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図面 (20)

課題

錐体細胞において遺伝子を発現させるためのポリヌクレオチドカセット発現ベクターおよび方法を提供すること。

解決手段

一局面において、哺乳動物網膜の錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットが提供され、このポリヌクレオチドカセットは、(a)網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、(b)上記プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、(c)ポリアデニル化部位とを含む。

概要

背景

発明の背景
眼の視覚障害は、多くの場合、錐体細胞における公知の一次的欠陥に関する。これらとしては、スタガル黄斑ジストロフィー錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、脊髄小脳失調症7型、およびバルデー・ビード症候群−1などの黄斑ジストロフィー、ならびに1色覚(achromotopsia)、青錐体1色覚(blue cone monochromacy)、1型色覚(protan defect)、2型色覚(deutan defect)、および3型色覚(tritan defect)を含めた色覚障害が挙げられる。

公知の原因が錐体光受容体固有のものである障害に加えて、錐体細胞を標的とすることによって治療することができる中心黄斑の視覚障害が存在する(霊長類の中で)。これらとしては、加齢黄斑変性症、黄斑部毛細血管拡張症網膜色素変性症糖尿病性網膜症網膜静脈閉塞症緑内障ソースビー眼底変性症成人卵黄様黄斑ジストロフィー、ベスト病、およびX連鎖網膜分離症が挙げられる。

既存の治療に関する限定に対処する、眼疾患を治療および防止するための有望な手法は、アデノ随伴ウイルス(AAV)などの遺伝子療法ベクターを用いて治療剤を眼に送達することである。AAVは、4.7kb一本鎖DNAウイルスである。野生型AAVは非病原性であり、いかなる公知の疾患とも病因学的関連がないので、AAVに基づく組換えベクターには優れた臨床的安全性が伴う。さらに、AAVにより、眼、筋肉、および脳を含めた多数の組織への高度に効率的な遺伝子送達および持続的な導入遺伝子発現の可能性がもたらされる。さらに、AAVは、ヒト臨床試験において将来性があることが示されている。1つの例は、レーバー先天黒内障であり、その場合、rAAVベクターの単回網膜下投与によって送達された治療薬を用いた治療を受けた患者では、治療の初日から4年超にわたって治療剤の発現による持続的な臨床的利益が生じた。

概要

錐体細胞において遺伝子を発現させるためのポリヌクレオチドカセット発現ベクターおよび方法を提供すること。一局面において、哺乳動物の網膜の錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットが提供され、このポリヌクレオチドカセットは、(a)網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、(b)上記プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、(c)ポリアデニル化部位とを含む。なし

目的

既存の治療に関する限定に対処する、眼疾患を治療および防止するための有望な手法は、アデノ随伴ウイルス(AAV)などの遺伝子療法ベクターを用いて治療剤を眼に送達することである

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

本明細書に記載の発明。

技術分野

0001

関連出願への相互参照
米国特許法§119(e)にしたがって、この出願は、2014年3月17日に出願された米国仮特許出願第61/954,330号および2015年3月2日に出願された米国仮特許出願第62/127,185号(これらの完全な開示は、参考として本明細書に援用される)の出願日に対する優先権を主張する。

0002

配列表に関する声明
この出願に伴う配列表が、紙でのコピーの代わりにテキストフォーマットで提供され、これは、ここで参考として本明細書に援用される。この配列表を含むテキストファイル名称は、AVBI_005_02WO_ST25.txtである。このテキストファイルは、308KBであり、2015年3月17日に作成されたものであり、そしてEFS−Webを介して電子的に提出される。

0003

発明の分野
本発明は、網膜障害遺伝子療法に関する。

背景技術

0004

発明の背景
眼の視覚障害は、多くの場合、錐体細胞における公知の一次的欠陥に関する。これらとしては、スタガル黄斑ジストロフィー錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、脊髄小脳失調症7型、およびバルデー・ビード症候群−1などの黄斑ジストロフィー、ならびに1色覚(achromotopsia)、青錐体1色覚(blue cone monochromacy)、1型色覚(protan defect)、2型色覚(deutan defect)、および3型色覚(tritan defect)を含めた色覚障害が挙げられる。

0005

公知の原因が錐体光受容体固有のものである障害に加えて、錐体細胞を標的とすることによって治療することができる中心黄斑の視覚障害が存在する(霊長類の中で)。これらとしては、加齢黄斑変性症、黄斑部毛細血管拡張症網膜色素変性症糖尿病性網膜症網膜静脈閉塞症緑内障ソースビー眼底変性症成人卵黄様黄斑ジストロフィー、ベスト病、およびX連鎖網膜分離症が挙げられる。

0006

既存の治療に関する限定に対処する、眼疾患を治療および防止するための有望な手法は、アデノ随伴ウイルス(AAV)などの遺伝子療法ベクターを用いて治療剤を眼に送達することである。AAVは、4.7kb一本鎖DNAウイルスである。野生型AAVは非病原性であり、いかなる公知の疾患とも病因学的関連がないので、AAVに基づく組換えベクターには優れた臨床的安全性が伴う。さらに、AAVにより、眼、筋肉、および脳を含めた多数の組織への高度に効率的な遺伝子送達および持続的な導入遺伝子発現の可能性がもたらされる。さらに、AAVは、ヒト臨床試験において将来性があることが示されている。1つの例は、レーバー先天黒内障であり、その場合、rAAVベクターの単回網膜下投与によって送達された治療薬を用いた治療を受けた患者では、治療の初日から4年超にわたって治療剤の発現による持続的な臨床的利益が生じた。

発明が解決しようとする課題

0007

一般に眼疾患、特に錐体細胞を治療するための遺伝子療法において使用するためのポリヌクレオチドカセットおよび発現ベクターの設計に関して、いくつもの難題が残っている。1つの重要な難題は、標的細胞において、特に網膜の錐体細胞において導入遺伝子の十分な発現を得ることである。遺伝子移入後の導入遺伝子の十分にロバストな発現が当技術分野において長年必要とされており、まだ対処されていない。いくつかの場合には、ある特定のベクター、例えば、プラスミドDNAベクターの有効性に関して、より効率的な発現が必要である。他の場合では、より好都合な安全性プロファイルを有するより低い治療用量または投与のより侵襲性の少ない経路(例えば、硝子体内と網膜下)を可能にするために、より効率的な遺伝子発現カセットが望ましい。いくつかの状況では、効率的な発現は、強力な、遍在するプロモーターを使用して達成されているが、多くの場合、標的細胞型においてのみ発現する核酸発現カセットを使用して高い導入遺伝子発現を得ることが望ましい。

0008

例えば米国特許出願US2012/0172419に開示されている、錐体細胞において導入遺伝子を発現させるための以前の試みでは、いくらかの将来性が示されたが、多くの場合、発現レベルは、最適よりも低かったか細胞特異的ではなかった。いくつもの視覚障害が錐体細胞における一次的欠陥に起因することを考慮すれば、錐体細胞において導入遺伝子を高い発現レベルで特異的に発現させることは、当技術分野における意味のある進歩である。したがって、錐体細胞において遺伝子を発現させるための改善された方法ならびに最適化された核酸カセットおよびベクターが依然として必要とされている。

課題を解決するための手段

0009

本開示は、錐体細胞において遺伝子を発現させるためのポリヌクレオチドカセット、発現ベクターおよび方法を提供する。

0010

本発明の一部の態様では、哺乳動物の網膜の錐体細胞において導入遺伝子を発現させるためのポリヌクレオチドカセットが提供される。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は、増強された発現である。ある特定の実施形態では、コード配列の発現は、配列番号1に作動可能に連結した導入遺伝子の発現よりも大きい。一部の実施形態では、導入遺伝子の発現は錐体特異的なものである。

0011

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、網膜錐体細胞における遺伝子の発現を促進するプロモーター領域と、ポリアデニル化部位とを含む。一部の実施形態では、発現は錐体細胞において特異的なものである。一部のそのような実施形態では、プロモーター領域は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、および配列番号83からなる群より選択される配列、またはその機能性断片に対して85%またはそれ超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、プロモーター領域は、492ヌクレオチド未満の長さである。一部の実施形態では、プロモーター領域は、配列番号55の全長またはその機能性断片に対して85%またはそれ超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列から本質的になる。

0012

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、本明細書では5’UTRと称される、コード配列に対して5’にある非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部のそのような実施形態では、5’UTRは、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、および配列番号89からなる群より選択される配列、またはその断片に対して85%またはそれ超の配列同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、5’UTR配列の一部または全部は、例えば、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号53、配列番号54、配列番号55、または配列番号79に開示されているプロモーター領域に含まれる。一部の実施形態では、5’UTR配列は、プロモーター配列に対して異種性のものである。一部の実施形態では、5’UTRは、配列番号85もしくは配列番号86の全長、またはその断片に対して85%またはそれ超の配列同一性を有する配列から本質的になる。一部の実施形態では、5’UTRは、ポリヌクレオチドATGを含まない。

0013

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットはイントロンを含む。一部のそのような実施形態では、イントロンは、配列番号5、配列番号59、および配列番号60からなる群より選択される配列に対して85%またはそれ超の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の実施形態では、イントロンは、5’UTRをコードするポリヌクレオチド配列内に位置する。

0014

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは翻訳開始配列を含む。一部のそのような実施形態では、翻訳開始配列は、配列番号72または配列番号73から本質的になるポリヌクレオチド配列を含む。

0015

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットはエンハンサー配列を含む。一部のそのような実施形態では、エンハンサー配列は、配列番号52またはその機能性断片に対して85%またはそれ超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、エンハンサー配列は、配列番号51の全長に対して85%またはそれ超の配列同一性を有する配列から本質的になる。

0016

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、プロモーターに作動可能に連結したコード配列を含む。一部の実施形態では、コード配列は、プロモーター領域および/または5’UTR配列に対して異種性である。一部の実施形態では、コード配列は、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、ならびに(i)Thr65Ile(ii)Ile111Val(iii)Ser116Tyr(iv)Leu153Met(v)Ile171Val(vi)Ala174Val(vii)Ile178Val(viii)Ser180Ala(ix)Ile230Thr(x)Ala233Ser(xi)Val236Met(xii)Ile274Val(xiii)Phe275Leu(xiv)Tyr277Phe(xv)Val279Phe(xvi)Thr285Ala(xvii)Pro298Ala、および(xviii)Tyr309Pheからなる群より選択される配列番号11の多形体に対して少なくとも85%、90%、または95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、コード配列は、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、または配列番号71に対して少なくとも85%、90%、または95%の配列同一性を有する。一部の実施形態では、転写開始部位とコード配列の末端との間の配列は、500ヌクレオチド超の長さである導入遺伝子のオープンリーディングフレーム以外のオープンリーディングフレームを含有しない。一部の実施形態では、転写開始部位とコード配列の末端との間の配列は、273ヌクレオチド超の長さである導入遺伝子のオープンリーディングフレーム以外のオープンリーディングフレームを含有しない。一部の実施形態では、転写開始部位とコード配列の末端との間の配列は、250ヌクレオチド超の長さである導入遺伝子のオープンリーディングフレーム以外のオープンリーディングフレームを含有しない。一部の実施形態では、コード配列の少なくとも1つのオープンリーディングフレームが除去されている。

0017

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、網膜錐体細胞における遺伝子の発現を促進するプロモーター領域と、5’非翻訳領域と、イントロンと、翻訳開始配列と、プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、ポリアデニル化部位とを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、遺伝子の発現を網膜錐体細胞において特異的に促進するプロモーター領域と、5’非翻訳領域と、イントロンと、翻訳開始配列と、プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、ポリアデニル化部位とを含む。

0018

本発明の一部の態様では、本発明のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターが提供される。一部の実施形態では、遺伝子送達ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスであり、組換えアデノ随伴ウイルスは、AAVカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、AAVカプシドタンパク質は、野生型AAVカプシドタンパク質である。他の実施形態では、AAVカプシドタンパク質は、改変体AAVカプシドタンパク質である。ある特定の実施形態では、改変体AAVカプシドタンパク質は、LGETTRP(配列番号96)、NETITRP(配列番号97)、KAGQANN(配列番号98)、KDPKTTN(配列番号99)、KDTDTTR(配列番号100)、RAGGSVG(配列番号101)、AVDTTKF(配列番号102)、およびSTGKVPN(配列番号103)からなる群より選択されるAAVGHループ内のペプチド挿入を含む。

0019

本発明の一部の態様では、本発明のポリヌクレオチドカセットおよび医薬賦形剤を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、本発明の遺伝子送達ベクターと医薬賦形剤とを含む。

0020

本発明の一部態様では、錐体細胞において導入遺伝子を発現させるための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、1つまたは複数の錐体細胞に、本発明のポリヌクレオチドカセットまたは本発明の遺伝子送達ベクターを有効量で接触させるステップを含み、導入遺伝子が、1つまたは複数の錐体細胞において検出可能なレベルで発現される。一部の実施形態では、方法は、in vitroにおけるものである。他の実施形態では、方法は、in vivoにおけるものである。ある特定のそのような実施形態では、接触させるステップは、ポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクターを哺乳動物の眼の硝子体内に注射することを含む。他のそのような実施形態では、方法は、ポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクターを哺乳動物の眼の網膜下腔内に注射することを含む。一部の実施形態では、方法は、錐体細胞における導入遺伝子の発現を検出するステップをさらに含み、発現が、錐体細胞の80%またはそれ超で検出される。一部の実施形態では、発現は、錐体細胞に対して特異的である。

0021

本発明の一部の態様では、錐体細胞障害に対する治療または予防を必要とする哺乳動物における錐体細胞障害を治療または予防するための方法が提供される。一部の実施形態では、方法は、哺乳動物の眼に本発明の医薬組成物を有効量で投与するステップを含み、コード配列が治療用遺伝子産物をコードするものである。一部の実施形態では、投与するステップは、医薬組成物を哺乳動物の眼の硝子体内に注射することを含む。他のそのような実施形態では、方法は、医薬組成物を哺乳動物の眼の網膜下腔内に注射することを含む。

