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技術 単一ヌクレオチドの検出方法

出願人 ベース4イノベーションリミテッド
発明者 バーナビーバームフォース
出願日 2017年2月24日 (3年11ヶ月経過) 出願番号 2018-544550
公開日 2019年5月9日 (1年9ヶ月経過) 公開番号 2019-511915
状態 未査定
技術分野 酵素、微生物を含む測定、試験 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード 遮断エレメント 可動表面 エレメント型 遮断部位 エレメント領域 構造的配置 微小液滴中 捕捉領域
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年5月9日)のものです。
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図面 (2)

課題・解決手段

核酸配列決定する方法であって、以下の工程を特徴とする方法:(1)核酸の漸進的ピロホスホリラーゼ分解により単一ヌクレオチドストリームを生成する工程;(2)ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で、単一ヌクレオチドの1つを、以下を含む対応するプローブ系と反応させることによって、少なくとも1つの実質的に二本鎖オリゴヌクレオチドの使用されるプローブを生成する工程:(a)前記捕捉部位を含む制限酵素認識部位エレメントと、そのX'側にエキソヌクレアーゼ遮断部位とを含む第3領域のX'およびY'末端側にそれぞれ位置する検出不能な状態の特徴的な検出可能なエレメント型の第1および第2領域で標識された第1一本鎖オリゴヌクレオチド(ここで、X'は3'であり、Y'は5'であるか、またはX'は5'であり、Y'は3'である)、ならびに(b)前記捕捉部位に隣接する第1オリゴヌクレオチド上の相補的領域にハイブリダイズすることができる第2および第3一本鎖オリゴヌクレオチド;(2a)(i)捕捉された単一ヌクレオチドが置換された核酸塩基を含む場合にのみ、前記使用されたプローブを従来のまたはニッキング置換依存性制限エンドヌクレアーゼで処理し、認識部位で第1オリゴヌクレオチド鎖を切断する工程か、または(ii)捕捉された単一ヌクレオチドが非置換の核酸塩基を含む場合にのみ、前記使用されたプローブを従来のまたはニッキング置換感受性制限エンドヌクレアーゼで処理し、認識部位で第1オリゴヌクレオチド鎖を切断する工程;(3)前記使用されたプローブの第1オリゴヌクレオチド鎖を、二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で、第1オリゴヌクレオチドに対応するX'-Y'方向に消化し、第1領域、第2領域、または検出可能な状態の第1および第2領域のいずれかに由来する検出可能なエレメントと、少なくとも部分的に第1オリゴヌクレオチドの配列相補体である一本鎖第4オリゴヌクレオチドとを生じる工程;(4)第4オリゴヌクレオチドを別の第1オリゴヌクレオチドと反応させ、前記使用されたプローブに対応する実質的に2本鎖のオリゴヌクレオチド産物を生成する工程;(5)工程(2a)、(3)および(4)をサイクルで繰り返す工程;(6)工程(3)の各反復において放出された前記検出可能なエレメントを検出する工程であって、ここで、使用される前記エンドヌクレアーゼ従来型のものである場合、第2または第3オリゴヌクレオチドは、そのX'もしくはY'末端に、またはその近くにそれぞれエンドヌクレアーゼ分解指向性結合を含む。対応する生体プローブ系も開示される。

概要

背景

遺伝物質の次世代配列決定はすでに、より迅速な配列決定装置市場投入に伴い配列決定の単価が下がるなど、生物科学全般に、特に医学に大きな影響を与えている。

本発明者らの先の出願WO2014/053853、WO2014/053854、WO2014/167323、WO2014/167324およびWO2014/111723では、新規配列決定方法が記載されており、それはポリヌクレオチド分析物の漸進的消化を伴い、単一ヌクレオチド順序付けられたストリーム、好ましくは単一デオキシリボヌクレオシド三リン酸のストリームを生成し、その各々を微小液滴ストリーム中の対応する液滴に1つずつ捕捉することができる。その後、各液滴を化学的および/または酵素的に操作し、もともと含有していた特定の単一ヌクレオチドを明らかにすることができる。一実施形態では、これらの化学的および/または酵素的操作は、分析物が構成されている単一ヌクレオチド型のうちの1つを選択的に捕捉することができるように各々がなっている1つ以上の2成分オリゴヌクレオチドプローブ型の使用を伴う方法を含む。典型的には、そのようなプローブ型の各々では、2つのオリゴヌクレオチド成分の1つは特徴的なフルオロフォアを含み、プローブ未使用状態では、これらのフルオロフォアが蛍光を発する能力は、近接する消光剤の存在のために、または自己消光により、失われたままである。使用中、プローブがその対応する単一ヌクレオチドを捕捉した場合、それは、その後のエキソヌクレアーゼ分解を受けやすくなり、それにより消光剤からフルオロフォアを遊離させることができるか、および/または互いにそれらを自由に蛍光発光させることができる。この手段により、各液滴中にもともと存在する単一ヌクレオチドを分光学的手段によって間接的に同定することができる。

概要

核酸を配列決定する方法であって、以下の工程を特徴とする方法:(1)核酸の漸進的ピロホスホリラーゼ分解により単一ヌクレオチドのストリームを生成する工程;(2)ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で、単一ヌクレオチドの1つを、以下を含む対応するプローブ系と反応させることによって、少なくとも1つの実質的に二本鎖オリゴヌクレオチドの使用されるプローブを生成する工程:(a)前記捕捉部位を含む制限酵素認識部位エレメントと、そのX'側にエキソヌクレアーゼ遮断部位とを含む第3領域のX'およびY'末端側にそれぞれ位置する検出不能な状態の特徴的な検出可能なエレメント型の第1および第2領域で標識された第1一本鎖オリゴヌクレオチド(ここで、X'は3'であり、Y'は5'であるか、またはX'は5'であり、Y'は3'である)、ならびに(b)前記捕捉部位に隣接する第1オリゴヌクレオチド上の相補的領域にハイブリダイズすることができる第2および第3一本鎖オリゴヌクレオチド;(2a)(i)捕捉された単一ヌクレオチドが置換された核酸塩基を含む場合にのみ、前記使用されたプローブを従来のまたはニッキング置換依存性制限エンドヌクレアーゼで処理し、認識部位で第1オリゴヌクレオチド鎖を切断する工程か、または(ii)捕捉された単一ヌクレオチドが非置換の核酸塩基を含む場合にのみ、前記使用されたプローブを従来のまたはニッキング置換感受性制限エンドヌクレアーゼで処理し、認識部位で第1オリゴヌクレオチド鎖を切断する工程;(3)前記使用されたプローブの第1オリゴヌクレオチド鎖を、二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で、第1オリゴヌクレオチドに対応するX'-Y'方向に消化し、第1領域、第2領域、または検出可能な状態の第1および第2領域のいずれかに由来する検出可能なエレメントと、少なくとも部分的に第1オリゴヌクレオチドの配列相補体である一本鎖第4オリゴヌクレオチドとを生じる工程;(4)第4オリゴヌクレオチドを別の第1オリゴヌクレオチドと反応させ、前記使用されたプローブに対応する実質的に2本鎖のオリゴヌクレオチド産物を生成する工程;(5)工程(2a)、(3)および(4)をサイクルで繰り返す工程;(6)工程(3)の各反復において放出された前記検出可能なエレメントを検出する工程であって、ここで、使用される前記エンドヌクレアーゼ従来型のものである場合、第2または第3オリゴヌクレオチドは、そのX'もしくはY'末端に、またはその近くにそれぞれエンドヌクレアーゼ分解指向性結合を含む。対応する生体プローブ系も開示される。

