図面 (/)

技術 PETイメージング用免疫修飾因子

出願人 ブリストル-マイヤーズスクイブカンパニー
発明者 デイビッド・ジェイ・ドネリーケネス・エム・ボーイユンフイ・チャンキム・ジュニョンアドリエンヌ・ペナ
出願日 2017年5月17日 (3年1ヶ月経過) 出願番号 2018-560588
公開日 2019年7月18日 (11ヶ月経過) 公開番号 2019-520328
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 中間水準 液体センサー 軸方向視野 定量パラメータ インジェクションループ M機器 温度調節ユニット イメージングスキャナー
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年7月18日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (5)

課題・解決手段

本発明は、体内の様々な過程イメージングし、疾患病状に関連する分子の位置を検出し、疾患の進行をモニタリングするための18F−標識ミラモレキュラーの合成および使用に関する。

概要

背景

概要

本発明は、体内の様々な過程イメージングし、疾患病状に関連する分子の位置を検出し、疾患の進行をモニタリングするための18F−標識ミラモレキュラーの合成および使用に関する。

目的

これらの18F標識されたミラモレキュラーは、細胞および組織(例えば、腫瘍)において、貴重治療情報を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
- 件
牽制数
- 件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

該当するデータがありません

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

式(I)(式中、xは、1〜8の整数であり、RはC1−C6アルキル基である)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩。

請求項2

式(II)(式中、xは、1〜8の整数であり、Rは、C1−C6アルキル基である)である、請求項1記載の化合物またはその医薬的に許容され得る塩。

請求項3

式(III)である、請求項1記載の化合物またはその医薬的に許容され得る塩。

請求項4

式(IV)(式中、xは、1〜8の整数であり、RがC1−C6アルキル基である)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩。

請求項5

式(V)である、請求項4記載の化合物またはその医薬的に許容され得る塩。

請求項6

請求項1記載の化合物の画像を得る方法であって、以下の工程:a)化合物を対象に投与する工程;b)インビボでの該化合物の分布を、陽電子放出断層撮影(PET)スキャンによりイメージングを行なう工程、を特徴とする、方法。

請求項7

画像化された請求項1記載の化合物の分布が、疾患の存在または非存在指標である、請求項6記載の方法。

請求項8

対象における疾患の進行をモニターする方法であって、以下の工程:(a)最初の時点で、疾患の存在に関係する標的分子に結合する請求項1記載の化合物を、それが必要な患者に投与して、疾患細胞または組織の量を決定するために、対象の少なくとも1部分の画像を得る工程;および(b)その後の1以上の時点で、対象に請求項1記載の化合物を投与して、各時点での対象の少なくとも1部分の画像を得る工程;ここで、各時点での該疾患細胞または組織の体積および位置は疾患の進行の指標である、を特徴とする、方法。

請求項9

対象における疾患細胞または組織を定量する方法であって、以下の工程:(a)疾患細胞または組織を有する対象に、該疾患細胞または組織に位置する標的分子に結合する請求項1記載の化合物を投与する工程;および(b)該疾患細胞または組織において、18Fの放射性放射を検出する工程;ここで、該疾患細胞または組織の放射性放射の量および分布は、疾患細胞または組織の定量的な測定基準である、を特徴とする、方法。

請求項10

疾患が、固体癌、造血癌、血液癌自己免疫性疾患神経変性疾患循環器疾患および病原性感染からなる群から選択される、請求項9記載の方法。

請求項11

PD−L1を発現している組織または細胞定量画像を得る方法であって、以下の工程:細胞または組織に、PD−L1に結合する請求項1記載の化合物を接触させる工程;および陽電子放出断層撮影(PET)を用いて、PD−L1が発現している組織を検出または定量する工程、を特徴とする、方法。

請求項12

疾患を治療する薬剤スクリーニング方法であって、以下の工程:(a)PD−L1を発現する細胞を、候補薬剤の存在および非存在下において、PD−L1に結合する請求項1記載の化合物と接触させる工程;および(b)該候補薬剤の存在および非存在下において、陽電子放出断層撮影(PET)を用いて、該細胞のイメージングを行なう工程;ここで、該候補薬剤の存在下における放射性放射の量の減少は、該候補薬剤がPD−L1に結合しているという指標である、を特徴とする、方法。

請求項13

請求項1記載の化合物を含む、医薬組成物

請求項14

請求項1記載の化合物を製造する際に使用するための反応前駆体、および請求項1の化合物を製造するための説明書を含む、キット

関連出願の相互参照

0001

本願は、2016年5月19日に出願した米国仮出願第62/338,872号の優先権を主張するものであり、その内容は引用により本明細書に援用される。

技術分野

0002

本発明は、一般的に、18F−補欠分子族を含有する免疫修飾因子に関するもので、体内の様々なプロセスをイメージングするため、疾患病状に関連する分子の位置を検出するため、および疾患の進行をモニターするための、18F−標識免疫修飾因子の合成および使用に関する。

0003

陽電子放出断層撮影(PET)は、高い感受性(フェムトモル)および高分解能(4〜10mm)を有し、組織成長定量化することができる、診断医学および創薬において最も広く用いられる方法のうちの1つになっている非侵襲性イメージング技術である。PETイメージングによって得られる生体内生物学的プロセスに関する有益なインビボ機能の情報によって、前臨床および臨床の両方において同じ手段を用いることができるという、固有翻訳可能医療上の利点もまた得られる。

0004

PETは、18F、64Cu、11C、150、13N、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、94mTc、86Yおよび124Iなどの陽電子放出放射同位体によって標識される分子の設計および合成を利用する。インビボにおいて、これらの放射性トレーサーまたは放射性リガンドは同位体の核から、用いられる同位体に応じてエネルギーの異なる陽電子を放出する。放出された陽電子のエネルギーは、陽電子が電子衝突して反対方向に511keVの2つのガンマ線を放出する前に、陽電子が移動する平均距離を制御する。この陽電子消滅によって生じるガンマ線が、PETイメージングスキャナーによって検出され、放射性トレーサーの分布時間関数として明らかにする平面および断層画像が得られる。そのため、PETイメージングにおいて、対消滅の前の陽電子の移動距離および、ガンマ線、アルファ粒子またはベータ粒子など他の放出によって起こる線量測定の問題を最小化するためには、低い放出エネルギーを持つ同位体の純粋な陽電子放射体である同位体が好ましい。

0005

さらに、PETイメージングに用いられる同位体の半減期は、放射性トレーサー分子の合成および解析患者への注入、インビボでの局在化非標的組織からのクリアランス、および鮮明な画像の取得に耐えうる十分な長さでなければならない。18F(β+ 635keV 97%、t1/2 110分)は、陽電子放出エネルギーが低く、副次的な放出がなく、適切な半減期であるため、最も広く用いられるPET放出同位体の1つである。

0006

本発明は、ポリエチレングリコール(PEG)部位および末端アジドに結合したニトロ−ピリジンを含む18F−標識補欠分子族で置換されたミラモレキュラーに関する。いくつかの実施態様において、二価結合性(bifunctional conjugating)基(例えば、環束縛アルキン基)を含むミラモレキュラーは、18F−標識補欠分子族の末端アジドと「クリック生体直交性反応を介して共有結合を形成し、生理学的条件下で安定な放射性標識プローブを生成する。最終産物のUV吸光度はさらに、生成物放射化学的純度を決定するために、実用的で、高感度かつ迅速な解析方法につながる。これらの18F標識されたミラモレキュラーは、細胞および組織(例えば、腫瘍)において、貴重治療情報を提供することができるPD-L1の存在を検出するのに有用である。

0007

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明白であるが、これらを制限として理解されるべきではない。

図面の簡単な説明

0008

図1は、左右相称にPD−L1(+)L2987およびPD−L1(−)異種移植腫瘍を持つマウスにおける[18F]標識された大環状PD−L1ペプチドの代表的なPET/CT画像である。
図2は、[18F]標識された大環状PD−L1ペプチド放射性トレーサーについての平均的な時間放射能曲線を示す。
図3は、非ヒト霊長類における[18F]標識された大環状PD−L1ペプチド放射性トレーサーの代表的なPET画像を示す。
図4は、異種移植(A&B)およびヒト非小細胞肺癌生検組織(C&D)における[18F]標識された大環状PD−L1ペプチド放射性トレーサーのオートラジオグラム画像を示す。

0009

第一態様において、本明細書は、式(I)




(式中、xは、1〜8の整数であり、RはC1−C6アルキル基である)
化合物、あるいはその医薬的に許容され得る塩を提供する。

0010

第二態様において、本明細書は、式(II)




(式中、xは、1〜8の整数であり、RはC1−C6アルキル基である)
の化合物、あるいはその医薬的に許容され得る塩を提供する。

0011

第三態様において、本明細書は、式(III)




の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を提供する。

0012

第四態様において、本明細書は、式(IV)




(式中、xは、1〜8の整数であり、Rは、C1−C6アルキル基である)
の化合物、またはその医薬的に許容され得る塩を提供する。

0013

第五態様において、本明細書は、式(V)




の化合物、またはその医薬的に許容され得る塩を提供する。

0014

第六態様において、本発明は、式(I)〜(V)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩の画像を得る方法を提供するものであって、該方法は、
a)該化合物を対象に投与する工程;および
b)インビボでの化合物の分布を、陽電子放出断層撮影(PET)スキャンによりイメージングを行なう工程、
を特徴とする。

0015

第六態様の第一実施形態において、式(I)〜(V)の化合物、あるいはその医薬的に許容され得る塩の画像分布が、疾患の存在または非存在を示す。

0016

第七態様において、本発明は、対象における疾患の進行をモニターする方法を提供するものであって、該方法は、
(a)最初の時点で、疾患の存在に関係する標的分子に結合する式(I)〜(V)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を、それが必要な対象に投与して、疾患細胞または組織の量を決定するために、対象の少なくとも1部分の画像を得る工程;および
(b)その後の1以上の時点で、対象に化合物を投与して、各時点での対象の少なくとも1部分の画像を得る工程;ここで、各時点での該疾患細胞または組織の体積および位置は疾患の進行の指標である、
を特徴とする。

0017

第八態様において、本発明は、対象における疾患細胞または組織を定量する方法を提供するものであって、該方法は、
(a)疾患細胞または組織を有する対象に、疾患細胞または組織に位置する標的分子に結合する式(I)〜(V)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を投与する工程;および
(b)疾患細胞または組織において、18Fの放射性放射を検出する工程;ここで、該疾患細胞または組織の放射性放射の量および分布は、疾患細胞または組織の定量的な測定基準である、
を特徴とする。

0018

第八態様の第一実施形態において、疾患が、固体癌、造血癌、血液癌自己免疫性疾患神経変性疾患循環器疾患および病原性感染からなる群から選択される。

0019

第九態様において、本発明は、PD−L1を発現している組織または細胞の定量画像を得る方法を提供するものであって、該方法は、細胞または組織を、PD−L1に結合する式(I)〜(V)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩と接触させる工程、および陽電子放出断層撮影(PET)を用いて、PD−L1を発現している組織を検出または定量する工程、を特徴とする。

0020

第十態様において、本発明は、疾患を治療する薬剤スクリーニング方法を提供するものであって、該方法は、
(a)候補薬剤の存在および非存在下において、PD−L1を発現する細胞を、PD−L1に結合する式(I)〜(V)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩と接触させる工程;および
(b)該候補薬剤の存在および非存在下において、陽電子放出断層撮影(PET)を用いて、該細胞のイメージングを行なう工程;ここで、該候補薬剤の存在下における放射性放射の量の減少は、該候補薬剤がPD−L1に結合しているという指標である。

0021

第十一態様において、本発明は、式(I)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を含む診断剤または医薬組成物を提供する。

0022

第十二態様において、本発明は、式(I)の化合物の製造において使用するための反応前駆体、ならびに式(I)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を製造するための指示書を含むキットを提供する。

0023

別の態様において、本発明は、イメージング剤として使用するための、式(I)〜(V)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を提供する。

0024

別の態様において、本発明は、対象における疾患の診断において使用するための、式(I)〜(V)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を提供する。典型的には、診断とは、対象における疾患の進行を検出またはモニターすることを含む。一実施形態に従って、式(I)〜(V)の化合物は、診断を必要する対象に投与され、陽電子放出断層撮影を用いて疾患細胞および組織の直接的な可視化が行なわれる。

0025

別の態様において、本発明は、式(I)〜(V)の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を用いて、対象において、組織および細胞におけるPD−L1発現の量および分布に関連する疾患をエクソビボで診断する方法を提供する。

