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技術 多能性幹細胞から血小板を生産するための方法およびその組成物

出願人 アステラスインスティテュートフォーリジェネレイティブメディシン
発明者 フェン,チャンリュ,シ-ジャンランツァ,ロバートピー.
出願日 2019年7月10日 (1年4ヶ月経過) 出願番号 2019-128551
公開日 2019年12月5日 (11ヶ月経過) 公開番号 2019-205448
状態 未査定
技術分野 微生物、その培養処理
主要キーワード 立体ベース 外周バンド ISOクラス 各三つ組 亜酸化炭素 エスチン 付着条件 被覆容器
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年12月5日)のものです。
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図面 (20)

課題

多能性幹細胞から血小板生産するための方法およびその組成物の提供。

解決手段

多能性幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞(hESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)から、胚様体も多能性幹細胞のクラスターも形成することなく、間質インデューサー細胞の使用を伴わずに実施される血小板の生産方法および生産された血小板を含む組成物。収量および/または純度は、多能性幹細胞から血小板を生成する以前の方法について報告されているよりも高くなり得る。

概要

背景

発明の背景
血小板は、血液凝固という重要な高度に特化した機能を果たす小さな血液細胞である。平均的なヒトの血液ではほぼ1兆個の血小板が循環し、そのターンオーバーは、全血小板集団が10日毎に置き換えられるようなものである。これは、莫大な量の進行中の血小板生成を示す。血小板は、高度に組織化された細胞骨格および300を超えるタンパク質細胞貯蔵を有し、血管傷害の部位においてこれらを分泌する。血小板は、炎症、血管増殖および腫瘍転移においても役割を果たす。

脈管傷害後、血小板は、損傷された血管に迅速に接着し、血栓形成を生じる複雑なカスケード事象惹起する。血小板輸血に対する需要は、過去数十年間増加し続けている(51)。従来の方法を使用すると、血小板は、1週間未満にわたってしか貯蔵できず、ドナー依存的プログラムにとって絶え間ない課題を生んでいる。血小板の供給の不足は、生命脅かす結果を潜在的に有し得る(特に、複数回の輸血が必要な患者において)。反復される輸血は、免疫媒介性の宿主反応に関連付けられる不応性応答もまたもたらし得、費用のかかる患者マッチングを必要とし得る(52;53)。in vitroの血小板、特に患者にマッチした血小板を生成する能力は、これらの臨床的シナリオにおいて顕著な利益を提供する。

血小板の供給における制約は、普通でない/稀な血液型を有する、輸血に依存する患者、特に同種免疫された患者、およびがんまたは白血病を有し、しばしば起きることであるが、血小板同種免疫を発達させる患者にとって、生命を脅かす結果を潜在的に有し得る。輸血されたヒト血小板半減期は4〜5日間であるので、血小板の頻繁な輸血が、これらの患者において臨床的に必要である。さらに、志願者ドナープログラム由来の血小板は、種々の病原体による汚染リスクが絶えない。血小板は、従来技術を使用しては凍結貯蔵することができず、したがって、血小板をin vitroで生成する能力は、臨床状況における血小板置換療法に顕著な利益を提供する。

10年より長くにわたって、骨髄(BM)、臍帯血(CB)または末梢血(PB)由来のヒト造血幹細胞(HSC、CD34+)が、巨核球(MK)および血小板の生成について研究されてきた。サイトカイン増殖因子および/または間質フィーダー細胞の特定の組合せを使用して、機能的血小板が、顕著な成功を収めてHSCから生成されている(1;2)。しかし、HSCは、なおもドナーから収集され、現行培養条件下で限定的な拡大増殖能力を有し、それが、大規模生成および将来の臨床的適用を妨げている。
ヒト胚性幹細胞(hESC)は、in vitroで無制限に繁殖および拡大増殖され得、ヒト治療のための細胞の、潜在的に無尽蔵のドナーなしの供給源を提供する。in vitroでのhESCの造血細胞への分化は、過去10年間にわたって広範囲調査されてきた。hESCの方向付けられた造血分化は、2つの異なる型の培養系によってin
vitroで首尾よく達成されている。これらのうち1つは、血清含有培地中での、h
ESCと間質フィーダー細胞との共培養を使用する(3;4)。第2の型の手順は、血清あり/なしのサイトカインの存在下での、超低細胞結合プレートにおける懸濁培養条件を使用する(5〜7);その終点は、細胞凝集体または胚様体(「EB」)の形成である。造血先駆体ならびに赤血球、骨髄、マクロファージ、巨核球およびリンパ系系列を示す成熟した機能的子孫が、上記分化するhESC培養系の両方において同定されている(3〜6:8〜14)。以前の研究でもまた、血清の存在下で間質細胞と共培養することによって、hESCから巨核球/血小板が生成した(15;16)。しかし、上記研究における巨核球/血小板の収量は低かった(15;16)。

概要

多能性幹細胞から血小板を生産するための方法およびその組成物の提供。多能性幹細胞、例えばヒト胚性幹細胞(hESC)および人工多能性幹細胞(iPSC)から、胚様体も多能性幹細胞のクラスターも形成することなく、間質インデューサー細胞の使用を伴わずに実施される血小板の生産方法および生産された血小板を含む組成物。収量および/または純度は、多能性幹細胞から血小板を生成する以前の方法について報告されているよりも高くなり得る。なし

目的

in vitroの血小板、特に患者にマッチした血小板を生成する能力は、これらの臨床的シナリオにおいて顕著な利益を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

少なくとも108個の血小板を含む、ヒト患者における使用に適切な医薬調製物であって、該調製物白血球を実質的に含まず、該血小板の実質的に全てが機能的である、医薬調製物。

請求項2

109〜1014個の血小板、任意選択で、109個、1010個、1011個、1012個、1013個または1014個の血小板を含む、請求項1に記載の医薬調製物。

請求項3

前記血小板が、以下の属性:9.7〜12.8fLの平均血小板容量範囲;前記調製物中のサイズの単峰型分布;および/または1標準偏差が2μm3未満(好ましくは、1.5μm3未満、1μm3未満またはさらには0.5μm3未満)である対数正規型血小板容量分布のうち1つまたは複数を有する、請求項1〜2のいずれか一項に記載の医薬調製物。

請求項4

前記血小板が、以下のマーカー:CD41aおよびCD42bのうち少なくとも1つについて陽性である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の調製物。

請求項5

前記血小板がヒト血小板である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の調製物。

請求項6

前記血小板の少なくとも50%、60%、70%、80%または90%が、室温での貯蔵後少なくとも2、3または4日間にわたって機能的である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の調製物。

請求項7

フィーダー細胞なしに機能的血小板を生成する弱い接着性のまたは非接着性巨核球を有するバイオリアクター

請求項8

少なくとも109個のMLPを含む組成物

請求項9

MLPを含む凍結保存組成物。

請求項10

凍結保存されたMLPを含むバンク

請求項11

前記MLPが、規定されたHLA型のものである、請求項9または10に記載の凍結保存組成物またはバンク。

請求項12

患者に対してHLAがマッチしている、請求項9に記載の凍結保存組成物。

請求項13

109〜1014個のMLP、任意選択で109個、1010個、1011個、1012個、1013個または1014個のMLPを含む、請求項9〜12のいずれか一項に記載の凍結保存組成物またはバンク。

請求項14

巨核球から血小板を生成するための方法であって、a)巨核球の非接着性培養物を提供するステップ;b)該巨核球をTPOまたはTPOアゴニストと接触させて、培養において前血小板の形成を引き起こすステップであって、該前血小板が血小板を放出するステップ;およびc)該血小板を単離するステップを含む方法。

請求項15

巨核球から血小板を生成するための方法であって、a)巨核球の非接着性培養物を提供するステップ;b)該巨核球を、造血拡大増殖培地ならびに任意選択で(1)TPOもしくはTPOアゴニスト、SCF、IL−6およびIL−9または(2)TPOもしくはTPOアゴニスト、SCFおよびIL−11と接触させて、培養中において前血小板の形成を引き起こすステップであって、該前血小板が血小板を放出するステップ;およびc)該血小板を単離するステップを含む方法。

請求項16

前記TPOアゴニストが、ADPエピネフリントロンビンコラーゲン、TPO−Rアゴニスト、TPO模倣物、第2世代血小板新生剤、ロミプロスチム、エルトロンボパグ(SB497115、Promacta)、組換えヒトトロンボポエチン(TPO)、ペグ化組換えヒト巨核球増殖発達因子(PEG−rHuMGDF)、Fab59、AMG531、Peg−TPOmp、TPO非ペプチド模倣物、AKR−501、モノクローナルTPOアゴニスト抗体ポリクローナルTPOアゴニスト抗体、TPOミニボディ、VB22Bsc(Fv)2、ドメインサブクラス変換TPOアゴニスト抗体、MA01G4G344、組換えヒトトロンボポエチン、組換えTPO融合タンパク質またはTPO非ペプチド模倣物のうち1つまたは複数を含む、請求項14または15に記載の方法。

請求項17

実質的に全ての前記単離された血小板が機能的である、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。

請求項18

巨核球の前記非接着性培養物が、フィーダーフリーの培養物である、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。

請求項19

ステップ(b)における前記培養が、0.5〜100ng/mlの幹細胞因子(SCF)、10〜100ng/mlのトロンボポエチン(TPO)および10〜100ng/mlのインターロイキン−11(IL−11)、少なくとも1種のROCKインヒビター、ならびに/または2.5〜25単位/mlのヘパリンのうち1つまたは複数を含む培地中である、請求項14〜18のいずれか一項に記載の方法。

請求項20

ステップ(b)における前記培養が、10〜100ng/mlのTPO、0.5〜100ng/mlのSCF、5〜25ng/mlのIL−6、5〜25ng/mlのIL−9、少なくとも1種のROCKインヒビター、および/または2.5〜25単位/mlのヘパリンのうち1つまたは複数を含む培地中である、請求項14〜18のいずれか一項に記載の方法。

請求項21

前記少なくとも1種のROCKインヒビターがY27632を含む、請求項19または20に記載の方法。

請求項22

前記Y27632が、2〜20μM、約3〜10μM、約4〜6μMまたは約5μMの濃度内である、請求項21に記載の方法。

請求項23

前記巨核球を剪断力に供するステップをさらに含む、請求項14〜22のいずれか一項に記載の方法。

請求項24

巨核球1個当たり少なくとも2個、3個、4個または5個の血小板が生成される、請求項14〜23のいずれか一項に記載の方法。

請求項25

巨核球1個当たり少なくとも50個の血小板が生成される、請求項24に記載の方法。

請求項26

巨核球1個当たり少なくとも100個、500個、1000個、2000個、5000個または10000個の血小板が生成される、請求項25に記載の方法。

請求項27

前記血小板の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%が、CD41a+およびCD42b+である、請求項14〜26のいずれか一項に記載の方法。

請求項28

前記血小板が、フィーダー細胞または間質フィーダー細胞の非存在下で生成される、請求項14〜27のいずれか一項に記載の方法。

請求項29

前記血小板が、全ての異種細胞の非存在下で生成される、請求項14〜28のいずれか一項に記載の方法。

請求項30

前記血小板がヒトのものである、請求項14〜29のいずれか一項に記載の方法。

請求項31

前記巨核球が、外因的に添加されたプロテアーゼインヒビターの存在下で培養される、請求項14〜30のいずれか一項に記載の方法。

請求項32

前記巨核球が、外因的に添加されたMMPインヒビターの存在下で培養される、請求項14〜30のいずれか一項に記載の方法。

請求項33

前記巨核球が、外因的に添加されたMMP8インヒビターの存在下で培養される、請求項14〜30のいずれか一項に記載の方法。

請求項34

前記巨核球が、外因的に添加されたMMP8特異的インヒビターおよび汎MMPインヒビターの存在下で培養される、請求項14〜30のいずれか一項に記載の方法。

請求項35

前記巨核球が、約39℃の温度で培養される、請求項14〜34のいずれか一項に記載の方法。

請求項36

前記巨核球が、(a)多能性幹細胞を培養して、造血性内皮細胞PVE−HE)を形成するステップ;(b)該造血性内皮細胞を培養して、MLPを形成するステップ;および(c)該MLPを培養して、巨核球を形成するステップを含むステップによって生成される、請求項14〜35のいずれか一項に記載の方法。

請求項37

BETインヒビターが、ステップ(b)における前記培養物に添加される、請求項36に記載の方法。

請求項38

前記BETインヒビターがIBET151である、請求項37に記載の方法。

請求項39

前記多能性幹細胞がヒトのものである、請求項36〜38のいずれか一項に記載の方法。

請求項40

前記造血性内皮細胞が、胚様体形成なしに誘導される、請求項36〜39のいずれか一項に記載の方法。

請求項41

前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞(iPSC)である、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。

請求項42

前記iPSCがヒトのものである、請求項41に記載の方法。

請求項43

前記造血性内皮細胞が、胚様体形成なしに誘導される、請求項41または42に記載の方法。

請求項44

前記造血性内皮細胞が、1%〜10%の酸素、2%〜8%の酸素、3%〜7%の酸素、4%〜6%の酸素または約5%の酸素を含む低酸素条件下で、前記多能性幹細胞から分化させられる、請求項36〜43のいずれか一項に記載の方法。

請求項45

前記MLPが、38〜40セルシウス度の間の温度、または約39セルシウス度の温度で培養されて、巨核球を形成する、請求項36〜44のいずれか一項に記載の方法。

請求項46

請求項14〜45のいずれか一項に記載の方法によって生成された血小板を含む医薬調製物。

請求項47

ヒト患者における使用に適切であり、少なくとも108個の血小板を含む、請求項46に記載の調製物。

請求項48

ヒト患者における使用に適切であり、白血球を実質的に含まない、請求項46に記載の調製物。

請求項49

前記請求項のいずれかに記載の組成物または前記請求項のいずれかに記載の方法によって生成された組成物の使用であって、それを必要とする患者あるいは凝固に影響する疾患もしくは障害罹患している患者またはそれによって処置可能な疾患もしくは障害に罹患している患者の処置のための医薬の製造における使用。

請求項50

前記疾患または障害が、血小板減少症外傷、血液媒寄生生物またはマラリアを含む、請求項49に記載の使用。

請求項51

血小板輸血を必要とする患者を処置する方法であって、前記請求項のいずれかに記載の組成物または前記請求項のいずれかに記載の方法によって生成された組成物を、該患者に投与するステップを含む方法。

請求項52

血小板減少症、外傷、血液媒介寄生生物またはマラリアを含む疾患または障害を処置するために有効である、請求項51に記載の方法。

請求項53

巨核球またはMLPから血小板を生成するための方法であって、プロテアーゼインヒビターの存在下において、剪断力条件下で、MLPの巨核球の非接着性集団を培養するステップ、および該培養物から血小板を回収し、任意選択で単離するステップを含む方法。

請求項54

前記プロテアーゼインヒビターがMMPインヒビターである、請求項53に記載の方法。

請求項55

前記剪断力条件が一定の剪断力条件である、請求項53または54に記載の方法。

請求項56

前記剪断力条件が、1〜4.1ダイン/cm2の剪断力を含む、請求項53〜55のいずれか一項に記載の方法。

請求項57

前記巨核球またはMLPが、マイクロ流体デバイス中で培養される、請求項53〜56のいずれか一項に記載の方法。

請求項58

前記巨核球またはMLPが、iPS細胞ES細胞、または天然に存在するCD34+細胞、任意選択で、骨髄もしくは臍帯血CD34+細胞から誘導される、請求項53〜57のいずれか一項に記載の方法。

