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技術 ペクチン酸リアーゼ変異体およびこれをコードするポリヌクレオチド

出願人 ノボザイムスアクティーゼルスカブ
発明者 ルーネニュゴーモンラズピーダカンプハンスンフランクヴィンダラスムスンアネビンドムドゥーウイェンスイーレクニルスンガリポウルギバト
出願日 2017年7月5日 (2年10ヶ月経過) 出願番号 2018-568408
公開日 2019年8月22日 (8ヶ月経過) 公開番号 2019-522988
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 統合要素 固形物体 非極性特性 混練ステップ 冪指数 滞留チャンバ サチュレータ 植物繊維材料
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課題・解決手段

本発明は、ペクチン酸リアーゼ活性を示す親酵素に対して改変を示すペクチン酸リアーゼ変異体;このような酵素の生成方法;ならびに、生地洗剤およびセルロース繊維加工産業におけるこのような酵素の使用方法に関する。親酵素に比して、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、洗剤中において向上した安定性を示す。

概要

背景

本発明は、親酵素に対して改変を示すペクチン酸リアーゼ変異体;このような酵素の生成方法;ならびに、生地洗剤およびセルロース繊維加工産業におけるこのような酵素の使用方法に関する。親酵素と比して、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、洗剤中における向上した安定性、ならびに/または、例えば、洗濯プロセスおよび/もしくは洗濯および/もしくは食器洗浄用洗剤における向上した熱安定性を示す。

ペクチンポリマーは、植物細胞壁の重要な構成成分である。ペクチンは、交互に存在するホモガラクツロナン平滑領域)およびラムノガラクツロナン毛様領域)から組成される主鎖を有するヘテロ多糖類である。平滑領域は、1,4−結合α−D−ガラクツロン酸直鎖ポリマーである。ガラクツロン酸残基は、様々な程度で、通常は非ランダム形態に、カルボキシル基においてメチルエステル化されていることが可能であるが、ここで、ポリガラクツロン酸ブロックは完全にメチルエステル化されている。

ペクチン分解酵素ペクチナーゼ)は、高メチルエステル化ペクチンまたは低メチルエステル化ペクチンおよびポリガラクツロン酸(ペクチン酸)といった好まれる基質に従って分類が可能であり、その反応メカニズムは、β−脱離または加水分解である。ペクチナーゼは主にエンド作用型であることが可能であり、鎖中の無作為な部位でポリマーを切断してオリゴマーの混合物をもたらすか、または、これらは、エクソ作用型であり得、ポリマーの一端から作用して、モノマーもしくはダイマーをもたらす。ペクチンの平滑領域において作用する数々のペクチナーゼ活性は、ペクチン酸リアーゼ(EC4.2.2.2)、ペクチンリアーゼ(EC4.2.2.10)、ポリガラクツロナーゼ(EC3.2.1.15)、エクソ型ポリガラクツロナーゼ(EC3.2.1.67)、エクソ型ポリガラクツロ酸リアーゼ(EC4.2.2.9)およびエクソ型ポリ−α−ガラクツロノシダーゼ(EC3.2.1.82)などの、Enzyme Nomenclature(1992)によって提供されている酵素分類に含まれる。

ペクチン酸リアーゼは、エルウィニア属(Erwinia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、クレブシエラ属(Klebsiella)およびキサントモナス属(Xanthomonas)などの異なる細菌属からクローン化されてきている。バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)(Nasser et al.(1993)FEBS335:319−326)およびバチルス属(Bacillus sp.)YA−14(Kim et al.(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58:947−949)からのペクチン酸リアーゼのクローン化もまた記載されてきている。

バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)由来のペクチン酸リアーゼの変異体は、国際公開第2002/092741号パンフレットおよび国際公開第2003/095638号パンフレットに開示されている。

ペクチン酸リアーゼは一般に、アルカリ性のpHが至適条件であると共に、二価カチオンが絶対条件であることにより特徴付けられ、Ca2+がもっとも促進性である。

概要

本発明は、ペクチン酸リアーゼ活性を示す親酵素に対して改変を示すペクチン酸リアーゼ変異体;このような酵素の生成方法;ならびに、生地、洗剤およびセルロース繊維加工産業におけるこのような酵素の使用方法に関する。親酵素に比して、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、洗剤中において向上した安定性を示す。

目的

本発明は、例えば洗剤または生地産業プロセスにおいて適用された場合に親ペクチン酸リアーゼを超える向上した性能を示す、細胞壁分解酵素変異体、ペクチン−分解酵素変異体、特にペクチン酸リアーゼ酵素変異体を提供する

効果

実績

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請求項1

ペクチン酸リアーゼ変異体であって、ペクチン酸リアーゼ活性を有すると共に:250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257および229+250+356からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を含み、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、前記配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも65%であるが、100%未満の同一性を有する変異体

請求項2

前記配列番号1のアミノ酸配列に対して、少なくとも70%、例えば、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する親ペクチン酸リアーゼの変異体である、請求項1に記載の変異体。

請求項3

前記改変が正電荷アミノ酸であり、好ましくは前記正電荷アミノ酸はリシンまたはアルギニンであり、さらに好ましくは、前記改変が、位置:48、49、108、124および149からなる群から選択される1つ以上の位置におけるリシンまたはアルギニンに対する置換である、請求項1または2に記載の変異体。

請求項4

前記変異体が:P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356FおよびS229I+I250N+Q356Fからなる群から選択される1つ以上の置換を含む、請求項1または2に記載の変異体。

請求項5

位置250、176、124、108、149および325からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体であって、番号付けは配列番号1に従い、および、前記改変は、独立して:(i)前記位置を占有するアミノ酸下流へのアミノ酸の挿入;(ii)前記位置を占有するアミノ酸の欠失;または(iii)前記位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換であり、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、変異体ペクチン酸リアーゼは、前記配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有する、ペクチン酸リアーゼ変異体。

請求項6

前記配列番号1のアミノ酸配列に対して、少なくとも70%、例えば、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する親ペクチン酸リアーゼの変異体である、請求項5に記載の変異体。

請求項7

前記変異体が、好ましくは、洗剤中における安定性尺度として半減期向上係数または残存洗浄性能を用い、さらに好ましくは、熱安定性の尺度としてサーマルシフトアッセイを用いた場合に、親酵素と比して、洗剤中における向上した安定性、または、向上した熱安定性を有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異体。

請求項8

請求項1〜7のいずれか一項に記載の変異体を含む組成物

請求項9

前記組成物が、クリーニングまたは洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄組成物である、請求項8に記載の組成物。

請求項10

i)1種以上の洗剤成分であって、好ましくは:界面活性剤ヒドロトロープビルダー、コビルダー、キレート剤漂白剤成分ポリマー布地色相剤布地コンディショナ起泡増進剤泡抑制剤分散剤移染防止剤蛍光白化剤、芳香剤光学的増白剤殺菌剤、殺菌・殺カビ剤汚染物懸濁剤、汚染物遊離ポリマー再付着防止剤酵素阻害剤、酵素安定剤、酵素活性化剤酸化防止剤および溶解剤からなる群から選択される洗剤成分;ならびに/またはii)1種以上の追加の酵素であって、好ましくは:プロテアーゼアミラーゼリケナーゼリパーゼクチナーゼセルラーゼエンドグルカナーゼキシログルカナーゼペクチナーゼペクチンリアーゼキサンタナーゼ、ペルオキシダーゼハロペルオキシゲナーゼカタラーゼマンナナーゼオキシドレダクターゼヘミセルラーゼキシラナーゼガラクタナーゼアラビノフラノシダーゼエステラーゼアラビナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、DNアーゼペルヒドロラーゼ、βグルカナーゼキサンタンリアーゼアシルトランスフェラーゼホスホリパーゼラッカーゼアリールエステラーゼ、α−アミラーゼグルコアミラーゼケラチナーゼレダクターゼオキシダーゼフェノールオキシダーゼリポオキシゲナーゼリグニナーゼカラギナーゼプルラナーゼタンナーゼアラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼコンドロイチナーゼペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼラムガラクツロナーゼエンド型β−マンナナーゼ、エクソ型β−マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼセロビオヒドロラーゼトランスグルタミナーゼまたはこれらの組み合わせからなる群から選択される追加の酵素をさらに含む、請求項8または9に記載の組成物。

請求項11

請求項1〜10のいずれか一項に記載のペクチン酸リアーゼ変異体または組成物の使用であって:i)ペクチン質の切断における使用であって、好ましくは、前記ペクチン質はポリ(1,4−α−D−ガラクツロニド)またはその誘導体を含む使用、ii)洗濯クリーニングまたは食器洗浄などの硬質面クリーニングなどのクリーニングプロセスにおける使用、iii)生地および/またはセルロース系繊維の加工における使用、iv)生地からの細胞壁材料酵素的除去における使用、v)ワインまたはジュースの加工における使用、ならびにvi)動物飼料添加剤としての使用からなる群から選択される、使用。

請求項12

請求項1〜7のいずれか一項に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド

請求項13

請求項12に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された宿主細胞

請求項14

親ペクチン酸リアーゼの洗剤安定性を向上させる方法であって:前記親ペクチン酸リアーゼに:48、49、99、108、124、149、176、229、250、257、325、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、229+250、229+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+229、229+257、229+250、229+356、48+257、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356および229+250+356からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を導入するステップを含み、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、前記改変されたペクチン酸リアーゼが、前記配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも75%であるが、100%未満の配列同一性を有する、方法。

請求項15

1つ以上の位置における前記改変が:P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356FおよびS229I+I250N+Q356Fからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。

請求項16

ペクチン酸リアーゼ(例えば、親ペクチン酸リアーゼであって、例えば、配列番号1または配列番号2を有する親ペクチン酸リアーゼ)の洗剤安定性を向上させる方法であって:前記ペクチン酸リアーゼ(例えば、前記親ペクチン酸リアーゼであって、例えば、配列番号1または配列番号2を有する前記親ペクチン酸リアーゼ)中に、位置(例えば位置の組み合わせ):250、176、124、108、149および325からなる群から選択される1つ以上の位置に改変(例えば、置換、挿入または欠失)を導入するステップを含み、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有する前記ペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、前記ペクチン酸リアーゼ(例えば、前記改変されたペクチン酸リアーゼであって、例えば、前記改変を1つ以上の位置に含むペクチン酸リアーゼ)は、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列に対して、少なくとも75%、例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%、少なくとも99.1%、少なくとも99.2%、少なくとも99.3%、少なくとも99.4%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6であるが、100%未満の配列同一性を有する方法。

請求項17

前記親ペクチン酸リアーゼが、前記配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドである、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。

請求項18

1つ以上の位置における前記改変が、前記親ペクチン酸リアーゼと比して、>1.0の半減期向上係数(HIF)を有する変異体をもたらす、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。

