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技術 免疫細胞機能を促進するための方法および組成物

出願人 トルクセラピューティクス,インコーポレイテッド
発明者 プッチ,フェルディナンドアンドレセン,トマスラルスジョーンズ,ダグラススコットニールセン,ウルリックラケストロウ,ジェイムズアンドリュー
出願日 2017年6月13日 (3年6ヶ月経過) 出願番号 2018-566437
公開日 2019年6月27日 (1年5ヶ月経過) 公開番号 2019-518067
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 単一タイプ 凍結器 最大拡大 融解直後 マイナス効果 一致位置 密度クッション 融解中
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図面 (20)

課題・解決手段

本開示は、少なくとも部分的には、例えば、有核細胞凍結および/または融解する1回またはそれより多くのサイクル後に、細胞機能、例えば免疫細胞機能を保存するための方法を特徴とする。実施形態では、前記方法は、免疫細胞と、IL−15複合体を含むタンパク質ナノ粒子とを接触させる工程を含む。本開示は、少なくとも部分的には、少なくとも1つの保存された機能を有する(例えば、保存された生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを有する)有核細胞、例えば、免疫細胞を(例えば、エクスビボで)生産するための最適化された方法および組成物を特徴とする。

概要

背景

発明の背景
免疫細胞療法、例えば養子細胞療法(ACT)は、被験体から免疫細胞収集する工程、細胞を拡大する(expand)工程、および細胞を同じ被験体または異なる被験体に再導入する工程を含む。例えば、ドナー由来エクスビボで拡大したヒト細胞傷害性Tリンパ球(CTL)のACTは、がん処置するための有望なアプローチとして登場した。ACTの例としては、培養された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、単離および拡大されたT細胞クローン、ならびに従来のT細胞受容体またはキメラ抗原受容体発現する遺伝子操作リンパ球(例えば、T細胞)が挙げられる。遺伝子操作リンパ球は、特定の抗原を発現するがん細胞を排除するように設計されており、拡大されて患者送達される。ACTは、患者における腫瘍細胞の減少をもたらす腫瘍特異的リンパ球(例えば、T細胞)を提供し得る。

免疫細胞ベース治療の重要な制限は、特に凍結融解処理後、エクスビボにおける免疫細胞の生存能力(viability)および機能の急速な低下である。免疫細胞の単離、保存、凍結融解および/または拡大のための既存のプロトコールの制限は依然として残っている。したがって、例えば同じまたは異なる被験体への再導入前に、被験体由来の免疫細胞の機能を保存する、例えば最適化する必要性が存在する。

概要

本開示は、少なくとも部分的には、例えば、有核細胞を凍結および/または融解する1回またはそれより多くのサイクル後に、細胞機能、例えば免疫細胞機能を保存するための方法を特徴とする。実施形態では、前記方法は、免疫細胞と、IL−15複合体を含むタンパク質ナノ粒子とを接触させる工程を含む。本開示は、少なくとも部分的には、少なくとも1つの保存された機能を有する(例えば、保存された生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを有する)有核細胞、例えば、免疫細胞を(例えば、エクスビボで)生産するための最適化された方法および組成物を特徴とする。

目的

いくつかの態様では、本開示は、有核細胞と、少なくとも1つの保存剤、例えば本明細書に記載される保存剤とを含む組成物を提供する

効果

実績

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請求項1

有核細胞と、少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、(a)前記組成物の少なくとも一部は凍結されており、(b)前記保存剤はサイトカイン分子または共刺激分子を含み、(c)(i)前記サイトカイン分子は、IL15、IL2、IL6、IL7、IL12、IL17、IL18、IL21、IL−23、IL−4、IL1アルファ、IL1ベータ、IL−5、IFNガンマ、TNFa、IFNアルファ、IFNベータ、GMCSFもしくはGCSFから選択される;かつ/または(ii)前記共刺激分子は、OX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、もしくはCD137のアゴニストから選択される、組成物。

請求項2

前記組成物が融解されると、前記保存剤が、前記ナノ粒子の非存在下における有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを改善する、請求項1に記載の組成物。

請求項3

複数の保存剤が互いに共有結合的に連結されており、前記ナノ粒子が、その表面にカチオン性ポリマーを場合によりさらに含む、請求項1または2に記載の組成物。

請求項4

前記有核細胞がNK細胞またはT細胞である、請求項1または2に記載の組成物。

請求項5

有核細胞と、少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、(a)前記組成物の少なくとも一部は凍結されており;(b)前記保存剤は、配列番号7または配列番号8のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む第1のドメイン;および場合により、抗体分子またはFcドメインを含む第2の異種ドメインを含むポリペプチド複合体化されたIL−15分子複合体を含む、組成物。

請求項6

前記組成物が融解されると、前記保存剤が、前記ナノ粒子の非存在下における有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを改善する、請求項5に記載の組成物。

請求項7

前記Fcドメインが野生型であるかもしくは変異されているか、または前記Fcドメインが配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列を含む、請求項5または6に記載の組成物。

請求項8

有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを保存または増強する少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、前記組成物は凍結されており、前記組成物が融解されると、前記ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを改善し、前記保存剤はサイトカイン分子または共刺激分子を含み、(i)前記サイトカイン分子は、IL15、IL2、IL6、IL7、IL12、IL17、IL18、IL21、IL−23、IL−4、IL1アルファ、IL1ベータ、IL−5、IFNガンマ、TNFa、IFNアルファ、IFNベータ、GM−CSFもしくはGCSFから選択されるか;または(ii)前記共刺激分子は、OX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、もしくはCD137のアゴニストから選択される、組成物。

請求項9

有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを保存または増強する少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、前記組成物の凍結調製物が融解されると、前記保存剤は、前記ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、前記有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを保存または増強し、前記保存剤は、配列番号7もしくは配列番号8のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む第1のドメイン;ならびに場合により、抗体分子およびFcドメインを含む第2の異種ドメインを含むポリペプチドと複合体化したIL−15分子を含み;場合により、前記組成物の少なくとも一部は凍結されている、組成物。

請求項10

複合体した前記IL−15分子が、前記ポリペプチドと共有結合的または非共有結合的会合している、請求項9に記載の組成物。

請求項11

前記抗体分子が、Fab断片Fab2断片、scFv、重鎖抗体断片、アフィボディ断片もしくは誘導体またはsdAb(ナノボディ)断片を含む、請求項9に記載の組成物。

請求項12

融解されると、前記保存剤が前記ナノ粒子から放出される、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項13

IL−15受容体またはそのIL−15結合断片を含むポリペプチドと複合体化したIL−15分子を含むIL−15複合体を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項14

前記IL−15分子が変異体IL−15ポリペプチドを含む、請求項5、9または13に記載の組成物。

請求項15

前記変異体IL−15ポリペプチドが、1つまたはそれより多くのアミノ酸置換を有するヒトIL−15ポリペプチドを含む、請求項14に記載の組成物。

請求項16

前記ヒトIL−15ポリペプチドが72位の置換を有する、請求項15に記載の組成物。

請求項17

72位の前記置換が、NからDへの置換である、請求項16に記載の組成物。

請求項18

前記IL−15分子が、配列番号6のポリペプチド、あるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列である、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項19

IL−15受容体またはその断片を含む前記ポリペプチドが、配列番号5のポリペプチド、あるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項20

前記IL−15受容体またはその断片を含む前記ポリペプチドが、配列番号7または配列番号8のポリペプチドと、エフェクター弱体化Fcドメインを含む第2の異種ドメインとを含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項21

前記エフェクター弱体化FcドメインがヒトIgG2Fcドメインを含む、請求項20に記載の組成物。

請求項22

前記ヒトIgG2Fcドメインが、配列番号11のポリペプチドあるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項21に記載の組成物。

請求項23

融解されると、インターフェロンガンマの産生増加をもたらす、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項24

前記ナノ粒子からの保存剤の放出が、1時間〜3週間、例えば1時間〜24時間、1日間〜3日間、4日間〜6日間、1週間〜2週間または2週間〜3週間にわたって起こる、請求項12〜23のいずれかに記載の組成物。

請求項25

前記有核細胞が免疫エフェクター細胞または造血幹細胞である、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項26

前記有核細胞がリンパ球、T細胞、B細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞である、請求項25に記載の組成物。

請求項27

前記ナノ粒子が、前記有核細胞に対する静電引力によって細胞表面と会合している、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項28

前記ナノ粒子が少なくとも1つのリガンドを含み、前記リガンドが、前記有核細胞の表面上のタンパク質炭水化物または脂質に対する親和性を有する、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項29

前記ナノ粒子が、前記有核細胞の表面と共有結合的にコンジュゲートしているか、または共有結合的にコンジュゲートしていない、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項30

前記ナノ粒子が、リポソーム、タンパク質ナノゲルヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項31

前記ナノ粒子がタンパク質ナノゲルを含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項32

前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子表面上に少なくとも1つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項33

前記ナノ粒子が、PEGとポリリジンとを含むカチオン性ブロックコポリマーを含む、請求項32に記載の組成物。

請求項34

前記PEGが、約1〜10、2〜8、4〜6または約5kDの分子量を有するPEGである、請求項33に記載の組成物。

請求項35

前記ポリリジンが、10〜50、20〜40または約30アミノ酸平均長を有する、請求項33または34に記載の組成物。

請求項36

溶液中もしくは細胞表面上で前記ナノ粒子を安定化し、かつ/または前記ナノ粒子と前記有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項37

前記化合物が、プロタミンキトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン天然ポリマーポリサッカライド、デキストラマー、セルロースフィブロネクチンコラーゲンフィブリンまたはプロテオグリカンを含む、請求項36に記載の組成物。

請求項38

サイトカイン分子を含む第2の保存剤を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項39

前記サイトカイン分子が、IL2、IL6、IL7、IL12、IL15、IL17、IL18、IL21、IL−23、IL−4、IL1アルファ、IL1ベータ、IL−5、IFNガンマ、TNFa、IFNアルファ、IFNベータ、GM−CSF、またはGCSF、またはそれらのバリアントを含む、請求項38に記載の組成物。

請求項40

前記バリアントがスーパーアゴニストである、請求項39に記載の組成物。

請求項41

前記ナノ粒子が、CD45、CD11a(インテグリンアルファ−L)、CD18(インテグリンベータ−2)、CD11b、CD11c、CD25、CD8、またはCD4に対する抗体分子を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項42

配列番号6のポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;配列番号5のポリペプチド、あるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および場合により、CD45に対する抗体分子を含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項43

前記ナノ粒子が、レドックス、pHまたは酵素に対して感受性の可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む、上記請求項のいずれかに記載の組成物。

請求項44

レドックスに対して感受性の前記リンカーがジスルフィド基を含む、請求項43に記載の組成物。

請求項45

pHに対して感受性の前記リンカーが加水分解性基を含む、請求項43に記載の組成物。

請求項46

前記酵素がプロテアーゼである、請求項43に記載の組成物。

請求項47

有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを増強するための方法であって、前記有核細胞と、少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを接触させる工程;前記接触させた有核細胞を少なくとも1回の凍結融解サイクルに供する工程を含み、前記保存剤はサイトカイン分子または共刺激分子を含み、(i)前記サイトカイン分子は、IL15、IL2、IL6、IL7、IL12、IL17、IL18、IL21、IL−23、IL−4、IL1アルファ、IL1ベータ、IL−5、IFNガンマ、TNFa、IFNアルファ、IFNベータ、GM−CSFもしくはGCSFから選択されるか;または(ii)前記共刺激分子は、OX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、もしくはCD137のアゴニストから選択される、方法。

請求項48

有核細胞の凍結組成物を作製する方法であって、有核細胞と、少なくとも1つの保存剤を含む複数のナノ粒子とを含む非凍結組成物を提供する工程、および前記組成物が凍結するのに十分に前記組成物の温度を低下させ、それにより、有核細胞の組成物を凍結する工程を含み、前記保存剤はサイトカイン分子または共刺激分子を含み、(i)前記サイトカイン分子は、IL15、IL2、IL6、IL7、IL12、IL17、IL18、IL21、IL−23、IL−4、IL1アルファ、IL1ベータ、IL−5、IFNガンマ、TNFa、IFNアルファ、IFNベータ、GM−CSFもしくはGCSFから選択されるか;または(ii)前記共刺激分子は、OX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、もしくはCD137のアゴニストから選択される、方法。

請求項49

前記組成物の温度を0℃未満または−10℃未満に低下させる、請求項48に記載の方法。

請求項50

提供する工程が、別のエンティティから前記ナノ粒子を受け取ること、および前記ナノ粒子と前記有核細胞とを組み合わせることを含む、請求項47〜49のいずれかに記載の方法。

請求項51

提供する工程が、別のエンティティから有核細胞の前記非凍結組成物を受け取ることを含む、請求項47〜50のいずれかに記載の方法。

請求項52

有核細胞の前記凍結組成物を別のエンティティに提供または放出する工程を含む、請求項47〜51のいずれかに記載の方法。

請求項53

前記エンティティがヘルスケアプロバイダである、請求項52に記載の方法。

請求項54

前記ヘルスケアプロバイダが病院診療所または医院である、請求項53に記載の方法。

請求項55

有核細胞の前記凍結組成物を融解して、有核細胞の融解組成物を提供する工程を含む、請求項47〜54のいずれかに記載の方法。

請求項56

前記保存剤が、IL−15ポリペプチド受容体アルファ断片、および場合により、抗体分子またはFcドメインを含む第2の異種ドメインを含む、請求項47〜55のいずれかに記載の方法。

請求項57

前記抗体分子が、Fab断片、Fab2断片、scFv、重鎖抗体断片、アフィボディ断片もしくは誘導体またはsdAb(ナノボディ)断片を含む、請求項56に記載の方法。

請求項58

インターフェロンガンマ産生を促進する、請求項47〜57のいずれかに記載の方法。

請求項59

インターフェロンガンマ産生によって活性化を測定する、請求項58に記載の方法。

請求項60

前記ナノ粒子からの保存剤の放出が、1時間〜3週間、例えば1時間〜24時間、1日間〜3日間、4日間〜6日間、1週間〜2週間または2週間〜3週間にわたって起こる、請求項47〜59のいずれかに記載の方法。

請求項61

ナノ粒子が、前記有核細胞の表面と会合または共有結合的にコンジュゲートしている、請求項47〜60のいずれかに記載の方法。

請求項62

前記有核細胞が免疫エフェクター細胞または造血幹細胞である、請求項47〜61のいずれかに記載の方法。

請求項63

前記有核細胞がリンパ球、T細胞、B細胞またはNK細胞である、請求項62に記載の方法。

請求項64

前記有核細胞がT細胞またはNK細胞である、請求項63に記載の方法。

請求項65

前記ナノ粒子が、前記有核細胞に対する静電引力によって細胞表面と会合している、請求項47〜64のいずれかに記載の方法。

請求項66

前記ナノ粒子が少なくとも1つのリガンドを含み、前記リガンドが、前記有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する、請求項47〜65のいずれかに記載の方法。

請求項67

前記ナノ粒子が、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む、請求項47〜66のいずれかに記載の方法。

請求項68

前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子表面上に少なくとも1つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む、請求項47〜67のいずれかに記載の方法。

請求項69

前記ナノ粒子が、PEGとポリリジンとを含むカチオン性ブロックコポリマーを含む、請求項68に記載の方法。

請求項70

前記PEGが、約1〜10、2〜8、4〜6または約5kDの分子量を有するPEGである、請求項69に記載の方法。

請求項71

前記ポリリジンが、10〜50、20〜40または約30アミノ酸の平均長を有する、請求項69または70に記載の方法。

請求項72

前記組成物が、溶液中もしくは細胞表面上で前記ナノ粒子を安定化し、かつ/または前記ナノ粒子と前記有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物を含む、請求項47〜71のいずれかに記載の方法。