請求項59

前記プロテアーゼインヒビターがGM6001である、請求項53〜58のいずれか一項に記載の方法。

請求項60

前記プロテアーゼインヒビターがMMP8特異的インヒビターである、請求項53〜58のいずれか一項に記載の方法。

請求項61

前記MMP8特異的インヒビターが、MMP8−I((3R)−(+)−[2−(4−メトキシベンゼンスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−ヒドロキサメート])である、請求項60に記載の方法。

請求項62

2種またはそれより多くのプロテアーゼインヒビターが使用される、請求項53〜61のいずれか一項に記載の方法。

請求項63

前記2種のプロテアーゼインヒビターが、MMP一般的インヒビターおよびMMP8特異的インヒビターである、請求項62に記載の方法。

請求項64

前記プロテアーゼインヒビターが、前記培養物内の血小板のピーク生成の時点で添加される、請求項53〜63のいずれか一項に記載の方法。

請求項65

前記巨核球またはMPLが、TPOまたはTPOアゴニストの存在下で培養されて、前血小板の形成を引き起こし、該前血小板が血小板を放出する、請求項53〜64のいずれか一項に記載の方法。

請求項66

前記巨核球またはMPLが、造血拡大増殖培地中、および任意選択で(1)TPOもしくはTPOアゴニスト、SCF、IL−6およびIL−9または(2)TPOもしくはTPOアゴニスト、SCFおよびIL−11中で培養されて、培養において前血小板の形成を引き起こし、該前血小板が血小板を放出する、請求項53〜65のいずれか一項に記載の方法。

請求項67

前記巨核球またはMPLが、37℃よりも高く40℃と等しいかまたはそれより低い温度で培養される、請求項53〜66のいずれか一項に記載の方法。

請求項68

前記巨核球またはMPLが約39℃の温度で培養される、請求項67に記載の方法。

請求項69

巨核球またはMPLから血小板を生成するための方法であって、37℃よりも高く40℃と等しいかまたはそれより低い温度で、iPS細胞またはES細胞から誘導された巨核球またはMPLの非接着性集団を培養するステップ、および該培養物から血小板を回収し、任意選択で単離するステップを含む方法。

請求項70

前記巨核球またはMPLが約39℃の温度で培養される、請求項69に記載の方法。

請求項71

PVE−HE細胞からMPLを生成するための方法であって、BETのインヒビターの存在下で、iPS細胞またはES細胞から誘導されたPVE−HE細胞の集団を培養するステップ、および該培養物からMPLを回収し、任意選択で単離するステップを含む方法。

請求項72

BETの前記インヒビターがI−BET151である、請求項71に記載の方法。

請求項73

PVE−HE細胞からMPLを生成するための方法であって、c−mycサプレッサーの存在下で、iPS細胞またはES細胞から誘導されたPVE−HE細胞の集団を培養するステップ、および該培養物からMPLを回収し、任意選択で単離するステップを含む方法。

技術分野

0001

関連出願
本出願は、2012年12月21日に出願された米国仮特許出願第61/740,699号および2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/787,476号(両方とも多能性幹細胞から血小板生産するための方法およびその組成物」と題される)に対する利益を主張し、これら両方の内容全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。

背景技術

0002

発明の背景
血小板は、血液凝固という重要な高度に特化した機能を果たす小さな血液細胞である。平均的なヒトの血液ではほぼ1兆個の血小板が循環し、そのターンオーバーは、全血小板集団が10日毎に置き換えられるようなものである。これは、莫大な量の進行中の血小板生成を示す。血小板は、高度に組織化された細胞骨格および300を超えるタンパク質細胞貯蔵を有し、血管傷害の部位においてこれらを分泌する。血小板は、炎症、血管増殖および腫瘍転移においても役割を果たす。

0003

脈管傷害後、血小板は、損傷された血管に迅速に接着し、血栓形成を生じる複雑なカスケード事象惹起する。血小板輸血に対する需要は、過去数十年間増加し続けている(51)。従来の方法を使用すると、血小板は、1週間未満にわたってしか貯蔵できず、ドナー依存的プログラムにとって絶え間ない課題を生んでいる。血小板の供給の不足は、生命脅かす結果を潜在的に有し得る(特に、複数回の輸血が必要な患者において)。反復される輸血は、免疫媒介性の宿主反応に関連付けられる不応性応答もまたもたらし得、費用のかかる患者マッチングを必要とし得る(52;53)。in vitroの血小板、特に患者にマッチした血小板を生成する能力は、これらの臨床的シナリオにおいて顕著な利益を提供する。

0004

血小板の供給における制約は、普通でない/稀な血液型を有する、輸血に依存する患者、特に同種免疫された患者、およびがんまたは白血病を有し、しばしば起きることであるが、血小板同種免疫を発達させる患者にとって、生命を脅かす結果を潜在的に有し得る。輸血されたヒト血小板半減期は4〜5日間であるので、血小板の頻繁な輸血が、これらの患者において臨床的に必要である。さらに、志願者ドナープログラム由来の血小板は、種々の病原体による汚染リスクが絶えない。血小板は、従来技術を使用しては凍結貯蔵することができず、したがって、血小板をin vitroで生成する能力は、臨床状況における血小板置換療法に顕著な利益を提供する。

0005

10年より長くにわたって、骨髄(BM)、臍帯血(CB)または末梢血(PB)由来のヒト造血幹細胞(HSC、CD34+)が、巨核球(MK)および血小板の生成について研究されてきた。サイトカイン増殖因子および/または間質フィーダー細胞の特定の組合せを使用して、機能的血小板が、顕著な成功を収めてHSCから生成されている(1;2)。しかし、HSCは、なおもドナーから収集され、現行培養条件下で限定的な拡大増殖能力を有し、それが、大規模生成および将来の臨床的適用を妨げている。
ヒト胚性幹細胞(hESC)は、in vitroで無制限に繁殖および拡大増殖され得、ヒト治療のための細胞の、潜在的に無尽蔵のドナーなしの供給源を提供する。in vitroでのhESCの造血細胞への分化は、過去10年間にわたって広範囲調査されてきた。hESCの方向付けられた造血分化は、2つの異なる型の培養系によってin
vitroで首尾よく達成されている。これらのうち1つは、血清含有培地中での、h
ESCと間質フィーダー細胞との共培養を使用する(3;4)。第2の型の手順は、血清あり/なしのサイトカインの存在下での、超低細胞結合プレートにおける懸濁培養条件を使用する(5〜7);その終点は、細胞凝集体または胚様体(「EB」)の形成である。造血先駆体ならびに赤血球、骨髄、マクロファージ、巨核球およびリンパ系系列を示す成熟した機能的子孫が、上記分化するhESC培養系の両方において同定されている(3〜6:8〜14)。以前の研究でもまた、血清の存在下で間質細胞と共培養することによって、hESCから巨核球/血小板が生成した(15;16)。しかし、上記研究における巨核球/血小板の収量は低かった(15;16)。

先行技術

0006

Reems JA, Pineault N, and Sun S. In vitro megakaryocyte production and platelet biogenesis: state of the art. Transfus. Med.Rev. 2010; 24: 33−43.
Chockalingam P, Sacher RA. Management of patients’ refractory to platelet transfusion. J.Infus.Nurs. 2007; 30 : 220−225.
Hod E, Schwartz J. Platelet transfusion refractoriness. Br.J.Haematol. 2008; 142: 348−360.
Kaufman DS, Hanson ET, Lewis RL, Auerbach R, Thomson JA. Hematopoietic colony−forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 2001;98.: 10716−10721.
Lu S−J, Li F, Vida L, Honig GR. CD34+CD38− hematopoietic precursors derived from human embryonic stem cells exhibit an embryonic gene expression pattern. Blood 2004;103:4134−4141.
Chadwick K, Wang L, Li L et al. Cytokines and BMP−4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood 2003 2003;102:906−915.
Chang KH, Nelson AM, Cao H et al. Definitive−like erythroid cells derived from human embryonic stem cells coexpress high levels of embryonic and fetal globins with little or no adult globin. Blood 2006; 108: 1515−1523.
Tian X, Morris JK, Linehan JL, Kaufman DS. Cytokine requirements differ for stroma and embryoid body−mediated hematopoiesis from human embryonic stem cells. Exp.Hematol. 2004;32: 1000−1009.
Vodyanik MA, Bork JA, Thomson JA, Slukvin II. Human embryonic stem cell−derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood 2005;105:617−626.
Wang L, Menendez P, Shojaei F et al. Generation of hematopoietic repopulating cells from human embryonic stem cells independent of ectopic HOXB4 expression. J.Exp. Med. 2005;201 : 1603−1614.
Woll PS, Martin CH, Miller JS, Kaufman DS. Human embryonic stem cell−derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity. J.Immunol. 2005;175:5095− 5103.
Zambidis ET, Peault B, Park TS, Bunz F,CivinCI. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood 2005;106:860−870.
Qiu C, Hanson E, Olivier E et al. Differentiation of human embryonic stem cells into hematopoietic cells by coculture with human fetal liver cells recapitulates the globin switch that occurs early in development. Exp.Hematol. 2005;33: 1450−1458.
Zhan X, Dravid G, Ye Z et al. Functional antigen−presenting leucocytes derived from human embryonic stem cells in vitro. Lancet 2004;364: 163−171.
LedranMH, Krassowska A, Armstrong L et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell 2008;3:85−98.
Gaur M, Kamata T, Wang S et al. Megakaryocytes derived from human embryonic stem cells: a genetically tractable system to study megakaryocytopoiesis and integrin function. J.Thromb.Haemost. 2006;4:436−442.
Takayama N, Nishikii H, Usui J et al. Generation of functional platelets from human embryonic stem cells in vitro viaES−sacs,VEGF−promoted structures that concentrate hematopoietic progenitors. Blood 2008; 111 :5298−5306.

課題を解決するための手段

0007

発明の概要
本開示は、多能性幹細胞、例えば、ヒト胚性幹細胞(hESC)および人工多能性幹細胞(iPSCまたはiPS細胞)、例えばヒト人工多能性幹細胞(hiPSCまたはhiPS細胞)からの血小板の生成のための方法を提供する。これらの方法は、胚様体を形成することなく実施され得、間質インデューサー細胞の使用を伴わずに実施され得る。さらに、収量および/または純度は、多能性幹細胞から血小板を生成する以前の方法について報告されているよりも高くなり得る。血小板は、より高い効率およびより大きい規模で生成され得るので、本開示の方法および組成物は、医療上の輸血目的での使用についての大きな可能性を有する。さらに、血小板は、核を有さず、最小の遺伝子材料のみを含むので、本開示の調製物は、任意の汚染する有核細胞、例えば未分化hESCを効果的に排除するために、輸血前に照射され得る。したがって、有核細胞の起こり得る存在は、安全性の問題を示さないはずである。

0008

ドナーから収集された血小板は、非常に限定的な有効期限を有し、患者における予防的輸血にますます必要とされている。ドナー依存的な臍帯血または骨髄CD34+ヒト造血幹細胞とは対照的に、ヒト胚性幹細胞(hESC)は、制御された条件下での血小板の持続的なin vitro生成のための有望な代替的供給源であり得る。本明細書にさらに記載するように、本開示は、血清フリーおよび間質フリーの条件下で、多能性幹細胞から巨核球(MK)を生成するための系および方法を提供する。例示的な実施形態では、多能性幹細胞は、造血性内皮細胞PVE−HE、これは以下にさらに記載する)の分化を介して巨核球に向けて方向付けられる。CD31、CD144およびCD105マーカー発現する一過性多分化能細胞集団が、PVE−HE培養の最後に同定されている。フィーダーフリーおよび血清フリーの懸濁培養物中におけるTPO、SCFおよび他のサイトカインの存在下で、最大100倍の拡大増殖が、hESCまたはhiPS細胞からMKへと、18〜20日間で達成され得る。かかる方法は、多能性幹細胞からのMKの強いin vitro生成を提供し得る。フィーダーフリー条件下で培養した場合、多能性幹細胞由来のMKは、血小板様粒子(ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC−PLT)またはヒト胚性幹細胞(ESPLT)から生成された血小板または血小板様粒子)を生成するために使用され得る。これらのhiPSC−PLTおよびES−PLTは、トロンビン刺激に対して応答性であり、ミクロ凝集体形成に関与できる。

0009

一実施形態では、本開示は、少なくとも108個の血小板を含む、ヒト患者における使用に適切な医薬調製物を提供する。
であって、前記調製物が白血球を実質的に含まず、前記血小板の実質的に全てが機能的である、医薬調製物。

0010

さらに、本開示は、ヒト幹細胞から分化した血小板、例えば、少なくとも108個の血小板を含む医薬調製物を提供する。任意選択で、この調製物は白血球を実質的に含まなくてもよい。任意選択で、血小板の実質的に全てが機能的であってもよい。

0011

医薬調製物は、109〜1014個の血小板、任意選択で、109個、1010個、1011個、1012個、1013個または1014個の血小板を含み得る。

0012

血小板は、以下の属性:9.7〜12.8fLの平均血小板容量範囲調製物中のサイズの単峰型分布;および/または1標準偏差が2μm3未満(好ましくは1.5μm3未満、1μm3未満またはさらには0.5μm3未満)である対数正規型血小板容量分布のうち1つまたは複数を有し得る。

0013

血小板は、以下のマーカー:CD41aおよびCD42bのうち少なくとも1つについて陽性であり得る。

0014

血小板はヒト血小板であり得る。

0015

血小板の少なくとも50%、60%、70%、80%または90%は機能的であり得、任意選択で、室温での貯蔵後、少なくとも2、3または4日間にわたって機能的であり得る。

0016

別の態様では、本開示は、フィーダー細胞なしで機能的血小板を生成する弱い接着性のまたは非接着性の巨核球を有するバイオリアクターを提供する。

0017

別の態様では、本開示は、少なくとも109個の巨核球系列特異的前駆体(MLP)を含む組成物を提供する。

0018

別の態様では、本開示は、MLPを含む凍結保存組成物を提供する。

0019

別の態様では、本開示は、凍結保存されたMLPを含むバンクを提供する。

0020

MLPは、規定されたHLA型のものであり得る。

0021

凍結保存組成物は、患者にマッチしたHLAであり得る。

0022

別の態様では、本開示は、109〜1014個のMLP、任意選択で109個、1010個、1011個、1012個、1013個または1014個のMLPを含む、凍結保存組成物またはバンクを提供する。

0023

別の態様では、本開示は、巨核球またはMPLから血小板を生成するための方法であって、a)巨核球の非接着性培養物を提供するステップ;b)この巨核球またはMPLをTPOまたはTPOアゴニストと接触させて、培養において前血小板の形成を引き起こすステップであって、この前血小板が血小板を放出するステップ;およびc)この血小板を単離するステップを含む方法を提供する。

0024

別の態様では、本開示は、巨核球またはMPLから血小板を生成するための方法であって、a)巨核球またはMPLの非接着性培養物を提供するステップ;b)この巨核球またはMPLを、造血拡大増殖培地ならびに任意選択で(1)TPOもしくはTPOアゴニスト、SCF、IL−6およびIL−9または(2)TPOもしくはTPOアゴニスト、SCFおよびIL−11と接触させて、培養において前血小板の形成を引き起こし得るステップであって、この前血小板が血小板を放出するステップ;およびc)前記血小板を単離するステップを含む方法を提供する。

0025

前記TPOアゴニストは、ADPエピネフリン、トロンビン、コラーゲン、TPO−Rアゴニスト、TPO模倣物、第2世代血小板新生剤、ロミプロスチム、エルトロンボパグ(SB497115、Promacta)、組換えヒトトロンボポエチン(TPO)、ペグ化組換えヒト巨核球増殖発達因子(PEG−rHuMGDF)、Fab59、AMG 531、Peg−TPOmp、TPO非ペプチド模倣物、AKR−501、モノクローナルTPOアゴニスト抗体ポリクローナルTPOアゴニスト抗体、TPOミニボディ、VB22B sc(Fv)2、ドメインサブクラス変換TPOアゴニスト抗体、MA01G4G344、組換えヒトトロンボポエチン、組換えTPO融合タンパク質またはTP
O非ペプチド模倣物のうち1つまたは複数を含む。

