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課題・解決手段

本発明は、HSVに対する処置又はワクチン接種のためのワクチン組成物であって、単純ヘルペスウイルス(HSV)ポリペプチドマルチマー複合体を含むワクチン組成物に関する。本発明はまた、HSVポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞に関する。本発明は、ワクチン組成物を生産するための方法をさらに含む。

概要

背景

背景
単純ヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルスとして公知のウイルス科のウイルス属である。ヒトに感染する種は、単純ヘルペスウイルス1(HSV−1)及び単純ヘルペスウイルス2(HSV−2)として一般的に公知であり、それらの正式名称は、それぞれヒトヘルペスウイルス1(HHV−1)及びヒトヘルペスウイルス2(HHV−2)である。HSV−1の初期感染は、典型的には、小児期又は青年期に起こり、終生持続する。HSV−1の感染率は世界中で40%〜80%であり、社会経済的地位が低い人ほど高い。多くの場合、HSV−1に曝露された人は、無症候性セロコンバージョンを示す。しかしながら、初期感染も重度であり得、脱水症になるほど飲食を妨げる重度の不快感を伴う1〜2mmの広範な水疱を引き起こし、10〜14日間継続し得、接種の1〜26日後に起こり得る。再発性口唇ヘルペスは、米国人口の約3分の1が罹患しており、これらの患者は、典型的には、1年当たり1〜6回のエピソードを経験する。紅斑性基部上の丘疹は数時間以内に小胞になり、続いて、72〜96時間以内に潰瘍期、痂皮期及び治癒期へと進行する(Cernik et al., 2008, Arch Intern Med., vol. 168, pp. 1137-1144)。2003年の全体的推定では、人口の16.2%が、性器ヘルペスの主要原因であるHSV−2に感染していると推測されている。潜伏期として公知の非複製状態に入ることによって免疫系によるクリアランス上手く回避するウイルスの能力は、終生感染につながる。潜伏期からの周期再活性化が可能であり、初期感染部位からのウイルス排出につながる。ヘルペスによる生殖器病変は非常に痛みを伴うことが多く、重大な心理的病的状態つながり得る。このウイルスはまた、出生時に母親から子供に受け継がれ得る。処置しなければ、播種性疾患を有する乳児の80%が死亡し、生存者は脳に損傷を受けることが多い。加えて、性器ヘルペスは、HIV罹患リスクの2〜3倍の増加に関連し(性行為当たりのHIV伝播は最大5倍)、高HSV−2有病率集団内の新たなHIV感染の40〜60%を占め得る(Looker et al., 2008, Bulletin of the World Health Organization, vol. 86, pp. 805-812)。

現在のところ、合成非環状プリンヌクレオシド類似体であるアシクロビルは、HSV感染の標準治療であり、症候コントロールに非常に役立っている。前駆薬物である(アシクロビルに変換される)バラシクロビル及び(ペンシクロビルに変換される)ファムシクロビルは認可されており、それぞれアシクロビル及びペンシクロビルよりも良好な経口バイオアベイラビリティを有する。利用可能な薬物は、ウイルス感染細胞内のみにおいてウイルス性チミジンキナーゼによって活性薬物に変換されるので、優れた安全性を有する。しかしながら、HSVは、チミジンキナーゼ欠損突然変異体の生成によって、又はアシクロビルをリン酸化することができないチミジンキナーゼ有する突然変異体の選択によって、チミジンキナーゼをコードするウイルス遺伝子における突然変異を介して、アシクロビルに対する耐性を生じ得る。アシクロビルに対して耐性のほとんどの臨床HSV分離株はチミジンキナーゼ欠損性であるが、一部では、DNAポリメラーゼの変化が検出されている。HSVは、活性化前数カ月間又は数年間にわたってニューロン潜伏し得るので、このような治療は、HSVによって引き起こされる症候を処置するために使用され得るが、ウイルスの周期的再活性化を回避し得ない。

したがって、HSVと闘う最も有効かつ経済的な方法は、ウイルスの初期感染及び/又は周期的再活性化を予防するワクチンであろう。過去数十年間、多くの努力がこのようなワクチンの開発に注がれてきた。しかしながら、強力なHSVワクチンを開発しようとする試みは、臨床試験において低い成績を示した限られた数の抗原焦点を当てている。したがって、HSVに対するワクチンが至急必要である。

概要

本発明は、HSVに対する処置又はワクチン接種のためのワクチン組成物であって、単純ヘルペスウイルス(HSV)ポリペプチドマルチマー複合体を含むワクチン組成物に関する。本発明はまた、HSVポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞に関する。本発明は、ワクチン組成物を生産するための方法をさらに含む。

目的

本発明はこの必要性に対処し、単純ヘルペスウイルス(HSV)ポリペプチドUL11、UL16及びUL21のマルチマー複合体、単純ヘルペスウイルス(HSV)ポリペプチドUL48、UL49及びgEのマルチマー複合体、又は単純ヘルペスウイルス(HSV)ポリペプチドUL31及びUL34のマルチマー複合体を含む新規ワクチン組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

(i)単純ヘルペスウイルス(HSVポリペプチドUL11、UL16及びUL21、(ii)HSVポリペプチドUL48及びUL49;又は(iii)HSVポリペプチドUL31及びUL34のマルチマー複合体を含む、ワクチン組成物

請求項2

HSVポリペプチドUL11が、配列番号:1のアミノ酸配列と75%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL11が、ワクチン組成物の形態で被験体投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項1に記載のワクチン組成物。

請求項3

HSVポリペプチドUL16が、配列番号:2のアミノ酸配列と72%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL16が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項1に記載のワクチン組成物。

請求項4

HSVポリペプチドUL21が、配列番号:3のアミノ酸配列と80%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL21が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項1に記載のワクチン組成物。

請求項5

HSVポリペプチドUL48が、配列番号:6のアミノ酸配列と80%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL48が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項1に記載のワクチン組成物。

請求項6

HSVポリペプチドUL49が、配列番号:7のアミノ酸配列と62%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL49が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項1に記載のワクチン組成物。

請求項7

HSVポリペプチドUL31が、配列番号:8のアミノ酸配列と85%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL31が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項1に記載のワクチン組成物。

請求項8

HSVポリペプチドUL34が、配列番号:9のアミノ酸配列と70%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL34が、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項1に記載のワクチン組成物。

請求項9

HSVポリペプチドUL11、UL16及びUL21又はHSVポリペプチドUL48及びUL49を含むマルチマー複合体が、HSVポリペプチドgEを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

請求項10

HSVポリペプチドgEが、配列番号:4のアミノ酸配列と70%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドgEが、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項9に記載のワクチン組成物。

請求項11

HSVポリペプチドgEが、前記HSVポリペプチドgEの細胞質ドメインである、請求項9又は10のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

請求項12

HSVポリペプチドgEの細胞質ドメインが、配列番号:5のアミノ酸配列と80%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記gEの細胞質ドメインが、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる、請求項11に記載のワクチン組成物。

請求項13

ポリペプチドがHSV−1ポリペプチドである、前記請求項のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

請求項14

ポリペプチドがHSV−2ポリペプチドである、前記請求項のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

請求項15

核酸によってコードされる、前記請求項のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

請求項16

薬学的に許容し得る担体又はアジュバントをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

請求項17

被験体においてHSVに対する免疫応答を誘導する方法において使用するための、前記請求項のいずれか一項に記載のワクチン組成物。

請求項18

HSV感染症治療、予防若しくは改善又はHSVの再活性化の予防のための、請求項17に記載の使用のためのワクチン組成物。

請求項19

HSVがHSV−1である、請求項17又は18に記載の使用のためのワクチン組成物。

請求項20

HSVがHSV−2である、請求項17又は18に記載の使用のためのワクチン組成物。

請求項21

(i)UL11、UL16及びUL21並びに場合によりgE又はgEの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチド;(ii)UL48、UL49及び場合によりgE又はgEの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチド;又は(iii)UL31及びUL34をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター

請求項22

請求項21に記載のベクターを含む、宿主細胞

請求項23

請求項1〜20のいずれか一項に記載のワクチン組成物を生産するための方法であって、(i)請求項22に記載の宿主細胞を培養すること;(ii)マルチマー複合体を得ること;(iii)及び、前記マルチマー複合体と薬学的に許容し得る担体又はアジュバントとを混合することを含む、方法。

技術分野

0001

発明の分野
本発明は、HSVに対する処置又はワクチン接種のためのワクチン組成物であって、単純ヘルペスウイルス(HSV)ポリペプチドマルチマー複合体を含むワクチン組成物に関する。本発明はまた、HSVポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞に関する。本発明は、ワクチン組成物を生産するための方法をさらに含む。

背景技術

0002

背景
単純ヘルペスウイルスは、ヘルペスウイルスとして公知のウイルス科のウイルス属である。ヒトに感染する種は、単純ヘルペスウイルス1(HSV−1)及び単純ヘルペスウイルス2(HSV−2)として一般的に公知であり、それらの正式名称は、それぞれヒトヘルペスウイルス1(HHV−1)及びヒトヘルペスウイルス2(HHV−2)である。HSV−1の初期感染は、典型的には、小児期又は青年期に起こり、終生持続する。HSV−1の感染率は世界中で40%〜80%であり、社会経済的地位が低い人ほど高い。多くの場合、HSV−1に曝露された人は、無症候性セロコンバージョンを示す。しかしながら、初期感染も重度であり得、脱水症になるほど飲食を妨げる重度の不快感を伴う1〜2mmの広範な水疱を引き起こし、10〜14日間継続し得、接種の1〜26日後に起こり得る。再発性口唇ヘルペスは、米国人口の約3分の1が罹患しており、これらの患者は、典型的には、1年当たり1〜6回のエピソードを経験する。紅斑性基部上の丘疹は数時間以内に小胞になり、続いて、72〜96時間以内に潰瘍期、痂皮期及び治癒期へと進行する(Cernik et al., 2008, Arch Intern Med., vol. 168, pp. 1137-1144)。2003年の全体的推定では、人口の16.2%が、性器ヘルペスの主要原因であるHSV−2に感染していると推測されている。潜伏期として公知の非複製状態に入ることによって免疫系によるクリアランス上手く回避するウイルスの能力は、終生感染につながる。潜伏期からの周期再活性化が可能であり、初期感染部位からのウイルス排出につながる。ヘルペスによる生殖器病変は非常に痛みを伴うことが多く、重大な心理的病的状態つながり得る。このウイルスはまた、出生時に母親から子供に受け継がれ得る。処置しなければ、播種性疾患を有する乳児の80%が死亡し、生存者は脳に損傷を受けることが多い。加えて、性器ヘルペスは、HIV罹患リスクの2〜3倍の増加に関連し(性行為当たりのHIV伝播は最大5倍)、高HSV−2有病率集団内の新たなHIV感染の40〜60%を占め得る(Looker et al., 2008, Bulletin of the World Health Organization, vol. 86, pp. 805-812)。