目的

Nature Reviews Genetics 7(8) 632-644 (2006)のFanらは、遺伝子型解析コピー数測定、配列決定、ならびにヘテロ接合性喪失対立遺伝子特異的発現およびメチル化の検出の高並列ゲノムアッセイを可能にした方法とプラットフォームとの開発に関する一般評論を提供する

効果

実績

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請求項1

核酸配列決定する方法であって、以下の工程を特徴とする方法:(1)核酸の漸進的ピロホスホリラーゼ分解により単一ヌクレオチドストリームを生成する工程;(2)ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で、単一ヌクレオチドの1つを、以下を含む対応するプローブ系と反応させることによって、少なくとも1つの実質的に二本鎖オリゴヌクレオチドの使用されるプローブを生成する工程:(a)前記捕捉部位を含む制限酵素認識部位エレメントと、そのX'側にエキソヌクレアーゼ遮断部位とを含む第3領域のX'およびY'側にそれぞれ位置する検出不能な状態の特徴的な検出可能なエレメント型の第1および第2領域で標識された第1一本鎖オリゴヌクレオチド(ここで、X'は3'であり、Y'は5'であるか、またはX'は5'であり、Y'は3'である)、ならびに(b)前記捕捉部位に隣接する第1オリゴヌクレオチド上の相補的領域にハイブリダイズすることができる第2および第3一本鎖オリゴヌクレオチド;(2a)(i)捕捉された前記単一ヌクレオチドが置換された核酸塩基を含む場合にのみ、前記使用されたプローブを従来のまたはニッキング置換依存性制限エンドヌクレアーゼで処理し、前記認識部位で第1オリゴヌクレオチド鎖を切断する工程か、または(ii)捕捉された前記単一ヌクレオチドが非置換の核酸塩基を含む場合にのみ、前記使用されたプローブを従来のまたはニッキング置換感受性制限エンドヌクレアーゼで処理し、前記認識部位で第1オリゴヌクレオチド鎖を切断する工程;(3)前記使用されたプローブの第1オリゴヌクレオチド鎖を、二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で、第1オリゴヌクレオチドに対応するX'-Y'方向に消化し、第1領域、第2領域、または検出可能な状態の第1および第2領域のいずれかに由来する検出可能なエレメントと、少なくとも部分的に第1オリゴヌクレオチドの配列相補体である一本鎖第4オリゴヌクレオチドとを生じる工程;(4)第4オリゴヌクレオチドを別の第1オリゴヌクレオチドと反応させ、前記使用されたプローブに対応する実質的に2本鎖のオリゴヌクレオチド産物を生成する工程;(5)工程(2a)、(3)および(4)をサイクルで繰り返す工程;(6)工程(3)の各反復において放出された前記検出可能なエレメントを検出する工程であって、ここで、使用される前記エンドヌクレアーゼ従来型のものである場合、第2または第3オリゴヌクレオチドは、そのX'もしくはY'末端に、またはその近くにそれぞれエンドヌクレアーゼ分解指向性結合を含む。

請求項2

第2オリゴヌクレオチドのY'末端および第3オリゴヌクレオチドのX'末端がリンカー領域によって連結されていることを特徴とする、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記リンカー領域がオリゴヌクレオチド領域を含むことを特徴とする、請求項2に記載の方法。

請求項4

生成された第4オリゴヌクレオチドが閉ループを含むことを特徴とする、請求項2または3に記載の方法。

請求項5

第2オリゴヌクレオチドが、(a)前記捕捉領域のX'側の隣接領域にハイブリダイズし、(b)その側の前記領域よりも長いことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

第1オリゴヌクレオチドの3'末端と第2または第3オリゴヌクレオチドの対応する領域との間に少なくとも1つのヌクレオチド塩基ミスマッチが存在することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

前記検出可能なエレメント型が、少なくとも1つの消光剤の存在によって第1オリゴヌクレオチドにおいて検出不能になるフルオロフォア型であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

検出された置換一塩基三リン酸が、メチル化シトシンまたはメチル化アデニンヌクレオチド塩基のいずれかを含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

工程(2a)および(3)を異なる温度で実施することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

前記プローブ系が、異なる捕捉領域ならびに特徴的な第1の検出可能なエレメント型または第1および第2の検出可能なエレメント型がそれぞれ設けられた複数の第1オリゴヌクレオチド型を含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

最大4つの異なるセットのオリゴヌクレオチドプローブ系が使用され、各セットの第1オリゴヌクレオチドが、天然に存在するDNAまたはRNAの特徴的なヌクレオチド塩基の1つに対して選択的な捕捉領域と、異なる第1の検出可能なエレメント型または第1および第2の検出可能なエレメント型の対とを有することを特徴とする、請求項10に記載の方法。

請求項12

工程(1)が、対応する微小液滴中に各単一ヌクレオシド三リン酸を含有することをさらに含み、ならびに工程(2)〜(6)および(2a)を各微小液滴中で実施することを特徴とする、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

工程(6)を各微小液滴に適用することによって得られた結果が、前記核酸の配列に特徴的なデータのストリームに組み立てられることを特徴とする、請求項12に記載の方法。

請求項14

以下を含むことを特徴を有する、多成分生体プローブ系:(a)(1)会合した制限酵素認識部位と(2)そのX'側にエキソヌクレアーゼ遮断部位とを有するDNAまたはRNAの核酸塩基の1つに相補的な単一ヌクレオチド捕捉部位を含む第3領域のX'およびY'末端側にそれぞれ位置する、検出不能な状態の異なる検出可能なエレメント型の第1および第2領域で標識された第1一本鎖オリゴヌクレオチド;(b)前記捕捉部位に隣接する第1オリゴヌクレオチド上の相補的なX'およびY'側領域にそれぞれハイブリダイズすることができる第2および第3非標識一本鎖オリゴヌクレオチドであって、ここで、X'は3'であり、Y'は5'であるか、またはX'は5'であり、Y'は3'である。

請求項15

第2または第3オリゴヌクレオチドが、そのX'末端またはY'末端に、またはその近くにそれぞれエンドヌクレアーゼ分解指向性結合を含むことを特徴とする、請求項14に記載の生体プローブ系。

請求項16

第2オリゴヌクレオチドのY'末端および第3オリゴヌクレオチドのX'末端がリンカー領域によって連結されていることを特徴とする、請求項14または15に記載の生体プローブ系。

請求項17

前記リンカー領域がオリゴヌクレオチド領域を含むことを特徴とする、請求項16に記載の生体プローブ系。

請求項18

第1および第2領域の前記検出可能なエレメントが、任意に消光剤と会合したフルオロフォアであることを特徴とする、請求項14〜17のいずれか一項に記載の生体プローブ系。