0026

別の態様において、本発明は、インビトロでの対象における疾患の進行をモニターする方法を提供するものであって、該方法は、
(a)最初の時点で、一人の対象の細胞または組織を、式(I)〜(V)の化合物と接触させて(ここで、該化合物は、疾患の存在に関係する標的分子に結合する)、陽電子放出断層撮影を用いて画像を得る工程;および
(b)その後の1以上の時点で、細胞または組織の別のサンプルを、式(I)〜(V)の化合物と接触させて、各時点での画像を得る工程;ここで、各時点での該疾患細胞または組織の体積および位置は、疾患の進行の指標である、
を特徴とする。

0027

別の態様において、本発明は、対象における疾患細胞または組織をインビトロで定量する方法を提供するものであって、該方法は、
(a)対象の細胞または組織のサンプルを、式(I)〜(V)の化合物と接触させて(ここで、該化合物は、疾患の存在に関係する標的分子に結合する)、陽電子放出断層撮影を用いて画像を得る工程;および
(b)疾患細胞または組織中における18Fの放射性放射を検出する工程;ここで、該疾患細胞または組織中の放射性放射の量および分布は、疾患細胞または組織の定量的な測定基準である、
を特徴とする。

0028

本発明のいずれかの態様の一実施形態に従って、該疾患は、PD−L1を発現している組織および細胞中の量および分布に関連がある。通常、該疾患は、固体癌、造血癌、血液癌、自己免疫性疾患、神経変性疾患、循環器疾患および病原性疾患からなる群から選択される。別の実施形態において、該疾患は、固体癌である。

0029

別の態様に従って、本発明は、式(I)〜(V)の化合物を製造する方法を提供する。

0030

本明細書において、18F−補欠分子族および当該18F−補欠分子族を製造するための方法が記述される。本明細書において、18F−補欠分子族を含む放射性標識組成物が記述され、また疾患細胞および/または組織および関連する生物学的状態を、診断、局在化、モニターおよび/または評価するために、これらの放射性標識組成物の使用もまた記述されている。

0031

本開示がさらに容易に理解されうるために、いくつかの用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明に記載される。特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持ち、質量分析、NMRHPLC生化学、DNA組み換え技術および薬理学の従来の方法が用いられる。

0032

本明細書で用いられる単数形の詞「a」「an」および「the」は、文脈上明らかに他を指していない限り、複数の指示対象を含む。「または」または「および」の使用は、特に明示されていない限り、「および/または」を意味する。さらに、用語「例えば(including)」並びに「含む(include)」、「含む(includes)」および「含まれる(included)」などの他の形態の使用は、限定的なものではない。

0033

本明細書で用いられる「約」は、数字の10%増減以内であることを意味する。例えば、「約100」は、90から110の間のいずれかの数字を指す。

0034

本明細書で用いられる「医療用イメージング」は、臨床的目的(疾患を解明し、診断し、モニターしようとする医療処置)または医学(通常の解剖学または生理学の研究など)のために、対象の体(またはその一部)の画像を得るのに用いられる技術およびプロセスをいう。

0035

本明細書で用いられる「陽電子放出断層撮影」または「PET」は、体内のトレーサーの位置の3次元画像を得る、非侵襲性の核医学技術をいう。当該方法は、体内の生物学的に活性な分子に導入された陽電子放出核種(トレーサー)によって、間接的に放出されるガンマ線の対を検出する。PETイメージング方法は、前臨床的および臨床的な両方の創薬において、様々な種類の用途があり、助けとなる。応用例としては、標的のインビボでの飽和の直接的な可視化;毒性または患者ごとの変動を予測するための、正常組織における取り込みのモニター;疾患組織の定量化;腫瘍の転移;および薬剤の経時的な効果または経時的な耐性のモニターが挙げられる。

0036

用語「生体直交性化学」は、従来の生化学的プロセス干渉せずに、生物系の内部で起こりうるいずれかの化学反応をいう。当該用語は、生理学的pHまたは水の存在下におけるインビトロで起こる化学反応である化学反応を含む。生体直交性であるためには、反応は選択的であり、出発化合物に存在する他の官能基との副反応を避ける必要がある。さらに、反応相手との間に形成された共有結合は強く、生物学的反応化学的に不活性でなければならず、目的分子生物学的活性に影響してはならない。

0037

用語「クリックケミストリー」は、新たな化合物および組み合わせライブラリーの迅速な合成のための、確実で選択的な生体直交性反応をいう。クリック反応性質としては、生理学的条件下で安定な化合物を生成するための、モジュール性、範囲の広さ、高収率立体選択性、および簡単な生成物の単離(非クロマトグラフィー的な方法による不活性な副生成物の分離)が挙げられる。放射化学および放射性薬学において、クリックケミストリーは、選択的でモジュール式の構成要素を利用し、触媒なしで放射性標識された生物学的に関連のある化合物の化学選択的な連結を可能にする一連標識化反応の総称である。「クリック反応」は、銅を用いてもよく、または銅フリーのクリック反応であってもよい。

0038

用語「補欠分子族」または「二価性標識薬剤」は、ミラモレキュラーに結合させることのできる放射性核種(例えば、18F)を含む有機小分子をいう。

0039

本明細書で用いられる、一般的に「生物学的標的」と呼ばれる「標的」は、細胞、組織(例えば、癌または腫瘍)、病原性微生物(例えば、細菌、ウイルス真菌、植物、プリオン原生生物またはその一部)または組織の炎症、プラーク形成などの生物学的経路もしくは生物学的現象に関連する他の分子をいう。

0040

用語「標的リガンド」、「標的薬剤」または「標的分子」は、他の分子に結合する、ペプチド、ミラモレキュラーなどの分子を指すために互換的に用いられる。いくつかの実施態様において、標的薬剤は、特定の細胞、組織、病原体または生物学的経路に関連する分子を「標的」にするために、当該18F−補欠分子族に結合している。

0041

本明細書で互換的に用いられる用語「特異的に結合」、「特異的結合」、「選択的結合」、および「選択的に結合」は、これらに限定はされないが、スキャチャード解析および/または競合結合測定(例えば、競合ELISA、BIACOREアッセイ)などの当技術分野において利用可能な技術を用いて測定される、生物学的標的に対する親和性を発揮するが、他の分子に対する有意な結合を示さない(例えば、約10%未満の結合)ペプチドまたはポリペプチドをいう。

0042

本明細書で用いられる用語「IC50」は、インビトロまたはインビボアッセイのいずれかにおいて、最大の阻害反応の50%、すなわち最大の阻害反応および未反応の中間水準まで反応を阻害する、18F−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブの濃度をいう。

0043

本明細書で用いられる用語「結合した」は、2つ以上の分子の結合をいう。当該結合は、共有結合または非共有結合でありうる。

0044

用語「診断」または「検出」は、互換的に用いられうる。診断は、通常、組織の特定の組織学的状態を定義することをいう一方で、検出は、特定の検出可能な標的を含む組織、病変または生物を認識して見つけ出す。

0045

用語「検出可能」は、バックグラウンドシグナルに対して、シグナルを検出することができることをいう。本明細書でイメージング剤および診断の文脈において用いられる用語「検出可能なシグナル」は、これに限定はされないが、陽電子放出断層撮影(PET)などの非侵襲性のイメージング技術によって生じるシグナルである。この検出可能なシグナルは、検出可能であり、かつ対象から発生しうる他のバックグラウンドシグナルと区別できる。言い換えれば、検出可能シグナルとバックグラウンドの間に、測定可能および統計的に有意な違いが存在する(例えば、統計的に有意な違いは、検出可能なシグナルおよびバックグラウンドを区別するのに十分な違いであり、例えば検出可能なシグナルおよびバックグラウンドの違いが約0.1%、1%、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、または40%またはそれ以上である)。検量線および/または較正曲線が、検出可能なシグナルおよび/またはバックグラウンドの相対強度を決定するために用いられうる。

0046

本明細書に記載のイメージング剤を含む組成物の「検出可能な有効量」は、臨床的使用が可能な装置を用いて、許容可能な画像を得るのに十分な分量と定義される。本明細書で提供されるイメージング剤の検出可能な有効量は、1回以上の注射によって投与されうる。検出可能な有効量は、個体の感受性の程度、個体の年齢性別および体重、個体の特異体質反応などの因子によって変化しうる。イメージング組成物の検出可能な有効量はまた、用いられる機器および方法に従って変化しうる。このような因子の最適化は、十分に当分野の技術の範囲内である。

0047

本明細書においてイメージング剤に関連して用いられる「投与する」は、当業者にとって周知の様々な方法および送達ステムのいずれかを用いて、イメージング剤を含む組成物を対象に物理的に導入することをいう。本明細書に記載のイメージング剤の好ましい投与経路としては、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または、例えば注射もしくは点滴などによる他の非経口経路による投与が挙げられる。本明細書で用いられる用語「非経口投与」は、経腸および局所投与以外の、通常は注射による投与方法を意味し、例として、これらに限定はされないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、関節内、眼窩内心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下脊髄内硬膜外および胸骨内注射および点滴、並びにインビボエレクトロポーションが挙げられる。あるいは、本明細書に記載のイメージング剤は、局所上皮または粘膜経路による投与など、例えば鼻腔内、経口、内、直腸内、下または局所投与などの、非−非経口投与(non−parenteral)によって投与されうる。投与はまた、例えば、1回、複数回で、および/または1回以上の長期間にわたって実行されうる。

0048

本明細書で用いられる用語「併用投与」などは、選択された医薬品を1人の患者に投与すること含むことを意味し、当該薬剤が同じもしくは異なる投与経路によって、または同じもしくは異なる時点において投与されるレジメンを含むことが意図される。

0049

用語「患者」および「対象」は、本明細書に記載のイメージング剤を含む組成物を与えられるヒトまたは非ヒト動物のいずれかをいう。インビトロ診断および応用研究などのインビトロでの応用のために、前記の対象の血液、尿または組織サンプルなどの、体液および細胞サンプルは使用に適している。

0050

用語「試料」は、組織試料細胞試料液体試料などを表しうる。当該試料は対象から採取されうる。組織試料としては、髪(毛根を含む)、口腔粘膜検体、血液、唾液精液、筋肉、またはいずれかの内臓からの試料が挙げられる。液体試料は、これらに限定はされないが、尿、血液、腹水胸膜液髄液などでありうる。体内組織としては、これらに限定はされないが、皮膚、筋肉、子宮内膜子宮、および頸部組織が挙げられる。

0051

用語「同位体的に純粋な」とは、ある同位体が他の同位体に対してより多くの割合で含まれる成分、化合物または組成物を意味する。いくつかの実施態様において、当該成分、化合物、または組成物は約40%、50%、または60%を超えて同位体的に純粋である。

0052

本明細書で用いられるように、標的分子の画分を出発混合物と比較して濃縮するために、標的分子が部分的にまたは全体的に非標識分子から分離される場合に、標的分子が「精製」される。「精製」された標的分子は、標識および非標識分子の混合物を、これらに限定はされないが、約5:95;10:90;15:85;20:80;25:75;30:70;40:60;50:50;60:40;70:30;75:25;80:20;85:15;90:10;95:5;97:3;98:2;99:1または100:0などのほとんどいずれかの割合で有する混合物を含みうる。

0053

「OTf」基は、式CF3SO3またはトリフルオロメタンスルホン酸を有するトリフラートをいう。

0054

用語「ハロ」または、その代わりの「ハロゲン」もしくは「ハライド」は、フルオロクロロ、ブロモまたはヨードを意味する。

0055

本明細書全体にわたって、基およびその置換基は、安定な部位および化合物、並びに医薬的に許容され得る化合物として利用可能な化合物、並びに/または医薬的に許容され得る化合物の製造において利用可能な中間化合物を提供するように、当業者によって選択されうる。

0056

本明細書に記載の様々な局面は、下記のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。

0057

18F放射性標識補欠分子族
一態様において、本明細書は、以下の構造:




(式中、xは、1〜8の整数である)
を有するアジドに共有結合したPEG化18F−ピリジン、またはその医薬的に許容され得る塩を有する。いくつかの実施態様において、xは、2〜6の整数である。いくつかの実施態様において、xは、3〜5の整数である。いくつかの実施態様において、xは4である。関連する実施態様において、18Fは、ピリジンのN原子に対してオルト位に結合している。いくつかの実施態様において、[O(CH2)2]x基は、ピリジン環窒素に対して1〜3位に存在する。いくつかの実施態様において、[O(CH2)2]x基は、ピリジン環の窒素に対して1〜2位に存在する。他の実施態様において、[O(CH2)2]x基は、ピリジン環の窒素に対して1〜4位に存在する。

0058

いくつかの実施態様において、18F−放射性標識化合物は、以下の構造:




(式中、xは1〜8の整数である)
を有する化合物またはその医薬的に許容され得る塩である。いくつかの実施態様において、xは、2〜6の整数である。いくつかの実施態様において、xは、3〜5の整数である。いくつかの実施態様において、xは4である。いくつかの実施態様において、[O(CH2)2]x基は、ピリジン環の窒素に対して1〜3位に存在する。いくつかの実施態様において、[O(CH2)2]x基は、ピリジン環の窒素に対して1〜2位に存在する。別の実施態様において、[O(CH2)2]x基は、ピリジン環の窒素に対して1〜4位に存在する。

0059

いくつかの実施態様において、18F−放射性標識化合物は、以下の構造:




(式中、xは、1〜8の整数である)を有する化合物である。いくつかの実施態様において、xは、2〜6の整数である。いくつかの実施態様において、xは、3〜5の整数である。いくつかの実施態様において、xは4である。

0060

いくつかの実施態様において、18F−放射性標識化合物は、[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジン(18F−FPEGA)であり、下記構造を有する:




0061

別の実施態様において、18F−放射性標識補欠分子族は、フッ素化反応と干渉しないピリジン環に追加の基を含有し得る。ある実施態様において、ピリジン環への付加は、C1−6アルキル基、例えばメチルエチルおよびプロピルを含む。

0062

更に別の実施態様において、18F−放射性標識補欠分子族は、以下の構造:




(式中、「OPEG」は、[O(CH2)2]xであり、xは1〜8の整数である)
を有する縮合環系である。いくつかの実施態様において、xは、2〜6の整数である。いくつかの実施態様において、xは、3〜5の整数である。いくつかの実施態様において、xは4である。

0063

関連する態様において、本明細書は、以下の構造:




(式中、xは、1〜8の整数である)
を有するアジドに共有結合したPEG化18F−ピリジンの製造方法であり、該方法は、
(a)以下の構造:




(式中、xは、1〜8の整数であり、Rは、NO2、Br、Fまたは




であり、ピリジン環のN原子に対してオルト位である)
を含む化合物aの溶液を提供する工程;
(b)18F/18O水、4,7,13,16,21,24−ヘキサオキサ−1,10−ジアザビシクロ[8.8.8]ヘキサコサンおよび弱塩基の混合物を提供する工程;
(c)工程(b)の混合物を乾燥させて、固体を形成させる工程;および
(d)工程(a)の溶液を、工程(c)の固体と反応させて、18F−標識された化合物を形成させる工程、
を含んでいる。

0064

いくつかの実施態様において、該方法は、以下の構造b:




(式中、18Fは、N原子に対してオルト位である)
を有する18F−ピリジン補欠分子族を製造するものであり、該方法は、
(a)下記構造:




(式中、Xは、N原子に対してオルトであり、Xは、NO2、Brまたは



である)
の化合物の溶液を提供する工程;
(b)18F/18O水、4,7,13,16,21,24−ヘキサオキサ−1,10−ジアザビシクロ[8.8.8]ヘキサコサンおよび弱塩基(例えば、K2CO3)の混合物を提供する工程;
(c)工程(b)の混合物を乾燥させて、固体を形成させる工程;および
(d)工程(a)の溶液を工程(c)の固体と反応させて、18F−標識された化合物を形成させる工程、を含んでいる。

0065

いくつかの実施態様において、該方法は、以下に示されるスキームIに従って、
以下の構造a:




を有する化合物を製造する工程をさらに含む。

0066

いくつかの実施態様において、該方法は、以下の反応条件に従って、dからe、



即ち、18F−ピリジン補欠分子族[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジン(18F−FPPEGA)を製造することを含む。

0067

製剤
医薬的に許容され得る担体と共に製剤化される、本明細書に記載の18F−標識標的薬剤のうちの1つ、またはそれらの組み合わせを含む、組成物、例えば医薬組成物がさらに示される。このような組成物は、本明細書に記載の薬剤のうちの1つ、またはそれらの組み合わせ(例えば、2つまたはそれ以上)を含みうる。例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、18F−標識標的薬剤および薬剤の組み合わせを含みうる。

0068

本明細書で用いられる「医薬的に許容され得る担体」は、溶媒分散媒コーティング、抗細菌および抗真菌剤等張化剤および吸収遅延剤など、生理学的に適合性のあるもののいずれかおよび全てを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与(例えば、注射または点滴による)に適切である。投与経路に従って、18F−標識標的薬剤は、当該化合物を酸および、当該化合物を不活性化しうる他の自然条件の作用から保護する物質によってコーティングされうる。

0069

本明細書に記載の医薬的に許容され得る化合物は、1つ以上の医薬的に許容され得る塩を含みうる。「医薬的に許容され得る塩」は、元の化合物の望ましい生物学的活性を保持し、いずれの望ましくない毒性効果も与えない塩をいう(例えば、Berge,S.M.,et al.(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19を参照されたい)。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸硝酸リン酸硫酸臭化水素酸ヨウ化水素酸亜リン酸などの非毒性無機酸に由来するもの、並びに脂肪族モノ−およびジカルボン酸フェニル置換アルカン酸ヒドロキシアルカン酸芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウムカリウムマグネシウムカルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、並びにN,N'−ジベンジルエチレンジアミンN−メチルグルカミン、クロロプロカインコリンジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。

0070

本明細書に記載の医薬組成物はまた、医薬的に許容され得る抗酸化剤を含みうる。医薬的に許容され得る抗酸化剤の例としては、以下が挙げられる:(1)アスコルビン酸システイン塩酸、硫酸水素ナトリウムピロ亜硫酸ナトリウム硫酸ナトリウムなどの、水溶性の抗酸化剤;(2)パルミチン酸アスコルビルブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン没食子酸プロピルアルファトコフェロールなどの、脂溶性の抗酸化剤;および(3)クエン酸エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール酒石酸、リン酸などの、金属キレート剤

0071

本明細書に記載の医薬組成物に用いられうる適切な水性および非水性の担体の例としては、水、エタノールポリオール(グリセロールプロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、並びにオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レチシンなどのコーティング物質を用いることによって、分散の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、維持されうる。

0072

これらの組成物はまた、防腐剤湿潤剤乳化剤および分散剤などのアジュバンドを含みうる。微生物生存を防ぐことは、前記の滅菌処置、並びに、例えばパラベンクロロブタノールソルビン酸フェノールなどの様々な抗細菌および抗真菌剤を含有することの両方によって確保されうる。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが望ましい。さらに、注入可能な剤形の吸収遅延は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含有することによってもたらされうる。

0073

医薬的に許容され得る担体としては、無菌水溶液または分散液、および注入可能な無菌溶液または分散液を即時調製するための無菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような溶媒および薬剤の使用は、当技術分野において既知である。通常の溶媒または薬剤のいずれかが、当該活性化合物に対して不適合である場合を除いて、本明細書に記載の医薬組成物中のこれらを使用することが考慮される。さらなる活性化合物もまた、当該組成物に含まれうる。

0074

医薬組成物は、一般に製造および保管状態において、無菌および安定でなければならない。当該組成物は、溶液、マイクロエマルジョンリポソーム、または、高い薬剤濃度に適切な他の秩序構造として製剤化されうる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることによって、分散液の場合は必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持されうる。多くの場合において、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含むことが好ましい。注入可能な組成物の吸収遅延は、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物中に含有することによってもたらされうる。

0075

注入可能な無菌溶液は、必要な分量の18F−標識標的薬剤を適切な溶媒中に、必要に応じて前記で列挙される成分のうちの1つまたはそれらの組み合わせと共に加え、精密濾過によって滅菌を行うことによって製造されうる。一般に、分散液は、活性化合物を標準的な分散媒および前記に列挙される他の必要な成分を含む無菌溶媒中に加えることによって製造される。注入可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合は、好ましい製造方法は真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)であり、活性成分に加えて、あらかじめ濾過された無菌溶液中のさらに必要ないずれかの成分を含む粉末が得られる。

0076

単一剤形を生成するために担体物質と組み合わせられうる18F−標識標的薬剤の分量は、治療される対象および特定の投与方法に応じて変化する。単一剤形を生成するために担体物質と組み合わせられうる18F−標識標的薬剤の分量は、一般に検出可能な効果が得られる当該組成物の分量である。一般に、百分率で、この分量は医薬的に許容され得る担体との組み合わせにおいて、約0.01パーセントから約99パーセントの活性成分、好ましくは約0.1パーセントから約70パーセント、最も好ましくは約1パーセントから約30パーセントの活性成分に及ぶ。

0077

投与およびイメージング
本明細書に記載の18F−標識標的薬剤は、様々なインビボイメージングの応用(例えば、組織または全身のイメージング)において有用である。いくつかの実施態様において、18F−標識標的薬剤は、例えば標的発現性腫瘍などの標的に陽性である細胞または組織をイメージングするために用いられうる。例えば、標識された18F−標識標的薬剤は、対象の組織に18F−標識標的薬剤が取り込まれるのに十分な分量で、対象に投与される。対象は、次いで、PETなどのイメージングシステムを用いて、18F放射性核種に必要な時間にわたってイメージングされる。標的物質を発現している細胞または組織に結合した18F−標識標的薬剤が、その後イメージングシステムによって検出される。

0078

一般に、イメージングのために、単一の静脈内注入として約1mgから200mgの範囲のミラモレキュラーの用量を患者に投与することが望ましいが、低容量または高容量もまた状況に応じて投与されうる。一般に、典型的な成人に対して、体表面積平方メートルあたり約1mgから10mgのタンパク質またはペプチドの範囲の用量を患者に投与することが望ましいが、低容量または高容量もまた状況に応じて投与されうる。イメージングの目的のためにヒトの対象に投与されうるタンパク質またはペプチドの用量の例としては、約1から200mg、約1から70mg、約1から20mg、約1から10mgが挙げられるが、高容量または低容量もまた用いられうる。

0079

いくつかの実施態様において、18F−放射性標識−ミラモレキュラーの分量は、1日に約0.005μg/体重kgから約50μg/体重kgの間、通常は0.02μg/体重kgから約3μg/体重kgの間で投与される。PETトレーサーに関連する質量は、自然同位体の形態、すなわち18F PETトレーサーにおいて19Fのものである。本発明の組成物の特定の分析用量としては、約0.5μgから約100μgの18F−放射性標識ミラモレキュラーが挙げられる。用量は、通常は約1μgから約50μgの18F−放射性標識ミラモレキュラーである。

0080

用量レジメンは、18F−標識標的薬剤を取り込む組織または細胞の鮮明なイメージを得るために最適化された検出可能な分量を提供するように調整される。特に有利であるのは、投与の簡便性および用量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形として製剤化することである。本明細書で用いられる単位剤形は、18F−標識標的薬剤が投与される対象に対して均一な用量として適合された、物理的に個別の単位をいう。本明細書に記載の単位剤形のための仕様(specification)は、以下によって決定および直接影響される:(a)18F−標識標的薬剤の標的部位固有の特性;(b)標的とされる組織または細胞;(c)用いられるイメージング技術固有の制約

0081

18F−標識標的薬剤の投与のために用いられる用量は、疾患の種類、用いられる標的化合物、対象の年齢、健康状態および性別、疾患の程度、診察される部位などによって変化する。特に、対象の照射線量についての十分な配慮を行わなければならない。好ましくは、18−Fの飽和用量が患者に投与される。例えば、18F−標識標的薬剤の放射線量は通常、3.7メガベクレルから3.7ギガベクレル、好ましくは、18メガベクレルから740メガベクレルに及ぶ。あるいは、用量は、例えばミリキュリーによって測定されうる。いくつかの実施態様において、イメージング実験のために投与される18Fイメージング剤の分量は、5から10mCiである。別の実施態様において、有効量は約1〜5mCiの範囲の放射を生じるのに十分な化合物の分量である。

0082

本明細書に記載の医薬組成物における活性成分の実際の用量段階は、特定の患者の細胞または組織、組成物、および投与方法において、患者に毒性がなく、18F−標識標的薬剤の望ましい取り込みが生じるのに有効な活性成分の分量を得るために変化しうる。しかし、当然のことながら、本開示の18F−標識標的薬剤の1日の総用量は、健全な医学的判断の範囲で、主治医または他の担当専門家によって決定される。いずれかの特定の対象に固有の有効な用量段階は、例えば、用いられる特定の組成物の活性;用いられる特定の組成物;患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食生活;投与時間;投与経路;用いられる特定の化合物の排出率;治療の継続時間;用いられる特定の組成物との組み合わせにおいて使用される別の薬剤、化合物および/または物質、治療患者の年齢、性別、体重、病状、全体的な健康状態、および以前の病歴、並びに医療分野において周知の因子などの、様々な因子によって変化する。いくつかの実施態様において、ヒトの対象に投与されるイメージングに必要な18F−放射性標識プローブの分量は、処方医によって決定され、一般に当該用量は18F−放射性核種からの放射量に従って変化する。

