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図面 (20)

課題・解決手段

ATRタンパク質キナーゼ阻害する新規化合物には、本明細書に開示する式(I)の化合物、ならびにATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物を含むリポソーム製剤が含まれる。この組成物は、がん治療に有用である。

概要

背景

血管拡張性失調症及びRad3関連(ATRキナーゼは、細胞DNA損傷修復プロセス及び細胞周期シグナル伝達関与すると考えられるセリンスレオニンプロテインキナーゼである。ATRキナーゼは、ATM(「血管拡張性失調症変異」)キナーゼ及び他のタンパク質とともに作用し、一般的にDNA損傷応答(「DDR」)と呼ばれるDNA損傷に対する細胞の応答を調節する。DDRは、修復のための時間を提供する細胞周期チェックポイント活性化することによって、DNA修復刺激し、生存を促進し、細胞周期の進行を停止させると考えられている。DDRがなければ、細胞はDNA損傷に対してはるかに感受性があり、DNA複製などの内在性細胞プロセス、またはがん治療に一般的に用いられる外因性DNA傷害剤によって誘導されるDNA損傷によって容易に死滅する。

ATR機能の破壊(例えば遺伝子欠損による)は、DNA傷害剤の非存在下及び存在下の両方においてがん細胞死を促進することが示されている。ATRの変異は、及び子宮内膜の癌に関連し、電離放射線に対する感受性の増加及び細胞周期チェックポイントの消失につながる。ATRは体細胞生存能力に必須であり、ATRの欠損は損傷チェックポイント応答の喪失及び細胞死をもたらすことが示されている。Cortez et al.,Science 294:1713−1716(2001)参照。ATRは脆弱な部位の安定性にも不可欠であり、Seckel症候群患者においてはATR発現の低さから、複製ストレス後の染色体破壊が増加する。Casper et al.,Am.J.Hum.Genet 75:654−660(2004)参照。複製タンパク質A(RPA)複合体は、ATR及びその相互作用タンパク質ATRIPをDNA損傷部位に動員し、ATR自体がCHKシグナル伝達カスケードの活性化を媒介する。Zou et al.,Science 300:1542−1548(2003)参照。ATRは、関連するチェックポイントキナーゼATMと同様に、カスケード内上流においてRAD17をリン酸化し、これはDNA損傷細胞のチェックポイントシグナリングに重要である。Bao et al.,Nature 411:969−974(2001)参照。ATRは哺乳類初期胚において、不完全なDNA複製を感知し、分裂期細胞死を防ぐために特に必須であると考えられている。

概要

ATRタンパク質キナーゼ阻害する新規化合物には、本明細書に開示する式(I)の化合物、ならびにATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物を含むリポソーム製剤が含まれる。この組成物は、がんの治療に有用である。

目的

式(I)の化合物は、好ましくは、Rにおいて、所望のATR阻害及び/またはリポソーム形成ならびに安定性特性を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
0件

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請求項1

式(Ia)のATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物:(式中、R′が、9.5以上のpKaを有する第三級アルキル置換アミンを含むアルキルアミノ部分である)またはその薬学的に許容可能な塩。

請求項2

化合物5の式の化合物:またはその薬学的に許容可能な塩。

請求項3

化合物6の式の化合物:またはその薬学的に許容可能な塩。

請求項4

ATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物、またはその薬学的に許容可能な塩をリポソーム封入して含み、実施例8に従って測定する、マウスにおいて少なくとも約5時間の血漿半減期を有する、リポソーム組成物

請求項5

前記ATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物が化合物Aである、請求項4に記載のリポソーム組成物。

請求項6

前記ATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物が、式(I)の化合物:(式中、Rが、7.0より大きい(好ましくは8.0より大きく、最も好ましくは少なくとも約9.5の)pKaを有するアミンを含む部分である)またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項4に記載のリポソーム組成物。

請求項7

前記ATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物が、以下からなる群:から選択される化合物である、請求項4に記載のリポソーム組成物。

請求項8

前記ATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物が、以下からなる群:から選択される化合物である、請求項4に記載のリポソーム組成物。

請求項9

前記リポソームが、水素ダイズホスファチジルコリン(HSPC)及びコレステロールを含む、請求項4〜8のいずれか一項に記載の組成物

請求項10

前記リポソームが、PEG(2000)−ジステアロイルグリセロール(PEG−DSG)をさらに含む、請求項9に記載の組成物。

請求項11

前記リポソームが、約3:2:0.15のモル比で、HSPC、コレステロール及びPEG−DSGを含む、請求項10に記載の組成物。

請求項12

a.リン脂質及びコレステロールを含むベシクル中にカプセル化したスクロースオクタ硫酸をカプセル化するリポソームを形成し;及びb.前記ATRタンパク質キナーゼ阻害剤を前記リポソームに充填するのに有効な条件下で、工程(a)の前記リポソームを前記ATRタンパク質キナーゼ阻害剤と接触させる工程を含むプロセスによって得られる、請求項4〜11のいずれか一項に記載の組成物。

請求項13

前記リポソームを前記ATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物と接触させる前に、硫酸アンモニウムが約1.1Mの濃度を有する、請求項12に記載の組成物。

請求項14

前記ATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物が化合物Aである、請求項4に記載のリポソーム組成物。

請求項15

前記ATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物が化合物1である、請求項4に記載のリポソーム組成物。

技術分野

0001

関連技術
本出願は、2016年1月11日に出願された米国仮特許出願第62/277,262号、2016年11月10日に出願された米国仮特許出願第62/420,258号、及び2017年1月9日に出願された米国仮特許出願第62/444,172号の優先権を主張し、これらの文献の各々は、あらゆる目的のために、その全体を参照として本出願に援用する。

0002

分野
本開示は、がん治療に有用な方法及び化合物を含む、血管拡張性失調症及びRad3関連タンパク質ATR)を阻害する化合物及び関連する方法に関する。

背景技術

0003

血管拡張性失調症及びRad3関連(ATR)キナーゼは、細胞DNA損傷修復プロセス及び細胞周期シグナル伝達関与すると考えられるセリンスレオニンプロテインキナーゼである。ATRキナーゼは、ATM(「血管拡張性失調症変異」)キナーゼ及び他のタンパク質とともに作用し、一般的にDNA損傷応答(「DDR」)と呼ばれるDNA損傷に対する細胞の応答を調節する。DDRは、修復のための時間を提供する細胞周期チェックポイント活性化することによって、DNA修復刺激し、生存を促進し、細胞周期の進行を停止させると考えられている。DDRがなければ、細胞はDNA損傷に対してはるかに感受性があり、DNA複製などの内在性細胞プロセス、またはがん治療に一般的に用いられる外因性DNA傷害剤によって誘導されるDNA損傷によって容易に死滅する。

0004

ATR機能の破壊(例えば遺伝子欠損による)は、DNA傷害剤の非存在下及び存在下の両方においてがん細胞死を促進することが示されている。ATRの変異は、及び子宮内膜の癌に関連し、電離放射線に対する感受性の増加及び細胞周期チェックポイントの消失につながる。ATRは体細胞生存能力に必須であり、ATRの欠損は損傷チェックポイント応答の喪失及び細胞死をもたらすことが示されている。Cortez et al.,Science 294:1713−1716(2001)参照。ATRは脆弱な部位の安定性にも不可欠であり、Seckel症候群患者においてはATR発現の低さから、複製ストレス後の染色体破壊が増加する。Casper et al.,Am.J.Hum.Genet 75:654−660(2004)参照。複製タンパク質A(RPA)複合体は、ATR及びその相互作用タンパク質ATRIPをDNA損傷部位に動員し、ATR自体がCHKシグナル伝達カスケードの活性化を媒介する。Zou et al.,Science 300:1542−1548(2003)参照。ATRは、関連するチェックポイントキナーゼATMと同様に、カスケード内上流においてRAD17をリン酸化し、これはDNA損傷細胞のチェックポイントシグナリングに重要である。Bao et al.,Nature 411:969−974(2001)参照。ATRは哺乳類初期胚において、不完全なDNA複製を感知し、分裂期細胞死を防ぐために特に必須であると考えられている。

先行技術

0005

Cortez et al.,Science 294:1713−1716(2001)
Casper et al.,Am.J.Hum.Genet 75:654−660(2004)
Zou et al.,Science 300:1542−1548(2003)
Bao et al.,Nature 411:969−974(2001)

発明が解決しようとする課題

0006

しかしながら、DNA損傷化学療法剤及び電離放射線(IR)療法が、がん患者に初期の治療上の利点を提供してきた一方で、既存の療法は臨床効果を失っていた(例えば、腫瘍細胞DNA修復応答のために)。ATR阻害剤及びDNA傷害剤のin vivo効果は、正常な細胞に比べて、がんの選択的治療において、特にG1チェックポイント制御(生存のためにATRに依存する可能性がある)を欠損した腫瘍細胞の治療において、一定の可能性が示されている。

0007

単剤としてまたは併用療法の一部として(例えば、化学療法及び/または放射線療法と併用して)、がんの治療のためにATR阻害剤を送達するための強力で選択的な治療法の開発が依然として必要とされている。

課題を解決するための手段

0008

概要
本発明者らは、血管拡張性失調症及びRad3関連(ATR)キナーゼの阻害ならびにがんの治療に有用な新規化合物、ならびに所望の特性(例えば、血液循環系における半減期延長及び腫瘍の治療における有効性)を有するATRタンパク質キナーゼの特定の阻害剤のリポソーム製剤を見出した。本発明は、ATRタンパク質キナーゼを阻害するための特定の新規化合物、ならびにATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物の特定のリポソーム製剤の延長された血漿半減期及び増強された抗腫瘍効果発見に部分的に基づいている。

0009

第一の実施形態では、式(I)の新規化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、血管拡張性失調症及びRad3関連(ATR)キナーゼの阻害ならびにがんの治療に有用であり:

0010

0011

式中、Rは、7.0超(好ましくは8.0超、最も好ましくは少なくとも約9.5)のpKaを有するアミンを含む部分である。式(I)の化合物は、好ましくは、Rにおいて、所望のATR阻害及び/またはリポソーム形成ならびに安定性特性を提供するように選択された1つ以上の第三級アミン部分を含む。いくつかの実施例では、Rは、好ましくは第二の第三級置換窒素を含むアルキルアミノ部分で置換された第一の第三級置換窒素を含む複素環式部分である。特に、式(I)の化合物は、式:

0012

0013

の部分であり得るRを含む。

0014

式中、A1は、存在しないか、またはアルキル(例えば、C1−C4アルキル(好ましくは−(CH2)2−)であり、R1は、低級(例えば、C1−C4)アルキルアミノである。一実施形態では、R1は、(C1−C4アルキル)−NRaRbであり、Ra及びRbは、それぞれ独立して、C1−C4アルキル、例えば、R1は−(CH2)2−N(CH3)(CH3)である。別の実施形態では、R1はNRaRbであり、Ra及びRbは、それぞれ独立して、C1−C4アルキル、例えば、R1は−N(CH2CH3)(CH2CH3)である。

0015

式(I)の別の実施形態では、Rが−N(H)(C1−C4アルキル)−NRaRbであり、式中、Ra及びRbが、それぞれ独立してC1−C4アルキルであるか、またはRが−(G)−NRaRbであり、式中、Ra及びRbが、それぞれ独立してC1−C4アルキルであり、GがC1−C4アルキルであり、Gは、C1−C4アルキルでさらに置換されていてもよい。

0016

式(I)の別の実施形態では、Rは、式:

0017

0018

の部分であり得、
式中、Rc及びRdは、それぞれ独立して、C1−C4アルキルである。

0019

好ましい例として、化合物1、2、3、4、5、または6からなる群から選択される化合物を含むリポソームが挙げられる:

0020

0021

第二の実施形態では、ATR阻害剤化合物のリポソーム製剤は、1つ以上のリポソーム形成脂質(例えば、水素ダイズホスファチジルコリン(HSPC))、コレステロール及びポリマー結合脂質(例えば、メトキシポリエチレングリコール)−1,2−ジステアロイル−sn−グリセリル(PEG2000−DSG)から形成される単層ベシクル中に、ポリアニオン(例えば、スクロースオクタ硫酸などのポリアニオン化糖、または適切なポリアニオン化ポリオール)でカプセル化した式(I)の化合物または他のATR阻害化合物複数可)(例えば、比較化合物A)を含み得る。リポソーム形成脂質は、好ましくは、所望の量のリポソーム膜剛性を提供し、その一方でリポソームからの式(I)の化合物の漏出量を十分に低く維持するように選択されたリン脂質(複数可)とコレステロールの比を有する、1つ以上のリン脂質を含む。ポリマー結合脂質の種類及び量は、血流中において、望ましいレベルタンパク質結合、リポソーム安定性及び循環時間を提供するように選択することができる。いくつかの例では、リポソームベシクルは、モル比3:2のHSPC及びコレステロールを含む。特に、リポソームは、モル比3:2:0.15のHSPC、コレステロール及びPEG2000−DSGからなるベシクルを含み得る。式(I)の化合物は、適切なポリアニオン、例えばスクロースオクタ硫酸を用いてリポソーム内封入することができる。いくつかの例では、リポソームは、式(I)の化合物及びスクロースオクタ硫酸を、式(I)の化合物及びスクロースオクタ硫酸の化学量論比で、またはそれに近い比で封入する。

