技術 コネキシン（Ｃｘ）４３ヘミチャネル結合抗体及びその使用

0001

本出願は、２０１６年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／３００，４９２号の利益を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。

0002

１．発明の分野
本発明は、一部の実施形態において、概して、分子生物学、癌生物学、及びリウマチ学の分野に関する。より特に、コネキシン（Ｃｘ）４３ヘミチャネル結合抗体、ならびに癌、神経損傷、及び骨関節炎などの疾患の治療及び検出のためのそれらの使用に関係する。

0003

２．関連技術の説明
外傷性脊髄損傷（ＳＣＩ）及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、世界的に深刻な健康問題であり、毎年１５０万人を超える患者が外傷性脳損傷及び脊髄損傷を有すると診断される。ＳＣＩ及びＴＢＩを有する患者は、神経機能を喪失し得るだけでなく、神経障害性疼痛、及び神経制御の喪失に伴う他の合併症のより大きな危険性がある。二次性損傷は、主要な外傷後神経学的機能喪失に相当する。外傷後神経炎症過程の一部は、アストロサイトの活性化、及び軸索再生のための不浸透性環境をもたらすグリア瘢痕の形成である。治療的目標には、神経機能及びグリア瘢痕形成を支持することにおいて主要な役割を果たす支持細胞のクラスであるアストロサイトを標的にする革新的手法による、病変及び軸索喪失のサイズの制限が含まれる。しかしながら、グリア瘢痕形成を上手く制限するために用いられ得る組成物の必要性が依然として残る。

0004

骨組織は、乳癌及び前立腺癌転移の好ましい部位である。骨転移は、進行癌を有する患者の最高７５％において生じる。現在、転移性乳癌に対する治癒法はなく、及び最小限の副作用を有する、骨転移を治療するための信頼性の高い介入薬はない。

0005

骨関節炎（ＯＡ）は、米国の成人のおよそ２０％に影響を及ぼす蔓延性疾患である。この疾患は、関節軟骨及び軟骨下骨を含めた関節の変性を引き起こす。ＯＡの病理は、関節腔の狭窄、関節摩擦の増加、及び潜在的な構造改造につながる、関節軟骨の喪失によって特徴付けされる。現在の治療には、運動、生活様式の変化、及び鎮痛剤が含まれる。症状が重度になった場合、関節置き換え術が通常実施される。今までのところ、ＯＡの治療に使用可能な特異的な薬学的介入はない。

0006

コネキシンヘミチャネルは、細胞及び組織機能において重要な役割を果たし、コネキシンヘミチャネルの異常な機能は、上記で記載されるものなど、様々な病的状態に関与し得る。ゆえに、ヘミチャネル活性と関連した病的状態（例えば、炎症、ＳＣＩ、ＴＢＩ、骨転移）を治療するための付加的な療法、ならびにそのような療法を同定するための方法の必要性が依然として残る。

0007

第一の実施形態において、本発明は、コネキシン４３（Ｃｘ４３）ヘミチャネルに結合し及びチャネル開口を増強する抗体、または当該抗体をコードする発現ベクター（本明細書において詳述されるＡｂ２抗体など）の有効量を対象に投与することを含む、癌を有する対象における癌または骨転移を治療するまたは予防する方法を提供する。さらなる実施形態において、コネキシン４３（Ｃｘ４３）ヘミチャネルに結合し及びチャネル開口を増強する抗体、または当該抗体をコードする発現ベクター（本明細書において詳述されるＡｂ２抗体など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における骨粗鬆症または骨減少症を治療するまたは予防する方法が提供される。ある特定の態様において、方法は、当該抗体の有効量を対象に投与することを含む。さらなる態様において、方法は、当該抗体をコードする発現ベクターの有効量を対象に投与することを含む。一部の態様において、癌は、乳癌、前立腺癌（例えば、骨転移を有する）、または骨肉腫である。さらなる態様において、癌は、骨転移を有する癌である。

0008

さらなる態様において、抗体をコードする発現ベクターは、薬学的に許容される組成物の状態で投与され得る。ある特定の態様において、抗体は全身的に投与され得る。他の態様において、抗体は、静脈内に、皮内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、または局所的に投与され得る。

0009

いくつかの態様において、抗体は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１９と同一の第一のＶＨＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０と同一の第二のＶＨ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１と同一の第三のＶＨ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９と同一の第一のＶＬ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０と同一の第二のＶＬ ＣＤＲ、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１と同一の第三のＶＬ ＣＤＲを含み得る。一部の態様において、抗体はヒト化抗体である。ある特定の態様において、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８と少なくとも９０％同一のＶＨアミノ酸配列、及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３と少なくとも９０％同一のＶＬアミノ酸配列を含み得る。さらなる態様において、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に従ったＶＨアミノ酸配列、及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に従ったＶＬアミノ酸配列を含む。

0010

さらにさらなる態様において、方法は、少なくとも第二の抗癌療法を対象に施すことを付加的に含み得る。ある特定の態様において、第二の抗癌療法は、外科的療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法である。

0011

さらなる実施形態において、本発明は、コネキシン４３（Ｃｘ４３）ヘミチャネルに結合し及びチャネル開口を阻害する抗体、または当該抗体をコードする発現ベクター（本明細書において詳述されるＡｂ１抗体など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における神経変性疾患または神経損傷を治療するまたは予防する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、当該抗体の有効量を対象に投与することを含む。他の態様において、方法は、当該抗体をコードする発現ベクターの有効量を対象に投与することを含み得る。

0012

一部の態様において、方法は、神経変性疾患を治療するまたは予防するための方法として付加的に規定され得る。さらなる態様において、神経変性疾患は、多発性硬化症またはアルツハイマー病であり得る。他の態様において、方法は、神経損傷を治療するまたは予防するための方法として付加的に規定され得る。ある特定の態様において、神経損傷には、脊髄損傷（ＳＣＩ）、脳卒中、または外傷性脳損傷（ＴＢＩ）が含まれる。一部の具体的な態様において、対象は、神経損傷を有するまたは有すると診断されている。いくつかの態様において、抗体をコードする発現ベクターは、薬学的に許容される組成物の状態で投与される。ある特定の態様において、抗体は全身的に投与され得る。さらなる態様において、抗体は、静脈内に、皮内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、または局所的に投与される。

0013

いくつかの態様において、抗体は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１９と同一の第一のＶＨＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０と同一の第二のＶＨ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１と同一の第三のＶＨ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１と同一の第一のＶＬ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２と同一の第二のＶＬ ＣＤＲ、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３と同一の第三のＶＬ ＣＤＲを含む。一部の態様において、抗体はヒト化抗体である。ある特定の態様において、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８と少なくとも９０％同一のＶＨアミノ酸配列、及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０と少なくとも９０％同一のＶＬアミノ酸配列を含む。一部の特定の態様において、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に従ったＶＨアミノ酸配列、及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に従ったＶＬアミノ酸配列を含む。

0014

なおさらなる実施形態において、組換えコネキシン４３（Ｃｘ４３）ヘミチャネル結合抗体が提供される。ある特定の態様において、抗体は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１９と同一の第一のＶＨＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０と同一の第二のＶＨ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１と同一の第三のＶＨ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９と同一の第一のＶＬ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０と同一の第二のＶＬ ＣＤＲ、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１と同一の第三のＶＬ ＣＤＲを含む。一部の態様において、抗体はヒト化抗体である。ある特定の特定の態様において、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８と少なくとも９０％同一のＶＨアミノ酸配列、及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３と少なくとも９０％同一のＶＬアミノ酸配列を含む。具体的な態様において、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に従ったＶＨアミノ酸配列、及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３に従ったＶＬアミノ酸配列を含み得る。

0015

いくつかの態様において、抗体は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１９と同一の第一のＶＨＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０と同一の第二のＶＨ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１と同一の第三のＶＨ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１と同一の第一のＶＬ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２と同一の第二のＶＬ ＣＤＲ、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３と同一の第三のＶＬ ＣＤＲを含み得る。ある特定の態様において、抗体はヒト化抗体である。一部の態様において、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８と少なくとも９０％同一のＶＨアミノ酸配列、及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０と少なくとも９０％同一のＶＬアミノ酸配列を含む。ある特定の具体的な態様において、抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に従ったＶＨアミノ酸配列、及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０に従ったＶＬアミノ酸配列を含む。

0016

さらになおさらなる実施形態において、本発明は、上記で記載される実施形態及び態様に従った抗体、または上記で記載される実施形態及び態様に従った抗体をコードする発現ベクターを含む薬学的組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象における癌を治療する方法を提供する。一部の態様において、薬学的組成物は、対象への、上記で記載される実施形態及び態様に従った抗体をコードする発現ベクターを含む。他の態様において、薬学的組成物は、対象への、上記で記載される実施形態及び態様に従った抗体を含む。いくつかの態様において、方法は、対象における癌骨転移を阻害するまたは予防するための方法としてさらに規定され得る。ある特定の態様において、薬学的組成物は全身的に投与され得る。具体的な態様において、薬学的組成物は、静脈内に、皮内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、または局所的に投与される。

0017

一部の態様において、薬学的組成物は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１９と同一の第一のＶＨＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０と同一の第二のＶＨ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１と同一の第三のＶＨ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１と同一の第一のＶＬ ＣＤＲ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２と同一の第二のＶＬ ＣＤＲ、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３と同一の第三のＶＬ ＣＤＲを含み得る。いくつかの態様において、方法は、少なくとも第二の抗癌療法を対象に施すことをさらに含み得る。さらなる態様において、第二の抗癌療法は、外科的療法、化学療法、放射線療法、凍結療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法である。

0018

さらなる態様において、本発明は、上記で記載される実施形態及び態様に従った抗体、または上記で記載される実施形態及び態様に従った抗体をコードする発現ベクター（本明細書において詳述されるＡｂ１抗体など、Ｃｘ４３ヘミチャネルに結合し及びチャネル開口を阻害する抗体）を含む薬学的組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象における炎症性疾患、神経変性疾患、または神経損傷を治療する方法を提供する。ある特定の態様において、薬学的組成物は、対象への、上記で記載される実施形態及び態様に従った抗体をコードする発現ベクターを含む。具体的な態様において、薬学的組成物は、対象への、上記で記載される実施形態及び態様に従った抗体を含む。

