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図面 (9)

課題

標的療法による、肺癌、特に小細胞肺癌治療のための方法の提供。

解決手段

患者における肺癌の治療のための方法であって、CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、およびEpCAMを含めた1種または複数種細胞表面抗原に特異的に結合する標的化された治療用作用物質の有効用量を患者に投与する工程を含む、方法。

概要

背景

背景
抗体および特異的リガンドなどの標的療法は、癌と闘うのに、とりわけ従来の療法が奏功しない症例において有効であることが分かっている。さらにより有望であることは、癌に対する抗体は、一般的に、伝統的な化学療法または放射線療法とは別個メカニズムで作動し、それゆえそれらを伝統的療法と組み合わせて、相加的または相乗的な効果をしばしば生み出し得るということである。

抗体は、様々なメカニズムを通じてそれらの治療効果を達成し得る。抗体は、アポトーシスまたはプログラム細胞死をもたらすことにおいて直接的効果を有し得る。抗体は、成長因子受容体遮断し、腫瘍細胞の増殖を有効に停止させ得る。モノクローナル抗体発現する細胞において、それらは抗イディオタイプ抗体の形成を引き起こし得る。間接的効果には、単球およびマクロファージなど、細胞傷害性を有する細胞を動員することが含まれる。このタイプの抗体介在性の細胞殺傷は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害ADCC)と呼ばれる。モノクローナル抗体は補体にも結合し、補体依存性細胞傷害(CDC)として知られる直接的な細胞毒性につながる。

CD47は、マクロファージ食作用阻害剤としてのその機能、ならびに多様なヒト新生物上でのその幅広い発現に起因して、抗癌療法貴重な標的である。CD47は、マクロファージの表面に発現される受容体であるシグナル調節タンパク質α(SIRPα)への結合によって、食作用を妨げる阻害性シグナルを伝達し得る。CD47とSIRPαとの間の相互作用を抗体で遮断することは、インビトロにおいてマクロファージが癌細胞飲み込むのを刺激するだけでなく、インビボにおいて堅牢抗癌効果も発揮する。他のCD47遮断作用物質には、並外れて高いアフィニティーでヒトCD47に結合し遮断する「次世代」CD47アンタゴニストが含まれる。

高アフィニティーSIRPα変種は、SIRPαによって伝達される阻害性シグナルを無効にすることによって、マクロファージ活性化のための閾値を低下させ得、腫瘍特異的抗体によって進められる食作用応答を促進し得る。所与治療用抗体抗癌活性がCD47遮断によって増強される程度は、悪性細胞の表面上での抗原発現のレベル、その重鎖アイソタイプ、および、免疫エフェクター上のFc受容体と結合するその能力に影響を及ぼす、抗体が抗原結合時に取る配向を含めた、多数の因子に依存するようである。したがって、高アフィニティーSIRPα単量体は、この方向性で押し進められている薬物/毒素コンジュゲーション戦略を含めた他のいくつかの手法に対する、迅速で安全でかつ有効な代替策となる。

標的療法の有効な標的および組み合わせの同定は、依然として高い関心対象である。本発明はこの必要性に応える。

概要

標的療法による、肺癌、特に小細胞肺癌治療のための方法の提供。患者における肺癌の治療のための方法であって、CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、およびEpCAMを含めた1種または複数種細胞表面抗原に特異的に結合する標的化された治療用作用物質の有効用量を患者に投与する工程を含む、方法。なし

目的

他の態様において、療法は、CD47とCD56、CD47とCD44、CD47とEpCamなどを標的とする多特異性抗体を含めた、CD47と第二の癌細胞マーカーとを標的とする多特異性抗体を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

患者における肺癌治療のための方法であって、CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、およびEpCAMを含めた1種または複数種細胞表面抗原に特異的に結合する標的化された治療用作用物質の有効用量を患者に投与する工程を含む、方法。

請求項2

SIRPαへのCD47の結合を選択的に遮断する第二の標的化された剤を投与する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

第二の標的化された作用物質が、可溶性SIRPαポリペプチドを含む、請求項2に記載の方法。

請求項4

第一の作用物質が、細胞表面マーカーに選択的な抗体である、請求項3に記載の方法。

請求項5

肺癌が小細胞肺癌である、請求項1に記載の方法。

請求項6

マーカーが、CD56、CD99、CD44、およびEpCamより選択される、請求項5に記載の方法。

請求項7

第一および第二の作用物質を、CD47および第二の癌関連細胞マーカーに選択的な二重特異性抗体の状態で含む、請求項2に記載の方法。

背景技術

0001

背景
抗体および特異的リガンドなどの標的療法は、癌と闘うのに、とりわけ従来の療法が奏功しない症例において有効であることが分かっている。さらにより有望であることは、癌に対する抗体は、一般的に、伝統的な化学療法または放射線療法とは別個メカニズムで作動し、それゆえそれらを伝統的療法と組み合わせて、相加的または相乗的な効果をしばしば生み出し得るということである。

0002

抗体は、様々なメカニズムを通じてそれらの治療効果を達成し得る。抗体は、アポトーシスまたはプログラム細胞死をもたらすことにおいて直接的効果を有し得る。抗体は、成長因子受容体遮断し、腫瘍細胞の増殖を有効に停止させ得る。モノクローナル抗体発現する細胞において、それらは抗イディオタイプ抗体の形成を引き起こし得る。間接的効果には、単球およびマクロファージなど、細胞傷害性を有する細胞を動員することが含まれる。このタイプの抗体介在性の細胞殺傷は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害ADCC)と呼ばれる。モノクローナル抗体は補体にも結合し、補体依存性細胞傷害(CDC)として知られる直接的な細胞毒性につながる。

0003

CD47は、マクロファージ食作用阻害剤としてのその機能、ならびに多様なヒト新生物上でのその幅広い発現に起因して、抗癌療法貴重な標的である。CD47は、マクロファージの表面に発現される受容体であるシグナル調節タンパク質α(SIRPα)への結合によって、食作用を妨げる阻害性シグナルを伝達し得る。CD47とSIRPαとの間の相互作用を抗体で遮断することは、インビトロにおいてマクロファージが癌細胞飲み込むのを刺激するだけでなく、インビボにおいて堅牢抗癌効果も発揮する。他のCD47遮断作用物質には、並外れて高いアフィニティーでヒトCD47に結合し遮断する「次世代」CD47アンタゴニストが含まれる。

0004

高アフィニティーSIRPα変種は、SIRPαによって伝達される阻害性シグナルを無効にすることによって、マクロファージ活性化のための閾値を低下させ得、腫瘍特異的抗体によって進められる食作用応答を促進し得る。所与治療用抗体抗癌活性がCD47遮断によって増強される程度は、悪性細胞の表面上での抗原発現のレベル、その重鎖アイソタイプ、および、免疫エフェクター上のFc受容体と結合するその能力に影響を及ぼす、抗体が抗原結合時に取る配向を含めた、多数の因子に依存するようである。したがって、高アフィニティーSIRPα単量体は、この方向性で押し進められている薬物/毒素コンジュゲーション戦略を含めた他のいくつかの手法に対する、迅速で安全でかつ有効な代替策となる。

0005

標的療法の有効な標的および組み合わせの同定は、依然として高い関心対象である。本発明はこの必要性に応える。

0006

標的療法による肺癌治療のための方法および組成物が提供される。いくつかの態様において、肺癌は小細胞肺癌である。いくつかの態様において、療法は、CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、EpCAMなどを含めた、1種または複数種細胞表面抗原を標的とする。いくつかの態様において、標的療法は、肺癌に罹患している個体に、CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、およびEpCAMより選択される細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体の治療用量投与する工程を含む。

0007

いくつかの態様において、標的療法をCD47遮断作用物質と組み合わせる。癌細胞は、CD47発現の上方調節によってマクロファージの監視を逃れる。CD47タンパク質マスクする作用物質、例えばCD47またはSIRPαに結合し、CD47とSIRPαとの間の相互作用を妨げる抗体または小分子患者に投与し、それにより、食作用を介した癌細胞のクリアランスが増加する。CD47を遮断する作用物質は、1種または複数種の肺癌細胞マーカーに向けられたモノクローナル抗体と組み合わせられ、この組成物は、単一の作用物質の使用と比較して、癌細胞の食作用および排除を増強することにおいて相乗的であり得る。

0008

関心対象である、療法のための特異的な剤の組み合わせには、抗CD47と抗CD56、抗CD47と抗CD44、抗CD47と抗CD99、抗CD47と抗EpCamが含まれる。いくつかのそのような態様において、抗CD47剤は高アフィニティーSIRPαポリペプチドであり、これは、単量体または多量体の形態で、例えばIgGFcポリペプチドとの融合タンパク質として提供され得る。

0009

他の態様において、療法は、CD47とCD56、CD47とCD44、CD47とEpCamなどを標的とする多特異性抗体を含めた、CD47と第二の癌細胞マーカーとを標的とする多特異性抗体を提供する。そのような多特異性抗体の組成物も提供され、該多特異性抗体は、望ましくはヒト抗体またはヒト化抗体であり、例えばペグ化などによって、血中半減期延ばすように改変され得る。
[本発明1001]
患者における肺癌の治療のための方法であって、CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、およびEpCAMを含めた1種または複数種の細胞表面抗原に特異的に結合する標的化された治療用作用物質の有効用量を患者に投与する工程を含む、方法。
[本発明1002]
SIRPαへのCD47の結合を選択的に遮断する第二の標的化された剤を投与する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
第二の標的化された作用物質が、可溶性SIRPαポリペプチドを含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
第一の作用物質が、細胞表面マーカーに選択的な抗体である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
肺癌が小細胞肺癌である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
マーカーが、CD56、CD99、CD44、およびEpCamより選択される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
第一および第二の作用物質を、CD47および第二の癌関連細胞マーカーに選択的な二重特異性抗体の状態で含む、本発明1002の方法。

