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技術 細胞から指標シグナルを得る方法

出願人 テクノロジアンテュトキムスケスクスヴェーテーテーオサケユキチュア
発明者 プンカ、エーロヴァイニオ、セッポ
出願日 2016年12月22日 (3年3ヶ月経過) 出願番号 2018-533177
公開日 2019年1月31日 (1年1ヶ月経過) 公開番号 2019-502381
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード レベル指標 ハイパースペクトルカメラ 据付台 取得カード 物理的負荷 機械構成要素 小ポケット 表面導電率
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (14)

課題・解決手段

本発明は、遺伝子編集された細胞の分野、さらに遺伝子編集された細胞の指標シグナルを決定することに関する。本発明は、細胞から指標シグナルを得る方法、より具体的には、細胞の生物学的状態を決定する方法に関する。さらに、本発明は、再生細胞及び監視目的での再生細胞又は特異的指標ポリヌクレオチドの使用に関する。また、本発明の方法を実施するためのシステムも含まれる。

概要

背景

標的遺伝子編集工学は、遺伝子の欠失もしくは付加、エクソンの除去もしくは挿入、又は点突然変異の導入もしくは修正のための非常に重要なツールである。当技術分野にはいくつかの種類の遺伝子編集技術が存在する。一例として、Urnovらは、ZFNを用いてIL2Rγ遺伝子の突然変異を修正した(Urnovら 2005、Nature 435:646〜651)。TALLEN又はCrisp/cas技術が、例えばHockemeyerらならびにSander及びJoungによって利用されている(Hockemeyerら2012、Nat Biotechnol 29(8):731〜734;Hockemeyerら2009、Nat Biotechnol 27(9)851〜857、Sander及びJoung、2014、Nature Biotechnology 32、347〜355)。さらに、近年、特定の標的遺伝子改変を有する様々な細胞型に関する研究が公開されている。例えば、Hockemeyerらは、ヒト胚性幹細胞(hESC)及び誘導多能性幹細胞(iPSC)のゲノムインビトロ改変のための遺伝子ターゲティングを記載している(Hockemeyerら2012、Nat Biotechnol 29(8):731〜734;Hockemeyerら2009、Nat Biotechnol 27(9):851〜857)。

細胞の遺伝子編集は、前記編集によって引き起こされる分子変化を検出する必要性をもたらす。慣用的なDNA/RNA/タンパク質配列決定法及びブロッティング法が特定のタンパク質、RNA又はDNA含量の変化を決定するために利用されており、種々のPCR技術及び免疫組織化学も分子変化の観察に非常に有用である。遺伝子編集を介して内因性分子バイオセンサーとして変換することは、細胞の生化学過程監視する可能性を広げ、刺激に対する生物系の応答を測定する新たな時代切り開いた。

それでもまだ、内部及び外部刺激に対する細胞及び組織単位生物学的応答の重要な尺度文脈において、細胞の分子変化を決定するための、より単純で、低コストで、高感度で、最適な方法の必要性が大いに存在する。

概要

本発明は、遺伝子編集された細胞の分野、さらに遺伝子編集された細胞の指標シグナルを決定することに関する。本発明は、細胞から指標シグナルを得る方法、より具体的には、細胞の生物学的状態を決定する方法に関する。さらに、本発明は、再生細胞及び監視目的での再生細胞又は特異的指標ポリヌクレオチドの使用に関する。また、本発明の方法を実施するためのシステムも含まれる。

目的

本発明の目的は、遺伝子編集された細胞の説明のための単純で、非常に感度がよく、特異的な方法を提供し、その後、例えば対象の皮膚上の前記細胞の外側の特異的指標シグナル及び/又はその変化を監視することである

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

細胞から指標シグナルを得る方法であって、対象から得られる再生細胞を用意するステップと、指標をコードするポリヌクレオチド配列を前記再生細胞のDNAに挿入することによって前記再生細胞を改変するステップであって、前記指標をコードする前記ポリヌクレオチド配列を前記再生細胞中の標的ポリヌクレオチドと共に発現させる、改変するステップと、前記改変された再生細胞を対象に投与するステップと、前記対象の皮膚上の前記指標のシグナル又はその非存在監視するステップであって、それによって前記標的ポリヌクレオチドの発現に関連する指標シグナルを得る、監視するステップとを含む上記方法。

請求項2

細胞の生物学的状態を決定する方法であって、対象から得られる再生細胞を用意するステップと、指標をコードするポリヌクレオチド配列を再生細胞のDNAに挿入することによって前記再生細胞を改変するステップであって、前記指標をコードする前記ポリヌクレオチド配列を前記再生細胞中の標的ポリヌクレオチドと共に発現させる、改変するステップと、前記改変された再生細胞を対象に投与するステップと、前記対象の皮膚上の前記標的ポリヌクレオチドの発現に関連する前記指標のシグナル又は前記指標シグナルの非存在を監視するステップと、前記標的ポリヌクレオチドの発現によって定義される前記細胞の生物学的状態を決定するステップとを含む上記方法。

請求項3

前記対象が浸透性皮膚領域を有し、前記改変された再生細胞が、前記浸透性皮膚領域上への局所施用によって非侵襲的に投与される、請求項1又は2に記載の方法。

請求項4

前記改変された再生細胞が、刺青様の方法、穿孔光線照射、皮膚の微小擦過傷又は対象の皮膚上への細胞の施用からなる群から選択される方法によって対象に投与される、請求項1又は2に記載の方法。

請求項5

前記指標シグナルが電気信号に変換される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

前記監視が連続的に行われる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

前記監視が、光学導電率、磁場、放射線インピーダンス電気化学、音響又は生物学的測定値からなる群から選択される測定値を利用することによって行われる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

前記指標シグナルを値、定量的又は定性的値、数値、傾向を明らかにする結果又はオンオフ結果に変換するステップをさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

前記再生細胞を培養するステップをさらに含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

前記指標が蛍光タンパク質緑色蛍光タンパク質(GFP)、GFP誘導体発光タンパク質(例えば、ホタルルシフェリンタンパク質)、mCherry、黄色蛍光タンパク質、トマト赤色タンパク質、ルシフェラーゼレポーター、FRETドナー及び/又はアクセプタータンパク質、アプタマーポリヌクレオチド及び/又はアプタマーポリペプチド、mycタグ、flagタグ、haloタグ、ビオチンアビジンタグ及びそれらの変異型非天然塩基及びトランスファーRNA及びアミノ酸ベースのタグ、電気指標として機能するポリペプチドならびにメラニン及び眼色の色素などの身体の色素をコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

前記指標をコードするポリヌクレオチド配列の挿入が、部位特異的ヌクレアーゼを用いて行われる、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。

請求項12

前記指標をコードするポリヌクレオチド配列の挿入が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)介在ゲノム編集又はCRISPR/Casシステムによって行われる、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

前記標的ポリヌクレオチドの発現が分析物によって影響される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。

請求項14

前記標的ポリヌクレオチドがグルコース応答性ポリペプチド、増殖因子ミトコンドリア酵素ホルモン応答性ポリペプチド、ストレス応答性ポリペプチド中枢又は末梢神経系機能のポリペプチド、アルコール又は薬物応答性ポリペプチド、疾患発症免疫学的監視に使用されるポリペプチド、圧力又は伸張などの物理的力の変化を明らかにするポリペプチド、運動又は病原体感染における物理的負荷によって発現するポリペプチド、表1、表2、表3、図9又は図10のリスト提示される任意のポリペプチド、及びこれらの任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。

請求項15

対象から得られ、標的ポリヌクレオチドの発現に関連する指標シグナルを監視するために前記標的ポリヌクレオチドと共に発現する指標の挿入ポリヌクレオチド配列を含むよう改変された再生細胞の使用であって、監視が前記対象の皮膚に対して行われる、上記使用。

請求項16

対象から得られ、標的ポリヌクレオチドと共に発現する指標をコードする挿入ポリヌクレオチドを含む再生細胞。

請求項17

指標シグナルをさらに含む、請求項16に記載の細胞。

請求項18

前記指標ポリヌクレオチドがGFPであり、前記標的遺伝子が、表1、表2、表3、図9又は図10に列挙される遺伝子から選択される、請求項16又は17に記載の細胞。

請求項19

対象の皮膚上の前記標的ポリヌクレオチドの発現に関連する前記指標シグナルを測定するためのものである、請求項16から18のいずれか一項に記載の細胞。

請求項20

再生細胞中の標的ポリヌクレオチドに挿入され、前記細胞の分析物を決定するために、前記標的ポリヌクレオチドと共に発現する、指標をコードするポリヌクレオチドの使用であって、前記分析物が前記標的ポリヌクレオチドの発現を制御することができる、上記使用。

請求項21

前記再生細胞が、皮膚由来再生細胞、血液由来再生細胞及びiPS細胞からなる群から選択される、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法、使用又は再生細胞。

請求項22

指標をコードするポリヌクレオチド配列を再生細胞のDNAに挿入することによって前記再生細胞を改変する手段であって、前記指標をコードする前記ポリヌクレオチド配列を前記再生細胞中の標的ポリヌクレオチドと共に発現させる、改変する手段、前記改変された細胞を対象の皮膚上又は対象に施用する手段、及び前記対象の皮膚上の前記指標のシグナル又はその非存在を監視する手段を含むシステム。

請求項23

請求項1から14又は21のいずれか一項に記載の方法を実施するための、請求項22に記載のシステム。

技術分野

0001

本発明は、遺伝子編集された細胞の分野、さらに遺伝子編集された細胞の指標シグナルを決定することに関する。本発明は、細胞から指標シグナルを得る方法、より具体的には、細胞の生物学的状態を決定する方法に関する。さらに、本発明は、再生細胞及び監視目的での再生細胞又は特異的指標ポリヌクレオチドの使用に関する。また、本発明の方法を実施するためのシステムも含まれる。

背景技術

0002

標的遺伝子編集/工学は、遺伝子の欠失もしくは付加、エクソンの除去もしくは挿入、又は点突然変異の導入もしくは修正のための非常に重要なツールである。当技術分野にはいくつかの種類の遺伝子編集技術が存在する。一例として、Urnovらは、ZFNを用いてIL2Rγ遺伝子の突然変異を修正した(Urnovら 2005、Nature 435:646〜651)。TALLEN又はCrisp/cas技術が、例えばHockemeyerらならびにSander及びJoungによって利用されている(Hockemeyerら2012、Nat Biotechnol 29(8):731〜734;Hockemeyerら2009、Nat Biotechnol 27(9)851〜857、Sander及びJoung、2014、Nature Biotechnology 32、347〜355)。さらに、近年、特定の標的遺伝子改変を有する様々な細胞型に関する研究が公開されている。例えば、Hockemeyerらは、ヒト胚性幹細胞(hESC)及び誘導多能性幹細胞(iPSC)のゲノムインビトロ改変のための遺伝子ターゲティングを記載している(Hockemeyerら2012、Nat Biotechnol 29(8):731〜734;Hockemeyerら2009、Nat Biotechnol 27(9):851〜857)。

0003

細胞の遺伝子編集は、前記編集によって引き起こされる分子変化を検出する必要性をもたらす。慣用的なDNA/RNA/タンパク質配列決定法及びブロッティング法が特定のタンパク質、RNA又はDNA含量の変化を決定するために利用されており、種々のPCR技術及び免疫組織化学も分子変化の観察に非常に有用である。遺伝子編集を介して内因性分子バイオセンサーとして変換することは、細胞の生化学過程監視する可能性を広げ、刺激に対する生物系の応答を測定する新たな時代切り開いた。

