部位(DENVのN153結合グリコシル化部位と同等)は、単離されたZIKV株の一部には存在しない(表S2)。さらに、DENV EDE mAb結合にとって重要なbストランド、150ループ、ijループ、およびA鎖のいくつかの残基は、ZIKVおよび他のフラビウイルスにおいて保存されていない(図S2)。重要なことに、ZIKV sE構造は、EDE抗体の結合領域に独自に正電荷パッチを示すので(図S1)、EDE特異的抗生物質はZIKV感染に対して効果的でない可能性がある。しかしながら、高度に保存された融合ループを標的とする他
既知のフラビウイルスFL特異的抗体は、2A1−G6の中和プロファイルによって確認されるように、ZIKVを中和することができる。」

Daiら(2016)に記載された結論とは対照的に、本発明者らは、デングウイルスを越えてフラビウイルスが強力に中和され、例えばDaiら(2016)に報告されているよりもはるかに強力な中和など、ジカVの強力な中和をもたらす、デングウイルスを越えて、例えばジカウイルス(ジカV)においてもEDEが保存されると判定されている。EDEエピトープの保存は、フラビウイルス、例えばジカウイルスによって引き起こされる疾患の治療および予防に幅広く影響を及ぼす。

概要

1つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種する際に使用するためのフラビウイルスエンベロープ二量体エピトープ(EDE)であって、EDEは、安定化組換えフラビウイルス、任意に、デングウイルスおよび/またはジカエンベロープ糖タンパク質細胞外ドメイン(sE)二量体であり、二量体は、2つのsE単量体間で少なくとも1つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化される、ならびに/または各単量体の二量体界面で、またはドメイン1(D1)/ドメイン3(D3)リンカーにおいて、少なくとも1つのsE単量体のアミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基を、少なくとも1つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって、非共有結合的に安定化され、2つのsE単量体間で少なくとも1つのスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化される、ならびに/または任意に、sE配列を分離する、リンカー領域、任意に、グリシンセリンリッチリンカー領域を有する単一ポリペプチド鎖として形成されることによって共有結合的に安定化される、ならびに/または改変糖類を介して2つのsE単量体を連結することによって共有結合的に安定化される、ならびに/または、二量体は、DENV−1、DENV−2、DENV−3、DENV−4、ジカ、または他のフラビウイルスのうちのいずれか1つまたは2つからの天然および/または変異エンベロープポリペプチドホモ二量体またはヘテロ二量体であり、1つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、EDE。EDEは、DENV−1、DENV−2、DENV−3、DENV−4、およびジカのうちのいずれか1つまたは2つからの天然および/または変異エンベロープポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。請求項1〜29のいずれか一項に記載のEDEに対する単離された中和抗体またはその抗原結合断片であって、任意に、当該抗体またはその断片が、残基67〜74、残基97〜106、残基307〜314、残基148〜159、および残基243〜251、またはフラビウイルスもしくはジカウイルス糖タンパク質E細胞外ドメインの対応する残基からなるか、あるいはジカPF13残基67〜77、残基97〜106、残基313〜315、残基243〜253、残基K373、またはフラビウイルス糖タンパク質E細胞外ドメインの対応する残基からなる、デングウイルス糖タンパク質E細胞外ドメイン(sE)の5つのポリペプチドセグメントに結合し、任意に、結合が、デングN153(ジカN154)グリカンまたは対応する残基の存在もしくは不在によって影響を受けず、1つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および/または治療のための方法における使用のためのものであり、1つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、単離された中和抗体またはその抗原結合断片。、

目的

本発明は、デングウイルスを越えて新たに同定されたEDEの保存に関して、方法、使用、ワクチン、化合物、および組成物を提供する

効果

実績

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請求項1

1つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種する際に使用するためのフラビウイルスエンベロープ二量体エピトープ(EDE)であって、前記EDEが、安定化組換えフラビウイルス、任意にデングウイルスおよび/またはジカ、エンベロープ糖タンパク質細胞外ドメイン(sE)二量体であり、前記二量体が、前記2つのsE単量体間で少なくとも1つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化される、ならびに/または各単量体の二量体界面またはドメインI(DI)/ドメインIII(DIII)リンカーにおいて、少なくとも1つのsE単量体のアミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基を、少なくとも1つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって非共有結合的に安定化され、前記2つのsE単量体間で少なくとも1つのスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化される、ならびに/または、任意に、前記sE配列を分離する、リンカー領域、任意に、グリシンセリンリッチリンカー領域を有する単一ポリペプチド鎖として形成されることによって共有結合的に安定化される、ならびに/または、改変糖類を介して前記2つのsE単量体を連結することによって共有結合的に安定化される、ならびに/または、前記二量体が、DENV−1、DENV−2、DENV−3、DENV−4、ジカ、もしくは他のフラビウイルスのうちのいずれか1つもしくは2つからの天然および/もしくは変異エンベロープポリペプチドホモ二量体もしくはヘテロ二量体であり、前記1つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、EDE。

請求項2

前記二量体が、DENV−1、DENV−2、DENV−3、DENV−4、およびジカのうちのいずれか1つまたは2つからの天然および/または変異エンベロープポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体である、請求項1に記載の使用のためのEDE。

請求項3

前記二量体が、DENV−1、DENV−2、DENV−3、およびDENV−4のうちのいずれか1つまたは2つからの天然および/または変異エンベロープポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体である、請求項1に記載の使用のためのEDE。

請求項4

前記組換えsE単量体が、ジカウイルス(ZIKV、KJ776791、H−PF−2013_French_Polynesia株)配列番号1;デングウイルス血清型1(DENV−1、NC_001477)配列番号2;デングウイルス血清型2(DENV−2、NC_001474)配列番号3;デングウイルス血清型3(DENV−3、NC_001475)配列番号4;デングウイルス血清型4(DENV−4、NC_002640)配列番号5;他のフラビウイルス:セントルイス脳炎ウイルスSLEV、NC_007580)配列番号6;日本脳炎ウイルス(JEV、NC_001437、配列番号7;マリーバレー脳炎ウイルス(MVEV、NC_000943)配列番号8;ウエストナイルウイルス(WNV、NC_001563)配列番号9;WO2016/012800の配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135;および表Mを含む変異の項に記載される変異#1〜#13の中から選択される少なくとも1つの変異を有する変異体sE;ならびに任意に、表Mを含む変異の節に記載される変異#14〜#18の中から選択される少なくとも1つの変異、からなる群から選択される、請求項1、2、または3に記載の使用のためのEDE。

請求項5

前記二量体が、DENV−2の67位に対応する位置で、および任意に、各sE単量体のDENV−2の153位またはジカPF13のN154に対応する位置でグリコシル化されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用のためのEDE。

請求項6

前記二量体が、前記2つのsE単量体間で少なくとも1つ、2つ、または3つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のためのEDE。

請求項7

前記二量体が、DENV−2のA259C/ジカPF13のA264Cに対応する変異#2、またはDENV−2のS255C/ジカPF13のS260Cに対応する変異#1をそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体であり、259C/264Cまたは255C/260Cに対応する残基が、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に連結されている、請求項6に記載の使用のためのEDE。

請求項8

前記二量体が、DENV−2のA259C/ジカPF13のA264Cに対応する変異#2を有する変異体sEと、DENV−2のS255C/ジカPF13のS260Cに対応する変異#1を有する変異体sEとのヘテロ二量体であり、259C/264Cおよび255C/260Cに対応する残基が、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に連結されている、請求項6に記載の使用のためのEDE。

請求項9

前記二量体が、DENV−2のF108CおよびT315C/ジカPF13のF108CおよびT321Cに対応する変異#4をそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体、またはDENV−2およびジカPF13のL107CならびにDENV−2のA313C/ジカPF13のA319Cに対応する変異#3をそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体であり、108Cおよび315C/321Cに対応する残基、または107Cおよび313C/319Cに対応する残基が、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に連結されている、請求項6に記載の使用のためのEDE。

請求項10

前記二量体が、DENV−2およびジカPF13のF108C、DENV−2のA313C/ジカPF13のA319Cに対応する変異を有する変異体sEと、DENV−2およびジカPF13のL107CならびにDENV−2のT315C/ジカPF13の321Cに対応する変異を有する変異体sEとのヘテロ二量体であり、108Cおよび313C/319Cに対応する残基が、前記2つのsE単量体間でジスルフィド鎖間結合を介して315C/321Cおよび107Cに対応する残基にそれぞれ連結されている、請求項6に記載の使用のためのEDE。

請求項11

前記二量体が、DENV−2のA259C/ジカPF13のA264Cに対応する変異#2と、DENV−2およびジカPF13のF108CならびにDENV−2のT315C/ジカPF13のT321Cに対応する変異#4とをそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体、DENV−2のS255C/ジカPF13のS260Cに対応する変異#1と、DENV−2およびジカPF13のF108CならびにDENV−2のT315C/ジカPF13のT321Cに対応する変異#4とをそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体、DENV−2のA259C/ジカPF13のA264Cに対応する変異#2と、DENV−2およびジカPF13のL107CならびにDENV−2のA313C/ジカPF13のT319Cに対応する変異#3とをそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体、ならびにDENV−2のS255C/ジカPF13のS260Cに対応する変異#1と、DENV−2およびジカPF13のL107CならびにDENV−2のA313C/ジカPF13のT319Cに対応する変異#3とをそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体、からなる群から選択され、259C/264C、255C/260C、108C、315C/321C、107Cおよび313C/319Cに対応する前記残基が、ジスルフィド鎖間結合を介して、前記残基259C/264C、255C/260C、315C/321C、108C、313C/319Cおよび107Cにそれぞれ連結されている、請求項6に記載の使用のためのEDE。

請求項12

前記二量体が、DENV−2のA259C/ジカPF13のA264Cに対応する変異#2、DENV−2およびジカPF13のF108CならびにDENV−2のT315C/ジカPF13のT321Cに対応する変異#4を有する変異体sEと、DENV−2のS255C/ジカPF13のS260Cに対応する変異#1、DENV−2およびジカPF13のF108CならびにDENV−2のT315C/ジカPF13のT321Cに対応する変異#4を有する変異体sEとのヘテロ二量体であり、前記残基259C/264C、108C、および315C/321Cが、ジスルフィド鎖間結合を介して、前記残基255C/260C、315C/321C、および108Cにそれぞれ連結されている、請求項6に記載の使用のためのEDE。

請求項13

前記二量体が、請求項11に記載の変異S255C/260C、L107C、およびA313C/319Cを有する変異体sEと、請求項11に記載の変異A259C/264C、L107C、およびA313C/319Cを有する変異体sEとのヘテロ二量体であり、前記残基255C/260C、107C、および313C/319Cが、ジスルフィド鎖間結合を介して前記残基259C/264C、313C/319C、および107Cにそれぞれ連結されている、請求項6に記載の使用のためのEDE。

請求項14

前記二量体が、前記sE単量体間で少なくとも1つ、2つ、または3つのスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化されている、請求項1〜13のいずれか一項に記載の使用のためのEDE。

請求項15

前記スルフヒドリル反応性架橋剤が、マレイミドハロアセチルピリジルジスルフィド、ビニルスルホンアルキルハライド、またはアジリジン化合物アクリロイル誘導体アリール化剤、またはチオール−ジスルフィド交換試薬からなる群から選択される、請求項14に記載の使用のためのEDE。

請求項16

前記マレイミドスルフヒドリル反応性架橋剤が、BMOE、BMB、BMH、TMEA、BM(PEG)2、BM(PEG)3、BMDB、DTME、好ましくはBMH、BM(PEG)2、およびBM(PEG)3からなる群から選択される、請求項15に記載の使用のためのEDE。

請求項17

前記二量体が、DENV−2のT262CまたはDENV−2のT265Cに対応する変異をそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体であり、262Cまたは265Cに対応する残基が、スルフヒドリル反応性架橋剤を介して一緒に連結されている、請求項14〜16のいずれか一項に記載の使用のためのEDE。

請求項18

前記二量体が、DENV−2のT/S262Cに対応する変異を有する変異体sEと、DENV−2のT/A265Cに対応する変異を有する変異体sEとのヘテロ二量体であり、262Cおよび265Cに対応する残基が、スルフヒドリル反応性架橋剤を介して一緒に連結されている、請求項14〜16のいずれか一項に記載の使用のためのEDE。

請求項19

前記二量体が、変異体sEのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、DENV−2sEのアミノ酸残基1〜9、25〜30、238〜282、96〜111、および311〜318に対応する前記アミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基が、システインおよび変異体sEに変異し、DENV−2sEのアミノ酸残基1〜9、25〜30、238〜282、96〜111、および311〜318に対応するアミノ酸残基からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基が、システインに変異し、前記変異したシステイン残基が、スルフヒドリル反応性架橋剤を介して一緒に連結されている、請求項14〜16のいずれか一項に記載の使用のためのEDE。

請求項20

前記組換えsEまたは前記2つの組換えsEのうちの1つが、DENV−2のH27F、H27W、H244F、H244W、およびL278Fに対応する変異からなる群より選択される少なくとも1つの変異を有する、請求項1〜19のいずれか一項に記載の使用のためのEDE。

請求項21

前記組換えsEまたは前記2つの組換えsEのうちの1つが、DENV−2のL292FおよびL294Nに対応する変異からなる群から選択される少なくとも1つの変異を有する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の使用のためのEDE。

請求項22

前記二量体が、変異体sEのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、一方のsE単量体が、グリコシル化部位を導入する少なくとも1つの変異を有し、前記変異したアミノ酸残基が、X官能基担持する改変糖でグリコシル化され、−他方のsE単量体が、グリコシル化部位を導入する少なくとも1つの変異を有し、前記変異したアミノ酸残基が、Y官能基を担持する改変糖でグリコシル化され、両方の変異した残基が、具体的にはクリック化学によって、第1のsE単量体の糖のX官能基を他方のsE単量体の糖のY官能基と反応させることによって、前記改変糖類を介して一緒に結合している、請求項1〜21のいずれか一項に記載の使用のためのEDE。

請求項23

前記EDEが、安定化された組換えデングウイルスエンベロープ糖タンパク質細胞外ドメイン(sE)二量体、エンベロープタンパク質の二量体、またはその抗原性部分、または任意に、単量体間での共有結合および/または非共有結合のレベルが増加する場合、任意に、前記EDEが改善されたEDEである場合、異種骨格タンパク質内に保持された、前記エンベロープポリペプチド二量体の連続もしくは非連続残基を含む、請求項1〜22のいずれかに記載の使用のためのEDE。

請求項24

前記EDEが、前記DENV−1もしくはDENV−2ポリペプチド配列の、E49、K64、Q77、W101、V122(DENV−1;K122DENV−2)、N134、N153、T155、I161、A162(DENV−1;I162DENV−2)、P169(DENV−1;S169DENV−2)、T200(DENV−1;Q200DENV−2)、K202(DENV−1;E202DENV−2)、E203、L308(DENV−1;V308もしくはI308DENV−2_、K310、Q323(DENV−1;R323DENV−2)、W391、F392;ジカPF13のT49、S64、Q77、W101、S122、N134、N154、T156、K166T205、N207、N208、F314、K316、E319、W400、H401に対応する位置のうちの1つ以上;またはフラビウイルス、任意に、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基;ならびに/あるいはジカPF13のR2、M68、A69、S70、D71、S72、R73、C74、Q77、D83、V97、D98、R99、W101、G102、N103、G104、C105、G106、L113、K251、R252、Q253、T315、K316、Q331、K373に対応する位置のうちの1つ以上、例えばジカPF13のT315、K373、S70、S72、Q77、R99、G104、M68、R252、D83、Q253に対応する位置のうちの1つ以上、ならびに/あるいは、前記DENV−2もしくはDENV−4ポリペプチド配列の、A71、C105、C74、D154、D249、D271、D309、D362、D98、E148、E311、E44、E71、E84、G102、G104、G106、G152、G156、G28、G29、G374、H158、H27、I113、I308、I46、K246、K247、K310、K323、K325、K47、L113、L45、L82、M278、N103、N153、N362、N67、N83、Q248、Q271、Q325、Q77、R2、R247、R323、R73、R99、S72、S81、T115、T155、T361、T46、T68、T69、T70、T72、V113、V114、V250、V309、V324、V97、W101、に対応する位置のうちの1つ以上、またはフラビウイルス、任意に、ジカまたはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基、を含み、任意に、DENV−2/N154ジカPF13のN153および/またはDENV−2のN67に対応する位置が、グリコシル化され、任意に、前記EDEが、位置W101および少なくとも1つの他の位置を含む、請求項1〜22のいずれかに記載の使用のためのEDE。

請求項25

特定の残基が、エンベロープタンパク質の天然の二量体における前記残基と実質的に同様の空間配置にある、請求項1〜24のいずれかに記載の使用のためのEDE。

請求項26

前記EDEが、ドメインII側上のbストランド、およびドメインI側(前記二量体界面の向かいの)上の「150ループ」によって形成されたくぼみの中心に置かれた領域を含み、前記150ループが残基148〜159に広がり、ドメインIのbストランドE0およびF0を接続し、N153グリカンを担持し、これは前記二量体における前記パートナーサブユニットの融合ループを覆い、任意に、前記領域が、前記bストランド(前記N67グリカンを担持する残基67〜74)、すぐ上流の前記融合ループおよび残基(残基97〜106)、ならびに前記参照サブユニットの前記ijループ(残基246〜249)を含み、前記参照サブユニットが、前記融合ループに寄与する前記サブユニットであり、任意に、前記EDEが、第2のサブユニットの前記150ループおよび前記N153グリカン鎖をさらに含み、任意に、一方または両方の領域が天然領域と実質的に同様の空間配置にあるか、または前記EDEが、ドメインIIのジカPF13ベータストランドb、bcdベータ−シート端部、融合ループ主鎖、融合ループR99側鎖、Q77側鎖、C74とC105との間のジスルフィド結合、ベータストランドE、K373、ドメインIの荷電残基、ドメインIIのklループ、またはそれに対応する領域を含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の使用のためのEDE。