0022

一部の実施形態では、錐体細胞障害は、色覚障害である。ある特定の実施形態では、色覚障害は、1色覚、青錐体1色覚、1型色覚、2型色覚、および3型色覚からなる群より選択される。一部のそのような実施形態では、方法は、疾患の症状の変化を検出するステップをさらに含み、変化が、哺乳動物の色を知覚する能力の増大を含む。一部の実施形態では、錐体細胞障害は、黄斑ジストロフィーである。ある特定の実施形態では、黄斑ジストロフィーは、スタルガルト黄斑ジストロフィー、錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、脊髄小脳失調症7型、およびバルデー・ビードル症候群−1からなる群より選択される。一部の実施形態では、錐体細胞障害は、中心黄斑の視覚障害である。ある特定の実施形態では、中心黄斑の視覚障害は、加齢黄斑変性症、黄斑部毛細血管拡張症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、緑内障、ソースビー眼底変性症、成人卵黄様黄斑ジストロフィー、ベスト病、杆体−錐体ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、およびX連鎖性網膜分離症からなる群より選択される。一部のそのような実施形態では、方法は、疾患の症状の変化を検出するステップをさらに含む。一部のそのような実施形態では、変化は、錐体細胞の健康の安定化および/または哺乳動物の視力喪失の速度の低減を含む。特定のそのような実施形態では、変化は、錐体細胞の健康の改善および/または哺乳動物の視力の改善を含む。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
哺乳動物の網膜の錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットであって、
(a)網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、
(b)前記プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、
(c)ポリアデニル化部位と
を含む、ポリヌクレオチドカセット。
(項目2)
前記プロモーター領域が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、および配列番号83からなる群より選択される配列、またはその機能性断片に対して85%またはそれ超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、項目1に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目3)
前記プロモーター領域が、配列番号55の全長またはその機能性断片に対して85%またはそれ超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列から本質的になる、項目2に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目4)
前記コード配列の5’側にある非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド配列を含む、項目1から3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目5)
前記コード配列の5’側にある非翻訳領域をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、および配列番号89からなる群より選択される配列、またはその断片に対して85%またはそれ超の配列同一性を有する配列を含む、項目4に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目6)
前記コード配列の5’側にある前記非翻訳領域が、ポリヌクレオチドATGを含まない、項目4または5に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目7)
前記コード配列の5’側にある非翻訳領域をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号85もしくは配列番号86の全長、またはその断片に対して85%またはそれ超の配列同一性を有する配列から本質的になる、項目4に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目8)
イントロンをさらに含む、項目1から7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目9)
前記イントロンが、配列番号5、配列番号59、および配列番号60からなる群より選択される配列に対して85%またはそれ超の配列同一性を有する配列を含む、項目8に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目10)
前記イントロンが、前記コード配列の5’側にある非翻訳領域をコードする前記ポリヌクレオチド配列内に位置する、項目9に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目11)
翻訳開始配列をさらに含む、項目1から10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目12)
前記翻訳開始配列が、配列番号72または配列番号73から本質的になるポリヌクレオチド配列を含む、項目11に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目13)
配列番号52またはその機能性断片に対して85%またはそれ超の配列同一性を有するエンハンサー配列をさらに含む、項目1から12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目14)
前記エンハンサー配列が、配列番号51の全長に対して85%またはそれ超の配列同一性を有する配列から本質的になる、項目13に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目15)
前記コード配列の発現が、哺乳動物の錐体細胞に導入した際、前記プロモーター領域を配列番号1のプロモーター領域で置き換えた場合の前記コード配列の発現よりも大きい、項目1から14のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目16)
a)AAVカプシドタンパク質と、
b)AAV ITRが隣接した項目1から15までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットと
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)。
(項目17)
項目1から15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットまたは項目16に記載のrAAVと医薬賦形剤とを含む医薬組成物。
(項目18)
錐体細胞において導入遺伝子を発現させるための方法であって、
1つまたは複数の錐体細胞に、項目1から15までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットまたは項目16に記載の組換えアデノ随伴ウイルスを有効量で接触させるステップ
を含み、前記導入遺伝子が、1つまたは複数の前記錐体細胞において検出可能なレベルで発現される、方法。
(項目19)
前記錐体細胞における発現を検出するステップを含み、発現が、前記錐体細胞の60%またはそれ超で検出される、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記導入遺伝子が、錐体細胞において特異的に検出可能なレベルで発現される、項目19に記載の方法。
(項目21)
錐体細胞障害に対する治療または予防を必要とする哺乳動物における錐体細胞障害を治療または予防するための方法であって、前記哺乳動物の眼に項目17に記載の医薬組成物を有効量で投与するステップを含み、コード配列が治療用遺伝子産物をコードするものである、方法。
(項目22)
前記錐体細胞障害が、黄斑ジストロフィー、色覚障害、または中心黄斑の視覚障害である、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記色覚障害が、1色覚、青錐体1色覚、1型色覚、2型色覚、および3型色覚からなる群より選択される、項目22に記載の方法。
(項目24)
疾患の症状の変化を検出するステップをさらに含み、前記変化が、前記哺乳動物の色を知覚する能力の増大を含む、項目22または23に記載の方法。
(項目25)
前記黄斑ジストロフィーが、スタルガルト黄斑ジストロフィー、錐体ジストロフィー、錐体杆体ジストロフィー、脊髄小脳失調症7型、およびバルデー・ビードル症候群−1からなる群より選択される、項目21に記載の方法。
(項目26)
前記中心黄斑の視覚障害が、加齢黄斑変性症、黄斑部毛細血管拡張症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、緑内障、ソースビー眼底変性症、成人卵黄様黄斑ジストロフィー、ベスト病、杆体錐体ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、およびX連鎖性網膜分離症からなる群より選択される、項目21に記載の方法。
(項目27)
疾患の症状の変化を検出するステップをさらに含み、前記変化が、前記哺乳動物の視力喪失の速度の低減を含む、項目25または26に記載の方法。
(項目28)
哺乳動物の網膜の錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットであって、
(a)網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、
(b)前記プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、
(c)ポリアデニル化部位と
を含む、ポリヌクレオチドカセット。
(項目29)
哺乳動物の網膜の錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットであって、
(a)網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、
(b)5’非翻訳領域と、
(c)イントロンと、
(d)翻訳開始配列と、
(e)前記プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と、
(f)ポリアデニル化部位と
を含む、ポリヌクレオチドカセット。
(項目30)
転写開始部位と前記翻訳開始部位との間の配列が、ポリヌクレオチドATGを含有しない、項目28または29に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目31)
前記プロモーター領域が492塩基対未満の長さである、項目28または29に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目32)
前記プロモーター領域を用いた前記コード配列の発現が、配列番号1として列挙されているプロモーター領域を用いた発現よりも大きい、項目28または29に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目33)
転写開始部位と前記コード配列の末端との間の配列が、500ヌクレオチド超の長さである前記導入遺伝子のオープンリーディングフレーム以外のオープンリーディングフレームを含有しない、項目28または29に記載のポリヌクレオチドカセット
(項目34)
転写開始部位と前記コード配列の末端との間の配列が、250ヌクレオチド超の長さである前記導入遺伝子のオープンリーディングフレーム以外のオープンリーディングフレームを含有しない、項目28または29に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目35)
転写開始部位と前記コード配列の末端との間の配列が、100ヌクレオチド超の長さである前記導入遺伝子のオープンリーディングフレーム以外のオープンリーディングフレームを含有しない、項目28または29に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目36)
前記コード配列についてのオープンリーディングフレーム以外に273bp超のオープンリーディングフレームを含有しない、項目28または29に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目37)
前記コード配列が、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、ならびに(i)Thr65Ile(ii)Ile111Val(iii)Ser116Tyr(iv)Leu153Met(v)Ile171Val(vi)Ala174Val(vii)Ile178Val(viii)Ser180Ala(ix)Ile230Thr(x)Ala233Ser(xi)Val236Met(xii)Ile274Val(xiii)Phe275Leu(xiv)Tyr277Phe(xv)Val279Phe(xvi)Thr285Ala(xvii)Pro298Ala、および(xviii)Tyr309Pheからなる群より選択される配列番号11の多形体からなる群より選択されるポリペプチドを含む治療用タンパク質をコードする、項目28または29に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目38)
前記コード配列が、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、および配列番号71からなる群より選択されるポリヌクレオチド、ならびに(i)Thr65Ile(ii)Ile111Val(iii)Ser116Tyr(iv)Leu153Met(v)Ile171Val(vi)Ala174Val(vii)Ile178Val(viii)Ser180Ala(ix)Ile230Thr(x)Ala233Ser(xi)Val236Met(xii)Ile274Val(xiii)Phe275Leu(xiv)Tyr277Phe(xv)Val279Phe(xvi)Thr285Ala(xvii)Pro298Ala、および(xviii)Tyr309Pheからなる群より選択される配列番号11の多形体をコードするポリヌクレオチドを含
む、項目28または29に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目39)
前記プロモーター領域が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号53、配列番号54、および配列番号55からなる群より選択される配列を含む、項目28または29に記載のポリヌクレオチドカセット。
(項目40)
哺乳動物における錐体細胞遺伝子療法のための方法であって、錐体細胞遺伝子療法を必要とする哺乳動物の眼に、
(a)網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、
(b)前記プロモーター領域に作動可能に連結した、治療薬をコードするコード配列とを含むポリヌクレオチドカセットを含む組換え遺伝子送達ベクターを投与するステップを含み、
前記哺乳動物の錐体細胞における前記治療薬のin vivo発現が、錐体細胞遺伝子療法を必要とする前記哺乳動物の治療に役立つ、方法。
(項目41)
哺乳動物における錐体細胞遺伝子療法のための方法であって、錐体細胞遺伝子療法を必要とする前記哺乳動物の眼に、
(a)網膜錐体細胞に特異的なプロモーター領域と、
(b)5’非翻訳領域と、
(c)イントロンと、
(d)翻訳開始配列と、
(e)前記プロモーター領域に作動可能に連結した、治療薬をコードするコード配列とを含むポリヌクレオチドカセットを含む組換え遺伝子送達ベクターを投与するステップを含み、
前記哺乳動物の錐体細胞における前記治療薬のin vivo発現が、錐体細胞遺伝子療法を必要とする前記哺乳動物の治療に役立つ、方法。
(項目42)
前記遺伝子療法が、錐体細胞障害の治療に役立つ、項目40または41に記載の方法。
(項目43)
前記遺伝子療法が、分泌タンパク質の送達に役立つ、項目40または41に記載の方法。
(項目44)
前記イントロンが、配列番号5、配列番号59、および配列番号60からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、項目41に記載の方法。
(項目45)
前記錐体細胞障害が、青錐体1色覚、1型2色覚、2型2色覚、1型3色覚、2型3色覚、1色覚、不完全1色覚、杆体錐体変性症、網膜色素変性症(RP)、黄斑変性症、錐体ジストロフィー、失明、スタルガルト病、およびレーバー先天性黒内障からなる群より選択される、項目42に記載の方法。
(項目46)
前記プロモーターが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号52、配列番号53、配列番号54、および配列番号55からなる群より選択される配列を含む、項目40または41に記載の方法。
(項目47)
前記遺伝子送達ベクターが、前記プロモーターの上流エンハンサーエレメントをさらに含み、前記遺伝子が前記エンハンサーエレメントに作動可能に連結している、項目40または41に記載の方法。
(項目48)
前記遺伝子送達ベクターが、スプライスドナーアクセプター領域を含むイントロンをさらに含み、前記イントロンが、前記プロモーター領域の下流に位置し、かつ遺伝子の上
流に位置する、項目40に記載の方法。
(項目49)
前記コード配列が、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、ならびに:(i)Thr65Ile(ii)Ile111Val(iii)Ser116Tyr(iv)Leu153Met(v)Ile171Val(vi)Ala174Val(vii)Ile178Val(viii)Ser180Ala(ix)Ile230Thr(x)Ala233Ser(xi)Val236Met(xii)Ile274Val(xiii)Phe275Leu(xiv)Tyr277Phe(xv)Val279Phe(xvi)Thr285Ala(xvii)Pro298Ala、および(xviii)Tyr309Pheからなる群より選択される配列番号11の多形体からなる群より選択されるポリペプチドを含む治療用タンパク質をコードする、項目40または41に記載の方法。
(項目50)
前記コード配列が、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、および配列番号71からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む治療用タンパク質をコードする、項目40に記載の方法。
(項目51)
前記遺伝子送達ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)遺伝子送達ベクターを含む、項目40、41または46に記載の方法。
(項目52)
前記哺乳動物において視覚的能力回復させる、項目40、41または46に記載の方法。
(項目53)
前記哺乳動物が、青錐体1色覚、1型2色覚、2型2色覚、1型3色覚、2型3色覚に罹患している霊長類であり、前記霊長類が、前記療法の結果として新しい色を見ることが可能になる、項目40、41または46に記載の方法。
(項目54)
前記プロモーターが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号52、配列番号53、配列番号54、および配列番号55からなる群より選択される配列を含み、遺伝子が、配列番号7、配列番号9、配列番号11、ならびに(i)Thr65Ile(ii)Ile111Val(iii)Ser116Tyr(iv)Leu153Met(v)Ile171Val(vi)Ala174Val(vii)Ile178Val(viii)Ser180Ala(ix)Ile230Thr(x)Ala233Ser(xi)Va1236Met(xii)Ile274Val(xiii)Phe275Leu(xiv)Tyr277Phe(xv)Va1279Phe(xvi)Thr285Ala(xvii)Pro298Ala、および(xviii)Tyr309Pheからなる群より選択される配列番号11の多形体からなる群より選択される配列を含むポリペプチドをコードする、項目40または41に記載の方法。
(項目55)
前記哺乳動物が、光受容体は健康である視覚障害を有する霊長類である、項目40または41に記載の方法。
(項目56)
項目1、28、または29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットを含むパッケージされたウイルス粒子を含む製剤。
(項目57)
項目1、28、または29のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドカセットを用いてトランスフェクトまたは形質導入された組換え宿主細胞

0023

本開示の新規の特色は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載されている。本発明の原理が利用されている例示的な実施形態が記載されている以下の発明の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点がよりよく理解される。

図面の簡単な説明

0024

図1Aは、錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットを示す概略図である。

0025

図1Bは、錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現のためのポリヌクレオチドカセットを含むウイルスベクターを示す概略図である。

0026

図2は、スプライスドナーのコンセンサス配列(A/C)A G G T Pu A G U;枝部位C T Pu A Py;Pyリッチ領域;およびアクセプターN C A G Gを含めた標準的な特徴を含有するイントロンの例を示す図である。

0027

図3Aは、5’UTRmRNA構造の例である(配列番号56)、pR2.1由来の5’UTR mRNA構造(Mancusoら)を示す図である。この5’UTRは、2つの上流AUGおよびオープンリーディングフレーム(ORF)、高レベル塩基対合およびヘアピン構造、ならびにより短いコザック配列を有する。

0028

図3Bは、本開示の最適化されたカセットに由来する5’UTRmRNAおよび構造(配列番号57)の例を示す図である。5’UTRは、上流AUGもORFも含まない。さらに、図3Aの5’UTRと比較して、図3Bの5’UTRは短く、塩基対合が少なく、また、コザック配列がより長い。

0029

図4Aは、コドン最適化前のポリヌクレオチドカセットを示す図である。長さが250ヌクレオチドを超えるオープンリーディングフレーム(ORF)が配列の下に灰色で示されている。

0030

図4Bは、コドン最適化後であるが非導入遺伝子ORF除去前のポリヌクレオチドカセットを示す図である。250ヌクレオチドを超えるORFが配列図の下に灰色で示されている。SV40ポリAから始まり1,365塩基に及ぶ逆方向の新しいORFの導入に留意されたい。

0031

図4Cは、コドン最適化およびORF除去後のポリヌクレオチドカセットを示す図である。250ヌクレオチドを超えるORFが配列図の下に灰色で示されている。配列が最適化されており、したがって、新しく導入されたORFが短縮または除去されていることに留意されたい。

0032

図5は、硝子体内に送達されたAAV2改変体AAV2−7m8が、どのように、硝子体内に送達されたAAV2よりも効率的に霊長類の中心窩および傍中心窩内の網膜細胞に形質導入されるかを例示する図である。AAV2.CMV.GFP(左上);AAV−2.5T.CMV.GFP(右上)(Excoffon K. J.ら、2009年、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106巻:3865〜3870頁);(左下)AAV2−7.8.CMV.GFP(Dalkara Dら、Sci Transl Med. 2013年6月12日;5巻(189号):189ra76);またはAAV−ShH10.CMV.GFP(右下)(KlimczakRRPLoS One. 2009年10月14日;4巻(10号):e7467頁)のベクターゲノム5×1011個を50μLの体積アフリカミドリザル硝子体に注射し、8週間後にin vivoでのOCT蛍光イメージングによってGFP発現を観察した。

0033

図6は、pMNTC調節カセットにより、霊長類の中心窩錐体における遺伝子発現がどのくらいロバストに促進されるかを例示する図である。(a〜b)AAV2−7m8.MNTC.GFPをヒヒの中心硝子体内に注射し、(a)5週間後および(b)8週間後に眼底蛍光によって発現を観察した。(cおよびd)AAV2−7m8.MNTC.GFPを用いた注射のおよそ6カ月後の15ミクロン切片内の、低拡大率(c)および高拡大率(d)での天然のGFP蛍光。

0034

図7は、AAV−送達MNTC.GFPの硝子体内注射後のマウス網膜の錐体におけるロバストかつ錐体特異的な遺伝子発現を例示する図である。(a〜b)マウスがベクターゲノム5.04×1010個の硝子体内注射を硝子体内注射によって受けた11週間後のGFP蛍光の例。(c〜e)注射の14週間後に組織学的検査のために網膜を採取し、錐体外節を、L/Mオプシンに対する抗体を用いて標識した(赤色)。(c)では、赤色チャネルオフにし、したがって、ネイティブなGFPのみが可視であり、(d)は、赤色チャネルをオンにして錐体外節の可視化を可能にした同じ画像である。(c)と(d)の比較により、全てではないにしてもほとんどの錐体がウイルスによって形質導入されたことが示される。(e)錐体光受容体のプロファイルを示す、cおよびdと同じ網膜からの、異なる角度からの画像。

