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図面 (20)

課題

改善された再プログラム方法及び細胞培養基盤を提供すること。

解決手段

本発明は、多能性細胞を製造するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、基底状態多能性を有する多能性細胞を製造するための改善された培養基盤を提供する。様々な実施形態において、本発明は、部分的に、(a)Wnt経路アゴニストと;(b)MEK阻害剤と;(c)ROCK阻害剤とを含む組成物を企図する。ある特定の実施形態において、組成物は、bFGFまたはLIFをさらに含む。

概要

背景

今日の多能性幹細胞に基づく疾患及び毒性学スクリーニング研究、ならびに将来の自家/同種多能性幹細胞治療は、ヒト胚幹細胞(hESC)及びヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の細胞株生成及び拡大の、堅牢再現性のある方法を必要とする。hiPSCは、ゲノムに組み込まれたレトロ及びレンチウイルス発現系を介して導入された多能性因子異所性発現により生成されている。可能な限り多くの組み込みイベントを排除するための研究は、いくつかの再プログラミング因子を小分子阻害剤で置き換えることを含んでいた。さらに、非組み込み型の方法は、非効率的及び労働集約的であり、追加的な再プログラミング因子を必要とする、または全ての体細胞再プログラムにおいて効果的ではないことが証明されている(Lee et al.,2013)。

細胞を将来の産業的及び臨床的用途に好適とならしめるためには、多能性幹細胞の培養に関連したいくつかの課題が依然として対処されなければならない。最も一般的に使用されている従来の培養系では、hESC及びhiPSCはフィーダー細胞上に維持されながら塊として継代され、広範囲細胞死及びゲノム異常が防止される(Thomson et al.,1998)。フィーダーを含まない(FF)環境内でhiPSCの単一細胞培養を行えないことは、潜在的な産業規模でのスクリーニングまたは細胞治療用途を大幅に制限する(Skottman et al.,2007;Valamehr et al.,2011)。さらに、hiPSCの改善に関する最近の研究は、導入遺伝子不含ではないレンチウイルス誘導hiPSCに焦点を置いており、そのような研究の治療上の関連性が制限されている。

ゲノム修飾以外の依然として成功裏に対処されるべき別の課題は、培養中のヒト多能性幹細胞自発分化の傾向である(Pera and Trounson,2004;Sathananthan and Trounson,2005;Valamehr et al.,2011)。

hESC及びhiPSCにおける研究が説明されているが、ゲノム修飾ヒト多能性幹細胞をもたらす基底状態を維持するためには、多能性遺伝子の連続的異所性発現が必要であり(Hanna et al.,2010a)、これは産業及び臨床グレード多能性細胞には不適切である。

したがって、ヒト多能性細胞生成物の、ハイスループットの導入遺伝子またはフットプリントを使用しない生成のための組成物及び方法が存在しないことは、これまで、将来の多能性幹細胞治療の開発及び商業化における大きな障害であることが明らかとなっている。

概要

改善された再プログラム方法及び細胞培養基盤を提供すること。本発明は、多能性細胞を製造するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、基底状態多能性を有する多能性細胞を製造するための改善された培養基盤を提供する。様々な実施形態において、本発明は、部分的に、(a)Wnt経路アゴニストと;(b)MEK阻害剤と;(c)ROCK阻害剤とを含む組成物を企する。ある特定の実施形態において、組成物は、bFGFまたはLIFをさらに含む。E

目的

本発明は、部分的に、上記実施形態のいずれか1つに従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

図面に記載の発明。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、35U.S.C.§119(e)に基づき、参照により全体が本明細書に組み込まれる2014年3月4日出願の米国仮特許出願第61/947,979号の利益を主張する。

0002

配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙面の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイル名前は、FATE_122_01WO_ST25.txtである。テキストファイルは、8KBであり、2015年3月4日に作成され、本明細書の出願と同時にEFS−Webを介して電子的に提出されている。
背景

0003

本発明は、概して、多能性細胞を製造するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は、基底状態多能性を有する多能性細胞を製造するための改善された培養基盤に関する。

背景技術

0004

今日の多能性幹細胞に基づく疾患及び毒性学スクリーニング研究、ならびに将来の自家/同種多能性幹細胞治療は、ヒト胚幹細胞(hESC)及びヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の細胞株生成及び拡大の、堅牢再現性のある方法を必要とする。hiPSCは、ゲノムに組み込まれたレトロ及びレンチウイルス発現系を介して導入された多能性因子異所性発現により生成されている。可能な限り多くの組み込みイベントを排除するための研究は、いくつかの再プログラミング因子を小分子阻害剤で置き換えることを含んでいた。さらに、非組み込み型の方法は、非効率的及び労働集約的であり、追加的な再プログラミング因子を必要とする、または全ての体細胞再プログラムにおいて効果的ではないことが証明されている(Lee et al.,2013)。

0005

細胞を将来の産業的及び臨床的用途に好適とならしめるためには、多能性幹細胞の培養に関連したいくつかの課題が依然として対処されなければならない。最も一般的に使用されている従来の培養系では、hESC及びhiPSCはフィーダー細胞上に維持されながら塊として継代され、広範囲細胞死及びゲノム異常が防止される(Thomson et al.,1998)。フィーダーを含まない(FF)環境内でhiPSCの単一細胞培養を行えないことは、潜在的な産業規模でのスクリーニングまたは細胞治療用途を大幅に制限する(Skottman et al.,2007;Valamehr et al.,2011)。さらに、hiPSCの改善に関する最近の研究は、導入遺伝子不含ではないレンチウイルス誘導hiPSCに焦点を置いており、そのような研究の治療上の関連性が制限されている。

0006

ゲノム修飾以外の依然として成功裏に対処されるべき別の課題は、培養中のヒト多能性幹細胞自発分化の傾向である(Pera and Trounson,2004;Sathananthan and Trounson,2005;Valamehr et al.,2011)。

0007

hESC及びhiPSCにおける研究が説明されているが、ゲノム修飾ヒト多能性幹細胞をもたらす基底状態を維持するためには、多能性遺伝子の連続的異所性発現が必要であり(Hanna et al.,2010a)、これは産業及び臨床グレードの多能性細胞には不適切である。

0008

したがって、ヒト多能性細胞生成物の、ハイスループットの導入遺伝子またはフットプリントを使用しない生成のための組成物及び方法が存在しないことは、これまで、将来の多能性幹細胞治療の開発及び商業化における大きな障害であることが明らかとなっている。

課題を解決するための手段

0009

本発明は、概して、改善された細胞培養基盤を提供する。

0010

様々な実施形態において、本発明は、部分的に、(a)Wnt経路アゴニストと;(b)MEK阻害剤と;(c)ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない組成物を企図する。

0011

具体的実施形態において、Wnt経路アゴニストは、GSK3阻害剤である。

0012

ある特定の実施形態において、GSK3阻害剤は、CHIR99021またはBIOである。

0013

追加的実施形態において、MEK阻害剤は、PD98059またはPD032901である。

0014

さらなる実施形態において、ROCK阻害剤は、チアゾビンまたはY27632である。

0015

いくつかの実施形態において、GSK3阻害剤は、CHIR99021であり、MEK阻害剤は、PD032901であり、ROCK阻害剤は、チアゾビビンである。

0016

ある特定の実施形態において、上記組成物のいずれかは、bFGFまたはLIFをさらに含む。

0017

さらなる実施形態において、上記組成物のいずれかは、bFGF及びLIFをさらに含む。

0018

様々な実施形態において、上記組成物のいずれかを含み、TGFβR阻害剤を含まない培養培地が提供される。

0019

いくつかの実施形態において、1つ以上の多能性細胞を培養する方法であって、1つ以上の多能性細胞を、上記培養培地のいずれかに従う細胞培養培地中で培養することを含む方法。

0020

追加的実施形態において、1つ以上の多能性細胞は、胚幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)である。

0021

具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞は、iPSCである。

0022

ある特定の実施形態において、組成物は、多能性細胞の集団を含む。

0023

さらなる実施形態において、多能性細胞の集団は、多能性細胞の均質集団である。

0024

具体的実施形態において、多能性細胞の集団の少なくとも95%は、SSEA4−FITC及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する。

0025

いくつかの実施形態において、多能性細胞の集団の最大5%は、α−平滑筋アクチンSMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する。

0026

具体的実施形態において、多能性細胞は、TGFβR阻害剤を含む細胞培養培地中で事前に培養されている。

0027

追加的実施形態において、多能性細胞を細胞培養培地中で培養することは、培養された細胞の自発的分化を低減する。

0028

一実施形態において、培養された細胞における1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現は、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。

0029

別の実施形態において、1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される。

0030

さらに別の実施形態において、培養された細胞において、2つ以上の分化マーカー遺伝子の発現は、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における2つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。

0031

さらに別の実施形態において、2つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される。

0032

具体的実施形態において、培養された細胞において、3つ以上の分化マーカー遺伝子の発現は、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における3つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。

0033

ある特定の実施形態において、3つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される。

0034

追加的実施形態において、培養された細胞において、5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現は、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。

0035

さらなる実施形態において、5つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される。

0036

ある特定の実施形態において、多能性細胞を細胞培養培地中で培養することは、多能性の基底状態を維持または誘引する。

0037

具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞の多能性の基底状態は、少なくとも5継代の間維持される。

0038

ある特定の具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞の多能性の基底状態は、少なくとも10継代の間維持される。

0039

さらなる具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞の多能性の基底状態は、少なくとも50継代の間維持される。

0040

追加的な具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞の多能性の基底状態は、少なくとも100継代の間維持される。

0041

様々な実施形態において、上記方法は、継代の間、1つ以上の多能性細胞を解離させることをさらに含む。

0042

ある特定の実施形態において、継代の間、1つ以上の多能性細胞の生存能力が維持される。

0043

ある特定の具体的実施形態において、1つ以上の多能性細胞は、正常核型を含む。

0044

ある特定の追加的実施形態において、1つ以上の多能性細胞は、フィーダーを含まない環境内で培養される。

0045

ある特定のさらなる実施形態において、1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される。

0046

ある特定の関連した実施形態において、1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される。

0047

ある特定の他の実施形態において、1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される。

0048

様々な実施形態において、本発明は、部分的に、多能性細胞をフィーダーを含まない培養に適合させる方法であって、(a)フィーダー細胞の存在下で培養される1つ以上の多能性細胞を単離することと、(b)1つ以上の多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で培養することとを含む方法を企図する。

0049

様々な具体的実施形態において、本発明は、部分的に、単一細胞として酵素的に継代された多能性細胞を培養する方法であって、(a)1つ以上の多能性細胞を酵素的に処理して、単一多能性細胞を継代することと;(b)フィーダーを含まない環境内で単一多能性細胞を培養することと;(c)Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、単一多能性細胞を培養することとを含む方法を企図する。

0050

様々なある特定の実施形態において、本発明は、部分的に、1つ以上の多能性細胞の自発的分化を低減する方法であって、(a)フィーダーを含まない環境内で1つ以上の多能性細胞を培養することと;(b)Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、1つ以上の多能性細胞を培養することとを含む方法を企図する。

0051

様々な追加的実施形態において、本発明は、部分的に、人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法であって、(a)1つ以上の非多能性細胞を得ることと;(b)1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることと;(c)TGFβR阻害剤を含まない細胞培養培地中で多能性細胞を培養し、それによりiPSCを生成することとを含む方法を企図する。

0052

具体的実施形態において、1つ以上の非多能性細胞は、体細胞を含む。

0053

いくつかの実施形態において、1つ以上の非多能性細胞は、成体幹細胞を含む。

0054

ある特定の実施形態において、1つ以上の非多能性細胞は、細胞内の内在性OCT4の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされる。

0055

さらなる実施形態において、1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。

0056

追加的実施形態において、1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。

0057

ある特定の実施形態において、1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。

0058

ある特定の実施形態において、1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、及びESRRBからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。

0059

ある特定の実施形態において、1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、ECAT1、及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む。

0060

具体的実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターである。

0061

いくつかの実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターである。

0062

関連した具体的実施形態において、細胞培養培地は、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含む。

0063

さらなる具体的実施形態において、1つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることは、1つ以上の非多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWntアゴニスト;MEK阻害剤;及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させることを含む。

0064

追加的実施形態において、iPSCは、iPSCの集団を含む。

0065

具体的実施形態において、iPSCの集団は、iPSCの均質集団である。

0066

具体的実施形態において、iPSCの集団の少なくとも95%は、SSEA4及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する。

0067

ある特定の実施形態において、多能性細胞の集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する。

0068

ある特定の実施形態において、多能性細胞を細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する。

0069

追加的実施形態において、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、iPSCにおいて、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養されたiPSCにおける1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。

0070

具体的実施形態において、1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される。

0071

ある特定の実施形態において、自発的分化の低減は、少なくとも5継代の間維持される。

0072

他の実施形態において、自発的分化の低減は、少なくとも10継代の間維持される。

0073

具体的実施形態において、自発的分化の低減は、少なくとも50継代の間維持される。

0074

追加的実施形態において、自発的分化の低減は、少なくとも100継代の間維持される。

0075

さらなる実施形態において、上記方法は、継代の間、iPSCを解離させることを含む。

0076

追加的実施形態において、iPSCの生存能力は、継代の間維持される。

0077

ある特定の実施形態において、iPSCは、正常核型を含む。

0078

他の実施形態において、iPSCは、フィーダーを含まない環境内で培養される。

0079

具体的実施形態において、iPSCのゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される。

0080

追加的実施形態において、iPSCのゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される。

0081

具体的な追加的実施形態において、iPSCのゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される。

0082

様々な実施形態において、本発明は、部分的に、上記実施形態のいずれか1つに従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)を提供する。

0083

様々なある特定の実施形態において、本発明は、部分的に、基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まないiPSCを提供する。

0084

様々な具体的実施形態において、本発明は、部分的に、人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法であって、(a)1つ以上の多能性幹細胞を得ることと;(b)TGFβR阻害剤を含まない細胞培養培地中で1つ以上の多能性幹細胞を培養し、それにより基底状態iPSCを生成することとを含む方法を提供する。

0085

ある特定の実施形態において、1つ以上のiPSCは、再プログラムされた体細胞を含む。

0086

追加的実施形態において、1つ以上のiPSCは、再プログラムされた成体幹細胞を含む。

0087

他の実施形態において、1つ以上のiPSCは、1つ以上のiPSC内の内在性OCT4の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされている。

0088

具体的実施形態において、1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている。

0089

ある特定の具体的実施形態において、1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入することにより再プログラムされている。

0090

追加的実施形態において、1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている。

0091

追加的実施形態において、1つ以上のiPSCは、OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、及びESRRBからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている。

0092

別の実施形態において、1つ以上のiPSCは、OCT4、ECAT1、及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている。

0093

様々な実施形態において、レンチウイルスベクターは、1つ以上のポリヌクレオチドを含む。

0094

具体的実施形態において、エピソームベクターは、1つ以上のポリヌクレオチドを含む。

0095

他の実施形態において、細胞培養培地は、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含む。

0096

ある特定の実施形態において、1つ以上のiPSCを得ることは、1つ以上の非多能性細胞または部分多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWntアゴニスト;MEK阻害剤;及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させ、1つ以上のiPSCを生成することを含む。

0097

追加的実施形態において、iPSCは、iPSCの集団を含む。

0098

追加的実施形態において、iPSCの集団は、iPSCの均質集団である。

0099

具体的実施形態において、iPSCの集団の少なくとも95%は、SSEA4及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する。

0100

具体的実施形態において、1つ以上のiPSCは、多能性細胞の集団を再プログラムすることにより得られ、多能性細胞の集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する。

0101

さらなる実施形態において、上記方法は、1つ以上のiPSCを細胞培養培地中で培養することを含み、これは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する。

0102

ある特定の実施形態において、自発的分化が低減されたiPSCは、遺伝子発現を含み、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養されたiPSCにおける1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される。

