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技術 バチルス・シビ(BACILLUS CIBI)DNase変異体及びその使用

出願人 ザプロクターアンドギャンブルカンパニー
発明者 ベイヤー、ラッスオステルゴールド、ラッス・ヘンリクヨハンセン、アンネッテ・ヘレゴリ、クラウスブリシャー、トマス・ホルベルグアベル、ゲルノスクログスゴールド、スティーンニールセン、イェンス・イギガー、ラッスラント、ニール・ジョゼフ
出願日 2017年7月12日 (2年9ヶ月経過) 出願番号 2019-521186
公開日 2019年8月22日 (8ヶ月経過) 公開番号 2019-523336
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 任意追加的 改善係数 混合添加物 対象特性 対象構造 加水開裂 カルボキシメチルイヌリン 予形成
関連する未来課題
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課題・解決手段

ポリペプチド変異体を含む洗剤組成物、並びにこのような組成物を用いて表面を洗浄及び/又は処理する方法、並びにポリペプチド変異体を含む布地処理組成物。当該組成物は、アニオン性非イオン性、及び/又はカチオン性界面活性剤を含み得る。

概要

背景

省エネルギー化及び環境保護のために、多くの洗浄プロセスで温度を低下させている。更に、強力な漂白剤等の多くの過酷な洗剤成分が置き換えられ、短い洗浄プロセスが次第により一般的になってきている。温度を低下させた場合、漂白剤が置き換えられ、クリーニング及び洗浄プロセスを短縮した場合、細菌等の微生物の増殖にとってよりよい条件になる。一般的に、微生物は、バイオポリマー及び巨大分子を含む細胞外物質によって封入されている多くの天然、工業的、及び医学的環境において表面に付着して生存している。その結果生じる微生物を封入した粘液の層はバイオフィルムと呼ばれ、これは、細胞外高分子物質EPS)のマトリクスによって取り囲まれていることが多い。EPSは、一般的に細胞外DNA、タンパク質、及び多糖類で構成される高分子集塊である。

バイオフィルム及びEPSなどの有機物の存在は、洗濯物がべたつき、そのべたついた領域に汚れが付着する恐れがあることを示唆し得る。汚れた洗濯物を汚れの少ない洗濯物と共に洗浄すると、特に洗濯物が上記のようにべたついている場合、洗浄液中に存在する汚れが(例えば、再付着によって)洗濯物に付着する傾向がある。その結果、洗濯物は、洗浄後に洗浄前よりも「汚れた」状態になる。

国際公開第2011/098579号(Newcastle University)及び同第2014/087011号(Novozymes A/S)は、ジオキシリボヌクレアーゼ化合物の使用に関する。洗濯等の洗浄プロセスにおいて有用であるためには、DNase等の酵素洗剤組成物中で安定であり、かつ界面活性剤ビルダー、漂白剤等の標準的な洗剤成分と適合する必要がある。

概要

ポリペプチド変異体を含む洗剤組成物、並びにこのような組成物を用いて表面を洗浄及び/又は処理する方法、並びにポリペプチド変異体を含む布地処理組成物。当該組成物は、アニオン性非イオン性、及び/又はカチオン性の界面活性剤を含み得る。

目的

本発明は、洗浄及び処理組成物などの洗剤組成物を提供する

効果

実績

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請求項1

a)DNase親の変異体であって、前記変異体が[D/M/L][S/T]GYSR[D/N](配列番号25)又はASXNRSKG(配列番号26)モチーフの一方又は両方を含み、前記変異体が配列番号1と比較して1つ以上の置換を含み、前記置換が、T1I、T1V、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、T19K、T19L、T19S、T19I、T19V、K21E、K21M、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22I、G24Y、S25P、S27N、S27I、S27M、S27D、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42C、S42L、S42M、S42F、S42W、V49R、L51I、K52I、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78I、F78H、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107D、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147Q、A147W、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159F、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171A、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E、Y182T及びY182Wからなる群から選択され、前記変異体が配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有し、前記変異体がDNase活性を有する、変異体と、b)補助剤、好ましくは0.01〜99.9重量%の量の補助剤と、を含む、洗剤組成物

請求項2

前記DNase親の前記変異体が、前記親と比較して又は配列番号1に示されるポリペプチドを有する前記DNaseと比較して、半減期改善係数HIFとして測定される、改善された安定性を有する、請求項1に記載の洗剤組成物。

請求項3

前記変異体が、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有する、請求項1又は2に記載の洗剤組成物。

請求項4

配列番号1と比較した改変総数が、1〜20個、例えば、1〜10個及び1〜5個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の改変である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の洗剤組成物。

請求項5

前記補助剤が、プロテアーゼアミラーゼリパーゼクチナーゼセルラーゼエンドグルカナーゼキシログルカナーゼペクチナーゼペクチンリアーゼキサンタナーゼ、ペルオキシダーゼハロペルオキシダーゼカタラーゼ、及びマンナナーゼ、並びにこれらの混合物を含む群から選択される追加の酵素から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の洗剤組成物。

請求項6

5〜70重量%の界面活性剤を含み、好ましくはアニオン性及び/又は非イオン性の界面活性剤を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の洗剤組成物。

請求項7

洗濯洗剤組成物である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の洗剤組成物。

請求項8

硬質表面洗浄剤である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の洗剤組成物。

請求項9

食器洗浄組成物である、請求項8に記載の洗剤組成物。

請求項10

請求項1〜5のいずれか一項に記載の洗剤組成物であって、(i)2〜50重量%の四級アンモニウムエステル布地柔軟剤化合物、好ましくは以下の式の化合物から選択される四級アンモニウムエステル布地柔軟剤化合物を含む、洗剤組成物:{R2(4−m)−N+−[X−Y−R1]m}A−(式中、各mの値が同一である条件で、mは、1、2又は3であり、各R1は、独立して、ヒドロカルビル又は分枝状ヒドロカルビル基であり、好ましくは、R1は直鎖状であり、より好ましくはR1は、部分不飽和直鎖アルキル鎖であり、各R2は、独立して、C1〜C3アルキル又はヒドロキシアルキル基であり、好ましくは、R2は、メチルエチルプロピルヒドロキシエチル、2−ヒドロキシプロピル、1−メチル−2−ヒドロキシエチル、ポリ(C2〜3アルコキシ)、ポリエトキシベンジルから選択され、各Xは、独立して、(CH2)n、CH2−CH(CH3)−又はCH−(CH3)−CH2−であり、各nは、独立して、1、2、3又は4であり、好ましくは各nは2であり、各Yは、独立して、−O−(O)C−又は−C(O)−O−であり、A−は、独立して、塩化物硫酸メチル、及び硫酸エチルからなる群から選択され、好ましくは、A−は、塩化物及び硫酸メチルからなる群から選択され、ただし、Yが−O−(O)C−であるとき、各R1における炭素の合計は、13〜21、好ましくは13〜19である)。

請求項11

好ましくはすすぎ時に添加される、洗浄後処理組成物である、請求項10に記載の洗剤組成物。

請求項12

洗濯等の洗浄プロセス又は食器洗浄等の硬質表面洗浄における、請求項1〜11のいずれか一項に記載の洗剤組成物の使用。

請求項13

DNase変異体を得ることを含む、洗剤組成物を作製する方法であって、a)配列番号1の1、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16、17、19、21、22、24、25、27、28、29、30、32、38、39、40、42、49、51、52、55、56、57、58、59、61、63、65、68、76、77、78、79、80、82、83、92、93、94、99、101、102、104、105、107、109、112、116、125、126、127、130、132、135、138、139、143、144、145、147、149、152、156、157、159、160、161、162、164、166、167、168、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、181及び182位に対応する1つ以上の位置における改変を親DNaseに導入することであって、前記変異体がDNase活性を有することと、b)前記変異体を回収することと、前記DNase変異体を洗剤組成物の補助剤と混合することと、を含む、方法。

請求項14

前記変異体が、配列番号1に示されるポリペプチドと比較して1〜20個、例えば、1〜10個及び1〜5個、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の改変を含む、請求項13に記載の方法。

請求項15

前記改変が置換であり、前記置換が、配列番号1に示されるポリペプチドと比較して、T1I、T1L、T1V、T1F、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10T、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13T、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、A17S、T19K、T19N、T19L、T19S、T19I、T19V、K21Q、K21E、K21M、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22S、T22I、G24Y、S25P、S25T、S27N、S27I、S27M、S27D、S27T、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42G、S42C、S42D、S42L、S42M、S42F、S42N、S42W、V49R、L51I、K52I、K52Q、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57Y、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68K、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76I、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78L、F78I、F78H、F78V、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、N80S、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104S、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107Q、K107D、Q109K、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、T127S、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144A、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147H、A147R、A147K、A147Q、A147W、A147N、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159H、Y159F、K160R、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162N、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164H、S164N、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171N、T171A、T171S、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、G175S、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181I、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181V、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E、Y182T及びY182Wからなる群から選択される、請求項13又は14に記載の方法。

請求項16

前記DNase親がGYSクレードに属し、前記親DNaseが、[D/M/L][S/T]GYSR[D/N](配列番号25)又はASXNRSKG(配列番号26)モチーフの一方又は両方を含む、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。

請求項17

前記親DNaseが、以下のポリペプチド:a)配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、b)配列番号2に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、c)配列番号3に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、d)配列番号4に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、e)配列番号5に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、f)配列番号6に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、g)配列番号7に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、h)配列番号8に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、i)配列番号9に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、j)配列番号10に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、k)配列番号11に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、l)配列番号12に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、m)配列番号13に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、n)配列番号14に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、o)配列番号15に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、p)配列番号16に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、q)配列番号17に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、r)配列番号18に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、s)配列番号19に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、t)配列番号20に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、u)配列番号21に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、v)配列番号22に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、w)配列番号23に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、及びx)配列番号24に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチドの群から選択される、請求項13〜16のいずれか一項に記載の方法。

請求項18

物品の念入りな洗浄のための、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物又は請求項13〜17のいずれか一項により製造された組成物の使用であって、前記物品が織物又は硬質表面である、使用。

技術分野

0001

配列リストの参照)
本願は、参照によって本明細書に組み込まれる、コンピュータ読み取り可能な形式配列表を含む。

0002

(発明の分野)
本発明は、洗浄性能洗剤定性及び/又は保存安定性を含む1つ以上の特性が親DNaseに対して変化している新規DNase変異体を含む洗剤組成物に関する。本発明の変異体は、洗浄プロセス、並びに、洗濯組成物並びに手洗い及び自動食器洗浄組成物を含む食器洗浄組成物等の洗剤組成物において使用するのに好適である。また、本発明は、変異体をコードしている単離されたDNA配列発現ベクター宿主細胞、並びに本発明のDNase変異体を生成及び使用する方法に関する。

背景技術

0003

省エネルギー化及び環境保護のために、多くの洗浄プロセスで温度を低下させている。更に、強力な漂白剤等の多くの過酷な洗剤成分が置き換えられ、短い洗浄プロセスが次第により一般的になってきている。温度を低下させた場合、漂白剤が置き換えられ、クリーニング及び洗浄プロセスを短縮した場合、細菌等の微生物の増殖にとってよりよい条件になる。一般的に、微生物は、バイオポリマー及び巨大分子を含む細胞外物質によって封入されている多くの天然、工業的、及び医学的環境において表面に付着して生存している。その結果生じる微生物を封入した粘液の層はバイオフィルムと呼ばれ、これは、細胞外高分子物質EPS)のマトリクスによって取り囲まれていることが多い。EPSは、一般的に細胞外DNA、タンパク質、及び多糖類で構成される高分子集塊である。

0004

バイオフィルム及びEPSなどの有機物の存在は、洗濯物がべたつき、そのべたついた領域に汚れが付着する恐れがあることを示唆し得る。汚れた洗濯物を汚れの少ない洗濯物と共に洗浄すると、特に洗濯物が上記のようにべたついている場合、洗浄液中に存在する汚れが(例えば、再付着によって)洗濯物に付着する傾向がある。その結果、洗濯物は、洗浄後に洗浄前よりも「汚れた」状態になる。