0022

特定の一実施例は、モル比3:2:0.15のHSPC、コレステロール及びPEG2000−DSGから形成されるベシクルを有し、スクロースオクタ硫酸及び化合物5をカプセル化するリポソームを提供する。別の実施例は、モル比3:2:0.15のHSPC、コレステロール及びPEG2000−DSGから形成されるベシクルを有し、スクロースオクタ硫酸及び化合物5をカプセル化するリポソームを提供する。

0023

別の特定の実施例は、モル比3:2:0.15のHSPC、コレステロール及びPEG2000−DSGから形成されるベシクルを有し、スクロースオクタ硫酸及び化合物6をカプセル化するリポソームを提供する。

0024

別の特定の実施例は、モル比3:2:0.15のHSPC、コレステロール及びPEG2000−DSGから形成されるベシクルを有し、スクロースオクタ硫酸及び化合物Aをカプセル化するリポソームを提供する。

0025

本明細書に開示するATR阻害剤化合物及び/またはそのリポソーム製剤は、治療及び治療方法に使用することができる。いくつかの実施形態では、治療はがんの治療である。治療として使用する場合、リポソーム組成物は、1つ以上の他の化合物または組成物を用いた(例えば、MM−398などのイリノテカン

0026

0027

リポソーム製剤と併用した)治療レジメンで使用してもよい。1つ以上の他の化合物または組成物を用いたリポソーム組成物の投与は、同時、別々または連続的であってもよい。1つ以上の他の化合物または組成物は、さらなる治療薬、例えば、さらなる抗がん剤であってもよく、または治療剤マイナス副作用を改善するように設計された化合物であってもよい。

図面の簡単な説明

0028

本明細書に開示する特定の化合物の製造に有用な第一の化学反応スキームである。
本明細書に開示する特定の化合物の製造に有用な第二の化学反応スキームである。
本明細書に開示する特定の化合物の製造に有用な第三の化学反応スキームである。
本明細書に開示する特定の化合物の製造に有用な第四の化学反応スキームである。
実施例8に記載する、リポソームATR阻害剤の血液薬物動態を示すグラフである。
実施例9Aに記載する、子宮頸部MS751異種移植片モデルにおけるMM−398と併用したリポソーム化合物Aの抗腫瘍効力を示すグラフである。
実施例9Aに記載する、子宮頸部C33A異種移植片モデルにおけるMM−398と併用したリポソーム化合物Aの抗腫瘍効力を示すグラフである。
実施例9Aによる、子宮頸部C33A異種移植片モデルにおけるMM−398と併用したリポソーム化合物Aの抗腫瘍効力を示すグラフである。
実施例9Aによる、子宮頸部MS751におけるMM−398と併用したリポソーム化合物Aの忍容性を示すグラフである。
実施例10に記載するように、NCI−H2170(図10A)及びDMS−114(図10B)マウス異種移植片モデルにおけるMM−398と併用したリポソーム化合物5の効力を示すグラフである。
実施例10に記載するように、NCI−H2170(図11A)及びDMS−114(図11B)マウス異種移植片モデルにおけるMM−398と併用したリポソーム化合物5の効力を示すカプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフである。
NCI−H2170(図12A)及びDMS−114(図12B)マウス異種移植片モデルにおけるMM−398と併用したリポソーム化合物5の忍容性を示すグラフである。
実施例11に記載する、Calu−6(図13A)及びCOLO−699(図13B)マウス異種移植片モデルにおけるMM−398と併用したリポソーム化合物5の効力を示すグラフである。
肺癌細胞株パネル中の化合物6及び化合物5のin vitro単剤療法による細胞死滅を示すグラフである。
3つの化学療法剤(カルボプラチンゲムシタビン、化合物B)と併用した化合物5及び化合物6の効果を示すグラフである。
Sum190PT細胞株三種陰性乳癌、TNBC)において測定した様々な濃度の化合物Bの存在下及び非存在下での実施例2のATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物6のIC50シフト値を示すグラフである。
図16Aは、MDA−MB−453TNBC癌細胞株において測定した実施例2のATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物6の併用のIC50シフト値を示すグラフである。図16Bは、MDA−MB−453TNBC癌細胞株において測定したATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物Aの併用のIC50シフト値を示すグラフである。
ゲムシタビン[16nM]またはATR阻害剤(化合物Aまたは化合物5[1uM])のいずれか単独または組合せにin vitroで曝露した肺癌細胞DMS−114から得られたウェスタンブロット分析結果である。
U2OS細胞内で、化合物Aとゲムシタビンを様々な濃度で併用して実施した細胞死及び細胞増殖アッセイである。結果を、2つの化合物を併用する場合の細胞増殖及び細胞死の予測値と比較する。
U2OS細胞内で、化合物Aとゲムシタビンを様々な濃度で併用して実施した細胞死及び細胞増殖アッセイである。USO2細胞中の化合物A(1μM)及びゲムシタビン(0.04μM)の設定濃度で、生存細胞及びアポトーシス細胞の数も測定する。
いくつかの肺癌細胞株(NCI−H520及びNCI−H596)及びU2OS細胞において、単独で、及びSN38と併用して、設定濃度(それぞれ1μM及び0.2μM)で試験し、細胞数を経時的にモニタリングした化合物Aを示す。
子宮頸癌細胞株MS751における化合物A及びSN38の併用及び単独での効果を示すグラフである。
化合物Aまたは化合物5とゲムシタビンとの併用効果を示す。U2OS、H358、及びA549細胞株における、化合物Aまたは化合物5とゲムシタビンとの様々な濃度での併用効果を示すヒートマップである。
化合物Aまたは化合物5とゲムシタビンとの併用効果を示す。細胞内での、化合物5及びゲムシタビンまたは化合物A及びゲムシタビンを設定濃度で処置した細胞の顕微鏡写真を示す。
化合物Aまたは化合物5とゲムシタビンとの併用効果を示す。設定濃度でのUSO2及びH358細胞の増殖アッセイも同様に示す。
化合物Aまたは化合物5をSN38と併用した(図22A)又は単独の(図22B)場合のA549細胞の増殖曲線を示す。
様々な濃度の化合物Aまたは化合物5を含む設定濃度のゲムシタビンを用いたいくつかの細胞株におけるIC50値(μM)を示す。
ゲムシタビンまたはSN38と併用した化合物Aまたは化合物5に応答する肺癌細胞株の概要を示す。
様々なATR阻害剤の、ATR(オンターゲット)及びATM(オフターゲット阻害能力についての試験結果を示す。阻害を、nMでのIC50として報告する(図25A)。さらなる「オフターゲット」キナーゼを同様に化合物Aまたは化合物5を用いて試験する(図25B)。
A549肺癌細胞における化合物Aまたは化合物5を用いたオンターゲットの結果を示す。ATR阻害の読取り値であるCHK1 S345のリン酸化を、ウェスタンブロットにより測定する。各化合物を、一定濃度のゲムシタビンとともに使用する。
A549肺癌細胞における化合物Aまたは化合物5を用いたオンターゲットの結果を示す。ATR阻害の読取り値であるCHK1 S345のリン酸化を、ウェスタンブロットにより測定する。各化合物を、一定濃度のゲムシタビンとともに使用する。
H23肺癌細胞における化合物Aまたは化合物5を用いたオンターゲットの結果を示す。ATR阻害の読取り値であるCHK1 S345のリン酸化を、ウェスタンブロットにより測定する。各化合物を、一定濃度のゲムシタビンとともに使用する。
H23肺癌細胞における化合物Aまたは化合物5を用いたオンターゲットの結果を示す。ATR阻害の読取り値であるCHK1 S345のリン酸化を、ウェスタンブロットにより測定する。各化合物を、一定濃度のゲムシタビンとともに使用する。
DMS−114細胞における化合物Aまたは化合物5を用いたオンターゲットの結果を示す。ATR阻害の読取り値であるCHK1 S345のリン酸化を、ウェスタンブロットにより測定する。各化合物を、一定濃度のゲムシタビンとともに使用する。
DMS−114細胞における化合物Aまたは化合物5を用いたオンターゲットの結果を示す。ATR阻害の読取り値であるCHK1 S345のリン酸化を、ウェスタンブロットにより測定する。各化合物を、一定濃度のゲムシタビンとともに使用する。
HCC−70 TNBC、MDA−MB−468 TNBC、及びDMS−114細胞株についてのさらなるオンターゲット分析を示す。SN38の設定濃度を、ある範囲の化合物Aまたは化合物5濃度とともに使用する。ウェスタンブロットにより、様々なオンターゲット活性パラメータを試験し、測定する。
HCC−70 TNBC、MDA−MB−468 TNBC、及びDMS−114細胞株についてのさらなるオンターゲット分析を示す。SN38の設定濃度を、ある範囲の化合物Aまたは化合物5濃度とともに使用する。ウェスタンブロットにより、様々なオンターゲット活性パラメータを試験し、測定する。
SN38及び化合物Aまたは化合物5を添加した24時間後のSUM149細胞の細胞周期特性を示す。
MM398と併用した場合のLs化合物AまたはLs化合物5の効果を測定するために使用するDMS−114異種移植片モデルを示す。2つの異なる用量の化合物Aまたは化合物5(20mpkまたは80mpk)とともに設定用量のMM398(5mpk)を使用する。CHK1 S345のリン酸化のレベルを測定することにより、治療効果をアッセイする。
SUM−149細胞株におけるMM398存在下でのLs化合物Aの効果を示す。RPA2のリン酸化レベルを測定することによって、治療効果をアッセイする。
SUM−149細胞株におけるMM398存在下でのLs化合物Aの効果を示す。RPA2、DNAPK、CHK1、及びγH2AXのリン酸化レベルを測定することによって、治療効果をアッセイする。
SUM−149細胞株におけるMM398存在下でのLs化合物Aの効果を示す。RPA2、DNAPK、CHK1、及びγH2AXのリン酸化レベルを測定することによって、治療効果をアッセイする。Ls化合物5も、MM398と併用せずに試験する。
SUM−149マウス異種移植片モデルにおけるMM−398と併用した場合のリポソーム化合物5の効力を示すグラフである。
SUM−149マウス異種移植片モデルにおけるMM−398と併用した場合のリポソーム化合物5の忍容性を示すグラフである
細胞株パネルに対してウェスタンブロットによって定量化したDNA損傷応答経路に関連する様々なPDマーカーベースレベルである。
動的細胞生存率アッセイにおける各ウェルについて積分スコアを計算する方法を示す模式図である。
ATR阻害剤化合物5及び/またはSN38に曝露した肺癌細胞株における、基底MRE11タンパク質発現(ウェスタンブロットによって定量化)と動的細胞生存率の尺度である積分スコアとの相関である。
ATR阻害剤化合物5及び/またはSN38に曝露した肺癌細胞株における、基底ATMタンパク質発現(ウェスタンブロットによって定量化)と動的細胞生存率の尺度である積分スコアとの相関である。
ATR阻害剤化合物5及び/またはSN38に曝露した肺癌細胞株における、基底NBSタンパク質発現(ウエスタンブロットによって定量化)と動的細胞生存率の尺度である積分スコアとの相関である。
ATR阻害剤化合物5及び/またはSN38に曝露したp53機能障害性肺癌細胞株における、基底NBSタンパク質発現(ウエスタンブロットによって定量化)と動的細胞生存率の尺度である積分スコアとの相関である。
ATR阻害剤化合物5及び/またはSN38に曝露したp53機能障害性肺癌細胞株における、基底NBSタンパク質発現(ウェスタンブロットによって定量化)と動的細胞生存率の尺度である積分スコアとの相関である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株NCIH1299の薬力学的マーカー倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株NCIH1299の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株NCIH1299の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株NCIH1299の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株NCIH1299の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株NCIH1299の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株NCIH460の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株NCIH460の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株NCIH460の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株NCIH460の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株NCIH460の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株NCIH460の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株DMS114の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株DMS114の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株DMS114の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株DMS114の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株DMS114の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株DMS114の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株HCC70の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株HCC70の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株HCC70の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株HCC70の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株HCC70の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株HCC70の薬力学的マーカーにおける倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株MDAMB468の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株MDAMB468の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株MDAMB468の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株MDAMB468の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株MDAMB468の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはSN38に曝露した後のがん細胞株MDAMB468の薬力学的マーカーの倍率変化である。
ATR阻害及び/またはゲムシタビンに6または18時間曝露した後のがん細胞株A549における薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
ATR阻害及び/またはゲムシタビンに6または18時間曝露した後のがん細胞株NCIH23における薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
ATR阻害及び/またはゲムシタビンに6または18時間曝露した後のがん細胞株DMS114における薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
ATR阻害及び/またはゲムシタビンに6または18時間曝露した後のがん細胞株U20Sにおける薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
ATR阻害及び/またはゲムシタビンに6または18時間曝露した後のがん細胞株NCIH460における薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
ATR阻害及び/またはゲムシタビンに6または18時間曝露した後のがん細胞株HCC827における薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
化合物5及び/またはSN38に18時間曝露した後の結腸直腸癌細胞株パネルにおける薬力学的マーカーのウェスタンブロットである。
化合物5及び/またはSN38に18時間曝露した後の結腸直腸癌細胞株パネルにおける、リン酸化Chk1レベルの正規化した定量結果である(各細胞株のシグナルを、SN38単独の存在下でシグナルに対して正規化する)。
化合物5及び/またはSN38に18時間曝露した後の結腸直腸癌細胞株パネルにおける、リン酸化RPA2レベルの正規化した定量結果である(各細胞株のシグナルをSN38単独の存在下でシグナルに対して正規化する)。
化合物5及び/またはSN38に18時間曝露した後の結腸直腸癌細胞株パネルにおける、γH2AXレベルの正規化した定量結果である(各細胞株のシグナルを、SN38単独の存在下でシグナルに対して正規化する)。