0004

それでもまだ、内部及び外部刺激に対する細胞及び組織単位生物学的応答の重要な尺度文脈において、細胞の分子変化を決定するための、より単純で、低コストで、高感度で、最適な方法の必要性が大いに存在する。

先行技術

0005

Urnovら 2005、Nature 435:646〜651
Hockemeyerら2012、Nat Biotechnol 29(8):731〜734
Hockemeyerら2009、Nat Biotechnol 27(9)851〜857
Sander及びJoung、2014、Nature Biotechnology 32、347〜355

0006

本発明の目的は、遺伝子編集された細胞の説明のための単純で、非常に感度がよく、特異的な方法を提供し、その後、例えば対象の皮膚上の前記細胞の外側の特異的指標シグナル及び/又はその変化を監視することである。言い換えれば、本発明の方法により、改変された再生多能性細胞(例えば、皮膚由来再生細胞)によって生成された指標シグナルを、対象の皮膚上で監視することができる。本発明の目的は、独立請求項に明言されていることを特徴とする方法及び配置によって達成される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項に開示されている。

0007

本発明は、本発明の方法を用いると、細胞過程及びその変化を体外で監視することができるという認識に基づいている。本発明は、所与生物学的過程リアルタイム監視を可能にする様式で、細胞の生物編集(bioedited)遺伝子、タンパク質又は代謝産物によって産生される指標シグナルの非侵襲的監視を利用する。本発明は、身体機能の主要な測定基準として主に物理的な人工技術機械を使用する代わりに、所与の生物学的に関連する過程(グルコース代謝など)についての細胞測定能力を使用するものである。本発明は、細胞を体外又はインビトロで遺伝子編集する方法ステップの組み合わせを利用して、定義された生物学的過程及びその変化を示す分子によって強調される特定の生物学的変化を示す。生物学的指標が示す過程の監視も、提示される発明によって細胞外で行われる。

0008

本発明は、指標をコードするポリヌクレオチド配列を細胞のDNAに挿入し、指標のポリヌクレオチドを特定の標的ポリヌクレオチドと共に発現させる試験に基づく。指標ポリヌクレオチドと共に挿入される標的ポリヌクレオチドは、対象となる分析物の存在又は非存在に応答して発現するその能力に基づいて選択されている。言い換えれば、本発明は、特定の遺伝子の発現が特定の分析物又は物理的もしくはエネルギー的刺激に応答する状況を利用する。したがって、恒常性に影響を及ぼす因子に対する細胞内の定義された応答の変化を、指標によって生成される編集シグナルを監視することによって研究することができる。さらに、いくつかの異なる指標ポリヌクレオチドを細胞のDNAに挿入する場合、2つ以上の分析物又は刺激を同時に監視することができる。

0009

本発明は、特定のタイプの細胞(例えば、皮膚由来再生細胞)を監視するためのツールを提供する。

0010

本発明は、細胞の外部からのリアルタイム監視によって細胞の分子変化を研究する具体的な方法の欠如に関連する課題を解決する。さらに、本発明は、細胞の分子変化又は状態を研究するためのツール及び条件を提供する。

0011

本発明は、細胞状態を決定するための、柔軟で、単純で、低コストで、簡便で、効率的で、特異的で、感度がよく、信頼できる方法を提供する。

0012

本発明の方法は、分子生物学におけるさらなる改善を可能にし、生体系がどのように環境に応答するかを決定することを可能にする。さらに、本発明は、特定の細胞の変化を理解し、細胞及び細胞間の非常に特異的な変化を決定するのに役立つ。

0013

本発明はまた、対象の細胞生物学的事象を決定するためのより個別化された方法を提供し、それは、各個体がその遺伝子構成において唯一であるという事実に基づいている。したがって、技術革新は、個別化されたレベルでのバイオモニタリング技術も提供する。監視は非外科的に行われ、例えば患者の皮膚の縁部で行うことができるので、リアルタイム監視をいつでもどこでも継続することができる。実際、訓練された専門家が生物学的指標結果の蓄積を獲得し追跡することなく、健康である又は病気の患者が容易に監視を処理することができる。

0014

人々が特定の生理的状態を継続的に監視することができれば、より重度障害発症が減少し、病院又は診療所訪問する必要性が回避され得る。最も最適な場合には、本発明により提供されるバイオフィードバックによって疾患が完全に予防され得る。実際、本発明は、従来の診断に使用される方法と比較して、予見可能性及び早期介入も可能にする。

0015

本発明は、例えば、治療医学的処置食事生活様式、気分又は日常生活様式を計画するために使用することができる、結果を得るための面倒で、遅く、高コストの方法の限界を克服する方法を提供する。

0016

一態様では、本発明は、細胞から指標シグナルを得る方法であって、
対象から得られる再生細胞を用意するステップと、
指標をコードするポリヌクレオチド配列を再生細胞のDNAに挿入することによって再生細胞を改変するステップであって、指標をコードするポリヌクレオチド配列を再生細胞中の標的ポリヌクレオチドと共に発現させる、改変するステップと、
改変された再生細胞を対象に投与するステップと、
対象の皮膚上の指標のシグナル又はその非存在を監視するステップであって、それによって標的ポリヌクレオチドの発現に関連する指標シグナルを得る、監視するステップと
を含む方法に関する。

0017

一態様では、本発明は、細胞の生物学的状態を決定する方法であって、
対象から得られる再生細胞を用意するステップと、
指標をコードするポリヌクレオチド配列を再生細胞のDNAに挿入することによって再生細胞を改変するステップであって、指標をコードするポリヌクレオチド配列を前記再生細胞中の標的ポリヌクレオチドと共に発現させる、改変するステップと、
改変された再生細胞を対象に投与するステップと、
対象の皮膚上の標的ポリヌクレオチドの発現に関連する指標のシグナル又は前記指標シグナルの非存在を監視するステップと、
標的ポリヌクレオチドの発現によって定義される細胞の生物学的状態を決定するステップと
を含む方法に関する。

0018

さらに、一態様では、本発明は、対象から得られ、標的ポリヌクレオチドの発現に関連する指標シグナルを監視するために標的ポリヌクレオチドと共に発現する指標の挿入ポリヌクレオチド配列を含むよう改変された再生細胞の使用であって、監視が対象の皮膚に対して行われる使用に関する。

0019

さらに、一態様では、本発明は、対象から得られ、細胞の外側から標的ポリヌクレオチドの発現に関連する指標シグナルを監視するために標的ポリヌクレオチドと共に発現する指標の挿入ポリヌクレオチド配列を含むよう改変された皮膚由来再生細胞の使用に関する。

0020

さらに、一態様では、本発明は、対象から得られ、場合により対象の皮膚上の標的ポリヌクレオチドの発現に関連する指標シグナルを測定するために、標的ポリヌクレオチドと共に発現する指標をコードする挿入ポリヌクレオチド配列を含む再生細胞に関する。

0021

なおさらなる態様では、本発明は、対象の皮膚上で監視される指標シグナルを得るのに使用するための標的ポリヌクレオチドと共に発現する指標をコードする挿入ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子改変された再生細胞に関する。

0022

さらに、一態様では、本発明は、再生細胞中の標的ポリヌクレオチドに挿入され、細胞の分析物を決定するために、標的ポリヌクレオチドと共に発現する、指標をコードするポリヌクレオチドの使用であって、分析物が標的ポリヌクレオチドの発現を制御することができる、使用に関する。

0023

なお、さらなる態様では、本発明は、それを必要とする対象の生物学的状態を決定する方法であって、
対象から再生細胞を得るステップと、
指標をコードするポリヌクレオチド配列を再生細胞のDNAに挿入することによって再生細胞を改変するステップであって、指標をコードするポリヌクレオチド配列を前記再生細胞中の標的ポリヌクレオチドと共に発現させる、改変するステップと、
改変された再生細胞を対象に投与するステップと、
対象の皮膚上の標的ポリヌクレオチドの発現に関連する指標のシグナル又は前記指標シグナルの非存在を監視するステップと、
標的ポリヌクレオチドの発現によって定義される対象の生物学的状態を決定するステップと
を含む方法に関する。

0024

なおさらに、一態様では、本発明は、細胞から指標シグナルを得る方法であって、
対象から再生細胞を得るステップと、
指標をコードするポリヌクレオチド配列を再生細胞のDNAに挿入することによって再生細胞を改変するステップであって、指標をコードするポリヌクレオチド配列を前記再生細胞中の標的ポリヌクレオチドと共に発現させる、改変するステップと、
改変された再生細胞を対象に投与するステップと、
対象の皮膚上の指標のシグナル又はその非存在を監視するステップであって、それによって標的ポリヌクレオチドの発現に関連する指標シグナルを得る、監視するステップと
を含む方法に関する。

0025

なお、さらなる態様では、本発明は、
指標をコードするポリヌクレオチド配列を再生細胞のDNAに挿入することによって再生細胞を改変する手段であって、指標をコードするポリヌクレオチド配列を前記再生細胞中の標的ポリヌクレオチドと共に発現させる、改変する手段と、
改変された細胞を対象の皮膚上又は対象に施用する手段と、
対象の皮膚上の指標のシグナル又はその非存在を監視する手段と
を含むシステムに関する。

0026

以下で、本発明を、添付の[付属の]図面を参照して好ましい実施形態によって詳細に説明する。

図面の簡単な説明

0027

シリコンチャンバーを用いた皮膚幹細胞異種移植を示す図である。
WTレシピエントマウスの背中のGFP皮膚移植片(皮膚全体)を示す図である。
マウスのGFPと野生型(WT)の両方の皮膚の蛍光スペクトルを示す図である。
ハイパースペクトルカメラ光源フィルタ及び多色画像センサー)及びOU Olympus顕微鏡撮影した緑色蛍光タンパク質(GFP)マウス皮膚の画像及びスペクトルを示す図である。図4は、本発明の方法が皮膚上の指標シグナルを得るのに適していることを明らかにしている。
本発明の方法によって皮膚から得られた指標シグナルの画像及びスペクトルを示している。色素を含む領域からの明確な蛍光シグナルを、蛍光色素を含まない領域と比較したことを示す図である。図5は、本発明の方法が対象の皮膚上の指標シグナルを得るのに適していることを明らかにしている。
本発明の方法によって皮膚から得られた指標シグナルの画像及びスペクトルを示している。図5は、本発明の方法が対象の皮膚上の指標シグナルを得るのに適していることを明らかにしている。GFP由来蛍光を監視するためにOU Olympus顕微鏡及びカメラを用いて画像を撮影したことを示す図である。
本発明のための可能な測定設定の一例を示す図である。
手首機器に組み込まれた測定の一例を示す図である。
本発明に適した構成の概略図である。監視のための手段は、光機械構成要素レンズフィルタ及び他の部品を含んでいた。LED又は白色光源を適切なフィルタと共に使用して蛍光標的を照らした。カメラを検出に使用した。この設定で蛍光(例えば、グルコース誘発)を測定し、必要な検出限界及び強度変動スケールを試験した。
本発明に適した構成の概略図である。LEDを適当な波長に選択し、照明領域を定義した。小型センサー、CCDカメラ列検出器又は単一検出器を選択し、必要な電子回路及び読取り装置の機械的据付台を得た。シグナル取得はPCデータ取得カードに基づき、シグナル処理は任意の適切なプログラミング言語(例えば、Labview)で行った。
kalkrein6をコードする異なるポリペプチドに関する定量的PCR(QPCR)及びRNA配列決定の結果を示す図である。
Sprr1bをコードする異なるポリペプチドに関する定量的PCR(QPCR)及びRNA配列決定の結果を示す図である。
Pyhin1をコードする異なるポリペプチドに関する定量的PCR(QPCR)及びRNA配列決定の結果を示す図である。
グルコース注射によって有意に変化した(最小1.5倍)皮膚組織タンパク質を示す図である。

