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図面 (7)

課題・解決手段

本発明は、コラーゲン7を含む組成物及びDEBを治療するためのそれを用いる方法に関する。

概要

背景

コラーゲンVII(C7)タンパク質構造タンパク質であり、ここでC7は、表皮及び真皮の付着を可能にする係留線維の形成のための構造及び機能前駆物質の双方である。C7単量体は、1つのNC−1及び1つのNC−2結合領域を含有する約900kDaのホモ三量体として集合する。ホモ三量体は、αヘリカルコイルを介して一緒に保持される。これらのC7タンパク質前駆物質は、ホモ三量体から、分子量の1.8mDaへの増加を伴う逆平行二量体整列する。逆平行二量体の外側アセンブリは、係留線維の形成をもたらす。rC7タンパク質は、「粘着性」、特にPBS緩衝液中高タンパク質濃度で沈殿する傾向を示す。

概要

本発明は、コラーゲン7を含む組成物及びDEBを治療するためのそれを用いる方法に関する。

目的

本開示は、緩衝液非必須アミノ酸抗凍結剤界面活性剤、及びキレート剤を含有する組換えC7(rC7)製剤を提供する

効果

実績

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請求項1

組換えコラーゲン7、約10mMのリン酸ナトリウム、約5mMのクエン酸ナトリウム、約70mMの塩化ナトリウム、約100mMのアルギニン、約50mMのスクロース、及び約0.05%のポリソルベート20を含んでなる、組成物

請求項2

7.0〜7.2のpHを有する、請求項1に記載の組成物。

請求項3

前記組換えコラーゲン7がヒトコラーゲン7である、請求項1又は2に記載の組成物。

請求項4

組換えコラーゲン7、約10mMのリン酸ナトリウム、約5mMのクエン酸ナトリウム、約70mMの塩化ナトリウム、約100mMのアルギニン、約50mMのスクロース、約0.05%のポリソルベート20及び1つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含んでなる、医薬組成物

請求項5

7.0〜7.2のpHを有する、請求項4に記載の組成物。

請求項6

前記組換えコラーゲン7がヒトコラーゲンである、請求項4又は5に記載の組成物。

請求項7

(a)前記組成物500mLが1リットルポリカーボネートボトル内で貯蔵されるとき、−65±5℃又は−20±5℃で3か月間;(b)前記組成物5.5mLが10cm3(10cc)のガラスバイアル内で貯蔵されるとき、−65±5℃又は−20±5℃で6か月間;(c)25±3℃で2週間;及び(d)5±3℃で最大1か月間、のうちの少なくとも1つの条件で安定である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。

請求項8

栄養障害型表皮水疱症治療に用いられる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。

請求項9

栄養障害型表皮水疱症を治療する方法であって、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物を有効量でそれを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。

技術分野

0001

本発明は、組成物(例えば医薬組成物)、より詳細にはコラーゲン7組成物、及び栄養障害型表皮水疱症治療するためにそれを用いる方法に関する。

背景技術

0002

コラーゲンVII(C7)タンパク質構造タンパク質であり、ここでC7は、表皮及び真皮の付着を可能にする係留線維の形成のための構造及び機能前駆物質の双方である。C7単量体は、1つのNC−1及び1つのNC−2結合領域を含有する約900kDaのホモ三量体として集合する。ホモ三量体は、αヘリカルコイルを介して一緒に保持される。これらのC7タンパク質前駆物質は、ホモ三量体から、分子量の1.8mDaへの増加を伴う逆平行二量体整列する。逆平行二量体の外側アセンブリは、係留線維の形成をもたらす。rC7タンパク質は、「粘着性」、特にPBS緩衝液中高タンパク質濃度で沈殿する傾向を示す。

