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技術 アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤の同定方法

出願人 フォルシュングスツェントルム・ユーリッヒ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
発明者 ホーヤー・ヴォルフガング
出願日 2017年4月6日 (3年0ヶ月経過) 出願番号 2018-550829
公開日 2019年6月27日 (10ヶ月経過) 公開番号 2019-518196
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 二次プロセス 経時的上昇 成分候補 隣接物 不規則さ 同一単位 モデル物質 アミロイド構造
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (4)

課題・解決手段

本発明は、アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を同定するための方法であって、a)A−ベータ種を緩衝液の中に入れるステップ、b)アミロイドベータ凝集を定量するステップを含む方法において、c)A−ベータ種として、2単位のA−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する2単位のA−ベータモノマーを選択するステップを特徴とする方法に関する。そのためのリンカー、キット、ならびにその使用を開示する。

概要

背景

今後数十年間における人口統計学上の展開に起因し、老人性疾患を患う者の数は上昇するであろう。ここでは、特に、いわゆるアルツハイマー病(AD、アルツハイマー型認知症ラテン語:Morbus Alzheimer)を挙げたい。

これまでのところ、有効成分、またはADの原因に対して効き目がある医薬品は存在しない。従来使用されている承認医薬品は、アルツハイマー型認知症において現れる症状のいくつかを和らげる。ただし、それらの医薬品は、病気の進行を遅延させること、または治癒をもたらすことはできない。動物実験において、ADの予防には成果を示したものの処置に際しては(必ずしも)成果を示さなかった物質がいくつか存在する。

アルツハイマー病の特徴は、アミロイドベータペプチド(Aベータペプチド、A−ベータペプチド、Aβ、またはAβペプチド)の細胞外沈着である。A−ベータペプチドの、プラークにおける沈着は、典型的には、死後AD患者の脳内に認められる。それゆえ、A−ベータペプチドの様々な形態、例えば、原線維が疾患の発生および進行の原因とされている。さらに、数年来、自由拡散可能な小さいA−ベータオリゴマーが、ADの発生および進行の主な原因と見なされている。

A−ベータオリゴマーの構成成分であるA−ベータモノマーは、人体中絶えず生じ、おそらくそれ自体は毒性ではない。しかも、モノマーが有利な機能を有するという可能性さえある。A−ベータモノマーは、その濃度に依存して偶然集合し得る。その濃度は、体内での形成速度および分解速度に依存する。年齢の増加と共に体内でのA−ベータモノマーの濃度が高まると、A−ベータオリゴマーへのモノマーの自発的な集合がますます起こりやすくなる。そのように生じたA−ベータオリゴマーは、プリオンと類似に増加し、最終的にはアルツハイマー病につながるかもしれない。

従来技術から公知の物質は、きわめて様々なやり方で、A−ベータモノマーおよび/またはA−ベータオリゴマーの濃度を低下させる。例えば、動物実験において予防に使用されたガンマセクレターゼ修飾薬が公知である。

動物実験において肯定的な結果を示した多数の物質の場合、人での臨床試験ではその効果を確かめることはできなかった。望ましいのは、最初のA−ベータオリゴマーの形成の阻止、つまり、一次核形成を妨げることであろう。その結果、毒性オリゴマーのいずれも形成されないかもしれない。

それゆえ、非常に特異的かつ高い親和性でA−ベータオリゴマーに結合してその増加を阻止するか、または直接にその形成を阻害する有効成分および阻害剤のような新規化合物への需要が存在する。

アミロイドベータ凝集の阻害剤は、原則的には、アミロイドベータペプチドに対する結合親和性をもつ分子を選択するというやり方で得られるかもしれない。例えば、免疫学的手法により抗体を、そしてディスプレイ選択法によりペプチドを選択してから、凝集に対する潜在的阻害効果に関してそれらを試験する。

凝集反応に対するその効果を介して直接に阻害剤を同定することが望ましい。それは、Arosio等から公知であるように、動力学的凝集アッセイを利用して可能である(Arosio P.、Vendruscolo, M.、Dobson, C.M.、Knowles, T.P.J.(2015). Chemical kinetics for drug discovery to combat protein aggregation diseases。Trendsin Pharmacological Sciences. 35:127〜135頁(非特許文献1))。

しかしながら、現在の動力学的凝集アッセイを利用した場合、Habchi等から公知であるように、一次核形成の阻害剤を特異的に同定することは、多くの時間と材料を費やさないと不可能であることが不利である(Habchi, J.、Arosio, P.、Perni, M.、Costa, A.R.、Yagi−Utsumi, M.、Joshi, P.、Chia, S.、Cohen, S.I.A.、Mueller, M.B.D.、Linse, S.、Nollen, E.A.A.、Dobson, C.M.、Knowles, T.P.J.、Vensdruscolo, V.(2016). An anticancer drug suppresses the primary nucleation reaction that initiates the production of the toxic Ab42 aggregates linked with Alzheimer’s disease. Sci. Adv. 2、e1501244:1〜13頁(非特許文献2))。

