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技術 遺伝子操作された細胞および同細胞を作製する方法

出願人 ジュノーセラピューティクスインコーポレイテッドエディタス・メディシン,インコーポレイテッド
発明者 セイザーブライスウェルステッドジー.グラントバムクロットデビッドエー.フリートラントアリイー.ジョーンズジョンメーダーモーガンエル.ナイクリスルビオエウジェニオマルコサーモンルース
出願日 2017年5月6日 (2年6ヶ月経過) 出願番号 2018-558288
公開日 2019年6月27日 (4ヶ月経過) 公開番号 2019-517788
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理 糖類化合物 医薬品製剤 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 最後行 非相称 温度増大 四分区間 追加的要素 対応組 サーベイヤ 粒子精製
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図面 (20)

課題・解決手段

RISPR/CAS関連方法、標的核酸配列編集するまたは標的核酸配列の発現を調節するための組成物および構成要素、ならびに操作されたT細胞またはT細胞前駆体の養子免疫伝達を含んでなるがん免疫療法に関連したそれらの用途が、提供される。

概要

背景

背景
養子療法のために操作された細胞を生成し投与するための様々なストラテジー利用可能である。例えば、CARなどの遺伝子操作された抗原受容体発現する免疫細胞を操作するためのストラテジー、および細胞における遺伝子発現を抑制または抑圧するためのストラテジーが利用可能である。例えば、エフェクター機能の抑制を回避し、対象への投与時に細胞の活動および/または生存を改善することによって、細胞の有効性を改善するための改善されたストラテジーが必要である。このような要求を満たす方法、細胞、組成物キット、およびシステムが提供される。

概要

RISPR/CAS関連方法、標的核酸配列編集するまたは標的核酸配列の発現を調節するための組成物および構成要素、ならびに操作されたT細胞またはT細胞前駆体の養子免疫伝達を含んでなるがん免疫療法に関連したそれらの用途が、提供される。

目的

いくつかの実施形態では、細胞、組成物、および方法は、養子移入される免疫細胞(例えば、T細胞)において、PD−1の欠失ノックアウト破壊、または発現の減少を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
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請求項1

(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体を含んでなる操作された免疫細胞;および(b)PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊誘導できる作用物質を含んでなる組成物であって、前記作用物質が、前記組成物中の前記細胞の少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも90%もしくはそれより多くにおいて、および/または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも90%もしくはそれより多くにおいて、前記遺伝子破壊を誘導でき、および/またはPD−1発現を防止しまたは減少させることができる、組成物。

請求項2

(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする核酸を含んでなる操作された免疫細胞;および(b)PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を含んでなる組成物であって、前記作用物質が、前記組成物中の前記細胞の少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも90%もしくはそれより多くにおいて、および/または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも90%もしくはそれより多くにおいて、前記遺伝子破壊を誘導でき、および/またはPD−1発現を防止しまたは減少させることができる、組成物。

請求項3

前記操作された免疫細胞がその表面に前記組換え受容体を発現する、請求項1または請求項2に記載の組成物。

請求項4

(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体;および(b)PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊であって、前記PD−1ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させる、遺伝子破壊を含んでなる操作された免疫細胞を含有する細胞集団を含んでなる組成物であって、前記組成物中の前記細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%または少なくとも約90%もしくはそれより多くが、前記遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子を含有せず、PDCD1遺伝子を含有せず、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現せず;ならびに/または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%もしくはそれより多くが、前記遺伝子破壊を含有し、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない、組成物。

請求項5

(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体であって、前記組換え受容体の前記抗原への結合に際して、操作された免疫細胞が、細胞傷害性を誘導し、増殖し、および/またはサイトカイン分泌することができる、組換え受容体;ならびに(b)PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊であって、前記遺伝子破壊が、前記PD−1ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させることができ、任意選択的に、前記防止または減少が、前記組成物中の前記細胞の、および/または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の、少なくとも70%、75%、80%、85%、もしくは90%において、または少なくとも約70%、75%、80%、85%、もしくは90%において、または70%、75%、80%、85%、もしくは90%より多くにおいて、または約70%、75%、80%、85%、もしくは90%より多くにおいてである、遺伝子破壊を含んでなる操作された免疫細胞を含有する細胞集団を含んでなる組成物。

請求項6

(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体;および(b)PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊であって、前記PD−1ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させることができる、遺伝子破壊をそれぞれ含んでなる操作された免疫細胞の集団を含有する細胞集団を含んでなる組成物であって、前記操作された免疫細胞が、前記組換え受容体を含むが前記遺伝子破壊を含まない前記組成物中のその他の細胞における、前記組換え受容体の平均発現および/または表面発現ベルそれぞれと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一レベルで前記受容体の発現および/または表面発現を平均して示し、または前記操作された免疫細胞が、前記PD−1ポリペプチドを発現せず、かつ、前記組換え受容体を含んでなり前記PD−1ポリペプチドを発現する前記組成物中の細胞における、平均発現および/または表面レベルそれぞれと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一レベルで前記受容体の発現および/または表面発現を平均して示す、組成物。

請求項7

前記抗原、前記抗原を発現する細胞、および/または抗原受容体活性化物質とのインキュベーションに際して、任意選択的にインビトロアッセイにおいて測定されるように、任意選択的に1つまたは複数のサイトカインの存在下における、任意選択的に12、24、36、48、または60時間のインキュベーションを含んでなる、インビトロアッセイにおいて測定されるように、前記組換え受容体が、前記抗原に特異的に結合すること、操作されたT細胞を活性化または刺激すること、細胞傷害性を誘導すること、または前記免疫細胞による増殖、生存、および/またはサイトカイン分泌を誘導することができる、請求項1〜4および6のいずれか一項に記載の組成物。

請求項8

前記抗原、前記抗原を発現する細胞、および/または抗原受容体活性化物質とのインキュベーションに際して、任意選択的に1種または複数種のサイトカインの存在下における、任意選択的に12、24、36、48、または60時間のインキュベーションを含んでなる、任意選択的に前記免疫細胞のPD−L1発現細胞への曝露を含むまたは含まない、インビトロアッセイにおいて測定されるように、前記操作された免疫細胞が、前記抗原に特異的に結合すること、細胞傷害性、増殖、生存、および/またはサイトカイン分泌を誘導することができる、請求項1〜4、6および7のいずれか一項に記載の組成物。

請求項9

前記結合、細胞傷害性、増殖、生存、またはサイトカイン分泌のレベルまたは程度または規模または持続時間が、同一条件下で評価された、前記組換え受容体を含むが前記PDCD1遺伝子の遺伝子破壊を含まない免疫細胞で検出または観察されたものと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一である、請求項7または請求項8に記載の組成物。

請求項10

前記結合、細胞傷害性、増殖、生存、および/またはサイトカイン分泌が、中断と、前記抗原、前記抗原発現細胞、および/または前記物質への再曝露とに続いて、任意選択的にインビトロアッセイで測定される、請求項6および8〜9のいずれか一項に記載の組成物。

請求項11

前記免疫細胞が、対象由来初代細胞である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。

請求項12

前記免疫細胞がヒト細胞である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。

請求項13

前記免疫細胞が白血球細胞である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。

請求項14

前記免疫細胞がNK細胞またはT細胞である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。

請求項15

前記免疫細胞が、未分画T細胞を含んでなる複数のT細胞を含んでなり、単離されたCD8+細胞を含んでなるかもしくはCD8+T細胞が富化されており、または単離されたCD4+T細胞を含んでなるかもしくはCD4+細胞が富化されており、ならびに/または、未感作細胞エフェクターメモリー細胞セントラルメモリー細胞、セントラルメモリー幹細胞、エフェクターメモリー細胞、および長寿命エフェクターメモリー細胞からなる群から選択されるそのサブセットが富化されている、請求項14に記載の組成物。

請求項16

非活性の長寿命メモリーまたはセントラルメモリー表現型を示す、前記組成物中のT細胞の百分率、または前記受容体を発現し前記遺伝子破壊を含んでなる前記組成物中のT細胞の百分率が、組成が同一または実質的に同一であるが前記遺伝子破壊を含有せずまたは前記PD−1ポリペプチドを発現する細胞集団と、同一または実質的に同一である、請求項14または請求項15に記載の組成物。

請求項17

非活性の長寿命メモリーまたはセントラルメモリー表現型を示す、前記組成物中のT細胞の百分率が、任意選択的に、前記免疫細胞のPD−L1への接触または曝露の非存在下または存在下で比較される同一条件下で評価した際に、前記組換え受容体を含むがPD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の前記遺伝子破壊を含まないT細胞を含んでなる組成物中の前記表現型を示すT細胞の百分率と比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組成物。

請求項18

前記表現型が、少なくとも12時間、24時間、48時間、96時間、6日間、12日間、24日間、36日間、48日間または60日間にわたる、37±2℃または約37±2℃での前記組成物のインキュベーションに続いて評価される、請求項16または請求項17に記載の組成物。

請求項19

前記インキュベーションがインビトロで行われる、請求項18に記載の組成物。

請求項20

前記インキュベーションの少なくとも一部が、刺激剤の存在下で実施され、前記少なくとも一部は、任意選択的に最大1時間、6時間、24時間、または48時間のインキュベーションに及ぶ、請求項18または請求項19に記載の組成物。

請求項21

前記刺激剤が、T細胞、CD4+T細胞および/またはCD8+細胞の増殖を誘導できる作用物質である、請求項20に記載の組成物。

請求項22

前記刺激剤が、CD3に特異的な抗体、CD28に特異的な抗体、および/またはサイトカインであるか、またはそれを含んでなる、請求項20または請求項21に記載の組成物。

請求項23

組換え受容体を含んでなる前記T細胞が、CCR7+、4−1BB+(CD137+)、TIM3+、CD27+、CD62L+、CD127+、CD45RA+、CD45RO−、t−betlow、IL−7Ra+、CD95+、IL−2Rβ+、CXCR3+またはLFA−1+から選択される1つまたは複数の表現型マーカーを含んでなる、請求項16〜22のいずれか一項に記載の組成物。

請求項24

前記組換え受容体が、機能性非TCR抗原受容体または遺伝子組換えTCRである、請求項1〜23のいずれか一項に記載の組成物。

請求項25

前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体(CAR)である、請求項1〜23のいずれか一項に記載の組成物。

請求項26

前記CARが、抗体または抗体フラグメントである、抗原結合ドメインを含んでなる、請求項25に記載の組成物。

請求項27

前記抗体フラグメントが、一本鎖フラグメントである、請求項26に記載の組成物。

請求項28

前記抗体フラグメントが、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含んでなる、請求項26または請求項27に記載の組成物。

請求項29

前記フラグメントが、scFvを含んでなる、請求項26〜28のいずれか一項に記載の組成物。

請求項30

前記抗原が疾患または障害に関連する、請求項1〜29のいずれか一項に記載の組成物。

請求項31

前記疾患または障害が、感染性疾患もしくは病状自己免疫疾患炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、請求項30に記載の組成物。

請求項32

前記組換え受容体が、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項1〜31のいずれか一項に記載の組成物。

請求項33

前記抗原が、ROR1、Her2、L1−CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリンCEAB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP−2、EGP−4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎児アセチルコリン受容体GD2、GD3、HMW−MAA、IL−22R−α、IL−13R−α2、kdr、κ軽鎖ルイスY、L1−細胞接着分子(CD171)、MAGE−A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY−ESO−1、MART−1、gp100、がん胎児性抗原(oncofetalantigen)、TAG72、VEGF−R2、がん胎児性抗原(carcinoembryonicantigen;CEA)、前立腺特異的抗原、PSMA、エストロゲン受容体プロゲステロン受容体エフリンB2、CD123、CS−1、c−Met、GD−2、MAGEA3、CE7、ウィルムス腫瘍1(WT−1)、サイクリンA1(CCNA1)、BCMA、およびインターロイキン12から選択される、請求項1〜32のいずれか一項に記載の組成物。

請求項34

前記組換え受容体が、ITAMを含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項1〜33のいずれか一項に記載の組成物。

請求項35

前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3−ゼータ(CD3ζ)鎖の細胞内ドメインを含んでなる、請求項34に記載の組成物。

請求項36

前記組換え受容体が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含んでなる、請求項34または請求項35に記載の組成物。

請求項37

前記共刺激シグナル伝達領域が、CD28または4−1BBのシグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項36に記載の組成物。

請求項38

前記作用物質が、(a)PDCD1遺伝子の標的ドメイン相補的ターゲティングドメインを有する少なくとも1つのgRNA、または(b)前記少なくとも1つのgRNAをコードする少なくとも1つの核酸、のうち少なくとも1つを含んでなる、請求項1〜3および7〜37のいずれか一項に記載の組成物。

請求項39

前記作用物質が、Cas9分子と、PDCD1遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有するgRNAとの少なくとも1つの複合体を含んでなる、請求項1〜3および7〜38のいずれか一項に記載の組成物。

請求項40

前記ガイドRNAが、第1の相補的ドメイン、第1の相補的ドメインと相補的な第2の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的にテールドメインをさらに含んでなる、請求項38または請求項39に記載の組成物。

請求項41

前記第1の相補的ドメインおよび第2の相補的ドメインが、連結ドメインによって連結されている、請求項40に記載の組成物。

請求項42

前記ガイドRNAが、3’ポリAテールと5’アンチリバースキャップ類似体(ARCAキャップとを含んでなる、請求項41に記載の組成物。

請求項43

前記Cas9分子が、酵素的に活性なCas9である、請求項39〜42のいずれか一項に記載の組成物。

請求項44

前記少なくとも1つのgRNAが、からなる群から選択される配列を含んでなるターゲティングドメインを含む、請求項38〜43のいずれか一項に記載の組成物。

請求項45

前記少なくとも1つのgRNAが、配列を含んでなるターゲティングドメインを含む、請求項38〜44のいずれか一項に記載の組成物。

請求項46

前記Cas9分子がニッカーゼであり、2つのCas9分子/gRNA分子複合体が、前記標的ドメインの対向する鎖上の2つの一本鎖切断で前記標的ドメインを切断するように2つの異なるgRNA分子によって誘導される、請求項38〜45のいずれか一項に記載の組成物。

請求項47

前記Cas9分子がS.アウレウス(S.aureus)Cas9分子である、請求項39〜46のいずれか一項に記載の組成物。

請求項48

前記Cas9分子がS.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9である、請求項39〜46のいずれか一項に記載の組成物。

請求項49

前記Cas9分子が、活性RuvCドメインまたは活性HNHドメインを欠いている、請求項39〜48のいずれか一項に記載の組成物。

請求項50

前記Cas9分子が、D10A変異を含んでなるS.ピオゲネスCas9分子である、請求項39〜46、48、および49のいずれか一項に記載の組成物。

請求項51

前記2つのgRNA分子が、のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項46〜50のいずれか一項に記載の組成物。

請求項52

前記Cas9分子が、N863A変異を含んでなるS.ピオゲネスCas9分子である、請求項39〜46および48〜51のいずれか一項に記載の組成物。

請求項53

前記2つのgRNA分子が、のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項52に記載の組成物。

請求項54

前記遺伝子破壊が、前記PDCD1遺伝子中に挿入および欠失インデル)をもたらす非相同末端結合(NHEJ)によって修復される二本鎖切断の生成を含んでなる、請求項1〜53のいずれか一項に記載の組成物。

請求項55

前記組成物中の前記細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%が、前記遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現せず;および/または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%が、前記遺伝子破壊を含有し、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、またはPD−1ポリペプチドを発現しない、請求項1〜54のいずれか一項に記載の組成物。

請求項56

前記組成物中の前記細胞の80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%より多くが、前記遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現せず;および/または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞の80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%より多くが、前記遺伝子破壊を含有し、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、またはPD−1ポリペプチドを発現しない、請求項4または請求項55に記載の組成物。

請求項57

任意選択的にフローサイトメトリーによる評価で、前記組成物中の前記細胞、または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の細胞の少なくとも90%または少なくとも約90%が、前記遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない、請求項1〜56のいずれか一項に記載の組成物。

請求項58

ゲノム中の前記遺伝子の双方の対立遺伝子破壊される、請求項1〜57のいずれか一項に記載の組成物。

請求項59

前記組成物中の細胞が、および/または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の前記細胞が、前記遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない細胞について富化されないまたは選択されない、請求項1〜58のいずれか一項に記載の組成物。

請求項60

前記組成物中の各細胞の、または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の各細胞の、平均して2以下、5以下、または10以下のその他の遺伝子が、破壊される、または前記作用物質によって破壊される、請求項1〜59のいずれか一項に記載の組成物。

請求項61

前記組成物中の各細胞の、または前記組換え受容体を発現する前記組成物中の各細胞中の、その他の遺伝子が、前記細胞内で破壊されない、または前記作用物質によって破壊されない、請求項1〜60のいずれか一項に記載の組成物。

請求項62

薬学的に許容可能な緩衝液をさらに含んでなる、請求項1〜61のいずれか一項に記載の組成物。

請求項63

任意選択的に疾患または病状を有する対象への前記組成物の投与後のある時点で、前記組換え受容体を発現しPD−1を発現しない細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能であり;前記遺伝子破壊を含有する細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能であり;前記遺伝子破壊を含有し前記組換え受容体を発現する細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能である、請求項1〜62のいずれか一項に記載の組成物。

請求項64

前記ある時点が、投与の、7、8、9、10、11、12、13、または14日後、または約7、8、9、10、11、12、13、または14日後、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12週間後、または約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12週間後である、請求項63に記載の組成物。

請求項65

前記血液またはサンプル中で検出可能な前記細胞が、1マイクロリットルの血液当たり1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または100個、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または100個、または少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または100個、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または100個の細胞の濃度で存在し、および/または前記血液中のT細胞の少なくとも10、20、25、30、35、40、45、50%、またはそれ以上に相当する、請求項63または64に記載の組成物。

請求項66

前記組成物の対象への投与に続いて、前記遺伝子破壊のない前記組成物中のT細胞の拡張および/または持続と比較して、および/またはT細胞が前記組換え受容体を発現するが前記欠失を含まない参照組成物中のT細胞の拡張および/または持続と比較して、少なくとも同程度であり、任意選択的にそれを上回る、速度でおよび/または時間にわたり、前記遺伝子破壊を含んでなる前記組成物中の細胞が、前記対象中で拡張および/または持続し;および/または前記遺伝子破壊のない前記組成物中のT細胞の拡張および/または持続と比較して、および/またはT細胞が前記組換え受容体を発現するが前記欠失を含まない参照組成物中のT細胞の拡張および/または持続と比較して、少なくとも同程度であり、任意選択的にそれを上回る、速度でおよび/または時間にわたり、前記遺伝子破壊を含んでなり前記組換え受容体を含んでなる前記組成物中の細胞が、前記対象中で拡張および/または持続する、請求項1〜65のいずれか一項に記載の組成物。

請求項67

前記速度または時間が、少なくとも1.5倍または2倍または3倍大きい、または少なくとも約1.5倍または2倍または3倍大きい、請求項66に記載の組成物。

請求項68

(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする核酸分子を、免疫細胞に導入するステップと;(b)(i)PDCD1遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有する少なくとも1つのgRNA、または(ii)前記少なくとも1つのgRNAをコードする少なくとも1つの核酸、のうちの1つを含んでなる、PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を、前記免疫細胞に導入するステップとを含んでなる、遺伝子操作された免疫細胞を生成する方法。

請求項69

(i)PDCD1遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有する少なくとも1つのgRNA、または(ii)前記少なくとも1つのgRNAをコードする少なくとも1つの核酸、のうちの1つを含んでなる、PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を、抗原に特異的に結合する組換え受容体を発現する免疫細胞に導入するステップを含んでなる、遺伝子操作された免疫細胞を生成する方法。

請求項70

前記作用物質が、Cas9分子と、PDCD1遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有するgRNAとの少なくとも1つの複合体を含んでなる、請求項に記載の68または請求項69に記載の方法。

請求項71

前記ガイドRNAが、第1の相補的ドメイン、前記第1の相補的ドメインと相補的な第2の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的にテールドメインをさらに含んでなる、請求項68〜70のいずれか一項に記載の方法。

請求項72

前記第1の相補的ドメインおよび第2の相補的ドメインが、連結ドメインによって連結されている、請求項71に記載の方法。

請求項73

前記ガイドRNAが、3’ポリAテールと5’アンチリバースキャップ類似体(ARCA)キャップとを含んでなる、請求項68〜72のいずれか一項に記載の方法。

請求項74

導入が、前記細胞を前記作用物質またはその一部にインビトロで接触させるステップを含んでなる、請求項68〜73のいずれか一項に記載の方法。

請求項75

前記作用物質の導入が、電気穿孔を含んでなる、請求項68〜74のいずれか一項に記載の方法。

請求項76

前記導入が、前記細胞と前記作用物質との接触前、最中または後に、または前記電気穿孔の前、最中または後に、前記細胞をインビトロでインキュベートするステップをさらに含んでなる、請求項74または請求項75に記載の方法。

請求項77

(a)の導入が形質導入を含んでなり、前記導入するステップが、前記形質導入の前、最中または後に、前記細胞をインビトロでインキュベートするステップをさらに含んでなる、請求項68〜76のいずれか一項に記載の方法。

請求項78

前記インキュベーションの少なくとも一部が、(i)IL−2、IL−7、およびIL−15からなる群から選択されるサイトカイン、および/または(ii)任意選択的に抗CD3および/または抗CD28抗体を含んでなる1つまたは複数の刺激剤または活性化剤の存在下である、請求項76または請求項77に記載の方法。

請求項79

(a)の導入が、形質導入前に、前記細胞を、20U/mL〜200U/mL、任意選択的に約100U/mLの濃度のIL−2;1ng/mL〜50ng/mL、任意選択的に約10ng/mLの濃度のIL−7;および/または0.5ng/mL〜20ng/mL、任意選択的に約5ng/mLの濃度のIL−15と共にインキュベートするステップと;形質導入に続いて、前記細胞を、10U/mL〜200U/mL、任意選択的に約50U/mLの濃度のIL−2;0.5ng/mL〜20ng/mL、任意選択的に約5ng/mLの濃度のIL−7;および/または0.1ng/mL〜10ng/mL、任意選択的に約0.5ng/mLの濃度のIL−15と共にインキュベートするステップとを含んでなる、請求項77または請求項78に記載の方法。

請求項80

前記インキュベーションが、独立して、最大24、36、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日間にわたり、またはおよそ24、36、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日間にわたり実施される、請求項76〜79のいずれか一項に記載の方法。

請求項81

前記インキュベーションが、独立して、24〜48時間または36〜48時間にわたり実施される、請求項76〜80のいずれか一項に記載の方法。

請求項82

前記細胞が、100,000、200,000、300,000、400,000、または500,000個の細胞当たりおよそ1マイクログラム比率で、前記作用物質と接触されられる、請求項74〜81のいずれか一項に記載の方法。

請求項83

前記インキュベーションが、30℃±2℃〜39℃±2℃の温度である;または前記インキュベーションが、少なくとも30℃±2℃、32℃±2℃、34℃±2℃または37℃±2℃、または少なくとも約30℃±2℃、32℃±2℃、34℃±2℃または37℃±2℃の温度である、請求項76〜82のいずれか一項に記載の方法。

請求項84

前記インキュベーションの少なくとも一部が30℃±2℃であり、前記インキュベーションの少なくとも一部が37℃±2℃である、請求項76〜83のいずれか一項に記載の方法。