0026

任意選択で、実質的に全ての単離された血小板は機能的であり得る。

0027

巨核球またはMPLの非接着性培養物はフィーダーフリー培養物であり得る。

0028

ステップ(b)における培養は、0.5〜100ng/mlの幹細胞因子(SCF)、10〜100ng/mlのトロンボポエチン(TPO)および10〜100ng/mlのインターロイキン−11(IL−11)、少なくとも1種のROCKインヒビター、ならびに/または2.5〜25単位/mlのヘパリンのうち1つまたは複数を含む培地中であり得る。

0029

ステップ(b)における培養は、10〜100ng/mlのTPO、0.5〜100ng/mlのSCF、5〜25ng/mlのIL−6、5〜25ng/mlのIL−9、少なくとも1種のROCKインヒビター、および/または2.5〜25単位/mlのヘパリンのうち1つまたは複数を含む培地中であり得る。

0030

この少なくとも1種のROCKインヒビターはY27632を含んでもよく、このY27632は、2〜20μM、約3〜10μM、約4〜6μMまたは約5μMの濃度であり得る。

0031

この方法は、巨核球を剪断力に供するステップをさらに含み得る。

0032

巨核球1個当たり少なくとも2個、3個、4個または5個の血小板が生成され得る。

0033

巨核球1個当たり少なくとも50個の血小板が生成され得る。

0034

巨核球1個当たり少なくとも100個、500個、1000個、2000個、5000個または10000個の血小板が生成され得る。

0035

前記血小板の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%は、CD41a+および/またはCD42b+、例えばCD41a+およびCD42b+であり得る。

0036

血小板は、フィーダー細胞の非存在下で生成されてもよく、そして/または間質フィーダー細胞の非存在下で生成されてもよい。

0037

血小板は、全ての異種細胞の非存在下で生成されてもよい。

0038

血小板はヒトのものであり得る。

0039

巨核球またはMPLは、外因的に添加されたプロテアーゼインヒビターの存在下で培養され得る。 前記巨核球またはMPLは、外因的に添加されたMMPインヒビターの存在下で培養され得る。 前記巨核球またはMPLは、外因的に添加されたMMP8インヒビターの存在下で培養され得る。前記巨核球またはMPLは、外因的に添加されたMMP8特異的インヒビターおよび汎MMPインヒビターの存在下で培養され得る。

0040

巨核球またはMPLは、約39℃の温度で培養され得る。

0041

巨核球またはMPLは、(a)多能性幹細胞を培養して、造血性内皮細胞(PVE−H
E)を形成するステップ;(b)前記造血性内皮細胞を培養して、MLPを形成するステップ;および任意選択で(c)前記MLPを培養して、巨核球を形成するステップを含むステップによって生成され得る。この多能性幹細胞はヒトのものであり得る。

0042

造血性内皮細胞は、ステップ(b)において、BETインヒビターの存在下で培養され得る。このBETインヒビターはIBET151であり得る。

0043

造血性内皮細胞は、胚様体形成なしに誘導され得る。

0044

多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)であり得る。前記iPSCはヒトのものであり得る。

0045

造血性内皮細胞は、胚様体形成なしに誘導され得る。

0046

造血性内皮細胞が、1%〜10%の酸素、2%〜8%の酸素、3%〜7%の酸素、4%〜6%の酸素または約5%の酸素を含む低酸素条件下で多能性幹細胞から分化させられ得る。

0047

巨核球は、MLPが、38〜40セルシウス度の間の温度、または約39セルシウス度の温度でMLPから分化させられ得る。

0048

別の態様では、本開示は、本明細書に記載される方法のいずれか、例えば上記方法のいずれかによって生成された血小板を含む医薬調製物を提供する。

0049

この調製物は、ヒト患者における使用に適切であり得る。例えば、この調製物は、ヒト患者における使用に適切であり得、白血球を実質的に含まなくてもよい。この調製物は、少なくとも108個の血小板を含み得る。

0050

さらなる一態様では、本開示は、それを必要とする患者あるいは凝固に影響する疾患もしくは障害またはそれによって処置可能な疾患もしくは障害に罹患している患者の処置のための医薬の製造における、血小板を含む組成物(例えば、上述の段落などにおいて本明細書に記載される組成物)または本明細書に記載される方法(例えば、上述の段落に記載された方法)によって生成された血小板を含む組成物の使用を提供する。

0051

この疾患または障害は、血小板減少症外傷、血液媒寄生生物またはマラリアを含み得る。

0052

別の態様では、本開示は、血小板輸血を必要とする患者を処置する方法を提供し、この方法は、血小板を含む組成物(例えば、上述の段落などにおいて本明細書に記載される組成物)または本明細書に記載される方法(例えば、上述の段落に記載された方法)によって生成された血小板を含む組成物を、この患者に投与するステップを含む。

0053

この方法は、血小板減少症、外傷、血液媒介寄生生物またはマラリアを含む疾患または障害を処置するために有効であり得る。

0054

別の態様では、本開示は、任意選択で多能性幹細胞から誘導され、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離PVE−HE細胞を含む組成物を提供する。

0055

一態様では、本開示は、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離iPS−PVE−HE細胞を含む組成物を提供する。

0056

一態様では、本開示は、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離hES−PVE−HEを含む組成物を提供する。

0057

一態様では、本開示は、任意選択で多能性幹細胞から誘導され、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離PVE−HE−MLPを含む組成物を提供する。

0058

一態様では、本開示は、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離iPS−PVE−HE−MLPを含む組成物を提供する。

0059

一態様では、本開示は、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離hES−PVE−HE−MLPを含む組成物を提供する。

0060

一態様では、本開示は、任意選択で多能性幹細胞から誘導され、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離PVE−HE−MLP−MKを含む組成物を提供する。

0061

一態様では、本開示は、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離iPS−PVE−HE−MLP−MKを含む組成物を提供する。

0062

一態様では、本開示は、任意選択で本明細書に記載される方法に従って生成された単離hES−PVE−HE−MLP−MKを含む組成物を提供する。

0063

別の態様では、本開示は、少なくとも108個の血小板を含む、ヒト患者における使用に適切な医薬調製物を提供し、この調製物は白血球を実質的に含まず、血小板の実質的に全てが機能的である。

0064

種々の実施形態では、この医薬調製物は、有核細胞を除去または不活性化するために照射される。

0065

別の態様では、本開示は、少なくとも108個の機能的血小板を含む、ヒト患者における使用に適切な医薬調製物を提供し、この調製物中の機能的血小板の平均血漿半減期は、少なくとも4日間である。

0066

この医薬調製物は、109〜1014個の血小板、任意選択で109個、1010個、1011個、1012個、1013個または1014個の血小板を含み得る。

0067

この医薬調製物は、以下の属性:9.7〜12.8fLの平均血小板容量範囲;調製物中のサイズの単峰型分布;および/または1標準偏差が2μm3未満(好ましくは1.5μm3未満、1μm3未満またはさらには0.5μm3未満)である対数正規型血小板容量分布のうち1つまたは複数を有する血小板を含み得る。

0068

この医薬調製物は、以下のマーカー:CD41aおよびCD41bのうち少なくとも1つについて陽性である血小板を含み得る。

0069

血小板の少なくとも半分は、室温、例えば(22〜25℃)での貯蔵後、少なくとも2、3、4または5日間にわたって機能的であり得る。例えば、少なくとも60%、70%、80%または90%が、少なくとも2日間にわたって機能的であり得る。血小板は、少なくとも5日間にわたって室温で貯蔵され得る。

0070

別の態様では、本開示は、MLPの凍結保存されたバンクまたは調製物を提供する。

0071

MLPは、懸濁物中で浮遊し始めたときに、PVE−HEから収集され得る。好ましくは、MLPはプレート形成して(plated)おらず、好ましくは、MLPは接着されておらず、それによって、他の細胞型への分化を回避し、MKの生成を促進する。

0072

このバンクまたは調製物は、109〜1014個のMLP、任意選択で109個、1010個、1011個、1012個、1013個または1014個のMLPを含み得る。

0073

1個のMLPは、少なくとも2個、3個、4個、5個またはそれより多くの血小板を生じ得る。例示的な実施形態では、MLP1個当たり5個の血小板の収量で治療的用量の300〜600×109個の血小板を生成するのに十分な、6×1010〜1.2×1011個のMLPの組成物が提供される。例示的な実施形態では、MLP1個当たり少なくとも100個の血小板の収量で治療的用量を生成するのに十分な、3〜6×109個のMLPの組成物が提供される。

0074

別の態様では、本開示は、フィーダー細胞なしに機能的血小板を生成する弱い接着性のまたは非接着性の巨核球を有するバイオリアクターを提供する。前記巨核球を含む弱い接着性の細胞は、互いからまたは表面から機械的に分離され得る(例えば、血清学的ピペットを使用して穏やかな力で洗浄することによって)。好ましくは、MKは、MK表現型の維持を促進すると考えられる非接着性条件下で培養される。血小板生成の効率を改善するために、剪断力がMK培養物に加えられ得る。例えば、マイクロ流体チャンバーまたはチップが、剪断応力を制御するために使用され得、MK1個当たりの血小板収量を増加させ得る。一態様では、MKは、マイクロ流体チップの1つのチャネル中に播種され得、培地は、ほぼ生理学的速度で、MKのそばを通り過ぎて流され得る。

0075

別の態様では、本開示は、少なくとも109個のMLPを含む組成物を提供する。

0076

別の態様では、本開示は、MLPを含む凍結保存組成物を提供する。

0077

別の態様では、本開示は、巨核球から血小板を生成するための方法を提供し、この方法は、a)巨核球の非接着性培養物を提供するステップ;b)巨核球をTPOまたはTPOアゴニストと接触させて、培養において前血小板の形成を引き起こすステップであって、前血小板が血小板を放出するステップ;およびc)血小板を単離するステップを含む。

0078

トロンボポエチン(TPO)は、血小板新生および巨核球形成に関与する重要なサイトカインであると考えられ、血小板、巨核球および巨核球先駆体の表面上で発現されるトロンボポエチン受容体に対する内因性リガンドである。TPOは、2つのドメイン:受容体結合ドメイン(残基1〜153)および高度にグリコシル化されており、タンパク質の安定性のために重要である炭化水素リッチドメイン(残基154〜332)を含む、332アミノ酸(95kDa)の糖タンパク質である。TPO受容体c−Mpl(CD110としても公知)は、典型的な造血サイトカイン受容体であり、2つのサイトカイン受容体相同性モジュールを含む。TPOは、遠位サイトカイン受容体相同性モジュールにのみ結合し、それによって、シグナル伝達を開始させる。この遠位サイトカイン受容体相同性モジュールの非存在下では、c−Mplは活性になり、これは、この遠位サイトカイン受容体相同性モジュールが、TPOによって結合されるまでc−Mplのインヒビターとして機能することを示唆している。TPOによる結合は、ヤヌスキナーゼ2(Jak2)シグナル伝達兼転写活性化因子(STATシグナル伝達経路を活性化して、細胞の増殖および分化を駆動する。巨核球増殖発達因子(MGDF)は、別の血小板新生増殖因子である。ヒト形態およびペグ化形態を含む、TPOおよびMGDFの組換え形態が、巨核球および
血小板の分化および成熟化を誘発するために使用され得る。TPO受容体活性ペプチドおよび融合タンパク質(即ち、Fab59、ロミプロスチム/AMG 531またはペグ化体(Peg−TPOmp))が、TPOの代わりに使用され得る。非ペプチド模倣物(エルトロンボパグ(SB497115、Promacta)およびAKR−501)は、TPOとは異なる機構によってTPO受容体と結合してそれを活性化し、TPOに対して相加効果を有し得る。TPO受容体を活性化するTPOアゴニスト抗体(即ち、MA01G4G344)またはミニボディ(minibody)(即ち、VB22B sc(Fv)2)もまた、TPOの効果を模倣するために使用され得る。例示的なTPOアゴニストは、各々その全体が参照によって本明細書に組み込まれるStasiら、Blood Reviews 24巻(2010年)179〜190頁およびKuter、Blood. 2007年;109巻:4607〜4616頁に開示されている。例示的なTPOアゴニストには以下が含まれる:ADP、エピネフリン、トロンビンおよびコラーゲン、ならびにTPO−RアゴニストもしくはTPO模倣物として文献中で同定されている他の化合物、第2世代血小板新生剤、ロミプロスチム、エルトロンボパグ(SB497115、Promacta)、第1世代血小板新生増殖因子、組換えヒトトロンボポエチン(TPO)、ペグ化組換えヒト巨核球増殖発達因子(PEG−rHuMGDF)、TPOペプチド模倣物、Fabの相補性決定領域中に挿入されたTPO受容体活性化ペプチド(Fab
59)、AMG 531(2つのジスルフィド結合したヒトIgG1−HC定常領域(Fc断片)(その各々がポリグリシンを介して連結された2つの同一のペプチド配列と残基228において共有結合している)から構成される「ペプチボディ(peptibody)」)、Peg−TPOmp(ペグ化TPOペプチドアゴニスト)、経口投与可能なTPOアゴニスト、TPO非ペプチド模倣物、AKR−501、モノクローナルTPOアゴニスト抗体、ポリクローナルTPOアゴニスト抗体、TPOミニボディ、例えばVB22B sc(Fv)2、ドメインサブクラス変換TPOアゴニスト抗体、例えばMA01G4G344、組換えヒトトロンボポエチン、または組換えTPO融合タンパク質、TPO非ペプチド模倣物。TPOが本発明の一実施形態としてどの場面で使用されても、例示的なTPOアゴニストは本発明のさらなる実施形態においてTPOの代用になり得る。

0079

別の態様では、本開示は、巨核球から血小板を生成するための方法を提供し、この方法は、a)巨核球または巨核球前駆体の非接着性培養物を提供するステップ、b)巨核球または巨核球前駆体を、造血拡大増殖培地を含む組成物と接触させて、培養において前血小板の形成を引き起こすステップであって、この前血小板が血小板を放出するステップ、およびc)血小板を単離するステップを含む。

0080

例示的な実施形態では、実質的に全ての単離された血小板が機能的である。例示的な実施形態では、巨核球または巨核球前駆体の非接着性培養物は、フィーダーフリーの培養物である、および/または異種細胞を含まない。したがって、本開示は、フィーダー細胞なしに血小板を生成するための方法を提供する。

0081

ステップ(b)における培養は、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、インターロイキン−11(IL−11)、ROCKインヒビター、例えばY27632および/またはヘパリンのうち1つまたは複数を含む培地中で実施され得る。ステップ(b)における培養は、TPO、SCF、IL−6、IL−9、ROCKインヒビター、例えばY27632、および/またはヘパリンのうち1つまたは複数を含む培地中であり得る。

0082

一実施形態では、造血拡大増殖培地は、StemSpam(商標)ACF(ACF)(StemCell Technologies Inc.から入手可能)を含み、TPO(トロンボポエチン)またはTPOアゴニスト、SCF(幹細胞因子)、IL−6(インターロイキン6)およびIL−9(インターロイキン9)をさらに含み得、これはSte
mSpam(商標)CC220サイトカインカクテル(CC220)(StemCell
Technologies Inc.から入手可能)として提供され得る。この造血拡大増殖培地は、ROCKインヒビターおよび/またはヘパリンを任意選択で含み得る。TPO、SCF、IL−6、IL−9およびIL−11は、公知の巨核球発達因子および成熟化因子である(Stasiら、Blood Reviews 24巻(2010年)179〜190頁)。