0005

国際公開第2011/098579号(Newcastle University)及び同第2014/087011号(Novozymes A/S)は、ジオキシリボヌクレアーゼ化合物の使用に関する。洗濯等の洗浄プロセスにおいて有用であるためには、DNase等の酵素が洗剤組成物中で安定であり、かつ界面活性剤ビルダー、漂白剤等の標準的な洗剤成分と適合する必要がある。

先行技術

0006

国際公開第2011/098579号
国際公開第2014/087011号

発明が解決しようとする課題

0007

本発明は、洗浄及び処理組成物などの洗剤組成物を提供する。

課題を解決するための手段

0008

本発明は、DNase親の変異体と洗剤組成物補助剤とを含む洗剤組成物であって、DNase親が、GYSクレードに属し、[D/M/L][S/T]GYSR[D/N](配列番号25)又はASXNRSKG(配列番号26)モチーフの一方又は両方を含む、洗剤組成物に関する。

0009

本発明は、更に、(a)配列番号1に示されるポリペプチドと比較して配列番号1の1、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16、17、19、21、22、24、25、27、28、29、30、32、38、39、40、42、49、51、52、55、56、57、58、59、61、63、65、68、76、77、78、79、80、82、83、92、93、94、99、101、102、104、105、107、109、112、116、125、126、127、130、132、135、138、139、143、144、145、147、149、152、156、157、159、160、161、162、164、166、167、168、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、181及び182位に対応する1つ以上の位置に改変を含むDNase変異体であって、変異体が配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが100%未満の配列番号1に示されるポリペプチドの全長配列同一性を有し、変異体がDNase活性を有する、変異体と、(b)補助剤と、を含む、洗剤組成物に関する。

0010

本発明は、更に、(a)DNase親の変異体であって、変異体が、[D/M/L][S/T]GYSR[D/N](配列番号25)又はASXNRSKG(配列番号26)モチーフの一方又は両方を含み、変異体が配列番号1と比較して1つ以上の置換を含み、置換が、T1I、T1V、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、T19K、T19L、T19S、T19I、T19V、K21E、K21M、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22I、G24Y、S25P、S27N、S27I、S27M、S27D、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42C、S42L、S42M、S42F、S42W、V49R、L51I、K52I、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78I、F78H、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107D、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147Q、A147W、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159F、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171A、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E、Y182T及びY182Wからなる群から選択され、変異体が配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが100%未満の配列番号1に示されるポリペプチドと配列同一性を有し、変異体がDNase活性を有する、変異体と、(b)補助剤と、を含む、洗剤組成物に関する。好ましくは、変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと比較して少なくとも1つの改善された特性を有する。改善された特性は、好ましくは、配列番号1に示されるポリペプチドを有するDNaseと比較して、半減期改善係数HIFとして測定される増大した安定性である。

0011

本発明は、本発明に係る変異体と洗浄補助剤とを含む洗剤、例えば洗浄及び/又は処理組成物、並びに洗濯、又は食器洗浄等の硬質表面洗浄等の、洗浄及び/又は処理プロセスにおけるこのような組成物の使用に関する。また、本発明は、表面、好ましくは布地を処理する方法であって、(i)水及び洗剤組成物を含む水性洗浄液を形成することと、(ii)30℃以下の温度で表面を水性洗浄液処理することと、(iii)表面をすすぐことと、を含む、方法に関する。

0012

また、本発明は、布地柔軟剤組成物等の布地処理組成物である洗剤組成物、及び布地柔軟剤組成物で布地を処理する方法に関する。

0013

本明細書におけるDNase変異体は、以下を含む方法によって調製することができる:
a)配列番号1の1、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16、17、19、21、22、24、25、27、28、29、30、32、38、39、40、42、49、51、52、55、56、57、58、59、61、63、65、68、76、77、78、79、80、82、83、92、93、94、99、101、102、104、105、107、109、112、116、125、126、127、130、132、135、138、139、143、144、145、147、149、152、156、157、159、160、161、162、164、166、167、168、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、181及び182位に対応する1つ以上の位置における改変を親DNaseに導入することであって、変異体がDNase活性を有することと、
b)変異体を回収すること。

0014

本発明の組成物において使用するのに好適なDNase変異体は、1つ以上の位置において親DNaseに改変を導入することを含む方法によって調製することができ、改変は置換であり、置換は、配列番号1に示されるポリペプチドと比較してT1I、T1L、T1V、T1F、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10T、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13T、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、A17S、T19K、T19N、T19L、T19S、T19I、T19V、K21Q、K21E、K21M、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22S、T22I、G24Y、S25P、S25T、S27N、S27I、S27M、S27D、S27T、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42G、S42C、S42D、S42L、S42M、S42F、S42N、S42W、V49R、L51I、K52I、K52Q、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57Y、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68K、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76I、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78L、F78I、F78H、F78V、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、N80S、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104S、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107Q、K107D、Q109K、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、T127S、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144A、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147H、A147R、A147K、A147Q、A147W、A147N、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159H、Y159F、K160R、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162N、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164H、S164N、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171N、T171A、T171S、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、G175S、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181I、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181V、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E、Y182T及びY182Wからなる群から選択される。

0015

DNase親は、好ましくは、GYSクレードに属し、親DNaseは、[D/M/L][S/T]GYSR[D/N](配列番号25)又はASXNRSKG(配列番号26)モチーフの一方又は両方を含む。

0016

本発明の一態様は、物品の念入りな洗浄のための本発明に係る組成物の使用であって、物品が織物又は硬質表面である、使用に関する。

0017

配列
配列番号1バチルスシビ(Bacillus cibi)から得られた成熟ポリペプチド
配列番号2 バチルス・ホリコシイ(Bacillus horikoshii)から得られた成熟ポリペプチド
配列番号3バチルス属菌株62520から得られた成熟ポリペプチド
配列番号4 バチルス・ホリコシイから得られた成熟ポリペプチド
配列番号5 バチルス・ホリコシイから得られた成熟ポリペプチド
配列番号6 バチルス属菌株16840から得られた成熟ポリペプチド
配列番号7 バチルス属菌株16840から得られた成熟ポリペプチド
配列番号8 バチルス属菌株62668から得られた成熟ポリペプチド
配列番号9 バチルス属菌株13395から得られた成熟ポリペプチド
配列番号10 バチルス・ホルネキアエ(Bacillus horneckiae)から得られた成熟ポリペプチド
配列番号11バチルス属菌11238から得られた成熟ポリペプチド
配列番号12 バチルス62451から得られた成熟ポリペプチド
配列番号13 バチルス属菌株18318から得られた成熟ポリペプチド
配列番号14 バチルス・イドエンシス(Bacillus idriensis)から得られた成熟ポリペプチド
配列番号15 バチルス・アルコーラ(Bacillus algicola)から得られた成熟ポリペプチド
配列番号16環境サンプルJから得られた成熟ポリペプチド
配列番号17 バチルス・ベトナメンシス(Bacillus vietnamensis)から得られた成熟ポリペプチド
配列番号18 バチルス・フワジンポエンシス(Bacillus hwajinpoensis)から得られた成熟ポリペプチド
配列番号19パエニバチルスムシラギサス(Paenibacillus mucilaginosus)から得られた成熟ポリペプチド
配列番号20 バチルス・インディカス(Bacillus indicus)から得られた成熟ポリペプチド
配列番号21 バチルス・マリスフラビ(Bacillus marisflavi)から得られた成熟ポリペプチド
配列番号22 バチルス・ルシフェレンシス(Bacillus luciferensis)から得られた成熟ポリペプチド
配列番号23 バチルス・マリスフラビから得られた成熟ポリペプチド
配列番号24 バチルス属菌株SA2−6から得られた成熟ポリペプチド
配列番号25モチーフ[D/M/L][S/T]GYSR[D/N]
配列番号26 モチーフASXNRSKG

0018

用語の定義
用語「補助剤」は、所望の特定の種類の洗剤組成物及び製品形態(例えば、液体顆粒粉末、バー、ペーストスプレー錠剤ゲル、又は発泡性組成物)のために選択される任意の液体、固体、又は気体状の材料を意味し、当該材料は、また、好ましくは、組成物中で使用されるDNase変異体酵素と適合する。ある態様では、顆粒組成物は「コンパクト」形態であり、一方他の態様では、液体組成物は「濃縮」形態である。

0019

用語「対立遺伝子変異体」は、同じ染色体座を占める遺伝子の2つ以上の代替形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異によって自然発生し、個体群内の多形性となり得る。遺伝子の突然変異はサイレントコード化されたポリペプチドにおいて変化しない)であり得、代替アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることもできる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコード化されたポリペプチドである。

0020

「バイオフィルム」は、織物、食器、又は硬質表面等の表面上で細胞が互いに粘着している任意の微生物群によって生成され得る。これら接着細胞は、細胞外高分子物質(EPS)の自己生産マトリクス内に埋め込まれていることが多い。バイオフィルムEPSは、一般的に細胞外DNA、タンパク質、及び多糖類で構成される高分子集塊である。バイオフィルムは、生体又は非生体表面上で形成され得る。バイオフィルム中で増殖している微生物細胞は、対照的に液体媒体中で浮遊又は遊泳し得る単一細胞である同じ生物浮遊細胞とは生理学的に区別される。バイオフィルム中で生存している細菌は、通常、同じ種の浮遊性細菌とは著しく異なる特性を有するが、その理由は、フィルム密度が高くかつ保護されている環境によって、当該細菌が様々な方法で協働及び相互作用することができるためである。この環境の1つの利点は、洗剤及び抗生物質に対する耐性が増大することであるが、その理由は、密度の高い細胞外マトリクス及び細胞の外層共同体の内部を保護するためである。洗濯物には、以下の種の中からバイオフィルム生成細菌を見出すことができる:アシネトバクター属菌、アエロミクロビウム属菌ブレブンディモナス属菌、ミクロバクテリウム属菌、ミクロコッカスルテウス(Micrococcus luteus)、シュードモナス属菌表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、及びステノトロフォモナス属菌。

0021

用語「cDNA」とは、原核又は真核細胞から得られる、スプライシングされた成熟mRNA分子から逆転写によって調製することができるDNA分子を意味する。cDNAは、対応するゲノムDNA中に存在し得るイントロン配列を有しない。初期の一次RNA転写物は、スプライシングされた成熟mRNA分子として現れる前に、スプライシングを含む一連の工程を通して加工されるmRNAの前駆体である。

0022

用語「クレード」とは、共通の祖先由来する相同的特徴に基づいて一緒クラスタ分類されたポリペプチドの群を意味する。ポリペプチドのクレードは、系統樹として可視化することができ、クレードは、共通の祖先及びその全ての直系の子孫からなるポリペプチドの群である。系統樹に示される群、例えばクレードを形成するポリペプチドは、多くの場合、共通の特性を共有し得、そのクレードではない他のポリペプチドよりも密接に関連している。

0023

用語「コード配列」は、ポリヌクレオチドであって、そのポリペプチド生成物のアミノ酸配列を直接特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームで決定され、通常、ATG開始コドン、又はGTG及びTTG等の代替開始コドンにより開始し、TAA、TAG,及びTGA等の終止コドンで終了する。コード配列は、DNA、cDNA、又は組み換えポリヌクレオチドであり得る。

0024

用語「制御配列」は、本発明の変異体をコードしているポリヌクレオチドの発現に必要な全ての構成要素を意味する。各制御配列は、変異体をコードしているポリヌクレオチドに対してネイティブであっても外来であってもよく、又は互いに対してネイティブであっても外来であってもよい。このような制御配列としては、リーダーポリアデニル化配列プロペプチド配列プロモータシグナルペプチド配列、及び転写ターミネータが挙げられるが、これらに限定されない。制御配列は、最低限、プロモータ、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列と変異体をコードしているポリヌクレオチドのコード領域とのライゲーションを促進する特異的制限酵素部位を導入するためのリンカーを備えていてもよい。