技術分野

0001

配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。

背景技術

0002

本発明は、親酵素に対して改変を示すペクチン酸リアーゼ変異体;このような酵素の生成方法;ならびに、生地洗剤およびセルロース繊維加工産業におけるこのような酵素の使用方法に関する。親酵素と比して、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、洗剤中における向上した安定性、ならびに/または、例えば、洗濯プロセスおよび/もしくは洗濯および/もしくは食器洗浄用洗剤における向上した熱安定性を示す。

0003

ペクチンポリマーは、植物細胞壁の重要な構成成分である。ペクチンは、交互に存在するホモガラクツロナン平滑領域)およびラムノガラクツロナン毛様領域)から組成される主鎖を有するヘテロ多糖類である。平滑領域は、1,4−結合α−D−ガラクツロン酸直鎖ポリマーである。ガラクツロン酸残基は、様々な程度で、通常は非ランダム形態に、カルボキシル基においてメチルエステル化されていることが可能であるが、ここで、ポリガラクツロン酸ブロックは完全にメチルエステル化されている。

0004

ペクチン分解酵素ペクチナーゼ)は、高メチルエステル化ペクチンまたは低メチルエステル化ペクチンおよびポリガラクツロン酸(ペクチン酸)といった好まれる基質に従って分類が可能であり、その反応メカニズムは、β−脱離または加水分解である。ペクチナーゼは主にエンド作用型であることが可能であり、鎖中の無作為な部位でポリマーを切断してオリゴマーの混合物をもたらすか、または、これらは、エクソ作用型であり得、ポリマーの一端から作用して、モノマーもしくはダイマーをもたらす。ペクチンの平滑領域において作用する数々のペクチナーゼ活性は、ペクチン酸リアーゼ(EC4.2.2.2)、ペクチンリアーゼ(EC4.2.2.10)、ポリガラクツロナーゼ(EC3.2.1.15)、エクソ型ポリガラクツロナーゼ(EC3.2.1.67)、エクソ型ポリガラクツロ酸リアーゼ(EC4.2.2.9)およびエクソ型ポリ−α−ガラクツロノシダーゼ(EC3.2.1.82)などの、Enzyme Nomenclature(1992)によって提供されている酵素分類に含まれる。

0005

ペクチン酸リアーゼは、エルウィニア属(Erwinia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、クレブシエラ属(Klebsiella)およびキサントモナス属(Xanthomonas)などの異なる細菌属からクローン化されてきている。バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)(Nasser et al.(1993)FEBS335:319−326)およびバチルス属(Bacillus sp.)YA−14(Kim et al.(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58:947−949)からのペクチン酸リアーゼのクローン化もまた記載されてきている。

0006

バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)由来のペクチン酸リアーゼの変異体は、国際公開第2002/092741号パンフレットおよび国際公開第2003/095638号パンフレットに開示されている。

0007

ペクチン酸リアーゼは一般に、アルカリ性のpHが至適条件であると共に、二価カチオンが絶対条件であることにより特徴付けられ、Ca2+がもっとも促進性である。

発明が解決しようとする課題

0008

本発明は、例えば洗剤または生地産業プロセスにおいて適用された場合に親ペクチン酸リアーゼを超える向上した性能を示す、細胞壁分解酵素変異体、ペクチン−分解酵素変異体、特にペクチン酸リアーゼ酵素変異体を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0009

ここで、本発明者らは、ペクチン酸リアーゼ中の一定のアミノ酸置換により、親酵素と比して中性またはアルカリ性のpH範囲内において向上した性能および/または安定性を有する酵素変異体がもたらされることを見出しており、ここで、前記性能および/または安定性は例えば、保管の後および/またはその最中において特に向上している。本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、洗剤組成物中において用いられた場合に、向上した保管安定性、すなわち、洗剤成分に対する低い感受性または高温での向上した安定性を有する。

0010

それ故、いくつかの態様において、本発明は、位置番号:250、176、124、108、149および325からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体に関し、ここで、改変は、独立して:
(i)該当する位置を占有するアミノ酸下流へのアミノ酸の挿入、
(ii)該当する位置を占有するアミノ酸の欠失、または
(iii)該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有する。

0011

いくつかの態様において(例えば、上記の態様のいずれか)、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、位置:250、176、124、325、108および149(例えば、所与順番で)からなる群から選択される位置に1つ以上の改変を含み、例えば、もっとも好ましい変異体は位置250に改変を含み、さらに好ましくは、変異体は位置176に改変を含み;さらに好ましくは、変異体は位置124に改変を含み;さらに好ましくは、変異体は位置325に改変を含み、さらに好ましくは、変異体は位置108に改変を含み、さらに好ましくは、変異体は位置149に改変を含む。

0012

一態様に係るこのような変異体ペクチン酸リアーゼは、好ましくは:E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、D124Y、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、I325F、I325LおよびI325Yからなる群から選択される1つ以上の置換を含む。

0013

本発明の変異体は、さらなる改変を含んでいてもよく;または、他の態様に係る変異体ペクチン酸リアーゼであって、好ましくは:P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356FおよびS229I+I250N+Q356Fからなる群から選択される1つ以上の置換を含むものであってもよい。

0014

他の態様において、本発明は、ペクチン酸リアーゼ活性(EC4.2.2.2)を有すると共に:P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356FおよびS229I+I250N+Q356Fからなる群から選択される1つ以上の置換を含む親酵素の変異体に関し、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し(例えば、配列番号1の番号付けを用いて)、および、ここで、変異体は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有する。

0015

他の態様において、本発明は、ペクチン酸リアーゼ活性(EC4.2.2.2)を有すると共に、i)実施例2の表1、ii)実施例3の表2、iii)実施例3の表3、iv)実施例4の表4、v)実施例5の表5において本明細書に記載されている置換からなる群から選択される1つ以上の置換を含む親酵素の変異体に関し、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し(例えば、配列番号1の番号付けを用いて)、および、ここで、変異体は、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有する。

0016

他の態様において、本発明は、ペクチン酸リアーゼ変異体をコードする核酸配列に関する。

0017

本発明の他の態様においては、発現ベクターが提供されている。

0018

本発明の他の態様においては、上記の発現ベクターで形質転換された微生物宿主細胞が提供されている。

0019

本発明の他の態様においては、1つ以上のアミノ酸を改変させるステップを含む、ペクチン酸リアーゼの洗剤安定性を向上させる方法が提供されている。

0020

本発明の他の態様においては、上記に開示されている発現ベクターが導入されている細胞を培養し、これにより、核酸配列によってコードされた変異体を前記細胞に産生させるステップ、および、ペクチン酸リアーゼ変異体を回収するステップを含む本発明に係るペクチン酸リアーゼ変異体を産生する方法が提供されている。

0021

本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、特にセルロースを含有する繊維、ヤーン、織布または不織布といったセルロース系材料の処理、機械製紙パルプまたは再生古紙の処理、および、繊維の発酵精錬に有用である。処理は、例えばのり抜きもしくは精錬ステップといった衣服製造もしくは布地製造に適した材料へのセルロース系材料の加工の最中に;または、このような布地もしくは衣服の産業もしくは家庭洗濯の最中に実施することが可能である。

0022

従って、さらなる態様において、本発明は、かなりの細胞壁分解活性を有するペクチン酸リアーゼ変異体を含む洗剤組成物に関し;ならびに、例えば、セルロースを含有する繊維、ヤーン、織布または不織布のクリーニングといった処理のための本発明のペクチン酸リアーゼ変異体の使用に関する。さらに、本発明の追加の態様は、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体を他の酵素と組み合わせて含む酵素組成物に関し、ならびに、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体を含むクリーニングまたは洗剤組成物、好ましくは洗濯または食器洗浄組成物に関する。

0023

本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、例えばその後の染色作業において適切に対応するためのセルロース系材料の調製における酵素による精錬プロセスにきわめて効果的である。

0024

本発明の他の態様は、ワインおよびジュースの加工に関する。酵素または酵素調製物は、果実および野菜マッシュ抽出性または分解性を向上させるために、マッシュの処理に用いても良い。

0025

さらに、本発明の一態様は、動物飼料添加剤としての用途である。大豆ナタネルピナス等由来の植物材料を含有する飼料に添加した場合、ペクチン酸リアーゼ変異体によって、植物細胞壁材料のインビボ分解が顕著に向上され、これにより、動物による植物栄養分のより良好な利用が達成される。

0026

さらに、本発明の一態様は、ペクチンを含有する天然食品および加工食品による汚れを分解するための本発明の変異体の使用である。

0027

配列の簡単な説明
配列番号1は、本発明の変異体が基づいている親ペクチン酸リアーゼを示す。親ペクチン酸リアーゼは、国際公開第2002/092741号パンフレットに開示されているバチルスサブチリス(Bacillus subtilis)由来のペクチン酸リアーゼの変異体である。

0028

配列番号2は、親ペクチン酸リアーゼと等しく好適である同族体ポリペプチドを示す(UNIPROT:Q6LEQ4−Kim,J et al..Biosci Biotechnol Biochem.1994 58:947−949)。

0029

定義
cDNA:「cDNA」という用語は、真核または原核細胞から得られる成熟したスプライシングされたmRNA分子からの逆転写により調製されることが可能であるDNA分子を意味する。cDNAは、対応するゲノムDNA中に存在し得るイントロン配列を欠いている。初期の一次RNA転写物は、成熟型のスプライシングされたmRNAとして出現する前にスプライシングを含む一連のステップを介して処理されるmRNAの前駆体である。

0030

コード配列:「コード配列」という用語は、変異体のアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレームにより判定され、これは、ATG、GTGまたはTTGなどの開始コドンで開始され、TAA、TAGまたはTGAなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたはこれらの組み合わせであり得る。

0031

制御配列:「制御配列」という用語は、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドに対して在来(すなわち、同一の遺伝子由来)もしくは外来(すなわち、異なる遺伝子由来)のものであっても、または、相互に在来もしくは外来のものであってもよい。このような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダーポリアデニル化配列プロペプチド配列プロモータシグナルペプチド配列、および転写ターミネータが挙げられる。少なくとも、制御配列、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む。制御配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドのコード領域に対する制御配列の連結を促進させる特定の制限部位を導入する目的のためにリンカーを備えていてもよい。

0032

対応する:本明細書において用いられるところ、「対応する」という用語は、特定のアミノ酸配列に対して参照がなされている配列の特定のアミノ酸を決定する方法を指す。例えば、本発明の目的のために、特定のアミノ酸位置に対して参照がなされている場合、他のアミノ酸配列においてどの特定のアミノ酸が目的のものであり得るかを決定するために、参照がなされている前記アミノ酸配列に対して前記他のアミノ酸配列をアラインメントすることが当業者は可能であろう。例えば、配列番号1もしくは2に前出の成熟配列、または、本明細書において列挙されているいずれかの他の配列に対する他のアミノ酸配列のアラインメントは、本明細書において他の箇所において記載されている。代替的なアラインメント法を使用し得、これらは当業者に周知である。