請求項19

第2オリゴヌクレオチドが第1オリゴヌクレオチドのX'側隣接領域よりも長いことを特徴とする、請求項14〜18のいずれか一項に記載の生体プローブ系。

請求項20

第1オリゴヌクレオチドの3'末端のヌクレオチドが、第2または第3オリゴヌクレオチドの対応するヌクレオチドとのミスマッチであることを特徴とする、請求項14〜19のいずれか一項に記載の生体プローブ系。

請求項21

第3オリゴヌクレオチドのX'末端が、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のある領域を含むことを特徴とする、請求項14〜20のいずれか一項に記載の生体プローブ系。

請求項22

前記エンドヌクレアーゼ指向性結合がホスホロチオエートまたはホスホラミダイト結合であることを特徴とする、請求項14〜21に記載の生体プローブ系。

請求項23

配列、前記捕捉領域のヌクレオチド塩基特性、および使用された前記検出可能なエレメントで異なる、1〜4種類のさまざまな第1オリゴヌクレオチド型を含むことを特徴とする、請求項14〜21に記載の生体プローブ系。

技術分野

0001

本発明は、単一ヌクレオチドを検出および特性評価するための方法に関する。これは、DNAまたはRNAの配列決定における使用と、そのような配列におけるメチル化および非メチル化ヌクレオチド塩基の位置の検出とに特に適している。

背景技術

0002

遺伝物質の次世代配列決定はすでに、より迅速な配列決定装置市場投入に伴い配列決定の単価が下がるなど、生物科学全般に、特に医学に大きな影響を与えている。

0003

本発明者らの先の出願WO2014/053853、WO2014/053854、WO2014/167323、WO2014/167324およびWO2014/111723では、新規配列決定方法が記載されており、それはポリヌクレオチド分析物の漸進的消化を伴い、単一ヌクレオチドの順序付けられたストリーム、好ましくは単一デオキシリボヌクレオシド三リン酸のストリームを生成し、その各々を微小液滴ストリーム中の対応する液滴に1つずつ捕捉することができる。その後、各液滴を化学的および/または酵素的に操作し、もともと含有していた特定の単一ヌクレオチドを明らかにすることができる。一実施形態では、これらの化学的および/または酵素的操作は、分析物が構成されている単一ヌクレオチド型のうちの1つを選択的に捕捉することができるように各々がなっている1つ以上の2成分オリゴヌクレオチドプローブ型の使用を伴う方法を含む。典型的には、そのようなプローブ型の各々では、2つのオリゴヌクレオチド成分の1つは特徴的なフルオロフォアを含み、プローブ未使用状態では、これらのフルオロフォアが蛍光を発する能力は、近接する消光剤の存在のために、または自己消光により、失われたままである。使用中、プローブがその対応する単一ヌクレオチドを捕捉した場合、それは、その後のエキソヌクレアーゼ分解を受けやすくなり、それにより消光剤からフルオロフォアを遊離させることができるか、および/または互いにそれらを自由に蛍光発光させることができる。この手段により、各液滴中にもともと存在する単一ヌクレオチドを分光学的手段によって間接的に同定することができる。

発明が解決しようとする課題

0004

Nature Reviews Genetics 7(8) 632-644 (2006)のFanらは、遺伝子型解析コピー数測定、配列決定、ならびにヘテロ接合性喪失対立遺伝子特異的発現およびメチル化の検出の高並列ゲノムアッセイを可能にした方法とプラットフォームとの開発に関する一般評論を提供する。この概説の図2aは、3'および5'末端を有する環化可能なプローブの使用を模式的に示しており、それが分析物上の一塩基多型(SNP)の部位の上流および下流をアニーリングし、それにより間隙を残し、それが続いてSNPの相補体であるヌクレオチドで満たされて完全な環状プローブを形成し、次いで放出後増幅され得る。しかし、本発明者らの方法とは異なり、充填プロセス中に捕捉されるヌクレオチドは、分析物自体から直接は得られない。

0005

WO03080861は、核酸分析物が、放出されたときにヌクレオチドに直接結合するヌクレオチド特異的反応性標識の存在下で漸進的ピロホスホリラーゼ分解を受けるプロセスを開示する。これは、本発明者らが採用している方法とは全く異なるだけでなく、実際には、標識されたヌクレオチドがその後に調べられるときに測定される蛍光シグナルは、関連するバックグラウンドノイズより高い信頼性のある識別を可能にするには弱すぎる可能性が高い。

0006

最後に、国際公開第9418218号パンフレットは、分析物が漸進的エキソヌクレアーゼ分解を受けて単一ヌクレオチド二リン酸または一リン酸のストリームを生成し、その後検出される前に蛍光増強マトリックスに組み込まれるDNA配列決定法を教示する。これは、本発明者らが記述したものとはまったく異なる手法であるだけでなく、生成されたシグナルが、信頼性をもって検出および識別されるには弱すぎる可能性が高いことを再び観察する。

0007

本発明者らの出願WO2016/012789では、本発明者らは、改善されたプローブ系を含む本発明者らの上記の特許出願に記載されている配列決定方法の新版を開示する。この方法では、例えば検出不能な状態のフルオロフォアを有する第1一本鎖オリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で、捕捉されるヌクレオチド、ならびに第2および第3の一本鎖オリゴヌクレオチドと反応させ、第1オリゴヌクレオチドを含む鎖のみがエキソヌクレアーゼ分解の影響を受けやすい二本鎖の使用されるプローブを生成する。これにより、捕捉の間に生成された他の鎖が、第1オリゴヌクレオチドアニーリングおよびエキソヌクレアーゼ工程のサイクルに加わることが可能になり、遊離したフルオロフォアからのシグナル(今では検出可能な状態)が各サイクルで急速に増加し、検出がはるかに容易になる。一実施形態では、第2および/または第3オリゴヌクレオチドの3'末端(単数または複数)は、化学修飾によってエキソヌクレアーゼ分解に対して耐性にされるか、または好ましくは、それぞれの関連する末端を連結し、ヌクレオチドが捕捉されたとき、これらのオリゴヌクレオチドが位置する使用されたプローブの鎖は閉ループにされる。

課題を解決するための手段

0008

本発明者らは、会合した核酸塩基置換または非置換である;例えばメチル化されたまたはメチル化されていないヌクレオチドを区別することを可能にする、本特許出願に記載のプローブ系および方法の改良型を開発した。これは、本方法を、例えば、配列中のメチル化シトシンまたはアデニン核酸塩基の位置の検出に特に適したものにする。ある場合には、そのようなメチル化の位置は、がんなどの遺伝子状態および疾患と相関することが知られているため、これは非常に有益である。

