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技術 時間分解レーザ誘起蛍光分光システム及びその使用

出願人 シーダーズ-サイナイメディカルセンター
発明者 ビュートプラモッドラプチャクポールキトルデビッドスコット
出願日 2019年8月30日 (1年4ヶ月経過) 出願番号 2019-157713
公開日 2019年12月19日 (1年0ヶ月経過) 公開番号 2019-215373
状態 未査定
技術分野 蛍光または発光による材料の調査,分析
主要キーワード 周辺電子装置 時間遅延機構 ゲート窓 Qスイッチ 減衰プロファイル 高電圧供給源 トリガ遅延 分割ステージ
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年12月19日)のものです。
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図面 (11)

課題

励起時の生体サンプルからの蛍光発光分析することによって生体サンプルを特徴付けるためのシステム及びこれを用いるための方法を提供する。

解決手段

生体サンプル101に、励起光源100のパルスレーザ照射し、生体サンプルからの蛍光シグナル集光ファイバCFを介して、デマルチプレクサに導入されて、それぞれ別個中心波長を有する多数の狭いスペクトルバンドに分解され、さらに遅延装置105により、時間的に遅延したスペクトルバンドがマルチチャンネルプレート光電子増倍管MCP−PMT)106に異なる時点で届き、各スペクトルバンドの減衰プロファイルが検出される。

概要

背景

本明細書で挙げられたすべての引用文献は、引用によりそれらの全体があたかも全て記載されているかのように組み込まれる。他に定めのない限り、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味をもつ。Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed., Pharmaceutical Press (September 15, 2012)(非特許文献1)、Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology,CRCPress (2008)(非特許文献2)、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., revised ed., J.Wiley & Sons (New York, NY 2006)(非特許文献3)、Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J.Wiley & Sons (New York, NY 2013)(非特許文献4)、Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3rd ed., Wiley−Blackwell (November 28, 2012)(非特許文献5)、及びGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)(非特許文献6)は、本願で用いられる用語の多くへの一般的な指針を当業者に提供する。抗体をどのようにして調製するかについての参考文献に関しては、Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013)(非特許文献7)、Kohler and Milstein, Derivation of specific antibody−producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur.J.Immunol.1976 Jul, 6(7):511−9(非特許文献8)、Queen and Selick, Humanized immunoglobulins, U.S.Patent No.5,585,089 (1996 Dec)(特許文献1)、及びRiechmann et al., Reshapinghuman antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162):323−7(非特許文献9)を参照されたい。

腫瘍又はアテローム性プラークなどの疾患を診断するため、及び有機物化学組成又は生化学組成分析するために、レーザ誘起蛍光分光法(Laser−induced fluorescence spectroscopy:LIFS)が複雑な生体システムに広く適用されている。LIFSの利点は、生体システムの定性的情報定量的情報との両方をインビボで得るその非侵襲的手法を含む。LIFSのさらなる利点は、波長を調整できること、狭帯域励起指向性、及び短パルス励起を含む。さらに、LIFSは、有機物中フルオロフォアを選択的に効率よく励起し、蛍光選択性及び検出可能性を大いに改善することができる。

時間分解技術は、レーザ誘起発光リアルタイム発生を直接記録できるようにし、これは短(ナノ秒)及び超短(ピコ秒パルスレーザを利用できること、並びに高速電子装置の進歩によって可能となった。刺激イベントの後で非常に短い時間間隔発光プロセスが起こるので(例えば、蛍光減衰時間はナノ秒のオーダーである)、時間分解測定は、サンプルの分子種及びタンパク質構造についての情報を提供することができる。例えば、時間分解技術は、「早い」プロセス(通常は、短寿命の状態の直接励起又は非常に迅速なその後の反応)と「遅い」プロセス(通常は、長寿命の状態からの、電子群持続による又は元の電子プロセスの後に続く反応による遅延した励起)が測定されたデータにおいて分離されることを可能にする。

時間分解測定は、広範囲の波長からの統合された影響のみを取得し、サンプルのさらなる特徴を明らかにするためにレーザ誘起発光のスペクトル情報によって補うことができる。依然として時間分解測定を行うことができている状態でレーザ誘起発光を成分波長に分解するために、いくつかの既存のLIFS技術は、広帯域の発光から一度に1つの波長を選択し、選択した波長成分を光検出器誘導するためにスキャニングモノクロメータを用いる。しかしながら、発光スペクトルから別の波長を分解するために、モノクロメータが新しい波長を選択するべく調整される間に、サンプルは別の再発光を生じるように再び励起されなければならない。

概要

励起時の生体サンプルからの蛍光発光を分析することによって生体サンプルを特徴付けるためのシステム及びこれを用いるための方法を提供する。生体サンプル101に、励起光源100のパルスレーザを照射し、生体サンプルからの蛍光シグナル集光ファイバCFを介して、デマルチプレクサに導入されて、それぞれ別個中心波長を有する多数の狭いスペクトルバンドに分解され、さらに遅延装置105により、時間的に遅延したスペクトルバンドがマルチチャンネルプレート光電子増倍管MCP−PMT)106に異なる時点で届き、各スペクトルバンドの減衰プロファイルが検出される。A

目的

Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed., Pharmaceutical Press (September 15, 2012)(非特許文献1)、Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology,CRCPress (2008)(非特許文献2)、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., revised ed., J.Wiley & Sons (New York, NY 2006)(非特許文献3)、Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J.Wiley & Sons (New York, NY 2013)(非特許文献4)、Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3rd ed., Wiley−Blackwell (November 28, 2012)(非特許文献5)、及びGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)(非特許文献6)は、本願で用いられる用語の多くへの一般的な指針を当業者に提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

励起時の生体サンプルからの蛍光発光分析することによって生体サンプルを特徴付けるためのシステムであって、(i)励起ファイバ(ExF)を介して生体サンプルに接続されるレーザ光源であって、前記レーザ光源が、前記生体サンプルに応答蛍光シグナルを生じさせるために前記生体サンプルに所定の波長レーザパルス放射するように構成される、前記レーザ光源と、(ii)前記生体サンプルから前記蛍光シグナルを収集し、前記蛍光シグナルをデマルチプレクサリレーする、集光ファイバ(CF)と、(iii)365nm未満、365〜410nm、410〜450nm、450〜500nm、500〜560nm、560〜600nm、及び600nmを超える各スペクトルバンドを得るべく前記CFからの前記蛍光シグナルを所定の波長で分割するように構成されたデマルチプレクサであって、前記デマルチプレクサは、約500nmの第1の波長分割装置、約560nmの第2の波長分割装置、約600nmの第3の波長分割装置、約410nmの第4の波長分割装置、約450nmの第5の波長分割装置、及び約365nmの第6の波長分割装置を含み、前記CFからの前記蛍光シグナルが、前記第1の波長分割装置により500nm未満のシグナルと500nmを超えるシグナルとに分割され、前記500nmを超えるシグナルが、前記第2の波長分割装置により500〜560nmのシグナルと560nmを超えるシグナルとに分割され、前記560nmを超えるシグナルが、前記第3の波長分割装置により560〜600nmのシグナルと600nmを超えるシグナルとに分割され、前記500nm未満のシグナルが、前記第4の波長分割装置により410nm未満のシグナルと410〜500nmのシグナルとに分割され、前記410〜500nmのシグナルが、前記第5の波長分割装置により410〜450nmのシグナルと450〜500nmのシグナルとに分割され、前記410nm未満のシグナルが、前記第6の波長分割装置により365nm未満のシグナルと365〜410nmのシグナルとに分割される、前記デマルチプレクサと、(iv)光遅延装置とを備える、システム。

請求項2

前記光遅延装置が、前記デマルチプレクサからの前記スペクトルバンドを前記光遅延装置に連結するように適合され、単一のショットで複数の波長を捕捉するように、前記スペクトルバンドが前記光遅延装置を通り、かつ、前記スペクトルバンドが前記光遅延装置を通る際に制御された時間遅延を導入することを可能にする、請求項1に記載のシステム。

請求項3

前記集光ファイバが単一のバンドルを形成する、請求項1に記載のシステム。

請求項4

励起時の生体サンプルからの蛍光シグナルの発光を分析することによって生体サンプルを特徴付けるための方法であって、(i)生体サンプルに応答蛍光シグナルを生じさせるために前記生体サンプルに所定の波長のレーザパルスを放射することと、(ii)前記生体サンプルから前記蛍光シグナルを収集することと、(iii)365nm未満、365〜410nm、410〜450nm、450〜500nm、500〜560nm、560〜600nm、及び600nmを超える各スペクトルバンドを得るべく前記蛍光シグナルを所定の波長で分割することであって、前記蛍光シグナルが、500nm未満のシグナルと500nmを超えるシグナルとに分割され、前記500nmを超えるシグナルが、500〜560nmのシグナルと560nmを超えるシグナルとに分割され、前記560nmを超えるシグナルが、560〜600nmのシグナルと600nmを超えるシグナルとに分割され、前記500nm未満のシグナルが、410nm未満のシグナルと410〜500nmのシグナルとに分割され、前記410〜500nmのシグナルが、410〜450nmのシグナルと450〜500nmのシグナルとに分割され、前記410nm未満のシグナルが、365nm未満のシグナルと365〜410nmのシグナルとに分割される、前記蛍光シグナルを所定の波長で分割することと、(iv)時間遅延したスペクトルバンドを生成するために、前記スペクトルバンドを時間遅延機構に通すことと、(v)時間遅延したスペクトルバンドを得ることと、(vi)前記時間遅延したスペクトルバンドを処理することとを含む、方法。

請求項5

前記蛍光シグナルが生体分子によって発光される、請求項4に記載の方法。

請求項6

前記生体分子が、PLP−GAD(ピリドキサル−5'−リン酸(PLP)グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD))、結合NADH、遊離NADH、フラビンモノヌクレオチドFMNリボフラビンフラビンアデニンジヌクレオチドFAD)リボフラビン、リポピグメント内因性ポルフィリン、又はこれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上である、請求項5に記載の方法。

請求項7

請求項4に記載の方法によって生体サンプルの生体分子からの蛍光シグナルの発光を分析することを含む組織生存性を判定するための方法であって、正常サンプルと比較しての前記生体サンプルの蛍光シグナルの増加が、低い組織生存性を示す、方法。

請求項8

請求項4に記載の方法によって蛍光シグナルの発光を分析することを含む、細胞の代謝を連続的にモニタリングするための方法。

請求項9

請求項4に記載の方法によって生体分子からの蛍光シグナルの発光を分析することを含む、血漿中の薬剤レベル又は代謝産物レベルを判定するための方法。

請求項10

前記生体分子がNADHである、請求項9に記載の方法。

請求項11

NADHが、遊離型結合型、又はこれらの組み合わせである、請求項10に記載の方法。

請求項12

前記光遅延装置から受信したシグナルの検出用に構成された光電子増倍管をさらに含む、請求項1に記載のシステム。

請求項13

前記光電子増倍管から受信した前記シグナルのデジタル化用に構成されたデジタイザをさらに含む、請求項12に記載のシステム。

請求項14

前記光電子増倍管から受信した前記シグナルを、前記シグナルが前記デジタイザによりデジタル化される前に増幅するように構成された前置増幅器をさらに含む、請求項13に記載のシステム。

