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課題・解決手段

本発明は、抗菌効果免疫細胞活性調節機能とを共に有する新規ペプチド及びその用途に関するものである。本発明のペプチドは、兔疫細胞活性を調節する一方、グラム陰性菌及びグラム陽性菌などの各種のバクテリアに対して抗菌活性も示しており、アトピー皮膚炎のような各種の免疫疾患治療はもとより、病原性細菌の感染による疾患の治療に有用に用いられうる。

概要

背景

抗菌ペプチドは、自然界で発見されることもあり、合成ペプチドからその活性が見られることもある。このような抗菌ペプチドは、一般的なタンパク質に比べて、比較的短いアミノ酸配列(10個余り〜100個余り)からなっており、主に細胞膜に結合すれば、1)細胞膜にイオンチャネルを形成して、微生物エネルギー生成阻害するか、2)細胞膜に大きな穴を作るようになって、結果として細胞死ぬ。このように物理的に微生物を破壊するので、微生物の細胞壁や細胞内高分子合成を阻害する既存の抗生剤とは異なって、微生物が抗菌ペプチドに対する耐性を有することは非常に難しく、現在までも耐性が生じないと報告された。現在まで知られた多くの抗菌ペプチドの間で配列上の類似性は、ほとんど表われないが、構造や活性の側面では、幾つかの一般的な傾向性を示す。代表的に、抗菌ペプチドは、リシンアルギニンヒスチジンのような正電荷を帯びる部分と疎水性を有した部分とが存在するという点である。現在、抗菌ペプチドの作用機作に関連した仮説のうち、最も妥当性があるように提示されているShai−Matsuzaki−Huang(SMH)モデルでは、抗菌ペプチドの配列上の特徴と作用機転とを下記のように説明する:正電荷を帯びた新水性部分が負電荷を帯びたバクテリアの細胞膜と結合した後、細胞膜と結合されたペプチドの疎水性部分が細胞膜リン脂質(phospholipid)の疎水性部分と相互作用して、細胞膜上に穴を形成して、細胞膜の透過度を変化させることによって、細胞を破砕する。好中球(neutrophil)及びモノイトのような食細胞(phagocytic cell)から発現されるホルミルペプチド受容体族(formyl peptide receptor 1:FPR1)及びホルミルペプチド受容体(formyl peptide receptor 2:FPR2)は、病源菌感染に対する宿主対抗(defense)で重要な役割を果たす(Mangmool,S.et al.,Toxins,3:884−899,2011)。前記受容体は、百日咳毒素敏感性(pertussis toxin−sensitive)Giタンパク質と結合すると知られている(Nakashima,K.,et al.,J.Biol.Chem.,290(22):13678−91,2015)。その中でも、FPR2は、炎症性疾患で重要な役割を果たすと知られている。FPR2の活性化は、GαiサブユニットからGβγサブユニットの分離を誘導し、βγサブユニットは、ホスホリパーゼCβまたはホスホイノシタイド3−キナーゼの活性化を誘導する(Duru,E.A.,et al.,J.Surg.Res.,195(2):396−405,2015)。このような分子の活性化は、複雑な下流(downstream)信号伝逹を誘導して、走化性移動(chemotactic migration)、脱顆粒化(degranulation)、及びスーパーオキシド生成(superoxide generation)のような細胞反応多様化して、生体内免疫反応を調節する。

概要

本発明は、抗菌効果免疫細胞活性調節機能とを共に有する新規なペプチド及びその用途に関するものである。本発明のペプチドは、兔疫細胞の活性を調節する一方、グラム陰性菌及びグラム陽性菌などの各種のバクテリアに対して抗菌活性も示しており、アトピー皮膚炎のような各種の免疫疾患治療はもとより、病原性細菌の感染による疾患の治療に有用に用いられうる。