発明が解決しようとする課題

0003

C7の欠乏は、これらの係留線維の異常な減少及び栄養障害型表皮水疱症(DEB)として知られる状態をもたらす。EBは、皮膚への軽度の機械外傷後水疱の発生によって特徴づけられる分子的に多様な疾患群を包含する(1)。重症度、真皮外徴候及び臨床経過はEBのタイプに依存するが、ほぼすべての患者水疱形成又は皮膚破裂を経験する(2)。

0004

栄養障害型表皮水疱症(DEB)は、治癒による瘢痕の発生によって特徴づけられるEBの一形態である(3)。DEBを有する患者では、水疱形成は、皮膚の極度脆弱性のために軽度の機械的外傷によっても引き起こされ得る。これは、水疱形成、治癒、及び再水疱形成(reblistering)の慢性サイクルをもたらし、それにより患者が上皮組織の痛々しい傷及び衰弱性瘢痕(debilitating scarring)を患う原因となる。DEBに対する治療法はなく、支持療法が管理の対象である。

0005

ジストロフィー型EBは、基底膜下層の真皮に係留する係留線維の形成にとって必須のタンパク質である、コラーゲンVII(C7)のα鎖をコードするCol7a1遺伝子における突然変異によって引き起こされる(4)。その状態は、優性型(DDEB)又は劣性型RDEB)のいずれかとして遺伝され、RDEBは典型的にはより重篤表現型を有する(5)。

0006

DEBマウスモデル(Col7a1−/−)は、Col7a1遺伝子の標的化不活性化を有し、それは重篤なヒトRDEBの組織学的及び超微細構造的症状を模倣する重篤な水疱形成をもたらす(6)。これらのマウスは、係留線維が完全に欠如した真皮−上皮基底膜ゾーン(BMZ)に検出不能なコラーゲンVIIを有し、それらの腹側表面上に広範な皮膚水疱、またそれらの足と首に出血性水疱を持って生まれ、典型的には誕生週目の間に死亡が認められる。

課題を解決するための手段

0007

本開示は、コラーゲン7を含む組成物及びかかる組成物を調製する方法に関する。特定の実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン7、リン酸ナトリウムクエン酸ナトリウム塩化ナトリウムアルギニン、糖、及び界面活性剤を含む。リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、アルギニン、糖、又は界面活性剤の1つ以上を組成物から除外することは可能である。

0008

特定の実施形態では、糖は、スクロースである。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート、例えばポリソルベート20又はポリソルベート80である。
特定の実施形態では、リン酸ナトリウムは、100mM〜1mM、50mM〜5mM、25mM〜5mM、10mM〜5mM、10mM〜1mMの範囲又は約10mMの量で存在する。

0009

特定の実施形態では、クエン酸ナトリウムは、100mM〜1mM、50mM〜1mM、25mM〜1mM、10mM〜1mM、5mM〜1mMの範囲又は約5mMの量で存在する。

0010

特定の実施形態では、塩化ナトリウムは、200mM〜10mM、100mM〜20mM、80mM〜50mMの範囲、又は約70mMの量で存在する。
特定の実施形態では、アルギニンは、200mM〜5mM、150mM〜50mM、100mM〜75mMの範囲、又は約100mMの量で存在する。

0011

特定の実施形態では、糖は、100mM〜10mM、100mM〜50mM、75mM〜35mM、60mM〜40mMの範囲、又は約50mMの量で存在する。特定の実施形態では、スクロースは、100mM〜1mM、100mM〜50mM、75mM〜35mM、60mM〜40mMの範囲、又は約50mMの量で存在する。

0012

特定の実施形態では、界面活性剤は、1%〜0.01%、0.5%〜0.05%、0.025%〜0.05%、0.1%〜0.05%、0.05%〜0.01%(w/v)の範囲又は約0.05%(w/v)の量で存在する。特定の実施形態では、ポリソルベート(例えばポリソルベート20)は、1%〜0.01%、0.5%〜0.05%、0.025%〜0.05%、0.1%〜0.05%、0.05%〜0.01%(w/v)の範囲又は約0.05%(w/v)の量で存在する。

