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課題・解決手段

本開示は、骨関節炎処置し、骨関節炎の1つまたは複数の症候を改善し、かつ骨関節炎成分を有する障害を処置するための、C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体の使用に関する。

概要

背景

本開示の背景
骨関節炎OA)は、関節の変性疾患である。これは、60を超える男性推定10%および女性の推定18%に生じる、最も多く見られる関節疾患である。実際に、OAは、老化過程にある成人における、痛みおよび障害の主要な原因の1つである。これは、原因が1つであるのではなく、関節の外傷年齢、および肥満を含む多くの素因の最終エンドポイントである複雑な疾患である。OA関節における最も共通した病理学的変化は、関節軟骨の分解、滑膜の炎症、軟骨下骨の深さの増大、および骨増殖体成長である。OAの現在の薬学治療は、疾患の炎症局面を標的としており、関節の根本的な変性または構造変化を標的としていない。これらの抗炎症性処置は、一時的な痛みの緩和しかもたらさない。それに対して、関節の変性を減少させ、または逆転すると考えられる処置は、患者の痛みおよび運動能に、より長い、永続的かつ有利な効果を有すると思われる。したがって、OA患者において関節変性を減少させることができ、かつ/または関節軟骨および関節構造修復することができる薬学的剤が必要とされている。

C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)(CNP前駆体タンパク質PPCについて、GenBankアクセッション番号NP_077720)は、(最も顕著には、中枢神経系、生殖器官、骨、および血管の内皮によって)広く発現される小さな単鎖ペプチドである。CNPは、2つの別個受容体ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR−B)およびナトリウム利尿ペプチド受容体C(NPR−C)に結合する。NPR−Bは、膜結合したグアニリルシクラーゼ多重遺伝子ファミリメンバーであり、CNP結合によって活性化されると、第2のメッセンジャ環状グアノシン一リン酸cGMP)を生成する。それに対して、NPR−Cは、いかなる細胞シグナル伝達ドメインも有しておらず、その代わりとして、細胞外空間からナトリウム利尿ペプチドを一掃するよう機能する。ゆえに、CNPがNPR−Cに結合すると、受容体は内在化して、CNPをリソソーム送達し、そこでCNPが分解される。これによって、CNPの有効細胞外濃度を低くする。

CNPは、ナトリウム利尿ペプチド前駆体C(NPPC)遺伝子から、126個のアミノ酸プレプロポリペプチドとして最初に生成される。シグナルペプチドの除去により、プロCNPが生じ、そしてエンドプロテアーゼフーリンによる更なる切断により、生物学的に活性な53アミノ酸ペプチド(CNP−53)が生じる。これが分泌されてさらにプロセシングされて、成熟した22アミノ酸ペプチド(CNP−22)が生じる。CNP−53およびCNP−22は、それらの分布が異なる。CNP−53は、主に組織中に見出される一方、CNP−22は主に、血漿および髄液中に見出される。軟骨中での主たるCNP形態は、現在公知でない。CNP−53およびCNP−22は双方とも、類似した動態でNPR−Bに結合して、双方ともcGMP産生を用量依存的に誘導する。cGMPによって媒介される下流シグナル伝達は、軟骨内骨形成を含む多種多様生物学的プロセスに影響する。したがって、この経路におけるいずれかの成分のレベルの増大または減少により、異常な骨成長または軟骨成長が導かれる虞がある。例えば、マウスモデルにおけるCNPまたはNPR−Bのいずれかのノックアウトにより、長骨および脊柱がより短い萎縮性表現型動物が生じる。また、CNPシグナル伝達を阻止するヒトNPR−Bの突然変異により、矮小発育症となる。それに対して、高いレベルのCNPを産生するように操作されたマウスは、長い長骨および脊柱を示す。

CNPの治療的可能性は、その短い半減期によって制限される。CNPは、2つの機構:1)CNPを迅速に分解する、膜結合中性エンドペプチターゼNEP)の作用を介するもの、および2)CNPを、これが分解されるリソソームに向ける結合NPR−Cを介するものによって一掃される。これらの2つのクリアランス機構が、CNPの短い半減期(約2.6分)の原因である。CNP濃度を、ヒト血漿中で典型的に見出されるレベル(約5pM)を超えて増大させるには、連続的な注入が必須であった。これが、その治療的可能性を厳しく制限している。この問題を克服するために、半減期がより長いCNP変異体が開発されている。軟骨成長を刺激する潜在的役割を考えると、CNP変異体は、より長い永続的な緩和をOA患者にもたらす新規クラスの治療薬を代表する。

概要

本開示は、骨関節炎を処置し、骨関節炎の1つまたは複数の症候を改善し、かつ骨関節炎成分を有する障害を処置するための、C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体の使用に関する。

目的

種々の態様において、本開示は、原発性骨関節炎もしくは続発性骨関節炎、または1つもしくは複数の骨関節炎関連症候を処置する方法であって、CNP変異体またはCNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含み、当該投与工程は、原発性骨関節炎もしくは続発性骨関節炎、または疾患の前記1つもしくは複数の症候を処置する、方法を提供する

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請求項1

対象において骨関節炎処置する方法であって、CNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。

請求項2

対象において軟骨成長を増大させる方法であって、CNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。

請求項3

対象において軟骨変性遅延させる方法であって、CNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。

請求項4

骨関節炎を患う対象において骨関節炎の症候を改善する方法であって、CNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。

請求項5

骨関節炎患者において運動技術(または運動能)を向上させる方法であって、CNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。

請求項6

骨関節炎患者において運動能の退化阻害する方法であって、CNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。

請求項7

骨関節炎を患う対象の罹患関節において可動域を拡大させる方法であって、CNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。

請求項8

骨関節炎を患う対象の罹患関節において硬直を軽減する方法であって、CNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。

請求項9

対象において滑膜炎を軽減する方法であって、CNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。

請求項10

対象において骨関節炎の開始を予防する方法であって、CNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。

請求項11

対象において骨増殖体成長を減少させる方法であって、CNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。

請求項12

前記CNP変異体は、からなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

前記CNP変異体は、からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。

請求項14

前記骨関節炎は、原発性骨関節炎である、請求項1に記載の方法。

請求項15

前記骨関節炎は、続発性骨関節炎である、請求項1に記載の方法。

請求項16

前記CNP変異体は、軟骨変性が生じた後に投与される、請求項14に記載の方法。

請求項17

前記CNP変異体は、関節の損傷または外傷に応じて投与される、請求項15に記載の方法。

請求項18

前記CNP変異体は、関節の損傷または外傷から1ヵ月以内に投与される、請求項17に記載の方法。

請求項19

前記CNP変異体を含む組成物は、関節内に投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

請求項20

前記CNP変異体を含む組成物は、皮下に投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

請求項21

前記CNP変異体を含む組成物は、1週間に3回、1週間に2回、1週間に1回、または2週間に1回投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

請求項22

軟骨成長の前記増大または軟骨変性の前記遅延は、前記対象の関節において観察される、請求項2または3に記載の方法。

請求項23

前記関節は、、肩、、指、手、手首、股、首、脊柱、および背下部からなる群より選択される、請求項22に記載の方法。

請求項24

軟骨の損傷または成長は、軟骨細胞の死/損失プロテオグリカンPG)の損失、またはコラーゲンの損失もしくはフィブリル化によって分析される、請求項2または3に記載の方法。

請求項25

前記CNP変異体を含む組成物は、薬学的に許容される賦形剤キャリア、または希釈剤をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

請求項26

前記組成物は、pHが約4から約6であるクエン酸クエン酸バッファーまたは酢酸/酢酸バッファーを含む調合物から調製された凍結乾燥剤である、請求項25に記載の方法。

請求項27

第2の剤の投与をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

請求項28

前記第2の剤は、抗炎症剤、NSAID、コルチコステロイド、およびヒアルロン酸からなる群より選択される、請求項27に記載の方法。

請求項29

前記罹患関節の可動域は、股関節屈曲、股関節の伸展、股関節の外転、股関節の内転、膝の屈曲、または膝の伸展を測定することによって判定される、請求項7に記載の方法。

請求項30

前記対象は、少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルが増大していると同定されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。

請求項31

前記少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーは、CNP、cGMPコラーゲンII型プロペプチドおよびそのフラグメント、コラーゲンII型およびそのフラグメント、オステオカルシン増殖細胞核抗原(PCNA)、I型プロコラーゲンのプロペプチド(PINP)およびそのフラグメント、コラーゲンI型およびそのフラグメント、ならびにコンドロイチン硫酸アグリカンからなる群より選択される、請求項30に記載の方法。

技術分野

0001

本開示の分野
本開示は、骨関節炎処置し、骨関節炎の1つまたは複数の症候を改善し、かつ骨関節炎成分を有する障害を処置するための、C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)の変異体の使用に関する。

背景技術

0002

本開示の背景
骨関節炎(OA)は、関節の変性疾患である。これは、60を超える男性推定10%および女性の推定18%に生じる、最も多く見られる関節疾患である。実際に、OAは、老化過程にある成人における、痛みおよび障害の主要な原因の1つである。これは、原因が1つであるのではなく、関節の外傷年齢、および肥満を含む多くの素因の最終エンドポイントである複雑な疾患である。OA関節における最も共通した病理学的変化は、関節軟骨の分解、滑膜の炎症、軟骨下骨の深さの増大、および骨増殖体成長である。OAの現在の薬学治療は、疾患の炎症局面を標的としており、関節の根本的な変性または構造変化を標的としていない。これらの抗炎症性の処置は、一時的な痛みの緩和しかもたらさない。それに対して、関節の変性を減少させ、または逆転すると考えられる処置は、患者の痛みおよび運動能に、より長い、永続的かつ有利な効果を有すると思われる。したがって、OA患者において関節変性を減少させることができ、かつ/または関節軟骨および関節構造修復することができる薬学的剤が必要とされている。

0003

C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)(CNP前駆体タンパク質PPCについて、GenBankアクセッション番号NP_077720)は、(最も顕著には、中枢神経系、生殖器官、骨、および血管の内皮によって)広く発現される小さな単鎖ペプチドである。CNPは、2つの別個受容体ナトリウム利尿ペプチド受容体B(NPR−B)およびナトリウム利尿ペプチド受容体C(NPR−C)に結合する。NPR−Bは、膜結合したグアニリルシクラーゼ多重遺伝子ファミリメンバーであり、CNP結合によって活性化されると、第2のメッセンジャ環状グアノシン一リン酸cGMP)を生成する。それに対して、NPR−Cは、いかなる細胞シグナル伝達ドメインも有しておらず、その代わりとして、細胞外空間からナトリウム利尿ペプチドを一掃するよう機能する。ゆえに、CNPがNPR−Cに結合すると、受容体は内在化して、CNPをリソソーム送達し、そこでCNPが分解される。これによって、CNPの有効細胞外濃度を低くする。

0004

CNPは、ナトリウム利尿ペプチド前駆体C(NPPC)遺伝子から、126個のアミノ酸プレプロポリペプチドとして最初に生成される。シグナルペプチドの除去により、プロCNPが生じ、そしてエンドプロテアーゼフーリンによる更なる切断により、生物学的に活性な53アミノ酸ペプチド(CNP−53)が生じる。これが分泌されてさらにプロセシングされて、成熟した22アミノ酸ペプチド(CNP−22)が生じる。CNP−53およびCNP−22は、それらの分布が異なる。CNP−53は、主に組織中に見出される一方、CNP−22は主に、血漿および髄液中に見出される。軟骨中での主たるCNP形態は、現在公知でない。CNP−53およびCNP−22は双方とも、類似した動態でNPR−Bに結合して、双方ともcGMP産生を用量依存的に誘導する。cGMPによって媒介される下流シグナル伝達は、軟骨内骨形成を含む多種多様生物学的プロセスに影響する。したがって、この経路におけるいずれかの成分のレベルの増大または減少により、異常な骨成長または軟骨成長が導かれる虞がある。例えば、マウスモデルにおけるCNPまたはNPR−Bのいずれかのノックアウトにより、長骨および脊柱がより短い萎縮性表現型動物が生じる。また、CNPシグナル伝達を阻止するヒトNPR−Bの突然変異により、矮小発育症となる。それに対して、高いレベルのCNPを産生するように操作されたマウスは、長い長骨および脊柱を示す。

0005

CNPの治療的可能性は、その短い半減期によって制限される。CNPは、2つの機構:1)CNPを迅速に分解する、膜結合中性エンドペプチターゼNEP)の作用を介するもの、および2)CNPを、これが分解されるリソソームに向ける結合NPR−Cを介するものによって一掃される。これらの2つのクリアランス機構が、CNPの短い半減期(約2.6分)の原因である。CNP濃度を、ヒト血漿中で典型的に見出されるレベル(約5pM)を超えて増大させるには、連続的な注入が必須であった。これが、その治療的可能性を厳しく制限している。この問題を克服するために、半減期がより長いCNP変異体が開発されている。軟骨成長を刺激する潜在的役割を考えると、CNP変異体は、より長い永続的な緩和をOA患者にもたらす新規クラスの治療薬を代表する。

0006

本開示の要約
本開示は、原発性骨関節炎もしくは続発性骨関節炎、または1つもしくは複数の骨関節炎関連症候を処置するためのCNP変異体の使用に関する。CNP変異体の投与により、処置動物において、罹患関節の可動域が拡大し得、かつ軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨への骨関節炎関連損傷が遅延または低下し得ることが、本明細書において開示される。種々の態様において、CNP変異体は、Gly−CNP−37またはPro−Gly−CNP−37である。

0007

種々の態様において、本開示は、原発性骨関節炎もしくは続発性骨関節炎、または1つもしくは複数の骨関節炎関連症候を処置する方法であって、CNP変異体またはCNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含み、当該投与工程は、原発性骨関節炎もしくは続発性骨関節炎、または疾患の前記1つもしくは複数の症候を処置する、方法を提供する。また、意図されるのは、対象において軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨の成長を増大させる方法であって、CNP変異体またはCNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法である。本開示はまた、軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨の骨関節炎関連変性を遅延させ、予防し、または阻害する方法であって、CNP変異体またはCNP変異体を含む組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を意図する。また、本開示は、骨関節炎によって影響を受けた関節において、可動域を拡大させ、または硬直を軽減する方法であって、CNP変異体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。さらに、本開示は、骨関節炎によって影響を受けた関節において、骨増殖体の成長を減少させる方法であって、CNP変異体を、骨関節炎を患う対象に投与することを含む方法を提供する。

0008

種々の態様において、CNP変異体は、以下からなる群より選択される:

0009

種々の態様において、軟骨、石灰化した軟骨、もしくは軟骨下骨の成長の増大、または軟骨、石灰化した軟骨、もしくは軟骨下骨の変性の遅延が、対象の、肩、、指、手、手首、股、首、足首、脊柱、および/または対象の背下部において観察される。種々の態様において、軟骨の損傷または成長が、軟骨細胞の死/損失プロテオグリカンPG)の損失、およびコラーゲンの損失またはフィブリル化によって分析される。

0010

また、提供されるのは、骨関節炎の対象において関節の可動域を拡大させる方法であって、CNP変異体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法である。種々の態様において、CNP変異体は、股関節屈曲、股関節の伸展、股関節の外転、股関節の内転、膝の屈曲、または膝の伸展によって測定される可動域を、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、または75%拡大させる。また、詳細な説明においてさらに詳細に記載されるもの等の、種々の患者および痛みの尺度で評価される、骨関節炎を含む関節炎の症候が、CNP変異体の投与により向上すると考えられる。種々の態様において、CNP変異体は、Gly−CNP−37またはPro−Gly−CNP−37である。

0011

本発明のさらに別の態様は、哺乳類において骨増殖体の成長または形成を予防し、阻害し、または遅延させる方法であって、CNP変異体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。種々の態様において、骨増殖体の形成または成長は、対象において、骨関節炎と関連している。骨増殖体の形成または成長、およびその形成または成長の予防または阻害は、経時的に、そしてCNP変異体の処置レジメン中に、骨増殖体のサイズの物理的測定によって判定され得る。種々の態様において、CNP変異体は、Gly−CNP−37またはPro−Gly−CNP−37である。

0012

本発明の別の態様は、哺乳類において軟骨下骨または骨端小柱骨の異常な成長を予防し、阻害し、または遅延させる方法であって、CNP変異体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。一局面において、軟骨下骨または骨端骨の異常な成長は、骨の肥厚によって明示される。別の局面において、軟骨下骨または骨端小柱骨の異常な成長は、骨関節炎、骨粗鬆症、または骨硬化症と関連している。種々の態様において、CNP変異体は、Gly−CNP−37またはPro−Gly−CNP−37である。