請求項85

(a)の導入するステップと(b)の導入するステップとの間に、前記細胞を休止させるステップをさらに含んでなる、請求項68〜84のいずれか一項に記載の方法。

請求項86

前記Cas9分子が、酵素的に活性なCas9である、請求項70〜85のいずれか一項に記載の方法。

請求項87

前記少なくとも1つのgRNAが、からなる群から選択される配列を含んでなるターゲティングドメインを含む、請求項68〜86のいずれか一項に記載の方法。

請求項88

前記少なくとも1つのgRNAが、配列を含んでなるターゲティングドメインを含む、請求項68〜87のいずれか一項に記載の方法。

請求項89

前記Cas9分子がニッカーゼであり、2つのCas9分子/gRNA分子複合体が、前記標的ドメインの対向する鎖上の2つの一本鎖切断で前記標的ドメインを切断するように2つの異なるgRNA分子によって誘導される、請求項68〜79のいずれか一項に記載の方法。

請求項90

前記Cas9分子がS.アウレウスCas9分子である、請求項70〜89のいずれか一項に記載の方法。

請求項91

前記Cas9分子がS.ピオゲネスCas9である、請求項70〜90のいずれか一項に記載の方法。

請求項92

前記Cas9分子が、活性RuvCドメインまたは活性HNHドメインを欠いている、請求項70〜91のいずれか一項に記載の方法。

請求項93

前記Cas9分子が、D10A変異を含んでなるS.ピオゲネスCas9分子である、請求項70〜89、91、および92のいずれか一項に記載の方法。

請求項94

前記2つのgRNA分子が、のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項89〜93のいずれか一項に記載の方法。

請求項95

前記Cas9分子が、N863A変異を含んでなるS.ピオゲネスCas9分子である、請求項70〜89および91〜94のいずれか一項に記載の方法。

請求項96

前記2つのgRNA分子が、のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項94に記載の方法。

請求項97

前記遺伝子破壊が、PDCD1遺伝子中に挿入と欠失(インデル)をもたらす非相同末端結合(NHEJ)によって修復される二本鎖切断の生成を含んでなる、請求項68〜96のいずれか一項に記載の方法。

請求項98

前記組換え受容体が、機能性非TCR抗原受容体または遺伝子組換えTCRである、請求項68〜97のいずれか一項に記載の方法。

請求項99

前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体(CAR)である、請求項68〜98のいずれか一項に記載の方法。

請求項100

前記CARが、抗体または抗体フラグメントである、抗原結合ドメインを含んでなる、請求項99に記載の方法。

請求項101

前記抗体フラグメントが、一本鎖フラグメントである、請求項100に記載の方法。

請求項102

前記抗体フラグメントが、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含んでなる、請求項100または請求項101に記載の方法。

請求項103

前記フラグメントが、scFvを含んでなる、請求項100〜102のいずれか一項に記載の方法。

請求項104

前記抗原が疾患または障害に関連する、請求項100〜103のいずれか一項に記載の方法。

請求項105

前記疾患または障害が、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、請求項104に記載の方法。

請求項106

前記組換え受容体が、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項68〜105のいずれか一項に記載の方法。

請求項107

前記抗原が、ROR1、Her2、L1−CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、B型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP−2、EGP−4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎児型アセチルコリンe受容体、GD2、GD3、HMW−MAA、IL−22R−α、IL−13R−α2、kdr、κ軽鎖、ルイスY、L1−細胞接着分子(CD171)、MAGE−A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY−ESO−1、MART−1、gp100、がん胎児性抗原(oncofetalantigen)、TAG72、VEGF−R2、がん胎児性抗原(carcinoembryonicantigen;CEA)、前立腺特異的抗原、PSMA、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS−1、c−Met、GD−2、MAGEA3、CE7、ウィルムス腫瘍1(WT−1)、サイクリンA1(CCNA1)、BCMA、およびインターロイキン12から選択される、請求項68〜106のいずれか一項に記載の方法。

請求項108

前記組換え受容体が、ITAMを含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項68〜107のいずれか一項に記載の方法。

請求項109

前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3−ゼータ(CD3ζ)鎖の細胞内ドメインを含んでなる、請求項108に記載の方法。

請求項110

前記組換え受容体が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含んでなる、請求項108または請求項109に記載の方法。

請求項111

前記共刺激シグナル伝達領域が、CD28または4−1BBのシグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項110に記載の方法。

請求項112

前記組換え受容体をコードする前記核酸が、ウイルスベクターである、請求項68〜111のいずれか一項に記載の方法。

請求項113

前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項112に記載の方法。

請求項114

前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、請求項112または請求項113に記載の方法。

請求項115

前記組換えベクターをコードする核酸の導入が、任意選択的にレトロウイルス形質導入である形質導入による、請求項68〜114のいずれか一項に記載の方法。

請求項116

前記免疫細胞が、対象由来の初代細胞である、請求項68〜115のいずれか一項に記載の方法。

請求項117

前記免疫細胞がヒト細胞である、請求項68〜116のいずれか一項に記載の方法。

請求項118

前記免疫細胞が白血球細胞である、請求項68〜117のいずれか一項に記載の方法。

請求項119

前記免疫細胞がNK細胞またはT細胞である、請求項68〜118のいずれか一項に記載の方法。

請求項120

前記免疫細胞が、未分画T細胞、単離されたCD8+T細胞、または単離されたCD4+T細胞である、T細胞である、請求項119に記載の方法。

請求項121

複数の免疫細胞で実施される、請求項68〜120のいずれか一項に記載の方法。

請求項122

前記作用物質を導入するステップおよび前記組換え受容体を導入するステップに引き続いて、細胞が、(a)前記遺伝子破壊を含有する、または内因性PD−1ポリペプチドを発現しない細胞、(b)前記組換え受容体を発現する細胞、または(a)および(b)の双方について、富化も選択もされない、請求項68〜121のいずれか一項に記載の方法。

請求項123

(a)前記遺伝子破壊を含有する、または内因性PD−1ポリペプチドを発現しない細胞、(b)前記組換え受容体を発現する細胞、または(a)および(b)の双方を富化または選択するステップをさらに含んでなる、請求項68〜122のいずれか一項に記載の方法。

請求項124

前記細胞を37℃±2℃または約37℃±2℃でインキュベートするステップをさらに含んでなる、請求項68〜123のいずれか一項に記載の方法。

請求項125

前記インキュベーションが、1時間〜96時間、4時間〜72時間、8時間〜48時間、12時間〜36時間、6時間〜24時間、36時間〜96時間、または約1時間〜約96時間、約4時間〜約72時間、約8時間〜約48時間、約12時間〜約36時間、約6時間〜約24時間、約36時間〜96時間にわたり実施される、請求項124に記載の方法。

請求項126

前記インキュベーションまたは前記インキュベーションの一部が、刺激剤の存在下で実施される、請求項125に記載の方法。

請求項127

前記刺激剤が、T細胞、CD4+T細胞および/またはCD8+細胞の増殖を誘導できる作用物質である、請求項126に記載の方法。

請求項128

前記刺激剤が、CD3に特異的な抗体、CD28に特異的な抗体、および/またはサイトカインであるか、またはそれを含んでなる、請求項126または請求項127に記載の方法。

請求項129

前記方法によって生成された細胞を薬学的に許容可能な緩衝液中で製剤化するステップをさらに含んでなる、請求項68〜128のいずれか一項に記載の方法。

請求項130

前記細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%が、1)前記遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない;かつ2)前記組換え受容体を発現する、の双方である、または前記組換え受容体を発現する前記細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%が、前記遺伝子破壊を含有し、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、またはPD−1ポリペプチドを発現しない、細胞集団を生成する、請求項68〜129のいずれか一項に記載の方法。

請求項131

前記細胞の80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%より多くが、1)前記遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない;かつ2)前記組換え受容体を発現する、の双方であり、および/または前記組換え受容体を発現する前記細胞の80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%より多くが、前記遺伝子破壊を含有し、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、またはPD−1ポリペプチドを発現しない、細胞集団を生成する、請求項68〜130のいずれか一項に記載の方法。

請求項132

ゲノム中の前記遺伝子の双方の対立遺伝子が破壊される、請求項68〜131のいずれか一項に記載の方法。

請求項133

請求項68〜132のいずれか一項に記載の方法によって生成される、遺伝子操作された免疫細胞。

請求項134

請求項68〜132のいずれか一項に記載の方法によって生成される、複数の遺伝子操作された免疫細胞。

請求項135

前記細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%が、1)前記遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない;かつ2)前記組換え受容体を発現する、の双方である、または前記組換え受容体を発現する前記細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%が、前記遺伝子破壊を含有し、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、またはPD−1ポリペプチドを発現しない、請求項134に記載の複数の遺伝子操作された免疫細胞。

請求項136

前記細胞の80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%より多くが、1)前記遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない;かつ2)前記組換え受容体を発現する、の双方であり、および/または前記組換え受容体を発現する前記細胞の80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%より多くが、前記遺伝子破壊を含有し、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、またはPD−1ポリペプチドを発現しない、請求項134または請求項135に記載の複数の遺伝子操作された免疫細胞。

請求項137

請求項133の遺伝子操作された免疫細胞または請求項134〜136のいずれか一項に記載の複数の遺伝子操作された免疫細胞と、任意選択的に薬学的に許容可能な緩衝液とを含んでなる、組成物。

請求項138

請求項1〜67および137のいずれか一項に記載の組成物を、疾患または病状を有する対象に投与するステップを含んでなる、治療方法

請求項139

前記組換え受容体が、前記疾患または病状に関連する抗原に特異的に結合する、請求項138に記載の方法。

請求項140

前記疾患または病状が、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは障害、または感染性疾患である、請求項138または請求項139に記載の方法。

請求項141

請求項142

前記抗原が、オーファンチロシンキナーゼ受容体ROR1、tEGFR、Her2、L1−CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、B型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP−2、EGP−4、EPHa2、ErbB2、3、もしくは4、FBP、胎児型アセチルコリンe受容体、GD2、GD3、HMW−MAA、IL−22R−α、IL−13R−α2、kdr、κ軽鎖、ルイスY、L1−細胞接着分子、MAGE−A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY−ESO−1、MART−1、gp100、がん胎児性抗原(oncofetalantigen)、ROR1、TAG72、VEGF−R2、がん胎児性抗原(carcinoembryonicantigen;CEA)、前立腺特異的抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS−1、c−Met、GD−2、MAGEA3、CE7、ウィルムス腫瘍1(WT−1)、サイクリンA1(CCNA1)、BCMA、およびインターロイキン12からなる群から選択される、請求項139〜141のいずれか一項に記載の方法。

請求項143

前記抗原がCD19またはBCMAである、請求項139〜142のいずれか一項に記載の方法。

請求項144

前記対象に投与された前記操作された細胞が、投与後1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、14日、1ヶ月、2ヶ月、またはそれ以上、PD−1の発現を減少させるおよび/または消失する、請求項138〜143のいずれか一項に記載の方法。

請求項145

前記対象に投与された前記操作された細胞が、投与後少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、14日、1ヶ月、2ヶ月、またはそれ以上にわたり、前記対象において持続する、請求項138〜144のいずれか一項に記載の方法。

請求項146

前記組成物の投与後のある時点で、前記組換え受容体を発現しPD−1を発現しない細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能であり;前記遺伝子破壊を含有する細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能であり;前記遺伝子破壊を含有し前記組換え受容体を発現する細胞が、前記対象の血液中で、または前記対象からの血液由来サンプル中で、または前記対象の組織または生物学的サンプル中で、検出可能である、請求項138〜145のいずれか一項に記載の方法。

請求項147

前記ある時点が、投与の、7、8、9、10、11、12、13、または14日後、または約7、8、9、10、11、12、13、または14日後、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12週間後、または約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12週間後である、請求項138〜146のいずれか一項に記載の方法。

請求項148

前記血液またはサンプル中で検出可能な前記細胞が、1マイクロリットルの血液当たり1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または100個、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または100個、または少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または100個、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または100個の細胞の濃度で存在し、および/または前記血液中のT細胞の少なくとも10、20、25、30、35、40、45、または50%、またはそれ以上に相当する、請求項138〜147のいずれか一項に記載の方法。

請求項149

投与に続いて、前記遺伝子破壊のない前記組成物中のT細胞の拡張および/または持続と比較して、および/またはT細胞が前記組換え受容体を発現するが前記欠失を含まない参照組成物中のT細胞の拡張および/または持続と比較して、少なくとも同程度であり、任意選択的にそれを上回る、速度でおよび/または時間にわたり、前記遺伝子破壊を含んでなる前記組成物中の細胞が、前記対象中で拡張および/または持続し;および/または前記遺伝子破壊のない前記組成物中のT細胞の拡張および/または持続と比較して、および/またはT細胞が前記組換え受容体を発現するが前記欠失を含まない参照組成物中のT細胞の拡張および/または持続と比較して、少なくとも同程度であり、任意選択的にそれを上回る、速度でおよび/または時間にわたり、前記遺伝子破壊を含んでなり前記組換え受容体を含んでなる前記組成物中の細胞が、前記対象中で拡張および/または持続する、請求項138〜148のいずれか一項に記載の方法。

請求項150

前記速度または時間が、少なくとも1.5倍または2倍または3倍大きい、または少なくとも約1.5倍または2倍または3倍大きい、請求項149に記載の方法。

請求項151

前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項140〜150のいずれか一項に記載の方法。

請求項152

前記腫瘍が、B細胞由来腫瘍でなく、白血病でなく、および/またはリンパ腫でない、請求項140〜151のいずれか一項に記載の方法。

請求項153

前記腫瘍またはその細胞が、PD−1のリガンドを発現するまたはそれを発現することが観察されている、請求項140〜152のいずれか一項に記載の方法。

請求項154

(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体;および(b)PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊であって、前記PD−1ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させる、遺伝子破壊を含んでなる操作された免疫細胞を含んでなる薬学的組成物であって、前記操作された細胞が、対象への投与前にPD−1の発現の減少および/または消失の表現型を有し、前記細胞が、前記対象への投与後、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、14日、1ヶ月、2ヶ月、またはそれ以上にわたり前記表現型を保持する、薬学的組成物。

請求項155

対象における疾患または病状の治療で使用するための請求項1〜67、137、および154のいずれか一項に記載の組成物。

請求項156

前記組換え受容体が、前記疾患または病状に関連する抗原に特異的に結合する、請求項155に記載の使用のための組成物。

請求項157

前記疾患または病状が、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは障害、または感染性疾患である、請求項155または請求項156に記載の使用のための組成物。

請求項158

前記疾患または病状が、白血病、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、難治性濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、無痛性B細胞リンパ腫、B細胞悪性腫瘍、結腸がん、肺がん、肝臓がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、皮膚がん、黒色腫がん、骨がん、および脳がん、卵巣がん、上皮がん、腎細胞がん、膵臓腺がん、ホジキンリンパ腫、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、神経芽腫、ユーイング肉腫、髄芽腫、骨肉腫、滑膜肉腫、および/または中皮腫である、がんまたは腫瘍である、請求項155〜157のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

請求項159

前記抗原が、オーファンチロシンキナーゼ受容体ROR1、tEGFR、Her2、L1−CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、B型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP−2、EGP−4、EPHa2、ErbB2、3、もしくは4、FBP、胎児型アセチルコリンe受容体、GD2、GD3、HMW−MAA、IL−22R−α、IL−13R−α2、kdr、κ軽鎖、ルイスY、L1−細胞接着分子、MAGE−A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY−ESO−1、MART−1、gp100、がん胎児性抗原(oncofetalantigen)、ROR1、TAG72、VEGF−R2、がん胎児性抗原(carcinoembryonicantigen;CEA)、前立腺特異的抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS−1、c−Met、GD−2、MAGEA3、CE7、ウィルムス腫瘍1(WT−1)、サイクリンA1(CCNA1)、BCMA、およびインターロイキン12からなる群から選択される、請求項155〜158のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

請求項160

前記抗原がCD19またはBCMAである、請求項155〜159のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

請求項161

対象への前記組成物の投与に続いて、前記遺伝子破壊を含有し、任意選択的に前記組換え受容体を含有する、1つまたは複数の細胞が、投与後少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、14日、1ヶ月、2ヶ月、またはそれ以上の時点、または少なくとも約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、14日、1ヶ月、2ヶ月、またはそれ以上の時点で、前記対象の組織または生物学的サンプルにおいて、持続し、および/または検出可能であり;および/または前記対象に由来する生物学的サンプルまたは組織において検出可能な、T細胞の、または前記組換え受容体を発現するT細胞の、少なくとも50、60、70、80、85、または90%が、投与後少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、14日、1ヶ月、2ヶ月、またはそれ以上の時点、または少なくとも約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、14日、1ヶ月、2ヶ月、またはそれ以上の時点で、前記遺伝子破壊を含有する、請求項155〜160のいずれか一項に記載の使用のための組成物。

請求項162

T細胞を1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体と接触させるステップを含んでなり、前記1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体中のgRNA分子が、PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなる、T細胞を改変する方法。

請求項163

T細胞を2つのCas9分子/gRNA分子複合体と接触させるステップを含んでなり、各複合体が、PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなるgRNA分子を含んでなる、T細胞を改変する方法。

請求項164

前記T細胞が、がんに罹患している対象に由来する、請求項162または請求項163に記載の方法。

請求項165

前記がんが、リンパ腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、B細胞急性リンパ球性白血病(B−ALL)、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫(NHL)、びまん性大細胞リンパ腫(DLCL)、多発性骨髄腫、腎細胞がん(RCC)、神経芽細胞腫、結腸直腸がん、乳がん、卵巣がん、黒色腫、肉腫、前立腺がん、肺がん、食道がん肝細胞がん膵臓がん星細胞腫、中皮腫、頭頸部がん、および髄芽細胞腫からなる群から選択される、請求項164に記載の方法。

請求項166

前記T細胞が、がんを有する対象、またはさもなければ前記PDCD1遺伝子のT細胞標的位置における変異から利益を得ることができる対象に由来する、請求項162〜165のいずれか一項に記載の方法。

請求項167

前記接触させるステップが、エクスビボで実施される、請求項162〜166のいずれか一項に記載の方法。

請求項168

前記T細胞が組換え受容体を含んでなる、請求項162〜167のいずれか一項に記載の方法。

請求項169

前記核酸を前記細胞に導入させる条件下で、前記T細胞を、組換え受容体をコードする核酸と接触させるステップをさらに含んでなる、請求項162〜168のいずれか一項に記載の方法。

請求項170

前記組換え受容体が、機能性非TCR抗原受容体または遺伝子組換えTCRである、請求項168または請求項169に記載の方法。

請求項171

前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体(CAR)である、請求項168〜170のいずれか一項に記載の方法。

請求項172

前記CARが、抗体または抗体フラグメントである、抗原結合ドメインを含んでなる、請求項171に記載の方法。

請求項173

前記抗体フラグメントが、一本鎖フラグメントである、請求項172に記載の方法。

請求項174

前記抗体フラグメントが、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含んでなる、請求項172または請求項173に記載の方法。

請求項175

前記フラグメントが、scFvを含んでなる、請求項172〜174のいずれか一項に記載の方法。

請求項176

前記抗原が疾患または障害に関連する、請求項172〜175のいずれか一項に記載の方法。

請求項177

前記疾患または障害が、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、請求項176に記載の方法。

請求項178

前記組換え受容体が、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項168〜177のいずれか一項に記載の方法。

請求項179

前記抗原が、ROR1、Her2、L1−CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、B型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP−2、EGP−4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎児型アセチルコリンe受容体、GD2、GD3、HMW−MAA、IL−22R−α、IL−13R−α2、kdr、κ軽鎖、ルイスY、L1−細胞接着分子(CD171)、MAGE−A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY−ESO−1、MART−1、gp100、がん胎児性抗原(oncofetalantigen)、TAG72、VEGF−R2、がん胎児性抗原(carcinoembryonicantigen;CEA)、前立腺特異的抗原、PSMA、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS−1、c−Met、GD−2、MAGEA3、CE7、ウィルムス腫瘍1(WT−1)、サイクリンA1(CCNA1)、BCMA、およびインターロイキン12から選択される、請求項171〜178のいずれか一項に記載の方法。

請求項180

前記組換え受容体が、ITAMを含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項168〜179のいずれか一項に記載の方法。

請求項181

前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3−ゼータ(CD3ζ)鎖の細胞内ドメインを含んでなる、請求項180に記載の方法。

請求項182

前記組換え受容体が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含んでなる、請求項180または請求項181に記載の方法。

請求項183

前記共刺激シグナル伝達領域が、CD28または4−1BBのシグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項182に記載の方法。

請求項184

前記改変T細胞が、前記接触させるステップの後に前記対象の身体に戻される、請求項164〜183のいずれか一項に記載の方法。

請求項185

前記T細胞ががんに罹患している対象に由来し、前記接触させるステップがエクスビボで実施され、前記接触させるステップの後に前記改変T細胞が前記対象の身体に戻される、請求項162〜184のいずれか一項に記載の方法。

請求項186

前記接触させるステップの前に、前記1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体が形成される、請求項162〜185のいずれか一項に記載の方法。

請求項187

前記接触させるステップの前に、前記2つのCas9分子/gRNA分子複合体が形成される、請求項163〜186のいずれか一項に記載の方法。

請求項188

前記gRNA分子が、配列番号481〜555、563〜1516、1517〜3748、14657〜16670、および16671〜21037のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または3ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、請求項162〜187のいずれか一項に記載の方法。

請求項189

前記gRNA分子が、配列番号563〜1516から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項188に記載の方法。

請求項190

前記gRNA分子が、配列番号1517〜3748から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項188に記載の方法。

請求項191

前記gRNA分子が、配列番号14657〜16670から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項188に記載の方法。

請求項192

前記gRNA分子が、配列番号16671〜21037から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項188に記載の方法。

請求項193

前記gRNA分子が、配列番号481〜500および508〜547から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項188に記載の方法。

請求項194

前記gRNA分子が、配列番号501〜507および548〜555から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項188に記載の方法。

請求項195

前記gRNA分子が、配列番号508、514、576、579、582、および723から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項188に記載の方法。

請求項196

前記gRNA分子が、配列番号508、510、511、512、514、576、579、581、582、766、および723から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項188に記載の方法。

請求項197

前記gRNA分子が、それらの5’末端で修飾される、または3’ポリAテールを含んでなる、請求項162〜196のいずれか一項に記載の方法。

請求項198

前記gRNA分子が、それらの5’末端で修飾され、かつ3’ポリAテールを含んでなる、請求項162〜196のいずれか一項に記載の方法。

請求項199

前記gRNA分子が5’三リン酸基を欠いている、請求項197または請求項198に記載の方法。

請求項200

前記gRNA分子が5’キャップを含む、請求項197または請求項198に記載の方法。

請求項201

前記5’キャップが、5’−5’三リン酸結合を介して前記gRNA分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項200に記載の方法。

請求項202

前記5’キャップが、任意選択的に修飾された5’−5’三リン酸結合を介して連結された、2つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項200に記載の方法。

請求項203

前記3’ポリAテールが、約10〜約30個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項197〜202のいずれか一項に記載の方法。

請求項204

前記3’ポリAテールが、約20個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項197〜202のいずれか一項に記載の方法。

