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技術 ジスフェリン異常症の治療のためのトランケートされたジスフェリン

出願人 ザユニバーシティオブノースカロライナアットチャペルヒルテキサステックユニバーシティシステム
発明者 ヒルシュマシュールイスサットンアールブライアン
出願日 2017年6月16日 (2年5ヶ月経過) 出願番号 2018-566292
公開日 2019年6月27日 (4ヶ月経過) 公開番号 2019-517816
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 動物の育種及び生殖細胞操作による繁殖 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 収容部屋 グリーンチャネル 活性チャンバ 円回内筋 長掌筋 母指外転筋 短橈側手根伸筋 大円筋
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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、トランケートされたジスフェリン核酸およびタンパク質、核酸を含むベクター(例えば、アデノ随伴ウイルスベクター)、および、細胞または対象へのジスフェリンの送達およびジスフェリン異常症の治療のためにそれを用いる方法に関する。

概要

背景

ジスフェリン異常症は、臨床症状にかかわらず、ジスフェリン遺伝子における突然変異によって引き起こされる筋ジストロフィーである。ジスフェリン異常症の症候は、個体間で大いに異なる。ジスフェリン異常症と最も一般に関連する臨床症状は、肢帯筋ジストロフィー(LGMD2B)、三好型ミオパチー、前脛骨発症を伴う遠位型ミオパチー(DMAT)、遠近虚弱化(proximodistal weakness)、代謝(pseudometabolic)ミオパチー、およびhyperCKemiaを含む。最も一般に、患者は、10代に遠位筋力の虚弱化を、次の10年以内の遠位運動機能喪失とともに報告する。患者は一般に、動くために車椅子を必要として、全身制御の程度が異なる。ジスフェリン異常症はしばしば誤診されるので、その発生率は決定されていない。現在までに、筋肉機能の喪失を遅延またはジストロフィー表現型逆転/改善するための効果的な治療は存在しない。

ジスフェリンは、膜の完全性の維持に関与する、小胞および膜関連のタンパク質である。ジスフェリンは、膜損傷時に細胞シグナリング修復ネットワークトリガーする可能性のあるカルシウム感知ドメイン提示する。ジスフェリンを含む細胞内小胞は、膜損傷の部位へ輸送して、通常は小胞の融合が膜の完全性をもたらすと考えられる。ジスフェリン機能の機能はあまり特徴付けられていないが、それが不存在だと、筋肉膜は、軽度のストレス形態をより起こしやすい。

ジスフェリンタンパク質コード配列は>6.5kbであり、それは、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターキャプシドパッケージング容量を超えていて、単一のAAVが仲介する遺伝子付加ストラテジーによるジスフェリン異常症の治療を不可能にさせている。したがって、宿主酵素によってアセンブルされなければならないトランスジェニックDNA断片を保有する多数のキャプシドに依拠する、AAVが仲介するジスフェリン送達に関して、独創的な細胞内遺伝子の構築アプローチが研究されている。この「オーバーサイズのAAV遺伝子療法」のアプローチは、診療所において未だ検証されておらず、いくつかのレベルにおいて本質的により効率的でない。ジスフェリンの「オーバーサイズの」AAV形質導入での以前の試みは、検出可能なレベルのジスフェリンがインビボ復元されることの困難性に直面した。

本発明は、単一のAAV内にパッケージされることができてインビボで効果的であることが示されている、トランケートされた複合型ジスフェリン遺伝子を提供することによって、当該分野における短所を克服する。

概要

本発明は、トランケートされたジスフェリン核酸およびタンパク質、核酸を含むベクター(例えば、アデノ随伴ウイルスベクター)、および、細胞または対象へのジスフェリンの送達およびジスフェリン異常症の治療のためにそれを用いる方法に関する。 A

目的

本発明は、単一のAAV内にパッケージされることができてインビボで効果的であることが示されている、トランケートされた複合型ジスフェリン遺伝子を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記のポリペプチドのC2DおよびC2Fドメインのそれぞれの少なくとも実質的な部分は、欠失している、ポリヌクレオチド。

請求項2

請求項1のポリヌクレオチドであって、前記のポリペプチドのC2Eドメインの少なくとも実質的な部分は、欠失している、ポリヌクレオチド。

請求項3

請求項1または2のポリヌクレオチドであって、前記のポリペプチドは、C2A、C2C、FerA、DysF、C2G、およびTMドメインの少なくとも実質的な部分を含む、ポリヌクレオチド。

請求項4

請求項1から3のいずれか一項のポリヌクレオチドであって、前記のポリペプチドは、C2A、C2B、C2C、FerA、DysF、C2G、およびTMドメインの少なくとも実質的な部分を含む、ポリヌクレオチド。

請求項5

請求項1から4のいずれか一項のポリヌクレオチドであって、前記のジスフェリンポリペプチドは、ヒトジスフェリンポリペプチドである、ポリヌクレオチド。

請求項6

請求項1から5のいずれか一項のポリヌクレオチドであって、前記のポリヌクレオチドは:(a)配列番号1〜5のいずれか1つと少なくとも80%同一の配列を含むポリヌクレオチド;(b)配列番号6〜10のいずれか1つと少なくとも80%同一のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド;または(c)コドン縮退に起因して(a)または(b)のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである、ポリヌクレオチド。

請求項7

請求項1から6のいずれか一項のポリヌクレオチドであって、前記のポリヌクレオチドは:(a)配列番号1〜5のいずれか1つと同一の配列を含むポリヌクレオチド;(b)配列番号6〜10のいずれか1つと同一のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド;または(c)コドン縮退に起因して(a)または(b)のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである、ポリヌクレオチド。

請求項8

請求項1から7のいずれか一項のポリヌクレオチドを含む、発現カセット

請求項9

請求項8の発現カセットであって、前記のポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結される、発現カセット。

請求項10

請求項1から7のいずれか一項のポリヌクレオチド、または、請求項8または9の発現カセットを含む、ベクター

請求項11

請求項10のベクターであって、ウイルスベクターである、ベクター。

請求項12

請求項11のベクターであって、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、ベクター。

請求項13

請求項1から7のいずれか一項のポリヌクレオチド、請求項8または9の発現カセット、および/または、請求項10から12のいずれか一項のベクターを含む、形質転換された細胞

請求項14

請求項1から7のいずれか一項のポリヌクレオチド、請求項8または9の発現カセット、請求項10から12のいずれか一項のベクター、および/または、請求項13の形質転換された細胞を含む、トランスジェニック動物

請求項15

トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドであって、前記のポリペプチドのC2DおよびC2Fドメインのそれぞれの少なくとも実質的な部分は、欠失している、ポリペプチド。

請求項16

請求項15のポリペプチドであって、前記のポリペプチドのC2Eドメインの少なくとも実質的な部分は、欠失している、ポリペプチド。

請求項17

請求項15または16のポリペプチドであって、前記のポリペプチドは、C2A、C2C、FerA、DysF、C2G、およびTMドメインの少なくとも実質的な部分を含む、ポリペプチド。

請求項18

請求項15から17のいずれか一項のポリペプチドであって、前記のポリペプチドは、C2A、C2B、C2C、FerA、DysF、C2G、およびTMドメインの少なくとも実質的な部分を含む、ポリペプチド。

請求項19

請求項15から18のいずれか一項のポリペプチドであって、前記のジスフェリンポリペプチドは、ヒトジスフェリンポリペプチドである、ポリペプチド。

請求項20

請求項15から19のいずれか一項のポリペプチドであって、前記のポリペプチドは:(a)配列番号1〜5のいずれか1つと少なくとも80%同一の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;または(b)配列番号6〜10のいずれか1つと少なくとも80%同一の配列を含むポリペプチドである、ポリペプチド。

請求項21

請求項15から20のいずれか一項のポリペプチドであって、前記のポリペプチドは:(a)配列番号1〜5のいずれか1つと同一の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;または(b)配列番号6〜10のいずれか1つと同一の配列を含むポリペプチドである、ポリペプチド。

請求項22

請求項1から7のいずれか一項のポリヌクレオチド、または、請求項8または9の発現カセットを含む、組み換えAV粒子

請求項23

組み換えAAV粒子を生産する方法であって、AAV複製を許容する細胞に、(a)(i)請求項1から7のいずれか一項のポリヌクレオチドまたは請求項8または9の発現カセット、および(ii)逆位末端配列(ITR)を含む、組み換えAAVテンプレート;(b)Repコード配列およびCapコード配列を含む、ポリヌクレオチドを;前記組み換えAAVテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で、提供するステップを含み;それにより、前記細胞において組み換えAAV粒子が生産される、方法。

請求項24

請求項23の方法であって、前記のRepコード配列およびCapコード配列は、前記組み換えAAV粒子にパッケージされることができない、方法。

請求項25

請求項23または24の方法であって、前記のRepコード配列および/またはCapコード配列は、プラスミドによって提供される、方法。

請求項26

請求項23または24の方法であって、前記のRepコード配列および/またはCapコード配列は、ウイルスベクターによって提供される、方法。

請求項27

請求項26の方法であって、前記のウイルスベクターは、アデノウイルスベクターヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターからなる群より選択される、方法。

請求項28

請求項23から27のいずれかの方法であって、前記のRepコード配列は、前記細胞内に安定して組み込まれる、方法。

請求項29

請求項23から28のいずれかの方法であって、前記のCapコード配列は、前記細胞内に安定して組み込まれる、方法。

請求項30

請求項23から29のいずれかの方法であって、前記組み換えAAVテンプレートは、プラスミドまたはウイルスベクターによって提供されて、または、プロウイルスとして前記細胞内に安定して組み込まれる、方法。

請求項31

細胞にジスフェリン送達する方法であって、前記細胞を、請求項22の組み換えAAV粒子と接触させるステップを含み、それにより、前記細胞にジスフェリンを送達する、方法。

請求項32

請求項31の方法であって、前記細胞は、平滑筋細胞骨格筋細胞心筋細胞生殖細胞前駆細胞、および、幹細胞からなる群より選択される、方法。

請求項33

哺乳類対象にジスフェリンを投与する方法であって、前記哺乳類対象に、請求項22の組み換えAAV粒子と接触された細胞を投与するステップを含み、それにより、前記哺乳類対象にジスフェリンを投与する、方法。

請求項34

それを必要とする哺乳類対象においてジスフェリン異常症を治療する方法であって、前記哺乳類対象に、請求項22の組み換えAAV粒子と接触された細胞を投与するステップを含み、それにより、前記ジスフェリン異常症を治療する、方法。

請求項35

哺乳類対象にジスフェリンを投与する方法であって、前記哺乳類対象に、請求項22の組み換えAAV粒子を投与するステップを含み、それにより、前記哺乳類対象にジスフェリンを投与する、方法。

請求項36

それを必要とする哺乳類対象においてジスフェリン異常症を治療する方法であって、前記哺乳類対象に、請求項22の組み換えAAV粒子を投与するステップを含み、それにより、前記ジスフェリン異常症を治療する、方法。

請求項37

請求項33から36のいずれか一項の方法であって、前記対象は、ヒト対象である、方法。

請求項38

請求項35から37のいずれか一項の方法であって、前記AAV粒子は、経口、直腸、経粘膜経皮吸入静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内、内皮内、関節内投与、および、局所的な四肢灌流からなる群より選択される経路によって投与される、方法。

請求項39

請求項35から37のいずれか一項の方法であって、前記AAV粒子は、骨格筋平滑筋心臓、および、横隔膜からなる群より選択される部位に投与される、方法。

技術分野

0001

優先権の陳述
本出願は、2016年6月17日に出願された米国仮出願番号62/351,701の利益を主張し、その内容全体は、参照により本明細書中に援用される。

0002

本発明の分野
本発明は、トランケートされたジスフェリン核酸およびタンパク質、核酸を含むベクター(例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター)、および、細胞または対象へのジスフェリンの送達およびジスフェリン異常症の治療のためにそれを用いる方法に関する。

背景技術

0003

ジスフェリン異常症は、臨床症状にかかわらず、ジスフェリン遺伝子における突然変異によって引き起こされる筋ジストロフィーである。ジスフェリン異常症の症候は、個体間で大いに異なる。ジスフェリン異常症と最も一般に関連する臨床症状は、肢帯筋ジストロフィー(LGMD2B)、三好型ミオパチー、前脛骨発症を伴う遠位型ミオパチー(DMAT)、遠近虚弱化(proximodistal weakness)、代謝(pseudometabolic)ミオパチー、およびhyperCKemiaを含む。最も一般に、患者は、10代に遠位筋力の虚弱化を、次の10年以内の遠位運動機能喪失とともに報告する。患者は一般に、動くために車椅子を必要として、全身制御の程度が異なる。ジスフェリン異常症はしばしば誤診されるので、その発生率は決定されていない。現在までに、筋肉機能の喪失を遅延またはジストロフィー表現型逆転/改善するための効果的な治療は存在しない。

0004

ジスフェリンは、膜の完全性の維持に関与する、小胞および膜関連のタンパク質である。ジスフェリンは、膜損傷時に細胞内シグナリング修復ネットワークトリガーする可能性のあるカルシウム感知ドメイン提示する。ジスフェリンを含む細胞内小胞は、膜損傷の部位へ輸送して、通常は小胞の融合が膜の完全性をもたらすと考えられる。ジスフェリン機能の機能はあまり特徴付けられていないが、それが不存在だと、筋肉膜は、軽度のストレス形態をより起こしやすい。

0005

ジスフェリンタンパク質コード配列は>6.5kbであり、それは、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターキャプシドパッケージング容量を超えていて、単一のAAVが仲介する遺伝子付加ストラテジーによるジスフェリン異常症の治療を不可能にさせている。したがって、宿主酵素によってアセンブルされなければならないトランスジェニックDNA断片を保有する多数のキャプシドに依拠する、AAVが仲介するジスフェリン送達に関して、独創的な細胞内遺伝子の構築アプローチが研究されている。この「オーバーサイズのAAV遺伝子療法」のアプローチは、診療所において未だ検証されておらず、いくつかのレベルにおいて本質的により効率的でない。ジスフェリンの「オーバーサイズの」AAV形質導入での以前の試みは、検出可能なレベルのジスフェリンがインビボ復元されることの困難性に直面した。

0006

本発明は、単一のAAV内にパッケージされることができてインビボで効果的であることが示されている、トランケートされた複合型ジスフェリン遺伝子を提供することによって、当該分野における短所を克服する。