0028

本発明では、細胞過程に関連する特異的指標を、再生細胞からリアルタイムで監視することができる。この考えは、標的細胞中の指標を使用し、指標に、監視及び制御目的のためにシグナルを例えば数値に変換する皮膚付着装置に所与の生物学的応答を伝達させるものである。細胞レベル指標は、所与の生物学的又は環境的刺激の応答として活性化され(すなわち、特定の分析物又はエネルギーが標的ポリヌクレオチドの発現を引き起こし、同時に指標ポリヌクレオチドの発現も引き起こす)、刺激が終了すると下方制御又は完全に不活性化される。指標は、再生細胞に標的化され、感度のよい、重要なバイオセンサーとしての細胞を生成する。再生細胞は、ドナー又は他の対象の細胞の一部として生じる。特定の実施形態では、改変された再生細胞が、皮膚を再生する基底細胞層の一部として生じ、したがって対象又は患者の生涯を通じて指標及びセンサーとして作用する。細胞は、小分子誘導機構を介して根絶することもできる。遺伝子編集された再生細胞内の生物学的指標シグナルは、バイオモニタリングにおいて実数型及び生体バイオセンサーとして機能する測定可能なシグナルに変換される。

0029

本発明によって、感覚機構が1個又は複数の生細胞に埋め込まれ、動的な様式で1個又は複数の細胞の生物学的状態を決定することが可能となる。本明細書で使用される場合、「生物学的状態」とは、恒常性の維持又は喪失に関連する特定の分析物又は過程の量、存在、非存在又は活性によって定義される細胞の任意の状態を指す。

0030

本明細書で使用される場合、「又は」という用語は、「及び」と「又は」の両方の意味(すなわち「及び/又は」)を有する。さらに、単数名詞の意味は、複数の名詞の意味を含み、したがって、特に指定しない限り、単数の用語は、その複数形の意味も有し得る。言い換えれば、「a」又は「an」という用語は、1つ又は複数を意味し得る。
細胞

0031

本発明により遺伝子編集される細胞は、体細胞性再生細胞などの再生細胞である。本明細書で使用される場合、「再生細胞」とは、自己再生及び分化することができる細胞を指す。本発明の一実施形態では、再生細胞は、体性幹細胞(すなわち、それらが見出される組織を維持及び修復することができる細胞)、例えば、骨髄脂肪組織、血液、上皮内皮及び/又は間充織の細胞からなる群から選択される。本発明の再生細胞には、それだけに限らないが、多能性幹細胞(いくつかの細胞型、ただし密接に関連する細胞ファミリーのものにのみ分化することができる)、寡能性(oligopotent)幹細胞少数の細胞型にのみ分化することができる、例えばリンパ球系又は骨髄系幹細胞)及び/又は単能性細胞(それ自体はただ1つの細胞型のみを産生することができるが、それらを非幹細胞と区別する自己再生の性質を有する)が含まれる。本発明の再生細胞にはまた、稀で一般的に数が少なく、例えば骨髄に存在する多能性成体幹細胞も含まれ得る。

0032

本明細書で使用される場合、「遺伝子編集された細胞」及び「遺伝子改変された細胞」という用語は互換的である。

0033

本発明の一実施形態では、再生細胞が、皮膚由来再生細胞、血液由来再生細胞及びiPS細胞からなる群から選択される。

0034

本発明の一実施形態では、再生細胞が、例えばそれらの分化した前駆細胞における誘導多能性幹細胞(iPSC)である。本明細書で使用される場合、「誘導多能性幹細胞」(iPSC)という用語は、分化した細胞から、典型的には成人体細胞、例えば発育初期化によって線維芽細胞から生成された多能性幹細胞を指す。このような細胞は、例えば国際公開第2008/151058号パンフレット及び米国特許出願公開第2008/076176号明細書に記載されている。

0035

本発明の一実施形態では、再生細胞が、胚性幹細胞又は胚性幹細胞由来細胞である。胚性幹細胞(ESC)は、内皮細胞などの多種多様な異なる細胞型に分化する能力を有する多能性細胞である。胚性幹細胞を得る方法は、当技術分野において容易に利用可能である。さらに、国際公開第2007/130664号パンフレットは、ドナーを損傷することなくヒト胚性幹細胞を得るための、割球生検と呼ばれる有望な新しい手法を開示している。

0036

本発明の別の実施形態では、再生細胞が、皮膚由来再生細胞、すなわち皮膚から得られる再生細胞である。本明細書で使用される場合、「皮膚由来再生細胞」は、皮膚から得られ、自己再生し、複数の系統に分化することができる細胞を指す。さらに特定の実施形態では、皮膚由来再生細胞が、皮膚の基底層由来である、又は汗腺もしくは毛包由来である。皮膚は成人期を通して絶えず自己再生し、濾胞成長変性永続的なサイクルを経験する。表皮及び毛包に存在する幹細胞は、成人皮膚恒常性及び毛再生の維持を確実にするが、損傷後の表皮修復にも関与する。

0037

成人においては、異なるタイプの幹細胞が、正常な恒常性又は創傷修復を受ける際に、皮膚の種々の細胞型を補充するよう機能する。いくつかの幹細胞(例えば、メラニン芽細胞及び表皮幹細胞)は、皮膚自体の中に存在する。成熟した表皮は、その最外層が皮膚表面である重層扁平上皮である。最内(基底)層のみが有糸分裂的に活性である。基底層は、真皮から表皮を分離する基礎をなす基底膜の大部分を構成する細胞外マトリックスを産生、分泌及び構築する。細胞が基底層を離れ、皮膚表面に向かって外方に移動するにつれて、細胞は細胞周期から抜けて、最終分化プログラムを実行する。表皮有棘層及び顆粒層を生成する初期の段階では、プログラムは転写的に活性なままである。しかしながら、これは、ついに絶えず外側に移動する内側の細胞によって置き換えられる、皮膚表面から脱落する角化層鱗片)の死んだ平坦化細胞の産生となる。(Blanpain C及びFuchs E、2006、Annu Rev Cell Dev Biol 22:339〜373)。

0038

本発明の特定の実施形態では、皮膚由来再生細胞が、表皮幹細胞又は毛包の幹細胞である。これらの幹細胞は、全ての幹細胞に共通の2つの本質的な特徴を有する。これらは長期間自己再生することができ、組織起源に由来する複数の系統に分化する(WeissmanILら2001、Annu Rev Cell Dev Biol.17:387〜403、Blanpain C及びFuchs E、2006、Annu Rev Cell Dev Biol 22:339〜373)。本発明の別の特定の実施形態では、皮膚由来再生細胞がケラチノサイトである。ケラチノサイトは、皮膚の最外層である表皮の主要な細胞型であり、そこで見られる細胞の90%を構成する。皮膚の基底層に見られるケラチノサイトは、「基底細胞」又は「基底ケラチノサイト」と呼ばれることがある。

0039

本発明の一実施形態では、再生細胞が血液由来再生細胞、すなわち血液から得られる再生細胞である。

0040

特定の実施形態では、改変及び監視される細胞が初代再生細胞(例えば、初代表皮幹細胞)である。本明細書で使用される場合、「初代細胞」とは、多くの集団倍加を受けず、したがって、インビボの細胞の生理学的状態を密接に表し、生体系を表す関連データを生成する細胞を指す。初代細胞は、生体組織から直接採取され、インビトロで培養のために確立された細胞である。初代細胞は、例えば、腫瘍細胞株でも不死化細胞株でもない。

0041

本発明の別の実施形態では、改変及び監視される細胞が初代再生細胞でない。

0042

特定の実施形態では、本発明の方法が、再生細胞を培養するステップをさらに含む。細胞は、体外又はインビトロ培養条件下で培養することができる。

0043

本発明の方法において使用される細胞は、対象から得られる。対象は、ヒト又は動物対象から選択され得る。特定の実施形態では、遺伝子改変のための細胞が、ヒト細胞又は動物細胞のいずれかである。好ましい動物細胞には、それだけに限らないが、ヒト以外の霊長類チンパンジー及び他の類人猿ならびにサル種など);家畜家禽ウシヒツジブタヤギ及びウマなど);飼育哺乳動物(飼鳥、イヌ及びネコなど);実験室動物(マウス、ラットウサギモルモットなどのげっ歯類を含む)の細胞が含まれる。極めて特定の実施形態では、対象がヒト(例えば、小児(0から18歳までの年齢)又は成人(18歳から開始する年齢))である。ヒト胚性(hES)細胞を使用する場合、方法がヒト胚の破壊を含まないことを条件として、対象をヒト又は動物対象から選択することができる。

0044

本発明の一実施形態では、対象から得られた再生細胞が、標的ポリヌクレオチドと共に発現する指標をコードする挿入ポリヌクレオチド、及びさらに指標シグナルを含む。特定の実施形態では、細胞が、標的ポリヌクレオチドの発現に関連するシグナルを、対象の細胞の外側から又は皮膚上で測定することによって指標シグナルを監視するためのものである。

0045

いくつかの実施形態では、改変及び監視される再生細胞が、細胞を投与されるレシピエント対象に対して異種である対象から得られ得る。しかしながら、好ましい実施形態では、改変及び監視される再生細胞が、細胞を投与されるレシピエント対象に対して同種(すなわち、同種異系)、より好ましくは自原性である対象から得られ得る。したがって、改変された再生細胞を投与される適切な対象には、改変及び監視される適切な動物細胞に関連して上で開示されたものが含まれる。
ポリヌクレオチドターゲティング

0046

ポリヌクレオチドターゲティング(すなわち、遺伝子ターゲティング)は、相同組換えを使用して、特定の内因性ポリペプチドに対する所望の変化を標的とする。ポリヌクレオチドターゲティングの成功は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、設計されたホーミングエンドヌクレアーゼ転写アクチベーターエフェクターヌクレアーゼ又はCRISPRなどの設計されたヌクレアーゼの使用により増強することができる。設計されたヌクレアーゼはまた、遺伝子ノックアウトを生成する内因性遺伝子において突然変異を導入することもできる。

0047

本発明において、ポリヌクレオチドターゲティングは、指標ポリヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドに挿入するために使用される。ポリヌクレオチドターゲティングは、永続的又は条件付であり得る。本発明の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドターゲティングが永続的である。ポリヌクレオチドターゲティングは、対象となる各標的ポリヌクレオチドに特異的なベクターの作製を必要とする。しかしながら、ベクターは、転写活性又はサイズにかかわらず、任意の指標ポリヌクレオチドに使用することができる。「ベクター」という用語は、細胞に形質導入し、それによって細胞に、細胞にとって天然でないポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドをあるいは細胞にとって天然でない様式で発現させる核酸化合物及び/又は組成物を指す。一般に、DNAから作製されたターゲティング構築物は、細菌において生成される。構築物は、典型的には、標的化されるポリヌクレオチドの一部及び指標ポリヌクレオチド、場合によって選択マーカーも含む。体外又はインビトロ細胞のDNAに特異的なポリヌクレオチドを標的化するために、ポリヌクレオチドターゲティング構築物を培養中の細胞に挿入する。正しい挿入を有する細胞を、マーカーに基づいて選択することができる。