0009

したがって、本発明の第1の態様によれば、核酸を配列決定する方法であって、以下の工程を特徴とする方法が提供される:(1)核酸の漸進的ピロホスホリラーゼ分解により単一ヌクレオチドのストリームを生成する工程;(2)ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下で、単一ヌクレオチドの1つを、以下を含む対応するプローブ系と反応させることによって、少なくとも1つの実質的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの使用されるプローブを生成する工程:(a)捕捉部位を含む制限酵素認識部位エレメントと、そのX'側にエキソヌクレアーゼ遮断部位とを含む第3領域のX'およびY'末端側にそれぞれ位置する検出不能な状態の特徴的な検出可能なエレメント型の第1および第2領域で標識された第1一本鎖オリゴヌクレオチド(ここで、X'は3'であり、Y'は5'であるか、またはX'は5'であり、Y'は3'である)、ならびに(b)捕捉部位に隣接する第1オリゴヌクレオチド上の相補的領域にハイブリダイズすることができる第2および第3一本鎖オリゴヌクレオチド;(2a)(i)捕捉された単一ヌクレオチドが置換された核酸塩基を含む場合にのみ、使用されたプローブを従来のまたはニッキング置換依存性制限エンドヌクレアーゼで処理し、認識部位で第1オリゴヌクレオチド鎖を切断する工程か、または(ii)捕捉された単一ヌクレオチドが非置換の核酸塩基を含む場合にのみ、使用されたプローブを従来のまたはニッキング置換感受性制限エンドヌクレアーゼで処理し、認識部位で第1オリゴヌクレオチド鎖を切断する工程;(3)使用されたプローブの第1オリゴヌクレオチド鎖を、二本鎖エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素で、第1オリゴヌクレオチドに対応するX'-Y'方向に消化し、第1領域、第2領域、または検出可能な状態の第1および第2領域のいずれかに由来する検出可能なエレメントと、少なくとも部分的に第1オリゴヌクレオチドの配列相補体である一本鎖第4オリゴヌクレオチドとを生じる工程;(4)第4オリゴヌクレオチドを別の第1オリゴヌクレオチドと反応させ、使用されたプローブに対応する実質的に2本鎖のオリゴヌクレオチド産物を生成する工程;(5)工程(2a)、(3)および(4)をサイクルで繰り返す工程;(6)工程(3)の各反復において放出された検出可能なエレメントを検出する工程であって、ここで、使用されるエンドヌクレアーゼ従来型のものである場合、第2または第3オリゴヌクレオチドは、そのX'もしくはY'末端に、またはその近くにそれぞれエンドヌクレアーゼ分解指向性結合を含む。

図面の簡単な説明

0010

反応のdNTP成分の存在下でバックグラウンドを超える蛍光強度の経時的な増加を観察し、結果を図示したグラフ
反応のdNTP成分の存在下でバックグラウンドを超える蛍光強度の経時的な増加を観察し、結果を図示したグラフ。

実施例

0011

本発明の方法の工程(1)は、ピロホスホリラーゼ分解によって核酸分析物から単一ヌクレオチドのストリーム(ここでは単一ヌクレオシド三リン酸)を生成することを含む。この工程で使用される分析物は、好適には、原則としてその長さが制限されておらず、ヒトゲノム断片中に見られる最大で何百万ものヌクレオチド塩基を含む二本鎖ポリヌクレオチドである。しかしながら、典型的には、ポリヌクレオチドは少なくとも50ヌクレオチド対長、好ましくは少なくとも150ヌクレオチド対長である;好適には500より大きく、1000より大きく、多くの場合には数千のヌクレオチド対長である。分析物自体は、好適には、天然起源のRNAもしくはDNA(例えば、植物、動物、細菌またはウイルスに由来する)であるが、本方法を使用して、合成的に産生されたRNAもしくはDNA、または天然には通常は遭遇しない核酸塩基;すなわちアデニン、チミングアニンシトシンおよびウラシル以外の核酸塩基で全体もしくは一部が構成されている他の核酸を配列決定することもできる。そのような核酸塩基の例には、以下が含まれる:4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウリジン、2-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノ-メチルウリジンジヒドロウリジン、2-O-メチルプソイドウリジン、2-O-メチルグアノシンイノシン、N6-イソペンチルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、5-メトキシウリジン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、ウリジン-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン-5-オキシ酢酸、ウィブトキソシン、ウィブトシン、プソイドウリジン、クオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、2-O-メチル-5-メチルウリジンおよび2-O-メチルウリジン。DNAの場合、生成される単一ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオシド三リン酸であり、一方でRNAの場合、それらはリボヌクレオシド三リン酸である。

0012

本発明の一実施形態では、工程(1)は、分析物を基板に付着させる第1のサブ工程を含む。典型的には、基板は、マイクロ流体表面、マイクロビーズまたは透過膜;例えばガラスまたは非分解性ポリマーから作られたものを含む。好ましくは、基板は、分析物を受け取るように適合された表面をさらに含む。原則としてこのサブ工程で使用することができる任意のそのような表面に分析物を付着させることができる多くの方法がある。例えば、1つの方法は、エポキシシランアミノヒドロカルビルシランまたはメルカプトシランなどの官能化シランでガラス表面を下塗りすることを伴う。このようにして生成された反応性部位は、その後、末端アミンスクシニルまたはチオール基を含むように修飾された分析物の誘導体で処理することができる。

0013

工程(1)の一実施形態では、分析物は、漸進的にピロホスホリラーゼ分解され、その順序が分析物の配列の順序に対応する単一ヌクレオチドのストリームを生成する。ピロホスホリラーゼ分解は、20〜900℃の温度で、ポリメラーゼを含む反応媒体の存在下で実施され得る。好ましくは、それは連続流の条件下で実施され、単一ヌクレオチドが遊離されるにつれて反応ゾーンから連続的に除去されるようにする。最も好ましくは、ピロホスホリラーゼ分解は、酵素および他の典型的な添加物を含有する水性緩衝媒体を、分析物が結合している表面上に連続的に流すことによって行われる。

0014

一実施形態では、使用される酵素は、分析物の漸進的3'-5'ピロホスホリラーゼ分解を引き起こし、適切な反応速度で、忠実度の高いヌクレオチドのストリームを生じることができる酵素である。好ましくは、この分解速度は可能な限り速く、一実施形態では1秒あたり1〜50ヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの分解に適用されるピロホスホリラーゼ分解反応に関するさらなる情報は、例えばJ. Biol. Chem. 244(1969) pp. 3019-3028で見ることができる。好適には、ピロホスホリラーゼ分解は、ピロホスフェートアニオンおよびマグネシウムカチオンをさらに含む媒体の存在下で;好ましくはミリモル濃度で行われる。

0015

本発明の方法の工程(2)では、ストリーム中の少なくとも1つの単一ヌクレオチド、好ましくは規則正しいストリーム中の各単一ヌクレオチドを、ポリメラーゼおよびリガーゼの存在下でプローブ系と反応させて、実質的に二本鎖の使用されるプローブを生成する。一実施形態では、この工程を実施する前に、工程(1)の生成物ピロホスファターゼで処理し、任意の残留ピロホスフェートをホスフェートアニオンに加水分解する。