0025

用語「念入りな洗浄(deep cleaning)」とは、例えばバイオフィルム又はEPS中に存在するタンパク質、DNA、多糖類、汚れ、又は他の成分等のバイオフィルム、EPS又はこれらの一部の成分の低減又は除去を意味する。

0026

用語「洗剤組成物」には、特記しない限り、顆粒又は粉末形態汎用又は強力洗浄剤、特に洗浄洗剤;液体、ゲル、又はペースト形態の汎用洗浄剤、特に、いわゆる強力液体(HDL)タイプ;きめの細かい布地用液体洗剤;食器手洗い用洗剤又は軽質食器用洗剤、特に高発泡タイプのもの;食器洗い機用洗剤であって、家庭用及び業務用の、様々なタブレット状、粒状、液体、及びすすぎ補助タイプを含む洗剤;抗菌手洗いタイプ、クリーニングバー固形石鹸洗口剤義歯洗浄剤、車又はカーペットシャンプー浴室用クリーナーを含む液体洗浄及び消毒剤毛髪用シャンプー及び毛髪用リンス剤シャワーゲルフォームバス;金属クリーナー;並びに、漂白用補助剤、及び「しみ抜きスティック」又は前処理タイプ等の洗浄補助剤が含まれる。用語「洗剤組成物」及び「洗剤製剤」は、汚れた対象を洗浄するために洗浄媒体中で使用することを意図する混合物に関連して使用される。いくつかの態様では、この用語は、布地及び/又は衣類の洗濯に関連して使用される(例えば、「洗濯洗剤」)。別の態様では、この用語は、例えば、食器、カトラリー等を洗浄するために使用されるもの(例えば「食器洗浄洗剤」)等の他の洗剤を指す。本発明は、任意の特定の洗剤製剤又は組成物に限定されることを意図しない。用語「洗剤組成物」は、界面活性剤を含有する組成物に限定されることを意図しない。本発明に係る変異体に加えて、この用語は、例えば、界面活性剤、ビルダー、キレート剤又はキレート化剤漂白系又は漂白成分ポリマー、布地柔軟剤、起泡増進剤発泡抑制剤染料香料変色防止剤蛍光増白剤殺菌剤抗かび剤、汚れ懸濁剤防食剤酵素阻害剤又は安定剤、酵素活性化剤トランスフェラーゼ加水分解酵素酸化還元剤青味剤及び蛍光染料酸化防止剤、並びに可溶化剤を含有し得る洗剤を包含することを意図する。また、洗剤組成物は、布地処理工程で使用してもよく、例えば、布地フレッシュニング、布地柔軟化、及び/又は色再生工程を提供することができる。

0027

用語「DNase」、「DNase変異体」、又は「DNase親」は、DNA中のホスホジエステル結合加水開裂触媒し、それによってDNAを分解するDNase活性を有するポリペプチドを意味する。DNaseは、加水分解酵素の下位群であるエステラーゼEC番号3.1)に属する。DNaseは、EC 3.1.21.X(式中、X=1、2、3、4、5、6、7、8又は9)に分類される。用語「DNase」及び表現「DNase活性を有するポリペプチド」は、本願全体を通して互換的に使用され得る。本発明の目的のために、DNase活性は、アッセイI又はアッセイIIに記載されている手順に従って決定される。いくつかの態様では、本発明のDNase変異体は、親DNaseと比較して改善されたDNase活性を有する。いくつかの態様では、本発明のDNase変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと比較して少なくとも100%、例えば、少なくとも110%、少なくとも120%、少なくとも130%、少なくとも140%、少なくとも150%、少なくとも160%、少なくとも170%、少なくとも180%、少なくとも190%、又は少なくとも200%のDNase活性を有する。

0028

用語「酵素の有効量」は、特定の用途、例えば規定の洗剤組成物において必要とされる酵素活性を得るために必要な酵素の量を指す。このような有効量は、当業者により容易に確認され、使用される具体的な酵素、洗浄の用途、洗剤組成物の具体的な組成、及び液体又は乾燥(例えば、顆粒、バー)のいずれの組成物が必要であるのか、等の多くの要因に基づく。DNase変異体の「有効量」という用語は、例えば規定の洗剤組成物において所望のレベルの酵素活性を実現する上記DNase変異体の量を指す。

0029

用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳翻訳後修飾、及び分泌が挙げられるがこれらに限定されない、変異体の生成に含まれる任意の工程を含む。

0030

用語「発現ベクター」は、変異体をコードしているポリヌクレオチドを含む線状又は環状のDNA分子を意味し、それを発現させる追加のヌクレオチドに操作可能に連結している。

0031

用語「布地」は、任意の織物材料を含む。したがって、この用語は、衣類に加えて、布地、糸、繊維、不織材料、天然材料合成材料、及び任意の他の織物材料を包含することを意図する。

0032

用語「高洗剤濃度」系は、約2000ppm超の洗剤成分が洗浄液中に存在する洗剤を含む。欧州の洗剤は、一般的に、高洗剤濃度系であると考えられる。

0033

用語「宿主細胞」とは、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターを用いて形質転換トランスフェクション形質導入等をしやすい任意の細胞型を意味する。用語「宿主細胞」は、複製中に生じた突然変異に起因する、親細胞とは同一ではない親細胞の任意の後代を包含する。

0034

用語「改善された特性」は、親と比較して及び/若しくは配列番号1を有するDNaseと比較して、又は上記変異体と同一のアミノ酸配列を有するが、上記指定の位置のうちの1つ以上に改変を有しないDNaseと比較して、改善された変異体に関連する特徴を意味する。このような改善された特性としては、洗剤安定性等の安定性、洗浄性能、例えば念入りな洗浄効果が挙げられるがこれらに限定されず、当該念入りな洗浄効果は、接着除去効果を含み得るが、これに限定されない。

0035

用語「改善されたDNase活性」は、例えば、DNA中のホスホジエステル結合の加水開裂の触媒作用の増大によるDNase活性の変化として本明細書では定義され、DNase変異体は、配列番号1を有するDNaseと比較して等、親DNaseの活性に対して(又は比較して)活性の変化を示す。

0036

用語「低洗剤濃度」系は、約800ppm未満の洗剤成分が洗浄液中に存在する洗剤を含む。アジア、例えば、日本の洗剤は、典型的には、低洗剤濃度系であると考えられる。

0037

用語「改善された洗浄性能」は、用語「念入りな洗浄効果」を含むが、これに限定されない。本発明に係るDNase変異体の改善された性能、例えば、念入りな洗浄性能は、DNase親、例えば配列番号1に示されるDNaseと比較して測定される。改善された性能、例えば、念入りな洗浄性能は、染みのついた材料見本反射値(Remission value)として表すことができる。洗浄及びすすぎ後、材料見本を平らに広げ、室温で一晩空気乾燥させる。洗浄した全ての材料見本を洗浄後当日に評価する。非常に小さな口径を有するMacbeth Color Eye 7000反射分光計を用いて、材料見本の光反射率評価を行う。入射光中の紫外線なしで測定を行い、460nmにおける反射を抽出した。正の応答は、例えばバイオフィルムの粘着層が原因で布地に付着した汚れを含む汚れが除去されたことを示す。

0038

用語「単離ポリヌクレオチド」は、人為的に改変されたポリヌクレオチドを意味する。いくつかの態様では、単離ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動によって決定したとき、少なくとも1%純粋、例えば、少なくとも5%純粋、少なくとも10%純粋、少なくとも20%純粋、少なくとも40%純粋、少なくとも60%純粋、少なくとも80%純粋、少なくとも90%純粋、及び少なくとも95%純粋である。ポリヌクレオチドは、ゲノム、cDNA、RNA、半合成、合成起源、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。

0039

用語「洗濯」は、家庭での洗濯及び産業的洗濯の両方に関し、本発明の洗浄又は洗剤組成物を含有する溶液を用いて織物を処理するプロセスを意味する。例えば、洗濯プロセスは、例えば家庭用若しくは産業用洗濯機を使用して実施してもよく、又は手によって実施してもよい。

0040

用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳、及びN末端処理、C末端切断、グリコシル化リン酸化等の任意の翻訳後修飾の後の最終形態のポリペプチドを意味する。いくつかの態様では、成熟ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸1〜182である。本発明に従って使用される成熟ポリペプチドのN末端は、EDMANのN末端シークエンスデータ及びインタクトMSデータに基づいて実験的に確認された。宿主細胞が、同一のポリヌクレオチドによって発現される2つ以上の異なる成熟ポリペプチド(すなわち、異なるC末端及び/又はN末端アミノ酸を有する)の混合物を生成し得ることが当該技術分野において知られている。

0041

用語「成熟ポリペプチドコード配列」は、DNase活性を有する成熟ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを意味する。

0042

用語「中洗剤濃度」系は、約800ppm〜約2000ppmの洗剤成分が洗浄液中に存在する洗剤を含む。北米の洗剤は、一般的に、中洗剤濃度系であると考えられる。

0043

用語「核酸コンストラクト」は、天然に存在する遺伝子から単離されたか若しくは改変しなければ自然界には存在しないような核酸セグメントを含有するように改変された、又は合成である一本鎖又は二本鎖のいずれかである核酸分子を意味する。核酸コンストラクトという用語は、核酸コンストラクトが本発明のコード配列の発現に必要な制御配列を含有する場合、用語「表現カセット」と同義である。

0044

用語「非布地洗剤組成物」は、食器手洗い用組成物を含む食器洗浄洗剤組成物、口腔用洗剤組成物、義歯用洗剤組成物、及びパーソナルクレンジング組成物等の硬質表面洗浄用組成物が挙げられるがこれらに限定されない非織物表面洗剤組成物を含む。

0045

用語「操作可能に連結される」は、制御配列がコード配列の発現を指示するように、ポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に制御配列が配置される構成を意味する。

0046

用語「親」DNase、DNase親、又は前駆体DNaseは、互換的に使用してよい。本発明の状況において、「親DNase」は、改変が行われるDNase配列、すなわち、親DNaseと100%未満同一であるアミノ酸配列を有するDNase変異体を生成するために、アミノ酸配列において少なくとも1つの改変が行われるDNaseとして理解すべきである。したがって、親は、変異体と比較して同一のアミノ酸配列を有するが、指定の位置のうちの1つ以上に改変を有さないDNaseである。本状況において、「同一のアミノ酸配列を有する」という表現は100%の配列同一性に関することが理解される。特定の態様では、DNase親は、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも61%、少なくとも62%、少なくとも63%、少なくとも64%、少なくとも65%、少なくとも66%、少なくとも67%、少なくとも68%、少なくとも69%、少なくとも70%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、例えば、少なくとも99.1%、少なくとも99.2%、少なくとも99.3%、少なくとも99.4%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6又は100%の同一性を有するDNaseである。

0047

用語「関連する洗浄条件」は、洗剤市場区分における家庭で実際に使用される条件、特に、洗浄温度、時間、洗浄機、洗剤濃度、洗剤の種類、及び水硬度を示すために本明細書で使用される。

0048

用語「安定性」は、保管安定性、及び使用中、例えば、洗浄プロセス中の安定性を含み、時間の関数としての本発明に係るDNase変異体の安定性、例えば、DNase変異体が溶液、特に洗剤溶液中で維持されるとき、どれくらいの活性が保持されるかを反映する。安定性は、例えば、pH、温度、洗剤の組成、例えば、ビルダーの量、界面活性剤などの多くの要因によって影響を受ける。DNaseの安定性は、実施例2に記載のとおり測定することができる。用語「改善された安定性」又は「増大した安定性」は、親DNaseの安定性に対して及び/又は配列番号1に対して溶液中の安定性の増大を示す変異型DNaseとして本明細書で定義される。「改善された安定性」及び「増大した安定性」は、洗剤安定性を含む。用語「洗剤安定性」又は「改善された洗剤安定性」は、DNase親と比較して改善されたDNase活性の安定性であってよい。DNaseの安定性は、実施例2に記載のとおり測定される。