0035

図8は、スナネズミ網膜の錐体における、pMNTC調節カセットによって導かれた遺伝子発現を例示する図である。CMV、pR2.1、またはMNTCプロモーターの制御下でGFPを有するウイルスのベクターゲノム1×1010〜2×1010個を5μL体積でスナネズミの硝子体内に注射し、GFP発現を指定の時点で眼底蛍光イメージングによって可視化した。(a)硝子体内投与の4週間後に可視化した、AAV2−7m8.CMV.GFPおよびAAV2−7m8.MNTC.GFPによって導かれたGFPの発現。スナネズミ12−10、12−11、および12−12にはAAV2−7m8.CMV.GFPを注射し、スナネズミ12−13、12−14、および12−15にはAAV2−7m8.MNTC.GFPを注射した。OD、oculusdexter(右眼)。OS、oculus sinister(左眼)。(b)AAV2−7m8.pR2.1.GFPおよびAAV2−7m8.MNTC.GFPによって導かれたGFPの発現、4週間後および8週間後に眼底蛍光イメージングによって検出した。
図8は、スナネズミ網膜の錐体における、pMNTC調節カセットによって導かれた遺伝子発現を例示する図である。CMV、pR2.1、またはMNTCプロモーターの制御下でGFPを有するウイルスのベクターゲノム1×1010〜2×1010個を5μL体積でスナネズミの硝子体内に注射し、GFP発現を指定の時点で眼底蛍光イメージングによって可視化した。(a)硝子体内投与の4週間後に可視化した、AAV2−7m8.CMV.GFPおよびAAV2−7m8.MNTC.GFPによって導かれたGFPの発現。スナネズミ12−10、12−11、および12−12にはAAV2−7m8.CMV.GFPを注射し、スナネズミ12−13、12−14、および12−15にはAAV2−7m8.MNTC.GFPを注射した。OD、oculus dexter(右眼)。OS、oculus sinister(左眼)。(b)AAV2−7m8.pR2.1.GFPおよびAAV2−7m8.MNTC.GFPによって導かれたGFPの発現、4週間後および8週間後に眼底蛍光イメージングによって検出した。

0036

図9A〜9Dは、pMNTC調節カセットにより、錐体プロモーターpR2.1よりもロバストな、霊長類の中心窩錐体における遺伝子発現がもたらされることを実証する図である。AAV2−7m8.MNTC.GFPまたはAAV2−7m8.pR2.1.GFPのベクターゲノム5×1011個を50μLの体積で示されている通りアフリカミドリザルの硝子体内に注射した(AAV2−7m8.MNTC.GFPを動物271および472に注射し、AAV2−7m8.pR2.1.GFPを動物500および509に注射した)。(a)2週間、(b)4週間、(c)8週間、および(d)12週間の時点で、眼底蛍光カメラ(a、b、c、d)またはHeidelberg SpectralisOCTでの自己蛍光を使用して網膜をGFPについてin vivoにおいて可視化した(a、b;第8週および第12週についてのデータは示していない)。OD、oculusdexter(右眼)。OS、oculus sinister(左眼)。
図9A〜9Dは、pMNTC調節カセットにより、錐体プロモーターpR2.1よりもロバストな、霊長類の中心窩錐体における遺伝子発現がもたらされることを実証する図である。AAV2−7m8.MNTC.GFPまたはAAV2−7m8.pR2.1.GFPのベクターゲノム5×1011個を50μLの体積で示されている通りアフリカミドリザルの硝子体内に注射した(AAV2−7m8.MNTC.GFPを動物271および472に注射し、AAV2−7m8.pR2.1.GFPを動物500および509に注射した)。(a)2週間、(b)4週間、(c)8週間、および(d)12週間の時点で、眼底蛍光カメラ(a、b、c、d)またはHeidelberg Spectralis OCTでの自己蛍光を使用して網膜をGFPについてin vivoにおいて可視化した(a、b;第8週および第12週についてのデータは示していない)。OD、oculus dexter(右眼)。OS、oculus sinister(左眼)。
図9A〜9Dは、pMNTC調節カセットにより、錐体プロモーターpR2.1よりもロバストな、霊長類の中心窩錐体における遺伝子発現がもたらされることを実証する図である。AAV2−7m8.MNTC.GFPまたはAAV2−7m8.pR2.1.GFPのベクターゲノム5×1011個を50μLの体積で示されている通りアフリカミドリザルの硝子体内に注射した(AAV2−7m8.MNTC.GFPを動物271および472に注射し、AAV2−7m8.pR2.1.GFPを動物500および509に注射した)。(a)2週間、(b)4週間、(c)8週間、および(d)12週間の時点で、眼底蛍光カメラ(a、b、c、d)またはHeidelberg Spectralis OCTでの自己蛍光を使用して網膜をGFPについてin vivoにおいて可視化した(a、b;第8週および第12週についてのデータは示していない)。OD、oculus dexter(右眼)。OS、oculus sinister(左眼)。
図9A〜9Dは、pMNTC調節カセットにより、錐体プロモーターpR2.1よりもロバストな、霊長類の中心窩錐体における遺伝子発現がもたらされることを実証する図である。AAV2−7m8.MNTC.GFPまたはAAV2−7m8.pR2.1.GFPのベクターゲノム5×1011個を50μLの体積で示されている通りアフリカミドリザルの硝子体内に注射した(AAV2−7m8.MNTC.GFPを動物271および472に注射し、AAV2−7m8.pR2.1.GFPを動物500および509に注射した)。(a)2週間、(b)4週間、(c)8週間、および(d)12週間の時点で、眼底蛍光カメラ(a、b、c、d)またはHeidelberg Spectralis OCTでの自己蛍光を使用して網膜をGFPについてin vivoにおいて可視化した(a、b;第8週および第12週についてのデータは示していない)。OD、oculus dexter(右眼)。OS、oculus sinister(左眼)。

0037

図10A〜10Dは、最適化されたpMNTCエレメントのそれぞれの、よりロバストな観察された発現への寄与を実証する図である。(a)pMNTC発現カセットおよびpR2.1発現カセット。(b)pMNTC内の各エレメントを1つずつpR2.1内の対応するエレメントで置き換えた実験的な発現カセット。(c、d)注射の(c)4週間後および(d)8週間後にIVISイメージングによって検出された、試験物のそれぞれを硝子体内に注射したスナネズミの網膜におけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現(構築物当たりn=6〜8の眼)。「7M8.CMV」は陽性対照としての機能を果たした。
図10A〜10Dは、最適化されたpMNTCエレメントのそれぞれの、よりロバストな観察された発現への寄与を実証する図である。(a)pMNTC発現カセットおよびpR2.1発現カセット。(b)pMNTC内の各エレメントを1つずつpR2.1内の対応するエレメントで置き換えた実験的な発現カセット。(c、d)注射の(c)4週間後および(d)8週間後にIVISイメージングによって検出された、試験物のそれぞれを硝子体内に注射したスナネズミの網膜におけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現(構築物当たりn=6〜8の眼)。「7M8.CMV」は陽性対照としての機能を果たした。
図10A〜10Dは、最適化されたpMNTCエレメントのそれぞれの、よりロバストな観察された発現への寄与を実証する図である。(a)pMNTC発現カセットおよびpR2.1発現カセット。(b)pMNTC内の各エレメントを1つずつpR2.1内の対応するエレメントで置き換えた実験的な発現カセット。(c、d)注射の(c)4週間後および(d)8週間後にIVISイメージングによって検出された、試験物のそれぞれを硝子体内に注射したスナネズミの網膜におけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現(構築物当たりn=6〜8の眼)。「7M8.CMV」は陽性対照としての機能を果たした。
図10A〜10Dは、最適化されたpMNTCエレメントのそれぞれの、よりロバストな観察された発現への寄与を実証する図である。(a)pMNTC発現カセットおよびpR2.1発現カセット。(b)pMNTC内の各エレメントを1つずつpR2.1内の対応するエレメントで置き換えた実験的な発現カセット。(c、d)注射の(c)4週間後および(d)8週間後にIVISイメージングによって検出された、試験物のそれぞれを硝子体内に注射したスナネズミの網膜におけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現(構築物当たりn=6〜8の眼)。「7M8.CMV」は陽性対照としての機能を果たした。

0038

定義
「ベクター」とは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドを含むまたはポリヌクレオチドと結合し、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用することができる高分子または高分子の結合体(association)を指す。例示的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。

0039

「AAV」という用語は、アデノ随伴ウイルスに対する略語であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用することができる。この用語は、別段の必要性がある場合を除き、全ての亜型、および天然に存在する形態と組換え形態の両方を包含する。「AAV」という用語は、AAV1型(AAV−1)、AAV2型(AAV−2)、AAV3型(AAV−3)、AAV4型(AAV−4)、AAV5型(AAV−5)、AAV6型(AAV−6)、AAV7型(AAV−7)、AAV8型(AAV−8)、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAV、およびヒツジAAVを含む。「霊長類AAV」とは、霊長類に感染するAAVを指し、「非霊長類AAV」とは、非霊長類哺乳動物に感染するAAVを指し、「ウシAAV」とは、ウシ科の哺乳動物に感染するAAVを指す、などである。

0040

「AAVウイルス」または「AAVウイルス粒子」または「rAAVベクター粒子」とは、少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質(典型的には野生型AAVのカプシドタンパク質全て)およびカプシドに包まれた(encapsidated)ポリヌクレオチドrAAVベクターで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド(すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの、野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド)を含む場合、「rAAVベクター粒子」または単に「rAAVベクター」と称されるのが典型的である。したがって、ベクターはrAAV粒子内に含有されるので、rAAV粒子の作製とは、rAAVベクターの作製を必ず含む。

0041

複製欠損」という用語は、本発明のAAVウイルスベクターに対して本明細書で使用される場合、AAVベクターがそのゲノムを独立して複製およびパッケージングすることができないことを意味する。例えば、被験体の細胞にrAAVビリオンを感染させると、感染細胞において異種遺伝子が発現するが、感染細胞はAAV rep遺伝子およびcap遺伝子ならびにアクセサリー機能遺伝子を欠くという事実から、rAAVはそれ以上複製できない。

0042

「AAV改変体」または「AAV変異体」とは、本明細書で使用される場合、a)改変体AAVカプシドタンパク質であって、対応する親AAVカプシドタンパク質に対して少なくとも1つのアミノ酸差異(例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失)を含み、また、対応する、天然に存在するAAVカプシドタンパク質内に存在するアミノ酸配列を含まない親AAVカプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して網膜細胞の感染性の増大を付与するものである、改変体AAVカプシドタンパク質、およびb)異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸で構成されるウイルス粒子を指す。

0043

「rAAV」という略語は、組換えアデノ随伴ウイルスを指し、組換えAAVベクター(または「rAAVベクター」)とも称される。「rAAVベクター」とは、本明細書で使用される場合、AAV起源のものではないポリヌクレオチド配列(すなわち、AAVに対して異種性のポリヌクレオチド)、典型的には細胞の遺伝学形質転換のための目的の配列を含むAAVベクターを指す。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つ、一般には2つのAAV逆位末端反復配列(ITR)が隣接している。rAAVベクターという用語は、rAAVベクター粒子とrAAVベクタープラスミドのどちらも包含する。

0044

本明細書で使用される場合、「遺伝子」または「コード配列」という用語は、in vitroまたはin vivoにおける、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を指す。いくつかの場合には、遺伝子は、コード配列、すなわち遺伝子産物をコードする配列からなるまたはそれから本質的になる。他の場合では、遺伝子は、追加的な非コード配列を含む。例えば、遺伝子は、コード領域の前の領域と後ろの領域、例えば、個々のコードセグメントエクソン)の間の5’非翻訳(5’UTR)または「リーダー」配列および3’UTRまたは「トレーラー」配列、ならびに介在配列(イントロン)を含んでも含まなくてもよい。

0045

本明細書で使用される場合、「治療用遺伝子」とは、発現させると、それが存在する細胞または組織に対して、または当該遺伝子が発現する哺乳動物に対して有益な効果を付与する遺伝子を指す。有益な効果の例としては、状態もしくは疾患の徴候もしくは症状の寛解、状態もしくは疾患の防止もしくは阻害、または所望の特性の付与が挙げられる。治療用遺伝子としては、細胞または哺乳動物における遺伝的欠損補正する遺伝子が挙げられる。

0046

本明細書で使用される場合、導入遺伝子とは、ベクターによって細胞に送達される遺伝子である。

0047

本明細書で使用される場合、「遺伝子産物」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質または低分子干渉RNA(siRNA)、miRNAもしくは低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を含めた干渉RNAなどの、ポリヌクレオチド配列の所望の発現産物を指す。

0048

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。この用語は、修飾、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化脂質付加リン酸化、または標識構成成分とのコンジュゲーションがなされたアミノ酸のポリマーも包含する。

0049

「含む」とは、列挙された要素が、例えば、組成物、方法、キットなどに必要であるが、例えば、特許請求の範囲内に入る組成物、方法、キットなどを形成するために他の要素が含まれていてもよいことを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結した治療用ポリペプチドをコードする遺伝子を「含む」発現カセットは、遺伝子およびプロモーターに加えて、他の要素、例えば、ポリ−アデニル化配列、エンハンサーエレメント、他の遺伝子、リンカードメインなどを含み得る発現カセットである。

0050

「から本質的になる」とは、記載されている、例えば、組成物、方法、キットなどの範囲が、例えば、組成物、方法、キットなどの基本的な特性および新規の特性に実質的な影響を及ぼさない指定の材料またはステップに限定されることを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結した治療用ポリペプチドをコードする遺伝子およびポリアデニル化配列「から本質的になる」発現カセットは、遺伝子の転写または翻訳に実質的な影響を及ぼさない限りは、追加的な配列、例えば、リンカー配列を含んでよい。別の例として、列挙された配列「から本質的になる」改変体、または変異体、ポリペプチド断片は、それが由来する全長のナイーブなポリペプチドに基づいて配列の境界に、列挙された配列のアミノ酸配列プラスまたはマイナス約10アミノ酸残基、例えば、列挙された結合アミノ酸残基よりも10、9、8、7、6、5、4、3、2または1残基少ない、または列挙された結合アミノ酸残基よりも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10残基多いアミノ酸残基を有する。

0051

「からなる」とは、組成物、方法、またはキットから、特許請求の範囲において指定されていないあらゆる要素、ステップ、または成分が排除されることを意味する。例えば、プロモーターに作動可能に連結した治療用ポリペプチドをコードする遺伝子、およびポリアデニル化配列「からなる」発現カセットは、プロモーター、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、およびポリアデニル化配列のみからなる。別の例として、列挙された配列「からなる」ポリペプチドは、列挙された配列のみを含有する。

0052

本明細書で使用される場合、「配列同一性」例えば、「%配列同一性」という用語は、ヌクレオチド配列アラインメントプログラムを使用してアラインメントしたときの2つまたはそれ超のポリヌクレオチドの間、またはアミノ酸配列アラインメントプログラムを使用してアラインメントしたときの2つまたはそれ超のポリペプチド配列の間の同一性の程度を指す。同様に、「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、2つまたはそれ超のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関して本明細書で使用される場合、例えば、配列比較アルゴリズム、例えばSmith−Watermanアルゴリズムなどを使用して、または目視検査によって測定して、最大の対応について比較およびアラインメントしたときに同じまたは指定の百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する2つの配列を指す。例えば、2つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、GCソフトウェアパッケージ内のGAPプログラム組み入れられたNeedlemanおよびWunsch(1970年、J. Mol. Biol. 48巻:444〜453頁)アルゴリズムを使用し、Blossum62行列またはPAM250行列のいずれか、ならびにギャップ重みづけ(gap weight)16、14、12、10、8、6、または4および長さ重みづけ(length weight)1、2、3、4、5、または6を使用して決定することができる。別の例として、2つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ内のGAPプログラムを使用して、NWSgapdna.CMP行列ならびにギャップ重みづけ40、50、60、70、または80および長さ重みづけ1、2、3、4、5、または6を使用して決定することができる。特に好ましいパラメータのセット(そして別段の指定がない限り使用されるべきもの)は、ギャップペナルティ(gap penalty)12、ギャップ伸長ペナルティ(gap extend penalty)4、およびフレームシフトギャップペナルティ(frameshift gap penalty)5を用いたBlossum62スコアリング行列である。2つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み入れられたE. MeyersおよびW. Miller(1989年、Cabios、4巻:11〜17頁)のアルゴリズムを使用し、PAM120重み付け基表(weight residue table)、ギャップ長ペナルティ(gap length penalty)12およびギャップペナルティ4を使用して決定することもできる。例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定するために公共のデータベースに対する検索を実施するための「クエリ配列」として本明細書に記載の核酸およびタンパク質配列を使用することができる。そのような検索は、Altschulら(1990年、J. Mol. Biol、215巻:403〜10頁)のNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)を使用して実施することができる。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長(wordlength)=12を用いて実施して、本発明の核酸分子相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて実施して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較する目的でギャップを挿入したアラインメントを得るために、Altschulら(1997年、Nucleic AcidsRes、25巻:3389〜3402頁)に記載のGapped BLASTを利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)の初期設定のパラメータを使用することができる。