図面の簡単な説明

0010

CD47遮断療法は、小細胞肺癌のマクロファージ食作用を刺激する。匿名の血液ドナーからのヒト単球を、CD14+選択を用いた磁気活性化細胞選別(magnetic activated cell sorting)(MACS)によって精製した。単球を、10% ABヒト血清の存在下で1週間培養し、その時点において、呈される形態変化はマクロファージへの分化特有のものである。マクロファージを、緑色蛍光色素で標識された原発性ヒト小細胞肺癌細胞(SCLCサンプル「H29」)とともに共培養した。細胞を、ビヒクル対照リン酸緩衝生理食塩水PBS)、抗CD56抗体(クローンMEM-188)、またはヒト化抗CD47抗体(クローン5F9-G4)のいずれかで処理した。食作用を、緑色蛍光SCLC細胞を飲み込んだマクロファージのパーセンテージとしてハイスループットフローサイトメトリーによって評価した。抗CD47抗体による処理は、単一作用物質として、上昇したレベルの食作用を誘導し得た。
CD47遮断は、マウス異種移植モデルを用いたインビボにおいて、小細胞肺癌細胞に対する治療的応答をもたらす。原発性小細胞肺癌細胞(サンプルH29)を免疫欠損NSGマウスに植え付けた。およそ3週間の成長後、マウスを2つの処理コホート無作為に分けた。第一のコホートは、ビヒクル対照(リン酸緩衝生理食塩水、PBS;赤色)で処理され、第二のコホートは、250μgの抗CD47抗体(クローン5F9-G4、青色)の毎日注入で処理された。腫瘍成長を経時的にモニターした。各点は、個々のマウスにおける腫瘍成長を表す。黒色のバーは、腫瘍体積中央値を表す。左、調査の全時間経過にわたる腫瘍体積測定結果。右、調査の89日目における腫瘍体積測定結果。注釈対数尺度
小細胞肺癌細胞の表面上に高発現される新規治療標的。原発性ヒト小細胞肺癌細胞(サンプルH29)を、LEGENDScreenアッセイ(Biolegend)を用いた包括的フローサイトメトリーによる免疫表現型判定(immunophenotyping)に供した。表面抗原を、それらの幾何平均蛍光強度(Geo.MFI)に基づいてランク付けした。これらの抗原は、CD47遮断作用物質と組み合わせる抗体の治療標的である。
SCLC標的抗体がマクロファージ食作用を誘導し得る能力は、CD47遮断療法との組み合わせによって増強され得る。2種のヒト小細胞肺癌細胞株(H82およびH69)を緑色蛍光色素で標識し、次いでビヒクル対照(リン酸緩衝生理食塩水、PBS;灰色)または高アフィニティーSIRPα変種CV1単量体(黒色)のいずれかと組み合わせた指定された抗体の存在下で、初代NSGマウスマクロファージとともに共培養した。食作用を、緑色蛍光SCLC細胞を飲み込んだマクロファージのパーセンテージとしてハイスループットフローサイトメトリーによって評価した。抗CD47剤の5F9-G4およびCV1-G4は、直接競合の理由からCV1単量体と組み合わせて試験されなかった。
CD47遮断は、インビトロにおいてSCLC細胞のマクロファージ食作用を誘導する。A、フローサイトメトリーによって評価される、ヒトSCLC細胞株のパネルの表面上でのCD47の発現。黒色の点線は、染色されていないNCI-H82細胞を表す。B、原発性ヒトSCLCサンプルH29の表面上でのCD47の発現。C、ヒトマクロファージおよび蛍光腫瘍細胞を用いたインビトロ食作用アッセイを描写した略図。D、ヒトマクロファージおよびカルセインAM標識SCLC細胞を用いて実施された食作用アッセイの代表的なフローサイトメトリープロット。E、蛍光活性化細胞選別後の細胞集団の代表的な画像。選別された二重陽性集団は、飲み込んだ腫瘍細胞を有するマクロファージを含有した。スケールバーは20μmを表す。F、フローサイトメトリーによって解析される、ヒトマクロファージおよびカルセインAM標識SCLC細胞を用いた食作用アッセイの概要。SCLC細胞をビヒクル対照(PBS)または抗CD47抗体(クローンHu5F9-G4)で処理した。カルセインAM+マクロファージのパーセンテージを、各マクロファージドナーによる最大応答に対して正規化した。G、ビヒクル対照(PBS)または抗CD47抗体(クローンHu5F9-G4)による処理後の、原発性H29 SCLC細胞のヒトマクロファージによる食作用。F〜G、食作用アッセイを、4人の独立した血液ドナーに由来するマクロファージを用いて実施した。データは平均±SDを表す。ns、有意でない;Sidak補正を用いた二元配置分散分析(F)または両側t検定(G)による、指定された比較に対して**P<0.01;****P<0.0001。
CD47遮断抗体は、インビボにおいてヒトSCLC腫瘍の成長を阻害する。A、NSGマウスの皮下組織におけるNCI-H82細胞の成長。マウスを、ビヒクル対照(PBS)または抗CD47抗体(クローンHu5F9-G4)で処理される群に無作為に分けた。成長を腫瘍体積測定によって評価した。1つのコホートあたり7〜8匹のマウスが処理され、各点は、独立した動物の腫瘍体積を表す。B、生物発光イメージングによって評価される、NSGマウスの皮下組織におけるGFP-ルシフェラーゼ患者由来異種移植片H29腫瘍の成長。マウスを、ビヒクル対照(PBS)または抗CD47抗体(クローンHu5F9-G4)で処理される群に無作為に分けた。C、植え付け後85日目における、H29腫瘍の代表的な生物発光画像。D、腫瘍体積測定によって評価される、H29腫瘍の成長。E、指定される療法で処理された患者由来異種移植片H29腫瘍を担持するマウスの生存。Mantel-Cox検定による、P=0.0004。A〜E、黒色の矢印は処理の開始を示す。点は独立した動物からの測定結果を示し、バーは中央値を示す。コホートは、最低でも7〜8匹のマウスからなった。明確さのために、各時点における測定結果は重ならないようにずらされている。ns、有意でない;Mann-Whitney検定による、指定された比較に対して*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。
MCP-3は、CD47遮断療法に対する応答を予測する血清バイオマーカーである。A、未処理のNSGマウス(腫瘍なし)または皮下NCI-H82細胞を担持するNSGマウスに、単回用量の抗CD47抗体(クローンHu5F9-G4)を注入した。血清サンプルを、処理前または処理の24時間後に回収した。MCP-3レベルをLuminex多重アレイによって測定した。B、患者由来異種移植片H29腫瘍を担持するマウスにおけるMCP-3レベルを、Aにあるように評価した。点は個々のマウスからの測定結果を表し、バーは平均±SDを表す。1つの条件あたり5匹のマウスを評価した。ns=有意でない;Sidak補正を用いた二元配置分散分析による、****P<0.0001。
包括的FACSに基づく抗体スクリーニングにより、SCLC上の新しいおよび確立された治療標的を同定する。4種のSCLC細胞株および原発性患者サンプルH29の表面上での抗原発現を、細胞表面抗原を標的とする332種の抗体のコレクションであるLEGENDScreen Human Cell Screening Kits(BioLegend)を用いて評価した。抗体結合を、蛍光活性化細胞選別(FACS)解析によって検出した。A、SCLC表面結合についてスクリーニングされたすべての抗体の幾何平均蛍光強度(MFI)を描写したヒストグラム。データは、5つすべてのSCLCサンプルにわたる各抗体に対する中央値を表す。データをガウス分布適合させ(黒色の曲線)、陰性の抗体(灰色)を、平均値を2標準偏差上回る値よりも小さいMFI中央値によって規定した。陰性の閾値を1桁未満上回るMFIとして低い抗原(赤色)を規定した。陰性の閾値よりも1桁大きいものとして高い抗原(青色)を規定した。B、5つすべてのSCLCサンプルにわたって、MFI中央値に基づき「高い」と同定された39種の抗原のランク付けされたリスト
高アフィニティーSIRPα変種は、腫瘍結合抗体に応答したSCLCのマクロファージ食作用を増強する。腫瘍結合抗体単独(赤色)または高アフィニティーSIRPα変種CV1単量体との組み合わせ(青色)に応答した、NCI-H82細胞(A)およびNCI-H524細胞(B)の食作用。点は個々のドナーからの測定結果を表し、バーは中央値を表す。抗CD56(NCAM)抗体の3種のクローン、ならびにCD24、CD29、CD99、およびCD47(クローンHu5F9-G4)に対する抗体を試験した。C、変動する濃度の抗CD56抗体ロルボツズマブ(lorvotuzumab)単独(赤色)または高アフィニティーSIRPα変種CV1単量体との組み合わせ(青色)に応答した、NCI-H82 SCLC細胞の食作用。データは平均±SDを表す。A〜C、最低でも4人の独立した血液ドナーに由来するヒトマクロファージを用いて、食作用アッセイを実施した。測定結果を、各マクロファージドナーによる最大応答に対して正規化した。ns、有意でない;Sidak補正を用いた二元配置分散分析による、指定された比較に対して*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001。

0011

態様の詳細な説明
治療用作用物質、例えば肺癌のマーカーに標的化された抗体、例えば、CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、EpCAMなどを含めた1種または複数種の細胞表面抗原に標的化された抗体による、肺癌の治療のための方法および組成物が提供される。いくつかの態様において、作用物質の組み合わせ、例えば相乗的組み合わせが提供され、一方の作用物質は抗CD47遮断作用物質であり、第二の作用物質は、肺癌マーカー、例えばCD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、EpCAMなどに標的化されている。

0012

本発明をさらに説明する前に、本発明は説明される特定の態様に限定されるわけではなく、それ自体は当然変更し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様のみを説明することを目的とするものであり、限定することを意図しないことも理解されるべきである。

0013

ある範囲の値が提供される場合、文脈はっきりと別様に述べられていない限り、その範囲の上限値と下限値の間にある、その下限値の単位の10分の1までの各介在値、ならびにその記載範囲中の他の任意の記載値または介在値が本発明に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限値および下限値は、それらのより小さな範囲内に独立して含まれ得、また、記載範囲中の具体的に除外される任意の限界値に従って、本発明に包含される。記載範囲がこれらの限界値の一方または両方を含む場合、そうした含まれる限界値のいずれかまたは両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。

0014

本明細書において記載される方法は、列挙した事象論理的に可能である任意の順序で、ならびに事象を列挙した順序で行われ得る。

0015

別様に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様または等価な任意の方法および材料も、本発明の実践または試験において用いることができるものの、好ましい方法および材料がここに記載されている。

0016

本明細書において言及されるすべての刊行物は、これらの刊行物が関連して引用される方法および/または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み入れられる。

0017

本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において使用するとき、「a」、「an」、および「the」という単数形は、文脈上はっきりと別様に述べられていない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。特許請求の範囲は、任意の自由選択要素を除外するように起草され得ることにさらに留意されたい。そのため、本明細書は、「単に」、「のみ」などのような排他的用語を請求項の構成要素の記載に関連して使用するため、または「消極的」限定を使用するための、先行基準としての役割を果たすことが意図される。

0018

本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日より前にそれらの開示があったことを示すためだけに提供される。本明細書におけるいかなるものも、先行発明という理由で、そのような刊行物に本発明が先行する権利を与えられないことを認めるものとして解釈されるべきでない。さらに、提供される刊行物の日付は実際の刊行日とは異なり得、それは別個に確認される必要があり得る。

0019

定義
相乗的組み合わせ。相乗的組み合わせは、単独療法、すなわち組み合わせの個々の構成要素の有効性匹敵する治療効果を提供し得、一方で有害な副作用、例えば非標的組織へのダメージ免疫状態、および他の臨床兆候を低下させる。あるいは、相乗的組み合わせは、単独療法、すなわち組み合わせの個々の構成要素の有効性と比較した場合に向上した有効性を提供し得、その効果は、総腫瘍細胞数;再発までの時間の長さ;および患者の健康状態の他の兆候によって測定され得る。

0020

本発明の相乗的組み合わせは、CD47の機能を阻害または遮断するように標的化されている作用物質と、第二の肺癌細胞マーカー、通常は細胞表面マーカーを阻害または遮断するように標的化されている作用物質とを組み合わせる。組み合わせは、作用物質の組み合わせ、例えばそのそれぞれが異なるマーカーに特異的である、2種の別個のタンパク質の組み合わせにより提供され得るか、または多特異性作用物質、例えば2種以上の異なるマーカーに対する特異性を組み合わせた抗体として提供され得る。

0021

組み合わせ療法:本明細書において使用するとき、「組み合わせ療法」という用語は、対象が2種以上の治療レジメン(例えば、2種以上の治療用作用物質)に同時に曝露される状況を指す。いくつかの態様において、2種以上の作用物質は同時に投与され得る;いくつかの態様において、そのような作用物質は逐次的に投与され得る;いくつかの態様において、そのような作用物質は重複した投薬レジメンで投与される。

0022

剤形:本明細書において使用するとき、「剤形」という用語は、対象への投与のための、活性作用物質(例えば、治療用または診断用作用物質)の物理的に別々の単位を指す。それぞれの単位は、あらかじめ決められた分量の活性作用物質を含有する。いくつかの態様において、そのような分量は、関連集団に投与された場合に望ましいまたは有益な成果相関することが判明している投薬レジメン(すなわち、治療用投薬レジメン)に従った投与に適当な単位投薬量(またはその全画分)である。当業者であれば、特定の対象に投与される治療用組成物または作用物質の総量は、1人または複数の主治医によって決定され、多数の剤形の投与を伴い得ることを理解する。

0023

投薬レジメン:本明細書において使用するとき、「投薬レジメン」という用語は、典型的には、期間によって分離された、対象に個々に投与される単位用量(典型的には、2つ以上)のセットを指す。いくつかの態様において、所与の治療用作用物質は、1回または複数回の投薬を伴い得る、推奨される投薬レジメンを有する。いくつかの態様において、投薬レジメンは、そのそれぞれが同じ長さの期間によって互いから分離されている複数回の投薬を含み;いくつかの態様において、投薬レジメンは、複数回の投薬を含み、個々の投薬を分離する少なくとも2つの異なる期間を含む。いくつかの態様において、投薬レジメン内の全投薬は、同じ単位用量の量である。いくつかの態様において、投薬レジメン内の異なる投薬は、異なる量である。いくつかの態様において、投薬レジメンは、第一の投薬量での第一の投薬、それに続く、第一の投薬量とは異なる第二の投薬量での1回または複数回のさらなる投薬を含む。いくつかの態様において、投薬レジメンは、第一の投薬量での第一の投薬、それに続く、第一の投薬量と同じ第二の投薬量での1回または複数回のさらなる投薬を含む。いくつかの態様において、投薬レジメンは、関連集団全体に投与された場合に望ましいまたは有益な成果と相関する(すなわち、治療用投薬レジメンである)。

0024

CD47ポリペプチド。ヒトCD47の3種の転写産物バリアント(バリアント1、NM 001777;バリアント2、NM 198793;およびバリアント3、NM 001025079)は、CD47ポリペプチドの3種のアイソフォームをコードする。3種のアイソフォームのうち最長のものであるCD47アイソフォーム1(NP 001768)は、323アミノ酸長である。CD47アイソフォーム2(NP 942088)は、305アミノ酸長である。CD47アイソフォーム3は、312アミノ酸長である。3種のアイソフォームは、初めの303個のアミノ酸における配列が同一である。アミノ酸1〜8はシグナル配列を含み、アミノ酸9〜142は、可溶性フラグメントであるCD47免疫グロブリン様ドメインを含み、アミノ酸143〜300は膜貫通ドメインである。

0025

天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」とは、天然配列ポリペプチドと共通した定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、それらが相当する天然配列ポリペプチドと共通した生物学的活性を有するという条件で、天然配列のフラグメント、ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびそのフラグメントが含まれるが、それらに限定されるわけではない。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列変種およびその共有結合性改変体の両方を包含する。可溶性CD47の誘導体および融合体は、CD47模倣分子としての用途が見出される。

0026

CD47ポリペプチドの初めの142個のアミノ酸は、CD47の細胞外領域を含む(SEQID NO: 1)。3種のアイソフォームは、細胞外領域において同一のアミノ酸配列を有し、ゆえに該アイソフォームのいずれかを用いて、可溶性CD47を作製することができる。「可溶性CD47」とは、膜貫通ドメインを欠くCD47タンパク質である。可溶性CD47は、細胞表面に局在するのではなく、それを発現している細胞から分泌される。

0027

CD47の生物学的活性についてのインビトロアッセイには、例えばヒトマクロファージによるブタ細胞の食作用の阻害、SIRPα受容体への結合、SIRPαチロシンリン酸化などが含まれる。CD47の生物学的活性についての例示的なアッセイは、候補作用物質の存在下でヒトマクロファージ組成物を接触させる。細胞を候補作用物質と約30分間インキュベートし、溶解する。細胞溶解物抗ヒトSIRPα抗体と混合して、SIRPαを免疫沈降させる。沈降したタンパク質をSDS PAGEによって分離し、次いでニトロセルロース転写し、ホスホチロシンに特異的な抗体でプローブする。CD47模倣体として有用な候補作用物質は、候補作用物質の非存在下で観察されるリン酸化のレベルと比較して、少なくとも10%、または最高20%、または50%、または70%、または80%、または最高約90%、SIRPαチロシンリン酸化を増加させる。CD47の生物学的活性についての別の例示的なアッセイは、ヒトマクロファージによる造血細胞の食作用を測定する。CD47模倣体として有用な候補作用物質は、候補作用物質の非存在下で観察される食作用のレベルと比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約50%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、または最高約90%の、食作用の下方調節をもたらす。