0016

この工程で使用されるポリメラーゼは、一実施形態では、反応条件下で本質的にエキソヌクレアーゼ活性もエンドヌクレアーゼ活性も示さないものからなる群より選択される。有利に使用することができるポリメラーゼの例には、限定されないが、大腸菌(例えば、クレノウ断片ポリメラーゼ)、サーマスアクアチカス(例えば、Taq Pol)、バチルスステアロサーモフィルス、バチルス・カルベロクスおよびバチルス・カルドテナックスなどの細菌から得られる原核生物pol1酵素または酵素誘導体が含まれる。この工程では、任意の適切なリガーゼを使用することができる。

0017

工程(2)で使用されるプローブ系は、以下の3つの成分からなる;(a)検出不能な状態の異なる検出可能なエレメント型の第1および第2領域で標識された第1一本鎖オリゴヌクレオチド、および(b)捕捉部位のいずれかの側に位置する第1オリゴヌクレオチド上の相補的領域にハイブリダイズすることができる第2および第3非標識一本鎖オリゴヌクレオチド。制限エンドヌクレアーゼがニッキングエンドヌクレアーゼではない一実施形態では、第2および/または第3オリゴヌクレオチドは、そのX'もしくはY'末端にまたはその近傍にそれぞれ位置するエンドヌクレアーゼ分解指向性結合を含み、最終的にこの連結が、使用されたプローブ中に生成された制限酵素認識部位の一部を含むようにする。一実施形態では、このエンドヌクレアーゼ分解指向性結合は、ホスホロチオエート結合である。別の実施形態では、それは、C3スペーサー、スペーサー9、スペーサー12、スペーサー18、d-スペーサー(脱塩基性フラン型)もしくは他の同様のスペーサーなどのホスホラミダイト結合、またはオリゴヌクレオチド合成においてヌクレオチド間に使用される修飾からなる群より選択されるものである。

0018

一実施形態では、第2および第3オリゴヌクレオチドは別個実体であり、一方別の実施形態では、それらはリンカー領域によって互いに連結されている。別の実施形態では、リンカー領域は、第2オリゴヌクレオチドのY'末端と第3オリゴヌクレオチドのX'末端とを一緒に連結させるが、ここでおよび以下で、用語X'およびY'は、工程(3)のエキソヌクレアーゼ分解が生じる方向に関して使用される。このリンカー領域は、原則として任意の二価基であり得るが、別の一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド断片であることが好都合である。一実施形態では、リンカー領域は、実質的に第1オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができない。

0019

第1オリゴヌクレオチドは、上記の捕捉部位を含んで間に位置する第3領域のX'およびY'末端側に、異なる検出可能なエレメントを検出不能な状態で有する第1ならびに第2領域をさらに含む。この捕捉部位は、その核酸塩基が、検出されるヌクレオチドが持っているものに相補的な単一ヌクレオチドを含み、その特定のヌクレオチドに対してプローブ系を高度に選択的にする。したがって、例えば、分析物がDNAに由来する場合、第1、第2および第3オリゴヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであり、捕捉部位ヌクレオチドがチミン塩基を有する場合、捕捉部位はデオキシアデノシントリホスフェートに対して高度に選択的となる。したがって、本発明の1つの有用な実施形態では、複数のプローブ系型の存在下で工程(2)を実施することができる;例えば、(a)探索されるさまざまな異なる核酸塩基の異なる捕捉部位ヌクレオチド特性と、(b)異なる会合した検出可能なエレメントとを有する第1オリゴヌクレオチドをそれぞれが含む、1つ、2つ、3つまたは4つのプローブ系型。一実施形態では、全ての第1オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される型のものである。別の態様では、この型の少なくとも1つと、WO2016/012789に記載されている第1オリゴヌクレオチドの1つ以上との混合物が使用される。

0020

捕捉部位自体は、使用されたプローブが形成されたときに制限酵素認識部位が生成されることを可能にする制限部位エレメントの一部を形成する。典型的には、制限部位エレメントは4〜8ヌクレオチド長であるが、原則として任意の長さであり得る。

0021

第3領域は、工程(3)において使用されたプローブの第1オリゴヌクレオチド鎖のX'-Y'エキソヌクレアーゼ消化を、認識部位に達する前に停止させるように設計されたエキソヌクレアーゼ遮断部位も含む。この手段により、使用されたプローブの第1オリゴヌクレオチド鎖が認識部位で切断される場合、第1および第2領域の両方に会合した検出可能なエレメントを、検出可能な形態でのみ放出させることができる。したがって、このエキソヌクレアーゼ遮断エレメントは、制限部位エレメントのX'末端側の第3領域の骨格に適切に位置する。それは、好適には、ホスホロチオエート結合、G-クアドプレックス、ホウ素化ヌクレオチド、逆位dTもしくはddT、C3スペーサー、リン酸基、または任意のさまざまなエキソヌクレアーゼ阻害性リンカーまたは内部オリゴヌクレオチド修飾として一般的に利用可能なスペーサーから選択されるエレメントである。

0022

典型的には、第1オリゴヌクレオチドは最大150ヌクレオチド長、好ましくは20〜100ヌクレオチド長である。一実施形態では、第2オリゴヌクレオチドは、第1オリゴヌクレオチドの相補的X'側隣接領域よりも、最大10ヌクレオチドヌクレオチド長く、好ましくは1〜5ヌクレオチド長い。別の実施形態では、第1オリゴヌクレオチドの3'末端と、第2または第3オリゴヌクレオチド上のその反対側のヌクレオチドとの間に単一ヌクレオチドのミスマッチが存在し、ヌクレオシドトリホスフェートがこの時点でポリメラーゼによって捕捉されるのを防ぐ。さらに別の実施形態では、第3オリゴヌクレオチドのX'末端は、エキソヌクレアーゼ分解に耐性のあるエレメントを含み、工程(3)で産生された第4オリゴヌクレオチド自体がその後消化されないことを確実にする。これは、例えば、1つ以上のホスホロチオエート結合、G-クアドラプレックス、ホウ素化ヌクレオチド、逆位dTもしくはddT、C3スペーサー、リン酸基またはさまざまなエキソヌクレアーゼ阻害リンカーおよび一般的に利用可能なスペーサーのいずれかを、その特定の末端もしくはその近くに組み込むことによって達成することができる。

0023

それは、第1および第2の検出可能なエレメント領域で標識された第1オリゴヌクレオチドの特徴であり、その各々は、それ自体の固有で特徴的な型の検出可能なエレメント(単数または複数)で標識され、好ましくは多重標識され、これらの検出可能なエレメントは、プローブ系が未使用状態にあるときには、実質的に検出不可能である。好適には、これらの検出可能なエレメントは、光学的事象が起こった後に検出されるように適合されたものである。1つの好ましい実施形態では、検出可能なエレメントはフルオロフォアを含み、各未使用の第1オリゴヌクレオチドは、フルオロフォアが検出されるように設計された波長では、本質的に非蛍光性である。したがって、フルオロフォアは、電磁スペクトルの広い部分にわたって一般的な低レベルバックグラウンド蛍光を示すことができるが、典型的には、蛍光強度が最大である1つもしくは少数特定波長または波長エンベロープが存在する。フルオロフォアが特徴的に検出され、蛍光が本質的に生じないのは、これらの最大値のうちの1つ以上においてである。この特許の文脈において、用語「本質的に非蛍光性」または同等の表現は、関連する特徴的な波長または波長エンベロープで第1オリゴヌクレオチドに結合したフルオロフォアの総数の蛍光強度が、同等数の遊離フルオロフォアの対応する蛍光強度の25%未満;好ましくは10%未満;より好ましくは1%未満、最も好ましくは0.1%未満であることを意味する。