請求項27

前記EDEが、ビリオンまたはサブウイルス粒子、またはウイルス様粒子もしくはナノ粒子、任意に、自己組織化ナノ粒子の一部として提示される、請求項1〜26のいずれかに記載の使用のためのEDE。

請求項28

前記EDEが、一旦、対象、好ましくはヒトに投与されると、抗体を作り出すことができ、前記抗体が、1種を超える血清型のフラビウイルス、任意に、デングウイルスおよびジカウイルスに結合することができ、任意に、4種すべての血清型のデングウイルスおよびジフウイルスに結合することができ、1種を超える血清型のフラビウイルス、任意に、デングウイルスおよびジカウイルスを中和することができ、任意に、4種すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを中和することができ、かつ前記抗体が、任意に、4種すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを80、90、または100%中和することができ、任意に、ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られるウイルスを中和することができ、好ましくは、ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られる4種すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを80、90、または100%中和することができる、請求項1〜27のいずれかに記載の使用のためのEDE。

請求項29

前記EDEが、単一ポリペプチドとして表され、任意に、前記2つのエンベロープ単量体が、リンカーによって分離され、任意に、前記リンカーが、グリシンおよび/またはセリンリッチである、請求項1〜28のいずれかに記載の使用のためのEDE。

請求項30

1つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種する際に使用するための、または1つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および/または治療のための方法における使用のための、請求項1〜29のいずれか一項に記載のEDEをコードする核酸であって、前記1つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、核酸。

請求項31

1つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種する際に使用するための、または1つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および/または治療のための方法における使用のための組成物であって、a)請求項1〜29のいずれか一項に記載のEDE、b)請求項30に記載の核酸、c)請求項30に記載の核酸を含むベクター、d)請求項30に記載の核酸、または請求項30に記載の核酸を含むベクターを含む、宿主細胞であって、任意に、前記宿主細胞が、C6/36昆虫細胞、ヒト樹状細胞CHO細胞、またはピキアパストリス細胞である、宿主細胞、のうちのいずれか1つ以上を含み、前記1つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、組成物。

請求項32

a)請求項1〜29のいずれか一項に記載のEDE、b)請求項30に記載の核酸、c)請求項30に記載の核酸を含むベクター、d)請求項30に記載の核酸を含む宿主細胞、または請求項30に記載の核酸を含むベクターが、1種を超える、任意に2種、任意に3種、任意に4種の血清型のデングウイルスおよび/またはジカウイルスからのものであるか、またはそれらの前記EDEをコードする、請求項31に記載の使用のための組成物。

請求項33

a)請求項1〜29のいずれか一項に記載のEDE、b)請求項30に記載の核酸、c)請求項30に記載の核酸を含むベクター、d)請求項30に記載の核酸を含む宿主細胞、または請求項30に記載の核酸を含むベクターが、4種すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを中和する抗体を産生することができる単一のEDEであるか、またはそれをコードし、任意に、4種すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを完全に中和することができ、任意に、昆虫細胞およびヒト細胞における4種すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを完全に中和することができる、請求項31または32のいずれかに記載の組成物。

請求項34

前記個体が、妊娠中女性、任意に、例えばデングウイルスに感染したことが分かっている、または疑われることを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている1人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、妊娠中の女性、または、出産年齢の女性、任意に、例えば、デングウイルスに感染していることが分かっている、または疑わしいことを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている1人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、出産年齢の女性である、請求項1〜33のいずれか一項に記載の使用のための、EDE、核酸、または組成物。

請求項35

ジカウイルスに対するワクチンのために好適な抗原を選択することを補助するための方法であって、候補抗原応答して対象において作製された1つ以上の抗体の特性決定を含み、任意に、前記候補抗原が、請求項1〜29のいずれかに記載のEDEに結合することが知られている抗体のパネルに結合することがこれまでに見出されている、方法。

請求項36

前記抗体が、前記候補抗原に曝露された対象の分類された単一形質細胞から得られる、請求項35に記載の方法。

請求項37

前記主要抗体(複数可)が、任意に、ウエスタンブロットにおいて、前記デングエンベロープタンパク質を含む直線状エピトープを認識する場合、前記候補抗原がジカワクチン抗原として適していないと見なされる、請求項35または36に記載の方法。

請求項38

前記主要抗体(複数可)が、請求項1〜29のいずれかに記載のEDEに結合する場合、前記候補抗原が、ジカワクチン接種における使用に潜在的に適していると考えられる、請求項35〜37のいずれか一項に記載の方法。

請求項39

前記抗体が、2種以上の異なる血清型のデングウイルス/ジカウイルスの、請求項1〜29のいずれかに記載のエンベロープタンパク質またはEDEに対する交差反応性について評価される、請求項35〜38のいずれか一項に記載の方法。

請求項40

前記候補抗原が、任意に、請求項1〜29のいずれか一項に記載のフラビウイルスエンベロープタンパク質の安定化二量体である、請求項35〜39のいずれかに記載の方法。

請求項41

ジカウイルスワクチン接種に対する患者の必要性を評価するための方法であって、前記対象における抗EDE抗体および抗融合ループ抗体のレベルの特定を含み、前記EDEが、請求項1〜29のいずれかに記載されるとおりである、方法。

請求項42

前記患者が、抗EDE抗体を有すると判定される場合、ワクチン接種が不要である可能性があると特定される、請求項41に記載の方法。

請求項43

前記患者が、抗EDE抗体を有すると判定される場合、前記患者は、ブースト投与に供されるように選択される、請求項41に記載の方法。

請求項44

前記患者が、抗EDE抗体を有しない場合、前記患者は、全ワクチン接種のために選択される、請求項41に記載の方法。

請求項45

請求項1〜29のいずれか一項に記載のEDEに対する単離された中和抗体またはその抗原結合断片であって、任意に、前記抗体またはその断片が、前記残基67〜74、残基97〜106、残基307〜314、残基148〜159、および残基243〜251、または前記フラビウイルスもしくはジカウイルス糖タンパク質E細胞外ドメインの対応する残基からなるか、あるいはジカPF13残基67〜77、残基97〜106、残基313〜315、残基243〜253、残基K373、または前記フラビウイルス糖タンパク質E細胞外ドメインの対応する残基からなる、前記デングウイルス糖タンパク質E細胞外ドメイン(sE)の5つのポリペプチドセグメントに結合し、任意に、結合が、デングN153(ジカN154)グリカンまたは対応する残基の存在もしくは不在、によって影響を受けず、1つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および/または治療のための方法における使用のためのものであり、1つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、単離された中和抗体またはその抗原結合断片。

請求項46

前記個体が、妊娠中の女性、任意に、例えばデングウイルスに感染したことが分かっている、または疑われることを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている1人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、妊娠中の女性、または、出産年齢の女性、任意に、例えば、デングウイルスに感染していることが分かっている、または疑わしいことを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている1人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、出産年齢の女性である、請求項45に記載の使用のための、抗体またはその断片。

請求項47

フラビウイルス、任意に、ジカまたはデングウイルスのビリオン依存性(サブウイルス粒子またはウイルス様粒子を含む)エピトープ(複数可)を単独に認識する、請求項45または46に記載の使用のための抗体またはその断片。

請求項48

Fab断片である、請求項45〜47のいずれか一項に記載の断片。

請求項49

前記抗体または断片が、表Aに特定される抗体EDE1C8またはEDE1C10からの、任意に、配列番号15〜26および前記配列番号15〜26のいずれか1つから30、20、15、または10%以下の改変を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、CDR領域を含む、請求項45〜48のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。

請求項50

前記EDEが、前記ドメインII側上のbストランド、および(前記二量体界面の向かいにある)ドメインI側上の「150ループ」によって形成されたくぼみの中心に置かれた領域を含み、前記150ループが残基148〜159に広がり、ドメインIのbストランドE0およびF0を接続し、前記N153グリカンを担持し、前記二量体において前記パートナーサブユニットの融合ループを覆い、任意に、前記領域が、前記bストランド(前記N67グリカンを担持する残基67〜74)、すぐ上流の前記融合ループおよび残基(残基97〜106)、ならびに前記参照サブユニットの前記ijループ(残基246〜249)を含み、前記参照サブユニットが、前記融合ループに寄与する前記サブユニットであり、任意に、前記EDEが、第2のサブユニットの前記150ループおよび前記N153グリカン鎖をさらに含み、任意に、一方または両方の領域が、天然領域と実質的に同様の空間配置にあるか、または前記EDEが、ドメインIIのジカPF13ベータストランドb、bcdベータ−シート端部、融合ループ主鎖、融合ループR99側鎖、Q77側鎖、C74とC105との間のジスルフィド結合、ベータストランドE、K373、ドメインIの荷電残基、ドメインIIのklループ、またはそれに対応する領域を含む、請求項45〜49のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。

請求項51

前記抗体またはその断片が、1種以上の血清型のデングウイルスおよび/またはジカウイルスを中和し、任意に、1種以上の血清型のデングウイルスおよび/またはジカウイルスを80%または90%または98%または100%中和する、請求項45〜50のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。

請求項52

前記抗体またはその断片が、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを中和し、任意に、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを80%または90%または98%または100%中和し、任意に、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを100%に中和し、任意に、すべての血清型のデングウイルスを同じ濃度の抗体または断片で100%中和する、請求項45〜51のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。

請求項53

前記抗体またはその断片が、1つ以上の血清型のデングウイルスおよび/またはジカウイルスを0.5〜0.01μg/mlの濃度で80、90、98、または100%中和する、請求項45〜52のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。

請求項54

前記抗体またはその断片が、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを、0.5〜0.01μg/mlの濃度で80、90、98、または100%中和する、請求項45〜53のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。

請求項55

前記断片が、Fv断片、Fab様断片(例えば、Fab断片、Fab’断片、もしくはF(ab)2断片);またはドメイン抗体であるか、または前記抗体が、モノクローナル抗体または組換え抗体である、請求項45〜54のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。

請求項56

前記抗体が、ポリクローナル抗体またはその抗原結合部分である、請求項45〜54のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。

請求項57

前記抗体またはその断片が、混合物または抗体、任意に、a)モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、またはb)ポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、またはc)混合物、またはモノクローナルおよびポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分、を含む組成物の一部として使用するためのものである、請求項45〜56のいずれか一項に記載の使用のための抗体またはその断片。

請求項58

1つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および/または治療のための方法における使用のための、請求項45〜57のいずれかに記載の抗体またはその断片をコードする核酸であって、前記1つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、核酸。

請求項59

前記抗体もしくはその断片または核酸が、上述の1つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および/または治療のための方法における使用のためのものであり、前記治療が、抗体依存性増強(ADE)を減少させるためである、請求項45〜57のいずれか一項に記載の使用のための抗体もしくはその断片、または請求項58の使用のための核酸。

請求項60

対象における1つ以上のフラビウイルスによる感染の診断またはモニタリングする際に使用するための、請求項1〜59のいずれか一項に記載のEDEまたはその抗体もしくはその断片であって、前記1つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、EDEまたはその抗体もしくはその断片。

請求項61

1つ以上のフラビウイルスによる感染に対してワクチン接種された対象における1つ以上のフラビウイルスによる感染に対するワクチン接種プロトコル成功をモニタリングするためのインビトロ方法であって、a)前記対象からの適切な生物学的試料を、請求項1〜29のいずれか一項に記載のEDEとインビトロで接触させるステップと、b)前記生物学的試料中の前記二量体を対象とする中和抗体の量を判定するステップと、c)ステップ(b)において判定された量を、前記対象に対して以前に得られた前記二量体を対象とする抗体の量と比較するステップと、を含み、前記二量体を対象とする中和抗体の量の有意な増加が、前記ワクチン接種プロトコルの成功のマーカーを構成し、前記1つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、インビトロ方法。

請求項62

1つ以上のフラビウイルスによる感染を患っている患者を、請求項45〜57のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、または請求項58に記載の核酸での治療、あるいはその用量の増加を必要とする可能性が高いとして特定するための方法であって、前記対象における抗EDE抗体および抗融合ループ抗体のレベルの決定を含み、前記EDEが、請求項1〜29のいずれかに記載のとおりであり、前記1つ以上のフラビウイルスが、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される、方法。

請求項63

前記対象が主に抗融合ループ抗体を有する場合、前記対象が前記抗体、断片、または核酸で治療、任意に高用量でそれを必要とする、請求項62に記載の方法。

請求項64

前記対象が抗EDE抗体を有しないか、または特に低レベルの抗EDE抗体を有する場合、前記対象が、高用量の前記抗体、断片、または核酸を必要としていると見なされる、請求項62または63に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、フラビウイルス感染治療および予防の分野ならびに関連化合物および方法に関する。

背景技術

0002

フラビウイルスの負担
フラビウイルス属ウイルスは、最も重要な節足動物媒介性のヒト病原体であり、予防的治療治癒的治療が利用できない米における現在のジカ爆発などのますます深刻な蔓延を引き起こしている。ジカVの現在のメディアへの影響に加えて、社会に最も高い報酬課すフラビウイルス疾患は、アミノ酸配列が30〜35%異なる血清型DENV1〜4と呼ばれる4つの異なるウイルスによって引き起こされるデング熱である。世界の年間発生率は、3億9000万の症例であり、このうち、9600万人は、臨床的に明らかであり1、約25000人が死亡していると推定されている。グローバリゼーションAedesベクター広がり都市計画の不十分な計画、最近まで認可されたワクチンまたは抗デング治療薬がなかったことなど、いくつかの要因パンデミックを引き起こしている2。ジカVはまた、Aedes蚊によっても広がり、フラビウイルスの中でそのエンベロープタンパク質は他のフラビウイルスよりもDENV(42〜46%発散図1A)のアミノ酸配列に最も近い。

0003

重度のデング疾患の特徴は、毛細血管浸透性を高め、血漿漏出および出血を引き起こし、血流力学的妥協およびデングショック症候群をもたらす。未治療の重度の疾患は、死亡率が最大20%になり得るが、専門家の管理、主に補液により、これは、1%未満に減らすことができる2。デング熱は爆発的な蔓延を引き起こし、風土病国の医療制度に大きなストレスを与え、いくつかのデング熱管理戦略が評価されているが、一般的に、すべての年齢層に有効なワクチンが疾患の負担に深刻に参入することが必要である。ジカウイルスの場合、ほぼ70年前に発見されたが、最近になって、ミコセファリーおよびギランバレー症候群を含む重度の神経学後遺症が記載されている3〜6。

0004

フラビウイルスビリオン
フラビウイルスは、カプシド(C)前駆体膜タンパク質(prM)およびエンベロープ(E)、ならびに7つの非構造タンパク質(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5)の3つの構造タンパク質を有する直径50nmである、比較的単純なポジティブセンス一本鎖RNAウイルスである(図1B)。EおよびprMは、ウイルスの糖タンパク質の殻を形成し、Eは宿主細胞の結合および細胞への侵入7に関与する。ウイルス粒子の組み立ておよび成熟は、DENVについて最も徹底的に研究されている。小胞体中の粒子形態形成中、Eの180個のコピーは、1:1の様式で、prMの180個のコピーと会合して、「未成熟ビリオン」をそれらの特徴となるスパイク状外観7〜9を与える、60三量体(ヘテロ六量体スパイクを形成する(図2A)。トランスゴルジネットワーク内のprMは、それが分泌されるまで、ビリオンと会合したままの状態で膜アンカー型Mの切り株およびPRを生成し、宿主がコードされたフリンプロテアーゼによって切断される8、10、11。宿主細胞から分泌されると、prは、離れて、「成熟ビリオン」を残し、Eの180個のコピーを含む平滑な構造は、2、3、および5倍軸の周りに20面体対称を有する90ヘッドトゥーテール二量体に配置される(図2B)。

0005

DENVでは、prMの切断は、すべてのビリオンにおいて完全ではなく、割合の中間体の状態のままで、ウイルス粒子が様々な量の切断された、かつ切断されないprM12〜15を含む。prMの切断は、昆虫細胞またはベロなどの腫瘍細胞株で産生されるウイルスと比較して、ある特定の細胞型、特に樹状細胞などの初代ヒト細胞でより効率的である16、17。

0006

免疫増強
1種の血清型のデングによる感染は、その血清型との再感染への終生免疫の世代をもたらすが、他の血清型ではもたらさない18〜20。4種すべてのデング血清型がしばしば共循環するか、または周期的に互いに置き換わるので、複数の感染が流行国では典型的である。十分に管理された疫学研究は、大部分の重度のデング熱感染が、二次的または連続的なデング熱感染を経験している個体において生じることを示している21〜23。

0007

抗体依存性増強(ADE)の理論は、一次感染に対して生成された既存の異種抗体が、二次的に遭遇するウイルスを中和するのに十分な結合活性または濃度ではないことを仮定しており、エンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、30〜35%変化し得る。その代わりに、ウイルスは、インビボでDENV複製の主要部位である、単球およびマクロファージなどのFc受容体(FcR)を担持する細胞に取り組むために、オプソニン化および標的化され、そのため、ウイルス産生の増加をもたらし得る24〜27。