0033

「洗剤安定性」または「保管安定性」:「洗剤安定性」または「保管安定性」という用語は、例えばアニオン性界面活性剤といった洗剤を含有する配合物中におけるタンパク質の安定性を意味することが意図されている。アニオン性界面活性剤は、アニオン基疎水性末端との組み合わせにより特徴付けられる。それ故、タンパク質に結合する場合、リシンまたはアルギニンのような正に荷電された残基、および、疎水性の領域が相互作用点となりやすい。同様に、特定のフレキシブル領域動きが、通常はタンパク質の内部に埋もれているアミノ酸へのアクセスを開く。これらの残基は、典型的には疎水性であり、それ故、界面活性剤末端誘引性である。酵素と界面活性剤との化学的相互作用では、高い確率で、酵素が不活性な状態とされることとなる。それ故、向上した洗剤安定性または保管安定性とは、一定の洗剤濃度および温度で、一定の期間後においてもより高い酵素活性が残存していることとなること(高い残存活性)を意味する。

0034

従って、熱安定性および洗剤安定性はタンパク質または酵素の2つの独立した特徴である。

0035

向上した洗剤安定性を有する本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、実施例3および/または4に記載されている分析方法に供した場合に、親ペクチン酸リアーゼと比して、少なくとも120%(好ましくは少なくとも140%、より好ましくは少なくとも160%、さらにより好ましくは少なくとも180%、さらにより好ましくは少なくとも200%、もっとも好ましくは少なくとも250%、および、特に少なくとも300%)の残存活性を示し得る。

0036

発現:「発現」という用語は、特にこれらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含む、変異体の産生に関与するいずれかのステップを含む。

0037

発現ベクター:「発現ベクター」という用語は、変異体をコードするポリヌクレオチドを含み、かつ、その発現をもたらす制御配列作動可能リンクされている直鎖または環状DNA分子を意味する。

0038

宿主細胞:「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入形質導入等を受けやすい細胞種のいずれかを意味する。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異によって親細胞とは等しくない親細胞の子孫のいずれかを含む。

0039

半減期向上係数:「半減期向上係数」または「HIF」という用語は、以下の式:HIF=(T1/2)(変異体)/(T1/2)(基準ポリペプチド、例えば、親または主鎖ポリペプチド)に従って定義することが可能である。HIFを算出するための好ましい方法は、本明細書において参照により援用されている以下の実施例2にも記載されている。

0040

硬質面クリーニング:「硬質面クリーニング」という用語は硬質面のクリーニングとして本明細書において定義され、ここで、硬質面は、床、、壁、屋根等、ならびに、自動車(自動車洗浄)および食器(食器洗浄)などの硬質物体の表面を含み得る。食器洗浄は、これらに限定されないが、プレートカップガラスボールスプーンナイフフォークなどのカトラリー配膳用具、セラミックプラスチック、金属、陶磁器、ガラスおよびアクリルのクリーニングを含む。

0041

向上した洗浄性能:「向上した洗浄性能」という用語は、本明細書において、例えば増大した汚れ除去による、親酵素の洗浄性能と比して増大した洗浄性能を示す変異体酵素として定義される。「向上した洗浄性能」という用語は、洗濯における洗浄性能、また、例えば自動食器洗浄(ADW)などの硬質面クリーニングにおける洗浄性能をも含む。

0042

向上した特性:「向上した特性」という用語は、親と比して向上している変異体に関連する特徴を意味する。このような向上した特性としては、これらに限定されないが、例えば液体洗剤中における安定性といった洗剤安定性、化学安定性酸化安定性、pH安定性、保管条件下での安定性が挙げられる。

0043

単離された:「単離された」という用語は、自然界においては生じない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、(1)いずれかの非天然物質、(2)特にこれらに限定されないが、自然界において関連している天然構成成分の1種または複数種もしくはすべてが少なくとも部分的に除去されたいずれかの酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補助因子を含むいずれかの物質;(3)自然界において見出される物質と相対的に人工的に修飾されたいずれかの物質;または、(4)自然界においては関連している他の成分に対する物質の量を増やすことにより修飾されたいずれかの物質(例えば、物質をコードする遺伝子の複数のコピー;物質をコードする遺伝子と自然界で関連しているプロモータより強力なプロモータの使用)が挙げられる。単離された物質が発酵ブロスサンプルに存在していてもよい。

0044

成熟型ポリペプチド:「成熟型ポリペプチド」という用語は、N末端プロセシングC末端切断、グリコシル化リン酸化等などの翻訳およびいずれかの翻訳後修飾後における、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。

0045

修飾:「修飾」という用語は、本発明のポリペプチドの文脈において、アミノ酸の挿入または欠失、好ましくは少なくとも1つの欠失によって、基準アミノ酸配列(すなわち、配列番号:1または2)中の1つ以上のアミノ酸が、異なるアミノ酸よる置換で改変されることを意味する。「修飾」、「改変」および「突然変異」という用語は同義的に用いられ得ると共に、本発明の範囲内において同一の意味および目的を構成し得る。

0046

核酸構築物:「核酸構築物」という用語は、一重螺旋または二重螺旋を有する核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されるか、もしくは、そうでなければ自然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するよう修飾されるか、または、合成され、1つ以上制御配列を含む。

0047

作動可能にリンク:「作動可能にリンクされた」という用語は、制御配列がコード配列を発現させるよう、ポリヌクレオチドのコード配列と相対的に適切な位置に制御配列が位置する構造を意味する。

0048

親または親ペクチン酸リアーゼ:「親」または「親ペクチン酸リアーゼ」という用語は、改変が行われて本発明の酵素変異体を産生する、ペクチン酸リアーゼ活性を有するいずれかのポリペプチドを意味する。例示的な親ペクチン酸リアーゼが配列番号1に示されている。親ペクチン酸リアーゼと等しく好適である同族体ポリペプチドが、Kim et al.(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58:947−949(UNIPROT:Q6LEQ4)に公知である。

0049

ペクチン酸リアーゼ:「ペクチン酸リアーゼ」という用語は、非還元性末端に4−デオキシ−α−D−ガラクタ−4−エヌロノシル基を有するオリゴ糖をもたらす(1→4)−α−D−ガラクツロナンの切断脱離を触媒する活性(EC4.2.2.2)を意味する。

0050

本発明の目的上、ペクチン酸リアーゼ活性は、方法の欄、または、実施例3および/もしくは4に記載される手法に従って測定され得る。一態様において、本発明の変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドのペクチン酸リアーゼ活性の少なくとも20%、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または、少なくとも100%を有する。

0051

ペクチン:「ペクチン」という用語は、高度または低度にエステル化されていてもよいペクチン酸、ポリガラクツロン酸およびペクチンを指す。

0052

ペクチナーゼ:「ペクチナーゼ」という用語は、当技術分野に従って定義されるペクチナーゼ酵素を指すと共に、例えばポリ(1,4−α−D−ガラクツロニド)およびその誘導体といった、ペクチン質中の多糖および/またはオリゴ糖鎖を切断する酵素を含む(文献:Sakai et al.,Pectin,pectinase and protopectinase:production,properties and applications,pp 213−294:Advances in Applied Microbiology vol:39,1993を参照のこと)。ペクチナーゼの非限定的な例としては、ヒドロラーゼタイプのペクチナーゼ(例えばラムノガラクツロナンヒドロラーゼ)およびリアーゼタイプのペクチナーゼ(例えば、ペクチン酸リアーゼ)が挙げられる。好ましくは、本発明のペクチナーゼは、転移脱離によるポリガラクツロン酸とも呼ばれるペクチン酸におけるα−1,4−グリコシド結合ランダムな切断を触媒するペクチナーゼ酵素(ペクチン酸リアーゼとしても知られるポリ(1,4−α−D−ガラクツロニド)リアーゼとしても知られる酵素クラスポリガラクツロ酸リアーゼ(EC 4.2.2.2)(PGL)など)である。

0053

配列同一性:2つのアミノ酸配列間または2つのヌクレオチド配列間の関連性が、「配列同一性」というパラメータによって記載される。

0054

本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン5.0.0以降のEMBOSSパッケージ(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276−277)のNeedleプログラムにおいて実装されている、Needleman−Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443−453)を用いて判定される。用いられるパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップエクステンションペナルティおよびEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSボージョン)置換マトリックスである。Needle標識された「最長の同一性」(−nobriefオプションを用いて得られる)の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
(同等の残基×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数

0055

本発明の目的上、2つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン5.0.0以降のEMBOSSパッケージ(EMBOSS:European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,前掲書)のNeedleプログラムにおいて実装されている、Needleman−Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch,1970,前掲書)を用いて判定される。用いられるパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップエクステンションペナルティ、および、EDNAFLLNCBI NUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。Needle標識された「最長の同一性」(−nobriefオプションを用いて得られる)の出力が同一性割合として用いられ、以下のとおり算出される。
(同等のデオキシリボヌクレオチド×100)/(アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数)

0056

スワッチ:「スワッチ」という用語は、Center For Testmaterials BV,P.O.Box 120,3133 KT,Vlaardingen,The Netherlandsから入手される、実施例で用いられた生地を意味する。

0057

変異体:「変異体」という用語は、改変(すなわち、置換、挿入および/または欠失)を1つ以上の(例えば数々の)位置に含む、ペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。置換とは、ある位置のアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味し;欠失とは、ある位置のアミノ酸の除去を意味し;および、挿入とは、ある位置のアミノ酸に直に続くように隣接したアミノ酸の付加を意味する。

0058

本発明の変異体は、配列番号1の成熟型ポリペプチドのペクチン酸リアーゼ活性の少なくとも20%、例えば、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または、少なくとも100%の活性を有する。

0059

野生型ペクチン酸リアーゼ:「野生型ペクチン酸リアーゼ」という用語は、本明細書において用いられるところ、自然界において見出されるバクテリアイースト菌または糸状真菌などの天然微生物によって発現されるペクチン酸リアーゼを指す。

0060

変異体を決定するための定法
本発明の目的のために、配列番号1に開示されている成熟型ポリペプチドは、他のペクチン酸リアーゼにおける対応するアミノ酸残基を決定するために用いられる。他のペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列が配列番号1に開示されている成熟型ポリペプチドとアラインされ、このアラインメントに基づいて、配列番号1に開示されている成熟型ポリペプチドにおけるいずれかのアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号が、好ましくはバージョン5.0.0以降のEMBOSSパッケージのNeedleプログラム(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276−277)において実装されているNeedleman−Wunschアルゴリズム(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443−453)を用いて、判定される。用いられるパラメータは、10のギャップオープンペナルティ、0.5のギャップエクステンションペナルティおよびEBLOSUM62(BLOSUM62のEMBOSSバージョン)置換マトリックスである。