請求項15

前記デジタイザから受信したシグナルの処理及び表示用に構成されたコンピュータシステムをさらに含む、請求項13に記載のシステム。

請求項16

前記時間遅延したスペクトルバンドを処理することが、前記時間遅延したスペクトルバンドを検出することを含む、請求項4に記載の方法。

請求項17

検出したシグナルをデジタル化することをさらに含む、請求項16に記載の方法。

請求項18

前記検出したシグナルを、前記検出したシグナルをデジタル化する前に増幅することをさらに含む、請求項17に記載の方法。

請求項19

デジタル化したシグナルをコンピュータシステムによって処理及び表示することをさらに含む、請求項17に記載の方法。

技術分野

0001

米国政府権利
本発明は、National Institutes of Neurological Disorders and Strokeによって与えられた補助金交付番号.NS060685の下での政府支援でなされた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。

0002

本発明は、一般に、標識又は非標識生体分子からのレーザ誘起発光分析することによって生体材料特徴付けるための技術に関する。

背景技術

0003

本明細書で挙げられたすべての引用文献は、引用によりそれらの全体があたかも全て記載されているかのように組み込まれる。他に定めのない限り、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味をもつ。Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed., Pharmaceutical Press (September 15, 2012)(非特許文献1)、Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology,CRCPress (2008)(非特許文献2)、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., revised ed., J.Wiley & Sons (New York, NY 2006)(非特許文献3)、Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J.Wiley & Sons (New York, NY 2013)(非特許文献4)、Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3rd ed., Wiley−Blackwell (November 28, 2012)(非特許文献5)、及びGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)(非特許文献6)は、本願で用いられる用語の多くへの一般的な指針を当業者に提供する。抗体をどのようにして調製するかについての参考文献に関しては、Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013)(非特許文献7)、Kohler and Milstein, Derivation of specific antibody−producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur.J.Immunol.1976 Jul, 6(7):511−9(非特許文献8)、Queen and Selick, Humanized immunoglobulins, U.S.Patent No.5,585,089 (1996 Dec)(特許文献1)、及びRiechmann et al., Reshapinghuman antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162):323−7(非特許文献9)を参照されたい。

0004

腫瘍又はアテローム性プラークなどの疾患を診断するため、及び有機物化学組成又は生化学組成を分析するために、レーザ誘起蛍光分光法(Laser−induced fluorescence spectroscopy:LIFS)が複雑な生体システムに広く適用されている。LIFSの利点は、生体システムの定性的情報定量的情報との両方をインビボで得るその非侵襲的手法を含む。LIFSのさらなる利点は、波長を調整できること、狭帯域励起指向性、及び短パルス励起を含む。さらに、LIFSは、有機物中フルオロフォアを選択的に効率よく励起し、蛍光選択性及び検出可能性を大いに改善することができる。

0005

時間分解技術は、レーザ誘起発光のリアルタイム発生を直接記録できるようにし、これは短(ナノ秒)及び超短(ピコ秒パルスレーザを利用できること、並びに高速電子装置の進歩によって可能となった。刺激イベントの後で非常に短い時間間隔発光プロセスが起こるので(例えば、蛍光減衰時間はナノ秒のオーダーである)、時間分解測定は、サンプルの分子種及びタンパク質構造についての情報を提供することができる。例えば、時間分解技術は、「早い」プロセス(通常は、短寿命の状態の直接励起又は非常に迅速なその後の反応)と「遅い」プロセス(通常は、長寿命の状態からの、電子群持続による又は元の電子プロセスの後に続く反応による遅延した励起)が測定されたデータにおいて分離されることを可能にする。

0006

時間分解測定は、広範囲の波長からの統合された影響のみを取得し、サンプルのさらなる特徴を明らかにするためにレーザ誘起発光のスペクトル情報によって補うことができる。依然として時間分解測定を行うことができている状態でレーザ誘起発光を成分波長に分解するために、いくつかの既存のLIFS技術は、広帯域の発光から一度に1つの波長を選択し、選択した波長成分を光検出器誘導するためにスキャニングモノクロメータを用いる。しかしながら、発光スペクトルから別の波長を分解するために、モノクロメータが新しい波長を選択するべく調整される間に、サンプルは別の再発光を生じるように再び励起されなければならない。

0007

Queen and Selick, Humanized immunoglobulins, U.S.Patent No.5,585,089 (1996 Dec)

先行技術

0008

Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed., Pharmaceutical Press (September 15, 2012)
Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology,CRCPress (2008)
Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., revised ed., J.Wiley & Sons (New York, NY 2006)
Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J.Wiley & Sons (New York, NY 2013)
Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3rd ed., Wiley−Blackwell (November 28, 2012)
Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)
Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013)
Kohler and Milstein, Derivation of specific antibody−producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur.J.Immunol.1976 Jul, 6(7):511−9
Riechmann et al., Reshapinghuman antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162):323−7

発明が解決しようとする課題

0009

これらの既存の技術は、広帯域発光から複数のスペクトル成分を分解するのにかなりの時間がかかることがある。各波長成分をリアルタイムで記録することができるが、別の波長を選択するのにモノクロメータを用いる際の遷移時間は数秒かかることがあり、これはリアルタイム測定を行う際の制限因子となる。さらに、サンプル上の多数の刺激位置が測定されなければならない場合に測定全体に多くの時間がかかることがある。したがって、サンプルの単一の励起によって生じる発光からの時間で分解された情報と波長で分解された情報との両方のほぼリアルタイムでの記録を容易にするシステム及び方法が必要とされている。

課題を解決するための手段

0010

発明の概要
本発明は、励起シグナル応答して生体サンプルからの発光を分析することによって生体サンプルを特徴付けるシステムを提供する。システムは、最初に生体サンプルにレーザインパルス放射して生体サンプルに応答発光を生じさせる。システムは、次いで、波長分割装置を用いて応答発光を異なる中心波長スペクトルバンドの組に分割する。次いで、各スペクトルバンドが光学検出器に異なる時点で届くようにスペクトルバンドの組に時間的な遅延が適用され、これにより、光学検出器が各スペクトルバンドの応答発光を別々に時間的に分解することが可能となる。次いで、遅延したスペクトルバンドが、光学検出器の単一の検出窓内でシステムによって捕捉される。その後、捕捉されたスペクトルバンドが処理される。
[本発明1001]
励起時の生体サンプルからの蛍光発光を分析することによって生体サンプルを特徴付けるためのシステムであって、
(i)励起ファイバ(ExF)を介して生体サンプルに接続されるレーザ光源であって、前記レーザが、前記生体に応答蛍光シグナルを生じさせるために前記生体サンプルに所定の波長のレーザパルスを放射するように構成される、レーザ光源と、
(ii)前記サンプルから前記蛍光シグナルを収集し、前記シグナルをデマルチプレクサリレーする、集光ファイバ(CF)と、
(iii)スペクトルバンドを得るべく前記CFからの前記シグナルを所定の波長で分割するために波長分割フィルタを備えるデマルチプレクサと、
(iv)光遅延装置
を備える、システム。
[本発明1002]
前記シグナルがデジタル化される前に、前記シグナルが光電子増倍管を通過した後で前記シグナルを増幅するために、前置増幅器を備える光電子増倍管をさらに備える、本発明1001のシステム。
[本発明1003]
前記光電子増倍管から受信したシグナルをデジタル化するためのデジタイザと、前記シグナルを処理及び表示するコンピュータシステムをさらに備える、本発明1002のシステム。
[本発明1004]
前記光遅延装置が、前記デマルチプレクサからの前記スペクトルバンドを前記遅延装置に連結するように適合され、単一のショットで複数の波長を捕捉するように、前記スペクトルバンドが前記遅延装置を通り、かつ、前記スペクトルバンドが遅延装置を通る際に制御された時間遅延を導入することを可能にする、本発明1001のシステム。
[本発明1005]
前記集光ファイバが単一のバンドルを形成する、本発明1001のシステム。
[本発明1006]
前記デマルチプレクサが、入射シグナルを、355nm(360未満)、365〜410nm、410〜450nm、450〜480nm、500〜560nm、560〜600nm、及び600nmを超える波長で分割する、本発明1001のシステム。
[本発明1007]
励起時の生体サンプルからの蛍光シグナルの発光を分析することによって生体サンプルを特徴付けるための方法であって、
(i)生体に応答蛍光シグナルを生じさせるために前記生体サンプルに所定の波長のレーザパルスを放射することと、
(ii)前記サンプルから前記蛍光シグナルを収集することと、
(iii)スペクトルバンドを得るべく前記シグナルを所定の波長で分割することと、
(iv)前記スペクトルバンドを時間遅延機構に通すことと、
(v)時間遅延したスペクトルバンドを得ることと、
(vi)前記時間遅延したスペクトルバンドシグナルを処理することと
を含む、方法。
[本発明1008]
前記シグナルを処理することが、光電子増倍管から受信した前記シグナルをデジタル化するために前記シグナルをデジタイザに通して、前記シグナルを処理及び表示するためにコンピュータシステムに渡すことを含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記シグナルを分割することが、入射シグナルをデマルチプレクサで355nm(365nm未満)、365〜410、410〜450nm、450〜480nm、500〜560nm、560〜600nm、及び600nmを超える波長で分割することを含む、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記蛍光シグナルが生体分子によって発光される、本発明1007の方法。
[本発明1011]
前記生体分子が、PLP−GAD(ピリドキサル−5'−リン酸(PLP)グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD))、結合NADH、遊離NADH、フラビンモノヌクレオチドFMNリボフラビンフラビンアデニンジヌクレオチドFAD)リボフラビン、リポピグメント内因性ポルフィリン、又はこれらの組み合わせのうちのいずれか1つ以上である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
本発明1007の方法によって組織の生体分子からの蛍光シグナルの発光を分析することを含む組織生存性を判定するための方法であって、正常な対象と比較しての対象の生体分子の蛍光の増加が、低い組織生存性を示す、方法。
[本発明1013]
本発明1007の方法によって蛍光シグナルの発光を分析することを含む、細胞の代謝を連続的にモニタリングするための方法。
[本発明1014]
本発明1007の方法によって生体分子からの蛍光シグナルの発光を分析することを含む、血漿中の薬剤レベル又は代謝産物レベルを判定するための方法。
[本発明1015]
前記生体分子がNADHである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
NADHが、遊離型結合型、又はこれらの組み合わせである、本発明1015の方法。