請求項205

前記3’ポリAテールを含む前記gRNA分子が、DNA鋳型からのインビトロ転写によって調製された、請求項203または請求項204に記載の方法。

請求項206

前記ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記DNA鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含んでなり、前記T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、請求項205に記載の方法。

請求項207

前記ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記DNA鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含んでなり、前記T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、請求項205に記載の方法。

請求項208

前記1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体が、電気穿孔を通じて前記T細胞に送達される、請求項162〜207のいずれか一項に記載の方法。

請求項209

前記少なくとも2つのCas9分子/gRNA分子複合体が、電気穿孔を通じて前記T細胞に送達される、請求項163〜208のいずれか一項に記載の方法。

請求項210

前記gRNA分子が、前記PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなり、前記gRNA分子が、前記標的ドメインを少なくとも40%の切断効率で切断するように前記Cas9分子を誘導する、請求項162〜209のいずれか一項に記載の方法。

請求項211

前記切断効率が、標識抗PDCD1抗体およびフローサイトメトリーアッセイを用いて判定される、請求項210に記載の方法。

請求項212

前記Cas9分子が、単一のgRNA分子によって誘導され、前記標的ドメインを単一の二本鎖切断で切断する、請求項162〜211のいずれか一項に記載の方法。

請求項213

前記Cas9分子がS.ピオゲネスCas9分子である、請求項212に記載の方法。

請求項214

前記ターゲティングドメインが、から選択される、請求項162〜213のいずれか一項に記載の方法。

請求項215

前記Cas9分子がニッカーゼであり、2つのCas9分子/gRNA分子複合体が、前記標的ドメインの対向する鎖上の2つの一本鎖切断で前記標的ドメインを切断するように2つの異なるgRNA分子によって誘導される、請求項162〜211のいずれか一項に記載の方法。

請求項216

前記Cas9分子がS.ピオゲネスCas9分子である、請求項215に記載の方法。

請求項217

前記S.ピオゲネスCas9分子がD10A変異を有する、請求項162〜216のいずれか一項に記載の方法。

請求項218

前記2つのgRNA分子が、のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項162〜217のいずれか一項に記載の方法。

請求項219

前記S.ピオゲネスCas9分子が、N863A変異を有する、請求項162〜218のいずれか一項に記載の方法。

請求項220

前記2つのgRNA分子が、のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項219に記載の方法。

請求項221

前記gRNA分子がモジュラーgRNA分子である、請求項162〜220のいずれか一項に記載の方法。

請求項222

前記gRNA分子がキメラgRNA分子である、請求項162〜220のいずれか一項に記載の方法。

請求項223

前記gRNA分子が、5’から3’方向に、ターゲティングドメイン;第1の相補的ドメイン;連結ドメイン;第2の相補的ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインを含んでなる、請求項222に記載の方法。

請求項224

前記gRNA分子が、25ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも20ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、請求項222または請求項223に記載の方法。

請求項225

少なくとも60%の切断効率によって特徴付けられる、請求項210〜224のいずれか一項に記載の方法。

請求項226

少なくとも80%の切断効率によって特徴付けられる、請求項210〜224のいずれか一項に記載の方法。

請求項227

少なくとも90%の切断効率によって特徴付けられる、請求項210〜224のいずれか一項に記載の方法。

請求項228

前記gRNA分子が5未満のオフターゲットによって特徴付けられる、請求項210〜227のいずれか一項に記載の方法。

請求項229

前記gRNA分子が2未満のエクソンオフターゲットによって特徴付けられる、請求項210〜228のいずれか一項に記載の方法。

請求項230

前記オフターゲットが、GUIDE−seqによって同定される、請求項228または請求項229に記載の方法。

請求項231

前記オフターゲットが、Amp−seqによって同定される、請求項228または請求項229に記載の方法。

請求項232

gRNA分子が、PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなり、前記gRNA分子が、その5’末端で修飾され、および/または3’ポリAテールを含んでなる、Cas9分子/gRNA分子複合体。

請求項233

前記gRNA分子が、配列番号481〜555、563〜1516、1517〜3748、14657〜16670、および16671〜21037のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または3ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、請求項232に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項234

前記gRNA分子が、配列番号563〜1516から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項232に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項235

前記gRNA分子が、配列番号1517〜3748から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項232に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項236

前記gRNA分子が、配列番号14657〜16670から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項232に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項237

前記gRNA分子が、配列番号16671〜21037から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項232に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項238

前記gRNA分子が、配列番号481〜500および508〜547から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項232に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項239

前記gRNA分子が、配列番号501〜507および548〜555から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項232に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項240

前記gRNA分子が、配列番号508、514、576、579、582、および723から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項232のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項241

前記gRNA分子が、配列番号508、510、511、512、514、576、579、581、582、766、および723から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項232に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項242

前記gRNA分子がその5’末端で修飾されている、請求項232〜241のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項243

前記gRNA分子が5’三リン酸基を欠いている、請求項242に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項244

前記gRNA分子が5’キャップを含む、請求項242に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項245

前記5’キャップが、5’−5’三リン酸結合を介して前記gRNA分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項244に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項246

前記5’キャップが、任意選択的に修飾された5’−5’三リン酸結合を介して連結された、2つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項244に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項247

前記3’ポリAテールが約10〜約30個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項232〜246のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項248

前記3’ポリAテールが約20個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項232〜246のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項249

前記3’ポリAテールを含む前記gRNA分子が、DNA鋳型からのインビトロ転写によって調製された、請求項247または請求項248に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項250

前記ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記DNA鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含んでなり、前記T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、請求項249に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項251

前記ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記DNA鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含んでなり、前記T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、請求項249に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項252

前記Cas9分子が二本鎖切断で標的ドメインを切断する、請求項232〜251のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項253

前記Cas9分子がS.ピオゲネスCas9分子である、請求項252に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項254

前記ターゲティングドメインが、のターゲティングドメインの群から選択される、請求項232〜253のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項255

前記Cas9分子が一本鎖切断で標的ドメインを切断する、請求項232〜251のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項256

前記Cas9分子がS.ピオゲネスCas9分子である、請求項255に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項257

前記S.ピオゲネスCas9分子がD10A変異を有する、請求項232〜請求項256のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項258

前記ターゲティングドメインが、のターゲティングドメインの群から選択される、請求項232〜請求項257のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項259

前記S.ピオゲネスCas9分子がN863A変異を有する、請求項232〜256のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項260

前記ターゲティングドメインが、のターゲティングドメインの群から選択される、請求項259に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項261

前記gRNA分子がモジュラーgRNA分子である、請求項232〜260のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項262

前記gRNA分子がキメラgRNA分子である、請求項232〜261のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項263

前記gRNA分子が、5’から3’方向に、ターゲティングドメイン;第1の相補的ドメイン;連結ドメイン;第2の相補的ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインを含んでなる、請求項262に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項264

前記gRNA分子が、25ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも20ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、請求項262または請求項263に記載のCas9分子/gRNA分子複合体。

請求項265

少なくとも2つのCas9分子/gRNA複合体を含んでなる組成物であって、各複合体が、PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなるgRNA分子を含んでなる、組成物。

請求項266

前記gRNA分子が、配列番号481〜555、563〜1516、1517〜3748、14657〜16670、および16671〜21037のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または3ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、請求項265に記載の組成物。

請求項267

前記gRNA分子が、配列番号563〜1516から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項265に記載の組成物。

請求項268

前記gRNA分子が、配列番号1517〜3748から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項265に記載の組成物。

請求項269

前記gRNA分子が、配列番号14657〜16670から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項265に記載の組成物。

請求項270

前記gRNA分子が、配列番号16671〜21037から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項265に記載の組成物。

請求項271

前記gRNA分子が、配列番号481〜500および508〜547から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項265に記載の組成物。

請求項272

前記gRNA分子が、配列番号501〜507および548〜555から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項265に記載の組成物。

請求項273

前記gRNA分子が、配列番号508、514、576、579、582、および723から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項265に記載の組成物。

請求項274

前記gRNA分子が、配列番号508、510、511、512、514、576、579、581、582、766、および723から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項265に記載の組成物。

請求項275

前記gRNA分子がその5’末端で修飾される、請求項265〜741のいずれか一項に記載の組成物。

請求項276

前記gRNA分子が5’三リン酸基を欠いている、請求項275に記載の組成物。

請求項277

前記gRNA分子が5’キャップを含む、請求項275に記載の組成物。

請求項278

前記5’キャップが、5’−5’三リン酸結合を介して前記gRNA分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項277に記載の組成物。

請求項279

前記5’キャップが、任意選択的に修飾された5’−5’三リン酸結合を介して連結された、2つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項277に記載の組成物。

請求項280

前記3’ポリAテールが、約10〜約30個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項265〜279のいずれか一項に記載の組成物。

請求項281

前記3’ポリAテールが、約20個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項265〜279のいずれか一項に記載の組成物。

請求項282

前記3’ポリAテールを含む前記gRNA分子が、DNA鋳型からのインビトロ転写によって調製された、請求項280または請求項281に記載の組成物。

請求項283

前記ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記DNA鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含んでなり、前記T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、請求項282に記載の組成物。

請求項284

前記ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記DNA鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含んでなり、前記T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、請求項282に記載の組成物。

請求項285

前記Cas9分子が二本鎖切断で標的ドメインを切断する、請求項265〜284のいずれか一項に記載の組成物。

請求項286

前記Cas9分子がS.ピオゲネスCas9分子である、請求項285に記載の組成物。

請求項287

前記ターゲティングドメインが、のターゲティングドメインの群から選択される、請求項265〜286のいずれか一項に記載の組成物。

請求項288

前記Cas9分子が一本鎖切断で標的ドメインを切断する、請求項265〜287のいずれか一項に記載の組成物。

請求項289

前記Cas9分子がS.ピオゲネスCas9分子である、請求項288に記載の組成物。

請求項290

前記S.ピオゲネスCas9分子がD10A変異を有する、請求項265〜289のいずれか一項に記載の組成物。

請求項291

前記ターゲティングドメインが、のターゲティングドメインの群から選択される、請求項265〜290のいずれか一項に記載の組成物。

請求項292

前記S.ピオゲネスCas9分子が、N863A変異を有する、請求項265〜291のいずれか一項に記載の組成物。

請求項293

前記ターゲティングドメインが、のターゲティングドメインの群から選択される、請求項292に記載の組成物。

請求項294

前記gRNA分子がモジュラーgRNA分子である、請求項265〜293のいずれか一項に記載の組成物。

請求項295

前記gRNA分子がキメラgRNA分子である、請求項265〜294のいずれか一項に記載の組成物。

請求項296

前記gRNA分子が、5’から3’方向に、ターゲティングドメイン;第1の相補的ドメイン;連結ドメイン;第2の相補的ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインを含んでなる、請求項295に記載の組成物。

請求項297

前記gRNA分子が、25ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも20ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、請求項295または請求項296に記載の組成物。

請求項298

PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなり、その5’末端で修飾され、および/または3’ポリAテールを含んでなる、gRNA分子。

請求項299

配列番号481〜555、563〜1516、1517〜3748、14657〜16670、および16671〜21037のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または3ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含んでなる、請求項298に記載のgRNA分子。

請求項300

配列番号563〜1516から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項298に記載のgRNA分子。

請求項301

配列番号1517〜3748から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項298に記載のgRNA分子。

請求項302

配列番号14657〜16670から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項298に記載のgRNA分子。

請求項303

配列番号16671〜21037から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項298に記載のgRNA分子。

請求項304

配列番号481〜500および508〜547から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項298に記載のgRNA分子。

請求項305

配列番号501〜507および548〜555から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項298に記載のgRNA分子。

請求項306

配列番号508、514、576、579、582、および723から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項298に記載のgRNA分子。

請求項307

配列番号508、510、511、512、514、576、579、581、582、766、および723から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項298に記載のgRNA分子。

請求項308

その5’末端で修飾されている、請求項298〜94のいずれか一項に記載のgRNA分子。

請求項309

5’三リン酸基を欠いている、請求項308に記載のgRNA分子。

請求項310

5’キャップを含む、請求項308に記載のgRNA分子。

請求項311

前記5’キャップが、5’−5’三リン酸結合を介して前記gRNA分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項310に記載のgRNA分子。

請求項312

前記5’キャップが、任意選択的に修飾された5’−5’三リン酸結合を介して連結された、2つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項310に記載のgRNA分子。

請求項313

約10〜約30個のアデニンヌクレオチドから構成される3’ポリAテールを含んでなる、請求項298〜312のいずれか一項に記載のgRNA分子。

請求項314

約20個のアデニンヌクレオチドから構成される3’ポリAテールを含んでなる、請求項298〜312のいずれか一項に記載のgRNA分子。

請求項315

前記3’ポリAテールを含む前記gRNA分子が、DNA鋳型からのインビトロ転写によって調製された、請求項313または314に記載のgRNA分子。

請求項316

前記ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記DNA鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含んでなり、前記T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、請求項315に記載のgRNA分子。

請求項316

前記ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記DNA鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含んでなり、前記T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、請求項315に記載のgRNA分子。

請求項317

S.ピオゲネスgRNA分子である、請求項298〜316のいずれか一項に記載のgRNA分子。

請求項318

前記ターゲティングドメインが、のターゲティングドメインの群から選択される、請求項298〜317のいずれか一項に記載のgRNA分子。

請求項319

前記ターゲティングドメインが、のターゲティングドメインの群から選択される、請求項318に記載のgRNA分子。

請求項320

前記ターゲティングドメインが、のターゲティングドメインの群から選択される、請求項318に記載のgRNA分子。

請求項321

前記ターゲティングドメインが、のターゲティングドメインの群から選択される、請求項318に記載のgRNA分子。

請求項322

モジュラーgRNA分子である、請求項298〜321のいずれか一項に記載のgRNA分子。

請求項323

キメラgRNA分子である、請求項298〜322のいずれか一項に記載のgRNA分子。

請求項324

5’から3’方向に、ターゲティングドメイン;第1の相補的ドメイン;連結ドメイン;第2の相補的ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインを含んでなる、請求項323に記載のgRNA分子。

請求項325

25ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも20ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、請求項323または請求項324に記載のgRNA分子。

請求項326

細胞を1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体と接触させるステップを含んでなり、前記1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体中のgRNA分子が、PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなる、移植のための細胞を作製する方法。

請求項327

前記gRNA分子が、前記PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含んでなり、前記gRNA分子が、前記標的ドメインを少なくとも40%の切断効率で切断するように前記Cas9分子を誘導する、請求項326に記載の方法。

請求項328

前記切断効率が、標識抗PDCD1抗体およびフローサイトメトリーアッセイを用いて判定される、請求項327に記載の方法。

請求項329

前記gRNA分子が、それらの5’末端で修飾される、または3’ポリAテールを含んでなる、請求項326〜328のいずれか一項に記載の方法。

請求項330

前記gRNA分子が、それらの5’末端で修飾され、かつ3’ポリAテールを含んでなる、請求項326〜328のいずれか一項に記載の方法。

請求項331

前記gRNA分子が5’三リン酸基を欠いている、請求項329または請求項330に記載の方法。

請求項332

前記gRNA分子が5’キャップを含む、請求項329または請求項330に記載の方法。

請求項333

前記5’キャップが、5’−5’三リン酸結合を介して前記gRNA分子の残りの部分に連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項332に記載の方法。

請求項334

前記5’キャップが、任意選択的に修飾された5’−5’三リン酸結合を介して連結された、2つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含んでなる、請求項332に記載の方法。

請求項335

前記3’ポリAテールが、約10〜約30個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項329〜334のいずれか一項に記載の方法。

請求項336

前記3’ポリAテールが、約20個のアデニンヌクレオチドから構成される、請求項329〜334のいずれか一項に記載の方法。

請求項337

前記3’ポリAテールを含む前記gRNA分子が、DNA鋳型からのインビトロ転写によって調製された、請求項335または請求項336に記載の方法。

請求項338

前記ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドであり、前記DNA鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含んでなり、前記T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでない、請求項337に記載の方法。

請求項339

前記ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドがグアニンヌクレオチドでなく、前記DNA鋳型が、前記ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含んでなり、前記T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドが、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである、請求項337に記載の方法。

請求項340

前記1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体が、電気穿孔を通じて前記細胞に送達される、請求項326〜339のいずれか一項に記載の方法。

請求項341

前記Cas9分子が、単一のgRNA分子によって誘導され、前記標的ドメインを単一の二本鎖切断で切断する、請求項326〜340のいずれか一項に記載の方法。

請求項342

前記Cas9分子がS.ピオゲネスCas9分子である、請求項341に記載の方法。

請求項343

前記単一のgRNA分子が、のターゲティングドメインから選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項326〜342のいずれか一項に記載の方法。

請求項344

前記Cas9分子がニッカーゼであり、2つのCas9分子/gRNA分子複合体が、前記標的ドメインの対向する鎖上の2つの一本鎖切断で前記標的ドメインを切断するように2つの異なるgRNA分子によって誘導される、請求項326〜343のいずれか一項に記載の方法。

請求項345

前記Cas9分子が、D10A変異を有するS.ピオゲネスCas9分子である、請求項326〜344のいずれか一項に記載の方法。

請求項346

前記2つのgRNA分子が、のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項326〜345のいずれか一項に記載の方法。

請求項347

前記S.ピオゲネスCas9分子が、N863A変異を有する、請求項326〜346のいずれか一項に記載の方法。

請求項348

前記2つのgRNA分子が、のターゲティングドメイン対から選択されるターゲティングドメインを含んでなる、請求項347に記載の方法。

請求項349

前記gRNA分子がモジュラーgRNA分子である、請求項326〜348のいずれか一項に記載の方法。

請求項350

前記gRNA分子がキメラgRNA分子である、請求項326〜349のいずれか一項に記載の方法。

請求項351

前記gRNA分子が、5’から3’方向に、ターゲティングドメイン;第1の相補的ドメイン;連結ドメイン;第2の相補的ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインを含んでなる、請求項350に記載の方法。

請求項352

前記gRNA分子が、25ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも20ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含んでなる、請求項350または請求項351に記載の方法。

請求項353

前記gRNA分子が、少なくとも60%の切断効率で標的ドメインを切断するように前記Cas9分子を誘導する、請求項326〜352のいずれか一項に記載の方法。

請求項354

前記gRNA分子が、少なくとも80%の切断効率で標的ドメインを切断するように前記Cas9分子を誘導する、請求項326〜352のいずれか一項に記載の方法。

請求項355

前記gRNA分子が、少なくとも90%の切断効率で標的ドメインを切断するように前記Cas9分子を誘導する、請求項326〜352のいずれか一項に記載の方法。

請求項356

前記1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体が、5未満のオフターゲットを生じる、請求項326〜355のいずれか一項に記載の方法。

請求項357

前記1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体が、2未満のエクソンオフターゲットを生じる、請求項326〜356のいずれか一項に記載の方法。

請求項358

前記オフターゲットが、GUIDE−seqによって同定される、請求項356または請求項357に記載の方法。

請求項359

前記オフターゲットが、Amp−seqによって同定される、請求項356または請求項357に記載の方法。

請求項360

前記接触させるステップがエクスビボで実施される、請求項326〜359のいずれか一項に記載の方法。

請求項361

前記細胞が免疫細胞である、請求項326〜360のいずれか一項に記載の方法。

請求項362

前記細胞がリンパ球または抗原提示細胞である、請求項361に記載の方法。

請求項363

前記細胞がT細胞、B細胞または抗原提示細胞である、請求項362に記載の方法。

請求項364

前記細胞がT細胞である、請求項326〜363のいずれか一項に記載の方法。

請求項365

前記細胞が組換え受容体を含んでなる、請求項326〜364のいずれか一項に記載の方法。

請求項366

前記核酸を前記細胞に導入させる条件下で、前記細胞を、組換え受容体をコードする核酸と接触させるステップをさらに含んでなる、請求項326〜365のいずれか一項に記載の方法。

請求項367

前記組換え受容体が、機能性非TCR抗原受容体または遺伝子組換えTCRである、請求項365または請求項366に記載の方法。

請求項368

前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体(CAR)である、請求項365〜367のいずれか一項に記載の方法。

請求項369

前記CARが、抗体または抗体フラグメントである、抗原結合ドメインを含んでなる、請求項368に記載の方法。

請求項370

前記抗体フラグメントが、一本鎖フラグメントである、請求項369に記載の方法。

請求項371

前記抗体フラグメントが、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含んでなる、請求項369または請求項370に記載の方法。

請求項372

前記フラグメントが、scFvを含んでなる、請求項369〜371のいずれか一項に記載の方法。

請求項373

前記抗原が疾患または障害に関連する、請求項369〜372のいずれか一項に記載の方法。

請求項374

前記疾患または障害が、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、請求項373に記載の方法。

請求項375

前記組換え受容体が腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項365〜374のいずれか一項に記載の方法。

請求項376

前記抗原が、ROR1、Her2、L1−CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、B型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP−2、EGP−4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎児型アセチルコリンe受容体、GD2、GD3、HMW−MAA、IL−22R−α、IL−13R−α2、kdr、κ軽鎖、ルイスY、L1−細胞接着分子(CD171)、MAGE−A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY−ESO−1、MART−1、gp100、がん胎児性抗原(oncofetalantigen)、TAG72、VEGF−R2、がん胎児性抗原(carcinoembryonicantigen;CEA)、前立腺特異的抗原、PSMA、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS−1、c−Met、GD−2、MAGEA3、CE7、ウィルムス腫瘍1(WT−1)、サイクリンA1(CCNA1)、BCMA、およびインターロイキン12から選択される、請求項369〜375のいずれか一項に記載の方法。

請求項377

前記組換え受容体が、ITAMを含んでなる細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項365〜376のいずれか一項に記載の方法。

請求項378

前記細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3−ゼータ(CD3ζ)鎖の細胞内ドメインを含んでなる、請求項377に記載の方法。

請求項379

前記組換え受容体が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含んでなる、請求項377または378に記載の方法。

請求項380

前記共刺激シグナル伝達領域が、CD28または4−1BBのシグナル伝達ドメインを含んでなる、請求項379に記載の方法。

請求項381

請求項162〜231および326〜380のいずれか一項に記載の方法によって作製されたT細胞。

請求項382

請求項232〜264のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体を含んでなるT細胞。

請求項383

請求項265〜297のいずれか一項に記載の組成物を含んでなるT細胞。

請求項384

請求項381〜383のいずれか一項に記載のT細胞を前記対象に投与するステップを含んでなる、対象を治療する方法。

請求項385

治療で使用するための、請求項232〜264のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体、請求項265〜297のいずれか一項に記載の組成物、または請求項381〜383のいずれか一項に記載のT細胞。

請求項386

がんの治療のための医薬の製造における、請求項232〜264のいずれか一項に記載のCas9分子/gRNA分子複合体または請求項265〜297のいずれか一項に記載の組成物の使用。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれその内容全体が参照により援用される、2016年5月6日に出願された「Genetically Engineered Cells And MethodsOf Making The Same」と題された米国仮特許出願第62/333,144号明細書および2016年5月6日に出願された「CRISPR−CAS−Related Methods、Compositions And Components For Cancer Immunotherapy」と題された米国仮特許出願第62/332,657号明細書の優先権を主張する。

0002

配列表の参照による援用
本出願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、2017年5月4日に作成された735042006440SEQLIST.TXTと題された、サイズが12,031,926バイトのファイルとして提供される。配列表の電子形態情報は、その内容全体が参照により援用される。