0008

デングワクチン
過去数十年にわたるデング熱感染の指数関数的増加は、デングワクチンの探索を必要であるが、この目標を達成することは非常に困難であることを示している。成功したワクチンは、デング熱にさらされていないか、またはこれまでにデング熱感染を経験している個体において、4種すべてのデング血清型、好ましくは1または2用量で保護的で耐久性のある免疫応答誘導する必要があるであろう。同時に、ワクチンは上記の増強または病原性免疫応答を誘発することを避ける必要があり得る。

0009

初回のデング熱感染が他の3つのウイルス血清型の再感染に対する長期的な予防を与えないため18、19、ワクチンは四価製剤を要求する4種すべての血清型に対して防御型特異的応答を誘導する必要があると一般に認められている。ワクチン開発の取り組みは、タイで始まったおよそ50年間、4種の血清型を表すウイルス株の連続継代によって生きた弱毒化デングワクチン(LATV)を産生する作業を追求されてきた28。特定の課題は、過度に弱毒化されていない顕性デング疾患を誘発し、防御免疫応答を誘発することができない弱毒化形態のウイルスを開発することであった。別の課題は、4つすべてのウイルスが一緒送達される、四価製剤を生産し、均等に複製し、いくつかの血清型に対して良好な応答であるが、1種以上の血清型に対して不良な応答をもたらした血清型間の競合ではなく、4種すべての血清型に対してバランスのとれた応答を誘導することであった。

0010

最先端のデングワクチンは、Sanofi PasteurワクチンCYD−TDVである。これは、黄熱病17Dワクチン株を骨格とし、デングprMおよびE遺伝子を黄熱病のものに置き換えキメラである。ワクチンは、各血清型(CYD1〜4)を表す4種の組換えウイルスの混合物を含む29〜32。最初の臨床試験は、ワクチンに対する良好な血清反応が示され、血清陽性率は66.5〜100%であった。アジアおよびラテンアメリカにおけるこのワクチンの第III相試験は、35〜78%の準最適有効性を示し、デング2に対する有効性は最も低かった30、32。

0011

さらなる分析により、ワクチンはワクチン接種前にすでに1種以上の血清型に対して既に免疫されたワクチンに対してより良好な保護を与えたことが明らかになった。最近、最初の2〜3年の長期追跡調査暫定的結果が発表され、有効性が立証されたが、プラセボと比較して9未満のワクチン接種群で増加した入院デング熱病に関するシグナルが明らかになった33。ワクチンプライミングによる免疫増強が不完全な防御をもたらす可能性があるという強い疑いがあり、これは予防接種時に未熟なデング熱の若いワクチンでおそらく起こる。しかしながら、このワクチンは、いくつかのデング熱帯諸国で認可されているが、9〜45歳に制限されており、リスクのある個人の大半が適格ではないことを意味する。TakedaおよびNIHのLATVのうち2つ以上のLATVが第III相評価に近く、これらが優れた有効性を達成するかどうかが決定されるであろう。

0012

デングエピトープが、最もヒト中和抗体標的物であるかについては、これまでのところ明らかではなく、例えば、de Alwis(de Alwis et al 2012 Identification of human neutralizing antibodies that bind to complex epitopes on dengue virions.Proc Natl Acad Sci USA 109:7439−7444)は、エピトープが形成のためにウイルスの組み立てを必要とすることを示唆しているが、一方、Rey(Rey 2013 Nature 497:443−444)は、エンベロープ二量体自体が標的物であると示唆している。

0013

本発明者らが関与する以前の研究は、デングエンベロープ二量体の一部を標的とするヒト中和抗体を同定する。例えば、WO2016/012800、Rouvinski et al(2015)Nature 520,109−113、Dejnirattisai et al(2015)Nature Immunol 16,170−177を参照されたく、これらは、4種の血清型のデングウイルス(DENV)に対する強力な交差中和ヒト抗体の単離および構造的特徴付けに関連する。これらの抗体は、E−二量体−エピトープ(EDE)と呼ばれる高度に保存されたエピトープに結合する。

0014

Dai et al(2016)Cell Host&Microbe19,1−9は、融合ループエピトープを認識するフラビウイルス広範な防御抗体として記載されている抗体とのジカウイルスエベロープタンパク質およびその複合体の構造を報告している。Dai et al(2016)は、5頁、第2欄に
「EDE特異的中和抗体の構造研究により、融合ループの露出した主鎖および2つの保存されたグリカン鎖(N67およびN153結合グリカン)を含む、認識決定基がE二量体界面で血清型不変部位に見出されることが明らかになったことを言及する(Rouvinski et al.,2015)。これらの2つのグリコシル化部位は、他のフラビウイルスにおいて高度に保存されていない。さらに、ZIKVは、N67結合グルレーション部位を持たず、N154結合グリコシル化部位(DENVのN153結合グリコシル化部位と同等)は、単離されたZIKV株の一部には存在しない(表S2)。さらに、DENV EDE mAb結合にとって重要なbストランド、150ループ、ijループ、およびA鎖のいくつかの残基は、ZIKVおよび他のフラビウイルスにおいて保存されていない(図S2)。重要なことに、ZIKV sE構造は、EDE抗体の結合領域に独自に正電荷パッチを示すので(図S1)、EDE特異的抗生物質はZIKV感染に対して効果的でない可能性がある。しかしながら、高度に保存された融合ループを標的とする他
既知のフラビウイルスFL特異的抗体は、2A1−G6の中和プロファイルによって確認されるように、ZIKVを中和することができる。」

0015

Daiら(2016)に記載された結論とは対照的に、本発明者らは、デングウイルスを越えてフラビウイルスが強力に中和され、例えばDaiら(2016)に報告されているよりもはるかに強力な中和など、ジカVの強力な中和をもたらす、デングウイルスを越えて、例えばジカウイルス(ジカV)においてもEDEが保存されると判定されている。EDEエピトープの保存は、フラビウイルス、例えばジカウイルスによって引き起こされる疾患の治療および予防に幅広く影響を及ぼす。

発明が解決しようとする課題

0016

以下に記載の本発明は、デングウイルスを越えて新たに同定されたEDEの保存に関して、方法、使用、ワクチン、化合物、および組成物を提供する。

課題を解決するための手段

0017

本発明は、本発明の異なる態様の様々な実施形態に関して以下に記載されよう。明確にするために、個別の実施形態の文脈に記載される本発明のある特定の特性はまた、1つ以上の実施形態または単一の実施形態において組み合わせても提供されてもよいことが理解される。反対に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈に記載される本発明の様々な特性はまた、個別にまたは任意の適当なサブコンビネーションで提供されてもよい。これらの実施形態のすべての組み合わせは、あたかも各々およびすべての組み合わせが個別におよび明示的に開示されたかのように、本発明によって具体的に包含され、本明細書で開示されている。加えて、すべてのサブコンビネーションはまた、あたかも各々およびすべてのこのようなサブコンビネーションが個別におよび明示的に本明細書で開示されたかのように、本発明によって具体的に包含され、本明細書で開示されている。

0018

したがって、本発明の第1の態様は、1つ以上のフラビウイルスの感染の予防および/または治療のための方法における使用のために、1種を超える血清型のフラビウイルス、例えば1種を超える血清型のデングウイルスおよび/またはジフウイルスを中和する化合物を提供し、1つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。

実施例

0019

本化合物は、以下でさらに論じられるように、抗体またはその抗原結合断片であり得る。したがって、一実施形態では、本発明は、以下に定義されるEDEに対する単離された中和抗体またはその抗原結合断片を提供し、任意に、当該抗体またはその断片は、残基67〜74、残基97〜106、残基307〜314、残基148〜159、および残基243〜251、またはフラビウイルスもしくはジカウイルス糖タンパク質E細胞外ドメインの対応する残基からなるか、あるいはジカPF13残基67〜77、残基97〜106、残基313〜315、残基243〜253、残基K373、またはフラビウイルス糖タンパク質E細胞外ドメインの対応する残基からなる、デングウイルス糖タンパク質E細胞外ドメイン(sE)の5つのポリペプチドセグメントに結合し、任意に、結合が、デングN153(ジカN154)グリカンまたは対応する残基の存在もしくは不在によって影響を受けず、1つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。

0020

個体は、妊娠中女性、任意に、例えばデングウイルスに感染したことが分かっている、または疑われることを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている1人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、妊娠中の女性、または出産年齢の女性、任意に、例えば、デングウイルスに感染していることが分かっている、または疑わしいことを介してジカ感染に接触するリスクがあると考えられる、ジカウイルスまたはデングウイルスに感染したことが分かっている1人以上の個人と密接に接触している、ジカウイルスまたはデングウイルス感染の高い割合またはリスクがあると考えられる場所にいる、出産年齢の女性である。

0021

化合物、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、結果が特に重篤である可能性がある妊婦におけるジカ感染の可能性、ウイルス負荷、または重症度/影響を低減するのに特に有用であると考えられる。

0022

ジカウイルス糖タンパク質細胞外ドメイン(sE)については、結合セグメントは、実施例2、例えば「EDE1C8複合体」と記載された節に示されているように、ならびに実施例2の図3および4を参照してもよい。抗体とジカsEとの相互作用は、CDRからの側鎖(例えば、水素結合ドナー(NH基)およびbdcベータシート端(実施例2の図3bおよび3c)の受容体(主鎖カルボニル)を認識するH2、H3、およびL3など)を有するドメインIIのベータストランドbを含み得る。融合ループ主鎖(いくつかのグリシン残基を含む)およびCys74とCys105との間のジスルフィド結合は、CDR L1およびL3(実施例2のED図1)の残基の芳香族側鎖によって枠を付けることができる。これらの2つのCDRからの残基は、例えば、融合ループの保存された側鎖カイン、例えばArg99または近くに、例えばGln77も認識し得る。二量体界面を横断して、ベータストランドE、例えばLys373は、例えば、直接または水媒水素ディネットワーク(例えば、実施例2のED図4bおよび4cを参照のこと)のようなCDRs L1およびL2と相互作用することができる。ドメインIおよびドメインIIの近くのklループからの荷電残基は、例えば、CDR H2およびH3などの重鎖への結合に寄与し得る(実施例2のED図4eおよび4f)。実施例2のED表4および5は、例えば、EDE1 C8とZIKV sEとの間の極性相互作用を示す。したがって、ドメインIIにおけるbストランドおよび融合ループとの接触は、例えば、二量体界面を横断するか、または相互作用を安定化させるDENVのN67グリカンを介して、他の寄与とともに主要な結合決定因子であり得る。

0023

好ましくは、本化合物は、1種または2種の血清型のデングウイルス、より好ましくは3種のデングウイルス、および最も好ましくは4種の血清型のデングウイルスのデングウイルスすなわち、4種すべての血清型のデングウイルスを中和する、例えば、ジカウイルス、ならびにDENV−1、DENV−2、DENV−3、およびDENV−4を含む一覧表からの1種、2種またはそれ以上の血清型のデングウイルスを中和する。

0024

化合物とは、1種を超える血清型のフラビウイルス、例えばジカおよびデングウイルスを中和することができる任意の化合物を意味する。本化合物は、例えば、小分子ポリペプチド、またはタンパク質(これらの用語は、本明細書で同義に使用される)であってもよく、これには、糖タンパク質、核酸炭水化物脂肪原子、例えば、金属が含まれる。好ましい実施形態では、本化合物は、ポリペプチド、好ましくは抗体またはその抗原結合部分である。この抗原結合部分は、Fv断片、Fab様断片(例えば、Fab断片、Fab’断片、F(ab)2断片、Fv断片、もしくはscFv断片)、またはドメイン抗体であってもよい。この抗原結合部分は、無傷抗体に存在する線状アミノ酸配列に由来し得るか、または一連の非連続的なアミノ酸を含み得るか、任意に他のアミノ酸と散在され得、例えば、エピトープとの接触に必要とされる特定のアミノ酸を含み得るが、例えば、場合によっては、例えば異種骨格タンパク質によって置き換えられ得る、天然抗体のフレームワークに必要とされるアミノ酸を含み得ない。本発明に従う抗体は、例えば、当業者に周知であろう、ヒト、サルウサギ、またはマウスなどの哺乳動物免疫性を与えるステップを含む方法によって、および/または例えば、ファージディスプレイ選択ステップを含む、インビトロ方法によって得られる。

0025

抗体とは、実質的に無傷の抗体分子、ならびにキメラ抗体ヒト化抗体(少なくとも1つのアミノ酸が非ヒト抗体に対して変異である、例えば、天然非ヒト抗体または非ヒト抗体配列から組み立てられた抗体)、一本鎖抗体二重特異性抗体抗体重鎖抗体軽鎖、抗体重鎖および/または軽鎖ホモ二量体またはヘテロ二量体、ならびにその抗原結合部分および誘導体の意味を含む。

0026

本化合物がタンパク質、例えば、抗体またはその断片であり、ヒト対象投与されるとき、およびこの抗体がヒト抗体またはその断片ではない場合、ヒトにおける免疫原性を低減させるためにヒト化され得る。ヒト化抗体またはその断片を産生するための方法は、当該技術分野で既知である(Vinckleら、2009)。

0027

さらに、本発明に従う抗体またはその断片のバイオアベイラビリティは、中和抗体またはその断片をアルブミン(Coppietersら、2006)または免疫グロブリン(Harmsenら、2005)などの不活性担体接合することによって改善され得る。

0028

抗体という用語はまた、IgGIgAIgM、IdD、およびIgEを含む、すべてのクラスの抗体も含む。抗体という用語はまた、任意の定義された抗体およびその抗原結合部分の変異体融合体、および誘導体も含む。

0029

本化合物は、代替的には、例えば、MILLWARD STEVEN W ET AL:“Design of cyclic peptides that bind protein surfaces with antibody−like affinity”,ACS CHEMICAL BIOLOGY,vol.2,no.9,1 January 2007(2007−01−01),pages 625−634,XP002616292,AMERICAN CHEMICAL SOCIETY,WASHINGTON,DC,US ISSN:1554−8929,DOI:10.1021/CB7001126、HEINIS CHRISTIAN ET AL:“Phage−encoded combinatorial chemical libraries based on bicyclic peptides”NATURE CHEMICAL BIOLOGY,vol.5,no.7,July 2009(2009−07),pages 502−507,XP007913181に記載されるように、環状ペプチド、例えば、多環ペプチド、例えば、二環状ペプチドであり得る。例えば、WO2009/098450も参照されたい。必要とされる結合特性を有する二環状ペプチドは、例えば、ファージ提示法によって選択され得る。

0030

中和するとは、今までに感染していない細胞を感染させるウイルスの能力を低減させることを意味する。

0031

当業者は、化合物の能力を中和するウイルスを観察するために適当な技術を十分承知しているであろう。かかる方法の一例は、WO2016/012800の実施例3に詳述されており、1種以上の血清型のデングウイルスが潜在性のある宿主細胞集団を感染させることができ、アッセイ下での化合物をウイルスと混合させ、次いで、混合物を潜在性のある宿主細胞でインキュベートする。化合物の中和能力、すなわち、感染を予防する化合物の能力の基準を得る、感染した細胞数がアッセイされる。ある特定の例では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分を中和する可能性は、感染した病巣の数の低減が対照(化合物なし)と比較する場合に、フォーカス低減中和試験(FRNT)を用いて判定され得る(Dejnirattisai et al 2010 Cross−reacting antibodies enhance dengue virusinfection in humans.Science 328:745−748)。簡潔に言えば、本化合物をウイルスと混合し、37℃で1時間インキュベートする。次いで、混合物をベロ細胞アフリカミドリザルからの腎臓上皮細胞株)に移し、3日間インキュベートする。フォーカス形成アッセイは、抗E mAb(4G2)を用いて行われ、続いて、HRP共役されたウサギ抗マウスIgGを用いて行うことができる。この反応は、DAB基質の添加によって可視化することができる。フォーカス低減の割合は、各化合物について計算される。50%のFRNT値は、SPSSパッケージからのプロビットプログラムを用いて、低減率対化合物の濃度のグラフから決定され得る。典型的には、このアッセイは、試験化合物の不在下で、例えば、コンフルエントな細胞、例えばちょうどコンフルエントな細胞を含む96ウェルプレートウェル中で約100の病巣が存在するように行われ得る。

0032

例えばフォーカス低減中和試験(FRNT)、プラーク低減中和試験(PRNT;WHO文書http://whqlibdoc.who.int/hq/2007/who_ivb_07.07_eng.pdfを参照;FRNT、フローサイトメトリーを用いた、マウスおよびサルなどのインビボでの技術のような、他のかかる例は、当業者には既知であろう。例えば、FRNTおよびフローサイトメトリー方法の例については、WO2016/012800の図30を参照されたい。本明細書の実施例も参照されたい。

0033

一実施形態では、本化合物は、ウイルスを少なくとも80%、好ましくは90%、より好ましくは95%、および最も好ましくは100%中和する。さらに好ましい実施形態では、本化合物は、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを中和し、任意に、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを80%または90%または98%または100%中和し、任意に、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを同じ濃度の抗体または断片で100%中和する。

0034

このウイルスは、昆虫細胞によってまたはヒト癌細胞株(典型的には、以下にさらに論じられるように、高いpr−M含有ウイルスを産生すると見なされる)において、またはあるいは、ヒト初代細胞、例えば初代ヒト樹状細胞において、またはフリンを過剰発現する細胞株(低pr−M含有ウイルスを作製すると見なされる)において産生され得る。

0035

本化合物は、1種以上の血清型のデングウイルスおよび/またはジカウイルスを0.5〜0.01μg/mlの濃度で80、90、98、または100%中和させ得る。本化合物は、すべての血清型のデングウイルスおよびジカウイルスを0.5〜0.01μg/mlの濃度で80、90、98、または100%中和させ得る。