図面の簡単な説明

0011

本発明の種々の実施形態に係る、(A)マルチ励起時間分解レーザ誘起蛍光分光法の概略を示す図であり、BSビームスプリッタ、FB:ファイババンドルOD光学密度LPFW:ロングパスフィルタホイール、ExF:励起ファイバ、CF:集光ファイバ、PMT:光電子増倍管である。
本発明の種々の実施形態に係る、(B)トリガ同期を示す図である。
本発明の種々の実施形態に係る例示的なデマルチプレクサ設計の概略を示す図である。
本発明の種々の実施形態に係るプローブの概略を示す図である。
本発明の種々の実施形態に係る種々の例示的な生体分子の蛍光発光を示す図である。
本発明の種々の実施形態に係る生体外(ex−vivo)での脳サンプルの連続NADHモニタリングの使用を示す概略を示す図である。
本発明の種々の実施形態に係る細胞がNADH依存ATP産生を阻害する化合物であるロテノンに曝される間のNADHレベルをTRLIFS装置が連続的にモニタリングする能力を実証するデータを示す図である。
本発明の種々の実施形態に係る、(A)TRLIFSシステムによって観察される領域を示すであり、(B)TTCでの処置後に(A)からのサンプルが重ね合わされた図であり、(C)各領域(スポット)に関してプロットされた蛍光強度を示す図である。
本発明の種々の実施形態に係る種々の濃度のメトトレキサートを有する寒天ゲルを示す図である。
本発明の種々の実施形態に係る、(A)波長350nmの光に20分露光後の種々の濃度でのMTXの蛍光を示す図であり、(B)活性蛍光型の生成に起因するMTXの蛍光の増加を示す20分間にわたる蛍光の時間的経過のプロットを示す図である。

0012

発明の詳細な説明
本明細書で挙げられたすべての引用文献は、引用によりそれらの全体があたかも全て記載されているかのように組み込まれる。他に定めのない限り、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味をもつ。Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed., Pharmaceutical Press (September 15, 2012)、Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology,CRCPress (2008)、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., revised ed., J.Wiley & Sons (New York, NY 2006)、Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J.Wiley & Sons (New York, NY 2013)、Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3rd ed., Wiley−Blackwell (November 28, 2012)、及びGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)は、本願で用いられる用語の多くへの一般的な指針を当業者に提供する。抗体をどのようにして調製するかについての参考文献に関しては、Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013)、Kohler and Milstein, Derivation of specific antibody−producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur.J.Immunol.1976 Jul, 6(7):511−9、Queen and Selick, Humanized immunoglobulins, U.S.Patent No.5,585,089 (1996 Dec)、及びRiechmann et al., Reshapinghuman antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162):323−7を参照されたい。

0013

以下の説明は、どのような当業者も本発明を作製及び使用できるようにするために与えられ、特定の用途及びその要件との関連で提供される。開示された実施形態への種々の修正が当業者にはすぐに分かり、本明細書で定義される一般原理は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく他の実施形態及び用途に適用され得る。したがって、本発明は、示された実施形態に限定されないが、請求項と一致する最も広い範囲が認められることになる。

0014

本発明は、生体分子(標識又は非標識)からのレーザ誘起発光を分析することによって生体材料を特徴付けるための技術に関する。より詳細には、本発明は、生体材料からのレーザ誘起蛍光発光の時間分解及び波長分解分析を行うことによって生体材料を特徴付けるための方法及び装置に関する。

0015

本明細書で説明されるシステムは、限定はされないが、損傷後の組織生存性の評価、腫瘍及び腫瘍縁部の検出、細胞代謝の連続モニタリング薬剤療法を最適化するための血漿のモニタリングを含む、種々の生理的状態及び疾患状態を特徴付けるために用いられてもよい。システムは、分析される基質/マーカに応じて種々の用途/使用に適合させることができる。

0016

システム
励起光源はパルスレーザ100である。パルスレーザからの出力パルスは、サンプルを損傷させずに生体サンプル101を励起するのに適する所定の波長及び出力レベルで生体サンプル上に放射される。パルスレーザは、各レーザインパルス出力への正確なタイミングを提供する内部又は外部パルスコントローラ装置又はデジタル遅延装置又はトリガ装置102によって制御される。この正確なタイミングは、フォトダイオードを用いてパルス毎にチェックされ、アナログ−デジタル変換器装置、例えばNIPCIe−6320を用いて更新される。一実施形態では、パルスレーザは、生体サンプルを励起するために紫外(UV)光パルスを放出する。別の実施形態では、パルスレーザは、生体サンプルを励起するために可視又は近赤外光パルスを放出する。

0017

パルスレーザからのレーザ放出光ファイバに連結/集束し、光ファイバ103(図3)か又はレンズシステムかのいずれかを通じて生体サンプル上の特異的な場所に誘導することができる。レーザインパルス励起は、生体サンプルに通常は多くの波長を含む広いスペクトルを有する蛍光発光などの応答発光を生じさせる。次いで、このレーザ誘起発光が、1つ以上の集光ファイバ又はレンズによって集光される。本発明の一実施形態では、集光ファイバは、マルチモードファイバのバンドル103である。別の実施形態では、集光は対物レンズを用いて達成される。

0018

集光ファイバは、次いで、広帯域の放出光を、1つ以上の波長分割ステージを備えることができる波長分割装置104(図2)に運ぶ。広帯域の放出光は、広帯域のシグナルをそれぞれ別個の中心波長を有する多数の狭いスペクトルバンドに分解することができるように、一連の波長分割プロセスを経験する。波長分解されたスペクトルバンドが、光検出器106の方に移動する際の各スペクトルバンドに所定の時間的な遅延を適用する、対応する遅延装置105に連結される。遅延装置を出る時間的に遅延したスペクトルバンドが、レーザ光を含む各波長分解されたスペクトルバンドの蛍光減衰プロファイルを個々に記録し、時間的に分解することができるように、高速応答光電子増倍管上に配列される。これらのスペクトルバンドに適用された遅延は、各光シグナルマルチチャンネルプレート光電子増倍管(MCP−PMT)に異なる時点で届くことを可能にし、これは、各スペクトルバンドの減衰プロファイルが別々にレーザ光と共にMCP−PMTによって検出されることを可能にする。一実施形態では、高速デジタイザ107を用いてMCP−PMTからの出力を記録及び表示することができる。別の実施形態では、オシロスコープを用いてMCP−PMTからの出力を記録及び表示することができる。一実施形態では、MCP−PMTは、ゲート制御回路によって制御されるゲートMCP−PMTであり、ゆえにMCP−PMTは、MCP−PMTが開いているときの狭い検出窓の間の光シグナルにのみ応答する。一実施形態では、ゲート制御回路とパルス制御は、単一のレーザ誘起励起に関連するすべての蛍光減衰プロファイルが単一のMCP−PMT検出窓内で記録され得るように同期される。一実施形態では、MCP−PMTゲートを開くタイミングは、前の遅延に基づく補正を用いてレーザトリガとMCP−PMTゲートとの間の遅延を変化させることによってレーザパルスと同期される。レーザのトリガ遅延(トリガシグナルとレーザ光の実際の発射との間の遅延)は、フォトダイオードを用いて記録される。測定されたトリガ遅延は、レーザのトリガとMCP−PMTゲートのトリガとの間の同期を補正するのに用いられる。MCP−PMTの代わりに又はこれに加えて、限定はされないがアバランシェフォトダイオードAPD)、シリコンPMTを含む他の光検出器が用いられてもよい。MCP−PMTの利得は自動的に制御することができる。本発明の一実施形態では、MCP−PMTの電圧を蛍光シグナルに基づいて動的に変化させることできる。本発明の一実施形態では、電圧の変化は、蛍光シグナルを分析し、シグナルを記録する前の変化の量を求めることによって決定することができる。

0019

パルスレーザ103は、ユニットが外部からトリガされた後でレーザ光を発生させる固有の遅延を有する。例示的な実施形態では、外部遅延の後でレーザ光を発生する際の遅延は、限定はされないが85マイクロ秒までであることがある。以下、「トリガ遅延」と呼ばれるシグナルをトリガする際の遅延は、レーザの各パルス間で異なることがある。レーザ光をPMTゲートの開放と同期させるために、発明者らは、レーザパルスのタイミングを検出し、これを外部トリガと比較し、次いで、前のトリガ遅延に基づいて次のトリガのタイミングを補正するのにフォトダイオードを用いる(図1B)。図1Bでは、t0はレーザがトリガされる時間であり、t1は、レーザが発射される時間であり、t2は、PMTがトリガされる時間であり、t3は、PMTゲートがオンになる時間である。このフィードバックに基づくトリガ同期を可能にすることによって、t2は、蛍光シグナルがMCP−PMTに届くときにMCP−PMT上の電圧利得が確実に「オン」であるように動的に設定される。デジタイザは、より小さいデータサイズを保証するために第2のフォトダイオードを用いて「オン」をトリガされる。

0020

TRLIFSシステムの概略図が図1に描画される。種々の実施形態において、システムは、(i)励起ファイバ(ExF)、(ii)集光ファイバ(CF)、(iii)デマルチプレクサ(デマクサ)、蛍光シグナルの寿命(すなわち、蛍光シグナルの指数関数的減衰)についての微小測定を提供する波長分割装置、(iv)光電子増倍管(MCP−PMT、例えば、Photek210などの高利得(106)、低ノイズ、及び立ち上がり時間の速い(〜80ps)検出器)、(v)シグナルがデジタル化される前に光電子増倍管の後にさらなる利得を提供する随意的な前置増幅器、(vi)データ分析を行うために光電子増倍管から受信したシグナルを(例えば、6.4Gサンプル/秒で)デジタル化するデジタイザ(例えば、SP Devices:108ADQTiger)、及び(vii)シグナルを処理及び表示するコンピュータシステム、を備える。

0021

生体組織からの蛍光シグナルは、生体システムにおけるフルオロフォアに基づいて非常に高い又は低いことがある。フルオロフォアは、サンプルのタイプ(例えば、組織、血液、血漿)などの特定の条件に起因して阻止される場合がある量子効率及び/又は励起光の吸収に基づいて蛍光発光強度を放出する。蛍光スペクトルを適正に記録するために、増加した蛍光発光がシグナルの飽和を引き起こさず、低い蛍光発光が非常に低いシグナル対ノイズ比につながらないようにPMT利得が調節される必要がある。これは、前に記録されたデータに基づいてMCP−PMTにわたる電圧を迅速に変化させることによって達成することができる。一実施形態では、蛍光シグナルが高すぎる又は低すぎるかどうかを判定するために、レーザの2つのパルスからの蛍光が(例えば、ソフトウェアを用いて)平均され、分析され、その後、高電圧電源コンピュータとの通信を介してMCP−PMT(PMTの利得の制御を担当する)にわたる電圧が変えられる。蛍光発光が高すぎる場合、正しい量のシグナル対ノイズ比が達成されるまで繰返し電圧が下げられ、逆もまた同様である。正しいSNRが達成された後にのみ真のシグナルが保存され、分析される。