目的

本発明は、前記問題点を含んで多様な問題点を解決するためのものであって、より効率的な抗菌作用免疫活性とを同時に有する新規なペプチドを提供する

効果

実績

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請求項1

列番号1のアミノ酸配列で構成される新規抗菌及び免疫調節ペプチド

請求項2

N末端オクタノイル基(CH3(CH2)6CO−)が付加された請求項1に記載のペプチド

請求項3

C末端に1〜6個のアミノ酸が付加された請求項1または2に記載のペプチド。

請求項4

請求項1または2に記載のペプチドを有効成分として含む抗菌剤

請求項5

請求項3に記載のペプチドを有効成分として含む抗菌剤。

請求項6

請求項1または2に記載のペプチドを有効成分として含むアトピー皮膚炎治療用薬学的組成物

請求項7

請求項3に記載のペプチドを有効成分として含むアトピー皮膚炎治療用薬学的組成物。

請求項8

請求項1または2に記載のペプチドを有効成分として含むアトピー性皮膚改善用化粧料組成物

請求項9

請求項3に記載のペプチドを有効成分として含むアトピー性皮膚改善用化粧料組成物。

技術分野

0001

本発明は、新規抗菌ペプチド及びその用途に係り、さらに詳細には、抗菌効果と兔疫細胞活性調節機能とを共に有する新規なペプチド及びその用途に関する。

背景技術

0002

抗菌ペプチドは、自然界で発見されることもあり、合成ペプチドからその活性が見られることもある。このような抗菌ペプチドは、一般的なタンパク質に比べて、比較的短いアミノ酸配列(10個余り〜100個余り)からなっており、主に細胞膜に結合すれば、1)細胞膜にイオンチャネルを形成して、微生物エネルギー生成阻害するか、2)細胞膜に大きな穴を作るようになって、結果として細胞が死ぬ。このように物理的に微生物を破壊するので、微生物の細胞壁や細胞内高分子合成を阻害する既存の抗生剤とは異なって、微生物が抗菌ペプチドに対する耐性を有することは非常に難しく、現在までも耐性が生じないと報告された。現在まで知られた多くの抗菌ペプチドの間で配列上の類似性は、ほとんど表われないが、構造や活性の側面では、幾つかの一般的な傾向性を示す。代表的に、抗菌ペプチドは、リシンアルギニンヒスチジンのような正電荷を帯びる部分と疎水性を有した部分とが存在するという点である。現在、抗菌ペプチドの作用機作に関連した仮説のうち、最も妥当性があるように提示されているShai−Matsuzaki−Huang(SMH)モデルでは、抗菌ペプチドの配列上の特徴と作用機転とを下記のように説明する:正電荷を帯びた新水性部分が負電荷を帯びたバクテリアの細胞膜と結合した後、細胞膜と結合されたペプチドの疎水性部分が細胞膜リン脂質(phospholipid)の疎水性部分と相互作用して、細胞膜上に穴を形成して、細胞膜の透過度を変化させることによって、細胞を破砕する。好中球(neutrophil)及びモノイトのような食細胞(phagocytic cell)から発現されるホルミルペプチド受容体族(formyl peptide receptor 1:FPR1)及びホルミルペプチド受容体(formyl peptide receptor 2:FPR2)は、病源菌感染に対する宿主対抗(defense)で重要な役割を果たす(Mangmool,S.et al.,Toxins,3:884−899,2011)。前記受容体は、百日咳毒素敏感性(pertussis toxin−sensitive)Giタンパク質と結合すると知られている(Nakashima,K.,et al.,J.Biol.Chem.,290(22):13678−91,2015)。その中でも、FPR2は、炎症性疾患で重要な役割を果たすと知られている。FPR2の活性化は、GαiサブユニットからGβγサブユニットの分離を誘導し、βγサブユニットは、ホスホリパーゼCβまたはホスホイノシタイド3−キナーゼの活性化を誘導する(Duru,E.A.,et al.,J.Surg.Res.,195(2):396−405,2015)。このような分子の活性化は、複雑な下流(downstream)信号伝逹を誘導して、走化性移動(chemotactic migration)、脱顆粒化(degranulation)、及びスーパーオキシド生成(superoxide generation)のような細胞反応多様化して、生体内免疫反応を調節する。