0013

本発明のさらに別の態様は、哺乳類において滑膜炎(すなわち滑膜炎)を予防し、阻害し、または遅延させる方法であって、CNP変異体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。一局面において、滑膜炎は、少なくとも、罹患関節中への単核細胞浸潤によって、明示される。別の局面において、滑膜炎は、骨関節炎と関連している。種々の態様において、CNP変異体は、Gly−CNP−37またはPro−Gly−CNP−37である。

0014

一態様において、CNP変異体は、関節内に投与される。また、CNP変異体は、他の経路によって投与されることも意図される。例示的な投与経路として、以下に限定されないが、皮下、関節内、静脈内、動脈内、腹膜内、筋肉内、皮内、腹膜内、筋肉内、皮内、髄腔内、局所的、経皮、または経粘膜投与が挙げられる。

0015

別の態様において、CNP変異体は、関節の外傷または損傷に応じて投与される。更なる態様において、CNP変異体は、関節の外傷または損傷の1ヵ月以内に投与される。別の態様において、CNP変異体は、関節の外傷または損傷から1週以内に投与される。他の態様において、CNP変異体は、軟骨変性が生じた後に投与される。

0016

種々の態様において、本開示は、骨関節炎を患う対象において、少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルに対するCNP変異体の作用を評価する方法であって、CNPペプチドまたはCNP変異体を投与した、骨関節炎を患う対象に由来する生体サンプル中の少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイすることを含む方法を提供する。一態様において、CNP変異体は、少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイする前に、対象に投与される。

0017

種々の態様において、本明細書において意図されるのは、骨関節炎、または1つもしくは複数の骨関節炎関連症候もしくは徴候を処置する方法であって、CNP変異体を対象に投与することを含み、対象は、少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルが高いと同定された、方法である。種々の態様において、少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーは、CNP、cGMP、コラーゲンII型プロペプチドおよびそのフラグメント、コラーゲンII型およびそのフラグメント、シンデカン−3、アネキシンVI、増殖細胞核抗原(PCNA)、I型プロコラーゲンのプロペプチド(PINP)およびそのフラグメント、コラーゲンI型およびそのフラグメント、ならびにコンドロイチン硫酸アグリカンからなる群より選択される。

0018

種々の態様において、本開示は、CNP変異体を含む組成物の使用を提供する。一態様において、組成物はさらに、薬学的に許容される賦形剤キャリア、または希釈剤を含む。一態様において、組成物は、pHが約4から約6であるクエン酸クエン酸バッファーまたは酢酸/酢酸バッファーを含む製剤から調製された凍結乾燥剤である。

0019

また、意図されるのは、第2の剤の投与をさらに含む、本明細書中に記載される処置の方法である。種々の態様において、第2の剤は、抗炎症剤、NSAID、コルチコステロイド、およびヒアルロン酸からなる群より選択される。

0020

種々の態様において、本方法に用いられるCNP変異体は、疎水性の酸に取り付けられていてよく、または1つもしくは複数の疎水性の酸に取り付けられていてよい。疎水性の酸の非限定的な例として、直鎖状または分枝状の、飽和または不飽和C5〜C12カルボン酸(例えば、ペンタン酸ヘプタン酸等)および天然脂肪酸が挙げられる。疎水性の酸は、1つまたは複数のアミノ酸残基N末端C末端、および/または側鎖に取り付けられていてよい。一態様において、疎水性の酸は、N末端に結合されている。

0021

さらに別の態様において、本方法に用いられるCNP変異体は、CNP変異体、および切断可能ペプチドもしくは切断可能タンパク質、またはペプチドタグを含むキメラまたは融合タンパク質である。例示的な切断可能タンパク質または切断可能ペプチドとして、以下に限定されないが、ヒスチジン(例えばヘキサHis)タグ;TAF12:ヒト転写因子TAF12;KSI:ケトステロイドイソメラーゼ;MBP:マルトース結合タンパク質;β−Gal:β−ガラクトシダーゼ;GST:グルタチオン−S−トランスフェラーゼ;Trx:チオレドキシン;CBD:キチン結合ドメイン;BMPM:BMP−2突然変異、SUMO、CAT、TrpE、ブドウ球菌プロテインA連鎖球菌タンパク質デンプン結合タンパク質エンドグルカナーゼAのセルロース結合ドメインエキソグルカナーゼCexのセルロース結合ドメイン、ビオチン結合ドメイン、recA、Flag、c−Myc、ポリ(His)、ポリ(Arg)、ポリ(Asp)、ポリ(Gln)、ポリ(Phe)、ポリ(Cys)、緑色蛍光タンパク質赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、ビオチン、アビジンストレプトアビジン、抗体エピトープ、およびそれらのフラグメントが挙げられる。

0022

種々の態様において、CNP変異体は、モノマーであってもダイマーであってもよい。関連する態様において、二量体CNP変異体のモノマーは、リンカーを介して、もしくはリンカーなしでN末端がN末端に、リンカーを介して、もしくはリンカーなしでN末端がC末端に、またはリンカーを介して、もしくはリンカーなしでC末端がC末端に取り付けられ得る。

0023

本明細書中に開示される態様のいずれかにおいて、CNP変異体は、野生型CNP−22と実質的に同じ、またはそれよりも良好な生物学的活性を有し得る。例えば、CNP変異体は、野生型CNP−22の活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくはそれ以上を保持し得、または例えば、cGMPの生成を刺激する、NPR−Bとの相互作用に関して、CNP−22よりも大きな活性を有し得る。代わりに、または加えて、CNP変異体は、野生型CNP−22の活性の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくはそれ以上を保持し得、または、以下に限定されないが、軟骨細胞増殖軟骨細胞分化分裂促進因子活性化タンパク質MAPキナーゼ/MEK(Raf−1)キナーゼシグナル伝達経路の阻害、および軟骨内骨化の促進を含む、軟骨内骨成長および軟骨細胞活性の調整に関して、CNP−22よりも大きな活性を有し得る。本明細書中に記載される態様のいずれかにおいて、CNP変異体は、野生型CNP−22のアミノ酸6〜22または1〜22と少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含み得る。

0024

種々の態様において、CNP変異体は、任意で、例えばN末端および/またはC末端にて、軟骨標的を促進し、腎クリアランスを減少させ、かつ/またはNEP分解に対する耐性を増大させるための結合または伸長を有し得る。そのような結合または伸長は、例えば、ポリAsp、ポリGlu、軟骨標的ペプチドシアロタンパク質、PEG、炭水化物、疎水性の酸、NPPC、もしくは非CNP(ポリ)ペプチド、またはそれらの組合せから形成され、またはこれらに由来する分子または配列を含み得る。

0025

CNP変異体は、疎水性のポリマー部分または非ポリマー部分、例えばヘプタン酸、ペンタン酸、または脂肪酸に結合され得ることがさらに意図される。疎水性部分は、以下に限定されないが、リジンセリンシステイン、もしくはトレオニンを含むアミノ酸残基の側鎖に結合され得、またはCNP変異体のN末端および/もしくはC末端に取り付けられ得る。

0026

種々の態様において、本方法に有用なCNP変異体は、pIが約8から約10.5、または約8.5から約10の範囲にある。

0027

種々の態様において、本開示は、CNP変異体、任意で別の生物学的に活性な剤、および任意で薬学的に許容される賦形剤、キャリア、または希釈剤を含む薬学的組成物の使用を提供する。種々の態様において、組成物は、非経口投与に適した滅菌薬学的組成物である。一部の態様において、組成物は、実質的に純粋な、例えば少なくとも約90%または95%純粋なCNP変異体を含む。一部の態様において、組成物は、約5%、4%、3%、2%、1%、または0.5%未満の混入物、例えば、他のヒトタンパク質ブタタンパク質、または(所望のCNP変異体以外の)CNP−53もしくはそのフラグメントを含有する。特定の態様において、滅菌組成物は、本明細書中に開示されるCNP反応性の任意の症状または障害を処置または予防するために、対象に投与される。

0028

本明細書において有用なCNP変異体は、有利には、CNP活性を保持し、かつ血清半減期の増大を示す。CNP活性の保持は、例えば、所望のインビボ生物学的効果の保持、または同じ濃度(例えば、CNPペプチド1μM、またはED80を超える)の下での、CNP−22のcGMP刺激活性の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、もしくは少なくとも約100%の保持として、示され得る。一部の態様において、CNP変異体は、CNP−22と比較して、血清半減期の少なくとも約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、または40倍の増大を示す。

0029

関連する態様において、本明細書中に記載されるCNP変異体は、野生型CNP−22と比較して、NEP耐性が増大し、そして半減期の増大を示す。一態様において、CNP変異体の半減期は、野生型CNP−22と比較して、約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または約100%増大する。

0030

特定の態様において、本方法に用いられる、本明細書中に記載されるCNP変異体は、野生型CNP−22と比較して、約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、またはそれ以上、cGMP産生をインビトロで増大させ、cGMP産生をインビボで増大させ、軟骨もしくは骨の形成もしくは成長と関連した1つもしくは複数のバイオマーカーのレベルをインビボで増大させ、NEP切断に対する耐性をインビトロで増大させ、血漿半減期もしくは血清半減期をインビボで増大させ、生体利用性をインビボで増大させ、または軟骨の成長もしくは再生をインビボで増大させ、あるいはそのような増大を組み合わせてもたらす。

0031

種々の態様において、本明細書中に記載されるCNP変異体は、約5または10nmol/kgから約300nmol/kg、または約20nmol/kgから約200nmol/kgの範囲の用量にて投与される。一部の態様において、CNP変異体は、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、750、1000、1250、1500、1750、もしくは2000nmol/kgの用量、または処置医師によって適切であると考えられた他の用量にて投与される。他の態様において、CNP変異体は、約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800μg/kg、もしくは約1mg/kg、1.25mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kgの用量、または処置医師によって適切であると考えられた他の用量にて投与される。

0032

種々の態様において、CNP変異体は、単回処置で、または複数回投与で投与される。複数回投与は、処置の経過の全体にわたって毎日施されても、複数回投与で施されてもよい。種々の態様において、CNP変異体は、単回投与で、または複数回投与で、毎日、隔日、3日毎、1週あたり2回、1週あたり3回、毎週、隔週、3週毎、毎月、6週毎、2ヵ月毎、3ヵ月毎、または処置医師によって適切であると考えられるように投与されることが意図される。

0033

特定の態様において、CNP変異体の投与は、予防的処置または治療的処置の期間に続く、回復期間も見越すように調整される。例えば、CNP変異体は、関節内に、皮下に、静脈内に、または別のモードによって、しばらくの間、毎日または1週あたり複数回投与されてから、処置なしの期間が続いてよく、そしてサイクルが繰り返される。一部の態様において、処置の初期の期間(例えば、毎日、または1週あたり複数回のCNP変異体が投与される)は、3日間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、または12週間である。関連する態様において、処置なしの期間は、3日間、1週間、2週間、3週間、または4週間続く。特定の態様において、CNP変異体の投薬レジメンは、3日間、毎日に続いて3日オフ;または1週間、毎日もしくは1週あたり複数回に続いて3日もしくは1週オフ;または2週間、毎日もしくは1週あたり複数回に続いて1週もしくは2週オフ;または3週間、毎日もしくは1週あたり複数回に続いて1週、2週、もしくは3週オフ;または4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、もしくは12週間、毎日もしくは1週あたり複数回に続いて1週、2週、3週、もしくは4週オフである。

0034

付加的な態様において、本開示は、骨関節炎関連症候がある骨関節炎または障害を処置する方法であって、CNP変異体を対象に投与することと、対象において(例えば、対象由来生体サンプルにおいて)少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルをモニタすることとを含み、軟骨関連バイオマーカーのレベルの増大または減少が、対象に対するCNP変異体の治療的効果を示す、方法を提供する。一部の態様において、バイオマーカーのレベルが、軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨の形成または成長に関連して増大する場合、当該バイオマーカーのレベルの増大は、対象に対するCNP変異体の治療的効果を示す。他の態様において、バイオマーカーのレベルが、軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨の形成または成長に関連して減少する場合、当該バイオマーカーのレベルの減少は、対象に対するCNP変異体の治療的効果を示す。

0035

更なる態様において、治療方法はさらに、CNP変異体の投与の量(または用量)または頻度を調整することを含み:
(i)CNP変異体の投与の量(もしくは用量)もしくは頻度は、少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルであって、軟骨の形成もしくは成長に関連して増大するバイオマーカーのレベルが、標的レベル未満であるならば、増やされ;または
(ii)CNP変異体の投与の量(もしくは用量)もしくは頻度は、少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルであって、軟骨の形成もしくは成長に関連して増大するバイオマーカーのレベルが、標的レベルを超えるならば、減らされ;または
(iii)CNP変異体の投与の量(もしくは用量)もしくは頻度は、少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルであって、軟骨の形成もしくは成長に関連して減少するバイオマーカーのレベルが、標的レベルを超えるならば、増やされ;または
(iv)CNP変異体の投与の量(もしくは用量)もしくは頻度は、少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルであって、軟骨の形成もしくは成長に関連して減少するバイオマーカーのレベルが、標的レベル未満であるならば、減らされる。

0036

バイオマーカーの標的レベルが、対象における治療的効果、および/または障害の症候もしくは症状を緩和もしくは改善するのに有益な効果と関連するバイオマーカーのレベルまたはレベルの範囲を指すことが意図される。特定の態様において、標的レベルを上回る、または下回るバイオマーカーのレベルが、対象にとって有害であり得る。

0037

他の態様において、本開示は、CNP変異体の投与の、軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨の形成または成長に対する効果を評価する方法を意図する。一態様において、本方法は、CNP変異体が投与された対象において少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイまたは測定して、CNP変異体の、軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨のインビボ形成およびインビボ成長に対する効果を評価することを実現する。関連する態様において、少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルの増大は、CNP変異体の投与が、軟骨、石灰化した軟骨、または軟骨下骨の形成または成長に正の効果を有しており、骨関節炎、およびCNP活性の減少と関連した他の軟骨関連疾患または障害に有用な処置であることを示し得る。例示的な軟骨関連バイオマーカーとして、以下に限定されないが、CNP(例えば、CNP−22またはCNP−53の内因性レベル)、cGMP、コラーゲンII型のプロペプチドおよびそのフラグメント、コラーゲンII型およびそのフラグメント、シンデカン−3、アネキシンVI、増殖細胞核抗原(PCNA)、I型プロコラーゲンのプロペプチド(PINP)およびそのフラグメント、コラーゲンI型およびそのフラグメント、ならびにコンドロイチン硫酸アグリカンが挙げられる。

0038

更なる態様において、本開示は、CNP変異体の、対象における少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルに対する効果を評価する方法であって、CNP変異体が投与された対象由来の生体サンプル中で軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイまたは測定することを含む方法を意図する。一部の態様において、本方法はさらに、軟骨関連バイオマーカーのレベルをアッセイまたは測定する前に、CNP変異体を対象に投与することを含む。

0039

軟骨関連バイオマーカーに関係する方法(例えば、治療方法、診断方法、およびアッセイ方法)の一部の態様において、CNP変異体は、Gly−CNP−37であり、Gly−CNP−37とも呼ばれ、または本明細書中に記載されるCNPペプチドおよびCNP変異体のいずれかであり、本明細書中に示されるCNP変異体を含む。そのような方法の特定の態様において、CNPペプチドまたはCNP変異体は、CNP−22でもCNP−53でもない。特定の態様において、CNP変異体は、Pro−Gly−CNP−37である。

0040

骨関節炎、および骨関節炎に伴う、本明細書中に記載される症候または他の生理学的徴候の処置用医薬の調製における、本明細書中に記載される上述のCNP変異体のいずれかの使用もまた意図される。上述のペプチドまたはポリペプチドのいずれかを、任意で、適切な使用説明書と共に含むシリンジ、例えば単回使用シリンジもしくは予め充填されたシリンジ、滅菌シールコンテナ、例えばバイアルボトルベッセル、および/またはキットもしくはパッケージもまた意図される。

