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技術 抗CD73抗体を用いた併用療法

出願人 ブリストル-マイヤーズスクイブカンパニー
発明者 ブライアン・シー・バーンハートアラン・ジェイ・コーマンニルス・ロンバーグアーロン・ピー・ヤムニウクモハン・スリニバサンカーラ・エイ・ヘニングミン・レイエマヌエラ・セガアンジェラ・グッドイナフマリア・ジュア-クンケルグオドン・チェンジョン・エス・サックリチャード・ワイ・ホアンマーティン・ジェイ・コーベットジョセフ・イー・マイヤーズ・ジュニアリアン・シュヴァイツァーサンドラ・ブイ・ハッチャーレイチェル・アルトゥラハイチュン・ホアンピンピン・ジャンエドワード・ジェイ・ヒルトマイケル・ネイサン・ヘドリック
出願日 2017年3月3日 (3年9ヶ月経過) 出願番号 2018-546508
公開日 2019年6月6日 (1年6ヶ月経過) 公開番号 2019-514844
状態 未査定
技術分野 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 突然変異または遺伝子工学 ペプチド又は蛋白質 生物学的材料の調査,分析 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 遮断レベル 信頼性区間 クラス平均 X線解析 交換レベル RP領域 技術移転 検討項目
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年6月6日)のものです。
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図面 (20)

課題・解決手段

抗CD73抗体を、免疫−腫瘍学薬剤、例えば、抗PD−1抗体と組み合わせて使用する、腫瘍(例えば、進行固形腫瘍)の臨床治療のための方法が、提供される。

概要

背景

エクト−5’−ヌクレオチダーゼ(エクト−5’NT、EC 3.1.3.5)としても知られる分化抗原群73(Cluster of Differentiation 73:CD73)は、ほとんどの組織において見出されるが、特に、内皮細胞および造血細胞サブセットにおいて発現される、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合型細胞表面酵素である(Resta et al., Immunol Rev 1998;161:95-109およびColgan et al., Prinergic Signal 2006;2:351-60)。CD73は、細胞外ヌクレオシド一リン酸を、ヌクレオシド、例えばアデノシンにする脱リン酸化触媒することが公知である。アデノシンは、A1、A2A、A2B、およびA3を含む、いくつかの受容体を通じてその生物学的効果を媒介する、広く研究されているシグナル伝達分子である。アデノシンは、多数の癌の増殖および遊走を制御し、抗腫瘍T細胞の制御を通じた免疫抑制効果を有することが示されている(Zhang et al., Cancer Res 2010;70:6407-11)。

CD73は、結腸膵臓卵巣膀胱白血病神経膠腫神経膠芽腫黒色腫甲状腺食道前立腺および乳房の癌を含む、多数の異なる癌において発現することが報告されている(Jin et al., Cancer Res 2010;70:2245-55およびStagg et al., PNAS 2010;107:1547-52)。さらに、癌におけるCD73発現は、増大した増殖、遊走、血管新生侵襲性転移および患者生存期間の短さと関連付けられている。CD73活性は、甲状腺乳頭癌における診断マーカーとしても提案されている。CD73は、腫瘍細胞における細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用を制御することが示されているが、CD73の発現および活性は、T細胞応答の低減とも関連付けられており、薬物耐性と関係している(Spychala et al., Pharmacol Ther 3000;87:161-73)。したがって、CD73は、癌の進行を直接的および間接的の両方で制御できることから、新規治療標的としてのCD73の可能性が強調される。

概要

抗CD73抗体を、免疫−腫瘍学薬剤、例えば、抗PD−1抗体と組み合わせて使用する、腫瘍(例えば、進行固形腫瘍)の臨床治療のための方法が、提供される。

目的

ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域との間に多様なレベル可動性をもたらし、2つの重鎖定常領域間での分子間ジスルフィド結合のための部位も提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

癌を治療する方法であって、癌を有する対象に、治療上有効な量のCD73アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤投与することを含み、前記対象が、CD73を発現する腫瘍を有する、方法。

請求項2

対象におけるCD73を発現する腫瘍を治療する方法であって、前記対象に、治療上有効な量のCD73アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤を投与することを含む、方法。

請求項3

CD73が、腫瘍細胞の膜に発現される、請求項1または2に記載の方法。

請求項4

前記腫瘍が、前記免疫−腫瘍学薬剤の標的を発現する腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

前記癌または腫瘍が、肺腺癌甲状腺癌腫膵臓腺癌子宮内膜癌腫、結腸腺癌扁平上皮細胞癌腫、頭頸部扁平上皮細胞癌腫および卵巣腺癌からなる群から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

癌を有する対象が、抗CD73アンタゴニストでの治療に応答するか否かを判定する方法であって、前記対象の腫瘍におけるCD73のレベルを判定することを含み、前記腫瘍における高いレベルのCD73は、前記対象が抗CD73アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いことを示す、方法。

請求項7

癌を有する対象が、抗CD73アンタゴニストおよびPD−1アンタゴニストでの治療に応答するか否かを判定する方法であって、前記対象において、腫瘍におけるCD73のレベルおよび前記腫瘍の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)におけるPD−1のレベルを判定することを含み、前記腫瘍における高いレベルのCD73およびTILにおける高いレベルのPD−1は、前記対象が、抗CD73アンタゴニストおよび抗PD−1アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いことを示す、方法。

請求項8

TILにおけるPD−1のレベルが、CD8+T細胞、CD4+FoxP3−T細胞、またはCD4+FoxP3+T細胞におけるPD−1のレベルを判定することによって測定され、これらの細胞型のうちの1つまたは複数におけるPD−1のレベルが高い場合、前記対象は、抗CD73アンタゴニストおよび抗PD−1アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い、請求項7に記載の方法。

請求項9

前記CD73アンタゴニストが、抗CD73抗体またはその抗原結合部分である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

前記免疫−腫瘍学薬剤が、PD−1アンタゴニスト、PD−L1アンタゴニスト、CTLA−4アンタゴニストおよびLAG−3アンタゴニストからなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

前記免疫−腫瘍学薬剤が、抗体またはその抗原結合部分である、請求項10に記載の方法。

請求項12

前記免疫−腫瘍学薬剤が、抗PD−1抗体またはその抗原結合部分である、請求項11に記載の方法。

請求項13

前記抗PD−1抗体またはその抗原結合部分が、それぞれ、配列番号383〜385に記載される配列を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3ならびにそれぞれ、配列番号386〜388に記載される配列を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3を含む、請求項12に記載の方法。

請求項14

前記抗PD−1抗体またはその抗原結合部分が、それぞれ、配列番号381および382に記載される重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、請求項13に記載の方法。

請求項15

前記抗CD73抗体またはその抗原結合部分が、以下の特性:(1)例えば、BIACORE(登録商標)SPR分析によって測定される場合、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のKDで、ヒトCD73、例えば、ビーズ結合型(可溶性)ヒト二量体ヒトCD73アイソフォーム1および2と結合すること、(2)例えば、1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のEC50で、膜結合型ヒトCD73と結合すること、(3)例えば、10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のEC50で、カニクイザルCD73と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルCD73と結合すること、(4)例えば、10nM以下のEC50で、ヒトCD73酵素活性阻害すること、(5)例えば、10nM以下のEC50で、カニクイザルCD73酵素活性を阻害すること、(6)10nM以下のEC50で、Calu6細胞における内因性細胞性)ヒトCD73酵素活性を阻害すること、(7)インビボでヒトCD73酵素活性を阻害すること、(8)例えば、1時間未満、30分未満もしくは10分未満のT1/2および/または少なくとも70%、80%もしくは90%のYmaxでの細胞への内部移行、例えば、抗体媒介性(または依存性)CD73内部移行、(9)ヒトCD73上のコンホメーションエピトープ、例えば、アミノ酸残基FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号96)および/またはLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号97)のすべてまたは一部分を含む、アミノ酸配列(配列番号1)内の不連続なエピトープと結合すること、(10)ヒトCD73との結合について、CD73.4−1、CD73.4−2、CD73.3、11F11−1、11F11−2、4C3−1、4C3−2、4C3−3、4D4、10D2−1、10D2−2、11A6、24H2、5F8−1、5F8−2、6E11および/または7A11と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、および(11)X線結晶学によって判定される場合、CD73.4と類似のパターンで、ヒトCD73と相互作用することのうちの一種または複数を示す、請求項9に記載の方法。

請求項16

前記抗CD73抗体またはその抗原結合部分が、それぞれ、(a)配列番号4および8、(b)配列番号4および12、(c)配列番号16および20、(d)配列番号16および24、(e)配列番号16および28、(f)配列番号32および36、(g)配列番号40および44、(h)配列番号40および48、(i)配列番号52および56、(j)配列番号60および64、(k)配列番号68および72、(l)配列番号68および76、(m)配列番号80および84、(n)配列番号88および92、(o)配列番号135および8、ならびに(p)配列番号135および12からなる群から選択される重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%同一である、重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項9に記載の方法。

請求項17

前記抗CD73抗体が、配列番号135に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号8に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項16に記載の方法。

請求項18

前記抗CD73抗体が、配列番号135に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号12に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項16に記載の方法。

請求項19

前記抗CD73抗体またはその抗原結合部分が、(a)それぞれ、配列番号5、6および7を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号9、10および11を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(b)それぞれ、配列番号5、6および7を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号13、14および15を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(c)それぞれ、配列番号17、18および19を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号21、22および23を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(d)それぞれ、配列番号17、18および19を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号25、26および27を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(e)それぞれ、配列番号17、18および19を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号29、30および31を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(f)それぞれ、配列番号33、34および35を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号37、38および39を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(g)それぞれ、配列番号41、42および43を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号45、46および47を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(h)それぞれ、配列番号41、42および43を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号49、50および51を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(i)それぞれ、配列番号53、54および55を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号57、58および59を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(j)それぞれ、配列番号61、62および63を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号65、66および67を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(k)それぞれ、配列番号69、70および71を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号73、74および75を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(l)それぞれ、配列番号69、70および71を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号77、78および79を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(m)それぞれ、配列番号81、82および83を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号85、86および87を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、または(n)それぞれ、配列番号89、90および91を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号93、94および95を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む、請求項9に記載の方法。

請求項20

前記抗CD73抗体またはその抗原結合部分が、それぞれ、配列番号5、6および7を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号9、10および11を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む、請求項19に記載の方法。

請求項21

前記抗CD73抗体が、それぞれ、配列番号5、6および7を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号13、14および15を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む、請求項19に記載の方法。

請求項22

前記抗CD73抗体またはその抗原結合部分が、それぞれ、(a)それぞれ、配列番号100および101、(b)それぞれ、配列番号100および102、(c)それぞれ、配列番号103および104、(d)それぞれ、配列番号103および105、(e)それぞれ、配列番号103および106、(f)それぞれ、配列番号107および108、(g)それぞれ、配列番号109および110、(h)それぞれ、配列番号109および111、(i)それぞれ、配列番号112および113、(j)それぞれ、配列番号114および115、(k)それぞれ、配列番号116および117、(l)それぞれ、配列番号116および118、(m)それぞれ、配列番号119および120、(n)それぞれ、配列番号121および122、(o)それぞれ、配列番号133および101、ならびに(p)それぞれ、配列番号133および102からなる群から選択される重鎖および軽鎖配列のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一である重鎖および軽鎖配列を含む、請求項9に記載の方法。

請求項23

前記抗CD73抗体が、配列番号133または189に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号101に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項22に記載の方法。

請求項24

前記抗CD73抗体が、配列番号133または189に記載のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号102に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項22に記載の方法。

請求項25

前記抗CD73抗体が、エフェクターレスFcを含む、請求項9および15から24のいずれか一項に記載の方法。

請求項26

前記抗CD73抗体が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはそれらの変異体からなる群から選択される、請求項9および15から25のいずれか一項に記載の方法。

請求項27

前記抗CD73抗体が、N末端からC末端の順に、ヒトCH1ドメイン、ヒトヒンジドメイン、ヒトCH2ドメインおよびヒトCH3ドメインを含む、修飾された重鎖定常領域を含む、請求項9および15から26のいずれか一項に記載の方法。

請求項28

前記修飾された定常領域が、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなるアイソタイプ群から選択される異なるアイソタイプの少なくとも2つのドメインを含む、請求項27に記載の方法。

請求項29

前記修飾された定常領域が、ヒトIgG2CH1ドメインを含み、CH2、CH3およびヒンジドメインのうちの少なくとも1つが、IgG2アイソタイプではない、請求項27または28に記載の方法。

請求項30

前記IgG2CH1ドメインが、配列番号124のアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の方法。

請求項31

前記修飾された定常領域が、例えば、システイン結合における不均一性を低減させる、ヒトIgG2ヒンジドメインを含む、請求項27から30のいずれか一項に記載の方法。

請求項32

前記ヒンジドメインが、野生型ヒトIgG2ヒンジドメイン(配列番号136)と比べて、C219にアミノ酸置換を含む、請求項31に記載の方法。

請求項33

前記ヒンジドメインが、配列番号123のアミノ酸配列を含む、請求項32に記載の方法。

請求項34

前記修飾された定常領域が、エフェクター機能を低減または排除する、ヒトIgG1CH2ドメインを含む、請求項27から33のいずれか一項に記載の方法。

請求項35

前記CH2ドメインが、野生型ヒトIgG1CH2ドメイン(配列番号137)と比べて、アミノ酸置換A330SおよびP331Sを含む、請求項34に記載の方法。

請求項36

前記CH2ドメインが、配列番号125のアミノ酸配列を含む、請求項35に記載の方法。

請求項37

前記修飾された定常領域が、ヒトIgG1CH3ドメインを含む、請求項27から36のいずれか一項に記載の方法。

請求項38

前記CH3ドメインが、配列番号128のアミノ酸配列を含む、請求項37に記載の方法。

請求項39

前記抗CD73抗体またはその抗原結合部分が、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項9および15から38のいずれか一項に記載の方法。

請求項40

前記CDR領域中のメチオニン残基が、酸化を受けないアミノ酸残基と置換される、請求項9および15から39のいずれか一項に記載の方法。

請求項41

ヒト患者における固形腫瘍を治療する方法であって、前記患者に、(a)CD73アンタゴニスト、および(b)免疫−腫瘍学薬剤を、それぞれの有効量で投与することを含み、前記抗CD73抗体および前記免疫−腫瘍学薬剤が、1週間に1回、2週間に1回、3週間に1回もしくは4週間に1回投与されるか、または前記抗CD73抗体が、1週間に1回投与され、前記免疫−腫瘍学薬剤が、2週間に1回、3週間に1回もしくは4週間に1回投与される、方法。

請求項42

前記CD73アンタゴニストが、請求項15から40のいずれか一項に記載のCD73抗体である、請求項41に記載の方法。

請求項43

前記抗CD73抗体および前記免疫−腫瘍学薬剤が、同じ日に投与される、請求項41に記載の方法。

請求項44

前記抗CD73抗体および免疫−腫瘍学薬剤が、静脈内投与用に製剤化される、請求項41から43のいずれか一項に記載の方法。

請求項45

前記抗CD73抗体および免疫−腫瘍学薬剤が、別個に製剤化される、請求項41から44のいずれか一項に記載の方法。

請求項46

前記抗CD73抗体および免疫−腫瘍学薬剤が、一緒に製剤化される、請求項41から44のいずれか一項に記載の方法。

請求項47

前記抗CD73抗体が、前記免疫−腫瘍学薬剤の投与の前に投与される、請求項41から44のいずれか一項に記載の方法。

請求項48

前記抗CD73抗体が、前記免疫−腫瘍学薬剤の投与の後に投与される、請求項41から44のいずれか一項に記載の方法。

請求項49

前記抗CD73抗体および免疫−腫瘍学薬剤が、同時に投与される、請求項41から44のいずれか一項に記載の方法。

請求項50

前記免疫−腫瘍学薬剤が、PD−1アンタゴニスト、PD−L1アンタゴニスト、CTLA−4アンタゴニストおよびLAG−3アンタゴニストからなる群から選択される、請求項41から49のいずれか一項に記載の方法。

請求項51

前記免疫−腫瘍学薬剤が、PD−1アンタゴニストである、請求項50に記載の方法。

請求項52

前記PD−1アンタゴニストが、抗PD−1抗体またはその抗原結合部分である、請求項51に記載の方法。

請求項53

前記抗PD−1抗体が、配列番号383に記載される配列を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号384に記載される配列を含む重鎖可変領域CDR2、配列番号385に記載される配列を含む重鎖可変領域CDR3、配列番号386に記載される配列を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号387に記載される配列を含む軽鎖可変領域CDR2および配列番号388に記載される配列を含む軽鎖可変領域CDR3を含む、請求項52に記載の方法。

請求項54

前記抗PD−1抗体が、それぞれ、配列番号381および382に記載される配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項52または53に記載の方法。

請求項55

前記治療が、腫瘍サイズの低減、転移病変数の経時的な低減、完全な応答、部分的な応答および疾患の安定から選択される少なくとも1つの治療効果をもたらす、請求項41から54のいずれか一項に記載の方法。

請求項56

ヒト患者における固形腫瘍を治療するためのキットであって、(a)配列番号135に記載される配列を有する重鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインならびに配列番号8または12に記載される配列を有する軽鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む、ある用量の抗CD73抗体、(b)免疫−腫瘍学薬剤であって、配列番号381に記載される配列を有する重鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインならびに配列番号382に記載される配列を有する軽鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む、抗PD−1抗体である、ある用量の免疫−腫瘍学薬剤、ならびに(c)請求項41から55に記載の方法において前記抗CD73抗体および免疫−腫瘍学薬剤を使用するための説明書を含む、キット。

請求項57

対象の血液細胞において抗ヒトCD73抗体によるヒトCD73受容体占有率を判定するための方法であって、対象から全血サンプルを取得すること、および抗ヒトIgG1Fc抗体ならびにT細胞および/またはB細胞マーカーを使用してフローサイトメトリーを行うことを含む、方法。

請求項58

フローサイトメトリーが、直接的な検出アッセイである、請求項57に記載の方法。

請求項59

前記T細胞および/またはB細胞のマーカーが、CD8+T細胞のマーカーまたはB19+B細胞のマーカーである、請求項57に記載の方法。

請求項60

前記フローサイトメトリーが、前記対象から前記血液サンプルを取得してから48時間以内に行われる、請求項57から59のいずれか一項に記載の方法。

請求項61

前記抗ヒトIgG1Fc抗体が、IS1112E.E.23.30である、請求項57から60のいずれか一項に記載の方法。

請求項62

対象から全血サンプルを取得すること、および前記抗ヒトIgG1Fc抗体ならびにCD8+T細胞のマーカーおよび/またはB19+B細胞のマーカーを使用してフローサイトメトリーを行うことを含み、前記フローサイトメトリーが、前記対象から前記血液サンプルを取得してから48時間以内に行われる、請求項57から61のいずれか一項に記載の方法。