0036

上掲のDai et al(2016)Cell Host&Microbe 19,1−9は、融合ループエピトープを標的としたmAb 2A10G6については、プラーク減少アッセイにおいて249μg/mlの50%プラーク減少中和力価(PRNT50)を報告している(図3Aならびに3頁および4頁にわたる一節)。

0037

特定のレベルまで中和するとは、所与の濃度の化合物に対して特定のレベルまで中和することを意味することを含む。所与の化合物の適切な濃度は、実際の化合物に応じて異なり得ることが理解されよう。例えば、上記のアッセイにおいて使用される、例えば、所与の化合物の濃度は、100mM、10mM、1mM、100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、もしくは1nM;0.01μg/ml、0.02μg/ml、0.04μg/ml、0.05μg/ml、0.06μg/ml、0.075μg/ml、0.1μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、0.75μg/ml、1μg/ml、1.25μg/ml、1.5μg/ml、1.75μg/ml、2μg/ml、2.25μg/ml、2.5μg/ml、2.75μg/ml、3μg/ml、3.25μg/ml、3.5μg/ml、3.75μg/ml、4μg/ml、4.25μg/ml、4.5μg/ml、4.75μg/ml、5μg/ml、5.25μg/ml、5.5μg/ml、5.75μg/ml、6μg/ml、6.5μg/ml、7μg/ml、7.5μg/ml、8μg/ml、8.5μg/ml、9μg/ml、9.5μg/ml、もしくは10μg/ml以下、または0.01μg/ml未満であり得る。典型的には、化合物、例えば抗体の濃度は、例えば、1μg/ml未満であり得る。

0038

例えば、化合物(例えば、抗体)は、0.1μg/mlの化合物濃度で1種以上の血清型のウイルスを80%中和させ得、1μg/mlの化合物濃度で1種以上の血清型のウイルスを少なくとも98%、例えば100%中和させ得る。本化合物(例えば抗体)は、0.05μg/mlの濃度で1種以上の血清型のウイルスを80%中和するか、または0.5μg/mlの濃度で1種以上の血清型のウイルスを少なくとも98%、例えば100%中和する。

0039

化合物の所与の濃度に対して観察された中和のレベルがアッセイにおけるウイルス粒子の数によって異なり得ることも理解されよう。例えば、化合物の所与の濃度については、アッセイにおけるウイルス粒子の数が2倍である場合、中和のレベルは、(所与の宿主細胞集団に対して)低減し得ることが予測され得る。アッセイにおけるウイルス粒子の数は、典型的には、試験化合物の不在下で、例えば、96ウェルマイクロタイタープレートウェル中で、例えばコンフルエントな細胞、例えばちょうどコンフルエントな細胞を用いておよそ100フォーカスを提供するようなものであろう。

0040

例えば、一実施形態では、本化合物は、ウイルス濃度が、試験化合物の不在下で、例えば、96ウェルマイクロタイタープレートウェル中で、例えばコンフルエントな細胞、例えばちょうどコンフルエントな細胞を用いておよそ100フォーカスを提供するのに十分である場合に、1μg/mlまたは0.05ug/mlもしくはそれ以下の濃度で1種以上の血清型のウイルスを少なくとも80%のレベルまで、または100%のレベルまで中和する。

0041

ウイルスによって感染され得るアッセイにおける細胞の数はまた、見かけレベルの中和反応を影響し得る。例えば、少数の細胞は、大きな細胞集団よりも1細胞当たり表される、より大きな感染率を示し得る。したがって、化合物、ウイルス、および宿主細胞数の比率はまた、重要であり得る。アッセイにおいて使用される細胞は、コンフルエントであり得る。アッセイは、マイクロタイターウェルプレート中で、例えば96ウェルマイクロタイタープレート中で行われ得る。細胞は、マイクロタイタープレートウェル中で、例えば96ウェルマイクロタイタープレートウェル中で、容器中でコンフルエント、例えば、ちょうどコンフルエントであり得る。

0042

好ましくは、本化合物は、昆虫細胞、例えばC6/36昆虫細胞、またはヒト腫瘍細胞株(典型的には、高いpr−M含有ウイルスを産生し得る)およびヒト細胞、例えば初代ヒト細胞、例えば初代ヒト樹状細胞、またはフリンを過剰発現する細胞(低いpr−M含有ウイルスを作製すると見なされる)の両方において作られるウイルスを中和することができる。異なる細胞型におけるウイルス粒子、サブウイルス粒子、またはウイルス様粒子の産生は、当業者に周知であろう。例えば、ウイルスを中和する化合物の能力は、上述のように、および実施例において試験することができる。一実施形態では、化合物は、初代ヒト細胞、例えば初代ヒト樹状細胞、または昆虫細胞で作られるウイルスを中和することができる。別の実施形態では、本化合物は、初代ヒト細胞および昆虫細胞で作られるウイルスを同じレベルまで中和することができる。同じレベルまでとは、所与の濃度の化合物および/または所与の濃度のウイルスおよび/または所与の数の潜在性のある宿主細胞については、本化合物に起因する中和反応のレベルは、昆虫細胞および初代ヒト細胞の両方で作られるウイルスにとっては有意に異ならないか、または本化合物に起因する中和反応のレベルは、昆虫細胞および初代ヒト細胞の両方からのウイルスにおいて、特定の閾値を超える、例えば80%超、90%、95%、または98%の中和反応であるという意味を含む。例えば、所与の濃度のウイルス粒子、および所与の数の潜在性のある宿主細胞については、50%FRNTは、昆虫細胞および初代ヒト細胞で作られたウイルスについては同じであり(有意に異ならない)、例えば、0.05μg/ml以下、または0.5μg/ml以下、または1μg/ml以下、または5μg/ml以下である。好ましい実施形態では、本化合物は、初代ヒト細胞および昆虫細胞で作られた、好ましくは2種の血清型、好ましくは3種の血清型、より好ましくは4種の血清型、またはすべての血清型、1種を超える血清型のジカおよびデングウイルスを中和することができる。最も好ましい実施形態では、本化合物は、昆虫細胞および初代ヒト細胞の両方で作られたすべての血清型のジカおよびデングウイルスを完全に(すなわち100%)中和することができる。例えば、本化合物は、上で論じられるように、0.05μg/mlの化合物濃度で約100フォーカスを得るのに十分なウイルス濃度で初代ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られるウイルスを100%中和することができる。初代ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られるとは、初代ヒト細胞(例えば)中で独立して作られるウイルス、同じ手順で、初代ヒト細胞および昆虫細胞の両方を用いて産生されているウイルス粒子の特定の集団よりも昆虫細胞中で独立して作られるウイルスを意味することを含む。

0043

本発明において使用される交差反応性のある高度に中和する化合物は、ウイルス形成を独立して、エンベロープタンパク質の無傷ウイルスおよび二量体の両方において見出され得る特定のエピトープに結合することが見出された。それ故に、本発明の使用のための化合物は、この特定のエピトープに結合するそれらの能力に関して定義され得る。

0044

エンベロープ二量体エピトープ(EDE)に結合する化合物とは、1種以上の血清型のフラビウイルス(例えば、ジカまたはデングウイルス)のEDEに結合することができる任意の化合物を意味する。本化合物は、小分子、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂肪、原子、例えば金属であり得る。好ましい実施形態では、本化合物は、ポリペプチド、好ましくは抗体またはその抗原結合部分である。本化合物についての選好は、前述されたとおりである。

0045

4種の血清型のデングウイルス、ならびに他のフラビウイルス、例えば当業者に周知のまたは図1に示し、実施例1、2、および3で論じたようなジカウイルスなどがある。それ故に、本化合物が、1種の血清型のフラビウイルス、例えば、ジカウイルスまたはデングウイルスのEDEに結合し得ることが理解されよう。好ましい実施形態では、本化合物は、1種を超える血清型のフラビウイルス、例えば、1種を超える血清型のデングウイルスまたはジカウイルスのEDEに結合し、上記の、ジカウイルスおよび/または1種、2種の血清型のデングウイルス、または3種の血清型のデングウイルス、または4種の血清型のデングウイルスに結合する、すなわち、すべての血清型のデングウイルスであると見なされるであろう。

0046

「結合する」とは、本発明の使用のための化合物とエピトープまたは分子または巨大分子または化合物との間の任意の形態の非共有結合の意味を含み、当該技術分野で通常の方法により評価される、EDEへの結合のあらゆる有意な度合いの意味を含む。好ましい実施形態では、本化合物は、EDEに選択的に結合する。EDEに選択的に結合するとは、本化合物がEDE以外のフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルスまたはエンベロープタンパク質に結合しない、またはそれらに有意に結合しないという意味を含む。また、本化合物が、EDEを提示するもの以外の別の化合物または分子または巨大分子に結合しない、またはそれらに有意に結合しないという意味も含む。本化合物がEDEに結合するかどうかを決定することは、十分に当業者の技量内にあるであろう。例えば、当業者に周知であるような、ELISAタイプのアッセイを使用してもよい。本化合物がEDEと結合するかどうか判定するための方法のある非限定的な例は、デングウイルスのうちの1つ以上、好ましくはすべての血清型のフラビウイルス、例えばジコもしくはデングウイルスの無傷ウイルス、および/またはデングウイルスのうちの1つ以上、好ましくはすべての血清型のフラビウイルス、例えばジコもしくはデングウイルスのエンベロープ二量体、および/または本明細書に記載の定義のうちのいずれかに従うEDE、例えば安定化エンベロープ二量体、または異種骨格内に保持されるエンベロープタンパク質からの残基を含むEDEであり、物の非感染の上清は、固体支持体、例えば、抗E Ab(4G2)でコーティングしたMAXISORP免疫プレート(NUNC)上に別々に捕捉される。次いで、捕捉ウェルを、本化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分、例えば、ヒトモノクローナル抗体、例えば、1ug/mlのヒトmAbでインキュベートし、続いて、レポーターに共役した二次抗体(化合物に結合する)、例えばALP共役抗ヒトIgGでインキュベートする。この反応を、例えば、適切な基質、例えばPNPP基質の添加によって可視化し、NaOHで停止する。ALP/PNPPについては、吸光度は、405nmで測定する。

0047

EDEに結合する化合物とは、感染していない上清を含むウェルに結合する背景のレベルを上回る任意の度合いまで、ウイルスまたはEDE、例えば安定化した可溶性タンパク質E二量体を含むウェルに結合する任意の化合物の意味を含む。好ましくは、ウイルスまたはEDEに得られる結合レベル、例えば安定化された可溶性タンパク質E二量体は、感染していない上清ウェルに結合する背景のレベルの2倍、好ましくは4倍、好ましくは6倍、より好ましくは10倍である。この化合物がEDE以外の部位でウイルスまたはエンベロープタンパク質に結合するかどうか判定するために、変性または単量体または組換えエンベロープタンパク質に結合する化合物の能力を評価してもよい。この化合物が有意なレベルまで変性または単量体または組換えエンベロープタンパク質に結合する場合、EDE以外の部位でウイルスまたはエンベロープタンパク質に結合すると見なされる。この化合物が任意の他の分子または巨大分子または化合物以外のEDEに選択的に結合するかどうかを判定するために、EDEに結合する化合物の能力は、上述の方法を用いて、分子または巨大分子または化合物に結合する化合物の能力と比較することができる。化合物は、別の分子または巨大分子または化合物、例えば、変性または単量体エンベロープタンパク質に結合するよりも有意に広い範囲までEDEに結合する場合、例えば、この化合物が別の分子、巨大分子、または化合物、例えば、変性または単量体または組換えエンベロープタンパク質に結合するよりも少なくとも2倍、4倍、6倍、8倍、または10倍大きな親和性を有するEDEに結合する場合、EDEに選択的に結合する。

0048

EDEは、エンベロープタンパク質の二量体に広がる無傷ウイルス粒子上、または2つのポリペプチドに広がるエンベロープタンパク質の遊離二量体、例えば可溶性エンベロープタンパク質の遊離二量体上に形成されると見なされるエピトープである。エンベロープタンパク質配列は、図29中、ならびにWO2016/012800の配列番号29、31、33、および35に詳述されており、例えば、以下の「配列」の節にも論じられている。

0049

好ましい実施形態では、本発明の化合物は、無傷ウイルスまたは遊離エンベロープ二量体(すなわち、エンベロープポリペプチド単量体の2倍の分子量を有する)、または上述および以下にさらに論じられるようなEDEを提供する他の構造上のいずれかでEDEに結合し、単量体エンベロープタンパク質または変性エンベロープタンパク質に結合しない。一実施形態では、本化合物が単量体エンベロープタンパク質または変性エンベロープタンパク質に結合する場合、それは有用な化合物と見なされず、本発明の使用のための化合物ではない。したがって、化合物が本発明のこの実施形態の使用のための化合物であるかどうかを特定する1つの非限定的な方法は、例えば、ウエスタンブロットでは変形エンベロープタンパク質、および/または、例えばELISAでは組換え(単量体)エンベロープタンパク質、ならびに例えばELISAでは無傷ウイルス粒子、および/または、エンベロープタンパク質の二量体(例えば可溶性エンベロープタンパク質の二量体)に結合するその能力について、例えば、化合物、例えば抗体またはその抗原結合部分をアッセイすることによるものである。本発明の使用のための好ましい化合物は、無傷ウイルスまたは非変性二量体に結合すると見なされるが、変性または単量体エンベロープタンパク質に結合しない(または有意により少ない程度に)と見なされる。結合の度合いは、上述のように評価され得る。

0050

融合ループに結合するが、EDEに結合しない化合物は、本発明の使用のための化合物であると見なされない。融合ループは、上述のまたは古典的な融合ループエピトープ(FL)を定義する(デング)101Wの内外の制限的な残基セットである。融合ループでは、残基101−WGNG−104は、二量体界面の向かいにあるドメインIIIに向かってW101側鎖を突出する歪んだαらせん回転を作る。化合物がエンベロープ単量体または変性エンベロープタンパク質に結合する場合(例えば、上記のように決定される)、融合ループに結合すると考えられ得るが、代わりに抗体がエンベロープポリペプチドの異なる部分に結合し得る(融合ループ領域において変異したエンベロープポリペプチドに結合することによって確認することができる)。

0051

別の実施形態では、融合ループに結合する化合物は、エンベロープタンパク質における以下の残基、特に、DENV−1:E49、Q77、I161、T200、W391、またはF392のうちの任意の1つ以上で変異によって影響を受けない(または有意に影響を受けない)ものである。

0052

一実施形態では、融合ループに結合する化合物は、上記のDaiら(2016)、例えば、図4を参照して、表題「Complex structure of E protein with 2A10G6 Antibody」の節の4頁に記載される、融合ループおよびbcループを介して垂直な角度で、フィンガー様ドメインIIの先端に結合するものであり得る。

0053

いくつかの実施形態では、本発明の使用のための化合物は、変性EDEまたは変性エンベロープタンパク質に結合しない。

0054

一実施形態では、EDEは、フラビウイルス、例えば、ジカおよび/またはデングウイルスのポリペプチド、エンベロープポリペプチド二量体、例えば可溶性エンベロープポリペプチド二量体に広がると見なされる。特定の実施形態では、EDEは、エンベロープポリペプチド二量体のドメインI、II、およびIIIの領域を含む。EDEが、1種以上の血清型のフラビウイルス、例えば、1種以上の血清型のジカおよび/またはデングウイルスのエンベロープタンパク質の二量体界面で四次構造依存性のエピトープを含むことが理解されよう。

0055

異なるフラビウイルス、例えば、ジカおよび/またはデング血清型からのエンベロープタンパク質がハイブリッド二量体を形成する、二量化し得ることが理解されよう。一実施形態では、本化合物が結合するEDEは、異なるフラビウイルス、例えばジカおよび/またはデング血清型由来のエンベロープ単量体で作られ、したがって、EDEは、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含み得る。

0056

エンベロープタンパク質の二量体が無傷ビリオンまたはウイルス様粒子に見出されるように、EDEが、ビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子の一部として化合物に提示され得ることも理解されよう。EDEがビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子の一部として提示される場合に、本発明の化合物は、無傷ビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子に結合するが、単量体または変性エンベロープタンパク質に結合しないものである。

0057

あるいは、EDEは、ビリオンの一部としてではない化合物に提示され得、例えば、2つのエンベロープタンパク質の二量体から形成されるEDEは、遊離二量体として、または、例えば実施例3でさらに論じるように、ナノ粒子、例えば自己組織化ナノ粒子の形態で化合物に提示され得る。それ故に、一実施形態では、本発明の化合物は、EDEがエンベロープまたは可溶性エンベロープ(sE)タンパク質の遊離二量体で、または、例えば実施例3でさらに論じるように、ナノ粒子、例えば自己組織化ナノ粒子の形態である場合に、EDEに結合する化合物である。別の実施形態では、本発明の化合物は、EDEがエンベロープまたはsEタンパク質の安定化された二量体である場合に、EDEに結合する化合物であり、これもまた、例えば実施例3でさらに論じるように、ナノ粒子、例えば自己組織化ナノ粒子の形態であってもよい。

0058

あまり好ましくない実施形態では、遊離二量体は、タンパク質の二量化を安定化させる要素を含む組成物の一部として提示され得る。例えば、タンパク質会合を促進すると見なされる特定の緩衝液成分を、使用してもよい。あるいは、エンベロープタンパク質は、二量体形成を促進する高濃度で提示され得る(WO2016/012800の実施例7を参照のこと)。

0059

より好ましい実施形態では、エンベロープタンパク質は、二量体構成において安定性が増大するように操作され得る。例えば、二量体は、
−2つのエンベロープまたはsE単量体間で少なくとも1つ、任意に、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10もしくはそれ以上のジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化され得る、ならびに/または
−2つのsE単量体間で少なくとも1つ、任意に、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10もしくはそれ以上のスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化され得る、ならびに/または
−各単量体の二量体界面またはドメイン1(D1)/ドメイン3(D3)リンカーにおいて、少なくとも1つのエンベロープまたはsE単量体のアミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基を、少なくとも1つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって非共有結合的に安定化され得る、ならびに/または
改変糖類を介して2つのエンベロープまたはsE単量体を連結することによって共有結合的に安定化され得る。