0083

一実施形態では、造血拡大増殖培地は、Stemline−II造血幹細胞拡大増殖培地(Stemline−II)(Sigma Aldrichから入手可能)を含み、TPOまたはTPOアゴニスト、SCFおよびIL−11をさらに含み得る。この造血拡大増殖培地は、ROCKインヒビターおよび/またはヘパリンを任意選択で含み得る。このROCKインヒビターは、Y27632であり得るがこれに限定されない。

0084

別の一実施形態では、造血拡大増殖培地は、基本培地としてのイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ヒト血清アルブミン(組換えまたは精製)、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、b−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質(LDL)およびコレステロール(これは、本明細書で限定成分培地と呼ばれ得る)を含み、TPOまたはTPOアゴニスト、SCFおよびIL−11をさらに含み得る。この造血拡大増殖培地は、ROCKインヒビターおよび/またはヘパリンを任意選択で含み得る。このROCKインヒビターは、Y27632であり得るがこれに限定されない。

0085

別の一実施形態では、この造血拡大増殖培地は、基本培地としてのイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ヒト血清アルブミン(組換えまたは精製)、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、b−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質(LDL)およびコレステロール(これは、本明細書で限定成分培地と呼ばれ得る)を含み、TPO(トロンボポエチン)またはTPOアゴニスト、SCF(幹細胞因子)、IL−6(インターロイキン6)およびIL−9(インターロイキン9)をさらに含み得る。この造血拡大増殖培地は、ROCKインヒビターおよび/またはヘパリンを任意選択で含み得る。

0086

ステップ(b)における培養は、上述の段落のACF、Stemline−IIまたは限定成分培地、ならびに(1)SCF(例えば、0.5〜100ng/ml)、TPO(例えば、10〜100ng/ml)、IL−6(例えば、5〜25ng/ml)、IL−9(例えば、5〜25ng/ml)およびヘパリン(例えば、2.5〜25単位/ml)のうち1つまたは複数;(2)TPO(例えば、10〜100ng/ml)、SCF(例えば、0.5〜100ng/ml)、IL−6(例えば、5〜25ng/ml)、IL−9(例えば、5〜25ng/ml)、Y27632(例えば、5μM、または任意選択で2〜20μM、または任意選択で有効濃度の別のROCKインヒビター)およびヘパリン(例えば、0.5〜25単位/ml)のうち1つまたは複数;(3)TPO(例えば、10〜100ng/ml)、SCF(例えば、0.5〜100ng/ml)、IL−11(例えば、5〜25ng/ml)、Y27632(例えば、5μMまたは任意選択で2〜20μM、または任意選択で有効濃度の別のROCKインヒビター)およびヘパリン(例えば、2.5〜25単位/ml)のうち1つまたは複数;あるいは(4)TPO(例えば、10〜100ng/ml)、SCF(例えば、0.5〜100ng/ml)、IL−6(例えば、5〜25ng/ml)、IL−9(例えば、5〜25ng/ml)、Y27632(例えば、5μMまたは任意選択で2〜20μM、または任意選択で有効濃度の別のROCKインヒビター)およびヘパリン(例えば、2.5〜25単位/ml)のうち1つまたは複数を含む培地中で実施され得る。

0087

この方法は、巨核球を剪断力に供するステップをさらに含み得る。

0088

この方法は、巨核球1個当たり少なくとも2個、3個、4個もしくは5個の血小板、巨核球1個当たり少なくとも20個、30個、40個もしくは50個の血小板、または巨核球1個当たり少なくとも100個、500個、1000個、2000個、5000個もしくは10000個の血小板を生じ得る。

0089

前記血小板の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%が、CD41a+およびCD42b+であり得る。

0090

血小板は、フィーダー細胞または間質フィーダー細胞の非存在下で生成され得る。

0091

血小板は、任意の異種細胞の非存在下で生成され得る。

0092

血小板はヒトのものであり得る。

0093

血小板は、CD41a+および/またはCD42b+であり得る。

0094

別の態様では、本開示は、(a)多能性幹細胞を培養して、造血性内皮細胞(PVE−HE)を形成するステップ;および(b)造血性内皮細胞を培養して、巨核球前駆体(MLP)を形成するステップによって生成され得る巨核球前駆体(本明細書でMLPとも呼ばれる)(例えば、血小板を生成する方法においてまたは別の目的のために利用されるもの)を生成する方法を提供する。ステップ(a)は、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、b−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質(LDL)、コレステロール、骨形成タンパク質4(BMP4)(例えば、50ng/ml)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(例えば、50ng/ml)および血管内皮増殖因子(VEGF)(例えば、50ng/ml)から構成される動物成分フリーの培地の存在下で実施され得る。ステップ(b)は、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ハムF−12栄養混合物、Albucult(rhアルブミン)、ポリビニルアルコール(PVA)、リノール酸、SyntheChol(合成コレステロール)、モノチオグリセロール(a−MTG)、rhインスリン−トランスフェリンセレンエタノールアミン溶液、タンパク質フリーハイブリドーマ合物II(PFHMII)、アスコルビン酸ホスフェート、Glutamax I(L−アラニル−L−グルタミン)、ペニシリンストレプトマイシン、25ng/mlの幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)(例えば、25ng/ml)、Fms関連チロシンキナーゼ3リガンド(FL)(例えば、25ng/ml)、インターロイキン−3(IL−3)(例えば、10ng/ml)、インターロイキン−6(IL−6)(例えば、10ng/ml)およびヘパリン(例えば、5単位/ml)中で実施され得る。

0095

別の一態様では、本開示は、実施例1および2に示されるように、(a)多能性幹細胞を培養して、造血性内皮細胞(PVE−HE)を形成するステップ;(b)造血性内皮細胞を培養して、MLPを形成するステップ;および(c)MLPを培養して、巨核球を形成するステップによって生成され得る巨核球(例えば、血小板を生成する方法においてまたは別の目的のために利用されるもの)を生成する方法を提供する。ステップ(a)および(b)は、上述の段落に記載したように実施され得る。ステップ(c)は、基本培地としてのイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、b−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質(LDL)、コレステロール、TPO(例えば、30ng/ml)、SCF(例えば、1ng/ml)、IL−6(例えば、7.5ng/ml)、IL−9(例えば、13.5ng/ml)、ならびに任意選択でROCKインヒビター、例えば、これに限定されずY27632(例えば、5μM)および/またはヘパリン(例えば、5〜25単位/ml)中で実施
され得る。

0096

別の一態様では、本開示は、上記方法によって生成された血小板を含む医薬調製物を提供する。この調製物は、ヒト患者における使用に適切であり得、および/または少なくとも108個の血小板を含み得、および/または白血球を実質的に含まなくてもよい。

0097

別の一態様では、本開示は、それを必要とする患者または凝固に影響する疾患もしくは障害に罹患している患者の処置のための医薬の製造における、本明細書に記載されるかまたは本明細書に記載される任意の方法によって生成された任意の組成物の血小板の使用を提供する。

0098

別の一態様では、本開示は、血小板輸血を必要とする患者を処置する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるかまたは本明細書に記載される任意の方法によって生成された任意の組成物の血小板をこの患者に投与するステップを含み、これは、凝固および/もしくは他の血小板機能に影響する疾患もしくは障害、ならびに/または血小板減少症もしくは外傷などの、それによって処置され得る別の障害を処置するのに有効な量であり得る。血小板減少症は、血小板の生成、分布または破壊における乱れから生じる。血小板減少症は、肝硬変HIV感染自己免疫性疾患特発性血小板減少性紫斑病化学療法誘発性の骨髄機能抑制および骨髄障害を含む種々の医学的状態において頻繁に見出される。低い血小板計数は、出血のリスクの増加と関連している。それによって処置され得るさらなる例示的な疾患または障害は、マラリアおよび他の寄生生物感染症であり、理論に束縛されることは意図しないが、これは、寄生生物の消化胞を選択的に溶解させることによって赤血球内のマラリア寄生生物を死滅させるヒト血小板因子4の能力によって媒介されると考えられている(その全体が参照によって本明細書に組み込まれるLoveら、Cell Host Microbe 12巻(6号):815〜23頁を参照のこと)。

0099

別の一態様では、本開示は、薬物送達の方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるかまたは本明細書に記載される任意の方法によって生成された任意の組成物の血小板をこの患者に投与するステップを含み、この血小板が薬物を送達する。例えば、そのin
vivo寿命、投与後の生着欠如、およびホーミング特性に起因して、血小板は、薬物担体として有用であり得ると考えられる。hESC、hiPCおよびMLPは遺伝子改変され得、疾患の処置のための所望の薬物を発現する血小板を生成するために使用され得る。一態様では、hESC、hiPCまたはMLPは、抗腫瘍剤を発現するように遺伝子改変され得る。かかる遺伝子改変されたhESC、hiPSCおよびMLPから生成された血小板は、新生物疾患の処置のために腫瘍にかかる抗腫瘍剤を送達するために使用され得る。

0100

本発明の血小板は、受動的様式(経時的な血小板からの拡散)または能動的様式(血小板の活性化および脱顆粒の際に放出される)のいずれかで血小板によって放出される1種または複数の治療剤を含むように操作され得る。広範な薬物が使用され得る。操作された血小板は、シナプスおよび神経効果器接合部位において作用する薬物;中枢神経系に対して作用する薬物;炎症応答モジュレートする薬物;腎機能および/もしくは心血管機能に影響する薬物;胃腸機能に影響する薬物;抗生物質抗がん剤免疫調節剤;血液および/もしくは血液形性器官に対して作用する薬物;ホルモン;ホルモンアンタゴニスト石灰化および骨のターンオーバーに影響する薬剤ビタミン遺伝子治療剤;または標的化剤などの他の薬剤などからなる群から選択される1種または複数の化合物を含むように調製され得る。

0101

ある特定の実施形態では、血小板は、例えば、血小板の顆粒(例えばα−顆粒)中に貯蔵され得、好ましくは、血小板の活性化の際に放出され得る1種または複数の治療剤、例
えば小分子薬物アプタマーもしくは他の核酸薬剤、または組換えタンパク質を含むように操作されている。

0102

ある特定の実施形態では、血小板は、正常な創傷治癒を促進もしくは加速する外因性薬剤瘢痕を低減させる外因性薬剤、線維症を低減させる外因性薬剤1種もしくは複数、またはそれらの組合せを含む。

0103

ある特定の実施形態では、血小板は、1種または複数の外因性抗線維症剤を含む。抗血栓剤抗再狭窄剤を送達するように操作された血小板は、血管形成および血栓溶解手順の間に使用され得る。ある特定の実施形態では、操作された血小板は、アテローム動脈硬化症重症度を予防または低減するために使用され得る。ある特定の実施形態では、操作された血小板は、再狭窄の重症度を予防または低減するために使用され得る。なお他の実施形態では、操作された血小板は、固形腫瘍の処置の一環として使用され得る。操作された血小板は、1種または複数の免疫刺激剤を含み得る。

0104

本開示のさらなる一態様は、β2ミクログロブリン発現を欠損するように操作された細胞、例えばβ2ミクログロブリンノックアウト多能性細胞から血小板を生成するための本明細書に開示された任意の方法の使用を含む、β2ミクログロブリン欠損血小板、例えば、低減された免疫原性のまたは「ユニバーサル」な血小板を生成する方法を提供する。本開示は、β2ミクログロブリンの発現を欠くβ2ミクログロブリン欠損血小板、巨核球または血小板前駆体もまた提供する。β2ミクログロブリン欠損血小板は一般に、その原形質膜中に存在する、低いかまたは好ましくは検出不能なクラスIMHC分子を有し、それによって血小板の免疫原性を低減させる。

0105

別の一態様では、巨核球またはMLPから血小板を生成するための方法が提供され、この方法は、プロテアーゼインヒビターの存在下で、剪断力条件下で、MLPの巨核球の非接着性集団を培養するステップ、およびこの培養物から血小板を回収し、任意選択で単離するステップを含む。

0106

プロテアーゼインヒビターはMMPインヒビターであり得る。

0107

剪断力条件は一定の剪断力条件であり得る。剪断力条件は、1〜4.1ダイン/cm2の剪断力を含み得る。

0108

巨核球またはMLPは、マイクロ流体デバイス中で培養され得る。

0109

巨核球またはMLPは、iPS細胞、ES細胞、または天然に存在するCD34+細胞、任意選択で骨髄もしくは臍帯血CD34+細胞から誘導され得る。

0110

プロテアーゼインヒビターはMMPインヒビター、例えばGM6001であり得る。

0111

プロテアーゼインヒビターはMMP8特異的インヒビター、例えばMMP8−I((3R)−(+)−[2−(4−メトキシベンゼンスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−ヒドロキサメート])であり得る。

0112

プロテアーゼインヒビターは2種またはそれより多くのプロテアーゼインヒビターであり得る。

0113

2種のプロテアーゼインヒビターは、MMP一般的(汎)インヒビターおよびMMP8特異的インヒビターであり得る。

0114

プロテアーゼインヒビターが、培養物内の血小板のピーク生成の時点で添加され得る。

0115

巨核球またはMPLは、TPOまたはTPOアゴニストの存在下で培養されて、前血小板の形成を引き起こし得、この前血小板は血小板を放出する。巨核球またはMPLは、造血拡大増殖培地、および任意選択で(1)TPOもしくはTPOアゴニスト、SCF、IL−6およびIL−9または(2)TPOもしくはTPOアゴニスト、SCFおよびIL−11中で培養されて、培養において前血小板の形成を引き起こし得、この前血小板は血小板を放出する。

0116

巨核球またはMPLは、37℃よりも高く40℃と等しいかまたはそれより低い温度で培養され得る。

0117

巨核球またはMPLは約39℃の温度で培養され得る。

0118

別の態様では、巨核球またはMPLから血小板を生成するための方法であって、37℃よりも高く40℃と等しいかまたはそれより低い温度でiPS細胞またはES細胞から誘導された巨核球またはMPLの非接着性集団を培養するステップ、およびこの培養物から血小板を回収し、任意選択で単離するステップを含む方法が提供される。

0119

巨核球またはMPLは約39℃の温度で培養され得る。

0120

別の態様では、PVE−HE細胞からMPLを生成するための方法であって、BETのインヒビターの存在下でiPS細胞またはES細胞から誘導されたPVE−HE細胞の集団を培養するステップ、およびこの培養物からMPLを回収し、任意選択で単離するステップを含む方法が提供される。

0121

BETのインヒビターはI−BET151であり得る。

0122

BETのインヒビターは、培養の最後の48時間、最後の36時間、最後の24時間、最後の18時間、最後の12時間または最後の6時間において、PVE−HE細胞に添加され得る。

0123

別の態様では、PVE−HE細胞からMPLを生成するための方法であって、c−mycサプレッサーまたはインヒビターの存在下でiPS細胞またはES細胞から誘導されたPVE−HE細胞の集団を培養するステップ、およびこの培養物からMPLを回収し、任意選択で単離するステップを含む方法が提供される。

0124

c−mycサプレッサーまたはインヒビターは、培養の最後の48時間、最後の36時間、最後の24時間、最後の18時間、最後の12時間または最後の6時間において、PVE−HE細胞に添加され得る。

図面の簡単な説明

0125

多能性幹細胞からの血小板の生成を示す段階的プロセス。この図は、多能性幹細胞からの、多能性由来造血性内皮細胞(PVE−HE)を介し、巨核球系列特異的前駆細胞(MLP)を介し、巨核球(MK)を介した、分化の進行を示す。