0019

さらなる態様において、方法は、Ｃｘ４３ヘミチャネルに結合し及びチャネル開口を阻害する抗体、または当該抗体をコードする発現ベクター（本明細書において詳述されるＡｂ１抗体など）の有効量を対象に投与することを含む、炎症性疾患を治療するまたは予防するための方法として付加的に規定され得る。一部の具体的な態様において、炎症性疾患は骨関節炎である。一部の態様において、方法は、皮膚または角膜創傷治癒などの創傷治癒を促進するために提供され、コネキシン４３（Ｃｘ４３）ヘミチャネルに結合し及びチャネル開口を阻害する抗体、または当該抗体をコードする発現ベクター（本明細書において詳述されるＡｂ１抗体など）の有効量を対象に投与することを含む。他の態様において、方法は、神経変性疾患を治療するまたは予防するための方法として付加的に規定され得る。ある特定の特定の態様において、神経変性疾患は、多発性硬化症またはアルツハイマーである。いくつかの態様において、方法は、神経損傷を治療するまたは予防するための方法としてさらに規定され得る。一部の特定の態様において、神経損傷には、脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、または脳卒中が含まれる。ある特定の態様において、対象は、神経損傷を有すると診断されたことがあるまたは有すると診断されている。

0020

一部の態様において、薬学的組成物は全身的に投与され得る。具体的な態様において、薬学的組成物は、静脈内に、皮内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、または局所的に投与される。

0021

ある特定の実施形態において、ヘミチャネルポリペプチドに向けられた抗体、及びそのような抗体をコードする核酸分子も提供される。ある特定の態様において、実施形態の抗体は、ＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１３）、ＫＲＤＰＣＰＨＱＶＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、またはＬＳＡＶＹＴＣＫＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）のアミノ酸配列を有するエピトープに結合する。特定の態様において、抗体は、ＦＬＳＲＰＴＥＫＴＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）のアミノ酸配列を有するエピトープに結合する。

0022

さらなる実施形態において、実施形態に従った使用のための抗体は、参照により本明細書に組み入れられる国際（ＰＣＴ）特許公報第ＷＯ２０１５，０２７１２０号に記載されているもののいずれかであり得る。一実施形態において、本発明は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、ヘミチャネルに特異的に結合する単離された抗体を提供する。

0023

ある特定の態様において、第一の重鎖領域は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：２の残基１３〜３７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含み；第二の重鎖領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基４６〜６６に対応するアミノ酸配列を有し；及び第三の重鎖領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基９７〜１１６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。

0024

別の態様において、第一の軽鎖領域は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：４の残基９〜４０のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含み；第二の軽鎖領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の残基４９〜５８に対応するアミノ酸配列を有し；及び第三の軽鎖領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の残基６４〜１０８のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。

0025

一実施形態において、本発明は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を有する重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、ヘミチャネル及びギャップ結合に特異的に結合する単離された抗体を提供する。

0026

ある特定の態様において、第一の重鎖領域は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：６の残基１３〜３７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含み；第二の重鎖領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の残基４６〜６６に対応するアミノ酸配列を有し；及び第三の重鎖領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の残基９７〜１１６のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。

0027

別の態様において、第一の軽鎖領域は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：８の残基９〜４２のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含み；第二の軽鎖領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の残基５１〜６０に対応するアミノ酸配列を有し；及び第三の軽鎖領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の残基６６〜１２５のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。

0028

一実施形態において、本発明は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を有する重鎖及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、ギャップ結合に特異的に結合する単離された抗体を提供する。

0029

ある特定の態様において、第一の重鎖領域は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１０の残基１０〜３４のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含み；第二の重鎖領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の残基４３〜５９に対応するアミノ酸配列を有し；及び第三の重鎖領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の残基９４〜１０９のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。

0030

別の態様において、第一の軽鎖領域は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１２の残基９〜４０のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含み；第二の軽鎖領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の残基４９〜５８に対応するアミノ酸配列を有し；及び第三の軽鎖領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の残基６４〜１０８のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。

0031

ある特定の態様において、抗体には、全長抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体、及び抗体融合体、ならびにそれらのフラグメントが含まれる。

0032

さらなる実施形態は、薬学的に許容されるキャリアとともに、本明細書において記載される抗体を含む薬学的組成物を提供する。医薬としての使用のためのまたは癌に対する療法における使用のための、及び癌転移を阻害するための、本発明の抗体または薬学的組成物も提供される。

0033

さらなる実施形態は、癌転移を治療するまたは予防する方法を提供する。治療する方法は、本明細書において記載される単離された抗体の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含み得る。癌転移の治療または予防のための医薬の製造における、本明細書において記載される抗体の使用も提供される。

0034

ある特定の態様は、軟骨細胞における炎症反応を抑制するための抗体、化合物、または試薬を用いるインビトロ方法に向けられている。ある特定の態様において、方法は、（ｉ）ルシファーイエローまたはＡｌｅｘａ色素を用いた色素取り込みアッセイにより、ヘミチャネル開口を判定することによって、（ｉｉ）ＩＬ−１βにより、ヘミチャネル開口に対する阻害効果を査定することによって、（ｉｉｉ）流体せん断応力の形態の機械的負荷により、ヘミチャネル開口に対する試薬の阻害効果を試験することによって、軟骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネル開口の阻害に対する効果を判定することに向けられている。

0035

ある特定の態様は、（ｉ）ＩＬ−１βによって誘導される核内因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）の活性化の阻害を判定することによって、（ｉｉ）流体せん断応力によって誘導されるＮＦ−κＢの活性化の阻害を判定することによって、ＩＬ−１β及び機械的負荷によって誘起される炎症応答の抑制に対する、抗体、化合物、または試薬の効果を判定する方法に向けられている。

0036

他の態様は、（ｉ）膝蓋骨腔に抗体、化合物、または試薬を注射すること、（ｉｉ）ＩＬ−１βによって誘導されるＮＦ−κＢの活性化の阻害を査定すること、（ｉｉｉ）Ｘ線、組織学的解析、及び身体的動作によってＯＡ発症を査定することを含む、ＯＡを治療するまたはそれを同定するためのモノクローナル抗体、化合物、または試薬を用いるインビボ方法に向けられている。

0037

本明細書において使用するとき、「抗原」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体によって結合され得る分子である。ある特定の実施形態において、抗体以外の結合部分は、抗原、例えばアプタマー、アビマー等に特異的に結合するように操作される。

0038

「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、無傷抗体及びその結合フラグメント／セグメントを含むように用いられる。本明細書において使用するとき、「抗体」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及び遺伝子改変されたＩｇＧなどの任意の免疫学的結合作用物質、ならびに抗原結合活性を保持する抗体ＣＤＲドメインを含むポリペプチドを広く指すことを意図される。抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、あるいは抗原に結合する抗体フラグメントまたは天然もしくは合成リガンドからなる群より選択され得る。典型的に、フラグメントは、抗原への特異的結合に対して、それらが由来した無傷抗体と競合する。フラグメントには、別個の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、及びＦｖが含まれる。フラグメント／セグメントは、組換えＤＮＡ技法によって、または無傷免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離によって産生される。「抗体」という用語には、他のタンパク質に化学的に抱合されているまたは他のタンパク質との融合タンパク質として発現される、１つまたは複数の免疫グロブリン鎖も含まれる。「抗体」という用語には、二重特異性抗体も含まれる。二重特異性または二機能性抗体とは、２つの異なる重鎖／軽鎖ペア及び２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含めた多様な方法によって産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７９：３１５−２１，１９９０；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−５３，１９９２を参照されたい。

0039

「単離された」という用語は、それらの起源の元の細胞材料、細菌材料、ウイルス材料、もしくは培養培地（組換えＤＮＡ技法によって産生される場合）、または化学的前駆体もしくは他の化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含んでいない核酸またはポリペプチドを指し得る。さらに、単離された化合物とは、単離された化合物として対象に投与され得るものを指し；言い換えれば、化合物は、それがカラムに接着しているまたはアガロースゲル中に埋め込まれている場合、単に「単離された」とは見なされ得ない。さらに、「単離された核酸フラグメント」または「単離されたペプチド」とは、フラグメントとして天然に存在しない及び／または典型的には機能的状態にない核酸またはタンパク質フラグメントである。

0040

ポリペプチド、ペプチド、抗原、または免疫原などの本発明の部分は、アジュバント、タンパク質、ペプチド、支持体、蛍光部分、または標識などの他の部分に共有結合的にまたは非共有結合的に抱合され得るまたは連結され得る。「抱合体」または「免疫抱合体」という用語は、１つの部分と別の作用物質との作動的結び付きを定義するために広く用いられ、任意のタイプの作動的結び付きだけを指すことを意図されず、及び化学的「抱合」に特に限定されない。

0041

「提供する」という用語は、「使用のために供給するまたは付与すること」というその元々の意味に従って用いられる。一部の実施形態において、タンパク質は、当該タンパク質を投与することによって直接提供され、一方で他の実施形態において、タンパク質は、当該タンパク質をコードする核酸を投与することによって有効に提供される。ある特定の態様において、本発明は、核酸、抗原、ペプチド、及び／またはエピトープの様々な組み合わせを含む組成物を企図する。

0042

標的に「特異的に結合する」または「特異的に免疫反応性である」という語句は、他の生物製剤の不均質集団の存在下で、当該分子の存在を決定する結合反応を指す。ゆえに、指定された免疫アッセイ条件下で、定められた分子は特定の標的に優先的に結合し、及びサンプル中に存在する他の生物製剤に相当量で結合しない。そのような条件下での標的への抗体の特異的結合は、当該抗体が当該標的へのその特異性に対して選択されることを要する。多様な免疫アッセイ形式を用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択し得る。例えば、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが日常的に用いられる。例えば、特異的免疫反応性を判定するために用いられ得る免疫アッセイ形式及び条件の説明に関しては、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照されたい。

0043

本発明の他の実施形態は、本出願にわたって論じられている。本発明の一態様に関して論じられる任意の実施形態は、本発明の他の態様にも適用され、逆もしかりである。本明細書において記載される各実施形態は、本発明のすべての態様に適用可能である本発明の実施形態であると理解される。本明細書において論じられる任意の実施形態は、本発明の任意の方法または組成物に関して遂行され得、逆もしかりであることが企図される。さらには、本発明の組成物及びキットを用いて、本発明の方法を達成し得る。

0044

「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、特許請求の範囲及び／または本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併せて用いられる場合、「１つ」を意味し得るが、それは、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、及び「１つまたは１つを上回る」という意味とも矛盾しない。

0045

本出願にわたって、「約」という用語は、値が、当該値を決定するために採用されている装置または方法に対する誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。

0046

特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことまたは代替物は相互排他的であることが明示的に示されていない限り、「及び／または」を意味するために用いられるが、とはいえ本開示は、代替物のみを指す定義ならびに「及び／または」を支持する。

0047

本明細書及び特許請求の範囲（複数可）において使用するとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」など、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに、「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」など、有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」など、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」など、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）という単語は、内包的でありまたは制限がなく、及び付加的な列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。

0048

本発明の他の目的、特長、及び利点は、以下の詳細な説明から明白になるであろう。しかしながら、本発明の精神及び範囲の内にある様々な変化及び改変が、この詳細な説明から当業者に明白になるであろうため、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の具体的な実施形態を示すと同時に、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。

0049

以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本明細書において提示される具体的な実施形態についての詳細な説明と組み合わせてこれらの図面のうちの１つまたは複数を参照することにより、本発明はよりよく理解され得る。