0060

フラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルス、エンベロープ糖タンパク質E細胞外ドメイン(sE;可溶性エンベロープポリペプチド/糖タンパク質)は、例えば、実施例2 ED図7に示すように、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルスの血清型1、2、および4のエンベロープ糖タンパク質Eの1〜395のアミノ酸断片、デングウイルスの血清型3のエンベロープ糖タンパク質Eの1〜393のアミノ酸断片、およびジカウイルスのエンベロープ糖タンパク質Eの1〜404のアミノ酸断片を指す。

0061

本化合物は、EDEに結合し、このEDEはsEの安定化二量体であり、組換えフラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルスエンベロープ糖タンパク質E細胞外ドメイン(組換えsE)単量体は、WO2016/012800の、配列番号132のDENV−1 sE、配列番号133のDENV−2 sE、配列番号134のDENV−3 sE、配列番号135のDENV−4 sE、ならびにH27F、H27W、L107C、F108C、H244F、H244W、S255C、A259C、T/S262C、T/A265C、L278F、L292F、L294N、A313C(DENV−3ではS313C)、およびT315Cに対応する残基の中から選択される少なくとも1つの変異(置換)を有するその突然変異体sEからなる群から選択される。これらの変異は、下述のように、二量体配置において増加した安定性に寄与すると見なされる。

0062

特定の残基に対応する残基の概念は、当業者に周知であり、例えば、当業者によく知られているように、配列アラインメントを考慮して容易に判定することができることが理解されよう。

0063

任意に、その当該変異体sEは、さらに、Q227N、E174NおよびD329Nの中から選択される少なくとも1つの変異(置換)、好ましくは3つの変異Q227N、E174N、およびD329Nを有する。これらの変異は、適切でない免疫原性領域を覆い、対象において、本発明の安定化組換えsE二量体が、複数のフラビウイルスの血清型、例えば、ジカウイルスおよび1つ以上、例えば、4種すべてのデングウイルス血清型を対象とする中和抗体を優先的に引き起こすことが可能であると見なされる。

0064

有用なものと考えられる変異(例えば、ジカsEの番号付けを指摘する)およびそれらの論理根拠については、以下の突然変異の節でさらに論じる。

0065

さらなる実施形態では、化合物はEDEに結合し、EDEは、特許請求の範囲に記載される使用のためにEDEを対象とする特許請求の範囲に記載されているとおりである。

0066

したがって、例えば、組換えsE単量体は、ジカウイルス(ZIKV、KJ776791、H−PF−2013_French_Polynesia株)配列番号1;デングウイルス血清型1(DENV−1、NC_001477)配列番号2;デングウイルス血清型2(DENV−2、NC_001474)配列番号3;デングウイルス血清型3(DENV−3、NC_001475)配列番号4;デングウイルス血清型4(DENV−4、NC_002640)配列番号5;他のフラビウイルス:セントルイス脳炎ウイルスSLEV、NC_007580)配列番号6;日本脳炎ウイルス(JEV、NC_001437、配列番号7;マリーバレー脳炎ウイルス(MVEV、NC_000943)配列番号8;ウエストナイルウイルス(WNV、NC_001563)配列番号9;WO2016/012800の配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135;および表Mを含む変異の項に記載される変異#1〜#13の中から選択される少なくとも1つの突然変異を有する変異体sE;ならびに任意に、表Mを含む変異の節に記載される変異#14〜#18の中から選択される少なくとも1つの変異、からなる群から選択され得る。

0067

変異を誘発するsE二量体の上述の変異誘発は、架橋によって安定化を提供するための二量体の接触でのシステイン変異を含む、その免疫原性を妨げないが、より高い二量体親和性を提供する変異を導入する、かつ/あるいはクリック化学によって、および/または二量体を安定化するために、各単量体の二量体界面もしくはドメイン1(D1)/ドメイン3(D3)リンカーにおいて、空洞を充填するために、少なくとも1つのsE単量体のアミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基を、少なくとも1つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって、二量体における隣接糖類間での化学的架橋を可能にする新しいグリコシル化部位を導入する。

0068

特に特定されない限り、このアミノ酸残基位置は、WO2016/012800の図15中に示されるsEアミノ酸配列アライメントに従って番号付けされる。DENV−2の場合、番号付けは、配列番号3に示されるとおり、および/または以下の配列の節に記載される実施例2のED図7に示されるとおりであり得る。ZIKVの場合、番号付けは、以下の配列の節で論じられるように、および/または実施例2のED図7に示されるように、配列番号1に示されるとおりであり得る。何らかの疑いがある場合には、図面および実施例をさらに参照することによって、言及されたあらゆる残基の同一性を解決することができると考えられる。

0069

WO2016/012800の、配列番号132のDENV−1 sE、配列番号133のDENV−2 sE、配列番号134のDENV−3 sE、配列番号135のDENV−4 sEをコードする核酸配列はそれぞれ、WO2016/012800において配列番号136、137、138、および139として表される。

0070

明細書中で使用される場合、「組換え」という用語は、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルスエンベロープ糖タンパク質E細胞外ドメイン、本発明の使用のためまたはそれに関連する抗体または抗体断片を産生するための遺伝子操作方法(クローニング増幅)の使用を指す。

0071

二量体は、上に定義される2つの同一の組換えsEのホモ二量体、または上に定義される2つの異なる組換えsEのヘテロ二量体であり得、この二量体は、好ましくはホモ二量体である。二量体は、例えば、ZIKV組換え変異型sEの二量体であってもよい。

0072

さらなる例として、それは、上に定義されるDENV−1 sEおよびDENV−2 sEのヘテロ二量体であり得る。これは、DENV−1 sEと、上に定義されるDENV−1 sEの変異体sEとのヘテロ二量体であり得る。

0073

一実施形態では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、EDEに結合し、EDEはsEの安定化二量体であり、エンベロープまたは組換えsEの安定化二量体は、2つのsE単量体間で少なくとも1つ、2つ、または3つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化される。

0074

有利には、当該安定化二量体は、単一鎖間ジスルフィド結合をもたらす、二量体の2倍の分子軸によって位置付けられる単一のシステイン変異体sE、または2倍の分子軸から離れて複数の(例えば、2つの)ジスルフィド結合を作製し得る複数の(例えば、二重の)システイン変異体sEを含む。当該ジスルフィド結合は、酸性条件下で、例えば、DMSO溶液(O.Khakshoorら、2009)を用いてまたはCdCl2もしくはCuSO4などの酸化剤を用いて合成され得る。したがって、当該安定化二量体は、二量体の(ほぼ)2倍の分子軸によって各単量体の一方のアミノ酸残基がシステインで置換される、単量体からなり得る。当該安定化二量体はまた、二量体の2倍の分子軸から離れた各単量体の2つのアミノ酸残基がシステインで置換される、単量体からもなり得る。当該安定化二量体はまた、二量体の2倍の分子軸から離れた各単量体の3つのアミノ酸残基がシステインで置換される、単量体からもなり得る。

0075

かかる配置が、FLE領域への接近を制限し得、そのために、WO2016/012800の実施例17、および下の「突然変異」の節においてさらに論じられるように、抗FLE反応を作り出す分子の能力を低減するように、1つを超える鎖間ジスルフィド結合があり得ることが望ましいものであり得る。

0076

別の実施形態では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、EDEに結合し、EDEは、sEの安定化二量体であり、エンベロープまたは組換えsEの安定化二量体は、上に定義される変異A259CまたはS255Cをそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体であり、残基259Cまたは255Cはジスルフィド鎖間結合を介して一緒に連結されている。

0077

別の実施形態では、EDEが組換えsEの安定化二量体を含む場合に、安定化組換えsE二量体は、上に定義される変異A259Cを有する変異体sEと、上に定義される変異S255Cを有する変異体sEとのヘテロ二量体であり、残基259Cおよび255Cは、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に連結されている。

0078

別の実施形態では、EDEが組換えsEの安定化二量体を含む場合に、安定化組換えsE二量体は、上に定義される変異F108CおよびT315Cをそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体、または上に定義される変異L107CおよびA313Cをそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体であり、残基108Cおよび315C、または残基107Cおよび313Cは、ジスルフィド鎖間結合を介して一緒に連結されている。

0079

一実施形態では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、EDEに結合し、EDEは、sEの安定化二量体であり、エンベロープまたは組換えsEの安定化二量体は、上に定義される変異F108CおよびA313Cを有する変異体sEと、上に定義される変異L107CおよびT315Cを有する変異体sEとのヘテロ二量体であり、残基108Cおよび313Cは、2つのsE単量体間でジスルフィド鎖間結合を介して残基315Cおよび107Cにそれぞれ連結されている。

0080

別の実施形態では、EDEが組換えsEの安定化二量体を含む場合に、安定化組換えsE二量体は、上に定義される、変異A259C、F108C、およびT315Cをそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体、変異S255C、F108C、およびT315Cをそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体、変異A259C、L107C、およびA313Cをそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体、ならびに変異A255C、L107C、およびA313Cをそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体を含み、残基259C、255C、108C、315C、107C、および313Cは、ジスルフィド鎖間結合を介して残基259C、255C、315C、108C、313C、および107Cにそれぞれ連結されている。

0081

別の実施形態では、化合物、例えば抗体またはその抗原結合断片は、EDEに結合し、EDEは、組換えsEの安定化二量体を含み、安定化組換えsE二量体は、上に定義される変異A259C、F108C、およびT315Cを有する変異体sEと、上に定義される変異S255C、F108C、およびT315Cを有する変異体sEとのヘテロ二量体であり、残基259C、108C、および315Cは、ジスルフィド鎖間結合を介して残基255C、315C、および108Cにそれぞれ連結されている。

0082

別の実施形態では、EDEが組換えsEの安定化二量体を含む場合に、安定化組換えsE二量体は、上に定義される変異S255C、L107C、およびA313Cを有する変異体sEと、上に定義される変異A259C、L107C、およびA313Cを有する変異体sEとのヘテロ二量体であり、残基255C、107C、および313Cは、ジスルフィド鎖間結合を介して残基259C、313C、および107Cにそれぞれ連結されている。

0083

安定化組換えsE二量体に関する実施形態のさらなる例については、例えば、変異体sEがジカウイルスsE配列に基づく場合、以下の変異の節、および特許請求の範囲に記載の使用のためのEDEに関連する特許請求の範囲を参照のこと。

0084

ジスルフィド結合による安定化と同様に、安定化はまた、スルフヒドリル反応性架橋剤によっても達成され得ることを理解されよう。それ故に、一実施形態では、EDEは、組換えsEの安定化二量体を含み、安定化組換えsE二量体は、sE単量体間で少なくとも1つ、2つ、または3つのスルフヒドリル反応性架橋剤(チオール反応性架橋剤とも呼ばれる)によって共有結合的に安定化される。

0085

タンパク質の化学的架橋は、当該技術分野で周知である(概要については、Hemaprabha,(2012)Journal of Pharmaceutical and Scientific Innovation 1,22−26を参照のこと)。

0086

当然ながら、sE二量体は、2つの異なる面を有し、一方は、抗体が結合する細胞外培地曝露され、他方は、ウイルス膜に曝露される。

0087

有利には、当該安定化組換えsE二量体は、ウイルス膜に曝露されるsEの面に存在する候補アミノ酸残基を含み、それ故に、エピトープの部分ではない。各単量体の各候補アミノ酸残基の一方は、システインに変異(置換)され、適切な長さのスルフヒドリル反応性架橋剤の標的物である遊離スルフヒドリル基を産生する。

0088

Thr/Ser262およびThr/Ala265は、候補残基である。二量体の文脈においてそれらの間の距離は、それぞれ、12Åおよび22Åである。さらに、これらの残基(Thr/Ser262、Thr/Ala265)は、完全には保存されない。故に、それらは、点突然変異耐性があり得る。

0089

好ましい実施形態では、本化合物は、EDEに結合し、EDEは、組換えsEの安定化二量体を含み、安定化組換えsE二量体は、上に定義される変異T/S262CまたはT/A265Cをそれぞれ有する変異体sEのホモ二量体であり、残基262Cまたは265Cは、スルフヒドリル反応性架橋剤によって一緒に連結されている。

0090

別の好ましい実施形態では、EDEが組換えsEの安定化二量体を含む場合、安定化組換えsE二量体は、上に定義される変異T/S262Cを有する変異体sEと、上に定義される変異T/A265Cを有する変異体sEとのヘテロ二量体であり、残基262Cおよび265Cは、スルフヒドリル反応性架橋剤を介して一緒に連結されている。

0091

エピトープの一部であると見なされず、架橋され得る組換えsEの領域は、sEの残基1〜9からなる領域A、sEの残基25〜30からなる領域B、sEの残基238〜282からなる領域C、sEの残基96〜111からなる領域D、およびsEの残基311〜318からなる領域Eである。単量体のこれらの5つの領域(A〜E)の残基のうちのいずれかは、組換えsE二量体において他の単量体の他の残基の25〜30Å未満であり、それ故に、これらの残基は架橋され得る。

0092

有利には、各単量体のこれらの5つの領域における候補アミノ酸残基のうちの1つまたはいくつかは、システインに変異(置換)され、上に定義される適切な長さのスルフヒドリル反応性架橋剤の標的物である遊離スルフヒドリル基を産生する。

0093

別の実施形態では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、EDEに結合し、EDEは、組換えsEの安定化二量体を含み、安定化組換えsE二量体は、変異体sEのホモ二量体、またはsEのアミノ酸残基1〜9、25〜30、238〜282、96〜111、311〜318のうちの少なくとも1つが、システインに変異(置換)される変異体sEと、sEのアミノ酸残基1〜9、25〜30、238〜282、96〜111、311〜318のうちの少なくとも1つが、システインに変異(置換)される変異体sEとのヘテロ二量体であり、変異されたシステイン残基は、スルフヒドリル反応性架橋剤を介して一緒に連結されている。

0094

スルフヒドリル反応性架橋剤は、好ましくは、同一または非同一の反応基を含むホモ二官能性試薬であり、2つの単量体間での分子間架橋構築を可能にする。ホモ二官能性架橋剤は、スペーサーアームのいずれかの末端で同一の反応基を有し、一般に、それらは、1ステップの反応手順において使用され得る。本発明のスルフヒドリル反応性架橋剤は、マレイミドハロアセチル(好ましくは、ブロモ−またはヨード−アセチル)、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホンハロゲン化アルキル、またはアジリジン化合物アクリロイル誘導体アリール化剤、またはチオール−ジスルフィド交換試薬(Hermanson G.T.,Bioconjugate Techniques,3rd Edition.Academic Press(2013)、Hemaprabha,2012)、例えばビスメタンチオスフホネート)(Haberz P.et al.,Organic Letters,2006,8,1275−1278)であり得る。

0095

異なる長さのスペーサーを有する、本発明に従うマレイミドホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤の例としては、BMOE(1,2−ビス−マレイミドエタン)、BMB(1,4−ビス−マレイミドブタン)、BMH(1,6−ビス−マレイミドヘキサン)、TMEAトリス−(2−マレイミドエチルアミン)、BM(PEG)2(1,8−ビスマレイミドジエチレングリコール)、BM(PEG)3(1,11−ビスマレイミドトリエチレングリコール)、BMDB(1,4−ビスマレイミジル−2,3−ジヒドロキシブタン)、DTME(ジチオ−ビス−マレイミドエタン)、ならびに好ましくはBMH、BM(PEG)2、およびBM(PEG)3が挙げられる。

0096

スルフヒドリル基と特異的に反応するマレイミド基は、架橋反応による構造シフトの程度を最小にするために、穏やかな緩衝液およびpH条件下で実施される。好ましくは、反応混合物のpHは6.5〜7.5であり、可逆的ではない安定なチオ−エーテル結合が形成される(この結合は、還元剤で切断され得ない)。

0097

ジスルフィド結合およびスルフヒドリル反応性架橋剤を介した安定化に加えて、安定化は、改変糖類による2つの単量体の結合によって得られ得ることが理解されよう。この目的を達成するために、グリコシル化部位は、それらに挿入され、クリック化学によってそれらを連結するために、改変糖類と反応させる。

0098

この実施形態に従って、本化合物は、EDEに結合し、EDEは、組換えsEの安定化二量体を含み、安定化組換えsE二量体は、変異体sEのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、
−一方のsE単量体が、グリコシル化部位を導入する少なくとも1つの変異を有し、変異したアミノ酸残基が、X官能基を担持する改変糖でグリコシル化され、
−他方のsE単量体が、グリコシル化部位を導入する少なくとも1つの変異を有し、変異したアミノ酸残基が、Y官能基を担持する改変糖でグリコシル化され、
両方の変異した残基が、具体的にはクリック化学によって、第1のsE単量体の糖のX官能基を他方のsE単量体の糖のY官能基と反応させることによって、改変糖類を介して一緒に結合している。

0099

X官能基とは、Y官能基と反応し、クリック化学によって共有結合を形成することができる糖によって運ばれる化学基を意味し、当該Y官能基は、好ましくはアジド官能基である。

0100

Y官能基とは、X官能基と反応し、クリック化学によって共有結合を形成することができる糖によって運ばれる化学基を意味し、当該X官能基は、好ましくは末端アルキン官能基である。

0101

改変糖類は、Laughlinら、2007によって記載されるように、sE単量体において合成され、導入され、Speerら、2003によって記載されるように、一緒に結合され得る。