0013

特定の実施形態では、組成物は、8.0〜6.0、7.5〜6.5、7.5〜7.0、7.4〜7.0、7.3〜7.0、7.2〜7.0、7.1〜7.0、7.2〜7.1の間、7.2±0.3、約7.1、又は約7.2のpHを有する。

0014

特定の実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン7、100mM〜10mMのリン酸ナトリウム、100mM〜1mMのクエン酸ナトリウム、200mM〜10mMの塩化ナトリウム、200mM〜10mMのアルギニン、100mM〜10mMのスクロース、及び1.0%〜0.01%(w/v)のポリソルベート20及び任意選択的には7.2〜7.1のpHを含む。

0015

特定の実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン7、25mM〜5mMのリン酸ナトリウム、25mM〜1mMのクエン酸ナトリウム、100mM〜20mMの塩化ナトリウム、150mM〜50mMのアルギニン、75mM〜35mMのスクロース、及び0.5%〜0.05%(w/v)のポリソルベート20及び任意選択的には7.2〜7.1のpHを含む。

0016

一実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン7、約10mMのリン酸ナトリウム、約5mMのクエン酸ナトリウム、約70mMの塩化ナトリウム、約100mMのアルギニン、約50mMのスクロース、及び約0.05%(w/v)のポリソルベート20を含み、かつ約7.1のpHを有する。

0017

別の実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン7、10mMのリン酸ナトリウム、5mMのクエン酸ナトリウム、70mMの塩化ナトリウム、100mMのアルギニン、50mMのスクロース、及び0.05%(w/v)のポリソルベート20を含み、かつ7.1のpHを有する。

0018

別の実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン7、10mMのリン酸ナトリウム、5mMのクエン酸ナトリウム、70mMの塩化ナトリウム、100mMのアルギニン、50mMのスクロース、及び0.05%(w/v)のポリソルベート20を含み、かつ7.2±0.3のpHを有する。

0019

特定の実施形態では、組換えコラーゲン7は、ヒトコラーゲン7である。
コラーゲン7組成物は、増加した安定性を有する。特定の実施形態では、組成物は、1リットルポリカーボネートボトル内(組成物500mL)、−65±5℃又は−20±5℃で貯蔵後、3か月間安定である。特定の実施形態では、組成物は、10cm3(10cc)のガラスバイアル内(組成物5.5mL)、−65±5℃又は−20±5℃で貯蔵後、6か月間安定である。特定の実施形態では、組成物は、25±3℃で2週間の貯蔵後、安定である。特定の実施形態では、組成物は、5±3℃で最大1か月間の貯蔵後、安定である。

0020

組成物は、例えばDEBを治療するために用いることができる1つ以上の追加的な医薬賦形剤を含む医薬組成物であってもよい。
別の態様は、DEBを治療する方法であって、本明細書に記載されるような組換えコラーゲン7組成物を有効量でそれを必要とする対象に投与するステップを含む、方法を対象とする。

図面の簡単な説明

0021

rC7組成物又は対照の投与後5〜7日間生存するCol7a1−/−マウスからの及び前足における代表的な免疫蛍光画像を示す。
rC7組成物又は対照の投与後のCol7a1−/−マウスからの舌における代表的なH&E染色を示す。
rC7組成物又は対照の投与後のCol7a1−/−マウスの生存確率を示すカプラン・マイヤー曲線である。
rC7製剤の凍結解凍ストレスへの曝露後のSEC−HPLC特性を示す。
37℃で1時間のインキュベーション後、D−PBS及び10%血清希釈された0.5mg/mLのrC7におけるSEC−HPLCを示す。
様々な温度で貯蔵後の様々な量のアルギニンを含有するrC7製剤の%HMW種を示す。
様々な温度で貯蔵後の様々な量のアルギニンを含有するrC7製剤のフィブロネクチン結合を示す。