0048

ポリヌクレオチドターゲティングは、当技術分野で周知の任意の方法又は技術によって行うことができる。遺伝子ターゲティングのための方法は、実験室分子技術を説明する種々の実用マニュアルに記載されている。当業者は、これらの方法をいつどのように使用するかを知っている。

0049

本発明のポリヌクレオチドターゲティングは、人工的に設計されたヌクレアーゼを用いて行うことができる。ヌクレアーゼは、ゲノムの所望の位置で特異的な二本鎖切断を生じさせ、細胞の内因性機構を利用して、相同組換え及び非相同末端結合の自然過程によって誘導された切断を修復する。本発明に適したヌクレアーゼには、それだけに限らないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Casシステム及び設計メガヌクレアーゼ再設計ホーミングエンドヌクレアーゼが含まれる。本発明の特定の実施形態では、指標をコードするポリヌクレオチド配列の挿入が、部位特異的ヌクレアーゼを用いて行われる。本明細書で使用される場合、「部位特異的ヌクレアーゼ」とは、所望の位置に二本鎖切断を生じるヌクレアーゼを指す。本発明の別の特定の実施形態では、指標をコードするポリヌクレオチド配列の挿入が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)介在ゲノム編集又はCRISPR/Casシステムによって行われる。ZFNは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインをDNA切断ドメインと融合させることによって生成される人工制限酵素である。TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインと融合させることによって生成される人工制限酵素である。ZFN及びTALENは、それらのDNA結合ドメインを所望のDNA配列を標的とするように設計することができ、これによりヌクレアーゼが複雑なゲノム内でさえも特有の配列を標的とすることができるので、実際にいかなる所望のDNA配列にも結合するよう迅速に設計することができる。ZFN及びTALENを用いる方法の特異性は、DNA切断を隣接配列に向けるDNA結合ドメインに起因する。ZFN及びTALEN技術は、実験室の分子技術を説明する種々の実用的マニュアル、及び例えばHockemeyerらの論文(Hockemeyerら2012、Nat Biotechnol 29(8):731〜734;Hockemeyerら2009、Nat Biotechnol 27(9):851〜857)に記載されている。CRISPR/Casシステムは、例えばSander及びJoungの論文(2014、Nature Biotechnology 32、347〜355)に記載されている。当業者は、これらの方法をいつどのように使用するかを知っている。

0050

場合により、ポリヌクレオチドターゲティングのスクリーニングを、配列決定、PCR又はサザン解析によって行って、所望の遺伝子挿入が行われたことを確認する、又は指標ポリヌクレオチドの組込み点を同定することができる。
標的ポリヌクレオチド

0051

本発明では、指標をコードするポリヌクレオチド配列を細胞のDNAの特定の場所に挿入し、指標のポリヌクレオチドを対象となる標的指標遺伝子と共に発現させる。実際、指標ポリヌクレオチドは、DNA中の1つ又は複数の定義及び設計された領域に挿入される。ポリヌクレオチドが挿入されるDNAの部位は、発現する標的ポリヌクレオチド配列内に、又は標的ポリヌクレオチド配列の外側、例えば標的ポリヌクレオチドと同じクラスター遺伝子クラスター)内にあってもよい。遺伝子クラスターは、ポリペプチドをコードする少なくとも2つのポリヌクレオチド配列を含み、これらのポリヌクレオチド配列は、通常共にグループ化され、共に発現する。そのため、当業者であれば、本発明により、指標ポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドと共に、又は同時に発現することを理解する。これにより、標的ポリヌクレオチドの発現の追跡が可能になる。

0052

指標ポリヌクレオチドのDNAへの挿入は、細胞の機能に負の効果を及ぼさない。例えば、指標ポリヌクレオチドが発現する標的ポリヌクレオチドに挿入され、融合ポリペプチドが形成される場合、融合ポリペプチドの機能は、非改変ポリペプチドの機能に匹敵する。したがって、宿主DNA配列を除去する必要はなく、編集はゲノムに対して極めて最小となり、確認される。

0053

本発明の特定の実施形態では、指標をコードするポリヌクレオチド配列が標的ポリヌクレオチドに挿入される。本発明の極めて特定の実施形態では、指標をコードするポリヌクレオチド配列が標的ポリヌクレオチドの3’末端に挿入される。標的化のための標的ポリヌクレオチドの部位は、コードポリヌクレオチド配列又は任意の非コードもしくは調節配列内の任意の部位から選択され得る。挿入に適した部位が当の特定の標的ポリヌクレオチドに依存することは、当業者に周知である。

0054

生物学的指標/レポーターとして編集される標的ポリヌクレオチドは、その発現が分析物によって影響され得る任意のポリヌクレオチドであり得る。本発明の特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドが、グルコース応答性ポリペプチド、増殖因子ミトコンドリア酵素ホルモン応答性ポリペプチド、ストレス応答性ポリペプチド中枢又は末梢神経系機能のポリペプチド、アルコール又は薬物応答性ポリペプチド、疾患発症の免疫学的監視に使用されるポリペプチド、圧力又は伸張などの物理的力の変化を明らかにするポリペプチド、及び運動又は病原体感染における物理的負荷によって発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される。上記の標的ポリヌクレオチドの発現に関連する過程のいずれも、恒常性及び正常な生理学的状態からの逸脱又は疾患におけるこれらの特定の生物学的過程を示す同定されたバイオマーカーに基づいて、本発明によって監視され得る。同定された分子回路に適した標的ポリヌクレオチドの例としては、それだけに限らないが、分析物によって調節される特定の酵素をコードする遺伝子、エタノールなどの毒物によって標的化される遺伝子、細胞外マトリックス及び酵素及び運動負荷からの筋肉回復に関与する修復因子をコードする遺伝子、ならびに細胞の体液性応答先天性免疫誘因する免疫学的因子をコードする遺伝子が挙げられる。本発明に適したグルコース応答性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それだけに限らないが、実施例1の表1、表2又は表3、図9又は図10、あるいはこれらの任意の組み合わせに提示されるリストから選択され得る。一例として、標的ポリヌクレオチドがグルコース応答性ポリペプチドである場合、本発明は、細胞がどのようにグルコースに応答するかを分析するための正確で信頼できる安全な方法のための特定の方法及びツールを可能にする。一例として、例えば実施例1の表1、2又は3、図9又は図10で言及される遺伝子は、グルコースによってモデル生物でインビボで誘導され、グルコースの非存在下で発現が低下する。本発明は、生理学的機能を監視及び測定するための新しい方法を提供するので、細胞及び再生細胞によって作製された組織における新規な分析物及び応答機構を同定するためのプラットフォームにもなる。

0055

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、当のポリペプチドをコードする核酸配列又はその保存的配列変異体を含む、任意のポリヌクレオチド、例えば一本鎖又は二本鎖DNA(ゲノムDNA又はcDNA)を指す。ポリヌクレオチドに関連して、「保存的配列変異体」という用語は、コードされたポリペプチドの生物学的特性を有意には変化させないヌクレオチド配列改変を指す。保存的ヌクレオチド配列変異体には、遺伝暗号の変性及びサイレント突然変異から生じる変異体が含まれる。ヌクレオチド置換、欠失及び付加も熟慮される。本明細書で使用される「変異体」という用語は、所与の配列と比較して、アミノ酸又は核酸配列に小さな変化を有する配列を指す。このような変異体は、例えば対立遺伝子変異体のように天然に存在してもよく、又は突然変異誘発もしくは他の遺伝子改変によって生成されてもよい。

0056

指標をコードするポリヌクレオチド配列を細胞のDNAに挿入することによる遺伝子改変に加えて、本発明の細胞は、他の遺伝子改変も含み得る。これらの遺伝子改変には、任意の遺伝子改変、例えば1つもしくは複数の遺伝子又はその断片の挿入、欠失又は破壊、あるいは1つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、欠失又は破壊、あるいはプラスミドの付加が含まれる。本明細書で使用される場合、「破壊」とは、対応するタンパク質の欠如又は活性が低下した1つもしくは複数の非機能的タンパク質の存在をもたらす、1個又は数個のヌクレオチドの遺伝子への挿入を指す。他の遺伝子改変は、ポリヌクレオチドの下方制御及び/又は過剰発現を引き起こす、あるいはポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼさない、1個又は数個の改変から選択され得る。本明細書で使用される場合、「過剰発現」は、未改変細胞よりも多くの産物(例えば、ポリペプチド)を産生することによるポリヌクレオチドの過剰発現を指す。例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの1つ又は複数のコピーを過剰発現のために細胞に形質転換することができる。この用語はまた、ポリペプチドの過剰発現を可能にするためにプロモーターもしくはプロモーター領域が改変されている又は細胞中に天然には存在しないプロモーターが挿入されている実施形態も包含する。また、DNAメチル化及びヒストン修飾などのエピジェネティックな改変も「遺伝子改変」に含まれる。

0057

本発明の特定の実施形態では、指標をコードするポリヌクレオチド配列の挿入以外の他の遺伝子改変を監視する細胞で行わない。

0058

いくつかの実施形態では、例えば実施例1の表1、2もしくは3又は図9もしくは10に提示されるポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列が、公開ヌクレオチド配列データベースから導出可能なポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%拡散配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

0059

本開示の配列と比較した任意の配列又はその断片の同一性とは、本発明の配列全体と比較した任意の配列の同一性を指す。本明細書で使用される場合、2つの配列間の同一性%は、2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数である(すなわち、同一性%=同一位置の数/位置の総数×100)。配列の比較及び2つの配列間の同一性%の決定は、当技術分野で利用可能な数学アルゴリズムを使用して達成することができる。これは、アミノ酸配列と核酸配列の両方に当てはまる

0060

配列同一性は、例えばBLAST(Basic Local Alignment Search Tools)又はFASTA(FAST−All)を用いて決定することができる。検索では、典型的に、デフォルトとして「ギャップペナルティ」及び「マトリックス」の設定パラメータが選択される。

0061

本発明の1つの特定の実施形態では、指標ポリヌクレオチドがGFPであり、標的ポリヌクレオチドがグルコース応答性ポリペプチド、増殖因子、ミトコンドリア酵素、ホルモン応答性ポリペプチド、ストレス応答性ポリペプチド、中枢もしくは末梢神経系機能のポリペプチド、アルコールもしくは薬物応答性ポリペプチド、疾患発症の免疫学的監視に使用されるポリペプチド、圧力もしくは伸張などの物理的力の変化を明らかにするポリペプチド、及び運動もしくは病原体感染における物理的負荷によって発現するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は表1、表2、表3、図9もしくは図10のリストに提示される任意のポリヌクレオチド、あるいはこれらの任意の組み合わせである。

0062

本発明の特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの発現が分析物によって影響される。本明細書で使用される場合、「発現が分析物によって影響される」とは、分析物が例えばポリヌクレオチドの発現を開始、増加、減少又は停止させることによって制御することができる、すなわち標的ポリヌクレオチドの発現が分析物に応答する任意の状況を指す。