0083

本明細書に記載の組成物は、当技術分野において周知の様々な方法の1つ以上を用いて、1つ以上の投与経路によって投与されうる。当業者によって理解されるように、投与経路および/または方法は、求められる結果に従って変化する。本明細書に記載の18F−標識標的薬剤の好ましい投与経路としては、例えば注射もしくは点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与が挙げられる。本明細書で用いられる用語「非経口投与」は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、例として、これらに限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴が挙げられる。いくつかの実施態様において、18F−放射性標識標的化合物は静脈内投与される。

0084

あるいは、本明細書に記載の18F−標識標的薬剤は、局所、上皮または粘膜、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下または局所などの投与経路によって非−非経口(non−parenteral)投与されうる。

0085

いくつかの実施態様において、本明細書に記載の18F−標識標的薬剤は、インビボで適切に分布されるように製剤化されうる。例えば、血液脳関門(BBB)は、多くの高親水性化合物を排除する。薬剤は、例えばリポソーム内に製剤化されることによってBBBを通過しうる。リポソームを製剤化する方法としては、例えば、米国特許第4,522,811号;5,374,548号;および5,399,331号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送される1つ以上の部位を含み得、そのため薬剤の標的送達を向上させうる(例えば、V. V. Ranade(1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい)。標的部位の例としては、葉酸またはビオチン(例えば、米国特許第5,416,016号、Low et al.を参照されたい);マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗体(P. G. Bloeman et al. (1995) FEBSLett. 357:140;M .Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180);サーファクタントタンパク質受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134);p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)が挙げられ、K. Keinanen;M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123;J. J. Killion;I. J. Fidler (1994) もまた参照されたい。

0086

以下の実施手順は、診療所において、PETイメージングを用いて患者を診察する際に用いられうる。患者は、実施日しばらく前に、非標識ミラモレキュラーを前投与され、少なくとも12時間は絶食とするが、水の自由摂取は認められる。放射性トレーサーの投与を血液内に集中させるため、20G2−インチ静脈カテーテルが対側尺骨静脈に挿入される。

0087

患者はPETカメラに配置され、18F−放射性標識ミラモレキュラー(<20mCi)のPETトレーサーのトレーサー量が静脈カテーテルを通して投与される。未代謝のPETトレーサーである血漿中の[18F]実施例2化合物の割合を解析および定量するために、動脈または静脈血液試料のいずれかが、PETスキャンの間の適切な時間間隔において採取される。画像は最大で120分にわたって得られる。放射性トレーサーの注射の10分以内およびイメージング時間の終わりに、PETトレーサーの前に投与され得た非標識ミラモレキュラーの血漿濃度を決定するため、1mLの血液試料が採取される。

0088

画像再構成から断層画像が得られる。放射性トレーサーの分布を決定するため、関心領域(ROI)が、これらに限定はされないが、肝臓心臓腎臓、皮膚または他の臓器または組織などが、再構成画像上に描かれる。これらの領域における放射性トレーサーの経時的な取り込みは、試験される様々な投与パラダイムにおいて、あらゆる治療介入の非存在下、または非標識ミラモレキュラーの存在化で得られる時間放射能曲線(TAC)を作成するために用いられる。データは、単位容量あたりの単位時間あたりの放射能(μCi/cc/注入用量のmCi)として表される。TACデータは当技術分野において周知の様々な方法によって処理され、非占有標的陽性組織の密度に比例する結合能(BP)または体積分布(VT)などの定量パラメーターが得られる。

0089

キットおよび製造品
本明細書に記載の18F−放射性標識標的組成物の生成のためのキットおよび使用のための説明書もまた示される。キットには、一般に、所定量の試薬と説明書のパッケージ化された組み合わせおよびキットの内容物の意図される用途を表すラベルが含まれる。用語ラベルには、キットに組み込まれたまたはキットに含まれる、またはそうでなければ、キットに付随する、あらゆる文書または記録されたものが含まれる。

0090

例えば、いくつかの実施態様において、キットは補欠分子族が18Fによって当該部位でフッ素化され、次いで投与前に放射性標識補欠分子族がBFC−結合標的分子(例えば、タンパク質またはペプチド)に結合する条件において必要な試薬を含む。

0091

いくつかの実施態様において、キットは、18F標識抗PD−L1ミラモレキュラーであるインビボのイメージング剤、例えば本明細書においてさらに記述される剤を形成するのに必要な1つ以上の試薬を含む。例えば、キットは、抗PD−L1ミラモレキュラーを含む第一のバイアル、および[18F]FPPEGAを含む第二のバイアルを含みうる。キットは、抗PD−L1ミラモレキュラーを含む第一バイアル、4−PEG−トシル−アジドを含む第二バイアル、およびO18水中の18Fを含む第三バイアルを含みうる。キットはさらに、バイアル、溶液および適宜PD−L1ミラモレキュラー−PEG4−DBCO−18Fの生成に必要な追加の試薬を含みうる。

0092

いくつかの実施態様において、キットはさらに、少なくとも1つの追加の試薬(例えば、医薬的に許容され得る担体)を含みうる。いくつかの実施態様において、当該キットは、本明細書において開示される方法に従って標識プローブを生成するために用いられる反応前駆体を含む。キットの成分は、本明細書に記載されるような、モニターされる特定の生物学的条件に合わせて調整されうる。宿主細胞または宿主生物に、前記で列挙される成分の様々な組み合わせを投与するために、キットはさらに当技術分野において周知の適切な緩衝液および試薬を含みうる。イメージング剤および担体は、溶液または凍結乾燥された形態で提供されうる。キットのイメージング剤および担体が凍結乾燥された形態である場合、キットは、適宜、水、生理食塩水緩衝生理食塩水などの、無菌および生理学的に許容可能な再構成溶媒を含んでもよい。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたは樹脂などの様々な物質から形成されうる。さらに、商業上および利用者の観点から望ましい他の物質、例えば、他の緩衝剤希釈剤フィルター、針、シリンジおよび使用説明書に付随する添付文書もまた挙げられる。

0093

使用
18F−標識標的薬剤を用いたイメージング方法が本明細書において示される。18F−放射性標識ミラモレキュラーベースのPETプローブなどの陽電子放出断層撮影(PET)トレーサーは、インビトロおよびインビボでの画像診査および診断の画像応用において使用するための、現在利用可能なPET技術と共に用いられうる。PETスキャンによる18Fイメージングのためのイメージング技術および装置は、当技術分野において周知であり(例えば、米国特許第6,358,489号;6,953,567号;Page et al., Nuclear Medicine and Biology, 21:911-919, 1994;Choi et al., Cancer Research 55:5323-5329, 1995;Zalutsky et al., J. Nuclear Med., 33:575-582,1992を参照されたい)、このような周知のPETイメージング技術または装置のいずれかが用いられうる。

0094

本明細書に示されるイメージング方法のインビボでの応用としては、疾患の診断、疾患の進行のモニター、予後、対象の治療への応答の可能性の決定、治療への適格性の決定、治療への臨床的応答のモニター、治療化合物の臨床的評価および用量選択、動物モデルにおける潜在的な候補薬剤の前臨床試験、並びに、組織および臓器における標的分子の局所分布および濃度の観測が挙げられる。インビトロでの応用としては、細胞アッセイ(例えば、競合アッセイ親和性アッセイなど)における候補薬剤のスクリーニングが挙げられる。

0095

いくつかの実施態様において、18F−標識標的薬剤は、候補治療化合物による組織占有度と患者の臨床効果の関係を決定するため;長期間の臨床試験開始前に、候補薬剤の臨床試験のための用量選択を決定するため;および、異なる候補薬剤の有効性を比較するために用いられうる。

0096

いくつかの実施態様において、18F−放射性標識標的化合物は、正常または疾患組織および/または臓器(例えば、肺、心臓、腎臓、肝臓および皮膚)のインビボイメージングのための方法において用いられる。例えば、18F−放射性標識標的化合物は、対象の細胞または組織に18F−放射性標識標的化合物の取り込みが生じるのに有効な分量において、対象に投与される。対象は、次いで、適切なイメージングシステム(例えば、PETシステム)を、18F−放射性標識標的化合物を検出できる十分な時間にわたって受ける。18F−放射性標識標的化合物から検出されたシグナルの位置は、所定の細胞または組織の位置と相関しうる。いくつかの実施態様において、当該位置の範囲もまた決定されうる。インビボのイメージングは本明細書において記述される。以下もまた参照されたい:米国特許第6,126,916号;6,077,499号;6,010,680号;5,776,095号;5,776,094号;5,776,093号;5,772,981号;5,753,206号;5,746,996号;5,697,902号;5,328,679号;5,128,119号;5,101,827号;および4,735,210号、それぞれは引用により本明細書に援用される。

0097

そのため、いくつかの局面において、18F−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブの画像を得る方法が示され、対象に18F−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブを投与する工程、およびPETによる18F−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブのインビボでの分布をイメージングする工程を含む方法が示される。

0098

いくつかの実施態様において、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌネコ類人猿サルラットまたはマウスである。

0099

いくつかの局面において、対象における疾患の存在を診断する方法であって、疾患の存在に関係する標的分子に結合する、18F−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブを、それを必要とする対象に投与する工程、および18F−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブの存在または非存在を検出するために、対象の少なくとも1部分の放射線画像を得る工程を含む方法が示される。

0100

いくつかの実施態様において、疾患は、固形癌、造血癌、血液癌、自己免疫性疾患、神経変性疾患、心血管疾患または病原性感染である。

0101

18F−放射性標識標的化合物を用いたPETイメージングは、標的化合物を定性的または定量的に検出するために用いられうる。18F−放射性標識標的化合物イメージング剤は、バイオマーカーとして用いられ得、対象の陽性シグナルの存在もしくは非存在は、例えば、対象が癌治療などの所定の治療に対して応答すること、または対象が治療に応答するかどうかを示しうる。

0102

いくつかの実施態様において、当該方法のステップは、疾患の位置および/または大きさが、時間および/または治療に応じてモニターされうるように、所定の間隔において繰り返されうる。いくつかの実施態様において、18F−放射性標識標的化合物は、治療(例えば、化学療法など)を受けている対象の、治療に対する応答を可視化することを補助するために用いられうる。例えば、患者の疾患の進行または退縮をモニターするために、18F−放射性標識標的化合物は、一般に、治療前および治療中に、定期的に(例えば、毎日毎週、毎月、それらの間の間隔、など)、可視化および測定される。

0103

そのため、いくつかの実施態様において、それを必要とする対象における疾患の進行をモニターする方法であって、疾患の存在に関係する標的分子に結合する18F−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブを、最初の時点において対象に投与し、そして疾患細胞または組織の分量を決定するために、対象の少なくとも1部分の画像を得る工程、および18F−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブをその後の1回以上の時点において、対象に投与し、そしてその後の各時点において、対象の少なくとも1部分(例えば、最初の時点と同じ部分)の画像を得る工程を含む方法が示される。

0104

いくつかの実施態様において、癌治療(例えば、化学療法、放射線療法)を受けている対象において、腫瘍の大きさがモニターされ得、腫瘍の退縮度合いが、18F−放射性標識腫瘍標的の検出に基づいてリアルタイムでモニターされうる。

0105

いくつかの実施態様において、本明細書の方法は、治療に対する患者の応答を評価するために用いられる。いくつかの実施態様において、当該方法は、治療化合物の用量を選択または修正するために用いられる。いくつかの実施態様において、当該方法は、毒性または患者ごとの差異分析するために、正常組織における18F−放射性標識標的化合物の取り込みをモニターするために用いられる。いくつかの実施態様において、当該方法は、薬効をモニターするため、または薬剤耐性を検出するために用いられる。

0106

いくつかの実施態様において、放射性標識化合物は、標準的な薬務に従って、単体でまたは医薬的に許容され得る担体または希釈剤との組み合わせのいずれかの医薬組成物において、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。このような組成物は、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、直腸および局所投与経路などの、経口または非経口投与されうる。いくつかの実施態様において、投与は静脈内投与である。いくつかの実施態様において、当該放射性標識化合物は、合成から1時間未満の間に静脈内注射される。