0049

用語「実質的に純粋な変異体」は、10重量%以下、8重量%以下、6重量%以下、5重量%以下、4重量%以下、3重量%以下、2重量%以下、1重量%以下、及び0.5重量%以下のネイティブに又は組み換えで結合している他のポリペプチド材料を含有する調製品を意味する。好ましくは、変異体は、調製品中に存在する全ポリペプチド材料の少なくとも92%純粋、例えば、少なくとも94%純粋、少なくとも95%純粋、少なくとも96%純粋、少なくとも97%純粋、少なくとも98%純粋、少なくとも99%純粋、少なくとも99.5%純粋、及び少なくとも100%純粋である。本発明の変異体は、好ましくは実質的に純粋な形態である。これは、例えば、変異体を周知の組み換え方法によって又は古典的な精製法によって調製することにより達成することができる。

0050

用語「織物」は、織布に加えて、糸、織布、編布、及び不織布に変換するか又はこれらとして使用するのに好適な短繊維及び長繊維を指す。この用語は、天然繊維に加えて合成(例えば、製造された)繊維から作製された糸を包含する。用語「織物材料」は、繊維、糸の中間品、糸、布地、及び布地から作製された製品(例えば、衣類及び他の物品)の一般用語である。

0051

用語「転写プロモータ」は、特定の遺伝子の転写を促進するDNAの領域であるプロモータのために使用される。転写プロモータは、典型的には、同じ鎖上かつ(センス鎖の5’領域に向かって)上流において、それが調節する遺伝子の近傍に位置する。

0052

用語「転写ターミネータ」は、転写のためにゲノムDNA上の遺伝子又はオペロンの最後を標識する遺伝子配列の部分のために使用される。

0053

用語「変異体」は、DNase活性を有し、1つ以上の(例えば、いくつかの)位置に置換を含むポリペプチドを意味する。置換は、ある位置を占めているアミノ酸を異なるアミノ酸と交換することを意味し、欠失は、ある位置を占めているアミノ酸を除去することを意味し、挿入は、ある位置を占めているアミノ酸に隣接してアミノ酸、例えば1〜10個のアミノ酸、好ましくは1〜3個のアミノ酸を付加することを意味する。本発明の変異体は、配列番号1に示される成熟ポリペプチドのDNase活性の少なくとも20%、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも100%を有する。用語「DNase変異体」は、DNase活性を有し、かつ親DNaseと比較して、例えば配列番号1と比較して、1つ以上の(又は1個若しくは数個の)位置に改変、すなわち、置換、挿入、及び/又は欠失を含むDNaseを意味する。

0054

用語「水硬度」又は「硬度」又は「dH」又は「°dH」は、本明細書で使用するとき、ドイツの硬度を指す。1度は、水1リットルあたり10ミリグラム酸化カルシウムと定義される。

0055

用語「野生型DNase」は、自然界にみられる真菌、細菌、古細菌酵母、植物又は動物等の天然の生物が発現するDNaseを意味する。

0056

変異体指定の取り決め
本発明の目的上、配列番号1に開示されるポリペプチドは、別のDNase中の対応するアミノ酸残基を決定するのに使用される。別のDNaseのアミノ酸配列を配列番号1に開示されているポリペプチドとアラインメントし、そのアラインメントに基づいて、配列番号1に開示されているポリペプチド中の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を、例えば、EMBOSSパッケージ(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276〜277)の好ましくはバージョン5.0.0以上のNeedleプログラムにおいて実施される、Needleman−Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443〜453)を使用して決定する。用いられるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが10、ギャップ伸長ペナルティが0.5、及びEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。

0057

別のDNase中の対応するアミノ酸残基の同定は、それぞれのデフォルトパラメータを使用し、MUSCLE(multiple sequence comparison by log−expectation;バージョン3.5以上;Edgar,2004,Nucleic AcidsResearch 32:1792〜1797)、MAFFT(バージョン6.857以上;Katoh and Kuma,2002,Nucleic Acids Research 30:3059〜3066;Katoh et al.,2005,Nucleic Acids Research 33:511〜518;Katoh and Toh,2007,Bioinformatics 23:372〜374;Katoh et al.,2009,Methods in Molecular Biology 537:_39〜64;Katoh and Toh,2010,Bioinformatics 26:_1899〜1900)、及びClustalWを使用するEMBOSSEMMA(1.83以上;Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Research 22:4673〜4680)が挙げられるがこれらに限定されないいくつかのコンピュータプログラムを使用して、複数のポリペプチド配列のアラインメントによって決定することができる。

0058

別の酵素が配列番号1のポリペプチドから分岐しており、その結果、従来の配列に基づく比較がこれらの関係を検出できないとき(Lindahl and Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613〜615)、他のペアワイズ配列比較アルゴリズムを使用してもよい。データベース検索するためにポリペプチドファミリーの確率的表現(プロファイル)を利用するサーチプログラムを使用して、配列に基づく検索においてより大きな感度を得ることができる。例えば、PSI−BLASTプログラムは、反復データベース検索プロセスを通してプロファイルを作成し、遠縁ホモログを検出することができる(Atschul et al.,1997,Nucleic AcidsRes.25:3389〜3402)。ポリペプチドのファミリー又はスーパーファミリーが、タンパク質構造データベースにおいて1つ以上の表現を有する場合、更に大きな感度を得ることができる。GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.287:797〜815;McGuffin and Jones,2003,Bioinformatics 19:874〜881)等のプログラムは、クエリー配列構造的折り畳みを予測するニューラルネットワークへのインプットとして、様々な情報源(PSI−BLAST、二次構造予測、構造的アラインメントプロファイル、及び溶媒和物電位)からの情報を利用する。同様に、Gough et al.,2000,J.Mol.Biol.313:903〜919の方法を使用して、未知の構造の配列を、SCOPデータベース中に存在するスーパーファミリーのモデルとアラインメントすることができる。次に、これらアラインメントを、ポリペプチドのホモロジーモデルを作成するために使用することができ、その目的のために開発された様々なツールを使用して、このようなモデルを精度について評価することができる。

0059

既知の構造のタンパク質については、構造的アラインメントを検索し、作成するために、いくつかのツール及び情報源を利用可能である。例えば、タンパク質のSCOPスーパーファミリーは、構造的にアラインメントされており、これらアラインメントは、アクセス可能であり、ダウンロード可能である。ディスタンスアラインメントマトリクス(Holm and Sander,1998,Proteins 33:88〜96)又はコンビナトリアルエクステンション(Shindyalov and Bourne,1998,Protein Engineering 11:739〜747)等の様々なアルゴリズムを使用して2つ以上のタンパク質構造体をアラインメントすることができ、これらアルゴリズムの実行は、更に、可能性のある構造的ホモログを見つけるために、対象構造について構造データベースクエリーを行うために利用することができる(例えば、Holm and Park,2000,Bioinformatics 16:566〜567)。

0060

本発明の変異体の記載においては、参照し易くするために下記命名法適応する。一般に認められているIUPACの一文字又は三文字アミノ酸略記を用いる。#1、#2等を用いてアミノ酸位置を示す。

0061

置換:アミノ酸置換については、以下の命名法:オリジナルのアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸を使用する。したがって、位置#1におけるバリンアラニンによる置換は、「Val#1Ala」又は「V#1A」と表記される。複数の突然変異は、足し算マーク(「+」)又はカンマ(,)によって区切られ、例えば、「Val#1Ala+「Pro#2Gly」又はV#1A,P#2Gは、それぞれ位置#1及び#2におけるバリン(V)及びプロリン(P)のアラニン(A)及びグリシン(G)による置換を表す。所与の位置において1つ超のアミノ酸が置換され得る場合、[X]又は{X}等のようにこれらを括弧内に列挙する。したがって、位置#1を占めているアミノ酸の代わりにTrp及びLysの両方が置換され得る場合、これはX#1{W,K}、X#1[W,K]、又はX#1[W/K](式中、Xは、親DNase、例えば、配列番号1に示されるDNase又はそれと少なくとも60%の同一性を有するDNaseの位置に存在するアミノ酸残基を示す)として示される。場合によっては、変異体は#1{W,K}又はX#2Pと表すこともでき、これは、置換されるアミノ酸が親に依存して変動することを示す。便宜上、置換に付番するために配列番号1を使用するので、配列番号1における対応する位置のアミノ酸を、例えばT1Aと示す。しかし、T1Aを含むDNase変異体は、配列番号1の1位に対応する位置にスレオニンを有する親DNaseには限定されないことが当業者には明らかである。例えば1位にアスパラギンを有する親DNaseでは、当業者はT1Aと指定される突然変異をN1Aに変える。親DNaseが1位にアラニンを有する場合、当業者は、親DNaseがこの位置で変化していないことを認識する。下記欠失及び挿入についても同様である。

0062

欠失:アミノ酸欠失については、以下の命名法:オリジナルのアミノ酸、位置、*を使用する。したがって、位置#1におけるバリンの欠失は、「Val#1*」又は「V#1*」と表記される。複数の欠失は、例えば、「Val#1*+Pro#2*」又はV#1*,P#2*」のように足し算マーク(「+」)又はカンマによって区切られる。

0063

挿入:例えばVal#1の後へのリジン等の追加のアミノ酸残基の挿入は、Val#1ValLys又はV#1VKによって示すことができる。あるいは、Val#1の後へのリジン等の追加のアミノ酸残基の挿入は、*#1aKによって示すこともできる。例えば#1の後にLys及びGlyなどの1つ超のアミノ酸残基を挿入するとき、これは、Val#1ValLysGly又はV#1VKGと示すことができる。このような場合、挿入されるアミノ酸残基は、挿入されるアミノ酸残基の前のアミノ酸残基の位置番号小文字を付加することによって付番してもよく、この例では、*#1aK*#1bGである。

0064

複数の改変:複数の改変を含む変異体は、足し算マーク(「+」)又はカンマ(,)によって区切られ、例えば、「Val#1Trp+Pro#2Gly」又は「V#1W,P#2G」は、上記のとおりそれぞれ位置#1及び#2におけるバリン及びプロリンをトリプトファン及びグリシンで置換することを表す。

0065

異なる改変:ある位置に異なる改変を導入し得る場合、異なる改変をカンマによって区切ってもよく、例えば、「Val#1Trp,Lys」又はV#1W,Kは、位置#1におけるバリンのトリプトファン又はリジンによる置換を表す。したがって、「Val#1Trp,Lys+Pro#2Asp」は、以下の変異体:「Val#1Trp+Pro#2Asp」、「Val#1Lys+Pro#2Asp」又はV#1W,K+P#2Dを表す。

0066

クレードの命名に特有なもの
本発明の目的上、命名法[IV]又は[I/V]は、この位置におけるアミノ酸がイソロイシン(Ile、I)又はバリン(Val、V)であり得ることを意味する。同様に、命名法[LVI]及び[L/V/I]は、この位置におけるアミノ酸がロイシン(Leu、L)、バリン(Val、V)、又はイソロイシン(Ile、I)であり得ることを意味し、本明細書に記載される他の組み合わせについても同様である。特に更に限定されない限り、アミノ酸Xは、20種の天然アミノ酸のいずれかであってもよいと定義される。