請求項63

ヒトCD73と結合し、修飾された重鎖領域を含む、抗体。

請求項64

前記修飾された重鎖領域が、配列番号162〜169、180〜183、267〜282、300〜347および391〜454に記載されるアミノ酸配列またはその変異体を含み、前記変異体が、それぞれ、配列番号162〜169、180〜183、267〜282、300〜347および391〜454におけるアミノ酸ではない、それぞれの野生型IgG1、IgG2またはIgG4配列のものとは異なる、1つまたは複数のアミノ酸の点で異なる、請求項63に記載の抗体。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2016年12月9日に出願された米国仮出願第62/431987号、2016年7月18日に出願された同第62/363703号、2016年5月25日に出願された同第62/341220号、2016年3月8日に出願された同第62/305378号および2016年3月4日に出願された同第62/303985号に対する優先権を主張する。本出願を通じて引用されるいずれの特許、特許出願および参考文献の内容も、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

背景技術

0002

エクト−5’−ヌクレオチダーゼ(エクト−5’NT、EC 3.1.3.5)としても知られる分化抗原群73(Cluster of Differentiation 73:CD73)は、ほとんどの組織において見出されるが、特に、内皮細胞および造血細胞サブセットにおいて発現される、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合型細胞表面酵素である(Resta et al., Immunol Rev 1998;161:95-109およびColgan et al., Prinergic Signal 2006;2:351-60)。CD73は、細胞外ヌクレオシド一リン酸を、ヌクレオシド、例えばアデノシンにする脱リン酸化触媒することが公知である。アデノシンは、A1、A2A、A2B、およびA3を含む、いくつかの受容体を通じてその生物学的効果を媒介する、広く研究されているシグナル伝達分子である。アデノシンは、多数の癌の増殖および遊走を制御し、抗腫瘍T細胞の制御を通じた免疫抑制効果を有することが示されている(Zhang et al., Cancer Res 2010;70:6407-11)。

0003

CD73は、結腸膵臓卵巣膀胱白血病神経膠腫神経膠芽腫黒色腫甲状腺食道前立腺および乳房の癌を含む、多数の異なる癌において発現することが報告されている(Jin et al., Cancer Res 2010;70:2245-55およびStagg et al., PNAS 2010;107:1547-52)。さらに、癌におけるCD73発現は、増大した増殖、遊走、血管新生侵襲性転移および患者生存期間の短さと関連付けられている。CD73活性は、甲状腺乳頭癌における診断マーカーとしても提案されている。CD73は、腫瘍細胞における細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用を制御することが示されているが、CD73の発現および活性は、T細胞応答の低減とも関連付けられており、薬物耐性と関係している(Spychala et al., Pharmacol Ther 3000;87:161-73)。したがって、CD73は、癌の進行を直接的および間接的の両方で制御できることから、新規治療標的としてのCD73の可能性が強調される。

発明が解決しようとする課題

0004

癌などの疾患を標的とする改善された戦略に対する継続的な必要性を考慮すると、複数の機序を通じて腫瘍の進行を制御する方法、ならびにCD73活性を制御するための方法が、大いに望ましい。

課題を解決するための手段

0005

本明細書において提供される方法は、概して、癌を有する患者、例えば、CD73を発現する固形腫瘍(例えば、進行固形腫瘍)を有する患者の治療に関する。したがって、癌を治療する方法であって、癌を有する対象に、治療上有効な量のCD73アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤投与することを含み、対象が、CD73を発現する腫瘍を有する、方法が、本明細書において提供される。

0006

対象におけるCD73を発現する腫瘍を治療する方法であって、対象に、治療上有効な量のCD73アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤(例えば、抗PD−1アンタゴニスト、例えば、抗体)を投与することを含む、方法もまた、本明細書において提供される。

0007

特定の実施形態では、治療されるべき対象は、腫瘍細胞の膜にCD73を発現する腫瘍を有する。特定の実施形態では、腫瘍は、免疫学薬剤の標的、例えば、PD−1を発現する腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む。特定の実施形態では、治療されるべき対象は、腫瘍細胞にCD73を発現し、TILに免疫−腫瘍学薬剤の標的、例えば、PD−1またはPD−L1を発現する、腫瘍を有する。特定の実施形態では、癌または腫瘍は、肺腺癌甲状腺癌腫膵臓腺癌子宮内膜癌腫、結腸腺癌、肺扁平上皮細胞癌腫、頭頸部扁平上皮細胞癌腫および卵巣腺癌からなる群から選択される。

0008

癌を有する対象が、抗CD73アンタゴニストでの治療に応答するか否かを判定する方法であって、対象の腫瘍におけるCD73のレベルを判定することを含み、腫瘍におけるCD73の存在は、対象が抗CD73アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いことを示す、方法もまた、本明細書において提供される。

0009

癌を有する対象が、抗CD73アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤での治療に応答するか否かを判定する方法であって、対象において、腫瘍におけるCD73のレベルおよび腫瘍のTILにおける免疫−腫瘍学薬剤(例えば、チェックポイント阻害剤または共刺激タンパク質)の標的のレベルを判定することを含み、腫瘍におけるCD73の存在およびTILにおける免疫−腫瘍学薬剤の標的の存在は、対象が抗CD73アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤での治療に応答する可能性が高いことを示す、方法もまた、本明細書において提供される。

0010

特定の実施形態では、TILにおける免疫腫瘍学的な標的のレベルは、CD8+T細胞、CD4+FoxP3−T細胞またはCD4+FoxP3+T細胞における免疫−腫瘍学的な標的のレベルを判定することによって測定され、免疫−腫瘍学的な標的の発現が、これらの細胞型のうちの1つまたは複数において検出された場合、対象は、抗CD73アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤での治療に応答する可能性が高い。

0011

癌を有する対象が、抗CD73アンタゴニストおよびPD−1アンタゴニストでの治療に応答するか否かを判定する方法であって、対象において、腫瘍におけるCD73のレベルおよび腫瘍の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)におけるPD−1のレベルを判定することを含み、腫瘍におけるCD73の存在およびTILにおけるPD−1の存在は、対象が抗CD73アンタゴニストおよび抗PD−1アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高いことを示す、方法もまた、本明細書において提供される。

0012

特定の実施形態では、TILにおけるPD−1のレベルは、CD8+T細胞、CD4+FoxP3−T細胞またはCD4+FoxP3+T細胞におけるPD−1のレベルを判定することによって測定され、PD−1発現が、これらの細胞型のうちの1つまたは複数において検出された場合、対象は、抗CD73アンタゴニストおよび抗PD−1アンタゴニストでの治療に応答する可能性が高い。

0013

対象の血液細胞において抗ヒトCD73抗体によるヒトCD73受容体占有率を判定するための方法であって、対象から全血サンプルを取得すること、および抗ヒトIgG1 Fc抗体ならびにT細胞および/またはB細胞マーカーを使用してフローサイトメトリーを行うことを含む、方法もまた、本明細書において提供される。特定の実施形態では、フローサイトメトリーは、直接的な検出アッセイである。特定の実施形態では、T細胞および/またはB細胞のマーカーは、CD8+T細胞のマーカーまたはB19+B細胞のマーカーである。特定の実施形態では、フローサイトメトリーは、対象から血液サンプルを取得してから48時間以内に行われる。特定の実施形態では、抗ヒトIgG1 Fc抗体は、IS1112E.E.23.30である。

0014

特定の実施形態では、対象の血液細胞において抗ヒトCD73抗体によるヒトCD73受容体占有率を判定するための方法は、対象から全血サンプルを取得すること、および抗ヒトIgG1 Fc抗体ならびにCD8+T細胞および/またはB19+B細胞のマーカーを使用してフローサイトメトリーを行うことを含み、フローサイトメトリーは、対象から血液サンプルを取得してから48時間以内に行われる。

0015

抗CD73アンタゴニストおよび免疫−腫瘍学薬剤の組合せ投与など、癌のための併用治療が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するためのCD73アンタゴニストは、抗CD73抗体またはその抗原結合部分である。特定の実施形態では、免疫−腫瘍学薬剤は、PD−1アンタゴニスト、PD−L1アンタゴニスト、CTLA−4アンタゴニスト、LAG−3アンタゴニストまたは本明細書に記載されるその他のものからなる群から選択される。特定の実施形態では、免疫−腫瘍学薬剤は、抗体またはその抗原結合部分、例えば、抗PD−1抗体(例えば、それぞれ、配列番号383〜385に記載される配列を含む重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3ならびにそれぞれ、配列番号386〜388に記載される配列を含む軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3、またはそれぞれ、配列番号381および382に記載される重鎖および軽鎖可変領域配列を含む、抗PD−1抗体)である。抗CD73抗体とともに投与することができる例示的な抗PD−1抗体は、ニボルマブ(OPDIVO(登録商標)、BMS−936558)である。

0016

特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗CD73抗体またはその抗原結合部分は、以下の特性:(1)例えば、BIACORE(登録商標)SPR分析によって測定される場合、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のKDで、ヒトCD73、例えば、ビーズ結合型ヒト二量体ヒトCD73アイソフォーム1および2と結合すること、(2)例えば、1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のEC50で、膜結合型ヒトCD73と結合すること、(3)例えば、10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のEC50で、カニクイザルCD73と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルCD73と結合すること、(4)例えば、10nM以下のEC50で、ヒトCD73酵素活性阻害すること、(5)例えば、10nM以下のEC50で、カニクイザルCD73酵素活性を阻害すること、(6)10nM以下のEC50で、Calu6細胞における内因性細胞性)ヒトCD73酵素活性を阻害すること、(7)インビボ(in vivo)でヒトCD73酵素活性を阻害すること、(8)例えば、1時間未満、30分未満もしくは10分未満のT1/2および/または少なくとも70%、80%もしくは90%のYmaxでの細胞への内部移行、例えば、抗体媒介性(または依存性)CD73内部移行、(9)ヒトCD73上のコンホメーションエピトープ、例えば、アミノ酸残基FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号96)および/またはLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号97)のすべてまたは一部分を含む、アミノ酸配列(配列番号1)内の不連続なエピトープと結合すること、(10)ヒトCD73との結合について、CD73.4−1、CD73.4−2、CD73.3、11F11−1、11F11−2、4C3−1、4C3−2、4C3−3、4D4、10D2−1、10D2−2、11A6、24H2、5F8−1、5F8−2、6E11および/または7A11と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、および(11)X線結晶学によって判定される場合、CD73.4と類似のパターンで、ヒトCD73と相互作用することのうちの1種または複数を示す。

0017

特定の実施形態では、抗CD73抗体またはその抗原結合部分は、それぞれ(a)配列番号4および8、(b)配列番号4および12、(c)配列番号16および20、(d)配列番号16および24、(e)配列番号16および28、(f)配列番号32および36、(g)配列番号40および44、(h)配列番号40および48、(i)配列番号52および56、(j)配列番号60および64、(k)配列番号68および72、(l)配列番号68および76、(m)配列番号80および84、(n)配列番号88および92、(o)配列番号135および8ならびに(p)配列番号135および12からなる群から選択される、重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%同一である、重鎖および軽鎖可変領域を含む。

0018

特定の実施形態では、抗CD73抗体またはその抗原結合部分は、(a)それぞれ、配列番号5、6および7を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号9、10および11を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(b)それぞれ、配列番号5、6および7を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号13、14および15を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(c)それぞれ、配列番号17、18および19を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号21、22および23を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(d)それぞれ、配列番号17、18および19を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号25、26および27を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(e)それぞれ、配列番号17、18および19を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号29、30および31を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(f)それぞれ、配列番号33、34および35を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号37、38および39を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(g)それぞれ、配列番号41、42および43を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号45、46および47を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(h)それぞれ、配列番号41、42および43を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号49、50および51を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(i)それぞれ、配列番号53、54および55を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号57、58および59を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(j)それぞれ、配列番号61、62および63を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号65、66および67を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(k)それぞれ、配列番号69、70および71を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号73、74および75を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(l)それぞれ、配列番号69、70および71を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号77、78および79を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列、(m)それぞれ、配列番号81、82および83を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号85、86および87を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列または(n)それぞれ、配列番号89、90および91を含む重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびにそれぞれ、配列番号93、94および95を含む軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。

0019

特定の実施形態では、抗CD73抗体またはその抗原結合部分は、それぞれ、(a)それぞれ、配列番号100および101、(b)それぞれ、配列番号100および102、(c)それぞれ、配列番号103および104、(d)それぞれ、配列番号103および105、(e)それぞれ、配列番号103および106、(f)それぞれ、配列番号107および108、(g)それぞれ、配列番号109および110、(h)それぞれ、配列番号109および111、(i)それぞれ、配列番号112および113、(j)それぞれ、配列番号114および115、(k)それぞれ、配列番号116および117、(l)それぞれ、配列番号116および118、(m)それぞれ、配列番号119および120、(n)それぞれ、配列番号121および122、(o)それぞれ、配列番号133および101ならびに(p)それぞれ、配列番号133および102からなる群から選択される重鎖および軽鎖配列のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一である重鎖および軽鎖配列を含む。

0020

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、エフェクターレスFcを含む。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはそれらの変異体からなる群から選択される。

0021

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、N末端からC末端の順に、ヒトCH1ドメイン、ヒトヒンジドメイン、ヒトCH2ドメインおよびヒトCH3ドメインを含む、修飾された重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、修飾された定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4からなるアイソタイプ群から選択される異なるアイソタイプの少なくとも2つのドメインを含む。特定の実施形態では、修飾された定常領域は、ヒトIgG2 CH1ドメインを含み、CH2、CH3およびヒンジドメインのうちの少なくとも1つが、IgG2アイソタイプではない。特定の実施形態では、IgG2 CH1ドメインは、配列番号124のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、修飾された定常領域は、例えば、システイン結合における不均一性を低減させる、ヒトIgG2ヒンジドメインを含む。特定の実施形態では、ヒンジドメインは、野生型ヒトIgG2ヒンジドメイン(配列番号136)と比べて、C219またはC220にアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、ヒンジドメインは、配列番号123のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、修飾された定常領域は、エフェクター機能を低減または排除する、ヒトIgG1 CH2ドメインを含む。特定の実施形態では、CH2ドメインは、野生型ヒトIgG1 CH2ドメイン(配列番号137)と比べて、アミノ酸置換A330SおよびP331Sを含むか、または配列番号125のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、修飾された定常領域は、ヒトIgG1 CH3ドメイン、例えば、配列番号128のアミノ酸配列を含む。

0022

特定の実施形態では、抗CD73抗体またはその抗原結合部分は、ヒトまたはヒト化抗体である。

0023

特定の実施形態では、抗CD73抗体のCDR領域中のメチオニン残基は、酸化を受けないアミノ酸残基と置換される。

0024

特定の実施形態では、抗CD73抗体および免疫−腫瘍学薬剤は、静脈内投与用に製剤化される。特定の実施形態では、抗CD73抗体および免疫−腫瘍学薬剤は、別個に製剤化される。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、免疫−腫瘍学薬剤の投与の前に投与される。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、免疫−腫瘍学薬剤の投与の後に投与される。特定の実施形態では、抗CD73抗体および免疫−腫瘍学薬剤は、同時に投与される。

0025

ヒト患者における固形腫瘍を治療するためのキットであって、(a)配列番号135に記載される配列を有する重鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインならびに配列番号8または12に記載される配列を有する軽鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む、ある用量の抗CD73抗体、(b)免疫−腫瘍学薬剤であって、配列番号381に記載される配列を有する重鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインならびに配列番号382に記載される配列を有する軽鎖可変領域のCDR1、CDR2およびCDR3ドメインを含む、抗PD−1抗体、例えば、ニボルマブ(BMS−936558)である、ある用量の免疫−腫瘍学薬剤、ならびに(c)本明細書に記載される方法において抗CD73抗体および免疫−腫瘍学薬剤を使用するための説明書を含む、キットもまた、本明細書において提供される。