0061

他のペクチン酸リアーゼにおける対応するアミノ酸残基の同定は、特にこれらに限定されないが、MUSCLE(multiple sequence comparison by log−expectation;バージョン3.5以降;Edgar,2004,Nucleic AcidsResearch 32:1792−1797)、MAFFT(バージョン6.857以降;Katoh and Kuma,2002,Nucleic Acids Research 30:3059−3066;Katoh et al.,2005,Nucleic Acids Research 33:511−518;Katoh and Toh,2007,Bioinformatics 23:372−374;Katoh et al.,2009,Methods in Molecular Biology 537:39−64;Katoh and Toh,2010,Bioinformatics 26:1899−1900)、および、ClustalWを採用するEMBOSSEMMA(1.83以降;Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Research 22:4673−4680)を含む数々のコンピュータプログラムを、それぞれのデフォルトパラメータを利用して用いることで、複数のポリペプチド配列のアラインメントによって判定することが可能である。

0062

配列番号1の成熟型ポリペプチドから他の酵素が分化して、従来からの配列に基づく比較による関係の検出ができない場合(Lindahl and Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613−615)、他の対配列比較アルゴリズムを使用することが可能である。配列に基づくサーチにおける感度は、データベースのサーチにポリペプチドファミリープロファイル)の確率表現を利用するサーチプログラムを用いることで高めることが可能である。例えば、PSI−BLASTプログラムは、反復データベースサーチプロセスを介してプロファイルを生成し、離れた相同体を検出することが可能である(Atschul et al.,1997,Nucleic AcidsRes.25:3389−3402)。ポリペプチドに係るファミリーまたはスーパーファミリータンパク質構造データベースにおいて1つ以上の表現を有する場合には、感度をさらに高めることが可能である。GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.287:797−815;McGuffin and Jones,2003,Bioinformatics 19:874−881)などのプログラムは、問い合わせ配列に係るフォールド構造を予想するニューラルネットワークに対する入力として、多様なソース(PSI−BLAST、二次構造予測、構造アラインメントプロファイルおよび溶媒和ポテンシャル)からの情報を利用する。同様に、Gough et al.,2000,J.Mol.Biol.313:903−919による方法が、アライン未知の構造の配列とSCOPデータベースに存在するスーパーファミリーモデルとのアラインに用いられることが可能である。次いで、これらのアラインメントを用いてポリペプチドに係る相同性モデルを生成することが可能であり、このようなモデルは、その目的のために開発された多様なツールを用いて正確に評価可能である。

0063

公知の構造のタンパク質に関して、数々のツールおよびリソースが、構造アラインメントの検索および生成のために使用可能である。例えばタンパク質のSCOPスーパーファミリーが構造的にアラインされており、これらのアラインメントはアクセスおよびダウンロードが可能である。2つ以上のタンパク質構造は距離アラインメントマトリックス(Holm and Sander,1998,Proteins 33:88−96)または組み合わせ拡張法(Shindyalov and Bourne,1998,Protein Engineering 11:739−747)などの多様なアルゴリズムを用いてアラインすることが可能であり、これらのアルゴリズムを、可能性のある構造相同体発見するために、対象の構造と共に問い合わせ構造データベースに対して追加的に実行することが可能である(例えば、Holm and Park,2000,Bioinformatics 16:566−567)。

0064

本発明の変異体の説明において、下記に記載の命名法が参照を容易とするために採用される。公認されているIUPACの1文字または3文字のアミノ酸略記が利用されている。

0065

置換.アミノ酸置換に関しては、以下の命名法が用いられる:元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸。従って、アラニンによる位置226におけるスレオニンの置換は、「Thr226Ala」または「T226A」と示されている。複数の突然変異は加算記号(「+」)によって分けられており、例えば、「Gly205Arg+Ser411Phe」または「G205R+S411F」はそれぞれ、位置205および411における、グリシン(G)のアルギニン(R)による置換、および、セリン(S)のフェニルアラニン(F)による置換を表している。

0066

欠失.アミノ酸欠失に関しては、以下の命名法が用いられる:元のアミノ酸、位置、*。位置195における従って、グリシンの欠失は、「Gly195*」または「G195*」と示される。複数の欠失は加算記号(「+」)によって分けられており、例えば、「Gly195*+Ser411*」または「G195*+S411*」とされる。

0067

挿入.アミノ酸挿入に関しては以下の命名法が用いられている:元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸。従って、位置195でのグリシンの後へのリシンの挿入は、「Gly195GlyLys」または「G195GK」と示される。複数のアミノ酸の挿入は、[元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸1番、挿入されたアミノ酸2番;等]と示される。例えば、位置195でのグリシンの後へのリシンおよびアラニンの挿入は、「Gly195GlyLysAla」または「G195GKA」と示される。

0068

このような事例において、挿入されたアミノ酸残基には、挿入されたアミノ酸残基の前のアミノ酸残基に下付文字を付与することにより番号が付される。それ故、上記の例において配列は以下のとおりとなる。

0069

0070

複数の改変.複数の改変を含む変異体は加算記号(「+」)によって分けられており、例えば、「Arg170Tyr+Gly195Glu」または「R170Y+G195E」はそれぞれ、チロシンおよびグルタミン酸による位置170および195におけるアルギニンおよびグリシンの置換を表している。

0071

異なる改変.異なる改変がある位置で導入可能である場合、異なる改変はコンマによって分けられており、例えば、「Arg170Tyr,Glu」は、チロシンまたはグルタミン酸による位置170におけるアルギニンの置換を表している。それ故、「Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala」は以下の変異体を示す:
「Tyr167Gly+Arg170Gly」、「Tyr167Gly+Arg170Ala」、「Tyr167Ala+Arg170Gly」および「Tyr167Ala+Arg170Ala」。

0072

本発明は、親ペクチン酸リアーゼ(EC4.2.2.2)の変異体に関する。これらの変異体は、親酵素と比して向上した特性を有するものであり、特に洗剤安定性または洗剤組成物中における保管安定性が向上している。

0073

親ペクチン酸リアーゼの特性を向上させるプロセスにおいて、本発明者らは、親ポリペプチド主鎖における特定のアミノ酸の改変が、生成される変異体の洗剤安定性を大きく変化させることを見出した。

0074

変異体
一態様において、本発明は、位置250、176、124、108、149および325からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を含むペクチン酸リアーゼ変異体を提供するものであり、ここで、番号付けは配列番号1の成熟ポリペプチドに従い、および、ここで、改変は、独立して:
(i)該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入;
(ii)該当する位置を占有するアミノ酸の欠失;または
(iii)該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有する。

0075

一実施形態において、ペクチン酸リアーゼ変異体は、位置250、176、124、108、149および325に相当する1つ以上の(例えば数々の)位置に置換を含み、ここで、番号付けは配列番号1に従い、および、ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。

0076

特定の実施形態において、ペクチン酸リアーゼ変異体は、以下の位置:250+124、250+108、250+149、250+325、176+124、176+108、176+149、176+325、124+108、124+149、124+325、108+149、108+325、149+325、250+176+124、250+176+108、250+176+149、250+176+325、250+124+108、250+124+149、250+124+325、250+108+149、250+108+325、250+149+325、176+124+108、176+124+149、176+124+325、176+108+149、176+108+325、176+149+325、124+108+149、124+108+325、124+149+325、108+149+325、250+176+124+108、250+176+124+149、250+176+124+325、250+176+108+149、250+176+108+325、250+176+149+325、250+124+108+149、250+124+108+325、250+124+149+325、250+108+149+325、176+124+108+149、176+124+108+325、176+124+149+325、176+108+149+325、124+108+149+325、250+176+124+108+149、250+176+124+108+325、250+176+124+149+325、250+176+108+149+325、250+124+108+149+325、176+124+108+149+325および250+176+124+108+149+325に置換を含み、ここで、番号付けは成熟ポリペプチド配列番号1に従い、および、ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。

0077

他の態様において、本発明は、位置48、49、99、108、124、149、176、229、250、257、325および356(例えば、番号付けは配列番号1基準)に相当する1つ以上の(例えば、数々の)位置に置換を含むペクチン酸リアーゼ変異体を提供するものであり、ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。

0078

一実施形態において、ペクチン酸リアーゼ変異体は、以下の位置:48+49、48+99、48+108、48+124、48+149、48+176、48+229、48+250、48+257、48+325、48+356、49+99、49+108、49+124、49+149、49+176、49+229、49+250、49+257、49+325、49+356、99+108、99+124、99+149、99+176、99+229、99+250、99+257、99+325、99+356、108+124、108+149、108+176、108+229、108+250、108+257、108+325、108+356、124+149、124+176、124+229、124+250、124+257、124+325、124+356、149+176、149+229、149+250、149+257、149+325、149+356、176+229、176+250、176+257、176+325、176+356、229+250、229+257、229+325、229+356、250+257、250+325、250+356、257+325、257+356、325+356、48+49+99、48+49+108、48+49+124、48+49+149、48+49+176、48+49+229、48+49+250、48+49+257、48+49+325、48+49+356、48+99+108、48+99+124、48+99+149、48+99+176、48+99+229、48+99+250、48+99+257、48+99+325、48+99+356、48+108+124、48+108+149、48+108+176、48+108+229、48+108+250、48+108+257、48+108+325、48+108+356、48+124+149、48+124+176、48+124+229、48+124+250、48+124+257、48+124+325、48+124+356、48+149+176、48+149+229、48+149+250、48+149+257、48+149+325、48+149+356、48+176+229、48+176+250、48+176+257、48+176+325、48+176+356、48+229+250、48+229+257、48+229+325、48+229+356、48+250+257、48+250+325、48+250+356、48+257+325、48+257+356、48+325+356、49+99+108、49+99+124、49+99+149、49+99+176、49+99+229、49+99+250、49+99+257、49+99+325、49+99+356、49+108+124、49+108+149、49+108+176、49+108+229、49+108+250、49+108+257、49+108+325、49+108+356、49+124+149、49+124+176、49+124+229、49+124+250、49+124+257、49+124+325、49+124+356、49+149+176、49+149+229、49+149+250、49+149+257、49+149+325、49+149+356、49+176+229、49+176+250、49+176+257、49+176+325、49+176+356、49+229+250、49+229+257、49+229+325、49+229+356、49+250+257、49+250+325、49+250+356、49+257+325、49+257+356、49+325+356、99+108+124、99+108+149、99+108+176、99+108+229、99+108+250、99+108+257、99+108+325、99+108+356、99+124+149、99+124+176、99+124+229、99+124+250、99+124+257、99+124+325、99+124+356、99+149+176、99+149+229、99+149+250、99+149+257、99+149+325、99+149+356、99+176+229、99+176+250、99+176+257、99+176+325、99+176+356、99+229+250、99+229+257、99+229+325、99+229+356、99+250+257、99+250+325、99+250+356、99+257+325、99+257+356、99+325+356、108+124+149、108+124+176、108+124+229、108+124+250、108+124+257、108+124+325、108+124+356、108+149+176、108+149+229、108+149+250、108+149+257、108+149+325、108+149+356、108+176+229、108+176+250、108+176+257、108+176+325、108+176+356、108+229+250、108+229+257、108+229+325、108+229+356、108+250+257、108+250+325、108+250+356、108+257+325、108+257+356、108+325+356、124+149+176、124+149+229、124+149+250、124+149+257、124+149+325、124+149+356、124+176+229、124+176+250、124+176+257、124+176+325、124+176+356、124+229+250、124+229+257、124+229+325、124+229+356、124+250+257、124+250+325、124+250+356、124+257+325、124+257+356、124+325+356、149+176+229、149+176+250、149+176+257、149+176+325、149+176+356、149+229+250、149+229+257、149+229+325、149+229+356、149+250+257、149+250+325、149+250+356、149+257+325、149+257+356、149+325+356、176+229+250、176+229+257、176+229+325、176+229+356、176+250+257、176+250+325、176+250+356、176+257+325、176+257+356、176+325+356、229+250+257、229+250+325、229+250+356、229+257+325、229+257+356、229+325+356、250+257+325、250+257+356、250+325+356および257+325+356に置換を含み、ここで、番号付けは配列番号1の成熟ポリペプチドに従い、および、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。