0022

いくつかの実施形態では、励起ファイバ(例えば、直径600μm、NA0.12のUVグレードシリカコアファイバ)が、サンプルを所望の波長で励起するためにレーザ光源をサンプルに接続する。集光ファイバ(例えば、直径200μm、NA0.22のUVグレードのシリカコアファイバの12本のファイバ)が単一のバンドルにパッケージされ、このバンドルはデマルチプレクサにつながる(図3)。12本のファイバは、マルチモードファイバを単一のファイバに組み合わせる技術を用いて単一のファイバに組み合わせることができる。(http://www.ofsoptics.com/)。所定の波長のレーザでサンプルが励起すると、集光ファイバは、サンプルから蛍光シグナルを収集し、シグナルをデマルチプレクサにリレーする。デマルチプレクサの種々の波長分割フィルタは、限定はされないがフィルタ又はプリズムなどのビーム分割装置の波長に基づいて入射シグナルを分割する。蛍光シグナルパルス(パルス励起後)は、光電子増倍管、前置増幅器、及びデジタイザを介してコンピュータシステムにリレーされ、この場合の蛍光減衰は、記録された蛍光パルスからレーザパルス(以前に記録された)を逆重畳することによって計算される。

0023

波長分割装置
図2は、波長分割装置(デマルチプレクサ、デマクサ)の概略を示す。生体サンプルからのレーザ誘起発光シグナル(広範囲の波長を含む)が集光ファイバによって収集され、集光ファイバは、放出されたシグナルを波長分割装置の方に運ぶ。

0024

本発明の例示的な実施形態では、生体サンプルは、約337〜350nmの波長で励起される。一実施形態では、図1及び図2に描画される波長分割装置(デマルチプレクサ)は、入射シグナルを365nm未満(励起波長)、365〜410nm、410〜450nm、450〜480nm、500〜550nm、550〜600nm、及び600nmを超える波長で分ける。図1に示すように、入射光シグナルは、入射シグナルを約495nmを超える波長と約495nm未満の波長で分ける波長分割装置の第1のビーム分割装置上に誘導される。第1のビーム分割装置を通過した後で、495nmを超える波長を有するシグナルが、焦点距離60mmのレンズを用いて合焦され、次いで、シグナルを500〜560nmの波長と560nmを超える波長で分ける第2のビーム分割装置を通過し、最後に、第3のビームスプリッタが、光を560〜600nmの波長と600nmを超える波長で分ける。495nm未満の波長を有するシグナルも、焦点距離60mmのレンズを通過し、495nmの光シグナルを約410〜480nmの波長と410nm未満の波長に分ける第4のビーム分割装置を通過する前に合焦される。410〜450nmの波長を有する光シグナルは、シグナルを約415〜450nmの波長と450〜495nmの波長に分ける第5のビーム分割装置を通過する。410nm未満の波長からの光シグナルは、第6のビームスプリッタを通り、365〜410nmの波長とレーザ励起シグナルを含む365nm未満の波長に分けられる。レーザを蛍光と同時に記録することによって正確な逆重畳を保証することが可能である。このデマルチプレクサ設計は、限定はされないがフラビンモノヌクレオチド(FMN)リボフラビン、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)リボフラビン、リポピグメント、内因性ポルフィリンを含む生体分子、並びに入射シグナルにおけるNADH及びPLP−GADなどの分子の蛍光の検出を可能にする。本明細書で説明されるビーム分割装置は、ダイクロイックフィルタ、プリズム、及び回折格子とすることができるが、これらに限定されない。

0025

本発明の別の例示的な実施形態では、生体サンプルは、約337〜350nmの波長で励起される。この実施形態では、波長分割装置は、入射シグナルを400nm未満、415〜450nm、455〜480nm、400〜600nm、及び500nmを超える波長で分ける。集光ファイバを出て波長分割装置に入る前に、放出された光は、最初にコリメートレンズを用いて平行にされる。コリメートレンズは、屈折率分布型(GRIN)レンズ又は非球面レンズを含むことができるが、これらに限定されない。平行にされた光ビームは、入射シグナルを約400nmを超える波長と約400nm未満の波長で分ける波長分割装置の第1のビーム分割装置上に誘導される。第1のビーム分割装置を通過した後で、400nmを超える波長のシグナルは、シグナルを400〜500nmの波長と500nmを超える波長で分ける第2のビーム分割装置を通過する。400〜500nmの範囲内の波長のシグナルは、光シグナルを約450nmを超える波長と450nm未満の波長に分ける第3のビーム分割装置を通過する。種々の実施形態において、450nm未満の波長のシグナルが生体分子の活性に関して分析される。これらの波長は、限定はされないがNADHの遊離型及び結合型、PLP−GAD、又はこれらの組み合わせを含む生体分子を測定するために重要である。

0026

ビーム分割装置の構成を変化させることによって、種々の波長のスペクトルバンドが検出され得る。フィルタの異なる組を用いて他の波長域を達成することができ、これは当業者には明白であろう。

0027

時間的な遅延光学装置
図1に示されるように、波長分割装置からの各分解された波長成分は、対応する遅延装置に連結され、その後、対応する遅延装置において所定の量の遅延を経験する。種々の実施形態において、遅延装置は、異なる長さL1、L2、L3、L4などを有する光ファイバである。特定の実施形態では、光ファイバの長さは、約5フィート、55フィート、115フィート、165フィート、215フィート、265フィート、及び315フィートであってもよい。必要な遅延に基づいて光ファイバの他の長さが選択されてもよく、これは当業者には明白であろう。波長成分のそれぞれを同じ光学検出器で時間的に分離するために、波長成分のそれぞれは光ファイバの異なる長さを通して移動し、これにより、異なる量の遅延を経験する。最終的には、波長成分のそれぞれは異なる時点で光学検出器に届き、各成分が別々に検出されることが可能となる。

0028

光ファイバの長さに加えて、ファイバの屈折率を含むがこれに限定されない光ファイバの他の物理的特性も、特定の量の遅延を達成するためにファイバの長さを決定するのに用いられる。この時間領域において、各スペクトル成分は特定の量の時間(例えば、数十ナノ秒)にわたって持続する減衰プロファイルを有するので、2つの隣接するスペクトル成分間の時間的な遅延を、2つの減衰プロファイルを時間的に分離するのに十分なだけ長くなるように設計することができる。

0029

本発明の一実施形態では、光学検出器は、ゲート制御回路によって制御される短い検出窓内で入射光シグナルにのみ応答するゲートMCP−MCP−PMTである。このゲート窓は、すべての分解され時間的に分離された波長成分がゲート窓内でMCP−PMTに届くことになるように十分なだけ長くなるように設計することができる。したがって、ゲートMCP−PMTは、1つの検出窓内で単一のレーザ誘起発光によって生じるすべての波長成分を捕捉することができる。分解されたスペクトルバンドを時間的に分離するのに用いられる遅延装置は、光ファイバに限定されず、任意の遅延装置を一般に用いることができる。

0030

種々の実施形態において、サンプルは、固体半固体、又は液体生体サンプルである。種々の実施形態において、サンプルは、そこから化学的特徴を検出することができる血液、血漿、尿、組織、微生物寄生虫唾液嘔吐物脳脊髄液、又は任意の他の生体サンプルのうちのいずれか1つ以上である。

0031

種々の実施形態において、組織は、前立腺腎臓、脳、粘膜、皮膚、肝臓消化管結腸膀胱、筋、乳房、及び/又は頸部のうちのいずれか1つ以上とすることができる。

0032

本明細書で説明されるシステムは、検出可能な(例えば、放出される)特徴を有する任意の分子を検出するのに用いられてもよい。いくつかの実施形態では、放出される特徴は蛍光発光である。いくつかの実施形態では、特徴は蛍光発光の減衰である。

0033

本明細書で説明されるデマルチプレクサ設計は、例えば、治療薬(標識又は非標識)、抗体(標識又は非標識)、毒素(標識又は非標識)、内毒素(標識又は非標識)、外毒素(標識又は非標識)、腫瘍マーカ、及び/又はこれらの組み合わせの検出を可能にする。種々の実施形態において、非標識生体分子は固有の蛍光を有する。

0034

本明細書で説明されるシステムは、限定はされないがフラビンモノヌクレオチド(FMN)リボフラビン、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)リボフラビン、リポピグメント、内因性ポルフィリンを含む生体分子、並びに入射シグナルにおけるNADH及びPLP−GADなどの分子の蛍光の検出を可能にする。

0035

種々の実施形態において、治療薬は化学療法薬を含む。化学療法薬の例は、限定はされないが、アルブミン結合パクリタキセル(nab−パクリタキセル)、アクチノマイシン(Actinomycin)、アリトレチノイン(Alitretinoin)、オールトランス型レチノイン酸(All−trans retinoic acid)、アザシチジン(Azacitidine)、アザチオプリン(Azathioprine)、ベバシズマブ(Bevacizumab)、ベキサロテン(Bexatotene)、ブレオマイシン(Bleomycin)、ボルテゾミブ(Bortezomib)、カルボプラチン(Carboplatin)、カペシタビン(Capecitabine)、セツキシマブ(Cetuximab)、シスプラチンCisplatin)、クロラムブシル(Chlorambucil)、シクロホスファミド(Cyclophosphamide)、シタラビン(Cytarabine)、ダウノルビシン(Daunorubicin)、ドセタキセル(Docetaxel)、ドキシフルリジン(Doxifluridine)、ドキソルビシン(Doxorubicin)、エピルビシン(Epirubicin)、エポチロン(Epothilone)、エルロチニブ(Erlotinib)、エトポシド(Etoposide)、フルオロウラシル(Fluorouracil)、ゲフィチニブ(Gefitinib)、ゲムシタビン(Gemcitabine)、ヒドロキシ尿素(Hydroxyurea)、イダルビシン(Idarubicin)、イマチニブ(Imatinib)、イピリムマブ(Ipilimumab)、イリノテカン(Irinotecan)、メクロレタミン(Mechlorethamine)、メルファラン(Melphalan)、メルカプトプリン(Mercaptopurine)、メトトレキサート(Methotrexate)、ミトザントロン(Mitoxantrone)、オクレリズマブ(Ocrelizumab)、オファツムマブ(Ofatumumab)、オキサリプラチン(Oxaliplatin)、パクリタキセル(Paclitaxel)、パニツマブ(Panitumab)、ペメトレキセド(Pemetrexed)、リツキシマブ(Rituximab)、タフルポシド(Tafluposide)、テニポシド(Teniposide)、チオグアニン(Tioguanine)、トポテカン(Topotecan)、トレチノイン(Tretinoin)、バルルビシン(Valrubicin)、ベムラフェニブ(Vemurafenib)、ビンブラスチン(Vinblastine)、ビンクリスチン(Vincristine)、ビンデシン(Vindesine)、ビノレルビン(Vinorelbine)、ボリノスタット(Vorinostat)、ロミデプシン(Romidepsin)、5−フルオロウラシル(5−FU)、6−メルカプトプリン(6−MP)、クラドリビン(Cladribine)、クロファラビン(Clofarabine)、フロクスウリジン(Floxuridine)、フルダラビン(Fludarabine)、ペントスタチン(Pentostatin)、マイトマイシン(Mitomycin)、イキサベピロン(ixabepilone)、エストラムスチン(Estramustine)、又はこれらの組み合わせを含む。本明細書で説明されている様に、化学療法薬は、標識される又は標識されない場合がある(例えば、固有蛍光を有する薬剤)。いくつかの実施形態では、標識は蛍光標識である。治療薬を標識するために本明細書で説明されるシステム、装置、及び方法と共に用いられ得る蛍光標識の例は、インドシアニングリーン(ICG)、クルクミンローダミンローダミンB、ローダミン123、ローダミン6G、又はこれらの変種など)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ルシフェリンフルオレセイン量子ドット、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。