0107

いくつかの実施態様において、18F−放射性標識標的薬剤のインビボでの生物学的活性は、臓器特異的な取り込みに関して、生体内分布観測、および適切な動物モデルにおける小動物PET動的イメージングによって測定されうる。例えば、生体内分布観測のために、動物群は、18F−放射性標識標的薬剤を注射され、その小集団を1回以上の時間間隔(例えば、5分、10分、30分、60分、2時間)において犠死させる。対象の臓器および組織は、迅速に切除および重量測定され、放射能が決定される。臓器および選択された組織において蓄積された放射能は、注入量の割合(%ID)として算出される。

0108

いくつかの実施態様において、本明細書において示される18F−放射性標識標的薬剤は、治療組織または細胞において用いるための化合物を選択するスクリーニング手段としてインビトロで用いられる。例えば、いくつかの実施態様において、疾患細胞は、1つ以上の候補薬剤に晒露される間またはその後に、18F−放射性標識標的化合物と共に培養される。候補薬剤が疾患に作用する能力は、18F−放射性標識標的化合物を用いて経時的にイメージングされうる。

0109

例えば、インビトロでの18F−放射性標識標的薬剤の生物学的活性の統合性は、選択された標的分子への特異的結合および放射性標識組成物の取り込みに関して、標的分子を発現している細胞株において評価される。結合および細胞結合アッセイのために、細胞は4℃または37℃において、適切な時間にわたり、18F−放射性標識標的組成物と共に培養される。過剰の非標識標的薬剤を加えることによって、非特異的結合が観測される。特異的結合の程度は、全結合から非特異的結合を差し引くことによって算出される。取り込みは、タンパク質のマイクログラムあたりの、細胞へ添加された標的薬剤の総用量の割合(%ID/μg細胞タンパク質)として表される。

0110

関連する局面において、本発明は18F−放射性標識ミラモレキュラーベースのプローブ、および医薬的に許容され得る担体を含む、インビボまたはインビトロのための診断または放射性医薬組成物を提供する。

0111

引用による援用
特許文献およびウェブサイトなどの、本明細書に記載の全ての文書および参考文献は、本明細書において全体または一部が記載された場合と同じ程度に、引用により個別に本明細書に援用される。

0112

本発明は、以下の実施例を参照することによって説明されるが、実施例は例証するのみであり、本発明を限定するものではない。本発明は詳細に、およびそれらの特定の実施態様に関連して記述されているが、様々な変化および変更が、それらの趣旨および範囲から逸脱することなくなされうることが当業者には明らかであろう。

0113

分析条件A:
カラム:Waters BEH C18,2.0x50mm,1.7μm粒子移動相A:5:95アセトニトリル:水(10mM酢酸アンモニウムを含む);移動相B:95:5 アセトニトリル:水(10mM 酢酸アンモニウムを含む);温度:50℃;グラジエント:0%B,3分かけて0〜100%B,次いで100%Bで0.5分間保持;流量:1mL/min;検出:220nmのUV.

0114

分析条件B:
カラム:Waters BEH C18,2.0x50mm,1.7μm粒子;移動相A:5:95メタノール:水(10mM酢酸アンモニウムを含む);移動相B:95:5メタノール:水(10mM 酢酸アンモニウムを含む);温度:50℃;グラジエント:0%B,3分かけて0〜100%B,次いで100%Bで0.5分間保持;流量:0.5mL/min;検出:220nmのUV.

0115

シングルカップリング法:
先の工程からの樹脂を含む反応容器に、ピペリジンDMF(20:80v/v、5.0mL)を添加した。混合物を、3または5分間周期的に撹拌し、溶液をフリットから排出した。反応容器にピペリジン:DMF(20:80v/v、5.0mL)を添加した。混合物を3または5分周期的撹拌し、溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり5回連続的に洗浄した。各洗浄時、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を60秒周期的撹拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器にアミノ酸(DMF中0.2M、5.0mL、10当量)、次いでHATUまたはHCTU(DMF中0.2M、5.0mL、10当量)および最後にNMM(DMF中0.8M、2.5mL、20当量)を添加した。混合物を60分周期的撹拌し、次いで反応溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり連続的に4回洗浄した。各洗浄時、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を30秒周期的撹拌し、その後溶液をフリットから排出した。反応容器に酢酸無水物:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v、5.0mL)の溶液を添加した。混合物を10分周期的撹拌し、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり連続的に4回洗浄した。各洗浄時、DMF(4.0mL)を容器の上部から添加し、得られた混合物を90秒周期的撹拌し、その後溶液をフリットから排出した。得られた樹脂を直接次工程で使用した。

0116

ダブルカップカップリング法:
先の工程からの樹脂を含む反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80v/v、5.0mL)の溶液を添加した。混合物を3分周期的撹拌し、溶液をフリットから排出した。反応容器に、ピペリジン:DMF(20:80v/v、5.0mL)の溶液を添加した。混合物を3分周期的撹拌し、溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり連続的に3回洗浄した。DMF(7mL)を上部から洗い出し、その後DMF(7mL)を下部から洗い出し、最後にDMF(7mL)を上部から洗い出した。反応容器にアミノ酸(DMF中0.2M, 2.5mL、5当量)、HATU(DMF中0.5M、1.0mL、5当量)およびDIPEA(NMP中2M、0.5mL、10当量)を添加した。混合物を50℃でカップリングするFmoc−Cys(Trt)−OHおよびFmoc−His(Trt)−OH以外の全アミノ酸について、5分間、75℃でN2バブリングにより混合し、反応溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり連続的に3回洗浄した:DMF(7mL)を上部から洗い出し、その後DMF(7mL)を下部から洗い出し、最後にDMF(7mL)を上部から洗い出した。反応容器にアミノ酸(DMF中0.2M、2.5mL、5当量)、HATU(DMF中0.5M、1.0mL、5当量)およびDIPEA(NMP中2M、0.5mL、10当量)を添加した。混合物を、50℃でカップリングするFmoc−Cys(Trt)−OHおよびFmoc−His(Trt)−OH以外の全アミノ酸について、5分間、75℃でN2バブリングにより混合し、反応溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり連続的に3回洗浄した:DMF(7mL)を上部から洗い出し、その後DMF(7mL)を下部から洗い出し、最後にDMF(7mL)を上部から洗い出した。反応容器に酢酸無水物:DIEA:DMF(10:1:89v/v/v、5.0mL)の溶液を添加した。混合物を、2分間、65℃で周期的にバブリングし、次いで溶液をフリットから排出した。樹脂を次のとおり連続的に3回洗浄した。DMF(7mL)を上部から洗い出し、その後DMF(7mL)を下部から洗い出し、最後にDMF(7mL)を上部から洗い出した。得られた樹脂を、直接次工程で使用した。

0117

以下のペプチドを、1mmolで合成した。下線を引いた工程はダブルカップリング法を用いて、斜体の基は、30分間のシングルカップリング法を用いてカップリングした。

;ここで、(S)プロパルギルグリシンを、2−クロロトリチル樹脂上に組み込んだ。上記方法に従って脱保護および環化後、化合物を、下記の通りに精製した:粗生成物を、プレパラティブLC/MSにより、以下の条件を用いて精製した:カラム:XBridge C18,19x200mm,5μm粒子;移動相A:5:95メタノール:水(10mM酢酸アンモニウムを含む);移動相B:95:5メタノール:水(10mM 酢酸アンモニウムを含む);グラジエント:30分かけて45〜85%B、次いで100%Bで5分間保持;流量:20mL/min。目的の生成物を含有する画分を合わせて、遠心エバポレーターにより乾燥させた。生成物の収量は16.4mgであり、LCMS分析によるその算出純度は96%であった。分析条件A:保持時間=1.49min;ESI−MS(+)m/z992.3(M+2H),最も多いイオン。分析条件B:保持時間=3.02min;ESI−MS(+)m/z992.3(M+2H),最も多いイオン;ESI−HRMS(+)m/z:計算値:991.9953(M+2H).実測値:991.9926(M+2H).

0118

[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジンの合成

0119

実施例1:2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル4−メチルベンゼンスルホネートの製造




((オキシビス(エタン−2,1−ジイル)ビス(オキシ))ビス(エタン−2,1−ジイル)ビス(4−メチルベンゼンスルホネート)(5g,9.95mmol)およびアジ化ナトリウム(0.647g,9.95mmol)の混合物を、エタノール(50mL)に溶解して、反応溶液を、17時間かけて90℃で還流した。溶媒を、部分真空を用いて除去して、次いで40gramシリカカートリッジでロードして、フラッシュクロマトグラフィー(IscoCombiFlash、10%酢酸エチルヘキサンから開始して45分間かけて90%酢酸エチル/ヘキサンまでの、直線グラジエント方法を用いて溶出した)。集めた画分を、TLCにより確認して、これを合わせて、2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル 4−メチルベンゼンスルホネートを無色油状物として得た。2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル 4−メチルベンゼンスルホネート生成物の反応特性から、この物質をいずれの更なる特性分析も行なわず「そのまま」使用した。

0120

実施例2:3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジンの製造




水素化ナトリウム(0.129g,3.21mmol)/DMF(10mL)の懸濁液に、0℃で、2−フルオロピリジン−3−オール(0.363g,3.21mmol)/DMF(5mL)の攪拌溶液、次いで2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル4−メチルベンゼンスルホネート(1.00g,2.68mmol)/DMF(5mL)の溶液を滴加した。懸濁液を、0℃で10分間保持して、次いで1時間周囲温度として、60℃で4時間更に加熱した。溶媒を、真空除去した。酢酸エチル(100mL)を加えて、その後濃縮ブライン溶液を用いた3つの別個の洗浄抽出液を加えた。有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過して、濃縮した。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(IscoCombiFlash−10〜50%EtOAc/Hexで溶出した)を用いて精製して、無色油状物を得た。3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジン(702mg,2.233mmol,83%収率)を、透明な油として単離した。1H NMR(400MHz,クロロホルム−d) δ 7.75(dt,J=4.9,1.6Hz,1H),7.33(ddd,J=10.0,8.1,1.5Hz,1H),7.10(ddd,J=7.9,4.9,0.7Hz,1H),4.30−4.16(m,2H),3.95−3.83(m,2H),3.80−3.61(m,10H),3.38(t,J=5.1Hz,2H) 13C NMR(101MHz,クロロホルム−d)d 142.3,137.7,137.5,123.4,123.4,121.7,121.6,77.3,76.7,70.9,70.7,70.6,70.0,69.4,69.0,50.6.19F NMR(400MHz,クロロホルム−d)δ−83.55.HRMS(ESI)理論値:C13H20FN4O4+ m/z 315.464;実測値315.1463.

0121

実施例3:3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−ニトロピリジンの製造




水素化ナトリウム(0.121g,3.01mmol)(60%油中懸濁液)を、DMF(7.0mL)に溶解して、得られる懸濁液を0℃に冷却した。2−ニトロピリジン−3−オール(0.384g,2.74mmol)/DMF(1.5mL)の溶液を、ゆっくと加えて、次いで2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル4−メチルベンゼンスルホネート(1.023g,2.74mmol)/DMF(1.5mL)を滴加した。懸濁液を、0℃で10分間保持して、次いで2時間周囲温度まで昇温させて、次いで60℃で72時間加熱した。この反応溶液を、DI水(10mL)でクエンチして、次いで酢酸エチル(3x10mL)で抽出した。集めたEtOAc抽出液を、濃縮ブライン溶液(10mL)で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥して、濾過して、減圧下でエバポレートして、淡黄色油状物を得た。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィーで精製した。シリカカートリッジ(24g)を、25mL/minにて、10%酢酸エチル/ヘキサンを用いて開始して、その後25分かけて50%酢酸エチル/ヘキサンへと直線的に変化させる。この後に、グラジエントを、この溶媒組成で10分間保持して、次いで10分かけて100%酢酸エチルへと変えた。3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−ニトロピリジンを、30〜40分のクロマトグラム部分を溶出し、集めた画分を減圧下でエバポレートして、次いで真空下で2時間エバポレートして、3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−ニトロピリジン(687mg,1.973mmol,72.0%収率)を淡黄色油状物として得た。1HNMR(400MHz,クロロホルム−d) δ 8.11(dt,J=4.9,1.6Hz,1H),7.60(ddd,J=10.0,8.1,1.5Hz,1H),7.52(ddd,J=7.9,4.9,0.7Hz,1H),4.30−4.16(m,2H),3.95−3.83(m,2H),3.80−3.61(m,10H),3.38(t,J=5.1Hz,2H).13CNMR(101MHz,クロロホルム−d) d 147.3,139.5,128.4,124.4.71.1,70.7,70.6,70.0,69.9,69.3,50.7.
HRMS(ESI)理論値:C13H20N5O6+ m/z 342.1408;実測値:342.1409.