0067

本発明は、好ましくはバチルス属、特にバチルス・シビから得られる、すなわち、親DNaseがバチルス属に由来する新規DNaseを含む洗剤組成物を提供する。本発明において使用するのに好適なDNaseは、配列番号1を有するポリペプチドと少なくとも60%の配列同一性を有し、配列番号1を有するDNaseと比較して少なくとも1つのアミノ酸位置に改変を含む。本発明において使用するのに好適なDNase変異体は、配列番号1におけるある位置に相当する位置で行われたアミノ酸の少なくとも1つの置換を含むアミノ酸配列を含み得る。当該DNase変異体は、好ましくは、配列番号1のある位置に相当する位置で行われたアミノ酸の少なくとも1つの欠失を含むアミノ酸配列を含み得る。当該DNase変異体は、好ましくは、配列番号1のある位置に相当する位置で行われたアミノ酸の少なくとも1つの挿入を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明において使用するのに好適なDNase変異体は、親DNaseと比較して又は配列番号1と比較して少なくとも1つの改善された特性を有する。特性としては、洗剤中での安定性、保存安定性、洗浄安定性、及び熱安定性等の安定性、洗浄性能、特に念入りな洗浄性能、発現レベルの増加、及び悪臭低減が挙げられるが、これらに限定されない。

0068

DNase変異体
本発明の組成物において使用するのに好適なDNase変異体は、好ましくは、配列番号1の変異体又はそれと少なくとも60%の同一性を有するDNaseの変異体であり、配列番号1のDNase変異体又はそれと少なくとも60%の同一性を有するDNaseの生成方法である。

0069

好適なDNase変異体は、1、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16、17、19、21、22、24、25、27、28、29、30、32、38、39、40、42、49、51、52、55、56、57、58、59、61、63、65、68、76、77、78、79、80、82、83、92、93、94、99、101、102、104、105、107、109、112、116、125、126、127、130、132、135、138、139、143、144、145、147、149、152、156、157、159、160、161、162、164、166、167、168、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、181及び182からなるリストから選択される1つ以上の位置に改変を含み得、各位置は、配列番号1のポリペプチドの位置に対応し、変異体は、DNase活性を有し、変異体は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するDNaseと比較して少なくとも1つの改善された特性を有する。

0070

変異体は、成熟親DNaseのアミノ酸配列と少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有し得る。

0071

いくつかの態様では、変異体は、配列番号1に示すポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有する。

0072

本発明は、更に、配列番号1を含むDNase親の変異体を含む組成物であって、当該変異体が、配列番号1と比較して、配列番号1の位置に対応する1、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16、17、19、21、22、24、25、27、28、29、30、32、38、39、40、42、49、51、52、55、56、57、58、59、61、63、65、68、76、77、78、79、80、82、83、92、93、94、99、101、102、104、105、107、109、112、116、125、126、127、130、132、135、138、139、143、144、145、147、149、152、156、157、159、160、161、162、164、166、167、168、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、181及び182位から選択される少なくとも1つの位置に改変を含み、変異体が、配列番号1と少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有し、変異体がDNase活性を有し、変異体が、配列番号1のDNaseと比較して少なくとも1つの改善された特性を有する、組成物に関する。

0073

変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと比較して、配列番号1の1、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、16、17、19、21、22、24、25、27、28、29、30、32、38、39、40、42、49、51、52、55、56、57、58、59、61、63、65、68、76、77、78、79、80、82、83、92、93、94、99、101、102、104、105、107、109、112、116、125、126、127、130、132、135、138、139、143、144、145、147、149、152、156、157、159、160、161、162、164、166、167、168、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、181及び182位に対応する1つ以上の位置に改変を含み得、配列番号1に示されるポリペプチドの全長と少なくとも80%の配列同一性を有し、DNasa活性を有する。

0074

好ましくは、DNase変異体は、改善された性能を有し、改善された性能は、増大した安定性、例えば、改善された洗剤安定性、改善された洗浄安定性、改善された保存安定性、及び/又は改善された熱安定性である。

0075

いくつかの好ましい態様では、改変は置換であり、DNase変異体は、(配列番号1と比較して)1つ以上の置換を含み、置換は、T1E、T1L、T1V、T1F、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10T、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13T、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、A17S、T19K、T19N、T19L、T19S、T19I、T19V、K21Q、K21E、K21M、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22S、T22I、G24Y、S25P、S25T、S27N、S27I、S27M、S27D、S27T、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42G、S42C、S42D、S42L、S42M、S42F、S42N、S42W、V49R、L51I、K52I、K52Q、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57Y、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68K、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76I、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78L、F78I、F78H、F78V、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、N80S、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104S、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107Q、K107D、Q109K、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、T127S、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144A、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147H、A147R、A147K、A147Q、A147W、A147N、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159H、Y159F、K160R、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162N、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164H、S164N、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171N、T171A、T171S、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、G175S、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181I、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181V、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E、Y182T及びY182Wからなる群から選択され、変異体はDNase活性を有し、各位置は、配列番号1に示されるポリペプチドの位置に対応する(配列番号1に従って付番)。

0076

更により好ましい態様では、改変は置換であり、DNase変異体は、(配列番号1と比較して)1つ以上の置換を含み、置換は、T1I、T1V、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、T19K、T19L、T19S、T19I、T19V、K21E、K21M、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22I、G24Y、S25P、S27N、S27I、S27M、S27D、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42C、S42L、S42M、S42F、S42W、V49R、L51I、K52I、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78I、F78H、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107D、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147Q、A147W、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159F、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171A、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E、Y182T及びY182Wからなる群から選択され、変異体はDNase活性を有し、各位置は、配列番号1に示されるポリペプチドの位置に対応する(配列番号1に従って付番)。

0077

好適な変異体中の置換の数は、1〜20個、例えば、1〜10個及び1〜5個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の置換であることが好ましい場合がある。

0078

いくつかの好ましい態様では、本発明で使用するのに好適なDNase変異体は、(配列番号1と比較して)1つ以上の置換を含み得、当該置換は、T1I、T1L、T1V、T1F、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10T、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13T、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、A17S、T19K、T19N、T19L、T19S、T19I、T19V、K21Q、K21E、K21M、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22S、T22I、G24Y、S25P、S25T、S27N、S27I、S27M、S27D、S27T、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42G、S42C、S42D、S42L、S42M、S42F、S42N、S42W、V49R、L51I、K52I、K52Q、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57Y、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68K、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76I、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78L、F78I、F78H、F78V、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、N80S、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104S、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107Q、K107D、Q109K、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、T127S、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144A、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147H、A147R、A147K、A147Q、A147W、A147N、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159H、Y159F、K160R、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162N、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164H、S164N、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171N、T171A、T171S、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、G175S、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181I、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181V、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E、Y182T及びY182Wからなる群から選択され、変異体はDNase活性を有し、変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を有し、各位置は、配列番号1に示されるポリペプチドの位置に対応する(配列番号1に従って付番)。

0079

好適なDNase変異体は、配列番号1と少なくとも60%の配列同一性を有し得、変異体は、関連するアッセイで試験したとき、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含むDNaseと比較して少なくとも1つの改善された特性を有する。DNase変異体を関連するアッセイにおいて対象特性について試験し、参照DNaseの特性に1の値が与えられるとき、DNase変異体は、好ましくは、1を超える改善係数を有する。好ましくは、特性は、洗剤中における保存安定性等の安定性及び/又は念入りな洗浄性能等の洗浄性能である。

0080

いくつかの態様では、本発明に係る変異体は、1.0超の半減期改善係数HIFとして測定される親DNaseに対する1つ以上の改善された特性を有し、その改善された特性は、洗剤中における安定性等の安定性である。

0081

変異体の半減期改善係数(HIF)は、T1/2変異体/T1/2参照として計算することができる。参照配列と比較して1.0よりも大きい半減期改善係数HIFを有する変異体を、改善された変異体であると同定した。

0082

いくつかの好適な変異体は、少なくとも1.05、1.1;1.15、1.2;1.3;1.4;1.5;1.6;1.7;1.8;1.9;2.0;2.1;2.2;2.3;2.4;2.5;2.6;2.7、2.8;2.9;3.0、3.1;3.2;3.3;3.4;3.5、3.6、3.7、3.8、3.9;4.0、4.1;4.2;4.3;4.4;4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1;5.2;5.3;5.4;5.5、5.6、5.7、5.8、5.9;3.0、6.1;6.2;6.3;6.4;6.5、6.6、6.7、6.8、6.9;7.0、7.1;7.2;7.3;7.4;7.5、7.6、7.7、7.8、7.9;8.0、8.1;8.2;8.3;8.4;8.5、8.6、8.7、8.8、8.9;9.0、9.1;9.2;9.3;9.4;9.5、9.6、9.7、9.8、9.9;10.0、10.1;10.2;10.3;10.4;10.5、10.6、10.7、10.8、10.9;12、15、16、20、25又は30の半減期改善係数(HIF)を有する。

0083

変異体を作製するのに有用なタンパク質内のアミノ酸位置は、少なくとも1つの改変が、変化していないタンパク質、すなわち親と比較して改善された特徴を呈する変異体、すなわち、HIF>1.0を導く位置である。改善された特徴は、アッセイI若しくはIIを使用して、又は実施例2に記載のとおり判定することができる。

0084

好ましくは、DNase変異体は、参照DNase、例えば、配列番号1に示されるポリペプチドを含むDNaseと比較して改善されたDNase活性を有し、活性は、アッセイに記載されているアッセイI又はアッセイII及び以下の実施例において試験される。

0085

活性改善係数(AIF)は、変異体の活性(参照条件における勾配)を参照の活性で除することによって計算される。改善されたAIF>1.0を有する変異体を、対応する参照と比較して改善された活性を有すると同定した。

0086

好ましくは、DNase変異体は、参照DNase、例えば、配列番号1に示されるポリペプチドを含むDNaseと比較して改善された洗剤中における安定性を有し、安定性は、実施例2に記載のとおり試験される。

0087

好ましくは、DNase変異体は、参照DNase、例えば、配列番号1に示されるポリペプチドを含むDNaseと比較して改善された念入りな洗浄性能を有する。

0088

いくつかの好ましい態様では、好適なDNase変異体は、(配列番号1と比較して)1つ以上の置換を含み、置換は、T1I、T1L、T1V、T1F、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10T、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13T、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、A17S、T19K、T19N、T19L、T19S、T19I、T19V、K21Q、K21E、K21M、T22P、T22A、T22VT22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22S、T22I、G24Y、S25P、S25T、S27N、S27I、S27M、S27D、S27T、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42G、S42C、S42D、S42L、S42M、S42F、S42N、S42W、V49R、L51I、K52I、K52Q、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57Y、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68K、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76I、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78L、F78I、F78H、F78V、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、N80S、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104S、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107Q、K107D、Q109K、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、T127S、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144A、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147H、A147R、A147K、A147Q、A147W、A147N、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159H、Y159F、K160R、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162N、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164H、S164N、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171N、T171A、T171S、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、G175S、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181I、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181V、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E、Y182T及びY182Wからなる群から選択され、変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有し、各位置は、配列番号1に示されるポリペプチドの位置に対応し(配列番号1に従って付番)、変異体は、親DnNase、例えば、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むDNaseと比較して、少なくとも1つの改善された特性を有し、所望により、改善された特性は、以下のうちの1つ以上である:改善されたDNase活性(この活性はアッセイI又はアッセイIIで試験される)、改善された安定性(この安定性は、実施例2に記載のとおり試験される)、及び/又は改善された念入りな洗浄性能。

0089

いくつかの態様では、DNase変異体は、親又は配列番号1に示されるポリペプチドを有するDNaseと比較して、半減期改善係数HIFとして測定される改善された安定性を有する。