0028

「食作用を操作する」とは、介入の非存在下で観察される食作用のレベルと比較して、少なくとも約10%、または最高20%、または50%、または70%、または80%、または最高約90%の、食作用における上方調節または下方調節を意味する。ゆえに、循環造血細胞の食作用を減少させるという文脈において、特に移植の文脈において、食作用を操作するとは、介入の非存在下で観察される食作用のレベルと比較して、少なくとも約10%、または最高20%、または50%、または70%、または80%、または最高約90%の、食作用における下方調節を意味する。

0029

抗CD47作用物質。本明細書において使用するとき、「抗CD47作用物質」という用語は、(例えば、食細胞上の)SIRPαへの(例えば、標的細胞上の)CD47の結合を低下させる任意の作用物質を指す。適切な抗CD47剤の非限定的な例には、高アフィニティーSIRPαポリペプチドを含むがそれらに限定されないSIRPα剤、抗SIRPα抗体、可溶性CD47ポリペプチド、および抗CD47抗体または抗体フラグメントが含まれる。いくつかの態様において、適切な抗CD47作用物質(例えば、抗CD47抗体、SIRPα剤など)は、CD47に特異的に結合して、SIRPαへのCD47の結合を低下させる。いくつかの態様において、適切な抗CD47作用物質(例えば、抗SIRPα抗体、可溶性CD47ポリペプチドなど)は、SIRPαに特異的に結合して、SIRPαへのCD47の結合を低下させる。SIRPαに結合する適切な抗CD47作用物質は、(例えば、SIRPαを発現する食細胞において)SIRPαを活性化しない。

0030

適切な抗CD47作用物質の効力は、該作用物質をアッセイすることによって評価され得る(下記でさらに記載される)。例示的なアッセイにおいて、標的細胞を、候補作用物質の存在下または非存在下でインキュベートする。本発明の方法における使用のための作用物質は、該作用物質の非存在下における食作用と比較して、少なくとも10%(例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも120%、少なくとも140%、少なくとも160%、少なくとも180%、または少なくとも200%)、食作用を上方調節すると考えられる。同様に、SIRPαのチロシンリン酸化のレベルについてのインビトロアッセイは、候補作用物質の非存在下で観察されるリン酸化と比較して、少なくとも5%(例えば、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または100%)の、リン酸化の減少を示すと考えられる。

0031

いくつかの態様において、抗CD47作用物質は、結合してもCD47を活性化しない。CD47が活性化される場合、アポトーシスに似た過程(すなわち、プログラム細胞死)が生じ得る(Manna and Frazier, Cancer Research, 64, 1026-1036, Feb. 1 2004)。ゆえに、いくつかの態様において、抗CD47作用物質は、アポトーシスによるCD47発現細胞細胞死直接誘導しない。

0032

SIRPα剤。SIRPα剤は、シグナル配列と膜貫通ドメインとの間に通常存在する、認識可能なアフィニティーでCD47に結合するのに十分であるSIRPαの一部分、または結合活性を保持するそのフラグメントを含む。適切なSIRPα剤は、天然タンパク質SIRPαとCD47との間の相互作用を低下させる(例えば、遮断する、妨げるなど)。SIRPα剤は、通常、SIRPαの少なくともd1ドメインを含むと考えられる。いくつかの態様において、SIRPα剤は、例えば第二のポリペプチドとインフレームで融合した融合タンパク質である。いくつかの態様において、第二のポリペプチドは、例えば融合タンパク質が血液循環から急速に取り除かれないように、融合タンパク質のサイズを増加させ得る。いくつかの態様において、第二のポリペプチドは、免疫グロブリンFc領域の一部または全体である。Fc領域は、高アフィニティーSIRPα剤によって提供される、「don't eat me」シグナルの遮断を増強する「eat me」シグナルを提供することによって、食作用を助ける。他の態様において、第二のポリペプチドは、例えばサイズの増加、多量体化ドメイン、および/またはIg分子とのさらなる結合もしくは相互作用を提供する、Fcと実質的に類似している任意の適切なポリペプチドである。

0033

いくつかの態様において、対象の抗CD47作用物質は「高アフィニティーSIRPα剤」であり、これは、SIRPα由来ポリペプチドおよびその類似体を含む。高アフィニティーSIRPα剤は、国際出願PCT/US13/21937に記載されており、これは参照により本明細書によって具体的に組み入れられる。高アフィニティーSIRPα剤は、天然SIRPαタンパク質の変種である。いくつかの態様において、高アフィニティーSIRPα剤は可溶性であり、ポリペプチドはSIRPα膜貫通ドメインを欠き、かつ野生型SIRPα配列と比べて少なくとも1個のアミノ酸変化を含み、かつ該アミノ酸変化は、CD47へのSIRPαポリペプチドの結合のアフィニティーを、例えば解離速度(off-rate)を減少させることによって、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、またはそれを上回って増加させる。

0034

高アフィニティーSIRPα剤は、シグナル配列と膜貫通ドメインとの間に通常存在する、認識可能なアフィニティー、例えば高いアフィニティーでCD47に結合するのに十分であるSIRPαの一部分、または結合活性を保持するそのフラグメントを含む。高アフィニティーSIRPα剤は、通常は、アフィニティーを増加させるアミノ酸残基の改変を有するSIRPαのd1ドメインを少なくとも含むと考えられる。

0035

SIRPα剤は「単量体」として用いられ得、SIRPαの結合ドメインは用いられるが、該結合ドメインは可溶性の単量体タンパク質として提供される。他の態様において、本発明のSIRPα変種は、例えば第二のポリペプチドとインフレームで融合した融合タンパク質であり、特に該第二のポリペプチドは多量体化を提供する。いくつかの態様において、第二のポリペプチドは、免疫グロブリンFc領域の一部または全体である。Fc領域は、高アフィニティーSIRPα剤によって提供される、「don't eat me」シグナルの遮断を増強する「eat me」シグナルを提供することによって、食作用を助ける。他の態様において、第二のポリペプチドは、例えばサイズの増加、多量体化ドメイン、および/またはIg分子とのさらなる結合もしくは相互作用を提供する、Fcと実質的に類似している任意の適切なポリペプチドである。

0036

アフィニティーの増加を提供するアミノ酸変化は、d1ドメイン中に位置し、ゆえに高アフィニティーSIRPα剤は、d1ドメイン内に、野生型配列と比べて少なくとも1個のアミノ酸変化を有する、ヒトSIRPαのd1ドメインを含む。そのような高アフィニティーSIRPα剤は、任意で、さらなるアミノ酸配列、例えば抗体Fc配列;天然タンパク質の残基150〜374またはそのフラグメントを含むがそれらに限定されない、d1ドメイン以外の野生型ヒトSIRPαタンパク質の一部分、通常d1ドメインと隣接したフラグメントなどを含む。高アフィニティーSIRPα剤は、単量体または多量体、すなわち二量体三量体四量体などであり得る。

0037

抗CD47抗体。いくつかの態様において、対象の抗CD47作用物質は、CD47に特異的に結合し(すなわち、抗CD47抗体)、一方の細胞(例えば、感染細胞)上のCD47と、もう一方の細胞(例えば、食細胞)上のSIRPαとの間の相互作用を低下させる抗体である。いくつかの態様において、適切な抗CD47抗体は、結合してもCD47を活性化しない、例えば結合してもアポトーシスを誘導しない抗体である。適切な抗体の非限定的な例には、クローンB6H12、5F9、8B6、およびC3(例えば、参照により本明細書に具体的に組み入れられる国際特許公報WO 2011/143624に記載されているもの)が含まれる。適切な抗CD47抗体には、そのような抗体の完全なヒト型ヒト化型、またはキメラ型が含まれる。ヒト化抗体(例えば、hu5F9-G4)は、それらの低い抗原性が理由で、ヒトにおけるインビボ適用にとりわけ有用である。同様に、イヌ化(caninized)抗体、ネコ化(felinized)抗体などの抗体は、それぞれイヌ、ネコ、および他の種における適用にとりわけ有用である。関心対象の抗体には、ヒト化抗体、またはイヌ化抗体、ネコ化抗体、ウマ化(equinized)抗体、ウシ化(bovinized)抗体、ブタ化(porcinized)抗体などの抗体、およびそれらの変種が含まれる。

0038

抗SIRPα抗体。いくつかの態様において、対象の抗CD47作用物質は、SIRPαに特異的に結合し(すなわち、抗SIRPα抗体)、一方の細胞(例えば、感染細胞)上のCD47と、もう一方の細胞(例えば、食細胞)上のSIRPαとの間の相互作用を低下させる抗体である。SIRPαの活性化は食作用を阻害すると考えられるため、適切な抗SIRPα抗体は、SIRPαを介したシグナル伝達を活性化または刺激することなくSIRPαに結合し得る。それどころか、適切な抗SIRPα抗体は、正常細胞を上回って負傷細胞の優先的な食作用を促す。他の細胞(非感染細胞)と比べてより高いレベルのCD47を発現するそうした細胞(例えば、感染細胞)は、優先的に貪食されると考えられる。ゆえに、適切な抗SIRPα抗体は、(食作用を阻害するのに十分なシグナル伝達応答を活性化/刺激することなく)SIRPαに特異的に結合し、SIRPαとCD47との間の相互作用を遮断する。適切な抗SIRPα抗体には、そのような抗体の完全なヒト型、ヒト化型、またはキメラ型が含まれる。ヒト化抗体は、それらの低い抗原性が理由で、ヒトにおけるインビボ適用にとりわけ有用である。同様に、イヌ化抗体、ネコ化抗体などの抗体は、それぞれイヌ、ネコ、および他の種における適用にとりわけ有用である。関心対象の抗体には、ヒト化抗体、またはイヌ化抗体、ネコ化抗体、ウマ化抗体、ウシ化抗体、ブタ化抗体などの抗体、およびそれらの変種が含まれる。

0039

可溶性CD47ポリペプチド。いくつかの態様において、対象の抗CD47作用物質は、SIRPαに特異的に結合し、一方の細胞(例えば、感染細胞)上のCD47と、もう一方の細胞(例えば、食細胞)上のSIRPαとの間の相互作用を低下させる可溶性CD47ポリペプチドである。SIRPαの活性化は食作用を阻害すると考えられるため、適切な可溶性CD47ポリペプチドは、SIRPαを介したシグナル伝達を活性化または刺激することなくSIRPαに結合し得る。それどころか、適切な可溶性CD47ポリペプチドは、非感染細胞を上回って感染細胞の優先的な食作用を促す。正常な非標的細胞(正常細胞)と比べてより高いレベルのCD47を発現するそうした細胞(例えば、感染細胞)は、優先的に貪食されると考えられる。ゆえに、適切な可溶性CD47ポリペプチドは、食作用を阻害するのに十分なシグナル伝達応答を活性化/刺激することなくSIRPαに特異的に結合する。

0040

いくつかの場合には、適切な可溶性CD47ポリペプチドは、融合タンパク質(例えば、参照により本明細書に具体的に組み入れられる米国特許公報US20100239579に構造的に記載されているもの)であり得る。しかしながら、SIRPαを活性化しない/刺激しない融合タンパク質のみが、本明細書において提供される方法に適している。適切な可溶性CD47ポリペプチドには、SIRPαに特異的に結合し得、かつ食作用を阻害するのに十分なSIRPα活性を刺激することなくCD47とSIRPαとの間の相互作用を阻害し得る、変異または天然CD47配列(例えば、細胞外ドメイン配列または細胞外ドメイン変種)を含む任意のペプチドまたはペプチドフラグメントも含まれる。

0041

ある特定の態様において、可溶性CD47ポリペプチドは、CD47の細胞外部分が、典型的には142アミノ酸長でありかつSEQID NO: 3に明示されるアミノ酸配列を有するような、シグナルペプチドを含めたCD47の細胞外ドメインを含む。本明細書において記載される可溶性CD47ポリペプチドには、少なくとも65%〜75%、75%〜80%、80〜85%、85%〜90%、または95%〜99%(または65%〜100%の間にある具体的に挙げられていない任意のパーセント同一性)のアミノ酸配列を含むCD47細胞外ドメイン変種も含まれ、変種は、SIRPαシグナル伝達を刺激することなくSIRPαに結合する能力を保持する。

0042

ある特定の態様において、シグナルペプチドアミノ酸配列は、別のポリペプチド(例えば、免疫グロブリンまたはCTLA4)に由来するシグナルペプチドアミノ酸配列で置換され得る。例えば、細胞外膜横断する細胞表面ポリペプチドである全長CD47とは異なり、可溶性CD47ポリペプチドは分泌される;したがって、可溶性CD47ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、通常は細胞から分泌されるポリペプチドと関連しているシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。

0043

他の態様において、可溶性CD47ポリペプチドは、シグナルペプチドを欠く、CD47の細胞外ドメインを含む。例示的な態様において、シグナルペプチドを欠いたCD47細胞外ドメインは、SEQID NO: 1に明示されるアミノ酸配列(124個のアミノ酸)を有する。本明細書において記載されるように、シグナルペプチドはタンパク質の移動中に切断されるか、またはシグナルペプチドは細胞外膜に固定されたままである(そのようなペプチドはシグナルアンカーとも呼ばれる)かのいずれかであるため、分泌タンパク質または膜貫通タンパク質のシグナルペプチドは、細胞表面に曝露されていない。CD47のシグナルペプチド配列は、インビボにおいて前駆体CD47ポリペプチドから切断されると思われる。