0122

実施例4:3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−ブロモピリジンの合成




水素化ナトリウム(NaH,25.7mg,0.643mmol)/ジメチルホルムアミド(DMF,5mL)の懸濁液に、0℃で、2−ブロモピリジン−3−オール(112mg,0.643mmol)/DMF(1mL)、次いで2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル4−メチルベンゼンスルホネート(200mg,0.536mmol)/DMF(1mL)の溶液を滴加した。この懸濁液を、0℃で10分間保持して、次いで周囲温度まで昇温させて、1時間保持して、次いで60℃に4時間加熱した。加熱完了時に、粗製反応混合物の溶媒を真空除去した。粗反応物を、酢酸エチル(50mL)に溶かして、ブライン水溶液(2x50mL)で洗い、有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥させて、濾過して、真空濃縮した。粗生反応物を、逆相HPLCを用いて精製して、3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−ブロモピリジン,TFA(112mg,0.229mmol,42.7%収率)を、淡黄色油状物として得た。HRMSESIm/z(M+H),理論値:C13H20BrN4O4 375.0664,実測値:375.0662;1HNMR(400MHz,DMSO−d6) δ 7.97(dd,J=4.6,1.5Hz,1H),7.54(dd,J=8.2,1.6Hz,1H),7.40(dd,J=8.1,4.6Hz,1H),4.24(dd,J=5.3,3.9Hz,2H),3.85−3.78(m,2H),3.68−3.62(m,2H),3.62−3.52(m,8H),3.42−3.34(m,2H).

0123

トリメチルアニリウム化合物の合成

0124

実施例5:3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−N,N−ジメチルピリジン−2−アミンの合成




ジメチルスルホキシド(DMSO,2.5mL)中の3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジン(160mg,0.509mmol)、炭酸カリウム(K2CO3,84mg,0.611mmol)およびジメチルアミン(水中で40%, 0.097mL,0.764mmol)の混合物を、110℃で14時間、密閉耐圧バイアル内で加熱した。加熱完了時に、粗製反応混合物の溶媒を、真空除去した。粗製反応物を、酢酸エチル(50mL)に溶かして、ブライン水溶液(2x50mL)で洗い、有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥して、濾過して、真空濃縮した。粗製反応物を、順相クロマトグラフィーを用いて精製して、3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−N,N−ジメチルピリジン−2−アミン(140mg,0.413mmol,81%収率)を、無色油状物として得た。1H NMR(400MHz,クロロホルム−d) δ 7.86(dd,J=4.9,1.5Hz,1H),7.02(dd,J=7.8,1.5Hz,1H),6.73(dd,J=7.8,4.9Hz,1H),4.20−4.07(m,2H),3.98−3.86(m,2H),3.81−3.61(m,9H),3.38(t,J=5.1Hz,2H),3.13−2.94(m,6H),1.69(s,2H).HRMS(ESI)理論値:C15H26N5O4+ m/z 340.1980;実測値:340.1979.

0125

実施例6:3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−N,N,N−トリメチルピリジン−2−アミニウムの合成




メチルトリフルオロメタンスルホネート(0.065mL,0.589mmol)を、一定の窒素流下において、密閉容器内で3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−N,N−ジメチルピリジン−2−アミン(40mg,0.118mmol)/トルエン(1.5mL)の溶液に加えた。反応混合物を、14時間かけて、室温で攪拌した。溶媒を除去して、得られる残留物を、エーテル(2x10mL)で洗い、ジクロロメタン(2x1mL)と共に共沸乾燥させて、高圧真空下にて終夜乾燥して、3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−N,N,N−トリメチルピリジン−2−アミニウム,トリフルオロメタンスルホネート塩を定量的収量にて粘性の無色油状物として得た。
LCMS m/z 354.33;1HNMR(400MHz,DMSO−d6)δ8.24−8.17(m,1H),7.98(d,J=8.3Hz,1H),7.75(ddd,J=8.2,4.6,3.2Hz,1H),4.44(br.s.,2H),3.88(d,J=3.9Hz,2H),3.69−3.45(m,21H).

0126

実施例7:3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−N,N,N−トリメチルピリジン−2−アミニウム,トリフルオロメタンスルホネート塩を用いる[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジンの合成

0127

[18F]−フルオリド水溶液(2.0mL,33.3GBq/900mCi)を、ペンシルベニアウエストポイント、P.E.T.Net(登録商標)Pharmaceuticalsから購入し、直接Sep−Pak light QMAに移した[The Sep-Pak light QMAカートリッジを、使用前に、0.5Mカリウム炭酸水素塩(5ml)、脱イオン水(5mL)およびMeCN(5mL)を順に用いて事前処理した]。移行が完了してから、[18F]フルオリド水溶液を、炭酸カリウム(15mg/ml;0.1ml)、次いで炭酸カリウム(30mg/ml,0.1mL)、4,7,13,16,21,24−ヘキサオキサ−1,10−ジアザビシクロ[8.8.8]ヘキサコサン(15mg,0.04mmol)およびMeCN(1.2mL)の混合物を、連続的に加えることにより、QMA Sep−Pakから溶出した。溶媒を、90℃で真空にて、窒素の穏やかな気流下にて、エバポレートした。共沸乾燥を、アセトニトリル(1mL)を用いて2回繰り返して、無水K.2.2.2/K[18F]F複合体を生成した。3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−N,N,N−トリメチルピリジン−2−アミニウム,トリフルオロメタンスルホネート塩(2mg,5.6μmol)を、500マイクロリットルのDMSOに溶解し、乾燥クリプタンドに加えた。この溶液を120℃で10分間加熱した。その後、粗製反応混合物を3mlのDI水で希釈した。次いで、粗製反応混合物の全量を、逆相HPLCに移し、ロードし、以下の条件で精製した:HPLCカラム:Luna C18 250x10, 溶媒A:0.1%TFA/DI水;溶媒B:0.1%TFA/アセトニトリル,流量:4.6ml/分,UV280nmでモニターしながら、アイクラチック法の32%Bを用いる。[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジンを、クロマトグラムの24分のピークにて単離し、2分間かけて回収した。この生成物を10mlのDI水を含む100mlのフラスコ中に回収し、全ての内容物を、WatersのSep-Pak Vac tC18 6cc 1g sep packに移した。[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジン(6.1GBq/164mCi)を、この反応から単離した。これを、エタノール(3mL)を用いてsep−pakから溶出して、この溶液を、98℃の熱源、窒素の安定な気流および真空で15分間、当該バイアルにフィルムのみが残るまで蒸発させた。最終生成物を、100%1xPBS緩衝液に溶解したが、37℃で1時間以上この溶媒中で安定であった。

0128

[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジンを用いて、アルキンを含む適切なペプチドとの「クリック」アジド−アルキン反応を利用することにより18F−標識生成物(例えば、以下に記載した通りの18F−標識抗PD−L1大環状ペプチド)を製造してもよい。

0129

実施例8:「クリックケミストリー」を用いる18F−放射性標識された大環状ペプチドの作成
A.[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジンを形成するための4−PEG−トシル−アジド前駆体のフッ素化
[18F]−フルオリド水溶液(2.0mL,29.6GBq/800mCi)は、TowadaにあるIBAから購入して、BMS Princeton NJ siteに出荷された。この試料を、特注遠隔操作合成機器内に移した。この溶液を、Sep-Pak light QMA[The Sep-Pak light QMA cartridgeは、使用前に0.5M炭酸水素カリウム(5ml)、脱イオン水(5mL)およびMeCN(5mL)を順に用いて予め適切に調整された]に移した。この移行が完了してから、[18F]フルオリド水溶液を、炭酸カリウム(30mg/ml/蒸留水(DI),0.1mL)、4,7,13,16,21,24−ヘキサオキサ−1,10−ジアザビシクロ[8.8.8]ヘキサコサン(15mg,0.04mmol)およびアセトニトリル(1.4mL)の混合物を加えて、QMA Sep-Pakから溶出した。溶媒を、90℃真空にて窒素の穏やかな気流下においてエバポレートした。共沸乾燥を、1mLのアセトニトリルを用いて2回繰り返して、無水K.2.2.2/K[18F]F錯体を生成した。この処理が完了した後に、クリプタンドを完全な真空下にて15分間更に乾燥した。全ての処理は、完了するまで35分間を要した。

0130

この乾燥した[18F]/クリプタンド固体に、3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−ニトロピリジン/DMSO(2mg,0.5mL)を加えて、この混合物を、120℃で10分間加熱した。この後に、粗製反応混合物を、蒸留水(3mL)で希釈して、全ての内容物を、以下のHPLCカラムおよび条件にてロードした:HPLCカラム:Luna C18 250 x 10 mm;溶媒A:0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)/DI水;溶媒B:0.1%TFA/アセトニトリル;流量4.6ml/min;圧力1820PSI;アイソクラチック法32%B;UV−280nm。[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジン([18F]−FPPEGA)生成物を、クロマトグラムの24分の時点で単離して、2分かけて収集した。この生成物を、DI水(15mL)を含有するフラスコ(100mL)に集めて、全量をSep PakVac tC18 6cc 1g sep pack(PN WAT036795)に移した。[18F]−FPPEGAを、エタノール(2.5mL)を用いてSep Pakから溶出して、この溶液を、15分間かけて乾燥するまで98℃のN2および真空において減少させた。この化合物を、DI水(0.1mL)に溶解した。この生成物を、Varian HPLC HPLC Column Luna C18 (2) 4.6 x 150 mmを用いて分析した。溶媒A:0.1%TFA/DI水;溶媒B:0.1%TFA/アセトニトリル;流量1.0ml/min;グラジエント法、0分 90%A 10%B;15分 30%A 70%B;17分 30%A 70%B;18分 90%A 10%B;20分 90%A 10%B;UV−280nm。14.1 GBq(380mCi)の[18F]−FPPEGAを単離した。この生成物を、アルキンを含むPD−L1に結合する大環状ペプチドを用いて、「クリック」ケミストリーを完了させた。

0131

B.[18F]−FPPEGAと大環状ペプチドとのカップリング
[18F]−放射性標識された大環状ペプチドを合成するためのスキームは、スキーム(a)に示される。
(S)−2−(2−((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44R,47S,49aS)−36−((1H−インドール−3−イル)メチル)−6−(2−アミノ−2−オキソエチル)−33−(2−アミノエチル)−47−(アミノメチル)−24,27−ジブチル−30−((1−(カルボキシメチル)−1H−インドール−3−イル)メチル)−40−ヒドロキシ−12−(4−ヒドロキシベンジル)−21,44−ジイソブチル−9,10,25,28−テトラメチル−5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49−テトラデカオキソヘキサテトラコンヒドロ−1H,5H−ジピロロ[2,1−g1:2',1'−x][1]チア[4,7,10,13,16,19,22,25,31,34,37,40,43]トリデカアザシクロペンタテトラコンチン−18−カルボキサミド)アセトアミド)ペンタ−4−イン酸(0.75mg,0.378μmol)を、DI水(0.250mL)およびtert−ブチルアルコール(0.25mL)に溶解した。この溶液に、硫酸銅(1mg)を含有するDI水溶液(0.250mL)およびアスコルビン酸ナトリウム(1mg)を加えた。最終的に、14.1GBq(380mCi)の[18F]−FPPEGA(セクションAに記述したように製造した)(0.1mL溶液)を加えて、この反応混合物を、周囲温度で20分間混合した。この粗製反応混合物の内容物に、アセトニトリル(0.5mL)、DI水(1.5mL)を加えて、この混合物を、逆相HPLCカラムを用いて精製した。HPLCカラム:Luna C18 250x10mm;溶媒A:0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)/DI水;溶媒B:0.1%TFA/アセトニトリル;流量4.6ml/min;圧力1820PSI;アイソクラチック法37%B;UV−220nm。生成物を、クロマトグラムの27〜31分の間で単離して、図(b)に示したように4分かけて収集した。2.5GBq(67mCi)の[18F]−(S)−2−(2−((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)−36−((1H−インドール−3−イル)メチル)−6−(2−アミノ−2−オキソエチル)−33−(2−アミノエチル)−47−(アミノメチル)−24,27−ジブチル−30−((1−(カルボキシメチル)−1H−インドール−3−イル)メチル)−40−ヒドロキシ−12−(4−ヒドロキシベンジル)−21,44−ジイソブチル−9,10,25,28−テトラメチル−5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49−テトラデカオキソヘキサテトラコンタヒドロ−1H,5H−ジピロロ[2,1−g1:2',1'−x][1]チア[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]テトラデカアザシクロペンタテトラコンチン−18−カルボキサミド)アセトアミド)−3−(1−(2−(2−(2−(2−((2−フルオロピリジン−3−イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)プロパン酸を単離した。この溶液を、さらに、DI水(20mL)で希釈して、この溶液を、C-18sep-pak(Waters 50mg、これはエタノール(5mL)、その後にDI水(10mL)を用いて予め活性化された)に移して、全ての有機溶媒を該溶液から除去する。このsep-pakを、さらに注射用滅菌水(10mL)で洗った。この生成物を、エタノール(0.5mL)を用いてsep-pakから溶出し、滅菌バイアル中へ滅菌濾過して、注射用生理食塩水を用いて溶液重量まで5%エタノールに希釈した。この生成物を、図(b)に示されたとおりに逆相HPLCを介して分析した:非放射性標準物を同時にインジェクションすることにより、放射性化学物質の純度および化学的純度比活性を化学的に特定した。非放射性参照標準物と共に溶出したこの単離生成物は、100%放射性化学的純度であり、95%化学的純度であって、0.37(10mCi)GBq/nmolの比活性を有する。

0132

分析逆相HPLCを、以下のパラメーターで行った:
Zorbax SB-C18 250x4.6mmカラム;溶媒A:0.05%ギ酸/DI水;溶媒B:アセトニトリル中で0.05%;流量1.0ml/min;グラジエント法、20分かけて30%〜50%B;UV−220nm.