0090

いくつかの好ましいDNase変異体は、(配列番号1と比較して)1つ以上の置換を含み、置換は、T1I、T1L、T1V、T1F、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10T、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13T、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、A17S、T19K、T19N、T19L、T19S、T19I、T19V、K21Q、K21E、K21M、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22S、T22I、G24Y、S25P、S25T、S27N、S27I、S27M、S27D、S27T、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42G、S42C、S42D、S42L、S42M、S42F、S42N、S42W、V49R、L51I、K52I、K52Q、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57Y、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68K、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76I、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78L、F78I、F78H、F78V、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、N80S、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104S、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107Q、K107D、Q109K、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、T127S、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144A、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147H、A147R、A147K、A147Q、A147W、A147N、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159H、Y159F、K160R、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162N、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164H、S164N、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171N、T171A、T171S、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、G175S、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181I、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181V、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E、Y182T及びY182Wからなる群から選択され、各置換は、親DNase、例えば、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むDNaseと比較して、少なくとも1.05、例えば1.08、例えば1.1、例えば1.15、例えば1.2、例えば1.25、例えば1.3、例えば1.4、例えば1.5、例えば1.6、例えば1.7、例えば1.8、例えば1.9、例えば2、例えば3、例えば4、例えば5又は例えば少なくとも10の半減期改善係数HIFとして測定される安定性の増大を有するDNasa変異体を提供し、変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、例えば少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有し、各位置は、配列番号1に示されるポリペプチドの位置に対応する(配列番号1に従って付番)。

0091

いくつかの好ましいDNase変異体は、(配列番号1と比較して)1つ以上の置換を含み、置換は、T1I、T1L、T1V、T1F、T1Y、T1M、T1E、G4N、P6V、S7D、K8V、S9K、S9Q、S9V、A10D、A10M、A10I、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13T、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、Q14M、A17C、A17V、A17E、A17T、A17S、T19K、T19N、T19L、T19S、K21Q、K21E、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22S、T22I、G24Y、S25P、S25T、S27N、S27I、S27M、S27D、S27T、S27V、S27F、S27A、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、Q40V、S42G、S42C、S42D、S42L、S42M、S42F、S42N、V49R、L51I、K52I、K52Q、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57Y、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、P63A、T65L、T65I、T65V、S68V、S68I、S68W、S68K、S68Y、S68H、S68C、S68T、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76I、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78L、F78I、F78H、F78V、T79G、T79R、N80K、N80S、S82L、S82E、S82K、S82R、D83C、D83F、L92T、A93G、G99S、S101D、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、T104S、T104P、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107Q、K107D、Q109K、Q109R、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、T127S、S130E、G132R、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144A、S144L、S144P、S144E、G145V、G145E、A147H、A147R、A147K、A147Q、A147W、A147N、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、T157S、Y159H、K160R、W161L、G162Q、G162N、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、S164R、S164H、S164N、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、T171D、T171E、T171N、T171A、T171S、T171C、A172G、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、G175S、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181I、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181V、S181G、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D及びY182Qからなる群から選択され、各置換は、少なくとも1.1の半減期改善係数HIFとして測定される安定性の増大を有するDNasa変異体を提供し、変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有し、各位置は、配列番号1に示されるポリペプチドの位置に対応する(配列番号1に従って付番)。

0092

いくつかの好ましいDNase変異体は、(配列番号1と比較して)1つ以上の置換を含み、置換は、T1I、T1L、T1V、T1F、P6V、S7D、K8V、S9K、A10D、Q12S、Q12V、S13D、S13Y、S13T、S13Q、S13F、S13R、Q14M、A17C、A17V、A17E、A17T、T19K、T19N、T19L、K21Q、K21E、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22S、T22I、G24Y、S25P、S25T、S27N、S27I、S27M、S30K、S30D、D32Q、I38V、S39A、S39P、S39Y、Q40V、S42G、S42C、S42D、S42L、V49R、K52I、K52Q、A55S、D56I、D56L、S57W、S57Y、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、P63A、T65L、S68V、S68I、S68W、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78L、F78I、T79G、T79R、N80K、S82L、S82E、D83C、A93G、S101D、S102M、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、Q109K、Q109R、A112S、S116D、S116R、S116Q、A125K、S126I、S126E、T127C、T127V、T127S、S130E、G132R、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144A、S144L、S144P、G145V、G145E、A147H、A147R、A147K、A147Q、A147W、A147N、A147S、G149S、K152H、S156C、T157S、Y159H、W161L、G162Q、G162N、G162D、G162M、S164R、S164H、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S168V、S168E、S168D、K170S、K170L、T171D、T171E、T171N、A172G、L173T、L173A、Q174L、G175D、G175E、G175N、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S181R、S181E、S181D、S181I、S181F、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G及びY182Aからなる群から選択され、各置換は、少なくとも1.15の半減期改善係数HIFとして測定される安定性の増大を有するDNasa変異体を提供し、変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有し、各位置は、配列番号1に示されるポリペプチドの位置に対応する(配列番号1に従って付番)。

0093

いくつかの好ましいDNase変異体は、(配列番号1と比較して)1つ以上の置換を含み、置換は、T1I、T1L、T1V、T1F、P6V、K8V、A10D、Q12S、Q12V、S13D、S13Y、S13T、S13Q、A17C、A17V、T19K、K21Q、K21E、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22S、T22I、G24Y、S25P、S25T、S27N、S30K、D32Q、I38V、S39A、S39P、S39Y、Q40V、S42G、S42C、K52I、K52Q、A55S、D56I、S57W、S57Y、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、Y58A、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、P63A、T65L、S68V、S68I、S68W、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、T77N、T77Y、F78L、F78I、T79G、T79R、N80K、A93G、S101D、S102M、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、Q109K、Q109R、A112S、S116D、S116R、S126I、S126E、T127C、T127V、T127S、S130E、G132R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144A、G145V、A147H、A147R、A147K、A147Q、A147W、A147N、K152H、S156C、G162Q、G162N、G162D、S164R、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S168V、S168E、S168D、K170S、K170L、T171D、T171E、A172G、L173T、L173A、Q174L、G175D、G175E、G175N、L177I、N178D、N178E、N178T、S181R、S181E、Y182M、Y182C及びY182Kからなる群から選択され、各置換は、少なくとも1.2の半減期改善係数HIFとして測定される安定性の増大を有するDNasa変異体を提供し、変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有し、各位置は、配列番号1に示されるポリペプチドの位置に対応する(配列番号1に従って付番)。

0094

いくつかの好ましいDNase変異体は、(配列番号1と比較して)1つ以上の置換を含み、置換は、T1I、T1L、T1V、Q12S、Q12V、A17C、T22P、T22A、T22V、T22D、Q40V、K52I、K52Q、A55S、D56I、S57W、S57Y、S57F、S57H、S57C、S57P、S68V、V76G、V76L、V76C、T77N、F78L、A93G、T105V、K107L、Q109K、A112S、S126I、G132R、G145V、A147H、A147R、A147K、A147Q、S156C、G162Q、Q166D、S167M、S168V、K170S、T171D、L173T、L173A、G175D、G175E及びL177Iからなる群から選択され、各置換は、少なくとも1.5の半減期改善係数HIFとして測定される安定性の増大を有するDNasa変異体を提供し、変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有し、各位置は、配列番号1に示されるポリペプチドの位置に対応する(配列番号1に従って付番)。

0095

いくつかの好ましいDNase変異体は、(配列番号1と比較して)1つ以上の置換を含み、置換は、T1I、T1L、Q12S、Q12V、A17C、T22P、Q40V、K52I、S57W、S57Y、S57F、V76G、Q109K、A112S、A147H、A147R、A147K、K170S、T171D及びG175Dからなる群から選択され、各置換は、少なくとも2.0の半減期改善係数HIFとして測定される安定性の増大を有するDNasa変異体を提供し、変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有し、各位置は、配列番号1に示されるポリペプチドの位置に対応する(配列番号1に従って付番)。

0096

いくつかの特に好ましいDNase変異体は、(配列番号1と比較して)1つ以上の置換を含み、該置換は、T1I、T1L、T1V、T22P、S25P、S57Y、S57W、S57F、S59V、S68V、V76L、T77Y、F78L、A93G、Q109R、S116D、T127V、S144P、A147H、A147R、G162Q、Q166D、S167L、S167F、G175D、G175N及びN178Dからなる群から選択され、各置換は、配列番号1に示されるポリペプチドと比較して少なくとも1つの改善された特性を有するDNasa変異体を提供し、変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有し、各位置は、配列番号1に示されるポリペプチドの位置に対応する(配列番号1に従って付番)。

0097

好ましくは、変異体は、親酵素と比較して改善された(増大した)比活性を有する。

0098

好ましくは、変異体は、親酵素と比較して改善された(増大した)保存条件下における安定性を有する。

0099

好ましくは、変異体は、親酵素と比較して改善された(増大した)熱安定性を有する。

0100

本発明のDNase変異体は、配列番号1に示されるアミノ酸配列を有するDNase等の親DNaseと比較して少なくとも1つの改善された特性を有する。これらの各突然変異は、配列番号1又はそれと少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチドに導入されたとき、改善された安定性等の少なくとも1つの改善された特性を提供する。これら各突然変異が改善された効果を提供するので、上記置換のうちの2、3、4個等がこの効果を増大させ得ることは当業者には明らかである。したがって、本発明のいくつかの態様は、T1I、T1L、T1V、T1F、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10T、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13T、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、A17S、T19K、T19N、T19L、T19S、T19I、T19V、K21Q、K21E、K21M、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22S、T22I、G24Y、S25P、S25T、S27N、S27I、S27M、S27D、S27T、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42G、S42C、S42D、S42L、S42M、S42F、S42N、S42W、V49R、L51I、K52I、K52Q、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57Y、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68K、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76I、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78L、F78I、F78H、F78V、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、N80S、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104S、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107Q、K107D、Q109K、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、T127S、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144A、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147H、A147R、A147K、A147Q、A147W、A147N、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159H、Y159F、K160R、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162N、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164H、S164N、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171N、T171A、T171S、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、G175S、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181I、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181V、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E、Y182T及びY182W(配列番号1に従って付番)からなる群から選択される置換のうちの少なくとも2、3、4、5、6、7、8個を含むDNase変異体に関する。

0101

好ましい置換としては、以下の突然変異のうちの1つ以上が挙げられる:T1I、T1V、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、T19K、T19L、T19S、T19I、T19V、K21E、K21M、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22I、G24Y、S25P、S27N、S27I、S27M、S27D、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42C、S42L、S42M、S42F、S42W、V49R、L51I、K52I、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78I、F78H、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107D、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147Q、A147W、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159F、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171A、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E又はY182T。

0102

また、特に好ましい置換は、以下のうちの1つ以上を含む:T1I、T1V、Q12S、Q12V、A17C、T22P、T22A、T22V、T22D、Q40V、K52I、A55S、D56I、S57W、S57F、S57H、S57C、S57P、S68V、V76G、V76L、V76C、T77N、A93G、T105V、K107L、A112S、S126I、G132R、G145V、A147Q、S156C、G162Q、Q166D、S167M、S168V、K170S、T171D、L173T、L173A、G175D、G175E又はL177I。

0103

また、特に好ましい置換は、以下のうちの1つ以上を含む:T1I、T1V、T22P、S25P、S57W、S57F、S59V、S68V、V76L、T77Y、A93G、Q109R、S116D、T127V、S144P、G162Q、Q166D、S167L、S167F、G175D、G175N又はN178D。

0104

上記突然変異のうちのいずれかを含むいくつかのDNase変異体は、念入りな洗浄において有効である。

0105

好適な変異体は、上に列挙されたものに対して追加の突然変異を含み得る。これら追加の突然変異は、好ましくは、変異体DNaseの改善された特性を著しくは変化させない。

0106

保存的置換の例は、塩基性アミノ酸アルギニン、リジン及びヒスチジン)、酸性アミノ酸グルタミン酸及びアスパラギン酸)、極性アミノ酸グルタミン及びアスパラギン)、疎水性アミノ酸(ロイシン、イソロイシン及びバリン)、芳香族アミノ酸フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン)、及び低分子アミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、スレオニン及びメチオニン)の群内のものである。一般的に比活性を変化させないアミノ酸の置換は、当該技術分野において既知であり、例えば、H.Neurath and R.L.Hill,1979,In,The Proteins,Academic Press,New Yorkに記載されている。一般的な置換は、Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、及びAsp/Glyである。