0024

所与の第1および/または第2領域にフルオロフォアが使用される場合、原則として、任意の方法を使用し、第1オリゴヌクレオチドの未使用状態においてそれらが本質的に非蛍光性であることを確実にすることができる。1つの手法は、消光剤をそれらのすぐ近くに追加的に付着させることである。もう1つは、複数のフルオロフォアが互いに近接して配置されているときに、それらが相互に十分に良好に消滅する傾向があり、消光剤を必要とせずに前項で述べた基準を達成することができるという観察に基づくものである。この特許の文脈において、フルオロフォア間、またはフルオロフォアと消光剤との間の「近接」を構成するものは、使用される特定のフルオロフォアおよび消光剤、場合によっては第1オリゴヌクレオチドの構造特性に依存する。したがって、この用語は、さまざまなエレメントの任意の特定の構造的配置よりも、むしろ必要な結果を参照して解釈されるべきであると意図される。しかし、例示のみを提供する目的で、隣接するフルオロフォアまたは隣接するフルオロフォアおよび消光剤が、特徴的なForster距離(典型的には5nm未満)に対応する距離だけ分離されるとき、十分な消光が通常達成されることが指摘される。

0025

好適には、各第1および第2領域は、少なくとも1つ、好ましくは最大20のフルオロフォアで標識される。最大の利益を得るために、各領域が少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つのフルオロフォアで標識されていることが好ましい。したがって、これらの最大数および最小数の任意の順列から構成された範囲が具体的に想定される。消光剤が使用される場合、各領域が最大20、好ましくは最大10、最も好ましくは最大5のそれらで標識されることが同様に好ましい。

0026

フルオロフォア自体に関しては、原則として、限定されないが、以下を含む当該技術分野で慣習的に使用される任意のものから選択することができる:キサンテン部位、例えば、フルオレセインイソチオシアネートローダミンBなどのフルオレセインローダミンおよびそれらの誘導体;クマリン部位(例えばヒドロキシル‐、メチル‐およびアミノクマリン)ならびにCy2、Cy3、Cy5およびCy7などのシアニン部位。特定の例には、以下の一般的に使用される染料由来のフルオロフォアが含まれる:Alexa染料、シアニン染料、Atto Tec染料、およびローダミン染料。例としては、以下も含まれる:Atto 633(ATTO-TEC GmbH)、テキサスレッド商標)、Atto 740(ATTO-TEC GmbH)、ローズベンガル、Alexa Fluor(商標)750 C5-マレイミド(Invitrogen)、Alexa Fluor(商標)532 C2-マレイミド(Invitrogen)およびローダミンレッドC2-マレイミドおよびローダミングリーン、ならびにQuasar570などのホスホラマイト染料。あるいは、LI-COR Biosciencesによって供給されるものなどの量子ドットまたは近赤外染料を用いることができる。フルオロフォアは、典型的には、当該技術分野で知られている化学的方法を用いて、ヌクレオチド塩基を介して第1オリゴヌクレオチドに結合される。

0027

適切な消光剤には、Forster共鳴エネルギー移動(FRET)機構によって作用する消光剤が含まれる。上記のフルオロフォアとの会合に使用することができる市販の消光剤の例には、限定されないが、以下が含まれる:DDQ-1、ダブシルエクリプスアイオワブラックFQおよびRQIR色素-QC1、BHQ-0、BHQ-1、-2および-3ならびにQSY-7および-21。

0028

一実施形態では、第2および第3オリゴヌクレオチドは、検出可能なエレメントで標識されていない。

0029

工程(2)は、ストリーム中の各単一ヌクレオチドを、上記の1つ以上のプローブ系と、20〜80℃の温度で接触させることにより好適に実施される。

0030

本発明の方法の工程(2)の生成物は、上記のように、その構成鎖がそれぞれ、第1オリゴヌクレオチドと、そのY'-X'方向に読み取られたときに、第2オリゴヌクレオチド、捕捉されたヌクレオチド、および最後に第3オリゴヌクレオチドからなる相補的第4オリゴヌクレオチドとである、実質的に二本鎖の使用されたプローブである。したがって、第2および第3オリゴヌクレオチドが予めリンカー領域によって一緒に連結されている場合、第4オリゴヌクレオチドがエキソヌクレアーゼ分解に対して高度に耐性である閉ループ鎖を含むことは容易に明らかであろう。

0031

工程(2a)では、使用されるプローブを置換依存性または置換感受性制限エンドヌクレアーゼで処理し、単一ヌクレオチド内の核酸塩基置換(例えば、アルキル、アミノ、ニトロ、ハロゲン化物硫黄または同様の置換)の有無を検出する方法を可能にする。この手段により、本方法は、例えば、メチル化された核酸塩基の有無を検出するために使用され得るが、これは限定的なものとして解釈されるべきではない。この特定の用途では、メチル化依存性またはメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼのいずれかが、好ましくは最大70℃の温度で使用され、捕捉された単一ヌクレオチドがメチル化または非メチル化核酸塩基(場合によっては)を含む場合にのみ、認識部位で第1オリゴヌクレオチド鎖を切断する。例えば、メチル化感受性エンドヌクレアーゼMspIおよびHpallは、二本鎖オリゴヌクレオチドを、C*が非メチル化シトシンである配列5'--CC*GG--3'を有する認識部位でのみ切断し、DnpIエンドヌクレアーゼは、A*がメチル化アデニンである配列5'--GA*TC--3'を有する認識部位でのみ切断する。この工程の重要な特徴は、使用されたプローブの第1オリゴヌクレオチド鎖のみが、エンドヌクレアーゼによって、制限酵素がニッキングエンドヌクレアーゼであることによるか、または他方の鎖の第2または第3オリゴヌクレオチド由来のエンドヌクレアーゼ指向性結合の存在により、切断され得ることである。結果として、使用されるエンドヌクレアーゼがメチル化依存性であり、捕捉部位によって捕捉された単一ヌクレオチドがメチル化される場合、制限エンドヌクレアーゼは、使用されたプローブの第1オリゴヌクレオチド鎖を2つに切断して、第1および第2領域の両方を工程(3)の消化に感受性にし、一方、捕獲された単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合、制限酵素は効果を有さず、第1オリゴヌクレオチド鎖の消化は、エキソヌクレアーゼ遮断部位によって停止されるまでX'-Y'方向に続く。したがって、第1領域に会合した検出可能なエレメントのみが、検出可能な形態で遊離される。逆に、使用されるエンドヌクレアーゼがメチル化感受性であり、捕獲された単一ヌクレオチドがメチル化されていない場合、制限エンドヌクレアーゼは、使用されたプローブの第1オリゴヌクレオチド鎖を2つに切断して、第1および第2領域の両方を工程(3)の消化に感受性にし、一方、捕捉された単一ヌクレオチドがメチル化されている場合、制限酵素は効果を有さず、第1ヌクレオチド鎖の消化は、エキソヌクレアーゼ遮断部位によって停止されるまでX'-Y'方向に続く。したがって、第1領域に会合した検出可能なエレメントのみが、検出可能な形態で遊離される。これは、工程(6)において、捕捉された単一ヌクレオチドがメチル化された場合、観察者は検出可能なエレメントの両方の型を検出し、メチル化されていない場合、メチル化依存性制限酵素を使用したときは第2型のみを検出し、メチル化感受性制限酵素を使用したときは逆が正しくなる。別の実施形態では、制限部位での切断は、第1領域を含むオリゴヌクレオチド断片溶融させ、第2領域のみが消化されることを可能にするが、切断の欠如は、再び第1領域のみの消化をもたらす。