0053

「%相同性」という用語は、本明細書では、本明細書の「%同一性」という用語と互換的に使用され、配列アラインメントプログラムを使用してアラインメントしたときの2つまたはそれ超のアラインメントされた配列の間の核酸またはアミノ酸配列同一性のレベルを指す。例えば、本明細書で使用される場合、80%相同性とは、規定のアルゴリズムによって決定された80%配列同一性と同じことを意味し、したがって、所与の配列の相同体は、所与の配列の長さにわたって80%超の配列同一性を有する。

0054

本明細書で使用される場合、「相補物」および「相補的」という用語は、逆平行のヌクレオチド配列内の相補的な塩基残基の間で水素結合が形成されると互いと対形成することが可能な2つの逆平行のヌクレオチド配列を指す。例えば、shRNAは、標的配列に対して相補的、すなわち、100%相補的、または実質的に相補的、例えば、80%相補的、85%相補的、90%相補的、95%相補的、98%相補的、またはそれ超相補的であり得る。「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞における内在性遺伝子、導入遺伝子またはコード配列の転写および/または翻訳を包含する。

0055

「発現ベクター」とは、本明細書で使用される場合、目的の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む上記のまたは当技術分野で公知のベクター、例えば、プラスミド、ミニサークル(minicircle)、ウイルスベクター、リポソームなどを包含し、意図された標的細胞において遺伝子産物の発現をもたらすために使用されるものである。発現ベクターはまた、標的における遺伝子産物の発現を容易にするための、コード領域に作動可能に連結した制御エレメントも含む。制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、UTR、miRNAターゲティング配列などと、発現のために作動可能に連結した遺伝子(複数可)の組合せは、時には、「発現カセット」と称される。そのような制御エレメントは多く公知であり、当技術分野において入手可能である、または当技術分野において入手可能な構成成分から容易に構築することができる。

0056

「プロモーター」とは、本明細書で使用される場合、RNAポリメラーゼの結合を導き、それにより、RNA合成を促進するDNA配列、すなわち、転写を導くために十分な最小の配列を包含する。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は、遍在する、つまり、広範囲の細胞、組織および種において強力に活性なものであってもよく、細胞型特異的、組織特異的、または種特異的なものであってもよい。プロモーターは、「構成的」、つまり、継続的に活性なものであってもよく、「誘導性」、つまり、生物要因または非生物要因の有無によって活性化または非活性化されるものであってよい。プロモーター配列と連続していてもしてなくてもよいエンハンサー配列も本発明の核酸構築物またはベクターに含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存性遺伝子発現に影響を及ぼすものであり、ネイティブな遺伝子の5’領域または3’領域に位置してよい。

0057

「エンハンサー」とは、本明細書で使用される場合、隣接する遺伝子の転写を刺激または阻害するシス作用性エレメントを包含する。転写を阻害するエンハンサーは「サイレンサー」とも称される。エンハンサーは、コード配列から、および転写される領域の下流の位置から、数キロベース対(kb)までの距離にわたって、いずれの方向にも機能し得る(すなわち、コード配列と結び付けることができる)。

0058

終結シグナル配列」とは、本明細書で使用される場合、例えば、ポリアデニル化シグナル配列などの、RNAポリメラーゼに転写を終結させる任意の遺伝子エレメントを包含する。

0059

「ポリアデニル化シグナル配列」とは、本明細書で使用される場合、後にポリアデニル化コンセンサス配列AATAAAが続く、RNA転写物エンドヌクレアーゼ切断に必要な認識領域を包含する。ポリアデニル化シグナル配列により、「ポリA部位」、すなわち、転写後ポリアデニル化によってアデニン残基が付加されるRNA転写物上の部位がもたらされる。

0060

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結(operatively linked)」または「作動可能に連結(operably linked)」という用語は、遺伝子エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル配列、ポリアデニル化配列などが近位にあり、当該エレメントが予測された様式で作動することが可能な関係にあることを指す。例えば、プロモーターによりコード配列の転写の開始が補助される場合、プロモーターは、コード領域に作動可能に連結している。この機能的な関係が維持される限りは、プロモーターとコード領域との間に残基が介在してもよい。本明細書で使用される場合、「異種性」という用語は、比較されている実体の残りとは遺伝子型として別個の実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技法によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。別の例として、そのネイティブなコード配列から取り出され、天然には連結して見いだされないコード配列に作動可能に連結したプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むrAAVは、天然に存在する、野生型AAVには通常含まれない核酸を含むrAAVであり、コードされる異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型AAVによって通常はコードされない遺伝子産物である。

0061

内在性」という用語は、ヌクレオチド分子または遺伝子産物を参照して本明細書で使用される場合、宿主ウイルスまたは細胞において天然に存在するまたはそれに付随する、例えば、遺伝子または遺伝子エレメント、または遺伝子産物、例えば、RNA、タンパク質を指す。

0062

「ネイティブ」という用語は、本明細書で使用される場合、野生型ウイルスまたは細胞に存在するヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、または遺伝子産物、例えば、RNA、タンパク質を指す。「改変体」という用語は、本明細書で使用される場合、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列、例えば、ネイティブなポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の変異体、すなわち、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して100%未満の配列同一性を有するものを指す。言い換えると、改変体は、参照ポリヌクレオチド配列、例えば、ネイティブなポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも1つのアミノ酸の差異(例えば、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失)を含む。例えば、改変体は、全長のネイティブなポリヌクレオチド配列に対して70%またはそれ超の配列同一性、全長のネイティブなポリヌクレオチド配列に対して、例えば、75%または80%またはそれ超の同一性、例えば、85%、90%、または95%またはそれ超、例えば、98%または99%の同一性などを有するポリヌクレオチドであってよい。別の例として、改変体は、全長のネイティブなポリペプチド配列に対して70%またはそれ超の配列同一性、例えば、75%または80%またはそれ超、例えば、85%、90%、または95%またはそれ超の同一性など、例えば、全長のネイティブなポリペプチド配列に対して98%または99%の同一性を有するポリペプチドであってよい。改変体は、参照、例えば、ネイティブな配列の断片と70%またはそれ超の配列同一性、例えば、ネイティブな配列と75%または80%またはそれ超、例えば、85%、90%、または95%またはそれ超、例えば、98%または99%同一性などの同一性を共有する参照、例えば、ネイティブな配列の改変体断片も含み得る。

0063

本明細書で使用される場合、「生物活性」および「生物活性のある」という用語は、細胞内の特定の生物学的エレメントに帰する活性を指す。例えば、「免疫グロブリン」、「抗体」またはその断片もしくは改変体の「生物活性」とは、抗原性決定因子に結合し、それにより、免疫学的機能を促進する能力を指す。別の例として、ポリペプチドまたはその機能性断片もしくは改変体の生物活性とは、ポリペプチドまたはその機能性断片もしくは改変体の、例えば、結合、酵素活性などのネイティブな機能を行う能力を指す。第3の例として、遺伝子調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、コザック配列などの生物活性とは、調節エレメントまたはその機能性断片もしくは改変体の、それぞれ、作動可能に連結した遺伝子の発現の翻訳を調節する、すなわち、促進する、増強する、または活性化する能力を指す。

0064

「投与」または「導入」という用語は、本明細書で使用される場合、組換えタンパク質を発現させるためのベクターを細胞に、被験体の細胞および/もしくは器官に、または被験体に送達することを指す。そのような投与または導入は、in vivo、in vitroまたはex vivoで行うことができる。遺伝子産物を発現させるためのベクターは、典型的には、異種DNAを物理的手段(例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション電気穿孔微量注射またはリポフェクション)によって細胞に挿入することを意味するトランスフェクション;典型的には、感染因子、すなわちウイルスによって導入することを指す感染;または、典型的には、細胞にウイルスを安定に感染させることまたは1つの微生物から別の微生物にウイルス性因子(例えば、バクテリオファージ)によって遺伝物質移入すること意味する形質導入によって細胞に導入することができる。

0065

「形質転換」とは、典型的には、異種DNAを含む細菌または癌遺伝子を発現し、したがって、継続的な成長モードに変換されている細胞(腫瘍細胞など)を指すために使用される。細胞を「形質転換する」ために使用されるベクターは、プラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルであり得る。

0066

典型的には、細胞は、異種DNA(すなわち、ベクター)を細胞に投与、導入または挿入するために使用される手段に応じて、「形質導入された」、「感染した」;「トランスフェクトされた」または「形質転換された」と称される。「形質導入された」、「トランスフェクトされた」および「形質転換された」という用語は、本明細書では、異種DNAの導入方法にかかわらず互換的に使用することができる。

0067

宿主細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、ベクターを用いて形質導入、感染、トランスフェクトまたは形質転換された細胞を指す。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどであってよい。例えば温度、pHなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前使用されたものであり、当業者には明らかになるであろう。「宿主細胞」という用語は、元の形質導入、感染、トランスフェクトまたは形質転換された細胞、およびその後代を指すことが理解されよう。

0068

「治療」、「治療すること」などの用語は、本明細書において、一般に、所望の薬理的効果および/または生理的効果を得ることを意味するように使用される。効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止すること、例えば、被験体において疾患またはその症状が起こる可能性を低減させることに関して予防的なものであってよく、かつ/または、疾患および/もしくは疾患に起因する有害作用に対する部分的なまたは完全な治癒に関して治療的であってよい。「治療」とは、本明細書で使用される場合、哺乳動物における疾患の任意の治療を包含し、(a)疾患の素因があり得るが、今のところはまだそれを有すると診断されていない被験体において疾患が生じることを防止すること;(b)疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること;または(c)疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを含む。治療剤は、疾患または傷害の発生の前、その間、またはその後に投与することができる。治療により患者の望ましくない臨床症状が安定化するまたは低減するような、進行中の疾患の治療が特に興味深い。そのような治療は、罹患組織が完全に機能喪失する前に行うことが望ましい。主題の療法は、疾患の症候性の段階において、いくつかの場合には疾患の症候性の段階の後に施されることが望ましい。

0069

「個体」、「宿主」、「被験体」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、これだけに限定されないが、サルおよびヒトを含めたヒトおよび非ヒト霊長類;哺乳動物の競技動物(例えば、ウマ);哺乳動物の農場動物(例えば、ヒツジ、ヤギなど);哺乳動物の愛玩動物(イヌ、ネコなど);およびげっ歯類(例えば、マウス、ラットなど)を含めた哺乳動物を指す。

0070

本発明の種々の組成物および方法が下に記載されている。本明細書には特定の組成物および方法が例示されているが、いくつもの代替的な組成物および方法が本発明の実施の使用に適用可能であり、適切であることが理解される。本発明の発現構築物および方法の評価は、当技術分野において標準の手順を使用して行うことができることも理解されよう。

0071

本発明の実施では、別段の指定のない限り、当業者の技術の範囲内に入る、細胞生物学分子生物学(組換え技法を含む)、微生物学生化学および免疫学の従来の技法を用いる。そのような技法は、それぞれが参照により本明細書に明白に組み込まれる、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2版(Sambrookら、1989年);「Oligonucleotide Synthesis」(M. J. Gait編、1984年);「Animal Cell Culture」(R. I. Freshney編、1987年);「Methodsin Enzymology」(Academic Press, Inc.);「Handbook of Experimental Immunology」(D. M. Weir & C. C. Blackwell編);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J. M. Miller & M. P. Calos編、1987年);「Current Protocols in Molecular Biology」(F. M. Ausubelら編、1987年);「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編、1994年);および「Current Protocols in Immunology」(J. E. Coliganら編、1991年)などの文献において十分に説明されている。

0072

本発明のいくつかの態様が例示のために適用の例を参照して下に記載されている。多数の特定の詳細、関係、および方法は、本発明の完全な理解をもたらすために記載されていることが理解されるべきである。しかし、本発明は、特定の詳細のうちの1つまたは複数を伴わずにまたは他の方法を用いて実施できることは関連分野の当業者には容易に理解されよう。本発明は、例示されている行為または事象順序に限定されず、いくつかの行為は他の行為または事象と異なる順序で、かつ/またはそれと同時になされ得る。さらに、例示された行為または事象の全てが本発明による方法体系を実行するために必要であるとは限らない。

0073

本明細書において使用される用語法は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本発明を限定するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、複数の形態も同様に含むものとする。さらに、「含む(including)」、「含む(includes)」、「有する(having)」、「有する(has)」、「有する(with)」という用語またはその変形が発明の詳細な説明および/または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用されている限りでは、そのような用語は、「含む(comprising)」という用語と同様に、包括的なものとする。

0074

「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定される特定の値に対する許容される誤差範囲内に入ることを意味し、許容される誤差範囲は、一部において、どのように値を測定または決定するか、つまり、測定システム限界に依存する。例えば、「約」とは、当技術分野における実施に従って、1または1超の標準偏差の範囲内を意味し得る。あるいは、「約」とは、所与の値の20%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%まで、およびより好ましくはさらに1%までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の1桁分の範囲内、好ましくは5倍以内、およびより好ましくは2倍以内を意味し得る。特定の値が出願および特許請求の範囲に記載されている場合、別段の指定のない限り、特定の値について許容される誤差範囲を意味する「約」という用語が想定されているものとする。

0075

本明細書で言及されている全ての刊行物は、引用された刊行物に関連して方法および/または材料を開示し、説明するために参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある限りでは、組み込まれた刊行物のいかなる開示にも本開示が取って代わることが理解される。

0076

特許請求の範囲は、いかなる任意選択の要素も排除するように立案することができることにも留意する。そのように、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」などの排他的な用語の使用、または「否定的」限定の使用の前提としての機能を果たすものとする。

0077

本明細書で考察されている刊行物は、単に、本出願の出願日より前のそれらの開示について提供されている。本明細書におけるいずれも、本発明が、先行発明に基づいてそのような刊行物に先行する権限がないことを容認するとは解釈されない。さらに、示された刊行物の日付は、独立に確認する必要があり得る実際の刊行物の日付とは異なる可能性がある。

0078

別段の指定のない限り、本明細書で使用される用語は全て、当業者にとっての意味と同じ意味を有し、本発明の実施では、当業者の知見の範囲内に入る微生物学および組換えDNA技術の従来の技法を用いる。

0079

発明の詳細な説明
本開示は、錐体細胞において遺伝子を発現させるためのポリヌクレオチドカセットおよび発現ベクターを提供する。例えば、個体における、例えば、錐体細胞障害を治療または予防するための、錐体細胞における遺伝子の発現の促進においてこれらの組成物を使用する方法も提供される。これらおよび他の本発明の目的、利点および特徴は、以下により十分に記載されている組成物および方法の詳細を読めば、当業者には明白になるであろう。

0080

組成物
本開示の一部の態様では、錐体細胞において導入遺伝子を発現させるための組成物が提供される。「錐体細胞」は、本明細書では、「錐体光受容体」または「錐体」とも称され、比較的明るい光の中で最もよく機能する、眼の網膜内の光受容体細胞の亜型を意味する。錐体は、特定の波長の光に対して感受性であり、したがって、色の知覚を支持する。さらに、錐体は、杆体光受容体よりも刺激に対して速く応答し、杆体よりも像内の細かい詳細および迅速な変化を知覚し、したがって、読書運転などの視覚的な細部が最も重要になる活動のために高い視力を維持する。錐体は、網膜の断面において、それらの外節が錐体様形状であることによって容易に同定可能である。錐体はまた、網膜内でのそれらの位置によっても容易に同定可能であり、最も高密度の錐体は、「中心窩(fovea centralis)」または「中心窩(foveal pit)」と称される網膜の黄斑の中心に位置する1.5mmの凹部に存在する。