0003

分野
本開示は、CRISPR/CAS関連方法、標的核酸配列編集するまたは標的核酸配列の発現を調節するための組成物および構成要素、ならびに遺伝子操作細胞またはT細胞前駆体の養子免疫伝達を含んでなるがん免疫療法に関連したそれらの用途に関する。

背景技術

0004

背景
養子療法のために操作された細胞を生成し投与するための様々なストラテジー利用可能である。例えば、CARなどの遺伝子操作された抗原受容体を発現する免疫細胞を操作するためのストラテジー、および細胞における遺伝子発現を抑制または抑圧するためのストラテジーが利用可能である。例えば、エフェクター機能の抑制を回避し、対象への投与時に細胞の活動および/または生存を改善することによって、細胞の有効性を改善するための改善されたストラテジーが必要である。このような要求を満たす方法、細胞、組成物、キット、およびシステムが提供される。

0005

概要
例えば、対象における疾患および/または病状処置するための養子細胞療法において使用するための、組換え受容体と、PDCD1遺伝子の遺伝子破壊またはPD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質とを含有する、操作された免疫細胞を含む組成物が提供される。このような組成物または細胞、細胞、細胞集団、組成物を生成または作製するための方法と、このような組成物または細胞を使用する方法もまた提供される。組成物および細胞は、概して、PDCD1遺伝子の遺伝子破壊、またはPDCD1遺伝子発現の防止または減少、またはPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を含む。例えば、対象における疾患および/または病状を処置するための養子細胞療法において使用するための、本方法によって生成されるものなどの、提供された組成物、遺伝子操作された(組換え)細胞表面受容体を発現してPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を含有する細胞集団または細胞を対象に投与する方法もまた提供される。

0006

いくつかの実施形態では、(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体を含んでなる操作された免疫細胞;および(b)PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質、を含有する組成物が提供され、前記作用物質は、組成物中の細胞の少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも90%もしくはそれより多くにおいて、および/または組成物中の組換え受容体を発現する細胞の少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも90%もしくはそれより多くにおいて、前記遺伝子破壊を誘導でき、および/またはPD−1発現を防止しまたは減少させることができる。

0007

いくつかの実施形態では、(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする核酸を含有する操作された免疫細胞;および(b)PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質、を含有する組成物が提供され、前記作用物質は、組成物中の細胞の少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも90%もしくはそれより多くにおいて、および/または組成物中の組換え受容体を発現する細胞の少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも90%もしくはそれより多くにおいて、前記遺伝子破壊を誘導でき、および/またはPD−1発現を防止しまたは減少させることができる。

0008

本明細書に提供されるいくつかの実施形態では、組成物は、その表面に組換え受容体を発現する操作された免疫細胞を含む。

0009

いくつかの実施形態では、(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体;および(b)PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊、を含有する操作された免疫細胞を含有する細胞集団を含有する組成物が提供され、前記遺伝子破壊は、前記PD−1ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させ、組成物中の細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%もしくはそれより多くは、遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子を含有せず、PDCD1遺伝子を含有せず、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現せず;および/または組換え受容体を発現する組成物中の細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%もしくはそれより多くは、遺伝子破壊を含有し、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない。

0010

いくつかの実施形態では、(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体、(b)PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊、を含有する操作された免疫細胞を含有する細胞集団を含有する組成物が提供され、操作された免疫細胞は、組換え受容体の前記抗原への結合に際して、細胞傷害性を誘導し、増殖し、および/またはサイトカイン分泌することができ、前記遺伝子破壊は、前記PD−1ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させることができ、任意選択的に、前記防止または減少は、組成物中の細胞のおよび/または組換え受容体を発現する組成物中の細胞の、少なくとも70%、75%、80%、85%、または90%であるか、または少なくとも約70%、75%、80%、85%、または90%であるか、または70%、75%、80%、85%、または90%より多い、または約70%、75%、80%、85%、または90%より多い。

0011

いくつかの実施形態では、それぞれ(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体;および(b)PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊、を含有する操作された免疫細胞の集団を含有する細胞集団を含有する組成物が提供され、前記遺伝子破壊は、前記PD−1ポリペプチドの発現を防止しまたは減少させることができ、前記操作された免疫細胞は、組換え受容体を含有し遺伝子破壊を含有しない組成物中のその他の細胞における、前記組換え受容体の平均発現および/または表面発現ベルそれぞれと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一レベルで受容体の発現および/または表面発現を平均して示し、または前記操作された免疫細胞は、PD−1ポリペプチドを発現せず、かつ、組換え受容体を含有しPD−1ポリペプチドを発現する組成物中の細胞における、平均発現および/または表面レベルそれぞれと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一レベルで受容体の発現および/または表面発現を平均して示す。

0012

いくつかの実施形態では、組換え受容体は、抗原、抗原を発現する細胞、および/または抗原受容体活性化物質とのインキュベーションに際して、任意選択的にインビトロアッセイにおいて測定され、任意選択的に1つまたは複数のサイトカインの存在下における、任意選択的に12、24、36、48、または60時間のインキュベーションを含有する、インビトロアッセイにおいて測定されるように、抗原に特異的に結合すること、操作されたT細胞を活性化または刺激すること、細胞傷害性を誘導すること、または免疫細胞による増殖、生存、および/またはサイトカイン分泌を誘導することができる。いくつかの実施形態では、操作された免疫細胞は、抗原、抗原を発現する細胞、および/または抗原受容体活性化物質とのインキュベーションに際して、任意選択的に1種または複数種のサイトカインの存在下における、任意選択的に12、24、36、48、または60時間のインキュベーションを含有し、任意選択的に免疫細胞のPD−L1発現細胞への曝露を含むまたは含有しない、インビトロアッセイにおいて測定されるように、抗原に特異的に結合すること、細胞傷害性、増殖、生存、および/またはサイトカイン分泌を誘導することができる。

0013

いくつかの実施形態では、結合、細胞傷害性、増殖、生存、またはサイトカイン分泌のレベルまたは程度または規模または持続時間は、同一条件下で評価された、組換え受容体を含有するがPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を含有しない免疫細胞で検出または観察されたものと比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一である。いくつかの実施形態では、結合、細胞傷害性、増殖、生存、および/またはサイトカイン分泌は、中断と、抗原、抗原発現細胞、および/または物質への再曝露とに続いて、任意選択的にインビトロアッセイで測定される。

0014

いくつかの実施形態では、免疫細胞は対象由来初代細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はNK細胞またはT細胞などの白血球細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、未分画T細胞を含有する複数のT細胞を含有し、単離されたCD8+細胞を含有するかもしくはCD8+T細胞が富化されており、または単離されたCD4+T細胞を含有するかもしくはCD4+細胞が富化されており、ならびに/または、未感作細胞エフェクターメモリー細胞セントラルメモリー細胞、セントラルメモリー幹細胞、エフェクターメモリー細胞、および長寿命エフェクターメモリー細胞からなる群から選択されるそのサブセットが富化されている。いくつかの実施形態では、非活性の長寿命メモリーまたはセントラルメモリー表現型を示す、組成物中のT細胞の百分率、または受容体を発現し遺伝子破壊を含有するT細胞の百分率は、組成が同一または実質的に同一であるが遺伝子破壊を含有せずまたはPD−1ポリペプチドを発現する細胞集団と、同一または実質的に同一である。

0015

いくつかの実施形態では、非活性の長寿命メモリーまたはセントラルメモリー表現型を示す組成物中のT細胞の百分率は、任意選択的にPD−L1に対する免疫細胞への接触または曝露の非存在下または存在下で比較される、同一条件下で評価された場合に、T細胞を含有し、組換え受容体を含有するが、PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を含有しない組成物中の表現型を示すT細胞の百分率と比較して、同一、ほぼ同一または実質的に同一である。いくつかの実施形態では、表現型は、少なくとも12時間、24時間、48時間、96時間、6日間、12日間、24日間、36日間、48日間または60日間にわたる、37±2℃または約37±2℃での組成物のインキュベーションに続いて評価される。いくつかの実施形態では、インキュベーションはインビトロである。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は、刺激剤の存在下で実施され、少なくとも一部は、任意選択的に最大1時間、6時間、24時間、または48時間のインキュベーションに及ぶ。いくつかの実施形態では、刺激剤は、T細胞、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞の増殖を誘導できる作用物質である。いくつかの実施形態では、刺激剤は、CD3に特異的な抗体、CD28に特異的な抗体および/またはサイトカインでありまたはそれを含有する。いくつかの実施形態では、組換え受容体を含有するT細胞は、CCR7+、4−1BB+(CD137+)、TIM3+、CD27+、CD62L+、CD127+、CD45RA+、CD45RO−、t−betlow、IL−7Ra+、CD95+、IL−2Rβ+、CXCR3+またはLFA−1+から選択される、1つまたは複数の表現型マーカーを含有する。

0016

いくつかの実施形態では、組換え受容体は、機能性非TCR抗原受容体または遺伝子組換えTCRである。いくつかの実施形態では、組換え受容体は、抗体または抗体フラグメントである抗原結合ドメインを含有するCARなどのキメラ抗原受容体(CAR)である。いくつかの実施形態では、組換え受容体に含有される抗体フラグメントは、一本鎖フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含有する。いくつかの実施形態では、フラグメントはscFvを含有する。

0017

いくつかの実施形態では、抗原は、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんなどの疾患または障害に関連する。いくつかの実施形態では、組換え受容体は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、組換え受容体が結合する抗原は、RORl、Her2、Ll−CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリンCEAB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP−2、EGP−4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎児アセチルコリン受容体GD2、GD3、HMW−MAA、IL−22R−α、IL−13R−α2、kdr、κ軽鎖ルイスY、L1−細胞接着分子(CD171)、MAGE−A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY−ESO−1、MART−1、gp100、がん胎児性抗原(oncofetal antigen)、TAG72、VEGF−R2、がん胎児性抗原(carcinoembryonic antigen;CEA)、前立腺特異的抗原、PSMA、エストロゲン受容体プロゲステロン受容体エフリンB2、CD123、CS−1、c−Met、GD−2、MAGE A3、CE7、ウィルムス腫瘍1(WT−1)、サイクリンA1(CCNA1)またはインターロイキン12から選択される。

0018

いくつかの実施形態では、組換え受容体は、ITAMを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3−ゼータ(CD3ζ)鎖の細胞内ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、組換え受容体は、CD28または4−1BBのシグナル伝達ドメインを含有する共刺激シグナル伝達領域などの共刺激シグナル伝達領域をさらに含有する。

0019

いくつかの実施形態では、PDCD1遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質は、(a)PDCD1遺伝子の標的ドメイン相補的な少なくとも1つのガイドRNA(gRNA)を有するターゲティングドメイン、または(b)少なくとも1つのgRNAをコードする少なくとも1つの核酸、のうち少なくとも1つを含有する。いくつかの実施形態では、作用物質は、Cas9分子と、PDCD1遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有するgRNAとの少なくとも1つの複合体を含有する。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、第1の相補的ドメイン、第1の相補的ドメインと相補的な第2の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的にテールドメインをさらに含有する。いくつかの実施形態では、第1の相補的ドメインおよび第2の相補的ドメインは、連結ドメインによって連結されている。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、3’ポリAテールおよび5’アンチリバースキャップアナログ(ARCAキャップを含有する。いくつかの実施形態では、Cas9分子は、酵素的に活性なCas9である。

0020

いくつかの実施形態では、少なくとも1つのgRNAは、

からなる群から選択される配列を含有する、ターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのgRNAは、配列

を含有するターゲティングドメインを含む。

0021

いくつかの実施形態では、Cas9分子は、S.アウレウス(S.aureus)Cas9分子である。いくつかの実施形態では、Cas9分子は、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9である。いくつかの組成では、Cas9分子は、活性RuvCドメインまたは活性HNHドメインを欠く。いくつかの実施形態では、Cas9分子は、D10A変異を含有するS.ピオゲネスCas9分子である。いくつかの実施形態では、Cas9分子は、N863A変異を含有するS.ピオゲネスCas9分子である。

0022

本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、PDCD1遺伝子中に挿入と欠失インデル)をもたらす非相同末端結合(NHEJ)によって修復される、二本鎖切断の生成を含有する。

0023

いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%は、遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現せず;および/または組換え受容体を発現する組成物中の細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%は、遺伝子破壊を含有し、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、またはPD−1ポリペプチドを発現しない。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞の80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%より多くは、遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現せず;および/または組換え受容体を発現する組成物中の細胞の80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%より多くは、遺伝子破壊を含有し、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、またはPD−1ポリペプチドを発現しない。

0024

いくつかの実施形態では、ゲノム中の遺伝子の双方の対立遺伝子破壊される。

0025

いくつかの実施形態では、組成物中の細胞および/または組換え受容体を発現する組成物中の細胞は、遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有せず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない細胞について富化されないまたは選択されない。

0026

いくつかの実施形態では、組成物中の各細胞において、または組換え受容体を発現する組成物中の各細胞において、平均して2以下、5以下または10以下のその他の遺伝子が破壊される、または作用物質によって破壊される、例えば、組成物中の各細胞において、または組換え受容体を発現する組成物中の各細胞において、その他の遺伝子は1つも破壊されない、または作用物質によって破壊されない。

0027

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物のいずれかは、薬学的に許容可能な緩衝液をさらに含有する。

0028

本明細書では、(a)抗原に特異的に結合する組換え受容体をコードする核酸分子を免疫細胞に導入すること;および(b)(i)PDCD1遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有する少なくとも1つのgRNA、または(ii)少なくとも1つのgRNAをコードする少なくとも1つの核酸、のうち1つを含む、PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を免疫細胞に導入することを含む、遺伝子操作された免疫細胞を生成する方法もまた提供される。

0029

本明細書では、(i)PDCD1遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有する少なくとも1つのgRNA、または(ii)少なくとも1つのgRNAをコードする少なくとも1つの核酸、のうち1つを含む、PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を誘導できる作用物質を、抗原に特異的に結合する組換え受容体を発現する免疫細胞に導入することを含む、遺伝子操作された免疫細胞を生成する方法もまた提供される。

0030

いくつかの実施形態では、作用物質は、Cas9分子と、PDCD1遺伝子の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを有するgRNAとの少なくとも1つの複合体を含む。

0031

いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、第1の相補的ドメイン、第1の相補的ドメインと相補的な第2の相補的ドメイン、隣接ドメイン、および任意選択的にテールドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、第1の相補的ドメインおよび第2の相補的ドメインは、連結ドメインによって連結されている。いくつかの実施形態では、ガイドRNAは、3’ポリAテールおよび5’アンチリバースキャップアナログ(ARCA)キャップを含む。

0032

いくつかの実施形態では、導入は、インビトロで細胞を作用物質またはその一部と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、作用物質の導入は、電気穿孔を含む。いくつかの実施形態では、導入は、細胞と作用物質との接触前、最中または後に、あるいは電気穿孔の前、最中または後に、細胞をインビトロでインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態において、(a)における導入は、形質導入を含み、導入は、形質導入の前、最中または後にインビトロで細胞をインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は、(i)IL−2、IL−7、およびIL−15からなる群から選択されるサイトカイン、および/または(ii)任意選択的に抗CD3および/または抗CD28抗体を含む、1つまたは複数の刺激剤または活性化剤の存在下である。いくつかの実施形態では、(a)における導入は、形質導入前に、細胞を20U/mL〜200U/mL、任意選択的に約100U/mLの濃度のIL−2;1ng/mL〜50ng/mL、任意選択的に約10ng/mLの濃度のIL−7;および/または0.5ng/mL〜20ng/mL、任意選択的に約5ng/mLの濃度のIL−15と共にインキュベートすること;および形質導入に続いて、細胞を10U/mL〜200U/mL、任意選択的に約50U/mLの濃度のIL−2;0.5ng/mL〜20ng/mL、任意選択的に約5ng/mLの濃度のIL−7;および/または0.1ng/mL〜10ng/mL、任意選択的に約0.5ng/mLの濃度のIL−15と共にインキュベートすることを含む。

0033

いくつかの実施形態では、インキュベーションは、独立して、24〜48時間または36〜48時間などの、およそ24、36、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日間にわたり実施される。

0034

いくつかの実施形態では、細胞は、100,000、200,000、300,000、400,000、または500,000個の細胞当たりおよそ1マイクログラム比率で、作用物質と接触される。

0035

いくつかの実施形態では、インキュベーションは、30℃±2℃〜39℃±2℃の温度であり;またはインキュベーションは、少なくとも30℃±2℃、32℃±2℃、34℃±2℃または37℃±2℃、または少なくとも約30℃±2℃、32℃±2℃、34℃±2℃または37℃±2℃の温度である。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は、30℃±2℃であり、インキュベーションの少なくとも一部は、37℃±2℃である。いくつかの実施形態では、方法は、(a)の導入と(b)の導入との間に細胞を休止させるステップをさらに含む。

0036

本明細書で提供される任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、Cas9分子は、酵素的に活性なCas9である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのgRNAは、

からなる群から選択される配列を含む、ターゲティングドメインを含む。いくつかの実施形態59〜78では、少なくとも1つのgRNAは、配列

を含むターゲティングドメインを含む。

0037

いくつかの実施形態では、Cas9分子は、S.アウレウスCas9分子である。いくつかの実施形態では、Cas9分子は、S.ピオゲネスCas9である。いくつかの実施形態では、Cas9分子は、活性RuvCドメインまたは活性HNHドメインを欠く。いくつかの実施形態では、Cas9分子は、D10A変異を含むS.ピオゲネスCas9分子である。いくつかの実施形態では、Cas9分子は、N863A変異を含むS.ピオゲネスCas9分子である。

0038

いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、PDCD1遺伝子中に挿入と欠失(インデル)をもたらす非相同末端結合(NHEJ)によって修復される、二本鎖切断の生成を含む。

0039

いくつかの実施形態では、組換え受容体は、機能性非TCR抗原受容体または遺伝子組換えTCRである。いくつかの実施形態では、組換え受容体はキメラ抗原受容体(CAR)である。いくつかの実施形態では、CARは、抗体または抗体フラグメントである抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは一本鎖フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体フラグメントは、可撓性の免疫グロブリンリンカーによって連結された抗体可変領域を含む。いくつかの実施形態では、フラグメントはscFvを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、感染性疾患もしくは病状、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんなどの疾患または障害に関連する。いくつかの実施形態では、組換え受容体は、腫瘍抗原に特異的に結合する。

0040

いくつかの実施形態では、組換え受容体が結合するものは、RORl、Her2、Ll−CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、B型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP−2、EGP−4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎児型アセチルコリンe受容体、GD2、GD3、HMW−MAA、IL−22R−α、IL−13R−α2、kdr、κ軽鎖、ルイスY、L1−細胞接着分子(CD171)、MAGE−A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY−ESO−1、MART−1、gp100、がん胎児性抗原(oncofetal antigen)、TAG72、VEGF−R2、がん胎児性抗原(carcinoembryonic antigen;CEA)、前立腺特異的抗原、PSMA、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、CS−1、c−Met、GD−2、MAGE A3、CE7、ウィルムス腫瘍1(WT−1)、サイクリンA1(CCNA1)またはインターロイキン12から選択される。

0041

いくつかの実施形態では、組換え受容体は、ITAMを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3−ゼータ(CD3ζ)鎖の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、組換え受容体は、CD28または4−1BBのシグナル伝達ドメインをはじめとする共刺激シグナル伝達領域などの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。

0042

いくつかの実施形態では、組換え受容体をコードする核酸は、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、組換えベクターをコードする核酸の導入は形質導入により、それは任意選択的にレトロウイルス形質導入である。

0043

いくつかの実施形態では、免疫細胞は対象由来の初代細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はNK細胞またはT細胞などの白血球細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はT細胞であり、それは未分画T細胞、単離されたCD8+T細胞、または単離されたCD4+T細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかが、複数の免疫細胞に対して実施される。

0044

いくつかの実施形態では、作用物質の導入および組換え受容体の導入後に、細胞は、(a)遺伝子破壊を含むまたは内因性PD−1ポリペプチドを発現しない細胞、(b)組換え受容体を発現する細胞、または(a)および(b)の双方について、富化も選択もされない。いくつかの実施形態では、方法のいずれかは、(a)遺伝子破壊を含むまたは内因性PD−1ポリペプチドを発現しない細胞、(b)組換え受容体を発現する細胞、または(a)および(b)の双方について、富化または選択することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法のいずれかは、細胞を37℃±2℃または約37℃±2℃でインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、1時間〜96時間、4時間〜72時間、8時間〜48時間、12時間〜36時間、6時間〜24時間、36時間〜96時間、または約1時間〜約96時間、約4時間〜約72時間、約8時間〜約48時間、約12時間〜約36時間、約6時間〜約24時間、約36時間〜96時間にわたり実施される。いくつかの実施形態では、インキュベーションまたはインキュベーションの一部は、刺激剤の存在下で実施される。いくつかの実施形態では、刺激剤は、T細胞、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞の増殖を誘導できる作用物質である。いくつかの実施形態では、刺激剤は、CD3に特異的な抗体、CD28に特異的な抗体および/またはサイトカインでありまたはそれを含む。

0045

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかは、本方法によって生成される細胞を薬学的に許容可能な緩衝液中で製剤化することをさらに含む。

0046

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかは、細胞集団を生成し、その中では、細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%は、1)遺伝子破壊を含み;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含まず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない;かつ2)組換え受容体を発現する、の双方であり、または組換え受容体を発現する細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%は、遺伝子破壊を含み、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、またはPD−1ポリペプチドを発現しない。

0047

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかは、細胞集団を生成し、その中では、細胞の80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%より多くは、1)遺伝子破壊を含み;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含まず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない;かつ2)組換え受容体を発現する、の双方であり、および/または組換え受容体を発現する細胞の80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%より多くは、遺伝子破壊を含み、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;またはPD−1ポリペプチドを発現しない。

0048

本明細書で提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ゲノム中の遺伝子の双方の対立遺伝子が破壊される。

0049

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかによって生成される、遺伝子操作された免疫細胞もまた提供される。

0050

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかによって生成される、複数の遺伝子操作された免疫細胞もまた提供される。

0051

いくつかの実施形態では、このような遺伝子操作された免疫細胞が提供され、その中では、細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%は、1)遺伝子破壊を含み;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含まず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない;かつ2)組換え受容体を発現する、の双方であり、または組換え受容体を発現する細胞の少なくとも約70%、少なくとも約75%、または少なくとも約80%は、遺伝子破壊を含み、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、またはPD−1ポリペプチドを発現しない。

0052

いくつかの実施形態では、複数の遺伝子操作された免疫細胞が提供され、その中では、細胞の80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%より多くは、1)遺伝子破壊を含み;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含まず;および/またはPD−1ポリペプチドを発現しない;かつ2)組換え受容体を発現する、の双方であり、および/または組換え受容体を発現する、遺伝子破壊を含む細胞の80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、または95%より多くは、内因性PD−1ポリペプチドを発現せず、またはPD−1ポリペプチドを発現しない。

0053

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された免疫細胞のいずれかまたは本明細書で提供される複数の遺伝子操作された免疫細胞のいずれかと、任意選択的に薬学的に許容可能な緩衝液とを含む組成物もまた提供される。

0054

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物のいずれかを、疾患または病状を有する対象に投与することを含む治療方法もまた提供される。