0133

スキーム(a)
[18F]−放射性標識されたPD−L1に結合する大環状ペプチドを合成するためのスキーム




[18F]−(S)−2−(2−((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)−36−((1H−インドール−3−イル)メチル)−6−(2−アミノ−2−オキソエチル)−33−(2−アミノエチル)−47−(アミノメチル)−24,27−ジブチル−30−((1−(カルボキシメチル)−1H−インドール−3−イル)メチル)−40−ヒドロキシ−12−(4−ヒドロキシベンジル)−21,44−ジイソブチル−9,10,25,28−テトラメチル−5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49−テトラデカオキソヘキサテトラコンタヒドロ−1H,5H−ジピロロ[2,1−g1:2',1'−x][1]チア[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]テトラデカアザシクロペンタテトラコンチン−18−カルボキサミド)アセトアミド)−3−(1−(2−(2−(2−(2−((2−フルオロピリジン−3−イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)プロパン酸を、様々なインビトロおよび/またはインビボでの画像用途、例えば、診断用画像基礎研究および放射線治療用途に使用できる。診断イメージングおよび放射性治療応用の可能な特定の例としては、哺乳動物またはその臓器もしくは組織試料における、PD−L1陽性腫瘍の位置、相対的な活性および/または定量化の決定、PD−L1陽性腫瘍の放射免疫アッセイ、並びにPD−L1陽性腫瘍の分布を決定するためのオートラジオグラフィーが挙げられる。

0134

特に、[18F]−(S)−2−(2−((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)−36−((1H−インドール−3−イル)メチル)−6−(2−アミノ−2−オキソエチル)−33−(2−アミノエチル)−47−(アミノメチル)−24,27−ジブチル−30−((1−(カルボキシメチル)−1H−インドール−3−イル)メチル)−40−ヒドロキシ−12−(4−ヒドロキシベンジル)−21,44−ジイソブチル−9,10,25,28−テトラメチル−5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49−テトラデカオキソヘキサテトラコンタヒドロ−1H,5H−ジピロロ[2,1−g1:2',1'−x][1]チア[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]テトラデカアザシクロペンタテトラコンチン−18−カルボキサミド)アセトアミド)−3−(1−(2−(2−(2−(2−((2−フルオロピリジン−3−イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)プロパン酸は、ヒトおよび実験動物の肺、心臓、腎臓、肝臓および皮膚ならびに他の臓器におけるPD−L1陽性腫瘍の陽電子放出断層撮影(PET)イメージングに有用である。[18F]−(S)−2−(2−((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)−36−((1H−インドール−3−イル)メチル)−6−(2−アミノ−2−オキソエチル)−33−(2−アミノエチル)−47−(アミノメチル)−24,27−ジブチル−30−((1−(カルボキシメチル)−1H−インドール−3−イル)メチル)−40−ヒドロキシ−12−(4−ヒドロキシベンジル)−21,44−ジイソブチル−9,10,25,28−テトラメチル−5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49−テトラデカオキソヘキサテトラコンタヒドロ−1H,5H−ジピロロ[2,1−g1:2',1'−x][1]チア[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]テトラデカアザシクロペンタテトラコンチン−18−カルボキサミド)アセトアミド)−3−(1−(2−(2−(2−(2−((2−フルオロピリジン−3−イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)プロパン酸を用いるPETイメージングを用いて、以下の情報を得ることができる:PD−L1腫瘍-候補治療薬による組織占有度と患者の臨床効果との関係;長期間の臨床試験の開始前の、PD−L1腫瘍−候補治療薬の臨床試験のための用量選択;構造的に新しいPD−L1腫瘍−治療薬の相対的な有効性;PD−L1腫瘍−治療薬を用いた臨床的標的の治療の期間のインビボでの輸送体親和性および密度への影響の調査;有効および非有効治療中のPD−L1陽性腫瘍の密度および分布における変化。

0135

実施例9:GE TRACERlab FX2 N合成ユニット上での放射性物質合成のための一般方法に従う[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジンの自動製造



市販のTRACERlab FX2 N合成モジュール(GE)を用いる自動合成
[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジンの自動合成を、非カセット型のGE TRACERlab FX2 N合成モジュールを用いて行なった。合成ユニットの配置は表にまとめられる。[18F]−フルオリド水溶液(2.0mL,29.6GBq/800mCi)を、Sep-Pak light QMA[Sep-Pak light QMAカートリッジは、使用前に0.5M炭酸水素カリウム塩(5ml)、脱イオン水(5mL)およびアセトニトリル(5mL)を順に用いて事前に適切に処理された]に移した。この移行が完了してから、反応容器に、溶出用混合液を加えることにより(「V1」から)、[18F]フルオライド水溶液を、QMA Sep−Pakから溶出させた。溶媒を、窒素の穏やかな気流および真空下において、エバポレートした。前駆体の溶液(“V3”から)を、乾燥クリプタンド残留物に加え、この反応混合物を120℃で10分間加熱した。次いで、4mlの蒸留水を(「V4」から)、反応容器中の粗製反応混合物に加え、混合物を、ローディングの終わりを制御する液体センサーを介して、半分取HPLCの5ml試料注入ループに移した。混合物を、半分取HPLCカラム(Luna C18(2). 250x10mm, Phenomenex)にロードした。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液中の35%アセトニトリルの混合液を、毎分4.6mlの速度でカラムに通した。生成物をこのHPLCカラムから、15mlの蒸留水を含む希釈フラスコに回収し、その全ての内容物を、tC18(1グラム)の固相抽出カートリッジに移した。3mlのエタノールによって、このカートリッジから352mCi(13GBq)の[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジンを溶出させて(「V14」から)、これを用いて、アルキンを含む適切なペプチドとの「クリック」アジド−アルキン反応を利用した18F標識ペプチド製剤を生成し得る。

0136

実施例10:IBA Synthera合成ユニット上で合成放射性物質を合成するために一般方法に従う[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジンの自動製造




市販のSynthera合成モジュール(IBA)を用いる自動合成
[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジンの自動合成を、カセット型のIBA Synthera合成モジュールおよび適切に組み立てられた流体プロセッサー積算キットを用いて行なった。この合成のために、流体プロセッサー積算(IFP)キットは、適切な前駆体とともにロードされ、表()にまとめられる。精製を、VarianHPLCunit上で行なった。HPLCのインジェクションループ充填は、HPLCユニットの安定な窒素気流によって制御された。両方の自動装置の組み立ては、表()にまとめられる。[18F]−フルオリド水溶液(2.0mL,29.6GBq/800mCi)を、Sep-Pak light QMA[The Sep-Pak light QMA cartridgeは、使用前に0.5M炭酸水素カリウム塩(5ml)、脱イオン水(5mL)およびアセトニトリル(5mL)を順に用いて事前に処理された]に移した。この移行が完了してから、[18F]フルオリド水溶液を、反応容器への溶出混合物(「V1」から)の添加により、QMA Sep-Pakから溶出した。溶媒を、窒素の穏やかな気流および真空下でエバポレートした。前駆体の溶液を(「V2」から)、乾燥クリプタンド残留物に加え、この反応混合物を120℃で10分間加熱した。次いで、3mlの蒸留水を(「V4」から)、反応容器中の粗製反応混合物に加えて、混合物を、ローディングの終わりを制御する液体センサーを介して、半分取HPLCの5mlの試料注入ループに移した。混合物を、半分取HPLCカラム(Luna C18(2). 250 x 10mm, Phenomenex)にロードした。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液中の35%アセトニトリルの混合液を、毎分4.6mlの速度でカラムに通した。生成物をこのHPLCカラムから、15mlの蒸留水を含む希釈フラスコに回収し、全ての内容物を、tC18 1グラムの固相抽出カートリッジに移した。エタノール(3mL)によって、このカートリッジから325mCi(12GBq)の[18F]−3−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)−2−フルオロピリジンを溶出させ、これを使用して、アルキンを含有する適切なペプチドとの「クリック」アジド-アルキン反応を利用した18F標識ペプチド生成物を生成し得る。

0137

実施例11:抗PD−L1大環状ペプチドイメージング剤を用いるPD−L1−陽性腫瘍とPD−L1−陰性腫瘍の識別
PET画像にとって、迅速な血液クリアランス速度は、非関連組織から“バックグラウンド”プローブシグナル枯渇させるために必要な時間を最小とすることで、抗体などのより遅いクリアリング剤を超える利点を提供する。診療所において、血液半減期が長い抗体を基にしたPETトレーサーは、画像を収集するためには、注入後に数日間待つことを必要とする。プローブを迅速にクリアランスするということは、プローブを注入したその日に高分解性画像収集を可能にするという道を開くものであり、そのことが、実験動物または試験患者に対する全体の放射線暴露を減少させるのに役立ち得ることは非常に重要である。

0138

この実験において、[18F]標識された大環状PD−L1ペプチドを、上記実施例において記述された通りに製造して、マウスにおけるhPD−L1−陽性腫瘍およびhPD−L1−陰性腫瘍を識別するその能力を試験した。

0139

両側性異種移植片腫瘍を持つマウスを、マウスの両側に、2×106hPD−L1(+)L2987ヒト肺癌細胞および4×106hPD−L1(−)HT−29ヒト大腸癌細胞を皮下導入することにより作成した。腫瘍がおよそ300mm3に達してから(細胞移植の後おおよそ2〜3週間)、イメージングのために動物を選択した。各試験の体重および腫瘍サイズを、イメージング法の前に、イメージングの実施日に測定し、記録した。マウスを、麻酔誘導チャンバー内に置いて、1〜1.5L/minの速度で、100%O2中に3%イソフルラン吸入麻酔を送気した。一旦鎮静させてから、マウスを、誘導チャンバーから出して、プレキシガラス製の4つのチャンバーマウスホテル(BMS-Applied Biotechnology groupにより特注)に入れて、ノーズコーンを介して2L/minの速度で100%O2に送気して、1〜1.5%イソフルラン吸入麻酔を行ない続けた。イメージング中の低体温症を防ぐために、外付けスタンドアローン温度調節ユニット(M2MImaging Corp)を用いて動物を温め続けた。マウスの呼吸を、イメージング手法の間、連続的にモニターし、また麻酔の深さに拠ってイソフルランを調整されてもよい。次いで、マウスは、4匹動物を収容できるカスタム動物ホルダー内に入れられ、そこで試験の継続期間中、麻酔下に保たれた。動物ホルダーを、microPET(登録商標) F120(商標) scanner(Siemens Preclinical solutions, Knoxville, TN)に移した。この機器の軸方向視野は7.6cmである。この制限のために、動物は、スキャン領域が眼の直前から、おおよそ尾の付け根までとなるよう置かれる。最終的なPET画像を減衰補正するために、57Coの点光源を用いて最初に10分間の透過像を得た。透過スキャンに続いて、放射性トレーサー溶液を、予め取り付けられた尾静脈カテーテルを介して投与して、2時間のエミッション画像を得た。注入された放射性トレーサー溶液を、HT−29については腫瘍体積203.0±51.4mm3を有し、またL2987については腫瘍体積422.9±128.4mm3を有する全8匹(体重:22.2±2.0gram)に注入して、移殖16〜17日後にイメージングを行なった。各マウスは、[18F]標識された大環状PD−L1ペプチド(124.0±8.4μCi,トレーサー量:1.0±0.4μg/kg)のIV注射の30分前に、PD−L1に結合する大環状ペプチド60mg/kg(N=4)または生理食塩水(N=4)のSC投薬の単回注入を受容した。画像は、得られた透過像を用いて減衰補正をした最大事後(MAP)アルゴリズムを用いて再構築し、放射性同位体崩壊について補正した。最終的な画像において、ASIPro software(Siemens Preclinical Solutions)を用いて、腫瘍の境界付近に関心領域(ROI)を描いた。それぞれのROIについて時間放射曲線を算出し、2時間のエミッション画像の経過における腫瘍体積中の放射性トレーサーの定量画像を得た。最終的な比較のために、個々の時間放射能曲線は、それぞれの特定の動物に対して注入された放射性トレーサーの用量に基づいて標準化した。放射性トレーサーの取り込みを、それぞれの時間放射能曲線の最後の10分(放射性トレーサーの注入後90〜100分)を用いて、腫瘍全域にわたって比較した。この手法を用いて、hPD−L1(+)L2987異種移植片における放射性トレーサーの取り込みは、[18F]標識された大環状PD−L1ペプチド放射性トレーサーのみを受容した動物のhPD−L1(+)L2987異種移植片に見られるものに対して8.1×であった。放射性トレーサーの注入の30分前にPD−L1に結合する大環状ペプチド60mg/kgのSC投薬を受容した動物において、hPD−L1(+)L2987異種移植片における取り込みは、hPD−L1(−)HT−29異種移植片において見られるものに対してわずか0.7×であった(図1図2および表3)。