0102

二量体を安定化させる上述の共有結合方法に加えて、非共有結合手段もまた使用してもよい。それ故に、EDEが組換えsEの安定化二量体を含む別の実施形態では、この二量体は、二量体界面で当該二量体の空洞を充填させることによって、1つまたは2つの単量体、好ましくは2つの単量体のアミノ酸配列において少なくとも1つのアミノ酸を、かさ高い側鎖アミノ酸と置換することによって非共有結合的に安定化される。この実施形態に従って、組換えsE二量体の四元立体構造特有の空洞は、単量体において操作された疎水性置換によって特定され、充填される。

0103

この実施形態に従って、安定化組換えsE二量体は、二量体界面でまたは各単量体のドメイン1(D1)/ドメイン3(D3)リンカーにおいて、空洞を形成する領域内で、少なくとも1つのsE単量体のアミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基を、少なくとも1つのかさ高い側鎖アミノ酸と置換することによって非共有結合的に安定化される。かかる置換は、2つのsE単量体間での疎水性相互作用を増加させることができる。

0104

EDEが組換えsEの安定化された二量体を含む実施形態では、安定化組換えsE二量体は、上に定義される2つの組換えsEのホモ二量体またはヘテロ二量体、好ましくはホモ二量体であり、組換えsEのうちの1つまたは2つの組換えsEが、H27F、H27W、H244F、H244W、およびL278Fからなる群から選択される少なくとも1つの変異(置換)を有する。変異H27F、H27W、H244F、H244W、およびL278Fは、組換えsE二量体のF279周辺の空洞を安定化させ、二量体界面を強化し、ビリオン中のF279の立体構造を模倣することを可能にする。

0105

二量体を非共有結合的に安定化させる他の手段は、例えば、各単量体のドメイン1(D1)/ドメイン3(D3)リンカーにおいて、1つまたは2つの、好ましくは2つの単量体のアミノ酸配列中のアミノ酸を、少なくとも1つのかさ高い側鎖アミノ酸と置換することによる非共有結合性安定化を含む。

0106

好ましい実施形態では、本化合物は、EDEに結合し、上に定義される2つの組換えsEのホモ二量体またはヘテロ二量体、好ましくはホモ二量体であり、組換えsEのうちの1つまたは2つの組換えsEが、L292FおよびL294Nからなる群から選択される少なくとも1つの変異(置換)を有する。この変異L292F、L294Nは、sE二量体立体構造におけるD1−D3リンカーの安定化を可能にすると考えられる。

0107

さらなる実施形態、特にジカsE二量体安定化に関しては、特許請求の範囲および以下の変異の節に記載されている。

0108

EDEが操作によって二量体配置において安定化される好ましい実施形態では、上述のような操作は、二量体の全体の3D構造の変化をもたらさないか、または全体の3D構造を実質的に変化せず、天然の二量体における残基は、操作された二量体に空間的に対応する。天然二量体が操作された二量体に空間的に対応する場合、このことは、操作された二量体(またはその部分、例えば、EDEを特徴付ける際の特に重要な残基、例えば、WO2016/012800の表2中に示されるおよび/または以下にさらに論じられる残基に反映させること)の3Dモデルが天然二量体の3Dモデルに重ね合わされる場合に、天然二量体における骨格原子空間的位置を特徴付ける配位が、操作された二量体の類似した骨格原子を特徴付ける配位とは約10オングストローム未満異なることを意味する。骨格原子は、ペプチド骨格を形成するアミノ酸の骨格原子であるか、または3D折り畳みパターンは、すなわち、側鎖原子のいくつかまたはすべての位置が同様に有意に変化しない場合があるが、側鎖原子を含まない。3D構造は、VDEまたはEDEの免疫原性であるかどうかの鍵であり、したがって、好ましい実施形態では、操作は、減少した免疫原性を有する二量体をもたらさない。一実施形態では、操作は、異なる3D立体構造を有する二量体をもたらす。好ましくは、操作は、増加した免疫原性を有する二量体をもたらす。このようなアプローチは、Bommakanti et al 2010 PNAS 13701−13706で使用されている。それ故に、一実施形態では、本化合物は、上述のような操作されたEDEに結合する。

0109

天然二量体の3Dモデルは、例えば、上述の受入番号OAN、1OK8、1UZG、および3UAJの下で、タンパク質データバンクにおいて入手可能な、デングウイルス血清型、例えば、血清型2、3、および4からのエンベロープ糖タンパク質細胞外ドメインにおける結晶構造に関する情報を使用するために形成され得る。

0110

特定の突然変異または修飾が3D構造を変化させるまたは実質的に変化させるかどうかは、VDEに結合することが知られている本明細書に記載の抗体が操作されたバージョンのVDEに依然として結合することができるかどうかをモニタリングすることを含む、異なる技術によって評価され得る。

0111

当業者は、例えば、潜在的な安定化させる修飾の特定に役立つようなコンピュータプログラムを使用することができる

0112

EDEの免疫原性における操作の効果は、操作されたおよび操作されていないEDEを投与される場合に対象における抗体反応を比較することによって、または既知の抗EDE抗体への結合を比較することによって評価され得る。

0113

あるいは、改変されたエンベロープタンパク質は、デングウイルスまたはジカウイルスまたは他のフラビウイルスにおいて発現され、ウイルスを中和する化合物の能力が評価され得る。

0114

安定化したEDEを提示するために、それぞれのEDE(骨格タンパク質と称される)に類似の三次元構造を有する非EDE異種タンパク質は、改変タンパク質がEDEを保持することができる適切な残基を含有するように改変することができる。それ故に、一実施形態では、本化合物はEDEに結合し、このEDEは、エピトープ骨格タンパク質の一部として提示される。エピトープ骨格タンパク質は、異種の「受容体」骨格タンパク質に融合されるエピトープ配列を含むキメラタンパク質である。エピトープ骨格の設計は、例えば、エピトープが異種骨格タンパク質に融合される場合に、エピトープの天然構造および立体構造を保存する様式でコンピュータ的に行われる。かかる骨格タンパク質の使用は、当該技術分野で周知であり、かかる方法および技術は、WO2011/050168およびWO2016/012800、ならびに参考文献McLellan,J.S.et al.Structure−based design of a fusion glycoprotein vaccine for respiratory syncytial virus.Science 342,592−598,doi:10.1126/science.1f67283(2013)、Ofek et al 2010 PNAS 107:17880−17887、Burton 2010 PNAS 107:17859−17860に記載されており、当業者はそこに記載の方法に従い、それらを本発明に適用することができる。

0115

したがって、一実施形態では、EDEは、エピトープ骨格タンパク質の一部を含み、この骨格タンパク質は、エンベロープ二量体エピトープに共有結合している異種骨格タンパク質を含む。骨格タンパク質は、本化合物がタンパク質、任意に抗体またはその抗原結合部分である場合に、かかる残基と化合物の間、例えば化合物の接触残基間の相互作用を促進するために適切な空間的配向においてEDEの接触残基を保持するという点で、本発明のEDEを作製するのに有用である。接触残基は、別の分子のアミノ酸と直接または間接的に相互作用する(例えば、塩橋を通して直接的または間接的にイオン結合を形成する)分子に存在する任意のアミノ酸である。少なくともDENV−1において、EDEに結合する化合物において潜在的に重要であると見なされているエンベロープタンパク質の残基は、WO2016/012800の表2中に詳細されている。骨格タンパク質は、全二量体を示し得るか、または上の選択された残基のみ示し得る。天然二量体またはその一部の3Dモデルは、例えば、上述の受入番号1OAN、1OK8、1UZG、および3UAJの下で、タンパク質データバンクにおいて入手可能な、デングウイルス血清型、例えば、血清型2、3、および4からのエンベロープ糖タンパク質細胞外ドメインにおける結晶構造に関する情報を使用するために形成され得る。

0116

変異分析は、本発明の使用において特定される抗体への結合において重要であるDENV1およびDENV2の特定の残基を示した。これらの残基は、DENV1:E49、K64、Q77、W101、V122、N134、N153、T155、I161、A162、P169、T200、K202、E203、L308、K310、Q323、W391、F392;DENV2:Q77、W101、N153、T155、K310である。これらの残基のすべては、結合、およびQ77、W101、N153、T155、K310に重要であると見なされる。

0117

したがって、一実施形態では、化合物は、EDEに結合し、EDEは骨格タンパク質の一部であり、この骨格タンパク質は、DENV−2エンベロープタンパク質のE49、K64、Q77、W101、V122、N134、N153、T155、I161、A162、P169、T200、K202、E203、L308、K310、Q323、W391、F392のうちの1つ以上に対応する少なくとも残基、またはフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質、具体的にはDENV−1およびDENV−2に対して等価残基を保持する。ある特定の残基は、より重要であると見なされ、したがって、EDEのさらなる実施形態は、エンベロープタンパク質のQ77、W101、N153、T155、K310に対応する残基のうちの少なくとも1つ以上、またはフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質、具体的には、DENV−1およびDENV−2の等価残基を保持する骨格タンパク質を含む。

0118

デングウイルスにおけるエピトープに接触するのに重要であると見なされるエンベロープタンパク質の残基は、WO2016/012800の図31中に示され、例えば、WO2016/012800に論じられる。例えば、C10抗体は、残基R2、H27、G28、E44、L45、I46、K47、N67、T68、T69、T70、E71、S72、R73、C74、Q77、S81、L82、N83、E84、V97、R99、W101、G102、N103、G104、C105、G106、L113、T115、K246、K247、Q248、Q271、V309、K310、R323、Q325、D362でDENV2 EDEに接触すると見なされており、C10抗体は、残基R2、H27、G28、G29、E44、L45、T46、N67、T69、T70、A71、T72、R73、C74、Q77、V97、R99、W101、G102、N103、G104、C105、G106、V113、R247、Q248、D249、D271、M278、D309、K310、V324、K323、K325、T361、N362でDENV4 EDEに接触すると見なされており、C8抗体は、残基N67、T68、T69、T70、E71、S72、R73、C74、Q77、N83、E84、V97、D98、R99、W101、G102、N103、G104、C105、G106、L113、E148、H158、K246、K247、Q248、D249、I308、K310、E311、R323、D362、G374でDENV2 EDEに接触すると見なされている。

0119

したがって、化合物、具体的にはDENV2およびDENV4への結合において重要であると見なされているエンベロープタンパク質の残基は、K47、T68、S81、L82、N83、E84、T115、K246、K、V309、R2、H27、G28、G29、E44、L45、T46、N67、T69、T70、A71、T72、R73、C74、Q77、V97、R99、W101、G102、N103、G104、C105、G106、V113、R247、Q248、D249、D271、M278、D309、K310、V324、K323、K325、T361、N362、D98、E148、H158、K246、I308、E311、G374、またはフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基である。

0120

化合物、具体的にはDENV1または2またはジカウイルスへの結合において重要であると見なされている残基は、DENV−1もしくはDENV−2ポリペプチド配列の、E49、K64、Q77、W101、V122(DENV−1;K122 DENV−2)、N134、N153、T155、I161、A162(DENV−1;I162 DENV−2)、P169(DENV−1;S169 DENV−2)、T200(DENV−1;Q200 DENV−2)、K202(DENV−1;E202 DENV−2)、E203、L308(DENV−1;V308もしくはI308 DENV−2_、K310、Q323(DENV−1;R323 DENV−2)、W391、F392;ジカPF13のT49、S64、Q77、W101、S122、N134、N154、T156、K166 T205、N207、N208、F314、K316、E319、W400、H401;またはフラビウイルス、任意に、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基;ならびに/あるいは、ジカPF13のR2、M68、A69、S70、D71、S72、R73、C74、Q77、D83、V97、D98、R99、W101、G102、N103、G104、C105、G106、L113、K251、R252、Q253、T315、K316、Q331、K373に対応する位置のうちの1つ以上、例えば、ジカPF13のT315、K373、S70、S72、Q77、R99、G104、M68、R252、D83、Q253に対応する位置のうちの1つ以上である。これら(K373まで)は、EDE1 C8抗体と接触する実施例2のED図2に示される残基であると考えられる。さらなる残基(T315で始まる)は、実施例2のED表4および5に記載されているものと考えられる。

0121

骨格タンパク質は、DENV−2のE49、K64、Q77、W101、V122、N134、N153、T155、I161、A162、P169、T200、K202、E203、L308、K310、Q323、W391、F392、A71、C105、C74、D154、D249、D271、D309、D362、D98、E148、E311、E44、E71、E84、G102、G104 G106、G152、G156、G28、G29、G374、H158、H27、I113、I308、I46、K246、K247、K323、K325 K47、L113、L45、L82、M278、N103、N362、N67、N83、Q248、Q271、Q325、R2、R247、R323、R73、R99、S72、S81、T115、T361、T46、T68、T69、T70、T72、V113、V114、V250、V309 V324、V97;ジカPF13のR2、M68、A69、S70、D71、S72、R73、C74、Q77、D83、V97、D98、R99、W101、G102、N103、G104、C105、G106、L113、K251、R252、Q253、T315、K316、Q331、K373、例えば、ジカPF13のT315、K373、S70、S72、Q77、R99、G104、M68、R252、D83、Q253に対応する1つ以上の位置、またはフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基の、これらの一連の残基から選択される1つ以上の残基を示し得るか、またはこれらのうちの少なくとも1つ以上、例えば、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10、またはそのすべてを示し得る。

0122

加えて、骨格タンパク質は、前述のように、二量体配置の安定性を増加させると見なされている残基:H27F、H27W、L107C、F108C、H244F、H244W、S255C、A259C、T/S262C、T/A265C、L278F、L292F、L294N、A313C、およびT315C(またはフラビウイルス、例えば、ジカもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基)のセットのうちの任意の1つ以上またはそのすべてを示し得る。

0123

骨格タンパク質は、二量体、または二量体の断片を保持し得、免疫原性に必須であると見なされている上記の改変のうちのいずれかを含み得、および/または増加した二量体の安定性、例えば増加したジスルフィド結合をもたらし得る。

0124

さらに、この骨格は、改善されたEDEが示されるような骨格であり得る。一実施形態では、本化合物は、したがって、改善されたEDEに結合する。例えば、以下ならびにWO2016/012800の実施例2および5に記載されるように、デング熱感染を有する患者は、有用な抗体であると見なされるVDEに向けて進められる抗体、または有用であると見なされない融合ループ(抗FL抗体)に向かって配向される抗体のいずれかを有する傾向がある。それ故に、骨格は、EDEのみが提示されるように、かつ、化合物、例えば、FLに作り出される、抗体またはその抗原結合部分の可能性を排除するような方法で提示されるように操作され得る。したがって、ある好ましい実施形態では、EDEは、任意に骨格タンパク質に組み込むことによって、抗体をFLではなく、EDEに作り出すことができる。

0125

骨格タンパク質とは無関係に、エンベロープタンパク質は、改善されたEDEが生成されるように操作され得る。上述のように、抗FL抗体によって認識することができず、かかる抗体を作り出すことができないEDEは、改善されたEDEであると見なされる。これは、エンベロープタンパク質において1つ以上の変異、欠失、もしくは挿入によって、またハイブリッドタンパク質を生成することによって達成され得、特異的エピトープは、抗FL抗体を作り出し得るいかなる抗原も用いることなく、骨格タンパク質に融合される。例えば、実施例3で論じたような二量体の「呼吸」を減少させる安定化などの二量体の安定化は、抗FL抗体の上昇を減少させる可能性があり、したがって改善されたEDEを表すと考えられる。

0126

一実施形態では、エンベロープタンパク質は、NまたはO結合型グリカン配列を添加することによって、(ウイルスの内側に突出する)二量体の内部表面を改変し、それをより少ない免疫原性にすることによって操作される。

0127

二量体に新しい表面をつける広範囲変異原性は、残基の変異および/またはグリカンの添加によって非ED準最適反応の生成をさらに低減するのに有用であり得る。

0128

一例として、L278F変異は、klループを再形成し、ビリオン様の立体構造を模倣すると見なされる。

0129

さらなる議論のために、例えば、以下の変異の節および本明細書にける実施例3を参照のこと、ならびに例えばWO2016/012800、例えば実施例17および18における議論が含まれる。

0130

コアEDEエピトープのモデリングおよび最適化はまた、所望のEDE反応を誘発するために最適な配列を生成し、結合抗体および中和抗体を提供するためにも有用であり得る。

0131

EDEが、増加した二量体の安定性に影響を及ぼす骨格内に保持される天然のエンベロープタンパク質であり得ることが理解されよう。EDEはまた、いかなる骨格とも無関係に二量体の安定性を増加するように操作され得る。この2つは、一実施形態では、EDEは、異種骨格タンパク質内に保持されたエンベロープタンパク質が二量体配置において改善された安定性を有するように操作される二量体を含むように組み合わせられ得る。あるいは、エンベロープタンパク質は、タンパク質の関連部分のみが存在するように操作され得、これが異種骨格タンパク質において保持され得る。

0132

二量体立体構造は、例えば、2つのエンベロープポリペプチドドメインを含む単一のポリペプチド鎖として表される2つのエンベロープ単量体間に、長いリンカー、例えばグリシンセリンリッチライナーを作製することによって安定化させてもよい。あるいはまたは加えて、二量体構造は、二量体の内部に面する表面または二量体と関連するタグに結合する任意の抗体(例えば)によって安定化させてもよい。

0133

エンベロープタンパク質、sE、sE二量体、またはエンベロープタンパク質二量体への任意の言及はまた、その範囲内に、骨格タンパク質または構造も含み、EDEを作製し、適当なEDEを示すために、特定の立体構造において保持される特定の残基を含む。