0036

種々の実施形態において、治療用抗体を含む抗体は、3F8、8H9、アバゴボマブ(Abagovomab)、アブシキシマブ(Abciximab)、アクトクスマブ(Actoxumab)、アダリムマブ(Adalimumab)、アデカツムマブ(Adecatumumab)、アデュカヌマブ(Aducanumab)、アフェリモマブ(Afelimomab)、アフツズマブ(Afutuzumab)、アラシズマブ・ペゴル(Alacizumab pegol)、ALD518、アレムツズマブ(Alemtuzumab)、アリロクマブ(Alirocumab)、アルツモマブ・ペンテテート(Altumomab pentetate)、アマツキシマブ(Amatuximab)、アナツモマブ・マフェナトクス(Anatumomab mafenatox)、アニフロルマブ(Anifrolumab)、アンキンズマブ(Anrukinzumab)、アポリズマブ(Apolizumab)、アルシツモマブ(Arcitumomab)、アセリズマブ(Aselizumab)、アチヌマブ(Atinumab)、アトリズマブ(Atlizumab)、アトロリムマブ(Atorolimumab)、バピニューズマブ(Bapineuzumab)、バシリキシマブ(Basiliximab)、バビツキシマブ(Bavituximab)、ベクツモマブ(Bectumomab)、ベリムマブ(Belimumab)、ベンラリズマブ(Benralizumab)、ベルチリムマブ(Bertilimumab)、ベシレソマブ(Besilesomab)、ベバシズマブ(Bevacizumab)、ベズロトクスマブ(Bezlotoxumab)、ビシロマブ(Biciromab)、ビマグルマブ(Bimagrumab)、ビバツズマブ・メルタンシン(Bivatuzumab mertansine)、ブリナツモマブ(Blinatumomab)、ブロソズマブ(Blosozumab)、ブレンツキシマブ・ベドチン(Brentuximab vedotin)、ブリアキヌマブ(Briakinumab)、ブロダルマブ(Brodalumab)、カナキヌマブ(Canakinumab)、カンツズマブ・メルタンシン(Cantuzumab mertansine)、カンツズマブ・ラブタンシン(Cantuzumab ravtansine)、カプラシズマブ(Caplacizumab)、カプロマブ・ペンデチデ(Capromab pendetide)、カルルマブ(Carlumab)、カツマキソマブ(Catumaxomab)、cBR96−ドキソルビシン免疫複合体(cBR96−doxorubicin immunoconjugate)、セデリズマブ(Cedelizumab)、セルトリズマブ・ペゴル(Certolizumab pegol)、セツキシマブ(Cetuximab)、シタツズマブ・ボガトクス(Citatuzumab bogatox)、シクツムマブ(Cixutumumab)、クラキズマブ(Clazakizumab)、クレノリキシマブ(Clenoliximab)、クリバツズマブ・テトラセタン(Clivatuzumab tetraxetan)、コナツムマブ(Conatumumab)、コンシズマブ(Concizumab)、クレネズマブ(Crenezumab)、ダセツズマブ(Dacetuzumab)、ダクリズマブ(Daclizumab)、ダロツズマブ(Dalotuzumab)、ダラツムマブ(Daratumumab)、デムシズマブ(Demcizumab)、デノスマブ(Denosumab)、デツモマブ(Detumomab)、ドルリモマブ・アリトクス(Dorlimomab aritox)、ドロジツマブ(Drozitumab)、デュリゴツマブ(Duligotumab)、デュピルマブ(Dupilumab)、デュシジツマブ(Dusigitumab)、エクロメキシマブ(Ecromeximab)、エクリズマブ(Eculizumab)、エドバコマブ(Edobacomab)、エドレコロマブ(Edrecolomab)、エファリズマブ(Efalizumab)、エフングマブ(Efungumab)、エルデルマブ(Eldelumab)、エロツズマブ(Elotuzumab)、エルシリモマブ(Elsilimomab)、エナバツズマブ(Enavatuzumab)、エンリモマブ・ペゴル(Enlimomab pegol)、エノキズマブ(Enokizumab)、エノチクマブ(Enoticumab)、エンシツキシマブ(Ensituximab)、エピツモマブ・シツキセタン(Epitumomab cituxetan)、エプラツズマブ(Epratuzumab)、エルリズマブ(Erlizumab)、エルツマキソマブ(Ertumaxomab)、エタラシズマブ(Etaracizumab)、エトロリズマブ(Etrolizumab)、エボロクマブ(Evolocumab)、エクスビルマブ(Exbivirumab)、ファノレソマブ(Fanolesomab)、ファラリモマブ(Faralimomab)、ファルレツズマブ(Farletuzumab)、ファシヌマブ(Fasinumab)、FBTA05、フェルビズマブ(Felvizumab)、フェザキヌマブ(Fezakinumab)、フィクラツズマブ(Ficlatuzumab)、フィジツムマブ(Figitumumab)、フランボツマブ(Flanvotumab)、フォントリズマブ(Fontolizumab)、フォラルマブ(Foralumab)、フォラビルマブ(Foravirumab)、フレソリムマブ(Fresolimumab)、フルラヌマブ(Fulranumab)、フツキシマブ(Futuximab)、ガリキシマブ(Galiximab)、ガニツマブ(Ganitumab)、ガンネルマブ(Gantenerumab)、ガビリモマブ(Gavilimomab)、ゲムツズマブ・オゾガマイシン(Gemtuzumab ozogamicin)、ゲボキズマブ(Gevokizumab)、ギレンツキシマブ(Girentuximab)、グレムバツムマブ・ベドチン(Glembatumumab vedotin)、ゴリムマブ(Golimumab)、ゴミリキシマブ(Gomiliximab)、グセルクマブ(Guselkumab)、イバリズマブ(Ibalizumab)、イブリツモマブ・チウキセタン(Ibritumomab tiuxetan)、イクルクマブ(Icrucumab)、イゴボマブ(Igovomab)、IMAB362、イムシロマブ(Imciromab)、イムガツズマブ(Imgatuzumab)、インクラクマブ(Inclacumab)、インダツキシマブ・ラブタンシン(Indatuximab ravtansine)、インフリキシマブ(Infliximab)、イノリモマブ(Inolimomab)、イノツズマブ・オゾガマイシン(Inotuzumab ozogamicin)、インテツムマブ(Intetumumab)、イピリムマブ(Ipilimumab)、イラツムマブ(Iratumumab)、イトリズマブ(Itolizumab)、イキセキズマブ(Ixekizumab)、ケリキシマブ(Keliximab)、ラベツズマブ(Labetuzumab)、ラムブロリズマブ(Lambrolizumab)、ラムパリズマブ(Lampalizumab)、レブリキズマブ(Lebrikizumab)、レマレソマブ(Lemalesomab)、レルデリムマブ(Lerdelimumab)、レキサツムマブ(Lexatumumab)、リビビルマブ(Libivirumab)、リゲリズマブ(Ligelizumab)、リンツズマブ(Lintuzumab)、リリルマブ(Lirilumab)、ロデルシズマブ(Lodelcizumab)、ロルボツズマブ・メルタンシン(Lorvotuzumab mertansine)、ルカツムマブ(Lucatumumab)、ルミリキシマブ(Lumiliximab)、マパツムマブ(Mapatumumab)、マージツキシマブ(Margetuximab)、マスリモマブ(Maslimomab)、マツズマブ(Matuzumab)、マブリリムマブ(Mavrilimumab)、メポリズマブ(Mepolizumab)、メテリムマブ(Metelimumab)、ミラツズマブ(Milatuzumab)、ミンレツモマブ、(Minretumomab)ミツモマブ(Mitumomab)、モガムリズマブ(Mogamulizumab)、モロリムマブ(Morolimumab)、モタビズマブ(Motavizumab)、モキセツモマブ・パスドトクス(Moxetumomab pasudotox)、ムロモナブ−CD3(Muromonab−CD3)、ナコロマブ・タフェナトクス(Nacolomab tafenatox)、ナミルマブ(Namilumab)、ナプツモマブ・エスタフェナトクス(Naptumomab estafenatox)、ナルナツマブ(Narnatumab)、ナタリズマブ(Natalizumab)、ネバクマブ(Nebacumab)、ネシツムマブ(Necitumumab)、ネレリモマブ(Nerelimomab)、ネスバクマブ(Nesvacumab)、ニモツズマブ(Nimotuzumab)、ニボルマブ(Nivolumab)、ノフェツモマブ・メルペンタン(Nofetumomab merpentan)、オカラツズマブ(Ocaratuzumab)、オクレリズマブ(Ocrelizumab)、オデュリモマブ(Odulimomab)、オファツムマブ(Ofatumumab)、オララツマブ(Olaratumab)、オロキズマブ(Olokizumab)、オマリズマブ(Omalizumab)、オナルツズマブ(Onartuzumab)、オンツキシズマブ(Ontuxizumab)、オポルツズマブ・モナトクス(Oportuzumab monatox)、オレゴボマブ(Oregovomab)、オルチクマブ(Orticumab)、オテリキシズマブ(Otelixizumab)、オトレルツズマブ(Otlertuzumab)、オキセルマブ(Oxelumab)、オザネズマブ(Ozanezumab)、オゾラリズマブ(Ozoralizumab)、パジバキシマブ(Pagibaximab)、パリビズマブ(Palivizumab)、パニツムマブ(Panitumumab)、パンコマブ(Pankomab)、パノバクマブ(Panobacumab)、パルサツズマブ(Parsatuzumab)、パスコリズマブ(Pascolizumab)、パテクリズマブ(Pateclizumab)、パトリツマブ(Patritumab)、ペムツモマブ(Pemtumomab)、ペラキズマブ(Perakizumab)、ペルツズマブ(Pertuzumab)、ペキセリズマブ(Pexelizumab)、ピジリズマブ(Pidilizumab)、ピナツズマブ・ベドチン(Pinatuzumab vedotin)、ピンツモマブ(Pintumomab)、プラクルマブ(Placulumab)、ポラツズマブ・ベドチン(Polatuzumab vedotin)、ポネズマブ(Ponezumab)、プリリキシマブ(Priliximab)、プリトキサキシマブ(Pritoxaximab)、プリツムマブ(Pritumumab)、PRO140、クイリズマブ(Quilizumab)、ラコツモマブ(Racotumomab)、ラドレツマブ(Radretumab)、ラァフィビルマブ(Rafivirumab)、ラムシルマブ(Ramucirumab)、ラニビズマブ(Ranibizumab)、ラキシバクマブ(Raxibacumab)、レガビルマブ(Regavirumab)、レスリズマブ(Reslizumab)、リロツムマブ(Rilotumumab)、リツキシマブ(Rituximab)、ロバツムマブ(Robatumumab)、ロレデュマブ(Roledumab)、ロモ
ソズマブ(Romosozumab)、ロンタリズマブ(Rontalizumab)、ロベリズマブ(Rovelizumab)、ルプリズマブ(Ruplizumab)、サマリズマブ(Samalizumab)、サリルマブ(Sarilumab)、サツモマブ・ペンデチデ(Satumomab pendetide)、セクキヌマブ(Secukinumab)、セリバンツマブ(Seribantumab)、セトキサキシマブ(Setoxaximab)、セビルマブ(Sevirumab)、SGN−CD19A、SGN−CD33A、シブロツズマブ(Sibrotuzumab)、シファリムマブ(Sifalimumab)、シルツキシマブ(Siltuximab)、シムツズマブ(Simtuzumab)、シプリズマブ(Siplizumab)、シルクマブ(Sirukumab)、ソラネズマブ(Solanezumab)、ソリトマブ(Solitomab)、ソネプシズマブ(Sonepcizumab)、ソンツズマブ(Sontuzumab)、スタムルマブ(Stamulumab)、スレソマブ(Sulesomab)、スビズマブ(Suvizumab)、タバルマブ(Tabalumab)、タカツズマブ・テトラキセタン(Tacatuzumab tetraxetan)、タドシズマブ(Tadocizumab)、タリズマブ(Talizumab)、タネズマブ(Tanezumab)、タプリツモマブ・パプトクス(Taplitumomab paptox)、テフバズマブ(Tefibazumab)、テリモマブ・アリトクス(Telimomab aritox)、テナツモマブ(Tenatumomab)、テネリキシマブ(Teneliximab)、テプリズマブ(Teplizumab)、テプロツムマブ(Teprotumumab)、TGN1412、チシリムマブ(トレメリムマブ)(Ticilimumab(tremelimumab))、チガツズマブ(Tigatuzumab)、チルドラキズマブ(Tildrakizumab)、TNX−650、トシリズマブ(アトリズマブ)(Tocilizumab(atlizumab))、トラリズマブ(Toralizumab)、トシツモマブ(Tositumomab)、トベツマブ(Tovetumab)、トラロキヌマブ(Tralokinumab)、トラスツズマブ(Trastuzumab)、TRBS07、トレガリズマブ(Tregalizumab)、トレメリムマブ(Tremelimumab)、ツコツズマブ・セルモロイキン(Tucotuzumab celmoleukin)、ツビルマブ(Tuvirumab)、ウブリツキシマブ(Ublituximab)、ウレルマブ(Urelumab)、ウルトキサズマブ(Urtoxazumab)、ウステキヌマブ(Ustekinumab)、バンチクツマブ(Vantictumab)、バパリキシマブ(Vapaliximab)、バテリズマブ(Vatelizumab)、ベドリズマブ(Vedolizumab)、ベルツズマブ(Veltuzumab)、ベパリモマブ(Vepalimomab)、ベセンクマブ(Vesencumab)、ビシリズマブ(Visilizumab)、ボロシキシマブ(Volociximab)、ボルセツズマブ・マフォドチン(Vorsetuzumab mafodotin)、ボツムマブ(Votumumab)、ザルツムマブ(Zalutumumab)、ザノリムマブ(Zanolimumab)、ザツキシマブ(Zatuximab)、ジラリムマブ(Ziralimumab)、ゾリモマブ・アリトクス(Zolimomab aritox)を含むがこれらに限定されない。本明細書で説明されている様に、抗体は、標識される又は標識されない場合がある。いくつかの実施形態では、標識は蛍光標識である。治療薬を標識するために本明細書で説明されるシステム、装置、及び方法と共に用いられ得る蛍光標識の例は、インドシアニングリーン(ICG)、クルクミン、ローダミン(ローダミンB、ローダミン123、ローダミン6G、又はこれらの変種など)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ルシフェリン、フルオレセイン、量子ドット、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。