0063

本明細書で使用される場合、「分析物」は、分析手順において対象となり、標的ポリヌクレオチドの発現に影響(直接的又は間接的)を及ぼす分子、物質又は化学成分を指す。「直接的影響」は、分析物自体が、例えば発現を制御するポリヌクレオチドの位置に結合することによって発現に影響を及ぼす状況を指し、「間接的影響」は、分析物が、例えば任意の他のポリペプチドの発現の別の分析物に影響を及ぼすが、当の標的ポリペプチドに影響を及ぼさず、前記別の分析物又は発現によって、標的ポリペプチドの発現に影響を及ぼす状況を指す。具体的な実施形態では、分析物が、分泌ナノ及び微小胞(まとめてエキソソーム、脂質カプセルナノ及びマイクロスケール細胞分泌小胞とも呼ばれる)、細菌及びウイルス誘発性毒素コレステロール由来親油性及び非親油性ホルモンとその誘導体、ポリヌクレオチド(例えば、DNA、cDNA、mRNA、siRNA、非コードRNA、エンハンサーRNA、遊離RNA)、ポリペプチド(例えば増殖因子結合ポリヌクレオチド)、糖(例えば、グルコース、ガラクトースラクトース)、脂肪酸、脂質、糖タンパク質、代謝産物生成物電解質(例えば、Cl、K、Na、CO2)ならびに物理的刺激スペクトル周波数からなる群から選択され得る。本発明の方法によって検出され得る分析物のいくつかの例としては、それだけに限らないが、グルコース、インスリン内分泌物パラクリンもしくは自己分泌ホルモン、バイオマーカー及び/又は医薬品が挙げられる。特定の実施形態では、分析物が疾患関連バイオマーカーである。したがって、本発明は、疾患(例えば、糖尿病心臓病がんアルツハイマー病、薬物/アルコール/中毒病原体感染症、回復の免疫学的監視及び宿主移植適合性監視等)に関連するバイオマーカーを監視することを含み得る。

0064

特定の実施形態では、分析物がグルコースであり、標的ポリヌクレオチドがグルコース応答エレメントを含むポリヌクレオチド(例えば、インスリンもしくはグルカゴン受容体をコードするポリヌクレオチド又は実施例1の表1、2もしくは3、図9もしくは図10に列挙されるポリペプチドのいずれか)である。グルコース検出は、現在、血液試料から行われている。しかしながら、本発明の特定の実施形態は、対象の皮膚からグルコースレベル又は任意の他の分析物を間接的に、しかし同時に効率的かつ特異的に追跡する方法を提供する。
指標

0065

指標をコードするポリヌクレオチド配列がDNAに挿入された後、これは標的ポリヌクレオチドと共に細胞中で発現する。指標ポリヌクレオチド配列は、ポリペプチド又はその任意の断片をコードする。指標ポリヌクレオチドは、天然(例えば、単離されている)であっても、人工的、ヒト合成もしくは化学的に修飾された非天然ヌクレオチド、又は設計されたトランスファーRNAを利用することによって生成されてもよい。指標ポリペプチドはUV曝露に対する応答として発光し得る、例えば緑色蛍光タンパク質及びGFP変異体可視領域で自然に光子を生成するルシフェラーゼレポーター、FRET化合物アプタマー相互作用することができるタンパク質のドメイン可視光周波数に反応する光遺伝学的に活性なポリペプチド、高周波などの電磁スペクトル周波数に反応するポリペプチド、例えばmyc、flag又はhaloタグ付きペプチド、可視領域の周波数で皮膚表面に位置するリーダーによって診断することができるポリペプチド(例えば、メラニン産生酵素によって生成される色、青色、赤色、緑色)、宿主の眼の生物学的色素又は副腎発色団をコードする遺伝子などの生物に由来する遺伝子であり得る。本発明の一実施形態では、指標が蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質(GFP)、GFP誘導体、発光タンパク質(例えば、ホタルルシフェリンタンパク質)、mCherry、黄色蛍光タンパク質、トマト赤色タンパク質、ルシフェラーゼレポーター、FRETドナー及び/又はアクセプタータンパク質、アプタマーポリヌクレオチド及び/又はアプタマーポリペプチド、mycタグ、flagタグ、haloタグ、ビオチンアビジンタグ及びそれらの変異型非天然塩基及びトランスファーRNA及びアミノ酸ベースのタグ、電気指標として機能するポリペプチドならびにメラニン及び眼色の色素などの身体の色素をコードする遺伝子からなる群から選択される。

0066

GFPは、238個のアミノ酸残基で構成され、青色〜紫外領域の光に曝露すると明るい緑色の蛍光を示すポリペプチドである。GFPはまた、任意のGFPホモログを指す。本明細書で使用される場合、「GFP誘導体」は、GFPと比較してアミノ酸置換、欠失又は挿入を含むが、なおGFPと実質的に同じ様式で機能を含むポリペプチドを指し、特に青色〜紫外領域の光に曝露すると明るい緑色の蛍光を示す能力を保持している。例えば、融合タンパク質は、「GFP誘導体」の範囲内にある。細胞及び分子生物学では、GFP遺伝子が頻繁に発現のレポーターとして使用される。GFPをコードするポリヌクレオチド配列は、細胞に導入され、ゲノム中で維持され得る。一例として、GFPは、Hockemeyerらの論文(Hockemeyerら2009、Nat Biotechnol 27(9):851〜857)の方法に利用されている。野生型GFPポリヌクレオチド及びアミノ酸配列は公的配列データベースからアクセス可能であり、GFPは商業的に入手可能でもある。

0067

任意の発光ポリペプチドを本発明に利用することができる。発光タンパク質は、酸化されると光を発生し、一般に生物発光に使用される。

0068

蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、励起された発蛍光団(ドナー)から別の発蛍光団(アクセプター)へのエネルギーの非放射性伝達である。ドナーを刺激し、次いで、相対的なドナー及びアクセプターの発光を連続的に又は同時に監視することにより、いつFRETが起こったかを判定することが可能になる。FRETの検出を使用して、2個以上の生体分子がいつどこで相互作用するかを定量することができる。FRET法は当技術分野において十分に記載されている。

0069

アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチド又はペプチド分子である。アプタマーは、通常、大きなランダムな配列プールからそれらを選択することによって作成されます作製される。アプタマーを、標的分子の存在下で自己開裂するためにリボザイムと組み合わせることができる。DNA、RNA又は核酸アナログアプタマーは、ポリヌクレオチドの短鎖からなる。ペプチドアプタマーは、両端でタンパク質足場に結合した短い可変ポリペプチドドメインからなる。本明細書で使用される場合、「タンパク質足場」は、シグナル伝達経路の複数の他のポリペプチドと相互作用及び/又は結合し、それらを複合体につなぎ止めるポリペプチドを指す。アプタマー法は、当技術分野において十分に記載されており、当業者に周知である。

0070

GFP、発光タンパク質、FRET及びアプタマー技術はまた、実験室分子技術を説明する種々の実用マニュアルに記載されている。当業者は、これらの方法をいつどのように使用するかを知っている。

0071

場合により、使用される指標ポリヌクレオチドに応じて、指標ポリヌクレオチドを、当業者に周知の任意の標識又は標識技術で(さらに)印を付ける又は標識してもよい。これらの標識は、指標のシグナルを与えることができる。標識法は、実験室分子技術を説明する種々の実用マニュアルに記載されている。当業者は、これらの方法をいつどのように使用するかを知っている。指標の適切な標識には、それだけに限らないが、アビジン及びビオチン系又はクリック化学に基づくタグの結合が含まれる。本発明の特定の実施形態では、指標が測定可能なシグナルを有し、さらなる標識は必要とされない。別の特定の実施形態では、指標ポリヌクレオチドが、コードされたポリペプチドが任意の適切な手段によって検出することができる任意の薬剤又は分子に結合することができるように編集され得る。

0072

指標又はそのシグナルを監視することにより、標的ポリヌクレオチドの発現の変化を追跡することが可能になる。発現された指標ポリヌクレオチドの指標シグナルは、標的ポリヌクレオチドの発現と関連する。本明細書で使用される場合、「標的ポリヌクレオチドの発現と関連する」とは、指標シグナルの存在、非存在、相対存在量又は強度と標的ポリヌクレオチドの発現との間の任意の相関を指す。さらに、1個又は複数の細胞内の特定の分析物の存在、非存在又は相対存在量は、標的ポリヌクレオチドの発現、及び指標をコードするポリヌクレオチド配列の発現とも関連する。そのため、例えば、分析物の濃度は、指標シグナルの監視によって1個又は複数の細胞の外側から決定され得る。

0073

本発明の特定の実施形態では、指標が、標的ポリペプチドと共に融合ポリペプチドを形成する。この場合、指標ポリペプチドは、同じタンパク質分解サイクルにおいて融合ポリペプチドの標的ポリペプチドと共に分解される。

0074

いくつかの実施形態では、指標ポリヌクレオチド配列が、公開ヌクレオチド配列データベース(NIH、EMBLなど)から得られ得るポリヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは100%拡散配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み得る。

0075

本発明の特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドが、実施例1の表1、2又は4、図9又は図10に列挙されるもののいずれか1つであり、指標ポリヌクレオチドがGFPであり、分析物がグルコースである。

0076

本発明の一実施形態では、本発明で使用される細胞の遺伝子改変が、指標ポリヌクレオチドの転写ならびに指標シグナルの産生を除いて、非改変細胞と比較した場合に細胞の機能に他の効果を及ぼさない。指標は、生理学的に機能しない成分であり、恒常性制御において不活性である。これに基づいて、いくつかの生物学的指標を、バイオモニタリングに使用される細胞に、編集によって同時に挿入することができる。別の実施形態では、さらなる遺伝子改変を、本発明の方法又は前記方法を利用して得られる生成物に含めることができる。
指標シグナルの監視

0077

本発明によって遺伝子改変された細胞は、遺伝子改変された細胞と非改変細胞の両方を含む細胞の群から選択され得る。本発明によると、遺伝子改変された細胞を対象に投与する。任意の投与方法を本発明で利用することができ、一実施形態では、適切な投与経路には、それだけに限らないが、当業者に公知である、非経口送達(例えば、静脈内注射)、経腸送達(例えば、経口)、局部投与、局所投与(例えば、真皮的もしくは経皮的)が含まれる。極めて特定の実施形態では、遺伝子改変された細胞が、皮膚を再生することができる皮膚の基底細胞層又は表皮に投与される。