図面の簡単な説明

0026

図1Aは、CD73.4−1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号237)およびアミノ酸配列(配列番号135)を示す。CDR1(配列番号5)、CDR2(配列番号6)およびCDR3(配列番号7)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源(derivation)を示す。
図1Bは、CD73.4−1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域(VK1)のヌクレオチド配列(配列番号140)およびアミノ酸配列(配列番号8)を示す。CDR1(配列番号9)、CDR2(配列番号10)およびCDR3(配列番号11)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図2Aは、CD73.4−2ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号237)およびアミノ酸配列(配列番号135)を示す。CDR1(配列番号5)、CDR2(配列番号6)およびCDR3(配列番号7)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源(derivation)を示す。
図2Bは、CD73.4−2ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号141)およびアミノ酸配列(配列番号12)を示す。CDR1(配列番号13)、CDR2(配列番号14)およびCDR3(配列番号15)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図3Aは、11F11−1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号139)およびアミノ酸配列(配列番号4)を示す。CDR1(配列番号5)、CDR2(配列番号6)およびCDR3(配列番号7)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図3Bは、11F11−1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号140)およびアミノ酸配列(配列番号8)を示す。CDR1(配列番号9)、CDR2(配列番号10)およびCDR3(配列番号11)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図4Aは、11F11−2ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号139)およびアミノ酸配列(配列番号4)を示す。CDR1(配列番号5)、CDR2(配列番号6)およびCDR3(配列番号7)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図4Bは、11F11−2ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号141)およびアミノ酸配列(配列番号12)を示す。CDR1(配列番号13)、CDR2(配列番号14)およびCDR3(配列番号15)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図5Aは、4C3−1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号142)およびアミノ酸配列(配列番号16)を示す。CDR1(配列番号17)、CDR2(配列番号18)およびCDR3(配列番号19)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図5Bは、4C3−1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号143)およびアミノ酸配列(配列番号20)を示す。CDR1(配列番号21)、CDR2(配列番号22)およびCDR3(配列番号23)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図6Aは、4C3−2ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号142)およびアミノ酸配列(配列番号16)を示す。CDR1(配列番号17)、CDR2(配列番号18)およびCDR3(配列番号19)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図6Bは、4C3−2ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号144)およびアミノ酸配列(配列番号24)を示す。CDR1(配列番号25)、CDR2(配列番号26)およびCDR3(配列番号27)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図7Aは、4C3−3ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号142)およびアミノ酸配列(配列番号16)を示す。CDR1(配列番号17)、CDR2(配列番号18)およびCDR3(配列番号19)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図7Bは、4C3−3ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号145)およびアミノ酸配列(配列番号28)を示す。CDR1(配列番号29)、CDR2(配列番号30)およびCDR3(配列番号31)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図8Aは、4D4−1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号146)およびアミノ酸配列(配列番号32)を示す。CDR1(配列番号33)、CDR2(配列番号34)およびCDR3(配列番号35)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図8Bは、4D4−1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号147)およびアミノ酸配列(配列番号36)を示す。CDR1(配列番号37)、CDR2(配列番号38)およびCDR3(配列番号39)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図9Aは、10D2−1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号148)およびアミノ酸配列(配列番号40)を示す。CDR1(配列番号41)、CDR2(配列番号42)およびCDR3(配列番号43)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図9Bは、10D2−1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号149)およびアミノ酸配列(配列番号44)を示す。CDR1(配列番号45)、CDR2(配列番号46)およびCDR3(配列番号47)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図10Aは、10D2−2ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号148)およびアミノ酸配列(配列番号40)を示す。CDR1(配列番号41)、CDR2(配列番号42)およびCDR3(配列番号43)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図10Bは、10D2−2ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号150)およびアミノ酸配列(配列番号48)を示す。CDR1(配列番号49)、CDR2(配列番号50)およびCDR3(配列番号51)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図11Aは、11A6−1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号151)およびアミノ酸配列(配列番号52)を示す。CDR1(配列番号53)、CDR2(配列番号54)およびCDR3(配列番号55)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図11Bは、11A6−1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号152)およびアミノ酸配列(配列番号56)を示す。CDR1(配列番号57)、CDR2(配列番号58)およびCDR3(配列番号59)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図12Aは、24H2−1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号153)およびアミノ酸配列(配列番号60)を示す。CDR1(配列番号61)、CDR2(配列番号62)およびCDR3(配列番号63)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図12Bは、24H2−1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号154)およびアミノ酸配列(配列番号64)を示す。CDR1(配列番号65)、CDR2(配列番号66)およびCDR3(配列番号67)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図13Aは、5F8−1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号155)およびアミノ酸配列(配列番号68)を示す。CDR1(配列番号69)、CDR2(配列番号70)およびCDR3(配列番号71)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図13Bは、5F8−1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号156)およびアミノ酸配列(配列番号72)を示す。CDR1(配列番号73)、CDR2(配列番号74)およびCDR3(配列番号75)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図14Aは、5F8−2ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号155)およびアミノ酸配列(配列番号68)を示す。CDR1(配列番号69)、CDR2(配列番号70)およびCDR3(配列番号71)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図14Bは、5F8−2ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号157)およびアミノ酸配列(配列番号76)を示す。CDR1(配列番号77)、CDR2(配列番号78)およびCDR3(配列番号79)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図15Aは、5F8−3ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号155)およびアミノ酸配列(配列番号68)を示す。CDR1(配列番号69)、CDR2(配列番号70)およびCDR3(配列番号71)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図15Bは、5F8−3ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号242)およびアミノ酸配列(配列番号238)を示す。CDR1(配列番号239)、CDR2(配列番号240)およびCDR3(配列番号241)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図16Aは、6E11−1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号158)およびアミノ酸配列(配列番号80)を示す。CDR1(配列番号81)、CDR2(配列番号82)およびCDR3(配列番号83)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図16Bは、6E11−1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号159)およびアミノ酸配列(配列番号84)を示す。CDR1(配列番号85)、CDR2(配列番号86)およびCDR3(配列番号87)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図17Aは、7A11−1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号160)およびアミノ酸配列(配列番号88)を示す。CDR1(配列番号89)、CDR2(配列番号90)およびCDR3(配列番号91)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図17Bは、7A11−1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号161)およびアミノ酸配列(配列番号92)を示す。CDR1(配列番号93)、CDR2(配列番号94)およびCDR3(配列番号95)領域を線で示し、V、DおよびJ生殖系列起源を示す。
図18は、抗CD73抗体CD73.4−IgG2CS−IgG1.1fの重鎖、ならびにその可変領域CDR1、2および3、CH1、ヒンジ、CH2ならびにCH3ドメインのアミノ酸配列(配列番号189)を示す。
図19は、600、200、66.7、22.2、7.4および2.5nMのヒトCD73−his(太線)またはカニクイザルCD73−his(細線)の、25℃で固定化されたプロテインA表面に捕捉したCD73.4−IgG2−C219S−IgG1.1fとの結合のSPRセンサグラムデータを示す。
図20A1および20A2は、示される重鎖定常領域を有する11F11、CD73.4およびCD73.10抗体の、ヒトCD73陽性Calu6細胞(ヒト肺腺癌細胞株)との結合を示す。
図20B1および20B2は、示される重鎖定常領域を有する11F11、CD73.4およびCD73.10抗体の、ヒトCD73陰性DMS114細胞(肺小細胞癌細胞株)との結合を示す。
図20C1および20C2は、示される重鎖定常領域を有する11F11、CD73.4およびCD73.10抗体の、カニクイザルCD73陽性CHO細胞との結合を示す。
図20D1および20D2は、示される重鎖定常領域を有する11F11、CD73.4およびCD73.10抗体の、カニクイザルCD73陰性CHO−K1細胞との結合を示す。
図20Eは、示される抗体のドナーD1およびD2に由来するT細胞の結合を示す。
図20Fは、示される抗体のドナーD1およびD2に由来するT細胞の結合を示す。
図20Gは、125−I標識化CD73.4−IgG2−C219S−IgG1.1fのヒトB細胞との結合を示す。
図20Hは、125−I標識化CD73.4−IgG2−C219S−IgG1.1fのヒトCalu−6細胞との結合を示す。
図20Iは、125−I標識化CD73.4−IgG2−C219S−IgG1.1fのCHO−カニクイザルCD73細胞との結合を示す。
図21A1および21A2は、示される重鎖定常領域を有する抗CD73抗体11F11、CD73.4およびCD73.10による、ビーズ結合型ヒトCD73酵素活性の阻害を示す。すべての抗体が、ヒトCD73酵素活性を阻害した。
図21B1および21B2は、示される重鎖定常領域を有する抗CD73抗体11F11、CD73.4およびCD73.10による、ビーズ結合型カニクイザルCD73酵素活性の阻害を示す。すべての抗体が、カニクイザルCD73酵素活性を阻害した。
図22A1および22A2は、示される重鎖定常領域を有する11F11、CD73.4およびCD73.10抗体による、ヒトCD73陽性Calu6細胞におけるCD73酵素阻害を示す。すべての抗体が、これらの細胞においてCD73酵素活性を阻害した。
図22B1および22B2は、示される重鎖定常領域を有する11F11、CD73.4およびCD73.10抗体による、ヒトCD73陰性DMS−114細胞におけるCD73酵素阻害を示す。
図22Cは、Calu−6およびHEK/A2R細胞を使用したcAMPアッセイにおいて判定される、11F11および11F11 F(ab’)2断片による、内因性CD73活性の阻害のEC50およびYmaxの値を示す。図22Cもまた、Calu−6内部移行アッセイにおける、11F11および11F11 F(ab’)2断片のEC50およびYmaxの値を示す。図は、11F11Fab断片が、これらの2つのアッセイにおいて不活性であることを示す。
図22Dは、LC/MS/MSによって測定される場合、11F11または4C3抗体で処置したCalu6細胞からのアデノシン産生の時間過程を示し、11F11抗体によるCD73酵素阻害が、4C3抗体によるものよりも高速で生じることを示す。
図22Eは、示される用量のCD73.4−IgG2C219S.IgG1.1fまたは対照抗体で処置したCalu−6腫瘍におけるCD73酵素活性の定量化を示す。
図23Aは、以下の抗体によるCD73のH2228細胞における抗体媒介性内部移行の動態を示す:11F11、4C3、6D11、4C3Vk1軽鎖を有するCD73.3−IgG1.1f(「3−Vh−hHC−IgG1.1f/4C3Vk1」)、11F11 Vk2軽鎖を有するCD73.4−IgG2CS(「4−Vh−hHC−IgG2−C219S/11F11−Vk2」)、CD73.10−IgG2CS(「CD73.10−Vh−hHC−IgG2−C219S」)、CD73.10−IgG2CS−IgG1.1f(「CD73.10−Vh−hHC−IgG2−C219S−IgG1.1f」)およびCD73.10−IgG1.1f(「CD73.10−Vh−hHC−IgG1.1f」)抗体。11F11(IgG2アイソタイプのもの)、CD73.4−IgG2CS、CD73.10−IgG2CSおよびCD73.10−IgG2CS−IgG1.1f抗体は、IgG1アイソタイプのものである試験した他の抗体よりも高速かつ高い程度で内部移行される。
図23Bは、図23Aに示されるものと同一の抗体のHCC15細胞(非小細胞肺癌腫細胞株)における抗体媒介性CD73内部移行の動態を示し、H2228細胞(非小細胞肺癌種細胞株)において得られたものと類似の結果を示す。
図23Cは、図23Aおよび23Bに示されるものと同一の抗体、ならびにCD73.11−IgG2CS(「11−Vh−hVC−IgG2−C219S」)のCalu6細胞における抗体媒介性CD73内部移行の動態を示し、H2228およびHCC15細胞において得られたものと類似の結果を示す。
図23Dは、図23Cに示されるものと同一の抗体のNCI−2030細胞(非小細胞肺癌腫細胞株)における抗体媒介性CD73内部移行の動態を示し、H2228、HCC15およびCalu6細胞において得られたものと類似の結果を示す。
図23Eは、フローサイトメトリーによって測定される、示される抗体の、Calu6細胞における抗体媒介性CD73内部移行の動態を示す。
図23Fは、フローサイトメトリーによって測定される、示される抗体のNCI−H292細胞(粘膜表皮肺癌腫細胞株)における抗体媒介性CD73内部移行の動態を示すが、抗体は、細胞の抗体との初回インキュベーションの後に洗い流さなかった。
図23Gは、示された抗体で処置したCalu6細胞に内部移行されたCD73の割合を示し、示される抗体のCalu6細胞における抗体媒介性CD73内部移行を経時的に示す。
図23Hは、示された抗体で処置したNCI−H292細胞に内部移行されたCD73の割合を経時的に示し、示される抗体のNCI−H292細胞における抗体媒介性CD73内部移行を経時的に示す。
図23Iは、示された抗体で処置したSNU−C1細胞(結腸癌種細胞株)に内部移行されたCD73の割合を経時的に示し、示される抗体のSNU−C1細胞における抗体媒介性CD73内部移行を経時的に示す。
図23Jは、示された抗体で処置したNCI−H1437細胞(非小細胞肺癌腫細胞株)に内部移行されたCD73の割合を経時的に示し、示される抗体のNCI−H1437細胞における抗体媒介性CD73内部移行を経時的に示す。
図23Kは、示された抗体で処置したCalu6細胞に内部移行されたCD73の割合を経時的に示し、示される抗体のCalu6細胞における抗体媒介性CD73内部移行を経時的に示す。
図23Lは、示された抗体で処置したNCI−H292細胞に内部移行されたCD73の割合を経時的に示し、示される抗体のCalu6細胞における抗体媒介性CD73内部移行を経時的に示す。
図23Mは、5μg/mlの示される抗体で0、5、15または30分間処置したCalu6細胞の表面におけるCD73のレベルを示す。
図24Aは、動物を対照抗体で処置した4日後に採取された、動物に由来し、CD73酵素活性に関して染色した、異種移植腫瘍切片を示す。切片は、濃い色を示し、CD73酵素活性を示す。
図24Bは、動物を11F11抗体で処置した1日後に採取された、動物に由来し、CD73酵素活性に関して染色した、異種移植腫瘍切片を示す。切片は、図24Aに示される対照腫瘍切片と比べて、有意に薄い茶色を示し、処置の開始から1日後程度の早期におけるCD73.10−IgG2CS−IgG1.1fによるCD73酵素活性のインビボでの阻害を示す。
図24Cは、動物をCD73.10−IgG2CS−IgG1.1fで処置した2日後に採取された、動物に由来し、CD73酵素活性に関して染色した、異種移植腫瘍切片を示す。切片は、図24Aに示される対照腫瘍切片と比べておよび動物をCD73.10−IgG2CS−IgG1.1fで処置した1日後の腫瘍切片と比べて、有意に薄い茶色を示し、処置の開始から少なくとも2日後におけるCD73.10−IgG2CS−IgG1.1fによるCD73酵素活性のインビボでの阻害を示す。
図24Dは、動物をCD73.10−IgG2CS−IgG1.1fで処置した3日後に採取された、動物に由来し、CD73酵素活性に関して染色した、異種移植腫瘍切片を示す。切片は、図24Aに示される対照腫瘍切片と比べて、有意に薄い茶色を示し、処置の開始から少なくとも3日後におけるCD73.10−IgG2CS−IgG1.1fによるCD73酵素活性のインビボでの阻害を示す。
図24Eは、動物をCD73.10−IgG2CS−IgG1.1fで処置した7日後に採取された、動物に由来し、CD73酵素活性に関して染色した、異種移植腫瘍切片を示す。切片は、図24Aに示される対照腫瘍切片と比べて、有意に薄い茶色を示し、処置の開始から少なくとも7日後におけるCD73.10−IgG2CS−IgG1.1fによるCD73酵素活性のインビボでの阻害を示す。
図24Fは、対照(非CD73)抗体または1mg/kg、3mg/kgもしくは10mg/kgのCD73.4−IgG2CS−IgG1.1fで処置した異種移植片マウスのSNUC1腫瘍におけるヒトCD73の酵素活性の時間過程を示し、抗CD73抗体が、異種移植片マウスの腫瘍において、CD73酵素活性を効率的に低減することを示す。
図24Gは、10mg/kg、20mg/kgまたは30mg/kgの抗マウスCD73抗体で処置したマウスのMC38腫瘍における、抗体投与後の異なる時点でのCD73の阻害レベルを示す。
図25Aは、同系4T1腫瘍および対照mIgGを保持するBalb/cマウスに由来する対照腫瘍切片におけるマウスCD73酵素活性のレベルを示す。
図25Bは、抗マウスCD73抗体TY23で皮下処置した、同系4T1腫瘍を保持するBalb/cマウスの腫瘍切片(4T1、1日目〜7日目)を示し、TY23が、インビボでCD73酵素活性を阻害することを示す。
図26Aは、フローサイトメトリーによって判定される、抗CD73抗体4C3、7A11、6E11、5F8、4C3、11F11および11A6による4C3の交差遮断レベルを示す。
図26Bは、フローサイトメトリーによって判定される、抗CD73抗体4C3、7A11、6E11、5F8、4C3、11F11および11A6による11F11の交差遮断レベルを示す。
図27Aは、ヒトCD73のアミノ酸配列(配列番号283)および濃い灰色で表されるCD73.4−IgG2CS−IgG1.1fとの相互作用の領域を示す。相互作用が強力なほど、灰色が濃い。
図27Bは、二量体ヒトCD73タンパク質およびCD73.4−IgG2CS−IgG1.1fの間の相互作用のモデルを示す。
図28Aは、ヒトCD73および11F11Fab’断片の間の相互作用の結晶学モデルを示す。
図28Bは、2つのヒトCD73複合体の、11F11との複合構造のモデルを示す。
図28Cは、ヒトCD73および11F11抗体の間の相互作用のモデルを示す。
図28Dは、11F11およびヒトCD73の間の相互作用のモデルを示す。
図29Aは、ヒトCD73および抗体複合体のSEC−MALSデータを示す。「CD73.4−ハイブリッド」は、CD73.4−IgG2CS−IgG1.1fを指す。
図29Bは、ヒトCD73および抗体複合体のDLSデータを示す。
図30Aは、hCD73−hisの異なる定常領域を含むCD73.4抗体との複合体のSECクロマトグラムデータを示し、抗体/抗原複合体のサイズに対するIgG2ヒンジおよびCH1ドメインの効果を示す。
図30Bは、hCD73−hisの異なる定常領域を含むCD73.4抗体との複合体のDLSデータを示し、抗体/抗原複合体のサイズに対するIgG2ヒンジおよびCH1ドメインの効果を示す。
図30Cは、hCD73−hisの異なる定常領域を含むCD73.4抗体との複合体のMALSデータを示し、抗体/抗原複合体のサイズに対するIgG2ヒンジおよびCH1ドメインの効果を示す。
図30Dは、図30CのMALSにより判定された質量から導出したhCD73−his/mAb複合体の図式モデルを示す。
図30Eは、より高次な複合体が、CH1領域によって影響を受けることを示す。ヒストグラムは、各コンストラクトについて、グラフに示されるピーク1および2下の面積%を示す。
図31は、示される抗体のそれぞれを添加した1、4または21時間後における、抗体媒介性CD73内部移行の割合を示す。各抗体のバーを、21時間(左)、4時間(中央)および1時間(右)の順に示す。
図32Aは、1:1モルのhCD73−his複合体と異なる定常領域配列を含む16種類の異なるCD73.4抗体との複合体のSECクロマトグラムデータのオーバーレイを示す。
図32Bは、図32Aクロマトグラムの11〜19.5分のクロマトグラムデータの拡張を示し、4種類の異なる溶出種が示される。
図32Cは、16種類の異なる抗体/CD73−his複合体についてプロットした、図32Bのピーク2のUVクロマトグラムシグナル面積の割合を示す。データは、左から右に、ピーク面積順で分類されている。
図33は、抗hisFab捕捉FcγR−hisタンパク質との抗体結合を示す。結合応答は、mAb:FcγRの結合の化学量論が1:1であると仮定して、理論上のRmaxの割合としてプロットする。各抗体のバーは、スライドの下部の色凡例が提供されている順で示されている。
図34は、抗his Fab捕捉FcgR−hisタンパク質との抗体結合を示す。結合応答は、mAb:FcγRの結合の化学量論が1:1であると仮定して、理論上のRmaxの割合としてプロットする。各抗体のバーは、スライドの下部の色凡例が提供されている順で示されている。
図35は、種々の抗CD73抗体のVHおよびVL配列のアライメントを示す。VHおよびVL CDR1、CDR2およびCDR3配列を、太字で示す。
図36Aは、0(「4deg」)、15、30、60および120分後の、Calu−6細胞に内部移行された抗体11F11、6E11および4C3のEEA1共局在化係数(左から右に示される)を示す。
図36Bは、0(「4deg」)、15、30、60および120分後の、Calu−6細胞に内部移行された抗体11F11、6E11および4C3のRab7共局在化係数(左から右に示される)を示す。
図36Cは、0(「4deg」)、15、30、60および120分後の、Calu−6細胞に内部移行された抗体11F11、6E11および4C3のLamp−1共局在化係数(左から右に示される)を示す。
図37Aは、TMA切片においてモノクローナル抗体1D7を用いた免疫組織化学(IHC)によって判定される、示される腫瘍の細胞質細胞膜または両方におけるCD73の発現レベルを示す。グラフに列挙されている腫瘍は、左から右に、甲状腺癌腫(n=16)、膵臓腺癌(n=10)、子宮内膜癌腫(n=9)、肝細胞癌種または混合型(n=17)、頭頸部扁平上皮細胞癌腫(n=15)、腎細胞癌腫(n=16)、結腸腺癌(n=49)、胃癌腫(n=17)、非小細胞肺癌腫(n=45)、卵巣腺癌(n=18)、前立腺癌(n=17)、膀胱癌腫(n=20)、食道扁平上皮細胞癌腫(n=10)、乳房腺癌(n=52)およびリンパ腫(n=15)である。各癌の種類の最初のカラム(左)は、平均の組合せ腫瘍CD73スコアを表し、各癌の種類の第2のカラム(中央)は、平均の腫瘍細胞質CD73スコアを表し、各腫瘍型の第3のカラム(右)は、平均の腫瘍膜CD73スコアを表す。
図37Bは、示される腫瘍の細胞膜におけるCD73発現のレベルを示す。この図は、図36Aに対応しているが、細胞膜におけるCD73のレベルのみを示す。グラフに列挙されている腫瘍は、左から右に、甲状腺癌腫(n=16)、肝細胞癌腫または混合型(n=17)、頭頸部扁平上皮細胞癌腫(n=15)、膵臓腺癌(n=10)、結腸腺癌(n=49)、子宮内膜癌腫(n=9)、非小細胞肺癌腫(n=45)、腎細胞癌腫(n=16)、胃腺癌(n=17)、卵巣腺癌(n=18)、前立腺癌(n=17)、膀胱癌腫(n=20)、食道扁平上皮細胞癌腫(n=10)、リンパ腫(n=15)および乳房腺癌(n=52)である。
図38Aは、全腫瘍切片においてmAb D7F9Aを用いた免疫組織化学(IHC)によって判定される、複数の腫瘍型の腫瘍の細胞質および細胞表面におけるCD73の発現を示す。
図38Bは、示される腫瘍の細胞膜におけるCD73発現のレベルを示す。この図は、図37Aに対応しているが、細胞膜におけるCD73のレベルのみを示す。
図39A〜39Hは、全腫瘍切片における免疫組織化学(IHC)によって判定される、図38Aに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるCD73の発現を示す。
図39A〜39Hは、全腫瘍切片における免疫組織化学(IHC)によって判定される、図38Aに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるCD73の発現を示す。
図39A〜39Hは、全腫瘍切片における免疫組織化学(IHC)によって判定される、図38Aに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるCD73の発現を示す。
図39A〜39Hは、全腫瘍切片における免疫組織化学(IHC)によって判定される、図38Aに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるCD73の発現を示す。
図39A〜39Hは、全腫瘍切片における免疫組織化学(IHC)によって判定される、図38Aに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるCD73の発現を示す。
図39A〜39Hは、全腫瘍切片における免疫組織化学(IHC)によって判定される、図38Aに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるCD73の発現を示す。
図39A〜39Hは、全腫瘍切片における免疫組織化学(IHC)によって判定される、図38Aに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるCD73の発現を示す。
図39A〜39Hは、全腫瘍切片における免疫組織化学(IHC)によって判定される、図38Aに示される腫瘍型の個々の腫瘍の細胞表面におけるCD73の発現を示す。
図40A〜40Fは、フローサイトメトリーによって判定される、結腸腺癌(「結腸」)、腎細胞癌腫(「腎臓」)および肺腺癌(「肺」)を有する対象の腫瘍および血液における、CD8+T細胞、CD4+FoxP3−T細胞およびCD4+FoxP3+T細胞におけるPD−1の頻度を示す。図40A〜40Fのそれぞれについて、バーは、左から右に、結腸腺癌、腎細胞癌腫および肺腺癌を有する対象に対応する。図40Aは、血液中のCD8+T細胞におけるPD−1の頻度を示す。
図40Bは、腫瘍内のCD8+T細胞におけるPD−1の頻度を示す。
図40Cは、血液中のCD4+FoxP3−細胞におけるPD−1の頻度を示す。
図40Dは、腫瘍内のCD4+FoxP3−細胞におけるPD−1の頻度を示す。
図40Eは、血液中のCD4+FoxP3+細胞におけるPD−1の頻度を示す。
図40Fは、腫瘍内のCD4+FoxP3+細胞におけるPD−1の頻度を示す。
図41A〜41Dは、5mg/kg、10mg/kgおよび20mg/kgのサロゲートマウス抗CD73抗体(mIgG1)または10mg/kgの対照マウスIgG1抗体で処置したマウスにおけるMC38腫瘍成長を示す。
図42A〜42Dは、10mg/kgの抗PD−1抗体または5mg/kg、10mg/kgもしくは20mg/kgのサロゲートマウス抗CD73抗体(mIgG1)と組み合わせた10mg/kgの抗PD−1抗体で処置したマウスにおけるMC38腫瘍成長を示す。
図43は、図42A〜42Dの実験により得られたマウスにおけるMC38腫瘍成長の中央値を示す。
図44は、図42A〜42Dの実験により得られたマウスの生存グラフを示す。
図45A〜45Dは、無段階CT26癌モデルにおける抗CD73抗体および抗PD−1抗体の組合せの抗腫瘍効果を示す。
図46は、直接検出受容体占有率アッセイ形式において使用するために試験した3つの異なる抗ヒトIgG1−PE抗体の用量依存性を示す。
図47は、正常な健康志願者から採取した全血からのCD73抗体の用量応答を示す。3人の健康なドナーからの連続濃度の本明細書に記載されるCD73抗体のB細胞上のCD73に対する受容体占有パーセントを、示す。
図48は、蛍光強度アッセイ精度の結果を示す。3人の健康なドナーからの全血を、様々な濃度のCD73抗体でスパイクした。全受容体レベル(黒塗り記号)およびCD73抗体によって結合された受容体(白抜きの記号)を示す。
図49は、導出された受容体占有率アッセイ精度の結果を示す。3人の健康なドナーからの全血サンプルを、様々な濃度のCD73抗体でスパイクし、3連で分析した。
図50は、CD73受容体占有率アッセイのために採取された全血サンプルの採取後の安定性を示す。全血サンプルを、種々の濃度のCD73抗体で処置し、採取後0、24、48および72時間で分析した。
図51は、品質管理の範囲および性能を示す。CD−Chex(登録商用)NormalのCD19+B細胞(上)およびCD8+T細胞(下)におけるCD73の総発現を、5回分析して、95%信頼区間確立した。
図52A〜52Jは、IgG1およびIgG2.C219S定常領域を含む抗CD73(CD73.4)抗体を用いて形成された抗原−抗体複合体の種類の相違を示す。パネルA〜Eは、CD73+IgG1を含む抗CD73抗体の選択されたクラス平均を示し、抗体またはCD73二量体のいずれかとしてセグメントの同定が可能である(図Aおよび図B)。拡散分岐密度(diffuse branched density)は、Fcドメインであり、クラス平均では乱雑となることが多く、一方で、Fabは、それらの特徴的な二峰性形状およびサイズによって同定することができる。Fab結合部位における残りの密度もまた、二峰性であり、およそ85Åにわたり、それが、CD73二量体であることを示す(図Aおよび図B)。他の変異形の複合体もまた、サンプル中に存在しており、種々のコンホメーションを示す(C〜E)。パネルF〜Jは、CD73およびIgG2.C219Sを含む抗体の選択されたクラス平均を示し、IgG2.C219SまたはCD73二量体のいずれかとしてセグメントの同定が可能である。Fabは、それらの特徴的な二峰性形状およびサイズによって同定することができる。Fab結合部位における残りの密度は、CD73二量体である。線形多量体のセグメントは、明確に示すことができないが、IgG2.C219Sを含む抗体およびCD73が、観察されたストリング構造体をどのように形成するかを示唆する。パネルH〜Jは、ストリング様構造体の手作業による選択からの平均を示す。アライメントは、IgG2.C219SのFabアーム上で中央にあるように見えるが、より詳細な解釈は、可能ではない。IgG1を含むCD73.4抗体およびIgG2.C219Sを含む抗体は、それぞれ、「IgG1」および「IgG2」と称される。
図53は、濃い(茶色の)染色のレベルから明らかなように、患者腫瘍サンプルにおけるヒトCD73酵素阻害を示す。「スクリーン」は、抗CD73抗体を患者に投与する前の腫瘍サンプルを指し、「投薬後」または「投与後」は、抗CD73抗体を患者に投与した後の腫瘍サンプルを指す。
図54は、示される抗体のそれぞれを添加した1、4または21時間後における、抗体媒介性CD73内部移行の割合を示す。各抗体のバーを、21時間(左)、4時間(中央)および1時間(右)の順に示す。上部の破線は、IgG2のCH1およびヒンジを有する抗体の平均内部移行割合を表し、下の破線は、IgG1のCH1およびヒンジを有する抗体の平均内部移行割合を表す。
図55AおよびBは、図54に示された内部移行パーセントを、それぞれ、1時間および4時間の時点における別個のグラフとして示す。