請求項73

前記化合物が、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンを含む、請求項72に記載の方法。

請求項74

前記保存剤が、配列番号7または配列番号8のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む第1のドメイン;および場合により、抗体分子またはFcドメインを含む第2の異種ドメインを含むポリペプチドと、例えば、共有結合的または非共有結合的に複合体化したIL−15分子を含む、実施形態47〜73のいずれかに記載の方法。

請求項75

前記組成物が、CD45、CD11a(インテグリンアルファ−L)、CD18(インテグリンベータ−2)、CD11b、CD11c、CD25、CD8、またはCD4に対する抗体分子を含む、請求項47〜74のいずれかに記載の方法。

請求項76

前記ナノゲルが80重量%超のタンパク質であり、かつ/または前記タンパク質が、分解されるとネイティブ形態の前記タンパク質を放出する架橋分子によって架橋されている、請求項47〜75のいずれかに記載の方法。

請求項77

前記ナノ粒子が、レドックス、pHまたは酵素に対して感受性の可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む、請求項47〜77のいずれかに記載の方法。

請求項78

前記ナノ粒子が、配列番号6のポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;配列番号5のポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および場合により、CD45に対する抗体分子を含む、請求項47〜77のいずれかに記載の方法。

請求項79

有核細胞の融解組成物を作製する方法であって、有核細胞と、少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを含む凍結組成物を提供する工程;および有核細胞の前記凍結組成物を融解するのに十分に有核細胞の前記凍結組成物を加温し、それにより、有核細胞の融解組成物を作製する工程を含み、前記保存剤はサイトカイン分子または共刺激分子を含み、(i)前記サイトカイン分子は、IL15、IL2、IL6、IL7、IL12、IL17、IL18、IL21、IL−23、IL−4、IL1アルファ、IL1ベータ、IL−5、IFNガンマ、TNFa、IFNアルファ、IFNベータ、GM−CSFもしくはGCSFから選択されるか;または(ii)前記共刺激分子は、OX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、もしくはCD137のアゴニストから選択される、方法。

請求項80

提供する工程が、別のエンティティから前記凍結組成物を受け取ることを含む、請求項79に記載の方法。

請求項81

前記エンティティが、有核細胞の前記組成物を作製および/または凍結するエンティティである、請求項80に記載の方法。

請求項82

提供する工程が、前記有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせることを含む、請求項79に記載の方法。

請求項83

提供する工程が、別のエンティティから前記ナノ粒子を受け取ること、および前記ナノ粒子を前記有核細胞および前記緩衝化水性媒体溶液と組み合わせることを含む、請求項82に記載の方法。

請求項84

有核細胞の前記凍結組成物を加温する前に、有核細胞の前記凍結組成物を少なくとも1時間凍結したままに維持することを含む、請求項79〜83のいずれかに記載の方法。

請求項85

前記保存剤が、配列番号7または配列番号8のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む第1のドメイン;および場合により、抗体分子またはFcドメインを含む第2の異種ドメインを含むポリペプチドと複合体化されたIL−15分子を含む、請求項79〜84のいずれかに記載の方法。

請求項86

前記抗体分子が、Fab断片、Fab2断片、scFv、重鎖抗体断片、アフィボディ断片または誘導体、またはsdAb(ナノボディ)断片を含む、請求項85に記載の方法。

請求項87

前記ナノ粒子が、配列番号6のポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;配列番号5のポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および場合により、CD45に対する抗体分子を含む、請求項79〜86のいずれかに記載の方法。

請求項88

前記ナノ粒子からの保存剤の放出が、1時間〜3週間、例えば1時間〜24時間、1日間〜3日間、4日間〜6日間、1週間〜2週間または2週間〜3週間にわたって起こる、請求項79〜87のいずれかに記載の方法。

請求項89

前記有核細胞が免疫エフェクター細胞または造血幹細胞である、請求項79〜88のいずれかに記載の方法。

請求項90

前記有核細胞がリンパ球、T細胞、B細胞またはNK細胞である、請求項89に記載の方法。

請求項91

前記有核細胞がT細胞またはNK細胞である、請求項90に記載の方法。

請求項92

前記ナノ粒子が、前記有核細胞に対する静電引力によって細胞表面と会合している、請求項79〜91のいずれかに記載の方法。

請求項93

前記ナノ粒子が少なくとも1つのリガンドを含み、前記リガンドが、前記有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する、請求項79〜92のいずれかに記載の方法。

請求項94

前記ナノ粒子が、前記有核細胞の表面と共有結合的にコンジュゲートしているか、または共有結合的にコンジュゲートしていない、請求項79〜93のいずれかに記載の方法。

請求項95

前記ナノ粒子が、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む、請求項79〜94のいずれかに記載の方法。

請求項96

前記ナノ粒子が、場合により、前記ナノ粒子表面上に少なくとも1つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む、請求項79〜95のいずれかに記載の方法。

請求項97

前記ナノ粒子が、PEGとポリリジンとを含むカチオン性ブロックコポリマーを含む、請求項96に記載の方法。

請求項98

前記PEGが、約1〜10、2〜8、4〜6または約5kDの分子量を有するPEGである、請求項97に記載の方法。

請求項99

前記ポリリジンが、10〜50、20〜40または約30アミノ酸の平均長を有する、請求項97または98に記載の方法。

請求項100

前記保存剤が、配列番号7または配列番号8のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む第1のドメイン;および場合により、抗体分子またはFc断片を含む第2の異種ドメインを含むポリペプチドと複合体化されたIL−15分子を含む、請求項79〜99のいずれかに記載の方法。

請求項101

前記抗体分子が、Fab断片、Fab2断片、scFv、重鎖抗体断片、アフィボディ断片または誘導体、またはsdAb(ナノボディ)断片を含む、請求項100に記載の方法。

請求項102

前記組成物が、CD45、CD11a(インテグリンアルファ−L)、CD18(インテグリンベータ−2)、CD11b、CD11c、CD25、CD8、またはCD4に対する抗体分子を含む、請求項79〜101のいずれかに記載の方法。

請求項103

前記ナノゲルが80重量%超のタンパク質であり、かつ/または前記タンパク質が、分解されるとネイティブ形態の前記タンパク質を放出する架橋分子によって架橋されている、請求項79〜102のいずれかに記載の方法。

請求項104

前記ナノ粒子が、レドックス、pHまたは酵素に対して感受性の可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む、請求項79〜103のいずれかに記載の方法。

技術分野

0001

関連出願
本出願は、2016年6月13日に出願された米国出願第62/349,473号に対する優先権を主張し、その内容全体が本明細書に援用される。

背景技術

0002

発明の背景
免疫細胞療法、例えば養子細胞療法(ACT)は、被験体から免疫細胞収集する工程、細胞を拡大する(expand)工程、および細胞を同じ被験体または異なる被験体に再導入する工程を含む。例えば、ドナー由来エクスビボで拡大したヒト細胞傷害性Tリンパ球(CTL)のACTは、がん処置するための有望なアプローチとして登場した。ACTの例としては、培養された腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、単離および拡大されたT細胞クローン、ならびに従来のT細胞受容体またはキメラ抗原受容体発現する遺伝子操作リンパ球(例えば、T細胞)が挙げられる。遺伝子操作リンパ球は、特定の抗原を発現するがん細胞を排除するように設計されており、拡大されて患者送達される。ACTは、患者における腫瘍細胞の減少をもたらす腫瘍特異的リンパ球(例えば、T細胞)を提供し得る。

0003

免疫細胞ベース治療の重要な制限は、特に凍結融解処理後、エクスビボにおける免疫細胞の生存能力(viability)および機能の急速な低下である。免疫細胞の単離、保存、凍結融解および/または拡大のための既存のプロトコールの制限は依然として残っている。したがって、例えば同じまたは異なる被験体への再導入前に、被験体由来の免疫細胞の機能を保存する、例えば最適化する必要性が存在する。

課題を解決するための手段

0004

本開示は、少なくとも部分的には、少なくとも1つの保存された機能を有する(例えば、保存された生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを有する)有核細胞、例えば、免疫細胞を(例えば、エクスビボで)生産するための最適化された方法および組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、例えば、有核細胞の凍結および/または融解の1回またはそれより多くのサイクル後に、細胞機能、例えば免疫細胞機能を保存するための方法が本明細書に開示される。実施形態では、有核細胞、例えば免疫細胞と、保存剤を含む粒子、例えばナノ粒子、例えばタンパク質(例えば、本明細書に記載されるタンパク質ナノゲル)を含むナノ粒子とを接触させることによって、有核細胞の凍結組成物を調製および/または融解する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、接触工程は、エクスビボで行われる。特定の実施形態では、免疫細胞は、被験体から得られた免疫細胞の集団である。実施形態では、ナノ粒子中の前記タンパク質は、1つまたはそれより多くの(例えば、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれより多くの)治療用タンパク質、例えばサイトカイン分子(例えば、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、IL−18、IL−21、IL−23、IL−4、IL−1アルファ、IL−1ベータ、IL−5、IFNガンマ、TNFアルファ(TNFa)、IFNアルファ、IFNベータ、GMCSFまたはGCSF)(そのバリアント形態、例えば変異体を含む);ポリペプチドと共にサイトカイン分子を含む複合体、例えばサイトカイン受容体複合体;その融合形態またはアゴニスト形態);成長因子;および他の分子、例えば共刺激分子に対する抗体分子またはアゴニストリガンドから選択され得、例えば、共刺激分子は、OX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、もしくはCD137のアゴニストから選択される。

0005

実施形態では、保存剤、例えば治療用タンパク質は、例えば、分解性リンカー(例えば、ジスルフィドリンカー)によって、ナノ粒子に共有結合的にカップリングされる、例えば架橋される。いくつかの実施形態では、保存剤は、依然として生物学的に活性であり、例えば、少なくとも1回の凍結融解サイクルおよびナノ粒子からの放出後に、保存剤としてのその機能を維持する。ナノ粒子処置有核細胞は、未処置有核細胞と比較して、凍結融解サイクル後に、有意に増加した機能、例えば生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを示し得る。したがって、本明細書に開示される方法および組成物は、細胞療法、例えば免疫療法のための優位な利益を提供し得る。

0006

したがって、一態様では、本発明は、有核細胞と、少なくとも1つの保存剤、例えば本明細書に記載される保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物(本明細書では「有核細胞−ナノ粒子複合体」とも称される)を特徴とする。いくつかの態様では、本開示は、有核細胞と、少なくとも1つの保存剤、例えば本明細書に記載される保存剤とを含む組成物を提供する。一実施形態では、組成物の少なくとも一部は、凍結されている。

0007

他の態様では、本開示は、有核細胞の凍結組成物を作製する方法を提供する。前記方法は、a)本明細書に記載される有核細胞の非凍結組成物、例えば、有核細胞と、少なくとも1つの保存剤、例えば本明細書に記載される保存剤を含むナノ粒子とを含む有核細胞の組成物を提供する工程、およびb)前記組成物が凍結するのに十分に前記組成物の温度を低下させ、それにより、有核細胞の前記組成物を凍結する工程を含む。

0008

いくつかの態様では、本開示は、有核細胞の融解組成物を作製する方法であって、
a)有核細胞と、少なくとも1つの保存剤、例えば本明細書に記載の保存剤を含むナノ粒子とを含む有核細胞の凍結組成物を提供する工程;およびb)有核細胞の凍結組成物を融解するのに十分に有核細胞の凍結組成物を加温し、それにより、有核細胞の融解組成物を作製する工程を含む方法を提供とする。

0009

他の態様では、本開示は、a)保存剤、例えば本明細書に記載されるIL−15複合体と、b)10〜150、20〜100、20〜80、20〜60、20〜40または約30アミノ酸平均長を有するポリリジンとを含み、c)場合により、PEG分子、例えば約1〜10、2〜8、4〜6または約5kDの分子量を有するPEG分子をさらに含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ポリリジンおよびPEGは、ブロックコポリマーを形成する。いくつかの実施形態では、ポリリジンは、保存剤にカップリングされる、例えば(例えば、静電気力によって)共有結合的または非共有結合的にカップリングされる。いくつかの実施形態では、保存剤は、タンパク質ナノゲルを形成する。

0010

いくつかの態様では、本開示は、有核細胞と、少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、
(a)組成物の少なくとも一部は凍結されており、
(b)保存剤はサイトカイン分子または共刺激分子を含み、
(c)
(i)サイトカイン分子は、IL15、IL2、IL6、IL7、IL12、IL17、IL18、IL21、IL−23、IL−4、IL1アルファ、IL1ベータ、IL−5、IFNガンマ、TNFa、IFNアルファ、IFNベータ、GM−CSFもしくはGCSFから選択されるか;または
(ii)共刺激分子は、OX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、もしくはCD137のアゴニストから選択される、組成物を提供する。

0011

いくつかの態様では、本開示は、有核細胞と、少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、
(a)組成物の少なくとも一部は凍結されており;
(b)保存剤は、
列番号7または配列番号8のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む第1のドメイン;および
場合により、抗体分子またはFcドメインを含む第2の異種ドメイン
を含むポリペプチドと複合体化されたIL−15分子複合体を含む、組成物を提供する。

0012

実施形態では、組成物が融解されると、保存剤は、ナノ粒子の非存在下における有核細胞と比較して、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを改善する。

0013

ある実施形態では、Fcドメインは、野生型であるか、または変異されている。ある実施形態では、Fcドメインは、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列を含む。

0014

いくつかの態様では、本開示は、sushiドメイン(例えば、配列番号7または配列番号8のもの)を含むIL−15受容体もしくはその断片およびエフェクター弱体化Fcドメイン、例えば、ヒトIgG2 Fcドメイン、例えば、配列番号11のヒトIgG2ドメイン、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む第2の異種ドメインを含むポリペプチドを含むナノ粒子を提供する。

0015

以下の態様および実施形態は、上記方法および組成物を含む本明細書の任意の態様および実施形態と組み合わされ得る。

0016

実施形態では、保存剤は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である。実施形態では、保存剤は、免疫刺激性サイトカイン、例えば、一般的なγ鎖または4つのα−ヘリックスバンドルファミリーに属するサイトカインである。

0017

実施形態では、組成物、例えばナノ粒子および/または保存剤は、ポリペプチド、例えばIL−15受容体またはそのIL−15結合断片と例えば共有結合的または非共有結合的に複合体化したIL−15分子を含むIL−15複合体を含む。

0018

一実施形態では、ポリペプチドは、IL−15受容体アルファまたはIL−15結合断片、例えば、そのIL−15結合ドメインを含む。一実施形態では、ポリペプチドは、IL−15受容体アルファの細胞外ドメインを含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列(全長野生型IL−15受容体アルファ)、またはそのIL−15結合断片;あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列(野生型IL−15受容体アルファの細胞外ドメイン(ECD))、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列(IL−15受容体アルファアイソフォームCRA_dのECD)、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む。

0019

別の実施形態では、ポリペプチドは、
配列番号2、配列番号3のアミノ酸配列、または配列番号4、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む第1のドメイン;および
場合により、第2の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンFcドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、Fab断片FAB2断片、またはアフィボディ断片または誘導体、例えば、sdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む。一実施形態では、第2の異種ドメインは、FcドメインもしくはFabである。

0020

別の実施形態では、ポリペプチドは、
配列番号7または配列番号8のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む第1のドメイン;および
場合により、第2の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンFcドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、Fab断片、FAB2断片、またはアフィボディ断片または誘導体、例えば、sdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む。一実施形態では、第2の異種ドメインは、FcドメインもしくはFabである。