0055

いくつかの実施形態では、組換え受容体は、がん、腫瘍、自己免疫疾患もしくは障害、または感染性疾患などの疾患または病状に関連する抗原に特異的に結合する。

0056

いくつかの実施形態では、対象における疾患または病状の治療で使用するための本明細書で提供される薬学的組成物のいずれかもまた提供される。

0057

いくつかの実施形態では、使用される薬学的組成物のいずれかにおいて、組換え受容体は、がん、腫瘍、自己免疫疾患または自己免疫障害または感染性疾患などの疾患または病状に関連する抗原に特異的に結合する。

0058

本明細書では、T細胞を1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体に接触させることを含む、T細胞を改変する方法が提供され、その中で1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体中のgRNA分子は、PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含有する。いくつかの実施形態では、T細胞は、がんに罹患している対象に由来する。いくつかの例では、がんは、リンパ腫慢性リンパ球性白血病(CLL)、B細胞急性リンパ球性白血病(B−ALL)、急性リンパ芽球性白血病急性骨髄性白血病非ホジキンリンパ腫(NHL)、びまん性大細胞リンパ腫(DLCL)、多発性骨髄腫腎細胞がん(RCC)、神経芽細胞腫結腸直腸がん乳がん卵巣がん黒色腫肉腫前立腺がん肺がん食道がん肝細胞がん膵臓がん星細胞腫中皮腫頭頸部がん、および髄芽細胞腫からなる群から選択される。

0059

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、T細胞は、がんを有する対象に由来し、さもなければ、PDCD1遺伝子のT細胞標的位置における変異から恩恵を受け得る対象に由来する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、接触はエクスビボで実施される。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、改変T細胞は、接触処理の後に対象の身体に戻される。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、T細胞はがんに罹患している対象に由来し、接触はエクスビボで実施され、改変T細胞は接触処理の後に対象の身体に戻される。

0060

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、接触の前に1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体が形成される。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、配列番号481〜555、563〜1516、1517〜3748、14657〜16670、および16671〜21037のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または3ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含有する。いくつかの実施形態では、gRNA分子は、配列番号563〜1516から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号1517〜3748から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号14657〜16670から選択されるターゲティングドメインを含有する。いくつかの態様では、gRNA分子は、配列番号16671〜21037から選択されるターゲティングドメインを含有する。

0061

いくつかの実施形態では、gRNA分子は、配列番号481〜500および508〜547から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号501〜507および548〜555から選択されるターゲティングドメインを含有する。いくつかの実施形態では、gRNA分子は、配列番号508、514、576、579、582、および723から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号508、510、511、512、514、576、579、581、582、766、および723から選択されるターゲティングドメインを含有する。

0062

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、その5’末端が修飾されているか、または3’ポリAテールを含有する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、その5’末端が修飾され3’ポリAテールを含有する。場合によっては、gRNA分子は5’三リン酸基を欠いている。

0063

いくつかの態様では、gRNA分子は5’キャップを含む。場合によっては、5’キャップは、5’−5’三リン酸結合を介してgRNA分子の残りに連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含有する。場合によっては、5’キャップは、任意選択的に修飾された5’−5’三リン酸結合を介して連結された、2つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含有する。

0064

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、3’ポリAテールは、約10〜約30個のアデニンヌクレオチドを含む。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、3’ポリAテールは、約20個のアデニンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、3’ポリAテールを含むgRNA分子は、DNA鋳型からのインビトロ転写によって調製された。

0065

いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドであり、DNA鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含み、T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでない。場合によっては、ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでなく、DNA鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含み、T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドは、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体は、電気穿孔を通じてT細胞に送達される。

0066

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含有し、gRNA分子は、標的ドメインを少なくとも40%の切断効率で切断するようにCas9分子を誘導する。いくつかの例では、切断効率は、標識抗PDCD1抗体およびフローサイトメトリーアッセイを用いて判定される。

0067

いくつかの実施形態では、Cas9分子は、単一のgRNA分子によって誘導され、単一の二本鎖切断で標的ドメインを切断する。いくつかの例では、Cas9分子はS.ピオゲネスCas9分子である。

0068

いくつかの実施形態では、単一のgRNA分子は、以下のターゲティングドメインから選択されるターゲティングドメインを含む:

0069

いくつかの実施形態では、Cas9分子はニッカーゼであり、2つのCas9分子/gRNA分子複合体は2つの異なるgRNA分子によって誘導され、標的ドメインの対向する鎖上の2つの一本鎖切断で標的ドメインを切断する。場合によっては、Cas9分子はS.ピオゲネスCas9分子である。場合によっては、S.ピオゲネスCas9分子はD10A変異を有する。

0070

いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインを含む2つのgRNA分子は、以下のターゲティングドメイン対から選択される:

。場合によっては、S.ピオゲネスCas9分子は、N863A変異を有する。

0071

いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインを含む2つのgRNA分子は、以下のターゲティングドメイン対から選択される:

および

0072

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子はモジュラーgRNA分子である。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子はキメラgRNA分子である。

0073

いくつかの実施形態では、gRNA分子は、5’から3’方向に、ターゲティングドメイン;第1の相補的ドメイン;連結ドメイン;第2の相補的ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインを含む。場合によっては、gRNA分子は、25ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも20ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含有する。

0074

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、少なくとも60%の切断効率で標的ドメインを切断するようにCas9分子を誘導する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、少なくとも80%の切断効率で標的ドメインを切断するようにCas9分子を誘導する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、少なくとも90%の切断効率で標的ドメインを切断するようにCas9分子を誘導する。

0075

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体は、5つ未満のオフターゲットを生成する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体は、2つ未満のエクソンオフターゲットを生成する。いくつかの態様では、オフターゲットはGUIDE−seqによって同定される。場合によっては、オフターゲットはAmp−seqによって同定される。

0076

本明細書ではCas9分子/gRNA分子複合体が提供され、その中ではgRNA分子は、PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含有し、gRNA分子は、その5’末端で修飾され、および/または3’ポリAテールを含有する。いくつかの実施形態では、gRNA分子は、配列番号481〜555、563〜1516、1517〜3748、14657〜16670、および16671〜21037からのターゲティングドメインと同一の、または3ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含有する。いくつかの態様では、gRNA分子は、配列番号563〜1516から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号1517〜3748から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号14657〜16670から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号16671〜21037から選択されるターゲティングドメインを含有する。

0077

いくつかの実施形態では、gRNA分子は、配列番号481〜500および508〜547から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号501〜507および548〜555から選択されるターゲティングドメインを含有する。いくつかの態様では、gRNA分子は、配列番号508、514、576、579、582、および723から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号508、510、511、512、514、576、579、581、582、766、および723から選択されるターゲティングドメインを含有する。

0078

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子はその5’末端が修飾されている。場合によっては、gRNA分子は5’三リン酸基を欠いている。場合によっては、gRNA分子は5’キャップを含む。いくつかの実施形態では、5’キャップは、5’−5’三リン酸結合を介してgRNA分子の残りに連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含有する。場合によっては、5’キャップは、任意選択的に修飾された5’−5’三リン酸結合を介して連結された、2つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含有する。

0079

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、3’ポリAテールは、約10〜約30個のアデニンヌクレオチドを含む。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、3’ポリAテールは、約20個のアデニンヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、3’ポリAテールを含むgRNA分子は、DNA鋳型からのインビトロ転写によって調製された。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドであり、DNA鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含有し、T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでない。場合によっては、ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでなく、DNA鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含み、T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドは、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである。

0080

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、Cas9分子は、標的ドメインを二本鎖切断で切断する。いくつかの例では、Cas9分子はS.ピオゲネスCas9分子である。場合によっては、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される:

0081

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、Cas9分子は、標的ドメインを一本鎖切断で切断する。場合によっては、Cas9分子はS.ピオゲネスCas9分子である。いくつかの例では、S.ピオゲネスCas9分子はD10A変異を有する。場合によっては、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される:

。場合によっては、S.ピオゲネスCas9分子は、N863A変異を有する。

0082

いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される:

0083

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子はモジュラーgRNA分子である。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子はキメラgRNA分子である。

0084

いくつかの実施形態では、gRNA分子は、5’から3’方向に、ターゲティングドメイン;第1の相補的ドメイン;連結ドメイン;第2の相補的ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインを含む。いくつかの態様では、gRNA分子は、25ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも20ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含有する。

0085

本明細書では、PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含有するgRNA分子が提供され、gRNA分子は、その5’末端で修飾され、および/または3’ポリAテールを含有する。いくつかの実施形態では、gRNA分子は、配列番号481〜555、563〜1516、1517〜3748、14657〜16670、および16671〜21037のいずれかからのターゲティングドメインと同一の、または3ヌクレオチド以下が異なる、ターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号563〜1516から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号1517〜3748から選択されるターゲティングドメインを含有する。いくつかの例では、gRNA分子は、配列番号14657〜16670から選択されるターゲティングドメインを含有する。いくつかの態様では、gRNA分子は、配列番号16671〜21037から選択されるターゲティングドメインを含有する。

0086

いくつかの実施形態では、gRNA分子は、配列番号481〜500および508〜547から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号501〜507および548〜555から選択されるターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、配列番号508、514、576、579、582、および723から選択されるターゲティングドメインを含有する。いくつかの実施形態では、gRNA分子は、配列番号508、510、511、512、514、576、579、581、582、766、および723から選択されるターゲティングドメインを含有する。

0087

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子はその5’末端が修飾されている。場合によっては、gRNA分子は5’三リン酸基を欠いている。いくつかの態様では、gRNA分子は5’キャップを含む。いくつかの例では、5’キャップは、5’−5’三リン酸結合を介してgRNA分子の残りに連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、5’キャップは、任意選択的に修飾された5’−5’三リン酸結合を介して連結された、2つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含有する。

0088

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、約10〜約30個のアデニンヌクレオチドを含有する3’ポリAテールを含む。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、約20個のアデニンヌクレオチドを含有する3’ポリAテールを含有する。

0089

いくつかの実施形態では、3’ポリAテールを含むgRNA分子は、DNA鋳型からのインビトロ転写によって調製された。場合によっては、ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドであり、DNA鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含有し、T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでない。場合によっては、ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでなく、DNA鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含み、T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドは、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである。

0090

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子はS.ピオゲネスgRNA分子である。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される:

。場合によっては、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される:GCCCUGGCCAGUCGUCU(配列番号514);またはCACCUACCUAAGAACCAUCC(配列番号723)。場合によっては、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される:

。場合によっては、ターゲティングドメインは、以下のターゲティングドメイン群から選択される:

0091

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子はモジュラーgRNA分子である。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子はキメラgRNA分子である。いくつかの実施形態では、gRNA分子は、5’から3’方向に、ターゲティングドメイン;第1の相補的ドメイン;連結ドメイン;第2の相補的ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインを含有する。いくつかの実施形態では、gRNA分子は、25ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも20ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含有する。

0092

本明細書では、細胞を1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体と接触させることを含む、移植のための細胞を生成する方法が提供され、その中で1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体中のgRNA分子は、PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、PDCD1遺伝子由来の標的ドメインと相補的なターゲティングドメインを含有し、gRNA分子は、標的ドメインを少なくとも40%の切断効率で切断するようにCas9分子を誘導する。いくつかの態様では、切断効率は、標識抗PDCD1抗体およびフローサイトメトリーアッセイを用いて判定される。

0093

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、その5’末端が修飾されているか、または3’ポリAテールを含む。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、その5’末端が修飾され3’ポリAテールを含む。いくつかの実施形態では、gRNA分子は5’三リン酸基を欠いている。いくつかの例では、gRNA分子は5’キャップを含む。場合によっては、5’キャップは、5’−5’三リン酸結合を介してgRNA分子の残りに連結された、修飾グアニンヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、5’キャップは、任意選択的に修飾された5’−5’三リン酸結合を介して連結された、2つの任意選択的に修飾されたグアニンヌクレオチドを含有する。

0094

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、3’ポリAテールは、約10〜約30個のアデニンヌクレオチドを含有する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、3’ポリAテールは、約20個のアデニンヌクレオチドを含む。場合によっては、3’ポリAテールを含むgRNA分子は、DNA鋳型からのインビトロ転写によって調製された。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドであり、DNA鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含み、T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでない。場合によっては、ターゲティングドメインの5’ヌクレオチドはグアニンヌクレオチドでなく、DNA鋳型は、ターゲティングドメインに相当する配列のすぐ上流に位置するT7プロモーター配列を含み、T7プロモーター配列の3’ヌクレオチドは、グアニンヌクレオチド以外のヌクレオチドの下流のグアニンヌクレオチドである。

0095

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体は、電気穿孔を通じて細胞に送達される。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、Cas9分子は、単一のgRNA分子によって誘導され、単一の二本鎖切断で標的ドメインを切断する。いくつかの実施形態では、Cas9分子はS.ピオゲネスCas9分子である。

0096

いくつかの実施形態では、単一のgRNA分子は、以下のターゲティングドメインから選択されるターゲティングドメインを含有する:

0097

任意のこのような実施形態のいくつかでは、Cas9分子はニッカーゼであり、2つのCas9分子/gRNA分子複合体は2つの異なるgRNA分子によって誘導され、標的ドメインの対向する鎖上の2つの一本鎖切断で標的ドメインを切断する。

0098

いくつかの実施形態では、Cas9分子は、D10A変異を有するS.ピオゲネスCas9分子である。いくつかの例では、ターゲティングドメインを含む2つのgRNA分子は、以下のターゲティングドメイン対から選択される:

0099

場合によっては、S.ピオゲネスCas9分子は、N863A変異を有する。いくつかの実施形態では、ターゲティングドメインを含む2つのgRNA分子は、以下のターゲティングドメイン対から選択される:

0100

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子はモジュラーgRNA分子である。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子はキメラgRNA分子である。いくつかの例では、gRNA分子は、5’から3’方向に、ターゲティングドメイン;第1の相補的ドメイン;連結ドメイン;第2の相補的ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインを含有する。場合によっては、gRNA分子は、25ヌクレオチド長以下の連結ドメイン、および合わせると少なくとも20ヌクレオチド長の隣接ドメインおよびテールドメインを含有する。

0101

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、少なくとも60%の切断効率で標的ドメインを切断するようにCas9分子を誘導する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、少なくとも80%の切断効率で標的ドメインを切断するようにCas9分子を誘導する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、gRNA分子は、少なくとも90%の切断効率で標的ドメインを切断するように、Cas9分子を誘導する。

0102

任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体は、5つ未満のオフターゲットを生成する。任意のこのような実施形態のうちのいくつかでは、1つまたは複数のCas9分子/gRNA分子複合体は、2つ未満のエクソンオフターゲットを生成する。いくつかの態様では、オフターゲットはGUIDE−seqによって同定される。いくつかの例では、オフターゲットはAmp−seqによって同定される。

図面の簡単な説明

0103

最初に簡単に図面を説明する。

0104

図1A−G)いくつかの代表的なgRNAの描写である。
図1A)部分的にストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)(S.ピオゲネスに由来する(または部分的に配列をモデルにしている)、モジュラーgRNA分子を二重鎖構造として描写する(それぞれ出現順に配列番号42および43);
図1B)S.ピオゲネスに部分的に由来する単分子(またはキメラ)gRNA分子を二重鎖構造として描写する(配列番号44);
図1C)S.ピオゲネスに部分的に由来する単分子gRNA分子を二重鎖構造として描写する(配列番号45);
図1D)S.ピオゲネスに部分的に由来する単分子gRNA分子を二重鎖構造として描写する(配列番号46);
図1E)S.ピオゲネスに部分的に由来する単分子gRNA分子を二重鎖構造として描写する(配列番号47);
図1F)ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)(S.サーモフィルス(S.thermophilus)に部分的に由来するモジュラーgRNA分子を二重鎖構造として描写する(それぞれ出現順に配列番号48および49);
図1G)S.ピオゲネスおよびS.サーモフィルスのモジュラーgRNA分子のアライメントを描写する(それぞれ出現順に配列番号50〜53)。
図2A−G)Chylinski et al.(RNA BIOL.2013;10(5):726−737)からのCas9配列のアライメントを描写する。N末端RuvC様ドメインは、枠内に「y」で示される。他の2つのRuvC様ドメインは、枠内に「b」で示される。HNH様ドメインは、枠内に「g」で示される。Sm:S.ミュータンス(S.mutans)(配列番号1);Sp:S.ピオゲネス(配列番号2);St:S.サーモフィルス(配列番号3);Li:L.イノキュア(L.innocua)(配列番号4)。モチーフ:これは4つの配列に基づくモチーフである:全ての4つの配列中で保存される残基は、一文字アミノ酸略号によって示され;「*」は、4つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し;「−」は、例えば、20の天然起源アミノ酸のいずれかである、任意のアミノ酸を示す。
図3A−B)Chylinski et alで開示されるCas9分子からのN末端RuvC様ドメインのアライメントを示す(それぞれ出現順に配列番号54〜103)。図3Bの最後の行は、4つの高度に保存された残基を特定する。
図4A−B)配列外れ値を除外して、Chylinski et al.で開示されるCas9分子からのN末端RuvC様ドメインのアライメントを示す(それぞれ出現順に配列番号104〜177)。図4Bの最後の行は、3つの高度に保存された残基を特定する。
図5A−C)Chylinski et al.で開示されるCas9分子からのHNH様ドメインのアライメントを示す(それぞれ出現順に配列番号178〜252)。図5C最後行は、保存残基を特定する。
図6A−B)配列外れ値を除外して、Chylinski et al.で開示されるCas9分子からのHNH様ドメインのアライメントを示す(それぞれ出現順に配列番号253〜302)。図6Bの最後の行は、3つの高度に保存された残基を特定する。
(図7A−B)S.ピオゲネスおよびナイセリアメニンジチディス(Neisseria meningitidis)からのCas9配列のアライメントを描写する。N末端RuvC様ドメインは、枠内に「Y」で示される。他の2つのRuvC様ドメインは、枠内に「B」で示される。HNH様ドメインは、枠内に「G」で示される。Sp:S.ピオゲネス;Nm:N.メニンジチディス(N.meningitidis)。モチーフ:これは2つの配列に基づくモチーフである:双方の配列で保存される残基は、単一アミノ酸名称によって示される;「*」は、2つの配列のいずれかの対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し;「−」は、例えば、20の天然起源アミノ酸のいずれかである、任意のアミノ酸を示し、「−」は、例えば、20の天然起源アミノ酸のいずれかである、任意のアミノ酸または不在を示す。
図8)N.メニンジチディスのCas9をコードする核酸配列を示す(配列番号303)。「R」によって示される配列はSV40NLSであり;「G」として示される配列はHAタグであり;かつ「O」によって示される配列は、合成NLS配列である。残りの(印のない)配列は、読み取り枠(ORF)である。
図9A)Cas9(認識(REC)およびヌクレアーゼ(NUC)ローブ)の2つのローブに関して、S.ピオゲネスCas9のドメイン構成、およびアミノ酸位置を含めたCas9ドメインの構成を描写する概略図を示す。
図9B)83 Cas9オルソログ全体にわたる各ドメインパーセント相同性と共に、S.ピオゲネスCas9ドメイン構成を描写する概略図を示す。
図10A)二重鎖構造としてS.ピオゲネスに部分的に由来する、単分子gRNA分子の代表的構造を示す(配列番号40)。
図10B)二重鎖構造としてS.アウレウスに部分的に由来する、単分子gRNA分子の代表的構造を示す(配列番号41)。
図11)S.アウレウスCas9を使用して、293細胞中のTRBC遺伝子に対して生成された、gRNAの活性を評価する実験からの結果を示す。293は、1つはS.アウレウスCas9をコードし、もう1つは記載されたgRNAをコードする、2つのプラスミド形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムDNA上で実施されたT7E1アッセイから計算された、各gRNAについてTRBC2遺伝子座で観察された、平均%NHEJを要約する。
図12)S.ピオゲネスCas9を使用して、293細胞中のTRBC遺伝子に対して生成された、gRNAの活性を評価する実験からの結果を示す。293細胞は、1つはS.ピオゲネスCas9をコードし、もう1つは記載されたgRNAをコードする、2つのプラスミドで形質移入された。グラフは、二連サンプルから単離されたゲノムDNA上で実施されたT7E1アッセイから計算された、各gRNAについてTRBC1およびTRBC2遺伝子座の双方で観察された平均%NHEJを示す。
図13)S.アウレウスCas9を使用して、293細胞中のTRAC遺伝子に対して生成された、gRNAの活性を評価する実験からの結果を示す。293細胞は、1つはS.アウレウスCas9をコードし、もう1つは記載されたgRNAをコードする、2つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムDNA上で実施されたT7E1アッセイから計算された、各gRNAについてTRAC遺伝子座で観察された、平均%NHEJを示す。
図14)S.ピオゲネスCas9を使用して、293細胞中のTRAC遺伝子に対して生成された、gRNAの活性を評価する実験からの結果を示す。293細胞は、1つはS.ピオゲネスCas9をコードし、もう1つは記載されたgRNAをコードする、2つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムDNA上で実施されたT7E1アッセイから計算された、各gRNAについてTRAC遺伝子座で観察された、平均%NHEJを示す。
図15)S.アウレウスCas9を使用して、293細胞中のPDCD1遺伝子に対して生成された、gRNAの活性を評価する実験からの結果を示す。293細胞は、1つはS.アウレウスCas9をコードし、もう1つは記載されたgRNAをコードする、2つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムDNA上で実施されたT7E1アッセイから計算された、各gRNAについてPDCD1遺伝子座で観察された、平均%NHEJを示す。
図16)S.ピオゲネスCas9を使用して、293細胞中のPDCD1遺伝子に対して生成された、gRNAの活性を評価する実験からの結果を示す。293細胞は、1つはS.ピオゲネスCas9をコードし、もう1つは記載されたgRNAをコードする、2つのプラスミドで形質移入された。グラフは、複製サンプルから単離されたゲノムDNA上で実施されたT7E1アッセイから計算された、各gRNAについてPDCD1遺伝子座で観察された、平均%NHEJを示す。
図17A−C)S.ピオゲネスCas9mRNAおよびTRBCおよびTRAC遺伝子特異的gRNAの送達に起因する、CD4+T細胞内のCD3発現の喪失を示す結果を描写する。
図17A)S.ピオゲネスCas9 mRNAおよび示されるgRNA

で電気穿孔され、APC−CD3抗体で染色され、FACS分析された、CD4+T細胞を示す。細胞は、電気穿孔の2日および3日後に分析された。
図17B)(A)のプロットのからのCD3陰性集団の定量化を示す。
図17C)TRBC2およびTRAC遺伝子座で実施されたT7E1アッセイから得られた%NHEJを示す。
図18A−C)TRAC遺伝子をターゲティングするS.アウレウスCas9/gRNA RNPの送達に起因する、Jurkat T細胞内のCD3発現の喪失を示す結果を描写する。
図18A)TRAC遺伝子をターゲティングするS.アウレウスCas9/gRNATRAC−233

RNPで電気穿孔され、APC−CD3抗体で染色され、FACSによって分析された、Jurkat T細胞を示す。細胞は、電気穿孔の1日、2日、および3日後に分析された。
図18B)(A)のプロットのからのCD3陰性集団の定量化を示す。
図18C)TRAC遺伝子座で実施されたT7E1アッセイ%から得られたNHEJを示す。
図19)5’ ARCAキャップの構造を示す。
図20)Cas9mRNAおよびAAVS1 gRNAでの電気穿孔後における、生存Jurkat T細胞の定量化からの結果を描写する。Jurkat T細胞は、S.ピオゲネスCas9 mRNAおよびそれぞれの修飾gRNAで電気穿孔された。電気穿孔の24時間後、1×105個の細胞は、FITCコンジュゲートアネキシン特異的抗体によって室温で15分間染色され、フローサイトメトリーによる分析直前ヨウ化プロピジウムによる染色がそれに続いた。アネキシンVまたはPIのいずれでも染色されなかった細胞の百分率が、棒グラフ報告される。
図21A−C)TRACをターゲティングするS.アウレウスCas9/gRNARNPの送達に起因する、未感作CD3+T細胞中のCD3発現の喪失を描写する。
図21A)(ターゲティングドメイン