0044

他の態様において、可溶性CD47ポリペプチドには、CD47細胞外ドメイン変種が含まれる。そのような可溶性CD47ポリペプチドは、SIRPαシグナル伝達を刺激することなくSIRPαに結合する能力を保持する。CD47細胞外ドメイン変種は、参照ヒトCD47配列と少なくとも65%〜75%、75%〜80%、80〜85%、85%〜90%、または95%〜99%同一である(記載される範囲のいずれか1つの間にある任意のパーセント同一性を含む)アミノ酸配列を有し得る。

0045

「抗体」または「抗体成分」という用語は、エピトープに適合し認識する特異的な形状を有する、ポリペプチド鎖を含む任意の分子構造体を含むことが意図され、1つまたは複数の非共有結合性結合相互作用により、分子構造体とエピトープの複合体が安定化される。本発明において利用される抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体の方が、細胞培養または組換えによって複製することができ、改変してそれらの抗原性を低下させることができるため、好ましい。

0046

ポリクローナル抗体は、産生動物に抗原性組成物を注入することにより、標準プロトコールによって作られ得る。例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい。タンパク質全体、または大きめタンパク質部分を利用する場合、抗体は、産生動物にタンパク質および適切なアジュバント(例えば、フロイント、フロイント完全、水中油型乳剤など)を免疫することによって作られ得る。より小さなペプチドが利用される場合、ペプチドとより大きな分子とをコンジュゲートして、免疫賦活コンジュゲートを作製することが有利である。そのような使用のための、市販されている一般に利用されるコンジュゲートタンパク質には、ウシ血清アルブミンBSA)およびキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)が含まれる。特定のエピトープに対する抗体を作るために、完全配列に由来するペプチドを利用し得る。あるいは、タンパク質標的の比較的短いペプチド部分に対する抗体を作製するために、ポリペプチドをオボアルブミン、BSA、またはKLHなどのキャリアタンパク質接合させた場合に、優れた免疫応答が誘発され得る。あるいは、モノクローナル抗体の場合、接種動物の脾臓由来のものなど、刺激された免疫細胞を単離することによって、ハイブリドーマを形成し得る。次いで、これらの細胞を、細胞培養下で無限に複製し得る骨髄腫細胞または形質転換細胞などの不死化細胞に融合させ、それによって不死の免疫グロブリン分泌細胞株が産生される。加えて、抗体または抗原結合フラグメントは、遺伝子操作によって産生され得る。ヒトに投与された場合にそれほど免疫応答をもたらさない、ヒト化抗体、キメラ抗体、または異種ヒト抗体が、本発明における使用に好ましい。

0047

完全な免疫グロブリン(またはそれらの組換え対応物)に加えて、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリンフラグメント(例えば、Fab'、F(ab')2、または他のフラグメント)が、本発明における抗体成分として有用である。そのような抗体フラグメントは、リシンペプシンパパイン、または他のプロテアーゼ切断によって免疫グロブリン全体から作製され得る。「フラグメント」、つまり最小限の免疫グロブリンは、組換え免疫グロブリン技法を利用して設計され得る。例えば、本発明における使用のための「Fv」免疫グロブリンは、可変軽鎖領域可変重鎖領域にペプチドリンカー(例えば、ポリグリシン、または、αヘリックスβシートモチーフも形成しない別の配列)を介して連結させることによって産生され得る。

0048

抗体には、遊離抗体およびそれに由来する抗原結合フラグメント、ならびにコンジュゲート、例えばペグ化抗体、薬物、放射性同位体、または毒素のコンジュゲートなどが含まれる。特異的エピトープまたはエピトープの組み合わせに向けられたモノクローナル抗体は、マーカーを発現している細胞集団の標的化および/または枯渇を可能にする。モノクローナル抗体を用いた様々な技法を利用して、マーカーを発現している細胞集団をスクリーニングすることができ、これには、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いた磁気分離固相マトリックス(すなわち、プレート)に接着させた抗体による「パンニング」、およびフローサイトメトリー(例えば、米国特許第5,985,660号;およびMorrison et al. Cell, 96:737-49 (1999)を参照されたい)が含まれ得る。これらの技法は、生検サンプル免疫組織化学;癌細胞によって血中および他の生物学的流体中に流されたマーカーの存在の検出などにおいて、細胞の特定の集団についてのスクリーニングを可能にする。

0049

そのような抗体のヒト化型も本発明の範囲内にある。ヒト化抗体は、それらの低い抗原性が理由で、ヒトにおけるインビボ適用にとりわけ有用である。

0050

「多特異性または二重特異性抗体」という語句は、2種以上のタンパク質を認識する合成抗体または組換え抗体を指す。エピトープの組み合わせに向けられた二重特異性抗体は、該エピトープの組み合わせを発現している細胞集団の標的化および/または枯渇を可能にする。例示的な二重特異性抗体には、CD47およびSCLC癌細胞マーカーの組み合わせを標的とするものが含まれる。二重特異性抗体の作製は、文献に、例えば米国特許第5989830号、米国特許第5798229号に記載されており、それらは参照により本明細書に組み入れられる。より高次の特異性、例えば三重特異性抗体は、Holliger and Hudson (2005) Nature Biotechnology 23:1126-1136によって記載されている。

0051

CD47阻害剤の効力は、CD47活性をアッセイすることによって評価され得る。上記のアッセイまたはその改変型が用いられる。例示的なアッセイにおいて、SCLCを、候補作用物質の存在下または非存在下で、骨髄由来のマクロファージとともにインキュベートする。細胞表面CD47の阻害剤は、該候補作用物質の非存在下における食作用と比較して、少なくとも約10%、または最高20%、または50%、または70%、または80%、または最高約90%、食作用を上方調節すると考えられる。同様に、SIRPαのチロシンリン酸化のレベルについてのインビトロアッセイは、候補作用物質の非存在下で観察されるリン酸化と比較して、少なくとも約10%、または最高20%、または50%、または70%、または80%、または最高約90%の、リン酸化の減少を示すと考えられる。

0052

本発明の一態様において、作用物質、または該作用物質を含む薬学的組成物は、食細胞の表面に存在しているSIRPα受容体へのCD47の結合を検出可能な程度に阻害するのに有効な量で提供される。有効量は、当技術分野における経験的な通常の試験により決定される。有効量は、移植される細胞の数、移植の部位、および移植レシピエントに特異的な因子に応じて変動し得る。

0053

「食細胞(phagocytic cell)」および「貪食細胞(phagocyte)」という用語は、食作用の能力がある細胞を指すために本明細書において互換可能に用いられる。4つの主な貪食細胞のカテゴリー:マクロファージ、単核細胞組織球および単球)、多形核白血球好中球)、および樹状細胞が存在する。

0054

生物学的サンプル」という用語は、生物から得られる多様なサンプルタイプを包含し、診断用またはモニタリング用アッセイにおいて用いられ得る。該用語は、血液および生物学的起源の他の液体サンプル生検標本もしくは組織培養物またはそれらに由来する細胞およびそれらの子孫などの固体組織サンプルを包含する。該用語は、試薬による処理、可溶化、またはある特定の構成要素についての富化など、それらの調達後に任意の方法で操作されたサンプルを包含する。該用語は臨床サンプルを包含し、また、培養下の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清血漿、生物学的流体、および組織サンプルも含む。

0055

「治療」、「治療すること」、「治療する」などという用語は、概して、望ましい薬理学的および/または生理学的な効果を得ることを指すために本明細書において用いられる。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に阻止するという点において予防的であり得、かつ/または疾患および/もしくは該疾患に起因する有害な作用に対する部分的なもしくは完全な安定化もしくは治癒という点において治療的であり得る。本明細書において用いられる「治療」は、哺乳類、例えばマウス、ラットウサギ、ブタ、ヒトおよび他の類人猿を含めた霊長類、特にヒトにおける疾患の任意の治療を網羅し、かつ(a)疾患もしくは症状にかかりやすい傾向を有し得るが、それを有するとはまだ診断されていない対象において疾患もしくは症状が生じるのを阻止すること;(b)疾患症状を阻害すること、すなわちその進行を停止させること;または(c)疾患症状を軽減すること、すなわち疾患もしくは症状の退縮を引き起こすことを含む。

0056

「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は本明細書において互換可能に用いられ、それに対する診断、治療、または療法が望まれる任意の哺乳類対象、特にヒトを指す。

0057

本明細書において用いられる「宿主細胞」とは、組換えベクターまたは他の運搬用ポリヌクレオチドに対するレシピエントとして用いられ得るまたは用いられている微生物、または真核細胞、または単細胞実体として培養される細胞株を指し、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。天然の、偶発的な、または意図的な変異が原因で、単一の細胞の子孫の形態またはゲノムDNAもしくは全DNAの相補鎖が必ずしも元の親と完全に同一ではない場合があることが理解される。

0058

「癌」、「新生物」、「腫瘍」および「癌腫」という用語は、本明細書において互換可能に用いられ、比較的自律した成長を呈し、その結果、細胞増殖制御の重大な喪失によって特徴付けられる異常な成長表現型を呈する細胞を指す。一般的に、本出願における検出または治療のための関心対象の細胞には、前癌状態(例えば、良性)、悪性、前転移性(pre-metastatic)、転移性、および非転移性の細胞が含まれる。癌性細胞の検出は、特に関心対象である。「正常細胞」の文脈において用いられる「正常な」という用語は、形質転換されていない表現型の細胞、または調べられる組織型非形質転換細胞の形態を呈する細胞を指すことを意図している。「癌性表現型」とは、一般的に、癌性細胞に特徴的である多様な生物学的現象のいずれかを指し、現象は癌のタイプによって変動し得る。癌性表現型は、一般的に、例えば細胞の成長もしくは増殖の異常(例えば、無制御な成長または増殖)、細胞周期の調節の異常、細胞移動性の異常、細胞-細胞相互作用の異常、または転移などの異常によって同定される。

0059

「治療標的」とは、(例えば、発現、生物学的活性などの調整によって)その活性が調整されると、癌性表現型の調整を提供し得る遺伝子または遺伝子産物を指す。全体にわたって用いられるように、「調整」とは、指定された現象の増加または減少を指すことを意図している(例えば、生物学的活性の調整とは、生物学的活性の増加または生物学的活性の減少を指す)。

0060

肺癌
肺癌腫は、世界的に癌関連死の主因である。約85%の症例は、喫煙に関連付けされる。症状には、胸部不快感または痛み、体重減少、およびそれほど多くはないものの喀血が含まれ得る;しかしながら、多くの患者は、いかなる臨床症状もなしに転移性疾患呈示する。診断は、典型的には、胸部X線またはCTによって行われ、生検によって確認される。疾患の病期に応じて、治療には、外科手術、化学療法、放射線療法、または併用が含まれる。過去数十年間、肺癌患者、特にIV期(転移性)疾患を有する患者の予後は不良である。

0061

呼吸上皮細胞は、新生物になる前に、癌促進作用物質への長期間の曝露および多数の遺伝子変異蓄積を要する(広域発癌(field carcinogenesis)と呼ばれる作用)。肺癌を有する一部の患者において、細胞成長を刺激する遺伝子(K-ras、MYC)における二次的または付加的な変異は、成長因子受容体シグナル伝達(EGFRHER2/neu)の異常を引き起こし、異常細胞の増殖に寄与するアポトーシスを阻害する。加えて、腫瘍抑制遺伝子(p53、APC)を阻害する変異は、癌につながり得る。関与し得る他の変異には、EML-4-ALK転座、ならびにROS-1、BRAF、およびPI3KCAにおける変異が含まれる。肺癌に主として寄与するこれらの遺伝子などの遺伝子は、ドライバー変異と呼ばれる。ドライバー変異は喫煙者の間で肺癌を引き起こし得るまたは寄与し得るが、これらの変異は、特に非喫煙者の間で肺癌の原因となる可能性がある。

0062

胸部X線は、最初の画像検査であることが多い。それは、単一の塊もしくは多発性の塊、または孤立肺結節腫大した肺門、拡大した縦隔気管気管支狭窄無気肺治療抵抗性(non-resolving)の実質性浸潤空洞病変、または原因不明胸膜肥厚もしくは胸膜滲出液など、明確に定められる異常を示し得る。これらの所見は、肺癌について示唆的であるが診断的ではなく、CTスキャンまたは複合PET-CTスキャンおよび細胞病理学的な確認を用いた追跡調査を要する。

0063

CTは、診断を強力に示唆し得る多くの特徴的な解剖学パターンおよび外観を示す。CTはまた、接近可能な病変コア針生検ガイドし得、病期分類に有用である。単純X線で見出された病変が肺癌である可能性が高い場合、PET-CTが行われ得る。この検査は、CTからの解剖学的画像とPETからの機能的画像とを組み合わせる。PET画像は、炎症過程と悪性過程とを区別するのに役立ち得る。