0103

追加的実施形態において、1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される。

0104

他の実施形態において、低減された自発的分化は、少なくとも5継代の間維持される。

0105

ある特定の実施形態において、低減された自発的分化は、少なくとも10継代の間維持される。

0106

追加的実施形態において、低減された自発的分化は、少なくとも50継代の間維持される。

0107

具体的実施形態において、低減された自発的分化は、少なくとも100継代の間維持される。

0108

さらなる実施形態において、上記方法は、継代の間、1つ以上のiPSCを解離させることを含む。

0109

具体的実施形態において、継代の間、1つ以上のiPSCの生存能力が維持される。

0110

他の実施形態において、1つ以上のiPSCは、正常核型を含む。

0111

追加的実施形態において、1つ以上のiPSCは、フィーダーを含まない環境内で培養される。

0112

ある特定の実施形態において、1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される。

0113

追加的実施形態において、1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される。

0114

具体的実施形態において、1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される。

0115

様々な具体的実施形態において、本発明は、部分的に、上記実施形態のいずれか1つに従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)を提供する。

0116

様々な実施形態において、本発明は、部分的に、基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まないiPSCを提供する。

0117

いくつかの実施形態において、非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするための方法であって、非多能性細胞に、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチド、または、(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを導入し、それにより非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムすることを含む方法が提供される。

0118

具体的実施形態において、導入することは、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドを導入することを含む。

0119

別の実施形態において、導入することは、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または(ii)OCT−4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドを導入することを含む。

0120

いくつかの実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、レトロウイルスセンダイウイルスアデノウイルス、エピソーム、ミニサークル発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにより導入される。

0121

具体的実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。

0122

別の実施形態において、多能性細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない。

0123

別の実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、CRE媒介切断により切断される。

0124

いくつかの実施形態において、方法は、非多能性細胞に、(i)SV40LTポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または(ii)SV40LTポリペプチドを導入することをさらに含む。

0125

一実施形態において、方法は、非多能性細胞を、TGFβR阻害剤、Wnt経路アゴニスト、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つと接触させることを含み、Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤である。

0126

別の実施形態において、非多能性細胞は、TGFβR阻害剤、Wnt経路アゴニスト、MEK阻害剤、及びROCK阻害剤と接触させられ、Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤である。

0127

具体的実施形態において、方法は、Wnt経路アゴニストと、MEK阻害剤と、ROCK阻害剤とを含む培養培地中で多能性細胞を培養することをさらに含み、Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤であり、培養培地は、TGFβR阻害剤を含有しない。

0128

いくつかの実施形態において、Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または、MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である。

0129

別の実施形態において、多能性細胞の多能性は、少なくとも5回の細胞分裂または少なくとも10回の細胞分裂の間維持される。

0130

具体的実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される。

0131

一実施形態において、多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む。

0132

いくつかの実施形態において、方法は、多能性細胞内のOCT4発現のために選択することにより、多能性細胞を同定することを含む。

0133

一実施形態において、OCT4発現のために選択することは、異所性Oct−4発現のために選択することを含む。

0134

別の実施形態において、培養することは、多能性幹細胞の集団を生成する。

0135

別の実施形態において、多能性幹細胞の集団は、少なくとも70%均質、少なくとも80%均質、または少なくとも90%均質である。

0136

さらに別の実施形態において、多能性細胞の集団の少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%は、SSEA及びTra−181を発現する。

0137

ある実施形態において、多能性細胞または多能性細胞の集団は、単一細胞継代が可能である。

0138

一実施形態において、単一細胞継代により生成された細胞は、正常核型を有する。

0139

一実施形態において、本発明は、上記方法のいずれか1つに従って生成される多能性細胞を提供する。

0140

別の実施形態において、本発明は、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも1つの外因性ポリペプチドを含む、単離された非多能性細胞を含む組成物を提供する。

0141

一実施形態において、細胞は、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドの少なくとも2つをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも2つの外因性ポリペプチドを含む。

0142

別の実施形態において、細胞は、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドの少なくとも3つをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも3つの外因性ポリペプチドを含む。

0143

1つの具体的実施形態において、細胞は、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性OCT4ポリペプチド、外因性ECAT1ポリペプチド、外因性UTF1ポリペプチド、外因性NANOGポリペプチド、及び外因性ESRRBポリペプチドを含む。

0144

別の実施形態において、細胞は、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または外因性OCT4ポリペプチド、外因性ECAT1ポリペプチド、及び外因性UTF1ポリペプチドを含む。

0145

一実施形態において、細胞は、TGFβR阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つと接触させられている。

0146

別の実施形態において、細胞は、TGFβR阻害剤、Wnt経路活性化因子、MEK阻害剤、及びROCK阻害剤と接触させられており、Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である。

0147

具体的実施形態において、Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または、MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である。

0148

別の実施形態において、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにより非多能性細胞に導入される。

0149

別の実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。

0150

具体的実施形態において、細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない。

0151

ある実施形態において、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、CRE媒介切断により除去される。

0152

別の実施形態において、細胞は、SV40LT抗原ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、または外因性SV40LT抗原ポリペプチドを含む。

0153

一実施形態において、1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される。

0154

別の実施形態において、多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む。

0155

ある実施形態において、OCT4ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している。

0156

1つの具体的実施形態において、本発明は、(i)OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、(ii)ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、(iii)UTF1ポリペプチドをコードするcDNA、(iv)NANOGポリペプチドをコードするcDNA、及び(v)ESRRBポリペプチドをコードするcDNAの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つからなる組成物を提供する。

0157

ある実施形態において、組成物は、OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、UTF1ポリペプチドをコードするcDNA、NANOGポリペプチドをコードするcDNA、及びESRRBポリペプチドをコードするcDNAからなる。

0158

別の実施形態において、組成物は、OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、及びUTF1ポリペプチドをコードするcDNAからなる。

0159

具体的実施形態において、各cDNAは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにコードされる。

0160

一実施形態において、本発明は、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つの再プログラミング因子ポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

0161

ある実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、OCTポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする。

0162

別の実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、OCTポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする。

0163

別の具体的実施形態において、ベクターは、SV40LT抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。

0164

一実施形態において、ベクターは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAである。

0165

一実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。

0166

1つの具体的実施形態において、本発明は、非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするためのキットであって、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、もしくはESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチド;またはOCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、もしくはESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチド;ならびにTGFβR阻害剤、Wnt経路活性化因子、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つを備え、Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤であるキットを提供する。

0167

ある実施形態において、1つ以上のポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする、または、少なくとも1つのポリペプチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドを含む。

0168

別の実施形態において、1つ以上の1つ以上のポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする、または、少なくとも1つのポリペプチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドを含む。

0169

一実施形態において、キットは、SV40LT抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはSV40LT抗原ポリペプチドを備える。

0170

別の実施形態において、キットは、TGFβR阻害剤と、Wnt経路活性化因子と、MEK阻害剤と、ROCK阻害剤とを備え、Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である。

0171

一実施形態において、Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または、MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である。

0172

別の実施形態において、少なくとも1つのポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにコードされる。

0173

別の実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。

0174

一実施形態において、少なくとも1つのポリヌクレオチドは、多シストロン性ベクターにコードされ、各ポリヌクレオチドは、2Aペプチドにより隔てられている。

0175

さらに別の実施形態において、多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする2つ以上のポリヌクレオチドを含む。

0176

具体的実施形態において、OCT4ポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している。

0177

別の具体的実施形態において、本発明は、多能性幹細胞の集団を生成するための方法であって、非多能性細胞の集団を提供することと;非多能性細胞の集団に、選択可能マーカーに連結したOCT4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することと;非多能性細胞の集団の少なくとも一部を多能性細胞に再プログラムするのに十分な条件下で、非多能性細胞の集団をポリヌクレオチドと共にインキュベートすることと;選択可能マーカーを発現する細胞を選択し、それにより多能性幹細胞の集団を提供することとを含む方法を提供する。