0003

現在のところ、合成非環状プリンヌクレオシド類似体であるアシクロビルは、HSV感染の標準治療であり、症候コントロールに非常に役立っている。前駆薬物である(アシクロビルに変換される)バラシクロビル及び(ペンシクロビルに変換される)ファムシクロビルは認可されており、それぞれアシクロビル及びペンシクロビルよりも良好な経口バイオアベイラビリティを有する。利用可能な薬物は、ウイルス感染細胞内のみにおいてウイルス性チミジンキナーゼによって活性薬物に変換されるので、優れた安全性を有する。しかしながら、HSVは、チミジンキナーゼ欠損突然変異体の生成によって、又はアシクロビルをリン酸化することができないチミジンキナーゼ有する突然変異体の選択によって、チミジンキナーゼをコードするウイルス遺伝子における突然変異を介して、アシクロビルに対する耐性を生じ得る。アシクロビルに対して耐性のほとんどの臨床HSV分離株はチミジンキナーゼ欠損性であるが、一部では、DNAポリメラーゼの変化が検出されている。HSVは、活性化前数カ月間又は数年間にわたってニューロン潜伏し得るので、このような治療は、HSVによって引き起こされる症候を処置するために使用され得るが、ウイルスの周期的再活性化を回避し得ない。

0004

したがって、HSVと闘う最も有効かつ経済的な方法は、ウイルスの初期感染及び/又は周期的再活性化を予防するワクチンであろう。過去数十年間、多くの努力がこのようなワクチンの開発に注がれてきた。しかしながら、強力なHSVワクチンを開発しようとする試みは、臨床試験において低い成績を示した限られた数の抗原焦点を当てている。したがって、HSVに対するワクチンが至急必要である。

0005

詳細な説明
ワクチン組成物
本発明はこの必要性に対処し、単純ヘルペスウイルス(HSV)ポリペプチドUL11、UL16及びUL21のマルチマー複合体、単純ヘルペスウイルス(HSV)ポリペプチドUL48、UL49及びgEのマルチマー複合体、又は単純ヘルペスウイルス(HSV)ポリペプチドUL31及びUL34のマルチマー複合体を含む新規ワクチン組成物を提供する。

0006

「マルチマー複合体」又は「複合体」という用語は本明細書では互換的に使用され、任意の共有結合分子(例えば、脂質アンカー又はオリゴ糖)又は非タンパク質補欠分子族(例えば、ヌクレオチド又は金属イオン)と一緒に少なくとも2つのポリペプチドサブユニットから構成される安定なポリペプチド複合体を指す。この文脈における補欠分子族は、堅く結合した補因子を指す。したがって、マルチマー複合体は、2つのポリペプチド(すなわち、ダイマー)、3つのポリペプチド(すなわち、トリマー)又は4つのポリペプチド(すなわち、テトラマー)を含み得る。本発明のマルチマー複合体は、in vivoで機能的単位として存在することが示されている相互作用タンパク質のセットに関し、本発明のマルチマー複合体のポリペプチドは、ストリンジェントタンパク質精製方法を使用して共精製され得る。このようなストリンジェントなタンパク質精製方法は、非特異的及び/又は人工的なタンパク質相互作用強制しないバッファー及び溶液を使用するので、ストリンジェントな洗浄条件に供された場合にインタクトな状態を保持する複合体の精製のみをもたらす(すなわち、複合体のポリペプチドは放出されない)。したがって、ポリペプチドの相互作用を示すに過ぎない方法、例えば細胞抽出物からの免疫沈降又はプルダウン実験は、本発明の複合体を精製するための適切な方法とは考えられない。同様に、ポリペプチドの共局在化又はポリペプチドの相互作用を示すに過ぎない方法は、特にこのような方法が例えば酵母ツーハイブリッド系などの人工改変ポリペプチドを用いる場合、本発明の複合体を示すものではない。したがって、精製後、本発明の複合体は、適切な方法(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー)を使用して検出され得る。その結果として、組成物中に単に存在する2つ以上のポリペプチド(これらは、in vivoで複合体として存在することが示されたものであり得る)は、このような複合体が、特定の精製方法及び条件を使用した場合にのみ形成する可能性があり、精製後に特定の保存条件下でのみ安定である可能性があるので、本発明の複合体とは考えられない。したがって、特定のポリペプチドがin vivoで複合体を形成することが示された場合であっても、前記ポリペプチドは、溶液中でモノマーとして存在し得る。一実施態様では、マルチマー複合体は、HSVポリペプチドUL11及びUL16を含むダイマーである。さらなる実施態様では、複合体は、HSVポリペプチドUL16及びUL21を含むダイマーである。好ましい実施態様では、複合体は、HSVポリペプチドUL11、UL16及びUL21を含むトリマーである。さらに好ましい実施態様では、マルチマー複合体はトリマーであり、HSVポリペプチドUL11、UL16及びUL21を含むか又はそれらからなる。一実施態様では、マルチマー複合体は、HSVポリペプチドUL48及びUL49を含むダイマーである。さらなる実施態様では、複合体は、HSVポリペプチドUL49及びgEを含むダイマーである。好ましい実施態様では、複合体は、HSVポリペプチドUL48、UL49及びgEを含むトリマーである。さらに好ましい実施態様では、マルチマー複合体はトリマーであり、HSVポリペプチドUL48、UL49及びgEを含むか又はそれらからなる。さらに好ましい実施態様では、複合体は、HSVポリペプチドUL31及びUL34を含むか又はそれらからなるダイマーである。本発明のマルチマー複合体では、タンパク質の1つ以上は、さらなるB細胞エピトープ及び/又はT細胞エピトープを含み得る。前記T細胞エピトープは、CD4 T細胞エピトープ又はCD8 T細胞エピトープであり得る。好ましくは、本発明の複合体は、相乗効果を提供する。したがって、本発明の複合体は、好ましくは、患者PBMCを用いたELISPOTアッセイにおいて、単一タンパク質と比較して強い免疫応答を誘発することができる。

0007

本発明の複合体は、当技術分野で公知の適切な手段及び方法を使用して作製され得る。本発明の複合体は、宿主細胞において複合体が形成するように、宿主細胞において複合体の単一ポリペプチドを共発現させることによって作製され得る。本発明の複合体はまた、別個の宿主細胞において複合体の単一ポリペプチドを発現させ、宿主細胞から単一ポリペプチドを精製し、複合体の形成を可能にする条件下で単一ポリペプチドをin vitroで混合することによって作製され得る。しかしながら、本発明の複合体はまた、別個の宿主細胞において複合体の単一ポリペプチドを発現させ、宿主細胞から単一ポリペプチドを精製し、複合体がin vivoで形成するように単一ポリペプチドを被験体投与することによって作製され得る。複合体の単一ポリペプチドを被験体に投与した後に複合体がin vivoで形成するかは、in vivo条件(すなわち、37℃、血液、血清及び生理学塩濃度)に似たモデル系において決定され得る。

0008

ワクチン組成物のポリペプチドは、タグを含み得る。本明細書で使用される場合、ポリペプチドタグは、ポリペプチドの精製及び/又は検出をもたらすリコンビナントポリペプチドと遺伝的に融合されたアミノ酸配列である。ワクチン組成物のポリペプチドは、HAタグ、Flagタグ、Mycタグ、V5タグ、Strepタグ、StrepIIタグ、Sofタグ、His−Strepタグ、Aviタグ、カルモジュリンタグ、Eタグ、Sタグ、SBPタグ、TCタグ、VSVタグ、Xpressタグ、Tyタグ、Haloタグ、Nusタグ、チオレドキシンタグ、Fcタグ、キチン結合タンパク質(CBP)、マルトース結合タンパク質(MBP)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、緑色蛍光タンパク質(GFP)に融合され得る。好ましい実施態様では、ワクチン組成物のポリペプチドは、6個又は12個のHis残基から構成され得るポリヒスチジンタグに融合され、8個のHis残基が好ましい。ポリペプチドタグは、好ましくは、ポリペプチドリンカーを介してワクチン組成物のポリペプチドに融合される。ポリペプチドリンカー及び8Hisタグの好ましい組み合わせは、配列番号:10に示されている。

0009

「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸ポリマーを含む分子を指す。前記用語は、本明細書では、特定の長さの分子を指すことを意味するものではないので、本明細書では「タンパク質」という用語と互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語はまた、発現カセット若しくはベクターによって発現されるか、又は本発明の宿主細胞から単離され得る「目的のポリペプチド」又は「目的のタンパク質」を含む。ポリペプチドはアミノ酸配列を含むので、アミノ酸配列を含むポリペプチドは、本明細書では「ポリペプチド配列を含むポリペプチド」と称されることもある。したがって、本明細書では、「ポリペプチド配列」という用語は、「アミノ酸配列」という用語と互換的に使用される。

0010

「アミノ酸」又は「aa」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされるもの、並びにその後に改変されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート及びO−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち水素カルボキシル基アミノ基及びR基に結合した炭素を有する化合物、例えばホモセリンノルロイシンメチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、改変R基(例えば、ノルロイシン)又は改変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学物質を指す。

0011

「エピトープ」は、免疫系、例えばB細胞又はT細胞によって認識される抗原の一部である。この用語は、コンフォメーショナルエピトープ及び線状(又は連続)エピトープの両方を包含する。コンフォメーショナルエピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続セクションを含むのに対して、線状エピトープは、抗原のアミノ酸配列の連続的セクションから構成される。コンフォメーショナルエピトープはまた、2つ以上の抗原のアミノ酸配列のセクションを含み得る。この用語は、クリプトトープ及びネオトープをさらに含む。「クリプトトープ」は、天然に存在する抗原、例えばウイルス中に隠れているが、抗原がその天然コンフォメーションで存在していない場合にアクセス可能になり得るエピトープである。「ネオトープ」は、タンパク質の四次構造においてのみ見られ、タンパク質モノマーに見られないエピトープである。