0081

本開示の一部の実施形態では、錐体細胞における導入遺伝子の発現をもたらす組成物は、ポリヌクレオチドカセットである。「ポリヌクレオチドカセット」とは、2つまたはそれ超のポリヌクレオチド配列、例えば、調節エレメント、翻訳開始配列、コード配列、終結配列などを、典型的には、互いに作動可能に連結して含むポリヌクレオチド配列を意味する。同様に、「錐体細胞において導入遺伝子を発現させるためのポリヌクレオチドカセット」とは、錐体細胞における導入遺伝子の発現を促進する2つまたはそれ超のポリヌクレオチド配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、5’UTR、翻訳開始配列、コード配列、終結配列などの組合せを意味する。

0082

例えば、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
(a)錐体細胞におけるコード配列の発現を促進するプロモーター領域と、
(b)プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と
を含む。
別の例として、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
(a)網膜錐体細胞におけるコード配列の発現を促進するプロモーター領域と、
(b)翻訳開始配列と、
(c)プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と
を含む。
第3の例として、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
(a)網膜錐体細胞におけるコード配列の発現を促進するプロモーター領域と、
(b)5’非翻訳領域と、
(c)翻訳開始配列と、
(d)プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と
を含む。
第4の例として、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
(a)網膜錐体細胞におけるコード配列の発現を促進するプロモーター領域と、
(b)5’非翻訳領域と、
(c)イントロンと、
(d)翻訳開始配列と、
(e)プロモーター領域に作動可能に連結したコード配列と
を含む。
第5の例として、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、
(a)網膜錐体細胞におけるコード配列の発現を促進するプロモーター領域と、
(b)5’非翻訳領域と、
(c)イントロンと、
(d)翻訳開始配列と、
(e)ポリアデニル化配列と
を含む。

0083

一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドカセットにより、錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現がもたらされる。本開示の実用的な実施例によって実証される通り、本発明者らは、錐体細胞における導入遺伝子の増強された発現を個別にかつ相乗的にもたらすいくつものポリヌクレオチドエレメント、すなわち、当技術分野で公知のものと比較して改善されたエレメントを発見した。「増強された」とは、本開示のポリヌクレオチドカセットを有する錐体細胞において、例えば当技術分野で公知の同等の調節エレメントに作動可能に連結した導入遺伝子を有する錐体細胞におけるものと比較して導入遺伝子の発現が増加している、増大している、またはより強力であることを意味する。言い換えると、本開示のポリヌクレオチドカセットからの導入遺伝子の発現は、本開示の1つまたは複数の最適化されたエレメントを含まないポリヌクレオチドカセット、すなわち、参照対照からの発現と比較して増加する、増大する、またはより強力になる。例えば、本明細書に開示されているプロモーターを含むポリヌクレオチドカセットを含む錐体細胞では、例えば当技術分野で公知の異なるプロモーターと作動可能に連結した導入遺伝子を有する錐体細胞におけるものよりも、導入遺伝子の発現が増強される、または増大する、またはより強力になる。別の例として、本明細書に開示されているエンハンサー配列を含むポリヌクレオチドカセットを含む錐体細胞では、異なるエンハンサー配列と作動可能に連結した導入遺伝子を有する錐体細胞におけるものよりも、導入遺伝子の発現が増強される、または増加する、増大する、またはより強力になる。別の例として、本明細書に開示されている5’UTRをコードするポリヌクレオチドカセットを含む錐体細胞では、異なる5’UTRコード配列に作動可能に連結した導入遺伝子を有する錐体細胞におけるものよりも、導入遺伝子の発現が増強される、または増加する、増大する、またはより強力になる。別の例として、本明細書に開示されているイントロンを含むポリヌクレオチドカセットを含む錐体細胞では、当技術分野で公知の異なるイントロン配列に作動可能に連結した導入遺伝子を有する錐体細胞におけるものよりも、導入遺伝子の発現が増強される、または増加する、増大する、またはより強力になる。比較用の参照として使用することができるエレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー配列、5’UTR、およびイントロン)を含む例示的な配列としては、例えば米国特許出願第2013/0317091号に開示されているネイティブなL−オプシンプロモーター(配列番号1)およびその改変体に含まれる配列、合成プロモーターpR2.1(配列番号50)およびその改変体(例えば、pR1.7、pR1.5、pR1.1)に含まれる配列、ならびにIRBP/GNAT2プロモーター(米国特許出願第2014/0275231号)に含まれる配列が挙げられる。

0084

理論に束縛されることを望むものではないが、細胞における導入遺伝子の増強された発現は、細胞において遺伝子産物がより速く蓄積すること、または細胞における遺伝子産物がより安定であることに起因すると考えられる。したがって、本開示のポリヌクレオチドカセットによる導入遺伝子の増強された発現は、いくつものやり方で観察することができる。例えば、増強された発現は、導入遺伝子の発現が、ポリヌクレオチドカセットを錐体細胞と接触させた後、導入遺伝子が例えば当技術分野で公知の同等の調節エレメントに作動可能に連結した場合に検出される発現よりも早く、例えば、7日早く、2週間早く、3週間早く、4週間早く、8週間早く、12週間早く、またはそれ超の期間だけ早く検出されることによって観察することができる。増強された発現は、細胞当たりの遺伝子産物の量が増加することによっても観察することができる。例えば、錐体細胞当たりの遺伝子産物の量が2倍増加もしくはそれ超、例えば、3倍増加もしくはそれ超、4倍増加もしくはそれ超、5倍増加もしくはそれ超、または10倍増加もしくはそれ超増加し得る。増強された発現は、ポリヌクレオチドカセットに保有される導入遺伝子を検出可能なレベルで発現する錐体細胞の数の増加として観察することもできる。例えば、導入遺伝子を検出可能なレベルで発現する錐体細胞の数が2倍増加またはそれ超、例えば、3倍増加もしくはそれ超、4倍増加もしくはそれ超、5倍増加もしくはそれ超、または10倍増加もしくはそれ超増加し得る。別の例として、本発明のポリヌクレオチドにより、従来のポリヌクレオチドカセットと比較してより大きな百分率の細胞において検出可能なレベルの導入遺伝子を促進することができ、例えば、従来のカセットにより、例えば、ある特定の領域内の錐体細胞の5%未満で検出可能なレベルの導入遺伝子発現を促進することができる場合、本発明のポリヌクレオチドでは、その領域内の錐体細胞の5%またはそれ超で検出可能なレベルの発現が促進され、例えば、接触させた錐体細胞の10%またはそれ超、15%またはそれ超、20%またはそれ超、25%またはそれ超、30%またはそれ超、35%またはそれ超、40%またはそれ超、または45%またはそれ超、いくつかの場合には50%またはそれ超、55%またはそれ超;60%またはそれ超、65%またはそれ超、70%またはそれ超、または75%またはそれ超、例えば、80%もしくはそれ超、85%もしくはそれ超、90%もしくはそれ超、または95%またはそれ超で検出可能なレベルの遺伝子産物が発現される。増強された発現は、例えば、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載の、例えば、眼底撮影法、OCT、補償光学(adaptive optics)、cERG色覚検査視力検査などの評価ツールを使用して測定される錐体細胞の生存能力および/または機能の変更として観察することもできる。

0085

本開示のポリヌクレオチドカセットは、典型的には、プロモーター領域を含む。その中の任意の適切なプロモーター領域またはプロモーター配列を、当該プロモーター領域により網膜錐体細胞におけるコード配列の発現が促進される限りは、主題のポリヌクレオチドカセットに使用することができる。一部の実施形態では、プロモーターにより、哺乳動物の網膜錐体細胞、より好ましくは霊長類網膜錐体細胞において、より好ましくはCatarrhini網膜錐体細胞において、なおより好ましくはヒト網膜錐体細胞において、遺伝子の発現が特異的に促進される。「特異的に」とは、プロモーターにより、遺伝子の発現が、標的細胞において他の細胞型と比較して優勢に促進されることを意味する。したがって、例えば、錐体細胞における発現を特異的に促進するプロモーター領域を用いると、主題のポリヌクレオチドカセットを眼に送達した後、発現の50%超、例えば、発現の少なくとも60%、65%、70%または75%もしくはそれ超のいずれか、例えば、遺伝子の発現の少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97%、98%、99%、99.5%、またはそれ超のいずれかが錐体細胞におけるものになる。

0086

例示的な適切なプロモーター領域としては、任意の錐体特異的遺伝子に対するプロモーター領域、例えば、492L−オプシンプロモーター領域(配列番号1)、491L−オプシンプロモーター領域(配列番号53)、496L−オプシンプロモーター領域(配列番号79)、M−オプシンプロモーター領域(配列番号2、配列番号54)、最小M−オプシンプロモーター領域(配列番号55、配列番号93)、本明細書において初めて開示されるコアM−オプシンプロモーター配列(配列番号80)、S−オプシンプロモーター領域(配列番号3)、hRKプロモーター領域、および錐体アレスチンプロモーター領域、または錐体細胞における遺伝子の発現を促進する活性を保持するその部分もしくは改変体などが挙げられる。主題のポリヌクレオチドカセットへの使用が見いだされるプロモーター領域の部分または断片の非限定的な例としては、5’UTRのすぐ上流のプロモーター配列、および当技術分野で公知の転写因子に対する標準的な結合配列が挙げられる。そのような部分または断片は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の都合のよい方法を使用して容易に決定することができる。例えば、配列番号54および配列番号55の5’UTRのすぐ上流のプロモーター配列は、例えば、UCSCゲノムBLATブラウザなどの公的に入手可能なツールを使用して配列番号54のヌクレオチド1〜406または配列番号55のヌクレオチド1〜154から本質的になる配列をin silico評価することによって、または、例えば本明細書の実用的な実施例に記載の通りレポーター遺伝子との作動可能な連結および錐体細胞への導入による経験的な試験によって容易に決定することができる。一部の実施形態では、ベクター内で他のヌクレオチドエレメントに対してより多くの空間がもたらされるので、短いプロモーター配列が長いプロモーター配列よりも好ましい。一部の実施形態では、プロモーター領域は492塩基対未満の長さである。例えば、一部の実施形態では、機能性断片は、配列番号1のヌクレオチド1〜10またはそれ超を含まず、例えば、機能性断片は、配列番号1のヌクレオチド1〜20またはそれ超、ヌクレオチド1〜30またはそれ超、ヌクレオチド1〜40またはそれ超、ヌクレオチド1〜50またはそれ超、例えば、配列番号1のヌクレオチド1〜60またはそれ超、ヌクレオチド1〜70またはそれ超、ヌクレオチド1〜80またはそれ超、ヌクレオチド1〜90またはそれ超、ヌクレオチド1〜100またはそれ超、いくつかの場合には、配列番号1のヌクレオチド1〜120もしくはそれ超、ヌクレオチド1〜140もしくはそれ超、ヌクレオチド1〜160もしくはそれ超、ヌクレオチド1〜180もしくはそれ超、ヌクレオチド1〜200もしくはそれ超、ヌクレオチド1〜220もしくはそれ超、ヌクレオチド1〜240もしくはそれ超、またはおよそヌクレオチド1〜260を含まない。哺乳動物または霊長類の錐体細胞における発現を駆動することが可能なプロモーター領域を同定するための任意の適切な方法を使用して、本開示のポリヌクレオチドカセットへの使用が見いだされるプロモーター領域およびその中のプロモーター配列を同定することができる。

0087

一部の実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットのプロモーター領域は、本明細書に開示されているプロモーター領域、例えば、492L−オプシンプロモーター領域(配列番号1)、491L−オプシンプロモーター領域(配列番号53)、496L−オプシンプロモーター領域(配列番号79)、Mオプシンプロモーター領域(配列番号2、配列番号54)、最小Mオプシンプロモーター領域(配列番号55、配列番号93)、本明細書に開示されているコアM−オプシンプロモーター配列(配列番号80)、またはSオプシンプロモーター領域(配列番号3)、またはその機能性断片もしくは改変体、例えば、上述の配列もしくはその機能性断片に対して、75%またはそれ超、例えば、80%もしくはそれ超、85%もしくはそれ超、90%もしくはそれ超、または95%もしくはそれ超(例えば、80%、85%、90%または95%)の同一性を有する配列のうちの1つを含む。一部の実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットのプロモーター配列は、本明細書に開示されているプロモーター領域、すなわち配列番号1、配列番号53、配列番号79、配列番号2、配列番号54、配列番号55、配列番号93、配列番号80、もしくは配列番号3、またはその機能性断片もしくは改変体、例えば、上述の配列の全長プラスマイナス1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10ヌクレオチド、またはその機能性断片に対して75%もしくはそれ超、例えば、80%もしくはそれ超、85%もしくはそれ超、90%もしくはそれ超、または95%もしくはそれ超(例えば、80%、85%、90%または95%)の同一性を有する配列のうちの1つから本質的になる。一部の実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットのプロモーター領域は、本明細書に開示されているプロモーター領域、すなわち配列番号1、配列番号53、配列番号79、配列番号2、配列番号54、配列番号55、配列番号93、配列番号80、もしくは配列番号3、またはその機能性断片もしくは改変体、例えば、上述の配列の全長またはその機能性断片に対して75%またはそれ超、例えば、80%、85%、90%、95%またはそれ超の同一性を有する配列のうちの1つからなる。ある特定の実施形態では、プロモーター領域は、配列番号74から本質的になる。一部のそのような実施形態では、プロモーター配列は、配列番号80から本質的になる。一部の実施形態では、プロモーターにより、当技術分野で公知の他のプロモーター、例えば、合成プロモーターpR2.1、pR1.7、pR1.1、およびIRBP/GNAT2と比較して、錐体細胞における増強された発現がもたらされる。

0088

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、エンハンサーエレメントをさらに含む。エンハンサーは、転写を増強することが当技術分野で公知の核酸エレメントであり、当該エンハンサーにより調節される遺伝子と関連したどこにでも、例えば、上流、下流、イントロン内などに位置してよい。プロモーターと組み合わせて使用したときに遺伝子の発現を増強するものである限りは、任意のエンハンサーエレメントを本開示のポリヌクレオチドカセットおよび遺伝子療法ベクターに使用することができる。好ましい実施形態では、エンハンサーエレメントは、網膜錐体細胞に対して特異的である、より好ましくは、エンハンサーエレメントは、霊長類網膜錐体細胞、より好ましくはCatarrhini網膜錐体細胞、なおより好ましくはヒト網膜錐体細胞に対して特異的である。「特異的に」とは、エンハンサーにより、標的細胞において他の細胞型と比較して遺伝子の発現が優勢に増強されることを意味する。したがって、例えば、錐体細胞における発現を特異的に増強するエンハンサーを用いると、ベクターを眼に送達した後、発現の50%超、例えば、発現の少なくとも60%、65%、70%、75%またはそれ超のいずれか、例えば、遺伝子の発現の少なくとも80%、および好ましくは85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、97%、98%、99%、99.5%またはそれ超が錐体細胞におけるものになる。

0089

本開示のポリヌクレオチドカセットへの使用が見いだされる例示的なエンハンサー領域としては、エンハンサー活性を保持する、任意の錐体特異的遺伝子またはそれらの断片もしくは改変体に対するエンハンサー領域を含む、それから本質的になる、あるいはそれからなるものが挙げられる。例えば、遺伝子座制御領域(LCR)と称されるL/M最小オプシンエンハンサー(Wangら、1992年、Neuron 9巻:429〜440頁)(配列番号52)を使用して、錐体細胞における遺伝子発現を増強することができ、それが存在しないと、青錐体1色覚が生じる(Nathansら、1989年;Science、245巻:831〜838頁)。LCRは、例えばAAVベクターを用いた遺伝子療法において有用であることが示されている(Liら、Vision Research 48巻(2008年):332〜338頁)。さらに、36bpの「コア」LCR配列から本質的になる機能性断片が、錐体細胞におけるオプシンプロモーターからの発現に必要かつ十分であることが同定されている(Komaromyら Targeting gene expression to cones with human cone opsin promoters in recombinant AAV. Gene
Ther. 2008年;15巻(14号):1049〜55頁)(配列番号51)。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットのエンハンサーは、配列番号51または配列番号52を含む。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットのエンハンサーは、配列番号51または配列番号52から本質的になる。