0140

表3:実施例11におけるPET画像から得たHT−29およびL2987腫瘍中の標準取り込み値(SUV)

0141

これらの結果は、インビボにおいてhPD−L1(+)とhPD−L1(−)の異種移植腫瘍を識別する直接的な可視化を提供する。特異性は、放射性トレーサーの注入30分前にPD−L1に結合する大環状ペプチド60mg/kgを予め投与することにより検証され、hPD−L1(+)腫瘍における放射性トレーサーの取り込みは、hPD−L1(−)異種移植片の程度まで減少した。この事実は、PET画像を用いて、PD−L1組織発現を可視化するためのPD−L1大環状ペプチドの使用に関する正当性立証している。

0142

実施例12:抗PD−L1大環状ペプチドイメージング剤を用いる非ヒト霊長類におけるPET画像
抗PD−L1ミラモレキュラーを基にしたイメージング剤は、カニクイザルにおいて行なった場合にも同様の結果を示した。これらの試験において、上記実施例において記述したとおりに製造した[18F]標識された大環状PD−L1ペプチドは、カニクイザルにおいて高分解性画像を提供するその能力について試験された。本明細書に記述した抗PD−L1大環状ペプチドは、カニクイザルPD−L1(しかし、げっ歯類PD−L1に対しては低い親和性を有する)に対して高い親和性を維持する。さらに、カニクイザルは、マウスモデルに見られるようなPD−L1(+)腫瘍を含有せず、イメージングの性能を、内因性PD−L1発現(バックグラウンドが低いため、PD−L1(+)組織の高感度検出が可能になる)に関連する画像において測定されるバックグラウンド量を第一に評価した。バックグラウンド量にて主に評価した。これらの試験から、得られるPET画像におけるバックグラウンド量は極めて低く、顕著な放射性トレーサーの蓄積は、主に、腎臓、脾臓および膀胱に見られた。

0143

あらかじめ血管アクセスポート(VAP)を導入したオスのカニクイザルを、0.02mg/kgのアトロピン、5mg/kgのテラゾールおよび0.01mg/kgのブプレノルフィンI.M.によって麻酔した(全てを単一のシリンジから注入した)。次いで、イメージング手順の間に給水を維持する点滴投与のために、静脈カテーテルを頭部血管に設置した。動物を気管内チューブ−通常は3.0mmと共にインキュベートし、microPET(登録商標)F220TM PET機器(Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN)の撮影台に移した。イメージング処理の間、麻酔をイソフルランおよび酸素によって維持し、静脈内輸液(LRS)を6ml/kg/時間の速度で投与した。microPET(登録商標)F220TM機器の軸方向視野はわずか7.6cmであるため、心臓の直上からおよそ骨盤までの動物の合成画像を作成するために、5つの異なる台の位置における画像を得た。

0144

それぞれの視野において、最終的なPET画像を減衰補正するために、57Coの点光源を用いて10分の透過像を最初に得た。全ての台の位置において透過像が得られた後、およそ1.7mCi(およそ0.12μg/kg)の[18F]標識された大環状PD−L1ペプチド放射性トレーサーを、導入されたVAPを介して投与した。次いで、動物の心臓の中心付近ポジション1から始まり、骨盤に向かって動く、5分間の継続したエミッションスキャンを、それぞれの台の位置で順に行った。それぞれの位置(1から5)において画像を得た後、撮影台をポジション1の台に戻し、この手順を繰り返した。この手順を用いて、イメージング実験の継続時間にわたり、それぞれの台の位置について合計5つの異なる画像を得た。

0145

個々の画像は、得られた透過像を用いて減衰補正したフィルター逆投影(FBP)アルゴリズムを利用して再構築し、放射性同位体崩壊について補正された。最終的な合成画像は、次いで、イメージング実験の継続時間の間、1回の通過によって得られた全ての5つの台の位置の画像を整列させることによって得られた(すなわち、1つの合成画像は、台の位置1から5の逐次的な画像のそれぞれのセットから生成された)。最終的な画像は、放射性トレーサーの取り込みが、可視領域(すなわち、脾臓、腎臓、膀胱)およびバックグランド組織(筋肉)に見られるために、視覚的に調査された(図3)。[18F]標識された大環状PD−L1ペプチド放射性トレーサーのバックグラウンドの蓄積は極めて低く、筋肉などのバックグラウンド組織においてはわずかなシグナルしか可視化されなかった。さらに、免疫組織学的かつmRNA発現に基づいてPD−L1(+)である脾臓において、取り込みが検証された。このように、カニクイザルにおける実験によって、内因性PD−L1に関連する高感度のPD−L1イメージングについての可能性が実証される。カニクイザルの脾臓における特異的結合の特性を決定するために、以下の方法でブロッキング試験を行なった。

0146

カニクイザル(4.4kg,オス)は、ベースラインで[18F]標識された大環状PD−L1ペプチド放射性トレーサー(〜1.7mCi,量:0.21μg/kg)の単回IV注射を受容した。次の日に(投薬後)、同じNHPは、放射性トレーサー注射の2時間前に単回SC用量の2mg/kgの抗PD−L1に結合する大環状ペプチドを受容した(〜1.7mCi,量:0.12μg/kg)。種々の臓器におけるこのトレーサー取り込みを、表4に挙げる。ベースラインおよび投薬後の代表的なPET画像を、図3プロットした。抗PD−L1に結合する大環状ペプチドの血漿濃度を、各々イメージングの日に、放射性トレーサー注射後の0、10、30、60、90分に測定した(表4)。特異的結合シグナルを、非ヒトげっ歯類霊長類脾臓内で観察すると、93%のトレーサー取り込みが、2mg/kgの特異的PD−L1に結合する大環状ペプチド(2mg/kg)によりブロックされた。

0147

齧歯類およびカニクイザルにおけるPET実験において、18F標識抗ヒトPD−L1大環状ペプチドは、PD−L1発現量が低い組織の高感度検出を可能にする、インビボでのPD−L1陽性組織の標識のための強力で特異的なプローブを提供することが示される。

0148

インビボでのイメージング実験を抗PD−L1抗体を用いて行ない、このイメージング剤が検出した領域は、PD−L1イメージング剤を用いて検出した領域と同じ領域であり、即ち、抗PD−L1ミラモレキュラーイメージング剤が、インビボでのPD−L1陽性細胞の検出に成功したことが確認された。

0149

0150

実施例13:[18F]標識された大環状PD−L1ペプチド放射性トレーサーを用いるインビトロのオートラジオグラフィー
ヒトの肺腫瘍組織を、OCTに埋め込んで、凍結するまで2−メチルブタン中で2〜5分間冷却した。サンプルを、−80℃の冷凍庫に使用するまで保存した。ヒトの異種移植組織もアッセイに含めた。両側性の異種移植片を有するマウスは、2×106 hPD−L1(+)L2987ヒト肺癌細胞および4×106hPD−L1(−)HT−29ヒト大腸癌細胞をマウスの反対側に皮下導入することにより作成した。得られる異種移植腫瘍が、適切なサイズ(約200〜300mm3)に達してから、マウスを2%イソフルランで麻酔して、頸椎脱臼により屠殺した。新たに腫瘍組織切り出して、OCTに浸漬し、2−メチルブタン中で凍結するまで2〜5分間凍らせた。次いで組織を、foil/ZIPLOC(登録商標)バッグ包み、−80℃で使用するまで保存した。全ての組織(ヒトの肺腫瘍および異種移植片)について、5μm厚の切片(2切片/スライドとして回収した)を、クリオスタットを用いて切り出して、顕微鏡用ガラススライド上で溶融解凍して、おおよそ30分風乾させた。ブロッキング試験は、各々0.1nM、1nMおよび10nMのコールド(非標識)ペプチドを用いる。個々のスライド(濃度につき1枚のスライド)を、インキュベーションのためにガラススライドインキュベーションチャンバーに移した。これとは別に、0.25nMの[18F]−(S)−2−(2−((6S,9S,12S,18R,21S,24S,27S,30S,33S,36S,38aS,40R,44S,47S,49aS)−36−((1H−インドール−3−イル)メチル)−6−(2−アミノ−2−オキソエチル)−33−(2−アミノエチル)−47−(アミノメチル)−24,27−ジブチル−30−((1−(カルボキシメチル)−1H−インドール−3−イル)メチル)−40−ヒドロキシ−12−(4−ヒドロキシベンジル)−21,44−ジイソブチル−9,10,25,28−テトラメチル−5,8,11,14,20,23,26,29,32,35,38,43,46,49−テトラデカオキソヘキサテトラコンタヒドロ−1H,5H−ジピロロ[2,1−g1:2',1'−x][1]チア[4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43]テトラデカアザシクロペンタテトラコンチン−18−カルボキサミド)アセトアミド)−3−(1−(2−(2−(2−(2−((2−フルオロピリジン−3−イル)オキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)プロパン酸のストック溶液を、tween80(300mL)を用いる元々の放射性リガンド溶液(実験時に7064nM)(10.6μl)を希釈して作った。このストック溶液から、40mLを各インキュベーションチャンバーに加えた。これらのチャンバーの1つは、放射性リガンド緩衝液のみを含有しており、これは全結合切片として参照される。別のインキュベーションチャンバーには、ブロッキング化合物参照濃度と共に(0.1nM、1nMまたは10nMの非標識ペプチド)このストック溶液(40mL)を入れた。スライドを、個々の緩衝溶液中で、最大結合に達するように室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後に、各処置群からのスライドを、インキュベーション溶液から取り出して、氷冷した洗浄緩衝液(Tween80)中に3分間置いて、4回に分けてリンスした。スライドを、おおよそ30分間冷風下にて乾燥させた。風乾したスライドを、終夜室温で、スライドをイメージングプレート(BAS−SR3545S)上に置いて暴露した。バイオイメージング分析器(Fujifilm Fluorescent Image Analyzer,FLA-9000)を用いて、イメージングプレートを、スキャンした。オートラジオグラム画像の画素サイズは100μmであった。マルチゲージソフトウェアを用いて画像解析を行った。全ての試験群において、腫瘍組織全体を包囲するように、関心領域(ROI)を描いた。組織に関連する放射能のオートラジオグラフィーシグナルを、これらのROIから定量した。ヒトの肺腫瘍切片ならびにヒトの異種移植切片の双方において、非標識ペプチドの3つの異なる濃度(0.1nM、1nMおよび10nM)について、全結合切片と比較した場合の、[18F]標識された大環状PD−L1ペプチド放射性トレーサーの明らかな置き換えが測定された。非標識ペプチドの添加に伴う用量依存性の[18F]標識された大環状PD−L1ペプチド放射性トレーサーの置き換えが(図4)、全ての組織切片において見られた。各組織からの一連の5μmの連続組織切片を、抗ヒトPD−L1免疫組織化学手法に供して、ヒトの肺サンプルにおけるPD−L1発現が確認されたサンプル中のPD−L1抗原の発現量を実証した。

0151

当業者は、本明細書に記載の特定の実施態様の多くの均等物を認識し、単なる通常の実験だけで確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

該当するデータがありません

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

該当するデータがありません

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

この 技術と関連性が強い技術

該当するデータがありません

この 技術と関連性が強い法人

該当するデータがありません

この 技術と関連性が強い人物

該当するデータがありません

この 技術と関連する社会課題

該当するデータがありません

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