0178

別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される。

0179

一実施形態において、複数のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられる。

0180

さらに別の実施形態において、細胞の集団内の細胞の少なくとも10%は、SSEA及びTRA−181を発現する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
項目1)
(a)Wnt経路アゴニストと;
(b)MEK阻害剤と;
(c)ROCK阻害剤とを含み、
TGFβR阻害剤を含まない組成物。
(項目2)
前記Wnt経路アゴニストは、GSK3阻害剤である、項目1に記載の前記組成物。
(項目3)
前記GSK3阻害剤は、CHIR99021またはBIOである、項目2に記載の前記組成物。
(項目4)
前記MEK阻害剤は、PD98059またはPD032901である、項目1に記載の前記組成物。
(項目5)
前記ROCK阻害剤は、チアゾビビンまたはY27632である、項目1に記載の前記組成物。
(項目6)
前記GSK3阻害剤は、CHIR99021であり、前記MEK阻害剤は、PD032901であり、前記ROCK阻害剤は、チアゾビビンである、項目1に記載の前記組成物。
(項目7)
bFGFまたはLIFをさらに備える、項目1から6のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目8)
bFGF及びLIFをさらに含む、項目1から6のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目9)
項目1に記載の前記組成物を含み、
TGFβR阻害剤を含まない培養培地。
(項目10)
1つ以上の多能性細胞を培養する方法であって、前記1つ以上の多能性細胞を、項目9に記載の細胞培養培地中で培養することを含む前記方法。
(項目11)
前記1つ以上の多能性細胞は、胚幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)である、項目10に記載の前記方法。
(項目12)
前記1つ以上の多能性細胞は、iPSCである、項目10に記載の前記方法。
(項目13)
前記組成物は、多能性細胞の集団を含む、項目10に記載の前記方法。
(項目14)
多能性細胞の前記集団は、多能性細胞の均質集団である、項目13に記載の前記方法。
(項目15)
多能性細胞の前記集団の少なくとも95%は、SSEA4−FITC及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する、項目13に記載の前記方法。
(項目16)
多能性細胞の前記集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する、項目13に記載の前記方法。
(項目17)
前記多能性細胞は、TGFβR阻害剤を含む細胞培養培地中で事前に培養されている、項目10に記載の前記方法。
(項目18)
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、前記培養された細胞の自発的分化を低減する、項目13に記載の前記方法。
(項目19)
前記培養された細胞における1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目20)
前記1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目19に記載の前記方法。
(項目21)
前記培養された細胞において、2つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における2つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目22)
前記2つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目21に記載の前記方法。
(項目23)
前記培養された細胞において、3つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における3つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目24)
前記3つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目23に記載の前記方法。
(項目25)
前記培養された細胞において、5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養された多能性細胞における5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目18に記載の前記方法。
(項目26)
前記5つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目25に記載の前記方法。
(項目27)
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、多能性の基底状態を維持または誘引する、項目18に記載の前記方法。
(項目28)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも5継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目29)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも10継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目30)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも50継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目31)
前記1つ以上の多能性細胞の多能性の前記基底状態は、少なくとも100継代の間維持される、項目27に記載の前記方法。
(項目32)
継代の間、前記1つ以上の多能性細胞を解離させることをさらに含む、項目10から31のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目33)
継代の間、前記1つ以上の多能性細胞の生存率が維持される、項目32に記載の前記方法。
(項目34)
前記1つ以上の多能性細胞は、正常核型を含む、項目10から33のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目35)
前記1つ以上の多能性細胞は、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目10から34のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目36)
前記1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される、項目10から35のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目37)
前記1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される、項目10から35のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目38)
前記1つ以上の多能性細胞のゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される、項目10から35のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目39)
多能性細胞をフィーダーを含まない培養に適合させる方法であって、
(a)フィーダー細胞の存在下で培養される1つ以上の多能性細胞を単離することと、
(b)前記1つ以上の多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で培養することとを含む前記方法。
(項目40)
単一細胞として酵素的に継代された多能性細胞を培養する方法であって、
(a)1つ以上の多能性細胞を酵素的に処理して、単一多能性細胞を継代することと;
(b)フィーダーを含まない環境内で前記単一多能性細胞を培養することと;
(c)Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、前記単一多能性細胞を培養することとを含む前記方法。
(項目41)
1つ以上の多能性細胞の自発的分化を低減する方法であって、
(a)フィーダーを含まない環境内で前記1つ以上の多能性細胞を培養することと;
(b)Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤であるWnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含み、TGFβR阻害剤を含まない既知組成細胞培養培地中で、前記1つ以上の多能性細胞を培養することとを含む前記方法。
(項目42)
人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法であって、
(a)1つ以上の非多能性細胞を得ることと;
(b)前記1つ以上の非多能性細胞を、多能性状態に再プログラムすることと;
(c)TGFβR阻害剤を含まない細胞培養培地中で前記多能性細胞を培養し、それによりiPSCを生成することとを含む前記方法。
(項目43)
前記1つ以上の非多能性細胞は、体細胞を含む、項目42に記載の前記方法。
(項目44)
前記1つ以上の非多能性細胞は、成体幹細胞を含む、項目42に記載の前記方法。
(項目45)
前記1つ以上の非多能性細胞は、前記細胞内の内在性OCT4の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされる、項目42に記載の前記方法。
(項目46)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目47)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目48)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目49)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、及びESRRBからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目50)
前記1つ以上の非多能性細胞を、前記多能性状態に再プログラムすることは、OCT4、ECAT1、及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することを含む、項目42に記載の前記方法。
(項目51)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターである、項目46から50のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目52)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、エピソームベクターである、項目46から50のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目53)
前記細胞培養培地は、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含む、項目42から52のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目54)
前記1つ以上の非多能性細胞を再プログラムすることは、前記1つ以上の非多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wntアゴニスト;MEK阻害剤;及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させることを含む、項目42から53のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目55)
前記iPSCは、iPSCの集団を含む、項目42に記載の前記方法。
(項目56)
iPSCの前記集団は、iPSCの均質集団である、項目55に記載の前記方法。
(項目57)
iPSCの前記集団の少なくとも95%は、SSEA4及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する、項目55に記載の前記方法。
(項目58)
多能性細胞の前記集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する、項目55に記載の前記方法。
(項目59)
前記多能性細胞を前記細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する、項目42から58のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目60)
1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、前記iPSCにおいて、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養されたiPSCにおける1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目59に記載の前記方法。
(項目61)
前記1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目60に記載の前記方法。
(項目62)
自発的分化の前記低減は、少なくとも5継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目63)
自発的分化の前記低減は、少なくとも10継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目64)
自発的分化の前記低減は、少なくとも50継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目65)
自発的分化の前記低減は、少なくとも100継代の間維持される、項目60に記載の前記方法。
(項目66)
継代の間、前記iPSCを解離させることを含む、項目42から65のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目67)
前記iPSCの前記生存率は、継代の間維持される、項目66に記載の前記方法。
(項目68)
前記iPSCは、正常核型を含む、項目42から67のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目69)
前記iPSCは、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目42から68のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目70)
前記iPSCのゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される、項目42から69のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目71)
前記iPSCのゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される、項目42から69のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目72)
前記iPSCのゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される、項目42から69のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目73)
項目42から72のいずれか一項に従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)。
(項目74)
基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まない前記iPSC。
(項目75)
人工多能性幹細胞(iPSC)を製造する方法であって、
(a)1つ以上の多能性幹細胞を得ることと;
(b)TGFβR阻害剤を含まない細胞培養培地中で前記1つ以上の多能性幹細胞を培養し、それにより基底状態iPSCを生成することとを含む前記方法。
(項目76)
前記1つ以上のiPSCは、再プログラムされた体細胞を含む、項目75に記載の前記方法。
(項目77)
前記1つ以上のiPSCは、再プログラムされた成体幹細胞を含む、項目75に記載の前記方法。
(項目78)
前記1つ以上のiPSCは、前記1つ以上のiPSC内の内在性OCT4の発現を増加させることにより、多能性状態に再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目79)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される1つ以上の再プログラミング因子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目80)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28、C−MYC、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びSV40LTからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目81)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、SOX2、及びNANOGからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目82)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、NANOG、ECAT1、UTF1、及びESRRBからなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目83)
前記1つ以上のiPSCは、OCT4、ECAT1、及びUTF1からなる群から選択される再プログラミング因子の1つ以上の複製をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを、前記1つ以上の非多能性細胞に導入することにより再プログラムされている、項目75に記載の前記方法。
(項目84)
レンチウイルスベクターは、前記1つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目79から83のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目85)
エピソームベクターは、前記1つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目79から83のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目86)
前記細胞培養培地は、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wnt経路アゴニストと;MEK阻害剤と;ROCK阻害剤とを含む、項目75に記載の前記方法。
(項目87)
前記1つ以上のiPSC得ることは、前記1つ以上の非多能性細胞または部分多能性細胞を、Wnt経路アゴニストであって、任意選択でGSK3阻害剤である前記Wntアゴニスト;MEK阻害剤;及びTGFβR阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤と接触させ、前記1つ以上のiPSCを生成することを含む、項目75から86のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目88)
前記iPSCは、iPSCの集団を含む、項目75に記載の前記方法。
(項目89)
iPSCの前記集団は、iPSCの均質集団である、項目88に記載の前記方法。
(項目90)
iPSCの前記集団の少なくとも95%は、SSEA4及びTRA1−81またはTRA1−60を発現する、項目88に記載の前記方法。
(項目91)
前記1つ以上のiPSCは、多能性細胞の集団を再プログラムすることにより得られ、多能性細胞の前記集団の最大5%は、α−平滑筋アクチン(SMA)、TUJ1、またはFoxA2を発現する、項目88に記載の前記方法。
(項目92)
前記1つ以上のiPSCを前記細胞培養培地中で培養することは、自発的分化を低減する、または多能性の基底状態を維持もしくは誘引する、項目75に記載の前記方法。
(項目93)
自発的分化が低減された前記iPSCは、遺伝子発現を含み、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の分化マーカー遺伝子の発現が、TGFβR阻害剤を含む培地中で培養されたiPSCにおける1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%減少され、前記分化マーカー遺伝子は、FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1からなる群から選択される、項目92に記載の前記方法。
(項目94)
前記1つ以上の分化マーカー遺伝子は、T遺伝子、CXCR4、NODAL、GATA4、SOX17、FOXA2、OTX2、及びTUJ1からなる群から選択される、項目93に記載の前記方法。
(項目95)
前記低減された自発的分化は、少なくとも5継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目96)
前記低減された自発的分化は、少なくとも10継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目97)
前記低減された自発的分化は、少なくとも50継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目98)
前記低減された自発的分化は、少なくとも100継代の間維持される、項目93に記載の前記方法。
(項目99)
継代の間、前記1つ以上のiPSCを解離させることを含む、項目75から98のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目100)
継代の間、前記1つ以上のiPSCの生存率が維持される、項目90に記載の前記方法。
(項目101)
前記1つ以上のiPSCは、正常核型を含む、項目75から100のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目102)
前記1つ以上のiPSCは、フィーダーを含まない環境内で培養される、項目75から101のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目103)
前記1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも10継代の間維持される、項目75から102のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目104)
前記1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも50継代の間維持される、項目75から102のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目105)
前記1つ以上のiPSCのゲノム安定性は、少なくとも100継代の間維持される、項目75から102のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目106)
項目75から105のいずれか一項に従って生成された基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)。
(項目107)
基底状態多能性を含む人工多能性幹細胞(iPSC)であって、再プログラミング因子ポリペプチドをコードする外部から導入されたポリヌクレオチドを含まない前記iPSC。
(項目108)
非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするための方法であって、前記非多能性細胞に、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチド、または、(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを導入し、それにより前記非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムすることを含む前記方法。
(項目109)
導入することは、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドを導入することを含む、項目108に記載の前記方法。
(項目110)
導入することは、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドを導入すること、または(ii)OCT−4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドを導入することを含む、項目108に記載の前記方法。
(項目111)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにより導入される、項目108から110のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目112)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目111に記載の前記方法。
(項目113)
前記多能性細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない、項目111に記載の前記方法。
(項目114)
前記1つ以上のポリヌクレオチドが、CRE媒介切断により切断される、項目113に記載の前記方法。
(項目115)
前記非多能性細胞に、(i)SV40LTポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または(ii)SV40LTポリペプチドを導入することをさらに含む、項目108から114のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目116)
前記非多能性細胞を、TGFβR阻害剤、Wnt経路アゴニスト、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つと接触させることをさらに含み、前記Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤である、項目108から115のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目117)
前記非多能性細胞は、TGFβR阻害剤、Wnt経路アゴニスト、MEK阻害剤、及びROCK阻害剤と接触させられ、前記Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤である、項目116に記載の前記方法。
(項目118)
Wnt経路アゴニストと、MEK阻害剤と、ROCK阻害剤とを含む培養培地中で前記多能性細胞を培養することをさらに含み、前記Wnt経路アゴニストは、任意選択でGSK3阻害剤であり、前記培養培地は、TGFβR阻害剤を含有しない、項目108から117のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目119)
(a)前記Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、(b)前記TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、(c)前記GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または(d)前記MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である、項目116から118のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目120)
前記多能性細胞の多能性は、少なくとも5回の細胞分裂または少なくとも10回の細胞分裂の間維持される、項目118または119に記載の前記方法。
(項目121)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目108から120のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目122)
前記多シストロン性ベクターは、Oct4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、項目121に記載の前記方法。
(項目123)
前記多能性細胞内のOct34発現のために選択することにより、前記多能性細胞を同定することをさらに含む、項目108から122のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目124)
Oct4発現のために選択することは、異所性Oct4発現のために選択することを含む、項目123に記載の前記方法。
(項目125)
培養することは、多能性幹細胞の集団を生成する、項目118から124のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目126)
多能性幹細胞の前記集団は、少なくとも70%均質、少なくとも80%均質、または少なくとも90%均質である、項目125に記載の前記方法。
(項目127)
多能性細胞の前記集団の少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%は、SSEA及びTra−181を発現する、項目125または126に記載の前記方法。
(項目128)
前記多能性細胞または多能性細胞の集団は、単一細胞継代が可能である、項目108から127のいずれか一項に記載の前記方法。
(項目129)
単一細胞継代により生成された前記細胞は、正常核型を有する、項目128に記載の前記方法。
(項目130)
項目108から129のいずれか一項に記載の前記方法に従って生成される多能性細胞。
(項目131)
(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも1つの外因性ポリペプチドを含む、単離された非多能性細胞を含む組成物。
(項目132)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドの少なくとも2つをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも2つの外因性ポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目133)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドの少なくとも3つをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドから選択される少なくとも3つの外因性ポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目134)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性OCT4ポリペプチド、外因性ECAT1ポリペプチド、外因性UTF1ポリペプチド、外因性NANOGポリペプチド、及び外因性ESRRBポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目135)
前記細胞が、(i)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする1つ以上の外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性OCT4ポリペプチド、外因性ECAT1ポリペプチド、及び外因性UTF1ポリペプチドを含む、項目131に記載の前記組成物。
(項目136)
前記細胞は、TGFβR阻害剤、GSK3阻害剤、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つと接触させられている、項目121から135のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目137)
前記細胞は、TGFβR阻害剤、Wnt経路活性化因子、MEK阻害剤及びROCK阻害剤と接触せられており、前記Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である、項目136に記載の前記組成物。
(項目138)
(a)前記Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、(b)前記TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、(c)前記GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または(d)前記MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である、項目136または137に記載の前記組成物。
(項目139)
前記1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにより前記非多能性細胞に導入される、項目131から138のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目140)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目139に記載の前記方法。
(項目141)
前記細胞は、外因性ポリヌクレオチドを含まない、項目139に記載の前記組成物。
(項目142)
前記1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、CRE媒介切断により除去される、項目141に記載の前記方法。
(項目143)
前記細胞は、(i)SV40LT抗原ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド、または(ii)外因性SV40LT抗原ポリペプチドをさらに含む、項目131から142のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目144)
前記1つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの2Aペプチドにより隔てられた複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目
131から143のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目145)
前記多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む、項目144に記載の前記組成物。
(項目146)
OCT4ポリペプチドをコードする前記外因性ポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している、項目131から145のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目147)
(i)OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、(ii)ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、(iii)UTF1ポリペプチドをコードするcDNA、(iv)NANOGポリペプチドをコードするcDNA、及び(v)ESRRBポリペプチドをコードするcDNAの少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つからなる組成物。
(項目148)
OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、UTF1ポリペプチドをコードするcDNA、NANOGポリペプチドをコードするcDNA、及びESRRBポリペプチドをコードするcDNAからなる、項目147に記載の前記組成物。
(項目149)
OCT4ポリペプチドをコードするcDNA、ECAT1ポリペプチドをコードするcDNA、及びUTF1ポリペプチドをコードするcDNAからなる、項目148に記載の前記組成物。
(項目150)
各cDNAは、レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにコードされる、項目147から149のいずれか一項に記載の前記組成物。
(項目151)
OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つの再プログラミング因子ポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター。
(項目152)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、OCTポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードする、項目151に記載の前記ベクター。
(項目153)
前記1つ以上のポリヌクレオチドは、OCTポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする、項目152に記載の前記ベクター。
(項目154)
前記ベクターは、SV40LT抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目151から153のいずれか一項に記載の前記ベクター。
(項目155)
レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAである、項目151から154のいずれか一項に記載の前記ベクター。
(項目156)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目155に記載の前記ベクター。
(項目157)
非多能性細胞を多能性細胞に再プログラムするためのキットであって、
(a)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、もしくはESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドをコードする、1つ以上のポリヌクレオチド;または
(b)OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、もしくはESRRBポリペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチド;ならびに
(c)TGFβR阻害剤、Wnt経路活性化因子、MEK阻害剤及びROCK阻害剤の少なくとも1つを備え、前記Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である、前記キット。
(項目158)
(i)前記1つ以上のポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドをコードし、または、(ii)前記少なくとも1つのポリペプチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、UTF1ポリペプチド、NANOGポリペプチド、及びESRRBポリペプチドを含む、項目157に記載の前記キット。
(項目159)
(i)前記1つ以上の1つ以上のポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドをコードする、または、(ii)前記少なくとも1つのポリペプチドは、OCT4ポリペプチド、ECAT1ポリペプチド、及びUTF1ポリペプチドを含む、項目157に記載の前記キット。
(項目160)
(i)SV40LT抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または(ii)SV40LT抗原ポリペプチドをさらに備える、項目157から159のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目161)
前記キットは、TGFβR阻害剤と、Wnt経路活性化因子と、MEK阻害剤と、ROCK阻害剤とを備え、前記Wnt経路活性化因子は、任意選択でGSK3阻害剤である、項目157から160のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目162)
(a)前記Rock阻害剤は、チアゾビビンもしくはY27632であり、(b)前記TGFβR阻害剤は、A−83−01もしくはSB431542であり、(c)前記GSK3阻害剤は、CHIR99021もしくはBIOであり、または(d)前記MEK阻害剤は、PD98059もしくはPD032901である、項目157から161のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目163)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドは、レンチウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、エピソーム、ミニサークル、発現カセットを有するベクター系、またはmRNAにコードされる、項目157から162のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目164)
前記レトロウイルスは、レンチウイルスである、項目163に記載の前記キット。
(項目165)
前記少なくとも1つのポリヌクレオチドは、多シストロン性ベクターにコードされ、各ポリヌクレオチドは、2Aペプチドにより隔てられている、項目157から164のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目166)
前記多シストロン性ベクターは、OCT4ポリペプチドをコードする2つ以上のポリヌクレオチドを含む、項目165に記載の前記キット。
(項目167)
OCT4ポリペプチドをコードする前記少なくとも1つのポリヌクレオチドは、選択可能マーカーに連結している、項目157から166のいずれか一項に記載の前記キット。
(項目168)
多能性幹細胞の集団を生成するための方法であって、
a)非多能性細胞の集団を提供することと;
b)非多能性細胞の前記集団に、選択可能マーカーに連結したOCT4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することと;
c)非多能性細胞の前記集団の少なくとも一部を多能性細胞に再プログラムするのに十分な条件下で、非多能性細胞の前記集団を前記ポリヌクレオチドと共にインキュベートすることと;
d)前記選択可能マーカーを発現する細胞を選択し、それにより多能性幹細胞の集団を提供することとを含む前記方法。
(項目169)
前記ポリヌクレオチドは、OCT4ポリペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを含む多シストロン性ベクターとして導入される、項目168に記載の前記方法。
(項目170)
前記複数のポリヌクレオチドは、2Aペプチドにより隔てられている、項目169に記載の前記方法。
(項目171)
細胞の前記集団内の細胞の少なくとも10%は、SSEA及びTRA−181を発現する、項目169に記載の前記方法。