0064

SCLCは2つの病期:限局(limited)期および進展(extensive)期を有する。限局期SCLC疾患は、胸膜滲出液または心膜滲出液が存在する場合を除いて、1つの許容放射線療法ポート内に包含され得る、一方の半胸部(同側のリンパ節を含む)に限定される癌である。進展期疾患は単一の半胸部の外側の癌、または胸膜滲出液もしくは心膜滲出液中に検出される悪性細胞の存在である。SCLCを有する患者の3分の1未満は限局期疾患を呈示し;残りの患者は、進展型遠隔転移をしばしば有する。SCLCの全体的予後は不良である。限局期SCLCの生存期間中央値は20ヶ月であり、20%の5年生存率を有する。進展期SCLCを有する患者はとりわけ不良であり、<1%の5年生存率を有する。

0065

NSCLCは4つの病期I〜IVを有する(TNMシステムを用いて)。TNM病期分類は、腫瘍サイズ、腫瘍およびリンパ節の位置、ならびに遠隔転移の有無に基づく。NSCLCを有する患者の5年生存率は、I期疾患を有する患者の場合の60〜70%からIV期疾患を有する患者の場合の<1%まで、病期によって変動する。

0066

従来の治療は、細胞タイプによっておよび疾患の病期によって変わる。腫瘍に関連しない、患者の多くの因子が、治療の選定に影響を及ぼす。たとえ積極的療法による治癒が技術的に可能であり得たとしても、心肺予備力不良、低栄養衰弱または身体能力不良状態、血球減少症および精神医学的なまたは認知機能病気を含めた共存症はすべて、治癒的治療よりも緩和的治療の決定、または一切の治療なしの決定につながり得る。

0067

任意の病期のSCLCは、典型的には、当初は治療に応答性であるが、応答は通常一時的である。疾患の病期に応じて、放射線療法を伴うまたは伴わない化学療法が提供される。多くの患者において、化学療法は、生存を延長させかつその使用を正当化するのに十分なほど生活の質を向上させる。外科手術は、一般的にSCLCの治療において何の役割も果たさないが、外科手術は、腫瘍がSCLCと同定される前に外科切除を受けた、広がりを有しない小さな局所性腫瘍(孤立性肺結節など)を有する稀な患者において治癒的であり得る。エトポシドおよび白金化合物シスプラチンまたはカルボプラチンのいずれか)の化学療法レジメンが一般に用いられ、イリノテカントポテカンビンカアルカロイドビンブラスチンビンクリスチンビノレルビン)、アルキル化剤シクロホスファミドイホスファミド)、ドキソルビシンタキサンドセタキセルパクリタキセル)、およびゲムシタビンなどの他の薬物も同様である。疾患が半胸部に限定される場合、放射線療法は臨床成果をさらに向上させる;放射線療法に対するそのような応答は、限局期疾患の定義の根拠であった。脳転移を阻止する頭蓋照射の使用も、ある特定の症例において提唱される;微小転移はSCLCにおいてよく見られ、化学療法は、血液脳関門を通過し得る能力が低い。

0068

進展期疾患において、治療は、放射線療法よりもむしろ化学療法に基づくが、放射線療法は、骨または脳への転移に対する緩和的治療としてしばしば用いられる。化学療法に対して優れた応答を有する患者では、脳におけるSCLCの成長を阻止するために、限局期SCLCのように、予防的な脳照射が用いられることがある。

0069

NSCLCに対する治療は、典型的には、外科手術の適格性についての評価、それに続く、腫瘍タイプおよび病期に応じた、外科手術、化学療法、放射線療法、または必要に応じてモダリティの併用の選定を伴う。

0070

癌の治療
本発明は、CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、EpCAMなどを含むがそれらに限定されない肺癌細胞表面マーカーに向けられた標的化された治療用作用物質の有効用量の導入により、肺癌細胞の成長を低下させるための方法を提供する。いくつかの態様において、マーカーは、CD56、CD44、CD99、およびEpCamのうちの1つである。好ましい態様において、標的化された治療用作用物質と、CD47遮断作用物質、例えば可溶性SIRPα単量体または多量体、抗CD47抗体、小分子などとを組み合わせる。ある特定の態様において、癌はSCLCである。CD47の活性を遮断することによって、ある特定の腫瘍細胞に関して見出される、食作用の下方調節が阻止される。

0071

「癌細胞の成長を低下させること」には、癌細胞の増殖を低下させることおよび癌性細胞になる非癌性細胞の発生率を低下させることが含まれるが、それらに限定されるわけではない。癌細胞成長の低下が達成されているかどうかは、[3H]-チミジンの取り込み;ある期間にわたって細胞数計数すること;SCLCに関連したマーカーを検出することおよび/または測定することなどを含むがそれらに限定されない、任意の公知のアッセイを用いて容易に判定され得る。

0072

ある物質、つまり特定量の該物質が癌を治療することにおいて有効であるかどうかは、生検、造影剤による放射線学的検査、CATスキャン、および個体の血中における癌に関連した腫瘍マーカーの検出を含むがそれらに限定されない、癌についての多様な公知の診断アッセイのいずれかを用いて評価され得る。物質は、全身にまたは局部的に、通常は全身に、投与され得る。

0073

代替的な態様として、癌細胞成長を低下させる作用物質、例えば化学療法薬物を、CD47特異的抗体へのコンジュゲーションによって癌細胞に標的化することができる。ゆえに、いくつかの態様において、本発明は、対象に薬物-抗体複合体を投与する工程を含む、癌細胞に薬物を送達する方法を提供し、該抗体は癌関連ポリペプチドに特異的であり、かつ該薬物は癌細胞成長を低下させるものであり、それらの様々な種類が当技術分野において公知である。癌関連ポリペプチドに特異的な抗体に薬物を結合させること(例えば、薬物-抗体複合体を形成するように、共有結合または非共有結合のいずれかで、直接的にまたはリンカー分子を介して連結させること)によって、標的化は実現され得る。薬物を抗体に結合させる方法は当技術分野において周知であり、本明細書において詳述される必要はない。

0074

ある特定の態様において、二重特異性抗体が用いられ得る。例えば、一方の抗原結合ドメインはCD47に向けられており、他方の抗原結合ドメインは、CD24、CD166、CD56、CD326、CD298、CD29、CD63、CD9、CD164、CD99、CD46、CD59、CD57、CD165、EpCAMなどの癌細胞マーカーに向けられている二重特異性抗体が用いられ得る。

0075

一般的に、用語が本明細書において利用されるとき、「抗体」または「抗体成分」は、エピトープに適合し認識する特異的な形状を有する、ポリペプチド鎖を含む任意の分子構造体を含むことが意図され、1つまたは複数の非共有結合性結合相互作用により、分子構造体とエピトープの複合体が安定化される。モノクローナル抗体の場合、接種動物の脾臓由来のものなど、刺激された免疫細胞を単離することによって、ハイブリドーマを形成し得る。次いで、これらの細胞を、細胞培養下で無限に複製し得る骨髄腫細胞または形質転換細胞などの不死化細胞に融合させ、それによって不死の免疫グロブリン分泌細胞株が産生される。利用される不死の細胞株は、好ましくは、ある特定の栄養素の利用に必要な酵素欠損しているように選択される。多くのそのような細胞株(骨髄腫など)が当業者に公知であり、例えばチミジンキナーゼ(TK)またはヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)を含む。これらの欠損は、例えばヒポキサンチン・アミノプテリンチミジン培地HAT)上で成長し得るそれらの能力に従った、融合細胞に対する選択を可能にする。

0076

ヒトにおいて激しいまたは有害な免疫応答(アナフィラキシーショックなど)を誘導する傾向が低下しており、かつ治療用またはイメージング用抗体物質による反復投薬を妨げるであろう免疫応答(例えば、ヒト抗マウス抗体「HAMA」応答)をプライムする傾向の低下も呈する抗体が、本発明における使用に好ましい。これらの抗体は、すべての投与経路に好ましい。ゆえに、ヒトに投与された場合にそれほど免疫応答をもたらさない、ヒト化抗体、キメラ抗体、または異種ヒト抗体が、本発明における使用に好ましい。

0077

マウス(または他の動物由来の)ハイブリドーマクローンから得られたマウス可変軽鎖および重鎖領域(VKおよびVH)と、ヒト定常軽鎖および重鎖領域とを組み合わせることによる組換え手段によってキメラ抗体を作製して、主にヒトドメインを有する抗体を産生し得る。そのようなキメラ抗体の産生は当技術分野において周知であり、標準的手段(例えば、参照により本明細書に完全に組み入れられる米国特許第5,624,659号に記載されているもの)によって達成され得る。ヒト化抗体は、さらによりヒト様の免疫グロブリンドメインを含有し、かつ動物由来の抗体の相補性決定領域のみを組み入れるように操作される。これは、モノクローナル抗体の可変領域の超可変ループの配列を慎重に調べ、それらをヒト抗体鎖の構造に適合させることによって実現される。表面的には複雑であるものの、実践において、過程は単純である。例えば、参照により本明細書に完全に組み入れられる米国特許第6,187,287号を参照されたい。

0078

あるいは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンを産生するように遺伝子改変されている動物から産生され得る。トランスジェニック動物は、該動物の天然抗体を産生しない「ノックアウト」動物を初めに産生し、該動物にヒト抗体遺伝子座を(例えば、ヒト人工染色体の使用によって)安定に形質転換することによって産生され得る。次いで、該動物によってヒト抗体のみが作られる。そのような動物を作製し、そこから抗体を得るための技法は、参照により本明細書に完全に組み入れられる米国特許第6,162,963号および第6,150,584号に記載されている。そのような完全ヒト異種抗体は、本発明の方法および組成物における使用のために好ましい抗体である。あるいは、ヒト可変領域を含有するファージライブラリーから、一本鎖抗体を産生することができる。参照により本明細書に完全に組み入れられる米国特許第6,174,708号を参照されたい。

0079

完全な免疫グロブリン(またはそれらの組換え対応物)に加えて、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリンフラグメント(例えば、Fab'、F(ab')2、または他のフラグメント)が、本発明における抗体成分として有用である。そのような抗体フラグメントは、リシン、ペプシン、パパイン、または他のプロテアーゼ切断によって免疫グロブリン全体から作製され得る。「フラグメント」、つまり最小限の免疫グロブリンは、組換え免疫グロブリン技法を利用して設計され得る。例えば、本発明における使用のための「Fv」免疫グロブリンは、可変軽鎖領域を可変重鎖領域にペプチドリンカー(例えば、ポリグリシン、または、αヘリックスもβシートモチーフも形成しない別の配列)を介して連結させることによって産生され得る。

0080

Fvフラグメントは、可変重鎖ドメイン(VH)および可変軽鎖ドメイン(VL)のヘテロ二量体である。IgG全体において生じる重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインのヘテロ二量体は、ジスルフィド結合によって接続される。VHおよびVLがペプチドリンカーによって接続されている組換えFvは典型的に安定であり、例えば、両方とも参照により本明細書に完全に組み入れられるHuston et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 85:5879 5883 (1988)およびBird et al., Science 242:423 426 (1988)を参照されたい。これらは、特異性およびアフィニティーを保持することが見出されており、腫瘍を撮像するのに有用であること、および腫瘍療法のための組換え免疫毒素を作製することが示されている一本鎖Fvである。しかしながら、研究者らは、一本鎖Fvの一部が抗原に対するアフィニティーの低下を有すること、およびペプチドリンカーが結合に干渉し得ることを見出している。参照により本明細書に完全に組み入れられる米国特許第6,147,203号に記載されているように、VH領域およびVL領域間に安定化ジスルフィド結合を含む、改善されたFvも作製されている。これらの最小限の抗体のいずれかを本発明において利用してもよく、HAMA反応を避けるためにヒト化されているものは、本発明の態様における使用に好ましい。

0081

付加された化学的リンカー蛍光色素、酵素、基質化学発光成分などの検出可能な成分、ストレプトアビジンアビジン、もしくはビオチンなどの特異的結合成分、または薬物コンジュゲートを有する誘導体化ポリペプチドを、本発明の方法および組成物において利用し得る。

0082

本発明のいくつかの態様において、本発明のポリペプチド剤を、1つまたは複数の治療用成分細胞傷害性成分、またはイメージング用成分に結合させるまたはコンジュゲートする。本明細書において使用するとき、「細胞傷害性成分」(C)とは、細胞に接近した場合または細胞によって吸収された場合に、細胞成長を阻害するまたは細胞死を促進する成分を単に意味する。この点において適切な細胞傷害性成分には、放射性同位体(放射性核種)、分化誘導因子および小型の化学毒性(chemotoxic)薬物などの化学毒性作用物質、毒素タンパク質、ならびにそれらの誘導体が含まれる。薬物動態学的安定性および患者への低下した全体的毒性の必要性を適当に考慮して、作用物質は本発明のポリペプチド剤に任意の適切な技法によってコンジュゲートされ得る。治療用作用物質は、直接的または間接的(例えば、リンカー基を介して)に適切な成分に結合され得る。直接的な反応は、それぞれが他方と反応し得る官能基所有する場合に、可能である。例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基などの求核基は、無水物もしくは酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と、または良好な脱離基(例えば、ハロゲン化物)を含有するアルキル基と反応する能力があり得る。あるいは、適切な化学的リンカー基が用いられ得る。リンカー基は、結合能への干渉を避けるための、本発明のポリペプチド剤を作用物質から遠ざけるスペーサーとして機能し得る。リンカー基は、成分上または本発明のポリペプチド剤上の置換基化学反応性を増加させ、ゆえに結合効率を増加させる働きもし得る。化学反応性の増加は、そうでなければ可能でないであろう、成分の使用、または成分上の官能基の使用も容易にし得る。