0050

Ｃｘ４３は、通常、細胞間のギャップ結合に、または原形質膜上のヘミチャネルとして局在する。Ａ）側において、Ｃｘ４３ヘミチャネルの病的開口は、二次性損傷の伝播、アストロ／ミクログリアの活性化、及び炎症をもたらす。Ｂ）側は、Ｃｘ４３ヘミチャネルの病的開口を阻止することが、分子の放出を阻止し、アストロサイトが世話役細胞として作用し及び二次性損傷のさらなる広がりを阻止することを可能にするという提案を図解している。
ヒト初代アストロサイトにおけるＩＬ−１βによるＣｘ４３ヘミチャネルの活性化は、Ｃｘ４３ヘミチャネルを遮断するマウスモノクローナル抗体（Ｍ１）及びマウス−ヒトキメラ抗体ＨＭＡｂ１の両方によって阻害された（これらの抗体は、同じマウス可変ドメイン及びＣＤＲを含む）。ヘミチャネル活性を、エチジウムブロマイド取り込みによって判定した。
マウスを単回のＳＣＩに供し、損傷後にＩＰ生理食塩水、対照ＩｇＧ、またはＨＭＡｂ１（２５ｍｇ／ｋｇ）で３０分間処理した。グリア瘢痕化を、損傷後１４及び５６日目に測定した。（Ａ〜Ｆ）アストロサイトマーカーＧＦＡＰに対する免疫組織化学に供された、（Ａ〜Ｃ）対照ＩｇＧまたは（Ｄ〜Ｆ）ＨＭＡｂ１で処理されたマウスにおける脊髄の代表的な画像。病変境界は、白の点線で表示されている。（Ｇ）ＧＦＡＰ免疫標識を、陽性染色の面積を乗じた平均強度として定量した。結果は、偽手術のＩｇＧ処理されたマウスについてのパーセンテージとして表現されている。結果は、ＳＥＭによる平均である。Ｉｇｇ ｗと比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１／テューキーのＨＳＤ ｎ＝３〜４。
マウスをＳＣＩに供し、損傷後３０分の時点でＩｇＧまたは抗Ｃｘ４３抗体（Ｍ１）で処理した。損傷の２週間後、組織切片をアストロサイトマーカーＧＦＡＰの発現について解析した。（Ａ）ＩｇＧ処理されたまたは（Ｂ）Ｍ１処理されたマウスにおける、脊髄の代表的な画像。白の点線は、病変のエリアを印付けしている。Ｃ）ｎ＝３〜５匹のマウスからの画像の定量は、切片におけるＧＦＡＰ免疫標識のＳＥＭによる平均を示している。＊二元配置ＡＮＯＶＡ、次いでテューキーのＨＳＤを用いて検定された有意性。
ＨＭＡｂ１処理は、ＳＣＩ後の身体的な活動及び協調性の回復を向上させた。マウスを単回のＳＣＩに供し、損傷後にＩＰ生理食塩水、対照ＩｇＧ、またはヒト−マウスキメラ抗Ｃｘ４３抗体（ＨＭＡｂ１）（２５ｍｇ／ｋｇ）で３０分間処理した。行動測定は、損傷後６時間の時点で０〜３のＢＭＳスコアを有するマウスにおいてのものである。（Ａ）ＢＭＳ：後肢機能；０＝後肢機能なし、及び９＝完全に正常な後肢機能。（Ｂ）ローターロッド：マウスを、最高３００秒間、加速式ローターロッド上にとどまり得る能力について試験して、運動協調性を測定した。結果は、ＳＥＭによる平均である。Ｉｇｇ ｗと比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１／テューキーのＨＳＤ。
マウスを単回のＳＣＩに供し、損傷後にＩＰ生理食塩水、対照Ｉｇｇ、またはＨＭＡｂ１（２５ｍｇ／ｋｇ）で３０分間処理した。ニューロンマーカーＭＡＰ２に対して免疫標識することによって、ニューロン樹状突起を測定した。（Ａ〜Ｆ）免疫組織化学に供された、（Ａ〜Ｃ）対照ＩｇＧまたは（Ｄ〜Ｆ）ＨＭＡｂ１で処理されたマウスにおける脊髄の代表的な画像。病変境界は、白の点線で表示されている。（Ｇ）ＭＡＰ２免疫標識を、陽性染色の面積を乗じた平均強度として定量した。結果は、偽手術のＩｇＧ処理されたマウスについてのパーセンテージとして表現されている。結果は、ＳＥＭによる平均である。テューキーのＨＳＤによる、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３〜４。
マウスを単回のＳＣＩに供し、損傷後にＩＰ生理食塩水、対照Ｉｇｇ、またはＨＭＡｂ１（２５ｍｇ／ｋｇ）で３０分間処理した。ニューロンマーカーＮｅｕＮに対して免疫標識することによって、ニューロン核を測定した。（Ａ〜Ｆ）免疫組織化学に供された、（Ａ〜Ｃ）対照ＩｇＧまたは（Ｄ〜Ｆ）ＨＭＡｂ１で処理されたマウスにおける脊髄の代表的な画像。病変境界は、白の点線で表示されている。（Ｇ）ＮｅｕＮ免疫標識を、陽性染色の面積を乗じた平均強度として定量した。結果は、偽手術のＩｇＧ処理されたマウスについてのパーセンテージとして表現されている。
骨における乳癌成長は、ヒト−マウスキメラ抗Ｃｘ４３抗体ＨＭＡｂ２によって抑制された（この抗体は、「Ｍ２」抗体と同じマウス可変ドメイン及びＣＤＲを含む）。Ｐｙ８１１９−Ｌｕｃ細胞を、対照及びｃＫＯ雌マウスの右脛骨に注射した。左脛骨に、対照としてＰＢＳを注射した。（Ａ）腫瘍成長を、生物発光イメージングによって４週間毎週記録し、定量した。データは、平均±ＳＥＭとして提示されている。＊＊、Ｐ＜０．０１。１群あたりｎ＝７。（Ｂ）白の矢頭で示された、肺に及び脳に広がった腫瘍を有するＣｘ４３ ｃＫＯマウスの代表的な画像。（Ｃ）Ｐｙ８１１９細胞を注射された脛骨に関する代表的なＸ線写真は、腫瘍細胞が注射され及び溶骨性病変が生じた場所（矢頭）を表示している。ＰＢＳを注射された左脛骨は、溶骨性病変を示さなかった。
ＭＬＯ−Ｙ４骨細胞（Ａ）または初代マウス骨細胞（Ｂ）におけるＣｘ４３ヘミチャネルは、ＨＭＡｂ２によって活性化されたが、ＨＭＡｂ１によって遮断された。細胞を、Ｅ２（ポリクローナル）、ＨＭＡｂ１、及びＨＭＡｂ２抗体、またはコネキシンチャネル遮断薬であるカルベノキソロン（ＣＢＸ）とともにインキュベートした。エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）色素取り込みアッセイを実施した。データは、ＳＥＭとして提示されている。基礎対照と比較して、＊＊＊、Ｐ＜０．００１。
インビボでの骨細胞におけるＭＨＡｂ２によるヘミチャネルの活性化。エバンスブルー色素をＷＴマウスの尾静脈に注射し、２５μｇ／ｍｌのＭＨＡｂ２をＩＰ注射した。注射の２時間後にマウスを屠殺し、ＰＢＳで灌流した。脛骨を単離し、及び固定された脛骨の骨組織切片を調製した。（Ａ）抗体の存在を、ローダミン抱合型抗ヒトＩｇＧで検出した。バー、５０μｍ。（Ｂ）色素取り込みを、エバンスブルー（ＥＢ）蛍光によって、皮質骨及び骨梁において測定し、定量した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。
ＨＭＡｂ２は、乳癌細胞の溶骨性成長を抑制し、及び骨を骨折から保護する。（Ａ）Ｐｙ８１１９−Ｌｕｃ乳癌細胞を、雌マウスの脛骨に注射した。（Ｂ）２５ｍｇ／ｋｇにおけるＨＭＡｂ２を、４週間、週１回または週２回のいずれかでｉ．ｐ．注射した。生理食塩水を対照マウスに週２回注射した。腫瘍成長を、生物発光イメージングによって４週間毎週記録し、定量した（下のパネル）。データは、平均±ＳＥＭとして提示されている。ＨＭＡｂ２及び生理食塩水に対してｎ＝６。（Ｃ）ＭＨＡｂ２または生理食塩水を注射されたマウスをＸ線によって撮像した。＊、Ｐ＜０．０５。
Ｃｘ４３は、軟骨細胞において豊富に発現される。マウスの骨から単離された初代軟骨細胞を、透過性細胞においてＣ末ドメインに対する抗Ｃｘ４３抗体（全体）で、及び非透過性細胞においてＣｘ４３Ｅ２抗体で免疫染色した。
ＨＭＡｂ１は、軟骨細胞においてＣｘ４３ヘミチャネルを遮断した。マウスの骨から単離された初代軟骨細胞を、カルベノキソロン（コネキシンチャネル遮断薬）またはＨＭＡｂ１抗体で前処理し、次いでＩＬ−１βの有りまたは無しで処理した。エチジウムブロマイド色素取り込みアッセイを実施して、ヘミチャネル活性を判定した。
ＨＭＡｂ１は、インビボでマウス軟骨細胞においてヘミチャネル活性を遮断した。エバンスブルー色素を、ＷＴマウスの尾静脈に注射した。Ｃｘ４３（Ｍ１）ｍＡｂ（２５ｍｇ／ｋｇ）を、色素注射の２時間前にｉ．ｐ．注射した。色素注射の３０分後、左脛骨に１０分間機械的負荷を１回かけた。色素取り込みをエバンスブルー（ＥＢ）蛍光によって測定し、定量した。Ｐ＜０．００１。ｎ＝３。
ＨＭＡｂ２及びＨＡｂ２抗体の両方とも、Ｃｘ４３を認識し、骨細胞の細胞表面上のＣｘ４３に結合する。（Ａ）親ＨｅＬａまたはＣｘ４３を発現するＨｅＬａ細胞を、ＨＭＡｂ２（ＭＨＣ２）及びＨＡｂ２（ＨＣ２）抗体で免疫標識した。（Ｂ）非透過性骨細胞ＭＬＯ−Ｙ４細胞を、抗ＨＭＡｂ２（ＭＨＣ２）またはＨＡｂ２（ＨＣ２）抗体で免疫蛍光標識した。
ＭＨＡｂ２による溶骨性乳癌成長の用量依存的阻害。Ｐｙ８１１９−Ｌｕｃ乳癌細胞を、雌マウスの脛骨に注射した。５、１５、及び２５ｍｇ／ｋｇにおけるＨＭＡｂ２を、４週間週１回ｉ．ｐ．注射した。生理食塩水を対照マウスに週１回注射した。腫瘍成長を、生物発光イメージングによって４週間毎週記録し、定量した。データは、平均±ＳＥＭとして提示されている。ＨＭＡｂ２及び生理食塩水に対してｎ＝６。＊、Ｐ＜０．０５。
ＨＭＡｂ２は、骨梁の質量、容積、及び厚みを増加させる。４ヶ月齢のマウスに、２５ｍｇ／ｋｇのＨＭＡｂ２抗体または生理食塩水を、２週間週１回ｉ．ｐ．注射した。骨パラメーター、（Ａ）骨容積；（Ｂ）骨梁の厚み；（Ｃ）骨梁数；及び（Ｄ）骨ミネラル密度（ＢＭＤ）を、マイクロＣＴイメージングによって判定し、定量した。データは、平均±ＳＥＭとして提示されている。ｎ＝６；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。
ＭＨＡｂ２による溶骨性ヒト乳癌成長の阻害。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞を、雌の免疫欠損ヌードマウスの脛骨に注射した。２５ｍｇ／ｋｇにおけるＨＭＡｂ２を、７週間週１回ｉ．ｐ．注射した。生理食塩水またはヒトＩｇＧを、対照マウスに週１回注射した。腫瘍成長を、生物発光イメージングによって７週間毎週記録し、定量した。データは、平均±ＳＥＭとして提示されている。ｎ＝６。＊、Ｐ＜０．０５。（Ｂ）７週間後にマウスを屠殺し、腫瘍を単離した。
ＭＨＡｂ１は、ＮＦ−ｋＢの核移行を阻害することによって炎症応答を抑制する。初代マウス軟骨細胞を、インターロイキン（ＩＬ）１β及びＭＨＡｂ１の有りまたは無しで処理し、固定し、ならびに抗体ＮＦ−ｋＢ抗体で免疫標識し、ならびにＦＩＴＣ−ＷＧＡで対比標識した。統合された画像が右のパネルに示されている。