0029

詳細な説明
ATRタンパク質キナーゼを阻害するための新規化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を、式(I):

0030

0031

によって記載し、式中、Rは、マウスにおいて少なくとも約5時間の血漿半減期を提供するように選択された、7.0より大きい(好ましくは8.0より大きい、そして最も好ましくは少なくとも約9.5の)pKaを有するアミンを含む部分である(実施例7に従って得られる)。好ましくは、Rは4〜12個の炭素原子を有するアミン置換アルキル部分を含む。Rは、三置換アミン及び水素化アルキル基の組合せのみを含むように選択することができる。Rは、好ましくは少なくとも7、しかし最も好ましくは少なくとも約9.5のpKa(例えば、約9.5〜10.5のpKa)を有する第三級アルキル置換アミンをさらに含む。式(I)の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩の例として、化合物1〜6が挙げられる(実施例1〜6参照):

0032

0033

式(I)の化合物は、好ましくは、Rに、所望のATR阻害及び/またはリポソーム形成及び安定性特性を提供するように選択された1つ以上の第三級アミン部分を含む。いくつかの例では、Rは、好ましくは第二の三級置換窒素を含むアルキルアミノ部分で置換された第一の第三級置換窒素を含む複素環式部分である。特に、式(I)の化合物は、式:

0034

0035

の部分であるRを含みことができ、式中、A1は、存在しないか、またはアルキル(例えばC1−C4アルキル(好ましくは−(CH2)2−)であり、R1は、低級(例えばC1−C4)アルキルアミノである。一実施形態では、R1は(C1−C4アルキル)−NRaRbであり、式中、Ra及びRbは、それぞれ独立してC1−C4アルキルであり、例えばR1は−(CH2)2−N(CH3)(CH3)である。別の実施形態では、R1はNRaRbであり、Ra及びRbは、それぞれ独立してC1−C4アルキルであり、例えばR1は−N(CH2CH3)(CH2CH3)である。

0036

式(I)の別の実施形態では、Rが−N(H)(C1−C4アルキル)−NRaRbであり、式中、Ra及びRbがそれぞれ独立してC1−C4アルキルであるか、またはRが−(G)−NRaRbであり、式中、Ra及びRbがそれぞれ独立してC1−C4アルキルであり、式中、GがC1−C4アルキルであり、式中、Gを、C1−C4アルキルでさらに置換することができる。

0037

式(I)の別の実施形態では、Rは、式:

0038

0039

の部分であることができ、式中、Rc及びRdは、それぞれ独立してC1−C4アルキルである。

0040

好ましい実施例として、上記の化合物1、2、3、4、5、または6からなる群から選択される化合物を含むリポソームが挙げられる。いくつかの実施例では、化合物は化合物5または化合物6である。

0041

式(I)の化合物は、式(Ia)、またはその薬学的に許容可能な塩の化学構造を有することができ、式中、R′は、約9.5以上のpKaを有する第三級アルキル置換アミンである:

0042

0043

式(Ia)の化合物の実施例として、本明細書に開示する化合物5(例えば、実施例1)が挙げられる。式(Ia)の一実施形態では、R′はNRaRbであり、Ra及びRbは、それぞれ独立してC1−C4アルキルである。

0044

ATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物のリポソーム製剤(例えば、実施例7に記載の)は、実施例8に記載するマウスモデルにおいて5時間以上の血漿半減期の向上などの望ましい薬物動態学的特性を提供することができる。リポソームは、通常、水性の内部を取り囲む1つ以上の脂質二重層を有するベシクルを備える。リポソーム組成物は、多くの場合、媒体、例えば、リポソーム外部の水性流体の中にリポソームを含む。リポソーム脂質は、水性媒質と接触する際に自発的に二層膜、例えばリン脂質、例えばホスファチジルコリンを形成する両親媒性脂質成分を含むことができる。リポソームはまた、膜硬化性成分、例えば、ステロール、例えば、コレステロールを含み得る。いくつかの場合には、リポソームはまた、親水性ポリマーに結合した脂質、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)脂質誘導体も含み、これは、リポソームの凝集傾向を低下させる場合があり、他の有益な効果も有し得る。

0045

リポソーム製剤は、1つ以上のリポソーム形成脂質(例えば、水素化ダイズホスファチジルコリン(HSPC))、コレステロール及びポリマー結合脂質(例えば、メトキシ−ポリ(エチレングリコール)−1,2−ジステアロイル−sn−グリセリル(PEG2000−DSG)から形成される単層ベシクル中に、ポリアニオン(例えば、ポリアニオン化糖、例えば、スクロースオクタ硫酸、または適切なポリアニオン化ポリオール)でカプセル化した式(I)の化合物を含む。リポソーム形成脂質は、好ましくは、所望の量のリポソーム膜剛性を提供し、その一方でリポソームからの式(I)の化合物の漏出量を十分に低く維持するように選択されたリン脂質(複数可)とコレステロールの比を有する、1つ以上のリン脂質を含む。

0046

リポソームは、通常、ミクロンまたはサブミクロンの範囲のサイズを有し、イリノテカンなどの抗がん剤を含む医薬物質を保持し、様々な有益な方法でそれらの医薬特性を変化させる能力について十分に認識されている。医薬用リポソーム組成物を調製し、特徴付ける方法は、当該分野で公知である(例えば、Lasic D. Liposomes:From physics to applications,Elsevier,Amsterdam 1993;G.Greroriadis(ed.),Liposome Technology,3rd edition,vol.1−3,CRCPress,Boca Raton,2006;Hong et al.,US Pat.8,147,867を参照されたく、前記文献は、あらゆる目的のためにその全体を参照として本明細書に援用する)。

0047

いくつかの実施例(例えば、実施例7)では、ATRタンパク質キナーゼ阻害剤組成物は、ポリ硫酸化糖(例えば、スクロースオクタ硫酸)などのポリアニオンとともにリポソームに封入されたATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物を含むリポソームを含み得る。スクロースの完全置換型硫酸エステルであるスクロソフェートは、完全にプロトン化された形態において以下の構造を有する:



スクロソフェートは、スクロースオクタ硫酸またはスクロオクタ硫酸(SOS)とも呼ばれる。様々な塩、例えば、アンモニウム塩ナトリウム塩、またはカリウム塩の形態でのスクロソフェートの調製方法は、当該分野において周知である(例えば、US Pat.4,990,610であり、前記文献は、その全体を参照として本明細書に援用する)。

0048

ATRタンパク質キナーゼ阻害剤リポソームは、TEAを含有するリポソームを形成し、続いてTEAがリポソームを離れるにつれて、ATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物(例えば、化合物Aまたは式(I)の化合物)をリポソームに充填することを含む、複数の工程で調製することができる。例えば、ATRタンパク質キナーゼ阻害剤リポソームは、(a)トリエチルアミン(TEA)をスクロソフェートのトリエチルアンモニウム塩(TEA−SOS)として含有するリポソームを調製し、(b)続いて、イリノテカンがリポソームに入り、対応する量のTEAがリポソームを離れることを可能にする(それによって、生じるリポソームにおけるTEAの濃度勾配を消耗または減少させる)のに効果的な条件下で、TEA−SOSリポソームをイリノテカンと接触させる工程を含むプロセスによって調製することができる。

0049

第一の工程は、TEAスクロソフェートの溶液中にリポソーム脂質を水和及び分散させることによって、TEA−スクロソフェートを含有するリポソームを形成することを含み得る。これは、例えば、HSPC及びコレステロールを含む脂質を加熱したエタノール中に溶解させ、溶解及び加熱した脂質溶液を、リポソーム脂質の転移温度(Tm)を超える温度、例えば60℃以上でTEA−スクロソフェート水溶液中に分散させることによって行うことができる。脂質分散液は、規定の細孔サイズ、例えば100nmを有するトラックエッチングされたポリカーボネート膜を通した押し出しによって、75〜125nm(例えば、80〜120nm、またはいくつかの実施形態では、90〜115nm)の平均サイズを有するリポソームに形成することができる。TEA−スクロソフェートは、各モル当量のスクロソフェートに対して少なくとも8モル当量のTEAを含み、約0.40〜0.50Nの濃度、ならびに分散及び押し出し工程の間にリポソームリン脂質の許容不能な分解を防止するように選択されたpH(例えば、約6.5)(例えば、これらの工程の間にリポソームリン脂質の分解を最小限に抑えるように選択されたpH)を有する溶液を得ることができる。次いで、捕捉されなかったTEA−SOSを、薬物のカプセル化の前に、例えば、透析ゲルクロマトグラフィーイオン交換または限外濾過によって、リポソーム分散液から除去することができる。得られるリポソームは、ATRタンパク質キナーゼ阻害剤スクロソフェートを含有することができる。これらのATR阻害剤リポソームは、得られるリポソーム組成物中のTEAの量を、4℃で180日後に所定の最大レベル未満、または約4℃、より一般的には5±3℃で、例えばmg/mL/月、または、単位時間、例えば、mol%リゾPC/月にわたるPCからリゾPCへの変換率(%)で測定する冷蔵庫中での保存中のリポソーム組成物中の所定の最大レベルのリゾPC蓄積速度未満のリゾPC形成を生じるレベルまで低下させるのに十分な薬物をリポソームに充填することによって安定化され得る。次に、充填プロセスの間にリポソームから外部媒体交換されるTEAを、通常、任意の適切な公知の方法(複数可)によって(例えば、ゲルクロマトグラフィー、透析、ダイアフィルトレーション、イオン交換または限外濾過によって)、任意の未捕捉のATR阻害剤とともに、リポソームから除去する。リポソーム外部媒体は、所望のpHで緩衝された注射可能な等張液(例えば、塩化ナトリウム等張溶液)と交換することができる。

0050

リポソームカプセル化ATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物を含む様々なリポソーム製剤の抗腫瘍効果を、ヒト子宮頸癌細胞株(例えば、実施例9に示す、MS751、C33A及びSiHa細胞株)、ならびに肺扁平上皮癌細胞株(例えば、実施例10のNCI−H2170細胞株)、小細胞肺癌細胞株(例えば、実施例10のDMS−114細胞株)、ならびにヒトCalu−6及びCOLO−699細胞株(実施例11)を含む、様々な肺癌細胞株で試験した。

0051

図6〜9及び実施例9に示すように、マウス異種移植片モデル(実施例9A)において、3種のヒト子宮頸癌細胞株に対して、単独で、及びイリノテカンリポソーム製剤MM398(実施例9B)と併用して、ATR阻害剤化合物Aのリポソーム製剤(実施例7)を試験した。3種の子宮頸癌細胞株(MS571及びC33A)のうちの2種の対照実験と比較して、実施例7のリポソーム化合物A製剤について、経時的により大きな腫瘍体積が観察された。しかしながら、イリノテカンリポソームMM398(実施例9B)を、化合物Aリポソーム製剤(実施例7)と併用して投与すると、MM398単独またはリポソーム化合物A単独の投与に比べて、3種の子宮頸癌細胞株の腫瘍体積を大幅に抑制した。

0052

図10A〜10B及び図11A〜11Bに示すように、式(I)及び式(Ia)のATR阻害剤化合物5(実施例7に記載するように、リポソームとして製剤化した実施例1の化合物)のリポソーム製剤を、マウス異種移植片モデルの2種の肺癌細胞株(実施例10)に対して、単独で、及びイリノテカンリポソーム製剤MM398(実施例9B)と併用して試験した。図10A及び図10Bに示すように、化合物5のリポソーム製剤の投与は、実施例10の対照実験に比べて試験した各細胞株において腫瘍体積を減少させ、MM398と実施例7の化合物5リポソーム組成物との併用は、マウスモデルにおいて、いずれかの化合物を他の化合物とは独立して投与した場合よりも腫瘍体積を大幅に減少させた。同様に、実施例10(図11A及び図11B)に示すカプラン−マイヤー生存曲線は、2つの異なる細胞株を用いて、実施例9BのイリノテカンリポソームMM398と実施例7の化合物5リポソーム製剤とを併用投与した場合に、マウス肺癌異種移植試験における生存率の増加を示す。

0053

図12A及び図12Bに示すように、ATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物の様々なリポソーム製剤の忍容性を実施例10において評価した。図12Aに示すように、NCI−H2170マウス異種移植片モデルで試験したマウス体重の減少は、化合物5のリポソーム製剤(実施例7)において、イリノテカンリポソームMM398(実施例9B)、対照、または化合物5とMM398を組み合わせたリポソーム製剤の併用に比べて、経時的に最も低かった。図12Bに示すように、DMS−114マウス異種移植片モデルで試験したマウス体重の減少は、化合物5とMM398を組み合わせたリポソーム製剤の併用において、化合物5のリポソーム製剤(実施例7)、または独立して投与したイリノテカンリポソームMM398(実施例9B)に比べて、経時的に最も低かった。