0090

L/M最小オプシンエンハンサーの1つまたは複数のコピーを含む100ヌクレオチド、200ヌクレオチド、300ヌクレオチド、400ヌクレオチド、500ヌクレオチド、600ヌクレオチド、700ヌクレオチド、800ヌクレオチド、900ヌクレオチド、1000ヌクレオチド、1100ヌクレオチド、1200ヌクレオチド、1300ヌクレオチド、1400ヌクレオチド、1500ヌクレオチド、1600ヌクレオチド、1700ヌクレオチド、1800ヌクレオチド、1900ヌクレオチド、2000ヌクレオチド、またはそれ超のヌクレオチドのL/Mエンハンサーエレメント、および完全なL/Mオプシンエンハンサー、または、遺伝子の発現を錐体特異的な様式で増強する活性を保持するその他の部分もしくは改変体が本組成物に使用される。本明細書における教示に基づいて当業者には理解される通り、霊長類錐体細胞における発現を駆動することが可能なエンハンサー配列を同定するための任意の適切な方法を使用して、そのようなエンハンサーを同定することができる。

0091

プロモーター領域およびエンハンサー領域の長さは、それらの意図された目的に適した任意の長さであってよく、プロモーター領域とエンハンサー領域との間隔は、遺伝子産物の錐体特異的発現を促進するために適した任意の間隔であってよい。種々の好ましい実施形態では、エンハンサーは、プロモーターの0〜1500ヌクレオチド上流;0〜1250ヌクレオチド上流;0〜1000ヌクレオチド上流;0〜750ヌクレオチド上流;0〜600ヌクレオチド上流;0〜500ヌクレオチド上流;0〜400ヌクレオチド上流;0〜300ヌクレオチド上流;0〜200ヌクレオチド上流;0〜100ヌクレオチド上流;0〜90ヌクレオチド上流;0〜80ヌクレオチド上流;0〜70ヌクレオチド上流;0〜60ヌクレオチド上流;0〜50ヌクレオチド上流;0〜40ヌクレオチド上流;0〜30ヌクレオチド上流;0〜20ヌクレオチド上流;または0〜10ヌクレオチド上流に位置する。プロモーターは、コードされる遺伝子から任意の適切な距離だけ上流にあってよい。

0092

一部の実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットは、5’UTRとも称される、5’非翻訳領域をコードする配列、すなわち、コード配列に対して5’にある非翻訳領域をコードするポリヌクレオチド配列を含む。発現カセットにおいて、5’UTRは、転写開始部位とタンパク質翻訳が開始されるコザック配列の間との配列として当技術分野で公知である。5’UTRの二次mRNA構造が転写レベルに影響を及ぼすことが公知である。具体的には、増強された遺伝子発現のために、本発明における5’UTR領域の配列は、二次構造および非効率的なリボソームスキャニングおよび誤った翻訳開始に起因して翻訳効率を低減させることが公知である上流AUG(uAUG)コドンが最小になるまたは回避されるように選択する(Kozak、1995年、PNAS 92巻:2662頁)。Davuluriら、Genome Research、2000年:10巻(11号);1807〜1816頁を参照されたい。例えば、ヒト遺伝子HSP70由来の5’UTR配列(配列番号58)は、おそらくIRES機構に起因した、mRNA翻訳を増強する通常見られない能力が同定されている(Rubtsovaら、2003年、PNAS 278巻(25号):22350〜22356頁;Vivinusら、2001年、Eur J Biochem. 268巻:1908〜1917頁)。任意の5’UTRを使用することができるが、5’UTRの配列は最小の二次的mRNA構造および上流AUG配列を有することが理想的である。言い換えると、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットの転写開始部位と翻訳開始部位との間の配列はポリヌクレオチドATGを含有しない。一部の実施形態では、5’UTRは、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、もしくは配列番号89;またはその機能性断片もしくは改変体、例えば、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、および配列番号89からなる群より選択される配列、もしくはその断片に対して85%またはそれ超の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、あるいはそれからなる。一部の実施形態では、5’UTR配列の一部または全部は、例えば、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号53、配列番号54、配列番号55、または配列番号79に開示されているプロモーター領域に含まれる。他の実施形態では、5’UTRは、プロモーター領域に含まれない;例えば、5’UTR配列をコードしないコアプロモーター配列である配列番号84を参照されたい。一部の実施形態では、5’UTR配列は、プロモーター配列に対して異種性のものである。種々の好ましい実施形態では、UTRの3’末端は、コード配列の0〜20ヌクレオチド上流;0〜15ヌクレオチド上流;0〜10ヌクレオチド上流;0〜9ヌクレオチド上流;0〜8ヌクレオチド上流;0〜7ヌクレオチド上流;0〜6ヌクレオチド上流;または0〜5ヌクレオチド上流であり、UTRの5’末端は、近位のプロモーター領域の0〜20ヌクレオチド下流;0〜15ヌクレオチド下流;0〜10ヌクレオチド下流;0〜9ヌクレオチド下流;0〜8ヌクレオチド下流;0〜7ヌクレオチド下流;0〜6ヌクレオチド下流;または0〜5ヌクレオチド下流である。一部の実施形態では、5’UTRエレメントにより、当技術分野で公知の他の5’UTR、例えば、合成プロモーターpR2.1、pR1.7、pR1.1、およびIRBP/GNAT2に含まれる5’UTRと比較して、錐体細胞における増強された発現がもたらされる。

0093

一部の実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットは、スプライスドナー/アクセプター領域を含むイントロンをさらに含む。一部の実施形態では、イントロンは、プロモーター領域の下流に位置し、遺伝子の翻訳開始配列の上流に位置する、すなわち、イントロンは、5’UTR内に位置する。他の実施形態では、イントロンは、遺伝子の翻訳開始配列の下流に位置する、すなわち、イントロンは、コード配列内に位置する。一般に、当技術分野で公知の通り、イントロンは、RNAに転写され、mRNAプロセシングの間にイントロンスプライシングによって除去されるDNAポリヌクレオチドである。イントロンを含有するポリヌクレオチドカセットは、一般に、イントロンを有さないものよりも高い発現を有する。イントロンにより、発現が2倍〜500倍刺激され得る(BuchmanおよびBerg、1988年、Mol Cel Bio、8巻(10号):4395頁)。効率的にスプライシングされたイントロンは、プレスプライスドナー、枝分かれ部位、およびPyリッチ領域を含有する(Senapathyら、1990年;Meth. Enzymol. 183巻、252〜78頁;WuおよびKrainer、1999年;Mol Cell Biol 19巻(5号):3225〜36頁)。5’イントロンは、一般に、3’末端にあるイントロンと比較して、より効率的である(HuangおよびGorman、1990年;Mol Cell Bio、10巻:1805頁)。一般に、イントロンにより遺伝子発現レベルが上昇することが公知であるが、所与のcDNAの特異的な増加(もしあれば)は経験的なものであり、試験しなければならない。例えば、pSIベクター内のキメライントロンにより、CAT発現は21倍上昇したが、ルシフェラーゼ発現の上昇はわずか3倍であった。

0094

哺乳動物錐体細胞または霊長類錐体細胞において認識されるスプライスドナー/アクセプター領域を含み、したがって得られたmRNA産物からイントロンをスプライシングにより除去することができる限りは、任意のイントロンを主題のポリヌクレオチドカセットに使用することができる。一実施形態では、イントロンは、配列番号5によるSV40イントロンを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。別の実施形態では、イントロンは、pSI(配列番号60)に由来するキメライントロンもしくはその改変体を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。別の実施形態では、イントロンは、CMVイントロンAもしくはその改変体を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。さらに別の実施形態では、イントロンは、pR2.1イントロン(配列番号59)またはその改変体、あるいは、ウサギまたはヒトベータグロビンイントロンまたはその改変体を含む、それから本質的になる、またはそれからなる(Xuら、2001年、Gene 272巻:149頁;Xuら2002年;J Control Rel 81巻:155頁)。一部のそのような実施形態では、イントロンは、配列番号5、配列番号59、および配列番号60からなる群より選択される配列に対して85%またはそれ超の配列同一性を有する配列を含む。典型的には、イントロンは、プロモーター領域および/または5’UTRに対して異種性である。

0095

一部の実施形態では、イントロンは、5’UTR内に存在する。言い換えれば、5’UTRをコードするDNA配列はイントロンDNA配列によって遮られている。例えば、配列番号84である5’UTRのコード配列は、2つの部分、例えば、配列番号85および配列番号86でコードされ、それらの間にイントロン配列があるものであってよい。別の例として、配列番号88である5’UTRのコード配列は、2つの部分、例えば、配列番号89および配列番号73でコードされ、それらの間にイントロン配列があるものであってよい。種々の実施形態では、イントロンの3’末端は遺伝子の0〜20ヌクレオチド上流;0〜15ヌクレオチド上流;0〜10ヌクレオチド上流;0〜9ヌクレオチド上流;0〜8ヌクレオチド上流;0〜7ヌクレオチド上流;0〜6ヌクレオチド上流;または0〜5ヌクレオチド上流であり、イントロンの5’末端は近位のプロモーター領域の0〜20ヌクレオチド下流;0〜15ヌクレオチド下流;0〜10ヌクレオチド下流;0〜9ヌクレオチド下流;0〜8ヌクレオチド下流;0〜7ヌクレオチド下流;0〜6ヌクレオチド下流;または0〜5ヌクレオチド下流である。他の実施形態では、イントロンは、遺伝子のコード配列内に存在する。

0096

一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドカセットは、「コザック配列」または「コザック翻訳開始配列」としても公知の翻訳開始配列を含む。これは、リボソームが付着し、翻訳が開始される核酸配列である。例として、ACCATGG(Kozak、1986年、Cell、44巻:283〜292頁)および(GCC)GCC(A/G)CCATGG(Kozak、1987年、Nucl Acid Res;15巻(20号):8125頁)(配列番号73)が挙げられる。任意の適切なコザック配列をポリヌクレオチドカセットに使用することができ、それは網膜錐体細胞におけるコード配列の発現が増加するように選択することが好ましい。一実施形態では、翻訳開始配列は配列番号72を含む。代替の実施形態では、翻訳開始配列は配列番号73を含む。一部の実施形態では、コザックエレメントにより、当技術分野で公知の他のコザック配列、例えば、合成プロモーターpR2.1、pR1.7、pR1.1、およびIRBP/GNAT2に含まれるコザック配列と比較して、錐体細胞における増強された発現がもたらされる。

0097

本発明の一部の態様では、例えば、遺伝子が細胞の生存能力および/または機能に対して有する効果を決定するために、錐体細胞障害を治療するなどのために、主題のポリヌクレオチドカセットを使用して遺伝子を動物の錐体細胞に送達する。したがって、一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドカセットは、導入遺伝子としてin vitroまたはin vivoにおいて動物の錐体細胞に送達される遺伝子をさらに含む。遺伝子コード配列は、典型的には、主題のポリヌクレオチドカセットのプロモーター領域に作動可能に連結しており、エンハンサーエレメントが存在する例では、主題のポリヌクレオチドカセットのエンハンサーエレメントに作動可能に連結しており、したがって、プロモーターおよび場合によってエンハンサーエレメントにより、被験体の錐体細胞におけるコード配列またはcDNAの発現が促進される。

0098

錐体細胞において発現されるコード配列は、任意のポリヌクレオチド配列、例えば、遺伝子産物をコードする遺伝子またはcDNA、例えば、ポリペプチドまたはRNAに基づく治療薬(siRNA、アンチセンスリボザイム、shRNAなど)であってよい。コード配列は、それが作動可能に連結したプロモーター配列および/または5’UTR配列に対して異種性であってよい、すなわち、天然にはそれと作動可能に結びついていないものであってよい。あるいは、コード配列は、それが作動可能に連結したプロモーター配列および/または5’UTR配列に対して内在性であってよい、すなわち、天然にそのプロモーターまたは5’UTRと結びついたものであってよい。遺伝子産物は、錐体細胞において内因的に作用するものであってもよく、外因性に作用するものであってもよい、例えば、分泌されるものであってもよい。例えば、導入遺伝子が治療用遺伝子である場合、コード配列は、錐体細胞疾患または障害を治療するための治療薬として、または、これだけに限定されないが、4色型色覚の促進を含めた、他の点で視覚を増強するための手段として使用することができる所望の遺伝子産物またはその機能性断片もしくは改変体をコードする任意の遺伝子であってよい。種々の好ましい実施形態では、導入遺伝子は、以下からなる群より選択される治療用タンパク質またはその機能性断片もしくは改変体をコードする:
(a)配列番号7(配列番号6)Homo sapiensオプシン1(錐体色素)、短波長感受性(OPN1SW)、mRNANCBI Reference Sequence:NM_001708.2;
(b)配列番号9(配列番号8)Homo sapiensオプシン1(錐体色素)、中波長感受性(OPN1MW)、mRNA NCBI Reference Sequence:NM_000513.2;
(c)配列番号11(配列番号10)Homo sapiensオプシン1(錐体色素)、長波長感受性(OPN1LW)、mRNA NCBI Reference Sequence:NM_020061.4;
(d)配列番号13(配列番号12)ATP結合性カセット網膜遺伝子(ABCR)遺伝子(NM_000350);
(e)配列番号15(配列番号14)網膜色素上皮に特異的65kDタンパク質遺伝子(RPE65)(NM._000329);
(f)配列番号17(配列番号16)網膜結合性タンパク質1遺伝子(RLBP1)(NM._000326);
(g)配列番号19(配列番号18)ペリフェリン/網膜変性症遅延遺伝子(NM_000322);
(h)配列番号21(配列番号20)アレスチン(SAG)(NM_000541);
(i)配列番号23(配列番号22)アルファトランスデューシン(GNAT1)(NM_000172);
(j)配列番号24グアニル酸シクラーゼ活性因子1A(GUCA1A)(NP_000400.2);
(k)配列番号25 網膜特異的グアニル酸シクラーゼ(GUCY2D)(NP_000171.1);
(l)配列番号26&27 錐体環状ヌクレオチドゲーティング陽イオンチャネルアルファサブユニット(CNGA3)(NP_001073347.1またはNP_001289.1);
(m)配列番号28 ヒト錐体トランスデューシンアルファサブユニット(不完全1色覚(incomplete achromotopsia));
(n)配列番号29 錐体cGMP特異的3’,5’−環状ホスホジエステラーゼサブユニットアルファ’、タンパク質(錐体ジストロフィー4型);
(o)配列番号30網膜錐体ロドプシン感受性cGMP3’,5’−環状ホスホジエステラーゼサブユニットガンマ、タンパク質(網膜錐体ジストロフィー3A型);
(p)配列番号31 錐体杆体ホメオボックス、タンパク質(錐体杆体ジストロフィー);
(q)配列番号32錐体光受容体環状ヌクレオチドゲーティングチャネルベータサブユニット、タンパク質(1色覚);
(r)配列番号33 錐体光受容体cGMPゲーティング陽イオンチャネルベータ−サブユニット、タンパク質(全色盲(total color blindness)、例えば、Pingelapese Islandersの間での);
(s)配列番号35(配列番号34)網膜色素変性症1(常染色体優性)(RP1);
(t)配列番号37(配列番号36)網膜色素変性症GTPアーゼ調節因子相互作用タンパク質1(RPGRIP1);
(u)配列番号39(配列番号38)PRP8;
(v)配列番号41(配列番号40)中心体タンパク質290kDa(CEP290);
(w)配列番号43(配列番号42)IMP(イノシン5’−一リン酸デヒドロゲナーゼ1(IMPDH1)、転写物改変体1;
(x)配列番号45(配列番号44)アリール炭化水素受容体相互作用タンパク質様1(AIPL1)、転写物改変体1;
(y)配列番号47(配列番号46)レチノールデヒドロゲナーゼ12(オールトランス/9−シス/11−シス)(RDH12);
(z)配列番号49(配列番号48)レーバー先天黒内障5(LCA5)、転写物バリアント1;および
(aa)例示的なOPN1LW/OPN1MW2多形体(OPN1LW(Lオプシン)ポリペプチド配列と比較;数字の左側のアミノ酸はLオプシン配列に存在する残基であり、数字はLオプシンにおける残基番号であり、数字の右側の残基はLオプシンからの変異(variation)である。これらの実施形態による多形体は、Thr65Ile;Ile111Val;Ser116Tyr;Leu153Met;Ile171Val;Ala174Val;Ile178Val;Ser180Ala;Ile230Thr;Ala233Ser;Val236Met;Ile274Val;Phe275Leu;Tyr277Phe;Val279Phe;Thr285Ala;Pro298Ala;Tyr309Pheから選択されるアミノ酸置換のうちの1つまたは複数を含み得る;
(ab)追加的なオプシン配列変異1(配列番号61);
(ac)追加的なオプシン配列変異2(配列番号62);
(ad)追加的なオプシン配列変異3(配列番号63);
(ae)追加的なオプシン配列変異4(配列番号64);
(af)追加的なオプシン配列変異5(配列番号65);
(ag)追加的なオプシン配列変異6(配列番号65);
(ah)追加的なオプシン配列変異7(配列番号66);
(ai)追加的なオプシン配列変異8(配列番号67);
(aj)追加的なオプシン配列変異9(配列番号68);
(ak)hCHR2(チャネルロドプシン)(配列番号69);
(al)NpHR(ハロロドプシン)(配列番号70);および
(am)eGFP(配列番号71)。
一部の実施形態では、導入遺伝子によりコードされるコード配列は、上または本明細書に開示されている配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%配列同一性、例えば、少なくとも90%配列同一性、例えば、少なくとも95%配列同一性、少なくとも98%配列同一性、または少なくとも99%配列同一性を有するポリペプチドをコードする。したがって、例えば、コード配列は、OPN1LW、OPNIMW、またはOPN1SWによりコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%同一性、少なくとも98%配列同一性、または少なくとも99%配列同一性を有する錐体オプシンをコードする。一部の実施形態では、コード配列は、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、または配列番号71に対して少なくとも85%、90%、95%、98%または少なくとも99%の配列同一性を有する。