発明が解決しようとする課題

0007

本発明は、トランケートされたジスフェリンポリペプチド、および、それをコードするポリヌクレオチドを提供する。トランケートされたポリペプチドは、野生型ジスフェリンの生物学的活性の少なくとも一部を保持し、ポリヌクレオチドは、野生型ポリヌクレオチドと比較して低減されたそれらの長さに起因して、ウイルスゲノムおよびウイルスベクターの中にパッケージされることが可能である。

課題を解決するための手段

0008

本発明の一態様は、トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、ポリペプチドのC2DおよびC2Fドメインのそれぞれの少なくとも実質的な部分は、欠失している。本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチドを含む発現カセット、ベクター(例えば、ウイルスベクター)、および、組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)、および、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、または、ベクターを含む、形質転換された細胞およびトランスジェニック動物に関する。本発明のウイルス粒子薬学的に許容できる担体中に含む医薬製剤がさらに提供される。

0009

本発明のさらなる態様は、トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドに関し、ポリペプチドのC2DおよびC2Fドメインのそれぞれの少なくとも実質的な部分は、欠失している。

0010

本発明のさらなる態様は、組み換えAAV粒子を生産する方法に関し、AAV複製を許容する細胞に、(a)(i)本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセット、および(ii)逆位末端配列(ITR)を含む、組み換えAAVテンプレート;(b)Repコード配列およびCapコード配列を含む、ポリヌクレオチドを;組み換えAAVテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で、提供するステップを含み;それにより、細胞において組み換えAAV粒子が生産される。

0011

本発明のさらなる態様は、細胞にジスフェリンを送達する方法に関し、細胞を、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)と接触させるステップを含み、それにより、細胞にジスフェリンを送達する。

0012

本発明の別の態様は、哺乳類対象にジスフェリンを投与する方法に関し、哺乳類対象に、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)と接触された細胞を投与するステップを含み、それにより、哺乳類対象にジスフェリンを投与する。

0013

本発明のさらなる態様は、それを必要とする哺乳類対象においてジスフェリン異常症を治療する方法に関し、哺乳類対象に、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)と接触された細胞を投与するステップを含み、それにより、ジスフェリン異常症を治療する。

0014

本発明の別の態様は、哺乳類対象にジスフェリンを投与する方法に関し、哺乳類対象に、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)を投与するステップを含み、それにより、哺乳類対象にジスフェリンを投与する。

0015

本発明のさらなる態様は、それを必要とする哺乳類対象においてジスフェリン異常症を治療する方法に関し、哺乳類対象に、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)を投与するステップを含み、それにより、ジスフェリン異常症を治療する。

0016

本発明の別の態様は、細胞にジスフェリンを送達するための、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)の使用に関する。

0017

本発明のさらなる態様は、哺乳類対象にジスフェリンを送達するための、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)と接触された細胞の使用に関する。

0018

本発明のさらなる態様は、哺乳類対象にジスフェリンを送達するための、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)の使用に関する。

0019

本発明のさらなる態様は、哺乳類対象においてジスフェリン異常症を治療するための、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)の使用に関する。

0020

本発明の別の態様は、細胞にジスフェリンを送達するための薬品の製造のための、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)の使用に関する。

0021

本発明のさらなる態様は、哺乳類対象にジスフェリンを送達するための薬品の製造のための、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)と接触された細胞の使用に関する。

0022

本発明のさらなる態様は、哺乳類対象にジスフェリンを送達するための薬品の製造のための、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)の使用に関する。

0023

本発明のさらなる態様は、哺乳類対象においてジスフェリン異常症を治療するための薬品の製造のための、本発明の組み換えウイルス粒子(例えば、AAV粒子)の使用に関する。

0024

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に示される。

図面の簡単な説明

0025

ナノ−ジスフェリンの設計および哺乳類細胞における発現を示す。(図1A)ナノ−ジスフェリンが得られた親cDNAであるヒトジスフェリンアイソフォーム8は、C2A、C2B、C2C、FerA、Dysf、C2D、C2E、C2F、C2G、および膜貫通ドメインを含み、6,240ntのサイズである。ナノ−ジスフェリンは、C2D、C2E、およびC2Fドメインが欠失していて、4,356ntにサイズダウンしたcDNAを保有する。(図1Bトランスフェクトされたc2c12マウス筋芽細胞ウエスタンブロット分析は、可溶性タンパク質溶解物が、ナノ−ジスフェリンまたは全長ジスフェリンを含まないことを明らかにした。対照的に、膜に関連するタンパク質溶解物は、ジスフェリンおよびナノ−ジスフェリンの両方を含む。(図1CHeLa細胞における免疫蛍光イメージングは、ジスフェリンおよびナノ−ジスフェリンの同様の細胞内分布を明らかにした。スケールバー、20μm。(図1D)ナノ−ジスフェリンは、低(0.5mg)、中(1mg)、または高(1.5mg)プラスミド投与量でアラマーブルー吸光度によって測定されるように、ジスフェリン欠損患者細胞において有意な毒性を示さなかった。0.5%次亜塩素酸塩ナトリウムを、陽性死滅陽性コントロールとして用いた。平均+SDが示される。
弱いプロモーターを用いた無傷のAAV形質導入は、強いプロモーターを用いたフラグメントAAVよりも効率的であることを示す。(図2A)プロモーターおよびポリアデニル化ポリA)配列に基づき、サイズが異なる2つのナノ−ジスフェリンAAV−ITRカセットを設計した。JeT−ナノ−ジスフェリンは4,849ntのサイズであり、一方で、CMV−ナノ−ジスフェリンは5,597ntである。(図2B)293細胞における、(図2A)に示される構築物トランスフェクション後の、示された抗体によって染色された、ウエスタンブロット(ジスフェリンおよびGFPコントロールを伴う)。(図2C)AAVウイルスパッケージングを、アルカリゲル電気泳動およびSYBRゴールド染色によって分析した。無傷のパッケージングがJeT−ナノ−ジスフェリンカセットに関して観察されて、一方で、断片化されたパッケージングがCMV−ナノ−ジスフェリンカセットに関して見られた(数字は、それぞれのCsCl勾配画分において見られるパッケージングされたゲノムを示した)。(図2D)細胞ごとに、示された量で示されたAAVベクターによって処置された、293細胞のウエスタンブロット分析。
AAV−ナノ−ジスフェリンが、筋肉注入後に筋肉組織学を有意に改善することを示す。(図3ABLA/Jジスフェリン欠損マウスのTA筋に、AAV1−CMV−GFPまたはAAV1−JeT−ナノ−ジスフェリンのいずれかを対側性に注入した。エバンスブルー色素を、屠殺の40時間前に腹腔内に投与した。エバンスブルー色素陽性の線維を、全線維に対して標準化した。マッチド・ペア統計分析は、対側コントロールと比較してAAV1−JeT−ナノ−ジスフェリンによって処置されたTAにおけるエバンスブルー色素陽性の線維の有意な減少を明らかにした。(図3B)筋肉ターンオーバーに関するマーカーである中心に核のある線維は、AAV1−JeT−ナノ−ジスフェリンによって処置された1つの筋肉を除いて全てにおいて減少して、統計分析は、ナノ−ジスフェリンによって処置された筋肉の中心の核形成の有意な低減を示した(p=0.0125)。(図3C)代表的な画像は、AAV1−JeT−ナノ−ジスフェリンが注入された筋肉において改善された筋肉組織学を示し、それは、BLA/Jジスフェリン欠損筋肉よりも密接にWT筋肉に似ている。スケールバー、40μm。(図3D)Romeoジスフェリン抗体IF染色は、内因性ジスフェリンとナノ−ジスフェリンとの間の異なる分布パターンを明らかにした。線維のおよそ30%が、ナノ−ジスフェリンに関して陽性に染色された(全線維n=455)。スケールバー、40μm。平均+SDが示される。
AAV−ナノ−ジスフェリンが、全身注入後に運動機能を改善させることを示す。(図4Aクレアチンキナーゼ活性は、AAV9−JeT−ナノ−ジスフェリンによって処置されたマウスと比較して、AAV9−CMV−GFPによって処置されたマウスにおいて、より高いことがわかった。(図4B立ち上がり行動(rearing)の能力は、AAV9−CMV−GFPによって処置されたマウスと比較して、AAV9JeT−ナノ−ジスフェリンを注入されたBLA/Jマウスにおいて、1時間の評価にわたって有意に改善された。(図4C)経時的な立ち上がり行動の分析は、AAV9−JeT−ナノ−ジスフェリンによって処置されたマウスが増大した持久力を有することを示し、AAV9CMV−GFPコントロールマウスと比較して1時間にわたる一貫した立ち上がり行動によって示された。平均+SDが示される。
全身注入後の筋肉組織学に対するAAV−ナノ−ジスフェリンの効果を示す。(図5A)中心に核のある線維(その存在は、再生およびターンオーバーを示す)は、GFPによって処置された筋肉と比較して、ナノ−ジスフェリンによって処置された筋肉において、有意でないが減少する傾向があった(p=0.0835)。(図5B筋肉損傷尺度であるエバンスブルー色素の全筋肉吸光度アッセイは、AAV9−JeT−ナノ−ジスフェリンを注入されたマウスの臀筋において有意に低減した(p=0.037)。(図5C)エバンスブルー色素陽性の線維の組織学の代表的な画像は、AAV9−CMV−GFPによって処置されたコントロールと比較して、AAV9−JeT−ナノ−ジスフェリンによって処置された筋肉の、筋肉損傷における顕著な低減を示す。統計分析は、AAV9−JeT−ナノ−ジスフェリンによって処置されたマウスの臀筋において、エバンスブルー色素陽性の線維のほぼ有意な減少(p=0.056)を示した。スケールバー、100μm。(図5D)線維サイズの尺度である最小Feret径を、臀筋のWGAレクチンによって染色された筋肉断面から得て、独立t検定によって処置間に有意差があった(p<0.0001)。(図5E疎水性および負電荷脂質(矢印)に関するOil−Red−O染色;この代表的な画像は、処置間の著しい違いを示した。スケールバー、300μm。平均+SDが示される。
さらなるデータを示す。(図6A)水平活性を、IVによって処置されたマウスにおいて測定して、最初の30分では処置間に違いはなく(p=0.58)、一方で、有意ではないが(p=0.13)、観察の最後の30分にわたって、ナノ−ジスフェリンによって処置されたマウスにおいて、より高い水平活性の傾向があった。(図6B)H&E染色を臀筋および腰筋において行なって全線維に対して標準化された全中心核に関して分析し、中心の核形成を測定するこの方法によって、処置間で違いは見られなかった。平均+SDが示される。
線維サイズの分布を示す。筋線維サイズのアーチファクトの弾力の尺度である最小Feret径を、ImageJプロトコルに読み込まれた、WGAレクチンによって標識された大殿筋断面に対して行なった。ナノ−ジスフェリンによって処置されたマウス線維サイズの分布(n=610)は、GFPによって処置されたマウス線維サイズ分布(n=619)より大きな線維サイズを示し、野生型の未処置の分布(n=467)と比較して、部分的な補正を示した。範囲内の総計を示す。スケールバー=100μm。
免疫蛍光によるナノ−ジスフェリン検出を示す。ジスフェリン抗体を用いた示されたマウス由来の臀筋の免疫蛍光染色、Hoechst核染色、および小麦胚芽アグルチニン膜染色。膜および細胞質の全体を通したナノ−ジスフェリン局在が顕著であったが、一方で、内因性ジスフェリンは、膜に特有局在化される。筋線維のおよそ10%が、ナノ−ジスフェリンに関して陽性に染色された(全線維n=441)。スケールバー、100μm。
RTPCRによる検出を示す。(図9A)RT−QPCRに関する予想されるアンプリコンは、筋肉内処置された脛骨筋において、ナノ−ジスフェリンに関して観察されたが、一方で、よりかすかシグナルが、ネガティブコントロールでは観察されないがそれらの対側コントロールでも観察されて、注入部位からのベクターの漏れ示唆した。アンプリコンサイズに起因して、PCRサンプルをExo−Sap Itで処理してプライマーダイマーを除去して、臀筋におけるナノ−ジスフェリンに関するRT−QPCRにもこれを行ない(図9B)、単一の全身注入のほぼ8ヶ月後に転写mRNAの存在を確認するシグナルを示した。

0026

ここで、本発明は、本発明の好ましい実施態様が示される添付の図面に関して説明される。しかしながら、本発明は異なる形で具体化され得て、本明細書中に示される実施態様に制限されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底的かつ完全であるように提供されて、本発明の範囲を当業者に完全に届ける。

0027

別段の定義がされない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人により一般に理解されるのと同一の意味を有する。本発明において、本発明の説明に用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の限定を意図しない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体で参照により援用される。

0028

ヌクレオチド配列は、本明細書において、特に別段の指示がない限り、左から右へ5’から3’への方向で、一本鎖によってのみ提供される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書において、IUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される様式で、または、(アミノ酸については)一文字コードまたは三文字コードのいずれかによって、どちらも37 CFR §1.822および確立された使用に従って示される。例えば、PatentIn User Manual,99−102(Nov.1990)(米国特許商標)を参照。

0029

別段の指示がある場合を除き、当業者に公知の標準的な方法が、組み換えAAV(rAAV)構築物、AAV Repおよび/またはCap配列を発現するパッケージングベクター、および、一時的および安定的にトランスフェクトされたパッケージング細胞の構築のために用いられ得る。そのような技術は、当業者に公知である。例えば、SAMBROOK et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL 2nd Ed.(Cold Spring Harbor,NY,1989);AUSUBEL et al.,CURRNTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,New York)を参照。

0030

さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書に示される任意の特性または特性の組み合わせは、除外または省略され得ることも検討される。

0031

さらに説明するために、仮に例えば、明細書が、特定のアミノ酸はA、G、I、Lおよび/またはVから選択され得ると示す場合、この言葉は、アミノ酸は、これらのアミノ酸(単数または複数)の任意のサブセット、例えばA、G、IまたはL;A、G、IまたはV;AまたはG;Lのみ;などから、あたかもそのようなサブコンビネーションのそれぞれが本明細書において明示的に示されるかのように、選択され得ることも示す。さらに、そのような言葉は、規定のアミノ酸の1つまたは複数が放棄され得ることも示す。例えば、特定の実施態様では、アミノ酸は、あたかもそのようなあり得る放棄のそれぞれが本明細書において明示的に示されるかのように、A、GまたはIではない;Aではない;GまたはVではない;などである。

0032

定義
以下の用語は、本明細書における説明および添付の特許請求の範囲において用いられる。

0033

単数形「a」および「an」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形を同様に含むことが意図される。