図面の簡単な説明

0181

図1A〜1E。向上した再プログラム及びhiPSC維持のための複数段階培養基盤からの結果を示す図である。(1A)レンチウイルス生成hiPSCクローンFTi088は、SMC4において未分化細胞の均質集団を維持し、一方SMC4において培養されたレンチウイルス生成hiPSC株FTi096においては、自発的分化が観察された。自発的分化は、形態(上パネル)ならびにSSEA4及びTRA1−81のフローサイトメトリー(下パネル)により示されるように、FTi096が3継代培養FMMに移行した際に最小限となった。(1B)ウイルス様配列WPREの導入遺伝子発現のqRTPCR。発現は、GAPDHに対して、及びレンチウイルス感染から4日後(Day 4 P.I.)の親線維芽細胞株のWPRE発現と比較して正規化した。非感染線維芽細胞株(線維芽細胞)及びヒトESC株HUES9を、陰性対照として使用した。各セットの値は、バーの上に示されている。(1C)10継代後の、導入遺伝子を含まないレンチウイルス誘引hiPSCのSSEA4及びTRA1−81集団に対する様々な培地構成成分の効果のスクリーニング;SB431542(−TGFβRi)の除去、10から100ng/mL bFGFの増加、10ng/mL LIFの添加。(1D)線維芽細胞株は、遺伝子セットOCT4/KLF4/SOX2を含有するレンチウイルスコンストラクトトランスフェクトし、様々な培地(従来の培地;Conv.)中に分割し、17日間培養し、17日目にSSEA4及びTRA1−81二重陽性集団にソーティングした。ソートゲートは、青色で強調表示されている。各セットは、FMM及びSMC4に分割されたSMC4セットを除いて、それぞれの培地中でさらに10日間培養した。27日目に、培養物をSSEA4及びTRA1−81二重陽性集団に再びソーティングし、ソーティングイベントの正規化された密度播種し、さらに9日間それぞれの培地中に維持した。従来の培養セットゲティングは、正規化された数の細胞を達成するために拡大された。36日目に、各培養物を、OCT4及びNANOG発現に関して染色した。代表的な免疫細胞化学画像は、各セットの右パネルに示されている。(1E)(1D)において議論された36日目の染色のコロニー数エラーバーは、FRMからFMM及びFRMに対して3つ、ならびにFMM及びhESCに対して2つを示している。
図1A〜1E。向上した再プログラム及びhiPSC維持のための複数段階培養基盤からの結果を示す図である。(1A)レンチウイルス生成hiPSCクローンFTi088は、SMC4において未分化細胞の均質集団を維持し、一方SMC4において培養されたレンチウイルス生成hiPSC株FTi096においては、自発的分化が観察された。自発的分化は、形態(上パネル)ならびにSSEA4及びTRA1−81のフローサイトメトリー(下パネル)により示されるように、FTi096が3継代培養のFMMに移行した際に最小限となった。(1B)ウイルス様配列WPREの導入遺伝子発現のqRT−PCR。発現は、GAPDHに対して、及びレンチウイルス感染から4日後(Day 4 P.I.)の親線維芽細胞株のWPRE発現と比較して正規化した。非感染線維芽細胞株(線維芽細胞)及びヒトESC株HUES9を、陰性対照として使用した。各セットの値は、バーの上に示されている。(1C)10継代後の、導入遺伝子を含まないレンチウイルス誘引hiPSCのSSEA4及びTRA1−81集団に対する様々な培地構成成分の効果のスクリーニング;SB431542(−TGFβRi)の除去、10から100ng/mL bFGFの増加、10ng/mL LIFの添加。(1D)線維芽細胞株は、遺伝子セットOCT4/KLF4/SOX2を含有するレンチウイルスコンストラクトでトランスフェクトし、様々な培地(従来の培地;Conv.)中に分割し、17日間培養し、17日目にSSEA4及びTRA1−81二重陽性集団にソーティングした。ソートゲートは、青色で強調表示されている。各セットは、FMM及びSMC4に分割されたSMC4セットを除いて、それぞれの培地中でさらに10日間培養した。27日目に、培養物をSSEA4及びTRA1−81二重陽性集団に再びソーティングし、ソーティングイベントの正規化された密度で播種し、さらに9日間それぞれの培地中に維持した。従来の培養セットゲーティングは、正規化された数の細胞を達成するために拡大された。36日目に、各培養物を、OCT4及びNANOG発現に関して染色した。代表的な免疫細胞化学画像は、各セットの右パネルに示されている。(1E)(1D)において議論された36日目の染色のコロニー数。エラーバーは、FRMからFMM及びFRMに対して3つ、ならびにFMM及びhESCに対して2つを示している。
図1A〜1E。向上した再プログラム及びhiPSC維持のための複数段階培養基盤からの結果を示す図である。(1A)レンチウイルス生成hiPSCクローンFTi088は、SMC4において未分化細胞の均質集団を維持し、一方SMC4において培養されたレンチウイルス生成hiPSC株FTi096においては、自発的分化が観察された。自発的分化は、形態(上パネル)ならびにSSEA4及びTRA1−81のフローサイトメトリー(下パネル)により示されるように、FTi096が3継代培養のFMMに移行した際に最小限となった。(1B)ウイルス様配列WPREの導入遺伝子発現のqRT−PCR。発現は、GAPDHに対して、及びレンチウイルス感染から4日後(Day 4 P.I.)の親線維芽細胞株のWPRE発現と比較して正規化した。非感染線維芽細胞株(線維芽細胞)及びヒトESC株HUES9を、陰性対照として使用した。各セットの値は、バーの上に示されている。(1C)10継代後の、導入遺伝子を含まないレンチウイルス誘引hiPSCのSSEA4及びTRA1−81集団に対する様々な培地構成成分の効果のスクリーニング;SB431542(−TGFβRi)の除去、10から100ng/mL bFGFの増加、10ng/mL LIFの添加。(1D)線維芽細胞株は、遺伝子セットOCT4/KLF4/SOX2を含有するレンチウイルスコンストラクトでトランスフェクトし、様々な培地(従来の培地;Conv.)中に分割し、17日間培養し、17日目にSSEA4及びTRA1−81二重陽性集団にソーティングした。ソートゲートは、青色で強調表示されている。各セットは、FMM及びSMC4に分割されたSMC4セットを除いて、それぞれの培地中でさらに10日間培養した。27日目に、培養物をSSEA4及びTRA1−81二重陽性集団に再びソーティングし、ソーティングイベントの正規化された密度で播種し、さらに9日間それぞれの培地中に維持した。従来の培養セットゲーティングは、正規化された数の細胞を達成するために拡大された。36日目に、各培養物を、OCT4及びNANOG発現に関して染色した。代表的な免疫細胞化学画像は、各セットの右パネルに示されている。(1E)(1D)において議論された36日目の染色のコロニー数。エラーバーは、FRMからFMM及びFRMに対して3つ、ならびにFMM及びhESCに対して2つを示している。
図1A〜1E。向上した再プログラム及びhiPSC維持のための複数段階培養基盤からの結果を示す図である。(1A)レンチウイルス生成hiPSCクローンFTi088は、SMC4において未分化細胞の均質集団を維持し、一方SMC4において培養されたレンチウイルス生成hiPSC株FTi096においては、自発的分化が観察された。自発的分化は、形態(上パネル)ならびにSSEA4及びTRA1−81のフローサイトメトリー(下パネル)により示されるように、FTi096が3継代培養のFMMに移行した際に最小限となった。(1B)ウイルス様配列WPREの導入遺伝子発現のqRT−PCR。発現は、GAPDHに対して、及びレンチウイルス感染から4日後(Day 4 P.I.)の親線維芽細胞株のWPRE発現と比較して正規化した。非感染線維芽細胞株(線維芽細胞)及びヒトESC株HUES9を、陰性対照として使用した。各セットの値は、バーの上に示されている。(1C)10継代後の、導入遺伝子を含まないレンチウイルス誘引hiPSCのSSEA4及びTRA1−81集団に対する様々な培地構成成分の効果のスクリーニング;SB431542(−TGFβRi)の除去、10から100ng/mL bFGFの増加、10ng/mL LIFの添加。(1D)線維芽細胞株は、遺伝子セットOCT4/KLF4/SOX2を含有するレンチウイルスコンストラクトでトランスフェクトし、様々な培地(従来の培地;Conv.)中に分割し、17日間培養し、17日目にSSEA4及びTRA1−81二重陽性集団にソーティングした。ソートゲートは、青色で強調表示されている。各セットは、FMM及びSMC4に分割されたSMC4セットを除いて、それぞれの培地中でさらに10日間培養した。27日目に、培養物をSSEA4及びTRA1−81二重陽性集団に再びソーティングし、ソーティングイベントの正規化された密度で播種し、さらに9日間それぞれの培地中に維持した。従来の培養セットゲーティングは、正規化された数の細胞を達成するために拡大された。36日目に、各培養物を、OCT4及びNANOG発現に関して染色した。代表的な免疫細胞化学画像は、各セットの右パネルに示されている。(1E)(1D)において議論された36日目の染色のコロニー数。エラーバーは、FRMからFMM及びFRMに対して3つ、ならびにFMM及びhESCに対して2つを示している。
図1A〜1E。向上した再プログラム及びhiPSC維持のための複数段階培養基盤からの結果を示す図である。(1A)レンチウイルス生成hiPSCクローンFTi088は、SMC4において未分化細胞の均質集団を維持し、一方SMC4において培養されたレンチウイルス生成hiPSC株FTi096においては、自発的分化が観察された。自発的分化は、形態(上パネル)ならびにSSEA4及びTRA1−81のフローサイトメトリー(下パネル)により示されるように、FTi096が3継代培養のFMMに移行した際に最小限となった。(1B)ウイルス様配列WPREの導入遺伝子発現のqRT−PCR。発現は、GAPDHに対して、及びレンチウイルス感染から4日後(Day 4 P.I.)の親線維芽細胞株のWPRE発現と比較して正規化した。非感染線維芽細胞株(線維芽細胞)及びヒトESC株HUES9を、陰性対照として使用した。各セットの値は、バーの上に示されている。(1C)10継代後の、導入遺伝子を含まないレンチウイルス誘引hiPSCのSSEA4及びTRA1−81集団に対する様々な培地構成成分の効果のスクリーニング;SB431542(−TGFβRi)の除去、10から100ng/mL bFGFの増加、10ng/mL LIFの添加。(1D)線維芽細胞株は、遺伝子セットOCT4/KLF4/SOX2を含有するレンチウイルスコンストラクトでトランスフェクトし、様々な培地(従来の培地;Conv.)中に分割し、17日間培養し、17日目にSSEA4及びTRA1−81二重陽性集団にソーティングした。ソートゲートは、青色で強調表示されている。各セットは、FMM及びSMC4に分割されたSMC4セットを除いて、それぞれの培地中でさらに10日間培養した。27日目に、培養物をSSEA4及びTRA1−81二重陽性集団に再びソーティングし、ソーティングイベントの正規化された密度で播種し、さらに9日間それぞれの培地中に維持した。従来の培養セットゲーティングは、正規化された数の細胞を達成するために拡大された。36日目に、各培養物を、OCT4及びNANOG発現に関して染色した。代表的な免疫細胞化学画像は、各セットの右パネルに示されている。(1E)(1D)において議論された36日目の染色のコロニー数。エラーバーは、FRMからFMM及びFRMに対して3つ、ならびにFMM及びhESCに対して2つを示している。
図2A〜2E。個々のエピソーム再プログラムhiPSCが効率的に選択され、クローン拡大のために96ウェルプレート内に播種されることを示す図である。(2A)エピソーム誘引、複数段階培養基盤、フローサイトメトリーソーティング及びクローン拡大の概略的タイミング図。(2B)トランスフェクション後の示された日数における、FF培養物(2Aで概説される)中でのFRMからFMMへの移行において維持されたエピソーム誘引再プログラムのフローサイトメトリープロファイル。各親株(SSEA4+/TRA1−81+/CD30+集団)に使用されたソートゲーティング戦略は、個々のhiPSCクローンを含有する96ウェルプレートのウェルパーセントを表す下のヒストグラムパネルに対応して、それぞれの色で示されている。複数のクローンまたは分化したクローンを含有するウェルは、スコア化しなかった。実線は、全ての誘導物の平均パーセンテージを表し、点線は、標準偏差を表している。(2C)MEF細胞の存在下で従来の培地中に維持された、トランスフェクションから19日後に再プログラムするように誘引されたFTC007のフロープロファイル。誘引された集団は、(2B)におけるFTC007の同じ集団から採取したが、その後異なる培養物中で処理した。(2D)96ウェルプレート内のソーティングされたコロニーの様々な多能性マーカーの免疫細胞化学分析。右隅のパネルは、DAPI染色を表す。(2E)ウェル当たり3細胞でのSSEA4/TRA1−81/CD30直接ソーティング(FACS)96ウェルプレートの各ウェルにおけるNANOG発現のqRT−PCR。発現範囲は、凡例において説明されるように、H1ヒトESCに対してゼロから4回の発現の間であり、GAPDHに正規化されている。
図2A〜2E。個々のエピソーム再プログラムhiPSCが効率的に選択され、クローン拡大のために96ウェルプレート内に播種されることを示す図である。(2A)エピソーム誘引、複数段階培養基盤、フローサイトメトリーソーティング及びクローン拡大の概略的タイミング図。(2B)トランスフェクション後の示された日数における、FF培養物(2Aで概説される)中でのFRMからFMMへの移行において維持されたエピソーム誘引再プログラムのフローサイトメトリープロファイル。各親株(SSEA4+/TRA1−81+/CD30+集団)に使用されたソートゲーティング戦略は、個々のhiPSCクローンを含有する96ウェルプレートのウェルのパーセントを表す下のヒストグラムパネルに対応して、それぞれの色で示されている。複数のクローンまたは分化したクローンを含有するウェルは、スコア化しなかった。実線は、全ての誘導物の平均パーセンテージを表し、点線は、標準偏差を表している。(2C)MEF細胞の存在下で従来の培地中に維持された、トランスフェクションから19日後に再プログラムするように誘引されたFTC007のフロープロファイル。誘引された集団は、(2B)におけるFTC007の同じ集団から採取したが、その後異なる培養物中で処理した。(2D)96ウェルプレート内のソーティングされたコロニーの様々な多能性マーカーの免疫細胞化学分析。右隅のパネルは、DAPI染色を表す。(2E)ウェル当たり3細胞でのSSEA4/TRA1−81/CD30直接ソーティング(FACS)96ウェルプレートの各ウェルにおけるNANOG発現のqRT−PCR。発現範囲は、凡例において説明されるように、H1ヒトESCに対してゼロから4回の発現の間であり、GAPDHに正規化されている。
図2A〜2E。個々のエピソーム再プログラムhiPSCが効率的に選択され、クローン拡大のために96ウェルプレート内に播種されることを示す図である。(2A)エピソーム誘引、複数段階培養基盤、フローサイトメトリーソーティング及びクローン拡大の概略的タイミング図。(2B)トランスフェクション後の示された日数における、FF培養物(2Aで概説される)中でのFRMからFMMへの移行において維持されたエピソーム誘引再プログラムのフローサイトメトリープロファイル。各親株(SSEA4+/TRA1−81+/CD30+集団)に使用されたソートゲーティング戦略は、個々のhiPSCクローンを含有する96ウェルプレートのウェルのパーセントを表す下のヒストグラムパネルに対応して、それぞれの色で示されている。複数のクローンまたは分化したクローンを含有するウェルは、スコア化しなかった。実線は、全ての誘導物の平均パーセンテージを表し、点線は、標準偏差を表している。(2C)MEF細胞の存在下で従来の培地中に維持された、トランスフェクションから19日後に再プログラムするように誘引されたFTC007のフロープロファイル。誘引された集団は、(2B)におけるFTC007の同じ集団から採取したが、その後異なる培養物中で処理した。(2D)96ウェルプレート内のソーティングされたコロニーの様々な多能性マーカーの免疫細胞化学分析。右隅のパネルは、DAPI染色を表す。(2E)ウェル当たり3細胞でのSSEA4/TRA1−81/CD30直接ソーティング(FACS)96ウェルプレートの各ウェルにおけるNANOG発現のqRT−PCR。発現範囲は、凡例において説明されるように、H1ヒトESCに対してゼロから4回の発現の間であり、GAPDHに正規化されている。
図2A〜2E。個々のエピソーム再プログラムhiPSCが効率的に選択され、クローン拡大のために96ウェルプレート内に播種されることを示す図である。(2A)エピソーム誘引、複数段階培養基盤、フローサイトメトリーソーティング及びクローン拡大の概略的タイミング図。(2B)トランスフェクション後の示された日数における、FF培養物(2Aで概説される)中でのFRMからFMMへの移行において維持されたエピソーム誘引再プログラムのフローサイトメトリープロファイル。各親株(SSEA4+/TRA1−81+/CD30+集団)に使用されたソートゲーティング戦略は、個々のhiPSCクローンを含有する96ウェルプレートのウェルのパーセントを表す下のヒストグラムパネルに対応して、それぞれの色で示されている。複数のクローンまたは分化したクローンを含有するウェルは、スコア化しなかった。実線は、全ての誘導物の平均パーセンテージを表し、点線は、標準偏差を表している。(2C)MEF細胞の存在下で従来の培地中に維持された、トランスフェクションから19日後に再プログラムするように誘引されたFTC007のフロープロファイル。誘引された集団は、(2B)におけるFTC007の同じ集団から採取したが、その後異なる培養物中で処理した。(2D)96ウェルプレート内のソーティングされたコロニーの様々な多能性マーカーの免疫細胞化学分析。右隅のパネルは、DAPI染色を表す。(2E)ウェル当たり3細胞でのSSEA4/TRA1−81/CD30直接ソーティング(FACS)96ウェルプレートの各ウェルにおけるNANOG発現のqRT−PCR。発現範囲は、凡例において説明されるように、H1ヒトESCに対してゼロから4回の発現の間であり、GAPDHに正規化されている。
図2A〜2E。個々のエピソーム再プログラムhiPSCが効率的に選択され、クローン拡大のために96ウェルプレート内に播種されることを示す図である。(2A)エピソーム誘引、複数段階培養基盤、フローサイトメトリーソーティング及びクローン拡大の概略的タイミング図。(2B)トランスフェクション後の示された日数における、FF培養物(2Aで概説される)中でのFRMからFMMへの移行において維持されたエピソーム誘引再プログラムのフローサイトメトリープロファイル。各親株(SSEA4+/TRA1−81+/CD30+集団)に使用されたソートゲーティング戦略は、個々のhiPSCクローンを含有する96ウェルプレートのウェルのパーセントを表す下のヒストグラムパネルに対応して、それぞれの色で示されている。複数のクローンまたは分化したクローンを含有するウェルは、スコア化しなかった。実線は、全ての誘導物の平均パーセンテージを表し、点線は、標準偏差を表している。(2C)MEF細胞の存在下で従来の培地中に維持された、トランスフェクションから19日後に再プログラムするように誘引されたFTC007のフロープロファイル。誘引された集団は、(2B)におけるFTC007の同じ集団から採取したが、その後異なる培養物中で処理した。(2D)96ウェルプレート内のソーティングされたコロニーの様々な多能性マーカーの免疫細胞化学分析。右隅のパネルは、DAPI染色を表す。(2E)ウェル当たり3細胞でのSSEA4/TRA1−81/CD30直接ソーティング(FACS)96ウェルプレートの各ウェルにおけるNANOG発現のqRT−PCR。発現範囲は、凡例において説明されるように、H1ヒトESCに対してゼロから4回の発現の間であり、GAPDHに正規化されている。
図3A〜3F。エピソーム再プログラムhiPSCクローンがその未分化状態を維持し、導入遺伝子配列を含まないことを示す図である。(3A)単一細胞継代から24時間後のhiPSCクローンの典型的な形態。(3B)培養中のhiPSCクローンの代表的な画像。(3C)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、FTC007−c1 p4;レーン2、FTC007−c21 p4;レーン3、FTC016−c25 p5;レーン4、FTC016−c36 p5;レーン5、FTC017−c11 p7;レーン6、FTC017−c14 p7;レーン7、FTC017−c17 p6(エピソームコンストラクトを維持する株は、陽性対照を使用した);レーン8、非トランスフェクトFTC007;レーン9、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC(二次汚染に対する対照として役立つ);レーン10、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(3D)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。(3E)様々な親株からの選択されたhiPSCクローンのフローサイトメトリープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(3F)内因性多能性遺伝子発現のqRT−PCR分析。データは、GAPDHに対して、及びHUES9 hESCと比較して正規化された。KLF4発現の場合、2つのデータ点がHUES9の15倍を超え、グラフ上に記録された。エラーバーは、反復の標準偏差を表す。
図3A〜3F。エピソーム再プログラムhiPSCクローンがその未分化状態を維持し、導入遺伝子配列を含まないことを示す図である。(3A)単一細胞継代から24時間後のhiPSCクローンの典型的な形態。(3B)培養中のhiPSCクローンの代表的な画像。(3C)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、FTC007−c1 p4;レーン2、FTC007−c21 p4;レーン3、FTC016−c25 p5;レーン4、FTC016−c36 p5;レーン5、FTC017−c11 p7;レーン6、FTC017−c14 p7;レーン7、FTC017−c17 p6(エピソームコンストラクトを維持する株は、陽性対照を使用した);レーン8、非トランスフェクトFTC007;レーン9、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC(二次汚染に対する対照として役立つ);レーン10、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(3D)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。(3E)様々な親株からの選択されたhiPSCクローンのフローサイトメトリープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(3F)内因性多能性遺伝子発現のqRT−PCR分析。データは、GAPDHに対して、及びHUES9 hESCと比較して正規化された。KLF4発現の場合、2つのデータ点がHUES9の15倍を超え、グラフ上に記録された。エラーバーは、反復の標準偏差を表す。