0021

ある実施形態では、組成物、例えば、ナノ粒子および/または保存剤、IL−15複合体を含み、前記IL−15複合体は、IL−15受容体もしくはそのIL−15結合断片を含むポリペプチドと、例えば、共有結合的または非共有結合的に複合体化したIL−15分子を含む。ある実施形態では、IL−15分子は、IL−15変異体、例えば、1つもしくはそれより多くのアミノ酸置換を有するヒトIL−15ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、IL−15分子は、72位における置換、例えば、NからDへの置換を含む。一実施形態では、IL−15分子は、配列番号6のIL−15N72DポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列である。ある実施形態では、IL−15受容体またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号5のsushi−FcポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、IL−15受容体またはその断片を含むポリペプチドは、sushiドメイン(例えば、配列番号7または配列番号8のもの)およびエフェクター弱体化Fcドメイン、例えば、ヒトIgG2 Fcドメイン、例えば、配列番号11のヒトIgG2ドメインあるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む第2の異種ドメインを含む。

0022

実施形態では、組成物は、緩衝液をさらに含む。実施形態では、組成物は、水性媒体をさらに含む。

0023

実施形態では、凍結組成物が融解されると、保存剤、例えばIL−15複合体は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する。実施形態では、生存能力の促進は、例えばアクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウムで染色することによって、例えば実施例32のアッセイによって測定した場合に、ナノ粒子を含まない以外は同様の有核細胞と比較して、生存能力を少なくとも1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍または5倍増加させることを含む。実施形態では、増殖の促進は、例えば第1および第2の時点で生細胞カウントすることによって、例えば実施例33のアッセイによって測定した場合に、ナノ粒子を含まない以外は同様の有核細胞と比較して、増殖を少なくとも1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍または5倍増加させることを含む。実施形態では、細胞傷害活性の促進は、例えばがん細胞株、例えばDaudi細胞に対する細胞傷害活性のアッセイ、例えば実施例28のアッセイにおいて、ナノ粒子を含まない以外は同様の有核細胞と比較して、細胞傷害活性を少なくとも1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍または5倍増加させることを含む。実施形態では、活性化の促進は、例えばCD45RAに対する抗体を使用したフローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例26のアッセイにおいて、ナノ粒子を含まない以外は同様の有核細胞と比較して、活性化を少なくとも1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍または5倍増加させることを含む。

0024

実施形態では、保存剤、例えばIL−15複合体は、ナノ粒子から放出される。実施形態では、融解されると、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化は、参照、例えば有核細胞を含むナノ粒子を欠く以外は同様の組成物と比較して促進される、例えば保存または増強される。実施形態では、凍結組成物が融解されると、保存剤は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する。実施形態では、インターフェロンガンマ産生が促進される。実施形態では、活性化は、インターフェロンガンマ産生によって測定される。いくつかの実施形態では、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性、活性化またはインターフェロンガンマ産生の1つ、2つ、3つ、4つまたはそれよりも多くが促進される。

0025

実施形態では、組成物は、細胞の生存能力および増殖を刺激および持続する化合物を含む。実施形態では、組成物は、凍結および融解中に細胞を保護する化合物を含む。実施形態では、組成物は、第2の保存剤、例えば本明細書に記載される保存剤を含む。実施形態では、ナノ粒子からの保存剤の放出は、1時間〜3週間、例えば1時間〜24時間、1日間〜3日間、4日間〜6日間、1週間〜2週間または2週間〜3週間にわたって起こる。

0026

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面と会合して、有核細胞−ナノ粒子複合体を形成する。

0027

実施形態では、有核細胞は、免疫細胞、例えば免疫エフェクター細胞(例えば、リンパ球、T細胞、B細胞またはナチュラルキラー細胞から選択される免疫細胞)または造血幹細胞を含む。実施形態では、有核細胞は、リンパ球を含む。実施形態では、有核細胞は、T細胞を含む。実施形態では、有核細胞は、B細胞を含む。実施形態では、有核細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞を含む。実施形態では、有核細胞は、造血幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、有核細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)、例えばがん抗原に結合するCARを含む、例えば発現する免疫細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)である。他の実施形態では、有核細胞は、外因性高親和性Fc受容体を発現する。

0028

実施形態では、有核細胞は、患者から取得された免疫細胞、例えばNK細胞、例えば患者の血液である。他の実施形態では、有核細胞は、健常ドナーから取得された免疫細胞、例えばNK細胞である。例えば、それは、同種T細胞が枯渇したNK細胞集団である。実施形態では、有核細胞は、胚性幹細胞および/またはiPSC細胞由来の免疫細胞、例えばNK細胞である。いくつかの実施形態では、有核細胞は、細胞株、例えば安定細胞株または不死化細胞株(例えば、NK細胞不死化細胞株)である。いくつかの実施形態では、有核細胞は、患者、例えば血液がん、例えば白血病またはリンパ腫を有する患者から取得される。実施形態では、有核細胞は、NK細胞株、例えばKlingemann,Hら、(2016)Frontiers in Immunology Vol.7(Art.91):1−7(これは、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されているように、例えばNK−92(例えば、ATCCcat.No.CRL−2407)、NK−YS、KHYG−1、NKL、NKG、SNK−6、IMC−1から選択されるNK細胞株である。一実施形態では、有核細胞は、NK92細胞株、例えば高親和性Fc受容体を発現するバリアントNK92細胞、例えばFcガンマRIIIa発現細胞(例えば、158V)である。他の実施形態では、NK92細胞株は、例えばKlingemannら(前掲)にも記載されているように、がん抗原に結合するCARを含む。

0029

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞に対する静電引力によって細胞表面と会合している。実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも1つのリガンドを含み、リガンドは、有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する。

0030

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の例えば表面に共有結合的にコンジュゲートしている。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞に共有結合的にコンジュゲートしていない。

0031

実施形態では、ナノ粒子は、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む。実施形態では、ナノ粒子は、リポソームを含む。実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質ナノゲルを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、互いに共有結合的に連結された複数の保存剤によって形成されたタンパク質ナノゲルである。実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子表面上に少なくとも1つのポリマーカチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む。

0032

いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、ポリリジン、例えば、polyK30またはpolyK200を含む。いくつかの実施形態では、ポリリジンは、ポリ−L−リジンである。ある実施形態では、ポリリジンは、20〜30、30〜40、40〜50、50〜100、100〜150、150〜200、200〜250、250〜300、300〜400、または400〜500アミノ酸の平均長を有する。ある実施形態では、ポリリジンは、10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有する。ある実施形態では、ポリリジンは、100〜300、150〜250、または約200アミノ酸の平均長を有する。いくつかの実施形態では、ポリリジンは、10〜150、20〜100、20〜80、20〜60、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有する。

0033

ある実施形態では、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール(PEG)を含む。ある実施形態では、PEGは、1〜2、2〜3、3〜4、4〜5、5〜6、6〜7、7〜8、8〜9、または9〜10kDの分子量を有する。実施形態では、PEGは、約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有する。

0034

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、PEG(例えば、本明細書に記載されるPEG、例えば約1〜10、2〜8、4〜6または約5kDの分子量を有するPEG)と、ポリリジン(例えば、本明細書に記載されるポリリジン、例えば10〜50、20〜40もしくは約30アミノ酸の平均長を有するポリリジン;または100〜300、150〜250もしくは約200アミノ酸の平均長を有するポリリジン)とを含むカチオン性ブロックコポリマーを含む。実施形態では、カチオン性ブロックコポリマーは、PEG5k−polyK30またはPEG5k−polyK200を含む。

0035

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号6のIL−15N72DポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号5のsushi−FcポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0036

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号1のIL−15ポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号7または配列番号8のsushiドメインあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号11のFcドメインあるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むsushi−Fcポリペプチド;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0037

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号6のIL−15N72DポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号15のsushi−Fc2DaポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0038

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号1のIL−15ポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号15のsushi−Fc2DaポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0039

実施形態では、組成物は、(例えば、溶液中に、または例えば保存剤の一部としてナノ粒子と会合して、例えばナノ粒子に共有結合的にコンジュゲートして)溶液中もしくは細胞表面上のナノ粒子を安定化し、および/またはナノ粒子と有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物を含む。実施形態では、化合物は、プロタミンキトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン天然ポリマーポリサッカライド、デキストラマー、セルロースフィブロネクチンコラーゲンフィブリンまたはプロテオグリカンから選択される。実施形態では、組成物は、(例えば、溶液中に、または例えば保存剤の一部としてナノ粒子と会合して、例えばナノ粒子に共有結合的にコンジュゲートして)サイトカイン分子、成長因子分子、共刺激分子を含む。実施形態では、組成物は、(例えば、溶液中に、または例えば保存剤の一部としてナノ粒子と会合して、例えばナノ粒子に共有結合的にコンジュゲートして)サイトカイン分子、例えばIL−2、IL−7、IL−12、IL−15、IL−18、IL−21、IL−23、IL−4、IL1アルファ、IL1ベータ、IL−5、IFNガンマ、TNFアルファ、IFNアルファ、IFNベータ、GM−CSFまたはGCSF、そのバリアント、またはサイトカイン複合体、例えばIL−15複合体(例えば、本明細書に記載されるIL−15スーパーアゴニスト)を含む。実施形態では、組成物は、(例えば、溶液中に、または例えば保存剤の一部としてナノ粒子と会合して、例えばナノ粒子に共有結合的にコンジュゲートして)分子、例えば共刺激分子に対する抗体分子またはアゴニストリガンドを含み、例えば、共刺激分子は、OX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、もしくはCD137のアゴニストから選択される。

0040

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞によるナノ粒子の取り入れを減少させる、例えば阻害減退または低減するエンティティを含む。ある実施形態では、ナノ粒子は、CD45、CD11a(インテグリンアルファ−L)、CD18(インテグリンベータ−2)、CD11b、CD11c、CD25、CD8、またはCD4に対する抗体分子を含む。

0041

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、NK細胞上に存在するタンパク質、例えば受容体に結合するエンティティを含む。例えば、ナノ粒子は、NK細胞上の刺激性受容体または阻害性受容体に結合するエンティティを含み得る。

0042

実施形態では、エンティティは、NK細胞上の刺激性受容体のアゴニストであり、例えば、エンティティは、アゴニストリガンドまたはアゴニスト抗体分子であり得る。実施形態では、刺激性受容体は、TRAIL、CD16、NKp30a,b、DNAM−1、CD137、OX40、CD27、DAP12、FcεRI−γ、CD3−ζ、NKG2D、DAP10またはCD225(2B4)である。実施形態では、刺激性受容体は、ITAMモチーフ、例えば(D/E)XXYXX(L/I)X6−8YXX(L/I)を含む。実施形態では、刺激性受容体は、天然細胞傷害性受容体またはMHC結合活性化受容体ある。

0043

実施形態では、エンティティは、NK細胞上の阻害性受容体の阻害剤であり、例えば、エンティティは、阻害剤リガンドまたは阻害剤抗体分子であり得る。実施形態では、阻害性受容体は、KIR、LILR、Ly49またはNKG2Aである。実施形態では、阻害性受容体は、ITIMモチーフ、例えば(I/L/V/S)XYXX(L/V)を含む。実施形態では、阻害性受容体は、MHCクラスI阻害性受容体または非MHC結合阻害性受容体である。

0044

実施形態では、NK細胞受容体は、Lanier“Up on the tightrope:natural killer cell activation and inhibition”Nat Immunol.2008 May;9(5):495−502、Sentmanら、“NK Cell Receptors as Tools in Cancer Immunotherapy”Advances in Cancer Research 2006 249−292またはPardoll“The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy”Nat Rev Cancer.2012 Mar 22;12(4):252−64に記載されている受容体である。

0045

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、高密度タンパク質構造(80重量%超のタンパク質)であり、タンパク質は、分解されると機能的形態、例えばネイティブ形態の前記タンパク質を放出する架橋分子によって架橋されている。

0046

実施形態では、ナノ粒子は、レドックス(例えば、リンカーはジスルフィド結合を含む)またはpH(例えば、リンカーは加水分解性基を含む)または酵素(例えば、リンカーはプロテアーゼ切断部位を含む)に対して感受性の可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む。

0047

実施形態では、本明細書の組成物は、粒子、例えばナノ粒子またはマイクロ粒子またはナノ粒子およびマイクロ粒子の両方を含む。実施形態では、粒子、例えばナノ粒子は、30nm〜1200nm、40nm〜1,100nm、50nm〜1,000ナノメートル、例えば50〜500nm、より典型的には70〜400nmの(例えば、動的光散乱によって測定された)平均流体力学直径を有する。実施形態では、粒子、例えばナノ粒子は、100nm〜400nm、150nm〜350nmまたは200nm〜300nmの(例えば、動的光散乱によって測定された)平均強度に基づくサイズを有する。実施形態では、粒子、例えばナノ粒子は、60nm〜100nmまたは70nm〜90nmの(例えば、動的光散乱によって測定された)平均数に基づくサイズを有する。

0048

実施形態では、組成物は、凍結されている。実施形態では、組成物は、凍結部分および液体部分を含む。

0049

実施形態では、組成物の温度は、0℃未満に低下される。

0050

実施形態では、組成物の温度は、−10℃未満に低下される。実施形態では、組成物の温度は、−10℃未満、−20℃、−30℃、−40℃、−50℃、−60℃、−70℃、−80℃、−100℃、−120℃、−140℃、−160℃、−180℃または−200℃に低下される。実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を少なくとも1時間凍結したままに維持する工程を含む。実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を少なくとも2、4、6、12もしくは24時間、または1、2、3、4、5もしくは6日間、または1、2、3もしくは4週間、または1、2、3もしくは6カ月間、または1、2、3、4もしくは5年間凍結したままに維持する工程を含む。

0051

実施形態では、提供する工程は、有核細胞と、保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせることを含む。実施形態では、提供する工程は、別のエンティティからナノ粒子を受け取ること、およびナノ粒子と有核細胞とを組み合わせることを含む。実施形態では、提供する工程は、別のエンティティから有核細胞の非凍結組成物を受け取ることを含む。

0052

実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を別のエンティティ、例えばヘルスケアプロバイダ、例えば病院診療所または医院に提供または放出する工程を含む。実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を融解して、有核細胞の融解組成物を提供する工程を含む。実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を加温する前に、有核細胞の凍結組成物を少なくとも1時間凍結したままに維持する工程を含む。実施形態では、組成物の凍結調製物が融解されると、保存剤は、ナノ粒子から放出され、ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する。実施形態では、前記方法は、有核細胞の融解組成物を被験体に投与する工程を含む。

0053

実施形態では、提供する工程は、別のエンティティ、例えば有核細胞の組成物を作製および/または凍結するエンティティから凍結組成物を受け取ることを含む。実施形態では、提供する工程は、有核細胞を、緩衝化水性媒体溶液と、少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせることを含む。実施形態では、提供する工程は、別のエンティティからナノ粒子を受け取ること、およびナノ粒子と有核細胞とを組み合わせることを含む。

0054

実施形態では、前記方法は、例えば融解後に細胞を拡大する工程を含む。実施形態では、細胞は、(例えば、2日間で)少なくとも2倍拡大される。実施形態では、細胞は、少なくとも2、3、4、5、10、20、50または100倍拡大される。