0051

様々な細胞は、タンパク質コネキシンによって形成されるヘミチャネル及びギャップ結合を通じて、互いと及び細胞外環境とコミュニケーションを取り合うことができる。コネキシンタンパク質は、身体にわたって普遍的に発現される。６個のコネキシンタンパク質が１個のヘミチャネルを構成し、２個のヘミチャネルが１個のギャップ結合チャネルを構成する。ギャップ結合は、接触している細胞間の原形質膜に位置するチャネルのクラスターであり、それらは細胞間コミュニケーションを仲介する。ヘミチャネルは、ギャップ結合チャネルとは別個の実体である。ヘミチャネルは、細胞内区画と細胞外環境の間の分子の交換を可能にする。

0052

骨細胞は、コネキシン（Ｃｘ）４３ヘミチャネルとして知られるヘミチャネルを発現する。これらの骨細胞ヘミチャネルは通常閉じており、機械的刺激に曝露された場合に開口し得、それは骨微小環境への様々な因子の放出につながる。ヘミチャネル開口によって放出される因子は、腫瘍細胞移動及び骨転移を減少させ得る他の過程を仲介し得る。

0053

ある特定の実施形態は、コネキシンヘミチャネルの開口を変調する試薬を同定する方法に向けられている。ある特定の態様において、方法は、コネキシンヘミチャネルの開口を正に変調する化合物または薬物を同定する。他の実施形態は、乳癌または前立腺癌などの癌を有する患者に、ヘミチャネルを開口させる化合物を投与することによって、癌を治療する方法に向けられている。ある特定の態様において、患者は原発性腫瘍を有する。ある特定の態様において、Ｃｘ４３ヘミチャネルを開口させる化合物を用いて、骨への転移を阻害し得るまたは低下させ得る。他の態様において、Ｃｘ４３チャネルを開口させる化合物を用いて、骨粗鬆症、骨減少症、または骨肉腫を治療する。

0054

癌転移は、癌が、それの起源である身体の部分（例えば、乳房または前立腺）から、身体の他の部分（例えば、肝臓または骨）に広がり、及び二次性腫瘍を確立した場合に生じる。骨は、癌転移の最もよく見られる部位の１つである。骨に転移する癌には、乳癌、前立腺癌、肺癌、及び皮膚癌（例えば、黒色腫）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。骨転移は、進行性の乳癌及び前立腺癌を有する患者の最高７５％において同定され得る。骨転移（ｍｅｔｓ）は、難治性疼痛、病的骨折、脊髄及び神経圧迫、骨髄浸潤、ならびに運動性の欠如などであるがそれらに限定されない、多くの重大な臨床的帰結及び生活の質の帰結と関連付けされる。多くの場合、癌の全身的存在は、癌を治療不能にもする。

0055

正常な骨は、３つの主要な細胞タイプ：骨形成骨芽細胞、骨吸収破骨細胞、及び骨細胞から構成される。骨細胞は、骨の細胞のおよそ９５％を構成し、溶骨活性及び骨芽細胞活性を協調させることによって骨再形成過程を維持する。癌細胞が骨に侵襲した場合、正常な骨機能の多くが影響を受ける。癌細胞は局所的微小環境と相互作用して、骨破壊及び血管新生を介して癌細胞生存を促進する。

0056

骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルは、効果的でよく用いられるビスホスホネート薬であるアレンドロネート（ＡＤ）による処理によって開口することが示されている。ビスホスホネートは、骨転移を含めた多くの骨障害を治療することで知られる薬物のクラスである。Ｐｏｗｌｅｓらは、ビスホスホネートの投与が、骨転移の発生率の減少、及び乳癌を有する患者における死亡率の減少と関連付けられることを示している。ＡＤは、腫瘍成長の減少ならびに骨破壊及び疼痛の低下と関連付けられている。ＡＤは、破骨細胞活性を阻害し、及び骨細胞におけるＣｘ４３ヘミチャネルの開口を誘導する（Ｐｌｏｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。しかしながら、ＡＤ投与は、複数の重度の副作用を伴う。

0057

Ｉ．抗体
本発明のある特定の態様は、ヘミチャネルの機能を正または負に変調する抗体に向けられている。モノクローナル抗体を同定し及び単離する例が、下で記載される。

0058

本明細書において用いられる「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変ドメインの相補性決定領域を指す。ＣＤＲに含まれる残基の体系的同定は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）によって開発された。可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲは、本明細書において、箇所２７〜３２（ＣＤＲ１）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、及び９１〜９７（ＣＤＲ３）の残基を含むように規定される。可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲは、本明細書において、箇所２７〜３３（ＣＤＲ１）、５２〜５６（ＣＤＲ２）、及び９５〜１０２（ＣＤＲ３）の残基を含むように規定される。

0059

当業者によって解されるであろうように、本明細書において開示されるＣＤＲは、変種も含み得る。一般的に、個々の変種ＣＤＲ間のアミノ酸同一性は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。ゆえに、「変種ＣＤＲ」は、本発明の親ＣＤＲとの定められた同一性を有するものであり、親ＣＤＲの特異性及び／または活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含むがそれらに限定されない、生物学的機能を共有する。

0060

アミノ酸配列変動を導入するための部位または領域はあらかじめ決められるものの、変異それ自体があらかじめ決められる必要はない。例えば、所定の部位における変異の性能を最適化するために、ランダム突然変異誘発が標的コドンまたは領域で行われ得、及び発現した抗原結合タンパク質ＣＤＲ変種は、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされ得る。公知の配列を有するＤＮＡにおけるあらかじめ決められた部位に置換変異を作製するための技法、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発及びＰＣＲ突然変異誘発は周知である。変異体のスクリーニングは、本明細書において記載される抗原結合タンパク質活性のアッセイを用いて行われる。

0061

アミノ酸置換は、典型的に単一残基のものであり；挿入は、通常約一（１）〜約二十（２０）個のアミノ酸残基ほどのものであるが、とはいえ、かなりより大きな挿入が容認され得る。欠失は、約一（１）〜約二十（２０）個のアミノ酸残基に及ぶが、とはいえある場合には、欠失ははるかにより大きくあり得る。

0062

置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせを用いて、最終的な誘導体または変種に到達し得る。一般的に、これらの変化は、分子の変更、特に抗原結合タンパク質の免疫原性及び特異性の変更を最小限に抑えるために、数個のアミノ酸に対して行われる。しかしながら、ある特定の状況では、より大きな変化が容認され得る。

0063

本明細書において用いられる「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」によって、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドが意味される。Ｆａｂは、単離状態にあるこの領域、または全長抗体、抗体フラグメント、もしくはＦａｂ融合タンパク質の背景におけるこの領域、または本明細書において概説される他の任意の抗体実施形態を指し得る。

0064

本明細書において用いられる「Ｆｖ」または「Ｆｖフラグメント」または「Ｆｖ領域」によって、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドが意味される。

0065

本明細書において用いられる「フレームワーク」によって、ＣＤＲとして定義されるそうした領域を除外した、抗体可変ドメインの領域が意味される。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離された隣接領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）にさらに細分され得る。

0066

本明細書において用いられる、抗体の「抗原結合部」（または、単に「抗体部」）という用語は、抗原（例えば、ヘミチャネル）に特異的に結合し得る能力を保持する、抗体の１つまたは複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部」という用語の内に包含される結合フラグメントの例には、（ｉ）ＶＬ／ＶＫ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価のフラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）本質的にヒンジ領域の一部と合わせたＦａｂである、Ｆａｂ’フラグメント（ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｐａｕｌ ｅｄ．，３ｒｄ ｅｄ．１９９３を参照されたい）；（ｉｖ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる、Ｆｄフラグメント；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなる、Ｆｖフラグメント；（ｖｉ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；ならびに（ｖｉｉｉ）単一の可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域である、ナノボディが含まれる。

0067

「特異的に結合する」（または、「免疫特異的に結合する」）という用語は、抗体が、その意図される標的に独占的に結合することを示すことを意図されるわけではない。むしろ、抗体は、その意図される標的に対するその親和性が、非標的分子に対するその親和性と比較したときに約５倍大きい場合に、「特異的に結合する」。適切には、非所望の物質との有意な交差反応または交差結合はない。抗体の親和性は、例えば、非標的分子に対するその親和性よりも、標的分子に対して少なくとも５倍、１０倍など、２５倍など、とりわけ５０倍、及び特に１００倍またはそれを上回る割合大きい。一部の実施形態において、抗体または他の結合作用物質と抗原の間の特異的結合は、少なくとも１０６Ｍ−１の結合親和性を意味する。抗体は、例えば、約１０８Ｍ−１〜約１０９Ｍ−１、約１０９Ｍ−１〜約１０１０Ｍ−１、または約１０１０Ｍ−１〜約１０１１Ｍ−１など、少なくとも約１０７Ｍ−１の親和性で結合し得る。抗体は、例えば、５０ｎＭもしくはそれを下回る、１０ｎＭもしくはそれを下回る、１ｎＭもしくはそれを下回る、１００ｐＭもしくはそれを下回る、またはより好ましくは１０ｐＭもしくはそれを下回るＥＣ５０で結合し得る。