発明が解決しようとする課題

0003

本発明は、前記問題点を含んで多様な問題点を解決するためのものであって、より効率的な抗菌作用免疫活性とを同時に有する新規なペプチドを提供することを目的とする。

0004

本発明は、同時に、前記ペプチドを含む抗菌剤アトピー皮膚炎治療用薬学的組成物、及びアトピー性皮膚改善用化粧料組成物など、前記ペプチドの多様な用途を提供することを目的とする。

0005

しかし、このような課題は、例示的なものであって、これにより、本発明の範囲が限定されるものではない。

課題を解決するための手段

0006

本発明の一観点によれば、配列番号1のアミノ酸配列で構成される新規な抗菌及び免疫調節ペプチドが提供される。

0007

本発明の他の一観点によれば、前記ペプチドを有効成分として含む抗菌剤が提供される。

0008

本発明のさらに他の一観点によれば、前記ペプチドを有効成分として含むアトピー皮膚炎治療用薬学的組成物が提供される。

0009

本発明のさらの他の一観点によれば、前記ペプチドを有効成分として含むアトピー性皮膚改善用化粧料組成物が提供される。

発明の効果

0010

本発明の一実施例による抗菌ペブタイは、グラム陽性菌及びグラム陰性菌など多様な細菌に対する非常に高い抗菌活性を有しているだけではなく、アトピー性皮膚炎に対する治療効果を有しているために、抗生剤はもとより、皮膚外用剤、またはアトピー性皮膚炎緩和用化粧料組成物など多様な用途として使われる。

図面の簡単な説明

0011

本発明の一実施例による配列番号1で記載されるアミノ酸配列を有し、N末端オクタノイル基が付加されたペプチドのグラム陽性菌(Staphylococcus epidermidis及びStaphylococcus aureus)及びグラム陰性菌(Pseudomonas aeruginosa、Escherichia coli)に対する抗菌活性を確認した結果を示すグラフである。
本発明の一実施例による配列番号1で記載されるアミノ酸配列を有するペプチドの兔疫細胞でFPR2依存的な細胞内カルシウムイオン増加活性を示したものであって、Aは、RBL細胞、RBL細胞でFPR2とFPR1とをそれぞれ過発現させた細胞でペプチドのFL比率を示すグラフであり、Bは、FPR2が過発現されたRBL細胞で配列1ペプチドの濃度によるカルシウムイオン増加活性を示すグラフである。
本発明の一実施例によるカプサイシン誘導アトピー皮膚炎モデルで、前記ペプチド処理時に、実験過程図式化したものである。
本発明の一実施例による前記ペプチド処理時に、カプサイシン誘導アトピー皮膚炎モデルで真皮、真皮の適用部位皮膚炎改善効果の確認結果を示すものであって、Aは、カプサイシンを処理してアトピー皮膚炎を誘発させた新生ネズミ(Neo−Cap)での皮膚炎改善効果を示すグラフであり、Bは、カプサイシンを処理してアトピー皮膚炎を誘発させた2週齢家ネズミ(2W Cap)での皮膚炎改善効果を示すグラフである。
本発明の一実施例による前記ペプチド(NCP112)処理時に、新生モデル動物(Neo−Cap、A)及び2週齢モデル動物(2W Cap、B)のペプチド処理後、時間経過(3週〜5週)による皮膚状態対照群と比較して撮影した一連写真である。
本発明の一実施例による前記ペプチド(NCP112)をそれぞれ新生モデル動物(Neo−Cap、上段)及び2週齢モデル動物(2W Cap)に処理し、5週経過後の皮膚組織状態を顕微鏡を観察した組織染色写真(左側パネル)及び上皮の厚さを測定した結果を示すグラフ(右側パネル)である。