0041

本明細書中に記載される各特徴は、本開示の局面のいずれかの非限定的な解説用の例であり、したがって、本明細書中に記載される他のいかなる特徴とも組合せ可能であることが意図されていると理解される。例えば、特徴が、「一態様」、「特定の態様」、「一部の態様」、「更なる態様」、「特定の例示的な態様」、および/または「別の態様」等の文言と共に記載されている場合、これらの特徴はそれぞれ、本明細書中に記載される他のいかなる特徴とも組み合わせられてよく、考えられる組合せが全て一覧にされている必要はない。範囲に収まる値の例が開示されている場合、これらの例はいずれも、範囲の考えられるエンドポイントとして意図され、そのようなエンドポイント間のあらゆる全ての数値が意図され、そして上下のエンドポイントのあらゆる全ての組合せが想定されている。

図面の簡単な説明

0042

図1は、低い用量(35.5μg)または高い用量(110μg)でのGly−CNP−37投与が、脛骨における軟骨変性の有意な減少を示したことを示している。ビヒクルに対するANOVAについて*p≦0.05。
図2は、深さ比がGly−CNP−37処置群において向上していたことを示している。ビヒクルに対するANOVAについて*p≦0.05。
図3は、いずれかの変性によって影響を受けた軟骨の幅が、Gly−CNP−37処置群において向上していたことを示すグラフである。ビヒクルに対するANOVAについて*p≦0.05。
図4は、Gly−CNP−37処置動物が大幅な脛骨軟骨変性の50%超の向上を示したことを示している。
図5は、110μgでのGly−CNP−37が、総関節スコア大腿骨を含まない)を有意に減少させたことを示している。ビヒクルに対するANOVAについて*p≦0.05。
図6は、大腿骨スコアが計算に含まれる場合の、Gly−CNP−37処置動物についての総関節スコアを表すグラフである。
図7は、Gly−CNP−37処置動物および未処置対照動物における内側および外側の成長板の厚さを示すグラフである。ビヒクルに対するANOVAについて*p≦0.05。
図8は、外側の厚さを内側の厚さから減算して、2つの間の差異を判定した、図7のデータを表すグラフである。ビヒクルに対するANOVAについて*p≦0.05。
図9は、Gly−CNP−37処置ラットまたは未処置対照ラットにおける歩行スコアの経過を表している。ビヒクルに対するANOVAについて*p≦0.05。
図10は、図9の歩行スコアの曲線下面積(AUC)を表すグラフである。全ての値が、ビヒクルに対するANOVAについてp≦0.05である。
図11は、Pro−Gly−CNP−37またはGly−CNP−37で処置した動物についての総軟骨変性幅の測定値を示している。ビヒクルに対するANOVAについて*p≦0.05。
図12は、Pro−Gly−CNP−37またはGly−CNP−37で処置した動物についての大幅な軟骨変性幅の測定値を示している。ビヒクルSCに対するt検定について†p<0.05。
図13は、Pro−Gly−CNP−37またはGly−CNP−37で処置した動物についての平均内側脛骨骨増殖体スコアを示している。ビヒクルSCに対するt検定について†p<0.05。
図14は、Pro−Gly−CNP−37またはGly−CNP−37で処置した動物についてのマイクロメートルの平均成長板厚さを示している。ビヒクルに対するANOVAについて*p≦0.05。ビヒクルSCに対するt検定について†p<0.05。
図15は、Pro−Gly−CNP−37またはGly−CNP−37で処置した動物についての平均総関節スコア(マイナス大腿骨)を示している。ビヒクルに対するANOVAについて*p≦0.05。ビヒクルSCに対するt検定について†p<0.05。
図16は、Pro−Gly−CNP−37またはGly−CNP−37で処置した動物についての平均滑膜炎スコアを示している。
図17は、Pro−Gly−CNP−37またはGly−CNP−37で処置した動物についての体重の平均変化を示している。ビヒクルに対するANOVAについて*p≦0.05。
図18は、Pro−Gly−CNP−37またはGly−CNP−37で処置した動物についての平均歩行スコアを示している。値は、ビヒクルSCに対するt検定についてp<0.05である。
図19は、各試験群についての、関節内経路または皮下経路を介したPro−Gly−CNP−37の投与後の、動物におけるPro−Gly−CNP−37の平均血漿濃度についての時間的経過を示している。各線について、対応する試験群の数を、対応するデータ線の直ぐ上に示している。
図20は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Pro−Gly−CNP−37で(関節内(「IA」)、そして皮下(「SC」))処置した動物についての平均総脛骨軟骨変性幅を示している(処置投与は、外科手術後21日目に始めて、データを40日目に収集した)。
図21は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Pro−Gly−CNP−37で(関節内(「IA」)、そして皮下(「SC」))処置した動物についての平均の大幅な脛骨軟骨変性幅を示している(処置投与は、外科手術後21日目に始めて、データを40日目に収集した)。
図22は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Pro−Gly−CNP−37で(関節内(「IA」)、そして皮下(「SC」))処置した動物について(外科手術の21日後に処置投与を開始)、3つのゾーンのそれぞれおよび合計についての平均脛骨軟骨変性スコアを示している。各IAまたはSCビヒクル(40日目)対照に対するK−W検定(Dunnの事後)について*p<0.05。IAビヒクル(40日目)に対するM−W検定について†p<0.05。SCビヒクル(40日目)に対するM−W検定について‡p<0.05。
図23は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Pro−Gly−CNP−37で(関節内(「IA」)、そして皮下(「SC」))処置した動物について(外科手術の21日後に処置投与を開始)、3つのゾーンのそれぞれおよび平均についての平均脛骨軟骨変性深さ比を示している。各IAまたはSCビヒクル(40日目)対照に対するK−W検定(Dunnの事後)について*p<0.05。IAビヒクル(40日目)に対するM−W検定について†p<0.05。SCビヒクル(40日目)に対するM−W検定について‡p<0.05。
図24は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Pro−Gly−CNP−37で(関節内(「IA」)、そして皮下(「SC」))処置した動物について(外科手術の21日後に処置投与を開始)、3つのゾーンのそれぞれおよび平均についての大腿骨ありの総関節スコアを示している。IAビヒクル(40日目)に対するM−W検定について†p<0.05。SCビヒクル(40日目)に対するM−W検定について‡p<0.05。
図25は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Pro−Gly−CNP−37で(関節内(「IA」)、そして皮下(「SC」))処置した動物について(外科手術の21日後に処置投与を開始)、3つのゾーンのそれぞれおよび平均についての大腿骨なしの総関節スコアを示している。IAビヒクル(40日目)に対するM−W検定について†p<0.05。SCビヒクル(40日目)に対するM−W検定について‡p<0.05。
図26は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Pro−Gly−CNP−37で(関節内(「IA」)、そして皮下(「SC」))処置した動物について、骨増殖体スコアを示している(外科手術の21日後に処置投与を開始、40日目にデータを収集)。
図27は、後期段階の骨関節炎モデルにおいて、Pro−Gly−CNP−37で(関節内(「IA」)、そして皮下(「SC」))処置した動物について(外科手術の21日後に処置投与を開始)、体重の変化を示している。各IAまたはSCビヒクル(40日目)対照に対するK−W検定(Dunnの事後)について*p<0.05。IAビヒクル(40日目)に対するM−W検定について†p<0.05。

0043

本開示の詳細な説明
本開示は、CNP変異体を用いて骨関節炎、骨関節炎の1つまたは複数の症候、および骨関節炎が関連する症候または成分を有する他の障害を処置する方法に関する。

0044

A.定義
特に明記されない限り、明細書および特許請求の範囲を含む本出願において用いられる以下の用語は、以下で与えられる定義を有する。

0045

用語「約」または「おおよそ」は、当技術分野の当業者によって判定された特定の値についての許容可能な誤差を意味する。これは、部分的に、値がどのように測定または判定されたかによって決まる。特定の態様において、用語「約」または「おおよそ」は、1、2、3、または、4標準偏差以内であることを意味する。特定の態様において、用語「約」または「おおよそ」は、所定の値または範囲の30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、または0.05%以内であることを意味する。用語「約」または「おおよそ」は、一連の2つ以上の数値における第1の数値に先行する場合はいつでも、その一連の数値のそれぞれに当てはまることが理解される。

0046

標準的な化学用語の定義が、Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3rd Edition, Vols. A and B (Plenum Press, New York 1992)を含む参考資料中に見出され得る。本開示の実行には、特に明記されない限り、当技術分野における範囲内の、合成有機化学質量分析分取分クロマトグラフィ、タンパク質化学、生化学組換えDNA技術、および薬学の特定の従来方法が使用されてよい。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993);A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 4th Edition, 2004);Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989);MethodsIn Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.);Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania:Mack Publishing Company, 1990)参照。

0047

前掲されるか以下にあるかに拘らず、本明細書において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。

0048

「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合またはペプチド結合イソスターを介して連結された、アミノ酸残基、その関連の、天然に存在する構造変異体および天然に存在しない合成類似体で構成されるポリマーを指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成装置を用いて合成することができる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、産物の最小の長さに限定されない。

0049

ポリペプチド配列表現するのに、従来の表記が本明細書において用いられる:ポリペプチド配列の左端は、アミノ末端である;ポリペプチド配列の右端は、カルボキシル末端である。

0050

保存的置換」は、ポリペプチド中のアミノ酸の、機能的に、構造的に、または化学的に類似した天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸との置換を指す。一態様において、以下の群はそれぞれ、互いとの置換が保存的である天然のアミノ酸を含有する:
(1)アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
(4)アルギニン(R)、リジン(K);
(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);および
(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。

0051

別の態様において、以下の群はそれぞれ、互いとの置換が保存的である天然のアミノ酸を含有する:
(1)グリシン(G)、アラニン(A);
(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
(4)アルギニン(R)、リジン(K);
(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)、アラニン(A);
(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);および
(7)セリン(S)、トレオニン(T)、システイン(C)。

0052

更なる態様において、アミノ酸は、以下に記載されるようにグループ化されてもよい。
(1)疎水性:Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)骨格配向性に影響する残基:Gly、Pro;および
(6)芳香性:Trp、Tyr、Phe、His。

0053

一態様において、本方法に有用な、本明細書中に記載されるCNP変異体は、CNP変異体をコードするポリヌクレオチドを用いて、組換え手段を介して生成される。そのようなポリヌクレオチドによって発現されるCNP変異体は、CNP変異体をコードするポリヌクレオチドの発現に適した条件下で、培地中で宿主細胞を増殖させることと、発現産物を宿主細胞または培地から単離することとを含む方法によって生成され得る。実際の発現産物は、翻訳後の任意のプロセシングに応じて、コードされたタンパク質産物から僅かに変化し得る。

0054

「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位で構成されるポリマーを指す。ポリヌクレオチドとして、天然に存在する生体ポリマー(分子型に関してであり、必ずしも生体ポリマー配列に関してではない)、例えばデオキシリボ核酸(「DNA」)およびリボ核酸(「RNA」)、ならびに核酸類似体が挙げられる。「cDNA」は、mRNA相補的な、またはこれと同一の、一本鎖の形態または二本鎖の形態のDNAを指す。

0055

発現制御配列」は、これに機能的に連結されたヌクレオチド配列の発現を調節するヌクレオチド配列を指す。「機能的に連結された」は、一方の部分の活性(例えば、転写を調節する能力)が、他方の部分への作用(例えば、配列の転写)をもたらす、2つの部分間の機能的関係を指す。発現制御配列として、例えば、限定されないが、プロモーター(例えば、誘導可能プロモーターまたは構成プロモーター)、3’UTR、エンハンサ転写ターミネータ開始コドン(すなわちATG)、イントロンについてのスプライシングシグナル、および終止コドンの配列が挙げられ得る。

0056

組換えポリヌクレオチド」は、天然では結合されない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅され、またはアセンブルされた組換えポリヌクレオチドが、適切なベクター中に含まれてよく、そしてベクターが、適切な宿主細胞を形質転換するのに用いられ得る。組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。遺伝子はその後、例えば「組換えポリペプチド」を生成するために、組換え宿主細胞中で発現される。組換えポリヌクレオチドは、同様に、非コーディング機能(例えば、プロモーター、複製起点リボソーム結合部位等)を果たし得る。

0057

本明細書において用いられる「キメラ」は、少なくとも2つの異種起源ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列(すなわち、異なるソースに由来するか、または、天然に存在する配列として互いに関連しない)を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指し、これらは、当技術分野において一般的に公知の技術、例えば、組換え発現または化学架橋を用いて、直接的に、または間接的に取り付けられ、または連結される。一態様において、異種起源の配列は、CNP変異体に直接的に、または間接的に連結されるタンパク質またはペプチドを含んでよく、CNP変異体から切断可能であるタンパク質またはペプチドを含む。関連する態様において、CNP変異体は、本明細書中に記載されるようなキメラである。

0058

特定の態様において、キメラとして、切断可能なキャリアタンパク質またはペプチドタグを含むCNP融合タンパク質が挙げられる。用語「切断可能なキャリアタンパク質」または「切断可能なペプチドタグ」は、異種起源のポリペプチド配列に直接的に、またはリンカーを介して間接的に融合され得、そして異種起源のポリペプチドまたはタンパク質から切断可能なペプチドまたはポリペプチドを切断または分離する剤を用いて、異種起源の配列から取外し可能であるペプチド配列またはポリペプチド配列を指す。一部の態様において、切断可能なキャリアタンパク質またはペプチドタグは、融合タンパク質または異種起源のポリペプチドの生成、精製、および/または検出を向上させる。例示的な切断可能なキャリアタンパク質およびペプチドタグとして、以下に限定されないが、ヒト転写因子TAF12(TAF12)、ケトステロイドイソメラーゼ(KSI)、マルトース結合タンパク質(MBP)、β−ガラクトシダーゼ(β−Gal)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン(Trx)、キチン−結合ドメイン(CBD)、BMP−2突然変異(BMPM)、SUMO、CAT、TrpE、ブドウ球菌プロテインA、連鎖球菌タンパク質、デンプン結合タンパク質、エンドグルカナーゼAのセルロース結合ドメイン、エキソグルカナーゼCexのセルロース結合ドメイン、ビオチン結合ドメイン、recA、FLAG(登録商標)、c−Myc、ポリ(His)、ポリ(Arg)、ポリ(Asp)、ポリ(Gln)、ポリ(Phe)、ポリ(Cys)、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体エピトープ、およびそれらのフラグメントが挙げられる。

0059

「可動域」が意味するのは、関節の完全な移動可能性、典型的には屈曲および/または伸展の範囲である。可動域は典型的に、ゴニオメータを用いて測定されて、弧度で示される。当業者に公知の任意の測定方法が、対象の関節の可動域を測定するのに用いられ得る。関節の可動域を測定する1つの実例となる方法が、例えば、Norkin, C.C. and White D.J., Measurement of joint motion: a guide to goniometry (F.A. Davis Company, 2nd ed. Philadelphia) (1995)によって提供される。

0060

「関節硬直」が意味するのは、関節を動かす困難さの感覚、または関節の可動域の明らかな損失である。

0061

切断剤」は、例えば、異種起源のポリペプチドまたはタンパク質から切断可能なペプチドまたはポリペプチドを切断または分離するのに有用な剤である。切断剤として、以下に限定されないが、パラジウム臭化シアン(CNBr)、ギ酸ヒドロキシルアミンクロストリパイントロンビンキモトリプシントリプシントリプシン様プロテアーゼカルボキシペプチダーゼエンテロキナーゼエンテロペプチダーゼ)、Kex2プロテアーゼ、Omp Tプロテアーゼ、因子Xaプロテアーゼ、サブチリシン、proTEV、SUMOプロテアーゼ、V8プロテアーゼ、HIVプロテアーゼ、ライノウィルスプロテアーゼ、フリリシンプロテアーゼ、IgAプロテアーゼ、ヒトPaceプロテアーゼ、コラゲナーゼ、Niaプロテアーゼ、ポリオウィルス2Aproプロテアーゼ、ポリオウィルス3Cプロテアーゼ、ゲネナーゼ、フーリン、エラスターゼプロテイナーゼK、ペプシンレンニンキモシン)、微生物アスパラギン酸プロテアーゼパパインカルパインキモパパインフィシンフィイン)、ブロメラインブロメラーゼ)、カテプシンBカスパーゼサーモリシン、エンドプロテアーゼArg−C、エンドプロテアーゼGlu−C、エンドプロテアーゼLys−C、カリクレイン、およびプラスミンが挙げられる。

0062

2つ以上のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一の」およびパーセント同一性」は、対応が最大となるように比較かつアラインされた場合に、同じである、または特定のパーセンテージヌクレオチドもしくはアミノ酸残基が同じである、2つ以上の配列またはサブ配列を指す。