0027

CD73と特異的に結合し、それによって、CD73活性を低減する、単離された抗体、特に、モノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体が、本明細書に記載される(「アンタゴニスト抗CD73抗体」)。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖系列配列に由来し、および/または特定のアミノ酸配列を含むCDR領域などの特定の構造的特徴を含む。単離された抗体、このような抗体、イムノコンジュゲート、このような抗体を含む二重特異性分子および抗体を含有するよう製剤化された医薬組成物を作製する方法が、本明細書において提供される。抗体を、腫瘍成長を低減するために、単独でかまたは他の治療剤(例えば、抗体)および/または癌治療と組み合わせて使用する方法もまた、本明細書において提供される。したがって、本明細書に記載される抗CD73抗体は、例えば、腫瘍成長の阻害、転移の阻害および腫瘍に対する免疫応答の増強を含めた、様々な治療適用における治療において使用され得る。

0028

定義
本明細書において説明がより容易に理解され得るために、特定の用語をまず定義する。さらなる定義は詳細な説明を通じて示されている。

0029

用語「分化抗原群73」または「CD73」とは、本明細書において、細胞外ヌクレオシド5’一リン酸をヌクレオシドに、すなわち、アデノシン一リン酸AMP)をアデノシンに、変換することができる、酵素(ヌクレオチダーゼ)を指す。CD73は、通常、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合を通じて細胞膜と結合した二量体として見出され、エクト酵素活性を有し、シグナル伝達において役割を果たす。CD73の主要な機能は、細胞外ヌクレオチド(例えば、5’−AMP)から、高度に免疫抑制性分子であるアデノシンへのその変換である。したがって、エクト−5’−ヌクレオチダーゼは、プリンおよびピリミジンリボおよびデオキシリボヌクレオシド一リン酸から対応するヌクレオシドへの脱リン酸化を触媒する。CD73は、広範な基質特異性を有するが、プリンリボヌクレオシドが好まれる。

0030

CD73はまた、エクト−5’ヌクレアーゼ(エクト−5’NT、EC 3.1.3.5)とも称される。用語「CD73」は、細胞によって天然に発現される、CD73の任意の変異体またはアイソフォームを含む。したがって、本明細書に記載される抗体は、ヒト以外の種に由来するCD73(例えば、カニクイザルCD73)と交差反応し得る。あるいは、抗体は、ヒトCD73に特異的であり得、他の種とのいずれの交差反応性も示さない可能性がある。CD73またはその任意の変異体およびアイソフォームは、それらを天然に発現する細胞もしくは組織から単離され得るか、または当技術分野で周知の技術および/もしくは本明細書に記載されるものを使用して組換えにより産生され得るかのいずれであってもよい。

0031

ヒトCD73の2種類のアイソフォームが同定されており、それらはいずれも、同一のN末端およびC末端部分を共有する。アイソフォーム1(受託番号NP_002517.1、配列番号1)は、574個のアミノ酸および9個のエクソンからなる、長い方のタンパク質を表す。アイソフォーム2(受託番号NP_001191742.1、配列番号2)は、524個のアミノ酸からなり、アミノ酸404〜453が欠けている、短い方のタンパク質をコードする。アイソフォーム2は、選択的インフレームエクソンが欠けており、エクソンは8つのみだが同一のN末端およびC末端配列を有する転写産物をもたらす。

0032

カニクイザル(cyno)CD73タンパク質配列は、配列番号3として提供される。カニクイザルおよびcynoという用語は、いずれも、マカカ・ファクラリス(Macaca fascicularis)種を指し、本明細書全体で互換可能に使用される。

0033

本明細書において、用語「プログラム死1」、「プログラム細胞死1」、「タンパク質PD−1」、「PD−1」、「PD1」、「PDCD1」、「hPD−1」および「hPD−I」は、同義的に使用され、ヒトPD−1の変異体、アイソフォーム、種間相同体(species homologs)およびPD−1と共通のエピトープを少なくとも1つ有する類似体を含む。完全なPD−1配列は、GenBank受託番号U64863に見出すことができる。

0034

本明細書において用語「抗体」とは、全抗体および任意の抗原結合断片(すなわち「抗原結合部分」)またはその単一鎖を含み得る。「抗体」とは、一実施形態では、ジスルフィド結合によって相互接続している少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書において、VHと略される)および重鎖定常領域からなる。特定の天然に存在するIgG、IgDおよびIgA抗体では、重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3からなる。特定の天然に存在する抗体では、各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書において、VLと略される)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLからなる。VHおよびVL領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれ、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存されている領域と散在している超可変性の領域にさらに細分され得る。各VHおよびVLは、以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される、3つのCDRおよび4つのFRから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または因子、例えば、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および伝統的な補体系の第1の成分(Clq)との結合を媒介し得る。

0035

抗体の重鎖は、末端リシン(K)または末端グリシンおよびリシン(GK)を含んでもよくまたは含まなくてもよい。したがって、本明細書において提供される重鎖配列および重鎖定常領域配列のいずれも、GKもしくはGで終了し得るか、または配列の最後のアミノ酸が何になるかに関係なく、KもしくはGKが欠けていてもよい。これは、末端リシンならびに場合によりグリシンおよびリシンが、抗体の発現の際に切断されるためである。

0036

抗体は、通常、そのコグネイト抗原と、10−7〜10−1M以下の解離定数(KD)によって反映される高親和性で特異的に結合する。約10−6Mより大きい任意のKDは、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。本明細書において、抗原と「特異的に結合する」抗体とは、抗原および実質的に同一の抗原と、10−7M以下、好ましくは、10−8M以下、さらにより好ましくは、5×10−9M以下、最も好ましくは、10−8Mから10−10M以下の間のKDを有することを意味する高親和性で結合するが、無関係の抗原とは高親和性で結合しない抗体である。抗原は、所与の抗原に対して高度の配列同一性を示す場合には、例えば、所与の抗原の配列に対して、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%または少なくとも99%、またはそれ以上の配列同一性を示す場合に、所与の抗原と「実質的に同一」である。例として、ヒトCD73と特異的に結合する抗体は、特定の非ヒト霊長類種(例えば、カニクイザル)に由来するCD73とまた交差反応し得るが、その他の種に由来するCD73と、またはCD73以外の抗原とは交差反応し得ない。

0037

免疫グロブリンは、それだけには限らないがIgA分泌型IgA、IgGおよびIgMを含めた、よく知られているアイソタイプのいずれかに由来し得る。IgGアイソタイプは、特定の種ではサブクラスに分けられる:ヒトでは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4ならびにマウスでは、IgG1、IgG2a、IgG2bおよびIgG3。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗CD73抗体は、ヒトIgG1またはIgG2サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えば、ヒトIgG1は、多くても2、3個のアミノ酸で互いに異なるいくつかのアロタイプで存在する。「抗体」は、例として、天然に存在する抗体および天然に存在しない抗体の両方、モノクローナルおよびポリクローナル抗体キメラおよびヒト化抗体、ヒトおよび非ヒト抗体、完全合成抗体ならびに一本鎖抗体を含み得る。

0038

本明細書において、用語、抗体の「抗原結合部分」は、抗原(例えば、ヒトCD73)と特異的に結合する能力を保持する抗体の1種または複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実施され得ることが示されている。抗体、例えば、本明細書に記載される抗CD73抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価の断片であるFab断片、(ii)ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価の断片であるF(ab’)2断片、(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、(iv)抗体の一本のアームのVLおよびVHドメインからなるFv断片、(v)VHドメインからなるdAb断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)、ならびに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)、または(vii)適宜合成リンカーによって接続され得る2つ以上の単離されたCDRの組合せを含む。さらに、Fv断片の2つのドメイン、VLおよびVHは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、VLおよびVH領域対が、一本鎖Fv(scFv)として知られる;例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照のこと、一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによる組換え方法を使用して接続され得る。このような一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合部分」内に包含されるものとする。これらおよびその他の可能性あるコンストラクトは、Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301に記載されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えDNA技術によって、または無傷の免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって生産され得る。

0039

二重特異性」または「二機能性抗体」は、2つの異なる重鎖/軽鎖対を有し、異なる抗原に対して特異性を有する2つの抗原結合部位を生じさせる人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab’断片の連結を含めた種々の方法によって生産できる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)を参照のこと。

0040

本明細書において、用語「モノクローナル抗体」とは、特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す抗体またはすべての抗体が特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す抗体の組成物を指す。通常、このようなモノクローナル抗体は、抗体をコードする単一細胞または核酸に由来し、任意の配列変更を意図的に導入することなく増殖され得る。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および適宜定常領域を有するモノクローナル抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、トランスジェニックまたは導入染色体非ヒト動物(例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス)から得られたB細胞を不死化された細胞と融合することによって得られたハイブリドーマによって産生される。

0041

本明細書において、用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製され、発現され、作製されるか、または単離されたすべてのヒト抗体、例えば、(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックまたは導入染色体またはそれから調製されたハイブリドーマである動物(例えば、マウス)から単離された抗体、(b)抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、(c)組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体および(d)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のDNA配列へのスプライシングを含む任意のその他の手段によって調製され、発現され、作製されるか、または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用し、生殖系列遺伝子によってコードされる可変および定常領域を含むが、その後の再編成および例えば、抗体成熟の間に起こる突然変異を含む。当技術分野で公知のように(例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125を参照のこと)、可変領域は、外来抗原に対して特異的な抗体を形成するよう再編成する種々の遺伝子によってコードされる抗原結合ドメインを含有する。可変領域は、再配列に加えて、外来抗原に対する抗体の親和性を増大するよう、複数の単一アミノ酸変更(体細胞突然変異または高頻度突然変異とも呼ばれる)によってさらに修飾され得る。定常領域は、抗原にさらに応じて変化する(すなわち、アイソタイプスイッチ)。したがって、抗原に応じた、軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再編成され、体細胞突然変異された核酸配列は、元の生殖系列配列と同一ではない場合があるが、代わりに、実質的に同一または同様となる(すなわち、少なくとも80%の同一性を有する)。

0042

「ヒト」抗体(HuMAb)とは、フレームワークおよびCDR領域の両方が、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含有する場合には、定常領域はまた、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本明細書に記載される抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボでの体細胞突然変異によって導入された突然変異)を含み得る。しかし、本明細書において、用語「ヒト抗体」はマウスなどの別の哺乳類種の生殖系列に由来するCDR配列が、ヒトフレームワーク配列グラフトされている抗体を含むよう意図されない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は、同義的に使用される。

0043

ヒト化」抗体とは、非ヒト抗体のCDRドメインの外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたはすべてが、ヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換されている抗体を指す。抗体のヒト化形態の一実施形態では、CDRドメインの外側のアミノ酸の一部、ほとんどまたはすべてが、ヒト免疫グロブリンに由来するアミノ酸で置換されているが、1つまたは複数のCDR領域内の一部、ほとんどまたはすべてのアミノ酸は変更されていない。アミノ酸の小さい付加、欠失、挿入または置換または修飾は、抗体の特定の抗原と結合する能力を抑制しない限り許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体のものと同様の抗原特異性を保持する。

0044

キメラ抗体」とは、可変領域がマウス抗体に由来し、定常領域がヒト抗体に由来する抗体などの、可変領域がある種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体を指す。