があるS.アウレウスCas9/gRNAで電気穿孔された未感作CD3+T細胞を描写し、TRACをターゲティングするRNPはAPC−CD3抗体で染色され、FACSによって分析された。細胞は、電気穿孔の4日後に分析された。陰性対照は、ターゲティングドメイン

のあるgRNAがあり、機能性Cas9がない細胞である。
図21B図21AのプロットからのCD3陰性集団の定量化を描写する。
図21C)TRAC遺伝子座で実施されたT7E1アッセイ%から得られたNHEJを描写する。
図22)(ターゲティングドメイン

がある)S.ピオゲネスCas9 mRNAおよびPDCD1 gRNA、またはPDCD1をターゲティングする(ターゲティングドメイン

がある)S.ピオゲネスCas9/gRNARNPの送達後のJurkat T細胞のPDCD1遺伝子座におけるゲノム編集を描写する。24、48、および72時間目にPDCD1遺伝子座で実施されたT7E1アッセイから得られた、%NHEJの定量化。特許請求される例示的標的gRNA(配列番号508)を用いて、より高レベルの%NHEJがRNP対mRNA送達で検出された)。
図23)PDCD1遺伝子座をターゲティングする異なる標識gRNAを含んでなる、Cas9/gRNA RNPを有する初代T細胞の電気穿孔に続く、PD−1表面発現について陰性である細胞の百分率を示す。
図24A)S.ピオゲネスCas9/gRNA RNPターゲティングPDCD1の送達後の、活性化初代T細胞におけるPDCD1遺伝子座のゲノム編集を示す。複数の健常ドナーから単離された初代CD4T細胞が同一RNPで処理され、再活性化後に、フローサイトメトリーによってPDCD1発現が評価された。複数の実験からのPDCD1陰性細胞の百分率の平均がプロットされ、標準偏差エラーバーで示される。
図24B)PDCD1遺伝子座または対照AAVS1遺伝子座をターゲティングする異なる標識gRNAを含んでなるCas9/gRNA RNPによる電気穿孔に続く、初代CD4+T細胞におけるCD4およびPD−1の表面発現を示す。
図25)PDCD1遺伝子座または対照AAVS1遺伝子座をターゲティングする異なる標識gRNAを含んでなるCas9/gRNA RNPによる電気穿孔に続く、初代CD8+T細胞におけるCD45RAおよびCD62Lの表面発現を示す。
(図126)Cas9/gRNA RNPターゲティングPDCD1遺伝子座(PD−1KO)、Cas9/gRNA RNPターゲティングAAVS1対照(AAVS1−KO)または未処理対照による電気穿孔に続いて、抗CD19 CARまたはモック形質導入対照(モック)で形質導入されたCD8+またはCD4+T細胞上における、抗CD19キメラ抗原受容体(CAR)発現のPD−1および代理マーカー(EGFRt)の表面発現を示す。
(図27A−27B)Cas9/gRNA RNPターゲティングPDCD1遺伝子座(PD−1KO)またはCas9/gRNA RNPターゲティングAAVS1対照(AAVS1−KO)による電気穿孔に続いて、抗CD19 CAR(CAR)またはモック形質導入対照(モック)で形質導入された、CD8+(図27A)またはCD4+(図27B)T細胞のT細胞表面マーカー発現の平均蛍光強度MFI)を示す。表面マーカーCD45RA、CD69、41BB、CCR7、CD27、CD25、CD62L、TIM3、およびCD45ROのMFIが示される。
図28A)Cas9/gRNA RNPターゲティングPDCD1遺伝子座(PD−1KO)またはCas9/gRNA RNPターゲティングAAVS1対照(AAVS1−KO)による電気穿孔に続いて、抗CD19 CAR(CAR+)またはモック形質導入対照(モック)で形質導入されたT細胞におけるPDCD1遺伝子座にインデルを含有する細胞の百分率を示す。
図28B)使用されたPDCD1 gRNAと比較した、各配置の欠失または挿入を含有するMiSeq配列解析からの読み取り相対数を示す。ガイドRNAの位置は、x軸の60位の周囲の太い垂直線として示される。
図29)抗CD19 CAR(CAR+)またはモック形質導入対照(モック)で形質導入され、Cas9/gRNA RNPターゲティングPDCD1遺伝子座またはCas9/gRNA RNPターゲティングAAVS1対照で電気穿孔された、初代CD8+およびCD4+T細胞のT細胞増殖を示す。T細胞増殖は、CellTrace(登録商標バイオレットを用いて測定されたCD19発現細胞またはROR−1発現対照細胞との共培養の後に評価された。
図30A−C)CD19発現細胞またはROR−1発現対照細胞との共培養に続いて、抗CD19 CAR(CAR+)またはモック形質導入対照(モック)で形質導入され、Cas9/gRNA RNPターゲティングPDCD1遺伝子座またはCas9/gRNA RNPターゲティングAAVS1対照で電気穿孔された、初代T細胞の細胞上清中のサイトカイン分泌を示す。図30Aは、細胞上清中のIFN−γを示す。図30Bは、細胞上清中のインターロイキン−2(IL−2)分泌を示す。図30Cは、細胞上清中の腫瘍壊死因子α(TNF−α)分泌を示す。
図31)S.ピオゲネスD10AまたはN863AニッカーゼRNPのどちらかのペアで処理された活性化CD4T細胞を示す。PMA/IOによる再刺激の後に、PDCD1の発現が、PEコンジュゲート抗PDCD1抗体を使用したフローサイトメトリーによって評価された。PDCD1陰性細胞の百分率は、二連のサンプルの標準偏差を指すエラーバーを有するグラフで表示される。サンプル25および26は、陰性対照の役割を果たす、単一のgRNAを有するD10AおよびN863Aである一方で、サンプル27は、陽性対照の役割を果たす、単一のgRNAを有する野生型Cas9である。

0105

詳細な説明
I.組換え受容体を発現する細胞における、PD−1ノックアウトのターゲティング
遺伝子組換えまたは操作されたT細胞受容体(TCR)および/またはキメラ抗原受容体(CAR)などの組換え受容体を発現する、T細胞およびNK細胞などの免疫細胞をはじめとする、細胞および細胞組成物が提供される。細胞は、概して、このような組換え受容体またはその産物をコードする1つまたは複数の核酸分子を導入することによって、操作される。このような組換え受容体としては、遺伝子操作されたTCRおよび機能性非TCR抗原受容体、キメラ抗原受容体(CAR)など、活性化、刺激、および共刺激CARおよびそれらの組み合わせなどの操作された抗原受容体が挙げられる。提供された細胞はまた、プログラム死−1(PD−1)ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を有する。このような遺伝子操作された細胞を生成する方法もまた提供される。いくつかの実施形態では、細胞および組成物は、例えば養子免疫療法などの養子細胞療法で使用され得る。

0106

いくつかの実施形態では、提供された細胞、組成物および方法は、プログラム死−1(PD−1)とそのリガンドPD−L1の間の阻害相互作用関与する、T細胞阻害経路またはシグナルの効果を改変しまたは減少させる。いくつかの実施形態では、共刺激阻害受容体またはそのリガンドの片方または双方の上方制御および/または発現は、T細胞活性化およびT細胞機能を負に制御し得る。PD−1(コード核酸配列が配列番号51207および51208にそれぞれ記載される例示的アミノ酸)は、B7:CD28共刺激分子ファミリーに属する免疫阻害受容体であり、そのリガンドPD−L1およびPD−L2と反応してT細胞機能を阻害する。PD−L1(コード核酸配列が配列番号51209および51210にそれぞれ記載される例示的アミノ酸;GenBank受入番号AF233516もまた参照されたい)は、抗原提示細胞またはがん細胞上で発現されることが主に報告されており、T細胞発現PD−1と相互作用してT細胞活性化を阻害する。場合によっては、PD−L1はT細胞上で発現されることもまた報告されている。場合によっては、PD−1とPD−L1との相互作用は、細胞傷害性T細胞の活性を抑制し、いくつかの態様では、腫瘍免疫を阻害して腫瘍細胞に免疫逃避を提供し得る。いくつかの実施形態では、T細胞上および/または腫瘍微小環境中のPD−1およびPD−L1の発現は、養子T細胞療法の効力および有効性を減少させ得る。

0107

したがって、いくつかの実施形態では、このような阻害経路は、養子細胞療法の文脈で、特定の望ましいエフェクター機能を別の様式で損なう場合がある。腫瘍微小環境中の腫瘍細胞および/または細胞は、PD−1のリガンド(PD−L1およびPD−L2など)を頻繁に上方制御し、それは次に、PD−1を発現する腫瘍特異的T細胞へのPD−1リガンドのライゲーションをもたらし、阻害シグナルを送達する。PD−1はまた、腫瘍微小環境におけるT細胞、例えば、腫瘍浸潤T細胞上で上方制御されることが多く、それは、例えば、抗原受容体または特定のその他の活性化シグナルを通じたシグナル伝達の後に起こり得る。

0108

場合によっては、このような事象は、PD−L1を発現する他の細胞と近接して存在する場合などに、遺伝子操作された(例えば、CAR+)T細胞が枯渇した表現型を獲得することに寄与し得て、それは次に機能性の減少をもたらし得る。T細胞の枯渇は、T細胞機能の進行性喪失および/または細胞の枯渇をもたらし得る(Yi et al.(2010)Immunology,129:474−481)。T細胞枯渇および/またはT細胞持続の欠如は、養子細胞療法の有効性および治療転帰に対する障壁であり;臨床試験は、より大きなおよび/またはより長い抗原受容体(例えば、CAR)発現細胞への曝露と、治療転帰との間の相関関係を明らかにしている。

0109

特定の方法は、PD−1シグナル伝達を遮断すること、またはがん治療の文脈をはじめとする、T細胞におけるPD−1発現を破壊することを目的としている。このような遮断または破壊は、遮断抗体、小分子、または阻害的ペプチドの投与によるものであってもよく、またはT細胞における、例えば養子移入されたT細胞における、PD−1の発現のノックアウトまたは減少によるものであってもよい。しかし、移入されたT細胞におけるPD−1の破壊は、完全に満足できるものでないこともある。場合によっては、PD−1をコードする遺伝子の破壊が永続的でないこともあり、その結果、細胞表面のPD−1発現の消失は一時的に過ぎない。その他の態様では、細胞における遺伝子破壊の効率は十分に高くはなく、その結果、破壊の対象となる比較的多数の細胞が、標的遺伝子の発現を保持する。場合によっては、CRISPR/Cas9を使用するなどの特定の破壊方法は、限定的な切断特異性が1つまたは複数の非標的遺伝子の非特異的破壊をもたらすこともあるために、オフターゲット効果をもたらし得る。場合によっては、このような問題は、その中で遺伝子(例えば、PD−1)の破壊が望まれる、操作された細胞の有効性を制限し得る。

0110

いくつかの実施形態では、提供される細胞、組成物、および方法は、免疫細胞(例えば、T細胞)におけるPDCD1の発現の減少、欠失、消失、ノックアウトまたは破壊をもたらす。いくつかの態様では、破壊は遺伝子編集によって実施され、例えば、RNA誘導ヌクレアーゼを使用するなどして、PD−1遺伝子(PDCD1)に特異的なCRISPR−Cas9システムなどのクラスター化等間隔短鎖回文構造核酸(CRISPR)−Casシステムなどが破壊される。いくつかの実施形態では、PDCD1遺伝子座の領域をターゲティングするターゲティングドメインを含有するCas9とガイドRNA(gRNA)とを含有する作用物質が、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、作用物質は、PDCD1ターゲティングされるターゲティングドメインを含有するCas9とgRNAとのリボ核タンパク質(RNP)複合体(Cas9/gRNA RNP)であるか、またはそれを含んでなる。いくつかの実施形態では、導入は、インビトロで作用物質またはその一部を細胞と接触させることを含み、それは、細胞と作用物質を24、36または48時間または3、4、5、6、7、または8日間に至るまで、培養またはインキュベートすることを含み得る。いくつかの実施形態では、導入は、作用物質の細胞への送達を行うことをさらに含み得る。様々な実施形態では、本開示による方法、組成物、および細胞は、例えば電気穿孔による、Cas9とgRNAとのリボ核タンパク質(RNP)複合体の細胞への直接送達を利用する。いくつかの実施形態では、RNP複合体は、3’ポリAテールおよび5’アンチリバースキャップ類似体(ARCA)キャップを含むように改変されたgRNAを含む。場合によっては、改変される細胞の電気穿孔は、細胞の電気穿孔に続いて播種の前に、例えば32℃で、細胞に低温ショックを与えることを含む。

0111

いくつかの実施形態では、作用物質を細胞と接触させる前、最中または後に、および/または送達(例えば、電気穿孔)を行う前、その最中または後に、提供される方法は、細胞をサイトカイン、刺激剤および/または免疫細胞(例えば、T細胞)の増殖を誘導できる作用物質の存在下でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は、CD3に特異的な抗体であるかまたはCD28に特異的な抗体であるまたはそれを含んでなる刺激剤、および/またはサイトカインの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は、IL−2、IL−7、およびIL−15の1つまたは複数などのサイトカインの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、24時間、36時間または48時間または3、4、5、6、7または8日間に至るなどの、電気穿孔の前後の8日間時間に至る。いくつかの実施形態では、刺激剤(例えば、抗CD3/抗CD28)および/またはサイトカイン(例えば、IL−2、IL−7および/またはIL−15)の存在下のインキュベーションは、電気穿孔の前の24時間、25時間または48時間に至る。

0112

いくつかの態様では、提供される組成物および方法は、PDCD1遺伝子のノックアウトまたは遺伝子破壊のための作用物質(例えば、gRNA/Cas9)が導入される、細胞組成物中の細胞の少なくとも約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%、または約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%より多くは、遺伝子破壊を含有し;内因性PD−1ポリペプチドを発現せず;隣接PDCD1遺伝子、PDCD1遺伝子、および/または機能性PDCD1遺伝子を含有しないものを含む。いくつかの実施形態では、本開示による方法、組成物および細胞は、PDCD1遺伝子のノックアウトまたは遺伝子破壊のための作用物質(例えば、gRNA/Cas9)が導入される、細胞組成物中の細胞の少なくとも約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%、または約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%より多くにおいて、細胞表面などでPD−1ポリペプチドを発現しないものを含む。いくつかの実施形態では、PDCD1遺伝子のノックアウトまたは遺伝子破壊のための作用物質(例えば、gRNA/Cas9)が導入される、細胞組成物中の細胞の少なくとも約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%、または約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%より多くにおいて、双方の対立遺伝子がノックアウトされており、すなわち、このような百分率の細胞が二対立遺伝子欠失を含んでなる。

0113

いくつかの実施形態では、PDCD1遺伝子のノックアウトまたは遺伝子破壊のための作用物質(例えば、gRNA/Cas9)が導入されている細胞組成物の細胞において、PDCD1遺伝子またはその近く(例えば、切断部位の上流または下流の100または約100塩基対内、50または約50塩基対内、または25または約25塩基対内、または10または約10塩基対内)におけるCas9媒介切断効率(%インデル)が、少なくとも約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%以上である、組成物および方法が提供される。いくつかの実施形態では、PDCD1遺伝子のノックアウトまたは遺伝子破壊のための作用物質(例えば、gRNA/Cas9)が導入されている細胞組成物の細胞の少なくとも約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%以上において、免疫チェックポイント分子PD−1を介して送達されるシグナルの低下または破壊をもたらす、細胞、組成物、および方法が提供される。

0114

いくつかの実施形態では、組換え受容体で操作された細胞を含んでなり、PD−1発現の減少、欠失、消失、ノックアウトまたは破壊(例えば、PDCD1遺伝子の遺伝子破壊)を含んでなる、提供される開示による組成物は、同一条件下で評価された場合に、組換え受容体で操作されているが、PDCD1遺伝子の遺伝子破壊を含まずまたはPD−1ポリペプチドを発現しない、対応組成物または参照組成物の操作された細胞中で発現される組換え受容体と比較して、組換え受容体(例えば、CAR)の機能特性または活性を保持する。いくつかの実施形態では、組換え受容体(例えば、CAR)は、抗原に対する特異的結合を保持する。いくつかの実施形態では、組換え受容体(例えば、CAR)は、抗原結合時に、活性化または刺激性活性を保持して、細胞における細胞傷害性、増殖、生存またはサイトカイン分泌を誘導する。いくつかの実施形態では、提供される組成物の操作された細胞は、同一条件下で評価された場合に、組換え受容体で操作されているが、PDCD1遺伝子の遺伝子破壊を含まずまたはPD−1ポリペプチドを発現しない、操作された細胞を含んでなる対応組成物または参照組成物と比較して、機能特性または活性を保持する。いくつかの実施形態では、細胞は、このような対応組成物または参照組成物と比較して、細胞傷害性、増殖、生存またはサイトカイン分泌を保持する。

0115

いくつかの実施形態では、組成物中の細胞は、同一条件下で評価された場合に、対応組成物または参照組成物中の細胞の表現型と比較して、免疫細胞または細胞の表現型を保持する。いくつかの実施形態では、組成物中の細胞としては、未感作細胞、エフェクターメモリー細胞、セントラルメモリー細胞、セントラルメモリー幹細胞、エフェクターメモリー細胞、および長寿命エフェクターメモリー細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、T細胞の、または組換え受容体(例えば、CAR)を発現して、非活性の長寿命メモリーまたはセントラルメモリー表現型を示すPDCD1遺伝子の遺伝子破壊を含んでなるT細胞の百分率は、組換え受容体で操作されているが、遺伝子破壊を含有せずまたはPD−1ポリペプチドを発現しない細胞の対応または参照集団または組成物と、同一または実質的に同一である。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、組換え受容体(例えば、CAR)と、CCR7+、4−1BB+(CD137+)、TIM3+、CD27+、CD62L+、CD127+、CD45RA+、CD45RO−、t−betlow、IL−7Ra+、CD95+、IL−2Rβ+、CXCR3+またはLFA−1+から選択される1つまたは複数の表現型マーカーとを含んでなる、T細胞を含んでなる。

0116

いくつかの実施形態では、このような特性、活性または表現型は、抗原、抗原発現細胞、および/または抗原−受容体活性化物質の存在下における、細胞のインキュベーションなどによってインビトロアッセイにおいて測定され得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、37℃±2℃または約37℃±2℃で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、最大で12、24、36、48または60時間まで、または約12、24、36、48または60時間までであり得て、任意選択的に、1種または複数種のサイトカイン(例えば、IL−2、IL−15および/またはIL−17)の存在下で行われ得る。いくつかの実施形態では、評価される活性、特性または表現型のいずれかは、電気穿孔、またはその他の作用物質導入に続いて、3、4、5、6、7日後までなどの様々な日数で評価され得る。いくつかの実施形態では、このような活性、特性または表現型は、同一条件下で評価された場合に、組換え受容体で操作されているが、PDCD1遺伝子の遺伝子破壊を含まない細胞を含有する対応組成物の活性と比較して、組成物中の細胞の少なくとも80%、85%、90%、95%または100%によって保持される。

0117

本明細書の用法では、「対応組成物」または「対応細胞集団」(「参照組成物」または「参照細胞集団」とも称される)への言及は、同一または実質的に同一条件下で得られ、単離され、作製され、生成されおよび/またはインキュベーションされた、T細胞または細胞を指すが、ただし、T細胞またはT細胞の集団に作用物質は導入されなかった。いくつかの態様では、作用物質の導入を含有しないこと以外は、このような細胞またはT細胞は、作用物質が導入されているT細胞または細胞と完全に同じようにまたは実質的に完全に同じように処理されており、その結果、作用物質の導入以外は、阻害分子の上方制御または発現をはじめとする、細胞の活性または特性に影響を及ぼし得るいかなる1つまたは複数の条件も細胞間で変化せず、または実質的に変化しない。例えば、1つまたは複数の阻害分子(例えば、PD−1)の発現の減少および/または上方制御の阻害を評価する目的で、作用物質の導入を含むT細胞および作用物質の導入を含まないT細胞が、T細胞において1つまたは複数の阻害分子の発現および/または上方制御を導くことが知られている同じ条件下でインキュベートされる。

0118

PD−1などの阻害分子をはじめとするT細胞マーカーの発現および/またはレベルを評価するための方法および技術は、当技術分野で公知である。このようなマーカーの検出のための抗体および試薬は、当技術分野において周知であり、容易に入手可能である。このようなマーカーを検出するためのアッセイおよび方法としては、細胞内フローサイトメトリーなどのフローサイトメトリー、ELISA、ELISPOT、サイトメトリビーズアレイまたはその他の多重法、ウエスタンブロットおよびその他の免疫親和性に基づく方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、抗原受容体(例えば、CAR)発現細胞は、フローサイトメトリーまたはこのような細胞に特有のマーカーの発現のためのその他の免疫親和性に基づく方法によって検出され得て、次にこのような細胞は、阻害性分子(例えば、PD−1)などの別の1つまたは複数のT細胞表面マーカーについて共染色され得る。いくつかの実施形態では、抗原受容体(例えば、CAR)を発現するT細胞が生成され得て、非免疫原性選択エピトープとして切断型EGFR(EGFRt)を含有し、次にそれは、このような細胞を検出するためのマーカーとして使用され得る(例えば、米国特許第8,802,374号明細書を参照されたい)。

0119

いくつかの実施形態では、細胞、組成物、および方法は、養子移入される免疫細胞(例えば、T細胞)において、PD−1の欠失、ノックアウト、破壊、または発現の減少を提供する(CARまたは遺伝子組換えTCRを発現するように操作された細胞など)。いくつかの実施形態では、方法は、対象来の初代免疫細胞(例えば、T細胞)などの初代細胞上で、エクスビボで実施される。いくつかの態様では、このような遺伝子操作されたT細胞を生成または作製する方法は、免疫細胞(例えば、T細胞)を含有する細胞集団に、組換え受容体(例えば、CAR)をコードする1つまたは複数の核酸と、免疫阻害分子PD−1をコードする遺伝子を破壊できる1つまたは複数の作用物質とを導入することを含む。

0120

本明細書の用法では、「導入する」という用語は、インビトロまたはインビボのどちらかで、細胞にDNAを導入する様々な方法を包含し、このような方法としては形質転換、形質導入、形質移入(例えば、電気穿孔)、および感染が挙げられる。ベクターは、分子をコードするDNAを細胞に導入するのに有用である。可能なベクターとしては、プラスミドベクターおよびウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクターなどのその他のベクターが挙げられる。