それによると、個々の阻害剤候補に関して、一次核形成に対する阻害効果を検出するためには、複数のA−ベータ濃度ならびに阻害剤濃度において、通常は何時間にもわたって多数の凝集アッセイを実施してから、手間のかかる数学的なフィット法を行う必要があることが特に不利である。

この従来技術によって得られた阻害剤候補の場合、特に不利なことには、A−ベータ凝集のどの反応ステップにおいて阻害剤がそもそも介入するのか不明なままである。

つまり、従来技術からは、アミロイド形成は妨害するものの、その代わりに、潜在的に毒性のA−ベータオリゴマーの形成を増加させる分子が頻繁に選択されることが公知である。したがって、一次核形成を特異的に阻害する分子は、労力と時間のかかるケースバイケースの検査によってしか同定できない。

概要

本発明は、アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を同定するための方法であって、a)A−ベータ種を緩衝液の中に入れるステップ、b)アミロイドベータ凝集を定量するステップを含む方法において、c)A−ベータ種として、2単位のA−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する2単位のA−ベータモノマーを選択するステップを特徴とする方法に関する。そのためのリンカー、キット、ならびにその使用を開示する。

目的

本発明の課題は、アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を明確に同定できる、より簡単かつ迅速で経済的な方法を提供する

効果

実績

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請求項1

アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を同定するための方法であって、a)A−ベータ種を溶液または緩衝液の中に入れるステップ、b)アミロイドベータ凝集を測定するステップを含む方法において、c)A−ベータ種として、A−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する2単位のA−ベータモノマーを選択するステップを特徴とする方法。

請求項2

アミロイド形成を検出するための蛍光色素を、溶液または緩衝液に添加し、アミロイドベータ凝集の検出として、蛍光シグナルの上昇を測定することを特徴とする、請求項1に記載の方法。

請求項3

アミロイドベータ凝集を光散乱によって検出することを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。

請求項4

A−ベータ種に、A−ベータ(1−42)および/もしくはA−ベータ(1−40)からなるモノマー、ならびに/または別のA−ベータモノマーを選択することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一つに記載の方法。

請求項5

2つの同一単位のA−ベータモノマーまたは2つの同一ではない単位のA−ベータモノマーを選択することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一つに記載の方法。

請求項6

フレキシブル立体配座を有するペプチドリンカーをリンカーとして選択することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一つに記載の方法。

請求項7

リンカーとして、極性、非荷電アミノ酸、例えば、セリンおよび/またはトレオニンに富み、小さいアミノ酸、例えば、グリシンおよび/またはアラニンおよび/またはプロリン富むペプチドリンカーを選択することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一つに記載の方法。

請求項8

A−ベータ種間のリンカーとして、アミロイドベータ凝集の誘導期を少なくとも50%、特に80%、90%、さらには100%さえも低下させるペプチドを選択することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一つに記載の方法。

請求項9

リンクされるA−ベータモノマー中にあるアミノ酸数の50%±5%に相当するアミノ酸数を有するリンカーを選択することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一つに記載の方法。

請求項10

リンカーとして、配列(Glyx−Sery)n(x=1〜4、y=1およびn=1〜10)を有するペプチドリンカーを選択することを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一つに記載の方法。

請求項11

リンカーとして、配列(Gly4−Ser)4を有するペプチドリンカーを選択することを特徴とする、請求項10に記載の方法。

請求項12

アミノ酸グリシンがアミノ酸アラニンおよび/またはプロリンに交換されているリンカーを選択することを特徴とする、請求項10または11に記載の方法。

請求項13

アミノ酸セリンがアミノ酸トレオニンおよび/またはアスパラギンおよび/またはグルタミンに交換されているリンカーを選択することを特徴とする、請求項10〜12のいずれか一つに記載の方法。

請求項14

被検阻害剤を添加し、その阻害剤が、蛍光シグナルの高さを制限するか、または蛍光シグナルの時間的上昇を減速させた場合に肯定的に評価されることを特徴とする、請求項2〜13のいずれか一つに記載の方法。

請求項15

タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーの凝集を検査するための方法であって、−タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーを溶液または緩衝液の中に入れるステップ、−モノマーの凝集を測定するステップを含む方法において、−モノマーとして、タンパク質ミスフォールディング疾患の際に現れるモノマーの2単位であって、これらのモノマー単位間に配置されたリンカーを有する2単位を選択するステップを特徴とする検査方法