0068

ある特定の実施形態において、Ｃｘ４３タンパク質の少なくとも一部分に結合し、ならびにＣｘ４３シグナル伝達及び癌細胞増殖を阻害する抗体またはそのフラグメントが企図される。好ましくは、抗Ｃｘ４３抗体は、モノクローナル抗体またはヒト化抗体である。ゆえに、公知の手段によって及び本明細書において記載されるように、Ｃｘ４３タンパク質、そのそれぞれのエピトープの１つもしくは複数、または前述のもののいずれかの抱合体に特異的である、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、抗体フラグメント、ならびに結合ドメイン及びＣＤＲ（前述のもののいずれかの操作された形態を含む）が、そのような抗原またはエピトープが天然の供給源から単離されているかどうか、または天然化合物の合成誘導体もしくは変種であるかどうかにかかわらず、創出され得る。

0069

本実施形態に適切な抗体フラグメントの例には、限定することなく、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる、Ｆａｂフラグメント：（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる、「Ｆｄ」フラグメント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなる、「Ｆｖ」フラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインからなる、「ｄＡｂ」フラグメント；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、当該２つのドメインが結び付いて結合ドメインを形成するのを可能にするペプチドリンカーによって連結されている、一本鎖Ｆｖ分子（「ｓｃＦｖ」）；（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（米国特許第５，０９１，５１３号を参照されたい）；ならびに（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価のまたは多特異性フラグメントである、ダイアボディ（米国特許出願公報２００５０２１４８６０）が含まれる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはダイアボディ分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み入れによって安定化され得る。ＣＨ３ドメインに接合したｓｃＦｖを含むミニボディも作製され得る（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

0070

抗体様結合ペプチド模倣体も、実施形態において企図される。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）は、そぎ落とされた抗体として作用し、及びより長い血清半減期ならびにより扱いやすい合成法というある特定の利点を有するペプチドである「抗体様結合ペプチド模倣体」（ＡＢｉＰ）を記載している。

0071

Ｃｘ４３タンパク質に特異的な抗体を産生するために、Ｃｘ４３細胞外ドメインタンパク質などの抗原を動物に接種し得る。高い頻度で抗原は別の分子に結合されてまたは抱合されて、免疫応答を増強する。本明細書において使用するとき、抱合体とは、動物において免疫応答を引き出すために用いられる抗原に結合した、任意のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または非タンパク質性物質である。抗原接種に応答して動物において産生される抗体は、多様な個々の抗体産生Ｂリンパ球から作製される多様な非同一分子（ポリクローナル抗体）を含む。ポリクローナル抗体とは、そのそれぞれが、同じ抗原上の異なるエピトープを認識し得る抗体種の混合集団である。動物におけるポリクローナル抗体産生のための正しい条件を考慮すれば、動物の血清中の抗体の大部分は、それに対して動物が免疫化されている抗原性化合物上の集合的エピトープを認識するであろう。この特異性は、関心対象の抗原またはエピトープを認識するそうした抗体のみを選択するためのアフィニティー精製によってさらに増強される。

0072

モノクローナル抗体とは、すべての抗体産生細胞が単一のＢリンパ球細胞株に由来するため、あらゆる抗体分子が同じエピトープを認識する、抗体の単一種である。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成するための方法は、一般的に、ポリクローナル抗体を調製するためのものと同じ道筋に沿って始まる。一部の実施形態において、マウス及びラットなどの齧歯類が、モノクローナル抗体を生成することにおいて用いられる。一部の実施形態において、ウサギ、ヒツジ、またはカエル細胞が、モノクローナル抗体を生成することにおいて用いられる。ラットの使用は周知であり、ある特定の利点を提供し得る。マウス（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）は日常的に用いられ、一般的に、高いパーセンテージの安定な融合体を与える。

0073

ハイブリドーマ技術は、Ｃｘ４３抗原で以前に免疫化されたマウス由来の単一のＢリンパ球と不死の骨髄腫細胞（通常、マウス骨髄腫）との融合を伴う。この技術は、同じ抗原またはエピトープ特異性を有する無制限の分量の構造上同一の抗体（モノクローナル抗体）が産生され得るような、不特定数の生成のための単一抗体産生細胞を繁殖させる方法を提供する。

0074

血漿Ｂ細胞は、免疫化されたウサギの新たに調製されたウサギ末梢血単核細胞から単離され得、Ｃｘ４３結合細胞に対してさらに選択され得る。抗体産生Ｂ細胞の富化の後、全ＲＮＡが単離され得、及びｃＤＮＡが合成され得る。重鎖及び軽鎖の両方からの抗体可変領域のＤＮＡ配列が増幅され得、ファージディスプレイＦａｂ発現ベクター内に構築され得、及びＥ．ｃｏｌｉに形質転換され得る。Ｃｘ４３特異的結合Ｆａｂが、複数ラウンドの富化パニングを通して選出され得、及びシーケンシングされ得る。選択されたＣｘ４３結合ヒットは、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において哺乳類発現ベクターシステムを用いてウサギ及びウサギ／ヒトキメラ形態の全長ＩｇＧとして発現され得、ならびに高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）分離ユニットとともにプロテインＧ樹脂を用いて精製され得る。

0075

一実施形態において、抗体は、キメラ抗体、例えば異種の非ヒト、ヒト、またはヒト化配列（例えば、フレームワーク及び／または定常ドメイン配列）に接ぎ木された、非ヒトドナー由来の抗原結合配列を含む抗体である。外来抗体の可変領域を無傷のままにして、モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖定常ドメインをヒト起源の類似ドメインで置き換える方法が開発されている。あるいは、「完全にヒト」のモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックのマウスにおいて産生される。齧歯類、例えばマウス、及びヒトアミノ酸配列の両方を有する抗体可変ドメインを組換えにより構築することによって、モノクローナル抗体の可変ドメインをよりヒトの形態に変換する方法も開発されている。「ヒト化」モノクローナル抗体では、超可変ＣＤＲのみがマウスモノクローナル抗体に由来し、フレームワーク及び定常領域はヒトアミノ酸配列に由来する（米国特許第５，０９１，５１３号及び第６，８８１，５５７号を参照されたい）。抗体における、齧歯類に特徴的であるアミノ酸配列を、ヒト抗体の対応する箇所に見い出されるアミノ酸配列で置き換えることは、治療的使用の間の有害な免疫反応の可能性を低下させると考えられる。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は、当該ハイブリドーマによって産生される抗体の結合特異性を変更し得るまたは変更し得ない遺伝子変異または他の変化にも供され得る。

0076

様々な動物種においてポリクローナル抗体を産生するための、ならびにヒト化、キメラ、及び完全にヒトを含めた様々なタイプのモノクローナル抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知であり、高度に予測可能である。例えば、以下の米国特許及び特許出願は、そのような方法についての実現可能にする説明を提供する：米国特許出願第２００４／０１２６８２８号及び第２００２／０１７２６７７号；ならびに米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，１９６，２６５号；第４，２７５，１４９号；第４，２７７，４３７号；第４，３６６，２４１号；第４，４６９，７９７号；第４，４７２，５０９号；第４，６０６，８５５号；第４，７０３，００３号；第４，７４２，１５９号；第４，７６７，７２０号；第４，８１６，５６７号；第４，８６７，９７３号；第４，９３８，９４８号；第４，９４６，７７８号；第５，０２１，２３６号；第５，１６４，２９６号；第５，１９６，０６６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，４２０，２５３号；第５，５６５，３３２号；第５，５７１，６９８号；第５，６２７，０５２号；第５，６５６，４３４号；第５，７７０，３７６号；第５，７８９，２０８号；第５，８２１，３３７号；第５，８４４，０９１号；第５，８５８，６５７号；第５，８６１，１５５号；第５，８７１，９０７号；第５，９６９，１０８号；第６，０５４，２９７号；第６，１６５，４６４号；第６，３６５，１５７号；第６，４０６，８６７号；第６，７０９，６５９号；第６，７０９，８７３号；第６，７５３，４０７号；第６，８１４，９６５号；第６，８４９，２５９号；第６，８６１，５７２号；第６，８７５，４３４号；及び第６，８９１，０２４号。本明細書において及びその中において引用されるすべての特許、特許出願公報、及び他の刊行物は、本出願における参照により本明細書によって組み入れられる。

0077

抗体は、トリ及び哺乳類を含めた任意の動物供給源から産生され得る。好ましくは、抗体は、ヒツジ、ネズミ（例えば、マウス及びラット）、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。加えて、より新しい技術は、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリーからのヒト抗体の開発及びスクリーニングを可能にする。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，９４６，５４６号に記載されているように、バクテリオファージ抗体発現技術は、動物免疫化なしで特異的抗体が産生されるのを可能にする。これらの技法は、Ｍａｒｋｓ（１９９２）；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）；及びＳｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）にさらに記載されている。

0078

Ｃｘ４３に対する抗体は、動物種、モノクローナル細胞株、または抗体の他の供給源にかかわらず、Ｃｘ４３の効果を中和し得るまたは和らげ得る能力を有することが十分に予想される。ある特定の動物種は、それらが、抗体の「Ｆｃ」部を介した補体系の活性化によりアレルギー応答を引き起こす可能性がより高くあり得るため、治療用抗体を生成するのにあまり好ましくない可能性がある。しかしながら、抗体全体を、「Ｆｃ」（補体結合）フラグメントに、及び結合ドメインまたはＣＤＲを有する抗体フラグメントに酵素的に消化し得る。Ｆｃ部の除去は、抗原抗体フラグメントが、望ましくない免疫学的応答を引き出す可能性を低下させ、ゆえにＦｃなしの抗体は、予防的または治療的な処置に優先的であり得る。上で記載されるように、抗体を、キメラまたは部分的もしくは完全にヒトであるように構築して、他の種において産生されているまたは他の種由来の配列を有する抗体を動物に投与することにより生じる有害な免疫学的帰結も低下させ得るまたは排除し得る。

0079

置換変種は、典型的に、タンパク質内の１つまたは複数の部位における別のものに対する１個のアミノ酸の交換を含有し、他の機能または特性の喪失の有無にかかわらず、ポリペプチドの１つまたは複数の特性を変調するように設計され得る。置換は保存的であり得、つまり、１個のアミノ酸は類似の形状及び電荷のもので置き換えられる。保存的置換は、当技術分野において周知であり、例えば、アラニンからセリンへ；アルギニンからリジンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへ；アスパラギン酸からグルタミン酸へ；システインからセリンへ；グルタミンからアスパラギンへ；グルタミン酸からアスパラギン酸へ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；イソロイシンからロイシンまたはバリンへ；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへ；リジンからアルギニンへ；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへ；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニンへ；セリンからトレオニンへ；トレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ；及びバリンからイソロイシンまたはロイシンへの変化を含む。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるような非保存的であり得る。非保存的変化は、典型的に、非極性または非荷電アミノ酸の代わりに極性または荷電アミノ酸、逆もしかりなど、化学的に類似していないもので残基を置換することを伴う。