0037

種々の実施形態において、毒素は、α毒素、炭疽菌毒素細菌毒素ジフテリア毒素、外毒素、百日咳毒素志賀毒素志賀様毒素耐熱性エンテロトキシンチャネル形成毒素、マイコトキシンコレラ毒素サソリ毒クロロトキシン、及び/又は破傷風毒素を含むがこれらに限定されない。本明細書で説明されている様に、毒素は、標識される又は標識されない場合がある。いくつかの実施形態では、標識は蛍光標識である。治療薬を標識するために本明細書で説明されるシステム、装置、及び方法と共に用いられ得る蛍光標識の例は、インドシアニングリーン(ICG)、クルクミン、ローダミン(ローダミンB、ローダミン123、ローダミン6G、又はこれらの変種など)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ルシフェリン、フルオレセイン、量子ドット、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。

0038

いくつかの実施形態では、タンパク質(例えば、細胞表面タンパク質)は、本明細書で説明されるシステムを用いて検出されてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞表面マーカに結合される抗体(例えば、標識又は非標識抗体)を用いて検出されてもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質は、関心あるタンパク質に結合するsiRNA(例えば、標識又は非標識siRNA)を用いて検出されてもよい。本明細書で説明されるシステムを用いて検出され得るタンパク質の例は、4−1BB、5T4、腺癌抗原アルファフェトプロテインアネキシン(例えば、アネキシンA1、A2、A5)、BAFF、B−リンパ腫細胞、C242抗原、CA−125、カルボニックアンヒドラーゼ9(CA−IX)、C−MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受容体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNTO888、CTLA−4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、フィブロネクチンエクストラドメイン−B、葉酸受容体1、GD2、GD3ガングリオシドグリコプロテイン75、GPNMB、HER2/neu、HGF、ヒト散乱因子(human scatter factor)受容体キナーゼ、IGF−1受容体、IGF−I、IgG1、L1−CAM、IL−13、IL−6、インスリン様成長因子I受容体、インテグリンα5β1、インテグリンαvβ3、MORAb−009、MS4A1、MUC1、ムチンCanAg、N−グリコリルノイラミン酸、NPC−1C、PDGF−R α、PDL192、ホスファチジルセリン前立腺癌細胞、RANKL、RON、ROR1、SCH900105、SDC1、SLAMF7、TAG−72、テネイシンC、TGFベータ2、TGF−β、TRAIL−R1、TRAIL−R2、腫瘍抗原CTAA16.88、VEGF−A、VEGFR−1、VEGFR2、又はビメンチンを含むがこれらに限定されない。さらなる例は、AOC3(VAP−1)、CAM−3001、CCL11(エオタキシン−1)、CD125、CD147(ベイジン)、CD154(CD40L)、CD2、CD20、CD23(IgE受容体)、CD25(IL−2受容体のα鎖)、CD3、CD4、CD5、IFN−α、IFN−γ、IgE、IgEFc領域、IL−1、IL−12、IL−23、IL−13、IL−17、IL−17A、IL−22、IL−4、IL−5、IL−5、IL−6、IL−6受容体、インテグリンα4、インテグリンα4β7、ラマグラマ(Lama glama)、LFA−1(CD11a)、MEDI−528、ミオスタチン、OX−40、rhuMAb β7、スクレスシン(scleroscin)、SOST、TGFベータ1、TNF−α、VEGF−A、ベータアミロイド、MABT5102A、L−1β、CD3、C5、心筋ミオシン、CD41(インテグリンα−IIb)、フィブリンII、ベータ鎖、ITGB2(CD18)、スフィンゴシン−1−リン酸、炭疽菌毒素、CCR5、CD4、クランピング因子A、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルスグリコプロテインB、内毒素、大腸菌タンパク質、B型肝炎表面抗原B型肝炎ウイルスHIV−1、Hsp90、インフルエンザ血球凝集素リポタイコ酸緑膿菌狂犬病ウイルスグリコプロテイン、呼吸器合胞体ウイルス、TNF−α、ルイスY及びCEA抗原、Tag72、葉酸結合タンパク質、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、タンパク質は標識される。いくつかの実施形態では、標識は蛍光標識である。治療薬を標識するために本明細書で説明されるシステム、装置、及び方法と共に用いられ得る蛍光標識の例は、インドシアニングリーン(ICG)、クルクミン、ローダミン(ローダミンB、ローダミン123、ローダミン6G、又はこれらの変種など)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ルシフェリン、フルオレセイン、量子ドット、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。

0039

方法
励起波長とデマクサの波長分割ビーム分割装置との組み合わせに基づいて、種々の分子の蛍光が分析される場合がある(図4)。例えば、波長350nmでのサンプルの励起とデマクサの適切な波長分割ビーム分割装置により、限定はされないがPLG−GAD(ピリドキサル−5'−リン酸(PLP)グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD))、結合NADH、及び遊離NADHを含む生体分子の蛍光が分析される場合がある。すなわち、波長440nmでのサンプルの励起とデマクサの適切な波長分割ビーム分割装置で、FAD(フラビンアデニンジヌクレオチド)、FMN(フラビンモノヌクレオチド)、及びポルフィリンなどの生体分子の蛍光を分析することができる。

0040

本発明は、本明細書で説明されるTRLIFSシステムを用いて、それを必要とする対象の損傷後の組織生存性を判定するための方法を提供する。この方法は、生体分子から放出される蛍光(例えば、NADH酸還元状態)を測定するために本明細書で説明されるシステムを用いることを含み、蛍光シグナルの変化は組織生存性を示す。いくつかの実施形態では、生体分子の蛍光シグナルの変化は、対照(正常な)対象と比較しての対象の生体分子からの蛍光シグナルの増加である。いくつかの実施形態では、生体分子の蛍光シグナルの変化は、対照(正常な)対象と比較しての対象の生体分子からの蛍光シグナルの減少である。一実施形態では、NADH酸化還元状態の変化は組織生存性を示す。一実施形態では、対象のNADH蛍光の増加は、NADHの蓄積及び低い組織生存性を示す。