0055

実施形態では、前記方法は、例えば融解後に細胞を活性化する工程をさらに含む。実施形態では、(例えば、CD45RAに対する抗体を使用したフローサイトメトリーアッセイ、例えば実施例26のアッセイにおいてCD45RA+の比率として測定される)活性化細胞、例えば活性化CD8+細胞のパーセントは、少なくとも40%、50%、60%、70%、80%または90%である。

0056

実施形態では、本明細書の組成物で処置された細胞(例えば、融解細胞)は、例えば実施例27に記載されているアッセイを使用して決定される細胞傷害活性を有する。実施形態では、細胞傷害活性は、実施例27のアッセイにおいて、少なくとも10%、20%、30%、40%または50%の死滅率を含む。実施形態では、細胞傷害活性は、がん細胞株、例えばDaudi細胞に対する細胞傷害活性のアッセイ、例えば実施例28のアッセイにおいて、少なくとも10%、20%、30%、40%または50%の死滅率を含む。実施形態では、細胞傷害活性は、実施例29のアッセイにおいて、少なくとも10%、20%、30%、40%または50%の死滅率を含む。実施形態では、細胞傷害活性は、実施例30のアッセイにおいて、少なくとも10%、20%、30%、40%または50%の死滅率を含む。

0057

実施形態では、本明細書の組成物で処置された細胞(例えば、融解細胞)は、例えば細胞を被験体に注射し、その後の時点で血液を採取し、フローサイトメトリーによって拡大したドナー細胞をカウントするアッセイ、例えば実施例35のアッセイにおいて、インビボ拡大活性を有する。実施形態では、本明細書の組成物で処置された融解細胞はインビボで拡大して、組成物で処置されない以外は同様の細胞と比較して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%超の細胞を生じさせる。

0058

実施形態では、本明細書の組成物で処置された細胞(例えば、融解細胞)は、例えば腫瘍を切除し、フローサイトメトリーによって拡大したドナー細胞をカウントした場合に、例えば実施例36のアッセイにおいて、腫瘍浸潤活性を有する。実施形態では、本明細書の組成物で処置された細胞は、腫瘍1mg当たり少なくとも200、400、600または800個の細胞をもたらす。実施形態では、本明細書の組成物で処置された細胞は、組成物で処置されない以外は同様の細胞と比較して例えば少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍または5倍大きい腫瘍浸潤ベルをもたらす。

0059

実施形態では、被験体は、有核細胞を提供したドナー被験体である。実施形態では、ドナー被験体は、がん、糖尿病自己免疫疾患もしくは心血管疾患を有するか、または移植を必要とする。実施形態では、被験体は、ドナー被験体以外の被験体である。実施形態では、ドナー被験体以外の被験体は、健常被験体である。

0060

いくつかの態様では、本開示は、有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物であって、組成物の凍結調製物が融解されると、保存剤が、場合によりナノ粒子から放出され、ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進し、例えば保存または増強し、保存剤が、例えばIL−15受容体またはそのIL−15結合断片を含むポリペプチドと例えば共有結合的または非共有結合的に複合体化したIL−15分子を含む、組成物を提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、IL−15受容体アルファもしくはそのIL−15結合断片を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、IL−15受容体アルファの細胞外ドメインを含む。

0061

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列(全長野生型IL−15受容体アルファ)、またはそのIL−15結合断片;あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列(野生型IL−15受容体アルファのECD)、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列(IL−15受容体アルファアイソフォームCRA_dのECD)、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む。

0062

別の実施形態では、ポリペプチドは、
配列番号2、配列番号3、または配列番号4のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む第1のドメイン;および
場合により、第2の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンFcドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、Fab断片、FAB2断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、sdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む。一実施形態では、第2の異種ドメインは、FcドメインもしくはFabである。

0063

ある実施形態では、組成物、例えば、ナノ粒子および/または保存剤、は、IL−15複合体を含み、前記IL−15複合体は、IL−15受容体もしくはそのIL−15結合断片を含むポリペプチドと、例えば、共有結合的または非共有結合的に複合体化したIL−15分子を含む。ある実施形態では、IL−15分子は、配列番号6のヒトIL−15 N72DポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、IL−15受容体またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号5のIL15RaSu−FcポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、IL−15受容体またはその断片を含むポリペプチドは、sushiドメイン(例えば、配列番号7または配列番号8のもの)およびエフェクター弱体化Fcドメイン、例えば、ヒトIgG2 Fcドメイン、例えば、配列番号11のヒトIgG2ドメインあるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む第2の異種ドメインを含む。

0064

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号6のIL−15N72DポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号5のsushi−FcポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0065

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号1のIL−15ポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号7または配列番号8のsushiドメインあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号11のFcドメインあるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むsushi−Fcポリペプチド;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0066

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号6のIL−15N72DポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号15のsushi−Fc2DaポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0067

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号1のIL−15ポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号15のsushi−Fc2DaポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0068

実施形態では、保存剤は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である。

0069

実施形態では、インターフェロンガンマ産生が促進される。実施形態では、活性化は、インターフェロンガンマ産生によって測定される。

0070

実施形態では、媒体は、細胞の生存能力および増殖を刺激および持続する化合物を含有する。実施形態では、媒体は、凍結および融解中に細胞を保護する化合物を含む。

0071

実施形態では、ナノ粒子からの保存剤の放出は、1時間〜3週間、例えば1時間〜24時間、1日間〜3日間、4日間〜6日間、1週間〜2週間または2週間〜3週間にわたって起こる。

0072

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面と会合している。

0073

実施形態では、有核細胞は、免疫細胞、例えば免疫エフェクター細胞(例えば、リンパ球、T細胞、B細胞またはナチュラルキラー細胞)または造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、有核細胞は、免疫細胞または本明細書に記載の細胞株である。

0074

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞に対する静電引力によって細胞表面と会合している。実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも1つのリガンドを含み、リガンドは、有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートする。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートしない。実施形態では、ナノ粒子は、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む。実施形態では、ナノ粒子は、リポソームを含む。実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質ナノゲルを含む。実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子表面上に少なくとも1つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む。

0075

実施形態では、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール(PEG)を含む。実施形態では、組成物は、溶液中もしくは細胞表面上のナノ粒子を安定化し、かつ/またはナノ粒子と有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンから選択される。

0076

ある実施形態では、保存剤は、サイトカイン分子、成長因子分子、共刺激分子を含む。ある実施形態では、組成物は、サイトカイン分子を含む第1および/または第2の保存剤を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、IL−18、IL−21、IL−23、IL−4、IL1アルファ、IL−1ベータ、IL−5、IFNガンマ、TNFa、IFNアルファ、IFNベータ、GM−CSF、またはGCSF、それらのバリアント、またはサイトカイン複合体、あるいは前記の任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、IL−15複合体、例えば、本明細書に記載のIL−15スーパーアゴニストを含む。ある実施形態では、組成物は、共刺激分子に対する抗体分子またはアゴニストリガンドを含み、例えば、共刺激分子は、OX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、またはCD137のアゴニストから選択される。

0077

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞によるナノ粒子の取り入れを減少させる、例えば阻害、減退または低減するエンティティを含む。ある実施形態では、ナノ粒子は、CD45、CD11a(インテグリンアルファ−L)、CD18(インテグリンベータ−2)、CD11b、CD11c、CD25、CD8、またはCD4に対する抗体分子を含む。

0078

実施形態では、ナノ粒子は、レドックス(例えば、ジスルフィド)またはpH(例えば、加水分解性基)または酵素(例えば、プロテアーゼ)に対して感受性の可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む。

0079

実施形態では、組成物は、凍結されている。実施形態では、組成物は、凍結部分および液体部分を含む。

0080

別の態様では、本発明は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば増強するための方法を特徴とする。実施形態では、有核細胞は、患者から単離されているかまたは単離される。前記方法は、有核細胞と、緩衝化水溶液と、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を保存または増強する少なくとも1つの薬剤、例えば本明細書に記載される保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせることによって、有核細胞を改変する工程を含む。

0081

別の態様では、本発明は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば増強するための方法を特徴とする。実施形態では、有核細胞は、患者から単離されているかまたは単離され、緩衝化水溶液と、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を保存または増強する少なくとも1つの薬剤、例えば本明細書に記載される保存剤を含むナノ粒子と組み合わせることによって改変される。前記方法は、有核細胞を少なくとも1回の凍結融解サイクルに供する工程を含む。

0082

ある特定の態様では、本発明は、有核細胞の凍結組成物を作製する方法であって、
a)有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、少なくとも1つの保存剤、例えば有核細胞の凍結調製物が融解されると、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する薬剤を含むナノ粒子とを含む非凍結組成物を提供する工程(例えば、非凍結有核細胞ーナノ粒子複合体を提供する工程)、
b)場合により、組成物が凍結するのに十分に組成物の温度を低下させ、それにより、有核細胞の組成物を凍結する工程
を含む、方法を特徴とする。

0083

実施形態では、組成物の温度は、0℃未満に低下される。実施形態では、組成物の温度は、−10℃未満に低下される。実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を少なくとも1時間凍結したままに維持する工程を含む。

0084

実施形態では、提供する工程は、有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせて、有核細胞−ナノ粒子複合体を形成することを含む。実施形態では、提供する工程は、別のエンティティからナノ粒子を受け取ること、およびナノ粒子を有核細胞および緩衝化水性媒体溶液と組み合わせることを含む。実施形態では、提供する工程は、別のエンティティから有核細胞の非凍結組成物を受け取ることを含む。

0085

実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を別のエンティティ、例えばヘルスケアプロバイダ、例えば病院、診療所または医院に提供または放出する工程を含む。実施形態では、前記方法は、有核細胞の凍結組成物を融解して、有核細胞の融解組成物を提供する工程を含む。

0086

実施形態では、組成物の凍結調製物が融解されると、保存剤は、ナノ粒子から放出され、ナノ粒子の非存在下で凍結および融解された緩衝化水性媒体溶液中の有核細胞と比較して、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する。

0087

実施形態では、前記方法は、有核細胞の融解組成物を被験体に投与する工程を含む。実施形態では、被験体は、ドナー被験体である。実施形態では、ドナー被験体は、がん、糖尿病、自己免疫障害を有するか、または移植を必要とする。実施形態では、被験体は、ドナー被験体以外の被験体である。実施形態では、ドナー被験体以外の被験体は、健常被験体である。

0088

前記組成物および方法のいくつかの実施形態では、保存剤は、IL−15スーパーアゴニスト、例えば、野生型IL−15よりも高い活性を有するIL−15分子を含む。ある実施形態では、保存剤は、IL−15分子およびポリペプチド、例えば、IL−15ポリペプチド受容体アルファ断片(例えば、IL−15受容体アルファの細胞外ドメイン)を含む。

0089

一実施形態では、ポリペプチドは、
配列番号2のアミノ酸配列(野生型IL−15受容体アルファ)、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む第1のドメイン;および
場合により、第2の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンFcドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、Fab断片、FAB2断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、sdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む。一実施形態では、第2の異種ドメインは、FcドメインもしくはFabである。

0090

別の実施形態では、ポリペプチドは、
配列番号3のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む第1のドメイン;および
場合により、第2の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンFcドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、Fab断片、FAB2断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、sdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む。一実施形態では、第2の異種ドメインは、FcドメインもしくはFabである。

0091

一実施形態では、ポリペプチドは、
配列番号4のアミノ酸配列(IL−15受容体アルファアイソフォームCRA_dのECD)、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列を含む第1のドメイン;および
場合により、第2の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンFcドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、Fab断片、Fab2断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、sdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体を含む。一実施形態では、第2の異種ドメインは、FcドメインもしくはFabである。

0092

ある実施形態では、組成物、例えば、ナノ粒子および/または保存剤、は、IL−15複合体を含み、前記IL−15複合体は、IL−15受容体もしくはそのIL−15結合断片を含むポリペプチドと、例えば、共有結合的または非共有結合的に複合体化したIL−15分子を含む。ある実施形態では、IL−15分子は、配列番号6のヒトIL−15 N72DポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、IL−15受容体またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号5のIL15RaSu−FcポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、IL−15受容体またはその断片を含むポリペプチドは、sushiドメイン(例えば、配列番号7または配列番号8のもの)およびエフェクター弱体化Fcドメイン、例えば、ヒトIgG2 Fcドメイン、例えば、配列番号11のヒトIgG2ドメインあるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む第2の異種ドメインを含む。

0093

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号6のIL−15N72DポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号5のsushi−FcポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0094

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号1のIL−15ポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号7または配列番号8のsushiドメインあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号11のFcドメインあるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むsushi−Fcポリペプチド;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0095

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号6のIL−15N72DポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号15のsushi−Fc2DaポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0096

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号1のIL−15ポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号15のsushi−Fc2DaポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0097

実施形態では、保存剤は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である。

0098

実施形態では、インターフェロンガンマ産生が促進される。実施形態では、活性化は、インターフェロンガンマ産生によって測定され得る。

0099

実施形態では、媒体は、細胞の生存能力および増殖を刺激および持続する化合物を含有する。実施形態では、媒体は、凍結および融解中に細胞を保護する化合物を含む。

0100

実施形態では、ナノ粒子からの保存剤の放出は、1時間〜3週間、例えば1時間〜24時間、1日間〜3日間、4日間〜6日間、1週間〜2週間または2週間〜3週間にわたって起こる。

0101

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞、例えば有核細胞の表面と例えば共有結合的または非共有結合的に会合し、そうすることで有核細胞−ナノ粒子複合体を形成する。

0102

実施形態では、有核細胞は、免疫エフェクター細胞(例えば、リンパ球、T細胞、B細胞またはナチュラルキラー細胞)または造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、有核細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)、例えばがん抗原に結合するCARを含む、例えば発現する免疫細胞(例えば、T細胞またはNK細胞)である。他の実施形態では、有核細胞は、外因性高親和性Fc受容体を発現する。実施形態では、有核細胞は、患者または健常ドナーから取得されたNK細胞である。他の実施形態では、有核細胞は、NK細胞株、例えば本明細書に記載される安定細胞株または不死化細胞株である。一実施形態では、NK細胞は、NK−92細胞株である。

0103

実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも1つのリガンドを含み、リガンドは、有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する。

0104

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートする。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートしない。

0105

実施形態では、ナノ粒子は、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む。実施形態では、ナノ粒子は、リポソームを含む。実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質ナノゲルを含む。実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子表面上に少なくとも1つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを場合により含む。実施形態では、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール(PEG)を含む。

0106

実施形態では、組成物は、溶液中もしくは細胞表面上のナノ粒子を安定化し、かつ/またはナノ粒子と有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンから選択される。

0107

ある実施形態では、保存剤は、サイトカイン分子、成長因子分子、または共刺激分子を含む。ある実施形態では、保存剤は、サイトカイン分子、例えば、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、IL−18、IL−21、IL−23、IL−4、IL−1アルファ、IL−1ベータ、IL−5、IFNガンマ、TNFa、IFNアルファ、IFNベータ、GM−CSF、またはGCSF、それらのバリアント、またはサイトカイン複合体、例えば、IL−15複合体(例えば、本明細書に記載のIL−15スーパーアゴニスト)を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、抗体分子、(例えば、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、Fab断片、FAB2断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、sdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片、例えば、免疫グロブリンFc、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体をさらに含む、例えば、これらにカップリング(例えば、融合)されている。

0108

ある実施形態では、組成物は、共刺激分子、例えば、OX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、またはCD137のアゴニストのアゴニスト(例えば、抗体分子またはアゴニストリガンド)を含む。