0054

図13A及び図13Bに示すように、イリノテカンリポソームMM398(実施例9B)とATRタンパク質キナーゼ阻害剤化合物5のリポソーム製剤を併用して投与すると、対照、MM398イリノテカンリポソーム単独投与、化合物Aリポソーム製剤(実施例7)の投与またはMM398イリノテカンリポソーム(実施例9B)と化合物Aリポソーム製剤(実施例7)との併用に比べて、マウス異種移植片モデルのCalu−6細胞株及びCOLO699細胞株の両方において腫瘍体積が最も大きく減少した。

0055

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示す。以下の実施例及び調製物は、本発明のこれらの及び他の実施形態を当業者がより明確に理解し実施できるようにするために提供する。これらは、本発明の範囲を限定するものではなく、単に例示的で代表的なものであるとみなされるべきである。

0056

ATRペプチドは、文献において公知の様々な方法を用いて発現させ、及び単離することができる(例えば、Unsal−Kacmaz et al,PNAS 99:10,pp6673−6678,May 14,2002参照;Kumagai et al. Cell 124,pp943−955,Mar.10,2006;Unsal−Kacmaz et al. Molecular and Cellular Biology,February 2004,p1292−1300;及びHall−Jackson et al. Oncogene 1999,18,6707−6713も参照)。

0057

化合物Aは、化合物II−A−7の合成及び使用に関連する部分を参照として本明細書に援用する、WO2010/071827A1(2010年6月24日公開)に開示されている方法によって得ることができる。化合物Aの構造は以下の通りである:

0058

0059

式(I)の様々な化合物を、本明細書に記載するように調製し、これらを以下の表に要約する。

0060

0061

実施例1、2、3及び6は、図1のスキーム1に示す、in−situ生成されたボロン酸エステルを用いたワンポットスズキクスカプリング法で調製した。図1に示すように、中間体3:1−ブロモ−4−(2−ブロモエチルスルホニルベンゼンの合成は、以下のようにして得ることができる。

0062

0063

DCM(400mL)中の中間体2(35g、133mmol)の溶液に、PBr3(40g、146mmol)を0℃で滴下した。次いで、混合物を室温で一晩攪拌した。水(15mL)を加えて反応をクエンチした。次いで、得られたものを水(120mL)及びブライン(120mL)で洗浄した。有機相濃縮して20gの3の粗製物黄色油状物として取得し、これをさらに精製することなく次の工程で使用した。

0064

図1に示すように、中間体2の合成は以下のように実施することができる:

0065

0066

DCM(500ml)中の中間体1(45g、194mmol)の溶液に、数回のバッチでm−CPBA(134g、776mmol)を室温で加えた。次いで、混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物濾過し、DCM(500ml)を添加して固体を洗浄した。濾液をNaOH(1M、300mL×3)及びブライン(300mL)で洗浄した。有機層濃縮乾固して36gの2(70%)を白色固体として得た。

0067

図1に示すように、中間体1の合成は以下のように実施することができる。

0068

0069

MeCN(600ml)中の4−ブロモベンゼンチオール(45g、238mmol)の溶液に、K2CO3(60g、476mmol)及びNaI(36g、238mmol)を加えた。混合物を室温で10分間攪拌した。次に2−ブロモエタノールを滴下した。添加後、混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカラムで精製して、45gの1(81%)を淡黄色の油状物として得た。

0070

ブロックBは、図2のスキーム2に従って調製することができる。図2に示すように、ブロックBの合成は以下のようにして行うことができる。

0071

0072

DMSO(30mL)中の中間体6(6.0g、27.4mmol)の溶液に、CDI(8.9g、54.8mmol)、DIPEA(3.8g、30.1mmol)及びDMAP(0.17g、1.37mmol)を加えた。溶液を室温で4時間攪拌した。アニリン(2.5g、27.4mmol)を加え、混合物を室温で一晩攪拌した。水を加え、形成した固体を濾過により回収した。粗生成物をシリカゲルカラムで精製して、2.5gのブロックB(31%)を黄色固体として得た。

0073

LC−MS (M+1): 293.2;1H NMR(400MHz,DMSO−d6) δ10.28 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 7.78 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.74 (s, 2H), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.13 (t, J = 7.6 Hz, 1H)。

0074

再び図2に示すように、中間体6の合成は以下のようにして行うことができる。

0075

0076

MeOH(70mL)中の3−アミノ−6−ブロモピラジン−2−カルボン酸メチル(10.0g、43.1mmol)の溶液に、水(70mL)中のLiOH(9.0g、215mmol)の溶液を加えた。混合物を90℃で3時間攪拌した。反応混合物を室温まで冷却し、HCl(2M)でpH=4〜5に酸性化した。混合物を濾過して7.4gの6(79%)を黄色固体として得た。

0077

LC−MS (M+1): 218.0;1H NMR(400MHz,DMSO−d6) δ 8.39 (s, 1H), 7.59 (br, 2H)。

0078

実施例1:化合物5(3−アミノ−6−(4−((2−(4−(2−(ジメチルアミノエチルピペリジン−1−イル)エチル)スルホニル)フェニル)−N−フェニルピラジン−2−カルボキサミド)の合成

0079

0080

正確な質量:536.26;分子量:536.70;化合物5;より塩基性;143mg;収率8.2%;pKa 10.00。

0081

無水ジオキサン(3ml)中の2−(1−(2−((4−ブロモフェニル)スルホニル)エチル)ピペリジン−4−イル)−N,N−ジメチルエタン−1−アミン(ブロックA1)(261mg、0.648mmol)の溶液に、酢酸カリウム(191mg、1.944mmol)及びビス(ピナコラト)ジボラン(246mg、0.971mmol)を添加し、反応容器真空窒素サイクルを繰り返して脱気し、次いでPd(dppf)2Cl2を加えた。CH2Cl2(53mg、0.0648mmol)を再び脱気し、反応物を窒素下で90℃、2時間加熱した。次いで、反応物を室温に冷却し、3−アミノ−6−ブロモ−N−フェニルピラジン−2−カルボキサミド(ブロックB)、2MのK2CO3(1ml)を添加し、脱気し、窒素でパージした。Pd(PPh3)4(75mg、0.0648mmol)を添加した。反応物を100℃で4時間加熱した。反応物を室温に冷却し、酢酸エチル希釈し、ブラインで3回洗浄し、有機層をNa2SO4で乾燥させた。ロータリーエバポレーター溶媒を除去すると、暗色油の残留粗生成物が得られ、溶出液としてジクロロメタン中0〜15%メタノールを用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィー(Reveleris Flash Chromatography System)で精製した。所望の生成物を黄色固体として得た(149mg、収率43%)。MS (M+H)+ 537;1H NMR(400MHz,DMSO−d6): δ 10.45 (s, 1H), 9.03 (s, 1H), 8.49 (d, 2H, 6.8Hz), 7.95 (d, 2H, 6.8Hz), 7.88 (s, br, 2H), 7.81 (d, 2H, 8.8Hz), 7.40 (t, 2H, 7.2Hz), 7.18( t, 1H, 7.2Hz), 3.53 (t, 2H, 7.2Hz), 2.64 (d, 2H, 11.6 Hz), 2.55 (t, 2H, 7.2Hz), 2.05 (m, 2H), 1.98 (s, 6H), 1.17 (m, 2H), 1.42 (d, 2H, 12.0Hz), 1.18 (m, 3H), 0.78 (m, 2H)。

0082

高分解能質量(Thermo Scientific(商標)Q Exactive(商標)ハイブリッド四重極型Orbitrap質量分析計):計算値C28H36N6O3S+プロトン(1.00728)=537.2642;単一荷電イオンのm/z理論値:537.2642;実測値:537.2636。

0083

実施例2:化合物6(3−アミノ−6−(4−((2−(4−(ジエチルアミノ)ピペリジン−1−イル)エチル)スルホニル)フェニル)−N−フェニルピラジン−2−カルボキサミド)の合成

0084

0085

正確な質量:536.26;分子量:536.70;化合物6;より塩基性;53mg;収率11.1%;pKa 9.81。

0086

ブロックA2(1−(2−((4−ブロモフェニル)スルホニル)エチル)−N,N−ジエチルピペリジン−4−アミンを用いて同様の様式で実施例2を調製し、黄色固体を得た(52mg、収率24%)。MS (M+H)+ 537;1H NMR(400MHz,DMSO−d6): δ 10.45 (s, 1H), 9.05 (s, 1H), 8.51 (d, 2H, 8.4Hz), 7.94 (d, 2H, 8.8Hz), 7.87 (s, br, 2H), 7.79 (d, 2H, 8.8Hz), 7.42 (t, 2H, 8.4Hz), 7.18( t, 1H, 7.2Hz), 3.54 (t, 2H, 6.4Hz), 2.65 (d, 2H, 11.2 Hz), 2.56 (t, 2H, 6.4Hz), 2.20 (q, 4H, 6.8 Hz), 1.71 (t, 2, 10.4 Hz), 1.33 (d, 2H, 12.4Hz), 0.85 (qd, 2H, 12.4 Hz), 0.74(t, 6H, 7.2 Hz)。

0087

1−(2−((4−ブロモフェニル)スルホニル)エチル)−N,N−ジエチルピペリジン−4−アミン(ブロックA2)を、対応する4−ジエチルアミノピペリジンを用いて同様の方法で調製した。無色の油状物が得られた(661mg、収率47%)、MS(M+H)+ 403, 405。

0088

実施例3:化合物2(3−アミノ−6−(4−((2−(ジエチルアミノ)エチル)スルホニル)フェニル)−N−フェニルピラジン−2−カルボキサミド)の合成

0089

0090

正確な質量:453.18;分子量:453.56;化合物2;より塩基性でない;98mg;収率7.7%;pKa 7.46。

0091

中間体ブロックA3の2−((4−ブロモフェニル)スルホニル)−N,N−ジエチルエタン−1−アミンを用いて同様の方法で、実施例3の化合物を調製し、黄色の固体を得た(98mg、収率11%)。MS (M+H)+ 454;1H NMR(400MHz,DMSO−d6): δ 10.46 (s, 1H), 9.05 (s, 1H), 8.51 (d, 2H, 6.8Hz), 7.98 (d, 2H, 6.8Hz), 7.88 (s, br, 2H), 7.81 (d, 2H, 8.8Hz), 7.41 (t, 2H, 7.2Hz), 7.17( t, 1H, 7.2Hz), 3.48 (dd, 2H, 6.8Hz), 2.73 (m, 2H), 2.33 (q, 4H, 6.8Hz), 0.81 (t, 6H, 6.8Hz)。

0092

ブロックA3(2−((4−ブロモフェニル)スルホニル)−N,N−ジエチルエタン−1−アミン)を、対応する4−ジエチルアミンを用いて同様の方法で調製した。無色の油状物が得られた(1.42g、収率73%)、MS (M+H)+ 320, 322。

0093

実施例4:化合物4(3−アミノ−6−(4−(((2−(ジメチルアミノ)エチル)−λ2−アザニル)スルホニル)フェニル)−N−フェニルピラジン−2−カルボキサミド)の合成

0094

0095

正確な質量:439.16;分子量:439.51;化合物4;pKa 8.36。

0096

化合物4は、図3のスキーム3に示すように調製することができる。トルエン/エタノール/水(2mL/2mL/2mL)中のブロックB(150mg、0.51mmol)、ブロックF(153mg、0.56mmol)及びNa2CO3(216mg、2.0mmol)にPd(dppf)Cl2(30mg)を添加した。混合物をアルゴン雰囲気下、75℃で4時間攪拌した。反応混合物を濃縮乾固した。残渣を分取HPLCにより精製して、100mgのTM4(45%)を白色固体として得た。

0097

LC−MS (M+1): 441.4;1H NMR(400MHz, CD3OD) δ 8.88 (s, 1H), 8.33 (dd, J = 6.8 Hz, 1.6 Hz, 2H), 8.00 (dd, J = 6.8 Hz, 1.6 Hz, 2H), 7.80 (dd, J = 8.4 Hz, 1.2 Hz, 2H), 7.41 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.19 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 3.10 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.73 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.46 (s, 6H)。

0098

再び、図3のスキーム3に示すように、ブロックFの合成は以下のように行うことができる。

0099

0100

THF(200mL)中の中間体7(10.0g、32.6mmol)の溶液に、アルゴン雰囲気下、−78℃でB(i−Pr)3(30.6g、163mmol)を添加した。次いで、n−BuLi(2.5M、65mL)を滴下した。混合物を−78℃で2時間、次に室温でさらに16時間攪拌した。水を加えて反応を停止させた。混合物を濃縮乾固した。残渣を分取HPLCで精製して、5.2gのブロックF(59%)を白色固体として得た。

0101

LC−MS (M+1): 273.4;1H NMR(400MHz,DMSO−d6) δ 7.90−7.45 (m, 4H), 2.91 (s, 2H), 2.69 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.18 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.03 (s, 6H)。