0045

「修飾された重鎖定常領域」とは、定常ドメインCH1、ヒンジ、CH2およびCH3を含み、定常ドメインのうちの1つまたは複数が、異なるアイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)に由来する、重鎖定常領域を指す。特定の実施形態では、修飾された定常領域は、ヒトIgG2 CH1ドメインおよびヒトIgG1 CH2ドメインに融合されたヒトIgG2ヒンジおよびヒトIgG1 CH3ドメインを含む。特定の実施形態では、そのような修飾された定常領域はまた、野生型アミノ酸配列と比べて、ドメインのうちの1つまたは複数内にアミノ酸修飾を含む。

0046

本明細書において、定常領域の同一性を示すことなく「CD73.3」または「CD73.4」として抗体に言及する場合、別途示されない限り、それぞれ、CD73.3またはCD73.4の可変領域を、本明細書に記載される任意の定常領域とともに有する抗体を指す。

0047

本明細書において、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgDおよびIgE抗体)を指す。

0048

「アロタイプ」とは、特定のアイソタイプ群内の天然に存在する変異体を指し、これらの変異体は、2、3個のアミノ酸で異なっている(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと)。本明細書に記載される抗体は、任意のアロタイプのものであり得る。

0049

本明細書において別途指定されない限り、すべてのアミノ酸の番号は、カバットステム(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)のEU指数に従う。

0050

語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」は、本明細書において、用語「抗原と特異的に結合する抗体」と同義的に使用される。

0051

本明細書において「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする(例えば、CD73と特異的に結合する単離された抗体は、CD73以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかし、CD73のエピトープと特異的に結合する単離された抗体は、異なる種に由来するその他のCD73タンパク質と交差反応性を有し得る。

0052

本明細書において、「CD73を阻害する」抗体は、CD73の生物学的および/または酵素的機能を阻害する抗体を指す。これらの機能としては、例えば、抗体がCD73酵素活性、例えば、CD73により制御されるアデノシンの産生またはcAMP産生の低減を阻害する能力が挙げられる。

0053

本明細書において、「内部移行する」抗体とは、細胞表面抗原と結合すると細胞膜を越える抗体を指す。内部移行には、抗体媒介性受容体、例えば、CD73内部移行が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体は、約10分またはそれ以下のT1/2の速度で、CD73を発現する細胞に「内部移行する」。

0054

「エフェクター機能」とは、抗体のFc領域Fc受容体もしくはリガンドとの相互作用、またはそれにより生じる生化学的事象を指す。例示的「エフェクター機能」は、Clq結合、補体依存性細胞傷害性(CDC)、Fc受容体結合、ADCCおよび抗体依存性細胞媒介性食作用ADCP)などのFcγR媒介性エフェクター機能ならびに細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体;BCR)の下方制御を含む。このようなエフェクター機能は、一般に、結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わされるFc領域を必要とする。

0055

「Fc受容体」または「FcR」は、免疫グロブリンのFc領域と結合する受容体である。IgG抗体と結合するFcRは、対立遺伝子変異体およびこれらの受容体の別法としてスプライシングされた形態を含めたFcγRファミリーの受容体を含む。FcγRファミリーは、3種の活性化(マウスではFcγRI、FcγRIIIおよびFcγRIV;ヒトではFcγRIA、FcγRIIAおよびFcγRIIIA)および1種の阻害性(FcγRIIB)受容体からなる。ヒトFcγRの種々の特性は、表1に要約されている。先天性エフェクター細胞種の大部分は、1種または複数の活性化FcγRおよび阻害性FcγRIIBを同時に発現するが、ナチュラルキラー(NK)細胞は、1種の活性化Fc受容体(マウスではFcγRIIIおよびヒトではFcγRIIIA)を選択的に発現するが、マウスおよびヒトにおいて阻害性FcγRIIBを発現しない。ヒトIgG1は、ほとんどのヒトFc受容体と結合し、結合する活性化Fc受容体の種類に関してマウスIgG2aと同等と考えられる。

0056

0057

「ヒンジ」、「ヒンジドメイン」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」とは、CH1ドメインをCH2ドメインに接続する、重鎖定常領域のドメインを指し、ヒンジの上部、中部および下部を含む(Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083)。ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域との間に多様なレベルの可動性をもたらし、2つの重鎖定常領域間での分子間ジスルフィド結合のための部位も提供する。本明細書において、ヒンジは、すべてのIgGアイソタイプについて、Glu216で開始し、Gly237で終了する(Roux et al., 1998 J Immunol 161:4083)。野生型IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4のヒンジの配列は、表2および37に示されている。

0058

0059

用語「ヒンジ」は、野生型ヒンジ(表2および37に記載されるものなど)、ならびにその変異体(例えば、天然に存在しないヒンジまたは修飾されたヒンジ)を含む。例えば、用語「IgG2ヒンジ」は、表2に示されるような野生型IgG2ヒンジならびに1個、2個、3個、4個、5個、1〜3個、1〜5個、3〜5個および/または多くとも5個、4個、3個、2個もしくは1個の突然変異、例えば、置換、欠失または付加を有する変異体を含む。例示的IgG2ヒンジ変異体として、1個、2個、3個または4個すべてのシステイン(C219、C220、C226およびC229)が、別のアミノ酸に変化しているIgG2ヒンジが挙げられる。具体的な実施形態では、IgG2は、C219S置換を含む。IgG2ヒンジはまた、C220における置換またはC219およびC220の両方における置換を含み得る。IgG2ヒンジは、置換を含み得、この置換は、単独でかまたは重鎖もしくは軽鎖の他の領域における1つもしくは複数の置換と一緒に、抗体に形態AまたはBをとらせることになる(例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755を参照のこと)。特定の実施形態では、ヒンジは、少なくとも2種のアイソタイプに由来する配列を含む、ハイブリッドヒンジである。例えば、ヒンジは、1種のアイソタイプに由来する上部、中部または下部ヒンジを含み、ヒンジの残りの部分が1種または複数のアイソタイプに由来してもよい。例えば、ヒンジは、IgG2/IgG1ヒンジであってもよく、例えば、IgG2の上部および中部ヒンジならびにIgG1の下部ヒンジを含み得る。ヒンジは、エフェクター機能を有してもよく、またはエフェクター機能が欠けていてもよい。例えば、野生型IgG1の下部ヒンジは、エフェクター機能を提供する。

0060

用語「CH1ドメイン」とは、重鎖定常ドメインにおいて可変ドメインをヒンジと連結する重鎖定常領域を指す。本明細書において、CH1ドメインは、A118で開始し、V215で終了する。用語「CH1ドメイン」は、野生型CH1ドメイン(IgG1については配列番号98およびIgG2については配列番号124を有するものなど)ならびにそれらの変異体(例えば、天然に存在しないCH1ドメインまたは修飾されたCH1ドメイン)を含む。例えば、用語「CH1ドメイン」は、野生型CH1ドメインならびに1個、2個、3個、4個、5個、1〜3個、1〜5個、3〜5個および/または多くとも5個、4個、3個、2個もしくは1個の突然変異、例えば、置換、欠失または付加を有するそれらの変異体を含む。例示的CH1ドメインとして、ADCC、CDCまたは半減期など、抗体の生物活性を修飾する、突然変異を有するCH1ドメインが挙げられる。抗体の生物活性に影響を及ぼすCH1ドメインへの修飾が、本明細書において提供される。CH1ドメインは、置換C131Sを含み得、この置換により、IgG2抗体またはIgG2抗体の少なくとも一部分、例えば、ヒンジならびに/もしくはヒンジおよびCH1を含む抗体は、抗体のA形態とは対照的なB形態をとることになり得る。

0061

用語「CH2ドメイン」とは、重鎖定常ドメインにおいてヒンジをCH3ドメインに連結する重鎖定常領域を指す。本明細書において、CH2ドメインは、P238で開始し、K340で終了する。用語「CH2ドメイン」は、野生型CH2ドメイン(IgG1については配列番号137を有するものなど;表37)ならびにそれらの変異体(例えば、天然に存在しないCH2ドメインまたは修飾されたCH2ドメイン)を含む。例えば、用語「CH2ドメイン」は、野生型CH2ドメインならびに1個、2個、3個、4個、5個、1〜3個、1〜5個、3〜5個および/または多くとも5個、4個、3個、2個もしくは1個の突然変異、例えば、置換、欠失または付加を有するそれらの変異体を含む。例示的CH2ドメインとして、ADCC、CDCまたは半減期など、抗体の生物活性を修飾する、突然変異を有するCH2ドメインが挙げられる。特定の実施形態では、CH2ドメインは、エフェクター機能を低減する置換A330S/P331Sを含む。抗体の生物活性に影響を及ぼすCH2ドメインへの他の修飾が、本明細書において提供される。

0062

用語「CH3ドメイン」とは、重鎖定常ドメインにおいてCH2ドメインに対してC末端側である、重鎖定常領域を指す。本明細書において、CH3ドメインは、G341で開始し、K447で終了する。用語「CH3ドメイン」は、野生型CH3ドメイン(IgG1については配列番号138を有するものなど;表37)ならびにそれらの変異体(例えば、天然に存在しないCH3ドメインまたは修飾されたCH3ドメイン)を含む。例えば、用語「CH3ドメイン」は、野生型CH3ドメインならびに1個、2個、3個、4個、5個、1〜3個、1〜5個、3〜5個および/または多くとも5個、4個、3個、2個もしくは1個の突然変異、例えば、置換、欠失または付加を有するそれらの変異体を含む。例示的CH3ドメインとして、ADCC、CDCまたは半減期など、抗体の生物活性を修飾する、突然変異を有するCH3ドメインが挙げられる。抗体の生物活性に影響を及ぼすCH3ドメインへの修飾が、本明細書において提供される。

0063

「CLドメイン」とは、軽鎖の定常ドメインを指す。用語「CLドメイン」は、野生型CLドメインおよびそれらの変異体、例えば、C214Sを含む変異体を含む。

0064

天然配列Fc領域」または「天然配列Fc」は、自然界において見られるFc領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトFc領域は、天然配列ヒトIgG1 Fc領域、天然配列ヒトIgG2 Fc領域、天然配列ヒトIgG3 Fc領域および天然配列ヒトIgG4 Fc領域ならびにそれらの天然に存在する変異体を含む。天然配列Fcは、Fcの種々のアロタイプを含む(例えば、Jefferis et al. (2009) mAbs 1:1を参照のこと)。

0065

用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原(例えば、CD73)上の部位を指す。タンパク質抗原内のエピトープは、連続アミノ酸(普通、直鎖エピトープ)またはタンパク質の三次元フォールディングによって並置された非連続アミノ酸(普通、コンホメーションエピトープ)の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、通常、必ずではないが、変性溶媒に対する曝露の際に保持されるが、三次元フォールディングから形成されるエピトープは、通常、変性溶媒を用いる処理の際に失われる。エピトープは、通常、独特の空間コンホメーション中に少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個のアミノ酸を含む。所与の抗体(すなわち、エピトープマッピング)によって結合されるエピトープを決定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、(例えば、CD73に由来する)重複ペプチドまたは連続ペプチドが、所与の抗体(例えば、抗CD73抗体)との反応性について試験される、免疫ブロット法および免疫沈降アッセイが挙げられる。エピトープの空間コンホメーションを決定する方法として、当技術分野における技術および本明細書に記載される技術、例えば、X線結晶学、2次元核磁気共鳴およびHDX−MS(例えば、Epitope MappingProtocols in Methodsin Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照のこと)が挙げられる。

0066

用語「エピトープマッピング」とは、抗体抗原認識関与する抗原上の分子決定基の同定のプロセスを指す。

0067

2種以上の抗体に関して、用語「同一エピトープと結合する」は、所与の方法によって決定されるように、抗体がアミノ酸残基の同一セグメントと結合することを意味する。本明細書に記載される抗体を用いて、抗体が「CD73上の同一エピトープ」と結合するか否かを調べる技術として、例えば、エピトープの原子分解を提供する抗原:抗体複合体の結晶X線分析および水素重水素交換質量分析(HDX−MS)などのエピトープマッピング方法が挙げられる。その他の方法は、抗体の抗原断片(例えば、タンパク質分解断片)との、または抗原の突然変異された変動との結合をモニタリングし、これでは、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の喪失が、エピトープ成分の指標と考えられることが多い(例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発- Cunningham & Wells (1985) Science 244:1081)。さらに、エピトープマッピングのための計算コンビナトリアル法を使用してもよい。これらの方法は、対象の抗体の、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリーから特異的な短いペプチドを親和性単離する能力に依存する。

0068

「標的との結合について別の抗体と競合する」抗体とは、その他の抗体の標的との結合を阻害する(部分的にまたは完全に)抗体を指す。2種の抗体が、標的との結合について互いに競合するか否か、すなわち、ある抗体が、その他の抗体の標的との結合を阻害するか否か、およびどの程度阻害するかは、公知の競合実験、例えば、実施例に記載されるものなどを使用して調べてもよい。特定の実施形態では、抗体は、別の抗体の標的との結合と、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%競合する、阻害する。阻害または競合のレベルは、どの抗体が「ブロッキング抗体」であるか(すなわち、標的とともに最初にインキュベートされるコールド抗体)に応じて異なり得る。競合アッセイは、例えば、Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi:10.1101/pdb.prot4277 or in Chapter 11 of "Using Antibodies" by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999に記載されるように実施できる。競合抗体は、同一エピトープと、重複エピトープとまたは隣接するエピトープ(例えば、立体障害によって証明されるような)と結合する。

0069

その他の競合結合アッセイとして、固相直接または間接ラジオイムノアッセイ(RIA)、固相直接または間接酵素イムノアッセイEIA)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methodsin Enzymology 9:242 (1983)を参照のこと);固相直接ビオチンアビジンEIA(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)を参照のこと);固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)を参照のこと);I−125標識を使用する固相直接標識RIA(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)を参照のこと);固相直接ビオチン−アビジンEIA(Cheung et al., Virology 176:546 (1990));および直接標識化RIA(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990))が挙げられる。

0070

本明細書において、用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」および「特異的に結合する」とは、所定の抗原上のエピトープとの、その他の抗原とではない抗体結合を指す。通常、抗体は、(i)例えば、分析物として所定の抗原、例えば、組換えヒトCD73およびリガンドとして抗体を使用したBIACORE(登録商標)2000表面プラズモン共鳴機器における表面プラズモン共鳴(SPR)技術または抗体の抗原陽性細胞との結合のスキャッチャード解析法によって決定される場合に、およそ10−7M未満、例えば、およそ10−8M、10−9Mまたは10−10M未満またはさらにそれより小さい平衡解離定数(KD)で結合し、(ii)所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原(例えば、BSA、カゼイン)との結合に対するその親和性よりも、少なくとも2倍大きい親和性で所定の抗原と結合する。したがって、別途示されない限り、「ヒトCD73と特異的に結合する」抗体とは、10−7M以下、例えば、およそ10−8M、10−9Mまたは10−10M未満またはさらにそれより小さいKDで、可溶性または細胞結合型ヒトCD73と結合する抗体を指す。「カニクイザルCD73と交差反応する」抗体とは、10−7M以下、例えば、およそ10−8M、10−9Mまたは10−10M未満またはさらにそれより低いKDでカニクイザルCD73と結合する抗体を指す。特定の実施形態では、非ヒト種由来のCD73と交差反応しない抗体は、標準結合アッセイにおいて、これらのタンパク質に対して本質的に検出不可能な結合を示す。

0071

本明細書において、用語「kassoc」または「ka」とは、特定の抗体抗原相互作用の会合速度定数を指すものとするのに対し、本明細書において、用語「kdis」または「kd」は、特定の抗体抗原相互作用の解離速度定数を指すものとする。用語「KD」は、本明細書において、平衡解離定数を指すものとし、これはkaに対するkdの割合(すなわち、kd/ka)から得られ、モル濃度(M)として表される。抗体のKD値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定できる。抗体のKDを決定する好ましい方法は、好ましくは、Biacore(登録商標)表面プラズモン共鳴システムなどのバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード解析法を使用することによるものである。

0072

用語、抗体またはその抗原結合断片を使用するインビトロまたはインビボアッセイに関連して「EC50」とは、最大応答の50%、すなわち、最大応答とベースラインの間の中間である応答を誘導する抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。

0073

抗体の、または抗体、例えば、抗CD73抗体によって媒介される受容体、例えば、CD73の「内部移行速度」は、例えば、例として、実施例に示されるように、内部移行のT1/2によって表され得る。抗CD73抗体の内部移行速度は、抗体の重鎖定常領域を修飾された重鎖定常領域、例えば、IgG2ヒンジおよびIgG2 CH1ドメインを含むものに変更することによって、少なくとも10%、30%、50%、75%、2倍、3倍、5倍またはそれ以上増強または増大され得、結果として、T1/2が少なくとも10%、30%、50%、75%、2分の1、3分の1、5分の1またはそれよりも低減され得る。例えば、10分間というT1/2を有する代わりに、修飾された重鎖定常領域は、内部移行速度を増大させ、それによって、T1/2を5分間に低減することができる(すなわち、内部移行速度を2倍に増大またはT1/2を2分の1に減少)。「T1/2」は、抗体が細胞に添加された時間から測定して、最大内部移行の半分が達成される時間として定義される。内部移行の最大レベルは、抗体濃度に対してプロットした内部移行を表すグラフのプラトーにおける内部移行レベルであり得る。修飾された重鎖定常領域は、抗体の内部移行の最大レベルを、少なくとも10%、30%、50%、75%、2倍、3倍、5倍またはそれ以上増大させ得る。異なる抗体、例えば、修飾された重鎖定常領域を有する抗体およびそれを有さない同一抗体の内部移行効力を比較する別の方法は、所与の抗体濃度(例えば、100nM)または所与の時間(例えば、2分間、5分間、10分間または30分間)におけるそれらの内部移行レベルを比較することによるものである。内部移行レベルの比較は、内部移行のEC50レベルを比較することによって行うこともできる。ある抗体の内部移行レベルは、所与の(参照)抗体、例えば、本明細書に記載される抗体、例えば、11F11またはCD73.4−IgG2CS−IgG1またはCD73.4−IgG2CS−IgG1.1fのものに対して定義され得、所与の(参照)抗体で得られた値に対する割合として示され得る。内部移行の程度は、これらの方法のうちのいずれか1つによって比較した場合に、少なくとも10%、30%、50%、75%、2倍、3倍、5倍またはそれ以上増強され得る。

0074

用語、本明細書において対象に適用されるような「天然に存在する」とは、対象が自然界において見出され得るという事実を指す。例えば、実験室において人によって意図的に修飾されていない、自然界における供給源から単離され得る生物(ウイルスを含む)中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列が天然に存在する。

0075

「ポリペプチド」とは、少なくとも2個の連続して連結しているアミノ酸残基を含む鎖を指し、鎖の長さに上限はない。タンパク質中の1個または複数のアミノ酸残基は、それだけには限らないが、グリコシル化リン酸化またはジスルフィド結合などの修飾を含有し得る。「タンパク質」は、1つまたは複数のポリペプチドを含み得る。