0012

B細胞エピトープは、特定の膜結合型B細胞レセプター(BCR)又は抗体のいずれかによって認識される抗原(例えば、天然タンパク質)の領域である。B細胞エピトープを同定又は選択するための多くの方法が容易に利用可能であり、X線結晶学アレイベースオリゴペプチドスキャニング部位特異的突然変異誘発突然変異誘発マッピング及びファージディスプレイ、並びにSun et al. Comput Math MethodsMed. 2013; 2013: 943636に概説されている計算方法が挙げられる。例えば、適切な方法としては、幾何学的属性及び特定の物理化学的特性を含む抗原及びエピトープ関連傾向スケールの3D構造に依拠する構造ベース予測モデルが挙げられる。構造ベースのアルゴリズム及びウェブサーバープログラム)としては、例えば、EPSVR及びEPMeta(http://sysbio.unl.edu/services/)、EPCES(http://sysbio.unl.edu/services/EPCES/)及びEpitopia(http://epitopia.tau.ac.il/)が挙げられる。ミモトープベースの予測方法は、インプットとして抗体親和性選択ペプチド及び抗原の3D構造の両方を必要とするコンビナトリアル方法である。ミモトープベースの予測モデルに基づく例示的なアルゴリズム及びプログラムとしては、例えば、MimoPro(http://informatics.nenu.edu.cn/MimoPro)、PepSurf(http://pepitope.tau.ac.il)及びEpiSearch(http://curie.utmb.edu/episearch.html)が挙げられる。さらに、抗原の一次配列のみに依拠する配列ベースの予測モデル、例えばSun et al. Comput Math Methods Med. 2013; 2013: 943636に概説されているBEST及びZhangの方法が利用可能である。加えて、抗原及び抗体の相互作用であるタンパク質間相互作用結合部位予測に注目する方法を推論する結合部位予測モデル、例えばProMate、ConSurf、PINUP、及びPIERが使用され得る。

0013

T細胞エピトープは、典型的には、プロセシングタンパク質抗原由来する。T細胞エピトープは、CD4−T細胞エピトープ又はCD8T細胞エピトープであり得る。細胞傷害性(CD8)T細胞は、MHCクラスI分子によってディスプレイされた細胞内ペプチド(CD8T細胞エピトープ)を認識するが、Tヘルパー細胞は、細胞外空間から取り込まれてMHCクラスII分子によってディスプレイされたペプチド(CD4T細胞エピトープ)を認識する。ペプチド:MHC複合体(pMHC)はT細胞レセプターと相互作用し、その活性化とそれに続く細胞性免疫応答誘導をもたらす。T細胞エピトープ予測及び/又は選択のための多くのin silico方法が利用可能である。CD8+T細胞エピトープ予測の場合、Larsen et al.BMCBioinformatics 2007, 8:424に概説されているように、NetCTL−1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)、EpiJen(http://www.ddg-pharmfac.net/epijen/EpiJen/EpiJen.htm)又はMAPPP(http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/)が使用され得る。CD4+T細胞の場合、エピトープ予測のためのコンピューターモデルは、Oyarzun P et al. BMC Bioinformatics 2013, 14:52に概説されており、ペプチド配列比較に依拠して結合モチーフを同定するデータ駆動型の方法、例えばRankpep(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)、TEPITOPE及びNN−align(http://www.cbs.dtu.dk/services/NNAlign/)、並びに結合エネルギーを推測するために分子モデリング計算を実施することによって実験的結合データとの非依存性を提供する構造ベースの方法、例えばNetMHCIIPan−2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan-2.0/)、TEPITOPEpan(http://www.biokdd.fudan.edu.cn/Service/TEPITOPEpan/)及びPredivac(http://predivac.biosci.uq.edu.au/)が挙げられる。

0014

「単純ヘルペスウイルス」及び「HSV」という用語は本明細書では互換的に使用され、一般に、ヘルペスウイルス属単純ヘルペスウイルスのウイルス、すなわちクモザル亜科ヘルペスウイルス1、ウシヘルペスウイルス2、オナガザル亜科ヘルペスウイルス1、オナガザル亜科ヘルペスウイルス2、オナガザル亜科ヘルペスウイルス16、ヒトヘルペスウイルス1、ヒトヘルペスウイルス2、カンガルー科ヘルペスウイルス1、カンガルー科ヘルペスウイルス2、リスザル亜科ヘルペスウイルス1を指す。単純ウイルス属の好ましいウイルス種は、ヒトに感染するウイルスである。さらにより好ましいウイルス種は、それぞれヒトヘルペスウイルス1及び2(HHV−1及びHHV−2)としても公知の単純ヘルペスウイルス1(HSV−1)及び単純ヘルペスウイルス2(HSV−2)である。

0015

本明細書で使用される場合、「ワクチン組成物」という用語は、被験体におけるHSVに関連する病理学的症状を予防又は治療するために使用され得る本発明のマルチマー複合体を含む組成物に関する。「ワクチン組成物」は、活性成分免疫学的活性を増強する1つ以上のさらなる成分又は例えば緩衝剤還元剤、安定剤、キレート化剤増量剤浸透圧平衡化剤(等張化剤);界面活性剤ポリオール抗酸化剤凍結保護剤消泡剤保存剤;及び着色料洗浄剤ナトリウム塩及び/若しくは抗菌剤などを含んでいてもよいし、又は含まなくてもよい。ワクチン組成物は、医薬組成物に典型的なさらなる成分をさらに含み得る。本発明のワクチンは、好ましくは、ヒト及び/又は家畜への使用のためのものである。ワクチン組成物は、滅菌及び/又はパイロジェンフリーのものであり得る。ワクチン組成物は、ヒトに対して等張性のものであり得る。

0016

ワクチン組成物は、好ましくは、治療有効量の本発明のマルチマー複合体又は本発明の方法によって取得可能なマルチマー複合体を含む。

0017

本発明のワクチン組成物のHSVポリペプチドUL11は、好ましくは、配列番号:1のアミノ酸配列と75%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL11は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。

0018

本明細書で使用される場合、「UL11」という用語は、HSVのテグメントタンパク質に関する。配列番号:1は、アクセッションナンバーAHG54674.1でNCBIGenBankにも寄託されているHSV−2 UL11のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「UL11」という用語はまた、配列番号:1に示されているアミノ酸配列と一定の同一性共有するアミノ酸配列を有するUL11ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号:1に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「UL11」という用語は、配列番号:1のアミノ酸配列と比較して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、74%、73%、72%、71%、70%若しくは好ましくは75%以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号:1のアミノ酸配列と比較して最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、25個、26個、27個、28個、29個若しくは好ましくは24個のアミノ酸置換、挿入及び/若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいUL11タンパク質は、UL16、UL21及び/又はgE若しくはgEの細胞質尾部と複合体を形成し得る。したがって、好ましいUL11タンパク質は、UL16若しくはgE若しくはgEの細胞質尾部とダイマーを形成し得、UL16及びUL21と、若しくはUL16及びgE若しくはgEの細胞質尾部とトリマーを形成し得、並びに/又はUL16、UL21及びgE若しくはgEの細胞質尾部とテトラマーを形成し得る。

0019

配列同一性」又は「%同一性」は、正規化アルゴリズムを使用してアライメントした少なくとも2つのポリペプチド配列間の残基マッチの割合を指す。このようなアルゴリズムは、2つの配列間のアライメントを最適化するために、再現可能な正規化方法で、比較される配列にギャップを挿入し得るので、2つの配列のより有意義な比較を達成し得る。本発明の目的のために、2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、NCBIBLASTプログラムバージョン2.3.0(Jan-13-2016) (Altschul et al., Nucleic AcidsRes. (1997) 25:3389-3402)を使用して決定される。2つのアミノ酸配列の配列同一性は、以下のパラメータ:Matrix: BLOSUM62、Word Size: 3; Expect value: 10; Gap cost: Existence = 11、Extension = 1; Compositional adjustments: Conditional compositional score matrix adjustmentに設定されたblastpを使用して決定され得る。

0020

「免疫応答」という用語は、好ましくはin vivoで、しかしin vivoのみではなく、体液性免疫応答及び/又は細胞性免疫応答を誘導する能力を指す。体液性免疫応答は、B細胞性抗体応答を含む。細胞性免疫は、限定されないが、CD4+T細胞及びCD8+T細胞を含むT細胞性免疫応答を含む。免疫応答を誘発する抗原の能力は免疫原性と称され、体液性免疫応答及び/又は細胞性免疫応答であり得る。本発明の免疫応答は、好ましくは、HSVに対する免疫応答、さらにより好ましくは被験体におけるHSV感染症に対する免疫応答である。

0021

in vivoで体液性免疫応答及び/又は細胞性免疫応答を誘導する能力は、性器HSV−2感染症のモルモットモデル(これは、ヒトにおける疾患を正確に反映し、病因と、候補抗ウイルス化合物及びワクチンの治療有効性とを調べる系に相当する)を使用して決定され得る。それはまた、性器常在性及び神経組織常在性免疫記憶の両方の性質に対応する理想的な系としても機能する。モルモットの性器感染症は、ヒト疾患に見られるものを反映する神経学兆候を伴う自己定性外陰膣炎をもたらす。雌性モルモットにおける原発疾患は、一般には8日間に限定される性器上皮細胞におけるウイルス複製を伴う。この間、ウイルスは感覚神経終末に到達し、逆行性輸送によって、脊髄における感覚神経節及び自律神経ニューロンの細胞体輸送される。この部位における短期間の急性複製の後、免疫系は、通常、接種後15日目までに急性ウイルス複製を解消し、ウイルスは、感覚ニューロンの終生潜伏感染として維持される。原発HSV−2性器感染症から回復した後、モルモットは、一時的な自発性再発性感染症及び疾患を経験する。HSV−2再発は、会陰上に紅斑病変及び/若しくは水疱性病変を伴う臨床的に明らかな疾患として、又は生殖管からのウイルスの排出を特徴とする無症候性再発として現れ得る。ワクチン有効性は、例えば、モルモット性器感染症モデルを使用して評価され得る。HSV−2(例えば、MS株) 5×101PFU、5×102PFU、5×103PFU、5×104PFU、5×106PFU、5×107PFU、5×108PFU又は5×109PFU、好ましくは5×105PFUを動物内感染させ得る。感染前又は感染後に、動物を1回、2回、3回、4回、5回以上免疫化し得る。好ましくは、感染後15日目に、動物を15日間隔で2回免疫化した。一般に、任意の適切な投与経路が免疫化に使用され得る。しかしながら、好ましくは、動物を筋肉内的に免疫化する。アジュバントのみ(例えば、CpG 100μg/ミョウバン150μg)又はPBS(両ネガティブコントロール)又はHSV−2 dI5−29突然変異体ウイルス株(ポジティブコントロール)のいずれかで、可能なコントロール群免疫化し得る。各免疫化ラウンドでは、各抗原0.1μg、0.5μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、10μg、15μg、25μg、30μg、35μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg、200μg、好ましくは20μg用量を、アジュバントと組み合わせたワクチン候補で免疫化される群に投与し得る。再発性ウイルス排出の頻度及び規模の評価のために、例えば、感染後0日目〜200日目、感染後1日目〜180日目、感染後3日目〜160日目、感染後5日目〜140日目、感染後7日目〜120日目、感染後10日目〜100日目、感染後12日目〜90日目に、リードアウトとして膣スワブ回収し得る。1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日又は10日ごとに、膣スワブを回収し得る。好ましくは、感染後15日目〜85日目に、膣スワブを毎日回収する。同じ時間間隔で、再発性性器ヘルペス病変の重症度スコア0〜4)及び持続期間を毎日スコア化する。好ましくは、研究終了時に、抗体応答並びにCD4+及びCD8+T細胞応答を決定する。