0121

T細胞を含有する細胞集団は、末梢血単核細胞(PBMC)サンプル、未分画T細胞サンプルリンパ球サンプル、白血球細胞サンプル、アフェレーシス生成物、または白血球除去生成物から得られるものなどの、対象から得られる細胞であり得る。いくつかの実施形態では、T細胞は、正または負の選択および富化方法を用いて分離または選択され、集団中のT細胞が富化され得る。いくつかの実施形態では、集団は、CD4+、CD8+、またはCD4+およびCD8+T細胞を含有する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体をコードする核酸を導入する工程、および作用物質(例えば、Cas9/gRNA RNP)を導入する工程は、任意の順序で同時にまたは順次実施され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体(例えば、CAR)および1つまたは複数の作用物質(例えば、Cas9/gRNA RNP)の導入後、細胞は、細胞の拡張および/または増殖を刺激する条件下で、培養またはインキュベートされる。

0122

したがって、経時的に持続性または転写された細胞への曝露を維持する一方で、投与される遺伝子操作された(例えば、CAR+)細胞の活性および効力を増加させることなどによって、改善された有効性を提供することをはじめとする、養子細胞療法においてT細胞などの免疫細胞機能を強化する細胞、組成物、および方法が提供される。いくつかの実施形態では、CAR発現T細胞などの遺伝子操作された細胞は、特定の利用可能な方法と比較して、対象にインビボで投与された場合に、増大した拡張および/または持続性を示す。

0123

いくつかの実施形態では、CAR発現細胞などの組換え受容体発現細胞を含有する提供される組成物は、インビボで対象に投与されると持続性が増大する。いくつかの実施形態では、投与に際して、対象におけるCAR発現T細胞などの遺伝子操作された細胞の持続性は、PD−1をコードする遺伝子の発現を減少させまたは妨害する作用物質と共にT細胞が導入されない方法によって遺伝子操作された細胞の投与を伴うものなどの代替的方法によって得られるものと比較して、より大きい。いくつかの実施形態では、持続性は、少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、またはそれ以上、または少なくとも約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、またはそれ以上である。

0124

いくつかの実施形態では、投与された細胞の持続性の程度または規模は、対照への投与後に検出または定量され得る。例えば、いくつかの態様では、定量PCR(qPCR)を用いて、対象の血液または血清または臓器または組織(例えば、疾患部位)中の組換え受容体を発現する細胞(例えば、CAR発現細胞)の量が評価される。いくつかの態様では、持続性は、1マイクログラムのDNA当たりの、例えばCARなどの受容体をコードするDNAまたはプラスミドのコピーとして、または例えば血液または血清などの1マイクロリットルのサンプル当たりの、または1マイクロリットルのサンプル当たりの末梢血単核細胞(PBMC)または白血球細胞またはT細胞の総数当たりの、例えばCAR発現細胞などの細胞受容体を発現する細胞数として、定量化される。いくつかの実施形態では、受容体に特異的な抗体を一般に使用して受容体を発現する細胞を検出する、フローサイトメトリーアッセイもまた実施され得る。細胞ベースのアッセイもまた使用されてもよく、例えば、疾患または病状を有する細胞、または受容体によって認識される抗原を発現する細胞に対する、細胞傷害性応答などの応答を結合および/または中和および/または誘導できる細胞などの、機能性細胞の数または百分率が検出される。このような実施形態のいずれかでは、組換え受容体に関連する別のマーカー(例えば、CAR発現細胞)の発現の程度またはレベルが、投与された細胞を対象の内因性細胞と区別するために使用され得る。

0125

がん治療の養子療法などにおける、細胞の方法および使用もまた提供される。また、細胞を操作し調製し生成する方法、細胞を含有する組成物、および細胞を生成し投与するための細胞を含有するキットおよび装置もまた提供される。操作された細胞を生成するための方法、化合物、および組成物もまた提供される。細胞単離、遺伝子操作、および遺伝子破壊のための方法が提供される。例えば、遺伝子操作された抗原受容体をコードする、および/または破壊をもたらす作用物質をコードする、ウイルスベクターなどのコンストラクトなどの核酸と、このような核酸を形質導入などによって細胞に導入する方法とが提供される。操作された細胞を含有する組成物、そして養子細胞療法などのために細胞および組成物を対象に投与するための方法、キット、および装置もまた提供される。いくつかの態様では、細胞は対象から単離され、操作され、同一対象に投与される。その他の態様では、それらは一対象から単離され、操作され、別の対象に投与される。

0126

II.遺伝子操作された細胞、および組換え受容体を発現する細胞を生成する方法
例えば養子免疫療法などの養子細胞療法のための細胞と、細胞を生成または作製する方法とが提供される。細胞としては、T細胞などの免疫細胞が挙げられる。細胞は、1つまたは複数の遺伝子操作された核酸またはその生成物を導入することによって、一般に操作される。このような生成物としては、遺伝子操作されたT細胞受容体(TCR)および機能性非TCR抗原受容体、キメラ抗原受容体(CAR)などの、活性化、刺激、および共刺激CARおよびそれらの組み合わせなどの操作された抗原受容体が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞はまた、免疫阻害分子PD−1をコードする遺伝子を破壊できる作用物質(例えば、Cas9/gRNA RNP)と共に、遺伝子操作された抗原受容体をコードする核酸と同時にまたはそれに連続して導入される。

0127

いくつかの実施形態では、細胞(例えば、T細胞)は、組換え受容体をコードする核酸分子および/または作用物質(例えば、Cas9/gRNA RNP)の導入前、最中および/または後に、インキュベートまたは培養され得る。いくつかの実施形態では、細胞(例えば、T細胞)は、組換え受容体をコードするウイルスベクター(例えば、レンチウイルスベクター)の細胞への形質導入前、最中または後などの、組換え受容体をコードする核酸分子の導入前、最中または後に、インキュベートまたは培養され得る。いくつかの実施形態では、細胞(例えば、T細胞)は、細胞と作用物質との接触前、最中または後、あるいは例えば電気穿孔を通じた細胞への作用物質送達の前、最中または後などの、作用物質(例えば、Cas9/gRNA RNP)の導入前、最中または後に、インキュベートまたは培養され得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、組換え受容体をコードする核酸分子を導入し、例えばCas9/gRNA RNPなどの作用物質を導入する状況の双方であり得る。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、IL−2、IL−7またはIL−15などのサイトカインの存在下、または抗CD3/抗CD28抗体などの細胞の増殖または活性化を誘導する刺激剤または活性化剤の存在下であり得る。

0128

いくつかの実施形態では、方法は、組換え受容体をコードする核酸分子と、例えばCas9/gRNA RNPなどの作用物質とを導入する前に、細胞を刺激剤または活性化剤(例えば、抗CD3/抗CD28抗体)で活性化または刺激することを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションはまた、IL−2(例えば1U/mL〜500U/mL、10U/mL〜200U/mLなど、例えば少なくとも50U/mLまたは100U/mL、または約50U/mLまたは100U/mL)、IL−7(例えば0.5ng/mL〜50ng/mL、1ng/mL〜20ng/mLなど、例えば少なくとも5ng/mLまたは10ng/mL、または約5ng/mLまたは10ng/mL)またはIL−15(例えば0.1ng/mL〜50ng/mL、0.5ng/mL〜25ng/mLなど、例えば少なくとも1ng/mLまたは5ng/mL、または約1ng/mLまたは5ng/mL)などのサイトカインの存在下でも実施され得る。いくつかの実施形態では、(例えば、形質導入を通じて)組換え受容体をコードする核酸分子を導入する前に、細胞は、24〜48時間または24〜36時間などの、6時間〜96時間にわたってインキュベートされる。

0129

いくつかの実施形態において、例えばCas9/gRNA RNPなどの作用物質の導入は、組換え受容体をコードする核酸分子の導入後である。いくつかの実施形態では、作用物質を導入する前に、例えば、あらゆる刺激剤または活性化剤を除去することによって、細胞を休止させる。いくつかの実施形態では、作用物質を導入する前に、刺激剤または活性化剤および/またはサイトカインが除去されない。

0130

いくつかの実施形態では、核酸分子の導入後、および/または例えばCas9/gRNAなどの作用物質の導入後、細胞は、IL−2(例えば1U/ML〜500U/mL、1U/mL〜100U/mLなど、例えば少なくとも25U/mLまたは50U/mL、または約25U/mLまたは50U/mL)、IL−7(例えば0.5ng/mL〜50ng/mL、1ng/mL〜20ng/mLなど、例えば少なくとも1ng/mLまたは5ng/mL、または約1ng/mLまたは5ng/mL)またはIL−15(例えば0.1ng/mL〜50ng/mL、0.1ng/mL〜10ng/mLなど、例えば少なくとも0.1ng/mL、0.5ng/mLまたは1ng/mL、または約0.1ng/mL、0.5ng/mLまたは1ng/mL)などのサイトカインの存在下で、インキュベート、育成または培養される。

0131

いくつかの実施形態では、工程の任意の部分または工程全体のインキュベーションは、30℃±2℃〜39℃±2℃、例えば、少なくとも30℃±2℃、32℃±2℃、34℃±2℃または37℃±2℃、または少なくとも約30℃±2℃、32℃±2℃、34℃±2℃または37℃±2℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションの少なくとも一部は30℃±2℃であり、インキュベーションの少なくとも一部は、37℃±2℃である。

0132

A.遺伝子操作のための細胞および細胞調製
PD−1ポリペプチドをコードするPDCD1遺伝子の遺伝子編集のための特異的抗原および作用物質(例えば、Cas9/gRNA RNP)に結合する組換え受容体は、多種多様な細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、組換え受容体が操作されおよび/またはPDCD1標的遺伝子がエクスビボで操作され、得られた遺伝子操作された細胞が対象に投与される。エクスビボ操作のための標的細胞起源としては、例えば、対象の血液、対象の臍帯血、または対象の骨髄が挙げられる。エクスビボ操作のための標的細胞の起源としては、例えば、異種供与者血液、臍帯血、または骨髄もまた挙げられる。

0133

いくつかの実施形態では、例えば操作された細胞などの細胞は、例えばヒト細胞などの哺乳類細胞のような真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、血液、骨髄、リンパ液、またはリンパ器官に由来し、例えばリンパ球をはじめとする骨髄性またはリンパ系細胞などの先天または適応免疫細胞などの免疫系細胞であり、典型的にT細胞および/またはNK細胞である。その他の例示的細胞としては、人工多能性幹細胞(iPSC)をはじめとする、多能性および多能性幹細胞などの幹細胞が挙げられる。いくつかの態様では、細胞はヒト細胞である。治療される対象に関して、細胞は、同種異系および/または自己由来であってもよい。細胞は、典型的には、対象から直接単離されたもの、および/または対象から単離され凍結されたものなどの初代細胞である。

0134

いくつかの実施形態では、標的細胞は、例えば、CD8+T細胞(例えば、CD8+未感作T細胞、セントラルメモリーT細胞、またはエフェクターメモリーT細胞)、CD4+T細胞、ナチュラルキラーT細胞NKT細胞)、制御性T細胞(Treg)、幹細胞メモリーT細胞、リンパ系前駆細胞造血幹細胞ナチュラルキラー細胞(NK細胞)または樹状細胞などのT細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、骨髄性細胞マクロファージ好中球、樹状細胞、肥満細胞好酸球、および/または好塩基球などの単球または顆粒球である。一実施形態では、標的細胞は、例えば、対象から生成され、操作されて改変された(例えば、変異誘導された)、または1つまたは複数の標的遺伝子の発現が操作されて、例えば、CD8+T細胞(例えば、CD8+未感作T細胞、セントラルメモリーT細胞、またはエフェクターメモリーT細胞)、CD4+T細胞、幹細胞メモリーT細胞などのT細胞、リンパ系前駆細胞または造血幹細胞に分化した、人工多能性(iPS)細胞などの、iPS細胞、またはiPS細胞に由来する細胞である。

0135

いくつかの実施形態では、細胞は、全T細胞集団、CD4+細胞、CD8+細胞などの、そして機能、活性化状態成熟度、分化可能性、拡張、再循環局在化、および/または持続能力抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の臓器またはコンパートメント中の存在、マーカーまたはサイトカイン分泌プロファイル、および/または分化度によって定義されるその亜集団などの、T細胞またはその他の細胞型の1つまたは複数のサブセットを含む。

0136

T細胞のおよび/またはCD4+および/またはCD8+T細胞の亜型および亜集団としては、未感作T(TN)細胞;エフェクターT細胞(TEFF);メモリーT細胞、および幹細胞メモリーT(TSCM)、セントラルメモリーT(TCM)、エフェクターメモリーT(TEM)、または最終分化エフェクターメモリーT細胞などのその亜型;腫瘍細胞浸潤性リンパ球(TIL);未熟T細胞;成熟T細胞;ヘルパーT細胞;細胞傷害性T細胞;粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞、天然および適応型調節性T(Treg)細胞;TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞などのヘルパーT細胞;α/βT細胞、およびδ/γT細胞が挙げられる。

0137

いくつかの実施形態では、方法は、対象から細胞を単離し、それらを調製、処理、培養、および/または操作することを含む。いくつかの実施形態では、操作された細胞の調製は、1つまたは複数の培養および/または調製工程を含む。記載されるような操作のための細胞は、例えば、対象から得られ、またはそれに由来する、生物学的サンプルなどのサンプルから単離されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞がそれから単離される対象は、疾患または病状を有する、または細胞療法を必要とする、またはそれに対して細胞療法が投与される、対象である。いくつかの実施形態における対象は、そのために細胞が単離され、処理され、および/または操作される養子細胞療法などの特定の治療的介入を必要とするヒトである。

0138

したがって、いくつかの実施形態における細胞は、例えば初代ヒト細胞などの初代細胞である。サンプルとしては、対象から直接採取された、組織、体液、およびその他のサンプル、ならびに分離、遠心分離、遺伝子操作(例えば、ウイルスベクターによる形質導入)、洗浄、および/またはインキュベーションなどの1つまたは複数の処理工程から得られたサンプルが挙げられる。生物学的サンプルは、生物学的起源から直接得られたサンプル、または処理されたサンプルであり得る。生物学的サンプルとしては、それに由来する処理されたサンプルを含めた、血液、血漿、血清、脳脊髄液滑液、尿、およびなどの体液や、組織および臓器サンプルが挙げられるが、これに限定されるものではない。

0139

いくつかの態様では、細胞がそれに由来するまたはそれから単離されるサンプルは、血液であるか、または血液由来サンプルであるか、またはアフェレーシスまたは白血球除去生成物であるか、またはそれに由来する。例示的サンプルとしては、全血、末梢血単核細胞(PBMC)、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節腸関連リンパ系組織、粘膜関連リンパ系組織、脾臓、その他のリンパ系組織、肝臓腸管結腸腎臓膵臓乳房、骨、前立腺子宮頸部精巣卵巣扁桃、またはその他の臓器、および/またはそれに由来する細胞が挙げられる。サンプルには、例えば養子細胞療法などの細胞療法の文脈で、自己由来および同種異系起源のサンプルが含まれる。

0140

いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、T細胞株などの細胞株に由来する。いくつかの実施形態における細胞は、例えば、マウスラット非ヒト霊長類、およびブタなどの異種起源から得られる。

0141

いくつかの実施形態では、細胞の単離は、1つまたは複数の調製および/または非親和性ベース細胞分離の工程を含む。いくつかの例では、細胞は、洗浄、遠心分離、および/または1つ以上の試薬の存在下でインキュベートされ、例えば、望まれない成分が除去され、所望の成分が富化され、特定の試薬に感受性の細胞が溶解または除去される。いくつかの例では、細胞は、密度付着特性、サイズ、感受性および/または特定の成分に対する耐性などの1つまたは複数の特性に基づいて分離される。

0142

いくつかの例では、対象の循環血液に由来する細胞は、例えば、アフェレーシスまたは白血球除去血によって得られる。サンプルは、いくつかの態様では、T細胞、単球、顆粒球、B細胞をはじめとするリンパ球;その他の有核白血球細胞;赤血球および/または血小板を含有し、いくつかの態様では、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。

0143

いくつかの実施形態では、対象から採取された血液細胞は洗浄され、例えば血漿画分が除去されて、後続する処理工程のために、細胞は適切な緩衝液または媒体に入れられる。いくつかの実施形態では、細胞は、リン酸緩衝食塩水PBS)で洗浄される。いくつかの実施形態では、洗浄液は、カルシウムおよび/またはマグネシウムおよび/または多数のまたは全ての二価カチオンを欠いている。いくつかの態様では、洗浄工程は、製造会社の使用説明書に従って、半自動「通過型」遠心分離機(例えば、Cobe 2991 cell processor,Baxter)で達成される。いくつかの態様では、洗浄ステップは、製造会社の使用説明書に従って、接線流濾過(TFF)によって達成される。いくつかの実施形態では、細胞は、洗浄後に、例えばCa++/Mg++非含有PBSなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁される。特定の実施形態では、血液細胞サンプルの成分が除去され、細胞が培地に直接再懸濁される。

0144

いくつかの実施形態では、方法は、赤血球を溶解し、パーコールまたはフィコール勾配により遠心分離することによる、末梢血からの白血球の調製などの密度に基づく細胞分離法を含む。

0145

いくつかの実施形態では、単離法は、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカーまたは核酸などの表面マーカーなどの1つまたは複数の特異的分子の細胞における発現または存在に基づく、異なる細胞型の分離を含む。いくつかの実施形態では、このようなマーカーに基づく分離のための任意の既知の方法が用いられてもよい。いくつかの実施形態では、分離は、親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、単離は、いくつかの態様では、例えば、このようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーションと、一般にそれに続く、洗浄工程、および、抗体または結合パートナーへの結合を有する細胞の抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの分離による、典型的に細胞表面マーカーである、細胞の1つまたは複数のマーカー発現または発現レベルに基づく、細胞および細胞集団の分離を含む。

0146

このような分離工程は、試薬に結合している細胞がさらなる使用のために保持される正の選択、および/または抗体または結合パートナーに結合していない細胞が保持される負の選択に基づき得る。いくつかの例では、双方の画分が、さらなる使用のために保持される。いくつかの態様では、負の選択は、不均一集団中の細胞型を特異的に同定する抗体が利用可能でなく、その結果、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づく分離が最良である場合に、特に有用であり得る。

0147

分離は、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞の100%富化または除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現するものなどの特定タイプの細胞の正の選択または富化は、そのような細胞の数または百分率を増加させることを意味するが、必ずしもマーカーを発現しない細胞が完全に不在である必要はない。同様に、マーカーを発現するものなどの特定タイプの細胞の負の選択、除去または枯渇は、そのような細胞の数または百分率を減少させることを意味するが、必ずしもそのような細胞の全てが完全に除去される必要はない。

0148

いくつかの例では、複数回の分離工程が実施され、1回の工程からの正または負の選択画分が、後続する正または負の選択などの別の分離工程に供される。いくつかの例では、細胞と、それぞれ負の選択の標的となるマーカーに特異的である、複数の抗体または結合パートナーとをインキュベートすることなどによって、単一の分離工程が、複数のマーカーを同時に発現する細胞を枯渇させる得る。同様に、細胞と、様々な細胞型で発現される複数の抗体または結合パートナーとをインキュベートすることによって、複数の細胞型が同時に正に選択され得る。

0149

いくつかの実施形態では、表面マーカーなどの1つまたは複数のT細胞集団は、1つまたは複数の特定のマーカーについて陽性である(marker+)、またはそれを高レベルで発現する(markerhigh)細胞、または1つまたは複数のマーカーについて陰性である(marker−)、またはそれを比較的低レベルで発現する(markerlow)細胞が、富化されておりまたは枯渇している。例えば、いくつかの態様では、例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、および/またはCD45RO+T細胞などの1つまたは複数の表面マーカーについて陽性である、またはそれを高レベルで発現する細胞などのT細胞の特定の亜集団が、正または負の選択技術によって単離される。場合によっては、このようなマーカーは、T細胞の特定の集団(非記憶細胞など)に存在しないかまたは比較的低いレベルで発現されるが、T細胞の特定のその他の集団(記憶細胞など)に比較的より高いレベルで存在しまたは発現されるものである。一実施形態では、細胞(CD8+細胞またはT細胞など、例えばCD3+細胞)は、CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127、および/またはCD62Lについて陽性でありまたはそれを高い表面レベルで発現する細胞が富化されており(すなわち、正に選択される)、および/またはCD45RAについて陽性でありまたはそれを高い表面レベルで発現する細胞が枯渇している(例えば、負に選択される)。いくつかの実施形態では、細胞は、CD122、CD95、CD25、CD27、および/またはIL7−Rα(CD127)について陽性でありまたはそれを高い表面レベルで発現する細胞が、富化されておりまたは枯渇している。いくつかの例では、CD8+T細胞は、CD45ROおよびCD62Lについて陽性(またはCD45RAについて陰性)の細胞が富化されている。

0150

例えば、CD3+、CD28+T細胞は、CD3/CD28コンジュゲート磁気ビーズ(例えば、DYNABEADS(登録商標)M−450CD3/CD28T Cell Expander)を用いて、正に選択され得る。

0151

いくつかの実施形態では、T細胞は、B細胞、単球、またはCD14などのその他の白血球細胞などの非T細胞上で発現される陰性の選択マーカーによって、PBMCサンプルから分離される。いくつかの態様では、CD4+またはCD8+選択工程を使用して、CD4+ヘルパーおよびCD8+細胞傷害性T細胞が分離される。このようなCD4+およびCD8+集団は、1つまたは複数の未感作、メモリー、および/またはエフェクターT細胞亜集団上で発現される、または比較的高い程度で発現される、マーカーに対する正または負の選択によって、亜集団にさらに分類され得る。

0152

いくつかの実施形態では、CD8+細胞は、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく正または負の選択などによって、未感作、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、および/またはセントラルメモリー幹細胞についてさらに富化または枯渇されている。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーT(TCM)細胞の富化が実施されて、投与に続く長期生存、拡張および/または生着を改善するなど、有効性を高め、それはいくつかの態様では、このような亜集団において特に堅固である。Terakura et al.(2012)Blood.1:72−82;Wang et al.(2012)J Immunother.35(9):689−701を参照されたい。いくつかの実施形態では、TCM富化CD8+T細胞とCD4+T細胞とを組み合わせることにより、有効性がさらに増強される。

0153

いくつかの実施形態では、メモリーT細胞は、CD8+末梢血リンパ球のCD62L+およびCD62L−サブセットの双方に存在する。PBMCは、抗CD8および抗CD62L抗体などを使用して、CD62L−CD8+および/またはCD62L+CD8+画分が富化または枯渇され得る。

0154

いくつかの実施形態では、CD4+T細胞集団およびCD8+T細胞亜集団は、例えば、セントラルメモリー(TCM)細胞が富化された亜集団などの。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーT(TCM)細胞の富化は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および/またはCD127の陽性または高度の表面発現に基づき;いくつかの態様では、それは、CD45RAおよび/またはグランザイムBを発現しまたは高度に発現する細胞の負の選択に基づく。いくつかの態様では、TCM細胞富化CD8+集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇、およびCD62Lを発現する細胞の正の選択または富化によって実施される。一態様では、セントラルメモリーT(TCM)細胞の富化は、CD4発現に基づいて選択される細胞の陰性画分から出発して行われ、それはCD14およびCD45RAの発現に基づく負の選択、およびCD62Lに基づく正の選択を受ける。そのような選択は、いくつかの態様では同時に行われ、その他の態様ではいずれかの順序で順次行われる。いくつかの態様では、CD8+細胞集団または亜集団を調製するのに使用されるのと同じCD4発現に基づく選択工程が、CD4+細胞集団または亜集団を作製するのにも使用され、その結果、CD4に基づく分離からの陽性および陰性画分の双方が保持され、任意選択的に1つまたは複数のさらなる正または負の選択工程に続いて、方法の引き続く工程で使用される。