請求項16

グリシンおよび/またはセリンに富むことを特徴とする、請求項1〜15のいずれか一つに記載の方法を実施するためのペプチドリンカー。

請求項17

列番号1によるペプチドを特徴とする、請求項16に記載のペプチドリンカー。

請求項18

アミノ酸グリシンがアミノ酸アラニンおよび/またはプロリンに交換されており、アミノ酸セリンがアミノ酸トレオニンおよび/またはアスパラギンおよび/またはグルタミンに交換されていることを特徴とする、請求項16または17に記載のペプチドリンカー。

請求項19

凝集、特に、アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を同定するための、2単位のタンパク質ミスフォールディング疾患のモノマー間、特にA−ベータモノマー間のリンカーとしての、請求項16〜18のいずれか一つに記載のペプチドリンカーの使用。

請求項20

2つのモノマー、A−ベータ(1−42)および/またはA−ベータ(1−40)を特徴とする、請求項19に記載の、ペプチドリンカーの使用。

請求項21

請求項1〜15に記載の方法を実施するためのキットにおいて、a)凍結乾燥された、タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマー、特にA−ベータ種、b)緩衝液、c)任意選択で、凝集、特に、アミロイドベータ凝集を検出するための蛍光色素、を含み、モノマー、特に、A−ベータ種が、2単位のモノマー間、特にA−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する2単位のモノマー、特にA−ベータモノマーからなることを特徴とするキット。

技術分野

0001

本発明は、アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤同定方法に関する。

背景技術

0002

今後数十年間における人口統計学上の展開に起因し、老人性疾患を患う者の数は上昇するであろう。ここでは、特に、いわゆるアルツハイマー病(AD、アルツハイマー型認知症ラテン語:Morbus Alzheimer)を挙げたい。

0003

これまでのところ、有効成分、またはADの原因に対して効き目がある医薬品は存在しない。従来使用されている承認医薬品は、アルツハイマー型認知症において現れる症状のいくつかを和らげる。ただし、それらの医薬品は、病気の進行を遅延させること、または治癒をもたらすことはできない。動物実験において、ADの予防には成果を示したものの処置に際しては(必ずしも)成果を示さなかった物質がいくつか存在する。

0004

アルツハイマー病の特徴は、アミロイドベータペプチド(Aベータペプチド、A−ベータペプチド、Aβ、またはAβペプチド)の細胞外沈着である。A−ベータペプチドの、プラークにおける沈着は、典型的には、死後AD患者の脳内に認められる。それゆえ、A−ベータペプチドの様々な形態、例えば、原線維が疾患の発生および進行の原因とされている。さらに、数年来、自由拡散可能な小さいA−ベータオリゴマーが、ADの発生および進行の主な原因と見なされている。

0005

A−ベータオリゴマーの構成成分であるA−ベータモノマーは、人体中絶えず生じ、おそらくそれ自体は毒性ではない。しかも、モノマーが有利な機能を有するという可能性さえある。A−ベータモノマーは、その濃度に依存して偶然集合し得る。その濃度は、体内での形成速度および分解速度に依存する。年齢の増加と共に体内でのA−ベータモノマーの濃度が高まると、A−ベータオリゴマーへのモノマーの自発的な集合がますます起こりやすくなる。そのように生じたA−ベータオリゴマーは、プリオンと類似に増加し、最終的にはアルツハイマー病につながるかもしれない。

0006

従来技術から公知の物質は、きわめて様々なやり方で、A−ベータモノマーおよび/またはA−ベータオリゴマーの濃度を低下させる。例えば、動物実験において予防に使用されたガンマセクレターゼ修飾薬が公知である。

0007

動物実験において肯定的な結果を示した多数の物質の場合、人での臨床試験ではその効果を確かめることはできなかった。望ましいのは、最初のA−ベータオリゴマーの形成の阻止、つまり、一次核形成を妨げることであろう。その結果、毒性オリゴマーのいずれも形成されないかもしれない。

0008

それゆえ、非常に特異的かつ高い親和性でA−ベータオリゴマーに結合してその増加を阻止するか、または直接にその形成を阻害する有効成分および阻害剤のような新規化合物への需要が存在する。

0009

アミロイドベータ凝集の阻害剤は、原則的には、アミロイドベータペプチドに対する結合親和性をもつ分子を選択するというやり方で得られるかもしれない。例えば、免疫学的手法により抗体を、そしてディスプレイ選択法によりペプチドを選択してから、凝集に対する潜在的阻害効果に関してそれらを試験する。

0010

凝集反応に対するその効果を介して直接に阻害剤を同定することが望ましい。それは、Arosio等から公知であるように、動力学的凝集アッセイを利用して可能である(Arosio P.、Vendruscolo, M.、Dobson, C.M.、Knowles, T.P.J.(2015). Chemical kinetics for drug discovery to combat protein aggregation diseases。Trendsin Pharmacological Sciences. 35:127〜135頁(非特許文献1))。