0102

再び、図3のスキーム3に示すように、中間体7の合成は以下のように行うことができる。

0103

0104

0℃のDCM(300mL)中の4−ブロモベンゼン−1−スルホニルクロライド(20g、78.3mmol)の溶液に、TEA(22mL、158mmol)、続いてN,N′−ジメチルエタン−1,2−ジアミン(8.3g、94.0mmol)を加えた。得られた溶液を室温で1時間攪拌し、次いでDCM(300mL)で希釈した。溶液を水(200mL)及びブライン(200mL)で洗浄した。有機層を濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカラムで精製して17.0gの7(71%)をオフホワイトの固体として得た。

0105

実施例5:化合物3(3−アミノ−6−(4−((2−(4−メチルピペラジン−1−イル)エチル)スルホニル)フェニル)−N−フェニルピラジン−2−カルボキサミド)の合成

0106

0107

正確な質量:480.19;分子量:480.59;化合物3;pKa 7.73。

0108

実施例5の化合物は、図4に示すスキーム4により得ることができる。スキーム4の中間体5は、下記のようにして得ることができる。

0109

アルゴン雰囲気下、−78℃のTHF(30mL)中の中間体4(1.7g、5.0mmol)の溶液にB(i−Pr)3(4.7g、25mmol)を添加した。次いで、n−BuLi(2.5M、10mL)を滴下した。混合物を−78℃で2時間、次に室温でさらに16時間攪拌した。水を加えて反応をクエンチした。混合物を濃縮乾固した。残渣を分取HPLCで精製して、300mgの5(19%)を白色固体として得た。

0110

再び図4に示すように、スキーム4の中間体4は以下のようにして得ることができる。

0111

0112

MeCN(300mL)中の中間体3(20g、60mmol)の溶液に、1−メチルピペラジン(9.0g、90mmol)及びK2CO3(16.6g、120mmol)を加えた。混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮乾固した。残渣をシリカゲルカラムで精製して15gの4(71%)を淡色固体として得た。

0113

実施例6:化合物1(3−アミノ−6−(4−((1−(ジメチルアミノ)プロパン−2−イル)スルホニル)フェニル)−N−フェニルピラジン−2−カルボキサミド)の合成

0114

0115

正確な質量:439.17;分子量:439.53;化合物1;より塩基性でない;427mg;収率12.9%;pKa 7.04。

0116

1−ブロモ−4−(2−ブロモエチルスルホニル)ベンゼンを使用する以外は、J.Med.Chem.2011,54,2320(補足資料)に記載の化合物1の調製手順に従って、実施例6の化合物を調製した。黄色の固体が得られた(427mg、収率11%)。MS (M+H)+ 440;1H NMR(400MHz,DMSO−d6): δ 10.46 (s, 1H), 9.05 (s, 1H), 8.52 (d, 2H, 6.8Hz), 7.93 (d, 2H, 6.8Hz), 7.89 (s, br, 2H), 7.82 (d, 2H, 8.0Hz), 7.40 (t, 2H, 7.2Hz), 7.18( t, 1H, 7.2Hz), 3.53 (t, 2H, 7.2Hz), 2.64 (d, 2H, 11.6 Hz), 2.55 (t, 2H, 7.2Hz), 2.05 (m, 2H), 1.98 (s, 6H), 1.17 (m, 2H), 1.42 (d, 2H, 12.0Hz), 1.18 (m, 3H), 0.78 (m, 2H)。

0117

実施例7:封入トリエチルアンモニウムSOS塩を有するリポソームの調製及びリポソームへのATRiの充填
スクロースオクタ硫酸(当量144.8)は、すべてのヒドロキシル基が硫酸エステルを形成しているスクロース誘導体のナトリウム塩である。60gのスクロースオクタ硫酸(SOS)ナトリウム塩を150mlの脱イオン水に溶解し、50℃の水浴振とう旋回)させながら加熱した。この溶液を、スルホン化ポリスチレンジビニルベンゼンコポリマー陽イオン交換樹脂ビーズ(Dowex 50Wx8−100−200メッシュ、Dow Chemical Co.)を充填したカラムに通した。このカラムを3〜3.6MのHCl水溶液で予め平衡化して樹脂水素形態にし、流出量が導電率<1μS/cmを示すまで、脱イオン水で洗浄した。導電率検出器を用いて溶離液をモニタリングした。導電率ピークに対応してSOS画分を集め、すぐに純粋なトリエチルアミン(TEA)溶液でpH6〜6.5に滴定した。この溶液に対し、ナトリウム感受性電極を用いた電位差測定によって残留ナトリウムを、及び屈折計を用いてSOS濃度を分析した。0.25%未満の残留ナトリウムを有する溶液を脱イオン水で希釈して、SOSの終濃度1.1Mとし、次いでMillipore製0.22μm Steri−Topフィルターを用いて滅菌濾過した。

0118

コレステロール(Chol)は、Avanti Polar Lipids、Alabaster、Ala、USAから購入した。水素化ダイズホスホコリン(HSPC)及びメトキシ−ポリ(エチレングリコール)−1,2−ジステアロイル−sn−グリセリル(PEG2000−DSG)は、Lipoid GmbH、Ludwigshafen、Germanyから入手した。

0119

Chol、HSPC及びPEG2000−DSGを、65℃で3:2:0.15のモル比で100%エタノール(200プルーフ、Sigmaカタログ番号:459828)に同時溶解させた。TEA−SOSの溶液(添加したエタノールの体積の10倍)を脂質溶液と60〜65℃で混合し、この温度で、多層ベシクルの均一な乳状懸濁液が形成されるまで攪拌した。この懸濁液を、60〜65℃で、アルゴン加圧押出機(Lipex Biomembranes)を用いて100nmの孔径を有する5つの積層ポリカーボネートトラックエッチングフィルター(Corning Nuclepore)に3回押し出し、得られた単層リポソームを中で急速に冷却し、使用前に4〜6℃で保存した。リン脂質の濃度をリン酸アッセイによって測定し、粒径をMalvern Nanosizerで記録した。

0120

薬剤充填前に、ゲルクロマトグラフィー(Sepharose CL−4B、Pharmacia)を用いて過剰の未捕捉TEA−SOSを除去することにより、TEA−SOS勾配を作製した。50%デキストロース溶液を用いてリポソームの浸透圧を平衡化した。デキストロースの終濃度は15%であった。

0121

ATR阻害剤を、1M HClでの滴定及び45℃での加熱によって、脱イオン水中の15%デキストロース溶液に溶解し、次いで、0.2μmNALGENE 13mmシリンジフィルターで濾過した。溶液中の薬物濃度をHPLCで検出した。9〜10mg/mLの薬物を含有するATR阻害剤のストック溶液を、薬物/脂質比800mg/mmolリン脂質となるようにリポソームに添加し、pHを1M Hepes緩衝液及び0.1N NaOHでpH6.5に調整した。

0122

リポソーム−薬物混合物を、時々攪拌しながら65℃で30分間インキュベートした。インキュベーション混合物を迅速に冷却し、0℃で10分間インキュベートし、次いで周囲温度に到達させた。HBS−6.5緩衝液(5mMの2−(4−(2−ヒドロキシエチル)−ピペラジノ)−エチルスルホン酸(HEES)、144mMのNaCl、pH6.5)で溶離するSephadex G−25(Amersham Pharmacia)上でのゲルクロマトグラフィーにより、捕捉されなかった薬物を除去した。空隙容量溶出されたリポソーム画分を合わせ、0.2μmの濾過で滅菌し、使用前に4〜6℃で保存した。リポソームを、脂質濃度、薬物濃度、及び粒子サイズによって特徴付けた(表2)。400g/molより高い薬物/脂質比において凝集を形成し、沈殿した化合物1を除いて、すべてのATR阻害剤が良好な充填効力を示した。

0123

0124

実施例8:リポソームATRiのPK試験の一般的説明
図5は、リポソームATR阻害剤の血液薬物動態を示すグラフである。ATR阻害剤のリポソーム製剤を実施例7に記載したように調製した。リポソームを、3匹の7〜9週齢の雌CD−1マウス(Charles River)(体重約25g)に20mg薬物/kgの用量で静脈内投与した。0.08、1.5、4、8及び24時間の時点で、伏在静脈からの出血により、血液試料リチウムヘパリン管に収集した。10000rpm、5分間の遠心分離によって、血漿細胞画分から分離した。メタノール中の1%酸性酸(1%Ac/MeOH)200μlの存在下で、血漿試料を少なくとも2時間、−80℃でインキュベーションすることにより、薬物を抽出した。血漿タンパク質を、15000rpm、20分間の遠心分離によってスピンダウンさせた。75μlの上清をHPLCバイアル(Thermo Scientific、カタログ番号C4011−LV1)に移し、さらに75μlの1%Ac/MeOHを加えた。薬物含量をHPLCで分析し、各試料を2回測定した。データは、注入後の時間に対してプロットした注入用量(%)として表した。図5に示すように、化合物1、化合物3及び化合物2のリポソーム製剤は、循環器系において不安定であり、リポソーム化合物1及び化合物3は24時間時点でのHPLC分析で検出不能であり、リポソーム化合物2は8時間時点ですでに検出不能であった。2つのリポソーム製剤化合物6及び化合物5は、24時間後において初期注入用量の16%を上回っており、循環器系での良好な寿命を有する。以下の表2は、血液PK曲線をまとめたものである。リポソーム化合物6及び化合物5は、他のリポソームの実施例に比べて最も高い血漿半減期を示す。

0125

0126

実施例9A:マウスの子宮頸癌異種移植片に対するTEA.SOSを用いて調製したLS化合物Aのin vivo抗腫瘍効力及び忍容性
図6は、実施例9Aに記載する、子宮頸部MS571異種移植片モデルにおける、MM−398と併用した場合のリポソーム化合物Aの抗腫瘍効力を示すグラフである。

0127

図7は、実施例9Aに記載する、子宮頸部C33A異種移植片モデルにおける、MM−398と併用した場合のリポソーム化合物Aの抗腫瘍効力を示すグラフである。

0128

図8は、実施例9Aによる、子宮頸部C33A異種移植片モデルにおける、MM−398と併用した場合のリポソーム化合物Aの抗腫瘍効力を示すグラフである。

0129

図9は、実施例9Aによる、子宮頸部MS751における、MM−398と併用した場合のリポソーム化合物Aの忍容性を示すグラフである。

0130

MM−398(リポソームイリノテカン)と併用したATR阻害剤化合物A(Ls化合物A)を充填したリポソームの抗腫瘍効力を、ヒト子宮頸部MS751、C33A及びSiHa細胞株のモデルにおいて試験した。細胞は、American Type Culture Collection(Rockville、MD)から入手し、供給元推奨に従って、10%ウシ胎仔血清、50U/mLペニシリンG、及び50μg/mLのストレプトマイシン硫酸塩を添加したRPMI培地中、37℃、5%CO2下で増殖させた。NCR nu/nuホモ接合性胸腺ヌードマウス(4〜5週齢、少なくとも16gの体重)をCharles Riverから入手した。マウスに対し、30%マトリゲルを添加したPBS中に懸濁した5×106細胞を含有する0.1mLの懸濁液を、右脇腹に皮下接種した。腫瘍が150mm3〜350mm3の大きさに達した時点で、動物を以下の方法に従って処置群割り当てた。動物を腫瘍サイズによってランク付けし、縮小腫瘍サイズの6つのカテゴリーに分けた。各サイズカテゴリーから1匹の動物を無作為に選択することにより、10匹の動物/群からなる4つの処置群を形成し、それにより、各処置群においてすべての腫瘍サイズを同等に表現した。

0131

以下の調製物の4つの尾静脈注射を、7日間の間隔で動物に与えた:1)対照(HEPES緩衝食塩水pH6.5);2)注射1回につき2または5mg/kgの用量のMM−398;3)注射1回につき20または60mg/kgのリポソーム化合物A;4)MM−398、続いて24時間間隔のリポソーム化合物Aの注射。注射用リポソームを実施例7に記載したように調製した。動物の体重及び腫瘍サイズを週2回モニタリングした。腫瘍の進行を、最大(長さ)及び最小(幅)軸に沿った腫瘍の触診及びキャリパー測定によって週2回モニタリングした。腫瘍サイズは、式(Geran,R.I.,et al.,1972 Cancer Chemother.Rep.3:1−88):
腫瘍体積=[(長さ)×(幅)2]/2
を用いて、キャリパー測定により、週2回測定した。

0132

処置に関連する毒性を評価するために、動物の体重を週2回、測定した。腫瘍接種後、動物を60日間観察した。群内の腫瘍がマウス体重の10%に達した時点で、群内の動物を安楽死させた。群全体にわたる平均腫瘍体積一緒にプロットし、経時的に比較した。図6、7、及び8に示すように、リポソームATR阻害剤化合物AとMM−398の併用は、3つの異種移植片モデルすべてにおいて、MM−398及びリポソーム化合物A単独に比べて、有意に強力な抗腫瘍効果を有する。処置に関連する毒性を、動物の体重の動態によって評価した(図9)。いずれの群も有意な毒性を示さなかった。すべての処置群における動物の体重は対照群と同等であり、一貫して増加していた。したがって、ATR阻害剤化合物Aのリポソーム製剤は、試験した腫瘍モデルにおいて、毒性を顕著に増加させることなく抗腫瘍活性の増加を示した。