0080

タンパク質は、組換えであり得るまたはインビトロで合成され得る。あるいは、非組換えまたは組換えタンパク質は、細菌から単離され得る。そのような変種を含有する細菌が、組成物及び方法において取り入れられ得ることも企図される。その結果として、タンパク質は単離される必要がない。

0081

組成物内に、ｍｌあたり約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの全ポリペプチド、ペプチド、及び／またはタンパク質が存在することが企図される。ゆえに、組成物におけるタンパク質の濃度は、約、少なくとも約、または多くとも約０．００１、０．０１０、０．０５０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０ｍｇ／ｍｌまたはそれを上回る濃度（または、その中に導き出せる任意の値域）であり得る。このうち、約、少なくとも約、または多くとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、Ｃｘ４３に結合する抗体であり得る。

0082

抗体、または好ましくは抗体の免疫学的部分は、他のタンパク質に化学的に抱合され得る、または他のタンパク質との融合タンパク質として発現され得る。本明細書及び添付の特許請求の範囲の目的のために、すべてのそのような融合タンパク質は、抗体または抗体の免疫学的部分の定義に含まれる。

0083

実施形態は、少なくとも１種の作用物質に連結されて、抗体抱合体またはペイロードを形成する、Ｃｘ４３、ポリペプチド、及びペプチドに対する抗体及び抗体様分子を提供する。診断用または治療用作用物質としての抗体分子の効力を増加させるために、少なくとも１つの所望の分子または部分に連結させるまたは共有結合的に結合させるまたは複合させることが従来的である。そのような分子または部分は、少なくとも１つのエフェクターまたはレポーター分子であり得るが、それらに限定されるわけではない。エフェクター分子には、所望の活性、例えば細胞傷害活性を有する分子が含まれる。抗体に付着されているエフェクター分子の非限定的な例には、毒素、治療用酵素、抗生物質、放射性標識されたヌクレオチド等が含まれる。対照的に、レポーター分子は、アッセイを用いて検出され得る任意の部分として定義される。抗体に抱合されているレポーター分子の非限定的な例には、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、リン光性分子、化学発光分子、発色団、発光性分子、光親和性分子、着色粒子、またはビオチンなどのリガンドが含まれる。

0084

抗体のその抱合部分への付着または抱合のためのいくつかの方法が、当技術分野において公知である。一部の付着法は、抗体に付着した、例えばジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）；エチレントリアミン四酢酸；Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド；及び／またはテトラクロロ−３−６−ジフェニルグリコルリル−３のような有機キレート剤を採用した金属キレート錯体の使用を伴う。モノクローナル抗体は、グルタルアルデヒドまたはペリオデートなどのカップリング剤の存在下で、酵素とも反応し得る。フルオレセインマーカーとの抱合体は、これらのカップリング剤の存在下でまたはイソチオシアネートとの反応によって調製される。

0085

ＩＩ．疾患の治療
本実施形態のある特定の態様を用いて、Ｃｘ４３シグナル伝達と関連した疾患または障害を予防し得るまたは治療し得る。Ｃｘ４３のシグナル伝達は、癌細胞増殖を阻止する任意の適切な薬物によって低下し得る。好ましくは、そのような物質は抗Ｃｘ４３抗体であろう。

0086

「治療」及び「治療する」とは、疾患、または健康状態に関係する病状の治療的利益を得る目的のための、対象への治療用作用物質の投与もしくは適用、または対象に対する施術もしくは治療法の実施を指す。例えば、治療は、Ｃｘ４３シグナル伝達を阻害する抗体の薬学上有効な量の投与を含み得る。

0087

「対象」及び「患者」とは、霊長類、哺乳類、及び脊椎動物など、ヒトまたは非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態において、対象はヒトである。

0088

本出願にわたって用いられる「治療的利益」または「治療上有効な」という用語は、この病状の医学的治療に関して対象の健康を促進するまたは増強するいかなるものをも指す。これには、疾患の兆候または症状の頻度または重症度の低下が含まれるが、それらに限定されるわけではない。例えば、癌の治療は、例えば腫瘍のサイズの低下、腫瘍の侵襲性の低下、癌の成長速度の低下、または転移の阻止を伴い得る。癌の治療は、癌を有する対象の生存を引き延ばすことも指し得る。

0089

Ａ．薬学的組成物
ある特定の態様は、薬学的に許容されるキャリアとともに製剤化された、モノクローナル抗体またはその抗原結合部（複数可）の１つまたは組み合わせを含有する組成物、例えば薬学的組成物を含む。そのような組成物は、本明細書において記載される（例えば、２種またはそれを上回る種類の異なる）抗体または免疫抱合体の１つまたは組み合わせを含み得る。例えば、本発明の薬学的組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合する、または相補的活性を有する抗体の組み合わせを含み得る。

0090

本発明の薬学的組成物は、併用療法としても投与され得る、すなわち他の作用物質と組み合わせられ得る。例えば、併用療法は、少なくとも１種の他の抗癌剤と組み合わせた抗ヘミチャネル抗体を含み得る。

0091

本明細書において使用するとき、「薬学的に許容されるキャリア」には、生理学的に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、キャリアは、静脈内、筋肉内、皮下、または非経口投与（例えば、注射または注入による）に適切である。投与の経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、または免疫抱合体は、当該化合物を不活性化し得る酸の作用及び他の天然条件から当該化合物を保護する材料にコーティングされ得る。

0092

本発明の薬学的組成物において採用され得る適切な水性及び非水性キャリアの例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。

0093

薬学的に許容されるキャリアには、無菌の水溶液または分散液、及び無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒体及び作用物質の使用は、当技術分野において公知である。任意の従来的な媒体または作用物質が活性化合物と不適合である限りを除いて、本発明の薬学的組成物におけるそれらの使用が企図される。補足的な活性化合物も、組成物に組み入れられ得る。

0094

治療用組成物は、典型的に、製造及び保管の条件下で無菌及び安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に適切な他の秩序構造として製剤化され得る。キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなど、糖類、ポリアルコールを内包することが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に内包することによってもたらされ得る。

0095

無菌の注射可能な溶液は、要求に応じて、上記で列挙された成分の１つまたは組み合わせとともに、適当な溶媒中に要求される量の活性化合物を組み入れ、その後に滅菌精密濾過が続くことによって調製され得る。一般的に、分散液は、基本的な分散媒、及び上記で列挙されたものからの要求される他の成分を含有する無菌ビヒクル中に、活性化合物を組み入れることによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分と、それに加えて以前に滅菌濾過されたその溶液からの任意の付加的な所望の成分との粉末を産出する真空乾燥及び冷凍乾燥（凍結乾燥）である。

0096

キャリア材料と組み合わされて単一剤形を産生し得る活性成分の量は、治療されている対象、及び投与の特定の様式に応じて変動する。キャリア材料と組み合わされて単一剤形を産生し得る活性成分の量は、一般的に、治療効果をもたらす組成物のその量である。一般的に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせて、約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分に及ぶ。

0097

投薬量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与し得る、いくつかの分割された用量を経時的に投与し得る、または用量を、治療状況の緊急要件によって示されるように比例的に低下させ得るもしくは増加させ得る。投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形に製剤化することがとりわけ有利である。本明細書において用いられる単位剤形とは、治療されるべき対象に対する単位投薬量として合う物理的に別々の単位を指し；各単位は、要求される薬学的キャリアと共同して所望の治療効果をもたらすように算出された、あらかじめ決められた分量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形に関する仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴及び達成されるべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性についての、治療のためにそのような活性化合物を混ぜ合わせることの当技術分野において特有の制約、によって決定付けされ及びそれらに直接依存する。

0098

抗体の投与に関して、投薬量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、及びより通常には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇに及ぶ。例えば、投薬量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの値域内であり得る。例示的な治療レジームは、週１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１ヶ月に１回、３ヶ月ごとに１回、または３〜６ヶ月ごとに１回の投与を伴う。本発明の抗ヘミチャネル抗体に対する好ましい投薬量レジメンには、静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が含まれ、抗体は、以下の投薬スケジュールのうちの１つを用いて与えられる：（ｉ）６回の投薬量に対して４週間ごと、次いで３ヶ月ごと；（ｉｉ）３週間ごと；（ｉｉｉ）１回の３ｍｇ／ｋｇ体重、それに続く３週間ごとの１ｍｇ／ｋｇ体重。

0099

一部の方法において、異なる結合特異性を有する２種またはそれを上回る種類のモノクローナル抗体が同時に投与され、その場合、投与される各抗体の投薬量は、示された値域内に入る。抗体は、通常、何度も投与される。単一投薬量の間の間隔は、例えば週に１回、月に１回、３ヶ月ごと、または年に１回であり得る。間隔は、患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することによって示されるように、不規則でもあり得る。一部の方法において、投薬量を調整して約１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度、及び一部の方法において約２５〜３００μｇ／ｍｌを達成する。

0100

本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投薬量レベルを変動させて、患者に有害であることなく、特定の患者、組成物、及び投与の様式に対する所望の治療的応答を達成するために有効である活性成分の量を獲得し得る。選択される投薬量レベルは、採用された本発明の特定の組成物の活性、投与の経路、投与の時間、採用されている特定の化合物の排出の速度、治療の継続期間、採用された特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物、及び／または材料、治療されている患者の年齢、性別、重量、病状、全般的健康状態、及び以前の病歴、ならびに医学の技術分野において周知の同様の因子を含めた、多様な薬物動態学的因子に依存する。

0101

「治療上有効な投薬量」の抗ヘミチャネル抗体は、疾患症状の重症度の減少、疾患症状がない期間の頻度及び継続期間の増加、または疾患の苦痛による機能障害もしくは障碍の阻止をもたらす。治療上有効な量の治療用化合物または抗体は、腫瘍転移を減少させ得る、または対象における症状を別様に改善し得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び特定の組成物または選択された投与の経路などのような因子に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。

0102

本発明の組成物は、当技術分野において公知の多様な方法のうちの１つまたは複数を用いて、投与の１つまたは複数の経路を介して投与され得る。当業者によって解されるであろうように、投与の経路及び／または様式は、所望の結果に応じて変動する。本発明の抗体に対する好ましい投与の経路には、例えば注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、または他の非経口の投与の経路が含まれる。本明細書において用いられる「非経口投与」という語句は、通常は注射による、腸内及び局所投与以外の投与の様式を意味し、限定することなく、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内の注射及び注入を含む。

0103

Ｂ．併用治療
ある特定の実施形態において、本実施形態の組成物及び方法は、第二のまたは付加的な療法と組み合わせて、Ｃｘ４３に対する抗体または抗体フラグメントを伴って、癌細胞増殖におけるその活性を阻害する。そのような療法は、Ｃｘ４３仲介性細胞増殖と関連する任意の疾患の治療において適用され得る。例えば、疾患は癌であり得る。