0078

本発明の一実施形態では、遺伝子改変された再生細胞又は前記改変細胞を含む任意の組成物が、対象の皮膚に施用される。この特定の実施形態では、改変された細胞が皮膚の再生部分入り、したがって皮膚の再生細胞の一部、それゆえ皮膚の恒常性にもなる。具体的には、分子生物学的技術によって確認された遺伝子編集された指標細胞を含む細胞が、皮膚の再生を担当する特定の細胞層に導入される。これの代替は、指標細胞がエピソームのままであることである。これは、細胞が人に組み込まれておらず、細胞が、例えば、ナノ針を用いて汗腺腔に挿入されることを意味する。したがって、このようにして、細胞が、血液由来構成成分及びその中の分析物を含む体液に曝露される。さらに、宿主由来の生物/遺伝子編集指標細胞を皮膚に導入する第3の方法は、この細胞を使用して、この細胞を宿主の皮膚の一部として導入することによって皮膚再構成物を生成することである。生物学的指標はまた、このような細胞が、分析物が分析物透過性膜を介して指標細胞を露出するように携帯型装置内の微少流体チャンバーにセットされている状態でレポーターとして機能することもできる手段を提供している。ここでは、生体指標再生細胞が、現場日常的である器官培養及びオルガノイド培養技術によって皮膚構造を組み立てるための体外設定で使用される。第4に、小さい電流の使用を介して皮膚を開くことができる。このような手順は、皮膚の細孔を開き、したがって、指標細胞が汗腺腔に入るためのより良い通路を形成することがVTTによって近年示されている。さらに、電流が皮膚細胞を刺激して皮膚細胞をより受容性にすることが示されている。指標細胞は、例えば、一般的なスキンクリームと混合して、指標細胞を皮膚に挿入する実用的な方法を可能にすることができるだろう。第5に、指標細胞を刺青技術を用いて皮膚に挿入することができるだろう。第6に、およそ再生皮膚細胞層と皮膚の最外細胞層との間の距離の針高さを有する指標細胞を含浸させたマイクロニードル硬膏を使用することにより、指標細胞を皮膚に挿入することができるだろう。

0079

本発明の一実施形態では、改変細胞を投与するために使用される技術が、それだけに限らないが、刺青様の方法(すなわち、細胞を皮膚の真皮に投与する)、穿孔光線照射、皮膚の微小擦過傷、濾胞開口部又は毛包に対する効果を有する絆創膏、及び皮膚上への細胞の施用を含む。対象の皮膚上への遺伝子改変された細胞の施用により、前記細胞が身体と接触し、再生細胞として機能することが可能になる。対象から得られ、さらに遺伝子改変された細胞は、前記対象の皮膚又は別の対象の皮膚に施用され得る。1つの特定の実施形態では、遺伝子改変された細胞を皮膚上に施用する前に毛包から毛を除去する。

0080

本発明のいくつかの実施形態では、遺伝子改変された再生指標細胞が、細胞を透過性皮膚領域に施用することによって非侵襲的に対象に投与される。前記皮膚領域は、例えば、切断もしくは擦過を通して、又は穿孔によって、穿刺によって、スクラビングによって、剥離によって、毛包から1本又は複数本細毛を除去する(例えば、引き抜く)ことにより毛包を開くことによって、電流又は任意の他の適切な手段により濾胞開口部、毛包及び/又は汗腺腔を開くことによって、あるいは遺伝子改変された細胞を皮膚の再生細胞層に投与する及び組み込むための経路を開く任意の他の目的にかなって作られた小さな皮膚損傷などを通して、細胞に対して透過性にされたかもしれない。皮膚の透過性はまた、プラスチックフィルム又は任意の他の対応するシート状構造を皮膚上に置き、それによって皮膚細胞の細胞質液体内容物を増加させることによって増強され得る。また、皮膚領域を本細胞に対して透過性にするための化学的手段も想起される。したがって、遺伝子改変された再生指標細胞は、前記皮膚領域を通して透過性皮膚領域を有する対象に投与され得る。重要なことに、これらの実施形態では、所与の皮膚領域を本細胞に対して透過性にする処理が本方法の一部ではない。代わりに、細胞から指標シグナルを得る方法又は細胞の生物学的状態を決定する方法が、既に透過性皮膚領域を有する対象に実施される。

0081

いくつかの他の実施形態では、遺伝子改変された再生指標細胞が、無傷の皮膚領域を通して対象に投与され得る。これは、遺伝子改変された細胞を無傷の皮膚上に局所的に施用することによって実行され得る。好ましくは、細胞が、再生皮膚層への細胞の取り込みを増強するために、例えば、皮膚によって容易に吸収されるクリーム又は他の担体物質の形態で適切な化学組成物に含まれる。換言すれば、細胞が施用される皮膚領域が、任意の前処理によって透過性にされる必要はなく、細胞に対する透過性が細胞を投与するために使用される組成物又は担体を通して達成される。したがって、「透過性皮膚領域」という用語は無傷の皮膚も包含する。

0082

本発明による遺伝子改変された細胞の施用のための量及びレジメンは、遺伝子改変された再生細胞の分野の当業者によって容易に決定され得る。一般的に、遺伝子改変された細胞の投与量は、投与頻度(数回の投与が利用される場合)、投与のための再生細胞及び標的組織の種類;ならびに個々の医師によって調整される他の変数などの考察に応じて変化する。例えば、再生細胞は、典型的には約1000個の細胞で構成される細胞クラスターの量で、具体的には再生及び自己再生の能力があれば少なくとも1個の細胞の量で投与される。標的組織中の所望量の再生細胞を得るために、適切な間隔で1回又は複数回用量で所望の投与量を投与することができる。

0083

遺伝子改変された細胞は、対象に1回だけ、又は代わりに数回投与され得る。例えば、使用される特定の実施形態に応じて、改変細胞を毎週、毎月、6ヶ月毎又は毎年施用することが望ましい場合がある。

0084

遺伝子改変された細胞は、固体半固体又は液体形態などの任意の形態で投与され得る。製剤は、それだけに限らないが、液剤乳剤懸濁剤、クリーム、ローション錠剤及びカプセル剤からなる群から選択され得る。しかしながら、遺伝子改変された細胞又は前記遺伝子改変された細胞を含む組成物は、一定の製剤に限定されず、任意の公知の許容可能な製剤に製剤化され得る。組成物は、例えば、細胞と1種又は複数の任意の他の薬剤を混合することによって、当技術分野で公知の任意の慣用的な方法によって製造され得る。

0085

本発明の一実施形態では、本発明の方法によって遺伝子改変された再生細胞を投与するための適切な標的としてヒト又は動物対象を分類する前に、例えば病歴又は例えば特定の疾患のリスクを評価することができる。臨床医は、本発明の方法を行い、標準から逸脱した結果を受けた後に、例えば、患者に対するさらなる診断方法及び/又は治療を提案することができる。

0086

本発明のセンシングは、指標分子のシグナルを検出することに頼る。指標のシグナルは、例えば対象の皮膚の上、外、又はより上の細胞から監視される。本発明の方法は、細胞壁侵入又は細胞を破壊することなく、細胞内の分析物の存在、非存在又は量と関連する指標シグナルの存在、非存在又は量を検出する。実際、本発明で使用される監視は非外科的監視法である、又は最小限の細胞/組織挿入操作が必要とされる外科的監視法に変換することができる。例えば、人がひどい火傷をした場合にケラチノサイトを使用して皮膚の漏出を防ぎ、このような細胞が皮膚を回復させるので、これは現場では日常的である。したがって、皮膚回復のための日常的な技術が存在し、商業化されている。

0087

本発明の1つの利点は、指標シグナルをリアルタイムで監視することができることである。これによりユーザーフレンドリーな施用が可能になる。本発明の特定の実施形態では、監視が連続的に実行される。本明細書で使用される場合、「連続的に」とは、指標シグナルの変化をノンストップで追跡することを指す。「連続的に」という表現は、時々監視することの反対である。

0088

本発明の一実施形態では、監視が、光学導電率、磁場、放射線インピーダンス電気化学、音響及び生物学的測定値からなる群から選択される測定値を利用することによって行われる。そのため、指標シグナルは、任意の光学(例えば、光及びその反射率屈折率、吸収又は色;ラマン散乱特性の変化又はハイパースペクトル指紋の変化)、電気(例えば、皮膚表面導電率又は表面電位の変化)、磁場(例えば、磁気分極強磁性共鳴電子スピン共鳴電子常磁性共鳴又は核磁気共鳴の変化)、放射線(例えば、蛍光共鳴エネルギー移動、発光又はリン光の変化)、インピーダンス(例えば、誘電率又はその周波数スペクトルの変化)、電気化学(例えば、イオン導電率又は酸化還元反応の変化)、音響(例えば、音響又は光音響特性の変化)及び/又は生物学的(例えば、組織又は毛の検出可能な生物学的変化)シグナルであり得る。指標分子からのシグナルは、当技術分野で公知の種々の方法によって検出又は監視することができる。これらの方法は、当業者に周知であり、当業者は、これらの方法をいつどのように使用するかを知っている。これらの方法には、それだけに限らないが、光学測定、例えば紫外線赤外線生物発光測定もしくはイメージング蛍光測定もしくはイメージング、放射性標識もしくはトレーサの測定、磁場の使用及び/又はX線もしくはγ線の使用が含まれる。本発明の方法は、1つ又は複数の分析物の存在及び/又は量に対応するシグナルを、細胞の外側、例えば皮膚上の外部装置に送信するステップを含むことができる。対象の1個もしくは複数の細胞又は皮膚は、1個又は複数の細胞からのシグナルを検出するように適合された装置に連結され得る、又はその近傍に存在することができる。

0089

例えば、電気信号にさらに変換することができる指標のいずれのシグナルも本発明に適している。本発明の一実施形態では、指標シグナルが電気信号に変換される。

0090

例えば、本発明の一実施形態では、例えばGFP又はFRET対からの蛍光を用いて、例えばグルコースに関連する指標シグナルを測定するために、外部光源及び蛍光光度計を改変された細胞の近くに配置することができる。別の例では、図6の設定及び/又は図7の設定を含む測定設定又は装置を本発明で使用することができる。本発明の一実施形態では、手首装置の下の皮膚を照らし、次いで、低コスト光検出器を使用して指標シグナルを読み取るために、低コストのLEDを使用することによって測定を行う。周囲光が実際の測定を妨害しないように、LEDと光検出器の両方を手首装置の底面に配置することができる。

0091

本発明の監視ステップは、非外科的手段又は非侵襲的手段によって細胞内の分析物の存在、非存在又は量を検出する。「非外科手術」又は「非侵襲的」とは、皮膚の破損が生じず、監視が対象又は細胞の内側で行われないことを意味する。

0092

本発明の一実施形態では、方法が指標シグナルを値、定量的又は定性的値、数値、傾向を明らかにする結果又はオンオフ結果に変換するステップをさらに含む。本発明の特定の実施形態では、細胞からのシグナルを検出するように適合された装置がリーダー装置である、又はユーザーフレンドリーな方法での結果の表示に必要とされる電子装置及び/又はシグナルプロセッサを有するリーダー装置を含む。本発明に適した監視設定又は装置には、それだけに限らないが、例えば図5B〜図8に記載又は図示さるものが含まれる。

0093

本発明はまた、指標をコードするポリヌクレオチド配列を再生細胞のDNAに挿入することによって再生細胞を改変する手段であって、指標をコードするポリヌクレオチド配列を前記再生細胞中の標的ポリヌクレオチドと共に発現させる、改変する手段、及び対象の皮膚上の指標のシグナル又はその非存在を監視する手段を含むシステムに関する。一実施形態では、システムが、改変された細胞を対象の皮膚上又は対象に投与する手段をさらに含む。本発明の一実施形態では、システムが改変される再生細胞も含む。

0094

本発明の特定の実施形態では、システムが本発明の方法を行うためのものである。

0095

本明細書で使用される場合、「再生細胞を改変するための手段」とは、再生細胞を改変するための任意の装置及び/又は薬剤を指し、例として、再生細胞を改変するためのキット、改変を行うために必要な試薬(例えば、緩衝液)、適切なプライマー又はプローブ、1つ又は複数のコードするポリヌクレオチド及び指標、ならびに細胞を改変するのに適したピペット又はバイアルなどの装置からなる群から選択され得る。再生細胞を改変する方法は、本開示で先に記載されており、当業者の一般的な知識に属する。