0126

高度分化形態細胞(ADM)を介したiPS細胞の分化の進行。この図は、PVE−HEへ向けたiPS細胞の進行を示す。図2A、48時間後、付着した細胞は、フィーダーフリー条件下で典型的な多能性幹細胞形態を示す。図2B、多能性幹細胞形態から点在する小さい細胞クラスターへのほぼ完全な推移が示される。図2C、PVE−HE分化開始の96〜146時間後、単層の上で増殖している小さいコンパクトな細胞クラスターを示す、高度分化形態が観察された。

0127

図3。高度分化形態のPVE−HEの特徴付け。この図は、PVE−HEへ分化したADM細胞の表現型および形態を示す。ADM細胞は、分化のこの段階において、PVE−HE表現型CD31+CD144(VE−Cad)+CD105+を示す(図3A)。ADM細胞をまた、形態変化についても分析した(図3B)。
図3。高度分化形態のPVE−HEの特徴付け。この図は、PVE−HEへ分化したADM細胞の表現型および形態を示す。ADM細胞は、分化のこの段階において、PVE−HE表現型CD31+CD144(VE−Cad)+CD105+を示す(図3A)。ADM細胞をまた、形態変化についても分析した(図3B)。

0128

フローサイトメトリーによる、iPS−PVE−HE由来巨核球系列特異的前駆体(MLP)の特徴付け。この図は、ヒトiPS−PVE−HE−MLP細胞の表現型をCD34+CD31+CD41a+CD43+CD13+CD14−CD42b−/+として示す。

0129

ヒトiPS−PVE−HE−MLP由来の成熟中のMK細胞の形態分析。この図は、MK細胞の内側の核(「N」によって示される)、および容易に観察可能な、伸長した仮足を有する前血小板形成性細胞(矢印によって示される)を示す。血小板分化の開始の72時間後、非常に大きい倍数性MK(50μM)は、成熟化の進行を伴って豊富になった(図5AおよびB。5A中のスケールバーは100μMであり、5B中のNはMKの内側の核を示す)。72〜96時間から、伸長した仮足を有する前血小板形成性細胞が、顕微鏡により容易に観察された(図5Aおよび5C、矢印によって示される)。

0130

図6A〜E。異なる供給源由来の血小板調製物の表現型および純度の比較。この図は、形態ならびに末梢血由来ヒト血小板およびiPS−PVE−HE−MLP−MK由来血小板上のCD41aおよびCD42bの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。開始後72〜96時間の間、CD41a+CD42b+血小板の量は劇的に増加し、約70%もの高いレベルに達した(図6D)。図6A〜6Bは、ドナー由来ヒト血小板(6A)および実施例3に記載したように生成したhES由来血小板(hES−PVE−HE−MLP)(6B)についての、前方散乱(「FSC−A」)および側方散乱(「SSC−A」)を示す。図6C〜Eは、ドナー由来ヒト血小板(6C)、iPS由来血小板(iPS−PVE−HE−MLP)(6D)およびhES由来血小板(hES−PVE−HE−MLP)(6E)によるCD41aおよびCD42Bの発現を示し、後者の2つの試料は、実施例3に記載したように生成した。

0131

透過型走査顕微鏡による、末梢血由来ヒト血小板およびヒト人工多能性細胞の分化によって生成された血小板(hiPSC−PLT)の超微細構造的比較。この図は、末梢血由来ヒト血小板および本開示のhiPSC−PLTの細胞特徴における類似性を示す。hiPSC−PLTは円盤状である。

0132

末梢血由来ヒト血小板(hPRP)およびhiPSC−PLTの比較。この図は、血小板直径(左パネル)、ならびに活性化で誘発された血小板形状変化に関与する細胞構造タンパク質ベータ1−チューブリンおよびF−アクチンの発現(FITCファロイジン結合を介する)(右パネル)における、2つの細胞調製物間の類似性を示す。陰性Hoechst染色(右上)により、iPSC−PLTおよびドナー由来PLTにおける核DNAの非存在が確認された。

0133

末梢血由来ヒト血小板およびhiPSC−PLTの比較。この図は、微分干渉DIC生細胞顕微鏡を使用して、末梢血由来ヒト血小板および本開示のhiPSC−PLTの形態的特徴における類似性を示す。末梢血由来ヒト血小板およびhiPSC−PLTの両方が、負に荷電したガラス表面に結合したときの活性化を示す仮足放出を示す。

0134

末梢血由来ヒト血小板およびhiPSC−PLTの比較。この図は、トロンボスポンジン4(TSP4)および血小板因子4(PF4標識化によって実証されるように、アルファ−顆粒発現の類似性を示す。TSP4およびPF4は、活性化された血小板のアルファ−顆粒から放出されるケモカインである。hiPSC−PLT(図10B)は、TSP4およびPF4の標識化によって実証されるように、正常なヒト血小板(図10A)と比較して、正常なアルファ−顆粒発現を有することがわかった。

0135

hiPSC−PLTの機能的評価。この図は、2種の接着分子CD62pおよびαIIbβIIIの上方調節によって測定されるように(PAC−1 Abによって測定されるように)、トロンビンによるhiPSC−PLTのin vitro活性化を示す。

0136

循環ヒト血小板ならびにヒトiPSCおよびESCから誘導された血小板の機能的比較。この図は、循環ヒト血小板、hiPSC−PLTおよびhESC−PLTのin vivo血餅形成潜在力を示す。実験は、天然ヒト血小板(「hPLT」)、iPSC−PLTおよびhES細胞由来血小板(「hESC−PLT」)を用いて実施した。図12Aは、マウス血管壁傷害モデルにおいて形成された血栓代表的画像を示す。図12Bは、各実験において血栓に結合した血小板の平均数グラフにより示す。血小板結合は、抗αIIbβIII抗体断片ReoProによる処理によって阻害された。これは、結合が予測されたようにαIIbβIIIに依存したことを示している(図12B)。

0137

注入後のマクロファージ除去NOD/SCIDマウスにおけるPLTの動態。この図は、8時間のhiPSC−PLTおよびhESC−PLTの検出可能な循環を示す。

0138

多能性幹細胞からの血小板の生成のための例示的なプロセスフローダイヤグラム
多能性幹細胞からの血小板の生成のための例示的なプロセスフローダイヤグラム。
多能性幹細胞からの血小板の生成のための例示的なプロセスフローダイヤグラム。
多能性幹細胞からの血小板の生成のための例示的なプロセスフローダイヤグラム。
多能性幹細胞からの血小板の生成のための例示的なプロセスフローダイヤグラム。

0139

FACS分析(CD41a、CD42b)−hiPSCから誘導されたMLP。

0140

hiPSCから誘導された代表的MLP。

0141

FACS分析(CD31+、CD43+)−hiPSCから誘導されたMLP。

0142

hESCから誘導された代表的MK。

0143

MKからの前血小板形成。

0144

FACS分析(CD41a、CD42b)。

0145

β1−チューブリン染色と共にDIC顕微鏡法、ヒトドナーPLT(上)hESC−PLT(下)。

0146

一定の剪断力培養条件下で、DMSO(菱形)、MMPインヒビターGM6001(四角)、ならびにGM6001および8%デキストラン(「粘度」と称する)(三角)の存在下での、時間の関数として血小板純度。x軸は試料番号に対応し、試料は、6+時間の培養にわたって、30分毎に取り出した。

0147

一定の剪断力培養条件下で、DMSO(菱形)、MMPインヒビターGM6001(四角)、ならびにGM6001および8%デキストラン(「粘度」と称する)(三角)の存在下での、時間の関数としての血小板数。GM6001は0日目に培養物に添加した。

0148

一定の剪断力培養条件下でのDMSO(左の棒)およびMMPインヒビターGM6001(中央の棒)の存在下、ならびに静置培養条件下(MMPインヒビターGM6001の非存在下)(右の棒)での、血小板数。

0149

12マイクロリットル/分の流速(四角)および16マイクロリットル/分の流速(三角)で、マイクロ流体デバイス中におけるMMPインヒビターGM6001の存在下での時間の関数としての血小板純度。MMPインヒビターはDMSO中に溶解されるので、対照(菱形)はDMSOの存在下である。

0150

流速の関数としての血小板数。左の棒:12マイクロリットル/分、右の棒:16マイクロリットル/分。

0151

MMP8特異的インヒビターMMP8−I(第2の棒)、汎MMPインヒビターGM6001(第3の棒)、またはMMP8−IおよびGM6001の組合せ(第4の棒)の存在下での静置培養の結果としての血小板純度。MMP8−Iは、(3R)−(+)−[2−(4−メトキシベンゼンスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−ヒドロキサメート]であり、Millipore社から市販されている。第1の棒は対照である。

0152

MMP8特異的インヒビターMMP8−I(第2の棒)、汎MMPインヒビターGM6001(第3の棒)、またはMMP8−IおよびGM6001の組合せ(第4の棒)の存在下での静置培養の結果としての血小板数。第1の棒は対照である。

0153

37℃(対の左の棒)および39℃(対の右の棒)での培養における、時間の関数としての血小板純度。温度は、培養の開始時に設定し、培養を通じて維持した。

0154

37℃(対の左の棒)および39℃(対の右の棒)での培養における、時間の関数としての血小板数。

0155

6+4日目(即ち、分化の10日目)において回収した、漸増用量のiBET−151(μM)の関数としての巨核球前駆体(MLP)数。iBETを、6+3日の時間枠において培養物に添加し、MLPを、その回収の前に約24時間の期間にわたってiBETに曝露させる。iBET濃度:0(左の棒)、0.1マイクロM(中央の棒)、0.25マイクロM(右の棒)。

0156

漸増用量のiBET−151の関数としての、6+4日目のc−mycおよびGATA−1のmRNA相対的定量分析。iBET濃度:各三つ組について、0(左の棒)、0.1マイクロM(中央の棒)、0.25マイクロM(右の棒)。

0157

漸増用量のiBET−151の関数としての、6+4日目に回収された細胞集団におけるCD14+細胞の純度。iBET濃度:0(左の棒)、0.1マイクロM(中央の棒)、0.25マイクロM(右の棒)。

0158

発明の詳細な説明
本開示において使用する定義および略号リストは、詳細な説明の最後に提供する。

0159

上述のように、血小板の供給における制約は、輸血に依存する患者にとって、生命を脅かす結果を潜在的に有し得る。多能性細胞は、in vitroで無制限に繁殖され得、ヒト治療のための血小板の、潜在的に無尽蔵のドナーなしの供給源を提示する。マッチしたまたは低減された不適合性を有するhESC株のバンクを創出する能力は、免疫抑制薬および/または免疫調節プロトコールの必要性を、潜在的に減少させるまたは排除することができた。例示的な実施形態は、患者特異的iPS細胞を(例えば、本明細書に記載される方法または当技術分野で公知の任意の他の方法を使用して)生成するステップ、およびこの患者特異的iPS細胞から患者特異的血小板を生成するステップを含む方法を提供し、この血小板は、血小板同種免疫を発達させた患者またはそれを発達させるリスクがある患者などの患者の処置のために使用され得る。

0160

例示的な実施形態は、血清フリーおよびフィーダーフリー条件下で多能性幹細胞から巨核球(MK)を生成するための効率的な方法を提供する。好ましくは、MKは、巨核球系列特異的前駆細胞(MLP、これは、本明細書にさらに記載される)から生成される。好ましくは、MKは、米国特許第8017393号に開示されているもののような血管芽細胞または血管コロニー形成細胞(hemangio−colony forming cell)からは生成されない。本明細書に開示される方法を使用して、多能性幹細胞(iPSCおよびESC)を、MK分化に向けて方向付けた。MLPからの巨核球の分化の効率は、非常に高くなっていた(最大90%)。さらなる精製なしに、MK懸濁培養物由来の生細胞の85%は、CD41a+CD42b+であり、成熟MKは、CD29+およびCD61+でもあった。これらのin vitro誘導されたMK細胞は、核内分裂を起こすことができ、成熟した倍数体MKになることができる。重要なことに、伸長した仮足を有する前血小板形成性細胞は、MK培養の後期段階で観察された。これは、この系において生成されたMKは、フィーダーフリー条件下で最終分化を起こすことができ、機能的血小板を生成できることを示している。

0161

制御された条件下で、iPSCまたは他の多能性幹細胞を供給源細胞として使用した、大規模かつ効率的なin vitro巨核球生成に適合可能な効率的な系が、本明細書に記載される。さらに、血小板は、ドナー由来血小板に対する必要性を補完するまたはそれに取って代わるのに十分な量で、生成され得る。さらに、開示される方法は、予測可能な様式で血小板および血小板前駆細胞を生成するために利用され得、その結果、この細胞は、「オンデマンド」で、または予想された必要性を満たすのに望ましい量で、生成され得る。この細胞は、CD41aおよびCD42bを発現し、核内分裂を起こして、成熟倍数体MKを形成した。さらなる成熟化の際に、これらは、トロンビンによって刺激されて細
胞接着分子CD62pおよびαIIbβIIIについて陽性になった(活性化の際のαIIbβIIIのコンフォメーション変化後のPAC−1結合部位露出によって生じると考えられるが、CD62pは顆粒放出に起因して外側膜上に露出されると考えられる)、機能的または活性化された血小板を生成した。これらのマーカーは両方とも、活性化された血小板の表面上に発現されることが公知であり、PAC−1およびCD62p(p−セレクチン結合アッセイを使用して、hiPSC−PLT上で検出された。間質インデューサー細胞は巨核球生成に必要とされないので、本明細書に記載される方法は、フィーダーフリーの血小板生成、例えば、異種細胞のいずれの使用も伴わない血小板生成を提供し得る。

0162

例示的な実施形態では、エストラジオールビタミンB3マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター(MMP)、c−myc発現のインヒビター、および細胞外マトリックスタンパク質を含むさらなる因子もまた、血小板生成を増強するために使用され得(例えば、巨核球成熟化を刺激することおよび/または血小板生成を刺激することによって)、これは間質細胞の非存在下で実施され得る。

0163

血清フリーおよび間質フリー条件下での巨核球の生成は、十分に規定された条件下で巨核球形成および血小板新生を調節することにおいて重要な因子についてのスクリーニングを可能にし得る。そうして同定された因子は、臨床適用に寄与し得る。この分野での進歩は、系列の傾倒、拡大増殖および成熟化を含む、巨核球形成の異なる態様を調節する細胞機構および分子機構に関する洞察を提供する可能性もまたあり得る。

0164

例示的な実施形態は、多能性幹細胞からの巨核球分化の段階的誘発を統合する。進行中の制御のさらなる最適化および確立が、臨床適用のためにこの系の一貫性および効率を改善するために実施され得る。巨核球成熟化を調節する、根底の細胞機構または細胞外機構は、これらの方法を実施するために完全に規定される必要はない。倍数体化および細胞質成熟化を促進する他の因子が同定され、in vitro誘導された巨核球の最終分化を促進するために含まれ得る。例えば、少なくとも1種のROCKキナーゼインヒビターが、初期段階で巨核球の核内分裂を誘発するために使用され得る。しかし、この効果は、分化している巨核球の組織化された細胞および核の成熟化ではなく、染色体分配および細胞質分裂の人工的遮断に起因する可能性が高いと考えられる。規定された条件下での最も高いin vitro巨核球収量、最終分化状況、および機能的血小板の下流の生成を達成するために拡大増殖と核内分裂と細胞質成熟化との間のバランスに達することが有利であり得る。

0165

これらの現在の結果は、多能性幹細胞から誘導された血小板が、正常な血液血小板の形態的特性および機能的特性共有することを実証した。これらの多能性幹細胞由来ヒト血小板は、in vivoでも機能できる。