0063

2つの核酸またはポリペプチドの文脈におけるフレーズ「実質的に相同の」または「実質的に同一の」は概して、包括的にアラインされた場合に、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性が少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または98%である2つ以上の配列またはサブ配列を指す。

0064

比較用の配列の包括的アラインメントが、EMBOSSNeedleプログラム(例えば、ウェブインターフェイスを介してEMBL-EBIによって実行される)を用いて、デフォルトパラメータ(タンパク質について:マトリックスBLOSUM62、ギャップオープン=10、ギャップイクステンド=0.5、アウトプットフォーマットペアエンドギャップペナルティフォールス、エンドギャップオープン=10、エンドギャップイクステンド=0.5;ヌクレオチドについて、マトリックス=DNAフル、ギャップオープン=10、ギャップイクステンド=0.5、アウトプットフォーマット=ペア、エンドギャップペナルティ=フォールス、エンドギャップオープン=10、エンドギャップイクステンド=0.5)を用いて行われる。

0065

2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に相同または同一であるという更なる指標は、以下に記載されるように、第1の核酸によってコードされるポリペプチドが、第2の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的交差反応性であることである。ゆえに、ポリペプチドは典型的に、例えば、2つのポリペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合には、第2のポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるという別の指標は、本明細書中に記載されるように、2つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。

0066

「実質的に純粋な」または「単離された」は、対象種が、存在する主たる種である(すなわち、モルベースで、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも豊富である)こと、そして実質的に精製された画分が、存在する全ての高分子種の少なくとも約50%(モルベース)を対象種が構成する組成物であることを意味する。種々の態様において、対象となる種は、モルベースまたは重量ベースで、組成物中に存在する高分子種の少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、または98%を構成する。混入(contaminant)高分子種が従来の検出方法によって組成物中に検出され得ないならば、対象種は「本質的な均一性」となるまで精製されている。溶媒種、小分子(<500ダルトン)、安定化剤(例えばBSA)、および元素イオン種は、この定義の目的で考慮される高分子種ではない。一態様において、本開示の化合物は、実質的に純粋であり、または単離されている。別の態様において、本開示の化合物は、その生産に用いられる高分子出発材料に対して、実質的に純粋であり、または単離されている。さらに別の態様において、本開示の薬学的組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、キャリア、または希釈剤と、そして任意で別の生物学的に活性な剤と混合された、実質的に純粋な、または単離されたCNP変異体を含む。

0067

「野生型」(wt)は、種におけるポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質の天然の形態(配列を含む)を指す用語である。野生型形態は、遺伝的突然変異から生じるポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質の突然変異形態から区別される。

0068

一態様において、第2のポリペプチドの「類似体」または「変異体」または「誘導体」である第1のポリペプチドは、第2のポリペプチドとの配列同一性が少なくとも約50%、60%、または70%であるが、配列同一性が100%未満であるポリペプチドである。そのような類似体、変異体、または誘導体は、限定されないが、ホモアルギニンオルニチンペニシラミン、およびノルバリンを含む、天然に存在しないアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸残基で構成されてよい。そのような類似体、変異体、または誘導体は、1つまたは複数のD−アミノ酸残基で構成されてもよく、そしてまた、ペプチド模倣体またはペプチド結合イソスター、例えば2つ以上のアミノ酸残基間またはペプチド模倣残基間の非ペプチド結合を含有してもよい。別の態様において、第1のポリペプチドが、第2のポリペプチドの公知の切断産物でないならば、または第2のポリペプチドの公知の前駆体でないならば、たとえ第1のポリペプチドが、第2のポリペプチドに対する配列同一性が100%であり、または野生型配列を有するとしても、第1のポリペプチドは、第2のポリペプチドの「類似体」、「変異体」、または「誘導体」である。

0069

一態様において、本明細書において用いられる用語「に由来する」は、野生型の、または天然に存在するポリペプチド配列またはペプチド配列に基づき、かつ1つまたは複数の欠失、付加、および/または天然のアミノ酸、天然でないアミノ酸、もしくはペプチド模倣体との置換を有し得るポリペプチドまたはペプチド配列を指す。一態様において、派生的な配列は、野生型の、または天然に存在する配列に対して、少なくとも約40%、50%、60%、または70%、かつ100%未満の配列同一性を共有する。別の態様において、誘導体は、ポリペプチドのフラグメントであってよく、フラグメントは、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、または40のアミノ酸長に対して、野生型ポリペプチドと実質的に同一(例えば、少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、または95%同一)である。さらに別の態様において、ポリペプチドが、野生型ポリペプチドに存在しない部分(例えば、PEG等のポリマー)に直接的に、または間接的に取り付けられているならば、たとえ双方のポリペプチドが、アミノ酸配列において100%の同一性を共有するとしても、ポリペプチドは野生型ポリペプチド「に由来する」。

0070

ナトリウム利尿ペプチド前駆体C(NPPC)ポリペプチドは、単鎖126アミノ酸プレ−プロポリペプチドであり、そして以下で記載されるように、プロセシング後に最終的に野生型CNP−22(wtCNP−22)が生じる。NPPCからのシグナルペプチドの除去によりプロCNPが生じ、そしてさらにエンドプロテアーゼフーリンによって切断されて、活性53アミノ酸ペプチド(CNP−53)が生じて、これがここでも分泌かつ切断されて、成熟した22アミノ酸ペプチド(CNPまたはCNP−22)が生成される。一態様において、「CNP変異体」は、同じ数のアミノ酸残基に対して、野生型NPPCと少なくとも約40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、または95%同一である。

0071

用語「有効量」は、対象の健康状態病理、または疾患に所望の結果をもたらすのに十分な、または診断目的に十分な投薬量を意味する。所望の結果は、投薬量のレシピエントにおける主観的または客観的な向上を含み得る。「治療的有効量」は、健康に対して意図される有益な効果をもたらすのに有効な剤の量を指す。任意の特定の患者にとっての投薬量の特定の用量レベルおよび頻度は、変化してよく、そして、使用される具体的な化合物の活性;その化合物の生体利用性、代謝安定性排泄速度、および作用の長さ;化合物の投与のモードおよび時間;患者の年齢、体重、健康状態、性別、および食事;ならびに特定の症状の重篤度を含む種々の要因によって決まると考えられることが理解されよう。

0072

「処置」は、予防的処置または治療的処置または診断的処置を指す。特定の態様において、「処置」は、治療目的、予防目的、または診断目的での、化合物または組成物の、対象への投与を指す。

0073

「予防的」処置は、病理を進行させるリスクを低下させる目的で、疾患の徴候を示さない対象、または疾患の初期の徴候しか示さない対象に施される処置である。本開示の化合物または組成物は、病理を進行させる見込みを減少させるための、または進行したならば、病理の重篤度を最小にするための予防的処置として、与えられてよい。

0074

「治療的」処置は、病理の徴候または症候を示す対象に、この徴候または症候を減弱させ、または除外する目的で施される処置である。徴候または症候は、生化学的であっても、細胞性であっても、組織学的であっても、機能的であっても、身体的であっても、主観的であっても、または客観的であってもよい。本開示の化合物は、治療的処置として、または診断のために与えられてもよい。

0075

「診断」は、病状の存在、程度、および/または性質を同定することを意味する。診断方法は、その特異性および選択性の点で異なる。特定の診断方法は、症状の決定的診断を下し得ないが、当該方法が診断を補助する陽性指標を提供するならば、十分である。診断処置は、対象の診断を補助するために、本開示の化合物を投与することとなる。

0076

「軟骨関連バイオマーカー」または「軟骨関連マーカー」は、増殖因子酵素、タンパク質、核酸、または他の検出可能な生物学的物質もしくは生物学的部分を指し、これらのレベルは、例えば、軟骨代謝、軟骨形成、および/または軟骨成長に関連して増減する。そのようなバイオマーカーは、本明細書中に記載されるCNP変異体の投与の前、その間、かつ/またはその後に測定されてよい。例示的な軟骨関連バイオマーカーとして、以下に限定されないが、CNP、cGMP、コラーゲンII型のプロペプチドおよびそのフラグメント、コラーゲンII型およびそのフラグメント、コラーゲンI型のプロペプチドおよびそのフラグメント、コラーゲンI型およびそのフラグメント、増殖細胞核抗原(PCNA)、コンドロイチン硫酸アグリカン、シンデカン−3、ならびにアネキシンVIが挙げられる。軟骨関連バイオマーカーは、以下に限定されないが、組織、血液、血清、血漿、髄液滑液、および尿を含むいずれかの適切な生体サンプル中で測定され得る。一部の態様において、バイオマーカーは、有効性薬力学的インビボ試験を経験した動物由来の、そして/またはエクスビボ試験の馴化培地由来の血液、血漿、または血清中で測定される。

0077

特定の態様において、少なくとも1つの軟骨関連バイオマーカーのレベルが測定され、そして対象に投与されるCNP変異体の投与の量または頻度が、測定されたバイオマーカーのレベルに従って調整され得る。一部の態様において、バイオマーカーのレベルは、「標的レベル未満」、または「標的レベル超」である。バイオマーカーの標的レベルは、CNP変異体を受け入れた対象において治療的効果が観察されるバイオマーカーのレベルまたはレベルの範囲である。特定の態様において、骨関節炎を患う対象についてのバイオマーカーの標的レベルは、正常な、非罹患対象において観察されるバイオマーカーのレベルまたはレベルの範囲である。種々の態様において、治療的効果を示すために、バイオマーカーの標的レベルは、正常な対象において観察されるバイオマーカーのレベルまたはレベルの範囲に等しい必要はないが、例えば、非罹患対象において観察されるバイオマーカーの「正常な」レベルまたはレベルの範囲の100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、または5%以内であってよい。

0078

例えば、バイオマーカーのレベルが、軟骨の形成または成長に関連して増大するならば、治療的効果を示すバイオマーカーの標的レベルは、CNP変異体を投与されなかった、骨関節炎に苦しむ患者におけるバイオマーカーのレベルよりも高くなり得、そして任意で、当該障害に苦しんでいない対象におけるバイオマーカーの「正常な」レベルよりも低くなり得、約「正常な」レベルとなり得、または「正常な」レベルを超え得る。一態様において、バイオマーカーのレベルが標的レベル未満であるならば、これは不十分な治療的効果を示し、投与されるCNP変異体の投与の量または頻度の増大が必要とされてよい。関連する態様において、バイオマーカーが標的レベルを上回るならば、これは、必要とするよりも多くのCNP変異体が投与されたことを示し、投与されるCNP変異体の投与の量または頻度の減少が必要とされてよい。

0079

別の例として、バイオマーカーのレベルが、軟骨の形成または成長に関連して減少するならば、治療的効果を示すバイオマーカーの標的レベルは、CNP変異体を投与されなかった、骨関節炎に苦しむ患者におけるバイオマーカーのレベルよりも低くなり得、そして任意で、当該障害に苦しんでいない対象におけるバイオマーカーの「正常な」レベルよりも高くなり得、約「正常な」レベルとなり得、または「正常な」レベルを下回り得る。そのような場合、CNP変異体の投与の量および頻度の、先の調整の逆が当てはめられてよい。

0080

「薬学的組成物」は、ヒトおよび哺乳類を含む対象動物での薬学的用途に適した組成物を指す。薬学的組成物は、治療的有効量のCNP変異体、任意で別の生物学的に活性な剤、および任意で薬学的に許容される賦形剤、キャリア、または希釈剤を含む。一態様において、薬学的組成物は、活性成分を含む組成物、およびキャリアを構成する不活性成分、ならびに当該成分の任意の2つ以上の組合せ、複合体形成、もしくは凝集に直接的に、もしくは間接的に起因し、または当該成分の1つもしくは複数の分離に起因し、または当該成分の1つもしくは複数の他のタイプの反応もしくは相互作用に起因する任意の産物を包含する。したがって、本開示の薬学的組成物は、本開示の化合物と、薬学的に許容される賦形剤、キャリア、または希釈剤とを混合することによって製造される任意の組成物を包含する。

0081

「薬学的に許容されるキャリア」は、標準的な薬学的キャリア、バッファー等、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、5%デキストロース水溶液、およびエマルジョン(例えば、油/水エマルジョンまたは水/油エマルジョン)のいずれかを指す。賦形剤の非限定的な例として、アジュバント結合剤充填剤、希釈剤、崩壊剤乳化剤湿潤剤潤滑剤、滑走剤、甘味剤香味剤、および着色剤が挙げられる。適切な薬学的キャリア、賦形剤、および希釈剤が、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995)に記載されている。好ましい薬学的キャリアは、活性剤の意図される投与モードによって決まる。典型的な投与モードとして、経腸(例えば経口)または非経口(例えば、皮下注射筋肉内注射静脈内注射、もしくは腹膜内注射;または局所投与経皮投与、もしくは経粘膜投与)が挙げられる。

0082

「薬学的に許容される塩」は、薬学的用途用の化合物中に配合され得る塩であり、以下に限定されないが、金属塩(例えば、ナトリウムカリウムマグネシウムカルシウム等)、およびアンモニアまたは有機アミンの塩を含む。

0083

「薬学的に許容される」または「薬理的に許容される」が意味するのは、生物学的に、またはそれ以外でも、望ましくないものではない材料である。すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的作用も引き起こすこともなければ、それが含有される組成物の成分のいずれかと、または個体の体または体内に存在する任意の成分と有害に相互作用することもなく、個体に投与され得る。

0084

用語「単位剤型」は、ヒト対象および動物対象についての単位投薬量として適した、物理的に不連続な単位を指し、各単位は、所望の効果をもたらすのに十分な量と算出された本開示の化合物の所定の量を、任意で、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、キャリア、またはビヒクルを伴って、含有する。本開示の新規の単位剤型についての規格は、使用される特定の化合物、および達成されるべき効果、ならびに宿主における各化合物と関連する薬力学によって決まる。

0085

生理学的条件」は、動物(例えばヒト)の体内の条件を指す。生理学的条件として、以下に限定されないが、体温、ならびに生理学的イオン強度、pH、および酵素の水性環境が挙げられる。

0086

本明細書において用いられる用語「対象」は、ヒトおよびヒト以外の哺乳類、ならびに非哺乳類を包含し、その程度は、そのようなヒト以外の種に投与された場合に、本明細書において開示される組成物が有用である範囲に及ぶ。哺乳類の例として、以下に限定されないが、哺乳綱:ヒト、ヒト以外の霊長類、例えばチンパンジー、ならびに他の類人猿およびサル種;畜産動物、例えばウシウマヒツジヤギ、ブタ;家畜動物、例えばウサギイヌ、およびネコ齧歯類、例えばラット、マウス、およびモルモットを含むラボ動物等の任意のメンバーが挙げられる。非哺乳類の例として、以下に限定されないが、脊椎動物、例えば鳥類および魚類が挙げられる。当該用語は、特定の年齢または性別を意味しない。

0087

用語「ポリエチレングリコール」、「PEG」、「ポリエチレンオキシド」、および「PEO」は、特に明記されない限り、本明細書において互換的に用いられる。アミノ基を介して、数nを伴う「PEOn」ポリマーに結合されたCNP変異体は、一般に、式:CH3−[−O−CH2CH2−]n−C(=O)−NHRを有し、式中、nは、エチレンオキシド単位の数であり、Rは、残りのペプチドを表す。「PEOn」ポリマーは、任意で、カルボニル炭素と繰り返しのエチレンオキシド単位との間にアルキレン基、(CH2)mを有してよく、式中、mは、1から5の整数である。そのような「PEOn」(例えば、PEO12またはPEO24)ポリマーは、単分散性であり、すなわち、特定の分子量の単一の不連続なポリマーである。同様に、アミノ基を介して、数nKを伴う「PEGnK」ポリマーに結合されたCNP変異体は、一般に、式:CH3−[−O−CH2CH2−]p−C(=O)−NHRを有し、式中、pは、1よりも大きな整数である。「PEGnK」ポリマーもまた、任意で、カルボニル炭素と繰り返しのエチレンオキシド単位との間にアルキレン基、(CH2)mを有してよく、式中、mは、1から5の整数である。しかしながら、そのような「PEGnK」(例えば、PEG1K、PEG2K、PEG5K、またはPEG20K)ポリマーは、多分散性であり、すなわち、分子量の分布を有するポリマーの混合物を含有し、数nKは、ポリマー数平均分子量(Mn)をキロダルトンで表す。例えば、CNP変異体に結合する「PEG2K」は、ポリマー数平均分子量がおおよそ2kDaである多分散性PEGポリマーを表す。