0079

本発明はさらに、位置:48、49、99、108、124、149、176、229、250、257、325、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、229+250、229+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+229、229+257、229+250、229+356、48+257、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、229+250+356(例えば、番号付けは配列番号1基準)に相当する1つ以上の(例えば、数々の)位置に1つの置換(または、複数の置換)を含むペクチン酸リアーゼ変異体を提供するものであり、ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。

0080

好ましい実施形態において、変異体は、正の電荷を有するアミノ酸(すなわち、リシンまたはアルギニン)に対して、位置48、49、108、124および149(例えば、番号付けは配列番号1に従う)の1つ以上において置換を含む。本発明の好ましい変異体はそれ故、位置48、49、108、124および149(例えば、番号付けは配列番号1に従う)の1つ以上における置換によって、酵素の全体の電荷がさらに陽性とされている変異体を含む。

0081

一実施形態において、変異体は、親ペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に対して、少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%であるが、100%未満の配列同一性を有する。

0082

他の実施形態において、変異体は、配列番号1または配列番号2の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%であって、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%などであるが、100%未満の配列同一性を有する。

0083

他の実施形態において、親は、配列番号1または配列番号2の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%であって、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%などであるが、100%未満の配列同一性を有する。

0084

一態様において、本発明の変異体における改変の数は、1〜20、例えば1〜10および1〜5であって、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または13などの改変である。

0085

他の態様において、変異体は、位置48に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置48に相当する位置におけるアミノ酸が、Ala、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Arg、Ser、Thr、TrpまたはTyrで置換されており、好ましくはArg、LysまたはThrで置換されている。

0086

他の態様において、変異体は、位置49に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置49に相当する位置におけるアミノ酸が、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Val、TrpまたはTyrで置換されており、好ましくはArg、LysまたはTrpで置換されている。

0087

他の態様において、変異体は、位置99に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置99に相当する位置におけるアミノ酸が、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrで置換されており、好ましくはCysまたはGluまたはAspで置換されている。

0088

他の態様において、変異体は、位置108に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置108に相当する位置におけるアミノ酸が、Ala、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Arg、Ser、Thr、ValまたはTrpで置換されており、好ましくはLys、AsnまたはArgで置換されている。

0089

他の態様において、変異体は、位置124に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置124に相当する位置におけるアミノ酸が、Ala、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、TrpまたはTyrで置換されており、好ましくはArgまたはTrpで置換されている。

0090

他の態様において、変異体は、位置149に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置149に相当する位置におけるアミノ酸が、Lys、Leu、ArgまたはTrpで置換されており、好ましくはLysまたはArgで置換されている。

0091

他の態様において、変異体は、位置176に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置176に相当する位置におけるアミノ酸が、Ala、Cys、AspまたはGluで置換されており、好ましくはCysまたはAspで置換されている。

0092

他の態様において、変異体は、位置229に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置229に相当する位置におけるアミノ酸が、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Val、ThrまたはTyrで置換されており、好ましくはIle、Lys、TyrまたはValで置換されている。

0093

他の態様において、変異体は、位置250に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置250に相当する位置におけるアミノ酸が、Ala、Gly、Leu、Met、Asn、SerまたはThrで置換されており、好ましくはLeu、AsnまたはThrで置換されている。

0094

他の態様において、変異体は、位置257に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置257に相当する位置におけるアミノ酸が、Ala、Cys、Asp、His、Ile、Leu、Met、Gln、Ser、ValまたはTrpで置換されており、好ましくはLeu、Met、Gln、His、CysまたはAspで置換されている。

0095

他の態様において、変異体は、位置325に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置325に相当する位置におけるアミノ酸が、Phe、LeuまたはTyrで置換されており、好ましくはPheで置換されている。

0096

他の態様において、変異体は、位置356に相当する位置に置換を含む。好ましくは、位置356に相当する位置におけるアミノ酸が、Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Leu、Asn、Arg、Thr、TrpまたはTyrで置換されており、好ましくはGluまたはPheで置換されている。

0097

このような変異体ペクチン酸リアーゼは、好ましくは:P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356FおよびS229I+I250N+Q356Fからなる群から選択される1つ以上の置換を含み、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有する。

0098

より好ましくは、変異体ペクチン酸リアーゼは:S229I、I250L、T49R、S229V、S229K、I250NおよびI250Tからなる群から選択される1つ以上の置換を含む。

0099

さらにより好ましくは、変異体ペクチン酸リアーゼは、S229IおよびI250Nからなる群から選択される置換の一方または両方を含む。従って、一実施形態において、ペクチン酸リアーゼ変異体は:S229I+I250L、S229I+I250N、S229I+I250T、I250L+S229V、I250L+S229K、S229V+I250N、S229V+I250T、S229K+I250NおよびS229K+I250Tからなる群から選択される置換を含むか、または、これらから構成され、ここで、番号付けは配列番号1の成熟ポリペプチドに従い、および、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。

0100

他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置48および229に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。

0101

他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置49および229に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。従って、一実施形態において、ペクチン酸リアーゼ変異体は:S229I+T49R、T49R+S229VおよびT49R+S229Kからなる群から選択される置換を含むか、または、これらから構成され、ここで、番号付けは配列番号1の成熟ポリペプチドに従い、および、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。

0102

他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置48および250に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。従って、一実施形態において、ペクチン酸リアーゼ変異体は:I250L+T49R、T49R+I250NおよびT49R+I250Tからなる群から選択される置換を含むか、または、これらから構成され、ここで、番号付けは配列番号1の成熟ポリペプチドに従い、および、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する。

0103

他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置229および257に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。

0104

他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置229および250に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。

0105

他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置229および356に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。

0106

他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置250および257に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。

0107

他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置49、99、176、229、257、325および356に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。

0108

他の態様において、変異体は、上記のものなどの位置49、99、176、229、250、257、325および356に相当する位置の改変を含むか、または、これらから構成される。

0109

好ましい態様において、変異体は、49R、99D、108N/K/R、124R、149K/R、229I/V/Y、250L/N/T、257C/D/H/M/Qおよび325Fからなる群から選択される1つ以上の置換を含む。

0110

ここでは、これらの置換の1つ以上は、親酵素と比した場合に、単独で、または、組み合わせでペクチン酸リアーゼ変異体の洗剤安定性を高めることが予期されている。

0111

変異体ペクチン酸リアーゼの洗剤安定性を高める好ましい多重置換としては:P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、およびS229I+I250N+Q356Fが挙げられ、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有する。

0112

洗剤安定性を高めるより好ましい多重置換としては:T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229+IQ356F、I250N+K257L、P48W+I250NおよびI250N+Q356Fが挙げられる。

0113

さらに好ましくは、変異体は:T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250NおよびS229I+Q356Fからなる群から選択される置換の組み合わせを含む。

0114

一態様において、変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するポリペプチドについて、置換S299Iを含むか、または、これから構成され、および、変異体はさらに、配列番号1の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。この態様において、変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%同一性を有する。

0115

一態様において、変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するポリペプチドについて、置換I250Nを含むか、または、これから構成され、および、変異体はさらに、配列番号1の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。この態様において、変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有する。

0116

他の態様において、変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するポリペプチドについて、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356Fを含むか、または、これらから構成され、および、変異体はさらに、配列番号1の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。この態様において、変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有する。

0117

他の態様において、変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するポリペプチドについて、置換T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356Fを含むか、または、これらから構成され、および、変異体はさらに、配列番号1の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。この態様において、変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有する。

0118

他の態様において、変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するポリペプチドについて、置換S229I+I250Nを含むか、または、これらから構成され、および、変異体はさらに、配列番号1の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。この態様において、変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有する。

0119

他の態様において、変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するポリペプチドについて、置換S229I+Q356Fを含むか、または、これらから構成され、および、変異体はさらに、配列番号1の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。この態様において、変異体は、配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有する。

0120

変異体はさらに:配列番号1の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するポリペプチドについて、1、2、3、4、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、29、32、33、34、35、36、38、39、41、42、43、44、53、55、56、57、58、59、60、62、63、65、66、67、72、73、77、78、80、81、82、83、84、85、88、89、90、92、93、94、95、96、97、98、100、101、102、103、104、108、109、110、112、113、114、117、119、120、121、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、135、137、138、142、143、144、145、147、149、150、151、152、153、154、155、157、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、183、184、187、188、190、191、192、195、197、198、200、203、205、205、207、208、209、210、211、212、214、216、217、219、220、221、222、223、225、226、227、230、231、232、233、236、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、252、253、254、255、259、260、261、262、263、364、265、266、267、268、269、270、271、273、274、275、276、278、279、280、281、282、283、284、285、287、288、289、290、291、292、293、294、296、297、299、300、304、306、309、310、311、312、313、315、317、318、319、320、321、322、325、327、328、329、330、342、343、344、345、346、347、348、350、351、352、353、354、355、358、359、360、361、362、364、365、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、379、380、382、383、385、386、388、390、392、394、395、396、398および399からなる群から選択される1つ以上の追加の置換を含み得、および、変異体はさらに、配列番号1の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。

0121

変異体はまた:配列番号1の成熟ポリペプチドについて、または、ペクチン酸リアーゼ活性を有する配列番号1の成熟ポリペプチドに対して、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性を有するポリペプチドについて、5、9、11、26、28、30、31、37、40、45、46、47、48、49、50、51、52、54、61、64、68、69、70、71、74、75、76、79、86、87、91、99、105、106、107、111、115、116、118、122、123、134、136、139、140、141、146、148、156、158、170、182、185、186、189、193、194、196、199、201、202、204、213、215、218、224、228、229、234、235、237、251、256、257、258、272、277、286、295、298、301、302、303、305、307、308、314、316、323、324、326、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、349、356、357、363、366、378、381、384、386、387、389、390、391、393および397からなる群から選択される1つ以上の追加の置換を含み得、および、変異体はさらに、配列番号1の成熟ペクチン酸リアーゼと比して向上した安定性を有する。