0012

用語の定義:
本明細書で使われる用語を定義すれば、下記の通りである。

0013

本明細書で使われる用語「免疫調節ペプチド」は、非兔疫グロブリンタンパク質形態を有していながら、直接または間接に抗菌及び抗ウイルス作用炎症反応調節、ナチュラルキラー細胞natural killer cell)刺激抗体依存性細胞傷害(antibody dependent cellular cytotoxicity)調節のような免疫強化作用を行うペプチドを意味する。他の意味としては、前記遺伝子によって解毒されたタンパク質は、好中球及びモノサイトのような食細胞から発現されるホルミルペプチド受容体族(FPR1)及びホルミルペプチド受容体(FPR2)は、病源菌感染に対する宿主の対抗で重要な役割を果たす。前記受容体は、百日咳毒素−敏感性Giタンパク質と結合すると知られている。FPR1とFPR2との活性化は、GαiサブユニットからGβγサブユニットの分離を誘導し、βγサブユニットは、ホスホリパーゼCβまたはホスホイノシタイド3−キナーゼの活性化を誘導する。このような分子の活性化は、複雑な下部シグナリングを誘導して、走化性移動、脱顆粒化、及びスーパーオキシド生成のような細胞反応を多様化する。

0014

本明細書で使われる用語「抗菌ペプチド」は、一般的に比較的単純な構造からなる陽イオン性ペプチド(cationic peptide)化合物であって、グラム陽性菌(gram−positive bacteria)、グラム陰性菌(gram−negative bacteria)、真菌ウイルスなどに対する幅広抗菌スペクトルを有しており、その機転が完全に明らかにされていないが、一般的に微生物の細胞膜を破壊する作用機転を通じて抗菌力を示すと知られている。

0015

本明細書で使われる用語「アトピー皮膚炎」は、乳児小児とで最も平凡な炎症性皮膚疾患であって、激しいそう痒感、紅斑浮腫滲出痂皮、隣蘚化などを特徴とし、再発が多く、慢性に経過し、反復的な掻爬による擦傷と苔蘚化など2次的な病変が特徴的に表われる。

0016

発明の詳細な説明:
以下、本発明をより詳しく説明する。

0017

本発明の一観点によれば、配列番号1のアミノ酸配列で構成される新規な抗菌及び免疫調節ペプチドが提供される。

0018

前記ペプチドは、N末端にオクタノイル基(octanoyl group、CH3(CH2)6CO−、以下、‘Oct−’と略称する)が付着されたものであり、C末端に1〜6個のアミノ酸が付加されたものである。

0019

本発明の他の一観点によれば、前記ペプチドを有効成分として含む抗菌剤が提供される。

0020

前記抗菌剤は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌に対して抗菌活性を有し、前記グラム陰性菌は、大腸菌(E.coli)、サルモネラ菌(Salmonella sp.)、ビブリオ菌(Vibrio sp.)または緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)であり、前記グラム陽性菌は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、ニキビ菌(Propionibacterium acnes)または虫歯菌(Streptomyces mutans)であり得る。

0021

本発明のさらに他の一観点によれば、前記ペプチドを有効成分として含むアトピー皮膚炎治療用薬学的組成物が提供される。

0022

前記ペプチドを有効成分として含む薬学的組成物は、塩水、緩衝塩水、デキストロース、水、グリセロール、及びエタノールから選択される薬学的希釈剤のうち、1種以上含み、希釈剤は、これに限定されるものではない。

0023

前記薬学組成物は、投与目的及び疾病によって異なるように適用可能である。実質的に投与される活性成分の量は、多様な関連要素、すなわち、治療しようとする疾病、患者状態の程度、他の薬剤(例えば、走化性薬剤)と共同投与有無、患者年齢性別、体重、食べ物、投与時間、投与経路、及び組成物の投与比率(ratio)を考慮して決定しなければならない。前記組成物は、投与量及び投与経路が疾病の形態及び深刻性によって調節されるが、一日に一回または1〜3回に分けて投与される。

0024

本発明のペプチドまたは物質を含む組成物は、経口または非経口投与される。非経口投与は、経口以外の投与経路、すなわち、直腸静脈腹膜及び筋肉動脈経皮鼻腔(nasal)、吸入眼球、及び皮下を通じる薬剤投与を意味する。前記ペプチドまたは物質を含む薬学組成物は、経口投与形態注入可能な溶液または局所製剤のような如何なる形態でも製剤化される。製剤化は、経口及び注入可能な投与(真溶液(true solution)、懸濁液またはエマルジョン)に適するように製造されることが望ましく、錠剤カプセル軟質カプセル水性薬剤丸剤顆粒のような経口形態で製造されることが最も望ましい。前記製剤化で、本発明のペプチドは、賦形剤(excipient)なしに軟質カプセルに充填され、担持体と混合されるか、希釈された後に適当な製剤で作られる。適した担持体の例としては、澱粉、水、塩水、リンゲル液、デキストロースなどがある。