0083

適切な連結化学には、(抗体成分上のスルフヒドリルと反応する)マレイミジルリンカーおよびハロゲン化アルキルリンカー、ならびに(抗体成分上の第一級アミンと反応する)スクシンイミジルリンカーが含まれる。いくつかの第一級アミンおよびスルフヒドリル基が免疫グロブリン上に存在しており、さらなる基は、組換え免疫グロブリン分子内に設計され得る。ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方の、多様な二官能性または多官能性の試薬(Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.のカタログに記載されているものなど)がリンカー基として採用され得ることは当業者に明白であろう。結合は、例えばアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化炭水化物残基を介してもたらされ得る。そのような方法論を記載した多数の参考文献が存在し、例えば米国特許第4,671,958号がある。代替的な結合法として、米国特許第5,057,313号および第5,156,840号に記載されているように、細胞傷害性成分を本発明のポリペプチド剤に、グリコシル化部位における酸化炭水化物残基を介して結合させ得る。本発明のポリペプチド剤を細胞傷害性成分または治療用成分に結合させるさらに別の代替的な方法は、ストレプトアビジン/ビオチンまたはアビジン/ビオチンなどの非共有結合性結合ペアの使用によるものである。これらの態様において、ペアの一方のメンバーは抗CD47、CV1などの成分に共有結合で結合され、結合ペアの他方のペアは治療用成分、細胞傷害性成分、またはイメージング用成分に共有結合で結合される。

0084

細胞傷害性成分が、本発明のポリペプチド剤の結合部から遊離しているとより強力である場合、細胞内に内在化する間もしくは内在化した時点で切断可能であるリンカー基、または細胞外環境で経時的に徐々に切断可能であるリンカー基を用いることが望ましい場合もある。多数の種々の切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの細胞傷害性成分作用物質の細胞内放出のメカニズムには、ジスルフィド結合の還元による切断(例えば、米国特許第4,489,710号)、光不安定性(photolabile)結合の照射による切断(例えば、米国特許第4,625,014号)、誘導体化されたアミノ酸側鎖加水分解による切断(例えば、米国特許第4,638,045号)、血清補体介在性加水分解による切断(例えば、米国特許第4,671,958号)、および酸触媒加水分解による切断(例えば、米国特許第4,569,789号)が含まれる。

0085

2種以上の成分を本発明のポリペプチド剤に結合させることが望ましい場合もある。剤を多誘導体化(poly-derivatizing)することによって、いくつかの戦略を同時に実行し得、例えば可視化技法によって追跡するために、治療用抗体を標識化し得る。特定の態様にかかわらず、2種以上の成分とのコンジュゲートは、多様な方法で調製され得る。例えば、2種以上の成分をポリペプチド分子直接結合させ得るか、または接着のための多数の部位を提供するリンカー(例えば、デンドリマー)が用いられ得る。あるいは、2種以上の細胞傷害性成分またはイメージング用成分を保持する能力を有するキャリアが用いられ得る。

0086

キャリアは、直接的なまたはリンカー基を介した共有結合性結合、および非共有結合性の会合を含めた多様な方法で作用物質を担持し得る。適切な共有結合性キャリアには、アルブミンなどのタンパク質(例えば、米国特許第4,507,234号)、ペプチド、およびアミノデキストランなどの多糖類(例えば、米国特許第4,699,784号)が含まれ、そのそれぞれは成分の接着のための多数の部位を有する。キャリアは、非共有結合性結合などの非共有結合性の会合によってまたはリポソーム小胞内などへのカプセル化によっても、作用物質を担持し得る(例えば、米国特許第4,429,008号および第4,873,088号)。カプセル化用キャリアは、本発明における使用のための抗体成分へのイメージング用成分のコンジュゲーションにとりわけ有用である、というのも検出のための十分量のイメージング用成分(色素、磁気共鳴造影試薬など)を該抗体成分とより簡単に会合させ得るためである。加えて、カプセル化用キャリアは、化学毒性による治療態様においても有用である、というのもそれらは、治療用組成物が化学毒性成分を経時的に徐々に放出するのを可能にし得ると同時に、腫瘍細胞の近くにそれを濃縮するためである。

0087

細胞傷害性成分としての使用のための好ましい放射性核種は、薬理学的投与に適している放射性核種である。そのような放射性核種には、123I、125I、131I、90Y、211At、67Cu、186Re、188Re、212Pb、および212Biが含まれる。ヨウ素およびアスタチン同位体は、大量の参考文献がそれらの使用に関して蓄積されているように、本発明の治療用組成物における使用のためのより好ましい放射性核種である。

0088

好ましい化学毒性作用物質には、カルボプラチン、シスプラチン、ビンクリスチンなどの小分子薬物、パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン、ヒドロキシウレア、ゲムシタビン、ビノレルビン、イリノテカン、チラパザミン、マトリライシンメトトレキサートピリミジンおよびプリン類似体、ならびに当技術分野において公知の他の適切な小型毒素が含まれる。好ましい化学毒性分化誘導因子には、ホルボールエステルおよび酪酸が含まれる。化学毒性成分は、化学的リンカーを介して抗体成分に直接コンジュゲートされ得るか、またはキャリア内にカプセル化され得、それを次いで抗体に結合させる。細胞傷害性成分としての使用のための好ましい毒素タンパク質には、リシンAおよびB、アブリンジフテリア毒素ブリジン(bryodin)1および2、モモルジン、トリコキリン(trichokirin)、コレラ毒素ゲロニンシュードモナス外毒素赤痢菌毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ならびに医薬生化学の技術分野において公知の他の毒素タンパク質が含まれる。これらの毒素作用物質は、とりわけ血管内に注入された場合に患者において望ましくない免疫応答を誘発し得るため、抗体に結合させるためのキャリア内にそれらをカプセル化することが好ましい。

0089

投与に関して、標的化された治療用作用物質、または標的化された治療用作用物質の組み合わせは、別個にまたは一緒に投与され得;一般的に、同じ通常の時間枠内に、例えば1週間以内に、3〜4日間以内に、1日以内に、または互いと同時に投与される。

0090

1種または複数種の作用物質を、投与前に、非毒性の薬学的に許容されるキャリア物質と混合する。通常、これは、生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、リンゲル液乳酸リンゲル液、または選定された手段による投与に対して生理学的に許容される任意の等張溶液などの水溶液である。好ましくは、溶液は、無菌でかつ発熱物質不含であり、FDAによって認可されている現行適正製造基準(Good Manufacturing Processe)(GMP)の下で製造されかつパッケージされる。通常の技能を有する臨床医であれば、血管内注入、リンパ節内、腹腔内への直接注入、または他の経路による投与のために薬学的組成物を製剤化する場合の、pHの適当な範囲、張性、および添加物または保存剤を熟知している。pHまたは張性を調整するための添加物に加えて、作用物質は、凝集および重合に対して、アミノ酸および非イオン性界面活性剤ポリソルベート、ならびにポリエチレングリコールで安定化され得る。任意で、さらなる安定剤には、様々な生理学的に許容される糖および塩が含まれ得る。また、アミノ酸に加えて、ポリビニルピロリドンが添加され得る。保存およびヒトへの投与のために安定化される適切な治療用免疫グロブリン溶液は、参照により本明細書に完全に組み入れられる米国特許第5,945,098号に記載されている。ヒト血清アルブミンHSA)など、他の作用物質を治療用またはイメージング用組成物に添加して、抗体コンジュゲートを安定化させ得る。

0091

本発明の組成物は、医学的に適当な任意の手順、例えば血管内(静脈内、動脈内、毛細血管内)投与、腫瘍内への注入などを用いて投与され得る。血管内注入は、静脈内または動脈内注入によるものであり得る。特定の患者に与えられる治療用組成物の有効量は多様な因子に依存し、そのうちのいくつかは患者ごとに異なる。資格を有する臨床医であれば、治療用組成物の有効量を決定して、患者に投与して、腫瘍細胞の成長を遅らせかつ腫瘍細胞の死を促進することができるであろう。作用物質の投薬量は、腫瘍の治療、投与の経路、治療法性質、治療法に対する腫瘍の感度などに依存する。LD50動物データ、およびコンジュゲートした細胞傷害性成分またはイメージング用成分に関して入手可能な他の情報を利用すると、臨床医であれば、投与の経路に応じて、個体に対する最大安全用量を決定することができる。例えば、治療用組成物が投与されている流体の量がより多量であることを考慮すると、静脈内投与される用量は、局部的に投与される用量よりも多くてもよい。同様に、身体から急速に取り除かれる組成物をより高用量でまたは反復投薬で投与して、治療濃度を維持し得る。通常の技能を利用すると、資格を有する臨床医であれば、日常臨床的試行の経過の中で、特定の治療用またはイメージング用組成物の投薬量を最適化することができるであろう。

0092

典型的に、有効投薬量は、対象の体重キログラムあたり0.001〜100ミリグラムである。第二の作用物質に対する抗CD47の比は、1:100、1:50、1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、5:1、10:1、50:1、100:1に及び得る。作用物質は、2回以上の一連の投与で対象に投与され得る。治療用組成物に関して、一定の周期的投与(例えば、2〜3日ごと)が要求されることもあり、または毒性を低下させることが望ましい場合もある。反復投薬レジメンにおいて利用される治療用組成物に関して、HAMAまたは他の免疫応答を誘発しない抗体成分が好ましい。

0093

実施例1
高アフィニティーSIRPα変種は、小細胞肺癌のマクロファージによる破壊を増強する
CD47は、マクロファージ上の阻害性受容体であるSIRPαを介したシグナル伝達によって、癌細胞が免疫系を回避することを可能にする。本発明者らは、最近、SIRPαのN末免疫グロブリンドメインを操作することによって、次世代CD47アンタゴニストを開発した。これらの「高アフィニティーSIRPα変種」は、野生型SIRPαと比べておよそ50,000倍向上した、11.1pMという、ヒトCD47に対する低いアフィニティー(KD)を有する。腫瘍特異的抗体と組み合わせた場合、高アフィニティーSIRPα変種は、免疫療法用アジュバントとして作用して、癌細胞のマクロファージによる破壊を最大限に高める。

0094

本発明者らは、ここで、これらの剤を、臨床上認可された抗体が存在しない、予後不良を有する癌である小細胞肺癌(SCLC)に適用した。本発明者らは、それらの表面に高レベルのCD47が発現されたSCLC細胞株および原発性サンプルを見出した。ヒトマクロファージを用いて、本発明者らは、CD47遮断療法が、SCLC細胞のマクロファージ食作用を誘導し得ることを見出した。CD47遮断抗体による、原発性ヒトSCLC腫瘍を担持するマウスの処理は、腫瘍成長を阻害し得かつ生存を有意に延長させ得た。高アフィニティーSIRPα変種との組み合わせで標的とされ得る新規なSCLC抗原を同定するために、包括的抗体アレイを用いたフローサイトメトリーによって、SCLCサンプルをスクリーニングした。

0095

本発明者らは、SCLC細胞の表面にある腫瘍特異的抗原を検証し、インビトロにおいて食作用を刺激し得る、これらの抗原に対する抗体を同定した。高アフィニティーSIRPα単量体と組み合わせた場合、これらの抗体が食作用を刺激し得る能力は劇的に増強された。

0096

実施例2
CD47遮断療法は、小細胞肺癌のマクロファージによる破壊を刺激する
小細胞肺癌(SCLC)は、不良な予後を有する非常に侵襲性の強い肺癌の亜型である。該疾患に対して、臨床上認可された抗体、標的療法、または免疫療法は存在しない。本発明者らは、SCLCサンプルが、癌細胞が免疫系を回避することを可能にする細胞表面分子である高レベルのCD47を発現することを見出した。特に、CD47は、マクロファージ上の阻害性受容体であるSIRPαを介したシグナル伝達によって、免疫回避を促進する。本発明者らは、CD47遮断療法がSCLCの治療に適用され得るという仮説を立てた。本発明者らは、CD47遮断療法が、インビトロにおいてSCLCサンプルのマクロファージ食作用を誘導し得ることを見出した。また、CD47遮断療法は、SCLC腫瘍を担持するマウスの腫瘍成長を阻害しかつ生存を有意に延長させた。さらに、包括的抗体アレイを用いて、本発明者らは、SCLC細胞の表面にあるいくつかの新しいおよび確立された治療標的を同定した。これらの標的に対する抗体は、マクロファージ食作用を誘発し得、CD47遮断療法と組み合わせた場合に増強された。これらの知見は、CD47-SIRPaの系を妨害する療法が、特に腫瘍特異的抗体と組み合わせた場合に、SCLCを有する患者に利益をもたらし得ることを示唆する。

0097

神経内分泌細胞に由来する小細胞肺癌(SCLC)は、ヒトにおける最も致死的な癌の亜型の1つである。毎年、アメリカ合衆国単独で25,000人を上回る数の患者がSCLCを有すると診断されており、患者は、典型的に診断後6〜12ヶ月しか生きられない。5年生存率は依然として不良なままであり、1970年代以来5%前後で推移している。放射線および化学療法の組み合わせを除くと、過去30年間で実行された新しい治療手法は存在していない。過多臨床試験にもかかわらず、SCLCに対して標的療法は認可されていない。SCLCは多量の喫煙と強く関連付けられており、開発途上国における喫煙率の増加は、将来SCLCの世界的普及を増加させ続けると考えられる。これらの理由のために、新規な治療標的を同定し、SCLCを有する患者に対する新しい治療を生み出す必要性がある。