0166

さらなる血行力学的事象が、in vitro系によって完全には模倣することができない生きた生物における血小板血栓の生成および繁殖の間に生じ得る。生体内画像化技術の利用可能性は、複雑なin vivo系において脈管傷害後に生じる血小板依存的な血栓性プロセスを直接的に試験および定量するための手段を提供する。生体内高速広視野顕微鏡を使用して、本発明者らは、多能性幹細胞由来血小板は、正常なヒト血液血小板と同様に、生きたマウス中のレーザー誘発性細動脈壁傷害の部位において発達しているマウス血小板血栓中に取り込まれることを実証した。ReoProによる多能性細胞由来血小板および対照血小板の事前処理は、血栓中に取り込まれている供与された血小板および多能性幹細胞由来血小板の両方の数を顕著に低減させ、この結合がαIIbβIIIインテグリンによって媒介されることが確認された。これらの結果は、多能性幹細胞由来血小板が、生きた動物における脈管傷害の部位において機能的であることを示す。

0167

血小板は、脈管傷害に応答して組織にかつ互いに接着する無核細胞である。このプロセスは、いくつかの接着性基質、例えば、フォン・ヴィルブランド因子(vWF)およびフィブリノーゲンに結合して、成長中の血栓において血小板を架橋しさらに活性化する、血小板インテグリンαIIbβIIIによって主に媒介される(36)。本明細書の結果は、多能性幹細胞から生成された血小板が、in vitroおよび生きた動物の両方において、正常な血液血小板と機能的に類似していることを実証する。多能性幹細胞由来血小板は、生理学的アゴニストで刺激された時に凝集する能力を含む、止血に関与する重要な機能を有することが示された。さらに、免疫蛍光および透過型電子顕微鏡の結果は、多能性幹細胞から生成された血小板が、正常な血液血小板と類似していることをさらに実証している。

0168

以下の例にさらに記載するように、多能性細胞由来血小板と精製された正常ヒト血小板との間の多数の類似性が観察された。これらの類似性には以下が含まれる。

0169

hiPSC−PLTは円盤状である(透過型電子顕微鏡によって実証されるように)。

0170

hiPSC−PLTは、循環ヒトPLTと大部分は超微細構造的に同一である(透過型電子顕微鏡によって実証されるように)。

0171

hiPSC−PLTのサイズは、DICおよびβ1−チューブリンIF顕微鏡によって実証されるように、循環ヒトPLTのサイズに匹敵する(2.38μm±0.85μm対2.27μm±0.49μm)

0172

hiPSC−PLTは、DIC生細胞顕微鏡画像によって実証されるように、ガラス上に伸展することができ、糸状仮足および葉状仮足の両方を形成することができた。

0173

hiPSC−PLTは無核である−循環ヒトPLTと同等である(Hoechst標識化によって実証されるように)。

0174

hiPSC−PLTは、循環ヒトPLTと比較して、正常なチューブリン細胞骨格を有する(β1−チューブリン標識化によって実証されるように)。

0175

hiPSC−PLTは、循環ヒトPLTと比較して、正常な線維アクチンを有する(ファロイジン標識化によって実証されるように)。

0176

hiPSC−PLTは、循環ヒトPLTと比較して、正常なアルファ−顆粒発現を有する(TSP4およびPF4の標識化によって実証されるように)。

0177

別の科学的および臨床的な問題は、多能性幹細胞由来血小板が複雑なin vivo環境において機能的であるかどうかである。いくつかのグループによって近年使用されているレーザー傷害血栓症モデルを含む多数の実験モデルが、マウスにおいて血栓形成を調査するために過去10年間に確立された(37:38:39)。レーザー誘発性の血栓症モデルは、傷害の5〜30秒後に早くも血小板血栓形成を開始する。したがって、このモデルは、迅速に排除されるヒト血小板およびhESC−PLTの、発達中のマウス血小板血栓中へのリアルタイム取り込みのモニタリングを可能にし、これは、多数のシグナル伝達経路、酵素カスケード、ならびに無数の細胞成分およびタンパク質成分相互作用を含む。このモデルは、トロンビン誘発性血栓症と関連する炎症反応もまた反映する。

0178

レーザー誘発性脈管傷害モデルを使用して、生体内顕微鏡分析により、hiPSC−P
LTおよびhESC−PLTが、血液血小板と同様、脈管傷害後にαIIbβIIIインテグリンを介して発達中のマウス血小板血栓中に取り込まれることが実証されている(図12A)。hiPSC−PLTおよびhESC−PLTの機能的能力は、αIIbβIIIに特異的に結合して血小板機能を阻害するヒト−マウスキメラモノクローナル抗体Fab断片ReoProによる事前処理によって、αIIbβIIIによって媒介されることが決定された(図12B)。これらの結果は、hESC−PLTが脈管傷害の部位においてin vivoで機能的であるという証拠を提供する。重要なことに、血清フリー条件およびフィーダーフリー条件下で多能性幹細胞から誘導された血小板は、凝血および血栓形成をin vivoで促進することができることが最初に示された。

0179

2つの以前の研究が、hESCからのMKの生成を報告している。これらの系における収量は非常に低く、本発明の系とは異なり、血清を補充した動物間質細胞との共培養に依存する(15、16)。さらに、in vivoでの機能性は報告しなかった(15、16)。多能性幹細胞分化におけるこれら2つの変数の排除は、動物生成物への曝露なしでの血小板の生成を可能にする。さらに、本開示は、本明細書に記載されるフィーダーフリーの系が高い効率でMKを生成できること、および機能的な血小板がフィーダーフリー条件下で効率的に生成され得ることを実証している。

0180

血小板新生は、膜および微小管洗練された再編成ならびに顆粒およびオルガネラの正確な分布を伴う、高度に複雑なプロセスである(40)。血小板生合成の理解における最近の進歩にもかかわらず、膜再編成、前血小板の開始、血小板オルガネラおよび分泌顆粒輸送ならびに血小板サイズの制御の根底にある機構的詳細は、未だ解明されていない。血清およびフィーダーフリー条件下でMKを生成する能力は、十分規定された条件下で、系列の傾倒、拡大増殖および成熟化を含む巨核球形成の異なる態様を調節することにおいて重要な因子のスクリーニングを助けるはずである。

0181

本開示は、iPS由来またはESC由来であるPVE−HE細胞、MLP、MK、前血小板および血小板をin vitro(またはex vivo)で生成するための種々の方法を提供する。

0182

本開示は、iPS細胞またはES細胞からPVE−HE細胞へ、またはMLPへ、またはMKへ、または血小板へと推移させるための方法を提供する。本開示は、PVE−HE細胞からMLPへ、またはMKへ、または血小板へと推移させるための方法を提供する。本開示は、MLPからMKへ、または血小板へと推移させるための方法を提供する。本開示は、MKから血小板へと推移させるための方法を提供する。これらの種々の培養は、以下に簡潔に記載される。

0183

PVE−HE細胞は、基本培地としてのイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、b−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質(LDL)、コレステロールを含み、骨形成タンパク質4(BMP4)(例えば、50ng/ml)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(例えば、50ng/ml)および血管内皮増殖因子(VEGF)(例えば、50ng/ml)をさらに含む培養培地中でiPS細胞またはES細胞を培養するステップを含む方法を介して、iPS細胞またはES細胞から生成され得る。この培養期間は、平均して6日間持続し得る。

0184

MLPは、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ハムF−12栄養混合物、Albucult(rhアルブミン)、ポリビニルアルコール(PVA)、リノール酸、SyntheChol(合成コレステロール)、モノチオグリセロール(a−MTG)、rhインスリン−トランスフェリン−セレン−エタノールアミン溶液、タンパク質フリーハイ
ブリドーマ混合物II(PFHMII)、アスコルビン酸2ホスフェート、Glutamax I(L−アラニル−L−グルタミン)、ペニシリン/ストレプトマイシンを含み、幹細胞因子(SCF)(例えば、25ng/ml)、トロンボポエチン(TPO)(例えば、25ng/ml)、Fms関連チロシンキナーゼ3リガンド(FL)(例えば、25ng/ml)、インターロイキン−3(IL−3)(例えば、10ng/ml)、インターロイキン−6(IL−6)(例えば、10ng/ml)および任意選択でヘパリン(例えば、5単位/ml)をさらに含む培養培地中でPVE−HE細胞を培養するステップを含む方法を介して、PVE−HE細胞から生成され得る。この培養期間は、平均して3〜4日間持続し得る。最後の48時間、最後の36時間、最後の24時間、最後の18時間、最後の12時間または最後の6時間を含む培養の後半で、BETのインヒビターが、培養物に、好ましくは細胞毒性未満のレベルで添加され得る。これらの培養物から回収されたMLPは、血小板生成またはその他分析のために凍結保存されてもよいし、または直ぐに使用されてもよい。

0185

巨核球は、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、b−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質(LDL)、コレステロールを含み、TPO(例えば、30ng/ml)、SCF(例えば、1ng/ml)、IL−6(例えば、7.5ng/ml)、IL−9(例えば、13.5ng/ml)ならびに任意選択で、ROCKインヒビター、例えばY27632(例えば、5μM)および/またはヘパリン(例えば、5〜25単位/ml)をさらに含む培地中でMLPを培養するステップを含む方法を介して、MLPから生成され得る。

0186

巨核球は、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、b−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質(LDL)、コレステロールを含み、TPO(例えば、10〜100ng/ml)、SCF(例えば、0.5〜100ng/ml)、IL−11(例えば、5〜25ng/ml)ならびに任意選択で、ROCKインヒビター、例えばY27632(例えば、5μM)および/またはヘパリン(例えば、2.5〜25単位/ml)のうち1種または複数をさらに含む培地中でMLPを培養するステップを含む方法を介して、MLPから生成され得る。

0187

この後者の培養は、培養の長さに依存して、MKおよび血小板を生成する。血小板は、典型的には、培養の約3〜4日目までに観察される。この培養期間の間、MLPはMKへと成熟化しており、MKは前血小板へと成熟化しており、前血小板は血小板へと成熟化していると理解される。

0188

したがって、血小板は、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、b−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質(LDL)、コレステロールを含み、TPO(例えば、30ng/ml)、SCF(例えば、1ng/ml)、IL−6(例えば、7.5ng/ml)、IL−9(例えば、13.5ng/ml)ならびに任意選択で、ROCKインヒビター、例えばY27632(例えば、5μM)および/またはヘパリン(例えば、5〜25単位/ml)をさらに含む培地中でMLPまたはMKを培養するステップを含む方法を介して、MLPまたはMKから生成され得る。これらの培養期間は、4〜8日間の長さまたはそれより長くであり得る。

0189

血小板は、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、b−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質(LDL)、コレステロールを含み、TPO(例えば、10〜100ng/ml)、SCF(例えば、0.5〜100ng/ml)、IL−11(例えば、5〜25ng/ml)
ならびに任意選択で、ROCKインヒビター、例えばY27632(例えば、5μM)および/またはヘパリン(例えば、2.5〜25単位/ml)のうち1種または複数をさらに含む培地中でMLPまたはMKを培養するステップを含む方法を介して、MLPまたはMKから生成され得る。

0190

これらの血小板生成法は、静置培養条件または剪断力培養条件下でのMLPまたはMKの培養を含む。静置培養条件は、培養されている細胞と接触する培養培地が、比較的静的である培養条件である。剪断力培養条件は、培養されている細胞と接触する培養培地の意図的な一定の動きを含む培養条件である。剪断力はダイン/cm2で測定される。一部の例では、この剪断力は、骨髄の造血環境において生じる剪断力に近い。BM類洞における剪断力は、約1.3〜4.1ダイン/cm2であると報告されている。本開示は、剪断力培養が、約1〜約4.5ダイン/cm2、または約1.3〜約4.1ダイン/cm2の範囲の剪断力、例えば、その間の任意の力または任意の範囲の力、例えば、約1.5、約2.0、約2.5、約3.0、約3.5、約4.0および約4.1ダイン/cm2で実施され得ることを企図する。

0191

培養は、かかる剪断力を生じる流速で実施され得ることが理解される。所与の培養について、剪断力は、流速(容量/時間)と関連する。剪断力は、当技術分野の知識を使用して、任意の所与の培養物または培養デバイスについて、流速の知識を用いて決定され得る。本明細書に提供される実験結果の一部は、12マイクロリットル/分および16マイクロリットル/分の流速での、所与のマイクロ流体デバイスにおける血小板生成を比較している。一部の例では、流速は、5〜25マイクロリットル/分の範囲内、または10〜20マイクロリットル/分以内であり得る。一部の例では、流速は、10〜15マイクロリットル/分の範囲内であり得、他の例では、16〜20マイクロリットル/分の範囲内であり得る。

0192

剪断力培養が使用される場合、この血小板生成法は、3〜4日間または血小板が観察されるまでの静置培養での第1の培養期間と、その後の、マイクロ流体デバイスまたは剪断力を誘発することが可能な他のデバイスなどの剪断力環境中での第2の培養とを含み得る。

0193

一定分量がかかる培養物から回収され、血小板計数について測定され得ることを理解すべきである(例えばFACSを使用して)。これにより、ピーク血小板生成の期間が同定される。

0194

血小板生成法は、MLPおよびMKの混合物を出発材料として有するか、またはMLPおよびMKの混合物を、培養期間の間のいくつかの時点においてその培養培地中に含む場合が多いこともまた、理解すべきである。

0195

本開示は、マイクロ流体デバイスまたは剪断力条件が達成され得る他の培養デバイス中でMLPまたはMKが培養されることを企図する。一部の例では、このデバイスは、MLPまたはMKが、このデバイス内で固定化されるがこのデバイスに付着しないように設計される。一部の例では、このデバイスは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)またはジメチコンなどの合成樹脂で製造される。これらは、マイクロ流体デバイスおよびチップにおいて一般に使用される。

0196

本開示は、血小板が剪断力培養条件を使用して生成される場合に、特定のプロテアーゼインヒビターが培養物に添加されるとき、より良い血小板の収量および機能性が得られることをさらに企図する。本開示によって、血小板が剪断力下に置かれた場合、細胞表面CD42bが血小板表面から喪失され得、血小板の活性を低くすることが見出された。これ
を回避し、剪断培養の利益をなおも得るために、本開示は、CD42bの剪断または喪失を防止するプロテアーゼインヒビターを使用することを企図する。かかるインヒビターの例には、メタロプロテアーゼインヒビターおよびより具体的にはマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)インヒビターが含まれる。剪断培養において使用され得るインヒビターの別の例は、プラスミノーゲン活性化因子インヒビターである。これらのインヒビターは、汎インヒビターであり得、これは、単一のインヒビターが、そのクラス内の1種よりも多くのおよび場合によっては全てのプロテアーゼを阻害し得ることを意図する。あるいは、これらは特異的インヒビターであり得、これは、単一のインヒビターが、そのクラス内の1種のプロテアーゼを完全にまたは大部分阻害することを意図する。

0197

一部の例では、培養は、MMPインヒビターの存在下で実施される。インヒビターは、例えば、有機分子、抗体または抗体断片、アンチセンスまたはRNAi核酸などの小分子であり得る。