0011

しかしながら、現在の動力学的凝集アッセイを利用した場合、Habchi等から公知であるように、一次核形成の阻害剤を特異的に同定することは、多くの時間と材料を費やさないと不可能であることが不利である(Habchi, J.、Arosio, P.、Perni, M.、Costa, A.R.、Yagi−Utsumi, M.、Joshi, P.、Chia, S.、Cohen, S.I.A.、Mueller, M.B.D.、Linse, S.、Nollen, E.A.A.、Dobson, C.M.、Knowles, T.P.J.、Vensdruscolo, V.(2016). An anticancer drug suppresses the primary nucleation reaction that initiates the production of the toxic Ab42 aggregates linked with Alzheimer’s disease. Sci. Adv. 2、e1501244:1〜13頁(非特許文献2))。

0012

それによると、個々の阻害剤候補に関して、一次核形成に対する阻害効果を検出するためには、複数のA−ベータ濃度ならびに阻害剤濃度において、通常は何時間にもわたって多数の凝集アッセイを実施してから、手間のかかる数学的なフィット法を行う必要があることが特に不利である。

0013

この従来技術によって得られた阻害剤候補の場合、特に不利なことには、A−ベータ凝集のどの反応ステップにおいて阻害剤がそもそも介入するのか不明なままである。

0014

つまり、従来技術からは、アミロイド形成は妨害するものの、その代わりに、潜在的に毒性のA−ベータオリゴマーの形成を増加させる分子が頻繁に選択されることが公知である。したがって、一次核形成を特異的に阻害する分子は、労力と時間のかかるケースバイケースの検査によってしか同定できない。

先行技術

0015

Arosio P.、Vendruscolo, M.、Dobson, C.M.、Knowles, T.P.J.(2015). Chemical kinetics for drug discovery to combat protein aggregation diseases。Trendsin Pharmacological Sciences. 35:127〜135頁
Habchi, J.、Arosio, P.、Perni, M.、Costa, A.R.、Yagi−Utsumi, M.、Joshi, P.、Chia, S.、Cohen, S.I.A.、Mueller, M.B.D.、Linse, S.、Nollen, E.A.A.、Dobson, C.M.、Knowles, T.P.J.、Vensdruscolo, V.(2016). An anticancer drug suppresses the primary nucleation reaction that initiates the production of the toxic Ab42 aggregates linked with Alzheimer’s disease. Sci. Adv. 2、e1501244:1〜13頁

発明が解決しようとする課題

0016

それゆえ、本発明の課題は、アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を明確に同定できる、より簡単かつ迅速で経済的な方法を提供することである。

0017

さらに、本発明の課題は、この方法を実施するために適切な化合物を提供すること、またはその使用を提示することである。

0018

本発明のもう1つの課題は、この方法を実施できるキットを提供することである。

課題を解決するための手段

0019

この課題は、特許請求項1による方法、ならびに従属請求項による化合物およびキット、ならびにその使用によって解決される。これに関する有利な形態は、関連する請求項からもたらされる。

0020

発明の説明
アミロイドベータ凝集の一次核形成阻害剤を同定する方法の最中、次の:
a)A−ベータ種を溶液、特に緩衝液の中に入れるステップ
b)アミロイドベータ凝集を測定するステップ
を実施する。

0021

この方法は、
c)A−ベータ種として、2単位のA−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する2単位のA−ベータモノマーを選択するステップ
を特徴とする。

0022

前記のステップは、本方法の陰性対照の枠内で実施するステップである。

0023

一次核形成と呼ばれるのは、あらゆるオリゴマーの生成である。

0024

アミロイドベータ凝集、および潜在的阻害剤の影響は、従来技術による様々なやり方、例えば、マルチウェルプレート中で検出できる。

0025

例えば、アミロイド形成を検出するための蛍光色素を、溶液または緩衝液に添加してもよい。次いで、アミロイドベータ凝集の検出として、蛍光シグナルの上昇を、例えば、いわゆるチオフラビンT試験によって測定する。

0026

以下のさらなるアミロイドベータ凝集検出方法が、特に可能である:
a.アミロイドベータ凝集体に結合するとその蛍光特性(例えば、蛍光強度蛍光偏光)が変化する色素分子を添加した後の蛍光分光法。一例は、アミロイドベータ凝集体への結合後に蛍光強度の明らかな上昇を示す色素チオフラビンTである。
b.アミロイドベータ凝集体に結合するとその蛍光特性(例えば、蛍光強度、蛍光偏光)が変化する色素で標識されたAベータ・フレキシダイマー(Flexidimer)分子を使用した蛍光分光法。
c.(ナノ粒子およびタンパク質凝集体を検出するための確立された方法である動的光散乱

0027

これらの測定は、時間に対して行う。

0028

b.の場合、特に、色素で標識されている、A−ベータ種間のペプチドリンカーを選択してもよい。

0029

リンカーは複数の利点を有する。リンカーは、対応する、リンクされていないモノマーの凝集における誘導期と比べて、アミロイドベータ凝集の誘導期を著しく短縮させ、好ましくは少なくとも50%、60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、さらには100%さえも短縮させる。