0034

さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さの量、投与量、時間、温度などの、測定可能な値を言及する場合、規定の量の20%、10%、5%、1%、0.5%、または実に0.1%の変動を包含することを意味する。

0035

また、本明細書において用いられる「および/または」は、関係がある列挙された項目の1つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択的に(「または」)と解釈された場合は組み合わせの欠失を指し、および包含する。

0036

本明細書において用いられる移行「から本質的になる(consisting essentially of)」は、特許請求の範囲に記載された発明(例えば、ジスフェリンの生産)の、列挙された材料またはステップ、および、基礎的および新規の特徴(単数または複数)に実質的に影響を及ぼさないものを包含すると解釈されるべきである。したがって、本明細書において用いられる用語「から本質的になる」は、「含む(comprising)」と同等であると解釈されるべきでない。

0037

本明細書において用いられる用語「パルボウイルス」は、Parvoviridaeファミリーを包含し、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む。自律的パルボウイルスは、パルボウイルス、エリスロウイルス、デンソウイルス、イテラウイルス、および、コントラウイルス(Contravirus)属のメンバーを含む。例示的な自律的パルボウイルスは、限定されないが、マウスの微小ウイルスウシのパルボウイルス、イヌのパルボウイルス、ニワトリのパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルスネコのパルボウイルス、ガチョウのパルボウイルス、H1パルボウイルス、バリケンのパルボウイルス、ヘビのパルボウイルス、およびB19ウイルスを含む。他の自律的パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、FIELDS et al.VIROLOGY,第2巻、第69章(第4版,Lippincott−Raven Publishersを参照)。

0038

ディペンドウイルス属は、制限されないが、AAVタイプ1、AAVタイプ2、AAVタイプ3(タイプ3Aおよび3Bを含む)、AAVタイプ4、AAVタイプ5、AAVタイプ6、AAVタイプ7、AAVタイプ8、AAVタイプ9、AAVタイプ10、AAVタイプ11、AAVタイプ12、AAVタイプ13、鳥類AAV、ウシAAV、イヌAAV、ヤギAAV、ヘビAAV、ウマAAV、およびヒツジAAVを含む、アデノ付随ウイルス(AAV)を含む。例えば、FIELDS et al.VIROLOGY,第2巻,第69章(第4版,Lippincott−Raven Publishers);および表1を参照。

0039

本明細書において用いられる用語「アデノ付随ウイルス」(AAV)は、制限されないが、AAVタイプ1、AAVタイプ2、AAVタイプ3(タイプ3Aおよび3Bを含む)、AAVタイプ4、AAVタイプ5、AAVタイプ6、AAVタイプ7、AAVタイプ8、AAVタイプ9、AAVタイプ10、AAVタイプ11、AAVタイプ12、AAVタイプ13、ヘビAAV、鳥類AAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、ヒツジAAV、ヤギAAV、エビAAV、および、現在知られまたは後に発見される任意の他のAAVを含む。例えば、FIELDS et al.,VIROLOGY,第2巻,第69章(第4版,Lippincott−Raven Publishers)を参照。多くの相対的に新しいAAV血清型およびクレードが同定されている(例えば、Gao et al.(2004)J.Virol.78:6381;Moris et al.,(2004)Virol.33−:375;および表1を参照)。

0040

本発明のAAV粒子およびゲノムは、任意のAAV由来であってよい。様々な血清型のAAVのゲノム配列、ならびに、ネイティブのITR、Repタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。そのような配列は、文献またはGenBankのような公共データベースに見られ得る。例えば、GenBankアクセッション番号NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、AY631966、AX753250、EU285562、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852およびAY530579を参照;その開示は、AAV核酸およびアミノ酸配列を教示するために本明細書において参照により援用される。また、例えば、Bantel−Schaal et al.(1999)J.Virol.73:939;Chiorini et al.(1997)J.Virol.71:6823;Chiorini et al.(1999)J.Virol.73:1309;Gao et al.(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 99:11854;Moris et al.(2004)Virol.33−:375−383;Mori et al.(2004)Virol.330:375;Muramatsu et al.(1996)Virol.221:208;Ruffing et al.(1994)J.Gen.Virol.75:3385;Rutledge et al.(1998)J.Virol. 72:309;Schmidt et al.(2008)J.Virol.82:8911;Shade et al.,(1986)J.Virol.58:921;Srivastava et al.(1983)J.Virol.45:555;Xiao et al.(1999)J.Virol.73:3994;国際特許公報WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244;および米国特許第6,156,303号も参照;その開示は、AAV核酸およびアミノ酸配列を教示するために本明細書において参照により援用される。表1も参照。AAV1、AAV2およびAAV3 ITR配列の初期の説明は、Xiao、 X.,(1996)「Characterization of Adeno−associated virus(AAV)DNA replication and integration」(Ph.D.学位論文ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ペンシルニア州)によって提供される(本明細書においてその全体で援用される)。

0041

本明細書において用いられる用語「向性」は、細胞へのウイルスの侵入を指し、任意選択で、および好ましくは、細胞においてウイルスゲノムによって保有される配列の発現(例えば、転写、および任意選択で、翻訳)、例えば、組み換えウイルスについては、異種ヌクレオチド配列(単数または複数)の発現が続く。当業者は、ウイルスゲノム由来の異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは他の方法で制御される核酸配列に関するトランス作用因子が不存在では開始され得ないことを理解している。AAVの場合は、ウイルスゲノム由来の遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルス、非組込みのエピソーム、ならびに、ウイルスが細胞内に取り込み得る任意の他の形態由来であってよい。

0042

本明細書において用いられる、AAVによる細胞の「形質導入」は、AAVが介在する細胞中への遺伝物質の移行を指す。例えば、FIELDS et al.,VIROLOGY,第2巻,第69章(第3版,Lippincott−Raven Publishers)参照。

0043

用語「5’部分」および「3’部分」は、2以上のエレメント間空間的関係を定義するための相対的用語である。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの「3’部分」は、別のセグメントの下流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「3’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの3’末にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの3’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。同様に、ポリヌクレオチドの「5’部分」は、別のセグメントの上流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「5’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの5’末にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの5’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。

0044

本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。

0045

本明細書において用いられる用語「トランケートされたポリペプチド」は、野生型ポリペプチド内に存在するアミノ酸残基の1つまたは複数が欠失されているポリペプチドを指す。欠失された残基は、N末端C末端、中央、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。

0046

「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、RNA、DNAまたはDNA−RNAハイブリッド配列(天然起源および非天然起源ヌクレオチドの両方を含む)であってよく、一本鎖または二本鎖DNA配列のいずれかであってよい。

0047

本明細書において用いられる用語「配列同一性」は、当技術分野における標準的な意味を有する。当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが公知配列と配列同一性または類似性を有するかどうか同定することができる。配列同一性または類似性は、制限されないが、Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)の局所配列同一性アルゴリズムを含む当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,WIにおける、GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)のコンピューター化された実行によって、Devereux et al.,Nucl.Acid Res.12:387(1984)により記載されるBest Fit配列プログラム、好ましくはデフォルト設定を用いて、または調査によって、判定され得る。

0048

有用なアルゴリズムの例は、PILEUPである。PILEUPは、プログレッシブ、ペアワイズアライメントを用いて、関連のある配列のグループから多数の配列アライメントを作る。また、アライメントを作るために用いられるクラスタリング関係を示すツリープロットすることもできる。PILEUPは、Feng&Doolittle,J.Mol.Evol.35:351(1987)のプログレッシブアライメント法の簡易化を用いて;その方法は、Higgins&Sharp,CABIOS5:151(1989)により記載される方法に似ている。

0049

有用なアルゴリズムの別の例は、Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403(1990)およびKarlin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873(1993)に記載の、BLASTアルゴリズムである。特に有用なBLASTプログラムは、WU−BLAST−2プログラムであり、Altschul et al.,Meth.Enzymol.,266:460(1996);blast.wustl/edu/blast/README.htmlから取得した。WU−BLAST−2は、いくつかの検索パラメーターを用いて、それらは好ましくは、デフォルト値に設定されている。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成、および、目的の配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが;感度を増大させるために値を調節してよい。

0050

さらなる有用なアルゴリズムは、Altschul et al.,Nucleic AcidsRes.25:3389(1997)により報告されるギャップ化BLASTである。

0051

アミノ酸配列同一性パーセンテージの値は、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より長い」配列の残基の合計数で割って決定される。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである(アライメントスコア最大化するためにWU−Blast−2により導入されるギャップは無視する)。

0052

同様の様式で、核酸配列同一性パーセントは、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチド内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。

0053

アライメントは、並べられる配列内のギャップの導入を含み得る。加えて、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチドよりも多いまたは少ないヌクレオチドを含む配列に関して、一実施態様では、配列同一性のパーセンテージは、ヌクレオチドの合計数に対する、同一のヌクレオチドの数に基づいて決定されることが理解される。したがって、例えば、本明細書に具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施態様では、より短い配列におけるヌクレオチドの数を用いて決定される。同一性のパーセンテージの計算においては、相対的重量は、配列変動、例えば挿入、欠失、置換などの様々な発現に割り当てられない。

0054

一実施態様では、同一性のみが正にスコアされて(+1)、ギャップを含む全ての形態の配列変動は「0」の値に割り当てられて、配列類似性計算のための、以下に記載される加重したスケールまたはパラメーターの必要性を取り除く。配列同一性パーセントは、例えば、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より短い」配列の残基の合計数で割って、100を掛けることにより、計算され得る。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである。

0055

本明細書において用いられる「単離された」ポリヌクレオチド(例えば、「単離されたDNA」または「単離されたRNA」)は、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素、またはポリヌクレオチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリヌクレオチドを意味する。

0056

同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素、またはポリペプチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリペプチドを意味する。

0057

「治療的ポリペプチド」は、細胞または対象内のタンパク質の不存在または欠陥に起因する症候を緩和または減少し得るポリペプチドである。あるいは、「治療的ポリペプチド」は、抗癌効果または移植生存性の改善のような、他の方法で対象に利益を与えるものである。

0058

ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に適用される本明細書において用いられる用語「改変」は、1つまたは複数の欠失、付加、置換、またはそれらの任意の組み合わせに起因して、野生型配列とは異なる配列を指す。

0059

本明細書において用いられる、ウイルスベクターを「単離する」または「精製する」(または文法等価物)によって、ウイルスベクターが、出発原料内の他の構成要素の少なくとも一部から、少なくとも部分的に分離されることを意味する。

0060

用語「治療する(treat)」「治療する(treating)」または「〜の治療(treatment of)」(およびそれらの文法的変形)によって、対象の状態の重症度が低減され、少なくとも部分的に改善または安定化されること、および/または、少なくとも1つの臨床症候における一部の軽減、緩和、低減または安定化が達成され、および/または、疾患または障害の進行に遅れがあることを意味する。

0061

用語「予防する(prevent)」「予防する(preventing)」および「予防(prevention)」(およびそれらの文法的変形)は、対象における疾患、障害および/または臨床症候(単数または複数)の発症の予防および/または遅延、および/または、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較した疾患、障害および/または臨床症候(単数または複数)の発症の重症度の減少を指す。予防は、完全であってよく、例えば、疾患、障害および/または臨床症候(単数または複数)の全体的な不存在であってよい。また、予防は、対象における疾患、障害および/または臨床症候(単数または複数)の発生および/または発症の重症度が、本発明の不存在下で生じるであろうものよりも低いような、部分的であってもよい。

0062

本明細書において用いられる「治療効果的な」量は、対象に何らかの改善または利益を提供するのに十分な量である。別の言い方をすると、「治療効果的な」量は、対象における少なくとも1つの臨床症候に何らかの軽減、緩和、低減、または安定化を提供する量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、治療的効果は完全または治療的である必要はないことを理解している。

0063

本明細書において用いられる「予防効果的な」量は、対象における疾患、障害および/または臨床症候の発症を予防および/または遅延するのに十分な、および/または、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較して、対象における疾患、障害および/または臨床症候の発症の重症度を減少および/または遅延するのに十分な量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、予防のレベルは完全である必要はないことを理解している。

0064

用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸」は、本明細書において相互交換可能に用いられて、ウイルスにおける天然起源でない配列を指す。一部の実施態様では、異種核酸は、ポリペプチドまたは翻訳されていない目的RNA(例えば、細胞または対象への送達のため)をコードするオープンリーディングフレームを含む。

0065

本明細書において用いられる用語「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」は、核酸送達ビヒクルとして機能するウイルス(例えば、AAV)粒子を指し、ビリオン内にパッケージされたベクターゲノム(例えば、ウイルスDNA[vDNA])を含む。あるいは、一部の文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲノム/vDNA単独、またはプラスミドを指すために用いられてよい。

0066

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公報WO01/92551に記載される二重のAAV粒子であってよい(その開示はその全体で参照により本明細書中に援用される)。したがって、一部の実施態様では、二本鎖(二重)ゲノムがパッケージされ得る。

0067

rAAVベクターゲノム」または「rAAVゲノム」は、1つまたは複数の異種核酸配列を含むAAVゲノム(すなわち、vDNA)である。rAAVベクターは、一般に、ウイルスを生産するためにシスで145塩基ITRのみを必要とする。典型的に、rAAVベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージされ得る導入遺伝子のサイズを最大化するように、1つまたは複数のITR配列のみ保持する。構造的および非構造的タンパク質コード配列は、トランスで提供され得る(例えば、プラスミドのようにベクターから、または、配列をパッケージング細胞内に安定的に組み込むことによって)。本発明の実施態様では、rAAVベクターゲノムは、少なくとも1つのITR配列(例えば、AAV ITR配列)、任意選択で2つのITR(例えば、2つのAAV ITR)を含み、それは典型的に、ベクターゲノムの5’および3’末にあって異種核酸と隣接するが、それと連続している必要はない。ITRは、同一または互いに異なってよい。

0068

「AAV逆位末端配列」または「AAV ITR」は、制限されないが、血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11、または13、ヘビAAV、鳥類AAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、ヒツジAAV、ヤギAAV、エビAAV、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のAAVを含む任意のAAV由来であってよい(例えば、表1を参照)。末端反復が、例えば、複製、ウイルスパッケージング、持続性、および/またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を仲介する限り、AAV ITRは、ネイティブの末端反復配列を有する必要はない(例えば、ネイティブのAAV ITR配列は、挿入、欠失、トランケーションおよび/またはミスセンス突然変異によって変更されてよい)。