0133

実施例9B:MM−398イリノテカンリポソームの製造
実施例9A及び本明細書の他の箇所で使用するMM398は、多工程プロセスで調製可能なイリノテカンリポソームである。まず、脂質を加熱エタノールに溶解する。脂質は、3:2:0.015のモル比で混合したDSPC、コレステロール及びMPEG−2000−DSPEを含み得る。好ましくは、リポソームは、3:2:0.015のモル比で混合したDSPC、コレステロール及びMPEG−2000−DSPEからなるベシクルにイリノテカンスクロースオクタ硫酸(SOS)を封入してカプセル化することができる。得られるエタノール−脂質溶液を、溶解した脂質から形成されるベシクル中にカプセル化した置換アミンアンモニウム型)及びポリアニオンを含有する適切なサイズ(例えば80〜120nm)の本質的に単層リポソームを形成するのに有効な条件下で、置換アミン及びポリアニオンを含む水性媒体中に分散させる。分散は、例えば、置換アミン及びポリアニオンを含有する水溶液とエタノール脂質溶液とを脂質転移温度、例えば60〜70℃を超える温度で混合し、得られる水和脂質懸濁液(多層リポソーム)を1つ以上のトラックエッチングされた、例えばポリカーボネート製の、例えば、50nm、80nm、100nm、または200nmの規定された孔径を有する膜フィルターを介して圧力下で押し出しすることによって実施することができる。置換アミンは、トリエチルアミン(TEA)であることができ、ポリアニオンは、約0.4〜0.5Nの濃度で、化学量論比(例えば、TEA8SOS)で混合したスクロースオクタ硫酸(SOS)であることができる。次いで、すべての、または実質的にすべての捕捉されなかったTEAまたはSOSを除去し(例えば、ゲル濾過、透析または限外濾過によって)、その後、リポソームに残留するTEAとの交換でイリノテカンをリポソームに封入可能とするのに有効な条件下でリポソームをイリノテカンと接触させる。この条件は:捕捉されたTEA−SOS溶液の浸透圧を平衡させ、及び/または、充填時の浸透圧によるリポソームの破裂を防止するための浸透圧剤(例えば、5%デキストロース)のリポソーム外部媒体への添加、充填工程中の薬物及び/または脂質の分解を低減するためのpHの調整及び/または選択(例えば、6.5への)、ならびにTEAとイリノテカンとの膜間交換を促進するためのリポソーム脂質の転移温度を超える温度への上昇(例えば60〜70℃まで)からなる群から選択される1つ以上の条件を含み得る。リポソームを隔てたTEAとの交換によるイリノテカンの充填は、好ましくは、すべての、または実質的にすべてのTEAがリポソームから除去され、それによってリポソームを隔てたその濃度勾配が枯渇するまで続く。好ましくは、イリノテカン対スクロオクタ硫酸のグラム当量比が、少なくとも0.9、少なくとも0.95、0.98、0.99もしくは1.0(または約0.9〜1.0、0.95〜1.0、0.98〜1.0もしくは0.99〜1.0の範囲)である限り、イリノテカンのリポソーム充填プロセスを継続する。好ましくは、TEAが、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%またはそれ以上がリポソーム内部から除去されるまで、イリノテカンのリポソーム充填プロセスを継続する。イリノテカンは、例えば、イリノテカンとスクロースオクタ硫酸を約8:1のモル比で、リポソーム内にイリノテカンスクロソフェートを形成することができる。次に、ゲル(サイズ排除)クロマトグラフィー、透析、イオン交換、または限外濾過法を用いて、残存するリポソーム外イリノテカン及びTEAを除去して、イリノテカンリポソームを得る。リポソーム外部媒体を、注射可能な薬理学的に許容可能な流体、例えば緩衝化等張性生理食塩水で置換する。最後に、リポソーム組成物を、例えば0.2μmの濾過によって滅菌し、投与バイアルに分注し、使用時まで、標識し、例えば2〜8℃の冷蔵庫に保存する。リポソーム外部媒体は、残存するリポソーム外イリノテカン及びTEAの除去と同時に、薬理学的に許容可能な流体で置換することができる。組成物のリポソーム外pHは、例えば、約6.5〜8.0のpH、またはその間の任意の適切なpH値(例えば、7.0〜8.0、及び7.25を含む)で組成物を調製することによって、所望の貯蔵安定性(例えば、4℃での180日超の保存中にリポソーム内のリゾPCの形成を減少させる)を提供するように調整または選択することができる。

0134

DSPC、コレステロール(Chol)、及びPEG−DSPEをそれぞれ3:2:0.015のモル比に対応する量(例えば、1264mg/412.5mg/22.44mg)で量した。脂質をクロロホルム/メタノール(4/1 v/v)に溶解し、完全に混合し、4つのアリコート(A〜D)に分割した。回転蒸発器を用いて60℃で各試料を蒸発乾固させた。減圧下(180μトル)、室温で12時間静置することにより、残留クロロホルムを脂質から除去した。乾燥した脂質を60℃のエタノールに溶解し、最終アルコール含量が10%(v/v)になるように、適切な濃度の予熱したTEA8SOSを添加した。脂質濃度は75mMであった。脂質分散液を、Lipex thermobarrel押出機(Northern Lipids、Canada)を使用して約65℃で、2積層0.1μmポリカーボネート膜(Nucleopore)に10回押し出し、一般的な平均直径95〜115nm(準弾性光散乱によって測定)を有するリポソームを製造した。押し出されたリポソームのpHを必要に応じて1N NaOHでpH6.5に調整した。イオン交換クロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィーの併用により、リポソームを精製した。最初に、DOWEX IRA910樹脂を1N NaOHで処理し、続いて脱イオン水で3回洗浄した後、3N HClで3回洗浄した後、水で複数回洗浄した。調製した樹脂にリポソームを通し、フローセル導電率計(Pharmacia、Upsalla、Sweden)を用いて溶出画分の導電率を測定した。導電率が15μS/cm未満である場合、この画分は、さらなる精製を許容可能であると考えられた。次に、脱イオン水で平衡化したSephadex G−75(Pharmacia)カラムにリポソーム溶出液をアプライし、回収したリポソーム画分の導電率を測定した(通常1μS/cm未満)。40%デキストロース溶液を終濃度が5%(w/w)になるように添加し、緩衝液(Hepes)をストック溶液(0.5M、pH6.5)から最終濃度10mMになるように添加することにより、膜間の等張性を達成した。

0135

各バッチの分析証明書から得られた含水量及び不純物レベルを考慮して、脱イオン水中のイリノテカン・HCl三水和物粉末を、15mg/mLの無水イリノテカン−HClに溶解し、イリノテカンのストック溶液を調製した。薬物充填は、500g/molのリポソームリン脂質にイリノテカンを添加し、湯浴中で30分間、60±0.1℃まで加熱することによって開始した。湯浴から取り出す際に氷冷水に浸すことにより、溶液を急速に冷却した。Hepes緩衝化生理食塩水(10mM Hepes、145mM NaCl、pH6.5)で平衡化及び溶出したSephadex G75カラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによってリポソーム外の薬物を除去した。Bartlett法(リン酸塩測定法参照)により、HPLC及びリン酸塩によってイリノテカンに関して、試料を分析した。

0136

本明細書に記載する貯蔵安定性イリノテカンリポソームの好ましい一実施例は、ONIVYDE(イリノテカンリポソーム注射剤)として市販される製品である。ONIVYDEは、静脈内使用のために、イリノテカン塩酸塩三水和物をリポソーム分散液に製剤化したトポイソメラーゼ阻害剤である。ONIVYDEは、ゲムシタビンに基づく治療後の、疾患進行後の膵臓転移性腺癌の治療の必要性を示した。

0137

ONIVYDEは、約7.25のpHを有する貯蔵安定化リポソームである。ONIVYDE製品は、イリノテカン塩酸塩三水和物出発物質から得られたイリノテカンスクロソフェートをリポソームに封入して含有する。イリノテカンの化学名は、(S)−4,11−ジエチル−3,4,12,14−テトラヒドロ−4−ヒドロキシ−3,14−ジオキソ1H−ピラノ[3′,4′:6,7]−インドリジノ[1,2−b]キノリン−9−イル−[1,4′−ビピペリジン]−1′−カルボキシレートである。ONIVYDEの用量は、イリノテカンリポソームを調製するために使用するイリノテカン塩酸塩三水和物出発物質の当量に基づいて、またはリポソーム中のイリノテカンの量に基づいて計算することができる。イリノテカン塩酸塩三水和物1グラム当たり約866mgのイリノテカンが存在する。例えば、イリノテカン塩酸塩三水和物出発材料の量に基づく80mgのONIVYDE用量は、最終産物中に実際に約0.866×(80mg)のイリノテカンを含有する(すなわち、イリノテカン塩酸塩出発物質の重量に基づいて80mg/m2の用量のONIVYDEは、最終産物中の約70mg/m2のイリノテカンと同等である)。ONIVYDEは、滅菌された、白色〜わずかに黄色の不透明な等張性リポソーム分散液である。各10mLの単回用量バイアルは、43mgのイリノテカン遊離塩基を4.3mg/mLの濃度で含有する。リポソームは、直径およそ110nmの単層脂質二重層ベシクルであり、イリノテカンを含有する水性空間をスクロースオクタ硫酸塩としてゲル化または沈殿状態で封入する。ベシクルは、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC)6.81mg/mL、コレステロール2.22mg/mL、及びメトキシ末端ポリエチレングリコール(分子量2000)−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(MPEG−2000−DSPE)0.12mg/mLからなる。各mLにつき、緩衝液として4.05mg/mLの2−[4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−イル]エタンスルホン酸(HEPES)を、及び等張性試薬として8.42mg/mLの塩化ナトリウムも含有する。ONIVYDEの各バイアルは、単回用量バイアル中に、白色〜わずかに黄色の不透明なリポソーム分散液として43mg/10mLのイリノテカン遊離塩基を含有する。

0138

本発明の一例では、ONIVYDE単位剤形は、リポソームにカプセル化されたある量のイリノテカンを含む医薬組成物であり、80mg/m2のイリノテカン塩酸塩三水和物に等しい量のイリノテカンを提供する総量約70mg/m2のイリノテカン、及び約20%未満のリゾPCを提供する。単位剤形は、約500mLの総容量を有する静脈内製剤であり得る。ONIVYDEは、以下のようにバイアルからの等張性リポソーム分散液を希釈することによって投与用に調製される:算出した量のONIVYDEをバイアルから回収する。ONIVYDEを500mLの5%デキストロース注射液、USPまたは0.9%塩化ナトリウム注射液、USPで希釈し、穏やかな転倒混和により希釈溶液を混合し;希釈溶液を光から保護し、室温保存の場合は調製後4時間以内に、または冷蔵条件[2℃〜8℃(36°F〜46°F)]での保存の場合は調製後24時間以内に、希釈溶液を投与する。

0139

ゲムシタビンに基づく治療の後に進行する膵臓の転移性腺癌患者の治療のための、5−フルオロウラシル及びロイコボリンとの併用によるONIVYDE(イリノテカンリポソーム注射)の必要性が示される。ロイコボリンとフルオロウラシル投与前にONIVYDEを投与する。ONIVYDEの推奨用量は、2週間ごとに90分間にわたる静脈内注入によって投与するイリノテカン70mg/m2である。UGT1A1*28対立遺伝子について同型接合であることが既知の患者におけるONIVYDEの推奨開始用量は、90分間にわたる静脈内注入によって投与する50mg/m2のイリノテカンである。ONIVYDEの用量は、その後のサイクルで許容されるように70mg/m2に増加させることができる。血清ビリルビン値が正常値の上限を超えている患者に対しては、ONIVYDEの推奨用量は存在しない。ONIVYDEを希釈溶液として90分間にわたって静脈内に注入する。

0140

適切な治療レジメンとして、ONIVYDE 70mg/m2を、(1+dラセミ体の)ロイコボリン400mg/m2(または200mg/m2のロイコボリン活性型l)及びフルオロウラシル2,400mg/m2とともに、2週ごとに46時間にわたって(ONIVYDE/5−FU/LV;n=117)、ONIVYDE 100mg/m2を3週ごとに(n=147)、またはロイコボリン200mg/m2及びフルオロウラシル2000mg/m2を、1週ごとに24時間にわたって合計4週間とその後の2週間の休薬期間にわたって(5−FU/LV;n=134)が挙げられる。

0141

実施例10:TEA.SOSを用いて調製したLs化合物5のマウス肺癌異種移植片に対するin vivo抗腫瘍効力及び忍容性
図10A及び図10Bは、実施例10に記載するように、NCI−H2170(図10A)またはDMS−114(図10B)マウス異種移植片モデルにおけるMM−398と併用した場合のリポソーム化合物5の効力を示すグラフである。

0142

図11A及び図11Bは、実施例10に記載するように、NCI−H2170(図11A)及びDMS−114(図11B)マウス異種移植片モデルにおけるMM−398と併用した場合のリポソーム化合物5の効力を示すカプラン−マイヤー生存曲線を示すグラフである。