0104

併用療法を含めた方法及び組成物は、治療効果もしくは保護効果を増強し、及び／または別の抗癌もしくは抗過剰増殖療法の治療効果を増加させる。治療的及び予防的な方法及び組成物は、癌細胞の殺傷及び／または細胞過剰増殖の阻害など、所望の効果を達成するために有効な組み合わせた量で提供され得る。この工程は、細胞と、抗体または抗体フラグメント及び第二の療法とを接触させることを伴い得る。組織、腫瘍、及び／または細胞を、作用物質（すなわち、抗体もしくは抗体フラグメント、または抗癌剤）のうちの１種または複数種を含む、１つまたは複数の組成物または薬理学的製剤（複数可）と接触させ得る、あるいは１つの組成物が１）抗体もしくは抗体フラグメント、２）抗癌剤、または３）抗体もしくは抗体フラグメント及び抗癌剤の両方を提供する、２つまたはそれを上回る数の個別の組成物または製剤と接触させ得る。また、そのような併用療法は、化学療法、放射線療法、外科的療法、または免疫療法と併せて用いられ得ることが企図される。

0105

「接触した」及び「曝露した」という用語は、細胞に適用される場合、治療用構築物及び化学療法用または放射線療法用作用物質が標的細胞に送達される、または標的細胞と直接並べて置かれる過程を記載するために本明細書において用いられる。細胞殺傷を達成するために、例えば両作用物質は、細胞を殺傷するまたはそれが分裂するのを阻止するために有効な組み合わせた量で細胞に送達される。

0106

阻害抗体は、抗癌治療に対して前、間、後、または様々な組み合わせで投与され得る。投与は、同時から数分間〜数日間〜数週間に及ぶ間隔にあり得る。抗体または抗体フラグメントが抗癌剤とは別個に患者に提供される実施形態において、一般的に、２種の化合物が依然として患者に対して有利な組み合わせ効果を発揮し得るように、有意な期間が各送達の時間の間に失効しなかったことを確保する。そのような場合、互いの約１２〜２４または７２時間以内、及びより特に互いの約６〜１２時間以内に、抗体療法及び抗癌療法を患者に提供し得ることが企図される。ある状況では、それぞれの投与間で数日間（２、３、４、５、６、または７日間）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週間）が経過する、治療の期間を有意に引き延ばすことが望ましくあり得る。

0107

ある特定の実施形態において、治療のコースは、１〜９０日間またはそれを上回る期間（このような値域は介入日を含む）続く。一方の作用物質は、１日目〜９０日目（このような値域は介入日を含む）の任意の日またはそれらの任意の組み合わせに与えられ得、及びもう一方の作用物質は、１日目〜９０日目（このような値域は介入日を含む）の任意の日またはそれらの任意の組み合わせに与えられることが企図される。１日（２４時間の期間）のうちで、患者は、作用物質（複数可）の１回または複数回の投与を与えられ得る。さらに、治療のコースの後、抗癌治療が施されない期間があることが企図される。この期間は、彼らの予後、体力、健康状態など、患者の病状に応じて、１〜７日間、及び／または１〜５週間、及び／または１〜１２ヶ月もしくはそれを上回る期間（このような値域は介入日を含む）続き得る。治療サイクルは、必要に応じて繰り返されることが予想される。

0108

様々な組み合わせが採用され得る。下記の例に関しては、抗体療法が「Ａ」であり、抗癌療法が「Ｂ」である。

0109

患者への本実施形態の任意の化合物または療法の投与は、もしあるとしたら作用物質の毒性を考慮して、そのような化合物の投与のための一般的プロトコールに従う。それゆえ、一部の実施形態では、併用療法に起因する毒性をモニターするステップがある。

0110

ｉ．化学療法
本実施形態に従って、多種多様の化学療法用作用物質が用いられ得る。「化学療法」という用語は、癌を治療するための薬物の使用を指す。「化学療法用作用物質」は、癌の治療において投与される化合物または組成物を含意するために用いられる。これらの作用物質または薬物は、細胞内でのそれらの活性の様式、例えばそれらが細胞周期に影響を及ぼすかどうか及びどの段階で影響を及ぼすかによって分類される。あるいは、作用物質は、ＤＮＡに直接架橋し得る、ＤＮＡ内にインターカレートし得る、または核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体異常及び有糸分裂異常を誘導し得るその能力に基づいて特徴付けされ得る。

0111

化学療法用作用物質の例には、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）などのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチロールメラミンを含めたエチレンイミン及びメチルメラミン；アセトゲニン（とりわけ、ブラタシン及びブラタシノン（ｂｕｌｌａｔａｃｉｎｏｎｅ））；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、及びウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質（例えばカリケマイシン、とりわけカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１）などの抗生物質；ジネマイシンＡを含めたジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、及びゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、プテロプテリン、及びトリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、ドロスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、及びテストラクトンなどのアンドロゲン；ミトタン及びトリロスタンなどの抗副腎薬；フォリン酸などの葉酸補給薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシン及びアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ−２毒素、ベラクリン（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ）Ａ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えばパクリタキセル及びドセタキセル・ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。

0112

ｉｉ．放射線療法
ＤＮＡダメージを引き起こし、広範囲に用いられている他の因子には、γ線、Ｘ線、及び／または腫瘍細胞への放射性同位体の直接送達として一般に知られるものが含まれる。マイクロ波、陽子ビーム照射（米国特許５，７６０，３９５及び４，８７０，２８７）、及びＵＶ照射など、ＤＮＡダメージ因子の他の形態も企図される。これらの因子のすべては、ＤＮＡに対して、ＤＮＡの前駆体に対して、ＤＮＡの複製及び修復に対して、ならびに染色体の会合及び維持に対して広範なダメージを及ぼす可能性が最も高い。Ｘ線に対する線量域は、長期間（３〜４週間）の５０〜２００レントゲンの１日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単回線量に及ぶ。放射性同位体に対する線量域は、大幅に変動し、同位体の半減期、放たれた放射線の強度及びタイプ、ならびに新生細胞による取り込みに依存する。

0113

ｉｉｉ．免疫療法
当業者であれば、付加的な免疫療法が、実施形態の方法と組み合わせてまたはそれと併せて用いられ得ることを理解するであろう。癌治療の背景において、免疫療法は、一般的に、癌細胞を標的にし及び破壊する免疫エフェクター細胞及び分子の使用に頼る。リツキシマブ（リツキサン（登録商標））はそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のあるマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独で療法のエフェクターとして働き得る、またはそれは、細胞殺傷を実際に及ぼすように他の細胞を導き得る。抗体は、また、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）に抱合され得、及び標的化作用物質として働き得る。あるいは、エフェクターは、直接的または間接的に、腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。

0114

免疫療法の一態様において、腫瘍細胞は、標的化に適している、すなわち他の細胞の大多数に存在していない、あるマーカーを持っていなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかは、本実施形態の背景における標的化に適切であり得る。よく見られる腫瘍マーカーには、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、及びｐ1５５が含まれる。免疫療法の代替的な態様は、抗癌効果と免疫刺激効果とを組み合わせることである。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８などのケモカイン、及びＦＬＴ３リガンドなどの成長因子を含めた、免疫刺激分子も存在する。

0115

現在調査中または使用中の免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えばウシＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物（米国特許５，８０１，００５及び５，７３９，１６９；Ｈｕｉ ａｎｄ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）；サイトカイン療法、例えばインターフェロンα、β、及びγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ならびにＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）；遺伝子療法、例えばＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、及びｐ５３（Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ａｕｓｔｉｎ−Ｗａｒｄ ａｎｄ Ｖｉｌｌａｓｅｃａ，１９９８；米国特許５，８３０，８８０及び５，８４６，９４５）；ならびにモノクローナル抗体、例えば抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、及び抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，２０１２；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８；米国特許５，８２４，３１１）である。１つまたは複数の抗癌療法は、本明細書において記載される抗体療法とともに採用され得ることが企図される。

0116

ｉｖ．外科手術
癌を有する人のおよそ６０％は、予防の、診断または病期診断の、治癒の、及び苦痛緩和の手術を含む、あるタイプの手術を受ける。治癒の手術は、癌性組織のすべてまたは一部が物理的に除去され、摘出され、及び／または破壊される切除術を含み、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び／または代替的療法などの他の療法と併せて用いられ得る。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、外科手術による治療には、レーザー手術、凍結外科手術、電気外科手術、及び顕微鏡下で制御される外科手術（モース手術）が含まれる。

0117

癌性細胞、組織、または腫瘍の一部またはすべての摘出があると、身体に空洞が形成され得る。治療は、付加的な抗癌療法を用いた、当該エリアの灌流、直接注射、または局所的適用によって達成され得る。そのような治療は、例えば１、２、３、４、５、６、もしくは７日ごとに、または１、２、３、４、及び５週間ごとに、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月ごとに繰り返され得る。これらの治療は、変動投薬量のものでもあり得る。

0118

ｖ．他の作用物質
治療の治療効力を向上させるために、他の作用物質が本実施形態のある特定の態様と組み合わせて用いられ得ることが企図される。これらの付加的な作用物質には、細胞表面受容体及びＧＡＰ結合の上方調節を及ぼす作用物質、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導因子に対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる作用物質、または他の生物学的作用物質が含まれる。ＧＡＰ結合の数を上昇させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、近隣の過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させるであろう。他の実施形態において、細胞増殖抑制剤または分化剤を本実施形態のある特定の態様と組み合わせて用いて、治療の抗過剰増殖効力を向上させ得る。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の効力を向上させることが企図される。細胞接着阻害剤の例は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。治療の効力を向上させるために、ｃ２２５抗体など、アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる他の作用物質が、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて用いられ得ることがさらに企図される。

0119

ＩＩＩ．キット及び診断
実施形態の様々な態様において、治療用作用物質及び／または他の治療用及び送達用作用物質を含有するキットが想定される。一部の実施形態において、本実施形態は、実施形態の療法を準備する及び／または施すためのキットを企図する。キットは、本実施形態の薬学的組成物のいずれかを含有する１つまたは複数の密封バイアルを含み得る。キットは、例えば、少なくとも１種のＣｘ４３抗体、ならびに実施形態の構成成分を調製する、処方する、及び／または投与するための、あるいは本発明の方法の１つまたは複数のステップを実施するための試薬を含み得る。一部の実施形態において、キットは、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、またはチューブなど、キットの構成成分と反応しない容器である適切な容器も含み得る。容器は、プラスチックまたはガラスなどの滅菌可能な材料から作製され得る。