0025

本発明のさらに他の一観点によれば、前記ペプチドを含むアトピー皮膚改善用化粧料組成物が提供される。

0026

前記化粧料組成物は、化粧料組成物の剤型に使われる1つ以上の添加剤を含みうる。例えば、そのような添加剤には、1,3−ブチレングリコール大豆リン脂質コリンスフィンゴシンコレステロールツイン80、フィトスフィンゴシンサリチル酸皮膚保湿剤(湿潤剤)、柔軟剤天然オイルケラチンリポイド吸収水溶性物質角質層セラミド表皮脂質酸性膜脂肪酸コレステリルエステル、エタノール、蒸留水などが含まれうる。

0027

以下、本発明は、実施例及び実験例を通じてさらに詳しく説明される。しかし、本発明は、以下で開示される実施例及び実験例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態として具現可能なものであって、以下の実施例及び実験例は、本発明の開示を完全にし、当業者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。

0028

実施例1:抗菌ペプチドの製造
本発明者らは、基礎スクリーニングを通じて抗菌活性を有する配列番号1で記載されるアミノ酸配列(KFKWRYm)で構成されたペプチドを探索した。前記ペプチドのアミノ酸配列で、大文字は、通常のL型のアミノ酸を示し、小文字mは、D型メチオニン(methionine)を示す。前記ペプチドは、通常のアミノ酸合成法(Umbarger,H.E.,Ann.Rev.Biochem.,47:533−606,1978)を用いて製造可能である。

0029

実施例2:抗菌ペプチドの修飾
本発明者らは、前記実施例1から基礎探索されたペプチドの抗菌活性をより向上させるために、パルミトイル基、オクタノイル基など多様な脂質成分を、前記ペプチドのN末端に付着させた修飾ペプチドを合成して、抗菌活性を調査した。その結果、オクタノイル基が付着された修飾ペプチドが最も活性が良いと確認されて、以後、実験例では、Oct−KFKWRYmペプチド(以下、‘NCP112’と名付ける)を使用した。

0030

実験例1:新規なペプチドの抗菌活性の実験
前記実施例2から製造されたペプチドの抗菌活性を測定するために、抗菌検査を行った。グラム陽性菌(Staphylococcus epidermidis及びStaphylococcus aureus)とグラム陰性菌(Pseudomonas aeruginosa及びE.coli)とを準備して、寒天平板培地に4次塗抹して、36℃培養器で一晩中培養した。翌日、寒天平板培地上に生成された菌株コロニーを3ml栄養培地接種して、36℃、220rpmの条件で撹拌培養器で一晩中培養した。翌日、各菌を希釈して、600nmで吸光度を測定して、0.5になるように調整した。その後、栄養培地に1:100比率で希釈した。その後、前記実施例2から製造されたペプチドを栄養培地に0、1.25、2.5、5、10、及び20μMの濃度に順次希釈して、1mlずつ製造した後、前記希釈された菌1mlを接種した。引き続き、36℃、220rpmの条件で撹拌培養18時間培養した後、600nmでの吸光度を測定して、結果を分析した。

0031

その結果、図1で示すように、本発明の一実施例によるペプチドは、濃度依存的に試験したあらゆる菌に対して抗菌活性を示した。特に、10μMの濃度では、4種の菌の生育を完全に抑制させた。4種の菌のうち、緑膿菌(P.aeruginosa)の場合、抗菌効果が最も良いと表われた。