0096

本明細書で使用される場合、「対象の皮膚上の指標のシグナル又はその非存在を監視する手段」は、対象の皮膚上の指標シグナルを監視する任意の装置、器具又は設定を指す。適切な装置、器具又は設定の例は、本開示で先に記載されており、当業者の一般的な知識の範囲内である。

0097

本明細書で使用される場合、「改変された細胞を対象の皮膚上又は対象に投与する手段」は、細胞を施用するために使用される任意の装置及び/又は薬剤を指し、例えば、針、注射器、ピペット、バイアル、ローション、クリーム、液体、ならびに任意の他の薬剤、例えば許容される担体、緩衝剤賦形剤アジュバント添加剤防腐剤充填剤安定化剤及び/又は増粘剤、及び/又は対応する製品に通常見られる任意の成分からなる群から選択され得る。適切な成分及び適切な手段の選択は、当業者の一般的な知識に属する。

0098

技術が進歩するにつれて、本発明の概念を種々の方法で実施することができることは、当業者に自明である。本発明及びその実施形態は、上記の例に限定されず、特許請求の範囲内で変化し得る。

0099

実施例1.マーカーとして使用される遺伝子の同定
本発明の一例で、グルコース応答性遺伝子を、マウスの皮膚からスクリーニングした。

0100

皮膚のインビボグルコース応答をマウスを用いて測定した。動物を12時間絶食させ、次いで、体重を量り、ラタネスト(ratanest)を用いて麻酔し、2群に分けた。実験動物に、溶液中2g/kgのD−グルコース及び緩衝液中D−グルコースを腹腔内注射した。ストリップを有するBayer Contour(登録商標グルコースメーターを用いて、全ての動物で血糖を測定した。45分後、血糖値最大値を超え、頸椎脱臼により動物を屠殺し、背中の皮膚を剃り、70%EtOHで消毒し、皮膚試料を切断し、液体N2で急速凍結した。RNAをTrizol(商標)(Thermofisher、Vantaa、フィンランド)で抽出し、凍結皮膚を5分間、2つの7mm金属ビーズの間でTissulyzer(商標)(Qiagen、Helsinki、フィンランド)中で分離し、ビーズ除去後、皮膚溶解物を4℃で10分間、10000gで遠心分離し、上清を0.2体量のCHCl3と混合し、15秒間混合し、室温でインキュベートし、18分間12000gで遠心分離した。次いで、製造業者によって推奨されるように手順を続けた。濃度測定及びQiaxel(Qiagen、Helsinki、フィンランド)でのRNA完全性方向付け後、全RNA12μgを1/10体積酢酸Na pH5.3及び2.5体積の100%EtOHで沈殿させ、H2Oに再懸濁し、製造業者の指示に従って、Poly(A)Purist(商標)(Ambion、Austin、米国)を用いて選択した。ポリA RNAを選択した。ライブラリーを、6つの試料ベースラインから3つとグルコース注射動物から3つ)からのポリA−RNAから作製し、配列決定した。対照動物とグルコース注射動物との間の読取りの比較を行った。少なくとも2倍の変化(+又は)及びp値<0.1を有する遺伝子を、グルコースに対して感受性であるとみなした。これを確認するためのQPCRを、RNA−seqに使用した動物以外の動物の試料で行った。

0101

RNAの採取時間を、刺激に対する応答を示す血液試験によって決定し(実験刺激に応じて、血液又は体液から検出され得るがん関連分子プリオンタンパク質アミロイドタンパク質、任意の病理関連分子)、同時に健常/非刺激対照と比較した。

0102

2倍以上の倍数変化を計算した遺伝子を候補とみなした。

0103

この方法によって同定されたいくつかの遺伝子の同時の有意な変化を、刺激のサインとみなした。

0104

候補を2つの塩基で選択した。
1:若齢動物と高齢動物(5匹の対照及び5匹の処理動物)の両方で刺激に応答し、一時的応答上方制御又は下方制御とみなした
2a:上方制御により若齢動物と高齢動物の両方で刺激に応答する(グルコースが血液から取り除かれてすぐに長期応答が低下しない)
2b:高糖血において上方制御による刺激に応答し、上方制御されたままである(除去に十分でないインスリン)
一過的に変化した遺伝子を表1に示す。

0105

表1.一過的に変化した遺伝子。

0106

長期間変化した遺伝子を表2に列挙する。

0107

表2.長期間変化した遺伝子。

0108

例えば表1、2もしくは3、又は図9もしくは10のグルコース応答性遺伝子のいずれかを本発明に利用することができる。

0109

上記のアッセイは、例えばインスリン産生における膵臓の機能性を試験する場合にもヒトにおいて日常的である。

0110

グルコース注射後に上方制御されるタンパク質を同定することを目的とするもう1組の実験では、健康なマウスとI型糖尿病マウスの両方を使用した。この目的のために、4〜8週齢で、クエン酸緩衝液(pH4.5)中150mg/kgストレプトゾトシン(STZ)の単回静脈内注射(麻酔下)によって、マウスのサブセットにおいて1型糖尿病を誘発した。48時間毎に血糖を監視し、注射の1週間後に全てのSTZ処理マウスが糖尿病であった。次いで、マウスを以下の通り4つの試験群(n=11)に分けた。
G1:水を注射した健康なマウス(対照、Ctrl)
G2:グルコースを注射した健康なマウス(対照、Ctrl)
G3:水を注入したI型糖尿病マウス
G4:グルコースを注射したI型糖尿病マウス

0111

各試験群の6つの皮膚試料からタンパク質を抽出し、プロテオミクス分析に供した。この目的のために、皮膚片を切断し、2つの5mm金属ビーズを含む予冷却チューブに入れた。TissueLyser(Qiagen)中、50Hzで5分間、以下に開示される溶解緩衝液1mlを用いて皮膚を溶解した。厚く破砕不能で不溶性の膜状残片を除去した。次いで、試料を4℃で15分間13000rpmで回転させ、上清を新しいチューブに入れ、−70℃で保存した。製造者の指示に従って、Pierce BCAキット(Thermo Fisher)を用いてタンパク質濃度を測定した。対照マウスの等量の全タンパク質(50μg)をCy3(最小DIGE)で標識し、IEF(pH4〜7)及びSDS−PAGEで分離した。タンパク質スポット位置の変化を検出し、次いで、各タンパク質の発現プロファイル定量化し、統計的に分析した。p値が<0.05である場合に、タンパク質発現を有意に低下又は増加したとみなした。
溶解緩衝液

0112

25mMHEPES
0.3M NaCl、
1.5mM MgCl2、
0.2mMEDTA
0.1%Triton X−100、
0.5mMジチオトレイトール
最終体積100μlについて1個の錠剤のプロテアーゼ阻害剤(Sigma)。
最終体積100μlについて2個の錠剤のホスファターゼ阻害剤(Sigma、Mirjaストック)。

0113

結果は、健康なマウスとI型糖尿病マウスの両方で、グルコース注射後に3種のタンパク質が有意に増加する(p<0.05)ことを示した。これらのタンパク質及び異なる試験群間のそれらの相対発現比を以下の表3に示す:

0114

表3.

0115

同定したグルコース応答性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、指標をコードするポリヌクレオチドと共に発現する適切な標的ポリヌクレオチドの非限定的な例である。

0116

本発明のさらなる例で、グルコース応答性遺伝子を、皮膚前駆細胞からスクリーニングした。

0117

皮膚前駆細胞(SKP)は、以前に記載されたように形成手術を受けている患者の正常ヒト皮膚から単離した(Rezvani HRら、J Clin Invest.2011年1月;121(1):195〜211)。簡単に述べると、新鮮な皮膚断片を直ちに5×5mm片に切断し、37℃で3時間又は4℃で一晩トリプシンで処理して表皮を真皮から分離した。SKPを、ヒドロコルチゾン(0.5mg/ml)、表皮増殖因子(10ng/ml)、インスリン(5mg/ml)を補充したケラチノサイト−SFM(1X)培地に105個細胞/cm2の濃度で播種した。培地を1週間に3回交換した。培養物が70〜80%コンフルエンスに達したら、細胞を10%トリプシンで剥離し、次いで、形質導入実験(例えば、実施例3に記載される)に使用するケラチノサイト−SFM(1X)培地に再懸濁した、又はグルコース処理(例えば、実施例1もしくは2に記載される)に使用した、及び/又は移植実験(例えば、実施例4に記載される)に使用した。

0118

グルコース応答性遺伝子を見出すために、SKPを2つの濃度のグルコース(6及び26mM)で処理した。異なるエンドポイント(5分、45分、90分及び6時間、24時間)でRNA試料を収集した。RNA抽出及びRNA−Seqは、マウス皮膚に関するグルコース応答性遺伝子の下で上記のように実施した。

0119

結果によると、例えば表1、2もしくは3、又は図9もしくは10のグルコース応答性遺伝子のいずれかを本発明に利用することができる。
実施例2.マウス皮膚からの皮膚幹細胞の単離

0120

6〜8週齢のマウスの皮膚から皮膚幹細胞を単離した。マウスを屠殺し(頸椎脱臼により)、次いで毛を剃毛した。皮膚を、10%ベタジンを含むビーカーに2分間、70%エタノールを含むビーカーに1分間、次いで滅菌PBSに1分間浸漬することによって滅菌した。皮膚試料をトリプシンにより4℃で一晩処理した。表皮を真皮から分離し、細かく刻み、トリプシンを含む無菌50mlファルコンチューブに移した。表皮画分を40mmフィルタを通して濾過し、細胞ペレットを0.5%BSAを含むPBSに懸濁し、次いでCD34及びCD49f(α6−インテグリン)抗体により上で1時間染色した。フローサイトメーターFACS)を用いて染色分析を行った。CD49f及びCD34陽性細胞を選択し、FADDMEM培地に蒔いた。

0121

細胞をフィーダー(線維芽細胞株である3T3細胞)と共培養した。これらの最後の細胞は、幹細胞の成長に必要な全ての接着分子を皮膚幹細胞に提供していた。しかしながら、いくつかの手段の後、本発明者らは、幹細胞と3T3細胞との共培養が皮膚幹細胞の正常な増殖に影響を及ぼすことを認識した。本発明者らはフィーダーなしで皮膚幹細胞を培養することにし、本発明者らは異なるマウス個体から異なる皮膚幹細胞を調製することができた。さらに、本発明者らは継代2回まで幹細胞を保つことができた。この技術は、同様に、生検を介した皮膚細胞の単離、温和酵素処理による細胞の解離、及びFACSを用いた抗体マーカーセットによる細胞の幹細胞プール及び他の皮膚構成細胞の精製に基づいていた。このような細胞を細胞培養液に置き、そこで遺伝子編集を行った。技術が利用可能になったら、エキソソームを標的とする皮膚幹細胞を使用することによってインビボである標的遺伝子編集も目標とされる。

0122

様々なタイプの細胞を、日常的グルコース負荷耐性プロトコルに従って、2つの濃度のグルコース(6及び26mM)で処理した。RNA試料を、市販のキットに従って異なるエンドポイント(5分、45分、90分及び6時間、24時間)で回収し、RNA抽出、RNA配列決定及びQPCRを、実施例1に記載されるように実施して、グルコース応答性遺伝子を見つけ出した(表1、2及び3ならびに図9及び10参照)。
実施例3.指標ポリヌクレオチド配列の細胞DNAへの挿入