0022

限定されないが、経口、局所経皮、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内又は眼内を含む様々な経路が、本発明のワクチン組成物の投与に適用可能である。しかしながら、所望により、当業者であれば、任意の他の経路を容易に選択し得る。

0023

被験体に投与される本発明のワクチン組成物の正確な用量は、処置の目的(例えば、急性疾患の処置対予防的ワクチン接種)、投与経路、年齢、体重、一般的健康、性別食事、投与時間、薬物相互作用及び症状の重症度に依存し得、当業者によるルーチンな実験によって確認可能であろう。投与用量は、好ましくは有効用量である(すなわち、免疫応答を誘発するために有効である)。

0024

本発明のワクチン組成物は、被験体に1回以上、例えば2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回以上投与され得る。

0025

本明細書で使用される場合、「被験体」は、動物、好ましくは例えば、マウスラット、モルモット、ハムスターウサギイヌネコ又は霊長類であり得る哺乳動物に関する。好ましくは、被験体は、ヒトである。しかしながら、「被験体」という用語はまた、細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらにより好ましくはヒト細胞を含む。このような細胞は、免疫細胞、好ましくはリンパ球であり得る。

0026

本発明のワクチン組成物のHSVポリペプチドUL16は、好ましくは、配列番号:2のアミノ酸配列と75%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL16は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。

0027

本明細書で使用される場合、「UL16」という用語は、HSVのテグメントタンパク質に関する。配列番号:2は、アクセッションナンバーAHG54679.1でNCBIGenBankにも寄託されているHSV−2 UL16のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「UL16」という用語はまた、配列番号:2に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するUL16ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号:2に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「UL16」という用語は、配列番号:2のアミノ酸配列と比較して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、71%、70%、69%、68%、67%若しくは好ましくは72%以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号:2のアミノ酸配列と比較して最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個、101個、102個、103個、105個、106個、107個、108個、109個、110個、111個、112個、113個、114個、115個、116個、117個、118個、119個、120個、121個、122個、123個若しくは好ましくは104個のアミノ酸置換、挿入及び/若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいUL16タンパク質は、UL11、UL21及び/又はgE若しくはgEの細胞質尾部と複合体を形成し得る。したがって、好ましいUL16タンパク質は、UL21若しくはUL11とダイマーを形成(for)し得、UL11及びUL21とトリマーを形成し得、並びに/又はUL11、UL21及びgE若しくはgEの細胞質尾部とテトラマーを形成し得る。

0028

本発明のワクチン組成物のHSVポリペプチドUL21は、好ましくは、配列番号:3のアミノ酸配列と80%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL21は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。

0029

本明細書で使用される場合、「UL21」という用語は、HSVのテグメントタンパク質に関する。配列番号:3は、アクセッションナンバーAHG54684.1でNCBIGenBankにも寄託されているHSV−2 UL21のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「UL21」という用語はまた、配列番号:3に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するUL21ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号:3に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「UL21」という用語は、配列番号:3のアミノ酸配列と比較して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、79%、78%、77%、76%、75%若しくは好ましくは80%以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号:3のアミノ酸配列と比較して最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個、101個、102個、103個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、110個、111個、112個、113個、114個、115個、116個、117個、118個、119個、120個、121個、122個、123個、124個、125個、126個、127個、128個、129個、130個、131個、132個、133個、134個、135個、136個、137個、138個、139個、140個、141個、142個、143個、144個、145個、146個、147個、148個、149個、150個、151個、152個、153個、154個、155個、156個、157個、158個、159個、160個、161個、162個、163個、164個、165個、166個若しくは好ましくは134個のアミノ酸置換、挿入及び/若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいUL21タンパク質は、UL11、UL16及び/又はgE若しくはgEの細胞質尾部と複合体を形成し得る。したがって、好ましいUL21タンパク質は、UL16とダイマーを形成(for)し得、UL11及びUL16とトリマーを形成し得、並びに/又はUL11、UL16及びgE若しくはgEの細胞質尾部とテトラマーを形成し得る。

0030

本明細書で言及されるように、本発明のワクチン組成物に含まれるマルチマー複合体はまた、4つのポリペプチドを含むポリペプチド複合体(すなわち、テトラマー)であり得る。したがって、HSVポリペプチドUL11、UL16、UL21を含む本発明のマルチマー複合体は、HSVポリペプチドgEをさらに含み得る。この場合、本発明のマルチマー複合体は、HSVポリペプチドUL11、UL16、UL21及びgEを含む。

0031

本発明のワクチン組成物のHSVポリペプチドgEは、好ましくは、配列番号:4のアミノ酸配列と70%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドgEは、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。

0032

本明細書で使用される場合、「gE」という用語は、「糖タンパク質E」と称されることもあり得る。配列番号:4は、アクセッションナンバーAHG54732.1でNCBIGenBankにも寄託されているHSV−2 gEのアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「gE」という用語はまた、配列番号:4に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するgEポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号:4に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「gE」という用語は、配列番号:4のアミノ酸配列と比較して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、69%、68%、67%、66%、65%若しくは好ましくは70%以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号:4のアミノ酸配列と比較して最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個、101個、102個、103個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、110個、111個、112個、113個、114個、115個、116個、117個、118個、119個、120個、121個、122個、123個、124個、125個、126個、127個、128個、129個、130個、131個、132個、133個、134個、135個、136個、137個、138個、139個、140個、141個、142個、143個、144個、145個、146個、147個、148個、149個、150個、151個、152個、153個、154個、155個、156個、157個、158個、159個、160個、161個、162個、163個、164個、165個、166個、167個、168個、169個、170個、171個、172個、173個、174個、175個、176個、177個、178個、179個、180個若しくは好ましくは165個のアミノ酸置換、挿入及び/若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいgEタンパク質は、UL11、UL16及びUL21と複合体を形成し得る。したがって、好ましいgEタンパク質は、UL11とダイマー、UL11及びUL16とトリマー、並びにUL11、UL16及びUL21とテトラマーを形成し得る。

0033

本発明のさらに好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物に含まれるHSVポリペプチドUL11、UL16、UL21を含むマルチマー複合体はまた、HSVポリペプチドgEの細胞質ドメインを含むテトラマーであり得る。この場合、本発明のマルチマー複合体は、HSVポリペプチドUL11、UL16、UL21及びgEの細胞質ドメインを含む。

0034

本発明のワクチン組成物のgEの細胞質ドメインは、好ましくは、配列番号:5に記載されているアミノ酸配列を含む。しかしながら、gEの細胞質ドメインは、配列番号:5のアミノ酸配列と比較して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、79%、78%、77%、76%、75%若しくは好ましくは80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は配列番号:5のアミノ酸配列と比較して最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、24個、25個、26個、27個若しくは好ましくは23個のアミノ酸置換、挿入及び/若しくは欠失を有するポリペプチドを含むことも本明細書で想定される。gEの好ましい細胞質ドメインは、UL11、UL16及びUL21と複合体を形成し得る。したがって、gEの好ましい細胞質ドメインは、UL11とダイマー、UL11及びUL16とトリマー、並びにUL11、UL16及びUL21とテトラマーを形成し得る。

0035

本発明のワクチン組成物のHSVポリペプチドUL48は、好ましくは、配列番号:6のアミノ酸配列と80%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL48は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。

0036

本明細書で使用される場合、「UL48」という用語は、HSVのテグメントタンパク質VP16に関する。配列番号:6は、アクセッションナンバーAHG54712.1でNCBIGenBankにも寄託されているHSV−2 UL48のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「UL48」という用語はまた、配列番号:6に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するUL48ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号:6に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「UL48」という用語は、配列番号:6のアミノ酸配列と比較して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、79%、78%、77%、76%、75%若しくは好ましくは80%以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号:6のアミノ酸配列と比較して最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、99個、100個、101個、102個、103個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、110個、111個、112個、113個、114個、115個、116個、117個、118個、119個、120個、121個、122個、123個若しくは好ましくは98個のアミノ酸置換、挿入及び/若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいUL48タンパク質は、UL49とダイマーを形成し得、又はUL49及びgE若しくはgEの細胞質尾部とトリマーを形成し得る。

0037

本発明のワクチン組成物のHSVポリペプチドUL49は、好ましくは、配列番号:7のアミノ酸配列と62%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL49は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。

0038

本明細書で使用される場合、「UL49」という用語は、HSVのテグメントタンパク質VP22に関する。配列番号:7は、アクセッションナンバーAKC42813.1でNCBIGenBankにも寄託されているHSV−2 UL49のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「UL49」という用語はまた、配列番号:7に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するUL49ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号:7に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「UL49」という用語は、配列番号:2のアミノ酸配列と比較して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、74%、73%、72%、71%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、61%、60%、59%、58%、57%若しくは好ましくは62%以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号:7のアミノ酸配列と比較して最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個、89個、90個、91個、92個、93個、94個、95個、96個、97個、98個、99個、100個、101個、102個、103個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、110個、111個、112個、113個、114個、116個、117個、118個、119個、120個、121個、122個、123個、124個、125個、126個、127個、128個、129個、130個若しくは好ましくは115個のアミノ酸置換、挿入及び/若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいUL49タンパク質は、UL48及び/又はgE若しくはgEの細胞質尾部と複合体を形成し得る。したがって、好ましいUL49タンパク質は、UL48若しくはgE若しくはgEの細胞質尾部とダイマーを形成し得、又はUL48及びgE若しくはgEの細胞質尾部とトリマーを形成し得る。