0107

ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニン−スキャニング突然変異誘発(Cunningham and Wells,1989,Science 244:1081〜1085)等の当該技術分野において既知の手順によって同定され得る。後者の技術では、分子中の全ての残基に単一アラニン突然変異を導入し、得られた突然変異型分子をDNase活性について試験して、当該分子の活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Hilton et al.,1996,J.Biol.Chem.271:4699〜4708も参照。また、酵素又は他の生物学的相互作用の活性部位は、推定接触部位のアミノ酸の突然変異と併せて、核磁気共鳴結晶学電子線回折、又は光親和性標識等の技術によって決定されるように、構造の物理分析によっても決定することができる。例えば、de Vos et al.,1992,Science 255:306〜312;Smith et al.,1992,J.Mol.Biol.224:899〜904;Wlodaver et al.,1992,FEBSLett.309:59〜64を参照。

0108

好ましい変異体は、保存モチーフ[D/M/L][S/T]GYSR[D/N](配列番号25)又はASXNRSKG(配列番号26)を含み、これらは下記GYSグレードのDNaseに共有されている。「定義」において説明したとおり、クレードは、共通の祖先に由来する相同的特徴に基づいて一緒のクラスタに分類されたポリペプチドの群を含む。系統樹に示される群、例えばクレードを形成するポリペプチドは、多くの場合、共通の特性を共有し、そのクレードではない他のポリペプチドよりも密接に関連している。

0109

したがって、DNase親の好ましい変異体は、[D/M/L][S/T]GYSR[D/N](配列番号25)及び/又はASXNRSKG(配列番号26)モチーフの一方又は両方を含み、変異体は、配列番号1と比較して1つ以上の置換を含み、置換は、T1I、T1V、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、T19K、T19L、T19S、T19I、T19V、K21E、K21M、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22I、G24Y、S25P、S27N、S27I、S27M、S27D、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42C、S42L、S42M、S42F、S42W、V49R、L51I、K52I、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78I、F78H、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107D、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147Q、A147W、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159F、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171A、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E、Y182T及びY182Wからなる群から選択され、変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも80%の配列同一性を有し、変異体はDNase活性を有する。

0110

好ましい変異体は、[D/M/L][S/T]GYSR[D/N](配列番号25)及び/又はASXNRSKG(配列番号26)モチーフの一方又は両方を含み、当該変異体は、配列番号1と比較して1つ以上の置換を含み、当該置換は、T1I、T1L、T1V、T1F、T1Y、T1M、T1E、G4N、T5F、T5C、P6V、P6G、S7D、S7T、K8V、S9K、S9Q、S9V、S9L、S9F、S9P、S9R、A10D、A10M、A10I、A10Q、A10T、A10V、A10L、A10K、Q12S、Q12V、Q12E、S13D、S13Y、S13T、S13Q、S13F、S13R、S13V、S13N、S13H、S13M、S13W、S13K、S13L、S13E、Q14M、Q14R、N16S、A17C、A17V、A17E、A17T、A17S、T19K、T19N、T19L、T19S、T19I、T19V、K21Q、K21E、K21M、T22P、T22A、T22V、T22D、T22R、T22K、T22M、T22E、T22H、T22L、T22W、T22F、T22C、T22S、T22I、G24Y、S25P、S25T、S27N、S27I、S27M、S27D、S27T、S27V、S27F、S27A、S27C、S27L、S27E、G28L、Y29W、S30K、S30D、S30H、S30T、D32Q、I38V、I38M、S39A、S39P、S39Y、S39H、S39E、S39N、S39M、S39D、Q40V、S42G、S42C、S42D、S42L、S42M、S42F、S42N、S42W、V49R、L51I、K52I、K52Q、K52H、A55S、D56I、D56L、D56T、S57W、S57Y、S57F、S57H、S57C、S57P、S57V、S57R、S57T、Y58A、Y58T、S59C、S59T、S59L、S59Q、S59V、S59K、S59R、S59M、S59I、S59H、N61D、P63A、T65L、T65I、T65V、T65R、T65K、S68V、S68I、S68W、S68K、S68Y、S68H、S68C、S68T、S68L、V76G、V76L、V76C、V76K、V76H、V76E、V76A、V76Y、V76N、V76M、V76R、V76I、V76F、T77N、T77Y、T77W、T77R、F78L、F78I、F78H、F78V、F78Y、F78C、T79G、T79R、N80K、N80S、S82L、S82E、S82K、S82R、S82H、D83C、D83F、D83L、L92T、A93G、E94N、G99S、S101D、S101A、S102M、S102L、S102V、S102A、S102K、S102T、S102R、T104S、T104P、T104A、T105V、T105I、K107L、K107C、K107R、K107H、K107S、K107M、K107E、K107A、K107Q、K107D、Q109K、Q109R、Q109S、A112S、S116D、S116R、S116Q、S116H、S116V、S116A、S116E、S116K、A125K、S126I、S126E、S126A、S126C、T127C、T127V、T127S、S130E、G132R、D135R、T138Q、W139R、R143E、R143K、S144Q、S144H、S144A、S144L、S144P、S144E、S144K、G145V、G145E、G145D、G145A、A147H、A147R、A147K、A147Q、A147W、A147N、A147S、G149S、K152H、K152R、S156C、S156G、S156K、S156R、S156T、S156A、T157S、Y159H、Y159F、K160R、K160V、W161L、W161Y、G162Q、G162N、G162D、G162M、G162R、G162A、G162S、G162E、G162L、G162K、G162V、G162H、S164R、S164H、S164N、S164T、Q166D、S167M、S167L、S167F、S167W、S167E、S167A、S167Y、S167H、S167C、S167I、S167Q、S167V、S167T、S168V、S168E、S168D、S168L、K170S、K170L、K170F、K170R、T171D、T171E、T171N、T171A、T171S、T171C、A172G、A172S、L173T、L173A、L173V、Q174L、G175D、G175E、G175N、G175R、G175S、M176H、L177I、N178D、N178E、N178T、N178S、N178A、S179E、S181R、S181E、S181D、S181I、S181F、S181H、S181W、S181L、S181M、S181Y、S181Q、S181V、S181G、S181A、Y182M、Y182C、Y182K、Y182G、Y182A、Y182S、Y182V、Y182D、Y182Q、Y182F、Y182L、Y182N、Y182I、Y182E、Y182T及びY182W(配列番号1に従って付番)からなる群から選択され、変異体は、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%であるが100%未満の配列同一性を有し、変異体は、DNasa活性を有する。

0111

親DNase
好ましくは、DNase親は、酵素クラスE.C.3.1.11、E.C.3.1.12、E.C.3.1.15、E.C.3.1.16、E.C.3.1.21、E.C 3.1.22、E.C 3.1.23、E.C 3.1.24、及びE.C.3.1.25のいずれかから選択される。

0112

好ましくは、DNase親は微生物から得られ、DNaseは微生物酵素である。DNaseは、好ましくは、真菌又は細菌起源である。

0113

DNase親は、好ましくは、バチルス、例えば、バチルス・シビ、バチルス属菌株62451、バチルス・ホリコシイ、バチルス属菌株16840、バチルス属菌株62668、バチルス属菌株13395、バチルス・ホルネキアエ、バチルス属菌株11238、バチルス・イドリエンシス、バチルス属菌株62520、バチルス・アルギコーラ、バチルス・ベトナメンシス、バチルス・フワジンポエンシス、バチルス・インディカス、バチルス・マリスフラビ、バチルス・ルシフェレンシス、バチルス属菌株SA2−6等のバチルス属から得ることができる。

0114

DNase親は、好ましくは、保存モチーフ[D/M/L][S/T]GYSR[D/N](配列番号25)又はASXNRSKG(配列番号26)を含むDNaseであり、類似の構造的及び機能的特性を共有するGYSクレードに含まれるDNaseの群に属する。例えば、図1のアラインメント、及び国際公開第2017/060475号の実施例11における系統樹の作成を参照。GYSクレードのDNaseは、好ましくは、バチルス属から得られる。

0115

好ましい変異体は、DNase活性を有するGYSクレードのDNase親の変異体であり、所望により、親は、[D/M/L][S/T]GYSR[D/N](配列番号25)、ASXNRSKG(配列番号26)モチーフの一方又は両方を含み、ポリペプチドは、以下のポリペプチドの群から選択される:
a)配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
b)配列番号2に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
c)配列番号3に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
d)配列番号4に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
e)配列番号5に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
f)配列番号6に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
g)配列番号7に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
h)配列番号8に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
i)配列番号9に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
j)配列番号10に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
k)配列番号11に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
l)配列番号12に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
m)配列番号13に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
n)配列番号14に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
o)配列番号15に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
p)配列番号16に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
q)配列番号17に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
r)配列番号18に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
s)配列番号19に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
t)配列番号20に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
u)配列番号21に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
v)配列番号22に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、
w)配列番号23に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド、及び
x)配列番号24に示されるポリペプチドと少なくとも80%、少なくとも83%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するポリペプチド。

0116

DNase活性を有し、GYSクレードのモチーフを含むポリペプチドは、特に良好な念入りな洗浄特性を有する、例えば、DNaseは、織物又は硬質表面等の物品から微生物起源の汚れ等の有機物の成分を除去又は低減するのに特に有効である。

0117

好ましくは、変異体は、GYSクレードに属するDNase親の変異体であり、親DNaseは、[D/M/L][S/T]GYSR[D/N](配列番号25)又はASXNRSKG(配列番号26)モチーフの一方又は両方を含む。

0118

親DNaseは、(a)配列番号1の成熟ポリペプチドと少なくとも60%の配列同一性を有するポリペプチド、(b)成熟ポリペプチドのコード配列若しくはその完全長相補体高ストリンジェント条件下ハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチド、又は(c)成熟ポリペプチドのコード配列と少なくとも60%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチドであってよい。

0119

好ましくは、親は、DNase活性を有する、配列番号1に示されるポリペプチドと少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を配列番号1に示されるポリペプチドに対して有する。一態様では、親のアミノ酸配列は、配列番号1に示されるポリペプチドとは10個以下、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のアミノ酸が異なる。

0120

好ましくは、親は、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。

0121

好ましくは、親は、バチルス属のDNase、例えば、バチルス・シビのDNase、例えば、配列番号1として本明細書に開示されるDNaseである。

0122

DNase変異体の使用
本発明のDNase変異体は、洗濯などの洗浄に用いるのに適している。したがって、本発明のいくつかの態様は、物品を洗濯する方法であって、
a.本明細書に記載される洗剤組成物を含む洗浄液に物品を曝露する工程と、
b.少なくとも1つの洗浄サイクルを完了する工程と、
c.任意追加的に、物品をすすぐ工程と、
を含み、
物品が、織物である、方法に関する。

0123

液体溶液のpHは、1〜11の範囲内、例えば5.5〜11の範囲内、例えば7〜9の範囲内、7〜8の範囲内、又は7〜8.5の範囲内である。

0124

洗浄液は、5℃〜95℃の範囲内、又は10℃〜80℃の範囲内、10℃〜70℃の範囲内、10℃〜60℃の範囲内、10℃〜50℃の範囲内、15℃〜40℃の範囲内、又は20℃〜30℃の範囲内の温度を有し得る。いくつかの態様では、洗浄液の温度は30℃である。

0125

本発明は、更に、当該方法に従って洗浄された物品に関する。

0126

本発明の洗剤組成物を水に添加して洗浄液を形成することができる。

0127

洗浄液中のDNase変異体酵素の濃度は、典型的には、0.00004〜100ppmの酵素タンパク質の範囲、例えば、0.00008〜100の範囲、0.0001〜100の範囲、0.0002〜100の範囲、0.0004〜100の範囲、0.0008〜100の範囲、0.001〜100ppmの酵素タンパク質の範囲、0.01〜100ppmの酵素タンパク質、好ましくは0.05〜50ppmの酵素タンパク質、より好ましくは0.1〜50ppmの酵素タンパク質、より好ましくは0.1〜30ppmの酵素タンパク質、より好ましくは0.5〜20ppmの酵素タンパク質、最も好ましくは0.5〜10ppmの酵素タンパク質である。