0069

本発明のウイルスベクターは、さらに、「標的化された」ウイルスベクター(例えば、方向付けられた向性を有する)および/または国際特許公報WO00/28004およびChao et al.,(2000)Mol.Therapy 2:619に記載される「ハイブリッド」AAV(すなわち、ウイルスITRおよびウイルスキャプシドは、異なるAAV由来である)であってよい。

0070

さらに、ウイルスキャプシドまたはゲノムのエレメントは、挿入、欠失および/または置換を含む他の改変を含んでよい。

0071

用語「テンプレート」または「基質」は、本明細書において、AAVウイルスDNAを生産するために複製され得るポリヌクレオチド配列を指すために用いられる。ベクター生産の目的のために、テンプレートは、典型的に、制限されないが、プラスミド、ネイキッドDNAベクター細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)またはウイルスベクター(例えば、アデノウイルスヘルペスウイルスエプスタイン・バーウイルス、AAV、バキュロウイルスレトロウイルスベクターなど)を含む、より大きなヌクレオチド配列または構築物内に埋め込まれる。あるいは、テンプレートは、パッケージング細胞の染色体内に安定的に組み込まれ得る。

0072

本明細書において用いられる、AAV「Repコード配列」は、ウイルス複製および新たなウイルス粒子の生産を仲介するAAVの非構造的タンパク質をコードする核酸配列を示す。AAV複製遺伝子およびタンパク質は、例えば、FIELDS et al.,VIROLOGY,第2巻,第69&70章(第4版,Lippincott−Raven Publishers)に記載されている。

0073

「Repコード配列」は、AAVRepタンパク質の全てをコードする必要はない。例えば、AAVに関しては、Repコード配列は、4つのAAV Repタンパク質(Rep78、Rep68、Rep52およびRep40)の全てをコードする必要はなく、実際に、AAV5は、スプライスされたRep68およびRep40タンパク質のみを発現すると考えられている。代表的な実施態様では、Repコード配列は、ウイルスゲノム複製および新たなビリオン中へのパッケージングに必要な、少なくともこれらの複製タンパク質をコードする。Repコード配列は、一般に、少なくとも1つの大きなRepタンパク質(すなわち、Rep78/68)および1つの小さなRepタンパク質(すなわち、Rep52/40)をコードする。特定の実施態様では、Repコード配列は、AAV Rep78タンパク質およびAAV Rep52および/またはRep40タンパク質をコードする。他の実施態様では、Repコード配列は、Rep68およびRep52および/またはRep40タンパク質をコードする。さらに、さらなる実施態様では、Repコード配列は、Rep68およびRep52タンパク質、Rep68およびRep40タンパク質、Rep78およびRep52タンパク質、またはRep78およびRep40タンパク質をコードする。

0074

本明細書において用いられる用語「大きなRepタンパク質」は、Rep68および/またはRep78を指す。特許請求の範囲に記載される発明の大きなRepタンパク質は、野生型または合成のいずれかであってよい。野生型の大きなRepタンパク質は、制限されないが、血清型1、2、3a、3b、4、5、6、7、8、9、10、11、または13を含む任意のAAV、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のAAV由来であってよい(例えば、表1を参照)。合成の大きなRepタンパク質は、挿入、欠失、トランケーションおよび/またはミスセンス突然変異によって変更され得る。

0075

当業者は、複製タンパク質は同一のポリヌクレオチドによってコードされる必要はないことをさらに理解する。例えば、AAVに関しては、p19プロモーターは不活化され得て、大きなRepタンパク質(単数または複数)は1つのポリヌクレオチドから発現され得て、小さなRepタンパク質(単数または複数)は異なるポリヌクレオチドから発現され得る。しかしながら典型的に、単一の構築物から複製タンパク質を発現することがより便利である。一部のシステムでは、ウイルスプロモーター(例えば、AAV p19プロモーター)は、細胞によって認識されなくてよく、したがって、別個の発現カセットから大きなおよび小さなRepタンパク質を発現する必要がある。他の例では、大きなRepおよび小さなRepタンパク質を、別個に、すなわち、別個の転写および/または翻訳制御エレメントの制御下で発現することが望ましくあり得る。例えば、小さなRepタンパク質に対する大きな方の比を低減させるように、大きなRepタンパク質の発現を制御することが望ましくあり得る。昆虫細胞の場合は、細胞に対する毒性を避けるために、大きなRepタンパク質(例えば、Rep78/68)の発現を下方制御することが有利であり得る(例えば、Urabe et al.,(2002)Human Gene Therapy 13:1935を参照)。

0076

本明細書において用いられる、AAV「capコード配列」は、機能性AAVキャプシドを形成する構造タンパク質をコードする(すなわち、DNAをパッケージおよび標的細胞を感染することができる)。典型的に、capコード配列は、AAVキャプシドサブユニットの全てをコードするが、機能性キャプシドが生産される限り、全てよりも少ないキャプシドサブユニットがコードされてよい。典型的に、必ずしもではないが、capコード配列は、単一の核酸分子上に存在する。

0077

AAVのキャプシド構造は、BERNARD N.FIELDS et al.,VIROLOGY,第2巻,第69&70章(第4版,Lippincott−Raven Publishers)により詳細に説明される。

0078

ポリペプチドドメインに関して本明細書において用いられる用語「実質的な部分」は、ドメイン内のアミノ酸残基の大部分(すなわち、少なくとも50%)、例えば、少なくとも約80%またはそれよりも多くの残基、例えば、少なくとも85%、90%、または95%の残基を指す。欠失されるドメインの実質的な部分に関して、ドメインの残りの残基は、野生型ドメインの生物学的活性の約20%未満、例えば、生物学的活性の約15%、10%、または5%未満を維持する。存在しているドメインの実質的な部分に関して、ドメインの残基は、野生型ドメインの生物学的活性の少なくとも約70%、例えば、生物学的活性の少なくとも約80%、90%、または95%を維持する。

0079

トランケートされたジスフェリンポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は、トランケートされたジスフェリンポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。トランケートされたポリペプチドは、野生型ジスフェリンの生物学的活性の少なくとも一部を維持して、ポリヌクレオチドは、野生型ポリヌクレオチドと比較して低減されたそれらの長さに起因して、ウイルスゲノムおよびウイルスベクターの中にパッキングされることが可能である。特定の実施態様では、トランケートされたポリペプチドは、野生型ジスフェリンの生物学的活性の少なくとも約20%、例えば、少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%またはそれよりも多くを維持する。維持される生物学的活性は、筋肉の膜完全性の保持であってよく、当技術分野でよく知られていて本明細書において開示される技術を用いて測定することができる。

0080

本発明の一態様は、トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、ポリペプチドのC2DおよびC2Fドメインのそれぞれの少なくとも実質的な部分は、欠失している。一部の実施態様では、ポリペプチドのC2Eドメインの少なくとも実質的な部分も欠失している。一部の実施態様では、ポリペプチドのC2B、C2C、およびC2Dドメインの1つまたは複数の少なくとも実質的な部分も欠失している。欠失は、ドメインの一部または全部、例えば、ドメインの80%、85%、90%、95%、またはそれよりも多くの欠失であってよい。欠失は、ドメインのN末端の境界、ドメインのC末端の境界、ドメインの中央、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。

0081

特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、C2A、C2C、FerA、DysF、C2G、およびTMドメインの少なくとも実質的な部分を含む、から本質的になる、またはからなる、トランケートされたジスフェリンポリペプチドをコードする。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、C2A、C2B、C2C、FerA、DysF、C2G、およびTMドメインの少なくとも実質的な部分、例えば、それぞれのドメインの大部分、例えば、ドメインの80%、85%、90%、95%、またはそれよりも多くを含む、から本質的になる、またはからなる、トランケートされたジスフェリンポリペプチドをコードする。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、C2A、FerA、DysF、C2G、およびTMドメインの少なくとも実質的な部分を含む、から本質的になる、またはからなる、トランケートされたジスフェリンポリペプチドをコードする。

0082

特定の実施態様では、トランケートされたジスフェリンをコードするポリヌクレオチドは、約5kbまたはそれ未満、例えば、約4.5kb、4kb、またはそれ未満の長さを有する。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、非天然起源のポリヌクレオチドである。

0083

一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、哺乳類ジスフェリンポリペプチド、例えば、ヒトジスフェリンポリペプチドである、トランケートされたジスフェリンポリペプチドをコードする。

0084

ジスフェリンのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当技術分野でよく知られていて、GenBankのようなデータベースに見ることができる。例えば、ヒトジスフェリンヌクレオチド配列は、アクセッション番号AF075575.1に見られて、ヒトジスフェリンアミノ酸配列は、アクセッション番号NP_003485.1に見られる。他の哺乳類ジスフェリンアミノ酸配列は、ラット(NP_001101339.1)、マウス(AAG17046.2)、ウシ(NP_001095960.1)、ヤギ(XP_013822998.1)、ウマ(XP_008534159.1)、ヒツジ(XP_014949936.1)、およびイヌ(XP_003432282.1)を含む。

0085

ジスフェリンポリペプチドのドメイン構造は、当技術分野でよく知られている。図1Aに示されるように、ジスフェリンは、以下のドメイン:C2A、C2B、C2C、FerA、DysF、C2D、C2E、C2F、C2G、およびTMを含む。それぞれのドメインの正確な境界は、オルソログおよび変異間で異なってよい。ヒトジスフェリン内のそれぞれのドメインに関する概算アミノ酸範囲を表2に示す(アミノ酸のナンバリングは、配列番号11に基づく。挙げられたドメイン境界は、約20残基まで、例えば、約5、10、15、または20残基異なってよい。

0086

一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、
(a)配列番号1〜5のいずれか1つと少なくとも80%同一(例えば、少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一)の配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号6〜10のいずれか1つと少なくとも80%同一(例えば、少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一)のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド;または
(c)コドン縮退に起因して(a)または(b)のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド、である。

0087

一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、
(a)配列番号1〜5のいずれか1つと同一の配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号6〜10のいずれか1つと同一のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド;または
(c)コドン縮退に起因して(a)または(b)のポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチド、である。

0088

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現カセットである。発現カセットは、トランケートされたジスフェリンポリペプチドの発現を高めるためのエレメントをさらに含んでよい。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、プロモーター、例えば、普遍的プロモーター、または筋肉特異的または筋肉好適プロモーターに動作可能に連結される。

0089

また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含む、ウイルスベクターなどのベクターも提供する。ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター、例えば、AAVベクターであってよい。本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセットを含む、組み換えパルボウイルス粒子(例えば、組み換えAAV粒子)をさらに提供する。ウイルスベクターおよびウイルス粒子は、以下にさらに述べられる。ウイルス粒子は、例えば、改変されたキャプシドタンパク質の存在に起因して、野生型粒子と比較して変更された向性を有してよい。変更された向性は、制限されずに、増大された筋肉標的化および/または低減された肝臓標的化であってよい。

0090

本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および/またはベクターを含む、形質転換された細胞に関する。

0091

本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および/または形質転換された細胞を含む、トランスジェニック動物に関する。一部の実施態様では、トランスジェニック動物は、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳類、例えば、実験動物、例えば、マウスラット、イヌ、またはサルである。一部の実施態様では、動物は、疾患のモデルである。

0092

本発明の別の態様は、トランケートされた哺乳類ジスフェリンポリペプチドに関し、ポリペプチドのC2DおよびC2Fドメインのそれぞれの少なくとも実質的な部分は、欠失している。一部の実施態様では、ポリペプチドのC2Eドメインの少なくとも実質的な部分も欠失している。一部の実施態様では、ポリペプチドのC2B、C2C、およびC2Dドメインの1つまたは複数の少なくとも実質的な部分も欠失している。本発明のトランケートされたポリペプチドは、野生型ジスフェリンの少なくとも1つの生物学的活性の少なくとも約20%を維持し、例えば、筋肉完全性を、例えば、少なくとも1つの生物学的活性の少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれよりも多くを保持する。一部の実施態様では、ポリペプチドは、非天然起源のポリペプチドである。

0093

特定の実施態様では、ポリペプチドは、C2A、C2C、FerA、DysF、C2G、およびTMドメインの少なくとも実質的な部分を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、C2A、C2B、C2C、FerA、DysF、C2G、およびTMドメインの少なくとも実質的な部分を含む、から本質的になる、またはからなる。特定の実施態様では、ポリペプチドは、C2A、FerA、DysF、C2G、およびTMドメインの少なくとも実質的な部分を含む、から本質的になる、またはからなる。

0094

一部の実施態様では、ジスフェリンポリペプチドは、哺乳類ジスフェリンポリペプチド、例えば、ヒトジスフェリンポリペプチドである。

0095

一部の実施態様では、ポリペプチドは、
(a)配列番号1〜5のいずれか1つと少なくとも80%同一(例えば、少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一)の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;または
(b)配列番号6〜10のいずれか1つと少なくとも80%同一(例えば、少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一)の配列を含むポリペプチド、である。

0096

一部の実施態様では、ポリペプチドは、
(a)配列番号1〜5のいずれか1つと同一の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド;または
(b)配列番号6〜10のいずれか1つと同一の配列を含むポリペプチド、である。

0097

ウイルスベクターを生産する方法
本発明は、ウイルスベクターを生産する方法をさらに提供する。1つの特定の実施態様では、本発明は、組み換えAAV粒子を生産する方法を提供し、AAV複製を許容する細胞に:(a)(i)本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセット、および(ii)ITRを含む、組み換えAAVテンプレート;(b)Repコード配列およびCapコード配列を含む、ポリヌクレオチドを;組み換えAAVテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で、提供するステップを含み;それにより、細胞において組み換えAAV粒子が生産される。組み換えAAVテンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、AAVテンプレートの複製およびAAVキャプシド中へのキャプシド形成に十分なAAV配列(例えば、AAV rep配列およびAAV cap配列)およびアデノウイルスおよび/またはヘルペスウイルス由来のヘルパー配列の存在であり得る。特定の実施態様では、AAVテンプレートは、2つのAAV ITR配列を含み、それは、本発明のポリヌクレオチドに対して5’および3’に位置するが、それに直接的に連続している必要はない。

0098

一部の実施態様では、組み換えAAVテンプレートは、Repによって分解されないITRを含み、国際特許公報WO01/92551において記載される二重のAAVベクターを作る。

0099

AAVテンプレートおよびAAV repおよびcap配列は、AAVキャプシド内にパッケージされたAAVテンプレートを含むウイルスベクターが細胞において生産されるような条件下で提供される。当該方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含んでよい。ウイルスベクターは、培地から、および/または、細胞を溶解させることによって、回収され得る。