0039

本発明のさらに好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物に含まれるHSVポリペプチドUL48、UL49を含むマルチマー複合体はまた、HSVポリペプチドgEの細胞質ドメインを含むトリマーであり得る。この場合、本発明のマルチマー複合体は、HSVポリペプチドUL48、UL49及びgEの細胞質ドメインを含む。

0040

本発明のワクチン組成物のHSVポリペプチドUL31は、好ましくは、配列番号:8のアミノ酸配列と85%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL31は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。

0041

本明細書で使用される場合、「UL31」という用語は、HSVのビリオン放出タンパク質に関する。配列番号:8は、アクセッションナンバーAHG54695.1でNCBIGenBankにも寄託されているHSV−2 UL31のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「UL31」という用語はまた、配列番号:8に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するUL31ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号:8に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「UL31」という用語は、配列番号:1のアミノ酸配列と比較して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、84%、83%、82%、81%、80%若しくは好ましくは85%以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号:8のアミノ酸配列と比較して最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、56個、57個、58個、59個、60個、61個若しくは好ましくは46個のアミノ酸置換、挿入及び/若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいUL31タンパク質は、UL34とダイマーを形成し得る。

0042

本発明のワクチン組成物のHSVポリペプチドUL34は、好ましくは、配列番号:9のアミノ酸配列と70%以上同一のアミノ酸配列を含み、前記HSVポリペプチドUL34は、ワクチン組成物の形態で被験体に投与された場合に免疫応答を誘発することができる。

0043

本明細書で使用される場合、「UL34」という用語は、HSVのビリオン放出タンパク質に関する。配列番号:9は、アクセッションナンバーAHG54698.1でNCBIGenBankにも寄託されているHSV−2 UL34のアミノ酸配列を例示的に示す。しかしながら、「UL34」という用語はまた、配列番号:9に示されているアミノ酸配列と一定の同一性を共有するアミノ酸配列を有するUL34ポリペプチドを包含し、本明細書に記載される配列番号:9に示されている参照配列と比べて突然変異を有するポリペプチドも包含する。したがって、「UL34」という用語は、配列番号:2のアミノ酸配列と比較して99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、69%、68%、67%、66%、65%若しくは好ましくは70%以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド、又は配列番号:9のアミノ酸配列と比較して最大1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個、84個、85個、86個、87個、88個若しくは好ましくは75個のアミノ酸置換、挿入及び/若しくは欠失を有するポリペプチドを包含する。好ましいUL34タンパク質は、UL31とダイマーを形成(for)し得る。

0044

前述のように、突然変異が、本発明のワクチン組成物における抗原としてのタンパク質の使用に有害ではない限り、本発明の各タンパク質は、配列番号:1(UL11)、配列番号:2(UL16)、配列番号:3(UL21)、配列番号:4(gE)、配列番号:5(gEの細胞質ドメイン)、配列番号:6(UL48)、配列番号:7(UL49)、配列番号:8(UL31)及び配列番号:9(UL34)に示されている参照配列と比べて、挿入、欠失及び置換などの突然変異を含有し得る。加えて、このような突然変異は、本発明のマルチマー複合体を形成するタンパク質の能力を妨げてはならない。本発明のマルチマー複合体の形成は、タンパク質精製を実施し、例えば非還元PAGE、ウエスタンブロット及び/又はサイズ排除クロマトグラフィーによってタンパク質を分析することによって試験され得る。特に、各タンパク質は、例えば、検出、精製を容易にし得、及び/又は溶解性を増強し得るタグを含み得る。

0045

本発明のさらに好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物のマルチマー複合体のポリペプチドは、HSV−1ポリペプチドである。

0046

本発明のさらに好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物のマルチマー複合体のポリペプチドは、HSV−2ポリペプチドである。

0047

本発明のワクチン組成物は、薬学的に許容し得る担体又はアジュバントをさらに含み得る。

0048

「担体」及び「賦形剤」という用語は、本明細書では互換的に使用される。薬学的に許容し得る担体としては、限定されないが、希釈剤充填剤、増量剤、例えばラクトース微結晶性セルロース)、崩壊剤(例えば、デンプングリコール酸ナトリウムクロスカルメロースナトリウム)、結合剤(例えば、PVP、HPMC)、潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム)、流動促進剤(例えば、コロダルSiO2)、溶媒/共溶媒(例えば、水性ビヒクルプロピレングリコールグリセロール)、緩衝剤(例えば、クエン酸塩グルコン酸塩乳酸塩)、保存剤(例えば、安息香酸Na、パラベン(Me、Pr及びBu)、BKC)、抗酸化剤(例えば、BHT、BHA、アスコルビン酸)、湿潤剤(例えば、ポリソルベートソルビタンエステル)、消泡剤(例えば、シメチコン)、増粘剤(例えば、メチルセルロース又はヒドロキシエチルセルロース)、甘味剤(例えば、ソルビトールサッカリンアスパルテームアセスルファム)、香味剤(例えば、ペパーミントレモン油バタースコッチなど)、保湿剤(例えば、プロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール)が挙げられる。さらなる薬学的に許容し得る担体は、(生分解性リポソーム生分解性ポリマーポリ(D,L)−乳酸−co−グリコール酸PLGA)から作製されたマイクロスフェアアルブミンマイクロスフェア;合成ポリマー(可溶性);ナノ繊維、タンパク質−DNA複合体タンパク質コンジュゲート赤血球;又はビロソームである。様々な担体ベース剤形は、固体脂質ナノ粒子(SLN)、ポリマーナノ粒子セラミックナノ粒子ヒドロゲルナノ粒子、共重合ペプチドナノ粒子ナノ結晶及びナノ懸濁液、ナノ結晶、ナノチューブ及びナノワイヤー官能ナノ担体ナノスフェアナノカプセル、リポソーム、脂質エマルジョン、脂質マイクロチューブマイクロシリンダー、脂質マイクロバブルリポスフェアリポポリプレックス、逆脂質ミセルデンドリマーエトソーム、多成分超カプセルアクアソーム、ファーマコソーム、コロイドソーム、ニオゾーム、ディスコーム、プロニオソーム、マイクロスフェア、マイクロエマルジョン及びポリマーミセルである。他の適切な薬学的に許容し得る賦形剤は、とりわけRemington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publishing Co., New Jersey (1991)及びBauer et al., Pharmazeutische Technologie, 5th Ed., Govi-Verlag Frankfurt (1997)に記載されている。当業者であれば、例えば、医薬組成物の製剤化及び投与経路に応じて、適切な薬学的に許容し得る担体を容易に選択することができるであろう。

0049

本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、抗原又はそのフラグメントに対する宿主の免疫応答(抗体及び/又は細胞性)を増強、増大又は強化する物質を指す。本発明にしたがって使用するための例示的なアジュバントとしては、無機化合物、例えばミョウバン、水酸化アルミニウムリン酸アルミニウム水酸化リン灰石、TLR9アゴニストであるCpGオリゴデオキシヌクレオチド、TLR4アゴニストであるモノホスホリル脂質(MPL)、TLR4アゴニストであるグルコピラノシル脂質(GLA)、油中水型エマルジョンであるMontanideISA51及び720鉱油、例えばパラフィン油、ビロソーム、細菌産物、例えば死菌Bordetella pertussis、Mycobacterium bovis、トキソイド、非細菌有機物質、例えばスクアレンチメロサール、洗浄剤(Quil A)、サイトカイン、例えばIL−1、IL−2、IL−10及びIL−12、並びに複合組成物、例えばフロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバントが挙げられる。一般に、本発明にしたがって使用されるアジュバントは、好ましくは、本発明のマルチマー複合体に対する免疫応答を強化し、及び/又はそれを所望の免疫応答に対してモジュレーションする。

0050

「薬学的に許容し得る」という用語は、本発明のマルチマー複合体の生物学的活性の有効性を妨げない非毒性材料を意味する。

0051

精製
全てのその文法的形態の「精製」は、望ましくない化合物、例えば細胞、細胞残屑培養培地バキュロウイルス、インタクト又は非インタクトなバキュロウイルスなどを除去することを意味する。発現系、収量などに応じた適切な精製方法は、先行技術において容易に利用可能である。例えば、精製としては、イオン交換クロマトグラフィー疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び/又は混合モードクロマトグラフィー(これらは全て、これまでに詳細に記載されている)が挙げられ得る。前記のように、精製工程は、とりわけ、バキュロウイルスを除去することを包含する。このようなバキュロウイルスは、バキュロウイルスベクター又はBacMamベクターを感染させた宿主細胞から取得可能な培養培地及び/又は上清に含まれ得る。本発明のマルチマー複合体を精製する場合、このようなバキュロウイルスが除去されることが好ましい。

0052

本明細書で使用される場合、精製はまた、HSVタンパク質を共発現する宿主細胞が培養培地から除去され得ることを含む。前記宿主細胞は前記マルチマー複合体を分泌し得るので、前記培養培地は、好ましくは本発明のマルチマー複合体を含む。培養培地からの宿主細胞の除去は、機械力によって、例えば遠心分離又はろ過によって行われ得る。ろ過は、好ましくは、ろ過媒体、例えば精密ろ過フィルタ又はデプスフィルタを使用することによって行われる。精密ろ過フィルタは、ポリエーテルスルホン又は再生セルロースから構成され得る。デプスフィルタは、ポリプロピレン又はガラス繊維から構成され得る。

0053

しかしながら、前記宿主細胞は、前記マルチマー複合体を必ずしも分泌しなくてもよいことも想定される。そのような場合、前記宿主細胞を回収し得る。回収後、マルチマー複合体を放出させるために、前記宿主細胞を例えば酵素的又は機械的に破壊し得、次いで、本明細書に記載されるようにこれを精製し得る。