0030

したがって、本発明による方法では、有利には、リンクされたA−ベータモノマーを緩衝液に添加した直後にアミロイドベータ凝集が開始する。

0031

本方法に関すると、このことは、リンクされていないモノマーを用いる、従来技術による方法において、蛍光シグナルの増大がおよそ10hのインキュベーション時間後に起こる場合に、本発明による方法のステップc)により、この例に基づくと、誘導期がほぼ80%短縮された遅くとも2h後には、または誘導期がほぼ90%短縮された遅くとも1h後には、またはさらに短い時間の経過後に、誘導期の終了が確保されるということを意味する。

0032

本発明による方法のステップc)により、有利には、2つのA−ベータモノマーのリンクにより、A−ベータ種の局所濃度が上昇し、それゆえアミロイドベータ凝集が加速され得ることが分かった。

0033

本発明による方法のステップc)により、絶対的に見たところ、同じく有利には、リンクされていないA−ベータモノマーを溶液中で使用するアッセイと比べて、リンクされたA−ベータモノマーを使用した場合、A−ベータ種についてより少ない材料が必要であることが分かった。したがって、この方法は、より経済的である。

0034

主な利点は、誘導期の明らかな短縮であり、この誘導期においては、従来技術での誘導期とは異なり、もはやいかなる二次プロセスも一次核形成に重ならない。したがって、本発明による方法によると、アミロイドベータ凝集における一次核形成に対する、物質の阻害効果の明確な検出を提供できる。

0035

その際、ステップa)〜c)による、本発明による方法は、アミロイドベータ凝集を阻止するための、従来技術からすでに公知であるか、または仮定される、一次核形成の潜在的阻害剤の有効性を試験できる方法の陰性対照である。

0036

A−ベータ種またはA−ベータモノマーとして考慮の対象になるのは、それに限られるものではないが、特にA−ベータ(1−42)のみならずA−ベータ(1−40)、または任意の別のA−ベータ種、例えば、Pyro−Glu−Aベータ(3−40、3−42)であり、アッセイアプローチに応じて選択可能である。本方法は、すべての公知のA−ベータモノマーに対して適用できる。

0037

アルツハイマー型認知症のA−ベータモノマーおよびその凝集をこのやり方で試験するのみならず、別のタンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーをこのやり方で試験することも考えられる。その場合、それらの疾患において生じるタンパク質のモノマーを互いにリンクする。

0038

ADの場合、リンカーによってヘッドトゥーテール型または他のやり方でリンクされる2つの同一単位のA−ベータ種を選択できるが、そうでなくてもよい。つまり、様々なA−ベータ種のA−ベータモノマーを互いにリンクすることも可能であり、例えば、A−ベータ(1−40)とA−ベータ(1−42)である。

0039

ヘッドトゥーテール型(英語:head−to−tail)とは、リンカーが、好ましくは共有ペプチド結合によって、最初のA−ベータモノマー単位C末端と2番目のA−ベータモノマー単位のN末端との間に配置されていることを意味する。

0040

リンカーとしては、有利には、フレキシブル立体配座(英語:intrinsically disordered conformation(天然変性立体配座))を有するペプチドリンカーを選択できる。フレキシブルな立体配座を可能にするため、およびリンカーとA−ベータモノマー単位との相互作用を妨げるためには、リンカーが、極性、非荷電アミノ酸、例えば、セリントレオニン、および/またはアスパラギンおよび/またはグルタミンに富み、その上、小さいアミノ酸、例えば、グリシンおよび/またはアラニンおよび/またはプロリンに富んでいると有利である。特に、リンカーは、グリシンおよび/またはセリンに富むように選択可能であり、特に、もっぱらグリシンおよびセリンからなることも可能である。

0041

リンカーが凝集状態の原線維(Fibrillen)の形態には介入せず、および/またはA−ベータモノマーがダイマー中でその天然立体配座を維持することを示すために、本方法は、さらなるステップとしてNMR分光法を想定してもよい。

0042

リンカーは、特に、溶液または緩衝液中において、A−ベータ単位の本来的な不規則さ(英語:intrinsically disordered conformation(天然変性立体配座))には影響を及ぼさない。リンカーは、特に、凝集状態のアミロイド原線維の形態も変化させない。

0043

本方法、およびこのやり方でリンクされたA−ベータ単位の凝集の反応速度論は、本質的には、特に、緩衝液中のおよそ1〜50μM、好ましくは1μM、2μM、5μM、10μM、20μM〜およそ50μMというA−ベータ種の濃度における一次核形成によって特徴づけられ、このことは、A−ベータの局所濃度の上昇に起因する。その際、あらゆる中間値が可能である。