0122

このような追加の置換はまた、タンパク質のフォールディングおよび/または活性に顕著に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換もしくは挿入;典型的には1〜30アミノ酸の小さな欠失;アミノ末端メチオニン残基などの小さなアミノもしくはカルボキシル末端延伸;20〜25以下の残基の小さなリンカーペプチド;または、ポリ−ヒスチジン配列、抗原性エピトープもしくは結合性ドメインなどの正味電荷または他の機能を変化させることによって精製を促進する小さな延伸といった、副次的な性質のアミノ酸の変更を含み得る。

0123

保存的置換の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リシンおよびヒスチジン)、酸性アミノ酸(グルタミン酸およびアスパラギン酸)、極性アミノ酸グルタミンおよびアスパラギン)、疎水性アミノ酸ロイシンイソロイシンおよびバリン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン)、および、小さいアミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン)の群の範囲内である。特異活性を一般に改変しないアミノ酸置換は当技術分野において公知であり、例えば、H.Neurath and R.L.Hill,1979,In,The Proteins,Academic Press,New Yorkに記載されている。一般的な置換はAla/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/GluおよびAsp/Glyである。

0124

あるいは、アミノ酸変異は、ポリペプチドの物理化学的特性が改変されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変異は、ポリペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を改変し、至適pHを変化させることであり得る。変異体の特性に顕著に影響を与えるこのような追加の置換としては、国際公開第2002/092741号パンフレットおよび国際公開第2003/095638号パンフレットに開示されているものが挙げられる。

0125

ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発(Cunningham and Wells,1989,Science 244:1081−1085)などの技術分野において公知である手法に従って同定することが可能である。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られたミュータント分子が、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するためにペクチン酸リアーゼ活性についてテストされる。また、Hilton et al.,1996,J.Biol.Chem.271:4699−4708を参照のこと。酵素の活性部位または他の生物学的相互作用は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異が併用される、核磁気共嗚結晶構造解析電子回折または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理分析によって判定されることも可能である。例えば、de Vos et al.,1992,Science 255:306−312;Smith et al.,1992,J.Mol.Biol.224:899−904;Wlodaver et al.,1992,FEBSLett.309:59−64を参照のこと。必須アミノ酸のアイデンティティは、関連するポリペプチドとのアラインメントから推測されることも可能である。

0126

配列番号1のペクチン酸リアーゼは、1種の親酵素の一例として用いられる。親ペクチン酸リアーゼは、(a)少なくとも60%、例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列番号1の成熟ポリペプチドに対する配列同一性を有する、ペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。特定の実施形態において、親酵素は、配列番号1の成熟ポリペプチドに対する少なくとも96%の配列同一性を有する親ペクチン酸リアーゼである。一態様において、親のアミノ酸配列は、配列番号1の成熟ポリペプチドとは、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9または10といった10以下のアミノ酸で異なる。

0127

他の態様において、親は、配列番号1のアミノ酸配列を含むか、または、これから構成される。他の態様において、親は、配列番号1の成熟ポリペプチドを含むか、または、これから構成される。

0128

ポリペプチドは、一のポリペプチドの領域が、他のポリペプチドの領域のN−末端またはC−末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。

0129

親は、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドのN−末端またはC−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合することにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、技術分野において公知であると共に、フレーム中に収まり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータによる制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合ポリペプチドはまた、翻訳後に融合ポリペプチドが形成されるインテインテクノロジーを用いて構築されてもよい(Cooper et al.,1993,EMBO J.12:2575−2583;Dawson et al.,1994,Science 266:776−779)。

0130

融合ポリペプチドは、2つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質が分泌される際に、この部位が切断されて2つのポリペプチドが遊離される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Martin et al.,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568−576;Svetina et al.,2000,J.Biotechnol.76:245−251;Rasmussen−Wilson et al.,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488−3493;Ward et al.,1995,Biotechnology 13:498−503;および、Contreras et al.,1991,Biotechnology 9:378−381;Eaton et al.,1986,Biochemistry 25:505−512;Collins−Racie et al.,1995,Biotechnology 13:982−987;Carter et al.,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics 6:240−248;および、Stevens,2003,Drug Discovery World 4:35−48に開示されている部位が挙げられる。

0131

親は、いずれかの属の微生物から得られ得る。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされた親がソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された菌株によって生成されることを意味することとする。一態様において、親は、細胞外に分泌される。

0132

親は細菌性ペクチン酸リアーゼであり得る。例えば、親は、バチルス属(Bacillus)、クロストリジウム属(Clostridium)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、ゲオバチルス属(Geobacillus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、オセアノバチルス属(Oceanobacillus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、もしくはストレプトマイセス属(Streptomyces)ペクチン酸リアーゼなどのグラム陽性細菌性ポリペプチド、または、カムピロバクター属(Campylobacter)、大腸菌(E.coli)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、フソバクテリウム属(Fusobacterium)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、イリオバクター属(Ilyobacter)、ネイッセリア属(Neisseria)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)またはウレアプラズマ属(Ureaplasma)ペクチン酸リアーゼなどのグラム陰性細菌性ポリペプチドであり得る。

0133

一態様において、親は、バチルスアルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルスブレビス(Bacillus brevis)、バチルスシルクランス(Bacillus circulans)、バチルスクラウシイ(Bacillus clausii)、バチルスコアグランス(Bacillus coagulans)、バチルスフィルムス(Bacillus firmus)、バチルスラウツス(Bacillus lautus)、バチルスレンツス(Bacillus lentus)、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルスメガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルスプミルス(Bacillus pumilus)、バチルスステアテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、バチルスサブチリス(Bacillus subtilis)、または、バチルスチューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)ペクチン酸リアーゼである。

0134

これらの種の菌株は、American Type Culture Collection(ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)、および、Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center(NRRL)などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。

0135

親は、上記のプローブを用いて、自然(例えば、汚染物コンポスト、水等)から単離された微生物、または、天然材料(例えば、汚染物、コンポスト、水等)から直接的に得られたDNAサンプルを含む他のソースから同定および得られ得る。微生物およびDNAを自然環境から直接的に単離する技術は技術分野において周知である。次いで、親をコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合DNAサンプルのゲノムDNAもしくはcDNAライブラリを同じようにスクリーニングすることにより入手し得る。一旦、親をコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の技術(例えば、前述のSambrook et al.,1989を参照のこと)を利用することにより単離またはクローン化することが可能である。

0136

変異体の調製
本発明はまた、ペクチン酸リアーゼ活性を有する変異体を得る方法であって:(a)親ペクチン酸リアーゼ(例えば、配列番号1または配列番号2を有する)に、位置:48、49、99、108、124、149、176、229、250、257、325、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、99+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、229+250、229+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356および48+257(例えば、配列番号1に従う番号付けを用いる)に相当する1つ以上の(例えば、数々の)位置に置換を導入するステップ、および/または、(b)親ペクチン酸リアーゼ(例えば、配列番号1または配列番号2を有する)に、配列番号1の成熟ポリペプチドの:P48A、P48F、P48H、P48I、P48K、P48L、P48N、P48Q、P48R、P48S、P48T、P48W、P48Y、T49F、T49H、T49I、T49K、T49L、T49M、T49N、T49Q、T49R、T49V、T49W、T49Y、K99A、K99C、K99D、K99E、K99F、K99G、K99H、K99I、K99L、K99M、K99N、K99P、K99Q、K99S、K99T、K99V、K99W、K99Y、E108A、E108G、E108H、E108K、E108L、E108M、E108N、E108R、E108S、E108T、E108V、E108W、D124A、D124E、D124F、D124G、D124I、D124L、D124M、D124N、D124P、D124Q、D124R、D124S、D124T、D124V、D124W、S149K、S149L、S149R、S149W、S176A、S176C、S176D、S176E、S229I、S229K、S229L、S229M、S229Q、S229T、S229V、S229Y、I250A、I250G、I250L、I250M、I250N、I250S、I250T、K257A、K257C、K257D、K257H、K257I、K257L、K257M、K257Q、K257S、K257V、K257W、I325F、I325L、I325Y、Q356D、Q356E、Q356F、Q356G、Q356H、Q356I、Q356L、Q356N、Q356R、Q356T、Q356W、Q356Y、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、S229I+I250N、S229I+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356FおよびI250N+Q356Fからなる群から選択される1つ以上の置換を導入するステップ(ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する);ならびに、(c)変異体を回収するステップを含む方法に関する。

0137

好ましい実施形態において、方法は:(a)親ペクチン酸リアーゼ(例えば、配列番号1を有する)に、配列番号1の成熟ポリペプチドの:P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+S229I、S229I+K257L、S229I+I250N、S229I+Q356F、P48W+K257L、I250N+K257L、K257L+Q356F、P48W+I250N、P48W+Q356F、I250N+Q356F、K99D+S176D+I325F、T49R+K99D+S176D+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+K257L+I325F+Q356F、K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+S176D+I325F+Q356F、K99D+D124W+S176D+I325F+Q356F、P48W+K99D+S176D+I325F+Q356F、K99D+E108N+S176D+I325F+Q356F、K99D+T49W+E108N+S176D+I325F+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+E108N+D124W+S176D+S229I+I250N+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+S176D+I250N+I325F+K257L+Q356F、P48W+T49R+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、P48W+T49W+K99D+S176D+K257L+I325F+Q356F、T49R+K99D+D124W+S176D+K257L+I325F+Q356FおよびS229I+I250N+Q356Fからなる群から選択される1つの改変(または複数の改変)を導入するステップ(ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する);ならびに、(b)変異体を回収するステップを含む。

0138

さらなる態様において、本発明はまた、ペクチン酸リアーゼ活性を有する変異体を得る方法であって:(a)親ペクチン酸リアーゼ(例えば、配列番号1または配列番号2を有する)に、位置250、176、124、108、149および325(ここで、番号付けは配列番号1の成熟ポリペプチドに従い、ここで、変異体はペクチン酸リアーゼ活性を有する)に相当する1つ以上の(例えば、数々の)位置に置換を導入するステップ;ならびに、(b)任意選択により、変異体を回収するステップを含む方法に関する。

0139

いくつかの態様において(例えば、上記の態様のいずれか)、この方法はさらに、変異体を精製するステップを含む。

0140

変異体は、部位特異的突然変異誘発、合成遺伝子構築、半合成遺伝子構築ランダム突然変異誘発、シャッフリング等などの技術分野において公知であるいずれかの突然変異誘発法を用いて調製可能である。