0155

特定の例では、PBMCまたはその他の白血球のサンプルは、CD4+細胞の選択に供され、陰性画分および陽性画分の双方が保持される。次に陰性画分は、CD14およびCD45RAまたはCD19の発現に基づく負の選択、およびCD62LまたはCCR7などのセントラルメモリーT細胞のマーカーに基づく正の選択に供され、正の選択および負の選択はどちらの順序でも実施される。

0156

CD4+Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、未感作、セントラルメモリー、およびエフェクター細胞に分類される。CD4+リンパ球は、標準法によって得られ得る。いくつかの実施形態では、未感作CD4+Tリンパ球は、CD45RO−、CD45RA+、CD62L+、CD4+T細胞である。いくつかの実施形態では、セントラルメモリーCD4+細胞は、CD62L+およびCD45RO+である。いくつかの実施形態では、エフェクターCD4+細胞は、CD62L−およびCD45ROである。

0157

一例では、負の選択によってCD4+細胞を富化するために、モノクローナル抗体合物は、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA−DR、およびCD8に対する抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体または結合パートナーは、磁性ビーズまたは常磁性ビーズのような固体支持体またはマトリックスに結合され、正および/または負の選択について細胞が分離できるようにする。例えば、いくつかの実施形態では、細胞および細胞集団は、免疫磁気(または親和性磁気)分離技術を用いて、分離または単離される(Methodsin Molecular Medicine,vol.58:Metastasis Research Protocols,Vol.2:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,p 17−25 Edited by:S.A.Brooks and U.Schumacher(著作権)Humana Press Inc.,Totowa,NJで概説される)。

0158

いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子操作の前に、またはそれに関連してインキュベートおよび/または培養される。インキュベーション工程は、培養、育成、刺激、活性化、および/または増殖を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物または細胞は、刺激条件または刺激剤の存在下でインキュベートされる。このような条件としては、集団における細胞の増殖、拡張、活性化および/または生存を誘導するために、抗原曝露を模倣するために、および/または組換え抗原受容体の導入などのための遺伝子操作のために細胞を準備するために、設計されたものが挙げられる。

0159

条件としては、1つまたは複数の特定の培地;温度;酸素含有量;二酸化炭素含有量;時間;例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質イオンなどの作用物質;および/またはサイトカインなどの刺激因子ケモカイン;抗原;結合パートナー;融合タンパク質;組換え可溶性受容体;および細胞を活性化するように設計された任意のその他の作用物質が挙げられる。

0160

いくつかの実施形態では、刺激条件または作用物質は、例えばリガンドなどの、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化できる、1つまたは複数の作用物質を含む。いくつかの態様では、作用物質は、T細胞においてTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードを活性化しまたは開始する。このような作用物質は、例えば、ビーズなどの固体支持体に結合した抗CD3や抗CD28などの、TCR成分および/または共刺激受容体に特異的なものなどの抗体、および/または1つまたは複数のサイトカインを含み得る。任意選択的に、この拡張方法は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を培地に(例えば、少なくとも約0.5ng/mlの濃度で)添加する工程をさらに含んでなってもよい。いくつかの実施形態において、刺激剤は、例えば、少なくとも約10単位/mLの濃度のIL−2などの、IL−2および/またはIL−15を含む。

0161

いくつかの態様では、インキュベーションは、Riddellらに付与された米国特許第6,040,177号明細書、Klebanoff et al.(2012)J Immunother.35(9):651−660、Terakura et al.(2012)Blood.1:72−82、および/またはWang et al.(2012)J Immunother.35(9):689−701に記載されるものなどの技術に従って実施される。

0162

いくつかの実施形態では、T細胞は、非分裂末梢血単核細胞(PBMC)などの培養開始組成物支持細胞を(例えば、得られる細胞集団が、拡張される最初の集団中の各Tリンパ球毎に少なくとも約5、10、20、または40個以上のPBMC支持細胞を含有するように)添加すること;および培養物を(例えば、T細胞数を拡張させるのに十分な時間にわたり)インキュベートすることによって拡張される。いくつかの態様では、非分裂支持細胞は、γ照射PBMC支持細胞を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、細胞分裂を防ぐために、PBMCに約3000〜3600ラドの範囲のγ線が照射される。いくつかの態様では、支持細胞は、T細胞集団の添加前に培地に添加される。

0163

いくつかの実施形態では、刺激条件は、例えば、少なくとも約25℃、一般に少なくとも約30℃、および一般に約37℃などのヒトTリンパ球増殖に適した温度を含む。任意選択的に、インキュベーションは、支持細胞として、非分裂型EBV形質転換リンパ芽球様細胞(LCL)を添加することをさらに含んでなってもよい。LCLは、約6000〜10,000ラドの範囲のγ線で照射され得る。LCL支持細胞は、いくつかの態様では、少なくとも約10:1の最初のTリンパ球に対するLCL支持細胞の比率などの任意の適切な量で提供される。

0164

いくつかの実施形態では、調製方法は、単離、インキュベーションおよび/または操作の前または後のいずれかで、細胞を例えば凍結保存するなど、凍結する工程を含む。いくつかの実施形態では、凍結および引き続く解凍工程は、細胞集団中の顆粒球を除去し、単球もある程度は除去する。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、血漿および血小板を除去するための洗浄工程に続いて、凍結溶液中に懸濁される。いくつかの態様では、様々な既知の凍結溶液およびパラメータのいずれかを使用することができる。一例は、20%DMSOおよび8%ヒト血清アルブミンHSA)、または他の適切な細胞凍結媒体を含有するPBSを使用することを伴う。次に、これは、DMSOおよびHSAの最終濃度がそれぞれ10%および4%になるように、媒体で1:1に希釈される。次に、細胞は、一般に毎分1℃の速度で−80℃に凍結され、液体窒素貯蔵タンク気相中に保存される。

0165

いくつかの実施形態では、方法は、操作された細胞を冷凍保存の前または後に、同一患者に再導入することを含む。

0166

B.組換え受容体
いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子操作を通じて導入された組換え受容体をコードする1つまたは複数の核酸と、このような核酸の遺伝子操作された生成物とを含んでなる。いくつかの実施形態では、細胞は、組換え受容体をコードする核酸分子を(例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターの形質導入を通じて)細胞に導入することによって、生成または作製され得る。いくつかの実施形態では、核酸は異種であり、すなわち、通常は細胞に、または細胞から得られたサンプルに存在せず、例えば、通常は操作された細胞に、および/またはこのような細胞が由来する生物に見られない、別の生物または細胞から得られたものなどである。いくつかの実施形態では、核酸は天然に存在せず、複数の異なる細胞型に由来する様々なドメインをコードする核酸のキメラの組み合わせを含んでなるものをはじめとする、天然に見られない核酸などである。

0167

いくつかの実施形態では、標的細胞は、1つまたは複数の腫瘍抗原などの1つまたは複数の標的抗原に結合するように改変されている。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ROR1、B細胞成熟抗原(BCMA)、炭酸脱水酵素9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受容体チロシンキナーゼerbB2)、L1−CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖タンパク質2(EPG−2)、上皮糖タンパク質40(EPG−40)、EPHa2、erb−B2、erb−B3、erb−B4、erbB二量体、EGFRvIII、葉酸結合タンパク質(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎児型アセチルコリン受容体、GD2、GD3、HMW−MAA、IL−22R−α、IL−13R−α2、キナーゼ挿入ドメイン受容体(kdr)、κ軽鎖、ルイスY、L1−細胞接着分子、(L1−CAM)、黒色腫関連抗原(MAGE)−A1、MAGE−A3、MAGE−A6、黒色腫優先発現抗原(PRAME)、サバイビン、TAG72、B7−H6、IL−13受容体α2(IL−13Ra2)、CA9、GD3、HMW−MAA、CD171、G250/CAIX、HLA−AIMAGEAl、HLA−A2NY−ESO−1、PSCA、葉酸受容体−a、CD44v6、CD44v7/8、avb6インテグリン、8H9、NCAM、VEGF受容体、5T4、胎児AchR、NKG2Dリガンド、CD44v6、二重抗原、がん精巣抗原、メソテリン、マウス型CMV、ムチン1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY−ESO−1、MART−1、gp100、がん胎児性抗原(oncofetal antigen)、ROR1、TAG72、VEGF−R2、がん胎児性抗原(carcinoembryonic antigen;CEA)、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c−Met、GD−2、O−アセチル化GD2(OGD2)、CE7、ウィルムス腫瘍1(WT−1)、サイクリン、サイクリンA2、CCL−1、CD138、病原体特異的抗原およびユニバーサル標識に関連する抗原から選択される。いくつかの実施形態では、標的細胞は、例えば、TCRまたはCARなどによって、以下の腫瘍抗原の1つまたは複数に結合するように改変されている。腫瘍抗原としては、AD034、AKT1、BRAP、CAGE、CDX2、CLP、CT−7、CT8/HOM−TES−85、cTAGE−1、フィビュリン−1、HAGE、HCA587/MAGE−C2、hCAP−G、HCE661、HER2/neu、HLA−Cw、HOM−HD−21/ガレクチン9、HOM−MEEL−40/SSX2、HOM−RCC−3.1.3/CAXII、HOXA7、HOXB6、Hu、HUB1、KM−HN−3、KM−KN−1、KOC1、KOC2、KOC3、KOC3、LAGE−1、MAGE−1、MAGE−4a、MPP11、MSLN、NNP−1、NY−BR−1、NY−BR−62、NY−BR−85、NY−CO−37、NY−CO−38、NY−ESO−1、NY−ESO−5、NY−LU−12、NY−REN−10、NY−REN−19/LKB/STK11、NY−REN−21、NY−REN−26/BCR、NY−REN−3/NY−CO−38、NY−REN−33/SNC6、NY−REN−43、NY−REN−65、NY−REN−9、NY−SAR−35、OGFr、PLU−1、Rab38、RBPJκ、RHAMM、SCP1、SCP−1、SSX3、SSX4、SSX5、TOP2A、TOP2B、またはチロシナーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。

0168

1.抗原受容体
a)キメラ抗原受容体(CAR)
細胞は、一般に、例えば、キメラ抗原受容体(CAR)、そして遺伝子組換えT細胞受容体(TCR)のようなその他の抗原結合受容体などの、機能性非TCR抗原受容体をはじめとする、抗原受容体などの組換え受容体を発現する。受容体としては、その他のキメラ受容体も挙げられる。

0169

CARなどの例示的抗原受容体、およびこのような受容体を操作して細胞に導入する方法としては、例えば、国際公開第200014257号パンフレット、国際公開第2013126726号パンフレット、国際公開第2012/129514号パンフレット、国際公開第2014031687号パンフレット、国際公開第2013/166321号パンフレット、国際公開第2013/071154号パンフレット、国際公開第2013/123061号パンフレット、米国特許出願公開第2002131960号明細書、米国特許出願公開第2013287748号明細書、米国特許出願公開第20130149337号明細書、米国特許第6,451,995号明細書、米国特許第7,446,190号明細書、米国特許第8,252,592号明細書、米国特許第8,339,645号明細書、米国特許第8,398,282号明細書、米国特許第7,446,179号明細書、米国特許第6,410,319号明細書、米国特許第7,070,995号明細書、米国特許第7,265,209号明細書、米国特許第7,354,762号明細書、米国特許第7,446,191号明細書、米国特許第8,324,353号明細書、および米国特許第8,479,118号明細書、および欧州特許出願第2537416号明細書に記載されるもの、および/またはSadelain et al.,Cancer Discov.2013 April;3(4):388−398;Davila et al.(2013)PLoS ONE 8(4):e61338;Turtle et al.,Curr.Opin.Immunol.,2012 October;24(5):633−39;Wu et al.,Cancer,2012 March 18(2):160−75によって記載されるものが挙げられる。いくつかの態様では、抗原受容体としては、米国特許第7,446,190号明細書に記載されるようなCAR、および国際公開第2014055668A1号パンフレットに記載されるものが挙げられる。CARの例としては、国際公開第2014031687号パンフレット、米国特許第8,339,645号明細書、米国特許第7,446,179号明細書、米国特許出願公開第2013/0149337号明細書、米国特許第7,446,190号明細書、米国特許第8,389,282号明細書、Kochenderfer et al.,2013, Nature Reviews Clinical Oncology,10,267−276(2013);Wang et al.(2012)J.Immunother.35(9):689−701;およびBrentjens et al.,Sci Transl Med.2013 5(177)などの前述の文献のいずれかで開示されるようなCARが挙げられる。国際公開第2014031687号パンフレット、米国特許第8,339,645号明細書、米国特許第7,446,179号明細書、米国特許第2013/0149337号明細書、米国特許第7,446,190号明細書、および米国特許第8,389,282号明細書もまた参照されたい。CARなどのキメラ受容体は、一般に、例えばscFv抗体フラグメントである、抗体の可変重(VH)鎖領域および/または可変軽(VL)鎖領域のような抗体分子の一部などの細胞外抗原結合ドメインを一般に含む。

0170

いくつかの実施形態では、受容体によってターゲティングされる抗原は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、それは炭水化物またはその他の分子である。いくつかの実施形態では、抗原は、正常細胞または非標的細胞または組織と比較して、例えば腫瘍または病原性細胞などの疾患または病状の細胞上で、選択的に発現されまたは過剰発現される。その他の実施形態では、抗原は、正常細胞上で発現され、および/または操作された細胞上で発現される。

0171

受容体によってターゲティングされてもよい抗原としては、αvβ6インテグリン(avb6インテグリン)、B細胞成熟抗原(BCMA)、B7−H6、炭酸脱水酵素9(CA9;CAIXまたはG250としても知られている)、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B(CTAG;NY−ESO−1およびLAGE−2としても知られている)、がん胎児性抗原(CEA)、サイクリン、サイクリンA2、C−Cモチーフケモカインリガンド1(CCL−1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、上皮成長因子タンパク質(EGFR)、切断型上皮成長因子タンパク質(tEGFR)、III型上皮成長因子受容体変異(EGFRvIII)、上皮糖タンパク質2(EPG−2)、上皮糖タンパク質40(EPG−40)、エフリンB2、エフリン受容体A2(EPHa2)、エストロゲン受容体、Fc受容体様5(FCRL5;Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られている)、胎児アセチルコリン受容体(胎児AchR)、葉酸結合タンパク質(FBP)、葉酸受容体α、胎児アセチルコリン受容体、ガングリオシドGD2、O−アセチル化GD2(OGD2)、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100(gp100)、Her2/neu(受容体チロシンキナーゼerbB2)、Her3(erb−B3)、Her4(erb−B4)、erbB二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原(HMW−MAA)、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1(HLA−AI)、ヒト白血球抗原A2(HLA−A2)、IL−22受容体α(IL−22Ra)、IL−13受容体α2(IL−13Ra2)、キナーゼ挿入ドメイン受容体(kdr)、κ軽鎖、L1細胞接着分子(L1CAM)、L1−CAMのCE7エピトープ、ロイシン富化リピート含有8ファミリーメンバーA(LRRC8A)、ルイスY、黒色腫関連抗原(MAGE)−A1、MAGE−A3、MAGE−A6、メソテリン、c−Met、マウスサイトメガロウイルス(CMV)、ムチン1(MUC1)、MUC16、ナチュラルキラーグループメンバーD(NKG2D)リガンド、メランA(MART−1)、神経細胞接着分子(NCAM)、がん胎児性抗原、黒色腫優先発現抗原(PRAME)、プロゲステロン受容体、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(RORl)、サバイビン、トロホブラスト糖タンパク質(TPBG;5T4としても知られている)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)、血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)、血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)、ウィルムス腫瘍1(WT−1)、および病原体特異的抗原が挙げられるが、これに限定されるものではない。

0172

いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態の受容体によってターゲティングされる抗原としては、オーファンチロシンキナーゼ受容体RORl、tEGFR、Her2、Ll−CAM、CD19、CD20、CD22、メソテリン、CEA、およびB型肝炎表面抗原、抗葉酸受容体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP−2、EGP−4、0EPHa2、ErbB2、3、もしくは4、FBP、胎児型アセチルコリンe受容体、GD2、GD3、HMW−MAA、IL−22R−α、IL−13R−α2、kdr、κ軽鎖、ルイスY、L1−細胞接着分子、MAGE−A1、メソテリン、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2Dリガンド、NY−ESO−1、MART−1、gp100、がん胎児性抗原(oncofetal antigen)、ROR1、TAG72、VEGF−R2、がん胎児性抗原(carcinoembryonic antigen;CEA)、前立腺特異的抗原、PSMA、Her2/neu、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、エフリンB2、CD123、c−Met、GD−2、およびMAGE A3、CE7、ウィルムス腫瘍1(WT−1)、サイクリンA1(CCNA1)などのサイクリン、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCVHBVまたはその他の病原体によって発現される分子が挙げられる。

0173

いくつかの実施形態では、CARは、例えば、CD19、CD20、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、CD171、CEA、ERBB2、GD2、α−葉酸受容体、ルイスY抗原、前立腺特異的膜抗原(PSMA)または腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72)などの腫瘍関連抗原に対する結合特異性を有する。

0174

いくつかの実施形態では、CARは、病原体特異的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、CARは、ウイルス抗原(HIV、HCV、HBVなど)、細菌抗原、および/または寄生性抗原に対して特異的である。

0175

キメラ受容体としては、キメラ抗原受容体(CAR)が挙げられる。CARなどのキメラ受容体は、一般に例えばscFv抗体フラグメントである、抗体の可変重(VH)鎖領域および/または可変軽(VL)鎖領域のような抗体分子の一部などの細胞外抗原結合ドメインを一般に含む。

0176

いくつかの実施形態では、例えばCARなどの組換え受容体の抗体部分は、例えばIgGヒンジ領域のようなヒンジ領域および/またはCH1/CLおよび/またはFc領域などの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態では、定常領域または部分は、IgG4またはIgG1などのヒトIgGである。いくつかの態様では、定常領域の部分は、例えばscFvなどの抗原認識成分と、膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域の役割を果たす。スペーサーは、スペーサーの非存在下と比較して、抗原結合に続く細胞の応答性の増大をもたらす長さであり得る。例えば、ヒンジ領域などの例示的スペーサーとしては、国際公開第2014031687号パンフレットに記載されるものが挙げられる。いくつかの例では、スペーサーは、12アミノ酸長または約12アミノ酸長であるか、または12アミノ酸長以下である。例示的スペーサーとしては、少なくとも約10〜229個のアミノ酸、約10〜200個のアミノ酸、約10〜175個のアミノ酸、約10〜150個のアミノ酸、約10〜125個のアミノ酸、約10〜100個のアミノ酸、約10〜75個のアミノ酸、約10〜50個のアミノ酸、約10〜40個のアミノ酸、約10〜30個のアミノ酸、約10〜20個のアミノ酸、または約10〜15個のアミノ酸、および列挙されたいずれかの範囲の終点の間の任意の整数を有するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、約12個以下のアミノ酸、約119個以下のアミノ酸、または約229個以下のアミノ酸を有する。例示的スペーサーとしては、IgG4ヒンジのみ、CH2およびCH3ドメインに連結したIgG4ヒンジ、またはCH3ドメインに連結したIgG4ヒンジが挙げられる。

0177

例示的スペーサーとしては、Hudecek et al.(2013)Clin.CancerRes.,19:3153または国際公開第2014031687号パンフレットに記載されるものが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列番号51213に記載される配列を有し、配列番号51212に記載される配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列番号51214に記載される配列を有する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列番号51215に記載される配列を有する。いくつかの実施形態では、定常領域または部分はIgDのものである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列番号51216に記載される配列を有する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列番号51213、51214、51215または51216のいずれかと少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。

0178

この抗原認識ドメインは、CARの場合にはTCR複合体などの抗原受容体複合体を通じた活性化を模倣するシグナル伝達成分、および/または別の細胞表面受容体を通じたシグナルなどの1つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に一般に連結している。したがって、いくつかの実施形態では、抗原結合成分(例えば、抗体)は、1つまたは複数の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインに連結している。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞外ドメインに融合する。一実施形態では、例えば、CARなどの受容体中の1つのドメインに天然に結合する、膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、膜貫通ドメインは、このようなドメインと、同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとの結合を避けるために、選択されまたはアミノ酸置換によって修飾されて、受容体複合体のその他の構成員との相互作用が最小化される。

0179

いくつかの実施形態における膜貫通ドメインは、天然または合成起源のどちらかに由来する。起源が天然である場合、いくつかの態様では、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、T細胞受容体のαまたはβまたはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来するものを含む(すなわち少なくともその膜貫通領域を含んでなる)。代案としては、いくつかの実施形態における膜貫通ドメインは、合成される。いくつかの態様では、合成膜貫通ドメインは、主に、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含んでなる。いくつかの態様では、フェニルアラニントリプトファン、およびバリンの三つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端に見いだされるであろう。いくつかの実施形態では、連結は、リンカー、スペーサーおよび/または膜貫通ドメインによるものである。

0180

細胞内シグナル伝達ドメインとしては、天然抗原受容体を通じたシグナル、このような受容体と共刺激受容体との組み合わせと組み合わせを通じたシグナル、および/または共刺激受容体のみを通じたシグナルを模倣または近似するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、例えばグリシンセリン二つ組などのグリシンおよびセリンを含有するものなどの例えば2〜10アミノ酸長のリンカーなどの短いオリゴ−またはポリペプチドリンカーが、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインの間に存在して、連結を形成する。

0181

例えばCARなどの受容体は、一般に、少なくとも1つの細胞内シグナル伝達成分を含む。いくつかの実施形態では、受容体は、例えばCD3ζ鎖などの、T細胞活性化および細胞傷害性を媒介するTCR CD3鎖などの、TCR複合体の細胞内成分を含む。したがって、いくつかの態様では、抗原結合部分は、1つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。いくつかの実施形態では、細胞シグナル伝達モジュールは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、および/またはその他のCD膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、例えばCARなどの受容体は、Fc受容体γ、CD8、CD4、CD25、またはCD16などの1つまたは複数の追加的な分子の一部をさらに含む。例えば、いくつかの態様では、CARまたは他のキメラ受容体は、CD3−ゼータ(CD3−ζ)またはFc受容体γと、CD8、CD4、CD25またはCD16との間のキメラ分子を含む。

0182

いくつかの実施形態では、CARまたはその他のキメラ受容体とのライゲーションに際して、受容体の細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、CARを発現するように操作されたT細胞などの免疫細胞の、正常なエフェクター機能または応答の少なくとも1つを活性化する。例えば、いくつかの状況では、CARは、細胞溶解活性またはサイトカインまたはその他の因子の分泌などのTヘルパー活性などのT細胞の機能を誘導する。いくつかの実施形態では、例えば、それがエフェクター機能シグナルを伝達する場合、抗原受容体成分の細胞内シグナル伝達ドメインのトランケート部分または共刺激分子が、非損傷免疫賦活性鎖の代わりに使用される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞受容体(TCR)の細胞質配列を含み、いくつかの実施形態では、天然の状況においてこのような受容体と協調して作用し抗原受容体結合に続くシグナル伝達を開始する共受容体の細胞質配列、および/またはこのような分子の任意の誘導体または変異型、および/または同一機能的能力を有する任意の合成配列もまた含む。

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