0088

ポリマー(例えばPEG)の質量範囲が(例えばkDaの単位で)与えられる場合、当該範囲は、特に明示的に示されない限り、多分散性混合物中の複数のポリマーの分子量の範囲ではなく、ポリマー数平均分子量の範囲を指す。

0089

用語「ハロゲン」、「ハライド」、または「ハロ」は、フッ素塩素臭素、および/またはヨウ素を指す。

0090

用語「アルキル」は、直鎖または分枝状の飽和一価炭化水素ラジカルを指し、アルキルは、本明細書中に記載される1つまたは複数の置換基Qで置換されていてもよい。特定の態様において、アルキルは、1から20(C1〜20)、1から15(C1〜15)、1から12(C1〜12)、1から10(C1〜10)、もしくは1から6(C1〜6)個の炭素原子を有する直鎖飽和一価炭化水素ラジカル、または3から20(C3〜20)、3から15(C3〜15)、3から12(C3〜12)、3から10(C3〜10)、もしくは3から6(C3〜6)個の炭素原子の分枝状飽和一価炭化水素ラジカルである。本明細書において用いられる直鎖C1〜6アルキル基および分枝状C3〜6アルキル基は、「低級アルキル」とも呼ばれる。アルキル基の例として、以下に限定されないが、メチルエチルプロピル(n−プロピルおよびイソプロピルを含む全ての異性体形態を含む)、ブチルn−ブチルイソブチル、sec−ブチル、およびtert−ブチルを含む全ての異性体形態を含む)、ペンチル(全ての異性体形態を含む)、およびヘキシル(全ての異性体形態を含む)が挙げられる。例えば、C1〜6アルキルは、1から6個の炭素原子の直鎖飽和一価炭化水素ラジカルまたは3から6個の炭素原子の分枝状飽和一価炭化水素ラジカルを指す。

0091

用語「アルコキシ」は、−O−アルキル基を指す。特定の態様において、アルコキシ基は、本明細書中に記載される1つまたは複数の置換基Qで置換されていてもよい。

0092

用語「ハロアルキル」は、1つまたは複数のハライド原子で置換されているアルキル基を指す。特定の態様において、ハロアルキル基は、1、2、3、4、5、または6個のハライド原子で置換されている。特定の態様において、ハロアルキル基は、本明細書中に記載される1つまたは複数の付加的な置換基Qで置換されていてもよい。

0093

用語「シクロアルキル」は、本明細書中に記載される1つまたは複数の置換基Qで置換されていてもよい、環状飽和架橋一価炭化水素ラジカルおよび/または非架橋一価炭化水素ラジカルを指す。特定の態様において、シクロアルキルは、3から20(C3〜20)、3から15(C3〜15)、3から12(C3〜12)、3から10(C3〜10)、もしくは3から7(C3〜7)個の炭素原子を有する。シクロアルキル基の例として、以下に限定されないが、シクロプロピルシクロブチルシクロペンチルシクロヘキシルシクロヘプチルデカニル、およびアダマンチルが挙げられる。

0094

用語「ヘテロシクリル」または「複素環式」は、少なくとも1つの非芳香族環を含有する単環式非芳香族環系または多環式環系を指し、非芳香族環原子の1つまたは複数は、O、S、またはNより独立して選択されるヘテロ原子であり、残りの非芳香族環原子は、炭素原子である。特定の態様において、ヘテロシクリル基または複素環基は、3から20、3から15、3から10、3から8、4から7、または5から6個の環原子を有する。特定の態様において、ヘテロシクリルは、単環式、二環式三環式、または四環式の環系であり、これらとして縮合環系または架橋環系が挙げられ得、そして窒素原子または硫黄原子は、酸化されていてもよく、窒素原子は、四級化されていてもよく、一部の環は、部分的に、または完全に飽和されていても、芳香族であってもよい。ヘテロシクリルは、任意のヘテロ原子または炭素原子にて主構造に取り付けられていてよく、これにより安定した化合物が生じる。複素環基の例として、以下に限定されないが、アクリジニル、アゼピニル、ベンズイミダゾリルベンズインドリルベンゾイソオキサゾリル、ベンズイソサジニル、ベンゾジオキサニルベンゾジオキソリルベンゾフラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾピラニル、ベンゾテトラヒドロフラニル、ベンゾテトラヒドロチエニル、ベンゾチアジアゾリルベンゾチアゾリル、ベンゾチオフェニルベンゾトリアゾリル、ベンゾチオピラニル、ベンゾオキサジニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリルクロマニル、クロモニル、シンノリニル、クマリニル、デカヒドロイソキノリニルジベンゾフラニル、ジヒドロベンズイソチアジニル、ジヒドロベンズイソキサジニル、ジヒドロフリル、ジヒドロピラニル、ジオキソラニル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジオキソラニル、1,4−ジチアニル、フラノニル、フラニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、イミダゾピリジニル、イミダゾチアゾリルインダゾリルインドリニル、インドリジニル、インドリル、イソベンゾテトラヒドロフラニル、イソベンゾテトラヒドロチエニル、イソベンゾチエニル、イソクロマニル、イソクマリニル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、イソキサゾリジニル、イソオキサゾリル、モルホリニルナフチリジニルオクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、オキサジアゾリル、オキサゾリジノニルオキサゾリジニルオキサゾロピリジニル、オキサゾリルオキシラニルペリミジニル、フェナントリジニル、フェナトロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニルピペリジニル、4−ピペリドニル、プテリジニルプリニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリドピリジニル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、ピロリル、キナゾリニルキノリニルキノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチエニル、テトラゾリル、チアジアゾロピリミジニル、チアジアゾリル、チアモルホリニル、チアゾリジニル、チアゾリル、チエニル、トリアジニルトリアゾリル、および1,3,5−トリチアニルが挙げられる。特定の態様において、複素環基は、本明細書中に記載される1つまたは複数の置換基Qで置換されていてもよい。

0095

用語「アリール」は、少なくとも1つの芳香族炭化水素環を含有する単環式芳香族基または多環式一価芳香族基を指す。特定の態様において、アリールは、6から20(C6〜20)、6から15(C6〜15)、または6から10個(C6〜10)の環原子を有する。アリール基の例として、以下に限定されないが、フェニル、ナフチルフルオレニルアズレニルアントリルフェナントリルピレニルビフェニル、およびテルフェニルが挙げられる。アリールはまた、二環式または三環式の炭素環を指し、環の少なくとも1つは、芳香族であり、その他は飽和していてもよいし、部分的に不飽和であってもよいし、芳香族、例えば、ジヒドロナフチル、インデニル、インダニル、およびテトラヒドロナフチル(テトラリニル)であってもよい。特定の態様において、アリール基は、本明細書中に記載される1つまたは複数の置換基Qで置換されていてもよい。

0096

用語「ヘテロアリール」は、少なくとも1つの芳香族環を含有する単環式芳香族基または多環式芳香族基を指し、少なくとも1つの芳香族環は、O、S、およびNより独立して選択される1つまたは複数のヘテロ原子を含有する。ヘテロアリール基の各環は、1もしくは2個のO原子、1もしくは2個のS原子、および/または1から4個のN原子を含有してよい。但し、各環中のヘテロ原子の総数が、4個以下であり、かつ各環が、少なくとも1個の炭素原子を含有する場合に限る。ヘテロアリールは、任意のヘテロ原子または炭素原子にて主構造に取り付けられてよく、これにより安定した化合物が生じる。特定の態様において、ヘテロアリールは、5から20、5から15、または5から10個の環原子を有する。単環式ヘテロアリール基の例として、以下に限定さないが、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、およびトリアジニルが挙げられる。二環式ヘテロアリール基の例として、以下に限定されないが、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラニル、インドリジニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロモニル、クマリニル、シンノリニル、キノキサリニル、インダゾリル、プリニル、ピロロピリジニル、フロピリジニル、チエノピリジニル、ジヒドロイソインドリル、およびテトラヒドロキノリニルが挙げられる。三環式ヘテロアリール基の例として、以下に限定されないが、カルバゾリル、ベンズインドリル、フェナントロリニル、アクリジニル、フェナントリジニル、およびキサンテニルが挙げられる。特定の態様において、ヘテロアリール基は、本明細書中に記載される1つまたは複数の置換基Qで置換されていてもよい。

0097

用語「置換されていてもよい」は、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールを含む基が、1つまたは複数の置換基Q(一態様において、1、2、3、または4個の置換基Q)で置換されていてよいことを意味することが意図され、各Qは、シアノ、ハロ、オキソニトロ、C1〜6アルキル、C1〜6アルコキシ、ハロC1〜6アルキル、C3〜7シクロアルキル、ヘテロシクリル、C6〜14アリール、ヘテロアリール、−C(O)Re、−C(O)ORe、−C(O)NRfRg、−C(NRe)NRfRg、−ORe、−OC(O)Re、−OC(O)ORe、−OC(O)NRfRg、−OC(=NRe)NRfRg、−OS(O)Re、−OS(O)2Re、−OS(O)NRfRg、−OS(O)2NRfRg、−NRfRg、−NReC(O)Rf、−NReC(O)ORf、−NReC(O)NRfRg、−NReC(=NRh)NRfRg、−NReS(O)Rf、−NReS(O)2Rf、−NReS(O)NRfRg、−NReS(O)2NRfRg、−SRe、−S(O)Re、−S(O)2Re、および−S(O)2NRfRgからなる群より独立して選択され、式中、Re、Rf、Rg、およびRhは、それぞれ独立して、水素、C1〜6アルキル、C3〜7シクロアルキル、ヘテロシクリル、C6〜14アリール、またはヘテロアリールであり;またはRfおよびRgは、これらが取り付けられるN原子と共に、ヘテロシクリルを形成する。

0098

B.CNP変異体
治療薬としてのCNP22の使用は、血漿中での短い半減期によって制限される(J. Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994))。ヒト血漿中でのCNP22の濃度は典型的に、5ピコモル未満である。CNP22は、ヒトにおいて、NEPおよびNPR−Cによって分解されて、循環系から一掃される(Growth Hormone & IGF Res., 16: S6-S14)。全身投与されるCNP22を用いる全てのヒト試験および動物試験において、対象中でCNP22濃度を増大させるのに、持続注入が用いられてきた。半減期がより長く、かつ官能性のレベルが少なくとも同程度であるCNPペプチドが、CNPベースの治療戦略に有益であると考えられる。CNP変異体はまた、関連する交付済み特許:米国特許第8,377,884号;米国特許第8,198,242号;および米国特許第8,598,121号に開示されている。列挙された特許はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に具体的に組み入れられる。

0099

本開示は、NEPおよび/またはNPR−Cに対する親和性が低く、かつNEPによる切断に対する感受性および/またはNPR−Cによるクリアランスが低いが、官能性が野生型CNP22よりも実質的に同程度であり、または良好であるCNP変異体を提供する。NEPによる切断および/またはNPR−Cによるクリアランスに対するCNP変異体の感受性の低下により、変異体の血漿半減期または血清半減期が増大することによって、変異体が標的組織および標的部位分配されて、所望の薬理効果を達成する機会が増大すると考えられる。特定の態様において、本明細書中に記載されるCNP変異体は、インビトロまたはインビボでの、NEPによる切断および/またはNPR−Cによるクリアランスに対する感受性が、wtCNP22と比較して、少なくとも約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、または5倍低くなり、かつインビボでの血漿半減期または血清半減期が、wtCNP22と比較して、少なくとも約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、または5倍増大した一方で、wtCNP22の官能性の少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、もしくは100%を保持し、またはwtCNP22よりも官能性が少なくとも約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、または5倍大きかった。CNP官能性は、例えば、インビトロ試験またはインビボ試験において、軟骨の形成または成長と関連した1つまたは複数のバイオマーカー(例えばcGMP)のレベルに関して評価することができる。また、CNP官能性は、エクスビボ試験またはインビボ試験等において関節炎の軟骨変性の防止を判定することによって評価することができる。

0100

NEPの天然の基質は小さく、ナトリウム利尿ペプチド(約2.2から約3.2kDa)は、NEPの天然の基質の中で最も大きい。X線結晶解析に従えば、NEP活性部位は、中心の空洞の内側に深く埋められており、基質分子のサイズを約3kDa以下に効果的に制限している(Oefner et al., J. Mol. Biol., 296: 341-349 (2000))。NPR−Bシグナル伝達研究に基づけば、CNP−22の変異体、例えばCNP−17(CNP22の環状ドメイン、Cys6〜Cys22のみを保持している)、およびCNP−53(N末端にて31個のアミノ酸伸長を有するCNP−22)は依然として、2.2kDaのwtCNP−22と同様に、NPR−Bに結合してこれを活性化することができる。したがって、本開示は、CNP22またはその変異体のN末端および/またはC末端にて、天然ポリマー(例えばペプチド)および/または合成ポリマー(例えばPEG)に結合されるCNP変異体を包含し、これは、NEP耐性の増大を示すが、NPR−Bシグナル伝達受容体に結合して、これを活性化する能力を保持する。

0101

一態様において、本開示は、一般式

によって表されるCNP変異体を包含し、式中:
(x)および(z)は、それぞれ独立して、天然のポリマー(例えば、少なくとも1つのアミノ酸を含有するペプチド配列)および/または本明細書中に記載される合成ポリマー(例えばPEG)であり、CNP変異体の総質量は、本明細書中に一般に記載される範囲によって特徴付けられ、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲である。一態様において、Cys6からCys22の残基は、環状部分を形成する。一態様において、(x)および/または(z)は、NPPCポリペプチドまたは非CNPポリペプチド(例えば、ANP、BNP、IgG等)に由来するアミノ酸伸長を含み、当該伸長は、1から40、1から35、1から31、5から35、5から31、または5から15個のアミノ酸を含有する。別の態様において、CNP変異体は、別の天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド模倣体、および/またはペプチド結合イソスターによる1つまたは複数の改変および/または置換を、CNP22の以下の位置の1つまたは複数にて含む:CNP22:Gly1、Lys4、Gly5、Cys6、Phe7、Gly8、Leu9、Lys10、Leu11、Ile14、Gly15、Ser16、Met17、Gly19、Leu20、およびGly21。

0102

別の態様において、総質量が、本明細書中に一般に記載される、例えば、約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲によって特徴付けられ、NEP分解に対する耐性が増大するように設計されているCNP変異体が、一般式:

によって表され、式中:
(x)は、合成もしくは天然のポリマー基、またはそれらの組合せであり、合成ポリマー基の非限定的な例として、PEG(またはPEO)があり、天然のポリマー基の非限定的な例として、1から35個のアミノ酸を含有し、かつNPPCまたはその、置換および/もしくは欠失を有する変異体、ANP、BNP、または他の非CNP(ポリ)ペプチド、例えば、血清アルブミン、IgG、ヒスチジンリッチ糖タンパク質フィブロネクチンフィブリノゲン亜鉛フィンガー含有ポリペプチドオステオクリン、または線維芽細胞増殖因子2(FGF2)に由来するアミノ酸配列があり;
(z)は、不在であってもよいし、合成もしくは天然のポリマー基、またはそれらの組合せであってもよく、合成ポリマー基の非限定的な例として、PEGがあり、天然ポリマー基の非限定的な例として、ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、NPPC、CNP、ANP、またはBNP)、または非ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、血清アルブミンまたはIgG)に由来するアミノ酸配列があり;かつ
(b)および(h)は、独立して、その位置にて野生型Lysであってもよいし、保存的アミノ酸置換基、あるいは以下に限定されないが、Arg、Gly、6−ヒドロキシノルロイシンシトルリンCit)、Gln、Glu、またはSerを含む、任意の天然もしくは非天然のアミノ酸、または側鎖上に反応性第一級アミンを有していないペプチド模倣体で置換されていてもよい。一態様において、(b)はArgである。別の態様において、NEP耐性の向上のために、(b)はGlyでない。

0103

さらに別の態様において、(h)はArgでない。
NPPCまたはその変異体に由来するアミノ酸配列の非限定的な例として、以下が挙げられる:

非CNPポリペプチド、例えば、ANP、BNP、血清アルブミン、およびIgGに由来するアミノ酸配列の非限定的な例として、以下が挙げられる:

0104

一態様において、本明細書中に記載される、(x)基および/または(z)基を有するCNP変異体のいずれかのN末端(x)基および/またはC末端(z)基は、独立して、もしあれば、少数の、酸性の天然または非天然のアミノ酸(例えば、AspまたはGlu)を含有するアミノ酸配列を含む。別の態様において、(x)および/または(z)は、CNP22のpI(pI8.9)と同程度のアルカリ性pIを保つために、塩基性の天然または非天然のアミノ酸(例えば、Lys、Arg、またはHis)が富化されている。一態様において、CNP変異体のpIは、約8から約10.5の範囲にあり、CNP変異体が、関節炎の関節の軟骨細胞を包囲する細胞外マトリックスを通ってより容易に拡散することができるように設計されている。より厳密な態様において、CNP変異体のpIは、約8.5から約10.5、または約8.5から約10、または約9から約10である。

0105

さらに別の態様において、(x)および/または(z)は、極性のある天然または非天然のアミノ酸が富化されており、水性溶解度が増大するように設計されている。さらに別の態様において、(x)および/または(z)は、もしあれば、少数の、疎水性の天然または非天然のアミノ酸(例えば、Ala、Val、Leu、Ile、またはMet)を含有する。

0106

更なる態様において、CNP変異体のN末端は、少なくとも1つのグリシン残基終わり、血清半減期が増大するように設計されている。関連する態様において、ピログルタミン形成を防止するために、普通であればグルタミンで終わるCNP変異体のN末端は、グリシン残基で終わる。一態様において、(x)基は、N末端が少なくとも1つのグリシン残基で終わるアミノ酸伸長を含有する。別の態様において、(x)および/または(z)は、2つの隣接する塩基性の天然または非天然のアミノ酸(例えば、Lys−LysまたはArg−Arg)を含有せず、プロテアーゼフーリンによる切断に対する感受性を減少させるように設計されている。一態様において、(x)は、CNP22のGly1に対応する位置の直ぐ前に、2つの隣接する塩基性アミノ酸を含有しない。

0107

さらに別の態様において、CNP変異体の(x)基および/または(z)基は、NPPCに由来する(例えばCNP53に由来する)アミノ酸配列を含む。一態様において、(x)は、ANPまたはBNPのN末端尾部に由来するアミノ酸配列を含む。別の態様において、(z)は、ANPまたはBNPのC末端尾部に由来するアミノ酸配列を含む。更なる態様において、(x)および/または(z)は、非ナトリウム利尿ポリペプチド、例えば、IgG、ヒト血清アルブミンHSA)、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、FGF−2、および骨標的タンパク質(例えば、オステオクリン、オステオポンチンオステオカルシン、およびシアロタンパク質)に由来するアミノ酸配列を含む。

0108

CNP22またはその変異体が、N末端(x)基および/またはC末端(z)基を有してよい、本明細書中に記載される任意の態様において、(x)および/または(z)は、独立して、骨形成タンパク質(BMP)の機能ドメインに由来するアミノ酸配列を含有してよい。BMPの機能ドメインに由来するN末端および/またはC末端のアミノ酸伸長が、CNP変異体の総質量を、本明細書中に一般に記載される範囲、例えば、約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲に特徴づけられるように増大させることによって、CNP変異体のNEP耐性、そしてそれ故に血清半減期を増大させることができる。また、特定のBMPが、骨および軟骨の形成を誘導する成長因子およびサイトカインであるので、BMPの機能ドメインに由来するフラグメントが、CNP22またはその変異体の環状ドメインによるNPR−Bのグアニリルシクラーゼ機能の活性化と異なる機構によって、軟骨細胞、軟骨、または骨の成長を促進することができる。骨の形成および発達、軟骨の形成および発達、ならびに/または骨芽細胞分化を促進するBMPの非限定的な例として、BMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7、およびBMP8aが挙げられる。一態様において、CNP22またはその変異体のN末端および/またはC末端は、独立して、BMP1、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7、またはBMP8aのC末端部分における最後の140個のアミノ酸に由来するアミノ酸配列に結合される。

0109

一態様において、CNP変異体は、CNP22またはCNP17のN末端および/またはC末端にて、以下に限定されないが、

を含むアミノ酸伸長を含有する。

0110

別の態様において、CNP変異体は、CNP22の位置4にて、K4R置換を有する。CNP(K4R)変異体の非限定的な例として、以下が挙げられる:

0111

更なる態様において、CNP変異体は、アミノ酸の付加、欠失、および/または置換を有するCNP22またはその変異体、ならびに、CNPペプチドのN末端に対する、CNP以外のポリペプチドもしくはタンパク質に由来するペプチドフラグメント、または非CNPポリペプチドもしくはタンパク質全体を含むキメラであり、CNP22またはその変異体は、1つまたは複数のアミノ酸残基のN末端アミノ酸伸長を有してもよい。特定の態様において、CNPキメラは、1つまたは複数のアミノ酸残基のN末端アミノ酸伸長を有するCNP22またはその変異体を含む。特定の態様において、CNPキメラは、CNP22またはその変異体の第1の位置(CNP22の場合、Gly)の直ぐ前に、リジン−リジン(KK)残基またはGANKK残基を含有する。他の態様において、CNPキメラは、リジン−リジンと異なる1または2個の残基を、CNP22またはその変異体の第1の位置の直ぐ前に含有する。CNP22またはその変異体の第1の位置に直ぐ先行し得る残基の非限定的な例として、KP、PK、PR、PQ、QK、QQ、RR、SS、GANKP、GANPK、GANPR、GANPQ、GANQK、GANQQ、GANRR、およびGANSSが挙げられる。

0112

別の態様において、CNP変異体は、CNP22およびN末端ペプチドフラグメントを含むキメラであり、以下に限定されないが、

を含む。

0113

さらに別の態様において、CNP変異体は、N末端ペプチドフラグメント、およびアルギニンがCNP22のLys4に置換されているCNP22(「CNP22(K4R)」)を含むキメラであり、以下に限定されないが、

を含む。

0114

IgGおよびCNP22またはその変異体を含むキメラは、とりわけ、NEP分解に対する耐性の増大および血清アルブミンへの結合の減少のために設計されている。HSAの表面フラグメントを含むCNPキメラは、とりわけ、免疫原性の減少、および血清アルブミンへの結合の減少のために設計されている。N末端にてカチオン、ヒスチジンリッチ、非リジン、非アルギニン配列を含有するHRGP−CNP22およびHRGP−CNP22(K4R)キメラは、とりわけ、プロテアーゼに対する安定性の増大のために設計されている。オステオクリンフラグメントを含有するキメラは、プロテアーゼ(例えばフーリン)切断直後に、骨成長板にてオステオクリンフラグメントを放出するように設計されており、そこでフラグメントは、クリアランス受容体NPR−Cを阻害すると考えられる。FGF2ヘパリン結合フラグメントを含むキメラに関して、フラグメントへのヘパリン結合は、キメラを分解から保護することによって、より長い血清半減期を実現するように設計されている。フィブロネクチン、フィブリノゲン、または亜鉛フィンガーフラグメントを含有するキメラが、いくつかある特徴の中で特に、血清アルブミンへの結合の減少のために設計されている。

0115

理論によって拘束されることを意図するものではないが、wtCNP22と比較して、NEP分解に対する耐性が増大し、かつ官能性(例えば、NPR−Bへの結合およびcGMPシグナル伝達の刺激)が同程度であり、または向上した、分子量が約2.6または2.8kDaから約6または7kDaのCNP変異体は、血漿タンパク質、例えば血清アルブミンに強固に結合しないならば、より効果的であり得る。血漿タンパク質(例えば血清アルブミン)に強固に結合しないCNP変異体は、軟骨を通って拡散して、関節炎の関節の軟骨細胞に到着して、cGMPシグナル伝達のためにNPR−Bに結合してこれを活性化するのに、より効果的であり得る。一態様において、血漿タンパク質(例えば血清アルブミン)への結合の減少のために設計されているCNP変異体は、CNP22またはその変異体およびIgG由来のペプチドフラグメントを含むキメラである。別の態様において、血漿タンパク質への結合の減少のために設計されているCNP変異体は、CNP22またはCNP22(K4R)およびポリペプチド(例えば、IgG、HSA、フィブロネクチン、フィブリノゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド等)由来のフラグメントを含むキメラである。さらに別の態様において、血漿タンパク質への結合の減少のために設計されているCNP変異体は、親水性または水溶性のポリマーに結合されたCNP22またはその変異体を含む。一態様において、親水性または水溶性のポリマーは、PEG(またはPEO)である。別の態様において、親水性または水溶性のポリマー(例えばPEG)は、生理学的条件下で、ポリマーに負の電荷を与える1つまたは複数の官能基、例えば、カルボキシル基硫酸基、もしくはリン酸基、またはそれらの組合せにより官能化される。

0116

更なる態様において、本開示のCNP変異体として、ヒトCNP−17(hCNP−17)からヒトCNP−53(hCNP−53)に及び、かつhCNP−53に由来する野生型アミノ酸配列を有する切断型(truncated)CNPペプチドが挙げられる。そのような切断型CNPペプチドとして、以下が挙げられる:

0117

特定の態様において、CNP変異体は、CNP−17、CNP−22、またはCNP−53を含まない。

0118

別の態様において、hCNP−17からhCNP−53に及ぶ切断型CNPペプチドは、特定の切断型CNPペプチドのアミノ酸位置の任意の1つまたは複数にて、本明細書中に記載される、アミノ酸の付加、欠失、および/または天然もしくは非天然のアミノ酸もしくはペプチド模倣体(例えばペプチド結合イソスター)との置換を含有してよい。さらに別の態様において、野生型配列、またはアミノ酸の付加、欠失、および/もしくは置換を有する切断型CNPペプチドは、N末端、C末端、および/または内部の部位にて、本明細書中に記載される部分のいずれかに結合されてよく、これらとして、以下に限定されないが、滑膜標的部分または軟骨標的部分(例えば、ビスホスホネート、骨標的ペプチド配列または軟骨標的ペプチド配列(例えば、ポリAsp、ポリGlu)、骨タンパク質(例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質)の骨標的ドメインに由来するペプチド配列)、骨形成タンパク質(例えば、BMP2、BMP3、BMP5、BMP7、BMP8a)の機能ドメインに由来するペプチド配列、ナトリウム利尿ポリペプチド(例えば、NPPC、ANP、BNP)に由来するペプチド配列、非ナトリウム利尿起源のポリペプチド(例えば、血清アルブミン、IgG、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、フィブロネクチン、フィブリノゲン、亜鉛フィンガー含有ポリペプチド、FGF−2、オステオクリン)に由来するペプチド配列、腎クリアランスを減少させる部分(例えば、負に帯電したPEG部分)、親水性ポリマー(例えばPEG)、炭水化物(例えば、関節炎の関節内の細胞の表面上の受容体によって認識される炭水化物)、疎水性の酸(例えば、C5〜C12カルボン酸、天然の脂肪酸)、リン脂質、およびそれらの組合せが挙げられる。一態様において、野生型配列、またはアミノ酸の付加、欠失、および/もしくは置換を有し、かつ任意で、N末端、C末端、および/または内部の部位にて1つまたは複数の部分に結合されている切断型CNPペプチドは、総質量が、本明細書中に一般に記載される、例えば約2.6kDaまたは2.8kDaから約6または7kDaの範囲によって特徴付けられる。

0119

更なる態様において、CNP変異体は、CNP37の誘導体であり、これは、

である。CNP37変異体は、CNP37の37の位置の任意の1つまたは複数にて、アミノ酸の付加、欠失、および/または天然もしくは非天然のアミノ酸もしくはペプチド模倣体(例えばペプチド結合イソスター)との置換を含有してよい。CNP22のナンバリングに基づいて、CNP37においてなされ得る置換の非限定的な例として、K4R、G5S、GSR、G8S、K10R、G15S、S16Q、M17N、G19R、およびそれらの組合せが挙げられる。一態様において、CNP37誘導体は、Met17の、天然(例えばアスパラギン)または非天然のアミノ酸またはペプチド模倣体への置換を含有し、部分的にメチオニンの硫黄原子の酸化を回避するように設計されている。別の態様において、CNP37変異体は、Lys8、Lys10、Lys14、および/またはLys15(CNP37のN末端からのナンバリングに基づく)の、非塩基性の天然または非天然のアミノ酸またはペプチド模倣体への置換を含有し、部分的にアルブミン結合を減少させるように設計されている。

0120

アミノ酸の付加、欠失、および/もしくは置換に加えて、またはそれらの代わりに、CNP37誘導体は、N末端、C末端、および/または内部の部位にて、以下に限定されないが、骨標的部分または軟骨標的部分(例えば骨標的ペプチドドメイン)、腎クリアランスを減少させる部分(例えば、負に帯電したPEG部分)、親水性ポリマー(例えばPEG)、1つまたは複数のアミノ酸を含むアミノ酸配列(例えば、オステオクリン「NPR−Cインヒビター」フラグメント)、炭水化物(例えば、骨成長板の細胞の表面上の受容体によって認識される炭水化物)、疎水性の酸(例えば、C5〜C12カルボン酸および天然の脂肪酸)、およびそれらの組合せを含む、本明細書中に記載される部分のいずれかに結合されてよい。

0121

一態様において、CNP変異体は、フーリン切断部位下線が引かれている)にて突然変異/置換を有して、フーリンプテアーゼに対するインビボ耐性を向上させるように設計されており、かつ/またはN末端にてグリシン(下線が引かれている)を含有して、血漿安定性を向上させて、ピログルタミン形成を防止するように設計されている改変CNP37ペプチドである。そのようなCNP37変異体として、以下に限定されないが、

が挙げられる。

0122

更なる態様において、本開示のCNP変異体として、本明細書中に記載される融合タンパク質プロセスによって生成され得るCNPペプチドおよびその変異体が挙げられる。化学切断もしくはタンパク質分解切断またはタンパク質自己切断を用いて、本明細書中に記載される融合タンパク質プロセスによって生成され得るCNP変異体の非限定的な例として、以下が挙げられる:

0123

融合タンパク質の化学切断またはタンパク質分解切断の意図された部位が、標的CNP変異体自体のアミノ酸配列内に存在していない限り、他のCNP変異体(hCNP−17からhCNP−53に及び、かつ野生型配列またはアミノ酸の付加、欠失および/もしくは置換を有する、切断型CNPペプチドを含む)も、本明細書中に記載される融合タンパク質プロセスによって生成され得る。非限定的な例として、本明細書中に記載される融合タンパク質プロセスは、ギ酸切断を用いて切断型wtCNP34を生成するために使用され得る。

0124

付加的な態様において、アスパラギン(Asn/N)残基および/またはグルタミン(Gln/Q)残基を有する、本明細書中に記載されるCNPペプチドおよびCNP変異体のいずれかについて、これらが野生型配列を有するか非天然のアミノ酸配列を有するかに拘らず、任意のAsn残基および/または任意のGln残基が独立して、AsnからGln等の保存的置換を含む、任意の他の天然または非天然のアミノ酸で置換されていてよい。そのような置換は部分的に、アスパラギンおよび/またはグルタミンの、可能性があるいかなる脱アミドも最小にし、または回避するように設計されている。任意のAsn残基および/または任意のGln残基が独立して、任意の他の天然または非天然のアミノ酸で置換されていてよい(AsnからGln等の保存的置換を含む)、CNPペプチドおよびCNP変異体の非限定的な例として、wtCNP34、wtCNP37、Gly−wtCNP37、Pro−wtCNP37、Pro−Gly−wtCNP37、GHKSEVAHRFK−wtCNP27(SEQID NO:48)、Pro−GHKSEVAHRFK−wtCNP27(SEQ ID NO:50)、PEO12−GANRR−CNP22(K4R)(SEQ ID NO:101)、およびPEO24−GANRR−CNP22(K4R)(SEQ ID NO:102)が挙げられる。特定の態様において、本明細書中に記載されるCNPペプチドおよびCNP変異体のアスパラギン残基は、グルタミン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸で置換されていない。特定の態様において、本明細書中に記載されるCNPペプチドおよびCNP変異体のグルタミン残基は、アスパラギン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸で置換されていない。

0125

非限定的な例として、Pro−Gly−wtCNP37

のアスパラギン残基7および/または15は独立して、アスパラギン残基の、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸への可能性があるいかなる脱アミドも回避するために、グルタミンを含む任意の他の天然または非天然のアミノ酸で置換されていてよい。特定の態様において、Pro−Gly−wtCNP37のアスパラギン残基7および/または15は、グルタミン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸で置換されていない。