0198

MMPインヒビターの例としては、以下が含まれるがこれらに限定されない:GM6001(汎インヒビター)、N−ダンシル−D−フェニルアラニン、4−エピ−クロルテトラサイクリンピリドキサチン塩酸塩(Hydrochloride Pyridoxatin)、ARP100、ARP 101、バチマスタットクロルヘキシジン二塩酸塩、シス−ACCP、CL82198塩酸塩、ミノサイクリン,塩酸塩、アレンドロネートナトリウム塩、GM 1489、TAPI−1、TAPI−2、GM 6001、マリマスタット、MMPインヒビターII、MMPインヒビターIII、EGTA、MMPインヒビターV、MMP−13インヒビター、MMP−2インヒビターI、MMP−2インヒビターII、CP 471474、MMP−2/MMP−3インヒビターI、MMP−2/MMP−3インヒビターII、MMP−2/MMP−9インヒビターI、MMP−2/MMP−9インヒビターII、MMP−2/MMP−9インヒビターV.エコチン、E.coli、MMP−3インヒビター、MMP−3インヒビターIII、MMP−3インヒビターIV、アクチノニン、MMP−3インヒビターV、MMP−3インヒビターVIII、MMP−7アンチセンスオリゴヌクレオチド、ナトリウム塩、MMP−8インヒビターI、MMP−9インヒビターI、MMP−9/MMP−13インヒビターI、MMP−9/MMP−13インヒビターII、NNGH、NSC 23766、PD166793、Pro−Leu−Glyヒドロキサメート塩酸塩、Ro 32−3555、PF−356231、SB−3CT、ホスホラミドン、WAY 170523、UK 370106、UK 356618、塩化バリウム二水和物(dehydrate)、ルテオリンイソババカルコン(Isobavachalcone)、ドキシサイクリンクレートコラゲナーゼインヒビターI、o−フェナントロリンおよびSanta Cruz Biotechnology,Inc.のTAPI−0。これらには、TIMP−1、TIMP−2、TIMP−3、TIMP−4、GM6001、メチルプレドニゾロン、バチマスタット、マリマスタット、プリノマスタット、BAY 12−9566、MMI270(B)、BMS−275291、メタスタット(metastat)およびMMP−1〜MMP−26の他のインヒビターもまた含まれる。MMPインヒビターは、1種のMMPファミリーメンバーのみを阻害してもよいし、または1種よりも多いもしくは全てのMMPファミリーメンバーを阻害してもよいことを理解すべきである。

0199

特定の合成MMPインヒビターは一般に、MMP活性部位における触媒亜鉛原子に緊密に結合するキレート基を含む。一般的なキレート基には、ヒドロキサメート、カルボキシレートチオールおよびホスフィニルが含まれる。

0200

他のMMPインヒビターには、BB−94、Ro 32−3555、BB−1101、BB−2516、SE205、CT1746、CGS 27023A、AG3340、BAY 12−9566、D2163、D1927、PNU−142372、CMT−1お
よびアクチノニンが含まれる。

0201

多くのMMPインヒビターが市販されている。

0202

当技術分野では、MMPインヒビターが熟知されており、さらなる例は、その各々が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第4,877,805号;第5,837,224号;第6,365,630号;第6,630,516号;第6,683,069号;第6,919,072号;第6,942,870号;第7,094,752号;第7,029,713号;第6,942,870号;第6,919,072号;第6,906,036号;第6,890,937号;第6,884,425号;第6,858,598号;第6,759,432号;第6,750,233号;第6,750,228号;第6,713,074号;第6,699,486号;第6,645,477号;第6,630,516号;第6,548,667号;第6,541,489号;第6,379,667号;第6,365,630号;第6,130,254号;第6,093,398号;第5,962,466号;第5,837,224号;第7,705,164号;第7,786,316号;第8,008,510号;第7,579,486号;第8,318,945号;および第7,176,217号;公開米国特許出願第20070037253号;第20060293345号;第20060173183号;第20060084688号;第20050058709号;第20050020607号;第20050004177号;第20040235818号;第20040185127号;第20040176393号;第20040067883号;第20040048852号;第20040034098号;第20040034086号;第20040034085号;第20040023969号;第20040019055号;第20040019054号;第20040019053号;第20040006137号;第20040006077号;第20030212048号;第20030004165号;第20020198176号;第20020177588号;第20020169314号;第20020164319号;第20020106339号;第20020061866号;第20020054922号;第20020049237号;第20020010162号;第20010039287号;および第20010014688号;ならびに公開されたPCT出願WO 02/064552、WO 05/1103399、WO 06/028523、WO2008/024784、WO 02/064552、WO 05/110399、WO 06/028523、WO01/62261およびWO2008/024784において提供される。

0203

MMPインヒビターは、科学文献中にも記載されており、例えば、WhittakerらChem Rev. 99巻:2735〜2776頁、1999年;WhittakeらCelltransmissions 17巻(1号):3〜14頁(表AB)およびHarrison、Nature Reviews Drug Discovery 6巻:426〜427頁、2007年(表AC)を参照されたいが、その具体的な教示は、参照によって本明細書に組み込まれる。

0204

いくつかのMMPインヒビターは以下であり得る。

0205

0206

一部の例では、MMP8インヒビター、例えば特異的MMP8インヒビターが、静置培養または剪断力培養において使用され得る。一部の例では、このMMP8インヒビターは、天然に存在するMLPおよびMK、例えば、骨髄または臍帯血由来のMLP(例えば、CD34+前駆細胞)またはMKの培養において使用され得る。

0207

MMP8特異的インヒビターの一例は、化学名(3R)−(+)−[2−(4−メトキシベンゼンスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−ヒドロキサメート]を有するMMP8−Iであり、Milliporeから市販されている。

0208

一部の例では、このプロテアーゼインヒビターは、プラスミノーゲン活性化因子インヒビターであり得る。プラスミノーゲン活性化因子インヒビターの例には、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1(PAI−1)、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター2(PAI−2)および組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)インヒビターが含まれるがこれらに限定されない。他のプラスミノーゲン活性化因子インヒビターには、その各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,923、807号;国際PC
T出願WO/13063331;WO/1316974;および参考文献Fortenberry YM. Plasminogen activator inhibitor−1 inhibitors: a patent review (2006−present). Expert Opin Ther Pat. 2013年7月;23巻(7号):801〜15頁;およびPannekoekら、EMBO J. 1986年;5巻(10号):2539〜44頁に記載されるものが含まれる。

0209

一部の例では、2種以上のプロテアーゼインヒビターが、培養物中で一緒に使用され得る。一例として、MMPインヒビターGM6001は、MMP8特異的インヒビターMMP8−Iと一緒に使用され得る。

0210

一部の例では、培養は、37℃を上回る温度で実施され得る。培養温度は、37℃〜45℃の範囲内、または37℃〜42℃の範囲内、または38℃〜41℃の範囲内、または39℃〜40℃の範囲内、または約39℃もしくは約40℃であり得る。培養は、設定された温度で実施される。37℃を上回る温度での培養は、本明細書で昇温培養と呼ぶ。

0211

一部の例では、PVE−HE細胞からMLPを生成する方法は、BETファミリーブロモドメイン含有タンパク質のインヒビターの存在下で実施される。BETインヒビターは、BETファミリーメンバーを阻害する任意の分子または化合物であり得、核酸、例えばDNAおよびRNAアプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAおよびshRNA、小ペプチド、抗体または抗体断片、ならびに小分子、例えば、小さい化学物質化合物であり得る。BETインヒビターは、少なくとも1つのBETファミリーメンバーのブロモドメインの、タンパク質のアセチルリシン残基への結合を防止または低減させ得る。BETインヒビターは、1種のBETファミリーメンバーのみを阻害してもよいし、または1種よりも多くのもしくは全てのBETファミリーメンバーを阻害してもよいことを理解すべきである。

0212

BETインヒビターの例は、参照によって本明細書に組み込まれる、US 2011143651、WO2009/084693A1、WO 2011143669、WO 2011143660、WO 2011054851およびJP 2008156311に記載されている。

0213

当技術分野で公知のBETインヒビターの例には、以下が含まれるがこれらに限定されない:RVX−208(Resverlogix)、PFI−1(Structural
Genomics Consortium)、OTX015(Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation)、BzT−7、GSK525762A(iBET、GlaxoSmithKline)、JQ1(Cell 2011年146巻(6号):904〜17頁)および以下の化合物(WO 2011054851、GlaxoSmithKline):

0214

0215

一部の実施形態では、BETインヒビターは、BETファミリーメンバー(例えば、BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRD7、BRDT;WO2011143669を参照のこと)の第1のブロモドメインの結合ポケットに結合する小分子化合物(例えば、JQ1またはその誘導体)である。他のBETインヒビターには、JQ1S、JQ1R、JQ20、JQ8、JQ6、JQ13、JQ19、JQ18、JQ11、JQ21、JQ24BおよびKS1が含まれる。

0216

BETインヒビター(本明細書でiBETと呼ぶ)の別の例は、GSK1210151A(本明細書でI−BET−151と呼ぶ)である。他のBETインヒビターには、IBET151およびIBET762が含まれる。

0217

多くのBETインヒビターは、抗白血病剤として有用である。本開示の方法において使用する場合、これらは、典型的には低濃度(即ち、その細胞毒性効果が観察されるレベル未満)で使用される。

0218

本開示は、BETインヒビターが、PVE−HE細胞をMLPに分化(または成熟化)させる培養期間の間に使用されることを企図する。この培養期間は、通常は約4日間持続する。BETインヒビターは、典型的には、培養の最後の48時間、最後の36時間、最後の24時間、最後の12時間または最後の6時間を含む、培養の後半に添加される。

0219

Mycインヒビターには、10058−F4およびCX−3543が含まれる。

0220

巨核球系列前駆体

0221

本開示の種々の実施形態は、多能性幹細胞(ヒトiPSおよびヒトESを含む)から巨核球系列前駆体(MLP)を生成する方法、ならびにMLPの組成物を提供する。

0222

初期系列造血性内皮細胞はCD41a陰性であり、造血前駆体への後期段階造血性分化の間にCD41aを発現する。CD42bは、成熟巨核球において排他的に発現される。MLP培養物は、高い割合のCD41+細胞および低い割合のCD42+細胞を伴って、不均一であり得る。

0223

MLPは、FACS分析によって、CD41aおよびCD42b二重陽性細胞百分率について評価され得る。CD41aは、フィブリノーゲン受容体(αIIbβIII)のサブユニットであり、CD42bは、フォン・ヴィルブランド因子受容体(GPIb−V−IX)上のサブユニットである。両方の受容体の発現は、巨核球系列に特異的であり、両方とも、血小板機能に必要とされると考えられる。

0224

凍結保存のための回収前に、MLPは、付着細胞のおよその百分率および低い核対細胞質比を有する分化した大きい細胞の程度について評価され得る。付着細胞は、明確なコロニー境界を有さない拡散コロニーとして表れ得る。付着細胞集団の上に静止している豊富な浮遊MLPが存在し得る。生存浮遊MLPは、最小の複屈折で、平滑な細胞膜によって境界が定められて、明確に見え得る。

0225

MLPおよびその組成物は、任意選択で、凍結保存組成物として提供され得る。

0226

別の一実施形態では、本開示は、細胞分化モジュレーターについてスクリーニングする方法を提供し、この方法は、ある量のPVE−HE細胞または巨核球前駆体(MLP)を提供するステップ;このPVE−HE細胞またはMLPを試験化合物と接触させるステップ;このPVE−HE細胞またはMLPとこの試験化合物との間の接触からの機能的影響の存在または非存在を決定するステップを含み、機能的影響の存在は、この試験化合物が細胞分化をモジュレートする巨核球形成因子、血小板新生因子および/または造血因子であることを示し、機能的影響の非存在は、この試験化合物が細胞分化をモジュレートする巨核球形成因子、血小板新生因子および/または造血因子ではないことを示す。他の実施形態では、巨核球形成因子、血小板新生因子および/または造血因子は、機能的血小板の拡大増殖、核内分裂、細胞質成熟化および最終分化に関連する。

0227

巨核球

0228

本開示の種々の実施形態は、間質フリー条件下および/または血清フリー条件下で多能性幹細胞(ヒトiPSおよびヒトESを含む)から巨核球を生成する方法を提供する。これらの実施形態は、巨核球を生成するステップを含む。さらなる実施形態は、多能性由来造血性内皮細胞から巨核球を生成する方法を提供する。前記巨核球は、好ましくは、血小板を生成できる(例えば、本明細書に記載される条件下で培養した場合)。

0229

一実施形態では、この方法は、多能性幹細胞を提供するステップ;および多能性幹細胞を巨核球に分化させるステップを含む。一実施形態では、多能性幹細胞はヒト細胞である。別の一実施形態では、多能性幹細胞は、NED7株などの、の破壊なしに任意選択で生成されたhESCである。別の一実施形態では、多能性細胞はヒトES細胞である。別の一実施形態では、巨核球は、人工多能性幹細胞から誘導される。別の一実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞再プログラミングすることから誘導されたヒトiPS細胞である。一実施形態では、体細胞は、胎仔組織由来である。別の一実施形態では、体細胞は、成体組織由来である。

0230

別の一実施形態では、本開示は、細胞分化のモジュレーターについてスクリーニングする方法を提供し、この方法は、ある量の巨核球(MK)を提供するステップ;このMKを試験化合物と接触させるステップ;およびこのMKとこの試験化合物との間の接触からの機能的影響の存在または非存在を決定するステップを含み、機能的影響の存在は、この試験化合物が細胞分化をモジュレートする巨核球形成因子、血小板新生因子および/または造血因子であることを示し、機能的影響の非存在は、この試験化合物が細胞分化をモジュレートする巨核球形成因子、血小板新生因子および/または造血因子ではないことを示す。他の実施形態では、巨核球形成因子、血小板新生因子および/または造血因子は、機能的血小板の拡大増殖、核内分裂、細胞質成熟化および最終分化に関連する。

0231

血小板

0232

本開示の他の実施形態は、ヒト胚性幹細胞および多能性幹細胞(iPSCおよびヒトiPSCを含む)から血小板を生成する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、ヒト胚性幹細胞(hESC)を提供するステップ;PVE−HE細胞を巨核球に分化させるPVE−HE細胞を形成するステップ;および巨核球を血小板に分化させるステップを含む。

0233

別の一実施形態では、血小板を生成する方法は、PVE−HE細胞を提供するステップ;PVE−HE細胞をMLPまたは巨核球に分化させるステップ;および任意選択で、MLPを巨核球に分化させるステップ;ならびに次いで、典型的には前血小板ステップを介して、巨核球を血小板に分化(または成熟化)させるステップを含む。PVE−HE細胞を巨核球に分化させるプロセスは、上記のように実施され得る。一実施形態では、PVE−HE細胞は、ヒトES細胞から誘導される。別の一実施形態では、PVE−HE細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)から誘導される。一実施形態では、iPS細胞は、体細胞を再プログラミングすることから誘導されたヒトiPS細胞である。一実施形態では、体細胞は、胎仔組織由来である。別の一実施形態では、体細胞は、成体組織由来である。種々の実施形態では、巨核球を血小板に分化させるプロセスは、巨核球を血小板に分化させるために、巨核球を培養し続けるステップを含む。種々の実施形態では、巨核球を血小板に分化させるプロセスは、フィーダーフリー条件下であり、巨核球系列特異的前駆細胞から分化した巨核球を収集するステップを含む。