0041

本発明はまた、本明細書で説明されるシステムを用いて、それを必要とする対象の細胞代謝をモニタリングするための方法を提供する。この方法は、生体分子から放出される蛍光(例えば、NADH酸化還元状態)を測定するために本明細書で説明されるTRLIFSシステムを用いることを含み、蛍光シグナルの変化は細胞代謝を示す。いくつかの実施形態では、生体分子の蛍光シグナルの変化は、対照(正常な)対象と比較しての対象の生体分子からの蛍光シグナルの増加である。いくつかの実施形態では、生体分子の蛍光シグナルの変化は、対照(正常な)対象と比較しての対象の生体分子からの蛍光シグナルの減少である。一実施形態では、NADH蛍光は、細胞代謝をモニタリングするのに用いられてもよい。細胞代謝は、連続的に又は定期的にモニタリングされてもよい。種々の実施形態において、細胞代謝の連続モニタリングは、例えば、虚血状態での細胞の生存性及び脆弱性、細胞代謝に対する薬剤の効果(例えば、薬剤開発中又は治療濃度域を最適化するため)の評価、及び/又は細胞の代謝状態を判断するためのpHレベルと酸素レベルの同時モニタリングを可能にする。

0042

本明細書で説明されている様に、本発明はまた、本明細書で説明されるTRLIFSシステムを用いて腫瘍を検出するための方法を提供する。

0043

実施例1
細胞代謝の連続モニタリング
本明細書で説明されるシステムは、酸素欠乏神経保護薬の影響などに対応する代謝状態の変化を判断するべく非常に細かいスケールでのNADHレベルの変化の連続モニタリングを可能にする(図1及び図5)。

0044

ニコチンアミドアデノシンジヌクレオチド(NADH)は、好気性呼吸でのATP産生に関する酸化還元反応に関係する。NADHは、解糖及びクエン酸(TCA)サイクル中にミトコンドリアで産生される。NADHは、ミトコンドリア膜でNAD+に酸化されてこのプロセスにおいてATPを産生する。このプロセスは、限定はされないが卒中に起因する虚血を含む状態では中断される。低酸素状態では、細胞内のNADH蓄積と持続的な酸素欠乏が、結果的に細胞死を引き起こし、NADHの完全な分解につながる場合がある。NADHレベルのこれらの変動は、虚血状態での細胞の生存性及び脆弱性の評価を可能にする。NADHレベルの変動は、NADHからの蛍光発光を測定することによって評価されてもよい。NAD+とNADHとの両方は、UVスペクトルでの強い吸収を有するが、それらは蛍光特徴が異なる。NADHは、遊離状態対その結合状態シトクロムへの)に応じて波長440/460nm付近の紫/青色バンドにおいて強い蛍光を呈する。この蛍光のリアルタイムの測定は、NADHレベルの変化のモニタリング、NADHの代謝状態の評価、これにより、細胞代謝のモニタリングを可能にする。

0045

組織を励起するために、400psのパルス幅FWHM)で1KHzで作動する、波長350nmで放出するQスイッチNd:YaGレーザ(Teem Photonics PNVM02510)を使用した。パルスあたりの全エネルギーは5μJを越えず、NADHの光退色を防いだ。励起光は、特注の三つ叉に分岐している光プローブを用いて組織に送達された。プローブは、励起光の送達用の600ミクロン中央ファイバが、蛍光を集光するために12本の200ミクロンファイバで取り囲まれたものであった(図3)。12本の集光ファイバからの一つおきのファイバが一緒束ねられて2つのチャネルを形成した。1つの集光チャネル/バンドルが100msごとに蛍光スペクトルを測定する分光計(Ocean Optics, Maya)に接続され、他のチャネル/バンドルがビームスプリッタ(デマルチプレクサ)に接続された。ビームスプリッタは波長452nmで有意に遊離蛍光と結合蛍光を分離し、これはMCP−PMTと分光計との両方で記録された。

0046

ORで動物屠殺した後でウサギ脳を取り出し、低温酸素豊富に含むクレベリンゲル液中で実験室輸送した。皮質を分離し、組織の生存を保つために95%のO2と5%のCO2との混合ガスを連続的にバブリングしている状態のクレベリンゲル液に入れた。プローブを、図5に示すように蛍光を記録するために組織上に調整した。組織からの蛍光が平衡化され、横ばいになるまで、ベースラインNADH(結合及び遊離)を記録した。およそ30分後に、ミトコンドリア中のシトクロムへのNADHの結合を阻止する計量された分量の50nMのロテノンを加えた。さらなる濃度のロテノンを10分ごとに加えた。

0047

ウサギ脳組織に対するロテノンの種々の濃度の影響を記録した(図6)。結果は、遊離NADHと結合NADHとの両方の濃度をリアルタイムでマッピングし(〜100ms毎)、外部刺激への応答を記録することができることを示した。図6は、2時間以上の時間にわたるNADH蛍光レベルの連続プロットを示す。濃度50nMのロテノンを溶液に加えると、NADHの消費及びその後の蓄積の阻止に起因して予想通りにNADHレベルの増加が観察された。ロテノンの濃度が増加するのに伴い、NADH蛍光が予想通りに増加した。80分間で、液体を通して連続的にバブリングされていたガスが止められ、次いで、再開されて、組織におけるNADHの蓄積に対する低酸素症の影響と、酸素供給復旧した後のその後続する消費の評価を可能にした。これは、本明細書で説明されるTRLIFSシステムが代謝状態をリアルタイムでモニタリングできることを実証した。

0048

実施例2
損傷後の組織生存性の判定
虚血性脳卒中後の脳の広い面積にわたってNADHレベルを記録することは、酸素の欠如によりショック状態にあるかもしれないがアポトーシスされなかった、したがって救出できる、生存可能な細胞の数の評価を可能にする。これらの細胞は半影帯として知られる領域の大半をなし、卒中処置の重要な目標は、できるだけ多くのニューロンを救出しつつ半影帯のサイズを減らすことである。半影帯領域全体にわたるNADHのモニタリングは、このために設計された種々の介入の効果の評価を可能にする。

0049

組織を励起するために、400psのパルス幅(FWHM)で1KHzで作動する、波長350nmで放出するQスイッチNd:YaGレーザ(Teem Photonics PNVM02510)を使用した。パルスあたりの全エネルギーは5μJを越えず、NADHの光退色を防いだ。励起光は、特注の三つ叉に分岐している光プローブを用いて組織に送達された。プローブは、励起光の送達用の600ミクロン中央ファイバが、蛍光を集光するために12本の200ミクロンファイバで取り囲まれたものであった。12本の集光ファイバからの一つおきのファイバが一緒に束ねられて2つのチャネルを形成した。1つの集光チャネル/バンドルが100msごとに蛍光スペクトルを測定する分光計(Ocean Optics, Maya)に接続され、他のチャネル/バンドルがビームスプリッタ(デマルチプレクサ)に接続された。

0050

脳の動脈凝血塊注入することによってウサギ脳に卒中が引き起こされた、ウサギ脳卒中モデルを用いた。ウサギは、神経系の損傷をテストした後で屠殺した。脳を取り出し、低温O2飽和クレベリンゲル液中で実験室に輸送した。実験室で、梗塞を生じた皮質を脳の残りから分離し、95%のO2と5%のCO2との混合ガスをバブリングしている状態のクレベリンゲル液に入れた。皮質の縁からの単一の読取値を記録し、プローブを図7に示すように皮質の表面の上で動かした。組織サンプルから蛍光強度を記録した。組織サンプルをTTC(2,3,5−トリフェニルテトラゾリウム)の溶液に浸し、次いで、生存可能な細胞に吸収されたとき、その細胞が赤くなった。TTCは、現在のところ、細胞の生存性をテストするための最も基準になる検査である。TTCにより染色された組織を記録した蛍光強度と比較した。

0051

健康な組織(図7の赤色に染まった領域)から死んだ組織(図7の染まっていない領域)へのNADH自己蛍光の滑らかな勾配が観察された。TTC染色で見られるように、生存可能な脳組織から死んでいる脳組織への急激な変化ではなく、蛍光強度(図7)は徐々に変化し、死んでいると示された領域における生存可能な細胞の存在を示すことも注目された。

0052

実施例3
血漿中の薬剤/代謝産物レベルを判定するための蛍光の使用
いくつかの抗がん剤は、高い投与量で有毒であり、より低い投与量でそれらの有効性を失う。薬剤が最も効果的である薬剤のこの最適血漿濃度(治療濃度域)は、身長、体重、代謝、及び民族多様性に起因して患者間で異なる。これらの多様性があるにもかかわらず、現在のところ、薬剤投与量は、患者の体重及び標準化された薬物動態プロファイルに基づいて計算される。血漿薬剤レベルを判定する迅速かつ低価格な方法は、個々の患者の投与量の最適化を可能にする。薬剤の血漿レベルは、蛍光分光法を用いて検出されてもよい。メトトレキサートなどの抗がん剤のうちのいくつかは蛍光特性を有することが知られている。本明細書で、出願人らは、本明細書で説明されるTRLIFSシステムを用いて、寒天(図8)中のメトトレキサート(MTX)の濃度を変化させることが、結果的にMTXの蛍光の対応する変化を生じたことを示した。

0053

寒天ゲルを励起するために、400psのパルス幅(FWHM)で1KHzで作動する、波長350nmで放出するQスイッチNd:YaGレーザ(Teem Photonics PNVM02510)を使用した。パルスあたりの全エネルギーは、NADHの光退色を防ぐ5μJを越えなかった。励起光は、特注の三つ叉に分岐している光プローブを用いてゲルに送達された。プローブは、励起光の送達用の600ミクロン中央ファイバが、蛍光を集光するために12本の200ミクロンファイバで取り囲まれたものであった。12本の集光ファイバからの一つおきのファイバが一緒に束ねられて2つのチャネルを形成した。1つの集光チャネル/バンドルが100msごとに蛍光スペクトルを測定する分光計(Ocean Optics, Maya)につながり、他のチャネル/バンドルがビームスプリッタ(デマルチプレクサ)に接続された。

0054

寒天ゲル中でMTXのシリアル希釈(25μg/mlから25ng/mlへ)を調製した。UV光に曝されたときのMTXは、さらなる蛍光型に変換される。UV光に曝されると、蛍光型が蓄積する。蛍光型を検出するために、飽和レベルに達するまで低蛍光型から蛍光型への変換を生じさせた。最終的な蛍光強度を記録し、濃度と比較した。20分のUV露光後のMTXの蛍光強度は、図9に示すように寒天ゲル中のMTXの濃度の良好な指標である。

0055

実施例4
腫瘍の検出
レーザ誘起蛍光分光法(LIFS)は、インビボ診断のための有望な新しい付加的な技術を表す。蛍光分光法は、組織内の内因性フルオロフォア(標識なし)を励起し、発光を記録することに関係する。蛍光分光法は、定常状態又は時間分解蛍光分光法の2通りで採用される。時間分解測定は、蛍光強度の減衰を寿命の観点から分解し、したがって、蛍光強度の減衰の基礎となる動態についてのさらなる情報を提供する。時間分解測定はまた、蛍光強度に影響する場合がある組織内因性フルオロフォア(例えば血液)による吸収、光退色、又は任意の他の状態などの因子から独立している。別個の蛍光分子弛緩動態の差異を反映する蛍光減衰特徴を測定することによって、時間分解測定は、重なるスペクトルを分解する能力を有し、蛍光測定特異性を向上させる。