0099

(a)〜(c)および(aa〜aj)に列挙されているタンパク質は全て色覚に関与する。例示的な多形体としては、それらを発現する錐体細胞における色素のスペクトルに影響を及ぼす65位、116位、180位、230位、233位、277位、285位、および309位におけるものが挙げられる。274位、275位、277位、279位、285位、298位および309位は一緒になってLオプシンとMオプシンを区別する。

0100

(d)〜(z)に列挙されているタンパク質は、網膜色素変性症(ポリペプチド「e」〜「l」、「s」〜「y」)、不完全1色覚(ポリペプチド「m」)、スタルガルト(ポリペプチド「d」);レーバー先天黒内障(ポリペプチド「z」);錐体ジストロフィー4型などの錐体ジストロフィー(ポリペプチド「n」);網膜錐体ジストロフィー;例えば、網膜錐体ジストロフィー3A型(ポリペプチド「o」);錐体杆体ジストロフィー(ポリペプチド「p」);1色覚(ポリペプチド「q」);および全色盲、例えば、Pingelapese Islandersの間(ポリペプチド「r」)におけるものなどの、例示的な眼疾患関連遺伝子である。

0101

本発明の一実施形態では、発現を増強するために、導入遺伝子コード配列を、まれに表されるコドンをより頻繁に表されるコドンで置き換えることによって改変または「コドン最適化」する。コード配列は、翻訳のためのアミノ酸をコードするmRNA配列の部分である。翻訳の間、61種のトリヌクレオチドコドンのそれぞれが20種のアミノ酸のうちの1つに翻訳され、それにより、遺伝暗号縮重、または重複性が生じる。しかし、異なる細胞型、および異なる動物種は、同じアミノ酸をコードするtRNA(それぞがアンチコドンを有する)を異なる頻度で利用する。遺伝子配列が、対応するtRNAでまれに表されるコドンを含有する場合、リボソーム翻訳機構は遅くなり、効率的な翻訳が妨げられる可能性がある。特定の種に関する「コドン最適化」によって発現を改善することができ、その場合、コード配列を、同じタンパク質配列をコードするが、高度に表され、かつ/または高度に発現されるヒトタンパク質に利用されるコドンを利用するように変更する(Cid−Arreguiら、2003年;J. Virol. 77巻:4928頁)。本発明の一態様では、導入遺伝子のコード配列を、哺乳動物または霊長類においてまれに発現するコドンが霊長類において頻繁に発現するコドンで置き換えられるように改変する。例えば、一部の実施形態では、導入遺伝子によりコードされるコード配列は、上または本明細書に開示されている配列によりコードされるポリペプチドに対して少なくとも85%配列同一性、例えば、少なくとも90%配列同一性、例えば、少なくとも95%配列同一性、少なくとも98%同一性、少なくとも99%同一性を有するポリペプチドをコードし、コード配列の少なくとも1つのコドンのヒトにおけるtRNA頻度は、上または本明細書に開示されている配列の対応するコドンよりも高い。

0102

本発明の追加的な実施形態では、導入遺伝子コード配列を、所望の導入遺伝子をコードしないオープンリーディングフレーム(ORF)の終結または除去により、発現が増強されるように改変する。オープンリーディングフレーム(ORF)は、開始コドンの後に続く、終止コドンを含有しない核酸配列である。ORFは、順方向であっても逆方向であってもよく、また、目的の遺伝子と比較して「インフレーム」であっても「アウトオブフレーム」であってもよい。そのようなオープンリーディングフレームには、発現カセットにおいて目的の遺伝子と並んで発現する潜在性があり、また、望ましくない有害作用が導かれる可能性がある。本発明の一態様では、導入遺伝子のコード配列を、コドン使用をさらに変更することにより、オープンリーディングフレームが除去されるように改変する。これは、開始コドン(ATG)を排除し、逆方向の終止コドン(TAG、TAA、またはTGA)またはアウトオブフレームORFを導入する一方で、目的の遺伝子におけるアミノ酸配列を保存し、高度に利用されるコドンを維持する(すなわち、頻度が20%未満のコドンを回避する)ことによって行われた。本発明では、コドン最適化および非導入遺伝子ORFの除去のいずれによっても、または両方の技法を使用することによって導入遺伝子コード配列を最適化することができる。当業者には明らかになるように、コドン最適化の間に導入されたORFを除去するために、コドン最適化後に非導入遺伝子ORFを除去するまたは最小限にすることが好ましい。コドン最適化およびORF除去の例が図3A〜3Cに示されている。

0103

一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドカセットは、ポリアデニル化領域をさらに含む。当技術分野で理解されている通り、RNAポリメラーゼII転写物は、ポリAシグナル、ポリA領域またはポリA尾部としても公知のポリアデニル化領域の切断および追加で終結する。ポリA領域は、多くの場合モチーフAAUAAAの反復を伴う多数の連続したアデノシン一リン酸を含有する。SV40、ウシ成長ホルモンヒト成長ホルモンおよびウサギベータグロビンに由来するものを含めたいくつかの効率的なポリアデニル化部位が同定されている(Xuら、2001年;Gene 272巻:149頁;Xuら、2002年;J Control Rel. 81巻:155頁)。錐体細胞において導入遺伝子を発現させるための最も効率的なポリAシグナルは、細胞型および目的の種および使用する特定のベクターに左右され得る。本発明の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドカセットは、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号90もしくは配列番号91または前述の配列のいずれかのその機能性断片もしくは改変体からなる群より選択されるポリA領域を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。ある特定の実施形態では、ポリA領域は、配列番号90またはその改変体を含む。一部のそのような実施形態では、ポリA領域は、配列番号90またはその改変体から本質的になる。

0104

当業者には理解される通り、上述のポリヌクレオチドエレメントのうちの2つまたはそれ超を組み合わせて、本開示のポリヌクレオチドカセットを創出することができる。したがって、例えば、主題のポリヌクレオチドカセットは、改善された5’UTR配列、例えば、配列番号84または配列番号85と作動可能に組み合わせた配列番号80と作動可能に連結した改善されたプロモーター配列を含むプロモーター領域を含んでよい;例えば、配列番号2、配列番号54、配列番号55、配列番号93、配列番号94、または配列番号95を参照されたい。別の例として、主題のポリヌクレオチドカセットは、改善されたプロモーター配列または領域、例えば、配列番号80、配列番号2、配列番号54、配列番号55、または配列番号93と作動可能に組み合わせた配列番号51または配列番号52と作動可能に連結した改善されたエンハンサー配列または領域を含んでよい;例えば、配列番号92または配列番号95を参照されたい。別の例として、主題のポリヌクレオチドカセットは、改善されたイントロン配列、例えば、配列番号60と作動可能に組み合わせた配列番号84または配列番号86と作動可能に連結した改善された5’UTR配列を含んでよい;例えば、配列番号94または配列番号95を参照されたい。別の例として、主題のポリヌクレオチドカセットは、改善されたイントロン配列および改善されたコザック配列、例えば、配列番号60とおよび配列番号73と作動可能に組み合わせた配列番号84または配列番号86と作動可能に連結した改善された5’UTR配列を含んでよい;例えば、配列番号95を参照されたい。別の例として、主題のポリヌクレオチドカセットは、作動可能に連結した、改善されたエンハンサー、改善されたプロモーター、改善された5’UTR、改善されたイントロン、改善されたコザックおよび改善されたポリA領域を含んでよい;例えば、配列番号95を参照されたい。本明細書に開示されているまたは当技術分野で公知のエレメントの他の組合せは、当業者には容易に理解されよう。

0105

さらに、当業者には理解される通り、ポリヌクレオチドカセットは、場合によって、これだけに限定されないが、クローニングを容易にするための制限部位および特定の遺伝子発現ベクターに対する調節エレメントを含めた他のエレメントを含有してよい。調節配列の例としては、AAVベクターに対するITR、プラスミドベクターに対する細菌配列、ファージインテグラーゼベクターに対するattP部位またはattB部位、およびトランスポゾンに対する転移因子が挙げられる。

0106

遺伝子療法ベクター
上で示唆した通り、本発明の一部の態様では、例えば、遺伝子が細胞の生存能力および/または機能に対して有する効果を決定するために、錐体細胞障害を治療するなどのために、主題のポリヌクレオチドカセットを使用して、遺伝子を動物の錐体細胞に送達する。したがって、本発明の一部の態様では、錐体細胞における導入遺伝子の発現をもたらす組成物は遺伝子送達ベクターであり、当該遺伝子送達ベクターは本開示のポリヌクレオチドカセットを含む。

0107

錐体細胞へのポリヌクレオチド配列の送達への使用が見いだされる任意の都合のよい遺伝子療法ベクターは本開示の遺伝子送達ベクターに包含される。例えば、ベクターは、一本鎖核酸または二本鎖核酸、例えば、一本鎖DNAまたは二本鎖DNAを含んでよい。例えば、遺伝子送達ベクターは、のDNA、例えば、プラスミド、ミニサークルなどであってよい。別の例として、遺伝子送達ベクターは、ウイルス、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス(M−MuLV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(MoMSV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳がんウイルス(MuMTV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、ネコ白血病ウイルスFLV)、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)およびラウス肉腫ウイルス(RSV))またはレンチウイルスであってよい。アデノ随伴ウイルスの使用を包含する実施形態が以下により詳細に記載されているが、当業者には同様の知見が理解されることおよび当業者は同様に非AAV遺伝子療法ベクターにも導かれ得ることが予想される。例えば、全開示が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第7,585,676号および米国特許第8,900,858号におけるレトロウイルスベクターに関する考察、ならびに例えば、米国特許第7,858,367号におけるアデノウイルスベクターに関する考察を参照されたい。

0108

一部の実施形態では、遺伝子送達ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスである(rAAV)。そのような実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットは、5’末端および3’末端で機能性AAV逆位末端反復(ITR)配列が隣接している。「機能性AAV ITR配列」とは、ITR配列が、AAVビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングに関して意図された通り機能することを意味する。したがって、本発明の遺伝子送達ベクターに使用するためのAAV ITRは必ずしも野生型ヌクレオチド配列を有さなくてよく、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって変更されたものであってよい、または、AAV ITRは、いくつかのAAV血清型、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10のいずれかに由来するものであってよい。好ましいAAVベクターは、野生型REP遺伝子およびCAP遺伝子が全部または一部欠失しているが、機能性の隣接ITR配列を保持する。

0109

そのような実施形態では、主題のポリヌクレオチドカセットは、これだけに限定することなく、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10などを含めた任意のアデノ随伴ウイルス血清型に由来するものであってよいAAVカプシド内に包まれている。例えば、AAVカプシドは、野生型、またはネイティブなカプシドであってよい。特に興味深い野生型AAVカプシドは、AAV2、AAV5、およびAAV9を含む。しかし、ITRと同様に、カプシドは、必ずしも野生型ヌクレオチド配列を有さなくてよく、むしろ、カプシドが錐体細胞を形質導入することができるものである限りは、VP1配列、VP2配列またはVP3配列内のヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更されたものであってよい。言い換えると、AAVカプシドは、改変体AAVカプシドであってよい。特に興味深い改変体AAVカプシドとしては、全開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願US2014/0294771に開示されている、AAV2の残基580〜600または別のAAVの対応する残基、例えば、LGETTRP、NETITRP、KAGQANN、KDPKTTN、KDTDTTR、RAGGSVG、AVDTTKF、またはSTGKVPN内にペプチド挿入を含むものが挙げられる。一部の実施形態では、AAVベクターは、1つのAAVのカプシド(cap)遺伝子と異なるAAV由来のrep遺伝子およびITRとを使用することによって創出される、「シュードタイピング」されたAAV、例えば、AAV2由来のrepとAAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、またはAAV9由来のcapとを、AAV2に基づくベクターを含有するプラスミドと共に使用することによって創出される、シュードタイピングされたAAV2である。例えば、AAVベクターは、rAAV2/1、rAAV2/3、rAAV2/4、rAAV2/5、rAAV2/6、rAAV2/7、rAAV2/8、rAAV2/9などであってよい。rAAVは、AAVベクターがそのゲノムを独立してさらに複製しパッケージングすることができないという点で複製欠損であることが好ましい。例えば、錐体細胞にrAAVビリオンを用いて形質導入すると、形質導入された錐体細胞において遺伝子が発現されるが、形質導入された錐体細胞はAAV rep遺伝子およびcap遺伝子ならびにアクセサリー機能遺伝子を欠くという事実に起因して、rAAVは複製することができない。

0110

本開示のポリヌクレオチドカセットを封入する遺伝子療法ベクター、例えば、rAAVビリオンは、標準の方法体系を使用して作製することができる。例えば、rAAVビリオンの場合では、本発明によるAAV発現ベクターを産生細胞に導入し、その後、AAVヘルパー構築物を導入することができ、ヘルパー構築物は、産生細胞において発現させることができるAAVコード領域を含むものであり、AAVベクターの不在下でAAVヘルパー機能を補完する。この後、ヘルパーウイルスおよび/または追加的なベクターを産生細胞に導入し、ここで、ヘルパーウイルスおよび/または追加的なベクターにより、効率的なrAAVウイルス産生を支持することが可能なアクセサリー機能がもたらされる。次いで、産生細胞を培養してrAAVを産生させる。これらのステップは、標準の方法体系を使用して行う。本発明の組換えAAVベクターを封入する複製欠損AAVビリオンは、AAVパッケージング細胞およびパッケージング技術を使用する当技術分野で公知の標準の技法によって作出される。これらの方法の例は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に明白に組み込まれる、米国特許第5,436,146号;同第5,753,500号、同第6,040,183号、同第6,093,570号および同第6,548,286号に見いだすことができる。パッケージングするためのさらなる組成物および方法は、同様にその全体が参照により本明細書に組み込まれるWangら(US2002/0168342)に記載されている。