0032

実験例2:FPRL1を通じる細胞内Caイオン活性の分析
本発明者らは、引き続き、本発明の一実施例による前記ペプチドが、生体免疫機能を活性化させるか否かを確認するために、カルシウムイオン透過性の変化を観察した。具体的に、前記ペプチドがFPR2を活性化させるかを確認するために、細胞内カルシウムイオンの濃度を測定した。このために、FPR2を発現していないRBL細胞とRBL細胞でFPR1を過発現させた細胞(FPR1−RBL)とFPR2を過発現させた細胞(FPR2−RBL)とを使用し、細胞内カルシウムイオンの遊離を敏感に測定可能な方法としてカルシウム結合力が強い染色物質であるFura−2/AMを利用した。すなわち、細胞を10%ウシ胎児血清が含有されたRPMI培地に培養し、対数期状態である時(mid−log phase、1−3×107細胞/ml)、遠心分離して収穫した後、ウシ胎児血清が含有されていないRPMI培地で数回洗浄し、それを1×107細胞/mlになるようにRPMI培地に再懸濁した。引き続き、最終3μM濃度のFura−2/AMを添加し、37℃、5% CO2培養器で45分間撹拌し続けながら培養した。適正時間が経過した後、細胞を収穫して、再びRPMI培地で数回洗浄した後、それを250μM濃度のスルフィンピラゾンが添加された適正量のRPMI培地に懸濁して、細胞内に入ったFura−2の細胞外部への流失を防止した。約2×106個の細胞を毎回取って、急速遠心分離で収穫し、それをカルシウムイオンが添加されず、EGTAが添加されたロック(Locke)溶液1mlに再懸濁して、分光光度計上で340nm及び380nmの2つの波長での吸光度比モニタリングしたが、1分間隔で本発明の一実施例によるペプチドを濃度を異ならせて(1μM、0.1μM及び0.01μM)処理した後、2つの波長での吸光度差を調査し、それを後でグリキーウィクツ(Grynkiewicz)の方法によって細胞内に遊離されたカルシウムイオンの濃度に換算した。その結果は、図2に示されたように、本発明の一実施例によるペプチドの処理時に、FPR2−RBL細胞のみで特異的に細胞内カルシウムイオンが急増し(A)、ペプチド処理によるカルシウムイオンの細胞内濃度増加量は、濃度依存的な態様を示した(B)。これは、本発明の一実施例によるペプチドが、FPR2への結合及び活性化を通じて個体の免疫機能を調節することができるという点を示唆するものである。

0033

実験例3:アトピー皮膚炎モデルでの皮膚炎の改善効果
3−1:外形的変化の分析
これにより、本発明者らは、本発明の一実施例による前記ペプチドが実際生体内で免疫機能を活性化させることによって、免疫関連疾患を治療することができるか否かを確認するために、アトピー動物モデルに前記ペプチドを処理して、アトピー皮膚炎の症状を改善することができるか否かを調査した。具体的に、発明者は、カプサイシン誘導アトピー皮膚炎モデルで皮膚炎の改善効果があるか否かを確認するために、本発明の一実施例によるペプチド(NCP112)をアトピーモデル動物で(Neo−Cap及び2W Cap)のアトピー誘発皮膚組織の真皮、真皮適用部位及び掻いた部位に処理した後、皮膚改善程度を観察した。前記Neo−Capは、生まれてから48時間以内の新生家ネズミ(Sprague Dawley rat)の背中の皮膚に50mg/kgのカプサイシンを皮下注射して、アトピー皮膚炎を誘発させたものであって、アトピー皮膚炎の代表的モデル動物である。2W Capは、2週齢家ネズミに25mg/kgのカプサイシンを2回皮下注射して、アトピー皮膚炎を誘発させたモデル動物であって、青少年期あるいは成人発病アトピー皮膚炎を模写するモデルである。

0034

具体的な実験処置過程は、図3に示されている。Neo−Capモデルでは、カプサイシン注射2週後に皮膚炎点数を測定した後、対照群(PBS)とNCP112とを10μMの濃度で毎日背中(200μl)と両(50μl)とに塗布し、1週間間隔で3週間皮膚炎点数を測定した。皮膚炎点数は、顔、耳、背中(total)と耳、背中(application site)で皮膚状態によって点数を測定し、開始点である2週目での点数を1にして標準化して、図4に示したが、その基準は、下記表1のようである。