0098

腫瘍学の分野において最も有望な進歩の1つは、患者自身の免疫系を刺激して、癌を攻撃し排除することを目指す免疫療法である。腫瘍が進行するにつれて、それらは、免疫系による破壊を避けるメカニズムを獲得する。これらのメカニズムを理解することによって、本発明者らは、免疫系に癌細胞を外来物として認識させる新しい戦略を開発することができる。以前の研究により、細胞表面分子であるCD47は、自然免疫系の細胞が血液悪性腫瘍およびある特定のタイプの固形腫瘍を攻撃するのを妨げる「自己のマーカー」として同定された。CD47は、マクロファージおよび他の骨髄細胞の表面に発現される受容体であるSIRPαを介して阻害性シグナルを送ることによって作用する。この意味において、CD47-SIRPα相互作用は、骨髄特異的免疫チェックポイントとなる。抗CD47抗体、およびその受容体SIRPαの操作された変種を含めた、CD47-SIRPα系によるシグナル伝達を妨害するいくつかの薬剤が生み出されている。最近の研究により、CD47の遮断は、癌のマクロファージ食作用のための閾値を下げることが示されている。本発明者らは、SCLC細胞もまたCD47を発現するという仮説、およびCD47遮断療法を用いて、SCLC細胞のマクロファージ食作用を刺激し得かつインビボにおいてSCLC腫瘍の成長を阻害し得るという仮説を立てた。

0099

さらに、CD47遮断療法は、モノクローナル抗体に対するマクロファージの応答を増強することが示されている。リンパ腫に対するリツキシマブまたはHer2+乳癌に対するトラスツズマブなどのモノクローナル抗体は、癌の治療に対する非常に大きな成功を実証している。SCLCの治療に対してモノクローナル抗体は臨床上認可されておらず、ゆえに本発明者らは、モノクローナル抗体により標的とされ得る新しいSCLC表面抗原を同定することを目指した。モノクローナル抗体による治療は、堅牢な抗腫瘍効果をもたらし得るものの、それらは、単一の作用物質として用いられた場合、しばしば治癒をもたらすことができず、これらの手法の効力を向上させる必要性が浮き彫りになっている。したがって、本発明者らは、CD47遮断療法と他の抗体とを組み合わせて、SCLCに対する最大の抗腫瘍応答を達成することを目指した。

0100

本発明者らの手法における最初の工程として、本発明者らは、CD47が、SCLCサンプルの表面に発現しているかどうかを検討した。次に、本発明者らは、CD47遮断療法が、インビトロにおいてSCLCのマクロファージ食作用を刺激し得るかどうかを調べた。ヒト癌のマウスモデルを用いて、インビボにおけるCD47遮断療法に対するSCLCサンプルの応答を評価した。SCLCサンプルの表面にある新しい治療標的を同定するために、本発明者らは、包括的抗体アレイを用いたハイスループットフローサイトメトリーを実施した。最後に、本発明者らは、同定された抗原に向けた抗体とCD47遮断療法とを組み合わせて、食作用をさらに増加させ得ることを実証することを目指した。本研究の全体的な目標は、SCLCに対するCD47遮断療法の正当性立証し、SCLCを標的とするために用いられ得るさらなる抗体を同定することであった。このようにして、本発明者らは、SCLCを有する患者の利益のために用いられ得る新しい免疫療法の組み合わせを同定することを目指す。

0101

結果
CD47はSCLCの表面に発現している。CD47遮断療法がSCLCに適用され得るかどうかを評価するために、本発明者らは、最初に、SCLC細胞の表面上でのCD47の発現を調べた。本発明者らは、6種のSCLC細胞株を入手し、それらをフローサイトメトリーに供して、細胞表面上でのCD47発現を評価した。6種すべての細胞株は、高いCD47発現を呈した(図5A)。本発明者らは、原発性SCLC患者サンプルから得られたSCLC患者由来異種移植片上でのCD47表面発現も評価した。細胞株と同様に、H29患者サンプルもその表面上に高レベルのCD47を発現した(図5B)。これらの知見は、CD47が、SCLC上の免疫療法標的であることを示唆した。

0102

CD47遮断抗体は、ヒトマクロファージによるSCLCの食作用を誘導する。SCLC上の真の治療標的としてCD47を立証するために、本発明者らは、ヒトマクロファージおよびSCLCサンプルを用いたインビトロ食作用アッセイを実施した。マクロファージを、ビヒクル対照または抗CD47抗体の存在下でSCLC細胞とともに共培養した。本発明者らは、CD47とSIRPaとの間の相互作用を遮断するヒト化抗CD47抗体であり、かつ固形腫瘍に対する第I相臨床試験(ClinicalTrials.gov識別番号:NCT02216409)において検討中である、抗CD47抗体クローンHu5F9-G4を試験した。ハイスループットフローサイトメトリーを用いて食作用を測定し、食作用を、カルセインAM標識されたSCLC細胞を飲み込んだマクロファージのパーセンテージによって評価した(図5CおよびD)。蛍光活性化細胞選別を用いて、飲み込まれた腫瘍細胞を有するマクロファージを含有する二重陽性集団を確認した(図5E)。4つのSCLCサンプルを食作用アッセイにおける評価に供した。3種の細胞株(NCI-H524、NCI-1688、およびNCI-H82)は、CD47遮断抗体で処理した場合に、食作用の有意な増加を呈した(図5F)。1種の細胞株NCI-H196は食作用に抵抗性があるように見え、さらなるメカニズムがマクロファージ攻撃に対するこの細胞株の感受性を改変することが示唆された。患者由来異種移植片H29も、ヒトマクロファージによる食作用アッセイに供した。抗CD47抗体によるこのサンプルの処理も、食作用の有意な増加をもたらした(図5G)。

0103

CD47遮断抗体は、インビボにおいてSCLC腫瘍の成長を阻害する。ヒトSCLCに対する療法として投与された場合のCD47遮断作用物質の潜在力を評価するために、本発明者らは、ヒトSCLCの異種移植片モデルを確立した。本発明者らは、NCI-H82細胞を、機能的T細胞、B細胞、およびNK細胞を欠くが機能的マクロファージを保持するNSGマウスの左下脇腹に植え付けた。植え付けのおよそ1週間後、1日おきに投与されるビヒクル対照または250μgの抗CD47抗体クローンHu5F9-G4による処理に無作為に分けた。腫瘍体積測定を用いて、療法に対する応答についてマウスを評価した。処理の2週間後、実験の残りの期間を通じて持続する、腫瘍体積中央値の有意な差異が観察された(図6A)。処理のおよそ1ヶ月後、ビヒクル対照コホートに関する腫瘍体積中央値は、抗CD47抗体で処理されたコホートに関する160.2mm3に対して837.8mm3であった(P=0.0281)。したがって、CD47遮断抗体は、腫瘍成長の有意な阻害をもたらし得た。

0104

本発明者らは、GFP-ルシフェラーゼ+NCI-H82細胞株を作製して、インビボにおける成長および転移をモニターした。ヒトSCLCの同所性モデルとして、本発明者らは、GFP-ルシフェラーゼ+NCI-H82細胞を左胸腔内空間に植え付けた。注入の4日後、生着を生物発光イメージングによって確認した。本発明者らは、次いで、マウスを、1日おきに投与されるビヒクル対照または250μgの抗CD47抗体クローンHu5F9-G4で処理される2つのコホートに無作為に分けた。本発明者らは、生物発光イメージングによって腫瘍成長を経時的にモニターした。再度、CD47遮断抗体は、腫瘍成長の有意な阻害をもたらした。加えて、本発明者らは、CD47遮断抗体で処理されたコホートに対する生存の有意な利益を観察した。死後解析により、胸腔内にまたは胸腔近傍の領域において形成された腫瘍が明らかになった。ビヒクル対照群におけるマウスは肝臓への実質的転移も呈し、それは、抗CD47抗体で処理されたコホートにおいては観察されなかった。

0105

細胞株は典型的に細胞のクローン集団を表すため、本発明者らは、次に、患者における治療をより厳密にモデル化する、患者由来異種移植片に対するCD47遮断抗体のインビボ効力を試験した、というのもそれは、腫瘍内の癌細胞集団不均一性を維持しているためである。インビボにおける腫瘍成長の動的測定を可能にするGFP-ルシフェラーゼを発現するように、原発性SCLCサンプルH29に形質導入した。次いで、腫瘍をマウスの左下脇腹に植え付け、およそ2週間定着させた。次いで、マウスを、1日おきに投与されるビヒクル対照または250μgの抗CD47抗体クローンHu5F9-G4による2つの処理コホートに無作為に分けた。本発明者らは、腫瘍体積測定および生物発光イメージングによって評価されるように、抗CD47抗体が腫瘍成長を有意に阻害することを見出した(図6B〜D)。CD47遮断療法による処理は、生存の有意な利益ももたらした。植え付けの125日後までに、対照群におけるすべてのマウスは死亡しており、一方で抗CD47抗体群における大部分のマウスは、植え付けの225日後であっても進行し得なかった小さな腫瘍のみを有した(図6E)。これらのモデルは、CD47遮断療法が、SCLCを有する患者に有効であり得ることを実証している。

0106

血清MCP-3は、CD47遮断療法に対する応答のバイオマーカーである。CD47遮断療法に対する応答の潜在的バイオマーカーを同定するために、本発明者らは、再度、マウスにNCI-H82細胞を植え付けた。本発明者らは、腫瘍を直径およそ1.5cmまで成長させ、次いで本発明者らは、マウスを単回用量のビヒクル対照または抗CD47抗体クローンHu5F9-G4で処理した。本発明者らは、処理の直前および処理の24時間後に血清サンプルを回収した。本発明者らは、血清サンプルを38種のサイトカイン多重解析に供した。この解析から、本発明者らは、マクロファージ走化性タンパク質3(MCP-3)が、抗CD47抗体クローンHu5F9-G4による処理後に全身的に増加することを見出した(図7A)。抗CD47抗体クローンHu5F9-G4で処理された、腫瘍を有しないマウスにおいて、MCP-3の有意な増加は観察されなかった(図7A)。本発明者らは、患者由来異種移植片H29を用いた同様の実験も実施した。同じく、腫瘍を担持するマウスを単回用量の抗CD47抗体クローンHu5F9-G4に供した。血清サイトカイン解析により、MCP-3はCD47遮断抗体による処理後に有意に増加することが再度明らかになった(図7B)。したがって、MCP-3は、患者におけるCD47遮断療法に対する応答のバイオマーカーとして働き得る。MCP-3の分泌は、より多くのマクロファージを腫瘍に動員する正のフィードバックメカニズムであり得、インビボにおけるCD47遮断療法の堅牢な効果を部分的に説明し得る。

0107

包括的抗体アレイにより、SCLC上の治療標的が同定される。モノクローナル抗体は、癌に対する最も有効な治療の一部であることが証明されている。しかしながら、SCLCの表面にある公知の抗体標的はほとんどない。この理由のために、本発明者らは、包括的抗体アレイを用いてSCLC細胞の表面抗原プロファイルを特徴付けすることを目指した。本発明者らは、4種のSCLC細胞株および原発性SCLCサンプルH29を、ヒト細胞表面抗原に対する332種の抗体の包括的コレクションであるBioLegendLEGENDScreenアレイを用いた解析に供した。***陰性、低い抗原、および高い抗原を規定するヒストグラムについての考察(図8A)。本発明者らは、SCLCサンプルの表面で高発現される39種の抗原を同定し、それらを治療用抗体の可能性のある標的とした。本発明者らがこれらの抗原をその染色強度中央値によってランク付けしたところ、本発明者らは、CD47が最も強く染色される表面抗原であることを見出した(図8B)。すべてのサンプルにわたって高発現される別の抗原は、神経内分泌腫瘍の公知のマーカーでありかつ現在SCLCについての評価段階にある治療標的であるCD56(NCAM)であり、ゆえに本発明者らの手法の正当性が立証された。CD24、CD29、およびCD99を含めた、モノクローナル抗体療法によって潜在的に標的とされ得る、いくつかの高発現される他の表面抗原も同定された(図8B)。興味深いことに、CD80、CD86、PD-L1、またはPD-L2などの他の免疫チェックポイントリガンドは、SCLCサンプルの表面で認識可能な程度には発現されなかった。

0108

抗体とCD47遮断とを組み合わせることにより、SCLCの食作用が増強される。LEGENDScreenアレイによって同定された抗原の治療的潜在力を評価するために、本発明者らは、次に、それらが抗体によって標的とされ得かつインビトロにおいて食作用を誘導し得る能力を評価した。本発明者らは、CD56(クローンHCD56およびMEM-188)、CD24、CD29、およびCD99を含めた、いくつかの高発現される表面抗原に対する抗体を入手した。加えて、本発明者らは、抗体-薬物コンジュゲートとして臨床試験で評価されている抗CD56抗体であるロルボツズマブに対する配列を入手し、本発明者らは、それをネイキッド抗体として組換えにより産生した。本発明者らは、これらの抗体を単独で、およびCD47を遮断するが付加的なFc刺激には寄与しない高アフィニティーCD47アンタゴニストCV1と組み合わせて試験した(図9AおよびB)。本発明者らは、これらの抗体が、2種の異なるSCLC細胞株NCI-H82(図9A)およびNCI-H524(図9B)のヒトマクロファージによる食作用を誘導し得る能力を試験した。試験された3種の抗CD56抗体のうち、本発明者らは、ロルボツズマブが食作用の最大の増加をもたらし得、かつこの効果はCV1との組み合わせによって有意に増強されることを見出した。CD24またはCD99に対する抗体も、抗CD47クローンHu5F9-G4による処理に匹敵するまたはそれを超える食作用を誘導し得た。予想どおり、Hu5F9-G4による食作用は、CV1と組み合わせた場合に完全に遮断された、というのもCV1が、同じ結合表面に対して競合しかつ極めて高いアフィニティーで結合するためである。興味深いことに、抗CD29抗体は、CV1との組み合わせであっても食作用を誘導し得ず、表面結合形状またはFc受容体と結合する能力などのさらなる因子が、治療用抗体に対するマクロファージの応答を改変し得るという重要な実証である。