0143

図12A及び図12Bは、NCI−H2170(図12A)またはDMS−114(図12B)マウス異種移植片モデルにおけるMM−398と併用した場合のリポソーム化合物5の忍容性を示すグラフである。

0144

ATR阻害剤化合物5とMM−398(リポソームイリノテカン)の組合せを充填したリポソームの抗腫瘍効力を、ヒトNCI−H2170(肺扁平上皮細胞癌)及びDMS−114(小細胞肺癌肺細胞株のモデルにおいて試験した。

0145

細胞をAmerican Type Culture Collection(Rockville、MD)から入手し、供給元が推奨するように、10%ウシ胎仔血清、50U/mLのペニシリンG、及び50μg/mLのストレプトマイシン硫酸塩を添加したRPMI培地中、37℃、5%CO2下で増殖させた。NCR nu/nuホモ接合性無胸腺雄ヌードマウス(4〜5週齢、少なくとも16gの体重)をCharles Riverから入手した。マウスに対し、30%マトリゲルを添加したPBS中に懸濁した5×106細胞を含有する0.1mLの懸濁液を、右脇腹に皮下接種した。腫瘍が150mm3〜350mm3の大きさに達した時点で、動物を以下の方法に従って処置群に割り当てた。動物を腫瘍サイズによってランク付けし、縮小腫瘍サイズの6つのカテゴリーに分けた。各サイズカテゴリーから1匹の動物を無作為に選択することにより、10匹の動物/群からなる4つの処置群を形成し、それにより、各処置群においてすべての腫瘍サイズを同等に表現した。以下の調製物の4つの尾静脈注射を、7日間の間隔で動物に与えた:1)対照(HEPES緩衝食塩水pH6.5);2)注射1回につき5mg/kgの用量のMM−398;3)注射1回につき80mg/kgのリポソーム化合物5;4)MM−398、続いて24時間間隔のリポソーム化合物5の注射。注射用リポソームを実施例7に記載したように調製した。MM−398は実施例9Bに記載されている。

0146

動物の体重及び腫瘍サイズを週2回モニタリングした。腫瘍の進行を、最大(長さ)及び最小(幅)軸に沿った腫瘍の触診及びキャリパー測定によって週2回モニタリングした。腫瘍サイズは、式:
腫瘍体積=[(長さ)×(幅)2]/2
を用いて、キャリパー測定により、週2回測定した。

0147

処置に関連する毒性を評価するために、動物の体重を週2回、測定した。群内の腫瘍がマウス体重の10%に達した時点で、群内の動物を安楽死させた。群全体にわたる平均腫瘍体積を一緒にプロットし、経時的に比較した。

0148

図10A及び10B、ならびに図11A及び11Bに示すように、両方の肺異種移植片モデルにおいて、リポソームATR阻害剤化合物5は、MM−398の抗腫瘍効力を有意に向上させた。リポソームATR阻害剤化合物5とMM−398の併用処置は、動物の体重に影響を及ぼさなかった(図12A及び図12B)。

0149

実施例11:MM−398と併用したリポソーム阻害剤Ls化合物5及びLS化合物Aのマウス肺癌異種移植片に対するin vivo抗腫瘍効力の比較
図13A及び13Bは、Calu−6(図13A)またはCOLO−699(図13B)マウス異種移植片モデルにおけるMM−398と併用した場合のリポソーム化合物5の効力を示すグラフである。例えば、図13A及び図13B中のデータは、リポソームATR阻害剤化合物5が両方のモデルにおいてMM−398の抗腫瘍効力を有意に向上させたが、リポソーム中に製剤化した化合物Aは、COLO−699異種移植片モデルにおいてのみ活性であったことを示している。

0150

ATR阻害剤化合物5とMM−398(リポソームイリノテカン)の組合せを充填したリポソームの抗腫瘍効果を、ヒトCalu−6及びCOLO−699肺細胞株の異種移植片モデルにおける化合物Aのリポソーム製剤と比較した。

0151

細胞は、American Type Culture Collection(Rockville、MD)から入手し、供給元の推奨に従って、10%ウシ胎仔血清、50U/mLペニシリンG、及び50μg/mLのストレプトマイシン硫酸塩を添加したRPMI培地中、37℃、5%CO2下で増殖させた。NCR nu/nuホモ接合性無胸腺雄ヌードマウス(4〜5週齢、少なくとも16gの体重)をCharles Riverから入手した。マウスに対し、30%マトリゲルを添加したPBS中に懸濁した5×106細胞を含有する0.1mLの懸濁液を、右脇腹に皮下接種した。腫瘍が150mm3〜350mm3の大きさに達した時点で、動物を以下の方法に従って処置群に割り当てた。動物を腫瘍サイズによってランク付けし、縮小腫瘍サイズの6つのカテゴリーに分けた。各サイズカテゴリーから1匹の動物を無作為に選択することにより、10匹の動物/群からなる4つの処置群を形成し、それにより、各処置群においてすべての腫瘍サイズを同等に表現した。以下の調製物の4つの尾静脈注射を、7日間の間隔で動物に与えた:1)対照(HEPES緩衝食塩水pH6.5);2)注射1回につき10または20mg/kgの用量のMM−398;3)注射1回につき80mg/kgのリポソーム化合物5;4)注射1回につき80mg/kgのリポソーム化合物A;5)MM−398、続いて24時間間隔のリポソーム化合物5の注射。6)MM−398、続いて24時間間隔のリポソーム化合物Aの注射。注射用リポソームを実施例7に記載したように調製した。

0152

動物の体重及び腫瘍サイズを週2回モニタリングした。腫瘍の進行を、最大(長さ)及び最小(幅)軸に沿った腫瘍の触診及びキャリパー測定によって週2回モニタリングした。腫瘍サイズは、式:
腫瘍体積=[(長さ)×(幅)2]/2
を用いて、キャリパー測定により、週2回測定した。

0153

処置に関連する毒性を評価するために、動物の体重を週2回、測定した。群内の腫瘍がマウス体重の10%に達した時点で、群内の動物を安楽死させた。群全体にわたる平均腫瘍体積を一緒にプロットし、経時的に比較した。

0154

実施例12:遊離型薬物併用スクリーニング試験
図14Aは、肺癌細胞株のパネル中の化合物6及び化合物5のin vitro単剤療法による細胞殺傷度を示すグラフである。化合物5は、化合物6よりも効力が高く、IC50が約3(=100.5)倍低い。図14Bは、3つの化学療法剤(カルボプラチン、ゲムシタビン、化合物B)と併用した場合の、化合物5と化合物6の効果を示すグラフである。この図は、化学療法剤と1μg/ mlの化合物6または化合物5との組合せのIC50をlog(μM)で比較する。試験したすべての細胞傷害剤及び1つを除くすべての細胞株において、化学療法剤への化合物5の添加は、化合物6よりも強力(より低いIC50)であった。

0155

図15は、Sum190PT細胞株(TNBC)における併用(実施例2+化合物B)のIC50シフトを示すグラフである。

0156

図16A及び図16Bは、MDA−MB−453細胞株(TNBC)における実施例2の化合物と化合物B、それに対して化合物Aと化合物Bの併用のIC50シフトの比較を示すグラフである。

0157

培養/治療条件
CELLITER−GLO発光細胞生存率アッセイ(Promega)をCorningカタログ番号3707 384ウェルWhite Clear底プレートと共に使用して、in vitroでの有効性試験を行った。細胞を384ウェルフォーマットプレーティングし(1000細胞/ウェル)、37℃で24時間インキュベートした。24時間の時点で単剤治療薬を添加し、次いで37℃で24時間インキュベートした。48時間の時点で、培地中の薬物を除去し、PBSで洗浄し、新鮮な培地を添加した。次いで、細胞を37℃で72時間インキュベートした。併用試験については、細胞をカルボプラチンまたは化合物Bまたはゲムシタビンに24時間曝露した後、化学療法剤を除去し、細胞を第二の化合物(ATR阻害剤)に24時間曝露した。細胞を新鮮な培地でさらに48時間培養した。



120時間の時点で、培地を除去し、CELLTITER−GLO(CTG)試薬を添加した(PBSと1:1の比)。照度計(Envision Multilabel reader)を用いてプレートを読み取った。

0158

データ分析
Matlab(Mathworks、Natick MA)を使用して開発された社内アルゴリズムを使用してデータを分析した。要約すると、4つの複製ウェルについて平均CTG発光値を計算した。外れ値検出は、変動係数CV>20%)を計算することにより行い、外れ値は平均値から除外した。対照未処理ウェルに基づいてCTG値を正規化した。マイクロモル濃度(μM)中の薬物濃度を対数変換し、4パラメータロジスティック曲線フィッティングした。

0159

0160

(式中、C:薬物濃度、y:正規化したCTG値、a:上部漸近線(最大細胞殺傷度を表す)、b:下部漸近線(0.8〜1.2に限定される)、IC50,slope:ロジスティック曲線勾配。)

0161

データ品質管理を行い、以下のルールに従って濃度範囲が最適であることを保証した:(1)最低濃度で細胞の70%超を殺傷する場合、その濃度範囲はあまりにも強力すぎると考えられる(2)最高濃度で細胞の30%未満しか殺傷しない場合、濃度範囲が低いか、またはその細胞株の耐性が高すぎると考えられる。さらに、R2を用いて適合度の好適性を評価し、R2<0.9の場合、不適合フラグ付けする。

0162

JMP(SASInstitute Inc.、NC)を用いて統計分析を行い、p<0.05ならば有意であるとみなした。

0163

実施例13:ATR活性測定
基質としてGST標識完全長p53を用いたEurofins ATR/ATRIPHTRFアッセイにおける線形酵素濃度を用いて、キナーゼATR/ATRIP(h)に対する供給された化合物セットについてEC50測定を実施した。

0164

Km値15μM以内のATP濃度でのATR/ATRIP(h)の活性を、10μMからの片対数希釈による9種類の濃度の化合物で測定した。Ser15上でのp53のATR/ATRIPリン酸化を、ユーロピウム標識抗ホスホSer15 p53抗体及び抗GST−d2抗体からなるエネルギー移動複合体の形成を介して測定した。すべてのデータ点を、DMSO対照及びEDTAブランクを用いて二連で実施した。

0165

ATR/ATRIP(h)を、25mMのHEPESpH8.0、0.01%のBrij−35、1%グリセロール、5mMのDTT、1mg/mLのBSA中に予め希釈し、25mMのHEPES pH8.0、0.01%のBrij−35、1%グリセロール、10mMのMnCl2中で、30nMのGST、cMyc p53−(hu,FL)を基質として用いてアッセイした。反応は、ATPを10μMの終濃度に到達するまで添加して開始した。

0166

個々のレプリケートを、DMSO陽性対照活性に対する割合(%)で表した。各阻害剤濃度の平均活性(%対照)を阻害剤濃度に対してプロットし、EC50値をGRAPHPADRISMを用いて測定した。

0167

%対照活性として表したデータを阻害剤濃度に対してプロットし、GRAPHPADPRISMを用いて4パラメータのロジスティックスにフィッティングした。各化合物のグラフを、付随するExcelレポートのデータとともに示す。化合物の効力の要約を以下に示す。

0168

0169

実施例14:ATM活性の決定
推定されるIC50値は以下の通りである(STANDARDKIASEPROFILERを用いて得られる):

0170

0171

実施例15:ウェスタンブロット分析による全ATR及びホスホATRの検出
図17に示すように:肺癌細胞DMS−114を、ゲムシタビン[16nM]またはATR阻害剤(化合物Aまたは化合物5[1μM])のいずれか単独または組合せにin vitroで曝露した。1、3、6及び24時間後に、2%SDS含有細胞溶解緩衝液を用いて全細胞タンパク質溶解物を生成し、ウェスタンブロット分析のために全試料を回収し、同時に実行するまでの間、−80℃で保存した。関心対象の以下のタンパク質及びリンタンパク質を、Cell Signaling Technology(以下の方法及び材料の部を参照)から購入した抗体によって検出した:全ATR及びリン酸化ATR(S428)、ホスホCHK1(S317及びS345)、γH2AX、βアクチン

0172

図17の結果:全ATR及びホスホATRシグナルが、2つのATR阻害剤(化合物A及び化合物5)のいずれかの添加により強力に低下し、対照またはゲムシタビン単独治療では低下しない(例えば、24時間でのレーン1、2を、3、4または5、6と比較されたい)。ゲムシタビンに応答して、ホスホCHK1(S317及びS345)シグナル伝達は、24時間にわたって有意に増加する。使用するATR阻害剤(化合物Aまたは化合物5)のいずれかの添加は、CHK1のリン酸化シグナル無効化する。両阻害剤によるATRタンパク質及び下流CHK1シグナル伝達の減少から、両分子の特定のオンターゲット効果が確認される。さらに重要な点として、本発明者らの仮説は、細胞周期の停止及びDNA損傷の修復につながるはずのCHK1リン酸化シグナリングによって引き起こされる細胞周期チェックポイントの喪失が、DNA損傷の蓄積による細胞死を誘導するということである。yH2AXシグナルの増加は、毒性の増大及びDNA損傷の蓄積を測定するための代用として見なすことができる。