0100

細胞は、AAVウイルス複製を許容する細胞であってよい。当技術分野で知られている任意の適切な細胞が用いられ得る。特定の実施態様では、細胞は、哺乳類細胞(例えば、霊長類またはヒト細胞)である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失された機能を与えるトランス補完パッケージング細胞株、例えば、293細胞または他のE1aトランス補完細胞であってよい。

0101

AAV複製およびキャプシド配列は、当技術分野で知られている任意の方法によって提供され得る。現行のプロトコルは、典型的に、AAV rep/cap遺伝子を単一のプラスミド上に発現する。AAV複製およびパッケージング配列は、一緒に与えられる必要はないが、そうすることが便利であり得る。AAV repおよび/またはcap配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、rep/cap配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る(例えば、欠失されたアデノウイルスベクターのE1aまたはE3領域内に挿入される)。また、EBVベクターを用いてAAV capおよびrep遺伝子を発現してもよい。この方法の1つの利点は、EBVベクターがエピソームであり、さらに、継続的な細胞分裂にわたって高いコピー数を維持することである(すなわち、「EBVに基づく核エピソーム」と指定される染色体外エレメントとして細胞内に安定して組み込まれる。Margolski,(1992)Curr.Top.Microbiol.Immun.158:67を参照)。

0102

さらなる代替として、rep/cap配列は、細胞内に安定的に組み込まれ得る。

0103

典型的に、AAV rep/cap配列は、これらの配列のレスキューおよび/またはパッケージングを防ぐために、TRによって隣接されない。

0104

AAVテンプレートは、当技術分野で知られている任意の方法を用いて細胞に提供され得る。例えば、テンプレートは、非ウイルス(例えば、プラスミド)またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施態様では、AAVテンプレートは、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターによって供給される(例えば、欠失されたアデノウイルスのE1aまたはE3領域内に挿入される)。別の説明として、Palombo et al.,(1998)J.Virology 72:5025は、AAV TRによって隣接されたレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターを記載する。EBVベクターは、rep/cap遺伝子に関して上述のように、テンプレートを送達するために用いられてもよい。

0105

別の代表的な実施態様では、AAVテンプレートは、複製rAAVウイルスによって提供される。さらに他の実施態様では、AAVテンプレートを含むAAVプロウイルスは、細胞の染色体に安定的に組み込まれる。

0106

ウイルス力価を高めるために、生産的なAAV感染を促進するヘルパーウイルス機能(例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス)が細胞に提供され得る。AAV複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野で知られている。典型的に、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクターによって、例えば、Ferrari et al.,(1997)Nature Med.3:1295、および、米国特許第6,040,183号および第6,093,570号によって説明されるように、効率的なAAV生産を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして、提供され得る。

0107

さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体内に埋め込まれた、または、安定した染色体外エレメントとして維持された、ヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。一般に、ヘルパーウイルス配列は、AAVビリオン内にパッケージングされ得ず、例えば、ITRによって隣接されない。

0108

当業者は、AAV複製およびキャプシド配列およびヘルパーウイルス配列(例えば、アデノウイルス配列)を単一のヘルパー構築物上に提供することが有利であり得ることを理解する。このヘルパー構築物は、非ウイルスまたはウイルス構築物であってよい。1つの非限定的な例示として、ヘルパー構築物は、AAV rep/cap遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであってよい。

0109

特定の一実施態様では、AAV rep/cap配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは、AAVテンプレートをさらに含んでよい。AAV rep/cap配列および/またはAAVテンプレートは、アデノウイルスの欠失された領域(例えば、E1aまたはE3領域)へ挿入され得る。

0110

さらなる実施態様では、AAV rep/cap配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施態様によれば、AAVテンプレートは、プラスミドテンプレートとして提供され得る。

0111

別の実例となる実施態様では、AAV rep/cap配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供されて、AAVテンプレートは、プロウイルスとして細胞内に組み込まれる。あるいは、AAVテンプレートは、染色体外エレメントとして(例えば、EBVに基づく核エピソームとして)細胞内に維持されるEBVベクターによって提供される。

0112

さらなる例示的な実施態様では、AAV rep/cap配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。AAVテンプレートは、別個の複製ウイルスベクターとして提供され得る。例えば、AAVテンプレートは、AAV粒子または第二の組み換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。

0113

前述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的に、アデノウイルスの複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス5’および3’シス配列(すなわち、アデノウイルス末端反復およびPAC配列)を含む。AAV rep/cap配列、および存在する場合は、AAVテンプレートは、アデノウイルス主鎖に埋め込まれて、これらの配列がアデノウイルスキャプシド内にパッケージされ得るように、5’および3’シス配列によって隣接される。上述のように、アデノウイルスヘルパー配列およびAAV rep/cap配列は、一般に、ITRによって隣接されないので、これらの配列はAAVビリオン内にパッケージされない。

0114

Zhangら((2001)Gene Ther.18:704−12)は、アデノウイルスおよびAAVのrepおよびcap遺伝子の両方を含む、キメラヘルパーを記載する。

0115

また、ヘルペスウイルスが、AAVパッケージング方法においてヘルパーウイルスとしても用いられ得る。AAVRepタンパク質(単数または複数)をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、スケーラブルなAAVベクター生産スキームを有利に促進し得る。AAV−2 repおよびcap遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスタイプI(HSV−1)ベクターが記載されている(Conway et al.,(1999)Gene Ther.6:986およびWO00/17377。

0116

さらなる代替として、本発明のウイルスベクターは、例えば、Urabe et al.,(2002)Human Gene Ther.13:1935−43によって説明されるように、rep/cap遺伝子およびAAVテンプレートを送達するために、バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞内に生産され得る。

0117

ヘルパーウイルスの汚染がないAAVベクターストックは、当技術分野で知られている任意の方法によって得ることができる。例えば、AAVおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別され得る。また、AAVは、ヘパリン基質に関する親和性に基づいて、ヘルパーウイルスから区別され得る(Zolotukhin et al.(1999)Gene Therapy 6:973)。いかなる汚染ヘルパーウイルスも複製能力がないように、欠失された複製欠損ヘルパーウイルスが用いられ得る。さらなる代替として、アデノウイルス初期遺伝子発現のみがAAVのパッケージングを仲介するのに必要とされるので、後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルスヘルパーが用いられ得る。後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルス突然変異体は、当技術分野で知られている(例えば、ts100Kおよびts149アデノウイルス突然変異体)。

0118

組み換えウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、細胞に、ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを、インビトロエクスビボで、およびインビボで送達するのに有用である。特に、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドを、動物(哺乳類細胞を含む)に送達または移行するために有利に用いられ得る。

0119

ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドは、適切な制御配列と動作可能に関連し得ることが当業者によって理解される。例えば、ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドは、転写/翻訳制御シグナル、複製起点ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー部位(IRES)、プロモーター、および/またはエンハンサーなどのような、発現制御エレメントと動作可能に関連し得る。

0120

当業者は、所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて、様々なプロモーター/エンハンサーエレメントが用いられ得ることを理解する。プロモーター/エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成的または誘導性であってよい。プロモーター/エンハンサーは、ネイティブまたは外来であってよく、天然または合成の配列であってよい。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主内に転写開始領域が見られないことを意図する。

0121

特定の実施態様では、プロモーター/エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療される対象にネイティブであってよい。代表的な実施態様では、プロモーター/エンハンサーエレメントは、ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドに対してネイティブであってよい。プロモーター/エンハンサーエレメントは、一般に、目的の標的細胞(単数または複数)内でそれが機能するように選択される。さらに、特定の実施態様では、プロモーター/エンハンサーエレメントは、哺乳類のプロモーター/エンハンサーエレメントである。プロモーター/エンハンサーエレメントは、構成的または誘導性であってよい。一部の実施態様では、プロモーターは、筋肉特異的または好適(心筋骨格筋および/または平滑筋特異的または好適を含む)プロモーターである。

0122

誘導性発現制御エレメントは、典型的に、異種核酸配列(単数または複数)の発現に対して制御を提供することが望ましい適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター/エンハンサーエレメントは、組織特異的または好適プロモーター/エンハンサーエレメントであってよく、筋肉特異的または好適(心筋、骨格筋および/または平滑筋特異的または好適を含む)プロモーター/エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター/エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター/エンハンサーエレメントは、限定されないが、Tet on/offエレメント、RU486誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、および、メタロチオネインプロモーターを含む。

0123

ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドが転写されて、その結果、標的細胞内で翻訳される実施態様では、特異的な開始シグナルが、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために一般に含まれる。これらの外因性の翻訳制御配列は、ATG開始コドンおよび隣接配列を含んでよく、天然および合成の両方の様々な由来であってよい。

0124

本発明に係るウイルスベクターは、分裂および非分裂細胞を含む広範な細胞内にジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを送達するための手段を提供する。ウイルスベクターは、例えばインビトロでポリペプチドを生産するためにジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを細胞にインビトロで送達するために、または、エクスビボでの遺伝子療法のために、用いられ得る。ウイルスベクターは、例えば、ジスフェリンを発現するために、それを必要とする対象に、ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを送達する方法においてさらに有用である。このようにして、ジスフェリンは、対象においてインビボで生産され得る。対象は、ポリペプチドが不足しているのでジスフェリンを必要とし得る。さらに、当該方法は、対象でのジスフェリンの生産が何らかの有益な効果を与え得るので実行され得る。

0125

また、ウイルスベクターは、培養細胞または対象においてジスフェリンを生産するために用いられてもよい(例えば、ポリペプチドを生産するためのバイオリアクターとして対象を用いる)。

0126

一般に、本発明のウイルスベクターは、ジスフェリンを送達することが有益である任意の病状を治療および/または予防するために、ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを送達するために用いられ得る。一部の実施態様では、病状は、ジスフェリン異常症および/またはジスフェリン異常症と関連する任意の症候である。本明細書において用いられる用語「ジスフェリン異常症」は、ジスフェリンの異常な発現と関連する任意の疾患、障害、または状態を指す。ジスフェリン異常症と最も一般的に関連する臨床症状は、肢帯筋ジストロフィー(LGMD2B)、三好型ミオパチー、前脛骨発症を伴う遠位型ミオパチー(DMAT)、遠近虚弱化、偽代謝ミオパチー、およびhyperCKemiaを含む。

0127

本発明に係るウイルスベクターは、診断およびスクリーニング方法における用途を見いだし、それにより、ジスフェリンは、細胞培養系、またはあるいは、トランスジェニック動物モデルにおいて一時的または安定的に発現される。

0128

また、本発明のウイルスベクターは、制限されないが、当業者に明らかなように、遺伝子ターゲッティングクリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコルでの使用を含む、様々な非治療的目的のためにも用いられ得る。また、ウイルスベクターは、安全性(拡散、毒性、免疫原性など)を評価する目的のためにも用いられ得る。そのようなデータは、例えば、臨床有効性の評価の前に規制上の承認プロセスの一部として米国食品医薬品局によって考慮される。

0129

対象、医薬製剤、および投与モード
本発明に係るウイルスベクターおよびキャプシドは、獣医および医療用途の両方において使用を見いだす。適切な対象は、鳥類および哺乳類の両方を含む。本明細書において用いられる用語「鳥類」は、制限されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ターキーキジオウムインコなどを含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどを含む。ヒト対象は、新生児幼児未成年および成人を含む。対象は、本発明の方法を必要としていてよく、すなわち、ジスフェリン異常症であると診断されていて、または、その疑いがある。

0130

特定の実施態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体中に、本発明のウイルスベクターおよび/またはキャプシド、および、任意選択で、他の医療薬剤医薬品、安定化剤バッファー、担体、アジュバント希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注入のために、担体は典型的に液体である。他の投与方法のために、担体は、固体または液体のいずれかであってよい。吸入投与のために、担体は呼吸用であり、任意選択で、固体または液体微粒子形態であってよい。

0131

「薬学的に許容できる」によって、毒性または他の方法で望ましくないようなものでない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与され得る。

0132

本発明の一態様は、ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを細胞にインビトロで移行または送達する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適切である標準的な形質導入方法に従って、適切な感染多重度で細胞内に導入され得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞のタイプおよび数、および特定のウイルスベクターに応じて変化し得て、過度実験をせずに当業者によって決定され得る。代表的な実施態様では、少なくとも約103感染単位、より好ましくは少なくとも約105感染単位が細胞に導入される。

0133

ウイルスベクターが導入される細胞(単数または複数)は、制限されないが、筋肉細胞(例えば、骨格筋細胞心筋細胞平滑筋細胞および/または横隔膜筋細胞)を含む任意のタイプであってよい。代表的な実施態様では、細胞は、任意の前駆細胞であってよい。さらなる可能性として、細胞は、幹細胞(例えば、筋肉幹細胞)であってよい。さらに、細胞は、上記の記載の任意の種の起源由来であってよい。

0134

ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞内に導入され得る。特定の実施態様では、細胞は対象から取り出されていて、ウイルスベクターがその中に導入されて、それから、細胞は元の対象内に投与される。エクスビボでの操作のために対象から細胞を取り出して、その後に元の対象に導入する方法は、当技術分野で知られている(例えば、米国特許第5,399,346号を参照)。あるいは、組み換えウイルスベクターは、ドナー対象から細胞内に、培養細胞内に、または、任意の他の適切な由来から細胞内に導入され得て、細胞は、それを必要とする対象(すなわち、「レシピエント」対象)に投与される。

0135

エクスビボでの遺伝子送達に適切な細胞は、上述されるとおりである。対象へ投与する細胞の用量は、対象の年齢、症状および種、細胞のタイプ、細胞によって発現される核酸、投与モードなどによって変化する。典型的に、少なくとも約102〜約108細胞または少なくとも約103〜約106細胞が、薬学的に許容できる担体において投与量あたり投与される。特定の実施態様では、ウイルスベクターを用いて形質導入された細胞は、調剤担体と組み合わせて治療有効量または予防有効量で対象に投与される。

0136

本発明のさらなる態様は、ウイルスベクターを対象に投与する方法である。それを必要とするヒト対象または動物への本発明に係るウイルスベクターおよび/またはキャプシドの投与は、当技術分野で知られている任意の手段によるものであってよい。任意選択で、ウイルスベクターおよび/またはキャプシドは、薬学的に許容できる担体において治療効果的または予防効果的な投与量で送達される。

0137

対象に投与されるウイルスベクターおよび/またはキャプシドの用量は、投与モード、治療および/または予防されるべき疾患または症状、個々の対象の症状、特定のウイルスベクターまたはキャプシド、および、送達されるべき核酸などに依存し、日常的な様式で決定され得る。治療的効果を達成するための例示的な投与量は、少なくとも約105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015 1016、1017、1018形質導入単位、任意選択で、約108〜1015形質導入単位の力価である。