0109

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞によるナノ粒子の取り入れを減少させる、例えば阻害、減退または低減するエンティティを含む。ある実施形態では、ナノ粒子は、CD45、CD11a(インテグリンアルファ−L)、CD18(インテグリンベータ−2)、CD11b、CD11c、CD25、CD8、またはCD4に対する抗体分子を含む。実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面にコンジュゲートされた抗CD45親和性または結合リガンドを含む。実施形態では、ナノ粒子は、レドックスに対して感受性(例えば、ジスルフィド)またはpHに対して感受性(例えば、加水分解性基)または酵素に対して感受性(例えば、プロテアーゼ)である可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む。

0110

いくつかの態様では、本発明は、有核細胞の融解組成物を作製する方法であって、
a)有核細胞と、緩衝化水性媒体溶液と、例えば、有核細胞の凍結調製物が融解されると、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を促進する、例えば保存または増強する少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを含む有核細胞の凍結組成物を提供する工程(例えば、本明細書に開示される有核細胞−ナノ粒子複合体を提供する工程);および
b)有核細胞の凍結組成物を融解するのに十分に有核細胞の凍結組成物を加温し、それにより、有核細胞の融解組成物を作製する工程
を含む方法を特徴とする。

0111

いくつかの実施形態では、提供する工程は、別のエンティティ、例えば有核細胞の組成物を作製および/または凍結するエンティティから凍結組成物を受け取ることを含む。いくつかの実施形態では、提供する工程は、有核細胞を、緩衝化水性媒体溶液と、少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを組み合わせ、そうすることで有核細胞ーナノ粒子複合体を形成することを含む。いくつかの実施形態では、提供する工程は、別のエンティティからナノ粒子を受け取ること、およびナノ粒子を、有核細胞および緩衝化水性媒体溶液と組み合わせることを含む。

0112

いくつかの実施形態では、方法は、有核細胞の凍結組成物を加温する前に、有核細胞の凍結組成物を少なくとも1時間凍結したままに維持する工程を含む。

0113

実施形態では、被験体は、有核細胞を提供したドナー被験体である。実施形態では、ドナー被験体、例えば患者は、がん、糖尿病、自己免疫疾患もしくは心血管疾患を有するか、または移植を必要とする。実施形態では、被験体は、ドナー被験体以外の被験体である。実施形態では、ドナー被験体以外の被験体は、健常被験体である。

0114

いくつかの実施形態では、保存剤は、以下:
i)配列番号2のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列;
ii)配列番号3のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列;
iii)配列番号4のアミノ酸配列、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有するアミノ酸配列;
から選択されるIL−15ポリペプチド受容体アルファ断片、および
場合により、第2の異種ドメイン、例えば、免疫グロブリンFcドメインもしくは抗体分子、例えば、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、Fab断片、FAB2断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、sdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体、を含む。一実施形態では、第2の異種ドメインは、FcドメインもしくはFabである。

0115

いくつかの実施形態では、保存剤は、IL−15分子およびIL−15ポリペプチド受容体アルファ断片の複合体を含む。

0116

ある実施形態では、組成物、例えば、ナノ粒子および/または保存剤、は、IL−15複合体を含み、前記IL−15複合体は、IL−15受容体もしくはそのIL−15結合断片を含むポリペプチドと、例えば、共有結合的または非共有結合的に複合体化したIL−15分子を含む。ある実施形態では、IL−15分子は、配列番号6のヒトIL−15 N72DポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、IL−15受容体またはその断片を含むポリペプチドは、配列番号5のIL15RaSu−FcポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、IL−15受容体またはその断片を含むポリペプチドは、sushiドメイン(例えば、配列番号7または配列番号8のもの)およびエフェクター弱体化Fcドメイン、例えば、ヒトIgG2 Fcドメイン、例えば、配列番号11のヒトIgG2ドメインあるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む第2の異種ドメインを含む。

0117

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号6のIL−15N72DポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号5のsushi−FcポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0118

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号1のIL−15ポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号7または配列番号8のsushiドメインあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列、および配列番号11のFcドメインあるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含むsushi−Fcポリペプチド;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0119

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号6のIL−15N72DポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号15のsushi−Fc2DaポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0120

いくつかの実施形態では、組成物(例えば、ナノ粒子)は、
配列番号1のIL−15ポリペプチドあるいはIL−15Ra結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
配列番号15のsushi−Fc2DaポリペプチドあるいはIL−15結合活性を有するそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列;
約1〜10、2〜8、4〜6、または約5kDの分子量を有するPEG、および10〜50、20〜40、または約30アミノ酸の平均長を有するポリリジンを含むカチオン性ブロックコポリマー;および
場合により、CD45に対する抗体分子を含む。

0121

実施形態では、保存剤は、有核細胞の生存能力、増殖、細胞傷害活性または活性化を持続するための刺激分子である。

0122

実施形態では、インターフェロンガンマ産生が促進される。実施形態では、活性化は、インターフェロンガンマ産生によって測定され得る。

0123

実施形態では、媒体は、細胞の生存能力および増殖を刺激および持続する化合物を含有する。実施形態では、媒体は、凍結および融解中に細胞を保護する化合物を含む。

0124

実施形態では、ナノ粒子からの保存剤の放出は、1時間〜3週間、例えば1時間〜24時間、1日間〜3日間、4日間〜6日間、1週間〜2週間または2週間〜3週間にわたって起こる。

0125

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面と会合している。

0126

実施形態では、有核細胞は、免疫エフェクター細胞(例えば、リンパ球、T細胞、B細胞またはナチュラルキラー細胞)または造血幹細胞である。

0127

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞に対する静電引力によって細胞表面と会合している。実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも1つのリガンドを含み、リガンドは、有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物または脂質に対する親和性を有する。

0128

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートする。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートしない。

0129

実施形態では、ナノ粒子は、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子または固体ナノ粒子を含む。実施形態では、ナノ粒子は、リポソームを含む。実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質ナノゲルを含む。

0130

実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子表面上に少なくとも1つのポリマー、カチオン性ポリマーまたはカチオン性ブロックコポリマーを含む。実施形態では、ナノ粒子は、ポリエチレングリコール(PEG)を含む。

0131

実施形態では、組成物は、溶液中もしくは細胞表面上のナノ粒子を安定化し、かつ/またはナノ粒子と有核細胞の表面との間の相互作用を増加させる化合物、例えば、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンを含む。

0132

ある実施形態では、保存剤は、サイトカイン分子、ポリペプチド、例えば、その受容体またはその受容体の断片もしくは部分、成長因子分子、または共刺激分子に複合体化されたサイトカインを含む。ある実施形態では、保存剤は、サイトカイン分子、例えば、IL2、IL7、IL12、IL15、IL18、IL21、IL−23、IL−4、IL1アルファ、IL1ベータ、IL−5、IFNガンマ、TNFa、IFNアルファ、IFNベータ、GM−CSF、またはGCSF、それらのバリアント、またはサイトカイン複合体、例えば、本明細書に記載のIL−15複合体(例えば、IL−15スーパーアゴニスト)を含む。ある実施形態では、保存剤は、IL−15受容体α鎖の断片、例えば、本明細書に記載の断片に会合されたサイトカイン分子、例えば、IL−15を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、抗体分子、(例えば、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、Fab断片、FAB2断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、sdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片、例えば、免疫グロブリンFc、単一ドメイン抗体、二重特異性もしくは多重特異性抗体をさらに含む、例えば、これらにカップリング(例えば、融合)されている。ある実施形態では、組成物は、アゴニスト、例えば、共刺激分子に対する抗体分子またはアゴニストリガンドを含み、例えば、共刺激分子は、OX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、またはCD137のアゴニストから選択される。

0133

実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞によるナノ粒子の取り入れを減少させる、例えば阻害、減退または低減するエンティティを含む。ある実施形態では、ナノ粒子は、CD45、CD11a(インテグリンアルファ−L)、CD18(インテグリンベータ−2)、CD11b、CD11c、CD25、CD8、またはCD4に対する抗体分子を含む。実施形態では、ナノ粒子は、レドックスに対して感受性(例えば、ジスルフィド)またはpHに対して感受性(例えば、加水分解性基)または酵素に対して感受性(例えば、プロテアーゼ)である可逆的リンカーによって架橋されたナノゲルを含む。

0134

いくつかの態様では、本発明は、有核細胞およびナノ粒子(例えば、有核細胞−ナノ粒子複合体)を凍結するための方法であって、前記有核細胞を−10℃未満で凍結して少なくとも1時間後に融解し、前記ナノ粒子が、融解後に前記ナノ粒子から場合により放出される少なくとも1つの薬剤であって、ナノ粒子なしで凍結された有核細胞の組成物と比較して前記細胞の機能を維持する、例えば前記細胞の生存能力を保存する薬剤を含む方法を特徴とする。

0135

いくつかの実施形態では、薬剤は、有核細胞の生存能力を持続するための刺激分子である。実施形態では、有核担体細胞は、リンパ球である。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面と会合している。実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞の表面に共有結合的にコンジュゲートしている。

0136

別の態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物、例えば有核細胞と、少なくとも1つの保存剤を含むナノ粒子とを含む組成物(例えば、有核細胞−ナノ粒子複合体)と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を特徴とする。

0137

実施形態では、本明細書の被験体は、細胞ベースの治療、例えば免疫細胞療法を必要とする。例えば、被験体は、養子細胞療法を必要とする。いくつかの実施形態では、被験体は、患者、例えばヒト患者である。いくつかの実施形態では、被験体は、がん、糖尿病、自己免疫疾患、アレルギーもしくはアレルギー症状喘息または心血管疾患から選択される疾患を有する。実施形態では、被験体は、移植を必要とする。

0138

実施形態では、本明細書の方法は、複合体中の有核細胞の機能を評価する工程、例えば、例えば融解後に有核細胞の増殖、サイトカイン放出または細胞傷害効果の1つまたはそれよりも多くを評価する工程をさらに含む。

0139

本発明の他の特徴、目的および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。

0140

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験では、本明細書に記載されるものに類似またはそれと同等の方法および材料が使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。加えて、材料、方法および実施例は例示に過ぎず、限定的なものであることを意図しない。

図面の簡単な説明

0141

図1A〜1Bは、IL−15/sushi−Fc融合構築物の概略図を示す。図1Aは、ヒトIgG1Fc領域N末端に融合したヒトIL−15Rαのsushiドメインと非共有結合的に会合したIL−15WT/sushi−Fc:WTヒトIL−15の概略図である。図1Bは、ヒトIgG1 Fc領域のN末端に融合したヒトIL−15Rαのsushiドメインと非共有結合的に会合した、N72D変異を含有するIL−15N72D/sushi−Fc:ヒトIL−15の概略図である。

0142

図2は、タンパク質ナノゲル(バックパック)形成に使用したIL15/sushi−IgG1−Fc構築物のSDS−PAGE分析を示す。可逆的架橋剤による架橋後のIL−15WT/sushi−Fc(黒色)およびIL−15N72D/sushi−Fc(青色)タンパク質ナノゲルの分析レーン1および2)。得られたタンパク質ナノゲルは高度に架橋されており、ポリアクリルアミドゲルに効率的に侵入しない。還元(レーン3および4)および非還元(レーン5および6)IL−15バリアントを示す対照も含まれる。同じSDS−PAGE上の無関係なデータは、図から省略されている。

0143

図3は、BioSep4000サイズ排除クロマトグラフィーカラムHPLCによって分析した架橋IL−15N72D/sushi−Fcタンパク質ナノゲル(11分のピークは、組み込まれていないリンカーである)を示す;5分のピークは、架橋IL−15N72D/sushi−Fcである。

0144

図4は、BioSep4000サイズ排除クロマトグラフィーカラムのHPLCによって分析した非架橋IL−15N72D/sushi−Fcを示す。

0145

図5は、BioSep4000サイズ排除クロマトグラフィーカラムによる、polyK30で官能化した架橋IL−15N72D/sushi−Fcタンパク質ナノゲルのHPLCを示す。

0146

図6は、BioSep4000サイズ排除クロマトグラフィーカラムのHPLCによって分析した非架橋抗CD45IgGを示す。

0147

BioSep4000サイズ排除クロマトグラフィーカラムのHPLCによって分析した、抗CD45IgG(上記と同じ初期濃度の抗CD45 IgG)で官能化した架橋IL−15N72D/sushi−Fcタンパク質ナノゲル。

0148

BioSep4000サイズ排除クロマトグラフィーカラムのHPLCによって分析した、抗CD45IgGおよびpolyK30で官能化した架橋IL−15N72D/sushi−Fcタンパク質ナノゲル。

0149

図9は、CD8 T細胞とのタンパク質ナノゲル会合を示す。CD8 T細胞を、3重量%のAlexa−647コンジュゲートIL−15N72D/sushi−Fcを含有するIL−15N72D/sushi−Fcタンパク質ナノゲル(バックパック)と会合させた。FBS+5%DMSO中で、CD8 T細胞を一晩凍結した。融解して、IL−2含有培地(20ng/ml)中でCD8 T細胞を培養し、示されている時点において、フローサイトメトリーによってそれらのAlexa−647蛍光を測定した。

0150

図10は、T細胞拡大分析を示す。CD8 T細胞をIL−15N72D/sushi−Fcバックパックとコンジュゲートしてから(右の群)、またはコンジュゲートせずに(左の群)、FBS+5%DMSO中で一晩凍結した。融解して、IL−2含有培地(20ng/ml)中で両群を培養し、4時間後(灰色のバー)および2日目(黒色のバー)に、フローサイトメトリーによって生細胞の数を測定した。この実験のための完全培地は、IMDM(Lonza)、Glutamaxx(Life Tech)、20%FBS(Life Tech)、2.5ug/mlヒトアルブミン(Octapharma)、0.5ug/mlイノシトール(Sigma)であった。

0151

図11A〜11Bは、T細胞拡大分析を示す。図11Aでは、無血清培地(Bambanker)中で2週間凍結する前に、CD3 T細胞をIL−15N72D/sushi−Fcタンパク質ナノゲル(バックパック)と会合させたか(右端の群)、または会合させなかった(左端の3つの群)。融解して、完全培地中で第1の群を培養し(培地のみ)、IL−2含有(20ng/ml)完全培地中で第2の群を培養し(IL−2(可溶性))、IL−15N72D/sushi−Fc含有(0.6ug/ml)完全培地中で第3の群を培養し(IL−15N72D/sushi−Fc(0.6ug/ml))、完全培地中で第4の群を培養した(IL−15N72D/sushi−Fcバックパック)。16時間後(灰色のバー)および9日目(黒色のバー)に、フローサイトメトリーによって生細胞の数を測定した。図11Bでは、無血清培地(Bambanker)中で一晩凍結する前に、CD3 T細胞をIL−15WT/sushi−Fc(バックパック)とコンジュゲートさせたか(右端の群)、またはコンジュゲートさせなかった(左端の3つの群)。融解して、完全培地中で第1の群を培養し(培地のみ)、IL−2含有(20ng/ml)完全培地中で第2の群を培養し(IL−2(可溶性))、IL−15WT/sushi−Fc含有(12ug/ml)完全培地中で第3の群を培養し(IL−15WT/sushi−Fc(12ug/ml))、完全培地中で第4の群を培養した(IL−15WT/sushi−Fcバックパック)。2日目(薄灰色のバー)、6日目(濃灰色のバー)および7日目(黒色のバー)に、顕微鏡検査によって生細胞の数を測定した。この実験のための完全培地は、IMDM(Lonza)、Glutamaxx(Life Tech)、20%FBS(Life Tech)、2.5ug/mlヒトアルブミン(Octapharma)、0.5ug/mlイノシトール(Sigma)であった。