0126

しかしながら、本開示は、脱アミドまたは脱アミド様反応(例えば異性化)に感受性の任意の1つまたは複数の、最大全ての残基が、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、変換される残基あたり任意の程度、最大100%の変換まで、他の残基に変換されていてよいCNP変異体を包含することが理解される。特定の態様において、本開示は:(1)任意の1つまたは複数、最大全てのアスパラギン(Asn/N)残基が、脱アミドを介して、アスパラギン酸もしくはアスパルテートに、かつ/またはイソアスパラギン酸もしくはイソアスパルテートに変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%であり;(2)任意の1つまたは複数、最大全てのグルタミン(Gln/Q)残基が、脱アミドを介して、グルタミン酸もしくはグルタメートに、かつ/またはイソグルタミン酸もしくはイソグルタメートに変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%であり;(3)任意の1つまたは複数、最大全てのアスパラギン酸またはアスパルテート(Asp/D)残基が、脱アミド様反応(異性化とも呼ばれる)を介して、イソアスパラギン酸またはイソアスパルテートに変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%であり;(4)任意の1つまたは複数、最大全てのグルタミン酸またはグルタメート(Glu/E)残基が、脱アミド様反応(異性化とも呼ばれる)を介して、イソグルタミン酸またはイソグルタメートに変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%であり;あるいは(5)上記のものが組み合わされている、CNP変異体を包含する。

0127

非限定的な例として、本開示は、Pro−Gly−wtCNP37

の任意の1つまたは複数、最大全てのアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、および/またはグルタミン酸残基が、先に記載されるように、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、(1)アスパラギン酸/アスパルテートおよび/もしくはイソアスパラギン酸/イソアスパルテート、(2)グルタミン酸/グルタメートおよび/もしくはイソグルタミン酸/イソグルタメート、(3)イソアスパラギン酸/イソアスパルテート、ならびに/または(4)イソグルタミン酸/イソグルタメートにそれぞれ変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%である、CNP変異体を包含する。

0128

更なる例として、本開示は、Pro−Gly−wtCNP37

の任意の1つまたは複数、最大全てのアスパラギンおよび/またはアスパラギン酸残基が、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、(1)アスパラギン酸/アスパルテートおよび/もしくはイソアスパラギン酸/イソアスパルテート、ならびに/または(2)イソアスパラギン酸/イソアスパルテートにそれぞれ変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%である、CNP変異体を包含する。

0129

別の例として、本開示は、Gly−wtCNP37

の任意の1つまたは複数、最大全てのアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、および/またはグルタミン酸残基が、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、(1)アスパラギン酸/アスパルテートおよび/もしくはイソアスパラギン酸/イソアスパルテート、(2)グルタミン酸/グルタメートおよび/もしくはイソグルタミン酸/イソグルタメート、(3)イソアスパラギン酸/イソアスパルテート、ならびに/または(4)イソグルタミン酸/イソグルタメートにそれぞれ変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%である、CNP変異体を包含する。

0130

さらに別の例として、本開示は、wtCNP37

の任意の1つまたは複数、最大全てのアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、および/またはグルタミン酸残基が、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、(1)アスパラギン酸/アスパルテートおよび/もしくはイソアスパラギン酸/イソアスパルテート、(2)グルタミン酸/グルタメートおよび/もしくはイソグルタミン酸/イソグルタメート、(3)イソアスパラギン酸/イソアスパルテート、ならびに/または(4)イソグルタミン酸/イソグルタメートにそれぞれ変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%である、CNP変異体を包含する。

0131

更なる例として、本開示は、HSA−wtCNP27キメラ、

の任意の1つまたは複数、最大全てのアスパラギン、アスパラギン酸、および/またはグルタミン酸残基が、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、(1)アスパラギン酸/アスパルテートおよび/もしくはイソアスパラギン酸/イソアスパルテート、(2)イソアスパラギン酸/イソアスパルテート、ならびに/または(3)イソグルタミン酸/イソグルタメートにそれぞれ変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%である、CNP変異体を包含する。

0132

更なる例として、本開示は、Pro−HSA−wtCNP27キメラ、

の任意の1つまたは複数、最大全てのアスパラギン、アスパラギン酸、および/またはグルタミン酸残基が、脱アミドまたは脱アミド様反応を介して、(1)アスパラギン酸/アスパルテートおよび/もしくはイソアスパラギン酸/イソアスパルテート、(2)イソアスパラギン酸/イソアスパルテート、ならびに/または(3)イソグルタミン酸/イソグルタメートにそれぞれ変換されていてよく、変換は、変換される残基あたり最大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%である、CNP変異体を包含する。

0133

また、本開示は、任意の1つまたは複数、最大全てのメチオニン(Met/M)残基が、任意の化学的に実行可能な酸化型(例えば、スルホキシドおよび/またはスルホン)に酸化されていてよく、転化は、酸化される残基あたり最大約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%である、CNP変異体を包含する。

0134

別の態様において、CNP変異体は、N末端および/またはC末端にて、細胞膜または細胞バリアの全体にわたって変異体の転座を促進する部分に結合されるCNP22またはその変異体を含む。一態様において、CNP変異体は、N末端および/またはC末端にて、細胞膜または細胞バリアの全体にわたって変異体の輸送を促進する(活性ペプチドトランスポータを介することを含む)ペプチド配列に結合される。

0135

更なる態様において、CNP22またはその変異体のN末端および/またはC末端は、化学部分、例えば、天然ポリマーおよび/または合成ポリマーに結合されて、改変CNPペプチドの総質量が、本明細書中に一般に記載される範囲、例えば、約2.6または2.8kDaから約6または7kDaの範囲に増大する。一態様において、化学部分は、生体適合性の、親水性または水溶性の天然ポリマー(例えば、ペプチド、炭水化物)または合成ポリマー(例えば、PEG(またはPEO))である。

0136

特定の態様において、CNP22またはその変異体のN末端および/またはC末端は、PEG(またはPEO)ポリマーに結合されて、本明細書中に一般に記載される、例えば約2.6または2.8kDaから約6または7kDaの範囲によって特徴付けられる総質量となる。CNP22またはその変異体のペグ化が、とりわけ、腎クリアランスを減少させ、かつプロテアーゼ耐性を増大させることによって、免疫原性を減少させて半減期を向上させるように設計されている。PEG部分が、CNP22、または、以下に限定されないが、CNP−17(CNP22のCys6〜Cys22環化部分)、CNP37、ならびにN末端および/もしくはC末端のアミノ酸伸長、アミノ酸置換、および/もしくはアミノ酸欠失を有するCNP17、CNP22、もしくはCNP37の変異体を含む、本明細書中に記載される任意の変異体のN末端および/またはC末端に取り付けられていてよい。一態様において、CNP17、CNP22、もしくはCNP37、またはそれらの変異体のLys4残基および/またはLys10残基は、天然または非天然のアミノ酸(例えば、Arg、Gly、Ser、Gln、Glu、またはCit)または側鎖上に反応性第一級アミンを含有しないペプチド模倣体で置換されて、これらのリジン残基の、可能性があるいかなるペグ化も排除している。一態様において、CNPペプチドのLys4残基および/またはLys10残基は、Argで置換されている。別の態様において、Lys10残基は、Argで置換されていない。

0137

更なる態様において、N末端にPEG(またはPEO)部分およびアミノ酸伸長を有するCNP変異体(CNP22およびその変異体を含む)は、CNP22のGly1に対応する位置の直ぐ前の位置にアルギニンを含有する。そのようなペグ化CNP変異体は、NEP分解に対する耐性の増大、血清アルブミンへの結合の減少、およびCNP機能活性の増強(例えば、cGMPシグナル伝達の活性化)のために設計されている。ペグ化CNP変異体の非限定的な例として、PEO24−GANRR−CNP22(K4R)(SEQID NO:102)、PEO12−GANRR−CNP22(K4R)(SEQ ID NO:101)、PEO24−GANRR−CNP22(SEQ ID NO:103)、PEO12−GANRR−CNP22(SEQ ID NO:104)、PEO24−GANPR−CNP22(K4R)(SEQ ID NO:105)、PEO12−GANPR−CNP22(K4R)(SEQ ID NO:106)、PEO24−GANPR−CNP22(SEQ ID NO:107)、PEO12−GANPR−CNP22(SEQ ID NO:108)、PEO24−GANQQ−CNP22(SEQ ID NO:109)、PEO12−GANQQ−CNP22(SEQ ID NO:110)、PEO24−ER−CNP22(K4R)(SEQ ID NO:111)、PEO12−ER−CNP22(K4R)(SEQ ID NO:112)、PEO24−ER−CNP22(SEQ ID NO:113)、PEO12−ER−CNP22(SEQ ID NO:114)、PEO24−R−CNP22(K4R)(SEQ ID NO:115)、PEO12−R−CNP22(K4R)(SEQ ID NO:116)、PEO24−R−CNP22(SEQ ID NO:117)、およびPEO12−R−CNP22(SEQ ID NO:118)が挙げられ、PEO24は、単分散性の1.2kDaのPEGポリマーであり、PEO12は、単分散性の0.6kDaのPEGポリマーである。一態様において、PEG(またはPEO)ポリマーは、CNP変異体のN末端に結合されている。

0138

本開示は、タイプ(例えば、ホモポリマーまたはコポリマーランダムコポリマー交互コポリマー、またはブロックコポリマー;直鎖または分枝状;単分散性または多分散性)、結合(例えば、加水分解性の結合または安定した結合、例えば、アミドイミンアミナールアルキレン、またはエステル結合)、結合部位(例えば、N末端および/またはC末端であり、好ましくは、CNPの環化領域(CNP22の残基6〜22に対応する)中のいかなる残基でもない)、および長さ(例えば、約0.2、0.4、または0.6kDaから約2、3、4、または5kDa)が異なり得る親水性ポリマーまたは水溶性ポリマー(例えばPEG)の使用を意図する。親水性ポリマーまたは水溶性ポリマーは、当技術分野において公知のN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)系もしくはアルデヒド系化学物質、または他の化学物質によって、CNPペプチドに結合されていてよい。そのようなCNP変異体は、例えば、wtCNP22(2.2kDa)、wtCNP22の環化領域(残基6〜22)のみを保持するCNP17、CNP22もしくはCNP17のN末端および/もしくはC末端にてアミノ酸伸長を有するCNP変異体、またはアミノ酸の置換、付加、および/もしくは欠失を有する変異体、例えば、GANRR−CNP22(K4R)(SEQID NO:119)、GANPR−CNP22(K4R)(SEQ ID NO:78)、R−CNP22(SEQ ID NO:71)、R−CNP22(K4R)(SEQ ID NO:79)、ER−CNP22(SEQ ID NO:72)、およびER−CNP22(K4R)(SEQ ID NO:80)を用いて生じさせることができる。一態様において、総質量が、本明細書中に一般に記載される、例えば約2.6または2.8kDaから約6または7kDaの範囲によって特徴付けられるPEG−CNP変異体は、N末端および/もしくはC末端に、NHSもしくはアルデヒド系の化学物質を介して結合した単分散性の直鎖PEG(またはPEO)部分、またはN末端および/もしくはC末端に、NHS系の化学物質を介して結合した2腕もしくは3腕の分枝状PEG部分を含有する。本開示はまた、腎クリアランスの減少のために設計されている、負に帯電したPEG−CNP変異体を包含し、以下に限定されないが、カルボキシル化された化合物、硫酸化された化合物、およびリン酸化された化合物を含む(Caliceti, Adv. Drug Deliv. Rev., 55: 1261-77 (2003);Perlman, J. Clin. Endo. Metab., 88: 3227-35 (2003);Pitkin, Antimicrob. Ag. Chemo., 29: 440-444 (1986);Vehaskari, Kidney Intl, 22: 127-135 (1982))。一態様において、PEG(またはPEO)部分は、カルボキシル基、硫酸基、および/またはリン酸基を含有する。

0139

別の態様において、本明細書中に記載されるCNP変異体のN末端、C末端、および/または内部の部位に結合されるPEG(またはPEO)部分は、生理学的条件下で正に帯電する1つまたは複数の官能基を含有する。そのようなPEG部分は、とりわけ、軟骨組織へのそのようなペグ化CNP変異体の分布を向上させるように設計されている。一態様において、そのようなPEG部分は、1つまたは複数の一級アミノ基、二級アミノ基、もしく三級アミノ基、四級アンモニウム基、および/または他のアミン含有(例えば尿素)基を含有する。

0140

一態様において、本開示は、式(CH2CH2O)nのPEG(またはPEO)に、NHS系またはアルデヒド系の化学物質を介して結合されたCNP22またはその変異体を包含し、式中、nは、約6から約100の整数であり、PEGポリマーは、約0.3kDaから約5kDaである。別の態様において、nは、約12から約50の整数であり、PEGポリマーは、約0.6kDaから約2.5kDaである。さらに別の態様において、nは、約12から約24であり、PEGポリマーは、約0.6kDaから約1.2kDaである。さらに別の態様において、PEGポリマーの末端ヒドロキシル基は、非反応性基キャッピングされている。特定の態様において、エンドキャッピング基は、アルキル基、例えば、メチル等の低級アルキル基である。

0141

更なる態様において、本開示は、中立エンドペプチターゼ(NEP)を含むペプチダーゼによる切断に対する感受性を減少させた、1つまたは複数のペプチド結合またはペプチド結合イソスターを有するCNP変異体を提供する。NEPは、大きな疎水性残基のアミノ末端にて基質ペプチド結合を切断する、膜結合亜鉛依存性エンドペプチターゼである。ゆえに、NEPの切断部位にあたるペプチド結合の、非天然ペプチドまたは非ペプチド結合への改変は、NEP切断の効率を排除し得、または低下させ得る。

0142

ANPおよびCNPについて、最初に環化領域内のCys6−Phe7結合にて、その後構造の残りの全体を通じて他の場所にて、NEP切断が起こることが報告されている。BNPについて、切断は、最初にペプチドN末端にて、その後環状構造内で起こることが報告されている。CNP上の第一のNEP切断部位は、Cys6−Phe7結合であることが報告されているが、wtCNP22がインビトロで2.5分間NEP消化に曝された場合に、全ての考えられる部位が予想外加水分解され、Cys6−Phe7ペプチド結合およびGly8−Leu9ペプチド結合が、僅かであるが最も不安定であった。

0143

NEPの基質特異性は主に、2つの基質−結合亜部位、S1’およびS2’によって判定される(Oefner et al., J. Mol. Biol. 296:341-349 (2000))。S1’部位は、N末端ペプチド結合が加水分解に曝される大きな疎水性P1’残基(例えば、Phe、Leu、Ile、およびMet)を受け入れる。S2’部位は一般に、P2’(例えば、GlyまたはSer)と呼ばれる、より小さな残基を好む。CNPの場合、Phe7が、NEP S1’部位にとって好ましいP1’残基であることが報告されている一方、Gly8が、S2’部位にとって好ましいP2’残基である。これらの2つの亜部位は、特定の総側鎖サイズしか一緒に収容することができないので、CNPのP1’−P2’残基の総サイズの任意の増大が、NEP結合を潜在的に破壊することができる。例えば、P1’Phe7芳香環の3−位置でのクロリド原子の付加(すなわち、3−Cl−Phe7)により、例えばS1’亜部位にて、CNPとNEP切断部位間の相互作用を潜在的に改変する(例えば、不安定にする)ことができる。より小さなP2’残基Gly8への三級ブチル基の付加(すなわち、tBu−Gly8)により、CNPとS2’亜部位間の相互作用を潜在的に破壊することができる。

0144

したがって、一態様において、本開示のCNP変異体として、P1’−P2’残基、例えばPhe7−Gly8のサイズが増大して、活性部位での基質認識に干渉することによって、NEP切断に対する感受性が減少しているCNPが挙げられる。天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、および/またはペプチド模倣体部分が、以下に限定されないが、Phe7、Leu9、Leu11、Ile14、Met17、およびLeu20を含む1つもしくは複数の大きなP1’疎水性残基に、かつ/または、以下に限定されないが、Cys6、Gly8、Gly15、Ser16、およびGly19を含む1つもしくは複数のより小さなP2’残基に、置換されている。