0138

特定の実施態様では、1よりも多い投与(例えば、2、3、4またはそれよりも多い投与)が、様々な間隔、例えば、毎時間、毎日毎週、毎月、毎年などの期間にわたって所望のレベルの遺伝子発現を達成するために用いられ得る。

0139

例示的な投与モードは、経口、直腸、経粘膜鼻腔内、吸入(例えば、エアロゾルを介する)、口腔(例えば、下)、髄腔内、眼球内経皮内皮内、子宮内(または内)、非経口(例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内[骨格筋、横隔膜筋および/または心筋への投与を含む]、胸膜内、脳内、および関節内)、局所(例えば、気道表面を含む皮膚および粘膜表面の両方、および経皮投与)、リンパ内など、ならびに、直接的な組織または臓器注入(例えば、肝臓、眼へ[硝子体内および網膜下を含む]、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳)を含む。

0140

投与は、制限されずに、脳、骨格筋、平滑筋、心臓横隔膜気道上皮、肝臓、腎臓脾臓膵臓、皮膚、および眼からなる群より選択される部位を含む、対象内の任意の部位に対するものであってよい。

0141

本発明に係る骨格筋への投与は、制限されないが、四肢(例えば、上腕前腕上脚、および/または下脚),背中,首、頭部(例えば、舌)、胸部腹部骨盤会陰、および/または指の骨格筋への投与を含む。適切な骨格筋は、限定されないが、小指外転筋小指外転筋(手)、小指外転筋小指外転筋(足)、母指外転筋、第五中足骨外転筋短母指外転筋長母指外転筋短内転筋母趾内転長内転筋大内転筋母指内転筋肘筋前斜角筋膝関節筋上腕二頭筋大腿二頭筋上腕筋腕橈骨筋頬筋烏口腕筋皺眉筋三角筋口角下制筋下唇下制筋二腹筋背側骨間筋(手)、背側骨間筋(足)、短橈側手根伸筋長橈側手根伸筋尺側手根伸筋小指伸筋指伸筋短指伸筋長指伸筋短母指伸筋、長母趾伸筋示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋橈側手根屈筋尺側手根屈筋短小指屈筋(手)、短小指屈筋(足)、短屈筋、長趾屈筋、深指屈筋浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋長母指屈筋前頭筋腓腹筋オトガイ舌骨筋、大殿筋、中殿筋小殿筋薄筋頚腸肋筋腰腸肋筋胸腸肋筋腸骨筋下双子筋下斜筋下直筋棘下筋棘間筋横突間筋外側翼突筋外側直筋広背筋口角挙筋眼窩下筋上唇鼻翼挙筋上眼瞼挙筋肩甲挙筋長回旋筋、頭最長筋最長筋胸最長筋頭長筋、頸長筋、虫様筋(手)、虫様筋(足)、咬筋内側翼突筋内側直筋中斜角筋多裂筋顎舌骨筋、下頭斜筋上頭斜筋外閉鎖筋内閉鎖筋後頭筋肩甲舌骨筋小指対立筋母指対立筋眼輪筋口輪筋掌側骨間筋、短掌筋長掌筋恥骨筋大胸筋小胸筋短腓骨筋長腓骨筋第三腓骨筋梨状筋底側骨間筋足底筋広頸筋膝窩筋後斜角筋方形回内筋円回内筋大腰筋大腿方形筋足底方形筋前頭直筋外側頭直筋、大後頭直筋小後頭直筋大腿直筋大菱形筋小菱形筋笑筋縫工筋、最小斜角筋半膜様筋頭半棘筋半棘筋胸半棘筋半腱様筋前鋸筋短回旋筋、ヒラメ筋頭棘筋頚棘筋胸棘筋頭板状筋頚板状筋胸鎖乳突筋胸骨舌骨筋胸骨甲状筋茎突舌骨筋鎖骨下筋肩甲下筋上双子筋上斜筋上直筋回外筋棘上筋側頭筋大腿筋膜張筋大円筋小円筋胸郭舌骨前脛骨筋後脛骨筋僧帽筋上腕三頭筋中間広筋外側広筋内側広筋大頬骨筋、および小頬骨筋、および任意の他の適切な当技術分野で知られている骨格筋を含む。

0142

ウイルスベクターは、静脈内投与動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流、(任意選択で、足および/または腕の単離された四肢灌流;例えばArruda et al.,(2005)Blood 105:3458−3464を参照)、および/または、直接的な筋肉内注入によって、骨格筋に送達され得る。特定の実施態様では、ウイルスベクターおよび/またはキャプシドは、四肢灌流、任意選択で、単離された四肢灌流(例えば、静脈内または関節内投与によって、対象(例えば、ジスフェリン異常症を有する対象)の四肢(腕および/または足)に投与される。本発明の実施態様では、本発明のウイルスベクターおよび/またはキャプシドは、「流体力学」技術を用いずに有利に投与され得る。従来技術ベクターの組織送達(例えば、筋肉への)は、血管系内の圧力を増大させてベクターが内皮細胞バリアを横切る能力を促進する流体力学技術(例えば、大量の静脈内/静脈内投与)によって、しばしば高められる。特定の実施態様では、本発明のウイルスベクターおよび/またはキャプシドは、大量インフュージョンおよび/または高められた血管内圧力(例えば、正常の収縮期圧よりも高い、例えば、正常の収縮期圧よりも、血管内圧が5%、10%、15%、20%、25%以下の増加)のような流体力学技術の不存在下で投与され得る。そのような方法は、浮腫神経損傷および/またはコンパートメント症候群のような、流体力学技術と関連する副作用を減少または防止し得る。

0143

心筋への投与は、左心房右心房左心室右心室および/または隔膜への投与を含む。ウイルスベクターおよび/またはキャプシドは、静脈内投与、動脈内投与、例えば、大動脈内投与、直接的な心臓注入(例えば、左心房、右心房、左心室、右心室へ)、および/または冠動脈灌流によって、心筋に送達され得る。

0144

横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および/または腹膜内投与を含む任意の適切な方法によるものであってよい。

0145

平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および/または腹膜内投与を含む任意の適切な方法によるものであってよい。一実施態様では、投与は、平滑筋内、付近および/または上に存在する内皮細胞に対するものであってよい。

0146

標的組織への送達は、ウイルスベクターおよび/またはキャプシドを含むデポーを送達することによっても達成され得る。代表的な実施態様では、ウイルスベクターおよび/またはキャプシドを含むデポーは、骨格筋、平滑筋、心筋および/または横隔膜筋組織へ移植されて、または、組織は、ウイルスベクターおよび/またはキャプシドを含むフィルムまたは他のマトリックスと接触され得る。そのような移植可能なマトリックスまたは基材は、米国特許第7,201,898号に記載される。

0147

特定の実施態様では、本発明に係るウイルスベクターは、骨格筋、横隔膜筋および/または心筋に投与される(例えば、ジスフェリン異常症を治療および/または予防するため)。

0148

代表的な実施態様では、本発明は、骨格筋、心筋および/または横隔膜筋の障害を治療および/または予防するために用いられる。

0149

代表的な実施態様では、本発明は、それを必要とする対象においてジスフェリン異常症を治療および/または予防する方法を提供し、当該方法は、治療的または予防的有効量の本発明のウイルスベクターを、哺乳類対象に投与するステップを含み、ここで、ウイルスベクターは、ジスフェリン、ミニ−ジスフェリン、または、マイクロ−ジスフェリンをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施態様では、ウイルスベクターは、本明細書における他のどこかに記載されるように、骨格筋、横隔膜および/または心筋に投与され得る。

0150

注入剤は、従来の形態で、液体の溶液または懸濁液のいずれかとして、注入前の液体での溶液または懸濁液に適切な固体形態、またはエマルションとして、調製され得る。あるいは、本発明のウイルスベクターおよび/またはウイルスキャプシドは、全身性よりむしろ局所的に、例えば、デポーまたは徐放性製剤において投与し得る。さらに、ウイルスベクターおよび/またはウイルスキャプシドは、外科的に移植可能なマトリックス(例えば、米国特許公報番号2004−0013645に記載)に付着されて送達され得る。

0151

本発明を説明したが、同様のものが、以下の実施例においてより詳細に説明されて、それは、説明目的のみのために本明細書に含まれて、本発明を制限することを意図しない。

0152

実施例1
トランケートされたジスフェリン
いくつかのトランケートされたヒトジスフェリンクローンが調製された。配列およびドメインを以下に開示する。残基のナンバリングは、ヒトジスフェリンアイソフォーム8(NP_003485.1)(配列番号11)に基づく。クローンのアミノ酸配列のアライメントを表3に示す(配列番号6〜11)。クローンのそれぞれは、インビトロで細胞において発現されて、ジスフェリンポリペプチドを生産することが示された。

0153

野生型ヒトジスフェリン(アイソフォーム8)(配列番号11)
[C2A,1:124];[125:218];[C2B,219:352];[353:365];[C2C,366:515];[516:669];
[FerA,670:782];[783:863];[DysF,864:1097];[1098:1136];[C2D,1137:1281];
[1282:1313];[C2E,1314:1465];[1466:1578];[C2F,1579:1696];[1697:1788];
[C2G,1789:1994];[1995:2044];[TM,2045:2067];[2068:2080]
野生型ジスフェリンドメインの概要:C2A、C2B、C2C、FerA、DysF、C2D、C2E、C2F、C2G、TM

0154

クローン_318 No Flag(433)(配列番号6)
[C2A,1:124];[147:155];[157:166];[172:180];[187:192];[199:205];[C2B,222:352];
[353:365];[C2C,366:515];[566:619];[FerA,670:782];[831:863];[DysF−a,864:891];
[DysF−b,942:1097][1098:1104][1282:1313];[C2E,1314:1465];[1496:1517];
[1523:1532];[1538:1548];[C2F,1579:1696];[1718];[1724:1741];[1747:1765];
[C2G,1792:1994];[2000:2003];[2018:2030];[2036:2044];[TM,2045:2067];
[2068:2080]
クローン_318ドメインの概要:C2A、C2B、C2C、FerA、DysF*、C2E、C2F、C2G、TM

0155

クローン_431 No Flag(431)(配列番号7)
[C2A,1:124];[125:218];[C2B,219:352];[353:365];[C2C,366:515];[516:669];
[FerA,670:782];[783:863];[DysF,864:1097];[1098:1136];[C2G,1789:1823];
[C2G*,1824:1836=TKGAFGDMLDTP−];[C2G,1837:(C1884A):1994];
[1995:2044];[TM,2045:2067];[2068:2080]
クローン_431ドメインの概要:C2A、C2B、C2C、FerA、DysF、C2G*、TM

0156

クローン_430 No Flag(430)(配列番号8)
[C2A,1:124];[125:218];[357:365];[C2C,366:515];[516:669];[FerA,670:782];
[783:863];[DysF,864:1097];[1098:1136];[C2G,1789:(C1884A):1994];[1995:2044];
[TM,2045:2067];[2068:2080]
クローン_430ドメインの概要:C2A、C2C、FerA、DysF、C2G、TM

0157

クローン_342 No Flag(426)(配列番号9)
[C2A,1:124];[125:218];[C2C,366:515];[516:669];[FerA,670:782];[783:863];
[DysF,864:1097];[1098:1136];[C2F,1579:1696];[1697:1788];
[C2G,1789:(C1884A):1994];[1995:2044];[TM,2045:2067];[2068:2080]
クローン_342ドメインの概要:C2A、C2C、FerA、DysF、C2F、C2G、TM

0158

クローン_425 No Flag(425)(以前は341)(配列番号10)
[C2A,1:124];[125:218];[C2B,219:352];[353:365];[C2C,366:515];[516:669];
[FerA,670:782];[783:863];[DysF,864:1097];[1098:1136];
[C2G,1789:(C1884A):1994];[1995:2044];[TM,2045:2067];[2068:2080]
クローン_425ドメインの概要:C2A、C2B、C2C、FerA、DysF、C2G、TM

0159

*−野生型ドメインの範囲と比較した、ドメイン範囲における中断を示す

0160

実施例2
トランケートされたジスフェリンのインビボ効果
より小さなジスフェリン遺伝子を構築する以前の試みは、部分的に折り畳まれたタンパク質ドメインが、不適当なトランケーションの結果として、より小さな遺伝子の任意の治療的価値を覆い得るという事実を無視していた。この問題を緩和するために、ジスフェリンのそれぞれのドメインを合理的に規定するためにC2ドメインの構造的特徴に対して注意深い配慮が払われた。ジスフェリン内の7つのC2ドメインを、ぞれぞれ、8個の予測のb鎖、C2ドメイントポロジー、Ca2+−結合部位の完全性(適切ならば)、および、ドメインのコアにおける疎水性パッキングの連続性によって規定した(表2)。ナノ−ジスフェリンを構築するための全体的な哲学は、3つのルールに基づく。第一に、フェーリンファミリーメンバー、FerAおよびDysFの中心的な特性は、全ての構築物において無傷に維持された。第二に、最初のC2Aドメイン、および、膜貫通スパンの隣のC2ドメインであるC2Gは、全ての構築物において保存された。第三に、多数のタンデムC2ドメインは、全体的な膜結合性に個々に寄与する。これらのテナントを考慮して、C2ドメインは、折り畳まれたドメインおよびそれを他の潜在的に折り畳まれたドメインに連結するフレキシブルリンカーの知識によって、その後に切除された。これらの3つのルールは、小型の潜在的に治療的なジスフェリン変異体(ナノ−ジスフェリン(クローン425))の構築を導き、それは、単一のAAVキャプシド内に効率的にパッケージされると予測された(オープンリーディングフレーム[ORF]4,356nt)。