0134

エンベロープヌクレオチド配列は、このエンベロープタンパク質が変異、挿入、または欠失のうちのいずれか1つ以上を有するように操作され得る。ヌクレオチド配列は、特定のエンベロープタンパク質(またはその部分)の天然配列に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%相同性を有するようなものであり得る。

0135

さらなる実施形態では、エンベロープタンパク質は、別の血清型のフラビウイルス、例えば、ジカウイルスまたはデングウイルスからのエンベロープタンパク質(またはその部分(複数可)、例えば、少なくとも8、9、または10の連続的なアミノ酸のうちの1つ以上の部分)に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%相同性を有するように操作され得る。好ましい実施形態では、エンベロープタンパク質は、すべての血清型のデングウイルスおよび/またはジカウイルスからの2つの異なるエンベロープタンパク質(またはその部分(複数可)、例えば、少なくとも8、9、または10の連続的なアミノ酸のうちの1つ以上の部分)、より好ましくは4つの異なるエンベロープタンパク質(またはその部分(複数可)、例えば、少なくとも8、9、または10の連続的なアミノ酸のうちの1つ以上の部分)、最も好ましくはすべてのエンベロープタンパク質(またはその部分(複数可)、例えば、少なくとも8、9、または10の連続的なアミノ酸のうちの1つ以上の部分)に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%相同性を有するように操作され得る。

0136

上記のように、エンベロープタンパク質は、実際には、天然エンベロープタンパク質に対して非常に低い相同性を有するように操作され得るが、EDEの完全性および立体構造が維持されるか、またはEDEが改善される、例えば、抗FL抗体を育てることができないような方法で改変される。それ故に、配列相同性のレベルは、必ずしも、3D構造相同性または機能的相同性を表示しない。例えば、EDEを含む構造をコードする特定の配列は、実際には、天然エンベロープタンパク質に対して非常に低いレベルの相同性を有し得るが、それでもなお、本発明に関して有用な化合物と見なされ得る。例えば、タンパク質は、天然エンベロープタンパク質に対して10%、20%、30%、40%、50%、または60%相同性を有し得、この構造をコードするヌクレオチド配列は、天然エンベロープ配列に対応して低い配列同一性を有し得る。

0137

例えば、異なるエンベロープタンパク質中のEDEを形成する残基間のアミノ酸側鎖相違がある場合、例えば、ジカおよびデングウエンベロープタンパク質EDEを構成するアミノ酸の間に差がある場合であっても、EDEを形成する骨格立体配座は、抗EDE抗体によって広く認識される可能性があると考えられる。

0138

好ましい実施形態では、EDEを含むエンベロープタンパク質または構造は、フラビウイルス、例えば、ジカウイルスまたはデングウイルスエンベロープタンパク質(またはその部分(複数可)、例えば、少なくとも8、9、または10の連続的なアミノ酸のうちの1つ以上の部分)に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%相同性、またはすべての血清型のフラビウイルス、例えば、ジカウイルスまたはデングウイルスからの2つの異なるエンベロープタンパク質(またはその部分(複数可)、例えば、少なくとも8、9、または10の連続的なアミノ酸のうちの1つ以上の部分)、より好ましくは4つの異なるエンベロープタンパク質、最も好ましくはすべてのエンベロープタンパク質に対して少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、98%、または99%相同性を有するか、またはEDEを含むタンパク質または構造は、1種以上の血清型のジカまたはデングウイルスの天然エンベロープタンパク質に対して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、または60%相同性を有し、このタンパク質は、E49、K64、Q77、W101、V122、N134、N153、T155、I161、A162、P169、T200、K202、E203、L308、K310、Q323、W391、F392、ならびに/あるいは、ジカPF13のR2、M68、A69、S70、D71、S72、R73、C74、Q77、D83、V97、D98、R99、W101、G102、N103、G104、C105、G106、L113、K251、R252、Q253、T315、K316、Q331、K373、例えば、ジカPF13のT315、K373、S70、S72、Q77、R99、G104、M68、R252、D83、Q253に対応する1つ以上の位置、またはフラビウイルス、例えばジカウイルスもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基のうちの1つ以上、または任意にこれらのすべてを含む。

0139

これらの残基のいくつかは、その他よりも重要であると見なされ、したがって、EDE、エンベロープタンパク質、またはEDEを含む構造のさらなる実施形態では、DENV−2のQ77、W101、N153、T155、K310、またはジカPF13のT315、K373、S70、S72、Q77、R99、G104、M68、R252、D83、Q253、またはフラビウイルス、例えばジカウイルスもしくはデングウイルスエンベロープタンパク質の等価残基のうちの1つ以上、または任意にこれらのすべてを含む。

0140

エンベロープタンパク質残基E49、K64、Q77、W101、V122、N134、N153、T155、I161、A162、P169、
T200、K202、E203、L308、K310、Q323、W391、F392(DENV−2)、またはジカPF13のT315、K373、S70、S72、Q77、R99、G104、M68、R252、D83、Q253、またはフラビウイルス、例えばジカウイルスもしくはデングウイルスの等価残基のうちの1つ以上は、EDEへの化合物の結合に必要であると考えられる。それ故に、一実施形態では、EDEを含むエンベロープタンパク質または構造は、これらの残基のうちの1つ以上、またはこれらのすべてを含む。

0141

抗FL抗体は、ほとんどの場合、アラニン走査分析において変異した残基の中から残基W101のみを必要とするように思われ(WO2016/012800の実施例2)、他の残基のうちのいずれかの変異によって影響を受けないが、一方、抗EDE抗体は、はるかに大きなエピトープを必要とし、抗FL抗体が必要とするように残基W101の存在を必要とするが、多くの他の残基での変異によって影響を受ける。したがって、一実施形態では、EDEは、エンベロープ二量体エピトープにおいて残基W101および位置E49、K64、Q77、W101、V122、N134、N153、T155、I161、A162、P169、T200、K202、E203、L308、K310、Q323、W391、F392(DENV−2)、またはジカPF13のT315、K373、S70、S72、Q77、R99、G104、M68、R252、D83、Q253、またはエンベロープ二量体エピトープの等価残基が化合物の結合に必要であるエピトープとして定義される。

0142

特定の実施形態では、エンベロープ二量体エピトープは、ジカPF13のドメインIII残基K310(DENV−2)またはT315、K373、S70、S72、Q77、R99、G104、M68、R252、D83、Q253、またはフラビウイルス、例えば、ジカウイルスもしくはデングウイルスタンパク質の等価残基を含む。

0143

一実施形態では、EDEは、例えば、各エンベロープ、例えば、sE、単量体の67位(Asn67グリカン)でおよび/または153位(Asn153グリカン、ジカにおいては154位)で、好ましくは各単量体の少なくとも67位(Asn67グリカン)でグリコシル化される。Asn67は、ジカエンベロープタンパク質中に存在するとは考えられていない。

0144

ある実施形態に従って、本発明の化合物は、エンベロープタンパク質二量体のN67グリカン鎖またはエンベロープタンパク質二量体のN153/N154(ジカ)グリカン鎖に接触する。本化合物は、エンベロープタンパク質二量体のN67(存在する場合)およびN153グリカン鎖の両方に接触することができると理解されよう。

0145

特定の例では、本化合物は、CDRH2がエンベロープタンパク質のN67グリカン鎖と相互作用する抗体である。

0146

一実施形態では、本化合物は、1種以上の血清型のデングウイルス、存在する場合、好ましくはすべての血清型のデングウイルスエンベロープタンパク質、例えば、DENV−2またはDENV−4におけるA71、C105、C74、D154、D249、D271、D309、D362、D98、E148、E311、E44、E71、E84、G102、G104 G106、G152、G156、G28、G29、G374、H158、H27、I113、I308、I46、K246、K247、K310、K323、K325 K47、L113、L45、L82、M278、N103、N153、N362、N67、N83、Q248、Q271、Q325、Q77、R2、R247、R323、R73、R99、S72、S81、T115、T155、T361、T46、T68、T69、T70、T72、V113、V114、V250、V309 V324、V97、W101のうちの任意の1つ以上でEDEに接触する。

0147

一実施形態では、エンベロープ二量体エピトープは、ドメインII側上のbストランド、および(二量体界面の向かいにある)ドメインI側上の「150ループ」(例えば、図29を参照のこと)によって形成されたくぼみの中心に置かれた領域を含み、150ループが残基148〜159に広がり、ドメインIのbストランドE0およびF0を接続し、N153残基またはN153グリカンを担持し、これは二量体におけるパートナーサブユニットの融合ループを覆う。150ループは、配列番号148の150ループのDenv−1 QHQVGNETTEHG、配列番号1149の150ループのDenv 2 EHAVGNDTGKHG、配列番号150の150ループのDenv 3 QHQVGNETQG、配列番号151の150ループのDenv 4 THAVGNDIPNHGを含むと見なされる。

0148

場合によっては、エンベロープ二量体エピトープは、ドメインIIのエンベロープタンパク質を含み、任意に、ドメインIIの以下の特性、b鎖(残基67〜74)、すぐ上流の融合ループおよび残基(残基97〜106)、ならびにijループ(残基246〜249)、ならびに残基243〜251および残基307〜314のうちの任意の1つ以上をさらに含む。

0149

一実施形態では、EDEは、残基67〜74、残基97〜106、残基148〜159、残基243〜251、および残基307〜314からなる、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルス糖タンパク質E細胞外ドメイン(sE)の5つのポリペプチドセグメントを含む。

0150

それ故に、一実施形態では、本発明はまた、上述のように使用するための化合物、例えば、上に定義される安定化組換えsE二量体に対する、上述のように使用するための単離された中和抗体またはその抗原結合断片も提供し、当該抗体またはその断片は、残基67〜74、残基97〜106、残基148〜159、残基243〜251、および残基307〜314からなる、フラビウイルス、例えば、ジカまたはデングウイルス糖タンパク質E細胞外ドメイン(sE)の5つのポリペプチドセグメントに結合する。

0151

化合物が結合するEDEは、ドメインIIのジカPF13ベータストランドb、床ベータシート端部、融合ループ主鎖、融合ループR99側鎖、Q77側鎖、C74とC105との間のジスルフィド結合、ベータストランドE、K373、ドメインIの荷電残基、ドメインIIのklループ、またはそれに対応する領域を含み得、
および/または、ジカPF13残基67〜77、残基97〜106、残基313〜315、残基243〜253、残基K373またはフラビウイルス糖タンパク質E細胞外ドメインの対応する残基からなり得、任意に、結合は、デングN153(ジカN154)グリカンまたは対応する残基の存在または不在によって影響を受けない。

0152

例えば、ポリペプチドセグメントまたはアミノ酸残基に対する本発明に従う使用のための、抗体断片の結合の特徴付けは、例えば、以下の実施例および/またはWO2016/012800に記載される結晶化試験によって行われ得る。

0153

好ましくは、EDEへの結合に加えて、本化合物は、ウイルスを中和することができる。好ましい実施形態では、本化合物は、すべての血清型のフラビウイルス、または例えば、すべての血清型のジカおよび/もしくはデングウイルスを、好ましくは少なくとも90%または少なくとも98%、例えば100%中和することができ、好ましくは昆虫細胞およびヒト細胞の両方で作られるすべての血清型のジカおよび/もしくはデングウイルスを少なくとも90%または少なくとも98%、例えば100%中和する。中和反応および中和アッセイ技術についての選好は、前述されたとおりである。

0154

一実施形態では、EDEは、完全長エンベロープタンパク質の二量体を含む。別の実施形態では、EDEは、エンベロープ細胞外ドメイン(sE)の二量体を含む。さらなる実施形態では、エンベロープタンパク質は、エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの(上で論じられるように、約)400のアミノ末端残基を含む。例えば、WO2016/012800の図28を参照されたい。上記の完全長エンベロープタンパク質の二量体の安定性についての選好はまた、エンベロープタンパク質の切断型細胞外ドメインにも適用する。したがって、エンベロープタンパク質の細胞外ドメインの二量体は、操作を通して安定化され得るか、または骨格タンパク質に組み込むことによって安定化され得るか、またはハイブリッド二量体を含み得る。

0155

さらなる実施形態では、本発明の使用のための化合物は、酸性pHでインキュベートされる、デングウイルスまたはビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子に結合しないであろうものである。酸性pHは、エンベロープタンパク質が三量体配置を不可逆的に導入するようにする。本発明者らは、本発明の使用のための化合物が低いpHでウイルス粒子に結合しないことを見出した(WO2016/012800の実施例4を参照のこと)。したがって、一実施形態では、化合物、例えば、抗体またはその抗原結合部分は、酸性pHでインキュベートされる、デングウイルスまたはビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子に結合しない。酸性pHとは、7より低い任意のpH、好ましくはpH5.5を意味する。

0156

したがって、当業者は、特定の化合物が本発明のこの実施形態に従う本発明の使用のための化合物であるかどうか、本化合物が、a)フリン活性を欠いている細胞で作られるビリオンもしくはサブウイルス粒子もしくはウイルス様粒子、b)高い割合のprMタンパク質を有するビリオンもしくはサブウイルス粒子もしくはウイルス様粒子、および/またはc)酸性条件下でインキュベートされるビリオンもしくはサブウイルス粒子もしくはウイルス様粒子、のうちの1つ以上に結合することができないかどうかを単に特定することによって容易に特定することができる。

0157

上述のビリオン、サブウイルス粒子、またはウイルス様粒子に対する本化合物の結合能力をアッセイするための方法は、EDEに結合する本化合物の能力をアッセイすることに関しては前述に提供され、WO2016/012800の実施例4に詳述されており、概して、本化合物が結合することができるかどうかをアッセイするために、特定のビリオンまたはウイルス様粒子に対してELISAを単に含む。本化合物は、天然EDEまたはビリオンまたはウイルス様粒子に結合するか、または有意に結合する場合、ならびにa)フリン活性を欠いている細胞で作られる、b)高い割合のprMタンパク質を有する、および/またはc)酸性条件下でインキュベートされる、ビリオンまたはサブウイルス粒子またはウイルス様粒子に結合しない場合、有用であると見なされる。

0158

本発明は、上記の使用のための特定の化合物をさらに含む。例えば、一実施形態では、本化合物は、重鎖配列番号11および軽鎖配列番号13、または重鎖配列番号12および軽鎖配列番号14の配列を含む抗体である。抗体が含んでいてもよい軽鎖、重鎖、およびCRD配列のさらなる例は、下記の抗体の節に記載されている。本発明はまた、これらの抗体の切断および変異に関し、そのため、使用のための化合物はその抗原結合部分であることが理解されよう。少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCDR配列または可変領域配列全体、または抗体配列全体において、上記の配列に対して少なくとも80、90%、または少なくとも95%相同性の配列相同性を有する抗体は、本発明の使用のために含まれる。抗体、軽鎖および重鎖の特定の配列は、配列番号1〜4、37〜141、141〜147、および例えばWO2016/012800の図29に記載されている。

0159

WO2016/012800、Rouvinski et al(2015) Nature 520, 109−113、Dejnirattisai et al(2015) Nature Immunol 16,170−177、の群「EDE1」として特徴付けられる抗体が、特にジカウイルスに関連する使用に関連して、特に価値があり得る。EDE群1抗体は、N153(または等価残基)グリコシル化の存在または不在によって影響を受けない結合によって特徴付けられると考えられる。

0160

ジカおよびデングウイルスに関連する広範な中和抗体として特に有用であり得る抗体は、以下の抗体の節に論じられるように、752−2 C8またはEDE1 C8であり得る(WO 2016/012800、Rouvinski et al(2015) Nature 520, 109−113、Dejnirattisai et al(2015) Nature Immunol 16, 170−177にあるような用語)、または753(3) C10 EDE C10(WO2016/012800、Rouvinski et al(2015) Nature 520, 109−113、Dejnirattisai et al (2015) Nature Immunol 16, 170−177にあるような用語)。

0161

ジカエンベロープタンパク質二量体に対して高い親和性を有し得るが、中和にはあまり有用でなく、抗体依存性増強(ADE)を促進し得る抗体は、DENV結合のために153位にグリコシル化部位を必要とすると思われるが、ジカエンベロープ二量体上の154グリカン(存在する場合)と同じ相互作用をしない、EDE2 A11であり得る(WO2016/012800、Rouvinski et al(2015) Nature 520, 109−113、Dejnirattisai et al(2015) Nature Immunol 16, 170−177にあるような用語)。実施例2を参照のこと。

0162

以下の実施例2においてさらに論じられるように、ジカ株は、154位でのグリコシル化に関して異なる場合がある。アフリカジカ株HD78788は、長年にわたり、マウスの脳をサックインする細胞培養適合し継代されており、Eグリコシル化がないと考えられている。2013年にフランス領ポリシアで単離されたPF13株は、150ループ、154位でグリコシル化されたEタンパク質を有する。EDE1群抗体、例えば、EDE1 C8はグリコシル化されていないアフリカ系統HD78788をグリコシル化PF13株よりも良好に中和することができるが、EDE1群抗体はこれらのジカ株の両方をDENV株と同等またはそれよりも中和することができる。

0163

EDE2抗体、例えばEDE2 A11は、これらのジカ株間差異を示さないかもしれないが、EDE1抗体としていずれかの株を中和するほど強力ではないかもしれない。

0164

特定の重鎖および軽鎖の特定の残基は、実施例、特に実施例2および実施例2のED図3でさらに論じるように、EDEへの結合に重要であると考えられる。したがって、当業者は、どの残基がどのような方法で改変を許容する可能性が高いかを決定することができるであろう。改変は、当業者には明らかであり本明細書に記載されるように、EDE結合能力またはウイルス中和能力に対する効果を試験することによって試験され得る。