0109

ロルボツズマブは、SCLCに対する治療用作用物質として評価段階にあるため、本発明者らは、変動する範囲の濃度にわたって、食作用を誘導し得るその能力を検討した。ロルボツズマブ単独での処理は、マクロファージ食作用を誘導することに関して用量反応関係をもたらした。重要なことに、本発明者らは、試験された各ロルボツズマブ濃度にわたって、CV1の添加がより大きな程度の食作用をもたらすことを見出した(図9C)。これらの知見は、以前にCV1をリツキシマブ、トラスツズマブ、およびセツキシマブと組み合わせた場合に観察されたように、CV1がロルボツズマブの最大効力および潜在力の両方を増加させ得ることを実証している。

0110

その予後不良および有効な治療選択肢不足という理由から、SCLCに対する新規な治療を同定する切迫した必要性が存在する。免疫療法は、癌に対する最も有望な新しい療法の一部として浮上しつつあり、ここで本発明者らは、骨髄特異的免疫チェックポイントであるCD47が、SCLCに対する真の免疫療法標的であることを示す。CD47は、試験されたすべてのSCLCサンプルの表面で高発現しており、かつ本発明者らは、CD47を遮断することが、インビトロにおいてSCLCサンプルのマクロファージ食作用を可能にすることを見出した。多数の異種移植片モデルを用いて、CD47遮断抗体Hu5F9-G4は、SCLC腫瘍を担持するマウスの腫瘍成長を阻害し得かつ生存を延長させ得た。重要なことに、本発明者らは、腫瘍形成細胞集団の複雑性を維持し、ゆえにヒトにおける治療のためのより正確なモデルとして働く、SCLCの患者由来異種移植片モデルにおいて抗腫瘍効力を観察した。加えて、本発明者らは、CD47遮断療法に応答して相関する血清バイオマーカーとしてMCP-3を同定した。抗CD47抗体Hu5F9-G4は、ヒト固形悪性腫瘍に対する第I相臨床試験(ClinicalTrials.gov識別番号:NCT02216409)において検討中であるため、本発明者らの知見は、SCLCを有する患者の部分集団における抗CD47抗体についてのさらなる評価の科学的正当性を提供する。

0111

さらに、包括的抗体アレイを用いて、本発明者らは、モノクローナル抗体療法で標的とされ得る、SCLCサンプルの表面にあるいくつかの抗原を同定した。次世代CD47アンタゴニストである高アフィニティーSIRPα変種CV1を用いて、本発明者らは、他の癌に対して実証されているように、CD47遮断が、SCLCに対する抗腫瘍抗体の効力を増大させることを見出した。高アフィニティーSIRPα変種と、独立した腫瘍結合抗体との組み合わせは、SCLCにおけるCD47の標的化のための最適な戦略を提供した。SCLCの表面上でのCD47の遮断は、マクロファージ食作用を誘導するのに十分ではなかったが、その代わりCD47の遮断は、SCLC結合抗体が存在している場合にマクロファージ食作用を増大させた。CD56、CD24、およびCD99に対する抗体は、特にCV1と組み合わせた場合に、SCLCの食作用を誘導するのに有効であることが証明された。

0112

加えて、本発明者らは、CD47遮断が、細胞傷害性作用物質メルタンシンとの抗体-薬物コンジュゲート(ADC)として、SCLCに対する臨床試験を通過している抗体であるロルボツズマブの効力を増強し得ることを見出した。治療用抗体とCD47遮断療法とを組み合わせることは、治療用抗体の効力を増強する代替的方法となる。ADCを上回るCV1の1つの利益は、さらに操作することなく、それを任意の抗体と組み合わせ得ることである。ADCは、その細胞傷害性の積載物を送達するために内在化に頼ることが多く、この依存性は、効力を制限し得かつ副作用を増加させ得る。CD47遮断は、マクロファージを刺激して除去のための細胞を同定させるため、ADCによって達成されるものよりも、細胞-細胞相互作用によって与えられるさらなる特異性が付加され得る。とはいえ、Fc受容体と結合する能力が保存されている場合、ロルボツズマブ-メルタンシンであっても、CV1との組み合わせにより利益を受け得る可能性がある。

0113

新規なSCLC表面抗原を同定する本発明者らの手法は、他のタイプの癌に適用され得、将来、外来性病原体または細胞に対する自然液性免疫応答を模倣するために用いられ得る、抗体のオリゴクローナルカクテル構築するために用いられ得る。これらのカクテルとCD47遮断療法および他の免疫療法とを組み合わせて、SCLC細胞に対する有効な免疫応答を起こさせ得る。これらの研究は、SCLCがCD47遮断療法に応答性であることを示している。

0114

材料および方法
細胞株および培養:NCI-H82、NCI-524、NCI-H69、およびNCI-1688をATCCから入手した。細胞を、10%ウシ胎仔血清(Hyclone)、1×Glutamax(Invitrogen)、ならびに100U/mLペニシリンおよび100ug/mLストレプトマイシン(Invitrogen)を補充したRPMI-1640中で培養した。細胞株を浮遊状態で成長させ(NCI-H82、NCI-524、NCI-H69)、穏やかなピペッティングまたは1×TrypLE(Invitrogen)との短時間のインキュベーションによって解離した。NCI-1688細胞を接着性単層状態で成長させ、1×TrypLEとの短時間のインキュベーションによって取り出した。細胞株を、5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーター内で37℃にて培養した。

0115

ヒトマクロファージ分化:白血球除去システムチャンバーを、Stanford Blood Centerで匿名の血液ドナーから入手した。単球を、メーカーの指示に従い、CD14+マイクロビーズまたはCD14+全血マイクロビーズ(Miltenyi)を用いたAutoMACS(Miltenyi)で精製した。精製されたCD14+単球を、1枚のプレートあたり1000万個の単球の密度で15cm組織培養ディッシュ上に播いた。単球を、10%ヒトAB血清(Invitrogen)、1×GlutaMax(Invitrogen)、ならびに100U/mLペニシリンおよび100ug/mLストレプトマイシンを補充したIMDM中でのおよそ7〜10日間の培養によってマクロファージに分化させた。

0116

インビトロ食作用アッセイ:インビトロ食作用アッセイを、以前に記載されているように実施した。簡潔には、SCLC癌細胞をプレートから取り出し、血清不含IMDMで洗浄した。GFP-ルシフェラーゼ+細胞またはカルセインAM(Invitrogen)で標識された細胞を標的細胞として用いた。マクロファージをHBSSで2回洗浄し、次いで1×TrypLEとともに加湿インキュベーター内で37℃にておよそ20分間インキュベートした。マクロファージを、セルリフター(Corning)を用いてプレートから取り出し、次いで血清不含IMDMで2回洗浄した。50,000個のマクロファージおよび100,000個の腫瘍細胞を用いて、食作用反応を行った。抗体療法ありで、細胞を37℃にて2時間共培養した。共培養の後、細胞をautoMACS Running Buffer(Miltenyi)で洗浄し、フローサイトメトリーによる解析のために調製した。100μg/mLマウスIgG(Lampire)の存在下で、CD45に対するフルオロフォアコンジュゲート型抗体(BioLegend)を用いてマクロファージを染色した。DAPI(Sigma)で染色することによって、死細胞を解析から除外した。高速サンプラーを備えたLSRFortessa(BD Biosciences)を用いたフローサイトメトリーによって、サンプルを解析した。FlowJo v9.4.10(Tree Star)を用いて、食作用をカルセイン-AM+マクロファージのパーセンテージとして評価し、示されている場合はそれぞれの独立したドナーによる最大応答に対して正規化した。統計的有意性を判定し、Prism 5(Graphpad)を用いてデータをS字用量反応曲線に適合させた。

0117

食作用において用いられたさらなる剤には、高アフィニティーSIRPα変種CV1単量体が含まれ、それは以前に記載されているように産生され、遮断のために1μMの濃度で用いられた。抗CD56(NCAM)クローンHCD56(BioLegend)、抗CD56(NCAM)クローンMEM-188(BioLegend)、抗CD24クローンML5(Biolegend)、抗CD29クローンTS2/16(BioLegend)、抗CD99クローン12E7(Abcam)を含めた、同定されたSCLC抗原に対する抗体を10μg/mLの濃度で食作用アッセイにおいて用いた。加えて、ロルボツズマブを、KEGGデータベース(Drug:D09927)で入手可能な重鎖および軽鎖可変領域配列を用いて組換えにより作製した。ロルボツズマブ可変領域を、発現のためにpFUSE-CHIg-hG1およびpFUSE2-CLIg-hK(Invivogen)内にクローニングした。293fectin(Invitrogen)を用いた293F細胞(Invitrogen)の一過性トランスフェクションによって、ロルボツズマブを組換えにより産生し、続いてHiTrap Protein Aカラム(GE Healthcare)を通した精製を行なった。精製された抗体を100mMクエン酸バッファー(pH3.0)で溶出し、1/10容量のTrisバッファー(pH8.0)で中和した。PD-10カラム(GE Healthcare)を用いて、抗体を脱塩した。

0118

食作用後のマクロファージ集団の選別:250万個のヒトマクロファージと500万個のGFP+NCI-H82細胞および10μg/mLの抗CD47抗体(クローンHu5F9-G4)とを血清不含培地中で組み合わせ、2時間インキュベートした。抗CD45で染色することによってマクロファージを同定し、マクロファージ集団をFACSAria IIセルソーター(BD Biosciences)で選別した。選別された集団由来の細胞を顕微鏡用スライド上に遠心分離し、次いでメーカーの指示に従い、Modified Wright-Giemsa染色(Sigma-Aldrich)で染色し、DM5500 B正立光学顕微鏡(Leica)で撮像した。

0119

マウス:Nod.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスをすべてのインビボ実験に用いた。およそ6〜10週齢でマウスに腫瘍を植え付け、年齢および性別合致させたコホートを用いて実験を実施した。スタフォード獣医学サービスセンター(Stanford Veterinary Services Center)のケアの下でマウスを障壁設備内で維持し、実験動物ケアに関するスタンフォード大学管理委員会(Stanford University Administrative Panel on Laboratory Animal Care)によって認可されたプロトコールに従って扱った。

0120

インビボSCLC処理モデル:1.25×106個のNCI-H82細胞をNSGマウスの脇腹へ皮下に植え付けた。腫瘍を8日間成長させ、次いでマウスを、PBSまたは250μgの抗CD47抗体(クローンHu5F9-G4)による処理群に無作為に分けた。腹腔内注入により、処理を1日おきに施した。楕円体公式(π/6×長さ×幅2)に従って腫瘍体積を算出するために用いられる腫瘍寸法測定によって、腫瘍成長をモニターした。SCLCの患者由来異種移植片モデルに関しては、3×106個のGFP-ルシフェラーゼ+H29細胞を25%マトリゲル(BD Biosciences)とともに、NSGマウスの脇腹へ皮下に植え付けた。腫瘍を15日間成長させ、次いでマウスを、PBSまたは250μgの抗CD47抗体(クローンHu5F9-G4)による処理群に無作為に分けた。腹腔内注入により、処理を1日おきに施した。生物発光イメージングおよび上記で記載される腫瘍体積測定によって、腫瘍成長をモニターした。腫瘍成長の統計的有意性をMann-Whitney検定によって判定した。生存をMantel-Cox検定によって解析した。H82細胞およびH29細胞を用いたパイロットインビボ実験を、同様の結果を有するマウスのより小さなコホートを用いて実施した。

0121

腫瘍結節からのGFP蛍光を、DFC 500カメラ(Leica)を取り付けたM205FA蛍光解剖顕微鏡(Leica)で可視化した。

0122

生物発光イメージング:GFP-ルシフェラーゼ+腫瘍を担持するマウスを、以前に記載されているように撮像した。簡潔には、麻酔されたマウスに、滅菌PBS中で16.67mg/mLに再構成された200μLのD-ルシフェリンホタルカリウム塩(Biosynth)を注入した。IVIS Spectrum(Caliper Life Sciences)を用いて、生物発光イメージングを20分間にわたって実施して、最大輝度を記録した。Living Image 4.0(Caliper Life Sciences)を用いて、ピーク全光束値を関心対象の解剖学的領域から評価し、解析に用いた。

0123

包括的FACSに基づく抗体スクリーニング:以下の改変を含むメーカーのプロトコールに従い、LEGENDScreen Human Cell Screening Kits(BioLegend)を用いて、SCLCサンプルの表面にある抗原を解析した。簡潔には、凍結乾燥された抗体を分子生物学グレードの水中で再構成し、1:8希釈細胞サンプルに添加した。1つのSCLCサンプルあたり、およそ20〜40×106個の総細胞を解析に用いた。NCI-H82をカルセイン-AMで標識し、NCI-H524と同時に解析した。NCI-H69をカルセイン-AMで標識し、NCI-H1688と同時に解析した。原発性患者サンプルH69を独立して解析した。それを低継代の異種移植片から新たに解離し、Pacific Blue抗マウスH-2kd(BioLegend)で染色することによって、マウス系統細胞を解析から除外した。サンプルを、光から保護された上で、抗体とともに30分間インキュベートした。すべてのサンプルに関して、DAPIで染色することによって、死細胞を解析から除外した。

実施例

0124

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