0161

哺乳類細胞におけるナノ−ジスフェリンの発現
ナノ−ジスフェリンは、野生型(WT)ジスフェリンアイソフォーム8のcDNA(6,240nt)に基づき、それは、ドメインC2A−C2B−C2C−FerADysF−C2D−C2E−C2F−C2G−TMを含む(図1A)。はじめに、膜関連、または可溶性の、タンパク質溶解物のウエスタンブロッティングを行なって、C2C12筋芽細胞におけるトランスフェクション後のナノ−ジスフェリン局在を決定した。これらの実験に関して、全長ジスフェリンおよびGFP発現カセットは、それぞれポジティブおよびネガティブコントロールとして働いた。結果は、ナノ−ジスフェリンが、その予測サイズ(160kDa)で単一バンドとして生産されて、および、その親分子ジスフェリン同様に、ナノ−ジスフェリンは、膜および膜小胞関連のタンパク質であることを示す(図1B)。トランスフェクトされたヒトHeLa細胞におけるナノ−ジスフェリンの免疫蛍光は、野生型ジスフェリン同様に大量であることおよびタンパク質局在化を示し、両方とも、以前に報告されたように(Han et al.,J.Clin.Invest.117:1805(2007);Bansa et al.Nature 423:168(2003))、膜小胞と同様に細胞全体にわたって分布していた(図1C)。ジスフェリン患者の筋芽細胞におけるインビトロの毒性実験は、プラスミドDNAの増加するトランスフェクション投与量でのナノ−ジスフェリンまたはジスフェリン過剰発現後のアラマーブルーによって、毒性を示さなかった(図1D)。

0162

弱いプロモーターを用いた無傷のAAV形質導入は、強力なプロモーターを用いたフラグメントAAVよりも効率的である
インビボ試験に関する最も効率的な治療法を見つけるために、ナノ−ジスフェリンタンパク質生産に関して、強力なCMVプロモーターによるフラグメントAAVを、小さくて弱いJeTプロモーターによる無傷のAAVに対して評価した。CMV−ナノ−ジスフェリンは、5,597ntのカセットサイズを有し、一方で、JeTナノ−ジスフェリンは、4,849ntで理論的にAAVキャプシドパッケージング容量内である(Tornoe et al.,Gene 297:21(2002))(図2A)。プラスミドのコンテキストにおいてそれぞれのカセットからのナノ−ジスフェリンタンパク質生産を決定するために、ウエスタンブロッティングをHEK293細胞トランスフェクション後に行なった。予期されたとおり、より大きなCMVプロモーターは、小さなJeTプロモーターよりもおよそ15倍多くのナノ−ジスフェリンを生産した(Tornoe et al.,Gene 297:21(2002))(図2B)。既存のAAVパッケージングの定説を考慮に入れれば、5.6kbでのCMV−ナノ−ジスフェリンカセットは、フラグメントAAVを生産するが、一方で、より小さなJeTカセットは、4.85kbの無傷のゲノムとしてAAV2キャプシド内にパッケージされ得ると仮定された。これを調べるために、キャプシドによってパッケージされたDNA種をアルカリゲル電気泳動によって分離して、それから、SYBRゴールドによって染色した。意図されたサイズの単一のDNA種が、より小さなJeTによって駆動されるカセットに関して観察されたが、一方で、より大きなCMVプロモーターから発現されるナノ−ジスフェリンは、意図された5.6kbゲノムよりもずっと小さな、およそ3.5〜4.5kbのサイズ範囲内の異種DNA種のパッケージングをもたらした(図2C)。無傷のAAVと比較してフラグメントAAV形質導入の効率は、5〜100倍に劇的に減少する(Hirsch et al.,Mol.Ther.21:2205(2013);Hirsch et al.,PLoS ONE 4:e7705(2009))。JeTプロモーターよりもずっと強力なCMVプロモーター(図2B)が、フラグメントAAVの低減された効率を克服することができるかどうかを決定するために、ナノ−ジスフェリンの多さを、増加する投与量での形質導入後にウエスタンブロットにより決定した。CMVに好適なプロモーター強度の違いにかかわらず、無傷のAAV2−JeT−ナノ−ジスフェリンベクター形質導入は、増加する投与量で投与された場合、フラグメントAAV2−CMV−ナノ−ジスフェリンと比較して優れたタンパク質生産を示した(図2D)。パッケージされたトランスジェニックDNAの規定された性質図2C)、無傷のAAVベクター形質導入の増大された効率(図2D)、想定された全身性臨床静脈内(IV)投与、および、診療所での高い投与量でのベクターに対する不要な免疫学的応答に関する潜在性を考慮に入れれば、より高い効率の無傷のJeT−ナノ−ジスフェリンに基づくベクターを、残りのインビボ試験のために選択した。

0163

AAV−ナノ−ジスフェリンは、筋肉内注入後に筋肉完全性を改善する
次に、AAV−ナノ−ジスフェリンの安全性および有効性を、AAV1キャプシドを広範な筋肉形質導入に関するその能力に起因して用いて、筋肉内注入後に盲目実験で調べた。6週齢ジスフェリン−欠損(BLA/J)マウスのTAにAAV1−JeT−ナノ−ジスフェリンを注入して、対側の足はAAV1−CMV−GFPをコントロールとして受け取った。屠殺の40時間前に、9週において、線維内アルブミンに結合する筋肉損傷マーカーであるエバンスブルー色素を腹腔内にマウスに注入して、損傷した筋肉線維の筋線維鞘内の裂け目の検出を助けた(Matsuda et al.,J.Biochem.118:959(1995))。横断面において全線維に対して標準化された陽性の線維をカウントする際に、AAV1−GFPコントロール筋肉におけるエバンスブルー色素陽性の線維の変動が個々のBLA/Jマウス間で観察されて、遺伝学的に同一のマウスにおける異なる疾患重症度を示唆した(図3A、「GFP」)。これは、以前に報告されたように、ヒトジスフェリン異常症患者での初期疾患の変動性と一致する(Nguyen et al.,Hum.Mutat.26:165(2005))。マウス間では、コントロールベクターによって処置されたTA間のベースラインの変動にもかかわらず、それぞれのマウス内で、AAV1−JeT−ナノ−ジスフェリンによって処置された全ての筋肉は、それぞれの対側GFPコントロールと比較して、より少ないエバンスブルー色素陽性の線維を示した(図3A)。まとめると、マウスコホートは、対応両側t検定によって、処置およびコントロール筋肉の間に有意差を示した(p=0.005)(図3A)。筋肉再生およびしたがって間接的に筋肉線維ターンオーバーに関するマーカーである中心の核形成を、断面のH&E染色の際に定量化した。データは、内部AAV1−GFPコントロールと比較して、AAV1−Jet−ナノ−ジスフェリンが注入されたTA筋肉の1つを除く全てにおける中心の核形成の低減を示す(図3B;両側t検定、p=0.0125)。AAVによって処置された筋肉も、視覚的に改善された組織学を示した(図3C)。免疫蛍光は、筋肉線維のおよそ30%においてナノ−ジスフェリンを検出したが;それぞれの筋肉線維におけるその局在は、内因性ジスフェリンに関して観察された筋線維鞘優勢と比較して、より分散していた。これは不可解であるが、ジスフェリン欠損マウスにおけるジスフェリン遺伝子付加試験に関して一貫して報告された一般的な観察である(Lostal et al.,Hum.Mol.Genet.19:1897(2010);Sondergaard et al.,Ann.Clin.Transl.Neurol.2:256(2015);Grose et al.,WPLoS ONE 7:e39233(2012))(図3D)。

0164

AAV−ナノ−ジスフェリンは、全身注入後に運動機能を改善する
ジスフェリン異常症のBLA/Jマウスモデルは、およそ12月齢において、運動チャレンジ(motor challenge)および獲得の感覚(sensitivity of acquisition)に応じて、有意に現れる軽度の運動欠陥のみを有し、ヒトの状態とは異なる(Nagy et al.,Physiol.Rep.5:e13173(2017))。一貫して、ヒトジスフェリン異常症は、人生のより初期の正常または実に高められた運動競技熱とともに、通常、12の後に明らかになる。診断のタイミングおよびその後のヒト治療的な処置ウインドウ模倣する試みにおいて、BLA/Jマウスを、1e11ウイルスゲノムの投与量で、AAV9−JeT−ナノジスフェリン(n=6)またはAAV9−CMV−GFPコントロールベクター(n=4)によって全身的に処置した。筋ジストロフィーにおいてしばしば上昇するマーカーである血液クレアチンキナーゼ活性(Cabaniss(1990).Creatine kinase.In Clinical Methods:The History,Third Edition,H.K.Walker,W.D.Hall,and J.W.Hurst,eds.(Butterworths))を、39週に測定して、AAV9−ナノ−ジスフェリンコホートは、ウェルチの補正を伴う独立t検定によって、有意ではないが低減する傾向を示した(p=0.13)(図4A)。より高齢のBLA/Jマウスにおける経時的な、腕/頭を空中に保って2本の後足で立つ能力である立ち上がり行動の減少の以前の知見に基づき、このコホートの立ち上がり行動の活性は、43週齢に、注入後だいたい5ヶ月半後に観察された(Nagy et al.,Physiol.Rep.5:e13173(2017))。データは、ウェルチの補正を伴うt検定によって、AAV9−JeT−ナノ−ジスフェリンを受け取ったマウスにおいてのみ1時間以内に平均して>200回よりも多く、合計の立ち上がり行動において有意な増大を示す。(p=0.037)(図4B)。さらに、経時的な立ち上がり行動の能力の分析は、AAV9−Jet−ナノ−ジスフェリンを注入されたマウスが疲労せず、一定レベルで立ち上がり行動を維持することを示唆して、一方で、AAV9−CMV−GFPが注入されたマウスの能力は、繰り返し測定でANOVAによって分析した場合に経時的に低減した(p=0.039)(図4C)。水平活性は、最初の30分にわたって違いを示さなかったが(p=0.58);評価の最後の30分にわたって、有意でないが(p=0.13)、より高い水平活性の傾向が、t検定によって、ナノ−ジスフェリンによって処置されたマウスにおいて観察された。早期の「疲労」に対するこの傾向は、C56B7マウスと比較した場合に、BLA/Jジスフェリン異常症マウスモデルにおいて観察されている(Nagy et al.,Physiol.Rep.5:e13173(2017))。

0165

AAV−ナノ−ジスフェリンは、全身注入後の筋肉完全性を改善する
運動機能に関して上述の全身性に処置されたコホートは、4.5月齢における単回注入後54週、およそ8ヶ月に屠殺された。エバンスブルー色素を安楽死の前に投与して、損傷した筋肉の指標である色素の取り込みを、全筋肉アッセイにおいて、組織学後に線維ごとの様式で別個に分析した(Matsuda et al.,J.Biochem.118:959(1995))。全筋肉エバンスブルー色素アッセイを、以前に研究でBLA/Jマウスにおいて最も影響を受けると決定された臀筋および腰筋を用いて行なった(Nagy et al.,Physiol.Rep.5:e13173(2017))。このアッセイでは、より高い吸光度は、色素取り込みの増大、および、より多くの筋肉損傷を示す(Matsuda et al.,J.Biochem.118:959(1995))。我々の以前の研究によってBLA/Jマウスモデルにおいて最も影響を受けると考えられた臀筋は(Nagy et al.,Physiol.Rep.5:e13173(2017))、ウェルチの補正を伴うt検定によって、コントロールと比較して、AAV9−JeT−ナノ−ジスフェリンによって処置されたマウスにおいて、有意により低いエバンスブルー色素の取り込みを示した(p=0.037)(図5B)。一方、腰筋の分析は、ウェルチの補正を伴うt検定によって、コントロール(n=4)と比較して、AAV9−JeT−ナノ−ジスフェリンによって処置されたマウス(n=6)において、減少されたエバンスブルー色素の全筋肉の取り込みの有意でない傾向を示した(p=0.11)(図6A〜6B)。エバンスブルー色素の全筋肉の分析を確認するために、エバンスブルー色素陽性の線維を、組織学後に直接カウントして、全線維に対して標準化して、AAV9−Jet−ナノ−ジスフェリンによって処置された筋肉は、エバンスブルー色素陽性の線維のほぼ有意な(p=0.056)減少を示した(図5C)。筋肉再生およびターンオーバーの指標である中央に核のある線維もまた、AAV9−Jet−ナノ−ジスフェリンによって処置された臀筋において、有意ではないが強い減少傾向を明らかにした(p=0.0835)(図5A)。全中心核/全線維も評価して、処置間で有意差は見られなかった(図6A〜6B)。筋線維の健康のさらなる尺度として、臀筋の線維サイズを、小麦胚芽アグルチニン(WGA)レクチンによって染色された筋肉断面由来の最小Feret径によって測定して(Briguet et al.,Neuromuscul.Disord.14:675(2004))、ImageJを用いて分析した。過去の試験は、野生型遺伝的背景マウスと比較した場合、ジスフェリン−ヌルマウスの筋肉における平均線維サイズの低減および変動性の増大を見いだした(Bansal et al.,Nature 423:168(2003)。本結果は、全身性に処置された、AAV9−Jet−ナノ−ジスフェリンによって処置されたマウス由来の筋線維が、GFP−マウス−処置の筋線維よりも有意に大きいことを見いだして(p<0.0001)(図5D)、線維サイズ分布グラフは、AAV9−Jet−ナノ−ジスフェリンによって処置されたコホートにおいて右にシフトした正規分布曲線を示した(図7)。以前の研究(Nagy et al.,Physiol.Rep.5:e13173(2017))での、臀筋において観察された有意な脂肪浸潤を考慮して、脂質のオイルレッド染色を臀筋断面において行ない、染色の徹底的な低減を観察して、AAV9−Jet−ナノジスフェリンによって処置されたマウスの臀筋における、より少ない脂質蓄積を示唆した。完全性の改善をもたらす臀筋におけるナノ−ジスフェリン生産の程度を決定するために、ウエスタンブロットを行なったが、ナノ−ジスフェリンは、このアッセイによる検出限界よりも低く、これらのブロット陰性であった。この後に、筋肉断面に対して蛍光免疫染色を行ない、小麦胚芽アグルチニンレクチンを、筋肉の筋線維鞘を染色するために用いた。発現は、筋線維のおよそ10%において明らかであった(ナノ−ジスフェリン全線維、n=256;未処置の全線維、n=185)(図8)。ナノ−ジスフェリンの存在も、RT−qPCRによって、処置されたマウスの臀筋において確認した(図9A〜9B)。ナノ−ジスフェリンは、筋線維鞘局在の傾向があると考えられて、一部のタンパク質は、IM注入(図3)およびいくつかの以前の報告(Lostal et al.,Hum.Mol.Genet.19:1897(2010);Sondergaard et al.,Ann.Clin.Transl.Neurol.2:256(2015);Grose et al.,WPLoS ONE 7:e39233(2012))と同様に、明らかに細胞基質の全体にわたって局在した。