0022

rC7組成物の前述及び他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明からより明白になるであろう。

0023

係留線維の主成分として、コラーゲン7は組織完全性を維持する機能がある。係留線維は、皮膚、口腔粘膜、及び頸部を含む、幾つかの組織の上皮層間葉層との間の界面で付着複合体として役立つ構造要素である(チャン(Chung)ら著、ダーマトロジック・クリニックス(Dermatol Clin)、2010年、第28巻、第1号、p.93〜105)。皮膚では、係留線維は、上皮基底膜の下位部から下層の真皮乳頭層にかけて広がり、上皮基底膜と真皮乳頭層との間の連結を確保する(ヴァルキ(Varki)ら著、ジャーナルオブメディカル・ジェネティクス(J Med Genet)、2007年、第44巻、p.181〜192)。この関連性は、表皮と真皮との間の接着を提供し、維持することを助け、皮膚の完全性(その適切な構造、機能、及び恒常性にとって重要である)に寄与する(ヴィローン(Villone)ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー(J Biol Chem)、2008年、第283巻、第36号、p.24506〜24513)。コラーゲン7をコードする核酸配列及びそれがコードするポリペプチドは、当該技術分野で公知である。一実施形態では、組換えコラーゲン7は、ヒトコラーゲン7である。

0024

本明細書に記載の組換え方法により生成されるコラーゲン7は、当該技術分野で公知の標準プロトコル(例えば、沈殿、遠心分離など)に従い、宿主細胞培養系から回収されてもよい。本明細書に記載の組換えコラーゲン7は、以下の参考文献に示される通り、宿主細胞培地分泌され、硫酸アンモニウム沈殿とそれに続く遠心分離により回収されてもよい(チェン(Chen)ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem)、2002年、第277巻、第18号、p.2118〜2124)。

0025

本明細書に記載の組換え及び分子生物学的方法により生成され、回収されたコラーゲン7は、当該技術分野で公知の標準的プロトコル(例えば、透析イオン交換クロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィー、SDSゲル電気泳動など)に従って精製されてもよい。本明細書に記載の組換えコラーゲン7は、以下の参考文献に示される通り、イオン交換クロマトグラフィーにより、均一になるまで精製されてもよい(チェン(Chen)ら著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J Biol Chem)、2002年、第277巻、第18号、p.2118〜2124)。

0026

本開示は、緩衝液非必須アミノ酸抗凍結剤、界面活性剤、及びキレート剤を含有する組換えC7(rC7)製剤を提供する。特定の実施形態では、非必須アミノ酸は、アルギニン、好適にはL−アルギニンである。特定の実施形態では、抗凍結剤は糖である。特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸塩緩衝液、例えばリン酸ナトリウムを含む。特定の実施形態では、キレート剤は、クエン酸塩である。好ましい実施形態では、rC7製剤は、10mMのリン酸ナトリウム、5mMのクエン酸ナトリウム、100mMのL−アルギニン、50mMのスクロース、70mMのNaCl、0.05%(w/v)のポリソルベート20、及び約7.2のpHを含む。

0027

これらの改善された製剤は、過去に用いられたPBS緩衝液と比べると、rC7の溶解度を高め、過去に用いられたPBS緩衝液と比べると、rC7タンパク質濃度を約8〜10倍増加させ、また凍結及び解凍、ならびに貯蔵及びハンドリングの間の熱応力に対する頑強性/安定性を増強する。特定の実施形態では、本明細書に記載のrC7組成物は、−65±5℃及び−20±5℃の双方で3か月間安定である。特定の実施形態では、本明細書に記載のrC7組成物は、−65±5℃及び−20±5℃の双方で6か月間安定である。特定の実施形態では、rC7組成物は、25±3℃で2週間及び5±3℃で最大1か月間、安定である。送達装置互換性の観点から、特定の実施形態では、本明細書に記載のrC7組成物は、ディスポーザブルシリンジ内での貯蔵時に25±3℃で最大8時間、又は生理食塩水での0.1mg/mLへの希釈時に25±3℃で最大6時間、安定である。本明細書で用いられるとき、「安定な」は、指示される貯蔵条件後、280nmの吸光度による測定として、タンパク質の量における有意差がなく、SEC−HPLCによる測定として、高分子量種、二量体、ホモ三量体、及び低分子量種の量における有意差がなく、またフィブロネクチン結合アッセイにおける測定として、効力の有意な低下がないことを意味する。