0145

本開示は、少なくとも1つの改変アミノ酸および/または少なくとも1つの改変ペプチド結合を含むCNP変異体を包含し、少なくとも1つの残基が、NEPによる基質認識および/または切断に関わり、改変アミノ酸および改変ペプチド結合は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、ペプチド模倣体、および/またはペプチド結合イソスターであってよい。一態様において、Cys6とPhe7間のCNP上のNEP切断部位は、改変されている。関連する態様において、Cys6とPhe7間のペプチド結合(−−C(=O)−−NH−−)は、以下のペプチド結合イソスターの1つで置換されている:
−−CH2−−NH−−、
−−C(=O)−−N(R)−−(式中、アミド基は、以下のR基のいずれかでアルキル化されている:メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、またはtert−ブチル)、
−−C(=O)−−NH−−CH2−−、
−−CH2−−S−−、
−−CH2−−S(O)n−−(式中、nは、1または2である)、
−−CH2−−CH2−−、
−−CH=CH−−、
−−C(=O)−−CH2−−、
−−CH(CN)−−NH−−、
−−CH(OH)−−CH2−−、
−−O−−C(=O)−−NH−−、または
−−NHC(=O)NH−−。

0146

別の態様において、CNP変異体は、式:

によって表され、式中:
(x)および(z)は、独立して、不在であってもよいし、合成骨標的化合物、例えば、ビスホスホネート;関節標的または軟骨標的に有用なアミノ酸配列、例えば、ポリAspおよびポリGlu;骨タンパク質、例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、およびシアロタンパク質の骨標的ドメインに由来するアミノ酸配列(Wang et al., Adv. Drug Delivery Rev., 57: 1049-76 (2005));腎クリアランスを減少させるポリマー分子および非ポリマー分子、例えば、負に帯電したPEG;ならびに、CNP変異体の総質量を、本明細書中に一般に記載される、例えば約2.6または2.8kDaから約6または7kDaの範囲に増大させることによってNEP分解に対するCNP変異体の耐性を増大させる、天然のポリマー(例えば、アミノ酸、脂肪酸、および/または炭水化物を含有するもの)および合成ポリマー(例えばPEG)からなる群より選択されてもよく;
(b)および(c)は、野生型Cys6およびPhe7であっても、別の天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸であってもよいし、NEP切断に対する耐性を増大させるために本明細書中に記載されるペプチド結合イソスターを含有してもよく;そして
(d)は、野生型Gly8であってもよいし、NEPへの結合を減少させるために、より大きな天然のアミノ酸もしくは非天然のアミノ酸(例えばt−Bu−Gly)、またはペプチド模倣体であってもよい。

0147

一態様において、そのようなCNP変異体は、(b)、(c)、および/または(d)にて少なくとも1つの改変アミノ酸を含有する。

0148

Gly8−Leu9、Lys10−Leu11、Arg13−Ile14、Ser16−Met17、およびGly19−Leu20結合を含む、CNP内の他のペプチド結合は、たとえCNP22またはその変異体が、Cys6−Phe7にて、NEP耐性を示すペプチド結合またはペプチド結合イソスターを有するとしても、切断され得る。したがって、本開示は、Cys6−Phe7結合に加えて、1つまたは複数の他のNEP切断部位にてペプチド結合イソスターを有するCNP変異体を包含し、ペプチド結合イソスターとして、本明細書中に記載されるものを含む。

0149

別の態様において、本開示は、Cys6および/またはCys22にて、以下に限定されないが、ホモシステイン、ペニシラミン、2−メルカプトプロピオン酸、および3−メルカプトプロピオン酸を含むシステイン類似体を有するCNP変異体を包含する。一態様において、そのようなCNP変異体は、野生型Cys6または類似体とCys22または類似体間のジスルフィド結合によって形成される環状ドメインを有する。さらに別の態様において、CNP22またはその変異体の1つまたは複数の残基、最大全ての残基が、D−アミノ酸で置換されている。L−アミノ酸の、D−アミノ酸との置換は本質的に、側鎖をその元の位置から約120度移動させることによって、NEPへのCNPペプチドの結合を潜在的に破壊する。特定の態様において、Phe7のL−Pheは、そのD−エナンチオ異性体、D−Pheで置換されている。

0150

さらに別の態様において、ベータ−アミノ酸、例えば、3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸(または2−フェニル−ベータ−アラニン)が、野生型アルファ−アミノ酸Phe7を置換している。ベータ−アミノ酸の使用により、ペプチド骨格長は1メチレン単位で実際上増大する。プロテアーゼ耐性は、基質構造の変化、またはアミノ酸側鎖間距離の増大に起因し得る。

0151

非天然のアルファ−アミノ酸、ベータ−アミノ酸、またはペプチド結合イソスターを有するCNP22の変異体の非限定的な例として、以下が挙げられる:

0152

更なる態様において、CNP変異体は、総質量が、本明細書中に一般に記載される、例えば約2.6または2.8kDaから約6または7kDaの範囲によって特徴付けられ、NEP分解に対する耐性の増大のために設計されており、そして以下の式によって表され:

式中:
(x)および(z)は、独立して、不在であってもよいし、合成骨標的化合物、例えば、ビスホスホネート;骨標的または軟骨標的に有用なアミノ酸配列、例えば、ポリAspおよびポリGlu;骨タンパク質、例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、およびシアロタンパク質の骨標的ドメインに由来するアミノ酸配列;腎クリアランスを減少させるポリマー部分および非ポリマー部分、例えば、負に帯電したPEG;例えば、アミノ酸、疎水性の酸、および/または炭水化物を含有するポリマー;ならびに合成親水性ポリマー、例えばPEGからなる群より選択されてもよく;
(a)は、その位置にて野生型Lysであってもよいし、保存的アミノ酸置換基、あるいは以下に限定されないが、Arg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、Ser、またはGluを含む、天然もしくは非天然のアミノ酸、または側鎖上に反応性第一級アミンを有していないペプチド模倣体で置換されていてもよく、一態様において、(a)はArgであり;
(b)は、Cys、およびCys6とPhe7間のペプチド結合イソスター、例えばCys−CH2−−NHからなる群より選択され;
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;PheのN−アルキル化誘導体(N−アルキル基は、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、またはtert−ブチルである);およびPhe類似体(Phe類似体のベンゼン環の1つまたは複数のオルソ位置、メタ位置、および/もしくはパラ位置は、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、直鎖状もしくは分枝状のC1〜6アルキル、直鎖状もしくは分枝状のC1〜6アルコキシ、直鎖状もしくは分枝状のハロ−C1〜6アルキル、C3〜10シクロアルキル、ヘテロシクリル、C6〜14アリール、およびヘテロアリール(例として、以下に限定されないが、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロ−フェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含む)からなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換され、または、Phe類似体のベンゼン環は、別のアリール基(非限定的な例として、1−および2−ナフチルアラニンを含む)で、もしくはヘテロアリール基(非限定的な例として、ピリジルアラニンチエニルアラニン、およびフリルアラニンを含む)で置換されていてよい)からなる群より選択され;
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Thr、Ser、Val、およびAsnからなる群より選択され;
(e)は、Leu、Ser、Thr、およびペプチド結合イソスター、例えばN−Me−Leuからなる群より選択され;
(f)は、その位置にて野生型Lysであってもよいし、保存的アミノ酸置換基、あるいは以下に限定されないが、Arg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、Ser、またはGluを含む、天然もしくは非天然のアミノ酸、または側鎖上に反応性第一級アミンを有していないペプチド模倣体で置換されていてもよく、一態様において、(f)はArgでなく;
(g)は、Leuおよびペプチド結合イソスター、例えばN−Me−Leuからなる群より選択され;
(h)は、Ile、tBu−Gly、およびペプチド結合イソスター、例えばN−Me−Ileからなる群より選択され;
(i)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)、および2−アミノ−イソ酪酸(Aib)からなる群より選択され;そして
(j)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Ser、Thr、Arg、およびペプチド結合イソスター、例えばN−Me−Leuからなる群より選択される。

0153

別の態様において、CNP変異体は、総質量が、本明細書中に一般に記載される、例えば約2.6または2.8kDaから約6または7kDaの範囲によって特徴付けられ、NEP切断に対する耐性の増大のために設計されており、そして以下の式によって表され:

式中:
(x)および(z)は、独立して、不在であってもよいし、合成骨標的化合物、例えばビスホスホネート;骨標的または軟骨標的に有用なアミノ酸配列、例えば、ポリAspおよびポリGlu;骨タンパク質およびその誘導体の骨標的ドメイン、例えば、オステオポンチン、オステオカルシン、シアロタンパク質等の融合タンパク質またはペプチド配列に由来するアミノ酸配列;以下に限定されないが、親水性ポリマーまたは水溶性ポリマー、例えば、帯電したPEG分子を含む、腎クリアランスを減少させる部分;ならびに、例えば、PEG、アミノ酸、炭水化物、および/または疎水性の酸を含む部分からなる群より選択されてもよく;
(a)は、その位置にて野生型Lysであってもよいし、保存的アミノ酸置換基、あるいは以下に限定されないが、Arg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、Ser、またはGluを含む、天然もしくは非天然のアミノ酸、または側鎖上に反応性第一級アミンを有していないペプチド模倣体で置換されていてもよく、一態様において、(a)はArgであり;
(b)は、Cys、およびCys6とPhe7間のペプチド結合イソスター、例えばCys−CH2−−NHからなる群より選択され;
(c)は、L−Phe;D−Phe;3−アミノ−2−フェニルプロピオン酸;PheのN−アルキル化誘導体(N−アルキル基は、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、またはtert−ブチルである);およびPhe類似体(Phe類似体のベンゼン環の1つまたは複数のオルソ位置、メタ位置、および/もしくはパラ位置は、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、直鎖状もしくは分枝状のC1〜6アルキル、直鎖状もしくは分枝状のC1〜6アルコキシ、直鎖状もしくは分枝状のハロ−C1〜6アルキル、C3〜10シクロアルキル、C6〜14アリール、ヘテロシクリル、およびヘテロアリール(例として、以下に限定されないが、チロシン、3−クロロフェニルアラニン、2,3−クロロ−フェニルアラニン、3−クロロ−5−フルオロ−フェニルアラニン、2−クロロ−6−フルオロ−3−メチル−フェニルアラニンを含む)からなる群より選択される1つもしくは複数の置換基で置換され、または、Phe類似体のベンゼン環は、別のアリール基(非限定的な例として、1−および2−ナフチルアラニンを含む)で、もしくはヘテロアリール基(非限定的な例として、ピリジルアラニン、チエニルアラニン、およびフリルアラニンを含む)で置換されていてよい)からなる群より選択され;
(d)は、Gly、tert−ブチル−Gly、Thr、Ser、Val、およびAsnからなる群より選択され;
(e)は、Leu、Ser、Thr、およびペプチド結合イソスター、例えばN−Me−Leuからなる群より選択され;
(f)は、Lys、Arg、Gly、6−ヒドロキシ−ノルロイシン、シトルリン(Cit)、Gln、およびSerからなる群より選択され;
(g)は、Leu、Asnおよびペプチド結合イソスター、例えばN−Me−Leuからなる群より選択され;
(h)は、Ile、tert−ブチル−Gly(tBu−Gly)、Asn、およびペプチド結合イソスター、例えばN−Me−Ileからなる群より選択され;
(i)は、Gly、Arg、Ser、およびAsnからなる群より選択され;
(j)は、Met、Val、Asn、ベータ−Cl−Ala、2−アミノ酪酸(Abu)、および2−アミノ−イソ酪酸(Aib)からなる群より選択され;そして
(k)は、Leu、ノルロイシン(Nle)、ホモロイシン(Hleu)、Val、tert−ブチル−Ala(tBu−Ala)、Arg、Thr、Ser、およびペプチド結合イソスター、例えばN−Me−Leuからなる群より選択される。

0154

CNP変異体の、関節関連障害(例えば骨関節炎)の標的部位への送達を向上させるために、CNP変異体は、(例えば、N末端および/またはC末端にて)骨標的部分または軟骨標的部分に取り付けられてよい。骨標的部分または軟骨標的部分の非限定的な例として、ビスホスホネート;ヒドロキシアパタイトグルコサミン;コラーゲン(例えばX型コラーゲン);ポリAsp;ポリGlu;および骨タンパク質、例えば、オステオクリン、オステオポンチン、オステオカルシン、およびシアロタンパク質の骨標的ドメインに由来するアミノ酸配列が挙げられる。

0155

NEP切断にあまり感受性でないことに加えて、CNP変異体は潜在的に、NPR−Cクリアランス受容体に対する親和性が低い一方で、CNP官能性を保持している。NEP媒介分解の他に、CNP22の半減期は、クリアランス受容体、NPR−Cによって影響され、これは、NPR−Bの細胞外ペプチド結合ドメインとの58%の配列相同性を共有する。CNP22は、NPR−Bにだけでなく(7〜30のpM親和性)、NPR−C(11〜140pM)にも強固に結合する(Bennett, B. D. et al., J. Biol. Chem., 266: 23060-67 (1991);Koller, K. J. & Goeddel, D. V.,Circulation, 86: 1081-88 (1992);Suga, S. et al., Endocrinology, 130: 229-39 (1992))。NPR−B結晶構造はまだ報告されていないが、NPR−CとNPR−Aの結晶構造間の配列相同性および類似性(He, X.-L. et al., Science, 293(5535): 1657-62 (2001);Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279(27): 28625-31 (2004);He, X.-L., J. Mol. Biol., 361(4): 698-714 (2006))は、NPR−Bがおそらく、全体的な構造的折畳みが類似するとみなされることを示唆している。

0156

したがって、NPR−B相同モデルを、以下の関連する系の構造ベースの配列アラインメントおよび結晶構造に基づいて構築した:NPR−Cに結合したCNP、NPR−Aに結合したANP、およびNPR−Cに結合したANP(He, X.-L. et al., Science, 293(5535): 1657-62 (2001);Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279(27): 28625-31 (2004);He, X.-L., J. Mol. Biol., 361(4): 698-714 (2006))。受容体が、結合したペプチド構造を決定すると思われ、そしてNPR−Bが、一次構造および機能特性に関してNPR−Aに最も近いという観察に基づいて、NPR−B/CNP相同性モデルを、モデルとしてのNPR−A/ANP結晶構造で構築した。CNP変異体の公開されているシグナル伝達データ(米国特許第5,434,133号および米国特許出願公開第2004/0138134A1号)、およびNPR−Cにもはや結合しない機能的ANP変異体の公開されているシグナル伝達データ(Cunningham,EMBO 13(11) 2508-15, 1994)を用いて、NPR−B/CNPモデルを洗練して解釈した。

0157

本開示は、NPR−B/CNP複合体の相同性ベースの構造モデルに基づいて、NPR−B選択性の向上のために設計されたCNP変異体を包含する。種々の受容体に結合されたナトリウム利尿ペプチドの実験コンピュータ構造データを、公開されている機能データと組み合わせることで、NPR−Bに結合し続けるが、NPR−Cクリアランス受容体への親和性を潜在的に減少させることができるCNP変異体が生成された。例えば、NPR−Cは、ペプチド結合部位におけるループ構造内に特有の挿入を有しており、そのループ残基を、NPR−AおよびNPR−Bにおけるそれぞれのループ残基と比較して、CNP Gly8(またはANP Gly9)のようなペプチド残基のより近くに置いている。以前の研究は、ANP中のG9T突然変異が、NPR−Cに対する親和性を減少させることによって、NPR−A選択性を向上させるのに寄与していることを示した(Cunningham,EMBO J., 13(11): 2508-15 (1994))。したがって、対応するGly8残基を、より大きな残基(Ser、Val、Thr、またはAsn)と置換して、NPR−Bへの結合に影響を及ぼすことなく、NPR−CへのCNP結合を破壊したCNP変異体が作成された。さらに、1つまたは複数の突然変異を、Gly15からGly21を包含するCNPのC末端に導入した。これは、受容体/ペプチド複合体の詳細な構造分析に基づいて、受容体特異的残基と相互作用すると予測される。例えば、CNP22におけるG19R突然変異は、NPR−Bシグナル伝達活性を大きく損失しない。しかしながら、この突然変異は、隣接残基の構造を変更することなく、NPR−C/CNPの有効な結晶構造にモデル化され得ない。これらの観察は、G19R突然変異が、特定の受容体、例えばNPR−CへのCNPの結合を選択的に破壊し得ることを示唆している。

0158

一態様において、CNP変異体は、位置1、5、8、15、19、および21の1つまたは複数のGly部位にて置換を有して、立体配座自由度を減少させることによって、受容体特異性を増大させている。NPR−CおよびNPR−Aに結合したANPの結晶構造の比較分析(Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279: 28625-31 (2004);He, X.-L., J. Mol. Biol., 361: 698-714 (2006))は、ANPの立体配座自由度が、受容体選択性の決定に重要な役割を果たし得ることを示している。

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