0044

つまり、リンカーにより、ペプチドの天然特性は影響されない。特に、原線維および/または凝集体の立体配座の形成に対する本来の無秩序性の特性が、リンカーによって影響されない。

0045

本方法は、リンクされたA−ベータ種の立体配座とリンクされていない単位の立体配座とを、例えば、NMR測定によって比較するステップを有してもよい。

0046

リンクされた単位が、有利には、リンクされていない単位に対するモデル物質として利用される。

0047

本方法は、リンクされたA−ベータ種が、リンクされていないA−ベータ種と同じ形態の原線維を形成すること、またはリンクされたA−ベータ種が、リンクされていないA−ベータ種と同じ形態の原線維を形成するかどうかを検査するステップを有してもよい。そのためには、例えば、原子間力顕微鏡法を実施することができる。

0048

本発明による方法は、例えば、マルチウェルマイクロタイタープレート中での、ハイスループットスクリーニングに適切である。

0049

本方法は、特に、一次核形成の反応速度論を調べるために実施する。そのためには、マイクロタイターベースのアッセイを、アミロイドベータ凝集の阻害剤を使用して、および使用せずに実施することができる。

0050

リンカーとしては、特に、配列(Glyx−Sery)n(x=1〜4、y=1およびn=1〜10)を有するペプチドリンカーが選択可能である。

0051

セリンの代わりにトレオニンおよび/またはアスパラギンおよび/またはグルタミンを選択してもよい。これらのアミノ酸は、有利には安定性を維持する。

0052

グリシンの代わりにアラニンおよび/またはプロリンを選択してもよい。

0053

経験則としては、リンクされるA−ベータ種中にあるアミノ酸数のおよそ10〜90%がリンカー中にあることが望ましい。一般的には、タンパク質ミスフォールディング疾患の場合、リンカーが、凝集を引き起こすモノマー単位のアミノ酸数のおよそ10〜90%を含むことが望ましい。A−ベータ(1−40)の場合、リンカーがおよそ4〜36個のアミノ酸を含む。特に、リンカーが、凝集を引き起こすモノマー単位のアミノ酸数の20〜80%、30〜70%または40〜60%を含む。

0054

さらなる経験則としては、特に、リンクされたA−ベータ種中にあるアミノ酸数のおよそ50%+5%がリンカー中にあることが望ましい。一般的には、タンパク質ミスフォールディング疾患の場合、リンカーが、凝集を引き起こすモノマー単位のアミノ酸数のおよそ50%±5%を含むことが望ましい。

0055

特に、配列(Gly4−Ser)4を有するペプチドリンカーが、リンカーとして実証され、ただし、別のアミノ酸での変換に関する上記の条件が当てはまり得る。

0056

これらのリンカーが、有利には、リンクされるA−ベータ種として、それらに限られるものではないが、特にA−ベータ(1−40)および/またはA−ベータ(1−42)において、アルツハイマー型認知症のアミロイドベータ凝集の誘導期を特に著しく短縮させる。

0057

リンクされたA−ベータ種を入れる濃度は、特に、およそ>2μMであることが望ましい。その場合、誘導期の短縮および一次核形成の優勢が特に顕著である。

0058

前記の方法、およびそれに伴う、誘導期の短縮によって、アミロイドベータ凝集が直ちに開始して検出可能であることが確保される。その結果、一次核形成の反応速度論に及ぼす、潜在的な有効成分候補の影響が検出可能である。

0059

A−ベータ種間、または別のタンパク質ミスフォールディング疾患のモノマー単位間にある、前記の、本発明によるリンカーは、(アミロイドベータ)凝集の誘導期を明らかに、好ましくは少なくとも80%ほど低下させる。

0060

被検物質、例えば、阻害剤を添加し、その阻害剤が、陰性対照のシグナルと比べて蛍光シグナルの高さを制限する、および/または蛍光シグナルの時間的上昇を減速させた場合に肯定的に評価される。

0061

列番号1によるペプチドである、アミノ酸配列ggggsggggsggggsggggsを有するフレキシブルなリンカーが、例示的であり特に重要であるが、なぜなら、このリンカーは、有利には、必要な特性を有するからである。このリンカーは、特に、A−ベータ(1−40)および/もしくはA−ベータ(1−42)からなる、ならびに/またはタンパク質ミスフォールディング疾患の別のモノマーからなるアミロイドベータ凝集の一次核形成に関する有効成分および阻害剤の同定において使用され、ただし、ここでも別のアミノ酸での変換性に関する上記の規則が当てはまることになる。

0062

本発明による方法を実施するためのキットは、
a)凍結乾燥されたA−ベータ種、
b)緩衝液または溶液、
c)任意選択で、アミロイド形成または凝集を検出するための蛍光色素
を含み、ここで、A−ベータ種は、2単位のA−ベータモノマー間に配置されたリンカーを有する2単位のA−ベータモノマーからなる。