0054

精製後、キレート化剤をマルチマー複合体に追加することが想定される。

0055

保存
全てのその文法的形態の「保存」は、好ましくは本発明のマルチマー複合体をそのインタクト又は機能的な形態で維持する条件下で(将来的な使用のために)貯蔵することを意味する(すなわち、マルチマー複合体は、好ましくは、その天然に存在する形態に似ている)。したがって、保存条件は、本発明のマルチマー複合体の崩壊を促進しない(又は防止さえする)ことが想定される。「崩壊」という用語は、本明細書ではその最も広い意味で理解されるべきであり、「分解」及び/又は「変性」を意味し得る。本発明のマルチマー複合体の保存は、キレート化剤及び/又は安定剤を含むバッファー溶液中であることが想定される。

0056

一般に、本発明のマルチマー複合体の保存を可能にし、その崩壊を促進しない限り、任意のキレート化剤及び/又は安定剤が適切である。

0057

本発明のバッファー溶液は、トリスバッファー、NaCl、KCl、PBS、HEPESバッファーを含み得る。

0058

ワクチン組成物の使用
本発明はまた、被験体においてHSVに対する免疫応答を誘導する方法におけるワクチン組成物の使用に関する。

0059

本発明の好ましい実施態様では、ワクチン組成物は、HSV感染症の治療、予防若しくは改善又はHSV再活性化の予防に使用される。

0060

したがって、ワクチン組成物は、HSVによって引き起こされる疾患及び/又は関連症候との闘いにおいて使用され得る。本発明のワクチン組成物は、被験体におけるウイルスを除去するために使用され得ることも想定される(すなわち、処置後、被験体から得られた適切なサンプルにおいて、HSVは、当業者に公知の適切な方法、例えばPCRELISAなどを使用して検出され得ない)。したがって、本発明のワクチン組成物は、原発感染症を阻止し、原発疾患を停止し、ウイルスの再活性化及び再感染を阻止し、潜伏を阻止するために使用され得る。

0061

性器ヘルペスの機会を減少させるために、母親の一次HSV感染を予防するための予防的ワクチンが望ましいが、母親が活動性HSV感染症と診断された場合には、有効な治療が必要である。本発明のマルチマー複合体は、例えば、妊婦若しくは子供のための予防ワクチンとして、又は血清陽性女性において送達時に無症候性再活性化を予防するための治療的ワクチンとして適用され得る。

0062

本発明のさらに好ましい実施態様では、ワクチン組成物は、被験体においてHSV−1又はHSV−2に対する免疫応答を誘導するための方法において使用される。

0063

ベクター
本発明はさらに、UL11、UL16及びUL21並びに場合によりgE又はgEの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。本発明のさらなる実施態様では、ベクターはまた、UL11及びUL16をコードするポリヌクレオチドを含み得る。本発明のさらなる実施態様では、ベクターはまた、UL16及びUL21をコードするポリヌクレオチドを含み得る。本発明はさらに、UL48、UL49及びgE又はgEの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。本発明のさらなる実施態様では、ベクターはまた、UL48及びUL49をコードするポリヌクレオチドを含み得る。本発明のさらなる実施態様では、ベクターはまた、UL49及びgE又はgEの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み得る。本発明はさらに、UL31及びUL34をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。一般に、本発明の複合体のHSVタンパク質をコードする遺伝子はまた、1つを超えるベクター、例えば2つのベクター上に存在し得る。したがって、遺伝子の1つ、2つ又は3つは第1のベクター上にあり、残りの遺伝子は第2のベクター上にある。しかしながら、各遺伝子はまた、別個のベクター上に存在し得る。しかしながら、好ましくは、前記遺伝子は、単一ベクター上に存在する。遺伝子はまた、ポリジェニック形態で存在し得る(欧州特許出願公開第1945773号)。

0064

本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、目的のタンパク質をコードする遺伝子を含む発現カセットが挿入又はクローニングされ得る核酸配列を指す。さらに、ベクターは、宿主細胞の選択をもたらす抗生物質耐性遺伝子をコードし得る。好ましくは、ベクターは、発現ベクターである。

0065

ベクターは、細菌(例えば、E. coli)、酵母(例えば、S. cerevisiae)、昆虫細胞及び/又は哺乳動物細胞における増殖のためのエレメントを含有し得る。好ましくは、前記ベクターは、バキュロウイルスベクター又はバキュロウイルスBacMamベクターである。ベクターは、線状、環状又はスーパーコイル状の形態を有し得、特定の目的のために他のベクター又は他の材料と複合体形成し得る。ベクターはまた、宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。

0066

BacMam系では、バキュロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物細胞に送達するために使用される。BacMam系は、宿主細胞として広範囲細胞株及び初代細胞への遺伝子送達のために使用され得、これらの例示的なリストは、本明細書の他の箇所に含まれる。非改変バキュロウイルスは哺乳動物細胞に侵入することができるが、しかしながら、哺乳動物認識可能プロモーターが目的の遺伝子の上流に組み込まれない限り、その遺伝子は発現されない。したがって、本発明のBacMamベクターは、本発明のマルチマー複合体のタンパク質をコードする遺伝子の上流に哺乳動物プロモーターを含むことが想定される。ベクターは、本明細書の他の箇所に記載されるさらなるエレメント、例えば抗生物質耐性遺伝子、E. coli、S. cerevisiaeなどにおける増殖のためのエレメントを含み得る。

0067

ベクターは、例えば、複製起点、プロモーター、クローニング部位遺伝子マーカー、抗生物質耐性遺伝子、エピトープ、レポーター遺伝子ターゲティング配列及び/又はタンパク質精製タグを含む1つ以上のさらなるエレメントを含有し得る。当業者であれば、特定の発現系に適切なエレメントを容易に把握するであろう。

0068

特に、本発明のベクターは、細菌(E. coli)、酵母(S. cerevisiae)、昆虫細胞及び/又は哺乳動物細胞における増殖のためのエレメント、例えば複製起点、選択マーカーなどをさらに含有し得る。

0069

ベクターは、遺伝子発現のためのプロモーターを含むことが想定される。本明細書に記載される本発明のタンパク質をコードする各遺伝子は、プロモーターによって駆動される。プロモーターは、好ましくは、polh、p10及びpXIV超後期バキュロウイルスプロモーター、vp39バキュロウイルス後期プロモーター、vp39polhバキュロウイルス後期/超後期ハイブリッドプロモーター、pca/polh、pcna、etl、p35、egt、da26バキュロウイルス初期プロモーター;CMV−IE1、UBc.EF−1、RSVLTRMTシミアンウイルス40プロモーター、CAGプロモーター(CMV−IE1エンハンサーを含むベータアクチンプロモーター)、B型肝炎ウイルスプロモーター/エンハンサー、ヒトユビキチンCプロモーター、ハイブリッドニューロンプロモーター、pDS47、Ac5及びPGAL及びPADHからなる群より選択される。各遺伝子の後に、ターミネーター配列、例えばHSVtkターミネーターSV40ターミネーター又はウシ成長ホルモン(BGH)ターミネーターが続く。

0070

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」又は「核酸分子」という用語は本明細書では互換的に使用され、通常、あるデオキシリボース又はリボースから別のものに連結されたポリマー形態のヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」という用語は、好ましくは、一本鎖形態及び二本鎖形態のDNA又はRNAを含む。本発明の核酸分子は、(リボヌクレオチドを含有する)RNA、cDNAゲノムDNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方、並びに上記の合成形態及び混合ポリマーを含み得る。当業者によって容易に認識されるように、それらは、化学的若しくは生化学的に改変され得るか、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得る。このような改変としては、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドの1つ以上を類似体で置換すること、ヌクレオチド間改変、例えば非荷電結合(例えば、メチルホスホナートホスホトリエステルホスホルアミダートカルバメートなど)、荷電結合(例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど)、ペンダント部分(例えば、ポリペプチド)、インターカレーター(例えば、アクリジンソラレンなど)、キレート化剤、アルキル化剤及び改変結合(例えば、アルファアノマー核酸など)が挙げられる。水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力の点でポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。このような分子は当技術分野で公知であり、例えば、分子の骨格においてペプチド結合がリン酸結合と置き換わった分子を含む。

0071

これに関して、発現産物である核酸は、好ましくはRNAであるのに対して、細胞に導入される核酸は、好ましくはDNA又はRNA、例えば合成DNA、ゲノムDNA又はcDNAである。

0072

本明細書に開示されるマルチマー複合体をコードする核酸又はベクターを含むワクチン組成物も想定される。前記核酸又はベクターは、DNA又はRNAベースのものであり得る。ワクチン組成物にしたがって使用するための適切なベクターとしては、DNAベースのベクター、例えばバキュロウイルスベクター、BacMamベクター、アデノウイルスベクターレンチウイルスベクター、AAVベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター及びエプスタイン−バーウイルスEBV)ベクターが挙げられる。例えば、プラスミドの形態でかつ場合により複合体化及び/又は安定化形態(例えば、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、ビロソーム及び無機ナノ粒子との複合体)の、ネイキッドなDNAの使用も想定される。適切なRNAベースのベクターとしては、レトロウイルスベクターセムリキ森林熱ウイルス(SFV)、シンドビスウイルス(SIN)及びベネズエラウマ脳炎ウイルスVEE)ベクターが挙げられる。

0073

マルチマー複合体を含むワクチン組成物と、マルチマー複合体をコードする核酸又はベクターを含むワクチン組成物とは、プライムブーストレジメンにおいて使用され得る。プライムブーストレジメンでは、一次免疫化(プライム又はプライミング)において使用されるワクチン及びブースター免疫化(ブースト又はブースティング)において使用されるワクチンを含む2種類以上のワクチンから構成されるプライム/ブーストワクチンが使用される。一次免疫化において使用されるワクチン及びブースター免疫化において使用されるワクチンは、互いに異なり得る。一次免疫化及びブースティング免疫化は逐次的に実施され得るが、しかしながら、これは必須ではない。プライム/ブーストレジメンとしては、限定されないが例えば、DNAプライム/タンパク質ブーストが挙げられる。しかしながら、ブースティング組成物はプライミング組成物としても使用され得、前記プライミング組成物はブースティング組成物として使用される。

0074

宿主細胞
本発明はさらに、UL11、UL16及びUL21並びに場合によりgE又はgEの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞に関する。本発明のさらなる実施態様では、宿主細胞はまた、UL11及びUL16をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み得る。本発明のさらなる実施態様では、宿主細胞はまた、UL16及びUL21をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み得る。