0123

任意の公知の1つ又は複数の指標を本発明で使用することができる。適切な指標は、当業者に周知であり、当業者は、これらの指標をいつどのように使用するかを知っている。適切な指標の例としては、それだけに限らないが、蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質(GFP)、GFP誘導体、発光タンパク質(例えば、ホタルルシフェリンタンパク質)、mCherry、黄色蛍光タンパク質、トマト赤色タンパク質、ルシフェラーゼレポーター、FRETドナー及び/又はアクセプタータンパク質、アプタマーポリヌクレオチド及び/又はアプタマーポリペプチド、mycタグ、flagタグ、haloタグ、ビオチン/アビジンタグ及びそれらの変異型、非天然塩基及びトランスファーRNA及びアミノ酸ベースのタグ、電気指標として機能するポリペプチドならびにメラニン及び眼色の色素などの身体の色素をコードする遺伝子が挙げられる。一実施形態では、指標がGFPである。

0124

指標ポリヌクレオチドを標的DNAに挿入するために、任意の公知の方法及び手段を本発明で使用することができる。適切な方法及び手段は、当業者に周知であり、当業者は、これらの方法及び手段をいつどのように使用するかを知っている。適切な方法の例としては、それだけに限らないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、CRISPR/Casシステム及び設計メガヌクレアーゼ再設計ホーミングエンドヌクレアーゼを利用するものが挙げられる。

0125

一実施形態では、指標(GFPなど)ポリヌクレオチドを、皮膚においてグルコース応答性であると同定され、例えば表1、2もしくは3、又は図9もしくは10で言及される遺伝子、あるいは前記遺伝子の近くに、前記遺伝子と共に発現させるために挿入した。図9によると、Kalrein6、Sprr1及びPyhin1遺伝子発現は、グルコースの入手可能性が改変されると劇的に変化した。これらの遺伝子配列は公的データバンク(NIH、EMBL)から得た。crisp/cas技術に基づく構築物、したがってこれらの遺伝子のそれぞれのためのガイドRNAは、商業的供給源から設計され、得られる。既に日常的であり、商業的に入手可能な技術を使用することにより、ガイドRNA及びcasを、ヒト又は動物の皮膚再生細胞、例えば実施例2の細胞に導入する。GFPのヌクレオチド配列の標的遺伝子Kalkrein6、Sprr1b及びPyhin1(又はその近く)への挿入を、Sander及びJoungの論文(2014、Nature Biotechnology 32、347〜355)に記載される方法に従って行う。指定されたガイドRNAによって生成された遺伝子編集を、配列決定、PCR及びサザンブロト法によって確認する。遺伝子編集細胞からのゲノムワイド配列データから、オフターゲットも分析する。いったんこれが完了したら、遺伝子編集された細胞を、指標の機能性の試験に供する。例えば、GFPは実際、期待通りに作用する。再生細胞をグルコース及びインスリンに曝露し、指標の変化を、GFPから放出されたエネルギーに基づく共焦点顕微鏡によって読み取る。いったんこれを確認したら、本発明の説明に示される規定の設計された遺伝子座に指標を含有するレポーター細胞を、本発明の開示に記載される技術によって、ヌードマウスにインビボで移植する。次いで、再生レポーター保有細胞の機能性を、インビボでグルコース耐性試験に曝露する。プロセスのこの部分はインビボで指標の適切な機能性を確認するのに役立つ。バイオレポーター生成プロセスにおけるこのステップの後、細胞を、本開示で概説されるように、皮膚を再生させる皮膚層に、異所性対象皮膚細孔存在細胞として、又は組込み体として移入させる。

0126

本発明の一実施形態では、指標ポリヌクレオチド配列を、実施例3で以下に記載されるように細胞DNAに挿入した。
CRISPRレンチウイルス粒子及び皮膚前駆細胞形質導入

0127

実施例1又は実施例2のRNA−Seqデータは、カリクレインスーパーファミリーメンバーの1つの遺伝子:KLK6(カリクレイン関連ペプチダーゼ6)がインビボ(マウス)及びインビトロ(前駆細胞)でグルコース注射後に有意に上方制御されることを示した。SKK中の発現KKL6をノックアウトするために、3種のgRNA配列:AAGCATAACCTTCGGCAAAGGG(配列番号1)、GAGCAGAGTTTGTTGTCCGGG(配列番号2)及びCCCTGACTATGATGCCGCCAGC(配列番号3)(Sigma−Aldrich、フィンランド)に基づいてCRISPRレンチウイルス粒子を構築した。レンチウイルス粒子は、細胞集団を監視するための複数の選択肢を提供する2つの選択マーカー(GFP及びPuro)を含有していた。

0128

形質導入のために、実施例1のヒト皮膚前駆細胞(T25フラスコ1つあたり5×105個細胞)を完全培地中で24時間インキュベートした。感染前に、培地を除去し、細胞をウイルス上清と共に、8μg/mlの硫酸プロタミンの存在下、37℃で24時間インキュベートした。5日後、形質導入効率を、GFP陽性細胞の百分率に基づいてフローサイトメーター(FACS)によって決定した。
遺伝子編集を確認するウェスタンブロット法手順

0129

KLK6ノックアウトの効率を検証するために、以前に記載されたように(Rezvani HRら、J Clin Invest.2011年1月;121(1):195〜211)、ウェスタンブロット法を行った。簡単に述べると、等量の全タンパク質をSDS−PAGEによって分割し、電気泳動的PVDF膜に移した。次いで、膜を抗KLK6(クローン4A10、Sigma−Aldrich、フィンランド)の1:200希釈物及び抗β−アクチン抗体(ab8227、abcam)の1:1000希釈物と4℃で一晩インキュベートした。抗免疫グロブリン西ワサビペルオキシダーゼ結合抗体(Vector Laboratories)の1:10000希釈物と1時間さらにインキュベートした後、化学発光ECL試薬(Amersham Biosciences、フィンランド)を用いてブロット展開した。

0130

CRISP/Cas9により皮膚前駆細胞におけるKLK6遺伝子の枯渇のために使用される方法を、GFPセンサーとのKLK6融合体を過剰発現するために利用する。次いで、GFPセンサーとのKLK6融合体を過剰発現する改変された細胞を、マウスもしくはヒト対象に注射する、又はその皮膚上に配置する。
実施例4.皮膚細胞をレシピエントに組み込む技術の開発

0131

GFP+細胞(GFPマウス由来)のWTレシピエントマウスへの組込みを試験するために、移植実験を行った。2つの異なる方法(A及び/又はB)を使用した。例えば、A又はBのいずれか、及びAとBの両方を本発明の方法で利用することができる。また、改変された細胞が毛包又は汗腺に入れば、遺伝子改変された細胞又は前記細胞を含む組成物を対象(例えば、マウス又はヒト対象)の皮膚上に施用することによって同様の結果が得られる。
A.シリコンチャンバーを用いた皮膚幹細胞の異種移植(図1)。

0132

GFP陽性細胞を上記のように調製し、2×106個の細胞をシリコンチャンバーに注入した。結果は、ドナー細胞がレシピエント皮膚マウスにうまく合体(増殖及び移動)し、少なくとも2ヶ月間とどまることができることを示した。これらの結果をGFP抗体免疫染色によって確認した。
B.WTレシピエントマウスの背中上のGFP皮膚移植片(皮膚全体)(図2)。

0133

このプロトコルでは、GFPマウスの皮膚全体を小片に切断した(刻んだ皮膚)。これらの小片をWTマウスの小ポケットに注射した。GFP皮膚の組込みを蛍光顕微鏡で2ヶ月検出し、次いで、GFP抗体免疫染色によって確認した。

0134

図3図4は移植実験の結果を明らかにしている。図5Aは、本発明の方法が機能し、本発明の方法を使用することによって指標シグナルを皮膚から得ることができることを明らかにしている。

0135

改変された再生細胞を、皮膚病変を含む皮膚領域への局所投与によって、非侵襲的に首尾よく移植することができることを実証するために、さらなる移植実験を行った。この実験では、蛍光GFPタンパク質が全ての器官、特に皮膚に構成的に発現しているGFP陽性マウスをドナーとして使用した。蛍光タンパク質発現のない黒色のC57BL/6マウスをレシピエントとして使用した。C57BL/6マウスをCO2で安楽死させ、鉗子を用いて背中の毛皮を引き抜いた。いったん毛皮を除去したら、背中の皮膚全体を回収し、種々の小片に切断した。シリコンチャンバーを各小片の上部に設置した。GFP陽性幹細胞を上記のようにGFPマウスから新たに単離し、シリコンチャンバーに施用した。24時間又は72時間後にGFPシグナルを追跡し、写真を撮影して、これらの細胞が毛包に合体する能力を示した。

0136

この実験の結果は、例えばクリームとして、単に皮膚の上部に施用することによって、皮膚の下に注射することなく、遺伝子改変された指標細胞を皮膚に組み込むための経路として、皮膚の毛の除去を使用することができることを示している。

0137

本発明の一実施形態では、ヒトの皮膚前駆細胞をインビボでマウスに移植する。SKP培養を実施例1で上記したように行う。これらの細胞にレンチウイルス粒子CRISPRを形質導入して、KLK6 GFP融合体を過剰発現させる。GFP陽性細胞の百分率に基づくFACSを、形質導入の効率を決定するために利用する。

0138

小型シリコンチャンバーを皮膚マウスに挿入し、GFP陽性細胞を注射する。注射の24時間後、小型ホールを適用し、引き続いて注射の1週間後にシリコンチャンバーを除去する。蛍光顕微鏡を用いて(1週間、2週間、1ヶ月及び2ヶ月)、GFP陽性細胞の完全性をチェックする。

0139

GFP陽性細胞のレシピエントマウス及び対照マウスを様々な濃度のグルコースで処理する。次いで、KLK6が特異的グルコースバイオセンサーであることを示すGFPシグナルに従って、KLK6の発現を追跡する。

0140

ヒトでも移植実験を行う。編集された細胞を人の皮膚上に施用する、又は皮膚を再生することができる皮膚の基底細胞層もしくは表皮に投与する。あるいは、刺青様の方法、穿孔、光線照射、皮膚の微小擦過傷、濾胞開口部又は毛包に対する効果を有する絆創膏を利用する。
実施例5.細胞の生化学的変化の監視

0141

特定の遺伝子の発現に関連する細胞の指標シグナルを監視するための任意の公知の監視方法及び手段を本発明で使用することができる。これらの方法は、当業者に周知であり、当業者は、これらの方法をいつどのように使用するかを知っている。適切な監視方法の例としては、それだけに限らないが、光学測定、例えば紫外線、赤外線、生物発光測定もしくはイメージング、蛍光測定もしくはイメージング、放射性標識もしくはトレーサの測定、磁場の使用及び/又はX線もしくはγ線の使用が挙げられる。

実施例

0142

一実施形態では、光電子方法又は手段(例えば、ハイパースペクトル法及び/又はカメラ)を利用することによって監視を行った。本発明に適した監視設定又は装置には、それだけに限らないが、例えば図5B〜図8に記載又は図示さるものが含まれる。

0143

配列表1〜3 <223>gRNA

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