0063

キットの構成要素は、使用に先立ち緩衝液または溶液に溶解すると、直ちに使用できる。

0064

リンカーは、有利には、アミロイドベータ凝集のシート構造には影響を及ぼさない。

0065

すると、従来技術を介して、ここではチオフラビン試験により、蛍光シグナルの経時的上昇の測定によってマルチウェルプレート中のアミロイドベータ凝集が、および潜在的阻害剤の影響が検出可能である。

0066

例えば、アミロイドベータ凝集を別のやり方で、例えば、上記のように、光散乱または別の方法によって検出する場合、蛍光色素を伴わないキットを提供することも可能である。

0067

A−ベータ凝集を妨害する物質、特に有効成分または阻害剤は、相応に、アルツハイマー病の治療に関して将来性のある有効成分候補であるが、なぜなら、本発明の方法によると、特に毒性のオリゴマーがまずまったく生じないからである。その意味で、本方法は、アミロイドベータ凝集の二次プロセスを時間的にスキップする。

0068

特に、凝集反応の最初のステップ、いわゆる一次核形成の阻害剤は、その際、有効成分として同じく興味深い。そのような阻害剤は、アルツハイマー型認知症に関して特に毒性のA−ベータオリゴマーの形成を潜在的に妨げる。

0069

本発明による方法を用いると、誘導期の相応する短縮により、特に簡単かつ手早いやり方で、アミロイドベータ凝集の確かな一次核形成阻害剤を同定すること、それゆえ毒性オリゴマーの形成に対する有効成分を経済的に見出すことに成功する。

0070

その際、すでに従来技術で同定されている分子、例えば、癌処置用のペプチド、抗体、有効成分、例えば、ベキサロテンを、本発明による短縮されたアッセイにおいて使用することも当然可能であり、毒性オリゴマーの形成を妨げる際のその有効性を検査することができる。それらは、陽性対照として使用できる。

0071

それに加えて、本発明の枠内では、アミロイドベータ凝集が、複数のステップからなる複雑な反応であり、その反応においては、後続の二次プロセスが、従来技術による一般的なアッセイの観察可能な反応推移を支配することが分かった。その上、それらの後続プロセスは、誘導期の最中に起こることが分かった。

0072

それに応じて、本発明によると、誘導期の短縮によって、二次プロセスではなく一次核形成が優勢である反応速度論的凝集アッセイを開発した。

0073

モノマーA−ベータの代わりに、本アッセイ、または本発明による方法、または本キットは、フレキシブルなペプチドリンカーによって2つのA−ベータモノマーが互いに結合している、「Aベータ・フレキシダイマー」という仮称の、新規開発されたダイマー構築物を用いる。そのためには、例えば、最も頻繁なA−ベータ変種の2単位、A−ベータ(1−40)を使用できる。別のA−ベータ変種、例えば、A−ベータ(1−42)または修飾バージョン、さらには短縮バージョンのダイマー、およびそれらの混合物が興味深く、それゆえ、本発明の主題である。単に例示的に、モノマーA−ベータ(1−40)を、モノマーA−ベータ(1−42)とリンクすることが可能である。

0074

比較的長いリンカーを選択することで、ダイマー構築物中のA−ベータ単位が、通常のアミロイド構造の形成において、融合された隣接物との相互作用によって邪魔されないようにし、そのことは、原子間力顕微鏡測定により確かめることができる。

0075

A−ベータモノマーと比べて、Aベータ・フレキシダイマーは、有利には、反応速度論的凝集アッセイ、この場合、本発明による方法において、改善された挙動を示す。Aベータ・フレキシダイマーは、有利には、誘導期をほぼ完全に除去することを特徴とする。これに関して、濃度は、緩衝液中において1μM〜およそ50μM、好ましくはおよそ5μMであり得る。その結果、有利には、試験方法を実施する際に明らかな時間の節約がもたらされる。その上、このやり方で、A−ベータモノマー濃度の低下と同時に、後の時点で初めてさらなる凝集に介入するのではなく確かに一次核形成を阻害する有効成分として、添加された有効成分を同定できる。

0076

これらの有利な効果は、リンカーに関する従来技術、例えば、Chen等(Chen, X.、Zaro, J.、Shen, W.−C.(2013)。Fusion protein linkers:Property, Design and Functionality。Adv Drug Deliv Rev 65(10):1357〜1369頁またはChichilli等(Chichilli, V.P.R.、Kumar, V.、Sivaram J.(2013年)。Protein Science 22:153〜167頁)からは予想できなかった。