0075

本発明はさらに、UL48、UL49及びgE又はgEの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞に関する。本発明のさらなる実施態様では、宿主細胞はまた、UL48及びUL49をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み得る。本発明のさらなる実施態様では、宿主細胞はまた、UL49及びgE又はgEの細胞質ドメインをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含み得る。

0076

本発明はさらに、UL31及びUL34をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞に関する。

0077

宿主細胞は、昆虫細胞又は哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞はまた、細菌(例えば、E. coli)又は酵母(例えば、S. cerevisiae)であり得る。一般に、核酸分子を発現して本発明のマルチマー複合体を産生するために適切な任意の宿主細胞が使用され得る。しかしながら、昆虫宿主細胞及び哺乳動物宿主細胞が好ましい。昆虫宿主細胞がさらにより好ましい。本発明にしたがって使用される宿主細胞は、昆虫細胞、例えばSf9、Sf21、Super Sf9−1(VE−1)、Super Sf9−2(VE−2)、Super Sf9−3(VE−3)、Hi−5、Express Sf+及びS2シュナイダー細胞であり得、Hi−5が好ましい[Oxford Expression Technologies, Cat. No. 600103, Oxford, UK; Fath-Goodin et al. (2006), Adv. Virus Res. 68, 75-90; Kroemer et al. (2006), J. Virol. 80(24), 12291-12228及び米国特許出願公開第20060134743号]。使用され得る例示的な哺乳動物宿主細胞は当技術分野で公知であり、American Type Culture Collection (ATCC)から入手可能な不死化細胞株、限定されないが、HEK293、HEK293F、CHO、HeLa、HUVEC、HUAEC、Huh7、HepG2、BHK、MT−2、Cos−7、Cos−1、C127、3T3、ヒト包皮線維芽細胞(HFF)、骨髄線維芽細胞、Bowesメラノーマ、初代神経細胞又は上皮細胞が挙げられる。BacMam系では、バキュロウイルス発現ベクターは、遺伝子を哺乳動物細胞に送達するために使用される。

0078

生産方法
本発明はさらに、マルチマー複合体を含むワクチン組成物を生産するための方法であって、
(i)本発明の宿主細胞を培養すること;
(ii)マルチマー複合体を得ること;
(iii)及び、前記マルチマー複合体と薬学的に許容し得る担体又はアジュバントとを混合すること
を含む方法を提供する。

0079

本発明のマルチマー複合体との関連で記載されている実施態様は、必要な変更を加えて、本発明の方法にも適用されることに留意する。

0080

マルチマー複合体は、バキュロウイルス、例えばバキュロウイルス発現系又はBacMam発現系を使用することによって、宿主細胞、好ましくは昆虫細胞又は哺乳動物細胞において発現され得る。「発現ベクター」は、本明細書では、遺伝物質を発現させ得るターゲット宿主細胞に遺伝物質を移入するために使用されるビヒクルとして定義される。「発現系」は、発現ベクターと、該ベクターのための宿主細胞であって、該宿主細胞における外来遺伝子発現を可能にするための状況を提供する宿主細胞との組み合わせである。本発明の複合体は、一過的又は安定的に発現され得る。したがって、本発明の宿主細胞は、発現ベクターで一過的にトランスフェクションされ得るか、又は例えば安定な細胞株をもたらす宿主細胞ゲノムへのベクターの組み込みを介して、発現ベクターで安定的にトランスフェクションされ得る。

0081

バキュロウイルス発現系は、典型的には、例えばターゲット遺伝子を含有するトランスファーベクターとの相同組換えを介した、非必須ウイルスゲノム領域への外来遺伝子の導入に基づく。得られたリコンビナントバキュロウイルスは、適切な宿主細胞において発現され得る異種タンパク質をコードする外来遺伝子で置き換えられた非必須遺伝子(例えば、polh、v−cath、ChiA)の1つを欠き得る。一般に、これらの技術は当業者に公知であり、例えばKosta et al. Nat Biotechnol. 2005; 23(5):567-75に概説されている。リコンビナントバキュロウイルスベクターを調製するための特定のアプローチは、Bac-to-Bac(登録商標)バキュロウイルス系(Invitrogen)である。

0082

リコンビナントバキュロウイルス発現ベクターは、宿主細胞において、及び場合によりE. coliなどの原核細胞において複製可能なものであり得る。本発明によれば、タンパク質のリコンビナント発現に一般に使用されるバキュロウイルスに由来する任意のバキュロウイルス発現ベクターが使用され得る。例えば、バキュロウイルスベクターは、例えば、AcMNPV、Bombyx mori(Bm)NPV、Helicoverpa armigera(Hear)NPV又はSpodoptera exigua(Se)MNPVに由来し得る。バキュロウイルスベクターは、バクミドであり得る。

0083

本明細書で使用される場合、「a」、「an」及び「the」という単数形は、特に文脈上明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「発現カセット」への言及は、本明細書に開示される発現カセットの1つ以上を含み、「方法」への言及は、改変され得るか又は本明細書に記載される方法と置き換えられ得る当業者に公知の同等の工程及び方法への言及を含む。

0084

本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、特に文脈上必要がない限り、「含む(comprise)」という単語並びに「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」などの変化形は、記述されている整数若しくは工程又は一群の整数若しくは工程を含むが、任意の他の整数若しくは工程又は一群の整数若しくは工程を排除しないことを暗示すると理解されよう。本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「含有する」という用語と置き換えられ得るか、又は本明細書で使用される場合には「有する」という用語と置き換えられることもあり得る。

0085

本明細書で使用される場合、「からなる」は、請求項のエレメントにおいて特定されていないいかなるエレメント、工程又は成分も排除する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、請求項の基本的な新規特徴に実質的に影響を与えない材料又は工程を排除しない。本明細書における各事例では、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という用語のいずれかは、他の2つの用語のいずれかと置き換えられ得る。

0086

本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、所定の値又は範囲の20%以内、好ましくは10%以内、より好ましくは5%以内を意味する。それはまた、名数を含む(例えば、約20は20を含む)。

0087

特に本明細書で他の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、特に文脈上必要がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本発明の方法及び技術は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法にしたがって実施される。一般に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分子細胞生物学微生物学遺伝学並びにタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションの技術に関連して使用される命名法は、当技術分野で周知であり、一般に使用される。

0088

特に他の指示がない限り、本発明の方法及び技術は、一般に、当技術分野で周知でありかつ本明細書を通して引用及び議論されている様々な一般的な参考文献及びより専門的な参考文献に記載されている通りの従来の方法にしたがって実施される。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I 1976CRCPress; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Pressを参照のこと。本明細書に記載される分子細胞生物学、タンパク質生化学、酵素学及び医薬品化学に関連して使用される命名法並びにそれらの実験手順及び技術は、当技術分野で周知でかつ一般に使用されるものである。

図面の簡単な説明

0089

本発明のHSVタンパク質のアミノ酸配列
本発明のHSVタンパク質のアミノ酸配列
UL21/UL16/UL11−Hisトリマーを示すSDS−PAGE及びウエスタンブロットの例
UL48−His/UL49−Hisダイマーを示すSDS−PAGEの例
UL48−His/UL49−Hisダイマーを示すSDS−PAGEの例
UL48−His/UL49−Hisダイマーを示すサイズ排除クロマトグラフィーの例
UL48−His/UL49−Hisダイマーを示すサイズ排除クロマトグラフィーの例
UL31−His/UL34ダイマーを示すSDS−PAGE及びウエスタンブロットの例
UL31/UL34−Hisダイマーを示すSDS−PAGE及びウエスタンブロットの例
UL31/UL34−Hisダイマーを示すSDS−PAGE及びウエスタンブロットの例
感染モルモットを用いたUL31/UL34ダイマーのELISPOT
患者PBMCを用いたUL31/UL34ダイマーのELISPOT
患者PBMCを用いたUL48/UL49ダイマーのELISPOT
患者PBMCを用いたUL48/UL49ダイマーのELISPOT
患者PBMCを用いたUL11/UL16/UL21トリマーのELISPOT
患者PBMCを用いたUL11/UL16/UL21トリマーのELISPOT
患者PBMCを用いたUL31/UL34ダイマーのLuminexアッセイ
患者PBMCを用いたUL48/UL49ダイマーのLuminexアッセイ
患者PBMCを用いたUL11/UL16/UL21トリマーのLuminexアッセイ実施例 以下の実施例は本発明を例証するが、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

0090

実施例1
Hi−5昆虫細胞においてUL21/UL16/UL11−Hisトリマーを発現させ、適切な溶解後に細胞ペレットから放出させた。続いて、IMAC及び0〜500mMイミダゾールバッファー系(50mM Hepes、500mM NaCl、pH7.0、1mM TCEP、10%グリセロール)を使用して、トリマーを精製した。25mM イミダゾールをカラムに適用することによって、不純物を洗い流した。次いで、250mM イミダゾールでトリマーを溶出させ、続いて、イミダゾールを含まないHepesバッファー(50mM Hepes、150mM NaCl、pH7.0、0.5mM TCEP、10%グリセロール)で透析した。図2(A)SDS−PAGEの例が示されている。このブロットでは、UL11−Hisは、薄いバンドによって表されているが、これは、抗His抗体を使用して明らかにされたものである。図2(B)UL11−Hisを検出するために抗His抗体を使用して実施したウエスタンブロットの例が示されている。両例における表示:1.標準、2.ろ過上清、3.細胞ペレット、4.フロースルー、5〜10.画分A5、B9、B11、C3、C6、E6、11.画分B9〜C3のプール、12.透析後のペレット、13.透析後の上清、14.ろ過タンパク質。