0076

用語「核酸分子」とは、本明細書において、DNA分子およびRNA分子を含むものとする。核酸分子は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、cDNAであり得る。特定の実施形態では、DNA分子は、天然に存在するDNA分子を包含しない。

0077

本明細書に記載される配列番号に記載される配列の「保存的配列修飾」、すなわち、ヌクレオチド配列によってコードされるか、またはアミノ酸配列を含有する抗体の、抗原との結合を抑制しない、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列修飾も提供される。このような保存的配列修飾として、保存的ヌクレオチドおよびアミノ酸置換ならびにヌクレオチドおよびアミノ酸付加および欠失が挙げられる。例えば、修飾は、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発などの当技術分野で公知の標準技術によって本明細書に記載される配列番号に導入され得る。保存的配列修飾として、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される保存的アミノ酸置換が挙げられる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニンヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギングルタミンセリントレオニンチロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリンロイシンイソロイシンプロリンフェニルアラニンメチオニン)、β分枝側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、抗CD73抗体中の予想される非必須アミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基と置換されることが好ましい。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である(例えば、Brummel et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999);およびBurks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)を参照のこと)。

0078

あるいは、別の実施形態では、突然変異は、飽和突然変異誘発などによって抗CD73抗体コード配列のすべてかまたは一部に沿って無作為に導入され得、得られた修飾された抗CD73抗体は、改善された結合活性についてスクリーニングされ得る。

0079

核酸については、用語「実質的な相同性」は、2種の核酸またはその指定された配列は、最適にアラインされ、比較される場合に、ヌクレオチドの少なくとも約80%、普通、少なくとも約90%〜95%、より好ましくは、ヌクレオチドの少なくとも約98%〜99.5%において適当なヌクレオチド挿入または欠失を用いて同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、鎖の相補体ハイブリダイズする場合に、実質的な相同性が存在する。

0080

ポリペプチドについては、用語「実質的な相同性」は、2種のポリペプチドまたはその指定された配列が、最適にアラインされ、比較される場合に、アミノ酸の少なくとも約80%、普通、少なくとも約90%〜95%、より好ましくは、アミノ酸の少なくとも約98%〜99.5%において適当なアミノ酸挿入または欠失を用いて同一であることを示す。

0081

2種の配列間の同一性パーセントは、配列が最適にアラインされる場合に配列によって共有される同一位置の数の関数であり(すなわち、相同性%=同一位置の数/位置の総数×100)、最適アラインメントは、2種の配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮して決定される。2種の配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、以下の限定されない例に記載されるように、数学アルゴリズムを使用して達成され得る。

0082

2種のヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、GCソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)中のGAPプログラムを使用して、NWSgapdna.CMPマトリックスおよび40、50、60、70または80のギャップ加重および1、2、3、4、5または6の長さ加重を使用して決定できる。2種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ALIGNプログラムバージョン2.0)に組み込まれているE. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム(CABIOS, 4:11-17 (1989))を使用し、PAM120加重残基表、12のギャップ長ペナルティーおよび4のギャップペナルティーを使用して決定できる。さらに、2種のアミノ酸配列間の同一性パーセントは、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで入手可能)中のGAPプログラム中に組み込まれたNeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズムを使用し、Blossum 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかおよび16、14、12、10、8、6または4のギャップ加重および1、2、3、4、5または6の長さ加重を使用して決定できる。

0083

本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するための公開データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」としてさらに使用され得る。このような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)を使用して実施され得る。本明細書に記載された核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて実施できる。本明細書に記載されたタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長(wordlength)=3を用いて実施できる。比較目的でギャップ付きアラインメント得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic AcidsRes. 25(17):3389-3402に記載されるようなギャップ付きBLASTを利用できる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター(例えば、XBLASTおよびNBLAST)を使用できる。www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。

0084

核酸は、全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分精製されたかもしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ/SDS処理、CsClバンド形成カラムクロマトグラフィーアガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知のその他のものを含めた標準技術によって、その他の細胞成分またはその他の夾雑物、例えば、その他の細胞性核酸(例えば、染色体のその他の部分)またはタンパク質から精製された場合に「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと。

0085

核酸、例えば、cDNAは、遺伝子配列を提供するための標準技術に従って突然変異してもよい。コード配列については、これらの突然変異は、所望されるアミノ酸配列に影響を及ぼし得る。特に、天然のV、D、J、定常、スイッチおよび本明細書に記載される他のそのような配列と実質的に相同であるか、またはそれらに由来する、DNA配列が考慮される。

0086

本明細書において、用語「ベクター」は、それに連結している別の核酸を輸送可能な核酸分子を指すものとする。ある種のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるDNAセグメントライゲーションされ得る環状二本鎖DNAループを指す。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、これでは、さらなるDNAセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製可能である(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。その他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製され得る。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示可能である。このようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」(または単に「発現ベクター」)と呼ばれる。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドは、ベクターの最もよく使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は、同義的に使用され得る。しかし、同等の機能を果たす、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルスアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などのその他の形態の発現ベクターもまた含まれる。

0087

用語「組換え宿主細胞」(または単に「宿主細胞」)は、本明細書において、細胞中に天然に存在しない核酸を含み、組換え発現ベクターが導入されている細胞であり得る細胞を指すものとする。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけではなく、このような細胞の後代も指すということは理解されなければならない。特定の修飾は、突然変異または環境的影響のいずれかによって後世において起こり得るので、このような後代は実際、親の細胞と同一ではない場合もあるが、本明細書において、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。

0088

本明細書において、用語「抗原」とは、タンパク質、ペプチドまたはハプテンなど、任意の天然または合成の免疫原性物質を指す。抗原は、CD73またはその断片であり得る。

0089

「免疫応答」とは、外来作用物質に対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、この応答が、これらの作用物質およびそれらによって引き起こされる疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の細胞(例えば、Tリンパ球Bリンパ球、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ好酸球肥満細胞樹状細胞または好中球)およびこれらの細胞のいずれかまたは肝臓によって産生される可溶性高分子(抗体、サイトカインおよび補体を含む)の作用によって媒介され、これは、進入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌性もしくはその他の異常な細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合には、正常なヒト細胞もしくは組織との選択的標的化、結合、損傷、破壊および/またはそれらの脊椎動物の身体からの排除をもたらす。免疫応答または反応は、例えば、T細胞、例えば、CD4+もしくはCD8+T細胞などのエフェクターT細胞もしくはTh細胞の活性化もしくは阻害またはTreg細胞の阻害を含む。

0090

免疫調節物質(immunomodulator)」または「免疫制御物質(immunoregulator)」とは、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得る作用物質、例えば、シグナル伝達経路の成分を指す。免疫応答の「調節」、「制御」または「修飾」とは、免疫系の細胞における、またはこのような細胞(例えば、エフェクターT細胞)の活性における任意の変更を指す。このような調節は、免疫系の刺激または抑制を含み、種々の細胞型の数の増大もしくは減少、これらの細胞の活性の増大もしくは減少または免疫系内で起こり得る任意のその他の変化によって示され得る。阻害的および刺激的免疫調節物質の両方とも同定されており、その一部は、腫瘍微小環境において増強された機能を有し得る。免疫調節物質は、T細胞の表面に位置し得る。「免疫調節性標的」または「免疫制御性標的」は、物質、作用物質、部分、化合物または分子による結合に対して標的化される免疫調節物質であり、その活性は、物質、作用物質、部分、化合物または分子の結合によって変更される。免疫調節性標的は、例えば、細胞の表面の受容体(「免疫調節性受容体」)および受容体リガンド(「免疫調節性リガンド」)を含む。

0091

免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、T細胞共刺激受容体の増強されたアゴニスト活性および/または阻害性受容体の増強されたアンタゴニスト活性に起因し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解活性標的細胞上で直接的にまたはCD107aもしくはグランザイムの検出を介して間接的に決定される)および増殖における変化を測定するアッセイにおける、EC50または最大活性レベルの倍増が反映され得る。免疫応答または免疫系の活性を刺激する能力は、少なくとも10%、30%、50%、75%、2倍、3倍、5倍またはそれ以上増強され得る。

0092

免疫療法」とは、免疫応答を誘導、増強、抑制またはそうでなければ修飾することを含む方法によって、疾患の再発苦しむまたは、それを起こすまたは患う危険にある対象の治療を指す。

0093

免疫賦活性(immunostimulating)療法」または「免疫賦活性(immunostimulatory)療法」とは、例えば、癌を治療するための、対象における免疫応答の増大(誘導または増強)をもたらす療法を指す。

0094

内因性免疫応答を増強する」とは、対象における既存の免疫応答の有効性または効力を増大することを意味する。この有効性および効力の増大は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機序を克服することによって、または内因性宿主免疫応答を増強する機序を刺激することによって達成され得る。

0095

「Tエフェクター」(「Teff」)細胞とは、サイトカインを分泌し、その他の免疫細胞を活性化し、指示する、細胞溶解活性を有するT細胞(例えば、CD4+およびCD8+T細胞)ならびにTヘルパー(Th)細胞を指すが、調節T細胞(Treg細胞)を含まない。

0096

本明細書において、用語「連結している」とは、2つ以上の分子の会合を指す。連結は、共有結合である場合も、非共有結合である場合もある。連結はまた、遺伝的であり(すなわち、組換えによって融合され)得る。このような連結は、化学的コンジュゲーションおよび組換えタンパク質生産などの様々な当技術分野において認識される技術を使用して達成され得る。

0097

本明細書において、「投与すること」は、当業者に公知の種々の方法および送達システムのいずれかを使用して、治療薬を含む組成物の対象への物理的導入を指す。本明細書に記載される抗体の好ましい投与経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または例えば、注射もしくは注入によるその他の非経口投与経路を含む。本明細書において、語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の、普通、注射による投与様式を意味し、制限するものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内リンパ内、病巣内、関節内、眼窩内心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、下、くも膜下脊髄内硬膜外および胸骨内注射および注入ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。あるいは、本明細書に記載される抗体は、局所上皮または粘膜投与経路などの非経口ではない経路によって、例えば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、直腸性に、下にまたは局所的に投与され得る。投与することは、例えば、1回、複数回および/または1回もしくは複数回の長期間にわたって実施され得る。

0098

本明細書において、用語「T細胞媒介性応答」とは、エフェクターT細胞(例えば、CD8+細胞)およびヘルパーT細胞(例えば、CD4+細胞)を含めたT細胞によって媒介される応答を指す。T細胞媒介性応答は、例えば、T細胞細胞傷害性および増殖を含む。

0099

本明細書において、用語「細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答」とは、細胞傷害性T細胞によって誘導される免疫応答を指す。CTL応答は、CD8+T細胞によって主に媒介される。

0100

本明細書において、用語「阻害する」または「遮断する」(例えば、CD73結合または活性の阻害/遮断を指す)は、同義的に使用され、部分的および完全阻害/遮断の両方を包含する。

0101

本明細書において、「癌」は、身体中での異常な細胞の制御されない成長を特徴とする疾患の広い群を指す。未制御細胞分裂は、隣接する組織へ浸潤し、リンパ系または血流によって身体の遠隔部位へ転移し得る悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得る。

0102

用語「治療する」、「治療すること」および「治療」とは、本明細書において、症状の進行、発生、重症度もしくは再発、合併症疾病と関連している状態または生化学的兆候逆転させ、軽減し、寛解し、阻害し、または減速することを目的とした、対象で実施される任意の種類の介入もしくはプロセスまたは対象へ活性薬剤を投与することを指す。予防とは、疾患が発生するのを防ぐため、またはそれが起こる場合にはその効果を最小化するための、疾患を有していない対象への投与を指す。

0103

血液悪性腫瘍」は、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ系悪性腫瘍ならびに脾臓およびリンパ節の癌を含む。例示的リンパ腫として、B細胞リンパ腫およびT細胞リンパ腫の両方が挙げられる。B細胞リンパ腫は、ホジキンリンパ腫およびほとんどの非ホジキンリンパ腫の両方を含む。B細胞リンパ腫の限定されない例として、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ性リンパ腫(慢性リンパ性白血病と重複する)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、バーキットリンパ腫縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症結節性辺縁帯B細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症が挙げられる。T細胞リンパ腫の限定されない例として、節外性T細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫未分化大細胞リンパ腫および血管免疫芽球性T細胞リンパ腫が挙げられる。血液悪性腫瘍としてまた、それだけには限らないが、続発性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病慢性骨髄性白血病および急性リンパ性白血病などの白血病も挙げられる。血液悪性腫瘍として、さらにそれだけには限らないが、多発性骨髄腫およびくすぶり型多発性骨髄腫などの骨髄腫も挙げられる。その他の血液系および/またはB細胞もしくはT細胞関連癌が、用語血液悪性腫瘍によって包含される。

0104

用語「有効用量」または「有効投与量」は、所望の効果を達成または少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。薬物または治療薬の「治療上有効な量」または「治療上有効な投与量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて使用される場合に、疾患症状の重症度の低減、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大または疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止によって証明される疾患退縮を促進する薬物の任意の量である。固形腫瘍に関して、有効量は、腫瘍の縮小を引き起こすおよび/または腫瘍の成長速度を減少させる(腫瘍成長を抑制するためなど)または他の望ましくない細胞増殖を防止もしくは遅延するのに十分な量を含む。特定の実施形態では、有効量は、腫瘍の発達を遅延するのに十分な量である。特定の実施形態では、有効量は、腫瘍の再発を防止または遅延するのに十分な量である。有効量は、1回または複数回の投与で投与され得る。薬物または組成物の有効量は、(i)癌細胞の数を低減する、(ii)腫瘍のサイズを低減する、(iii)癌細胞が末梢器官に浸潤するのをある程度阻害、妨害、減速する、およびそれを停止する場合もある、(iv)腫瘍の転移をある程度阻害、すなわち減速する、およびそれを停止する場合もある、(v)腫瘍成長を阻害する、(vi)腫瘍の発生および/もしくは再発を防止もしくは遅延する、ならびに/または(vii)癌と関連する症状のうちの1種もしくは複数をある程度緩和する。一実施例では、「有効量」は、癌の有意な減少または進行固形腫瘍などの癌の進行の有意な減速をもたらすことが臨床的に証明されている、組合せでの、抗CD73抗体の量および免疫−腫瘍学薬剤、例えば、抗PD−1抗体の量である。

0105

本明細書において、用語「固定用量」、「一定用量」および「一定固定用量」は、同義的に使用され、患者の体重または体表面積(BSA)に関係なく、患者に投与される用量を指す。固定または一定用量は、したがって、mg/kg用量ではなく、薬剤(例えば、抗CD73抗体および/または免疫−腫瘍学薬剤)の絶対量として提供される。

0106

本明細書において、「体表面積(BSA)に基づく用量」とは、個々の患者の体表面積(BSA)に合わせて調整された(例えば、抗CD73抗体および/または抗PD−1抗体の)用量を指す。BSAに基づく用量は、mg/kg体重として提供され得る。直接的な測定を行わずにBSAを得る様々な計算が公開されており、中でもDu Boisの式が最も広く使用されている(Du Bois D, Du Bois EF (Jun 1916) Archives of Internal Medicine 17 (6): 863-71およびVerbraecken, J. et al. (Apr 2006). Metabolism - Clinical and Experimental 55 (4): 515-24を参照のこと)。他の例示的BSA式として、Mostellerの式(Mosteller RD. N Engl J Med., 1987; 317:1098)、Haycockの式(Haycock GB, et al., J Pediatr 1978, 93:62-66)、GehanおよびGeorgeの式(Gehan EA, George SL, Cancer ChemotherRep 1970, 54:225-235)、Boydの式(Current, JD (1998), The Internet Journal of Anesthesiology 2 (2); and Boyd, Edith (1935), University of Minnesota. The Institute of Child Welfare, Monograph Series, No. x. London: Oxford University Press)、Fujimotoの式(Fujimoto S, et al., Nippon Eiseigaku Zasshi 1968;5:443-50)、Takahiraの式(Fujimoto S, et al., Nippon Eiseigaku Zasshi 1968;5:443-50)、ならびにSchlichの式(Schlich E, et al., Ernaehrungs Umschau 2010;57:178-183)が挙げられる。

0107

本明細書において、「免疫−腫瘍学薬剤」は、ヒト対象における免疫応答を刺激または増強または上方制御する薬剤を指し、例えば、免疫細胞、例えば、T細胞上の阻害性受容体のアンタゴニストおよび免疫細胞、例えば、T細胞上の刺激性受容体のアゴニストが含まれる。例示的な免疫−腫瘍学薬剤は、例えば、「併用療法」と題される節において、本明細書にさらに記載されている。

0108

薬物の「予防的有効量」または「予防的有効投与量」は、単独で、または別の治療薬と組み合わせて、疾患を発生するか、または疾患の再発を患うリスクにある対象に投与される場合に、疾患の発生または再発を阻害する薬物の量である。治療薬または予防薬の疾患退縮を促進する能力または疾患の発生もしくは再発を阻害する能力は、臨床治験の際にヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、インビトロアッセイにおいて薬剤の活性をアッセイすることによってなど、当業者に公知の種々の方法を使用して評価できる。

0109

例として、抗癌剤は、対象において、癌進行を減速するか、または癌退縮を促進する薬物である。好ましい実施形態では、治療上有効な量の薬物は、癌を排除するところまで癌退縮を促進する。「癌退縮を促進すること」とは、有効量の薬物を、単独でまたは抗新生物剤と組み合わせて投与することが、患者において、腫瘍成長または大きさの低減、腫瘍の壊死、少なくとも1種の疾患症状の重症度の低下、疾患症状のない期間の頻度および期間の増大、疾患苦痛による機能障害もしくは能力障害の防止またはそうでなければ疾患症状の寛解をもたらすことを意味する。薬理学的有効性とは、薬物の患者において癌退縮を促進する能力を指す。生理学的安全性とは、薬物の投与に起因する、容認できるほど低レベルの毒性または細胞、臓器および/または生物レベルでのその他の有害な生理学的効果有害効果)を指す。

0110

腫瘍の治療の例として、薬物の治療上有効な量または投与量は、未治療の対象と比較して、好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を少なくとも約20%、より好ましくは、少なくとも約40%、一層より好ましくは、少なくとも約60%、さらにより好ましくは、少なくとも約80%阻害する。最も好ましい実施形態では、薬物の治療上有効な量または投与量は、細胞成長または腫瘍成長を完全に阻害し、すなわち好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を100%阻害する。化合物の腫瘍成長を阻害する能力は、以下に記載されるアッセイを使用して評価できる。あるいは、この組成物の特性は、化合物の細胞成長を阻害する能力を調べることによって評価でき、このような阻害は、当業者に公知のアッセイによってインビトロで測定され得る。本明細書に記載されるその他の好ましい実施形態では、腫瘍退縮が観察され得、少なくとも約20日、より好ましくは、少なくとも約40日または一層より好ましくは、少なくとも約60日の期間継続し得る。

0111

用語「患者」および「対象」とは、予防的または治療的処置のいずれかを受ける任意のヒトまたは非ヒト動物を指す。例えば、本明細書に記載される方法および組成物は、進行固形腫瘍などの癌を有する対象または患者を治療するために使用され得る。用語「非ヒト動物」は、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジイヌウシニワトリなどの哺乳動物および非哺乳動物、両生類爬虫類などを含む。