0028

組成物中で用いられてもよい糖は、限定はされないが、非還元二糖(例えば、スクロース、トレハロース)又は糖アルコール、例えばソルビトールを含む。特定の実施形態では、組成物中の糖は、スクロースである。

0029

組成物はまた、1つ以上の緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液(例えば、リン酸ナトリウム)、ヒスチジン緩衝液トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液を含んでもよい。

0030

組成物はまた、1つ以上の界面活性剤及び/又は増量剤を含んでもよい。界面活性剤は、限定はされないが、ポロクサマー(例えば、プルロニック(Pluronic)(登録商標))、ポリソルベート(例えば、ポリソルベート80、ポリソルベート20)、CTABヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド)、又はSDS(ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム)を含む。特定の実施形態では、組成物中の界面活性剤は、ポリソルベート(例えばポリソルベート20)である。増量剤は、限定はされないが、PVP、PEG、デキストランマンニトール及びグリシンを含む。

0031

組成物はまた、1つ以上の追加的な薬学的に許容できる賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容できる賦形剤の例として、限定はされないが、塩、タンパク質(例えばアルブミン)、キレート剤(例えば、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸)、ゲル化ポリマー尿素(又はその誘導体)、及びそれらの組み合わせを含む。

0032

一態様は、DEBを治療するための本明細書に記載の組成物の使用を対象とする。さらに提供されるのは、DEBを治療する方法であって、組換えコラーゲン7、緩衝液、非必須アミノ酸、抗凍結剤、界面活性剤、及びキレート剤を含む組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法である。特定の実施形態では、緩衝液は、リン酸塩緩衝液(例えばリン酸ナトリウム)である。特定の実施形態では、非必須アミノ酸は、アルギニンである。特定の実施形態では、抗凍結剤は、糖、例えばスクロースである。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート、例えばポリソルベート20又はポリソルベート80である。特定の実施形態では、キレート剤は、クエン酸塩である。各成分の量は、本願全体を通じて記載に従って変動し得る。一実施形態では、組成物は、組換えコラーゲン7、10mMのリン酸ナトリウム、5mMのクエン酸ナトリウム、70mMの塩化ナトリウム、100mMのアルギニン、50mMのスクロース、及び0.05%(w/v)のポリソルベート20を含み、かつ7.1又は7.2のpHを有する。

0033

実施例1
凍結/解凍特性及び熱安定性を比較するため、以前に用いたPBS製剤を含む5つの製剤を選択した。これらの製剤を表1に列挙する。

0034

0035

これらの製剤を試験することにより、L−アルギニン及びスクロース、好適には75〜100mMのL−アルギニン及び1.7%(w/v)のスクロースが溶解度を改善することが発見された。界面活性剤(例えば0.05%ポリソルベート20)の封入により濾過性が改善されたことから、潜在的な非特異的吸着が低下することが予想される。NaCl、好適には約70mMのNaClの製剤への封入により、外観が改善された。

0036

以前に用いたrC7製剤(PBS)は、0.4mg/mLのみの溶解度の上昇を、この濃度を超える著しい粘性負荷とともに達成した。場合によっては、PBS製剤は0.8mg/mL押し上げることができたが、従来のタンパク質精製プロセス、例えばUF/DFスケーラブル又は互換可能でない非常に特異的な実験室条件下に限られた。約7.2のpHで1mg/mLのrC7、10mMのリン酸塩、5mMのクエン酸塩、100mMのL−アルギニン、1.7%(w/v)のスクロース、70mMのNaCl、0.05%(v/v)のポリソルベート20を含む製剤(「第I相製剤」)は、100kDaのPES分子量カットオフを有する通常のスピンカラムを用いて、約10倍高いタンパク質濃度(約4mg/mLの上昇)を達成することができた。