0128

Dnase変異体及び補助剤を含む本発明の洗剤組成物は、物品の念入りな洗浄のため、物品のべたつきを防止及び/若しくは低減するため、物品上の染みを前処理するため、洗浄サイクル中の汚れの再付着を防止及び/若しくは低減するため、物品への汚れの付着を防止及び/若しくは低減するため、物品の白色度を維持若しくは改善するため、並びに/又は物品からの悪臭を防止及び/若しくは低減するために使用することができる。好ましい洗剤組成物は、洗濯プロセスにおいて布地を処理及び/又は洗浄するためのものである。

0129

変異体の調製
本発明で使用するのに好適な変異体は、下記のもの等の手順によって調製することができる。

0130

部位特異的突然変異誘発は、親をコードしているポリヌクレオチドにおける1つ以上の規定の部位に1つ以上(例えば、数個)の突然変異を導入する技術である。

0131

部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴うPCRによって、インビトロで行うことができる。また、部位特異的突然変異誘発は、親をコードしているポリヌクレオチドを含むプラスミド中のある部位を制限酵素によって切断し、続いて、ポリヌクレオチド中の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドをライゲーションすることを含むカセット式突然変異誘発によって、インビトロで行うこともできる。通常、上記プラスミド及びオリゴヌクレオチドを分解する制限酵素は同じであるので、プラスミドの付着末端及びインサートを互いにライゲーションさせることができる。例えば、Scherer and Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949〜4955;及びBarton et al.,1990,Nucleic AcidsRes.18:7349〜4966を参照。

0132

また、部位特異的突然変異誘発は、当該技術分野において既知の方法によってインビボで行うこともできる。例えば、米国特許出願公開第2004/0171154号;Storici et al.,2001,Nature Biotechnol.19:773〜776;Kren et al.,1998,Nat.Med.4:285〜290;及びCalissano and Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15〜16を参照。

0133

合成遺伝子構築は、対象ポリペプチドをコードするように設計されたポリヌクレオチド分子インビトロ合成を必要とする。遺伝子合成は、オリゴヌクレオチドを合成し、フォトプログラム可能マイクロ流体チップ上でアセンブルする、Tian et al.(2004,Nature 432:1050〜1054)によって記載されているマルチプレックスマイクロチップベースの技術及び類似の技術等の多くの技術を利用して実施することができる。

0134

単一又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び/又は挿入は、公知の突然変異誘発、組み換え、及び/又はシャッフリングの方法、続いて、Reidhaar−Olson and Sauer,1988,Science 241:53〜57;Bowie and Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152〜2156;国際公開第95/17413号;又は同第95/22625号によって開示されているもの等の関連するスクリーニング手順を用いて実施及び試験され得る。使用することができる他の方法としては、エラープローンPCR、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al.,1991,Biochemistry 30:10832〜10837;米国特許第5,223,409号;国際公開第92/06204号)、及び定方向突然変異誘発(Derbyshire et al.,1986,Gene 46:145;Ner et al.,1988,DNA 7:127)が挙げられる。

0135

突然変異誘発/シャッフリング方法は、宿主細胞によって発現されるクローニングされた突然変異ポリペプチドの活性を検出するためにハイスループット自動スクリーニング法と組み合わせてもよい(Ness et al.,1999,Nature Biotechnology 17:893〜896)。活性ポリペプチドをコードしている突然変異DNA分子を宿主細胞から回収し、当該技術分野において標準的な方法を用いて迅速にシーケンスすることができる。これら方法は、ポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することができる。

0136

半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築、並びに/又は部位特異的な突然変異誘発、及び/若しくはランダムな突然変異誘発、並びに/又はシャッフリングの側面を組み合わせることによって達成される。半合成構築は、PCR技術と組み合わされた、合成されるポリヌクレオチドのフラグメントを利用するプロセスによって典型的に象徴される。このように、遺伝子の規定の領域をデノボ合成することができるが、他の領域は、部位特異的突然変異誘発プライマーを用いて増幅することができ、また、更に他の領域は、エラープローンPCR又は非エラープローンPCR増幅に供することができる。次いで、ポリヌクレオチドのサブシークエンスをシャッフリングしてもよい。

0137

核酸コンストラクト
本発明で使用するのに好適なDNase変異体をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトは、制御配列に適合する条件下で、好適な宿主細胞においてコード配列の発現を誘導する1つ以上の制御配列に操作可能に連結される。

0138

ポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供するために様々な方法で操作され得る。ベクターに挿入する前にポリヌクレオチドを操作することが、発現ベクターによっては望ましい又は必要な場合がある。組み換えDNA法を利用してポリヌクレオチドを改変するための技術は、当該技術分野において周知である。

0139

制御配列は、本発明のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドである、プロモータであってもよい。プロモータは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモータは、突然変異型、切断型、及びハイブリッド型のプロモータを含む、宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってよく、宿主細胞に相同又は非相同な細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードしている遺伝子から得ることができる。

0140

細菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を誘導するのに好適なプロモータの例は、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)アルファアミラーゼ遺伝子(amyQ)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)アルファ−アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルス・リケニフォルミスペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトース産生アミラーゼ遺伝子(amyM)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)レバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バチルス・サブチリスxylA及びxylB遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)cryIIIA遺伝子(Agaisse and Lereclus,1994,Molecular Microbiology 13:97〜107)、大腸菌(E. coli)lacオペロン、大腸菌trcプロモータ(Egon et al.,1988,Gene 69:301〜315)、ストレプトマイセスセリカラー(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)、及び原核生物ベータラクタマーゼ遺伝子(Villa−Kamaroff et al.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727〜3731)から得られるプロモータに加えて、tacプロモータ(DeBoer et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21〜25)である。更なるプロモータは、Gilbert et al.,1980,Scientific American 242:74〜94における「Useful proteins from recombinant bacteria」及びSambrook et al.,1989,上記に記載されている。タンデムプロモータの例は、国際公開第99/43835号に開示されている。

0141

糸状菌宿主細胞において本発明の核酸コンストラクトの転写を誘導するのに好適なプロモータの例は、バチルス・ニデュランス(Bacillus nidulans)アセトアミダーゼ、バチルス・ニガー(Bacillus niger)中性アルファ−アミラーゼ、バチルス・ニガー酸安定性アルファ−アミラーゼ、バチルス・ニガー又はバチルス・アワモリ(Bacillus awamori)のグルコアミラーゼ(glaA)、バチルス・シビTAKAアミラーゼ、バチルス・シビアルカリプロテアーゼ、バチルス・シビトリオースリン酸イソメラーゼフサリウムオキシスポラム(Fusarium oxysporum)トリプシン様プロテアーゼ(国際公開第96/00787号)、フサリウム・ベネナタム(Fusarium venenatum)アミログルコシダーゼ(国際公開第00/56900号)、フサリウム・ベネナタムDaria(国際公開第00/56900号)、フサリウム・ベネナタムQuinn(国際公開第00/56900号)、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼトリコデルマリーゼイ(Trichoderma reesei)ベータ−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼI、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼI、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼII、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼV、トリコデルマ・リーゼイキシラナーゼI、トリコデルマ・リーゼイキシラナーゼII、トリコデルマ・リーゼイキシラナーゼIII、トリコデルマ・リーゼイベータ−キシロシダーゼ、及びトリコデルマ・リーゼイ翻訳延長因子の遺伝子から得られるプロモータに加えて、NA2 tpiプロモータ(未翻訳リーダーがバチルス属トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の未翻訳リーダーによって置換されているバチルス属中性アルファ−アミラーゼ遺伝子由来の改変プロモータであり、非限定的な例としては、未翻訳リーダーがバチルス・ニデュランス又はバチルス・シビのトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の未翻訳リーダーによって置換されているバチルス・ニガー中性アルファ−アミラーゼ遺伝子由来の改変プロモータが挙げられる)、並びにこれらの突然変異型、切断型、及びハイブリッド型のプロモータである。他のプロモータは、米国特許第6,011,147号に記載されている。

0142

酵母宿主では、有用なプロモータは、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)エノラーゼ(ENO 1)、サッカロマイセス・セレビシエガラクトキナーゼ(GAL1)、サッカロマイセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼADH1、ADH2/GAP)、サッカロマイセス・セレビシエトリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)、サッカロマイセス・セレビシエメタロチオネイン(CUP1)、及びサッカロマイセス・セレビシエ3ホスホグリセレートキナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモータは、Romanos et al.,1992,Yeast 8:423〜488によって記載されている。

0143

また、制御配列は、転写を終結するために宿主細胞によって認識される転写ターミネータであってもよい。ターミネータは、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの3’末端に操作可能に連結される。宿主細胞において機能する任意のターミネータを本発明において使用してよい。

0144

細菌宿主細胞に好ましいターミネータは、バチルス・クラウシイ(Bacillus clausii)アルカリプロテアーゼ(aprH)、バチルス・リケニフォルミスアルファ−アミラーゼ(amyL)、及び大腸菌リボソームRNA(rrnB)の遺伝子から得られる。

0145

糸状菌宿主細胞に好ましいターミネータは、バチルス・ニデュランスアセトアミダーゼ、バチルス・ニデュランスアントラニル酸合成酵素、バチルス・ニガーグルコアミラーゼ、バチルス・ニガーアルファ−グルコシダーゼ、バチルス・シビTAKAアミラーゼ、フサリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼ、トリコデルマ・リーゼイベータ−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼI、トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼII、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼI、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼII、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼV、トリコデルマ・リーゼイキシラナーゼI、トリコデルマ・リーゼイキシラナーゼII、トリコデルマ・リーゼイキシラナーゼIII、トリコデルマ・リーゼイベータ−キシロシダーゼ、及びトリコデルマ・リーゼイ翻訳延長因子の遺伝子から得られる。

0146

酵母宿主細胞に好ましいターミネータは、サッカロマイセス・セレビシエエノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエシトクロムC(CYC1)、及びサッカロマイセス・セレビシエグリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネータは、Romanos et al.,1992,上記によって記載されている。

0147

また、制御配列は、遺伝子の発現を増加させる遺伝子のプロモータの下流かつコード配列の上流のmRNA安定化領域であってもよい。

0148

好適なmRNA安定化領域の例は、バチルス・チューリンゲンシスcryIIIA遺伝子(国際公開第94/25612号)及びバチルス・サブチリスSP82遺伝子(Hue et al.,1995,Journal of Bacteriology 177:3465〜3471)から得られる。

0149

また、制御配列は、宿主細胞による翻訳にとって重要なmRNAの非翻訳領域である、リーダーであってもよい。リーダーは、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの5’末端に操作可能に連結される。宿主細胞において機能する任意のリーダーを使用してよい。

0150

糸状菌宿主細胞に好ましいリーダーは、バチルス・シビTAKAアミラーゼ及びバチルス・ニデュランストリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。

0151

酵母宿主細胞に好適なリーダーは、サッカロマイセス・セレビシエエノラーゼ(ENO 1)、サッカロマイセス・セレビシエ3ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエアルファ−因子、及びサッカロマイセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)の遺伝子から得られる。

0152

また、制御配列は、ポリヌクレオチドの3’末端に操作可能に連結しており、転写されるとき、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためのシグナルとして宿主細胞によって認識される配列である、ポリアデニル化配列であってもよい。宿主細胞において機能する任意のポリアデニル化配列を使用してよい。

0153

糸状菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、バチルス・ニドゥランスアントラニル酸合成酵素、バチルス・ニガーグルコアミラーゼ、バチルス・ニガーアルファ−グルコシダーゼバチルス・シビTAKAアミラーゼ、及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。

0154

酵母宿主細胞のために有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983〜5990によって記載されている。

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