0112

本明細書に記載される種々の態様は、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。

0113

I.抗CD73抗体
特定の機能的特徴または特性を特徴とし、例えば、免疫−腫瘍学薬剤と組み合わせて使用した場合に癌の治療において有用である、抗体、例えば、完全ヒト抗体が、本明細書に記載される。例えば、抗体は、ヒトCD73と特異的に結合する。さらに、抗体は、カニクイザルCD73など、1種または複数の非ヒト霊長類由来のCD73と交差反応し得る。

0114

可溶性および/または膜結合型ヒトCD73と特異的に結合することに加えて、本明細書に記載される抗体は、以下の機能的特性
(a)CD73酵素活性(可溶性または膜結合型)を阻害し、結果として、産生されるアデノシンを低減すること、
(b)カニクイザルCD73と結合すること、
(c)細胞、例えば、腫瘍細胞への抗体媒介性CD73内部移行、ならびに
(d)ヒトCD73のアミノ酸65〜83および157〜172を含むコンホメーションエピトープと結合することのうちの1種または複数を示す。

0115

好ましくは、抗CD73抗体は、高い親和性、例えば、10−7M以下、10−8M以下、10−9M以下、10−10M以下、10−11M以下、10−12M以下、10−12M〜10−7M、10−11M〜10−7M、10−10M〜10−7M、10−9M〜10−7Mまたは10−10M〜10−8MのKDで、ヒトCD73(二量体およびいくつかの実施形態では単量体、アイソフォーム1または2)と結合する。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、BIACORE(登録商標)SPR分析によって判定される場合、10−7M以下、10−8M以下、10−9M(1nM)以下、10−10M以下、10−12M〜10−7M、10−11M〜10−7M、10−10M〜10−7M、10−9M〜10−7M、10−8M〜10−7Mまたは10−10M〜10−8MのKDで、可溶性ヒトCD73と結合する。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、本明細書にさらに記載されるように判定される場合、1nM未満のEC50で、結合型(例えば、細胞膜結合型、例えば、Calu6細胞)ヒトCD73と結合する。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、ヒトB細胞またはヒトCalu−6細胞において、例えば、フローサイトメトリーおよびスキャッチャードプロットによって判定される場合、10−7M以下、10−8M以下、10−9M(1nM)以下、10−10M以下、10−12M〜10−7M、10−11M〜10−8M、10−10M〜10−8M、10−9M〜10−8M、10−11M〜10−9M、10−10M〜10−8Mまたは10−10M〜10−9MのKDで、結合型ヒトCD73、例えば、細胞膜結合型ヒトCD73と結合する。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、10−7M以下、10−8M以下、10−9M(1nM)以下、10−10M以下、10−12M〜10−7M、10−11M〜10−7M、10−10M〜10−7M、10−9M〜10−7M、10−10M〜10−8Mまたは10−8M〜10−7MのKDで、可溶性ヒトCD73と結合し、10−7M以下、10−8M以下、10−9M(1nM)以下、10−10M以下、10−12M〜10−7M、10−11M〜10−8M、10−10M〜10−8M、10−9M〜10−8M、10−11M〜10−9Mまたは10−10M〜10−9MのKDまたはEC50で、結合型ヒトCD73、例えば、細胞膜結合型ヒトCD73と結合する。

0116

抗CD73抗体、例えば、本明細書に記載される抗体は、スキャッチャード法によって判定される場合、0.1nM以下のKDでヒトB細胞と結合し得る、1nM以下のKDでヒトCalu−6細胞と結合し得る、および/または1nM以下のKDでカニクイザルCD73−CHO細胞と結合し得る。

0117

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、高い親和性でカニクイザルCD73と結合する、例えば、それは、例えば、本明細書にさらに記載されるように判定される場合、0.1nM〜10nMのEC50、例えば、1nM未満のEC50で、カニクイザルCD73を発現するCHO細胞と結合する。

0118

特定の実施形態では、本明細書に記載される抗CD73抗体はまた、例えば、実施例において測定される場合、100nM以下、10nM以下、1nM以下、100nM〜0.01nM、100nM〜0.1nM、100nM〜1nMまたは10nM〜0.1nMのEC50で、カニクイザルCD73と結合する、例えば、膜結合型カニクイザルCD73、例えば、カニクイザルCD73を発現するCHO細胞と結合する。

0119

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、SECによって判定される場合、少なくとも90%、95%、98%または99%単量体である。抗CD73抗体はまた、本明細書に記載されるものと類似であるかまたはその範囲内の生物物理学的特徴を有し得る。

0120

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、実施例にさらに記載されるように、CD73ビーズ結合アッセイにおいて判定される場合、または細胞、例えば、Calu6、SKMEL24もしくはH292細胞において判定される場合またはインビボアッセイ、例えば、異種移植片腫瘍モデルにおいて判定される場合に、ヒトおよび/またはカニクイザルCD73の酵素活性を阻害する。抗CD73抗体は、本明細書に記載される抗体のものと少なくとも類似であるかまたはその範囲内である、阻害性活性を有し得る。例えば、抗CD73抗体は、10nM未満もしくは5nM未満または1〜10nMもしくは5〜10nMの範囲のEC50で、ヒトCD73(例えば、固体に結合したCD73)の酵素活性(アデノシン産生)を阻害し得る。抗CD73抗体は、細胞、例えば、Calu6細胞において、10nM未満もしくは1nM未満または0.1〜10nM、0.1〜1nMもしくは0.1〜0.5nMの範囲のEC50で、ヒトCD73の活性を阻害し得る。

0121

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、実施例にさらに記載されるように、ハイコンテント内部移行アッセイまたはFACSまたはフローサイトメトリーにおいて判定される場合、それが結合する細胞によって内部移行される(およびCD73内部移行を媒介する)。抗CD73抗体は、実施例に記載される抗体のものと少なくとも類似であるかまたはその範囲内である、内部移行特徴(EC50、T1/2、およびYmax)ならびにプラトーまでの時間を有し得る。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、ハイコンテント内部移行アッセイ(実施例6Aに記載される)において判定される場合、1種または複数の細胞型、例えば、実施例に記載されるものにおいて、1時間未満、例えば、30分未満、15分未満、12分未満、10分未満、7分未満またはさらには5分未満である内部移行のT1/2を有する。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、実施例6Aに記載されるハイコンテント内部移行アッセイを使用してまたは例えば、実施例6Bに記載されるフローサイトメトリーを使用して、判定される場合、10時間以下、6時間以下、5時間以下、4時間以下、3時間以下、2時間以下、1時間以下、例えば、10分間〜10時間、10分間〜6時間、1時間〜10時間または1時間〜6時間の範囲内に、最大の抗CD73抗体媒介性内部移行に達する。抗CD73抗体媒介性CD73内部移行の最大レベルは、細胞型に応じて、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%またはそれ以上であり得る。例えば、Calu6細胞における抗CD73抗体媒介性CD73内部移行のEC50は、実施例に記載されるハイコンテント内部移行アッセイにおいて測定される場合、10nM未満、例えば、0.1〜10nMまたは1〜10nMまたは1〜5nMであり得、Ymaxは、少なくとも90%または少なくとも95%であり得る。

0122

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、細胞への内部移行後にエンドソームマーカーと共局在化する。例えば、抗CD73抗体、例えば、11F11は、Calu−6細胞において、細胞が抗CD73抗体と接触してから15分以内、30分以内、60分以内および/または120分以内に、エンドソームマーカーEEA1、Rab7および/またはLamp−1と共局在化する。

0123

抗CD73抗体、例えば、IgG2ヒンジ、IgG2 CH1ドメインまたはIgG2ヒンジおよびIgG2 CH1ドメインを有する抗体は、例えば、実施例6Aに記載されるように、ハイコンテント内部移行アッセイにおいて測定される場合、以下のCD73内部移行特徴を媒介し得る:
−Calu6細胞において10nM以下、5nM以下、1nM以下または0.1〜10nMまたは0.1〜1nMのEC50;少なくとも90%、95%または98%のYmax(内部移行の最大の割合)ならびにCalu6細胞において30分未満または10分未満のT1/2;
−ヒト細胞、例えば、Calu6細胞、HCC44細胞、H2030細胞、H2228細胞、HCC15細胞、SKLU1細胞、SKMES1細胞またはSW900細胞において、30分未満または10分未満のT1/2。

0124

抗CD73抗体、例えば、IgG2ヒンジ、IgG2 CH1ドメインまたはIgG2ヒンジおよびIgG2 CH1ドメインを有する抗体は、例えば、実施例6Bに記載されるように、フローサイトメトリーによって測定される場合、以下のCD73内部移行特徴を媒介し得る:
−Calu6細胞において1時間以下のT1/2および少なくとも70%のYmax;
−NCI−H292細胞において30分以下のT1/2および少なくとも70%のYmax;
−SNUC1細胞において2時間以下のT1/2および少なくとも30%のYmax;ならびに/または
−NCI−H1437細胞において30分以下のT1/2および少なくとも60%のYmax。

0125

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、bin1抗体である、すなわち、これは、ヒトCD73との結合について、11F11と競合するが、4C3とは競合しない。

0126

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、実施例にさらに記載されるように、HDX−MSによって判定される場合、エピトープ、例えば、ヒトCD73のN末端部分のコンホメーションエピトープ、例えば、ヒトCD73のアミノ酸65〜83内に位置するエピトープ(配列番号96)と結合する。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、HDX−MSによって判定される場合、ヒトCD73のアミノ酸157〜172(配列番号97)またはヒトCD73のアミノ酸157〜172内に位置するエピトープ(配列番号97)と結合する。あるいは、抗CD73抗体は、例えば、HDX−MSによって判定される場合、エピトープ、例えば、ヒトCD73のN末端部分の不連続なエピトープと結合する。

0127

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、HDX−MSによって判定される場合、ヒトCD73のアミノ酸65〜83およびアミノ酸157〜172と結合するか、またはヒトCD73アイソフォーム1もしくは2のアミノ酸65〜83およびアミノ酸157〜172内のエピトープ、すなわち、アミノ酸配列FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号96)およびLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号97)と結合する。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、HDX−MSによって判定される場合、ヒトCD73のアミノ酸65〜83およびアミノ酸157〜172のすべてまたは一部と結合する。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、グリコシル化および非グリコシル化の両方のヒトCD73と結合する。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、グリコシル化CD73のみと結合し、非グリコシル化CD73とは結合しない。

0128

抗CD73抗体は、CD73との結合について、本明細書に記載されるCDRまたは可変領域、例えば、CD73.4−1、CD73.4−2、CD73.3、11F11−1、11F11−2、4C3−1、4C3−2、4C3−3、4D4、10D2−1、10D2−2、11A6、24H2、5F8−1、5F8−2、6E11および/または7A11のものを含む抗CD73抗体と競合し得る(またはその結合を阻害し得る)。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、CD73.4−1、CD73.4−2、CD73.3、11F11、4C3、4D4、10D2、11A6、24H2、5F8、6E11および/または7A11のヒトCD73との結合を、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%阻害する。特定の実施形態では、CD73.4−1、CD73.4−2、CD73.3、11F11−1、11F11−2、4C3−1、4C3−2、4C3−3、4D4、10D2−1、10D2−2、11A6、24H2、5F8−1、5F8−2、6E11および/または7A11は、抗CD73抗体のヒトCD73との結合を、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%阻害する。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、CD73.4−1、CD73.4−2、CD73.3、11F11−1、11F11−2、4C3−1、4C3−2、4C3−3、4D4、10D2−1、10D2−2、11A6、24H2、5F8−1、5F8−2、6E11および/または7A11のヒトCD73との結合を、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%阻害し、CD73.4−1、CD73.4−2、CD73.3、11F11−1、11F11−2、4C3−1、4C3−2、4C3−3、4D4、10D2−1、10D2−2、11A6、24H2、5F8−1、5F8−2、6E11および/または7A11は、抗CD73抗体のヒトCD73との結合を、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%阻害する(例えば、両方の方向で競合する)。競合実験は、例えば、例として実施例において本明細書にさらに記載されるように、行われ得る。

0129

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、FcR結合要件欠如によって判定される場合、CD73酵素活性を阻害する、および/または多価架橋を必要とすることなく細胞に内部移行する。

0130

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、表3に列挙される特徴のうちの1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種または11種を有する。

0131

表3:抗CD73抗体の潜在的な特徴
(1)例えば、BIACORE(登録商標)SPR分析によって測定される場合、例えば、10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のKDで、ヒトCD73、例えば、ビーズ結合型ヒト二量体ヒトCD73アイソフォーム1および2と結合すること、
(2)例えば、1nM以下(例えば、0.01nM〜1nM)のEC50で、膜結合型ヒトCD73と結合すること、
(3)例えば、10nM以下(例えば、0.01nM〜10nM)のEC50で、カニクイザルCD73と結合すること、例えば、膜結合型カニクイザルCD73と結合すること、
(4)例えば、10nM以下のEC50で、ヒトCD73酵素活性を阻害すること、
(5)10nM以下のEC50で、カニクイザルCD73酵素活性を阻害すること、
(6)10nM以下のEC50で、Calu6細胞における内因性(細胞性)ヒトCD73酵素活性を阻害すること、
(7)インビボでヒトCD73酵素活性を阻害すること、
(8)例えば、1時間未満、30分未満もしくは10分未満のT1/2および/または少なくとも70%、80%もしくは90%のYmaxでの細胞への内部移行、例えば、抗体媒介性(または依存性)CD73内部移行、
(9)ヒトCD73上のコンホメーションエピトープ、例えば、アミノ酸残基FTKVQQIRRAEPNVLLLDA(配列番号96)および/またはLYLPYKVLPVGDEVVG(配列番号97)のすべてまたは一部分を含む、アミノ酸配列(配列番号1)内の不連続なエピトープと結合すること、
(10)ヒトCD73との結合について、CD73.4−1、CD73.4−2、CD73.3、11F11−1、11F11−2、4C3−1、4C3−2、4C3−3、4D4、10D2−1、10D2−2、11A6、24H2、5F8−1、5F8−2、6E11および/または7A11と、いずれかの方向または両方の方向で、競合すること、および
(11)X線結晶学によって判定される場合、CD73.4と類似のパターンで、ヒトCD73と相互作用すること。

0132

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、可溶性CD73、例えば、可溶性ヒトCD73(例えば、可溶性血清CD73)と結合する。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、可溶性ヒトCD73の酵素活性を阻害する。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、膜結合型および可溶性CD73タンパク質と結合し、膜結合型および可溶性CD73タンパク質の酵素活性を阻害してもよい。可溶性ヒトCD73との結合は、例えば、本明細書にさらに記載されるように、膜結合型CD73に対するものと同じKD範囲であり得る。可溶性ヒトCD73の酵素活性の阻害は、例えば、本明細書にさらに記載されるように、膜結合型CD73に対するものと同じ活性範囲であり得る。

0133

当技術分野で公知および本明細書に記載される手法に従って判定されるこれらの機能的特性(例えば、生化学活性免疫化学活性、細胞活性、生理学活性または他の生物活性など)のうちの1種または複数を示す抗体活性は、特定の活性において、抗体の不在時(または例えば、無関係な特異性の対照抗体が存在する場合)に見られるものと比べた統計学的に有意な相違と関連することが理解される。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗CD73抗体は、測定されたパラメーター(例えば、腫瘍量、腫瘍転移アデノシンレベル、cAMPレベル)を、測定されたパラメーターの少なくとも10%、より好ましくは、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%および特定の好ましい実施形態では、92%、94%、95%、97%、98%または99%を上回って減少させる。逆に、本明細書に開示される抗CD73抗体は、測定されたパラメーターを、少なくとも10%、例えば、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%(すなわち、2倍)、3倍、5倍または10倍増大させる。

0134

例えば、ELISAウエスタンブロットおよびRIAを含む、種々の種のCD73に対する抗体の結合能力を評価するための標準アッセイは、当技術分野で公知である。好適なアッセイは、実施例において詳細に記載されている。抗体の結合動態(例えば、結合親和性)もまた、BIACORE(登録商標)SPR分析などの当技術分野で公知の標準アッセイによって評価することができる。CD73の機能的特性(例えば、アデノシン産生、腫瘍成長および転移、T細胞阻害)に対する抗体の効果を評価するためのアッセイは、以下および実施例においてさらに詳細に記載されている。

0135

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、天然の抗体ではない、または天然に存在する抗体ではない。例えば、抗CD73抗体は、より多い、より少ないもしくは異なる種類の翻訳後修飾を有するなど、天然に存在する抗体のものとは異なる翻訳後修飾を有する。

0136

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、例えば、CD73をT細胞表面から除去することによって、および/またはその酵素活性を阻害することによって、Teff(Tエフェクター)機能を刺激する、および/またはTreg機能を低減させる。

0137

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、少なくともIgG2ヒンジを含み、適宜、IgG2 CH1ドメインまたはヒンジおよび/もしくはCH1ドメインの断片もしくは誘導体も含み、抗体は、アイソフォームAをとっている(例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755を参照のこと)。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、少なくともIgG2ヒンジを含み、適宜、IgG2 CH1ドメインまたはヒンジおよび/もしくはCH1ドメインの断片もしくは誘導体も含み、抗体は、アイソフォームBをとっている(例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755を参照のこと)。特定の実施形態では、組成物は、アイソフォームAの抗CD73抗体およびアイソフォームBの抗CD73抗体の混合物を含む。

0138

(i)11F11によって結合されるものと類似のヒトCD73上の領域と結合するが、4C3によって結合されるものと類似の領域とは結合しない、可変領域を含み(すなわち、bin1抗体である)、(ii)10nM以下のKdで、二量体ヒトCD73(例えば、可溶性CD73)と結合し、(iii)例えば、細胞、例えば、Calu6細胞において、10nM未満のEC50で、ヒトCD73の酵素活性(AMPからアデノシンへの変換)を阻害し、(iv)ヒト細胞、例えば、Calu6細胞、H2228細胞、HCC15細胞、H2030細胞、SNUC1細胞において、1時間以下(または30分以下または10分以下)のT1/2、50%以上(または60%以上、70%以上、80%以上または90%以上)のYmaxで、細胞における抗体依存性CD73内部移行を媒介する、抗ヒトCD73抗体が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、抗体は、IgG2ヒンジまたはIgG2ヒンジおよびIgG2 CH1ドメインを含む。(i)11F11によって結合されるものと類似のヒトCD73上の領域と結合するが、4C3によって結合されるものと類似の領域とは結合しない、可変領域を含み(すなわち、bin1抗体である)、(ii)SPR(Biacore)によって判定される場合、10nM以下のKdで、二量体ヒトCD73(例えば、可溶性CD73)と結合し、(iii)例えば、細胞、例えば、Calu6細胞において、10nM未満のEC50で、ヒトCD73の酵素活性(AMPからアデノシンへの変換)を阻害し、(iv)実施例6Aに記載されるハイコンテント内部移行アッセイを使用して判定される場合、ヒトCalu6細胞、H2228細胞、HCC15細胞またはH2030細胞において、例えば、30分以下のT1/2、80%以上のYmaxで、細胞における抗体依存性CD73内部移行を媒介する、抗ヒトCD73抗体が、本明細書において提供される。