0037

PBS製剤との比較時と同様、粘性における改善が見られた。PBS製剤は、0.8mg/mLを超えるタンパク質濃度を支持することができなかった。したがって、より高濃度タンパク質製剤との直接的比較はできなかった。しかし、3mg/mLのrC7タンパク質製剤における粘性読み取り値はすべて、高粘性とみなされない約4センチポイズ(cp)であった。これらのデータは、一般に粘性の増加がrC7タンパク質濃度の増加と相関することを示す。粘性をタンパク質濃度と比較する場合(cP/タンパク質濃度)、アルギニン含有製剤がPBS製剤の場合よりも低い値を有することが明らかになる。したがって、アルギニン製剤は、粘性の増加をより良好に制御する一方でより高いタンパク質含量を支持する。

0038

チンダル光の強度下で、タンパク質の屈折及びタンパク質沈殿物は、より高いタンパク質濃度(3〜4mg/mLの上昇)での第I相製剤において有意により少なかった。これにより、より清澄でかつ混濁度が低下した外観の第I相製剤が得られた。

0039

第I相製剤をさらに、強固な小規模凍結/解凍モデルを用いて、凍結及び解凍ストレス条件に晒した。製造規模スケーラビリティ)にて遭遇され得る凍結/解凍ストレスを反映するため、第I相製剤を3つの凍結/解凍サイクル(表2を参照)に曝露した。

0040

0041

3サイクルの完了後、タンパク質含量(A280nmでの吸光度による測定として;表3を参照)又は会合状態(SEC−HPLCによる測定として;図4を参照)のいずれにおいても全く変化がなかった。

0042

0043

アルギニン含有製剤に、−65℃、−20℃、5±3℃、及び25℃の温度で2か月間の貯蔵を施した。任意の貯蔵条件で2か月後、外観上全く変化がなかった。同じ材料によると、5±3℃(最小)又は25℃のいずれかで貯蔵した製剤を除いて、タンパク質濃度(A280nm)又はSEC−HPLC特性(表4を参照)において有意な変化が示されなかった。25℃で2か月貯蔵後、高分子量(HMW)種の増加(約2%)が見られた。

0044

0045

1mg/mL用量での第I相製剤は、動物送達装置及び投与シリンジとの互換性についても評価した。1mg/mL製剤を適切なシリンジで注入セットに注射し、薬剤を各々の装置内で最大60分間保持した。装置内で60分後、可視粒子又はpH変化は認められなかった。SEC−HPLC特性もまた有意な変化を示さなかった
rC7を血流中に静脈内注射するときに何が生じるかを知ることは困難である。しかし、10%ウシ血清を含有し、37℃で保持される緩衝液などのより生理学関連条件にタンパク質が曝露するときの任意の変化について監視することにより、生成物品質変化についての可能性を評価することは可能である。rC7タンパク質は、可溶性凝集及び沈殿の傾向がある。これらの事象は、一般的な分析技術を通じて監視することができる。タンパク質含量における変化について監視するため、A280の吸光度を用いる。不可溶性微粒子の形成に起因する混濁度における変化について監視するため、A320の吸光度を用いる。HMW及び/又はLMW種が形成する場合の可溶性タンパク質における変化について監視するため、SEC−HPLCを用いる。血清効果の影響を最大化するため、緩衝液を等量の血清で希釈し、0.5mg/mLの最終タンパク質濃度、(第I相製剤中)rC7の存在下でインキュベートした。体温シミュレートするため、全試料を37℃で1時間保持した。これらの結果のまとめを表5に列挙する。その結果によると、生理学的培地への37℃で1時間の曝露後、タンパク質含量(A280)、又は混濁度(A320)に変化がないことが示された。したがって、データは、血清へのrC7送達の希釈時に即時性の溶解度制限が明白でないことを示唆している。