0166

考察
AAVによって仲介される遺伝子療法は、現在のところ、デュシェンヌ型筋ジストロフィーDMD)およびジスフェリン異常症のような疾患を治療するための有望な方法であると考えられている(Lostal et al.,Hum.Mol.Genet.19:1897(2010);Sondergaard et al.,Ann.Clin.Transl.Neurol.2:256(2015);Hirsch et al.,Mol.Ther.21:2205(2013);Grose et al.,WPLoS ONE 7:e39233(2012))。しかしながら、これらの筋消耗の疾患の両方とも、AAVベクターの主な欠陥を強調し:ウイルスキャプシドは小さすぎて、単純な遺伝子付加ストラテジーのために全長cDNAをパッケージすることができない(Pryadkina et al.、Mol.Ther.MethodsClin.Dev.2:15009(2015))。この制限を克服するために、我々およびその他は、多数のAAVキャプシドが大きな遺伝子の部分を核へ送達する能力を研究して、ここで、宿主のDNA損傷応答は、大きな遺伝子の再建に関する可能性を仲介する(Wu et al.,Mol.Ther.18:80(2010);Hirsch et al.,Mol.Ther.21:2205(2013);Dong et al.,Mol Ther.18:87(2010);Lai et al.,Mol Ther.18:75(2010))。興味深いことであるが、AAVの大きな遺伝子の送達に関するこれらのDNA修復依存性の多数のベクターのフォーマットは(Hirsch et al.,Mol Ther.18:6(2010))、無傷のトランスジェニックゲノムを有する単一のAAV粒子と比較して、劇的に減少された形質導入効率に悩まされる(Hirsch et al.,Mol.Ther.21:2205(2013);Hirsch et al.,PLoS ONE 4:e7705(2009))。単一細胞を感染する1つの粒子に理論的に依拠する単一粒子AAV遺伝子付加ストラテジーとは異なり、AAVオーバーサイズの遺伝子形質導入は、特に全身性に送達される場合に、非常に非効率である(Hirsch et al.,Mol.Ther.21:2205(2013);Hirsch et al.,PLoS ONE 4:e7705(2009))。これは、主に、(1)いくつかの異なるベクターゲノムが、単一の核内で脱コーティングされる必要性、および(2)非相同末端結合に向かう傾向がある、筋線維のような非分裂細胞における非効率な相同性に向けられた修復(それにより、異常な非機能性かつ潜在的に免疫原性の導入遺伝子産物が生じる)のせいである。オーバーサイズのAAV形質導入アプローチの低減された効率に起因して、(単一粒子AAV形質導入と比較して)より高い効果的な投与量が必要とされる(Hirsch et al.,Mol.Ther.21:2205(2013))。多くの場合において、ウイルスの用量の増大は、望ましくない免疫学的合併症を生じさせて治療的失敗をもたらすことによって、問題を悪化させる。さらに、単一のAAVベクター形質導入のみを必要とする他の筋肉疾患に関する臨床グレードAAVベクター製剤の現在の生産力価は、治療され得る患者数を限定する重大な制限である。AAVの大きな遺伝子の形質導入に関するこれらの2つの主な関心事にもかかわらず、ジスフェリン欠損マウスにおける前臨床データは、ジスフェリン異常症の治療のためのAAVオーバーサイズの形質導入の使用を提唱するフェーズ臨床試験に関するジスフェリン異常症患者の動員をもたらしている(Grose et al.,WPLoS ONE 7:e39233(2012))。とりわけ、これは、単一細胞の多数のベクター形質導入、および、臨床成功のための筋線維における相同性に向けられた修復に関する患者のDNA損傷応答の能力に意図的に依拠する最初のAAV試験である。ジスフェリン異常症を有する患者に代替の治療ストラテジーを提供するために、我々は、DMD共同体との先例に従って(followed suit with)、単一AAVベクターゲノムのパッケージングおよび形質導入を受け入れることが可能な、小型のジスフェリン様のオープンリーディングフレームであるナノ−ジスフェリンを合理的に設計した。

0167

一般に、C2ドメインは、リン脂質膜内葉に結合することのできるモジュール式タンパク質ドメインである(Davletov et al.,J.Biol.Chem.268:26386(1993))。ほとんどのC2ドメインは、Ca2+−依存性の様式で膜に結合するが、そうでないものが一部存在する。野生型ジスフェリンは7つのタンデムC2ドメインを保有し、それぞれが長いリンカーによって分離されている(Abdullah et al.,Biophys.J.106:382(2014))。より小型のジスフェリンタンパク質の構築における我々の中心的な仮説は、多数のタンデムC2ドメインが、タンパク質全体の膜結合結合活性に対して個々に寄与するということである。したがって、より少ないドメインが膜に結合してもなお、それらの機能を依然として提供するが、無傷のAAVパッケージングを受け入れることによって治療的利益を提供することができるポイントがあるはずである。このストラテジーは、C2ドメインを作り上げるものについて知識を与える。ジスフェリンの全体的なサイズを最小化する他の試みが存在している(Ghosh et al.,Hum.Gene Ther.22:77(2011));しかしながら、これらの実験は、C2ドメインの構造の徹底的な理解をせずに行なわれた。明確なドメインの定義がないと、単一の折り畳まれたドメインの、折り畳まれた意図しないトランケーションでさえ、タンパク質全体をミスフォールドし得て、それにより、分解、機能喪失、または凝集さえもたらす。いくつかの構築物を試験した後に、我々は、FerA、DysF、C2G、および膜貫通ドメインに加えて、アミノ末端C2ドメイン、C2A、C2B、およびC2Cをそれらのドメイン内リンカーとともに維持することが、ジスフェリン欠損マウスモデルにおけるジスフェリン機能の不存在に関して、分子補正をもたらすことを発見した。

0168

AAVのトランスジェニックDNAパッケージングの制限(<5kb)は、全長ジスフェリンcDNAのパッケージングを妨げるだけでなく、ナノ−ジスフェリン発現に関する我々のプロモーターサイズも制限する。パッケージされたAAVゲノムの実験は、JeTプロモーターから発現されたナノ−ジスフェリン(4,849nt)は、単一種としてパッケージされて;対照的に、CMVを用いた場合(5,597nt)、3〜5kbの範囲のサイズである異種DNA種がキャプシド形成されることを明らかに示した(Tornoe et al.,Gene 297:21(2002))(図2C)。このフラグメントAAVベクターは、JeTプロモーターと比較した場合、CMVプロモーターの>10倍増大された発現にもかかわらず、AAV単一ベクターの形質導入よりも非効率的であった(図2Bおよび2D)。

0169

以前の実験において、我々は、フラグメントAAVオーバーサイズの遺伝子の形質導入は、AAVの大きな遺伝子の形質導入の他のアプローチよりも良い、または同様であることを示し、それは一般に「デュアルベクター」アプローチと呼ばれる(Pryadkina et al.,Mol.Ther.MethodsClin.Dev.2:15009(2015);Hirsch et al.,Mol Ther.18:6(2010);Hirsch et al.,Mol Ther.21:2205(2013)によって概説される)。フラグメントAAVおよびデュアルAAVの形質導入効率を調べる我々の公表された研究では、無傷のAAVは、単一のAAVベクターの形質導入に依拠するAAVキャプシドパッケージよりも5〜100倍の効率を維持した。

0170

したがって、インビボ分析に関する我々の焦点は、単一AAVベクター形質導入に関するJeT−ナノ−ジスフェリンカセットに依拠した。本明細書における我々の努力限界は、無傷のゲノムパッケージングに必要とされる場合に、JeTプロモーターは小さくて、さらに相対的に弱くて事実上遍在することであり、それは、骨格筋療法によって送達されるIVにとって理想的でない(Tornoe et al.,Gene 297:21(2002))(図2A〜2D)。現在のところ、小さな筋肉特異的プロモーターC2−27およびC5−12が試験中であり、それは、AAVコンテキストにおいてナノ−ジスフェリンと組み合わせた場合に、筋肉における有意に高い転写活性を同様に有しながら、無傷のゲノムパッケージングを可能にすると仮定される(Li et al.,Nat.Biotechnol.17:241(1999))。

0171

ジスフェリン欠損骨格筋への直接のAAV1−JeT−ナノ−ジスフェリンの対側投与は、低減されたエバンスブルー色素線維染色によって決定されるように、試験された全てのマウス、および、中央に核のある線維によって試験された1匹を除くすべてのマウスにおいて、筋肉完全性の増大をもたらした(図3A〜3B)。このマウス間の対側の比較は、動物間のジスフェリン表現型(図3A〜3B、黒いバー)が、おそらく環境的コンテキスト(すなわち、特定のマウスに関する個々の活性の増大)に起因して変動したため、重要である。このマウス間の疾患重症度における変動にもかかわらず、結果は、処置された線維のおよそ30%において、免疫蛍光(IF)によって明らかな、ナノ−ジスフェリンの結果としての増大した完全性および有意に改善された筋肉表現型を明確に示した(図3C)。興味深いことに、我々は、遺伝子送達後のナノ−ジスフェリン局在が、WTマウスにおけるネイティブのジスフェリンに関して観察されるように、主に筋線維鞘に制限されないことに注目する(図3D)。以前の報告(Lostal et al.,Hum.Mol.Genet.19:1897(2010);Grose et al.,WPLoS ONE 7:e39233(2012))によって明らかにされたように、多数のベクターアプローチを介したWTジスフェリンの復元もまた異常な細胞内分布をもたらしたので、この結果はナノ−ジスフェリンに特異的でなく依然として不可解である。この異常な局在の理由は、ジスフェリンは分化中に制御されることが示唆されているので、最終分化した筋線維へのジスフェリン(またはナノ−ジスフェリン)の復元に起因すると推測されるが、線維あたりの変更された多さなどの他の理論も考慮される。

0172

奇妙なことに、ヒト患者におけるジスフェリン異常症の発症は、以前は無症状であって運動選手であることの多い個人において、10代の間に一般に始まる。報告は、これに関する理由は、この期間中の細胞呼吸における酸化から解糖系優勢への代謝スイッチに関与し得ることを示唆している(Armstrong et al.,Pediatr.Exerc.Sci.21:130(2009);Stephens et al.,Int.J.Sport Nutr.Exerc.Metab.16:166(2006);Taylor et al.,Mol.Cell.Biochem.174:321(1997);Timmons et al.,Appl.Physiol.Nutr.Metab.32:416(2007);Timmons et al.,J.Appl.Physiol.94:278(2003))。これは、15週齢に始まるBLA/Jジスフェリン欠損マウスにおける筋ジストロフィー表現型の出現と一致する(Nagy et al.,Physiol.Rep.5:e13173(2017))。実際に、研究は、ジスフェリン−欠損BLA/Jマウスおよび一次ヒト筋芽細胞の両方とも、グルコースおよび脂質取り込み/代謝が損なわれていることを見いだした(Keller(2014)Thesis(Berlin:Universitatsmedizin Berlin))。さらに、以前の報告は、脂質蓄積が、カルパイノパチー(calpainopathy)、DMD、および筋強直性ジストロフィーのような他の筋ジストロフィーにおいて未だ報告されていない、ヒトおよびBLA/Jマウスジスフェリン異常症において観察される性質であることを示した(Groundset al.,Am.J.Pathol.184:1668(2014))。この考えのラインと一致して、我々の以前の研究は、臀筋のMRI画像における目に見える脂肪浸潤によって、臀筋および腰筋BLA/Jマウスの筋肉(BLA/Jマウスモデルにおける最も影響を受けた筋肉)における筋細胞外脂質(EMCL)の増大を見いだした(Nagy et al.,Physiol.Rep.5:e13173(2017))。以前の研究においてH&Eによって染色された筋肉断面の分析後、潜在的な脂肪浸潤の違いは、処置間で明らかになった。これを確認するために、我々は、脂質に関するオイルレッドO染色を行ない、AAV9Jet−ナノ−ジスフェリンによって処置されたマウスにおける脂肪浸潤の徹底的な減少を明らかにした(図5E)。

0173

本明細書において設計された実験は、単回投与のAAV9−JeT−ナノ−ジスフェリンを用いて、進行性の筋肉疾患をすでに示している6ヶ月の動物を全身性に処理することによって、潜在的臨床状況を模倣することを試みた。盲目実験の結果は、AAV9−Jet−ナノ−ジスフェリンによって処置されたBLA/Jマウスが、1時間の評価の間に平均200回よりも多く立ち上がり、コントロール処置マウスの活性のほぼ2倍の合計であったことを示す。以前の研究において、我々は、WTマウスと比較した立ち上がり行動の不足が経時的に増大することを観察し、BLA/Jマウスにおける疲労のより早期の発生を示唆した(Nagy et al.,Physiol.Rep.5:e13173(2017))。本明細書における研究は、経時的に分析すると、我々の以前の研究において観察されたように(Nagy et al.,Physiol.Rep.5:e13173(2017))、処置されたマウスの能力が、疲労の補正を強く示唆して、WTマウスのものと同様の立ち上がり行動のレベルを示したので、AAV9−Jetナノ−ジスフェリンの治療的効果と一致する。治療の将来的な歩行運動の評価のための、この研究とは別の1つのさらなる見解(take)は、BLA/Jマウスの観察された「疲労」を考慮すれば、60分を超えて活動試験の時間を延ばす歩行運動実験を適切に設計することは、ジスフェリン異常症に関するこのモデルに存在する、より強くてより徹底的な不足を明らかにし得るということである。このことは、将来的な研究において試験される必要がある(図4C)。

0174

従来のエバンスブルー色素組織学(図5C)、中央に核のある線維(図5A)、および、Feret径による半自動化の線維サイズ分析(図5Dおよび図7)による、全筋肉アッセイ(図5B)を用いたエバンスブルー色素取り込みの検死解剖分析は、AAV9−Jet−ナノ−ジスフェリンによって処置されたBLA/Jマウスは、最も影響を受けたBLA/J筋肉群である臀筋において、筋肉完全性が増大したことと一致して(Nagy et al.,Physiol.Rep.5:e13173(2017))、ここで、筋線維のおよそ10%が免疫蛍光によってナノ−ジスフェリンに関して陽性に染色されて(図8)、少しのジスフェリン(または、この場合はナノ−ジスフェリン)が、筋肉完全性の維持において十分である(goes a long way)という観念と一致した(Lostal et al.,Hum.Mol.Genet.19:1897(2010))。本明細書におけるいずれの場合においても、ジスフェリン欠損患者の筋芽細胞またはBLA/Jモデルにおける制限されない生産であろうとなかろうと、ナノ−ジスフェリンまたはAAVベクター形質導入に関して毒性を確認しなかった。しかしながら再度、我々は、遍在するJeTプロモーターは相対的に弱く、検出可能であるが低いレベルのナノ−ジスフェリンをもたらすことに注目する。

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