0165

抗体は、軽鎖および重鎖からなり、各軽鎖および重鎖内に3つの可変領域がある。これらの領域のそれぞれの最も可変の部分は、相補性決定領域であり、抗原結合および認識には最も不可欠であると見なされる。したがって、一実施形態では、本化合物は、以下のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有しない、1つまたは2つアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する以下のアミノ酸配列のうちの1つ以上を含む:
以下の抗体の節の表Aで同定されたCDR配列、
または以下の抗体の節で同定される、例えば、EDE1抗体として同定される抗体のための、WO2016/012800からのCRD配列。

0166

タンパク質骨格における抗原性EDEの提示に関して上述のように、本化合物、例えばタンパク質、例えば抗体はまた、例えばタンパク質骨格内に保持される、より大きな構造の一部であってもよい。この骨格についての選好は、前述されたとおりである。例えば、一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、より大きなポリペプチド内にある。

0167

好ましい実施形態では、本化合物は、抗体またはその抗原結合部分である。抗原結合部分は、Fv部分、Fab様断片(例えば、Fab断片、Fab’断片、またはF(ab)2断片)、またはドメイン抗体であってもよい。

0168

一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、モノクローナル抗体であるか、または、モノクローナル抗体由来である。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ポリクローナル抗体であるか、または、ポリクローナル抗体由来である。さらなる実施形態では、本化合物は、
a)モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、または
b)ポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、または
c)モノクローナルおよびポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の混合物、を含む、抗体またはその抗原結合部分の混合物を含む組成物であり、例えば、モノクローナル抗体対ポリクローナル抗体もしくはその抗原結合部分の比率は、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、または1:10である。

0169

本化合物は、組換えタンパク質、例えば、組換え抗体またはその抗原結合部分であってもよいことが理解されよう。本化合物はまた、合成的に作製されてもよい。本化合物は、組換え的および合成的に産生された組み合わせであってもよい。

0170

このような化合物、例えばタンパク質、例えば抗体またはその抗原結合部分を作製する手段を提供する。

0171

本化合物が組換え手段によって産生され得る、例えば本化合物、例えばポリペプチド、例えば、抗体またはその抗原結合部分は、
a)ヒト細胞株、任意に、CHO細胞、または
b)哺乳動物、任意に、ヒト、または
c)微生物、または
d)昆虫細胞株、を含む、様々な生物から産生および単離または精製され得る。

0172

単離または精製されるとは、この薬剤は、その自然環境から除去され、この薬剤が精製される程度に反映しないことを意味する。

0173

したがって、本発明は、ヒト細胞株、任意にCHO細胞、または哺乳動物、任意にヒト、または微生物、または昆虫細胞株を含む、様々な生物からの本発明の使用のための化合物の単離または精製を提供する。

0174

本化合物が、ポリペプチド、例えば、抗体またはその抗原結合部分であるか、または例えば、タンパク質骨格に含まれる場合には、この化合物は、核酸によってコードされてもよい。核酸とは、一本または二本鎖のおよびすべてのそれらの様々な形態でDNAおよびRNAの両方の意味を含む。本発明の使用のためのまたは本発明に関連してタンパク質性化合物のうちのいずれかをコードする核酸を提供する。特に、WO2016/012800の配列番号41〜48は、本発明に関連して有用であり得る。本明細書の考察から明らかなように、WO2016/012800の他の配列も有用であり得る。前述の可能性のいずれかを含む配列、例えば、抗体配列のいずれかをコードする部分を含む核酸配列またはそれに対して少なくとも80、90、95、または95%の相同性を有する配列であるような、サイレント変異をもたらし得る変異を含む、例えば、WO2016/012800の配列番号41〜48に由来するかまたはそれを含む任意の配列、または本明細書に開示される他の配列が、含まれる。

0175

核酸は、イントロンを含んでも、含まなくてもよい。核酸はまた、その後の翻訳ポリペプチドの精製を可能にするために修飾されてもよく、例えば、目的とするポリペプチドのオープンリーディングフレームは、その後の精製を可能にするためにタグ、例えばmycタグまたはhisタグを組み込むように修飾されてもよい。

0176

核酸はまた、例えば、最終ポリペプチド配列に影響を及ぼすことなく、翻訳されるべき生物によってより良好に翻訳されるように最適化されたコドンに修飾されてもよい。

0177

本開示の核酸は、当業者に既知の多くの方法、例えば、古典的な変異誘発、化学的処理制限消化ライゲーション、およびPCRを用いて産生または修飾され得る。

0178

本発明の一態様は、個体に1つ以上のフラビウイルスにワクチン接種する際に使用するための、または1つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および/もしくは治療のための方法における使用のための、本発明の先の態様に関して定義される抗体またはその断片をコードする核酸を提供し、1つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。

0179

本発明の一態様は、本発明の第1の態様に従う使用のための抗体もしくはその断片、または本発明の先の態様の使用のための核酸を提供し、抗体もしくはその断片または核酸は、上述の1つ以上のフラビウイルスによる感染の予防および/または治療のための方法における使用のためのものであり、この治療は、抗体依存性増強(ADE)を減少させるためである。

0180

本発明に関連して、例えば、本発明の使用においてまたは本発明の使用のための化合物を調製することに関連して有用な核酸は、ベクターに組み込まれてもよい。したがって、本発明は、例えば、核酸を含むベクターの使用に関連し得る。ベクターとは、核酸の増幅のクローニングのための、または標的生物への挿入のためのビヒクルを意味し、例えば、ベクターは、標的生物に、例えば標的生物のゲノムに本発明の核酸を標的とするために使用される、プラスミドであっても、核酸であってもよい。ベクターは、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドの発現のために必要とされるヌクレオチド配列をさらに含んでもよく、例えば、プロモーター配列または終止配列は、本発明の使用のためのまたは本発明に関連して有用な核酸に動作可能に連結されてもよく、レポーター遺伝子、例えば抗生物質抵抗性カセットを含んでもよい。ベクターは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、線状であっても、環状であってもよい。一実施形態では、ベクターはプラスミドである。

0181

上述のEDEに結合することができる化合物を提供することに加えて、本発明はまた、以下に定義されるEDE化合物も提供する。核酸またはベクターを含む宿主細胞に加えて、本発明の使用のためのEDE化合物をコードする、核酸またはベクターを提供する。例えば、上述の核酸およびベクターについての選好はまた、当業者には明らかであるような、本発明の本態様に関連してもよい。それ故に、本発明は、以下に定義される使用のためのEDE化合物、またはそのようなEDE化合物をコードする核酸、または当該核酸を含むベクター、または以下に記載される使用のための当該核酸もしくはベクターを含む宿主細胞を提供する。

0182

本発明の一態様は、1つ以上のフラビウイルスに対して、個人にワクチン接種する際に使用するための、フラビウイルスエンベロープ二量体エピトープ(EDE)を提供し、EDEが、安定化組換えフラビウイルス、任意に、デングウイルスおよび/またはジカ、エンベロープ糖タンパク質E細胞外ドメイン(sE)二量体であり、この二量体は、
2つのsE単量体間で少なくとも1つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化される、ならびに/または
各単量体の二量体界面またはドメインI(DI)/ドメインIII(DIII)リンカーにおいて、少なくとも1つのsE単量体のアミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基を、少なくとも1つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって非共有結合的に安定化され、2つのsE単量体間で少なくとも1つのスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化される、ならびに/または
任意に、sE配列を分離する、リンカー領域、任意に、グリシンセリンリッチリンカー領域を有する単一ポリペプチド鎖として形成されることによって共有結合的に安定化される、ならびに/または
改変糖類を介して2つのsE単量体を連結することによって共有結合的に安定化される、ならびに/または、
二量体は、DENV−1、DENV−2、DENV−3、DENV−4、ジカ、もしくは他のフラビウイルスのうちのいずれか1つもしくは2つからの天然および/または変異エンベロープポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体であり、1つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。

0183

本発明のさらなる態様は、1つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種するための方法を提供し、1つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択され、本方法は、本発明の上述の態様に関して定義されるEDEを投与することを含む。

0184

本発明のさらなる態様はまた、1つ以上のフラビウイルスに対して、個体にワクチン接種するための医薬の製造における、本発明の上述の態様に関して定義されるEDEの使用も提供し、1つ以上のフラビウイルスは、ジカウイルス、ジカウイルスおよびデングウイルス、ジカウイルスおよび他のフラビウイルス、デング以外のフラビウイルスから選択される。

0185

実施形態は、特許請求の範囲に記載されており、さらなる好ましいものは、EDEに関して、および治療される個体に関して他の箇所で記載されている。典型的には、ワクチン接種される個体は、フラビウイルス感染またはジカウイルス感染を有するか、または有する可能性が高いと判断されていない者であり得る。

0186

EDE化合物は、エンベロープ依存性エピトープとして上述のエピトープを提供するよう意図されている。EDE化合物は、本発明の使用のための1つ以上のEDE特異的抗体、例えば上記の好ましい中和抗体、または本実施例もしくはWO2016/012800の実施例に例示されるように特異的に結合し得る。EDE化合物は、典型的には、ポリペプチドであるか、またはポリペプチドを含む。一実施形態では、EDE化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ細胞外ドメイン、またはエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの400アミノ末端残基である。本明細書で使用される「400アミノ末端残基」とは、約400アミノ末端残基、例えば、上述のおよび当業者には明らかであろう、350〜450残基、320〜470残基、または330〜480残基(もしくはその組み合わせ)、例えば380〜420残基、例えば390〜410残基、例えば395または393残基が含まれる。エンベロープタンパク質は、フラビウイルス、例えば、ジカ、DENV−1、DENV−2、DENV−3およびDENV−3、およびDENV−4、(WO2016/012800の配列番号29、31、33、もしくは35、または以下の配列の節に記載される配列)からのエンベロープタンパク質、またはWO2016/012800の配列番号29、31、33、または35の配列に少なくとも90%の相同性を有するタンパク質のうちのいずれかであってもよい。この二量体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体であってもよい。好ましい実施形態では、この二量体は、無傷ウイルス粒子、またはサブウイルス粒子、またはウイルス様粒子に組み込まれないが、典型的には、例えば、単量体エンベロープポリペプチドの分子量の2倍の分子量を有する遊離二量体の形態で、またはナノ粒子、例えば、自己組織化ナノ粒子の形態であってもよい。例えば、タンパク質骨格の一部として、本明細書に記載のEDEまたはEDE化合物、例えば、操作されたエンベロープタンパク質のうちのいずれかの形態が、ウイルス、ウイルス様粒子、またはサブウイルス粒子の一部として潜在的に提示されてもよいことが理解されよう。

0187

別の実施形態では、EDE化合物は、二量体配置において増加した安定性を有するように操作されている、例えば、二量体間の共有および/または非共有結合の増加したレベルを有するように操作されている、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ外部ドメイン、またはエンベロープタンパク質の外部ドメインの(約)400アミノ末端残基を含む。
好ましい一実施形態では、EDE化合物は、本発明の上述の態様に関連して記載される、安定化組換えフラビウイルス、例えば、ジカおよび/またはデングウイルスエンベロープ糖タンパク質E細胞外ドメイン(組換えsE)二量体であり、例えば、安定化組換えジカおよび/またはデングウイルスエンベロープ糖タンパク質E細胞外ドメイン(組換えsE)二量体であり、この二量体は、
−2つのsE単量体間で少なくとも1つのジスルフィド鎖間結合で共有結合的に安定化される、ならびに/または
−2つのsE単量体間で少なくとも1つのスルフヒドリル反応性架橋剤で共有結合的に安定化される、ならびに/または
−改変糖を介して2つのsE単量体を連結することによって共有結合的に安定化される、ならびに/または、
−各単量体の二量体界面でまたはドメイン1(D1)/ドメイン3(D3)リンカーにおいて、少なくとも1つのsE単量体のアミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基を、少なくとも1つのかさ高い側鎖アミノ酸で置換することによって、非共有結合的に安定化される。

0188

フラビウイルス、ジカまたはデングウイルスエンベロープ糖タンパク質E細胞外ドメイン(sE)は、例えば、実施例2 ED図7に示すように、デングウイルスの血清型1、2、および4のエンベロープ糖タンパク質Eの1〜395のアミノ酸断片、デングウイルスの血清型3のエンベロープ糖タンパク質Eの1〜393のアミノ酸断片、およびジカウイルスのエンベロープ糖タンパク質Eの1〜404のアミノ酸断片を指す。

0189

EDE化合物の選択は、上述に、および安定化二量体に関する特許請求の範囲に記載されている。

0190

一実施形態では、EDE化合物は、ウイルス、ウイルス様粒子、またはサブウイルス粒子内の天然に存在するエンベロープ二量体を超える改善されたエピトープを提示する。改善されたエピトープとは、無傷ウイルス粒子に天然に提示された改善されてあらゆるエピトープを超えるという意味を含む。改善されたとは、天然無傷デングウイルス粒子よりもより有益な免疫反応を引き起こすことができるという意味を含む。例えば、上述、および特許請求の範囲に記載される改変を介して、二量体配置において増加した安定性を有するEDE化合物は、改善されたエピトープであると見なされる。EDE化合物は、FLが、それ自体で、化合物、例えばポリペプチド、例えば抗体またはその抗原部分によって認識されることができないように操作されているか、または骨格に挿入されているEDEであってもよく、例えば、EDEは、FLが、融合ループの直接的隣接からの単離において抗体によって認識することができない、すなわち誘導ループは、四次組織から独立している文脈において認識することができない(または、例えば、融合ループを認識する反応を引き起こすことができる)ように操作される。

0191

一実施形態では、EDE化合物は、1種を超える血清型のフラビウイルス、例えば、ジカおよび/またはデングウイルスにわたってアミノ酸および空間的位置の両方において保存される残基、好ましくは、すべての血清型のフラビウイルス、例えば、ジカおよび/またはデングウイルスにわたって、つまり、ジカウイルスおよび4種の血清型のデングウイルスにわたってアミノ酸および空間的位置の両方において保存される残基を含む。

0192

EDE化合物は、エンベロープタンパク質の二量体、またはエンベロープ細胞外ドメイン、またはエンベロープタンパク質の細胞外ドメインの(約)400アミノ末端残基を含んでもよく、これは、二量体配置において増加した安定性を有し、また、上述のタンパク質骨格内に保持されるように操作される。

0193

好ましい実施形態では、EDE化合物は、一旦、対象、好ましくはヒトに投与されると、抗体を作り出すことができ、これらの抗体は、好ましくは、すべてのフラビウイルス、またはジカおよび/もしくはデングウイルス、例えば、ジカおよび4種の血清型のデングウイルスに結合することができ、任意に、少なくともジカおよび4種すべての血清型のデングウイルスを中和することができ、好ましくは、ジカおよび4種すべての血清型のデングウイルスを100%中和することができ、任意に、ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られるウイルスを中和することができ、好ましくは、ヒト細胞および昆虫細胞の両方で作られる4種すべての血清型のデングウイルスを中和することができる。

0194

EDE/VDE化合物は、当業者に周知であるように、例えば、WO2016/012800の実施例において示されるように、本明細書で提供される高親和性/中和抗体のうちの1つ以上に対して開発された、抗イディオタイプ抗体(もしくはその断片、または上で論じられるように、結合特異性を共有する分子)であってもよい。

0195

EDEが本発明の使用のための安定化組換えsE二量体である、EDEの合成のための方法を提供し、本方法は、
a)上に定義される2つの単一または複数のシステイン変異体sEを、酸化条件下で接触させるステップ、および/または
b)2つのsE単量体を、上に定義される少なくとも1つ、2つ、または3つのスルフヒドリル反応性架橋剤と接触させるステップ、および/または
c)上に定義されるグリコシル化部位を有する2つのsE単量体を、クリック化学によって接触させるステップ、および/または
d)少なくとも1つのsE単量体のアミノ酸配列において少なくとも1つのアミノ酸残基を、上に定義されるかさ高い側鎖アミノ酸で置換する2つのsE単量体と接触させるステップ、のうちの少なくとも1つを含む。

0196

本発明は、上に定義される方法によって得られる安定化組換えsE二量体を使用してもよい。

0197

本発明に従う使用のための安定化組換えsE二量体の適切な形成を確実にするために、以下に記載の抗体に対する親和性は、(共有結合的および非共有結合的に安定化した二量体については)ELISAによって、または(共有結合的に安定化した二量体については)表面プラズモン共鳴によって測定され得る。

0198

本発明の使用のための、または本発明に関して有用な核酸、または本発明の使用のためのベクター、例えば、EDE化合物または本発明の使用のための化合物をコードする核酸の一部を含む核酸またはベクターのうちのいずれかを含む宿主細胞を提供する。例えば、ベクター、例えばプラスミドを含む、異種タンパク質の発現に有用であることが知られている任意の宿主細胞、例えば、C6/36昆虫細胞、ヒト樹状細胞、CHO細胞、または微生物、例えば、Pichia pastoris細胞を提供する。宿主細胞はまた、任意に、ゲノム、例えば、アデノウイルスアデノ関連ウイルス、サイトメガロウイルスヘルペスウイルスポリオウイルスレトロウイルスシンドビスウイルスワクシニアウイルス、または任意の他のDNAもしくはRNAウイルスベクターへの核酸を標的とするためのウイルスベクターの使用によって宿主細胞のゲノムに組み込まれている、本発明の使用のための、または本発明に関連する核酸を含んでもよい。

0199

本発明の使用のための核酸または本発明の使用のためのベクター、または本発明の使用のための宿主細胞によって、例えば、EDE化合物または本発明の使用のための化合物をコードする核酸の一部を含む核酸またはベクターによって形質転換される少なくとも1つの細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物も提供する。

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