0139

好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗CD73抗体は、著しく毒性ではない。例えば、抗CD73抗体は、例えば、臨床試験において判定される場合、ヒトの臓器、例えば、肝臓、腎臓、脳、肺および心臓のうちの1種または複数に対して、著しく毒性ではない。特定の実施形態では、抗CD73抗体は、望ましくない免疫応答、例えば、自己免疫性または炎症を著しく引き起こすことはない。

0140

II.例示的な抗CD73抗体
抗CD73抗体の可変領域
本明細書に記載される特定の抗体は、抗体11F11−1、11F11−2、4C3−1、4C3−2、4C3−3、4D4、10D2−1、10D2−2、11A6、24H2、5F8−1、5F8−2、6E11、7A11、CD73.3−1、−2もしくは−3、CD73.4−1および−2、CD73.4−2、CD73.5−1および−2、CD73.6−1および−2、CD73.7−1および−2、CD73.8−1および−2、CD73.9−1および−2、CD73.10−1および−2ならびにCD73.11のCDRおよび/または可変領域配列を有する抗体、例えば、モノクローナル抗体、ならびにそれらの可変領域またはCDR配列と少なくとも80%の同一性(例えば、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%の同一性)を有する抗体である。表4は、各抗体のVHおよびVL領域のCDRの配列番号、ならびにVHおよびVL領域のものを記載する。実施例においてさらに記載されるように、特定の重鎖は、1種を上回る軽鎖を伴って存在し得、代替的な軽鎖の配列番号もまた、以下の表に提供される。

0141

0142

重鎖可変領域が配列番号4、16、32、40、52、60、68、80、88、135および170〜177からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。

0143

また、軽鎖可変領域が配列番号8、12、20、24、28、36、44、48、56、64、72、76、84、92および238からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、提供される。

0144

(a)それぞれ、配列番号135および8を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(b)それぞれ、配列番号135および12を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(c)それぞれ、配列番号4および8を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(d)それぞれ、配列番号4および12を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(e)それぞれ、配列番号16および20を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(f)それぞれ、配列番号16および24を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(g)それぞれ、配列番号16および28を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(h)それぞれ、配列番号32および36を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(i)それぞれ、配列番号40および44を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(j)それぞれ、配列番号40および48を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(k)それぞれ、配列番号52および56を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(l)それぞれ、配列番号60および64を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(m)それぞれ、配列番号68および72を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(n)それぞれ、配列番号68および76を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(o)それぞれ、配列番号68および238を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(p)それぞれ、配列番号80および84を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(q)それぞれ、配列番号88および92を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(r)それぞれ、配列番号170および20を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(s)それぞれ、配列番号170および24を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(t)それぞれ、配列番号170および28を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(u)それぞれ、配列番号171および8を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(v)それぞれ、配列番号171および12を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(w)それぞれ、配列番号172および8を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(x)それぞれ、配列番号172および12を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(y)それぞれ、配列番号173および8を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(z)それぞれ、配列番号173および12を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(a2)それぞれ、配列番号174および8を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(b2)それぞれ、配列番号174および12を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(c2)それぞれ、配列番号175および8を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(d2)それぞれ、配列番号175および12を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(e2)それぞれ、配列番号176および8を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、
(f2)それぞれ、配列番号176および12を含む重鎖および軽鎖可変領域配列、または
(g2)それぞれ、配列番号177および36を含む重鎖および軽鎖可変領域配列
を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供される。

0145

抗CD73抗体は、本明細書に記載される抗CD73抗体、例えば、CD73.4−1、CD73.4−2、CD73.3、11F11−1、11F11−2、11F11、4C3−1、4C3−2、4C3−3、4D4、10D2−1、10D2−2、11A6、24H2、5F8−1、5F8−2、5F8−3、6E11および7A11の重鎖および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3、またはそれらの組合せを含み得る。

0146

これらの抗体のそれぞれがCD73と結合すること、および抗原結合特異性が、主に、CDR1、2および3領域によって提供されることを考慮すると、VH CDR1、2および3配列ならびにVL CDR1、2および3配列は、本明細書に記載される他の抗CD73結合分子を作製するために、「混合および対応させる」ことができる(すなわち、異なる抗体に由来するCDRを、混合および対応させることができるが、各抗体は、VH CDR1、2および3ならびにVL CDR1、2および3を含有しなければならい)。このような「混合および対応させた」抗体のCD73結合は、上記および実施例に記載の結合アッセイ(例えば、ELISA)を使用して試験することができる。好ましくは、VHCDR配列を混合および対応させる場合、特定のVH配列に由来するCDR1、CDR2および/またはCDR3配列が、構造的に類似のCDR配列と置換されている。同様に、VL CDR配列を混合および対応させる場合、特定のVL配列に由来するCDR1、CDR2および/またはCDR3配列が、好ましくは、構造的に類似のCDR配列と置換されている。新規なVHおよびVL配列を、1つまたは複数のVHおよび/またはVLCDR領域配列をモノクローナル抗体CD73.4−1、CD73.4−2、11F11−1、11F11−2、4C3−1、4C3−2、4C3−3、4D4、10D2−1、10D2−2、11A6、24H2、5F8−1、5F8−2、6E11および/または7A11に関して本明細書に開示されるCDR配列に由来する構造的に類似の配列と置換することによって作製できることが、当業者には容易に明らかであると予想される。本明細書において開示される特定の抗体と同等またはそれより優れた、結合親和性、生理活性および/またはその他の特性を有する「混合および対応させた」抗体が、本発明の方法において使用するために選択され得る。

0147

(a)配列番号5、17、33、41、53、61、69、81および89からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号6、18、34、42、54、62、70、82および90からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号7、19、35、43、55、63、71、83および91からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号9、13、21、25、29、37、45、49、57、65、73、77、85および93からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号10、14、22、26、30、38、46、50、58、66、74、78、86および94からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2、ならびに
(f)配列番号11、15、23、27、31、39、47、51、59、67、75、79、87および95からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分が、本明細書において提供され、
ここで、抗体は、ヒトCD73と特異的に結合する。

0148

特定の実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、重鎖可変領域CDR1、CDR2、およびCDR3領域は、それぞれ、配列番号5〜7、17〜19、33〜35、41〜43、53〜55、61〜63、69〜71、81〜83または89〜91を含み、
ここで、抗体は、ヒトCD73と特異的に結合する。

0149

特定の実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3領域は、それぞれ、(a)配列番号9〜11、13〜15、21〜23、25〜27、29〜31、37〜39、45〜47、49〜51、57〜59、65〜67、73〜75、77〜79、85〜87または93〜95を含み、
ここで、抗体は、ヒトCD73と特異的に結合する。

0150

特定の実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、
(a)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号5〜7を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号9〜11を含む、
(b)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号5〜7を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号13〜15を含む、
(c)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号17〜19を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号21〜23を含む、
(d)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号17〜19を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号25〜27を含む、
(e)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号17〜19を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号29〜31を含む、
(f)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号33〜35を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号37〜39を含む、
(g)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号41〜43を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号45〜47を含む、
(h)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号41〜43を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号49〜51を含む、
(i)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号53〜55を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号57〜59を含む、
(j)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号61〜63を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号65〜67を含む、
(k)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号69〜71を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号73〜75を含む、
(l)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号69〜71を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号77〜79を含む、
(m)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号81〜83を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号85〜87を含む、または
(n)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号89〜91を含み、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号93〜95を含み、
ここで、抗体は、ヒトCD73と特異的に結合し、表3に列挙された特徴のうちの1種または複数、例えば、AMPの脱リン酸化を阻害し、受容体依存性CD73内部移行を媒介する能力を有してもよい。

0151

特定の実施形態では、抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、
(a)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号5〜7からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号9〜11からなる、
(b)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号5〜7からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号13〜15からなる、
(c)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号17〜19からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号21〜23からなる、
(d)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号17〜19からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号25〜27からなる、
(e)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号17〜19からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号29〜31からなる、
(f)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号33〜35からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号37〜39からなる、
(g)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号41〜43からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号45〜47からなる、
(h)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号41〜43からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号49〜51からなる、
(i)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号53〜55からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号57〜59からなる、
(j)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号61〜63からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号65〜67からなる、
(k)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号69〜71からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号73〜75からなる、
(l)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号69〜71からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号77〜79からなる、
(m)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号81〜83からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号85〜87からなる、または
(n)重鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号89〜91からなり、軽鎖可変領域CDR1、CDR2およびCDR3は、それぞれ、配列番号93〜95からなり、
ここで、抗体は、ヒトCD73と特異的に結合し、表3に列挙された特徴のうちの1種または複数、例えば、AMPの脱リン酸化を阻害し、受容体依存性CD73内部移行を媒介する能力を有してもよい。

0152

抗CD73抗体の重鎖定常ドメイン
本明細書に記載される抗CD73抗体の重鎖定常領域は、任意のアイソタイプ、例えば、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4、またはそれらの組合せおよび/もしくはそれらの修飾形のものであり得る。抗CD73抗体は、エフェクター機能を有してもよく、または低減されたエフェクター機能を有するかもしくはエフェクター機能を有さなくてもよい。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗CD73抗体は、増強された特性を抗体に提供する修飾された重鎖定常領域を含む。実施例に示されるように、IgG2ヒンジを有し、適宜IgG2 CH1ドメインを有する抗CD73抗体、例えば、11F11抗体の可変領域を有するものは、同一の可変領域を有するが、非IgG2ヒンジまたはCH1を有する抗体と比べて、例えば、IgG1ヒンジまたはIgG1ヒンジおよびIgG1 CH1を有する抗体と比べて、より良好かつ迅速に内部移行される。例えば、11F11抗体の可変領域を含み、IgG2ヒンジならびに適宜IgG2 CH1およびIgG1 CH2およびIgG1 CH3ドメインを含む抗体は、エフェクター機能の有無に関係なく、同一抗体であるがIgG1ヒンジまたはIgG1ヒンジおよびIgG1 CH1ドメインを有するものと比べて、細胞膜上のCD73と結合したときに、より効率的に細胞に内部移行される。本明細書にさらに示されるように、IgG2ヒンジを有し、残りがIgG1アイソタイプの抗体のものであるCD73抗体は、ヒンジがIgG1アイソタイプのものである同一抗体よりも効率的に内部移行する。IgG2ヒンジに加えて、IgG2 CH1ドメインを有する抗体は、CH1ドメインがIgG1 CH1ドメインである同一抗体よりもさらにより効率的に内部移行する。本明細書にさらに示されるように、IgG2ヒンジおよび適宜IgG2 CH1を有する抗CD73抗体はまた、IgG1ヒンジまたはIgG1ヒンジおよびIgG1 CH1を有する抗体よりも大きな抗体/抗原複合体を形成する。内部移行の増大は、抗体/抗原複合体サイズの増大と相関性があるとみられる。実施例にさらに記載されるように、増強された内部移行は、抗体の親和性の高さまたは低さと関連するとは考えられない。したがって、抗体媒介性CD73内部移行を媒介する修飾された重鎖定常領域を有する抗CD73抗体が、本明細書において提供され、ここで、修飾された重鎖定常領域を有する抗体は、同一抗体であるが異なる重鎖定常領域を有するものと類似の親和性でCD73と結合する。

0153

特定の実施形態では、CD73抗体は、IgG2アイソタイプのヒンジ(「IgG2ヒンジ」)ならびにCH1、CH2およびCH3ドメインを含む、修飾された重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、IgG2ヒンジならびにCH1、CH2およびCH3ドメインを含み、ここで、CH1、CH2およびCH3ドメインのうちの少なくとも1つは、IgG2アイソタイプのものではない。特定の実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、IgG2アイソタイプのヒンジ、IgG2アイソタイプのCH1を含み、ここで、CH2およびCH3ドメインのうちの少なくとも1つは、IgG2アイソタイプのものではない。IgG2ヒンジは、野生型IgG2ヒンジ、例えば、野生型ヒトIgG2ヒンジ(例えば、配列番号136を有する)またはその変異体であってもよいが、ただし、IgG2ヒンジが、非IgG2ヒンジおよび適宜非IgG2 CH1ドメインを含む同一抗体のものと比べて、増強された活性(例えば、細胞による内部移行の増大、酵素活性の阻害の増強、アンタゴニストもしくは遮断活性の増大、大きな抗体/抗原架橋複合体を形成する能力、免疫応答を刺激もしくは増強する能力の増大、ならびに/または抗増殖もしくは抗腫瘍効果の増大)を抗体に付与する能力を保持することを条件とする。特定の実施形態では、IgG2ヒンジ変異体は、野生型IgG2ヒンジのものと類似の強度または剛性を保持する。ヒンジまたは抗体の強度は、例えば、コンピュータモデリング電子顕微鏡法分析法、例えば、核磁気共鳴(NMR)、X線結晶学(B因子)または沈降速度解析超遠心分離(AUC)によってヒンジを含む抗体の旋回半径を測定または比較することによって判定することができる。ヒンジまたは抗体は、ヒンジを含む抗体が、異なるヒンジ、例えば、IgG1ヒンジを有する同一抗体の値と、5%、10%、25%、50%、75%または100%以内で異なる、前の文章に記載される試験のうちの1つにより得られた値を有する場合、別のヒンジと比べて類似または高い強度を有し得る。当業者であれば、これらの試験の結果を解釈することにより、ヒンジまたは抗体が、それぞれ、別のヒンジまたは抗体のものに少なくとも類似する強度を有するかどうかを、これらの試験から判定することができると予想される。例示的ヒトIgG2ヒンジ変異体は、4つのシステイン残基(すなわち、C219、C220、C226およびC229)のうちの1つまたは複数と、別のアミノ酸との置換を含む、IgG2ヒンジである。システインは、セリンと置換され得る。例示的IgG2ヒンジは、C219X突然変異またはC220X突然変異を含む、ヒトIgG2ヒンジであり、ここで、Xは、システイン以外の任意のアミノ酸である。特定の実施形態では、IgG2ヒンジは、C219XおよびC220X置換の両方は含まない。特定の実施形態では、IgG2ヒンジは、C219SまたはC220Sを含むが、C219SおよびC220Sの両方は含まない。使用され得る他のIgG2ヒンジとして、C220、C226および/またはC229置換、例えば、C220S、C226SまたはC229S突然変異(C219S突然変異との組合せであってもよい)を含むヒトIgG2ヒンジが挙げられる。IgG2ヒンジはまた、ヒンジの一部分が、別のアイソタイプのものであるIgG2ヒンジであってもよい(すなわち、これは、キメラまたはハイブリッドヒンジである)が、ただし、キメラヒンジの強度が、野生型IgG2ヒンジのものと少なくとも類似することを条件とする。例えば、IgG2ヒンジは、下部ヒンジ(表2に定義される)が、IgG1アイソタイプのものである、例えば、野生型IgG1下部ヒンジである、IgG2ヒンジであってもよい。

0154

「ハイブリッド」または「キメラ」ヒンジは、ヒンジの連続したアミノ酸のうちの半分を上回るものが、特定のアイソタイプに由来する場合、そのアイソタイプのものであると呼ばれる。例えば、IgG2の上部ヒンジおよび中部ヒンジならびにIgG1の下部ヒンジを有するヒンジは、IgG2ハイブリッドヒンジと見なされる。

0155

特定の実施形態では、抗CD73抗体は、以下のヒンジのうちの1つ、
ERKCCVECPPCPAPPVAG(配列番号348);
ERKSCVECPPCPAPPVAG(配列番号349);
ERKCSVECPPCPAPPVAG(配列番号350);
ERKXCVECPPCPAPPVAG(配列番号351);
ERKCXVECPPCPAPPVAG(配列番号352);
ERKCCVECPPCPAPPVAGX(配列番号353);
ERKSCVECPPCPAPPVAGX(配列番号354);
ERKCSVECPPCPAPPVAGX(配列番号355);
ERKXCVECPPCPAPPVAGX(配列番号356);
ERKCXVECPPCPAPPVAGX(配列番号357);
ERKCCVECPPCPAPELLGG(配列番号358);
ERKSCVECPPCPAPELLGG(配列番号359);
ERKCCSVECPPCPAPELLGG(配列番号360);
ERKXCVECPPCPAPELLGG(配列番号361);
ERKCXVECPPCPAPELLGG(配列番号362);
ERKCCVECPPCPAPELLG(配列番号363);
ERKSCVECPPCPAPELLG(配列番号364);
ERKCCSVECPPCPAPELLG(配列番号365);
ERKXCVECPPCPAPELLG(配列番号366);
ERKCXVECPPCPAPELLG(配列番号367);
ERKCCVECPPCPAP(配列番号368);
ERKSCVECPPCPAP(配列番号369);
ERKCSVECPPCPAP(配列番号370);
ERKXCVECPPCPAP(配列番号371);または
ERKCXVECPPCPAP(配列番号372)、
(式中、Xは、システイン以外の任意のアミノ酸である)
または1〜5個、1〜3個、1〜2個もしくは1個のアミノ酸が、アミノ酸残基CVEおよびCPPの間に挿入されている、上記配列のうちのいずれかを含むIgG2ヒンジを含む、修飾された重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、THTまたはGGGが挿入されている。

0156

特定の実施形態では、ヒンジは、配列番号348、349、350、351または352を含み、ここで、1個、2個、3個または4個すべてのアミノ酸P233、V234、A235およびG237(C末端の4個のアミノ酸「PVAG」(配列番号373に対応する)が、欠失しているか、または別のアミノ酸、例えば、IgG1ヒンジのC末端のアミノ酸(ELLG(配列番号374)もしくはELLGG(配列番号375)と置換されている。特定の実施形態では、ヒンジは、配列番号348、349、350、351または352を含み、ここで、V234、A235およびG237が欠失しているか、または別のアミノ酸と置換されている。特定の実施形態では、ヒンジは、配列番号348、349、350、351または352を含み、ここで、A235およびG237が欠失しているか、または別のアミノ酸と置換されている。特定の実施形態では、ヒンジは、配列番号348、349、350、351または352を含み、ここで、G237が欠失しているか、または別のアミノ酸と置換されている。特定の実施形態では、ヒンジは、配列番号348、349、350、351または352を含み、ここで、V234およびA235が欠失しているか、または別のアミノ酸と置換されている。例えば上記で示したようなハイブリッドヒンジを得るための、IgG2のPVAG(配列番号373)の、IgG1ヒンジの対応するアミノ酸での置換、すなわち(ELLG(配列番号374)またはELLGG(配列番号375))での置換は、例えば、IgG2ヒンジの利点およびIgG1ヒンジのエフェクター機能を有するヒンジを提供する。

0157

特定の実施形態では、修飾された重鎖定常領域は、上記の配列のうちの1つ、例えば、配列番号348〜372のうちのいずれかからなるかまたは本質的になるヒンジを含み、例えば、さらなるヒンジアミノ酸残基を含まない。

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