0035

0036

2W−Capモデルでは、カプサイシン注射1週後に皮膚炎点数を測定した後、対照群(PBS)とNCP112とを10μMの濃度で毎日背中(200μl)と両耳(50μl)とに塗布し、1週間間隔で2週間Neo−Capモデルのような方式で皮膚炎点数を測定した。開始点である3週での点数を1にして標準化して、図4に示した。

0037

3−2:アトピー皮膚炎の皮膚組織病理及び厚さの評価
前記実験例3−1で分析したマウスを、本発明の一実施例によるペプチド処理5週経過後、犠牲させた後、カプサイシン処理によって皮膚炎が誘発された部位の皮膚組織を3×3cm程度のサイズに摘出した後、該摘出された皮膚組織を2〜3日程度4%パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)溶液に固定した。該固定された組織は、再び1×0.5cmのサイズに再び細分化して、組織用カセット(cassette)に入れて、Tissue processor(Leica microsystems,Germany)で脱水、透明、パラフィン化過程を経て−20℃で保管した。薄切を行うために、Microtome(Leica microsystems,Germany)でパラフィンブロックを5μmの厚さに切った後、薄く切られた組織リボンは、恒温水槽に浮かべて平らにした後、スライドガラスに組織の切片を付着し、40℃加熱板(heating plate)で乾燥させた。マウス皮膚組織の病理学的評価を行うために、皮膚組織の切片をキシレン(xylene)で3分ずつ3回脱パラフィンを行い、70〜100%エタノールにそれぞれ1分ず浸す順序で最後に蒸留水で水洗を行い、ヘマトキシリン溶液に浸して組織細胞核部位を染色し、蒸留水で水洗した後、再びエオシン細胞質を染色した。該染色された組織は、脱パラフィン過程の逆行で70〜100%エタノールからキシレン順に進行し、最後に包埋剤(embedding reagent)を塗布した後、カバーガラスを覆って封入した。光学顕微鏡観察を行うために、200×の倍率で染色された組織を撮影して、病理学的評価を行った。図5は、経時的なアトピー皮膚炎が誘発された部位の皮膚組織の状態を撮影した写真であり、図6は、アトピー皮膚炎が誘発された部位の皮膚組織に対する組織染色結果を示す光学顕微鏡写真であって、Neo−Cap及び2W Cap群いずれも対照群は、上皮が厚くなって、典型的なアトピー皮膚炎の症状を示したが、本発明の一実施例によるペプチド処理群(NCP112)の場合、Neo−Capでは、上皮層の厚さがやや減少し、2W Cap群では、顕著に減少して、ほぼ正常レベル回復したことを確認した。したがって、本発明の一実施例によるペプチドは、動物実験の結果、Neo−Cap及び2W Capモデルいずれもでアトピー皮膚炎症状を改善する効果があり、特に、2W Capモデル動物では、ほぼ正常状態匹敵する皮膚状態を示して、非常に効率的であるということを確認することができた。

実施例

0038

本発明は、前述した実施例及び実験例を参考にして説明されたが、これは例示的なものに過ぎず、当業者ならば、これより多様な変形及び均等な他実施例及び実験例が可能であるという点を理解できるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、添付の特許請求の範囲の技術的思想によって決定されるべきである。

0039

本発明の一実施例による抗菌ペプチドは、グラム陽性菌(Staphylococcus epidermidis及びStaphylococcus aureus)とグラム陰性菌(Pseudomonas aeruginosa及びE.coli)のような多様な細菌に対する抗菌活性を示すだけではなく、アトピー性皮膚炎モデル動物に対するアトピー性皮膚炎症状改善効果が明らかなために、各種の抗生剤、特に、皮膚外用抗生剤はもとより、アトピー性皮膚炎改善用機能性化粧品などの原料として使用可能である。

0040

配列リストフリーテキスト
配列番号1は、本発明の一実施例による抗菌ペプチドのアミノ酸配列である。

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