0032

工程(3)では、工程(2a)の生成物を30〜100℃の温度で酵素処理する。この工程では、第1オリゴヌクレオチド由来の使用されたプローブの鎖または鎖の部分を、X'-Y'方向に消化して、それらの構成ヌクレオチド(場合によってはデオキシリボヌクレオシド一リン酸またはリボヌクレオシド一リン酸)にし、このプロセスでは、検出可能なエレメントをお互いに分離し、それらを消光させないようにし、したがって検出可能にする。したがって、検出可能なエレメントが、第1オリゴヌクレオチドにおいて検出不能状態に消光されたフルオロフォアである場合、工程(3)は、フルオロフォアを互いにおよび任意の消光剤から遊離させ、それによりそれらを蛍光させる。したがって、消化プロセスが起こると、観察者は、フルオロフォアのカスケードが生成されるにつれて、蛍光シグナル(単数または複数)の急速な増加を見る。次いで、この蛍光の特徴は、関連するプローブ系によってもともと捕捉されていた単一ヌクレオチドの性質を間接的に反映する。

0033

工程(3)で使用することができる酵素は、3'-5'または5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を示すエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼを含む。3'-5'クラスの酵素には、以下が含まれる:Q5、Q5ホットスタート、Phusion、Phusion HS、Phusion II、Phusion II HS、Dnase I(RNaseフリー)、エキソヌクレアーゼIまたはIII(例えば大腸菌)、エキソヌクレアーゼT、エキソヌクレアーゼV(RecBCD)、ラムダエキソヌクレアーゼミクロコッカスヌクレアーゼマンビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼBAL-31、RecJf、T5エキソヌクレアーゼおよびT7エキソヌクレアーゼ。工程(3)は、好ましくは60〜90℃の温度で実施される。

0034

一実施形態では、工程(3)の終了時および工程(4)の前に、好ましくは反応混合物を80〜100℃の温度に加熱し、消化から残った任意の付着した残存オリゴヌクレオチド断片を、第4オリゴヌクレオチドから除去する。

0035

工程(4)では、目下のところ一本鎖形態で存在する第4オリゴヌクレオチドを別の第1オリゴヌクレオチド分子にハイブリダイズさせ、それにより、使用されたプローブと同じ化学的および物理的構造を有するものに対応する新規の実質的に二本鎖のオリゴヌクレオチド産物を生成する。次いで、この生成物を工程(2a)および(3)の反復で消化し、それにより検出可能なエレメントを検出可能な状態でさらに放出し、第4オリゴヌクレオチドを再び再生する。その後、工程(5)に従い、工程(2a)、(3)および(4)をサイクルで継続させ、例えば、原則として第1オリゴヌクレオチドの実質的に全てが消費されるまで蛍光シグナルである、遊離検出可能エレメントからのシグナルをさらに高める。結果として、観察者は、以前に得られたものよりもはるかに大きな蛍光シグナルの増強を見る。

0036

その後、工程(6)において、工程(3)の種々の反復において遊離された検出可能なエレメントが検出され、もともと単一ヌクレオチドに結合していた核酸塩基の性質が決定される。したがって、本発明の方法を、工程(1)で生成されたストリーム中の全ての単一ヌクレオチドについて系統的に実施することにより、もともとの核酸分析物の配列のデータ特性を生成し、メチル化部位を特定することができる。この検出を行う方法は、当該技術分野でよく知られている;例えば、蛍光は、さまざまなフルオロフォア型の特徴的な蛍光波長(単数もしくは複数)もしくは波長エンベロープ(単数もしくは複数)に調整された光検出器または等価の装置を用いて検出することができる。これは、次いで、光検出器に特徴的な電気シグナルを発生させ、それをコンピュータ既知アルゴリズムを用いて処理および解析することができる。一実施形態では、工程(5)と(6)との間にある一定時間を経過させ、検出可能な状態の検出可能なエレメントの数が最大になったことを確実にする。

0037

1つの特に好ましい実施形態では、本発明の方法は、その少なくとも一部が単一ヌクレオチドを含む微小液滴ストリーム;好適には順序付けられたストリームの全体または一部において実施される。そのような方法は、例えば、工程(1)で生成されたヌクレオチドを、炭化水素またはシリコーン油などの不混和性担体溶媒中に保持された水性微小液滴の対応するストリームに1つずつ挿入して順序を保つのを助けることによって開始することができる。有利には、これは、ピロホスホリラーゼ分解反応ゾーンの下流に微小液滴を直接作り出すことによって達成することができる;例えば、反応媒体を、適切な寸法の微小液滴ヘッドから溶媒の流れているストリーム中に放出させることによって。あるいは、工程(1)からの反応媒体の少量のアリコートを、溶媒中に懸濁した既存の水性微小液滴のストリームに規則的かつ連続的に注入することができる。この後者の手法が採用される場合、各微小液滴は、工程(2)〜(5)を実施するのに必要な酵素と、任意の他の試薬(例えば緩衝液)とともに、プローブ系(単数または複数)の種々の成分を既に含んでいてもよい。さらに別の手法では、前の実施形態で作製された微小液滴を、そのような既存の微小液滴のストリームとその後合体させ、同様の結果を達成することができる。これらの微小液滴法では、工程(6)はその後、好ましくは各微小液滴を調べ、遊離された検出可能なエレメントと、したがってそれがもともと含有していたヌクレオシド三リン酸の性質を同定することを伴う。しかし、全ての最も好ましい実施形態では、工程(1)からの反応媒体は、任意にウェルなどからなる表面上の液滴受容位置で、担体溶媒で覆われた可動表面上に、一連の微小液滴としてプリントされる。その後、上記の他の成分を、もともとの反応媒体との合体を受けるさらなる水性微小液滴の形態で、各位置に順次導入してもよい。必要に応じて、これらのさらなる水性微小液滴は、インキュベーション期間が経過した後にのみ導入されてもよい。この手法が採用される場合、工程(6)は各液滴受容位置を順番に調べることを伴う。