0141

部位特異的突然変異誘発は、親をコードするポリヌクレオチドにおける1つ以上の定義された部位に1つ以上(例えば、数々)の突然変異を導入する技術である。

0142

部位特異的突然変異誘発は、所望される突然変異を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCRによりインビトロで達成可能である。部位特異的突然変異誘発はまた、親をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミド中における部位での制限酵素による開裂を含むカセット突然変異誘発により、および、その後の、ポリヌクレオチド中に突然変異を含有するオリゴヌクレオチドの連結により、インビトロで行うことが可能である。通常、プラスミドおよびオリゴヌクレオチドを消化する制限酵素は同一であり、プラスミドの付着末端と、インサートとの互いの連結が可能とされる。例えば、Scherer and Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4949−4955;および、Barton et al.,1990,Nucleic AcidsRes.18:7349−4966を参照のこと。

0143

部位特異的突然変異誘発はまた、当技術分野において公知である方法によってインビボで達成可能である。例えば、米国特許出願公開第2004/0171154号明細書;Storici et al.,2001,Nature Biotechnol.19:773−776;Kren et al.,1998,Nat.Med.4:285−290;および、Calissano and Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.43:15−16を参照のこと。

0144

部位特異的突然変異誘発法のいずれかを本発明において用いることが可能である。変異体の調製に用いることが可能である多数の市販キット入手可能である。

0145

合成遺伝子構築には、対象のポリペプチドをコードするための設計されたポリヌクレオチド分子インビトロ合成が伴う。遺伝子合成は、Tian et al.(2004,Nature 432:1050−1054)により記載されている多重マイクロチップ系テクノロジー、ならびに、オリゴヌクレオチドが合成されると共に光による制御が可能なマイクロ流体チップアセンブルされる同様のテクノロジーなどの多数の技術を利用して行うことが可能である。

0146

単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および/または挿入は、Reidhaar−Olson and Sauer,1988,Science 241:53−57;Bowie and Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152−2156;国際公開第95/17413号パンフレット;または、国際公開第95/22625号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組み換え法、および/または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンPCR、ファージディスプレイ(例えば、Lowman et al.,1991,Biochemistry 30:10832−10837;米国特許第5,223,409号明細書;国際公開第92/06204号パンフレット)、および、領域特異的突然変異誘発(Derbyshire et al.,1986,Gene 46:145;Ner et al.,1988,DNA 7:127)が挙げられる。

0147

突然変異誘発/シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である(Ness et al.,1999,Nature Biotechnology 17:893−896)。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発DNA分子は、宿主細胞から回収可能であり、当技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。

0148

半合成遺伝子構築は、合成遺伝子構築および/または部位特異的突然変異誘発および/またはランダム突然変異誘発および/またはシャッフリングの態様を組み合わせることにより達成される。半合成構築は、PCR技術と組み合わされる、合成されたポリヌクレオチド断片を利用するプロセスに代表される。それ故、遺伝子の定義された領域が新たに合成され得、一方で、他の領域が部位特異的突然変異誘発性プライマーを用いて増幅され得、一方で、さらに他の領域がエラープローンPCRまたは非エラープローンPCR増幅に供され得る。次いで、ポリヌクレオチドサブ配列シャッフルされ得る。

0149

ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。従って、一態様において、本発明は:250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257および229+250+356からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも65%であるが、100%未満の同一性を有する。

0150

他の態様において、本発明は、位置250、176、124、108、149および325からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチドに関し、ここで、番号付けは配列番号1に従い、および、ここで、改変は、独立して:
(i)該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入;
(ii)該当する位置を占有するアミノ酸の欠失;または
(iii)該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有する。

0151

核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる1つ以上の制御配列に作動的に結合された本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。従って、一態様において、本発明は:250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257および229+250+356からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも65%であるが、100%未満の同一性を有し、これは、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞にコード配列を発現させる1つ以上の制御配列に作動的に結合している。

0152

他の態様において、本発明は、位置250、176、124、108、149および325からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関し、ここで、番号付けは配列番号1に従い、および、ここで、改変は、独立して:
(i)該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入;
(ii)該当する位置を占有するアミノ酸の欠失;または
(iii)該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有し、これは、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞にコード配列を発現させる1つ以上の制御配列に作動的に結合している。

0153

ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されて変異体の発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組み換えDNA法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は当技術分野において周知である。

0154

制御配列は、ポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータであり得る。プロモータは、変異体の発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。

0155

細菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)α−アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)ペニシリナーゼ遺伝子(penP)、バチルスステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトジェニッアミラーゼ遺伝子(amyM)、枯草菌(Bacillus subtilis)レバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、枯草菌(Bacillus subtilis)xylAおよびxylB遺伝子、バチルスチューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)cryIIIA遺伝子(Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13:97−107)、大腸菌(E.coli)lacオペロン、大腸菌(E.coli)trcプロモータ(Egon et al.,1988,Gene 69:301−315)、ストレプトマイセスコエリコロル(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)および原核β−ラクタマーゼ遺伝子(Villa−Kamaroff et al.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:3727−3731)、ならびに、tacプロモータ(DeBoer et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21−25)から得られるプロモータである。さらなるプロモータが、「Useful proteins from recombinant bacteria」,Gilbert et al.,1980,Scientific American 242:74−94;および、前述のSambrook et al.,1989に記載されている。タンデムプロモータの例は国際公開第99/43835号パンフレットに開示されている。

0156

糸状真菌宿主細胞において本発明の核酸構築物の転写をもたらす好適なプロモータの例は、アスペルギルスズランス(Aspergillus nidulans)アセトアミダーゼアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)中性α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)またはアスペルギルスアワモリ(Aspergillus awamori)グルコアミラーゼ(glaA)、アスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)アルカリ性タンパク分解酵素、アスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)トリオースリン酸イソメラーゼフザリウムオキシスポルム(Fusarium oxysporum)トリプシン−様タンパク分解酵素(国際公開第96/00787号パンフレット)、フザリウムベネナツム(Fusarium venenatum)アミログルコシダーゼ(国際公開第00/56900号パンフレット)、フザリウムベネナツム(Fusarium venenatum Daria)(国際公開第00/56900号パンフレット)、フザリウムベネナツム(Fusarium venenatum Quinn)(国際公開第00/56900号パンフレット)、リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ、リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼトリコデルマレエセイ(Trichoderma reesei)β−グルコシダーゼ、トリコデルマレエセイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドロラーゼI、トリコデルマレエセイ(Trichoderma reesei)セロビオヒドロラーゼII、トリコデルマレエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼI、トリコデルマレエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼII、トリコデルマレエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼIII、トリコデルマレエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼIV、トリコデルマレエセイ(Trichoderma reesei)エンドグルカナーゼV、トリコデルマレエセイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼI、トリコデルマレエセイ(Trichoderma reesei)キシラナーゼII、トリコデルマレエセイ(Trichoderma reesei)β−キシロシダーゼ、ならびに、NA2−tpiプロモータ(非翻訳リーダーがアスペルギルス属(Aspergillus)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルス属(Aspergillus)中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータ;非限定的な例としては、非翻訳リーダーがアスペルギルスニズランス(Aspergillus nidulans)またはアスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーにより置き換えられた、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)中性α−アミラーゼ遺伝子由来の修飾プロモータが挙げられる)の遺伝子から得られたプロモータ;ならびに、そのミュータント、切断およびハイブリッドプロモータである。

0157

イースト菌宿主において、有用なプロモータは、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)エノラーゼ(ENO−1)、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)ガラクトキナーゼ(GAL1)、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)アルコール脱水素酵素グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素ADH1、ADH2/GAP)、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)トリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)メタロチオネイン(CUP1)およびサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)3−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞に対する他の有用なプロモータは、Romanos et al.,1992,Yeast 8:423−488により記載されている。

0158

制御配列はまた、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる転写ターミネータであり得る。ターミネータ配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの3’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのターミネータが用いられ得る。

0159

細菌性宿主細胞に好ましいターミネータは、バチルスクラウシイ(Bacillus clausii)アルカリ性プロテアーゼ(aprH)、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)α−アミラーゼ(amyL)および大腸菌(Escherichia coli)リボソーム性RNA(rrnB)の遺伝子から入手される。

0160

糸状真菌宿主細胞の好ましいターミネータは、アスペルギルスニズランス(Aspergillus nidulans)アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼ、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)α−グルコシダーゼ、アスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼおよびフザリウムオキシスポルム(Fusarium oxysporum)トリプシン−様タンパク分解酵素の遺伝子から得られる。

0161

イースト菌宿主細胞の好ましいターミネータは、charomyces cerevisiae)エノラーゼ、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)チトクロムC(CYC1)およびサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られる。イースト菌宿主細胞の他の有用なターミネータが、前述のRomanos et al.,1992に記載されている。

0162

制御配列はまた、プロモータの下流および遺伝子のコード配列の上流における、遺伝子の発現を高めるmRNAスタビライザ領域であり得る。

0163

好適なmRNAスタビライザ領域の例は、バチルスチューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)cryIIIA遺伝子(国際公開第94/25612号パンフレット)および枯草菌(Bacillus subtilis)SP82遺伝子(Hue et al.,1995,Journal of Bacteriology 177:3465−3471)から得られる。

0164

制御配列はまた、宿主細胞による翻訳に重要であるmRNAの非翻訳領域であるリーダーであり得る。リーダー配列は、変異体をコードするポリヌクレオチドの5’−末端に作動可能にリンクする。宿主細胞において機能するいずれかのリーダーが用いられ得る。

0165

糸状真菌宿主細胞の好ましいリーダーは、アスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼおよびアスペルギルスニズランス(Aspergillus nidulans)トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。

0166

イースト菌宿主細胞の好適なリーダーは、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)エノラーゼ(ENO−1)、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)3−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)アルコール脱水素酵素/グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素(ADH2/GAP)の遺伝子から得られる。

0167

制御配列はまた、変異体コーディング配列の3’−末端に作動可能にリンクし、転写された場合に、ポリアデノシン残基を転写mRNAに負荷するシグナルとして宿主細胞により認識される配列であるポリアデニル化配列であり得る。宿主細胞において機能するポリアデニル化配列のいずれかが用いられ得る。

0168

糸状真菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルスニズランス(Aspergillus nidulans)アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)グルコα−アミラーゼ、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)α−グルコシダーゼ、アスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼおよびフザリウムオキシスポルム(Fusarium oxysporum)トリプシン−様プロテアーゼの遺伝子から得られる。

0169

イースト菌宿主細胞の有用なポリアデニル化配列が、Guo and Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983−5990に記載されている。

0170

制御配列はまた、変異体のN−末端にリンクしたシグナルペプチドをコードし、および、変異体を細胞の分泌経路に送るシグナルペプチドコード領域であり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の5’−末端は、変異体をコードするコード配列のセグメントと共に、翻訳読み枠に元々リンクしたシグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。または、コード配列の5’−末端は、コード配列に対して外来性のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード配列を元々含有していない場合には、外来性のシグナルペプチドコード配列が必要とされる場合がある。または、外来性のシグナルペプチドコード配列は単に、変異体の分泌を増強するために天然シグナルペプチドコード配列を置き換えてもよい。しかしながら、発現変異体を宿主細胞の分泌経路に送るいずれかのシグナルペプチドコード配列が用いられてもよい。