0234

さらなる実施形態では、血小板は、MK−M培地中、または基本培地としてのイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、ヒト血清アルブミン、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、b−メルカプトエタノール、可溶性低密度リポタンパク質(LDL)、コレステロール、TPO(例えば、30ng/ml)、SCF(例えば、1ng/ml)、IL−6(例えば、7.5ng/ml)、IL−9(例えば、13.5ng/ml)、ならびに任意選択で、ROCKインヒビター、例えばY27632(例えば、5μM)および/もしくはヘパリン(例えば、5〜25単位/ml)を含む他の培地中における巨核球培養の4日目〜10日目に収集される。好ましい一実施形態では、血小板は、MK−M培地中の
巨核球培養物中における前血小板形成性細胞の最初の出現の3〜5日後から収集される。ある特定の実施形態では、血小板は、密度勾配遠心分離を使用して精製される。さらなる実施形態では、この密度勾配遠心分離はPercoll媒体を使用する。さらなる実施形態では、この密度勾配遠心分離はBSA/HSA媒体を使用する。別の一実施形態では、この血小板精製法は、CD41a陰性である粒子を分離する。別の一実施形態では、この血小板精製法は、CD42b陰性である粒子を分離する。別の一実施形態では、この血小板精製法は、細胞の生存度および形態学完全性を保持する。他の実施形態では、血小板は、CD41aおよびCD42bを発現する。他の実施形態では、血小板は、トロンビン刺激に対して応答性である。別の一実施形態では、血小板は、フィブリノーゲンおよびフォン・ヴィルブランド因子(vWF)表面上に伸展することができる。さらなる実施形態では、血小板は、PAC−1結合およびインテグリン活性化の能力を有する。別の一実施形態では、血小板は、ミクロ凝集体を形成し、血餅の形成および退縮を促進する。別の一実施形態では、血小板は、アピラーゼおよび/またはEDTAの存在下では活性化されない。

0235

本開示の種々の実施形態は、多能性幹細胞由来血小板を使用する方法を提供する。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞由来血小板は、血小板輸血において使用される。この方法は、ある量の多能性幹細胞由来血小板を提供するステップ;およびこの量の多能性幹細胞由来血小板を、それを必要とする対象に投与するステップを含み得る。種々の実施形態では、多能性幹細胞由来血小板は、患者にマッチした血小板であり得る。別の一実施形態では、血小板は、iPSCから誘導される。ある特定の一実施形態では、血小板は、ヒトiPS細胞から誘導される。他の実施形態では、血小板は、対象への血小板の投与の際に対象においてHLA同種免疫原性応答に寄与しない溶液中に貯蔵される。さらなる例示的な実施形態では、多能性幹細胞由来血小板は、白血球を実質的に含まなくてもよく、例えば、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、または1%未満の白血球、好ましくは0.1%未満、0.001%未満またはさらには0.0001%未満を含む。さらなる例示的な実施形態は、調製物中に106個未満の白血球、より好ましくは、105個未満、104個未満またはさらには103個未満の白血球を含む、多能性幹細胞由来血小板の調製物を提供する。

0236

さらなる例示的な実施形態は、少なくとも108個の血小板、より好ましくは少なくとも109個、少なくとも1010個または少なくとも1011個の血小板を含む組成物を提供する。

0237

22〜24℃における本発明の血液バンク貯蔵条件を使用すると、ヒト血小板(アフェレシスによって収集した)の生存度および機能は、5日間のみにわたって維持され得る−限定的な貯蔵時間は、血小板の加齢および細菌増殖のリスクの増加に起因すると考えられる。本発明の方法によって生成された血小板は、バンクに保存された血小板よりも長い有効期限を有し、例えば、22〜24℃で少なくとも6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間またはさらには15日間にわたって維持され得、ヒト患者において使用されるための適切な生存度を維持することが予測される。

0238

ある特定の実施形態では、血小板は、単離後にまたは血小板生成をもたらす培養ステップの1つもしくは複数の間に、22〜24℃における、冷蔵下における(例えば、4℃)および/または凍結下における血小板貯蔵を延長させる1つまたは複数の薬剤で処理され得る。

0239

例えば、本発明は、シアリダーゼ活性を低減させ、血小板生成物調製物における1種もしくは複数の細菌の増殖を(任意選択で)阻害する薬剤で血小板を処理すること、または
シアリダーゼ活性を低減させ、血小板生成物調製物における1種もしくは複数の細菌の増殖を(任意選択で)阻害する条件下で血小板を誘導することを企図する。この方法は、血小板生成物調製物をある量のシアリダーゼインヒビターと接触させ、それによって、シアリダーゼ処理された血小板生成物調製物を取得するステップを含み得る;ここで、シアリダーゼインヒビターに供されていない血小板生成物調製物と比較して、シアリダーゼ活性は低減され、1種または複数の細菌の増殖は阻害される。

0240

阻害される細菌の型には、血小板生成物調製物中に一般に見出されるものが含まれる。かかる細菌の例には以下が含まれる:Aspergillus、Bacillus sp、Bacteroides eggerthii、Candida albicans、Citrobacter sp、Clostridium perfringens、Corynebacterium sp、Diphtheroid、Enterobacter aerogenes、Enterobacter amnigenus、Enterobacter cloacae、Enterococcus avium、Enterococcus faecalis、Escherichia coli、Fusobacterium spp.、Granulicatella adiacens、Heliobacter pylori、Klebsiella sp、(K.pneumonia、K.oxytoca)、Lactobacillus sp、Listeria
sp、Micrococcus sp、Peptostreptococcus、Proteus vulgaris、Pseudomonas sp、Pseudomys oxalis、Propionibacterium sp、Salmonella sp、Serratia sp、Serratia marcescens Staphylococcus sp(コアグラーゼ陰性Staphylococcus、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus aureus)、Streptococcus sp、(S.gallolyticus、S.bovis、S.pyogenes、S.viridans)およびYersinia enterocolitica。

0241

本発明で使用され得るシアリダーゼインヒビターには、例えば以下が含まれる:フェチュイン、2,3−デヒドロ−2−デオキシ−N−アセチルノイラミン酸(DANA)もしくはその薬学的に許容される塩;エチル(3R,4R,5S)−5−アミノ−4−アセトアミド−3−(ペンタン−3−イルオキシ)−シクロヘキサ−1−エン−1−カルボキシレート);(2R,3R,4S)−4−グアニジノ−3−(プロパ−1−エン−2−イルアミノ)−2−((1R,2R)−1,2,3−トリヒドロキシプロピル)−3,4−ジヒドロ−2H−ピラン−6−カルボン酸;(4S,5R,6R)−5−アセトアミド−4−カルバミミダミド(carbamimidamido)−6−[(1R,2R)−3−ヒドロキシ−2−メトキシプロピル]−5,6−ジヒドロ−4H−ピラン−2−カルボン酸;および(1S,2S,3S,4R)−3−[(1S)−1−アセトアミド−2−エチル−ブチル]−4−(ジアミノメチリデンアミノ)−2−ヒドロキシ−シクロペンタン−1−カルボン酸、またはそれらの薬学的に許容される塩。

0242

1種またはそれ以上のグリカン改変剤が、血小板に添加され得る。かかるグリカン改変剤には、例えば、CMP−シアル酸、CMP−シアル酸先駆体、UDPガラクトースまたはそれらの組合せが含まれる。一態様では、CMP−シアル酸先駆体をCMP−シアル酸に変換する酵素もまた、血小板に添加され得る。

0243

ある特定の実施形態では、血小板は、血小板の集団のクリアランスを低減させるのに有効な量の少なくとも1種のグリカン改変剤で処理され得る。一部の実施形態では、このグリカン改変剤は、UDP−ガラクトースおよびUDP−ガラクトース先駆体からなる群から選択される。一部の好ましい実施形態では、このグリカン改変剤はUDP−ガラクト
スである。

0244

ある特定の実施形態では、血小板は、GP1b上に露出されたGlcNAc残基糖化をもたらす特定の糖分子で処理され得、それによって、血小板クリアランスを低減させ、血小板食作用を遮断し、血小板循環時間を増加させ、かつ/または血小板貯蔵時間を増加させる。

0245

ある特定の実施形態では、血小板は、トレハロースまたは他の低分子量多糖で処理され得る。

0246

ある特定の実施形態では、血小板は、プロテアーゼインヒビター、例えばマトリックスメタロプロテアーゼインヒビターで処理され得る。

0247

一部の実施形態では、血小板のin vivo循環時間は、少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、100%、150%、200%またはそれより多く、増加させられる。

0248

本発明の血小板は、少なくとも約3日間、少なくとも約5日間、少なくとも約7日間、少なくとも約10日間、少なくとも約14日間、少なくとも約21日間または少なくとも約28日間にわたって、冷却貯蔵され得る。

0249

さらに、培養物中の幹細胞から血小板を誘導することは、血小板および巨核球を事前順化する機会、ならびにさらには、血小板の有効期限を延長させ、冷蔵および/または凍結保存貯蔵後の収量および生存度を増強する様式で、幹細胞または巨核球などの前駆細胞を遺伝子改変する機会を提供する。例えば、MKは、膜脂質比率タンパク質グリコシル化パターンストレス誘発性タンパク質、14−3−3ζ移行などに関与する遺伝子の発現のレベルの変更を有するように操作され得る。

0250

さらなる一実施形態では、血小板は、機能的血小板である。さらなる一実施形態では、機能的血小板の百分率は、少なくとも約60%であり、少なくとも約70%であり、少なくとも約80%であり、または少なくとも約90%である。なおさらなる一実施形態では、機能的血小板は、22〜37℃で貯蔵した場合、少なくとも2日間にわたって活性である。

0251

本開示は、本明細書に提供される方法に従って生成された血小板が、受動的様式(例えば、経時的に血小板から拡散し得る)または能動的様式(例えば、血小板の活性化および脱顆粒の際に放出される)のいずれかで血小板によって放出される1種または複数の治療剤を含むように操作され得ることを、さらに企図する。広範な薬物が使用され得、これらには、抗生物質、抗ウイルス剤麻酔薬ステロイド性薬剤、抗炎症剤抗新生物剤抗原ワクチン、抗体、鬱血除去薬降圧薬鎮静薬受胎調節剤、プロゲステロン剤、抗コリン薬鎮痛薬抗うつ薬抗精神病薬、β−アドレナリン受容体遮断剤利尿薬、心血管活性剤血管作動性剤、非ステロイド性抗炎症剤栄養剤などが含まれ得る。

0252

例えば、操作された血小板は、以下からなる群から選択される1種または複数の化合物を含むように調製され得る:シナプスおよび神経効果器接合部位において作用する薬物(例えば、アセチルコリンメタコリンピロカルピンアトロピンスコポラミンフィゾスチグミンサクシニルコリン、エピネフリン、ノルエピネフリンドーパミンドブタミンイソプロテレノールアルブテロールプロプラノロールセロトニン);中枢神経系に対して作用する薬物(例えば、クロナゼパムジアゼパムロラゼパムベンゾカインブピバカインリドカインテトラカインロピバカインアミトリプチリン
フルオキセチンパロキセチンバルプロ酸カルバマゼピンブロモクリプチンモルヒネフェンタニルナルトレキソンナロキソン);炎症応答をモジュレートする薬物(例えば、アスピリンインドメタシンイブプロフェンナプロキセンステロイドクロモリンナトリウムテオフィリン);腎機能および/または心血管機能に影響する薬物(例えば、フロセミドチアジドアミロライドスピロノラクトンカプトプリルエナラプリルリシノプリルジルチアゼムニフェジピンベラパミルジゴキシンイソルジル(isordil)、ドブタミン、リドカイン、キニジンアデノシンジギタリスメバスタチンロバスタチンシンバスタチンメバロネート);胃腸機能に影響する薬物(例えば、オメプラゾールスクラルファート);抗生物質(例えば、テトラサイクリンクリンダマイシンアンホテリシンBキニーネメチシリンバンコマイシンペニシリンGアモキシシリンゲンタマイシンエリスロマイシンシプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アシクロビルジドブジン(AZT)、ddC、ddI、リバビリンセファクロルセファレキシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシンクロラムフェニコールイソニアジドフルコナゾールアマンタジンインターフェロン);抗がん剤(例えば、シクロホスファミドメトトレキセートフルオロウラシルシタラビンメルカプトプリンビンブラスチンビンクリスチンドキソルビシンブレオマイシンマイトマイシンCヒドロキシウレアプレドニゾンタモキシフェンシスプラチンダカルバジン(decarbazine));免疫調節剤(例えば、インターロイキン、インターフェロン、GM−CSF、TNFα、TNFβ、シクロスポリン、FK506、アザチオプリン、ステロイド);血液および/または血液形成性器官に対して作用する薬物(例えば、インターロイキン、G−CSF、GM−CSF、エリスロポエチン、ビタミン、鉄、銅、ビタミンB12、葉酸、ヘパリン、ワルファリンクマリン);ホルモン(例えば、成長ホルモン(GH)、プロラクチン黄体形成ホルモンTSHACTH、インスリン、FSH、CG、ソマトスタチンエストロゲンアンドロゲン、プロゲステロン、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)、チロキシントリヨードサイロニン);ホルモンアンタゴニスト;石灰化および骨のターンオーバーに影響する薬剤(例えば、カルシウム、ホスフェート、副甲状腺ホルモンPTH)、ビタミンDビスホスホネートカルシトニンフッ化物)、ビタミン(例えば、リボフラビンニコチン酸ピリドキシンパントテン酸ビオチン、コリン、イノシトールカルニチン(camitine)、ビタミンCビタミンAビタミンEビタミンK)、遺伝子治療剤(例えば、ウイルスベクター、核酸保有リポソーム、DNA−タンパク質コンジュゲートアンチセンス剤);または標的化剤などの他の薬剤。

0253

ある特定の実施形態では、血小板は、1種または複数の治療剤、例えば小分子薬物、アプタマー(apatamer)もしくは他の核酸薬剤、または組換えタンパク質を含むように操作されており、即ち、これらは、血小板の顆粒(例えばα−顆粒)中に貯蔵され得、好ましくは、血小板の活性化の際に、例えば、脈管傷害もしくは他の創傷アテローム動脈硬化性プラークもしくは内皮細胞びらん、感染、または血小板活性化が可能な血栓形成促進性環境、例えば固形腫瘍の血管系、の部位において放出され得る。他の実施形態では、操作された血小板は、線維症の重症度を低減させるまたは線維症を予防するために、例えば、の線維症(即ち、肺線維症肺高血圧症慢性閉塞性肺疾患COPD)、喘息および嚢胞性線維症からなる群から選択され得るもの)の処置などにおいて、使用され得る。

0254

ある特定の実施形態では、血小板は、正常な創傷治癒を促進もしくは加速する外因性薬剤、瘢痕を低減させる外因性薬剤、線維症を低減させる外因性薬剤1種もしくは複数、またはそれらの組合せを含む。巨核球において発現され、その巨核球から生成された血小板の顆粒中に詰め入れられ得る例示的な組換えタンパク質には、エリスロポエチンが含まれる。エリスロポエチンの局在化送達は、フィブリン誘発性の創傷治癒応答を加速させ、組換えEPO積載血小板は、糖尿病性潰瘍熱傷などを含む開放創傷および痛み、ならびに
外科的手順椎弓切除術椎間板切除術、関節手術腹部手術または胸部手術から生じるものなどの外科病変)を含む閉鎖(内部)創傷の処置において使用され得る。MK細胞における発現および血小板顆粒における貯蔵が本発明に従って達成され得る他の創傷治癒性タンパク質、特に、非線維性増殖因子には、インスリン様増殖因子1(IGF−1);塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF);トランスフォーミング増殖因子β−3(TGFβ−3)、顆粒球コロニー刺激因子GCSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、フィブロネクチンビトロネクチン、トロンボスポンジン、ラミニンテネイシン(tenasin)が含まれる。

0255

ある特定の実施形態では、血小板は、TGFβ−1、TGFβ−2および/もしくはPDGFに対する抗体(特に単鎖抗体);増殖因子自体への結合あるいは受容体(例えば、受容体結合部位配列を含むペプチド)または可溶性形態増殖因子受容体もしくはこれらの受容体の増殖因子結合ドメインへの結合のいずれかによって、TGFβ−1、TGFβ−2および/もしくはPDGFがそれらの受容体に結合することを防止する結合タンパク質;あるいは受容体−リガンド相互作用を阻害するアプタマーなどが含まれるがこれらに限定されない、1種または複数の外因性抗線維症剤を含む。

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