0077

このやり方で、毒性オリゴマーの形成を阻止し、相応するタンパク質ミスフォールディング疾患に対する有効成分として考慮の対象になる阻害剤を同定する。

0078

本発明はそれに制限されるものではない。むしろ本発明は、タンパク質ミスフォールディング疾患全般のモノマーの凝集に関するさらなる方法に関し、詳細には特に、
タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーの凝集を検査するための方法であって、
a)タンパク質ミスフォールディング疾患のモノマーを溶液または緩衝液に入れるステップ、
b)モノマーの凝集を測定するステップ
を含む方法において、
モノマーとして、タンパク質ミスフォールディング疾患の際に現れるモノマーの2単位であり、これらのモノマー単位間に配置されたリンカーを有する2単位を選択するステップ
を特徴とする方法に関する。

0079

そのリンカーは、記載されたような特徴を有する。

0080

これに関しては、A−ベータモノマー、例えば、前記のA−ベータ(1−42)および/もしくはA−ベータ(1−40)ならびに/またはアルツハイマー型認知症において現れる別のモノマーも、その凝集挙動を試験できるものと解釈される。その上、別のタンパク質ミスフォールディング疾患の別のあらゆるモノマーも、開示された方法による本発明のやり方で、試験することが可能であり、ならびにそのためのキットまたはペプチドリンカーが請求され得る。

0081

以下では、本発明を、実施例および添付の図を手がかりに詳細に説明するが、それによって本発明をアミロイドベータ凝集に制限するものではない。

図面の簡単な説明

0082

本発明によるダイマーを使用した本発明による方法の反応速度論を示す図である。Aは、A−ベータモノマー、ここではA−ベータ(1−40)と対応するフレキシダイマーとの間の比較である。Bは、濃度に依存した、一次核形成と二次プロセスとの間の移行である。
A−ベータ(1−40)アミロイド形成とフレキシダイマーからなる原線維形成との間のモデル比較の図である。

実施例

0083

マイクロタイタープレートに、緩衝液、例えば20μMリン酸ナトリウム、pH7.4、50μMNaCl中に溶かしたAベータ・フレキシダイマーの25μM溶液を入れる。アミロイド形成を検出するための色素、例えば、チオフラビンTを添加する。

0084

A−ベータモノマー・フレキシダイマーが誘導期の短縮に及ぼす影響を図1に示す。

0085

Aでは、x軸に時間(h)をプロットし、y軸には、凝集の尺度として蛍光強度をプロットしてある。Aベータ・フレキシダイマーの凝集は、初期濃度>1μMにおいて、凝集アッセイの開始直後に、遅延時間なしに検出可能である(図1A、白抜きひし形0.9μM、塗りつぶしひし形1.3μM、白抜き三角1.9μM、塗りつぶし三角2.7μM、白抜き丸3.9μM、塗りつぶし丸5.5μM、白抜き四角8μM、塗りつぶし四角11μM)。

0086

この挙動は、Aベータ・フレキシダイマー濃度>2μMにおける、優勢な二次プロセスから優勢な一次核形成への移行と一致する(図1B)。図1Bには、フレキシダイマー濃度(μM)に対するt1/2(時間)の二重対数プロットを示す。およそ3μMの濃度からは、Aベータ・フレキシダイマーのアミロイドベータ凝集において、一次核形成が優勢なプロセスである。およそ−0.3の勾配が二次プロセスの優勢を示し、およそ−3の勾配が一次核形成の優勢を示す。

0087

図2は、原子間力顕微鏡法により、フレキシダイマーが、A−ベータモノマー、ここではA−ベータ(1−40)の場合と同じ形態の原線維を形成することを示す。

0088

阻害剤候補は、個々のウェルに添加する。マイクロタイタープレートを37℃において蛍光レーザ中でインキュベートし、数分の間に、一定間隔で蛍光を測定する。

0089

蛍光シグナルの時間的上昇を阻むか減速させるということにより、阻害剤を同定する(表示せず)。

0090

さらなる実施例
1.マイクロタイタープレートに、緩衝液、例えば20μMリン酸ナトリウム、pH7.4、50μMNaCl中に溶かしたAベータ・フレキシダイマーの25μM溶液を入れる。アミロイド形成を検出するための色素、例えば、チオフラビンTを添加する。阻害剤の不在下および存在下において、蛍光レーザを使用して、蛍光強度を測定する。

0091

2.蛍光偏光の上昇によりアミロイドベータ凝集を示す適切な色素分子で、Aベータ・フレキシダイマーを標識する。マイクロタイタープレートに、緩衝液、例えば20μMリン酸ナトリウム、pH7.4、50μMNaCl中に溶かした標識Aベータ・フレキシダイマーの25μM溶液を入れる。阻害剤の不在下および存在下において、蛍光レーザを使用して、蛍光偏光を測定する。

0092

3.マイクロタイタープレートに、緩衝液、例えば20μMリン酸ナトリウム、pH7.4、50μMNaCl中に溶かしたAベータ・フレキシダイマーの25μM溶液を入れる。阻害剤の不在下および存在下において、光散乱検出器を使用して、光散乱を測定する。

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