図3A〜3F。エピソーム再プログラムhiPSCクローンがその未分化状態を維持し、導入遺伝子配列を含まないことを示す図である。(3A)単一細胞継代から24時間後のhiPSCクローンの典型的な形態。(3B)培養中のhiPSCクローンの代表的な画像。(3C)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、FTC007−c1 p4;レーン2、FTC007−c21 p4;レーン3、FTC016−c25 p5;レーン4、FTC016−c36 p5;レーン5、FTC017−c11 p7;レーン6、FTC017−c14 p7;レーン7、FTC017−c17 p6(エピソームコンストラクトを維持する株は、陽性対照を使用した);レーン8、非トランスフェクトFTC007;レーン9、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC(二次汚染に対する対照として役立つ);レーン10、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(3D)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。(3E)様々な親株からの選択されたhiPSCクローンのフローサイトメトリープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(3F)内因性多能性遺伝子発現のqRT−PCR分析。データは、GAPDHに対して、及びHUES9 hESCと比較して正規化された。KLF4発現の場合、2つのデータ点がHUES9の15倍を超え、グラフ上に記録された。エラーバーは、反復の標準偏差を表す。
図3A〜3F。エピソーム再プログラムhiPSCクローンがその未分化状態を維持し、導入遺伝子配列を含まないことを示す図である。(3A)単一細胞継代から24時間後のhiPSCクローンの典型的な形態。(3B)培養中のhiPSCクローンの代表的な画像。(3C)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、FTC007−c1 p4;レーン2、FTC007−c21 p4;レーン3、FTC016−c25 p5;レーン4、FTC016−c36 p5;レーン5、FTC017−c11 p7;レーン6、FTC017−c14 p7;レーン7、FTC017−c17 p6(エピソームコンストラクトを維持する株は、陽性対照を使用した);レーン8、非トランスフェクトFTC007;レーン9、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC(二次汚染に対する対照として役立つ);レーン10、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(3D)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。(3E)様々な親株からの選択されたhiPSCクローンのフローサイトメトリープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(3F)内因性多能性遺伝子発現のqRT−PCR分析。データは、GAPDHに対して、及びHUES9 hESCと比較して正規化された。KLF4発現の場合、2つのデータ点がHUES9の15倍を超え、グラフ上に記録された。エラーバーは、反復の標準偏差を表す。
図3A〜3F。エピソーム再プログラムhiPSCクローンがその未分化状態を維持し、導入遺伝子配列を含まないことを示す図である。(3A)単一細胞継代から24時間後のhiPSCクローンの典型的な形態。(3B)培養中のhiPSCクローンの代表的な画像。(3C)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、FTC007−c1 p4;レーン2、FTC007−c21 p4;レーン3、FTC016−c25 p5;レーン4、FTC016−c36 p5;レーン5、FTC017−c11 p7;レーン6、FTC017−c14 p7;レーン7、FTC017−c17 p6(エピソームコンストラクトを維持する株は、陽性対照を使用した);レーン8、非トランスフェクトFTC007;レーン9、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC(二次汚染に対する対照として役立つ);レーン10、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(3D)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。(3E)様々な親株からの選択されたhiPSCクローンのフローサイトメトリープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(3F)内因性多能性遺伝子発現のqRT−PCR分析。データは、GAPDHに対して、及びHUES9 hESCと比較して正規化された。KLF4発現の場合、2つのデータ点がHUES9の15倍を超え、グラフ上に記録された。エラーバーは、反復の標準偏差を表す。
図3A〜3F。エピソーム再プログラムhiPSCクローンがその未分化状態を維持し、導入遺伝子配列を含まないことを示す図である。(3A)単一細胞継代から24時間後のhiPSCクローンの典型的な形態。(3B)培養中のhiPSCクローンの代表的な画像。(3C)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、FTC007−c1 p4;レーン2、FTC007−c21 p4;レーン3、FTC016−c25 p5;レーン4、FTC016−c36 p5;レーン5、FTC017−c11 p7;レーン6、FTC017−c14 p7;レーン7、FTC017−c17 p6(エピソームコンストラクトを維持する株は、陽性対照を使用した);レーン8、非トランスフェクトFTC007;レーン9、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC(二次汚染に対する対照として役立つ);レーン10、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(3D)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。(3E)様々な親株からの選択されたhiPSCクローンのフローサイトメトリープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(3F)内因性多能性遺伝子発現のqRT−PCR分析。データは、GAPDHに対して、及びHUES9 hESCと比較して正規化された。KLF4発現の場合、2つのデータ点がHUES9の15倍を超え、グラフ上に記録された。エラーバーは、反復の標準偏差を表す。
図4A〜4E。継続的単一細胞及びFF培養中にゲノム安定性及び多能性が維持されることを示す図である。(4A)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、20〜40のGバンド中期細胞に対する細胞遺伝学的分析。(4B)FF及び単一細胞培養における、長期継代(p25〜30)hiPSCクローンのフローサイトメトリープロファイル及び細胞遺伝学的分析。(4C)3〜4日のFTC017−c11の一定方向分化。(4D)三胚葉分化を示すhiPSCクローンの胚様体形成及び分化。分化から28日後に行われた免疫細胞化学分析:外胚葉、TUJ1;中胚葉、α平滑筋アクチン(aSMA);内胚葉AFP。(4E)各体細胞系を表すFTC007−c21及びFTC016−c25から誘導された奇形腫組織学的断面。黒矢印、内胚葉;白矢印、外胚葉;灰色矢印、中胚葉。
図4A〜4E。継続的単一細胞及びFF培養中にゲノム安定性及び多能性が維持されることを示す図である。(4A)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、20〜40のGバンド中期細胞に対する細胞遺伝学的分析。(4B)FF及び単一細胞培養における、長期継代(p25〜30)hiPSCクローンのフローサイトメトリープロファイル及び細胞遺伝学的分析。(4C)3〜4日のFTC017−c11の一定方向分化。(4D)三胚葉分化を示すhiPSCクローンの胚様体形成及び分化。分化から28日後に行われた免疫細胞化学分析:外胚葉、TUJ1;中胚葉、α平滑筋アクチン(aSMA);内胚葉、AFP。(4E)各体細胞系を表すFTC007−c21及びFTC016−c25から誘導された奇形腫の組織学的断面。黒矢印、内胚葉;白矢印、外胚葉;灰色矢印、中胚葉。
図4A〜4E。継続的単一細胞及びFF培養中にゲノム安定性及び多能性が維持されることを示す図である。(4A)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、20〜40のGバンド中期細胞に対する細胞遺伝学的分析。(4B)FF及び単一細胞培養における、長期継代(p25〜30)hiPSCクローンのフローサイトメトリープロファイル及び細胞遺伝学的分析。(4C)3〜4日のFTC017−c11の一定方向分化。(4D)三胚葉分化を示すhiPSCクローンの胚様体形成及び分化。分化から28日後に行われた免疫細胞化学分析:外胚葉、TUJ1;中胚葉、α平滑筋アクチン(aSMA);内胚葉、AFP。(4E)各体細胞系を表すFTC007−c21及びFTC016−c25から誘導された奇形腫の組織学的断面。黒矢印、内胚葉;白矢印、外胚葉;灰色矢印、中胚葉。
図4A〜4E。継続的単一細胞及びFF培養中にゲノム安定性及び多能性が維持されることを示す図である。(4A)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、20〜40のGバンド中期細胞に対する細胞遺伝学的分析。(4B)FF及び単一細胞培養における、長期継代(p25〜30)hiPSCクローンのフローサイトメトリープロファイル及び細胞遺伝学的分析。(4C)3〜4日のFTC017−c11の一定方向分化。(4D)三胚葉分化を示すhiPSCクローンの胚様体形成及び分化。分化から28日後に行われた免疫細胞化学分析:外胚葉、TUJ1;中胚葉、α平滑筋アクチン(aSMA);内胚葉、AFP。(4E)各体細胞系を表すFTC007−c21及びFTC016−c25から誘導された奇形腫の組織学的断面。黒矢印、内胚葉;白矢印、外胚葉;灰色矢印、中胚葉。
図4A〜4E。継続的単一細胞及びFF培養中にゲノム安定性及び多能性が維持されることを示す図である。(4A)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、20〜40のGバンド中期細胞に対する細胞遺伝学的分析。(4B)FF及び単一細胞培養における、長期継代(p25〜30)hiPSCクローンのフローサイトメトリープロファイル及び細胞遺伝学的分析。(4C)3〜4日のFTC017−c11の一定方向分化。(4D)三胚葉分化を示すhiPSCクローンの胚様体形成及び分化。分化から28日後に行われた免疫細胞化学分析:外胚葉、TUJ1;中胚葉、α平滑筋アクチン(aSMA);内胚葉、AFP。(4E)各体細胞系を表すFTC007−c21及びFTC016−c25から誘導された奇形腫の組織学的断面。黒矢印、内胚葉;白矢印、外胚葉;灰色矢印、中胚葉。
図5A〜5J。最小限の数の再プログラミング因子によるhiPSCクローンの誘導物を示す図である。(5A)OCT4、SOX2及びNANOGを、様々な形態でpCEP4にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。(5B)誘引から13日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のSSEA4及びTRA1−81フローサイトメトリープロファイル。(5C)ウェル当たり3つ及び9つの細胞での96ウェルプレートのウェル内のTRA1−81陽性hiPSCクローンの存在を表す効率ヒストグラム。(5D)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、2xO+OS+ONS+T−c7 p6;レーン2、2xO+OS+ONS+T−c10 p6;レーン3、2xO+ONS+T−c5 p5;レーン4、2xO+ONS+T−c9 p5;レーン5、2xO+OS+T−c7 p7;レーン6、2xO+OS+T−c9 p6;レーン7、非トランスフェクトFTC007;レーン8、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC;レーン9、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(5E)2xO+OS+Tから誘導されたクローン9の形態。(5F)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は10倍の倍率撮影された。(5G)選択された遺伝子セットから誘導されたhiPSCクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(5H)誘引からおよそ72〜96時間後の選択されたhiPSCクローンの一定方向分化。(5I)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、Gバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。(5J)各体細胞系を表すhiPSCクローン2xO+OS+ONS+T−c10から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉;中央パネル、中胚葉;右パネル、外胚葉。
図5A〜5J。最小限の数の再プログラミング因子によるhiPSCクローンの誘導物を示す図である。(5A)OCT4、SOX2及びNANOGを、様々な形態でpCEP4にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。(5B)誘引から13日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のSSEA4及びTRA1−81フローサイトメトリープロファイル。(5C)ウェル当たり3つ及び9つの細胞での96ウェルプレートのウェル内のTRA1−81陽性hiPSCクローンの存在を表す効率ヒストグラム。(5D)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、2xO+OS+ONS+T−c7 p6;レーン2、2xO+OS+ONS+T−c10 p6;レーン3、2xO+ONS+T−c5 p5;レーン4、2xO+ONS+T−c9 p5;レーン5、2xO+OS+T−c7 p7;レーン6、2xO+OS+T−c9 p6;レーン7、非トランスフェクトFTC007;レーン8、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC;レーン9、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(5E)2xO+OS+Tから誘導されたクローン9の形態。(5F)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は10倍の倍率で撮影された。(5G)選択された遺伝子セットから誘導されたhiPSCクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(5H)誘引からおよそ72〜96時間後の選択されたhiPSCクローンの一定方向分化。(5I)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、Gバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。(5J)各体細胞系を表すhiPSCクローン2xO+OS+ONS+T−c10から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉;中央パネル、中胚葉;右パネル、外胚葉。
図5A〜5J。最小限の数の再プログラミング因子によるhiPSCクローンの誘導物を示す図である。(5A)OCT4、SOX2及びNANOGを、様々な形態でpCEP4にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。(5B)誘引から13日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のSSEA4及びTRA1−81フローサイトメトリープロファイル。(5C)ウェル当たり3つ及び9つの細胞での96ウェルプレートのウェル内のTRA1−81陽性hiPSCクローンの存在を表す効率ヒストグラム。(5D)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、2xO+OS+ONS+T−c7 p6;レーン2、2xO+OS+ONS+T−c10 p6;レーン3、2xO+ONS+T−c5 p5;レーン4、2xO+ONS+T−c9 p5;レーン5、2xO+OS+T−c7 p7;レーン6、2xO+OS+T−c9 p6;レーン7、非トランスフェクトFTC007;レーン8、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC;レーン9、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(5E)2xO+OS+Tから誘導されたクローン9の形態。(5F)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は10倍の倍率で撮影された。(5G)選択された遺伝子セットから誘導されたhiPSCクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(5H)誘引からおよそ72〜96時間後の選択されたhiPSCクローンの一定方向分化。(5I)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、Gバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。(5J)各体細胞系を表すhiPSCクローン2xO+OS+ONS+T−c10から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉;中央パネル、中胚葉;右パネル、外胚葉。
図5A〜5J。最小限の数の再プログラミング因子によるhiPSCクローンの誘導物を示す図である。(5A)OCT4、SOX2及びNANOGを、様々な形態でpCEP4にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。(5B)誘引から13日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のSSEA4及びTRA1−81フローサイトメトリープロファイル。(5C)ウェル当たり3つ及び9つの細胞での96ウェルプレートのウェル内のTRA1−81陽性hiPSCクローンの存在を表す効率ヒストグラム。(5D)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、2xO+OS+ONS+T−c7 p6;レーン2、2xO+OS+ONS+T−c10 p6;レーン3、2xO+ONS+T−c5 p5;レーン4、2xO+ONS+T−c9 p5;レーン5、2xO+OS+T−c7 p7;レーン6、2xO+OS+T−c9 p6;レーン7、非トランスフェクトFTC007;レーン8、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC;レーン9、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(5E)2xO+OS+Tから誘導されたクローン9の形態。(5F)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は10倍の倍率で撮影された。(5G)選択された遺伝子セットから誘導されたhiPSCクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(5H)誘引からおよそ72〜96時間後の選択されたhiPSCクローンの一定方向分化。(5I)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、Gバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。(5J)各体細胞系を表すhiPSCクローン2xO+OS+ONS+T−c10から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉;中央パネル、中胚葉;右パネル、外胚葉。
図5A〜5J。最小限の数の再プログラミング因子によるhiPSCクローンの誘導物を示す図である。(5A)OCT4、SOX2及びNANOGを、様々な形態でpCEP4にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。(5B)誘引から13日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のSSEA4及びTRA1−81フローサイトメトリープロファイル。(5C)ウェル当たり3つ及び9つの細胞での96ウェルプレートのウェル内のTRA1−81陽性hiPSCクローンの存在を表す効率ヒストグラム。(5D)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、2xO+OS+ONS+T−c7 p6;レーン2、2xO+OS+ONS+T−c10 p6;レーン3、2xO+ONS+T−c5 p5;レーン4、2xO+ONS+T−c9 p5;レーン5、2xO+OS+T−c7 p7;レーン6、2xO+OS+T−c9 p6;レーン7、非トランスフェクトFTC007;レーン8、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC;レーン9、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(5E)2xO+OS+Tから誘導されたクローン9の形態。(5F)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は10倍の倍率で撮影された。(5G)選択された遺伝子セットから誘導されたhiPSCクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(5H)誘引からおよそ72〜96時間後の選択されたhiPSCクローンの一定方向分化。(5I)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、Gバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。(5J)各体細胞系を表すhiPSCクローン2xO+OS+ONS+T−c10から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉;中央パネル、中胚葉;右パネル、外胚葉。