0152

図12A〜12Bは、NK−92細胞株および初代NK細胞の拡大分析を示す。図12Aでは、NK−92細胞をIL−15WT/sushi−Fcタンパク質ゲル(バックパック)と会合させたか(右端の2つの群)、または会合させなかった(左端の3つの群)。最初の4群は、無血清培地(Bambanker)中で2時間凍結させ、5群は、洗浄し、完全培地中で培養した(IL−15WT/sushi−Fcバックパック(非凍結))。左端の4つの群を融解して、完全培地中で第1の群を培養し(培地のみ)、IL−2含有(20ng/ml)完全培地中で第2の群を培養し(IL−2(可溶性))、IL−15WT/sushi−Fc含有(12ug/ml)完全培地中で第3の群を培養し(IL−15WT/sushi−Fc(12ug/ml))、完全培地中で第4の群を培養した(IL−15WT/sushi−Fcバックパック)。1日目(薄灰色のバー)、5日目(濃灰色のバー)および6日目(黒色のバー)に、顕微鏡検査によって生細胞の数を測定した。この実験のための完全培地は、組換えトランスフェリン(Lonza)、Glutamaxx(Life Tech)、5%ヒト血清AB(Corning)を含有するXvivo10であった。図12Bでは、無血清培地(Bambanker)中で2週間凍結する前に、初代NK細胞をIL−15N72D/sushi−Fcタンパク質ナノゲル(バックパック)と会合させたか(右端の群)、または会合させなかった(左端の3つの群)。融解して、完全培地中で第1の群を培養し(培地のみ)、IL−2含有(20ng/ml)完全培地中で第2の群を培養し(IL−2(可溶性))、IL−15N72D/sushi−Fc含有(0.6ug/ml)完全培地中で第3の群を培養し(IL−15N72D/sushi−Fc(0.6ug/ml))、完全培地中で第4の群を培養した(IL−15N72D/sushi−Fcバックパック)。16時間後(灰色のバー)および9日目(黒色のバー)に、フローサイトメトリーによって生細胞の数を測定した。この実験のための完全培地は、組換えトランスフェリン(Lonza)、Glutamaxx(Life Tech)、5%ヒト血清AB(Corning)を含有するXvivo10であった。

0153

図13A〜13Bは、T細胞サブセット分析を示す。図13Aでは、CD3 T細胞をIL−15N72D/sushi−Fcタンパク質ナノゲル(バックパック)と会合させてから(右端の群)、または会合させずに(左端の3つの群)、無血清培地(Bambanker)中で2週間凍結した。融解して、完全培地中で第1の群を培養し(培地のみ)、IL−2含有(20ng/ml)完全培地中で第2の群を培養し(IL−2(可溶性)、IL−15N72D/sushi−Fc含有(0.6ug/ml)完全培地中で第3の群を培養し(IL−15N72D/sushi−Fc(0.6ug/ml))、完全培地中で第4の群を培養した(IL−15N72D/sushi−Fcバックパック)。9日間培養した後、サブセット図13A)および活性化(図13B)マーカーの発現について、フローサイトメトリーによってCD3 T細胞を分析した。

0154

図14A〜14Bは、T細胞効力分析を示す。図14Aでは、無血清培地(Bambanker)中で2週間凍結させる前に、CD3 T細胞をIL−15N72D/sushi−Fcタンパク質ナノゲル(バックパック)と会合させたか(右端の群)、または会合させなかった(左端の3つの群)。融解して、完全培地中で第1の群を培養し(培地のみ)、IL−2含有(20ng/ml)完全培地中で第2の群を培養し(IL−2(可溶性)、IL−15N72D/sushi−Fc含有(0.6ug/ml)完全培地中で第3の群を培養し(IL−15N72D/sushi−Fc(0.6ug/ml))、完全培地中で第4の群を培養した(IL−15N72D/sushi−Fcバックパック)。1日間培養した後、異なるエフェクター対標的(E:T)比でCD3 T細胞を標的細胞(Daudi)と共に共培養した。16時間後に、フローサイトメトリーによって標的細胞の死滅を測定した。Tukeyの多重比較検定による2元配置ANOVAによって、統計的有意性を計算した。*:p<0.05;**:p<0.01。図14Bは、図14Aと同じ細胞からのIFNg放出の測定を示す。この実験のための完全培地は、IMDM(Lonza)、Glutamaxx(Life Tech)、20%FBS(Life Tech)、2.5ug/mlヒトアルブミン(Octapharma)、0.5ug/mlイノシトール(Sigma)であった。

0155

図15A〜図15Bは、T細胞効力分析を示す。図15Aでは、CD8 T細胞をIL−15N72D/sushi−Fcタンパク質ナノゲル(バックパック)と会合させ、洗浄および完全培地で培養したか、または無血清培地(Bambanker)中で凍結した(2日間)。融解して、完全培地中で、CD8 T細胞を培養した。18日間培養した後(「非凍結」の群については20日間)、異なるエフェクター対標的(E:T)比でCD8 T細胞を標的細胞(Daudi)と共に共培養した。16時間後に、フローサイトメトリーによって標的細胞の死滅を測定した。Sidakの多重比較検定による2元配置ANOVAによって、統計的有意性を計算した。n.s.:有意でない。図15Bは、図15Aと同じ細胞からのIFNg放出の測定を示す。この実験のための完全培地は、IMDM(Lonza)、Glutamaxx(Life Tech)、20%FBS(Life Tech)、2.5ug/mlヒトアルブミン(Octapharma)、0.5ug/mlイノシトール(Sigma)であった。

0156

図16A〜図16Bは、T細胞効力分析を示す。図16Aでは、CD8 T細胞を、IL−15N72D/sushi−Fcタンパク質ナノゲル(バックパック)と会合させたか(右端の群)、または会合させず(左端の2つの群)、洗浄およびIL−2(20ng/ml)含有培地で培養したか(左端の群)、またはFBS+5%DMSO中で凍結した(右端の2つの群)(一晩)。融解して、IL−2含有培地(20ng/ml)中で、両群を培養した。3日間培養した後、異なるエフェクター対標的(E:T)比でCD8 T細胞を標的細胞(Daudi)と共に共培養した。16時間後に、フローサイトメトリーによって標的細胞の死滅を測定した。Sidakの多重比較検定による2元配置ANOVAによって、統計的有意性を計算した。****:p<0.0001。図16Bは、図16Aと同じ細胞からのIFNg放出の測定を示す。この実験のための完全培地は、IMDM(Lonza)、Glutamaxx(Life Tech)、20%FBS(Life Tech)、2.5ug/mlヒトアルブミン(Octapharma)、0.5ug/mlイノシトール(Sigma)であった。

0157

図17A〜17Bは、初代NK細胞効力分析を示す。図17Aでは、無血清培地(Bambanker)中で2週間凍結させる前に、NK細胞をIL−15N72D/sushi−Fcバックパックとコンジュゲートさせたか(右端の群)、またはコンジュゲートさせなかった(左端の3つの群)。融解して、完全培地中で第1の群を培養し(培地のみ)、IL−2含有(20ng/ml)完全培地中で第2の群を培養し(IL−2(可溶性)、IL−15N72D/sushi−Fc含有(0.6ug/ml)完全培地中で第3の群を培養し(IL−15N72D/sushi−Fc(0.6ug/ml))、完全培地中で第4の群を培養した(IL−15N72D/sushi−Fcバックパック)。1日間培養した後、異なるエフェクター対標的(E:T)比でNK細胞を標的細胞(Daudi)と共に共培養した。16時間後に、フローサイトメトリーによって標的細胞の死滅を測定した。図17Bは、図17Aと同じ細胞からのIFNg放出の測定を示す。この実験のための完全培地は、組換えトランスフェリン(Lonza)、Glutamaxx(Life Tech)、5%ヒト血清AB(Corning)を含有するXvivo10であった。

0158

図18A〜18Bは、初代マウス細胞生存能力分析を示す。図18Aでは、インビトロ活性化T細胞(実施例14を参照のこと)を、ハンク平衡塩溶液(HBSS;黒色のバー)と共にインキュベートしたか(0日目)、またはIL−15MUT/sushi−Fc2Daバックパック(灰色のバー)もしくはIL−15WT/sushi−Fc2Daバックパック(灰色の斜線バー)とコンジュゲートした。IL−15MUT/sushi−Fc2Daバックパックは、IL15タンパク質内にD8N変異(これは、IL15タンパク質を不活性にする)を有する。洗浄後(実施例21を参照のこと)、T細胞を半分に分割し、CM−mT中で培養したか(実施例31を参照のこと)、または無血清培地(Bambanker)中で凍結した(5日間)。融解後、ならびに2日間培養した後、二重蛍光顕微鏡検査(アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム、Cat.CS2−0106;Cellometer,Nexcelom BiosciencesLLC)によって、T細胞生存能力を測定した。NA:該当なし。F/T:凍結/融解。BP:バックパック。図18Bでは、IL−15MUT/sushi−Fc2Daバックパックを用いず、培養液中でT細胞を2日間ではなく3日間保持する以外は同じ実験を、独立した操作者が反復した。

0159

図19は、培養中の初代マウスT細胞拡大を示す。インビトロ活性化T細胞(実施例31を参照のこと)を、ハンクス平衡塩溶液(HBSS;黒色のバー)と共にインキュベートしたか(0日目)、またはIL−15WT/sushi−Fc2Daバックパック(灰色の斜線バー)とコンジュゲートした。洗浄後(実施例21を参照のこと)、T細胞を半分に分割し、CM−mT中で培養したか(実施例31を参照のこと)、または無血清培地(Bambanker)中で凍結した(5日間)。融解後、ならびに3日間および6日間培養した後、二重蛍光顕微鏡検査(アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム、Cat.CS2−0106;Cellometer,Nexcelom)によって、T細胞をカウントした。結果を、0日目に対する変化倍率として報告する。F/T:凍結/融解。BP:バックパック。

0160

図20A〜20Bは、培養中の初代ヒトT細胞拡大を示す。両パネルでは、CD8 T細胞をハンクス平衡塩溶液(HBSS;黒色のバー)と共に、もしくはIL−15WT/sushi−Fc2Da(暗灰色のバー)と共にインキュベートし、またはPeg5kpolyK30を有しないIL−15WT/sushi−Fc2Daバックパック(薄灰色のバー)と、もしくはPeg5kpolyK30を有するIL−15WT/sushi−Fc2Da(白色のバー)とコンジュゲートした。図20Aでは、T細胞を凍結せずに新鮮培養し、図20Bでは、(90%FBS+10%DMSO中で)T細胞を7日間凍結し、融解し、さらに7日間培養した。両パネルでは、培養条件は、サイトカインを含んでいなかった。示されている時点において、フローサイトメトリーによって生細胞の数を測定した。結果は、0日目に対する変化倍率として報告されている。BP:バックパック。

0161

図21A〜21Bは、レシピエントマウス循環中の移入マウスPmel T細胞の濃度を示す。両パネルでは、Pmelトランスジェニックマウス脾臓から初代マウスT細胞を単離し、インビトロで活性化した(実施例31)。図21Aでは、活性化T細胞をIL−15MUT/sushi−Fc2DaまたはIL−15WT/sushi−Fc2Daバックパックとコンジュゲートし、凍結した(Bambanker)。図21Bでは、活性化T細胞をハンクス平衡塩溶液(HBSS)と共にインキュベートし、またはIL−15WT/sushi−Fc2Daバックパックとコンジュゲートし、凍結した(Bambanker)。融解して、T細胞を洗浄し、マウス1匹当たり107個を静脈内注射した。5日目(図21A)または7日目(図21B)に、フローサイトメトリーによって生細胞の数を測定した。独立した操作者が、2回の実験を実施した。結果は、血液1μl当たりのT細胞の数として報告されている。マンホイットニー検定による統計分析。BP:バックパック。

0162

図22は、レシピエントマウスの腫瘍微小環境中の移入マウスPmel T細胞の濃度を示す。Pmelトランスジェニックマウスの脾臓から初代マウスT細胞を単離し、インビトロで活性化した(実施例31)。活性化T細胞をハンクス平衡塩溶液(HBSS)と共にインキュベートし、IL−15MUT/sushi−Fc2Daバックパックとコンジュゲートし、またはIL−15WT/sushi−Fc2Daバックパックとコンジュゲートした。新鮮細胞または凍結細胞(マウス1匹当たり107個)を動物に注射した。26日目に、フローサイトメトリーによって、腫瘍に浸潤した生移入T細胞の数を測定した。結果は、腫瘍1mg当たりのT細胞の数として報告されている。マンホイットニー検定による統計分析。BP:バックパック。

0163

詳細な説明
少なくとも1つの保存された機能を有する(例えば、保存された生存能力、増殖および細胞傷害活性または活性化の1つまたはそれよりも多くを有する)有核細胞、例えば、免疫細胞を(例えば、エクスビボで)生産するための最適化された方法および組成物が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、免疫細胞機能を保存するための方法が本明細書に開示される。前記方法は、保存剤を含む粒子、例えばナノ粒子、例えばタンパク質(例えば、タンパク質ナノゲル)を含むナノ粒子と、有核細胞、例えば免疫細胞とを接触させる工程(例えば、被験体から得られた例えば免疫細胞の集団をエクスビボで接触させる工程)を含む。

0164

本明細書で使用される場合、「保存剤」は、有核細胞の生存能力、有核細胞の増殖能力、または有核細胞の別の生物学的活性、例えば細胞傷害活性、有核細胞の活性化(例えば、免疫細胞との関連では、活性化は、免疫細胞増殖、サイトカイン分泌または標的細胞死滅の1つまたはそれよりも多くの増加を含む)、因子、例えばサイトカイン、例えば炎症促進性サイトカイン分泌する能力の1つまたはそれよりも多くを促進する、例えば保存または増強する薬剤、例えばタンパク質を指す。実施形態では、保存剤は、インターフェロンガンマを分泌する能力を促進する。

0165

実施形態では、前記保存剤は、1つまたはそれより多くの(例えば、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれより多くの)治療用タンパク質または生物学的に活性なタンパク質、例えば1つまたはそれより多くのサイトカイン分子(例えば、IL−15、IL−2、IL−7およびIL−21(そのバリアント形態、例えば変異体を含む);ポリペプチドと共にサイトカイン分子を含む複合体、例えばサイトカイン受容体複合体;その融合形態またはアゴニスト形態);成長因子;および他の分子、例えばアゴニスト、例えば共刺激分子、例えばOX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、もしくはCD137のアゴニストに対する抗体分子またはリガンドから選択される。いくつかの実施形態では、保存剤としては、融合物、例えばサイトカインと免疫グロブリンFc領域との融合物、または抗体分子(例えば、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、Fab断片、FAB2断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えばsdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体)が挙げられる。

0166

あるいはまたは組み合わせて、バックパックピローは、抗体分子(例えば、本明細書に記載される抗体分子)、ヒト血清アルブミンまたは他の結合部分、例えばフィブロネクチン分子、ダーピン、受容体外部ドメインアプタマーまたは結合ペプチドの1つまたはそれよりも多くを含む。実施形態では、治療用タンパク質は、例えば分解性リンカー(例えば、ジスルフィドリンカー)によって、ナノ粒子に共有結合的にカップリングされる、例えば架橋される。したがって、本明細書に開示される方法および組成物は、細胞療法、例えば免疫療法のための有意な利益を提供し得る。

0167

定義
特定の用語を以下で定義する。さらなる定義は、本出願を通して提供される。

0168

本明細書で使用される場合、「a」および「an」という詞は、その冠詞の文法上の目的語の1つまたは1つより多く、例えば少なくとも1つを指す。「a」または「an」という語の使用は、「含む」という用語と併せて使用される場合、本明細書では「1つ」を意味し得るが、それはまた、「1つまたはそれより多く」、「少なくとも1つ」および「1つまたは1つより多く」の意味と一致する。