0046

0047

カルシウム及びマグネシウム生成物品質における変化に対する効果を有したか否かを確認するため、最初のダルベッコリン酸緩衝食塩水(D−PBS)を緩衝液中にCa2+及びMg2+カチオンを封入せずに入手した。この溶液を試験し、Ca2+及びMg2+を生理学的レベルで添加する場合のD−PBSと比較した。これらは、結果に対する効果を有しないことが判明した(表5).
SEC−HPLC特性によると、様々な試験緩衝液マトリックスに37℃で1時間曝露後、不可溶性凝集体の増加が認められないことが確認された。図5。様々な緩衝液への曝露により、おそらくαヘリックス可動性の増加に起因して、ピークの低分子量側領域における初期変化が惹起される。

0048

様々な量のL−アルギニン(25mM〜100mM)を含有するrC7製剤に対して、熱安定性試験を実施した。結果によると、L−アルギニンレベルの低下により、5±3℃及び25±3℃の双方で最大1か月間の貯蔵後、(フィブロネクチン結合アッセイによる測定として)高分子量種におけるわずかな増加及び効力低下がもたらされることが示される。図6及び7。加えて、25mM及び50mMのアルギニンでの試料中で、さらなる乳白光が見られた。これらの試験では、他の賦形剤レベルは同じく保持した。
実施例2
初期開発研究に基づき、10mMのリン酸ナトリウム、5mMのクエン酸ナトリウム、70mMの塩化ナトリウム、100mMのアルギニン、50mMのスクロース、0.05%のポリソルベート20、及び約7.1のpHを含む製剤を、DEBのマウスモデルにおけるCol7a1−/−マウスへの投与に用いた。

0049

組換えヒトコラーゲン7(rC7)をCHO細胞内で生成した。2つの異なる作製プロセスを用いて、rC7をCHO細胞から精製した。各作製プロセスから生成されたrC7ロットは、10mMのリン酸ナトリウム、5mMのクエン酸ナトリウム、70mMの塩化ナトリウム、100mMのアルギニン、50mMのスクロース、0.05%のポリソルベート20、及び約7.1のpHを含む組成物中で製剤化した。

0050

出生後2〜3日目、rC7の単回静脈内投与後の分布及び組織学的改善を評価するため、3つの治療群を通じて全部で59の新生児Col7a1−/−マウスにて試験を実施した。この試験では、さらに全生存を試験した。各組成物被験物質1及び被験物質2)は、0.4mg/mL(40μL中16μg)の用量で26の新生児Col7a1−/−マウスに静脈内投与した。組成物は、出生後2〜3日目、浅側頭静脈を介して単回静脈内ボーラスとして投与した。10mMのリン酸ナトリウム、5mMのクエン酸ナトリウム、70mMの塩化ナトリウム、100mMのアルギニン、50mMのスクロース、0.05%のポリソルベート20、及び約7.1のpHを含むが、rC7を有しない対照組成物もまた、新生児Col7a1−/−マウスに静脈内投与した。

0051

被験物質1及び被験物質2の投与の結果、新生児Col7a1−/−マウスにおける舌及び前足皮膚での真皮−上皮BMZに対してrC7の分布が得られた。図1。それに対し、溶媒対照を注射したすべてのマウスにおいて、C7は検出されなかった。図1