0120

キットは、本明細書において明記される方法の手順ステップを概説する指示シートをさらに含み得、及び本明細書において記載されるまたは当業者に公知であるものと実質的に同じ手順に従う。指示情報は、コンピューターを用いて実行される場合、薬学上有効な量の治療用作用物質を送達する現実または仮想の手順の呈示をもたらす、機械可読の指示を含有するコンピューター可読媒体の中にあり得る。

0121

ＩＶ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。後に続く実施例において開示される技法は、本発明の実践において十分に機能することが本発明者らによって発見された技法であり、ゆえにその実践のための好ましい様式をなすと見なされ得ることが当業者によって解されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの変化が、開示される具体的な実施形態において加えられ得、及び依然として同様または類似の結果を獲得し得ることを解するべきである。

0122

実施例１−抗Ｃｘ４３モノクローナル抗体
抗Ｃｘ４３モノクローナル抗体を生成し、及びＣｘ４３結合モノクローナル抗体を産生するクローンを同定した。すべての抗体配列に対するＤＮＡ及びアミノ酸の両方のＣＤＲ配列が、特徴付けされた抗体のそれぞれに対する正しいペアとともに、下記の表に示されている。

0123

表１：２種の機能的抗体に対する重鎖及び軽鎖のペア

0124

表２：ハイブリドーマ由来の抗体鎖の配列

0125

クローニングされた可変ドメインは、下記の図表に示されている。

0126

図表１．ＤＮＡ配列

0127

図表２．アミノ酸配列

0128

実施例２−脊髄及び神経損傷（ＳＣＩ）の治療的使用
図１に図解されるように、Ｃｘ４３は、通常、細胞間のギャップ結合に、または原形質膜上のヘミチャネルとして局在する。Ｃｘ４３ヘミチャネルの病的開口は、二次性損傷の伝播、アストロ／ミクログリアの活性化、及び炎症をもたらす。Ｃｘ４３ヘミチャネルの病的開口を阻止することが、分子の放出を阻止し、アストロサイトが世話役細胞として作用し及び二次性損傷のさらなる広がりを阻止することを可能にすることが提案される。

0129

ヒト初代アストロサイトにおけるＩＬ−１βによるＣｘ４３ヘミチャネルの活性化は、Ｃｘ４３ヘミチャネルを遮断するマウスモノクローナル抗体（Ｍ１）及びマウス−ヒトキメラ抗体ＨＭＡｂ１の両方によって阻害された。ヘミチャネル活性を、エチジウムブロマイド取り込みによって判定した。結果は図２に示されている。

0130

ＨＭＡｂ１で処理されたマウスは、グリア瘢痕化を減少させた。マウスを単回のＳＣＩに供し、損傷後にＩＰ生理食塩水、対照Ｉｇｇ、またはＨＭＡｂ１（２５ｍｇ／ｋｇ）で３０分間処理した。グリア瘢痕化を、損傷後１４及び５６日目に測定した。脊髄組織切片を、アストロサイトマーカーＧＦＡＰ（赤色）に対する免疫組織化学に供した。対照ＩｇＧで処理されたマウスにおける脊髄の代表的な画像は図３のＡ〜Ｃに示されており、ＨＭＡｂ１で処理されたものは図３のＤ〜Ｆに示されている。病変境界は、白の点線で表示されている。ＧＦＡＰ免疫標識を、図３のＧにおける陽性染色の面積を乗じた平均強度として定量した。結果は、偽手術のＩｇＧ処理されたマウスについてのパーセンテージとして表現されている。結果は、ＳＥＭによる平均である。Ｉｇｇ ｗと比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１／テューキーのＨＳＤ ｎ＝３〜４。

0131

グリア瘢痕化は、ＳＣＩ後に抗Ｃｘ４３で処理されたマウスにおいても低下した。マウスをＳＣＩに供し、損傷後３０分の時点でＩｇＧまたは抗Ｃｘ４３抗体（Ｍ１）で処理した。損傷の２週間後、組織切片をアストロサイトマーカーＧＦＡＰの発現について解析した。代表的な画像が図４のＡ及びＢに示されている。結果は図４のＣにおいて定量されている。

0132

ＳＣＩを有するマウスは、ＨＭＡｂ１による処理後に後肢機能を回復する（図５のＡ〜Ｂ）。マウスを単回のＳＣＩに供し、損傷後にＩＰ生理食塩水、対照ＩｇＧ、またはヒト−マウスキメラ抗Ｃｘ４３抗体（ＨＭＡｂ１）（２５ｍｇ／ｋｇ）で３０分間処理した。

0133

ＨＭＡｂ１で処理されたマウスは、ＳＣＩの１４日後に、病変周辺エリアにおいてより多くのニューロン樹状突起を有することが見い出された。上で記載されるように、マウスを単回のＳＣＩに供し、損傷後にＩＰ生理食塩水、対照Ｉｇｇ、またはＨＭＡｂ１（２５ｍｇ／ｋｇ）で３０分間処理した。ニューロンマーカーＭＡＰ２に対して免疫標識することによって、ニューロン樹状突起を測定した。対照ＩｇＧで処理されたマウスにおける脊髄の免疫組織化学の代表的な画像は図６のＡ〜Ｃに示されており、ＨＭＡｂ１で処理されたものは図６のＤ〜Ｆに示されている。病変境界は、白の点線で表示されている。図６のＧに図解されるように、ＭＡＰ２免疫標識を、陽性染色の面積を乗じた平均強度として定量した。結果は、偽手術のＩｇＧ処理されたマウスについてのパーセンテージとして表現されている。

0134

ＨＭＡｂ１で処理されたマウスは、ＳＣＩの１４日後に病変周辺エリアにおいてより多くのニューロン核を有することも観察された。再度、マウスを単回のＳＣＩに供し、損傷後にＩＰ生理食塩水、対照ＩｇＧ、またはＨＭＡｂ１（２５ｍｇ／ｋｇ）で３０分間処理した。ニューロンマーカーＮｅｕＮに対して免疫標識することによって、ニューロン核を測定した。対照ＩｇＧで処理されたマウスにおける脊髄の免疫組織化学の代表的な画像は図７のＡ〜Ｃに示されており、ＨＭＡｂ１で処理されたものは図７のＤ〜Ｆに示されている。病変境界は、白の点線で表示されている。図７のＧに示されるように、ＮｅｕＮ免疫標識を、陽性染色の面積を乗じた平均強度として定量した。結果は、偽手術のＩｇＧ処理されたマウスについてのパーセンテージとして表現されている。

0135

実施例３−診断的及び癌治療的な使用
米国では、毎年、転移性乳癌によるおよそ４０，０００件の死亡がある。進行性乳癌を有する患者の約７０〜８０％は、骨格転移を発症する。骨転移のみで、乳癌治療の費用の３分の２を占める。

0136

溶骨性腫瘍成長は、骨細胞特異的Ｃｘ４３ノックアウトマウスにおいて増大することが見い出された。Ｐｙ８１１９−Ｌｕｃ細胞を、対照及びｃＫＯ雌マウスの右脛骨に注射した。左脛骨に、対照としてＰＢＳを注射した。腫瘍成長を、生物発光イメージングによって４週間毎週記録し、定量した（図８のＡ〜Ｃ）。

0137

ＭＬＯ−Ｙ４骨細胞及び初代マウス骨細胞を、Ｅ２（ポリクローナル）、ＨＭＡｂ１、及びＨＭＡｂ２抗体、またはコネキシンチャネル遮断薬であるカルベノキソロン（ＣＢＸ）とともにインキュベートした。エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）色素取り込みアッセイを実施した（図９のＡ〜Ｂ）。Ｃｘ４３ ＨＭＡｂ２抗体はヘミチャネルを活性化することが見い出された。

0138

加えて、Ｃｘ４３（Ｍ１）抗体は、インビボで骨細胞に送達され、及び脛骨負荷によって誘導されたエバンスブルー取り込みを遮断することが見い出された。エバンスブルー色素を、ＷＴ、骨細胞特異的Ｃｘ４３ ＫＯの尾静脈に注射した。マウスＩｇＧまたはＣｘ４３（Ｍ１）ｍＡｂ（２５ｍｇ／ｋｇ）を、色素注射の２時間前にｉ．ｐ．注射した。色素注射の３０分後、左脛骨に１０分間機械的負荷を１回かけた。マウスを屠殺し、ＰＢＳで灌流した。脛骨を単離し、及び固定された脛骨の骨組織切片を調製した。結果は図１０のＡ〜Ｃに示されている。

0139

ＨＭＡｂ２による溶骨性腫瘍成長の阻害も観察された。Ｐｙ８１１９−Ｌｕｃ細胞を、雌マウスの右脛骨に注射した（図１１のＡ）。左脛骨に、対照としてＰＢＳを注射した。２５ｍｇ／ｋｇにおけるＨＭＡｂ２を、４週間、週１回または週２回のいずれかでｉ．ｐ．注射した。生理食塩水を対照マウスに週２回注射した。腫瘍成長を、生物発光イメージングによって４週間毎週記録し、定量した（図１１のＢ）。

0140

実施例４−骨関節炎治療
マウスの骨から単離された初代軟骨細胞を、透過性細胞においてＣ末ドメインに対する抗Ｃｘ４３抗体（全体）で、及び非透過性細胞においてＣｘ４３Ｅ２抗体で免疫染色した（図１２）。初代軟骨細胞の細胞表面で、Ｃｘ４３発現が観察された。

0141

別の調査において、マウスの骨から単離された初代軟骨細胞を、カルベノキソロン（コネキシンチャネル遮断薬）またはＨＭＡｂ１抗体で前処理し、次いでＩＬ−１βの有りまたは無しで処理した。エチジウムブロマイド色素取り込みアッセイを実施して、ヘミチャネル活性を判定した（図１３）。初代軟骨細胞において、ＨＭＡｂ１抗体は、ＩＬ−１βによるヘミチャネル開口を阻害することが観察された。

0142

上記の実施例にあるように、脛骨負荷によって誘導されたエバンスブルー取り込みは、インビボでＣｘ４３ヘミチャネル遮断抗体によって遮断された。エバンスブルー色素を、ＷＴマウスの尾静脈に注射した。Ｃｘ４３（Ｍ１）ｍＡｂ（２５ｍｇ／ｋｇ）を、色素注射の２時間前にｉ．ｐ．注射した。色素注射の３０分後、左脛骨に１０分間機械的負荷を１回かけた。色素取り込みをエバンスブルー（ＥＢ）蛍光によって測定し、定量した（図１４）。
* * *

0143

本明細書において開示され及び主張される方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験なしで行われ得及び実行され得る。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態の観点から記載されているものの、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書において記載される方法に及び方法のステップにおいてまたはステップの配列において変動が適用され得ることは当業者に明白であろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方で関連しているある特定の作用物質は、本明細書において記載される作用物質に代わって置換され得、一方で同じまたは類似の結果が達成されることは明白であろう。当業者に明白なすべてのそのような類似の置換及び改変は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲、及び概念の内にあると見なされる。