0169

本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」は、一般に、測定の性質または精度を考慮して、測定された量に関する誤差の許容され得る程度を意味する。誤差の例示的な程度は、所定の範囲値の20パーセント(%)以内、典型的には10%以内、より典型的には5%以内である。

0170

自己」という用語は、それがその後に再導入されるのと同じ個体に由来する任意の材料を指す。

0171

「同種」という用語は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。

0172

本明細書で使用される場合、「取得する」または「取得」という用語は、物理的エンティティまたは値を「直接的に取得すること」または「間接的に取得すること」によって、物理的エンティティ(例えば、サンプル、細胞もしくは細胞集団、ポリペプチド、核酸または配列)または値、例えば数値を得ることを指す。一実施形態では、取得は、細胞または細胞集団(例えば、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞または集団)を得ることまたは採取することを指す。「直接的な取得」は、物理的エンティティまたは値を得るためのプロセスを実施すること(例えば、合成方法または分析方法または精製方法を実施すること)を意味する。「間接的な取得」は、別の団体または供給源(例えば、物理的エンティティまたは値を直接的に取得した第3者研究室)から物理的エンティティまたは値を受け取ることを指す。

0173

「免疫細胞」は、その用語が本明細書で使用される場合、免疫応答に、例えば免疫応答の促進に関与する細胞を指す。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、免疫エフェクター細胞である。免疫エフェクター細胞の例としては、限定されないが、T細胞、例えばCD4+およびCD8+T細胞、アルファ/ベータT細胞およびガンマ/デルタT細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、ナチュラルキラーT(NKT)細胞および肥満細胞が挙げられる。「免疫細胞」はまた、免疫応答に関与する細胞の改変型、例えば改変NK細胞、例えばKlingemannら(前掲)に記載されているように、例えばNK細胞株NK−92(ATCCcat.No.CRL−2407)、haNK(高親和性Fc受容体FcγRIIIaを発現するNK−92バリアント(158V))およびtaNK(遺伝子でトランスフェクトされた標的NK−92細胞であって、所定の腫瘍抗原に対するCARを発現する標的NK−92細胞)を指す。

0174

本明細書で使用される場合、「細胞傷害性Tリンパ球」(CTL)は、標的細胞を死滅する能力を有するT細胞を指す。2つの工程が起こると(1)標的細胞上の抗原結合MHC分子と、CTL上のT細胞受容体との間の相互作用がなされ;2)T細胞および標的細胞上への共刺激分子の嵌合によって共刺激シグナルが作られると)、CTL活性化が起こり得る。次いで、CTLは、標的細胞上の特定の抗原を認識し、例えば細胞溶解によるこれらの標的細胞の破壊誘導する。

0175

本明細書で使用される場合、「腫瘍浸潤リンパ球」(TIL)は、腫瘍に遊走したリンパ球を指す。実施形態では、TILは、異なる成熟段階または分化段階の細胞であり得、例えば、TILは、他のタイプのリンパ球の中でも、CTL、Tregおよび/またはエフェクター記憶T細胞を含み得る。

0176

相同」または「同一性」という用語は、2つのポリマー分子間、例えば、2つの核酸分子、例えば2つのDNA分子もしくは2つのRNA分子間または2つのポリペプチド分子間におけるサブユニット配列同一性を指す。2つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じモノマーサブユニットによって占められている場合;例えば、2つの各DNA分子における位置がアデニンによって占められている場合、それらは、その位置において相同または同一である。2つの配列間の相同性は、一致位置または相同位置の数の一次関数である;例えば、2つの配列における位置の半数(例えば、長さ10サブユニットのポリマーにおける5つの位置)が相同である場合、2つの配列は50%相同である;位置の90%(例えば、10個中9個)が一致または相同である場合、2つの配列は90%相同である。

0177

本明細書で使用される場合、「因子分子」は、天然に存在する全長野生型分子、および天然に存在する分子の活性の少なくとも10%を有するそのバリアント、例えば機能的バリアント(例えば、切断型、断片、変異型(例えば、実質的に類似の配列)またはその誘導体化形態)を指す。実施形態では、因子分子は、天然に存在する分子の活性の少なくとも30、50または80%の活性を有する。実施形態では、バリアントは、天然に存在する野生型分子の対応する部分と70、80、90または95%の相同性を有する。実施形態では、因子分子は、抗体分子、サイトカイン分子、受容体分子、共刺激分子である。

0178

ポリペプチドとの関連における「機能的バリアント」という用語は、天然に存在する配列の1つまたはそれより多くの活性の少なくとも10%を有することができるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、機能的バリアントが、天然に存在する配列の1つまたはそれより多くの活性を有するように、機能的バリアントは、天然に存在する配列と実質的なアミノ酸配列同一性を有するか、または実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされる。

0179

本明細書で使用される場合、「抗体分子」は、少なくとも1つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば免疫グロブリン鎖またはその断片を指す。抗体分子は、抗体(例えば、全長抗体)および抗体断片包含する。例えば、全長抗体は、天然に存在するかまたは正常な免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスによって形成される免疫グロブリン(Ig)分子(例えば、IgG抗体)である。実施形態では、抗体分子は、免疫グロブリン分子免疫学的に活性な抗原結合部分、例えば抗体断片を指す。抗体断片、例えば機能的断片は、抗体の一部、例えばFab、Fab’、F(ab’)2、F(ab)2、可変断片(Fv)、ドメイン抗体(dAb)または単鎖可変断片(scFv)である。機能的抗体断片は、インタクトな(例えば、全長)抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合する。「抗体断片」または「機能的断片」という用語はまた、可変領域からなる単離された断片、例えば、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片、またはペプチドリンカーによって軽可変領域および重可変領域が接続された組換え単鎖ポリペプチド分子(「scFvタンパク質」)を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、抗原結合活性を有しない抗体の一部、例えばFc断片または単一アミノ酸残基を含まない。例示的な抗体分子としては、全長抗体および抗体断片、例えばdAb(ドメイン抗体)、単鎖、Fab、Fab’およびF(ab’)2断片ならびに単鎖可変断片(scFv)が挙げられる。

0180

実施形態では、抗体分子は単一特異性であり、例えば、それは、単一のエピトープに対する結合特異性を含む。いくつかの実施形態では、抗体分子は多重特異性であり、例えば、それは、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、第1の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第1のエピトープに対する結合特異性を有し、第2の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第2のエピトープに対する結合特異性を有する。いくつかの実施形態では、抗体分子は、二重特異性抗体分子である。本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体分子」は、1つより多くの(例えば、2つ、3つ、4つまたはそれより多くの)エピトープおよび/または抗原に対する特異性を有する抗体分子を指す。

0181

本明細書で使用される場合、「サイトカイン分子」は、天然に存在する野生型サイトカインの全長、断片またはバリアント(天然に存在するサイトカイン分子の活性の少なくとも10%の活性を有するその断片および機能的バリアントを含む)を指す。実施形態では、サイトカイン分子は、天然に存在する分子の活性、例えば免疫調節活性の少なくとも30、50または80%を有する。実施形態では、サイトカイン分子は、免疫グロブリンFc領域に場合によりカップリングされた受容体ドメイン、例えばサイトカイン受容体ドメインをさらに含む。他の実施形態では、サイトカイン分子は、免疫グロブリンFc領域にカップリングされる。他の実施形態では、サイトカイン分子は、抗体分子(例えば、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、Fab断片、FAB2断片またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えばsdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体)にカップリングされる。

0182

本明細書で使用される場合、「サイトカインアゴニスト」は、天然に存在するサイトカインの少なくとも1つの活性を誘発するサイトカイン受容体のアゴニスト、例えばサイトカイン受容体に対する抗体分子(例えば、アゴニスト抗体)を含み得る。

0183

「サンプル」または「組織サンプル」は、被験体または患者の組織または体液から得られた生物学的サンプルを指す。組織サンプルの供給源は、新鮮器官凍結器官および/もしくは保存器官、組織サンプル、生検または吸引物由来の固体組織;血液または任意の血液成分(例えば、血清血漿);骨髄または任意の骨髄成分;体液、例えば尿、脳脊髄液全血、血漿および血清であり得る。サンプルは、非細胞画分(例えば、尿、血漿、血清または他の非細胞体液)を含み得る。他の実施形態では、個体から得られるサンプルが由来する体液は、血液(例えば、全血)を含む。

0184

「被験体」という用語は、免疫応答が誘発され得る生物(例えば、哺乳動物、ヒト)を含む。一実施形態では、被験体は、患者、例えば免疫細胞療法を必要とする患者である。別の実施形態では、被験体は、ドナー、例えば同種移植用の免疫細胞の同種ドナーである。

0185

「実質的に精製された細胞」という用語は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、それがその天然に存在する状態で通常は結合している他の細胞型から分離されている細胞を指す。いくつかの場合では、実質的に精製された細胞の集団は、均一な細胞集団を指す。他の場合では、この用語は、それらがそれらの天然の状態で本来的に結合している細胞から分離されている細胞を単に指す。いくつかの態様では、細胞は、インビトロで培養される。他の態様では、細胞は、インビトロで培養されない。

0186

さらなる定義は、本明細書を通して提供される。

0187

保存剤
いくつかの実施形態では、保存剤は、有核細胞(例えば、免疫細胞)の生存能力、有核細胞の増殖能力、または有核細胞の別の生物学的活性、例えば細胞傷害活性、有核細胞の活性化、因子、例えばサイトカイン、例えば炎症促進性サイトカインを分泌する能力の1つまたはそれよりも多くを促進する、例えば保存または増強するタンパク質である。実施形態では、保存剤は、インターフェロンガンマを分泌する能力を促進する。

0188

実施形態では、前記保存剤は、1つまたはそれより多くの(例えば、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれより多くの)治療用タンパク質または生物学的に活性なタンパク質、例えば1つまたはそれより多くのサイトカイン分子(例えば、免疫刺激性サイトカイン、例えばIL−15、IL−2、IL−7およびIL−21(バリアント、例えばその変異体形態を含む)、またはサイトカイン複合体、例えば本明細書に記載されるIL−15複合体から選択される。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、例えば免疫エフェクター細胞、例えばT細胞またはNK細胞の増殖を促進する。

0189

他の実施形態では、保存剤は、成長因子である。

0190

他の実施形態では、保存剤は、分子、例えばアゴニスト、例えば共刺激分子、例えばOX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、またはCD137のアゴニストに対する抗体分子またはリガンドを含む。

0191

実施形態では、保存剤は、T細胞のアゴニスト、例えばアゴニスト抗体もしくはその断片、または共刺激分子のアクチベーター/アゴニストを含む。実施形態では、T細胞のアゴニストは、共刺激分子を含むか、または共刺激分子である。共刺激分子は細胞表面分子であり、必要に応じて、抗原に対するリンパ球、例えばT細胞の効率的な応答を増強する。実施形態では、共刺激分子は、抗原受容体またはそのリガンド以外の分子である。理論に縛られることを望むものではないが、共刺激は、T細胞の拡大、生存およびエフェクター機能を増強すると考えられる(例えば、T細胞の持続性および/または抗がん活性を増強する。例えば、Songら、BLOD.2012;119(3):696−706を参照のこと)。例示的な共刺激分子として、CD28、ICOS(CD278)、BTLA、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、CD160(BY55)、OX40、CD27、CD2、CD7、CD40、CD30、4−1BB(CD137)、ICAM−1、B7−1、トール様受容体LFA−1(CD11a/CD18)、GITR、BAFFR、B7−H3、シグナル伝達リンパ球活性化分子SLAMタンパク質)、SLAMF7、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO−3)、SLAMF4(CD244、2B4)、インテグリン、IL2Rベータ、ITGA4、MHCクラスI分子、TNF受容体、CD49D、CD49f、LFA−1、CD29、CD18、TNFR2、CD84、RANKL、CD229、CD69、CD100(SEMA4D)、およびSLAMF6(NTB−A、Ly108)が挙げられるが、これらに限定されない。

0192

いくつかの実施形態では、保存剤は、共刺激分子、例えばOX40、CD28、GITR、VISTA、CD40、CD3、またはCD137のアゴニストに対するアゴニスト(例えば、抗体分子またはアゴニストリガンド)を含む。

0193

いくつかの実施形態では、保存剤は、融合物、例えばサイトカイン分子、成長因子または共刺激分子と免疫グロブリンFc領域との融合物を含む。

0194

あるいはまたは組み合わせて、保存剤は、抗体分子(例えば、免疫グロブリンFabまたはscFv断片、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体)、ヒト血清アルブミンまたは他の結合部分、例えばフィブロネクチン分子、ダーピン、受容体外部ドメイン、アプタマーまたは結合ペプチドの1つまたはそれよりも多くを含む。

0195

いくつかの実施形態では、保存剤は、プロタミン、キトサン、炭水化物、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、天然ポリマー、ポリサッカライド、デキストラマー、セルロース、フィブロネクチン、コラーゲン、フィブリンまたはプロテオグリカンの1つまたはそれよりも多くを含む。

0196

いくつかの実施形態では、保存剤は、1つまたはそれより多くの(例えば、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれより多くの)治療用タンパク質、具体的には免疫刺激性サイトカインまたは抗体(例えば、IL−15、IL−2、IL−7、IL−21、CD3アゴニストまたはCD137アゴニスト)(これらのサイトカインの変異体またはスーパーアゴニスト、ならびにこのようなサイトカインと、免疫グロブリンFc領域、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、ヒト血清アルブミン、単一ドメイン抗体、さらなるサイトカイン、二重特異性物、フィブロネクチン、ダーピン、受容体外部ドメイン、アプタマーまたは結合ペプチドとの遺伝子融合物形態を含む)を含む。

0197

成長因子分子
本明細書に記載される方法および組成物、例えばナノ粒子は、1つまたはそれより多くの成長因子分子を含み得る。実施形態では、成長因子分子は、成長因子の完全長、断片またはバリアント、例えば1つまたはそれより多くの変異を含む成長因子である。実施形態では、成長因子は、骨形成タンパク質(BMP)、白血病抑制因子(LIF)、上皮成長因子(EGF)、エフリン(例えば、A1、A2、A3、A4、A5、B1、B2またはB3)、エリスロポエチン(EPO)、線維芽細胞成長因子(例えば、FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22またはFGF23)、GDNFファミリーのリガンド、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、成長分化因子−9(GDF9)、肝細胞成長因子HGF)、肝細胞癌由来成長因子(HDGF)、インスリンインスリン様成長因子(例えば、IGF−1またはIGF−2)、ケラチノサイト成長因子(KGF)、遊走促進因子(MSF)、マクロファージ刺激タンパク質(MSP)、ミオスタチン(GDF−8)、ニューレグリン(例えば、NRG1、NRG2、NRG3、NRG4)、ニューロトロフィン脳由来神経栄養因子(BDNF)、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン−3(例えば、NT−3またはNT−4)、胎盤成長因子(PGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、T細胞成長因子(TCGF)、トロンボポエチンTPO、トランスフォーミング成長因子(例えば、TGF−アルファまたはTGF−ベータ)または血管内皮細胞成長因子(VEGF)またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。