0173

細胞培養
U2OS及び他のすべての細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)及び抗生物質を添加した(RPMI)で増殖させた。イメージング及び低速度撮影適合するNucLight赤血球株を、Essen Bioscience Inc.によって推奨されるように、レンチウイルス粒子、感染及びピューロマイシン選択プロトコールを使用して生成した。

0174

抗体及びウェスタンブロット
すべての標的及びリン特異的抗体は、Cell Signaling及び/またはEpitomicsから購入し、1:1000希釈で使用した。すべての抗体のリストを表6に示す。標準的な抗体に基づくウェスタンブロット及び免疫組織化学プロトコールを使用した。簡潔に述べると、2%SDSに基づく細胞溶解緩衝液を使用して、ウェスタンブロッティング用の全細胞溶解物を回収した。LiCor Biosciences及び/またはBD Bioscienceに関して、二次抗体及び染色プロトコールを購入及びそれに従った。

0175

0176

全細胞溶解プロトコール
細胞を増殖させ、6cmディッシュスケールで処置した。細胞を採取するために、培地を除去し、迅速に氷冷PBSで置換した。次いでPBSを250μLの2%SDS溶解緩衝液に交換した。インキュベーションの5分後、溶解した細胞をこすり落とし、細胞溶解物ホモジナイザー微量遠心分離スピンカラム(QIAshredder、Qiagen、カタログ番号79656)に充填した。次いで、濾液を0.2μmの遠心フィルターカラム(NanosepMF0.2_m、Pall、カタログ番号ODM02C34)上に充填した。次いで、溶解物を−80℃で保存した。

0177

2%SDSを含有する溶解緩衝液(表7)を、Steven et al.,“Protein microarrays for multiplex analysis of signal transduction pathways,”Nat Med 10,no.12(December 2004):1390−1396に従って改質した。

0178

0179

実施例16:広範なキナーゼパネルスクリーニング(359)
359個のうち、主にヒットしたものは:ALK、ARK、c−MER、CLK1、DYRK、GSK3a、GSK3b、FLT2、FLT3、MLK1、SIK2、TNIK、及びYSK4であった。

0180

0181

本発明を、その特定の実施形態に関連して記載しているが、さらなる変更が可能であり、本出願は、一般的に、本発明の原則に従い、本発明の属する技術分野における公知のまたは慣習的な実施の範囲内にあり、本明細書に記載する本質的な特徴に適用し得る本開示からのそのような逸脱を含む、本発明の任意の変形、使用、または適応包含することを意図していることを理解されたい。

0182

実施例17:化合物Aを比較物質として用いたデータ
様々な濃度の化合物A及びゲムシタビンを併用して、U2OS細胞中で細胞死及び増殖アッセイを実施した。その結果を、2つの化合物の併用による細胞増殖及び細胞死の予測と比較した(図18A)。生存細胞及びアポトーシス細胞の数もまた、USO2細胞中の化合物A(1μM)及びゲムシタビン(0.04μM)の設定濃度で測定した(図18B)。結果は、化合物Aとゲムシタビンとの併用が、いずれかの化合物単独よりも細胞死の促進において優れていることを示している。

0183

化合物Aはまた、いくつかの肺癌細胞株(NCI−H520及びNCI−H596)及びU2OS細胞において、それぞれ単独で及びSN38と併用して、設定濃度(それぞれ1μM及び0.2μM)で試験し、細胞数を経時的にモニタリングした。この結果は、化合物AまたはSN38のいずれか単独よりも、併用のほうが、細胞数を経時的に維持または減少させるのにより効果的であることを示している(図19)。

0184

子宮頸癌細胞株MS−751において、化合物A及びSN38を併用して、及び単独で、in vitro増殖アッセイも実施した。in vitroアッセイは、いずれかの化合物単独に比べて、併用により、経時的な細胞数の減少を示す(図20)。

0185

実施例18:ゲムシタビンまたはSN38と併用した化合物A及び化合物5の比較
U2OS、H358、及びA549細胞株内で、化合物Aまたは化合物5とゲムシタビンとを様々な濃度で組み合わせ、in vitroでの細胞死及び増殖アッセイを実施した。結果は、細胞死を誘発するのに必要とされる各化合物及びゲムシタビンの濃度を示す(図21A)。化合物5とゲムシタビンまたは化合物Aとゲムシタビンの設定濃度をUSO2及びH358細胞においても同様に試験した。すべての場合において、相対的な細胞増殖は、薬物単独に比べて併用によって低下する(図21B〜C)。

0186

A549細胞内で、化合物Aまたは化合物5をSN38と併用した。細胞増殖を、経時的及びある範囲の濃度で測定した。最適化合物/ SN38濃度での増殖曲線を強調表示している(図22A)。化合物A単独または化合物5単独のいずれかをある濃度範囲で用いて、A549細胞の相対的な増殖を測定した(図22B)。

0187

様々な濃度の化合物Aまたは化合物5とともに、設定濃度のゲムシタビンを用いて、いくつかの細胞株においてIC50値を測定した(図23)。

0188

ゲムシタビンまたはSN38と併用した化合物Aまたは化合物5に応答する肺癌細胞株の概要を図24に示す。

0189

実施例19:化合物Aと化合物5のオンターゲット及びオフターゲットでの比較。
様々なATR阻害剤を、ATR(オンターゲット)及びATM(オフターゲット)を阻害する能力について試験した。阻害は、nMにおけるIC50として報告される(図25A)。さらなる「オフターゲット」キナーゼを化合物Aまたは化合物5を用いて同様に試験した(図25B)。

0190

A549肺癌細胞(図26A〜B)、H23肺癌細胞(図26C〜D)、及びDMS−114細胞(図26E〜F)における化合物Aまたは化合物5を用いて、オンターゲットでの試験を行った。ATR阻害の読取り値であるCHK1 S345リン酸化をウェスタンブロットにより測定した。各化合物は、一定濃度のゲムシタビンとともに同様に用いた。

0191

HCC−70 TNBC、MDA−MB−468 TNBC、及びDMS−114細胞株に対し、さらなるオンターゲット試験を行った。ある範囲の化合物Aまたは化合物5濃度とともにSN38の設定濃度を使用した。様々なオンターゲット活性パラメータをウェスタンブロットにより試験し、測定した(図27A〜B)。

0192

SN38及び化合物Aまたは化合物5の添加の24時間後に、SUM149細胞の細胞周期特性を決定した(図28)。薬物を併用して与えた場合、対照に比べてより多くの割合の細胞がG2期で停止する。

0193

実施例20:MM398と併用した化合物A及び化合物5のリポソーム製剤の比較
DMS−114肺異種移植片モデルを使用して、MM398と併用したLs化合物AまたはLs化合物5の効果を測定した。2つの異なる用量の化合物Aまたは化合物5(20mpkまたは80mpk)とともに設定用量のMM398(5mpk)を使用した。CHK1 S345リン酸化のレベルを測定することによって、治療効果をアッセイした(図29)。

0194

MM398存在下でのLs化合物Aの効果もSUM−149細胞株において試験した。RPA2、DNAPK、CHK1、及びγH2AXのリン酸化レベルを測定することによって、治療効果をアッセイした。Ls化合物5はまた、MM398と併用しない場合も試験した(図30A〜C)。

0195

実施例21:マウスにおける三種陰性乳癌異種移植片に対するTEA.SOSを用いて調製したLs化合物5のin vivo抗腫瘍効力及び忍容性
MM−398(リポソームイリノテカン)と併用したATR阻害剤化合物5を充填したリポソームの抗腫瘍効力を、ヒトSUM−149(三種陰性乳癌)細胞株のモデルにおいて試験した。

0196

細胞は、American Type Culture Collection(Rockville、MD)から入手し、供給元の推奨に従って、10%ウシ胎仔血清、50U/mLペニシリンG、及び50μg/mLのストレプトマイシン硫酸塩を添加したRPMI培地中、37℃、5%CO2下で増殖させた。NCR nu/nuホモ接合性無胸腺雄ヌードマウス(4〜5週齢、少なくとも16gの体重)をCharles Riverから入手した。マウスに対し、30%マトリゲルを添加したPBS中に懸濁した107細胞を含有する0.1mLの懸濁液を、右脇腹に皮下接種した。腫瘍が150mm3〜350mm3の大きさに達した時点で、動物を以下の方法に従って処置群に割り当てた。動物を腫瘍サイズによってランク付けし、縮小腫瘍サイズの6つのカテゴリーに分けた。各サイズカテゴリーから1匹の動物を無作為に選択することにより、10匹の動物/群からなる4つの処置群を形成し、それにより、各処置群においてすべての腫瘍サイズを同等に表現した。以下の調製物の5つの尾静脈注射を、7日間の間隔で動物に与えた:1)対照(HEPES緩衝食塩水pH6.5);2)注射1回につき5mg/kgの用量のMM−398;3)注射1回につき80mg/kgのリポソーム化合物5;4)MM−398、続いて24時間間隔のリポソーム化合物5の注射;5))MM−398、続いてカプセル化していない遊離のATR阻害剤化合物Aの注射。注射用リポソームを実施例10に記載したように調製した。

0197

動物の体重及び腫瘍サイズを週2回モニタリングした。腫瘍の進行を、最大(長さ)及び最小(幅)軸に沿った腫瘍の触診及びキャリパー測定によって週2回モニタリングした。腫瘍サイズは、式:
腫瘍体積=[(長さ)×(幅)2]/2
を用いて、キャリパー測定により、週2回測定した。

0198

処置に関連する毒性を評価するために、動物の体重を週2回、測定した。群内の腫瘍がマウス体重の10%に達した時点で、群内の動物を安楽死させた。群全体にわたる平均腫瘍体積を一緒にプロットし、経時的に比較した。

0199

図31に示すように、リポソームATR阻害剤化合物5は、異種移植片モデルにおいて、MM−398の抗腫瘍効力を有意に向上させた。リポソーム化合物AとMM−398の併用治療は、動物の体重に影響を及ぼさなかった(図32)。

0200

実施例22:細胞株特性及びIncucyteデータとの比較
DNA損傷経路に関与する様々なタンパク質について、蛍光標識した細胞株パネルを特性決定した。がん細胞の親株に、NucLight Redレンチウイルスで形質導入し、ピューロマイシンで選択した。基底タンパク質レベルを測定し、ウェスタンブロット分析によって定量化した。定量化を実施した際、PDマーカーシグナルをβアクチンシグナルに対して正規化した。タンパク質レベルは、化合物5に対するin vitro細胞応答及び化学療法併用処置の尺度である細胞株の「積分スコア」と相関していた。積分スコアは以下のように計算することができる:

0201

図33及び34に示すように、96ウェルプレートに細胞株を播種し、各ウェルを化合物5の投与マトリックス及び化学療法に4日間曝露した。Incucyteアッセイを用いて動的細胞生存率を測定した。用量マトリックス中の各薬剤の組合せについて、用量組合せ特異的積分スコアを、正規化した細胞増殖曲線下面積を合計することによって計算した。用量マトリックス上の4つの最大スコアを平均することによって、細胞株特異的積分スコアを計算した。

0202

図35及び36に示すように、化合物5及びSN38に曝露した肺癌細胞株において、基底MRE11タンパク質レベル及び基底ATMレベルの両方が、細胞株の積分スコアと有意に相関していることが観察された。p53機能障害性バックグラウンドを有し、化合物5及びSN38に曝露した肺癌細胞において、積分スコアは、NBS、MRE11及びRAD50タンパク質レベルと相関する。「機能障害性p53」細胞は、ゼロではない基底p53タンパク質レベルを有する細胞である(ほとんどの細胞において、p53レベルは、処置後にウェスタンブロットでのみ見ることができる)。(図37図38及び図39参照)。

0203

実施例23:シグナル伝達実験:SN38と併用した、化合物5対化合物A:6つの異なるPDマーカー
図40〜44に示すように:SN38と併用した様々な用量の化合物5または化合物Aにがん細胞株を曝露した後、ウェスタンブロットによって薬力学的マーカーpChk1、pRPA2、pATR、pDNAPK、pChk2及びγH2AXを定量化した。HCC70、DMS114、MDAMB468、NCIH1299及びNCIH460細胞を12ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした後、SN38及び/またはATR阻害剤に曝露した。薬物曝露の24時間後、細胞をウェスタンブロッティング用に溶解した。定量化を行った際、PDマーカーシグナルをβアクチンシグナルに対して正規化した。

実施例

0204

実施例24:シグナル伝達実験:ゲムシタビンと併用した、化合物5対化合物A:3つの異なるPDマーカー
図45〜50に示すように:ATR阻害剤及び/またはゲムシタビンに曝露した後のDNA損傷経路に関与する様々なタンパク質について、6つの蛍光標識した細胞株を特性決定した。がん細胞の親株に、NucLight Redレンチウイルスで形質導入し、ピューロマイシンで選択した。16nMのゲムシタビンと併用した様々な用量の化合物5または化合物Aにがん細胞株を曝露した後、薬力学的マーカーpChk1、pATR及びγH2AXをウェスタンブロットによって定量化した。A549、NCIH23、DMS114、U20S、HCC827及びNCIH460細胞を12ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした後、SN38及び/またはATR阻害剤に曝露した。薬物曝露の6時間または18時間後、細胞をウェスタンブロッティング用に溶解した。定量化を行った際、PDマーカーシグナルをβアクチンシグナルに対して正規化した。

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