0111

これだけに限定されないが、以下の実施例に記載されているものを含めた、主題のポリヌクレオチドカセットを送達するためのウイルス粒子を産生させるための任意の適切な方法を使用することができる。錐体細胞を有効に形質導入するために適した任意の濃度のウイルス粒子を、in vitroまたはin vivoにおいて錐体細胞と接触させるために調製することができる。例えば、ウイルス粒子を、1ml当たりベクターゲノム108個またはそれ超、例えば、1mL当たりベクターゲノム5×108個;1mL当たりベクターゲノム109個;1mL当たりベクターゲノム5×109個、1mL当たりベクターゲノム1010個、1mL当たりベクターゲノム5×1010個;1mL当たりベクターゲノム1011個;1mL当たりベクターゲノム5×1011個;1mL当たりベクターゲノム1012個;1mL当たりベクターゲノム5×1012個;1mL当たりベクターゲノム1013個;1mL当たりベクターゲノム1.5×1013個;1mL当たりベクターゲノム3×1013個;1mL当たりベクターゲノム5×1013個;1mL当たりベクターゲノム7.5×1013個;1mL当たりベクターゲノム9×1013個;1mL当たりベクターゲノム1×1014個、1mL当たりベクターゲノム5×1014個またはそれ超であるが、典型的には、1mL当たりベクターゲノム1×1015個以下の濃度で製剤化することができる。同様に、所望の効果を付与するまたは疾患を治療するための網膜錐体細胞の適切な形質導入をもたらすために適した任意の総数のウイルス粒子を哺乳動物または霊長類の眼に投与することができる。種々の好ましい実施形態では、眼当たり少なくとも108個;5×108個;109個;5×109個、1010個、5×1010個;1011個;5×1011個;1012個;5×1012個;1013個;1.5×1013個;3×1013個;5×1013個;7.5×1013個;9×1013個、1×1014個のウイルス粒子、または5×1014個もしくはそれ超のウイルス粒子であるが、典型的には、1×1015個以下のウイルス粒子を注射する。哺乳動物または霊長類の眼へのベクターの投与は任意の適切な回数で行うことができる。一実施形態では、方法は、単回投与を含み、他の実施形態では、担当臨床医が適切であると考える期間にわたって多数回投与を行う。

0112

主題のウイルスベクターは、これだけに限定することなく、ベクターゲノム1×108個またはそれ超、例えば、ベクターゲノム1×109個、1×1010個、1×1011個、1×1012個または1×1013個もしくはそれ超、特定の例では、ベクターゲノム1×1014個であるが、通常は4×1015個以下ベクターゲノムを含めた任意の適切な単位投薬量に製剤化することができる。いくつかの場合には、単位投薬量は、最大でベクターゲノム約5×1015個、例えば、ベクターゲノム1×1014個またはそれ未満、例えば、1×1013個、1×1012個、1×1011個、1×1010個、または1×109個のベクターゲノムもしくはそれ未満、特定の例では、ベクターゲノム1×108個またはそれ未満、および典型的には、ベクターゲノム1×108個以上である。いくつかの場合には、単位投薬量は、ベクターゲノム1×1010〜1×1011個である。いくつかの場合には、単位投薬量は、ベクターゲノム1×1010〜3×1012個である。いくつかの場合には、単位投薬量は、ベクターゲノム1×109〜3×1013個である。いくつかの場合には、単位投薬量は、ベクターゲノム1×108〜3×1014個である。

0113

いくつかの場合には、医薬組成物の単位投薬量は、感染多重度MOI)を使用して測定することができる。MOIとは、細胞に核酸を送達することができるベクターまたはウイルスのゲノムの比または倍率を意味する。いくつかの場合には、MOIは1×106であり得る。いくつかの場合には、MOIは1×105〜1×107であり得る。いくつかの場合には、MOIは1×104〜1×108であり得る。いくつかの場合には、本開示の組換えウイルスのMOIは、少なくとも約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018である。いくつかの場合には、本開示の組換えウイルスのMOIは1×108〜3×1014である。いくつかの場合には、本開示の組換えウイルスのMOIは、最大で約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018である。

0114

一部の態様では、医薬組成物の量は、組換えウイルス約1×108〜約1×1015個、組換えウイルス約1×109〜約1×1014個、組換えウイルス約1×1010〜約1×1013個、または組換えウイルス約1×1011〜約3×1012個を含む。

0115

主題のrAAV組成物の調製において、例えば、哺乳動物細胞(例えば、293細胞)、昆虫細胞(例えば、SF9細胞)、微生物および酵母を含めた、rAAVビリオンを産生させるための任意の宿主細胞を用いることができる。宿主細胞はまた、AAV rep遺伝子およびcap遺伝子が宿主細胞において安定に維持されるパッケージング細胞であってもよく、またはAAVベクターゲノムが安定に維持されパッケージングされる産生細胞であってもよい。例示的なパッケージング細胞および産生細胞は、SF−9細胞、293細胞、A549細胞またはHeLa細胞に由来するものである。AAVベクターは、当技術分野で公知の標準の技法を使用して精製し、製剤化する。

0116

錐体細胞をin vivoにおいて接触させる場合、主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターを、眼に送達するために必要に応じて処理することができる。具体的には、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクターと、薬学的に許容される担体希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を含む。主題のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクターは、一般に安全、無毒性、かつ望ましいものであり、霊長類への使用が許容される賦形剤を含む製剤の調製において有用な薬学的に許容される担体、希釈剤および試薬と組み合わせることができる。そのような賦形剤は、固体液体半固体、または、エアロゾル組成物の場合では気体であってよい。そのような担体または希釈剤の例としては、これだけに限定されないが、水、食塩水リンゲル液デキストロース溶液、および5%ヒト血清アルブミンが挙げられる。補足的な活性化合物も製剤に組み入れることができる。製剤に使用される溶液または懸濁物としては、注射用水食塩溶液不揮発性油ポリエチレングリコールグリセリンプロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤エチレンジアミン四酢酸EDTA)などのキレート化化合物アセテートシトレートまたはホスフェートなどの緩衝液凝集を防止するためのTween20などの洗剤;および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための化合物を挙げることができる。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。

0117

本発明における内用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液、または滅菌された注射用溶液または分散物を即時調製するための分散物と滅菌粉末をさらに含む。静脈内投与に関しては、適切な担体として、生理食塩水静菌水、またはリン酸緩衝食塩水PBS)が挙げられる。いくつかの場合には、組成物は滅菌されたものであり、容易な注射可能性(syringability)が存在する限りでは、流体であるべきである。ある特定の実施形態では、組成物は製造および保管の条件下で安定であり、また、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護される。担体は、例えば、例えば、水、エタノールポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、および適切なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。妥当流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒子サイズを維持することによっておよび界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベンクロロブタノールフェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張化剤(isotonic agent)、例えば、糖、マンニトールソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。内部の組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。

0118

滅菌溶液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒に、上に列挙されている成分の1つ、または成分の組合せと共に組み入れ、必要に応じて、その後に濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、活性化合物を、基本的な分散媒および上に列挙されているものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌された注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、調製方法は、活性成分と任意の追加的な所望の成分の粉末を予め滅菌濾過したその溶液から得る、真空乾燥および凍結乾燥である。

0119

一実施形態では、活性化合物を、化合物を体からの迅速な排除から保護する担体、例えば、埋め込み物およびマイクロカプセル封入送達系を含めた制御放出製剤などと共に調製する。エチレン酢酸ビニルポリ酸無水物ポリグリコール酸コラーゲンポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は当業者には明らかになるであろう。材料は、商業的に得ることもできる。リポソーム懸濁物(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞にターゲティングされるリポソームを含む)を薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記載の通り、当業者に公知の方法に従って調製することができる。

0120

経口組成物または非経口組成物を投与の容易さおよび投薬量均一性のために、単位剤形(dosage unit form)に製剤化することが特に有利である。単位剤形とは、本明細書で使用される場合、治療される被験体に対する単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果がもたらされるように算出された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の独特の特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびにそのような活性化合物を個人の治療のために配合する技術分野における固有の限定によって規定され、それに直接左右される。

0121

医薬組成物は、容器パック、またはディスペンサー、例えば、シリンジ、例えば、充填済みシリンジに、投与の説明書と共に含めることができる。

0122

本発明の医薬組成物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、もしくはそのようなエステルの塩、または、ヒトを含めた動物に投与されると、生物活性のある代謝産物またはその残渣を(直接または間接的に)もたらすことが可能な任意の他の化合物を含む。したがって、例えば、本開示は、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、ならびに他の生物学的同等物にも関する。

0123

「プロドラッグ」という用語は、不活性型で調製され、体内またはその細胞内で内在性酵素もしくは他の化学物質の作用および/または条件によって活性型(すなわち、薬物)に変換される治療剤を示す。

0124

「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理的にかつ薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物活性を保持し、それに望ましくない毒物学的な影響を与えない塩を指す。種々の薬学的に許容される塩は、当技術分野で公知であり、例えば、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、第17版、Alfonso R. Gennaro(編)、Mark Publishing Company、Easton、PA、USA、1985年(およびその最新版)、「Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology」、第3版、James Swarbrick(編)、Informa Healthcare USA(Inc.)、NY、USA、2007年、およびJ. Pharm. Sci. 66巻:2頁(1977年)に記載されている。また、適切な塩に関する概説については、Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use、StahlおよびWermuth(Wiley−VCH、2002年)を参照されたい。

0125

薬学的に許容される塩基付加塩は、アルカリ金属およびアルカリ土類金属または有機アミンなどの金属またはアミンと形成される。陽イオンとして使用される金属は、ナトリウムカリウムマグネシウムカルシウムなどを含む。アミンは、N−N’−ジベンジルエチレンジアミンクロプロカインコリンジエタノールアミンジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、N−メチルグルカミン、およびプロカインを含む(例えば、Bergeら、「Pharmaceutical Salts」、J. Pharma Sci.、1977年、66巻、119頁を参照されたい)。前記酸性化合物の塩基付加塩は、従来の様式で遊離酸の形態を十分な量の所望の塩基と接触させて塩を生じさせることによって調製される。遊離酸の形態は、従来の様式で塩の形態を酸と接触させ、遊離酸を単離することによって再生させることができる。遊離酸の形態は、それらのそれぞれの塩の形態とは、極性溶媒中の溶解度などのある特定の物理特性がいくらか異なるが、他の点では、塩は、本発明の目的上、それらのそれぞれの遊離酸と同等である。

0126

主題のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクター、例えば組換えウイルス(ビリオン)は、哺乳動物患者、特に霊長類、より具体的にはヒトに投与するための医薬組成物に組み入れることができる。主題のポリヌクレオチドカセットまたは遺伝子送達ベクター、例えば、ビリオンは、非毒性であり、不活性であり、薬学的に許容される水性担体中に、好ましくは3から8までにわたるpH、より好ましくは6から8までにわたるpHで、製剤化することができる。そのような滅菌組成物は、再構成の際に許容されるpHを有する水性緩衝液に溶解させた治療用分子をコードする核酸を含有するベクターまたはビリオンを含む。

0127

一部の実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、治療有効量のベクターまたはビリオンを、薬学的に許容される担体および/または賦形剤、例えば、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ホスフェートおよびアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、防腐剤および他のタンパク質との混合物で含む。例示的なアミノ酸、ポリマーおよび糖などは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルスクロースフルクトース、デキストロース、マルトースグルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトールガラクチトールキシリトールラクトーストレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、シトレート、アセテート、リンゲル液、ハンクス液システインアルギニンカルニチンアラニングリシンリシンバリンロイシンポリビニルピロリドンポリエチレンおよびグリコールである。この製剤は、4℃で少なくとも6カ月にわたって安定であることが好ましい。

0128

一部の実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水(PBS)またはリン酸ナトリウム硫酸ナトリウムトリス緩衝液グリシン緩衝液滅菌水、およびGoodら(1966年)Biochemistry 5巻:467頁に記載されているものなどの当業者に公知の他の緩衝液などを含む。医薬組成物がアデノウイルスベクター送達系に含有された腫瘍抑制因子遺伝子を含む緩衝液のpHは、6.5〜7.75、好ましくは7〜7.5、および最も好ましくは7.2〜7.4の範囲内であってよい。

0129

方法
上で示唆した通り、本明細書では集合的に「主題の組成物」と称される主題のポリヌクレオチドカセットおよび遺伝子送達ベクターを、動物の錐体細胞における導入遺伝子の発現において用途が見いだされている。例えば、主題の組成物は、例えば、錐体細胞の生存能力および/または機能に対する遺伝子の効果を決定するための研究において使用することができる。別の例として、主題の組成物は、例えば、錐体細胞障害を治療するための医薬に使用することができる。したがって、本発明の一部の態様では、錐体細胞において遺伝子を発現させるための方法であって、錐体細胞を本開示の組成物と接触させるステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、接触させるステップをin vitroで行う。一部の実施形態では、接触させるステップをin vivoで行う、すなわち、主題の組成物を被験体に投与する。

0130

錐体細胞をin vitroにおいて主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターと接触させる場合、細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、スナネズミ、リス)、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、霊長類、ヒトに由来するものであってよい。細胞は、樹立細胞株、例えば、WERI細胞、661W細胞に由来するものであってもよく、初代細胞であってもよく、「初代細胞」、「初代細胞株」、および「初代培養物」は、本明細書では互換的に使用され、被験体から引き出され、in vitroにおいて限られた数の培養物継代、すなわち分割にわたって成長させた細胞および細胞培養物を指す。例えば、初代培養物は、0回、1回、2回、4回、5回、10回、または15回、しかし転換期(crisis stage)を経るには不十分な回数にわたって継代された培養物である。典型的には、本発明の初代細胞株は、in vitroにおいて10回の継代未満にわたって維持されるものである。

0131

細胞が初代細胞である場合、任意の都合のよい方法、例えば、全外植(whole explant)、生検などによって哺乳動物から採取することができる。採取された細胞を分散または懸濁させるために、適切な溶液を使用することができる。そのような溶液は、一般に、低濃度、一般に、5〜25mMの許容される緩衝液と併せた、ウシ胎仔血清または他の天然に存在する因子を都合よく補充した、平衡塩類溶液、例えば、ノーマルセーライン、PBS、ハンクス平衡塩類溶液などになる。都合のよい緩衝液としては、HEPES、リン酸緩衝液乳酸緩衝液などが挙げられる。細胞はすぐに使用することもでき、長期間にわたって保管、凍結することができ、解凍し、再使用することができる。そのような場合では、細胞を、通常、10%DMSO、50%血清、40%緩衝培地、または当技術分野で一般に使用されるものと同様のいくつかの他のそのような溶液中に凍結して細胞をそのような凍結温度で保存し、凍結させた培養細胞を解凍するための当技術分野で公知の様式で解凍する。

0132

導入遺伝子の発現を促進するために、主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターを細胞と約30分〜24時間またはそれ超、例えば、1時間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、3.5時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、12時間、16時間、18時間、20時間、24時間などにわたって接触させる。主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターは、主題の細胞に、1回または複数回、例えば、1回、2回、3回、または4回以上もたらすことができ、各接触事象の後いくらかの時間、例えば16〜24時間にわたって細胞が薬剤と一緒にインキュベートされ、その後、培地を新鮮な培地と交換し、細胞をさらに培養する。細胞を接触させることは、細胞の生存が促進される任意の培養培地で、かつ任意の培養条件下で行うことができる。例えば、細胞を、ウシ胎仔血清または熱失活ヤギ血清(約5〜10%)、L−グルタミンチオール、特に2−メルカプトエタノール、および抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したイスコフ改変DMEMまたはRPMI1640などの都合のよい任意の適切な栄養培地中に懸濁させることができる。培養物は、細胞が応答する増殖因子を含有してよい。本明細書で定義されている増殖因子は、培養物中またはインタクトな組織内のいずれかで、膜貫通受容体に対する特異的な効果を通じて細胞の生存、成長および/または分化を促進することが可能な分子である。増殖因子はポリペプチドおよび非ポリペプチド因子を含む。

0133

典型的には、細胞における導入遺伝子の発現を生じさせるために、有効量の主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターが提供される。本明細書の他の箇所で考察されている通り、有効量は、例えば、導入遺伝子遺伝子産物の存在またはレベルを検出することによって、錐体細胞の生存能力または機能に対する効果を検出することなどによって、経験的に容易に決定することができる。典型的には、効果量の主題のポリヌクレオチドカセットまたは主題のポリヌクレオチドカセットを含む遺伝子送達ベクターにより、同じ量の、当技術分野で公知のポリヌクレオチドカセット、例えば、pR2.1(配列番号50のヌクレオチド1〜2274)、pR1.7、pR1.5、pR1.1、またはIRBP/GNAT2カセットよりも大きな、錐体細胞における導入遺伝子の発現が促進される。典型的には、発現は、例えば、当技術分野で公知の参照または対照ポリヌクレオチドカセットからの発現よりも2倍またはそれ超、例えば、3倍、4倍、または5倍もしくはそれ超、いくつかの場合には10倍、20倍または50倍またはそれ超、例えば、100倍増強される。

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