0038

これらの手法のいずれにおいても、所与の微小液滴が1つより多くのヌクレオチドを含むリスクを回避するために、工程(1)において、各ヌクレオチドを、各充填微小液滴が平均して1〜20個、好ましくは2〜10個の空のものによって分離されるような速度で放出することが好ましい。好適には、使用される微小液滴は、100ミクロン未満、好ましくは50ミクロン未満、より好ましくは20ミクロン未満、さらにより好ましくは15ミクロン未満の有限直径を有する。最も好ましくは、それらの直径の全てが2〜20ミクロンの範囲にある。一実施形態では、系全体の微小液滴生成速度は、50〜3000微小液滴/秒、好ましくは100〜2000の範囲である。

0039

本発明の第2の態様によれば、以下を含むことを特徴とする多成分生体プローブ系が提供される:(a)(1)会合した制限酵素認識部位エレメントと(2)そのX'側にエキソヌクレアーゼ遮断部位とを有するDNAまたはRNAの核酸塩基の1つに相補的な単一ヌクレオチド捕捉部位を含む第3領域のX'およびY'端側にそれぞれ位置する検出不能な状態の異なる検出可能なエレメント型の第1および第2領域で標識された第1一本鎖オリゴヌクレオチド;(b)捕捉に隣接する第1オリゴヌクレオチド上の相補的なX'およびY'側領域にそれぞれハイブリダイズすることができる第2および第3非標識一本鎖オリゴヌクレオチドであって、ここで、X'は3'であり、Y'は5'であるか、またはX'は5'であり、Yは3'である。

0040

第1の実施形態では、第3オリゴヌクレオチドは、そのY'末端またはその近傍にエンドヌクレアーゼ分解指向性結合を含む。別の実施形態では、第2オリゴヌクレオチドは、そのX'末端またはその近くに同様の結合を有する。一実施形態では、この結合はホスホロチオエート結合である。別の実施形態では、それは、C3スペーサー、スペーサー9、スペーサー12、スペーサー18、d-スペーサー(脱塩基性フラン型)もしくは他の同様のスペーサーなどのホスホラミダイト結合、またはオリゴヌクレオチド合成においてヌクレオチド間に使用される修飾からなる群より選択されるものである。好ましくは、第2オリゴヌクレオチドのY'末端および第3オリゴヌクレオチドのX'末端は、好適には一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド領域のリンカー領域によって連結される。別の実施形態では、第1および第2領域における検出可能なエレメントは、任意に消光剤の存在下の、上記の型のフルオロフォアである。さらに別の実施形態では、第2オリゴヌクレオチドは、第1オリゴヌクレオチドのX'隣接領域よりも長い。好ましくは、第1オリゴヌクレオチドの3'末端のヌクレオチドは、第2または第3オリゴヌクレオチドの対応するヌクレオチドとのミスマッチである。

0041

第2または第3オリゴヌクレオチドがリンカー領域によって連結されていない場合、第2および/または第3オリゴヌクレオチドは、好適には、そのX'末端にエキソヌクレアーゼ分解に耐性のあるエレメントも含む。

0042

上述の方法およびプローブ系は、配列決定装置において有利に使用することができ、そのような装置および使用は、本発明の範囲内であると考えられる。

0043

さまざまな態様の本発明を、以下の実施例を参照して説明する。

0044

(実施例1‐プローブ系の調製および使用)
以下のヌクレオチド配列を有する一本鎖第1オリゴヌクレオチド1を調製した:
5'-ACATCACGACTATCTAYYZCAGGACGG/mC/CCGTTAT/C3/CAXXQAACCGCACGA*-3'
ここで、A、C、G、およびTは、DNAの関連する特徴的なヌクレオチド塩基を有するヌクレオチドを表す;Xは、Atto 655色素で標識されたデオキシチミジンヌクレオチド(T)を表し、Qは、BHQ-2消光剤で標識されたデオキシチミジンヌクレオチドを表し、Yは、Atto 532色素で標識されたデオキシチミジンヌクレオチドを表し、Zは、BHQ-1消光剤で標識されたデオキシチミジンヌクレオチドを表し、/C3/はC3スペーサー修飾を表し、/mC/は5-メチルシトシンヌクレオチドを表し、*はヘキサンジオール修飾を表す。それは、デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)の混合物中のデオキシシトシン三リン酸ヌクレオチド(dCTP)を捕捉するために選択的な捕捉領域(Gヌクレオチド)をさらに含む。

0045

2つのさらなる一本鎖オリゴヌクレオチド2および3も調製され、それぞれがオリゴヌクレオチド1の領域に相補的な領域を有し、オリゴヌクレオチド2および3の両方がそこにアニーリングされるときにオリゴヌクレオチド1の捕捉領域に形成される単一塩基間隙を有する。オリゴヌクレオチド2は以下のヌクレオチド配列を有した:
5'-GTGATGTTAACGTGCGGTTAAATGATAACG**GG-3'
ここで、**はホスホロチオエート結合を表す。オリゴヌクレオチド3は以下の配列を有した:
5'-PCGTCCTGAAATAGATAGTCGTGATGTCTAGCATGACATA/IdT/-3'
ここで、Pは5'リン酸基を表し、/IdT/は3'逆位dT塩基を表す。

0046

次いで、プローブ系を含む反応混合物を調製した。それは、以下の処方設計に由来する組成に対応する組成を有した:
20nMオリゴヌクレオチド1
10nMオリゴヌクレオチド2
50nMオリゴヌクレオチド3
10nM dCTP、5mdCTPまたは等量の水
1×緩衝液pH7.6
1.4反応/mL PfuウルトラフュージョンIIホットスタートポリメラーゼ
57U/mL Bstラージフラグメントポリメラーゼ
71U/mL大腸菌リガーゼ
3.6U/mL AOXI
14U/mL熱安定性無機ピロホスファターゼ
ここで、5×緩衝液は、以下の混合物を含む:
60μLトリズマ塩酸塩、1M、pH 7.6
33.3μL KCl、3M
25μL水性MgCl2、1M
20μLニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、100μM
2.5μLジチオスレイトール、1M
50μLトリトンX-100界面活性剤(10%)
1mLまでの水

0047

次いで、混合物を37℃で10分間インキュベートすることにより、dCTPまたは5mdCTPの捕捉およびオリゴヌクレオチド2のオリゴヌクレオチド3へのライゲーションを実施した後、温度をさらに20分間で60℃にまで上昇させた。その後、温度を30秒間で95℃に上昇させた後、最終的に90分間で70℃に低下させた。次いで、反応混合物を、ヘリウムネオンレーザーの633nmラインおよびダイオードレーザーの532nmラインを用いて照射し、得られたAtto 655およびAtto 532色素の特徴的な蛍光をカメラを用いて検出した。

0048

反応のdNTP成分の存在下でバックグラウンドを超える蛍光強度の経時的な増加を観察し、結果を図1および2にグラフで示した。これらから、プローブ系が、dCTPおよび5mdCTPの両方を効率的に捕捉することが分かる。 dCTPの存在下では、蛍光シグナルはAtto 655チャネルでのみ観察され、一方、5mdCTPの存在下では、Atto 655およびAtto 532チャネルの両方でシグナルが観察される。dNTPが反応混合物中に存在しない比較実験において、オリゴヌクレオチド1のAtto 655およびAtto 532色素のいずれも、有意な程度の蛍光を示さなかった。

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