0056

出願人は、患者において、本明細書で説明されるTR−LIFSシステムが、手術中に神経膠腫高グレード低グレードとの両方)を周囲の正常な脳組織から区別することができることを示す。この研究は、手術中に神経外科医神経病理医チームが腫瘍と正常な脳とを迅速に見分ける能力を高めるためのTR−LIFSの可能性を確立するためである。

0057

機器装備スペクトル分解される蛍光寿命測定を可能にする機器構成実験を行った。装置の光学系及び電子機器回路レイアウトの概略が図1に示される。簡単にいえば、これは、a)励起光源として使用したパルスQスイッチNd:YaGレーザ(Teem Photonics、モデルTeem Photonics PNVM02510、λ=350nm、パルス幅=400psFWHM、パルスレート=1KHz)、b)特注の滅菌可能な三つ叉に分岐している光ファイバプローブ(ニュージャージー州、Fiberguide)、c)随意的な高速前置増幅器(英国Photek製、モデルPA200−10、2GHz)を伴うゲートマルチチャンネルプレート光電子増倍管(MCP−PMT、英国Photek製、モデル210、立ち上がり時間=80ps)、e)デジタイザ(ADQ−108、SPDevices、Sveden、7Gサンプル/秒)、及びf)ラップトップコンピュータ、g)図1に示す特注のデマクサ及び周辺電子装置、からなるものであった。機器は、個々のデバイス収納するように内部が改造された標準内視鏡カート(70×70×150cm3)に収容されているので移動することができた。高電圧供給源及び前置増幅器電源などの使用される電子装置からのノイズレベルを確実に非常に低くするために、すべての機器は、医療グレードの絶縁トランス(Toroid(登録商標) ISB−170A)を用いて主電源から遮蔽される。

0058

送達カテーテル:特注の二叉に分岐している滅菌可能なプローブで光の送達及び集光を行った。プローブは、開口数(NA)0.11のノンソラライジング(non−solarizing)シリカ/シリカステップインデックス型ファイバからなるものであった(ニュージャージー州ニュージャージー、Fiberguide)。これは、12本のコア直径200μmのファイバの集光リングによって取り囲まれるコア直径600μmの中央励起ファイバを有するものであった。すべての集光ファイバを一緒に束ね、組み合わせて、単一の600ミクロンのファイバにした。励起ファイバと集光ファイバとの中心間分離は480μmであった。プローブは、剛性ステンレス鋼管からなる7cmの遠位部以外は、その全長(3メートル)にわたって可撓性であった。これは、プローブの設置及び顕微操作を容易にした。両側部に2つのスリットを有するスペーサをプローブの遠位端の前に追加した。これは、組織から一定の距離を保ちつつプローブが組織と接触することを可能にした。スペーサ上の2つのスリットは、外科医クリア視界を維持するために吸引管を適用することを可能にした。レーザ光は、標準SMコネクタでプローブの照射チャネルに連結され、一方、集光チャネルの遠位端は、分光器への連結を容易にするために直線形に形成された。組織の励起後に、放出された蛍光を収集し、バンドル1によってデマクサの入口スリットに誘導し、バンドル2を介して分光計に誘導した。次いで、シグナルをMCP−PMTによって検出し、高速前置増幅器によって増幅し、最終的にデジタルオシロスコープによって8ビット分解能でデジタル化した。システムの全時間分解能はおよそ150psであった。

0059

光ファイバプローブは、前述のようにプローブの集光効率を最適化するために、かつ、プローブを組織の上で安定させるために、スペーサの助けにより、露出された脳組織試験片の3mm上に位置決めした。各サンプルの時間分解発光を、7つの別個の波長域(355(<365nm))、365〜410nm、415〜450nm、450〜490nm、500〜560nm、560〜600nm、及び>600nm)スペクトル範囲で記録した。サンプルを励起するためのレーザの(ファイバの先端での)エネルギー出力は5.0μJ/パルスに調整した。分光分析後に、正確な部位での組織の生検を行い、病理学検査に送った。

0060

生検サンプルを10%緩衝ホルマリン中に固定した。組織サンプルをスライド上に固定し、H&Eで染色した。すべての生検試験片は、病理学者によって調べられ、元の蛍光分光法測定結果と相互に関連付けられた。組織学的に、神経膠腫は、WHOのグレード分けに基づいて、低グレード:乏突起膠腫オリゴデンドロアストロサイトーマ、びまん性星細胞腫(WHOグレードII)、中グレード:退形成性星細胞腫(WHOグレードIII)、及び高グレード:退形成性乏突起膠腫、退形成性乏突起星細胞腫、及び多形性膠芽腫(グレードIII〜IV)に分類された。この研究での分光学的分類の目的上、神経膠腫は、低グレード神経膠腫(LGG)(グレードI及びII)及び高グレード神経膠腫(HGG)(グレードIII及びIV)としてグループ分けされた。

0061

TR−LIFSデータ分析:TR−LIFSとの関連で、固有蛍光インパルス応答関数(IRF)、h(n)は、蛍光減衰の真の動態を説明する。IRFは、測定された蛍光過渡応答からの測定された入力レーザパルスの数値逆重畳によって回収された。逆重畳のためにラゲール展開技術を用いた。ラゲール展開技術は、一連の理由のために、より従来型多指関数曲線の当てはめを越えて選択された。これは蛍光IRのより速い逆重畳を可能にする。ラゲールの基本は正規直交であるため、これは、減衰関数の独自の完全な展開を提供する。この技術はまたノンパラメトリックであり、したがって、減衰の関数式優先的な仮定を必要としない。その結果、これは、生体組織などの未知の複雑な弛緩動態を有する蛍光システムの近似を可能にする。この方法は、実験的な入力・出力データからの動的システム固有特性の直接回収を可能にする。この技術は、IRFを展開し、ラゲール展開係数LEC)を推定するのに正規直交ラゲール関数を用いる。正規化された蛍光スペクトルは、離散的強度値ピーク発光での強度値で割ることによって得られた。さらに、蛍光減衰の時間的な動態を特徴付けるために、2組のパラメータ、すなわち、1)IRFがその最大値に減衰する補間された時間として計算される平均寿命τλ)、及び、2)対応するLECの正規化された値、を用いた。したがって、発光波長λEの関数としての各サンプルからの蛍光の完全な説明は、離散的な波長での分光学的パラメータの組のバリエーションによって与えられた(発光強度Iλ、蛍光発光の平均寿命τfλ、及びラゲール係数LECf)。この蛍光減衰を特徴付けるための分析的手法は、我々の研究グループによって最近開発され、他で詳細に説明された。出願人らは、寿命及びラゲール係数値を回収することができた。

0062

上述の種々の方法及び技術は、本願を実行する多くの方法を提供する。もちろん、必ずしも説明されたすべての目的又は利点が本明細書で説明される任意の特定の実施形態に従って達成することができるとは限らないことが理解される。したがって、例えば、方法は、必ずしも本明細書で教示又は提案される他の目的又は利点を達成せずに、本明細書で教示される1つの利点又は利点の群を達成する又は最適化する様態で行うことができることを当業者は認識するであろう。種々の代替が本明細書で説明される。いくつかの好ましい実施形態が1つの、別の、又はいくつかの特徴を特異的に含み、一方、他の実施形態が1つの、別の、又はいくつかの特徴を特異的に除外し、一方、さらに他の実施形態が1つの、別の、又はいくつかの有利な特徴を含むことによって特定の特徴を緩和することが理解される。

0063

さらに、当業者は、異なる実施形態からの種々の特徴の適用可能性を認識するであろう。同様に、前述の種々の要素、特徴、及びステップ、並びにこうした要素、特徴、又はステップのそれぞれに関する他の公知の均等物を、本明細書で説明される原理に係る方法を実施するために当業者が種々の組み合わせで用いることができる。種々の要素、特徴、及びステップのうちのいくつかが特異的に含まれ、他のものが様々な実施形態において特異的に除外されることになる。

0064

本願は特定の実施形態及び実施例との関連で開示されているが、本願の実施形態が具体的に開示された実施形態を越えて他の代替的な実施形態及び/又はその使用及び修正及び均等物に延長されることが当業者によって理解されるであろう。

0065

いくつかの実施形態では、本願の特定の実施形態の説明との関連で(特に、以下の請求項の一部との関連で)用いられる「a」、「an」、及び「the」という詞及び類似の言及は、単数形と複数形との両方をカバーすると解釈することができる。本明細書での値の範囲の列挙は、その範囲内に入る各別個の値を個々に言及する簡潔な方法として役立つことだけを意図している。本明細書で他に指定のない限り、個々のそれぞれの値は、本明細書で個々に列挙されたかのように本明細書に組み込まれる。本明細書で説明されるすべての方法は、本明細書で他に指定のない限り或いは文脈によって明らかに相反しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。特定の実施形態に関して本明細書で提供されるいずれかの及びすべての例又は例示的な言語(例えば、「など」)の使用は、本願をよりよく説明することだけを意図しており、別段に特許請求される本願の範囲に制限を課さない。本明細書での文言のいずれも、本願の実施に必須のどのような特許請求されない要素を示すようにも解釈されるべきではない。

0066

本願を実施するための発明者に既知ベストモードを含む本願の好ましい実施形態が本明細書で説明される。上記の説明を読めば当業者にはこれらの好ましい実施形態のバリエーションが明らかとなるであろう。当業者は、こうしたバリエーションを適宜用いることができると考えられ、本願は、本明細書で具体的に説明される以外の様態で実施することができる。したがって、本願の多くの実施形態は、準拠法によって認められる本願に付属の請求項で列挙される事項のすべての修正及び均等物を含む。さらに、本明細書で他に指定のない限り或いは文脈によって明らかに相反しない限り、そのすべての可能なバリエーションでの上述の要素の任意の組み合わせが本願によって包含される。

0067

本明細書で引用される文献、本、仕様書刊行物文書、物、及び/又は同様のものなどのすべての特許、特許出願、特許出願の公開、及び他の資料は、これに関連する任意の実行ファイルヒストリ、本明細書と一致しない又は矛盾するそのいずれか、若しくは本明細書に現在又は後で関連する請求項の最も広い範囲に関して制限する影響を有する場合があるそのいずれかを除いて、あらゆる目的のためにこの引用によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。単なる例として、説明、定義、及び/又は組み込まれた資料のいずれかに関連し、かつ本明細書に関連する用語の使用間に任意の不一致又は矛盾が存在することがあり、本明細書での説明、定義、及び/又は用語の使用が優先するものとする。

0068

本明細書で開示される本願の実施形態は本願の実施形態の原理の例証であることが理解される。採用することができる他の修正は本願の範囲内とすることができる。したがって、単なる例として、限定ではないが、本願の実施形態の代替的な構成を本明細書での教示に従って用いることができる。したがって、本願の実施形態は、図示及び説明されたものに正確に限定されない。

実施例

0069

参考文献
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