0171

細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属(Bacillus)NCIB11837マルトジェニックアミラーゼ、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)サブチリシン、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)β−ラクタマーゼ、バチルスステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)α−アミラーゼ、バチルスステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)および枯草菌(Bacillus subtilis)prsAの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドが、Simonen and Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109−137に記載されている。

0172

糸状真菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)中性アミラーゼ、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼ、アスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、フミコラインソレンス(Humicola insolens)セルラーゼ、フミコラインソレンス(Humicola insolens)エンドグルカナーゼV、フミコララヌギノサ(Humicola lanuginosa)リパーゼおよびリゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。

0173

イースト菌宿主細胞の有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)α−因子およびサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列が、前述のRomanos et al.,1992により記載されている。

0174

制御配列はまた、変異体のN−末端でプロペプチド位置をコードするプロペプチドコード配列であり得る。得られたポリペプチドは、酵素原またはプロポリペプチド(または、いくつかの場合においてチモーゲン)として公知である。プロポリペプチドは、一般に非活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって活性ポリペプチドに転換されることが可能である。プロペプチドコード配列は、枯草菌(Bacillus subtilis)アルカリ性タンパク分解酵素(aprE)、枯草菌(Bacillus subtilis)中性タンパク分解酵素(nprT)、ミセリオフトラテルモフィラ(Myceliophthora thermophila)ラッカーゼ(国際公開第95/33836号パンフレット)、リゾムコールミエヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼおよびサッカロマイセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)α−因子の遺伝子から得られ得る。

0175

シグナルペプチドおよびプロペプチド配列の両方が存在する場合、プロペプチド配列は変異体のN−末端に隣接して位置されており、また、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のN−末端に隣接して位置されている。

0176

宿主細胞の増殖に対した変異体の発現を調節する調節配列を付加することが望ましい場合もあり得る。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応じて、遺伝子の発現をオンオフさせるものである。原核系における調節系としては、lac、tac、およびtrpオペレータ系が挙げられる。イースト菌においては、ADH2系またはGAL1系が用いられ得る。糸状菌においては、アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)グルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)TAKAα−アミラーゼプロモータおよびアスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)グルコアミラーゼプロモータが用いられ得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とするものである。真核系において、これらの調節配列は、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および、重金属を伴って増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの事例において、変異体をコードするポリヌクレオチドは、調節配列と作動可能にリンクしているであろう。

0177

発現ベクター
本発明はまた、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモータならびに転写および翻訳終止シグナルを含む組み換え発現ベクターに関する。従って、一態様において、本発明は:250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257および229+250+356(ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも65%であるが、100%未満の同一性を有する)からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモータならびに転写および翻訳終止シグナルを含む組み換え発現ベクターに関する。

0178

他の態様において、本発明は:位置250、176、124、108、149および325(ここで、番号付けは配列番号1に従い、および、ここで、改変は、独立して:
(i)該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入;
(ii)該当する位置を占有するアミノ酸の欠失;または
(iii)該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有する)からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチド、プロモータならびに転写および翻訳終止シグナルを含む組み換え発現ベクターに関する。

0179

種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位で変異体をコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために1つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組み換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。

0180

組み換え発現ベクターは、組み換えDNA法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター(例えば、プラスミドまたはウイルス)であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。

0181

ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター(すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター)であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含み得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全DNAを含有する2つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。

0182

ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入等された細胞の選択を容易とする1つまたは複数の選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子である。

0183

細菌性選択マーカーの例は、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)もしくは枯草菌(Bacillus subtilis)dal遺伝子、または、アンピシリンクロラムフェニコールカナマイシンネオマイシンスペクチノマイシンもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を与えるマーカーである。イースト菌宿主細胞の好適なマーカーとしては、これらに限定されないが、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1およびURA3が挙げられる。糸状真菌宿主細胞において使用される選択マーカーとしては、これらに限定されないが、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pyrG(オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)、sC(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)およびtrpC(アントラニル酸シンターゼ)、ならびに、これらの均等物が挙げられる。アスペルギルスニズランス(Aspergillus nidulans)またはアスペルギルスオリゼー(Aspergillus oryzae)amdSおよびpyrG遺伝子、ならびに、ストレプトマイセスハイグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)bar遺伝子がアスペルギルス属(Aspergillus)細胞における使用に好ましい。

0184

ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの統合、または、ゲノムとは無関係の細胞中のベクターの自律複製許容する要素を含むことが好ましい。

0185

宿主細胞ゲノムへの統合に関して、ベクターは、変異体をコードするポリヌクレオチドの配列、または、相同的もしくは非相同的組み換えによるゲノムへの統合に係るベクターのいずれかの他の要素に依存し得る。または、ベクターは、染色体における正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同的組み換えによる統合をもたらす追加のポリヌクレオチドを含有していてもよい。正確な位置で統合される可能性を高めるために、統合要素は、相同的組み換えの確率を高めるために対応する標的配列に対して高度の配列同一性を有する、100〜10,000塩基対、400〜10,000塩基対および800〜10,000塩基対などの十分な数の核酸を含有しているべきである。統合要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同的であるいずれかの配列であり得る。さらに、統合要素は、非コーディングまたはコーディングポリヌクレオチドであり得る。他方で、ベクターは、非相同的組み換えにより宿主細胞のゲノムに統合され得る。

0186

自律複製に関して、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含んでいてもよい。複製起点は、細胞において機能する自律複製を媒介するいずれかのプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」または「プラスミドレプリケータ」という用語は、インビボでのプラスミドまたはベクターの複製を可能とするポリヌクレオチドを意味する。

0187

細菌性複製起点の例は、大腸菌(E.coli)における複製を許容するプラスミドpBR322、pUC19、pACYC177およびpACYC184の複製起点、ならびに、バチルス属(Bacillus)における複製を許容するpUB110、pE194、pTA1060およびpAMβ1の複製起点である。

0188

イースト菌宿主細胞において用いられる複製起点の例は、2ミクロン複製起点、ARS1、ARS4、ARS1とCEN3との組み合わせ、および、ARS4とCEN6との組み合わせである。

0189

糸状真菌細胞において有用な複製起点の例は、AMA1およびANS1(Gems et al.,1991,Gene 98:61−67;Cullen et al.,1987,Nucleic AcidsRes.15:9163−9175;国際公開第00/24883号パンフレット)である。AMA1遺伝子の単離およびAMA1遺伝子を含むプラスミドまたはベクターの構築は、国際公開第00/24883号パンフレットに開示されている方法に従って達成可能である。

0190

本発明のポリヌクレオチドの2つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されて、変異体の生成が高められてもよい。ポリヌクレオチドのコピーの数は、配列の少なくとも1つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに統合することにより、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることにより増加させることが可能であり、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、従って、ポリヌクレオチドの追加のコピーを含有する細胞は、適切な選択可能な薬剤中で細胞を培養することにより選択可能である。

0191

上記の要素を連結して本発明の組み換え発現ベクターを構築するために用いられる手法は、当業者に周知である(例えば、前述のSambrook et al.,1989を参照のこと)。

0192

宿主細胞
本発明はまた、本発明の変異体を産生させる1つ以上の制御配列に作動的に結合した本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドの組み換え宿主細胞に関する。従って、一態様において、本発明は:250、176、124、325、108、149、48、49、99、229、257、356、99+176+325、49+99+176+325+356、49+99+176+257+325+356、49+99+176+229+257+325+356、99+176+325+356、99+49+176+325+356、99+124+176+325+356、48+99+176+325+356、99+108+176+325+356、99+49+108+176+325+356、48+229、229+257、229+250、229+356、250+257、257+356、48+250、48+356、250+356、48+49+99+176+257+325+356、48+49+99+176+257+325+356、49+99+124+176+257+325+356、49+99+124+176+229+250+257+325+356、49+99+176+229+250+257+325+356、49+99+108+124+176+229+250+257+325+356、48+49+99+176+250+257+325+356、49+99+176+250+325+257+356、48+257および229+250+356からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を含む変異体を産生させる1つ以上の制御配列に作動的に結合した本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え宿主細胞に関し、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体は、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも65%であるが、100%未満の同一性を有する。

0193

他の態様において、本発明は、位置250、176、124、108、149および325からなる群から選択される1つ以上の位置に改変を含む変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え宿主細胞に関し、ここで、番号付けは配列番号1に従い、および、ここで、改変は、独立して:
(i)該当する位置を占有するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入;
(ii)該当する位置を占有するアミノ酸の欠失;または
(iii)該当する位置を占有するアミノ酸の異なるアミノ酸による置換
であり、
ならびに、ここで、各位置は配列番号1のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に係る位置に対応し、および、ここで、変異体ペクチン酸リアーゼは、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも75%の同一性を有する。

0194

ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、変異体をコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。

0195

宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物といった、変異体の組み換え生成において有用ないずれかの細胞であり得る。

0196

原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属(Bacillus)、クロストリジウム属(Clostridium)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、ゲオバチルス属(Geobacillus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、オセアノバチルス属(Oceanobacillus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)およびストレプトマイセス属(Streptomyces)が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属(Campylobacter)、大腸菌(E.coli)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、フソバクテリウム属(Fusobacterium)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、イリオバクター属(Ilyobacter)、ネイッセリア属(Neisseria)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)およびウレアプラズマ属(Ureaplasma)が挙げられる。

0197

細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルスアルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルスブレビス(Bacillus brevis)、バチルスシルクランス(Bacillus circulans)、バチルスクラウシイ(Bacillus clausii)、バチルスコアグランス(Bacillus coagulans)、バシラスフィルムス(Bacillus firmus)、バチルスラウツス(Bacillus lautus)、バチルスレンツス(Bacillus lentus)、バチルスリケニホルミス(Bacillus licheniformis)、バチルスメガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルスプミルス(Bacillus pumilus)、バチルスステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、枯草菌(Bacillus subtilis)、およびバチルスチューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)細胞を含むいずれかのバチルス属(Bacillus)細胞であり得る。

0198

細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカスエクイシミリス(Streptococcus equisimilis)、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカスウベリス(Streptococcus uberis)、およびストレプトコッカスズーエピデミカス(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)細胞のいずれかのストレプトコッカス属(Streptococcus)細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属(Streptococcus)細胞であり得る。

0199

細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセスアウロモゲネス(Streptomyces achromogenes)、ストレプトマイセスアベルチリス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトマイセスコエリコロル(Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセスグリセウス(Streptomyces griseus)、およびストレプトマイセスリビダンス(Streptomyces lividans)細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属(Streptomyces)細胞であり得る。

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