図5A〜5J。最小限の数の再プログラミング因子によるhiPSCクローンの誘導物を示す図である。(5A)OCT4、SOX2及びNANOGを、様々な形態でpCEP4にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。(5B)誘引から13日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のSSEA4及びTRA1−81フローサイトメトリープロファイル。(5C)ウェル当たり3つ及び9つの細胞での96ウェルプレートのウェル内のTRA1−81陽性hiPSCクローンの存在を表す効率ヒストグラム。(5D)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、2xO+OS+ONS+T−c7 p6;レーン2、2xO+OS+ONS+T−c10 p6;レーン3、2xO+ONS+T−c5 p5;レーン4、2xO+ONS+T−c9 p5;レーン5、2xO+OS+T−c7 p7;レーン6、2xO+OS+T−c9 p6;レーン7、非トランスフェクトFTC007;レーン8、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC;レーン9、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(5E)2xO+OS+Tから誘導されたクローン9の形態。(5F)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は10倍の倍率で撮影された。(5G)選択された遺伝子セットから誘導されたhiPSCクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(5H)誘引からおよそ72〜96時間後の選択されたhiPSCクローンの一定方向分化。(5I)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、Gバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。(5J)各体細胞系を表すhiPSCクローン2xO+OS+ONS+T−c10から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉;中央パネル、中胚葉;右パネル、外胚葉。
図5A〜5J。最小限の数の再プログラミング因子によるhiPSCクローンの誘導物を示す図である。(5A)OCT4、SOX2及びNANOGを、様々な形態でpCEP4にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。(5B)誘引から13日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のSSEA4及びTRA1−81フローサイトメトリープロファイル。(5C)ウェル当たり3つ及び9つの細胞での96ウェルプレートのウェル内のTRA1−81陽性hiPSCクローンの存在を表す効率ヒストグラム。(5D)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、2xO+OS+ONS+T−c7 p6;レーン2、2xO+OS+ONS+T−c10 p6;レーン3、2xO+ONS+T−c5 p5;レーン4、2xO+ONS+T−c9 p5;レーン5、2xO+OS+T−c7 p7;レーン6、2xO+OS+T−c9 p6;レーン7、非トランスフェクトFTC007;レーン8、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC;レーン9、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(5E)2xO+OS+Tから誘導されたクローン9の形態。(5F)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は10倍の倍率で撮影された。(5G)選択された遺伝子セットから誘導されたhiPSCクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(5H)誘引からおよそ72〜96時間後の選択されたhiPSCクローンの一定方向分化。(5I)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、Gバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。(5J)各体細胞系を表すhiPSCクローン2xO+OS+ONS+T−c10から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉;中央パネル、中胚葉;右パネル、外胚葉。
図5A〜5J。最小限の数の再プログラミング因子によるhiPSCクローンの誘導物を示す図である。(5A)OCT4、SOX2及びNANOGを、様々な形態でpCEP4にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。(5B)誘引から13日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のSSEA4及びTRA1−81フローサイトメトリープロファイル。(5C)ウェル当たり3つ及び9つの細胞での96ウェルプレートのウェル内のTRA1−81陽性hiPSCクローンの存在を表す効率ヒストグラム。(5D)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、2xO+OS+ONS+T−c7 p6;レーン2、2xO+OS+ONS+T−c10 p6;レーン3、2xO+ONS+T−c5 p5;レーン4、2xO+ONS+T−c9 p5;レーン5、2xO+OS+T−c7 p7;レーン6、2xO+OS+T−c9 p6;レーン7、非トランスフェクトFTC007;レーン8、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC;レーン9、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(5E)2xO+OS+Tから誘導されたクローン9の形態。(5F)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は10倍の倍率で撮影された。(5G)選択された遺伝子セットから誘導されたhiPSCクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(5H)誘引からおよそ72〜96時間後の選択されたhiPSCクローンの一定方向分化。(5I)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、Gバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。(5J)各体細胞系を表すhiPSCクローン2xO+OS+ONS+T−c10から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉;中央パネル、中胚葉;右パネル、外胚葉。
図5A〜5J。最小限の数の再プログラミング因子によるhiPSCクローンの誘導物を示す図である。(5A)OCT4、SOX2及びNANOGを、様々な形態でpCEP4にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。(5B)誘引から13日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のSSEA4及びTRA1−81フローサイトメトリープロファイル。(5C)ウェル当たり3つ及び9つの細胞での96ウェルプレートのウェル内のTRA1−81陽性hiPSCクローンの存在を表す効率ヒストグラム。(5D)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、2xO+OS+ONS+T−c7 p6;レーン2、2xO+OS+ONS+T−c10 p6;レーン3、2xO+ONS+T−c5 p5;レーン4、2xO+ONS+T−c9 p5;レーン5、2xO+OS+T−c7 p7;レーン6、2xO+OS+T−c9 p6;レーン7、非トランスフェクトFTC007;レーン8、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC;レーン9、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(5E)2xO+OS+Tから誘導されたクローン9の形態。(5F)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は10倍の倍率で撮影された。(5G)選択された遺伝子セットから誘導されたhiPSCクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(5H)誘引からおよそ72〜96時間後の選択されたhiPSCクローンの一定方向分化。(5I)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、Gバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。(5J)各体細胞系を表すhiPSCクローン2xO+OS+ONS+T−c10から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉;中央パネル、中胚葉;右パネル、外胚葉。
図5A〜5J。最小限の数の再プログラミング因子によるhiPSCクローンの誘導物を示す図である。(5A)OCT4、SOX2及びNANOGを、様々な形態でpCEP4にクローニングした。表は、ベクター系及び略語を示す。(5B)誘引から13日後における様々な遺伝子の組合せにより誘引された再プログラム反応速度論のSSEA4及びTRA1−81フローサイトメトリープロファイル。(5C)ウェル当たり3つ及び9つの細胞での96ウェルプレートのウェル内のTRA1−81陽性hiPSCクローンの存在を表す効率ヒストグラム。(5D)様々なhiPSCクローンから誘導されたエピソームDNAのPCR分析。レーン1、2xO+OS+ONS+T−c7 p6;レーン2、2xO+OS+ONS+T−c10 p6;レーン3、2xO+ONS+T−c5 p5;レーン4、2xO+ONS+T−c9 p5;レーン5、2xO+OS+T−c7 p7;レーン6、2xO+OS+T−c9 p6;レーン7、非トランスフェクトFTC007;レーン8、レンチウイルスコンストラクトを使用して生成されたhiPSC;レーン9、陽性対照として使用されたエピソームベクター。100ngのゲノムDNAの投入及び35PCRサイクルを、全てのセットに対して使用した。(5E)2xO+OS+Tから誘導されたクローン9の形態。(5F)OCT4、NANOG、TRA1−81及びTRA160の発現に関して免疫蛍光により検出された多能性マーカー。画像は10倍の倍率で撮影された。(5G)選択された遺伝子セットから誘導されたhiPSCクローンのフロープロファイル。上の行のプロファイルは、SSEA4/TRA1−81表面発現である。下の行のプロファイルは、OCT4/NANOG細胞内発現である。(5H)誘引からおよそ72〜96時間後の選択されたhiPSCクローンの一定方向分化。(5I)FF及び単一細胞培養において維持された様々なhiPSCクローンからの、Gバンド中期細胞の細胞遺伝学的分析。(5J)各体細胞系を表すhiPSCクローン2xO+OS+ONS+T−c10から誘導された奇形腫の組織学的断面。左パネル、内胚葉;中央パネル、中胚葉;右パネル、外胚葉。
図6A〜6B。FMMにおける最小限の因子のエピソーム誘引hiPSCの相対的遺伝子発現プロファイルを示す図である。従来通り維持されたhiPSC株、従来通り維持されたH1 hESC、及びFMM中で維持された様々な遺伝子の組合せを使用して誘導されたエピソームhiPSC株の、多能性(6A)及び分化(6B)遺伝子の相対的遺伝子発現レベルRQ)を示す、Fluidigm動的配列から得られたヒートマップの結果。各株の相対的遺伝子発現は、各ボックス内に記され、凡例(右下)にまとめられた3つの発現レベルに基づいて色分けされている。全てのセットは2回行われ、2つのハウスキーピング遺伝子(GAPDH及びHPRT1)の平均発現に対して正規化され、1×値を表す6つの対照従来株(MEF上のOSKhiPSC及びH1 hESC)の中央発現レベルが参照されている。
図6A〜6B。FMMにおける最小限の因子のエピソーム誘引hiPSCの相対的遺伝子発現プロファイルを示す図である。従来通り維持されたhiPSC株、従来通り維持されたH1 hESC、及びFMM中で維持された様々な遺伝子の組合せを使用して誘導されたエピソームhiPSC株の、多能性(6A)及び分化(6B)遺伝子の相対的遺伝子発現レベル(RQ)を示す、Fluidigm動的配列から得られたヒートマップの結果。各株の相対的遺伝子発現は、各ボックス内に記され、凡例(右下)にまとめられた3つの発現レベルに基づいて色分けされている。全てのセットは2回行われ、2つのハウスキーピング遺伝子(GAPDH及びHPRT1)の平均発現に対して正規化され、1×値を表す6つの対照従来株(MEF上のOSK hiPSC及びH1 hESC)の中央発現レベルが参照されている。
図7A〜7G。FMM維持hiPSCが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。(7A)合計339のプローブセットが、従来の培養とFMM培養との間で、2.5倍超、または2.5倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した339のプローブセットに対する階層的クラス多分析。(7B)従来の培養により(FMM培養と比較して)2.5倍以上上方制御された213のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(7C)基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リストリストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。7(D)ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、(7C)における遺伝子に対応する231のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。(7E)(7C)における遺伝子に対応するプローブセットのRMA(log2)強度。左パネルは、基底状態の39のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の188のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがX軸上にプロットされ、平均FMM/SMC4強度がY軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。(7F)従来の培養培地中で誘導及び培養されたhiPSCクローンと、Affymetrixプローブセットを使用してSMC4に適合されたその対応物との間の、X染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。XIST遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。(7G)5継代の間FMM中で維持された、または従来の培養に適合されたhiPSCクローン上のHEK27me3の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、H3K27me3染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、H3K27me3染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。FMM培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー=50μm。
図7A〜7G。FMM維持hiPSCが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。(7A)合計339のプローブセットが、従来の培養とFMM培養との間で、2.5倍超、または2.5倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した339のプローブセットに対する階層的クラス多分析。(7B)従来の培養により(FMM培養と比較して)2.5倍以上上方制御された213のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(7C)基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。7(D)ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、(7C)における遺伝子に対応する231のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。(7E)(7C)における遺伝子に対応するプローブセットのRMA(log2)強度。左パネルは、基底状態の39のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の188のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがX軸上にプロットされ、平均FMM/SMC4強度がY軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。(7F)従来の培養培地中で誘導及び培養されたhiPSCクローンと、Affymetrixプローブセットを使用してSMC4に適合されたその対応物との間の、X染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。XIST遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。(7G)5継代の間FMM中で維持された、または従来の培養に適合されたhiPSCクローン上のHEK27me3の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、H3K27me3染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、H3K27me3染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。FMM培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー=50μm。
図7A〜7G。FMM維持hiPSCが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。(7A)合計339のプローブセットが、従来の培養とFMM培養との間で、2.5倍超、または2.5倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した339のプローブセットに対する階層的クラス多分析。(7B)従来の培養により(FMM培養と比較して)2.5倍以上上方制御された213のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(7C)基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。7(D)ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、(7C)における遺伝子に対応する231のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。(7E)(7C)における遺伝子に対応するプローブセットのRMA(log2)強度。左パネルは、基底状態の39のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の188のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがX軸上にプロットされ、平均FMM/SMC4強度がY軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。(7F)従来の培養培地中で誘導及び培養されたhiPSCクローンと、Affymetrixプローブセットを使用してSMC4に適合されたその対応物との間の、X染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。XIST遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。(7G)5継代の間FMM中で維持された、または従来の培養に適合されたhiPSCクローン上のHEK27me3の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、H3K27me3染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、H3K27me3染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。FMM培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー=50μm。