0091

実施例2:
Hi−5昆虫細胞においてUL48−His/UL49−Hisダイマーを発現させ、適切な溶解後に細胞ペレットから放出させた。続いて、IMAC及び0〜500mMイミダゾールバッファー系(TBSバッファー、500mM NaCl、pH7.4)を使用して、ダイマーを精製した。50mM イミダゾールをカラムに適用することによって、不純物を洗い流した。次いで、350mM イミダゾールでダイマーを溶出させ、続いて、イミダゾールを含まないTBSバッファー(TBSバッファー、500mM NaCl、pH7.4、10%グリセロール)で透析した。生成物をサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)にさらに供して、ダイマーの存在を証明した。UL48−His/UL49−Hisダイマーの予想サイズに対応するピークが存在した。図3(A)は、SECが示される前のSDS−PAGEの例を示す。表示:1.標準−a、2.上清、3.残屑ペレット、4.ろ過上清、5.未結合画分洗浄、6〜14.画分2A9、2A12、2C4、2C10、2C12、ろ過2C12、2D2、2D6、2D7。図3(B)及び(C)は、サンプルのSEC及びアセトン沈殿後のSDS−PAGEの例を示す。パネル(C)では、(B)と同じゲルが示されているが、低強度のバンドをより可視化するために露出過度にされている。表示:1.標準−b、2〜9.画分SECアセトン沈殿A8、A12、B1、B2、B3、B4、B5、B6.10.標準−a、11.画分2C11、2D1及び2D2のプールIMAC、12.プールIMAC透析液、13.透析液のプールIMAC上清、14.プールIMACペレット、15.プールIMACろ過タンパク質。

0092

実施例3:
UL48−His/UL49−His生成物の分析のために、TBSバッファー、500mM NaCl、pH7.4中で、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行った。Superdex 200 Increase 10/300 GL SECカラム及び流速0.5mL/分を使用して、ランを実施した。標準として3mg/mL BSAを使用して、カラムを較正した。図4(A)では、保持容量 12.36及び14.21mLのピークは、それぞれBSA較正標準のダイマー及びモノマー(66kDa)に対応する。図4(B)では、12.93mLの主ピークはUL48/UL49ダイマーを表すのに対して、12.16mLのピークは、UL48及びUL49サブユニットのテトラマー形成に対応する可能性が高い。図4(C)は、(A)及び(B)に示されている2回の独立したランのオーバーレイを示す。挿入図は、保持容量 8.5〜18mLの領域の拡大を示す。

0093

実施例4:
Hi−5昆虫細胞においてUL31−His/UL34ダイマーを発現させ、適切な溶解後に細胞ペレットから放出させた。続いて、IMAC及び0〜500mMイミダゾール連続勾配バッファー系(50mM Hepes、500mM NaCl、pH7.0、1mM TCEP)を使用して、ダイマーを精製した。図5(A)SDS−PAGEの例が示されている。2つの最濃縮画分の一方が、アスタリスクマーキングされている。図5(B)UL31−Hisを検出するために抗His抗体を使用して実施したウエスタンブロットの例が示されている。両例における表示:1.標準、2.上清、3.ろ過上清、4.細胞ペレット、5.フロースルー、6.未結合タンパク質の洗浄、7〜13.画分A8、A10、B4、B8、B11、C2、C7。

0094

実施例5:
Hi−5昆虫細胞においてUL31/UL34−Hisダイマーを発現させ、適切な溶解後に細胞ペレットから放出させた。続いて、IMAC及び25〜500mMイミダゾール連続勾配バッファー系(50mM Hepes、500mM NaCl、pH7.0、1mM TCEP)を使用して、ダイマーを精製した。図6(A)SDS−PAGEの例が示されている。2つの最濃縮画分の一方が、アスタリスクでマーキングされている。図6(B)UL34−Hisを検出するために抗His抗体を使用して実施したウエスタンブロットの例が示されている。両例における表示:1.標準、2.上清、3.ろ過上清、4.細胞ペレット、5.フロースルー、6.未結合タンパク質の洗浄、7〜13.画分A8、A10、B4、B8、B11、C2、C7。

0095

実施例6:
Hi−5昆虫細胞においてUL31/UL34−Hisダイマーを発現させ、適切な溶解後に細胞ペレットから放出させた。続いて、IMAC及び0〜500mMイミダゾールバッファー系(50mM Hepes、500mM NaCl、pH7.0、1mM TCEP、10%グリセロール)を使用して、ダイマーを精製した。50mM及び75mM イミダゾールをカラムに適用することによって、不純物を2段階で洗い流した。次いで、350mM イミダゾールでダイマーを溶出させ、続いて、イミダゾールを含まないHepesバッファー(50mM Hepes、500mM NaCl、pH7.0、0.5mM TCEP、10%グリセロール)で透析した。図7(A)SDS−PAGEの例が示されている。図7(B)UL34−Hisを検出するために抗His抗体を使用して実施したウエスタンブロットの例が示されている。両例における表示:1.標準、2.培養細胞ペレット、3.溶解物、4.上清、5.粗ペレット、6.ろ過上清、7.フロースルー、8〜16.画分B12、C2、C5、C7、C11及びF1、17.画分C3〜C7のプール、18.透析材料の合計、19.透析後の上清、20.透析後のペレット、21.ろ過タンパク質。

0096

実施例7:
HSV−2感染モルモット及びコントロールモルモット由来脾細胞(細胞1×105個)と、20μg/mL HSV−2 UL31/UL34複合体とを混合した。次いで、細胞をELISPOT抗インターフェロンガンマ(IFN−γ)抗体コーティングプレート(MultiscreenHTS Plates; Millipore)に移し、20時間インキュベーションした。その後、標準的なELISPOTプロトコールにしたがってプレート現像し、自動リーダーを使用してスポットとしてIFN−γ分泌細胞を定量した。非刺激細胞及び20μg/mLPHAをそれぞれネガティブコントロール及びポジティブコントロールとして使用した。結果は、図8に示されている。

0097

実施例8:
HSV−2感染個体 14人及び非感染個体 6人由来のPBMCを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 2×105個/ウェルでELISPOT抗インターフェロンガンマ(IFN−γ)抗体コーティングプレート上にプレーティングした。続いて、5μg/mL HSV−2 UL31/UL34複合体で細胞を48時間刺激した。その後、製造業者説明書にしたがってプレートを現像し、自動リーダーを用いてスポットとしてIFN−γ分泌細胞をカウントした。(バッファー刺激細胞から生成された)バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、PBMC 2×105個当たりのSFU(スポット形成単位)として結果を表した。結果は、図9に示されている。HSV−2タンパク質UL31及びUL34は、モノマーとして発現することができず、ダイマーとしてのみ発現することができる(個人意見、データは示さず)。したがって、UL48/UL49及びUL11/UL16/UL21複合体について示されているように、UL31/UL34複合体及び各モノマーの応答を比較することができなかった(図10及び12を参照のこと)。

0098

実施例9:
HSV−2感染個体 4人及び非感染個体 2人由来のPBMCを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 2×105個/ウェルでELISPOT抗インターフェロンガンマ(IFN−γ)抗体コーティングプレート上にプレーティングした。続いて、5μg/mL HSV−2 UL48/UL49複合体、又は複合体中の単一タンパク質の量に対して正規化した各モノマーで細胞を48時間刺激した。その後、製造業者の説明書にしたがってプレートを現像し、自動リーダーを用いてスポットとしてIFN−γ分泌細胞をカウントした。(バッファー刺激細胞から生成された)バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、PBMC 2×105個当たりのSFU(スポット形成単位)として結果を表した。結果は、図10に示されている。ここでは、非感染個体の応答は、平均値として示されている。

0099

実施例10:
HSV−2感染個体 14人及び非感染個体 6人由来のPBMCを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 2×105個/ウェルでELISPOT抗インターフェロンガンマ(IFN−γ)抗体コーティングプレート上にプレーティングした。続いて、5μg/mL HSV−2 UL48/UL49複合体で細胞を48時間刺激した。その後、製造業者の説明書にしたがってプレートを現像し、自動リーダーを用いてスポットとしてIFN−γ分泌細胞をカウントした。(バッファー刺激細胞から生成された)バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、PBMC 2×105個当たりのSFU(スポット形成単位)として結果を表した。結果は、図11に示されている。

0100

実施例11:
HSV−2感染個体 4人及び非感染個体 2人由来のPBMCを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 2×105個/ウェルでELISPOT抗インターフェロンガンマ(IFN−γ)抗体コーティングプレート上にプレーティングした。続いて、5μg/mL HSV−2 UL11/UL16/UL21複合体、又は複合体中の単一タンパク質の量に対して正規化した各モノマーで細胞を48時間刺激した。その後、製造業者の説明書にしたがってプレートを現像し、自動リーダーを用いてスポットとしてIFN−γ分泌細胞をカウントした。(バッファー刺激細胞から生成された)バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、PBMC 2×105個当たりのSFU(スポット形成単位)として結果を表した。結果は、図12に示されている。ここでは、非感染個体の応答は、平均値として示されている。

0101

実施例12:
HSV−2感染個体 14人及び非感染個体 6人由来のPBMCを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 2×105個/ウェルでELISPOT抗インターフェロンガンマ(IFN−γ)抗体コーティングプレート上にプレーティングした。続いて、5μg/mL HSV−2 UL11/UL16/UL21複合体で細胞を48時間刺激した。その後、製造業者の説明書にしたがってプレートを現像し、自動リーダーを用いてスポットとしてIFN−γ分泌細胞をカウントした。(バッファー刺激細胞から生成された)バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、PBMC 2×105個当たりのSFU(スポット形成単位)として結果を表した。結果は、図13に示されている。

0102

実施例13:
HSV−2感染個体 4人及び非感染個体 2人由来のPBMCを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 5×105個/ウェルでプレート上に播種し、続いて、5μg/mL HSV−2 UL31/UL34複合体で48時間刺激した。その後、上清を収集し、Luminex機器を用いてIFN−γの分泌について分析した。(バッファー刺激細胞から生成された)バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、pg/mlとして結果を表した。結果は、図14に示されている。

0103

実施例14:
HSV−2感染個体 4人及び非感染個体 2人由来のPBMCを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 5×105個/ウェルでプレート上に播種し、続いて、5μg/mL HSV−2 UL48/UL49複合体で48時間刺激した。その後、上清を収集し、Luminex機器を用いてIFN−γの分泌について分析した。(バッファー刺激細胞から生成された)バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、pg/mlとして結果を表した。結果は、図15に示されている。

0104

実施例15:
HSV−2感染個体 4人及び非感染個体 2人由来のPBMCを解凍し、一晩放置した。細胞を、細胞 5×105個/ウェルでプレート上に播種し、続いて、5μg/mL HSV−2 UL11/UL16/UL21複合体で48時間刺激した。その後、上清を収集し、Luminex機器を用いてIFN−γの分泌について分析した。(バッファー刺激細胞から生成された)バックグラウンドシグナルを各ウェルから差し引き、pg/mlとして結果を表した。結果は、図16に示されている。

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