0052

組織切片の代表的なヘマトキシリン及びエオシン(H&E)画像によって示される通り、試験組成物の静脈内投与の結果、溶媒対照と比べて、Col7a1−/−マウスにおける真皮−上皮分離の修正が生じた。図2。舌は、毛がないことから真皮−上皮分離を試験するのに最適な組織であり、表皮を真皮に係留し、新しく誘導される水疱の形成を阻止するのに役立ち得る
舌における表皮と真皮との間の完全な閉鎖(すなわち分離なし)を伴うマウスの割合は、被験物質1、被験物質2、及び溶媒対照を投与したCol7a1−/−マウスにおいて各々、50%(26中12)、63%(26中15)、及び10%(10中1)であった。真皮−上皮分離の完全な閉鎖を伴うCol7a1−/−マウスの割合は、rC7治療マウスにおいて、溶媒対照よりも高かった(被験物質1対溶媒フィッシャーp=0.06、被験物質2対溶媒、フィッシャーp=0.02)。真皮−上皮分離の閉鎖を伴うCol7a1−/−マウスの割合は、rC7治療マウス間で異ならなかった(フィッシャーp=0.58)。

0053

被験物質1又は2の新生児Col7a1−/−マウスへの単回静脈内投与の結果、下の表7及び図3に示すように、生存において、溶媒対照と比べて統計学的に有意な改善が得られた。中央値(四分位範囲)生存時間は、溶媒対照、被験物質1、及び被験物質2を投与したCol7a1−/−マウスにおいて各々、2.5、9、及び14日であった。

0054

0055

表6では、ハザード比をCox比例ハザードモデルにて評価した。比例ハザード仮説は、シェーンフィールド残差による評価として、満足された(p>0.37)。
この試験では、DEBの新生児マウスモデルでの試験対象のrC7組成物における有効性が実証された。詳細には、舌及び皮膚における真皮−上皮BMZに対して分布した両被験物質が、真皮−上皮分離を修正し、その結果、Col7a1−/−マウスにおける単回静脈内注射後、生存において、溶媒対照と比べて統計学的に有意な改善をもたらした。

0056

栄養障害型表皮水疱症(DEB)プログラムの第I/II相臨床試験を支持するため、以下の原体/製剤:原体(DS)-1Lのポリカーボネート(PC)ボトル内に1.0mg/mLのrC7で500mL満たした凍結液体;製剤(DP)−10cm3(10cc)のガラスバイアル内に1.0mg/mLのrC7で5.5mL満たした凍結液体を用いることになる。製剤は、10mMのリン酸ナトリウム、5mMのクエン酸ナトリウム、100mMのL−アルギニン、50mMのスクロース、70mMのNaCl、0.05%(w/v)のポリソルベート20、約7.2のpHを含む。

0057

DSにおける今日までの長期貯蔵安定性の観点では、GMP材料は、−65±5℃及び−20±5℃の双方で3か月間安定であり、280nmでの吸光度による測定として、タンパク質濃度における有意な変化はなく、SEC−HPLCによる測定として、高分子量種、二量体、ホモ三量体、及び低分子量種の量における有意な変化はなく、かつフィブロネクチン結合アッセイにおける測定として、効力における有意な変化はない。DPにおいては、今日まで、開発ロットは、−65±5℃及び−20±5℃の双方で6か月間安定である。ハンドリングにおいては、製剤は、25±3℃で2週間、また5±3℃で最大1か月間安定である。光からの曝露を最小限にし、生成物のハンドリング中での過剰な振盪を阻止することに注意払う必要がある。送達装置の互換性の観点では、製剤は、ディスポーザブルシリンジ内での貯蔵時、25±3℃で最大8時間、又はrC7を生理食塩水で0.1mg/mLまで希釈する時、25±3℃で最大6時間安定である。さらに、タンパク質含量における変化は、37℃で1時間の貯蔵後、10%ウシ血清を含有するPBSの存在下で認められなかった。これは、製剤投与時の生理学的互換性を示す。

0058

1つ以上の例示的実施形態が本明細書中で記載されているが、形態及び詳細における様々な変化が、以下の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の概念の精神及び範囲から逸脱しない限り、本明細書中に設けられてもよいことは当業者によって理解されるであろう。

実施例

0059

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