図7A〜7G。FMM維持hiPSCが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。(7A)合計339のプローブセットが、従来の培養とFMM培養との間で、2.5倍超、または2.5倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した339のプローブセットに対する階層的クラス多分析。(7B)従来の培養により(FMM培養と比較して)2.5倍以上上方制御された213のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(7C)基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。7(D)ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、(7C)における遺伝子に対応する231のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。(7E)(7C)における遺伝子に対応するプローブセットのRMA(log2)強度。左パネルは、基底状態の39のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の188のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがX軸上にプロットされ、平均FMM/SMC4強度がY軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。(7F)従来の培養培地中で誘導及び培養されたhiPSCクローンと、Affymetrixプローブセットを使用してSMC4に適合されたその対応物との間の、X染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。XIST遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。(7G)5継代の間FMM中で維持された、または従来の培養に適合されたhiPSCクローン上のHEK27me3の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、H3K27me3染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、H3K27me3染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。FMM培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー=50μm。
図7A〜7G。FMM維持hiPSCが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。(7A)合計339のプローブセットが、従来の培養とFMM培養との間で、2.5倍超、または2.5倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した339のプローブセットに対する階層的クラス多分析。(7B)従来の培養により(FMM培養と比較して)2.5倍以上上方制御された213のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(7C)基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。7(D)ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、(7C)における遺伝子に対応する231のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。(7E)(7C)における遺伝子に対応するプローブセットのRMA(log2)強度。左パネルは、基底状態の39のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の188のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがX軸上にプロットされ、平均FMM/SMC4強度がY軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。(7F)従来の培養培地中で誘導及び培養されたhiPSCクローンと、Affymetrixプローブセットを使用してSMC4に適合されたその対応物との間の、X染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。XIST遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。(7G)5継代の間FMM中で維持された、または従来の培養に適合されたhiPSCクローン上のHEK27me3の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、H3K27me3染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、H3K27me3染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。FMM培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー=50μm。
図7A〜7G。FMM維持hiPSCが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。(7A)合計339のプローブセットが、従来の培養とFMM培養との間で、2.5倍超、または2.5倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した339のプローブセットに対する階層的クラス多分析。(7B)従来の培養により(FMM培養と比較して)2.5倍以上上方制御された213のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(7C)基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。7(D)ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、(7C)における遺伝子に対応する231のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。(7E)(7C)における遺伝子に対応するプローブセットのRMA(log2)強度。左パネルは、基底状態の39のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の188のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがX軸上にプロットされ、平均FMM/SMC4強度がY軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。(7F)従来の培養培地中で誘導及び培養されたhiPSCクローンと、Affymetrixプローブセットを使用してSMC4に適合されたその対応物との間の、X染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。XIST遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。(7G)5継代の間FMM中で維持された、または従来の培養に適合されたhiPSCクローン上のHEK27me3の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、H3K27me3染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、H3K27me3染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。FMM培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー=50μm。
図7A〜7G。FMM維持hiPSCが、分化遺伝子の低減された発現を有し、基底状態を呈していることを示す図である。(7A)合計339のプローブセットが、従来の培養とFMM培養との間で、2.5倍超、または2.5倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した339のプローブセットに対する階層的クラス多分析。(7B)従来の培養により(FMM培養と比較して)2.5倍以上上方制御された213のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(7C)基底または準安定多能性状態の代表となる遺伝子リスト。リストは、文章中で述べられた参考文献から得られた。7(D)ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した、(7C)における遺伝子に対応する231のプローブセットに対する階層的クラスタ分析。(7E)(7C)における遺伝子に対応するプローブセットのRMA(log2)強度。左パネルは、基底状態の39のプローブセットを表し、右パネルは準安定状態の188のプローブセットを表す。平均的な従来の培養強度レベルがX軸上にプロットされ、平均FMM/SMC4強度がY軸上にプロットされるが、黒線は等しい発現を示す。(7F)従来の培養培地中で誘導及び培養されたhiPSCクローンと、Affymetrixプローブセットを使用してSMC4に適合されたその対応物との間の、X染色体に位置する遺伝子の遺伝子発現比較。XIST遺伝子発現に関連するプローブセットが強調表示されている。(7G)5継代の間FMM中で維持された、または従来の培養に適合されたhiPSCクローン上のHEK27me3の代表的画像。左パネル内の点線矢印は、H3K27me3染色のない代表的な核を指し、一方右パネル内の実線矢印は、H3K27me3染色に対し陽性の核を指している。染色陽性核のパーセンテージは、各パネルの左下隅に示されている。FMM培養細胞は、より大きな核を有する。スケールバー=50μm。
図8A〜8D。FRM及びFMMによるエピソーム誘引再プログラムを示す図である。(8A)再プログラムプールの10日目のSSEA4及びTRA1−81フロープロファイル。(8B)再プログラムの間に観察される典型的コロニーの代表的形態。画像は、トランスフェクションから13日後に撮影された。(8C)最初の14日間FRM中に維持されたエピソーム再プログラム線維芽細胞を分割し、FRM中に維持するか、またはFMMに切り替えた。次いで、トランスフェクションから21日後に、再プログラム培養物をSSEA4/TRA1−81/CD30にソーティングし、さらに10日間FRMまたはFMM中に維持してから分析した。(8D)FRMまたはFMM中での代表的培養物の形態及びフロープロファイル。白矢印は、未分化及び分化集団の混合物からなる培養物中の分化細胞の領域を指す。黒矢印は、ほぼ未分化の集団の明確な縁を指す。下パネルは、代表的なフロープロファイルである。FSC前方側方散乱
図8A〜8D。FRM及びFMMによるエピソーム誘引再プログラムを示す図である。(8A)再プログラムプールの10日目のSSEA4及びTRA1−81フロープロファイル。(8B)再プログラムの間に観察される典型的コロニーの代表的形態。画像は、トランスフェクションから13日後に撮影された。(8C)最初の14日間FRM中に維持されたエピソーム再プログラム線維芽細胞を分割し、FRM中に維持するか、またはFMMに切り替えた。次いで、トランスフェクションから21日後に、再プログラム培養物をSSEA4/TRA1−81/CD30にソーティングし、さらに10日間FRMまたはFMM中に維持してから分析した。(8D)FRMまたはFMM中での代表的培養物の形態及びフロープロファイル。白矢印は、未分化及び分化集団の混合物からなる培養物中の分化細胞の領域を指す。黒矢印は、ほぼ未分化の集団の明確な縁を指す。下パネルは、代表的なフロープロファイルである。FSC;前方側方散乱。
図8A〜8D。FRM及びFMMによるエピソーム誘引再プログラムを示す図である。(8A)再プログラムプールの10日目のSSEA4及びTRA1−81フロープロファイル。(8B)再プログラムの間に観察される典型的コロニーの代表的形態。画像は、トランスフェクションから13日後に撮影された。(8C)最初の14日間FRM中に維持されたエピソーム再プログラム線維芽細胞を分割し、FRM中に維持するか、またはFMMに切り替えた。次いで、トランスフェクションから21日後に、再プログラム培養物をSSEA4/TRA1−81/CD30にソーティングし、さらに10日間FRMまたはFMM中に維持してから分析した。(8D)FRMまたはFMM中での代表的培養物の形態及びフロープロファイル。白矢印は、未分化及び分化集団の混合物からなる培養物中の分化細胞の領域を指す。黒矢印は、ほぼ未分化の集団の明確な縁を指す。下パネルは、代表的なフロープロファイルである。FSC;前方側方散乱。
図8A〜8D。FRM及びFMMによるエピソーム誘引再プログラムを示す図である。(8A)再プログラムプールの10日目のSSEA4及びTRA1−81フロープロファイル。(8B)再プログラムの間に観察される典型的コロニーの代表的形態。画像は、トランスフェクションから13日後に撮影された。(8C)最初の14日間FRM中に維持されたエピソーム再プログラム線維芽細胞を分割し、FRM中に維持するか、またはFMMに切り替えた。次いで、トランスフェクションから21日後に、再プログラム培養物をSSEA4/TRA1−81/CD30にソーティングし、さらに10日間FRMまたはFMM中に維持してから分析した。(8D)FRMまたはFMM中での代表的培養物の形態及びフロープロファイル。白矢印は、未分化及び分化集団の混合物からなる培養物中の分化細胞の領域を指す。黒矢印は、ほぼ未分化の集団の明確な縁を指す。下パネルは、代表的なフロープロファイルである。FSC;前方側方散乱。
図9A〜9B。様々な親株の再プログラムを示す図である。(9A)この試験において使用された出発細胞株の要約表である。各株に関連した特定情報に加えて、エピソームトランスフェクション後のソーティング時点での陽性SSEA4/TRA1−81/CD30集団のパーセントが示されている。(9B)高CD34臍帯血細胞のソーティング及び培養を示す図である。事前にバンク内で維持された0.5mlの体積臍帯血を使用して、65,000 CD34+CD45+Lin−細胞を抽出し、これをエピソームトランスフェクションの前に懸濁液中で6日間培養した。
図9A〜9B。様々な親株の再プログラムを示す図である。(9A)この試験において使用された出発細胞株の要約表である。各株に関連した特定情報に加えて、エピソームトランスフェクション後のソーティング時点での陽性SSEA4/TRA1−81/CD30集団のパーセントが示されている。(9B)高CD34臍帯血細胞のソーティング及び培養を示す図である。事前にバンク内で維持された0.5mlの体積の臍帯血を使用して、65,000 CD34+CD45+Lin−細胞を抽出し、これをエピソームトランスフェクションの前に懸濁液中で6日間培養した。
図10A〜10G。再プログラム及び維持プロセスの間のhiPSCの特性決定を示す図である。(10A)単一細胞96ウェルプレートソーティングから3日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、400μmを示す。(10B)様々な出発細胞からのソーティングから7〜9日後の単一細胞誘導hiPSC様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、1000μmを示す。(10C)96ウェルプレートにおけるhiPSC様コロニーのNANOG発現の免疫細胞化学分析。(10D)再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたFTC007の、16日目のフロープロファイル分析。(10E)明視野像、(10F)OCT4及びNANOGの免疫蛍光、または(10G)マトリゲル上で継続的に、または5継代ビトロネクチンの間FMM中で維持されたFTC016−c28のSSEA4及びTRA1−81のフローサイトメトリー分析。
図10A〜10G。再プログラム及び維持プロセスの間のhiPSCの特性決定を示す図である。(10A)単一細胞96ウェルプレートソーティングから3日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、400μmを示す。(10B)様々な出発細胞からのソーティングから7〜9日後の単一細胞誘導hiPSC様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、1000μmを示す。(10C)96ウェルプレートにおけるhiPSC様コロニーのNANOG発現の免疫細胞化学分析。(10D)再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたFTC007の、16日目のフロープロファイル分析。(10E)明視野像、(10F)OCT4及びNANOGの免疫蛍光、または(10G)マトリゲル上で継続的に、または5継代ビトロネクチンの間FMM中で維持されたFTC016−c28のSSEA4及びTRA1−81のフローサイトメトリー分析。
図10A〜10G。再プログラム及び維持プロセスの間のhiPSCの特性決定を示す図である。(10A)単一細胞96ウェルプレートソーティングから3日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、400μmを示す。(10B)様々な出発細胞からのソーティングから7〜9日後の単一細胞誘導hiPSC様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、1000μmを示す。(10C)96ウェルプレートにおけるhiPSC様コロニーのNANOG発現の免疫細胞化学分析。(10D)再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたFTC007の、16日目のフロープロファイル分析。(10E)明視野像、(10F)OCT4及びNANOGの免疫蛍光、または(10G)マトリゲル上で継続的に、または5継代ビトロネクチンの間FMM中で維持されたFTC016−c28のSSEA4及びTRA1−81のフローサイトメトリー分析。
図10A〜10G。再プログラム及び維持プロセスの間のhiPSCの特性決定を示す図である。(10A)単一細胞96ウェルプレートソーティングから3日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、400μmを示す。(10B)様々な出発細胞からのソーティングから7〜9日後の単一細胞誘導hiPSC様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、1000μmを示す。(10C)96ウェルプレートにおけるhiPSC様コロニーのNANOG発現の免疫細胞化学分析。(10D)再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたFTC007の、16日目のフロープロファイル分析。(10E)明視野像、(10F)OCT4及びNANOGの免疫蛍光、または(10G)マトリゲル上で継続的に、または5継代ビトロネクチンの間FMM中で維持されたFTC016−c28のSSEA4及びTRA1−81のフローサイトメトリー分析。
図10A〜10G。再プログラム及び維持プロセスの間のhiPSCの特性決定を示す図である。(10A)単一細胞96ウェルプレートソーティングから3日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、400μmを示す。(10B)様々な出発細胞からのソーティングから7〜9日後の単一細胞誘導hiPSC様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、1000μmを示す。(10C)96ウェルプレートにおけるhiPSC様コロニーのNANOG発現の免疫細胞化学分析。(10D)再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたFTC007の、16日目のフロープロファイル分析。(10E)明視野像、(10F)OCT4及びNANOGの免疫蛍光、または(10G)マトリゲル上で継続的に、または5継代ビトロネクチンの間FMM中で維持されたFTC016−c28のSSEA4及びTRA1−81のフローサイトメトリー分析。
図10A〜10G。再プログラム及び維持プロセスの間のhiPSCの特性決定を示す図である。(10A)単一細胞96ウェルプレートソーティングから3日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、400μmを示す。(10B)様々な出発細胞からのソーティングから7〜9日後の単一細胞誘導hiPSC様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、1000μmを示す。(10C)96ウェルプレートにおけるhiPSC様コロニーのNANOG発現の免疫細胞化学分析。(10D)再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたFTC007の、16日目のフロープロファイル分析。(10E)明視野像、(10F)OCT4及びNANOGの免疫蛍光、または(10G)マトリゲル上で継続的に、または5継代ビトロネクチンの間FMM中で維持されたFTC016−c28のSSEA4及びTRA1−81のフローサイトメトリー分析。
図10A〜10G。再プログラム及び維持プロセスの間のhiPSCの特性決定を示す図である。(10A)単一細胞96ウェルプレートソーティングから3日後の典型的なコロニー形態。スケールバーは、400μmを示す。(10B)様々な出発細胞からのソーティングから7〜9日後の単一細胞誘導hiPSC様コロニーの代表的な形態。スケールバーは、1000μmを示す。(10C)96ウェルプレートにおけるhiPSC様コロニーのNANOG発現の免疫細胞化学分析。(10D)再プログラムするように誘引され、マトリゲルまたはビトロネクチンコーティング培養プレート上で維持されたFTC007の、16日目のフロープロファイル分析。(10E)明視野像、(10F)OCT4及びNANOGの免疫蛍光、または(10G)マトリゲル上で継続的に、または5継代ビトロネクチンの間FMM中で維持されたFTC016−c28のSSEA4及びTRA1−81のフローサイトメトリー分析。
図11A〜11C。FMM培養基盤による最小限の遺伝子再プログラムの例を示す図である。(11A)ハイグロマイシン選択カセットを含有するエピソームコンストラクトによるトランスフェクションから2〜5日後の、ハイグロマイシンで処理された細胞の形態。(11B)再プログラムプールを、より長期間維持し、トランスフェクションから16日後にプロファイリングした。(11C)マトリゲルまたはビトロネクチン上で維持された培養物の外観
図11A〜11C。FMM培養基盤による最小限の遺伝子再プログラムの例を示す図である。(11A)ハイグロマイシン選択カセットを含有するエピソームコンストラクトによるトランスフェクションから2〜5日後の、ハイグロマイシンで処理された細胞の形態。(11B)再プログラムプールを、より長期間維持し、トランスフェクションから16日後にプロファイリングした。(11C)マトリゲルまたはビトロネクチン上で維持された培養物の外観。
図11A〜11C。FMM培養基盤による最小限の遺伝子再プログラムの例を示す図である。(11A)ハイグロマイシン選択カセットを含有するエピソームコンストラクトによるトランスフェクションから2〜5日後の、ハイグロマイシンで処理された細胞の形態。(11B)再プログラムプールを、より長期間維持し、トランスフェクションから16日後にプロファイリングした。(11C)マトリゲルまたはビトロネクチン上で維持された培養物の外観。