0198

サイトカイン分子
本明細書に記載される方法および組成物、例えばナノ粒子は、1つまたはそれより多くのサイトカイン分子を含み得る。実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカインの全長、断片またはバリアント、例えば1つまたはそれより多くの変異を含むサイトカインである。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキン−1アルファ(IL−1アルファ)、インターロイキン−1ベータ(IL−1ベータ)、インターロイキン−2(IL−2)、インターロイキン−4(IL−4)、インターロイキン−5(IL−5)、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−7(IL−7)、インターロイキン−12(IL−12)、インターロイキン−15(IL−15)、インターロイキン−17(IL−17)、インターロイキン−18(IL−18)、インターロイキン−21(IL−21)、インターロイキン−23(IL−23)、インターフェロン(IFN)アルファ、IFNベータ、IFNガンマ、腫瘍壊死アルファ、GM−CSF、GCSF、またはそれらの断片もしくはバリアント、または前記サイトカインの任意の組み合わせから選択されるサイトカインを含む。別の実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキン−2(IL−2)、インターロイキン−7(IL−7)、インターロイキン−12(IL−12)、インターロイキン−15(IL−15)、インターロイキン−18(IL−18)、インターロイキン−21(IL−21)、インターロイキン−23(IL−23)またはインターフェロンガンマ、またはそれらの断片もしくはバリアント、または前記サイトカインの任意の組み合わせから選択される。サイトカイン分子は、単量体であっても、二量体であってもよい。

0199

実施形態では、サイトカイン分子は、受容体ドメイン、例えばサイトカイン受容体ドメインをさらに含む。一実施形態では、サイトカイン分子は、本明細書に記載されるIL−15受容体またはその断片(例えば、IL−15受容体アルファの細胞外IL−15結合ドメイン)を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、IL−15分子、例えば本明細書に記載されるIL−15またはIL−15スーパーアゴニストである。本明細書で使用される場合、サイトカイン分子の「スーパーアゴニスト」形態は、天然に存在するサイトカインと比較して、例えば少なくとも10%、20%、30%増加した活性を示す。例示的なスーパーアゴニストは、IL−15SAである。いくつかの実施形態では、IL−15SAは、例えば本明細書に記載されるように、IL−15と、IL−15受容体のIL−15結合断片、例えばIL−15受容体アルファまたはそのIL−15結合断片との複合体を含む。

0200

別の実施形態では、サイトカイン分子は、抗体分子、例えば、免疫グロブリンFabもしくはscFv断片、Fab断片、FAB2断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、sdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片、例えば、Fc領域、単一ドメイン抗体、二重特異性または多重特異性抗体)をさらに含む。一実施形態では、サイトカイン分子は、免疫グロブリンFcまたはFabをさらに含む。

0201

いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、IL−2分子、例えばIL−2またはIL−2−Fcである。

0202

他の実施形態では、サイトカインアゴニストが、本明細書に開示される方法および組成物において使用され得る。実施形態では、サイトカインアゴニストは、天然に存在するサイトカインの少なくとも1つの活性を誘発するサイトカイン受容体のアゴニスト、例えばサイトカイン受容体に対する抗体分子(例えば、アゴニスト抗体)である。実施形態では、サイトカインアゴニストは、サイトカイン受容体のアゴニスト、例えばIL−15RaまたはIL−21Rから選択されるサイトカイン受容体に対する抗体分子(例えば、アゴニスト抗体)である。

0203

IL−15分子
いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、IL−15分子、例えば、IL−15の全長、断片またはバリアント、例えば、ヒトIL−15である。ある実施形態では、IL−15分子は、野生型、ヒトIL−5であり、例えば、配列番号1のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、IL−15分子は、ヒトIL−5のバリアントであり、例えば、1つもしくはそれより多くのアミノ酸改変を有する。

0204

いくつかの実施形態では、IL−15分子は、変異、例えば、本明細書の配列番号6に示されるN72D点変異を含む。いくつかの実施形態では、IL−15分子は、配列番号6との少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列を含み、配列は、野生型ヒトIL−15と比較してN72D変異を含み、IL−15Rα結合活性を有する。

0205

他の実施形態では、サイトカイン分子は、免疫グロブリンFcまたは抗体分子に場合によりカップリングされた受容体のドメイン、例えばIL−15Rアルファの細胞外ドメインをさらに含む。実施形態では、サイトカイン分子は、WO2010/059253に記載されているIL−15スーパーアゴニスト(IL−15SA)である。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、例えばRubinsteinら、PNAS 103:24 p.9166−9171(2006)に記載されているように、IL−15と、Fcに融合された可溶性IL−15受容体アルファドメインとを含む(例えば、sIL−15Ra−Fc融合タンパク質)。

0206

IL−15分子は、ポリペプチド、例えば、サイトカイン受容体、例えば、サイトカイン受容体ドメイン、および第2の異種ドメインをさらに含み得る。一実施形態では、異種ドメインは、免疫グロブリンFc領域である。別の実施形態では、異種ドメインは、抗体分子、例えば、Fab断片、Fab2断片、scFv断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、sdAb(ナノボディ)断片、重鎖抗体断片である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第3の異種ドメインも含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体ドメインは、第2のドメインのN末端であり、別の実施形態では、サイトカイン受容体ドメインは、第2のドメインのC末端である。

0207

野生型IL−15受容体アルファ配列ならびにこの配列の断片およびバリアントは、以下に記載されている。

0208

野生型IL−15受容体アルファ配列(Genbankアクセッション番号AAI21141.1)

0209

野生型IL−15受容体アルファ細胞外ドメイン(アクセッション番号Q13261の一部):

0210

アイソフォームCRA_dIL−15受容体アルファ細胞外ドメイン(アクセッション番号EAW86418の一部):

0211

野生型IL−15受容体アルファ配列は、配列番号4として上記で提供されている。IL−15受容体アルファは、細胞外ドメインと、23アミノ酸の膜貫通セグメントと、39アミノ酸の細胞質尾部とを含有する。IL−15受容体アルファの細胞外ドメインは、配列番号3として提供されている。

0212

他の態様では、IL−15アゴニストが使用され得る。例えば、天然に存在するサイトカインの少なくとも1つの活性を誘発するIL−15受容体のアゴニスト、例えばIL−15受容体に対する抗体分子(例えば、アゴニスト抗体)。

0213

実施形態では、IL−15受容体またはその断片は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物、例えば非ヒト霊長類に由来する。

0214

本明細書の組成物および方法は、IL−15Rαの部分、例えば、IL−15RαのSushiドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Sushiドメインおよび第2の異種ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第3の異種ドメインも含む。いくつかの実施形態では、Sushiドメインは、第2のドメインのN末端であり、別の実施形態では、Sushiドメインは、第2のドメインのC末端である。ある実施形態では、第2のドメインは、Fcドメインを含む。

0215

IL−15受容体アルファ配列の断片およびバリアントは、以下に記載されている。
最小Sushiドメイン、野生型:



拡張Sushiドメイン、野生型:



最小Sushiドメイン、L77I:



拡張Sushiドメイン、L77I:

0216

sushiドメインの野生型およびL77I変異形態は、本明細書に記載されるアッセイの1つまたはそれよりも多くにおいて、同様の活性を示した。

0217

野生型IL−15受容体アルファ配列は、配列番号2として本明細書で提供されている。IL−15受容体アルファは、細胞外ドメインと、23アミノ酸の膜貫通セグメントと、39アミノ酸の細胞質尾部とを含有する。IL−15受容体アルファの細胞外ドメインは、配列番号3として提供されている。IL−15受容体アルファの細胞外ドメインは、IL−15に結合するドメイン(これは、Sushiドメインと称される)を含む。Sushiドメインは、62アミノ酸の最小ドメイン(配列番号7)、および最小ドメインを含む65アミノ酸の拡張ドメイン(配列番号8)として提供されている。

0218

本明細書に記載されるSushiドメインは、野生型Sushiドメインと比較して1つまたはそれより多くの変異を含み得る。例えば、IL−15Raの残基77は、野生型遺伝子ではロイシンであるが、イソロイシンに変異され得る(L77I)。したがって、L77Iを含む最小Sushiドメイン(ナンバリングは、配列番号2の野生型IL−15Raを参照のこと)は、配列番号9として提供されている。L77Iを含む拡張Sushiドメイン(ナンバリングは、配列番号4の野生型IL−15Raを参照のこと)は、配列番号10として提供されている。

0219

いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の62〜171アミノ酸あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有する配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の65〜171アミノ酸あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有する配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の最大171アミノ酸あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有する配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の62〜171、62〜160、62〜150、62〜140、62〜130、62〜120、62〜110、62〜100、62〜90、62〜80、62〜70、65〜171、65〜160、65〜150、65〜140、65〜130、65〜120、65〜110、65〜100、65〜90、65〜80、または65〜70アミノ酸あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有する配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の62〜171、62〜160、62〜150、62〜140、62〜130、62〜120、62〜110、62〜100、62〜90、62〜80、62〜70、65〜171、65〜160、65〜150、65〜140、65〜130、65〜120、65〜110、65〜100、65〜90、65〜80、または65〜70アミノ酸からなる。いくつかの実施形態では、Sushiドメインは、配列番号7または配列番号8のアミノ酸配列からなる。

0220

いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の62〜171アミノ酸あるいはそれと比較して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、または40の改変(例えば、置換)を有し、IL−15結合活性を有する配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の最大171アミノ酸あるいはそれと比較して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、または40の改変(例えば、置換)を有し、IL−15結合活性を有する配列からなる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の62〜171、62〜160、62〜150、62〜140、62〜130、62〜120、62〜110、62〜100、62〜90、62〜80、62〜70、65〜171、65〜160、65〜150、65〜140、65〜130、65〜120、65〜110、65〜100、65〜90、65〜80、または65〜70アミノ酸あるいはそれと比較して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、または40の改変(例えば、置換)を有し、IL−15結合活性を有する配列からなる。

0221

いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の少なくとも62アミノ酸あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列を含み、配列は、野生型IL−15Raと比較してL77I変異を含み、IL−15結合活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の少なくとも65アミノ酸あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列を含み、配列は、野生型IL−15Raと比較してL77I変異を含み、IL−15結合活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の部分あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列を含み、配列は、野生型IL−15Raと比較してL77I変異を含み、IL−15結合活性を有する。いくつかの実施形態では、Sushiドメインは、配列番号9または配列番号10のアミノ酸配列を含む。

0222

いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の少なくとも62アミノ酸あるいはそれと比較して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、または40の改変(例えば、置換)を有する配列を含み、配列は、野生型IL−15Raと比較してL77I変異を含み、IL−15結合活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の部分あるいはそれと比較して最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、または40の改変(例えば、置換)を有する配列を含み、配列は、野生型IL−15Raと比較してL77I変異を含み、IL−15結合活性を有する。

0223

ある実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の少なくとも10、20、30、40、50、60、62、65、70、80、90、100、110、120、130、140、150、または160の連続したアミノ酸、あるいはそれと比較してL77I変異を有する配列を含む。ある実施形態では、ポリペプチドのIL−15Rα部分は、配列番号3の10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、または160〜170の連続したアミノ酸、あるいはそれと比較してL77I変異を有する配列からなる。

0224

ある実施形態では、Sushiドメインは、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類由来のSushiドメインである。

0225

実施形態では、組成物は、例えばナノ粒子を含み、および/または保存剤は、IL−15複合体、ポリペプチドと例えば共有結合的または非共有結合的に複合体化したIL−15分子を含むIL−15複合体を含み、ポリペプチドは、以下を含む第1のドメインを含む:

0226

i)配列番号3の野生型IL−15受容体アルファ細胞外ドメインの少なくとも62アミノ酸であって、ここでポリペプチドの最長の連続したIL−15受容体アルファ配列は、171以下のアミノ酸長であるか、またはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有する配列;
ii)配列番号3の少なくとも62アミノ酸であって、ここでポリペプチドの最長の連続したIL−15受容体アルファ配列は、171以下のアミノ酸長であるか、または配列番号3の対応する配列から1、2、3、4、または5アミノ酸以下だけ異なり、IL−15結合活性を有する配列;
iii)配列番号3の少なくとも62アミノ酸であって、ここでポリペプチドの最長の連続したIL−15受容体アルファ配列は、171以下のアミノ酸長であり、IL−15結合活性を有する;
iv)最小sushiドメインおよび配列番号3の171以下の連続したアミノ酸残基活性断片、例えば、IL−15結合断片、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列;
v)最小sushiドメインおよび配列番号3の171以下の連続したアミノ酸残基の活性断片、例えば、IL−15結合断片、あるいは配列番号3の対応する配列から1、2、3、4、または5アミノ酸以下だけ異なる配列;
vi)最小sushiドメインおよび配列番号3の171以下の連続したアミノ酸残基の活性断片、例えば、IL−15結合断片;
vii)拡張sushiドメインおよび配列番号3の171以下の連続したアミノ酸残基の活性断片、例えば、IL−15結合断片、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列;
viii)拡張sushiドメインおよび配列番号3の171以下の連続したアミノ酸残基の活性断片、例えば、IL−15結合断片、あるいは配列番号3の対応する配列から1、2、3、4、または5アミノ酸以下だけ異なる配列;
ix)拡張sushiドメインおよび配列番号3の171以下の連続したアミノ酸残基の活性断片、例えば、IL−15結合断片;または
x)配列番号3の少なくとも62アミノ酸、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有し、IL−15結合活性を有する配列、ここで、アミノ酸77(ナンバリングは、配列番号4の野生型IL−15受容体アルファを参照のこと)はイソロイシンである;
xi)配列番号3の少なくとも62アミノ酸、あるいは配列番号3の対応する配列から1、2、3、4、または5アミノ酸以下だけ異なり、IL−15結合活性を有する配列、ここで、アミノ酸77はイソロイシンである;
xii)IL−15結合活性を有する配列番号3の少なくとも62アミノ酸、ここで、アミノ酸77はイソロイシンである;
xiii)最小もしくは拡張sushiドメインの活性断片、例えば、IL−15結合断片、あるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する配列、ここで、アミノ酸77はイソロイシンである;
xiv)最小もしくは拡張sushiドメインの活性断片、例えば、IL−15結合断片、あるいは配列番号3の対応する配列から1、2、3、4、または5アミノ酸以下だけ異なる配列、ここで、アミノ酸77はイソロイシンである;または
xv)最小もしくは拡張sushiドメインの活性断片、例えば、IL−15結合断片、ここで、アミノ酸77はイソロイシンである、
および
場合により、第2の異種ドメイン、例えば、FcドメインもしくはFabドメイン。

0227

いくつかの実施形態では、IL−15受容体またはその断片を含むポリペプチドは、Fcドメインを含む。ある実施形態では、Fcドメインは、エフェクター弱体化Fcドメイン、例えば、ヒトIgG2 Fcドメイン、例えば、配列番号11のヒトIgG2ドメインあるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列である。

0228

実施形態では、エフェクター弱体化Fcドメインは、例えば野生型IgG1 Fcドメインと比較して、例えば配列番号12の野生型IgG1 Fcドメインと比較して減少したエフェクター活性を有する。いくつかの実施形態では、エフェクター活性は、抗体依存性細胞傷害ADCC)を含む。実施形態では、エフェクター活性は、ADCCアッセイにおいて、例えば配列番号12の野生型IgG1 Fcドメインと比較して10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%だけ減少している。いくつかの実施形態では、エフェクター活性は、補体依存性細胞傷害(CDC)を含む。実施形態では、エフェクター活性は、CDCアッセイ、例えばArmourら、“Recombinant human IgG molecules lacking Fc gamma receptor I binding and monocyte triggering activities”Eur J Immunol(1999)29:2613−24”に記載されているCDCアッセイにおいて、例えば配列番号12の野生型IgG1 Fcドメインと比較して10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%だけ減少している。

0229

いくつかの実施形態では、Fcドメインは、配列番号12のIgG1 Fcドメインあるいはそれと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

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