図12A〜12E。複数の条件下で培養されたhiPSCの特性を示す図である。(12A)レンチウイルス誘導及びSMC4維持FTi111は、多能性及び維持されたゲノム完全性特質を示した。(12B)FTi111 p43の解凍戦略の描写。単一ウイルスを、示されるような4つの培養環境内に解凍した。フィーダー細胞上でのチアゾビビンが添加された従来の培養(これは、フィーダー細胞の存在下でチアゾビビンを含まない従来の培養物に移行され、塊として継代された)を除いて、生残培養物をそれぞれの培養物中で継代した。(12C)解凍後の様々な培養物中の回復細胞の形態。フィーダー細胞の存在下でのチアゾビビンを含まない従来の培養においては、生残細胞は特定されなかった。(12D)解凍後3継代目の培養セットの形態。より大きなコロニー形態は、従来の培養に関連していた。スケールバーは、1000μmである。(12E)各培養セットの内因性多能性遺伝子発現のqRT−PCR分析。データは、GAPDHに対して、及びH1 hESCと比較して正規化された。
図12A〜12E。複数の条件下で培養されたhiPSCの特性を示す図である。(12A)レンチウイルス誘導及びSMC4維持FTi111は、多能性及び維持されたゲノム完全性の特質を示した。(12B)FTi111 p43の解凍戦略の描写。単一ウイルスを、示されるような4つの培養環境内に解凍した。フィーダー細胞上でのチアゾビビンが添加された従来の培養(これは、フィーダー細胞の存在下でチアゾビビンを含まない従来の培養物に移行され、塊として継代された)を除いて、生残培養物をそれぞれの培養物中で継代した。(12C)解凍後の様々な培養物中の回復細胞の形態。フィーダー細胞の存在下でのチアゾビビンを含まない従来の培養においては、生残細胞は特定されなかった。(12D)解凍後3継代目の培養セットの形態。より大きなコロニー形態は、従来の培養に関連していた。スケールバーは、1000μmである。(12E)各培養セットの内因性多能性遺伝子発現のqRT−PCR分析。データは、GAPDHに対して、及びH1 hESCと比較して正規化された。
図12A〜12E。複数の条件下で培養されたhiPSCの特性を示す図である。(12A)レンチウイルス誘導及びSMC4維持FTi111は、多能性及び維持されたゲノム完全性の特質を示した。(12B)FTi111 p43の解凍戦略の描写。単一ウイルスを、示されるような4つの培養環境内に解凍した。フィーダー細胞上でのチアゾビビンが添加された従来の培養(これは、フィーダー細胞の存在下でチアゾビビンを含まない従来の培養物に移行され、塊として継代された)を除いて、生残培養物をそれぞれの培養物中で継代した。(12C)解凍後の様々な培養物中の回復細胞の形態。フィーダー細胞の存在下でのチアゾビビンを含まない従来の培養においては、生残細胞は特定されなかった。(12D)解凍後3継代目の培養セットの形態。より大きなコロニー形態は、従来の培養に関連していた。スケールバーは、1000μmである。(12E)各培養セットの内因性多能性遺伝子発現のqRT−PCR分析。データは、GAPDHに対して、及びH1 hESCと比較して正規化された。
図12A〜12E。複数の条件下で培養されたhiPSCの特性を示す図である。(12A)レンチウイルス誘導及びSMC4維持FTi111は、多能性及び維持されたゲノム完全性の特質を示した。(12B)FTi111 p43の解凍戦略の描写。単一ウイルスを、示されるような4つの培養環境内に解凍した。フィーダー細胞上でのチアゾビビンが添加された従来の培養(これは、フィーダー細胞の存在下でチアゾビビンを含まない従来の培養物に移行され、塊として継代された)を除いて、生残培養物をそれぞれの培養物中で継代した。(12C)解凍後の様々な培養物中の回復細胞の形態。フィーダー細胞の存在下でのチアゾビビンを含まない従来の培養においては、生残細胞は特定されなかった。(12D)解凍後3継代目の培養セットの形態。より大きなコロニー形態は、従来の培養に関連していた。スケールバーは、1000μmである。(12E)各培養セットの内因性多能性遺伝子発現のqRT−PCR分析。データは、GAPDHに対して、及びH1 hESCと比較して正規化された。
図12A〜12E。複数の条件下で培養されたhiPSCの特性を示す図である。(12A)レンチウイルス誘導及びSMC4維持FTi111は、多能性及び維持されたゲノム完全性の特質を示した。(12B)FTi111 p43の解凍戦略の描写。単一ウイルスを、示されるような4つの培養環境内に解凍した。フィーダー細胞上でのチアゾビビンが添加された従来の培養(これは、フィーダー細胞の存在下でチアゾビビンを含まない従来の培養物に移行され、塊として継代された)を除いて、生残培養物をそれぞれの培養物中で継代した。(12C)解凍後の様々な培養物中の回復細胞の形態。フィーダー細胞の存在下でのチアゾビビンを含まない従来の培養においては、生残細胞は特定されなかった。(12D)解凍後3継代目の培養セットの形態。より大きなコロニー形態は、従来の培養に関連していた。スケールバーは、1000μmである。(12E)各培養セットの内因性多能性遺伝子発現のqRT−PCR分析。データは、GAPDHに対して、及びH1 hESCと比較して正規化された。
図13A〜13E。様々な条件下で培養されたhiPSCの遺伝子発現プロファイルの遺伝子オントロジーを示す図である。(13A)包括的遺伝子発現試験において説明される各株の誘導及び維持を説明する表。(13B)合計300のプローブセットが、従来の培養条件と小分子(FMM及びSMC4)培養条件との間で、2.5倍超、または2.5倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した300のプローブセットに対する階層的クラス多分析。(13C)従来の培養により(小分子培養と比較して)2.5倍以上上方制御された133のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(13D)小分子培養により(従来の培養と比較して)2.5倍以上上方制御された167のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(13E)FMM培養により(従来の培養と比較して)2.5倍以上上方制御された126のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析。
図13A〜13E。様々な条件下で培養されたhiPSCの遺伝子発現プロファイルの遺伝子オントロジーを示す図である。(13A)包括的遺伝子発現試験において説明される各株の誘導及び維持を説明する表。(13B)合計300のプローブセットが、従来の培養条件と小分子(FMM及びSMC4)培養条件との間で、2.5倍超、または2.5倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した300のプローブセットに対する階層的クラス多分析。(13C)従来の培養により(小分子培養と比較して)2.5倍以上上方制御された133のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(13D)小分子培養により(従来の培養と比較して)2.5倍以上上方制御された167のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(13E)FMM培養により(従来の培養と比較して)2.5倍以上上方制御された126のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析。
図13A〜13E。様々な条件下で培養されたhiPSCの遺伝子発現プロファイルの遺伝子オントロジーを示す図である。(13A)包括的遺伝子発現試験において説明される各株の誘導及び維持を説明する表。(13B)合計300のプローブセットが、従来の培養条件と小分子(FMM及びSMC4)培養条件との間で、2.5倍超、または2.5倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した300のプローブセットに対する階層的クラス多分析。(13C)従来の培養により(小分子培養と比較して)2.5倍以上上方制御された133のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(13D)小分子培養により(従来の培養と比較して)2.5倍以上上方制御された167のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(13E)FMM培養により(従来の培養と比較して)2.5倍以上上方制御された126のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析。
図13A〜13E。様々な条件下で培養されたhiPSCの遺伝子発現プロファイルの遺伝子オントロジーを示す図である。(13A)包括的遺伝子発現試験において説明される各株の誘導及び維持を説明する表。(13B)合計300のプローブセットが、従来の培養条件と小分子(FMM及びSMC4)培養条件との間で、2.5倍超、または2.5倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した300のプローブセットに対する階層的クラス多分析。(13C)従来の培養により(小分子培養と比較して)2.5倍以上上方制御された133のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(13D)小分子培養により(従来の培養と比較して)2.5倍以上上方制御された167のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(13E)FMM培養により(従来の培養と比較して)2.5倍以上上方制御された126のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析。
図13A〜13E。様々な条件下で培養されたhiPSCの遺伝子発現プロファイルの遺伝子オントロジーを示す図である。(13A)包括的遺伝子発現試験において説明される各株の誘導及び維持を説明する表。(13B)合計300のプローブセットが、従来の培養条件と小分子(FMM及びSMC4)培養条件との間で、2.5倍超、または2.5倍未満だけ差別的に発現した。ユークリッド距離測定に基づく完全連結法を使用した300のプローブセットに対する階層的クラス多分析。(13C)従来の培養により(小分子培養と比較して)2.5倍以上上方制御された133のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(13D)小分子培養により(従来の培養と比較して)2.5倍以上上方制御された167のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析(D.A.V.I.D.)。(13E)FMM培養により(従来の培養と比較して)2.5倍以上上方制御された126のプローブセットの遺伝子オントロジー生物学的プロセス濃縮分析。
図14A〜14F。再プログラムに使用されたレンチウイルスコンストラクト(14A〜14B)及びエピソームコンストラクト(14C〜14F)の例を示す、クローニングマップを示す図である。レンチウイルスコンストラクトは、EF1αプロモーター、及び導入遺伝子のCRE媒介切断のためのLOXP部位を含む。エピソームコンストラクトもまた、EF1αプロモーターを含む。
図14A〜14F。再プログラムに使用されたレンチウイルスコンストラクト(14A〜14B)及びエピソームコンストラクト(14C〜14F)の例を示す、クローニングマップを示す図である。レンチウイルスコンストラクトは、EF1αプロモーター、及び導入遺伝子のCRE媒介切断のためのLOXP部位を含む。エピソームコンストラクトもまた、EF1αプロモーターを含む。
図14A〜14F。再プログラムに使用されたレンチウイルスコンストラクト(14A〜14B)及びエピソームコンストラクト(14C〜14F)の例を示す、クローニングマップを示す図である。レンチウイルスコンストラクトは、EF1αプロモーター、及び導入遺伝子のCRE媒介切断のためのLOXP部位を含む。エピソームコンストラクトもまた、EF1αプロモーターを含む。
図14A〜14F。再プログラムに使用されたレンチウイルスコンストラクト(14A〜14B)及びエピソームコンストラクト(14C〜14F)の例を示す、クローニングマップを示す図である。レンチウイルスコンストラクトは、EF1αプロモーター、及び導入遺伝子のCRE媒介切断のためのLOXP部位を含む。エピソームコンストラクトもまた、EF1αプロモーターを含む。
図14A〜14F。再プログラムに使用されたレンチウイルスコンストラクト(14A〜14B)及びエピソームコンストラクト(14C〜14F)の例を示す、クローニングマップを示す図である。レンチウイルスコンストラクトは、EF1αプロモーター、及び導入遺伝子のCRE媒介切断のためのLOXP部位を含む。エピソームコンストラクトもまた、EF1αプロモーターを含む。
図14A〜14F。再プログラムに使用されたレンチウイルスコンストラクト(14A〜14B)及びエピソームコンストラクト(14C〜14F)の例を示す、クローニングマップを示す図である。レンチウイルスコンストラクトは、EF1αプロモーター、及び導入遺伝子のCRE媒介切断のためのLOXP部位を含む。エピソームコンストラクトもまた、EF1αプロモーターを含む。
図15A〜15C。8〜15日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析を示す図である。OCT4、ECAT1、及びUTF1を含むレンチウイルス媒介再プログラミング因子の様々な組み合わせで、ヒト線維芽細胞を誘引した。
図15A〜15C。8〜15日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析を示す図である。OCT4、ECAT1、及びUTF1を含むレンチウイルス媒介再プログラミング因子の様々な組み合わせで、ヒト線維芽細胞を誘引した。
図15A〜15C。8〜15日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析を示す図である。OCT4、ECAT1、及びUTF1を含むレンチウイルス媒介再プログラミング因子の様々な組み合わせで、ヒト線維芽細胞を誘引した。
図16A〜16D。21〜27日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析及びiPSC形態の特性を示す図である。データは、固有の再プログラムの組み合わせを使用して、SSEA4+/TRA181+hiPSCを誘導することができることを示している。
図16A〜16D。21〜27日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析及びiPSC形態の特性を示す図である。データは、固有の再プログラムの組み合わせを使用して、SSEA4+/TRA181+hiPSCを誘導することができることを示している。
図16A〜16D。21〜27日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析及びiPSC形態の特性を示す図である。データは、固有の再プログラムの組み合わせを使用して、SSEA4+/TRA181+hiPSCを誘導することができることを示している。
図16A〜16D。21〜27日目の様々な再プログラミング因子の組み合わせに対する代表的なフロー分析及びiPSC形態の特性を示す図である。データは、固有の再プログラムの組み合わせを使用して、SSEA4+/TRA181+hiPSCを誘導することができることを示している。
図17A〜17B。フロー分析(SSEA4+/TRA181+及びCD30+集団)ならびにiPSC形態の特性により示されるような、極めて向上したレンチウイルス再プログラム効率を示す図である。ヒト線維芽細胞を、OCT4、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びNANOGで再プログラムした。細胞は、FRMを使用して再プログラムし、FMM中で維持した。
図17A〜17B。フロー分析(SSEA4+/TRA181+及びCD30+集団)ならびにiPSC形態の特性により示されるような、極めて向上したレンチウイルス再プログラム効率を示す図である。ヒト線維芽細胞を、OCT4、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びNANOGで再プログラムした。細胞は、FRMを使用して再プログラムし、FMM中で維持した。
図18A〜18D。96ウェルソーティング後7〜9継代後の樹立された4つのiPSCクローンの代表的フロー分析及び位相像を示す図である。クローンは、FRMを用いてレンチウイルス再プログラミング因子(OCT4、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びNANOG)により生成し、FMM中で維持した。高いSSEA4+/TRA181+を発現する集団は、多能性を示す。
図18A〜18D。96ウェルソーティング後7〜9継代後の樹立された4つのiPSCクローンの代表的フロー分析及び位相像を示す図である。クローンは、FRMを用いてレンチウイルス再プログラミング因子(OCT4、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びNANOG)により生成し、FMM中で維持した。高いSSEA4+/TRA181+を発現する集団は、多能性を示す。
図18A〜18D。96ウェルソーティング後7〜9継代後の樹立された4つのiPSCクローンの代表的フロー分析及び位相像を示す図である。クローンは、FRMを用いてレンチウイルス再プログラミング因子(OCT4、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びNANOG)により生成し、FMM中で維持した。高いSSEA4+/TRA181+を発現する集団は、多能性を示す。
図18A〜18D。96ウェルソーティング後7〜9継代後の樹立された4つのiPSCクローンの代表的フロー分析及び位相像を示す図である。クローンは、FRMを用いてレンチウイルス再プログラミング因子(OCT4、ECAT1、UTF1、ESRRB、及びNANOG)により生成し、FMM中で維持した。高いSSEA4+/TRA181+を発現する集団は、多能性を示す。
図19A〜19B。レンチウイルス再プログラミング因子OCT4、ECAT1、UTF1、NANOG及びESRRBにより再プログラムされたヒト線維芽細胞における、OCT4及びNANOGの発現の代表的フロー分析を示す図である。クローンは、FRMを使用して再プログラムし、FMM中で維持した。高いOCT4+/NANOG+を発現する集団は、多能性を示す。
図19A〜19B。レンチウイルス再プログラミング因子OCT4、ECAT1、UTF1、NANOG及びESRRBにより再プログラムされたヒト線維芽細胞における、OCT4及びNANOGの発現の代表的フロー分析を示す図である。クローンは、FRMを使用して再プログラムし、FMM中で維持した。高いOCT4+/NANOG+を発現する集団は、多能性を示す。
レンチウイルス再プログラミング因子OCT4、ECAT1、UTF1、NANOG及びESRRBにより再プログラムされたヒト線維芽細胞から誘導されたhIPSCクローンの核型分析を示す図である。クローンは、FRMを使用して再プログラムし、FMM中で維持した。クローンは、正常男性核型を示す。
レンチウイルス再プログラミング因子OCT4、ECAT1、UTF1、NANOG及びESRRBにより再プログラムされたヒト線維芽細胞から誘導されたhIPSCクローンの核型分析を示す図である。クローンは、FRMを使用して再プログラムし、FMM中で維持した。クローンは、正常男性核型を示す。
レンチウイルス再プログラミング因子OCT4、ECAT1、UTF1、NANOG及びESRRBにより再プログラムされたヒト線維芽細胞から誘導されたhIPSCクローンの核型分析を示す図である。クローンは、FRMを使用して再プログラムし、FMM中で維持した。クローンは、正常男性核型を示す。
再プログラミング因子の組み合わせOCT4/NANOG/SOX2/LARGE Tと比較した、再プログラミング因子の組み合わせOCT4/ESRRB/NANOG/ECAT1/UTF1の96ウェルプレートソーティング効率を示す図である。
図22A〜22B。(22A)4、6及び11日目のOCT4−P2A−OCT4/NANOG−P2A−ESRRB−T2A−LIN28/ECAT1−T2A−UTF1、ならびに(22B)7日目の2つのウェル、及び10日目の1つのウェルにおけるOCT4−P2A−ESRRB/OCT4−P2A−NANOG/ECAT1−T2A−UTF1で再プログラムされた細胞に対する、96ウェルからの拡大中のコロニーの画像を示す図である。
図22A〜22B。(22A)4、6及び11日目のOCT4−P2A−OCT4/NANOG−P2A−ESRRB−T2A−LIN28/ECAT1−T2A−UTF1、ならびに(22B)7日目の2つのウェル、及び10日目の1つのウェルにおけるOCT4−P2A−ESRRB/OCT4−P2A−NANOG/ECAT1−T2A−UTF1で再プログラムされた細胞に対する、96ウェルからの拡大中のコロニーの画像を示す図である。
図23A〜23C。(23A)再プログラミング因子の化学量論、及び異所性OCT4発現による細胞の選択のための遺伝子マーカーの使用の効果を示すフロー分析、(23B)OCT4の選択のないエピソームOCT4−P2A−NANOG−T2A−SOX2/SV40ラージT抗原により再プログラムされたヒト線維芽細胞のフロー分析、ならびに(23C)エピソームOCT4−P2A−NANOG−T2A−SOX2/SV40ラージT抗原/OCT2−P2A−OCT4−ピューロマイシンにより再プログラムされたヒト線維芽細胞のフロー分析の結果の要約を示す図である。
図23A〜23C。(23A)再プログラミング因子の化学量論、及び異所性OCT4発現による細胞の選択のための遺伝子マーカーの使用の効果を示すフロー分析、(23B)OCT4の選択のないエピソームOCT4−P2A−NANOG−T2A−SOX2/SV40ラージT抗原により再プログラムされたヒト線維芽細胞のフロー分析、ならびに(23C)エピソームOCT4−P2A−NANOG−T2A−SOX2/SV40ラージT抗原/OCT2−P2A−OCT4−ピューロマイシンにより再プログラムされたヒト線維芽細胞のフロー分析の結果の要約を示す図である。
図23A〜23C。(23A)再プログラミング因子の化学量論、及び異所性OCT4発現による細胞の選択のための遺伝子マーカーの使用の効果を示すフロー分析、(23B)OCT4の選択のないエピソームOCT4−P2A−NANOG−T2A−SOX2/SV40ラージT抗原により再プログラムされたヒト線維芽細胞のフロー分析、ならびに(23C)エピソームOCT4−P2A−NANOG−T2A−SOX2/SV40ラージT抗原/OCT2−P2A−OCT4−ピューロマイシンにより再プログラムされたヒト線維芽細胞のフロー分析の結果の要約を示す図である。
青色のDAPIにより多能性マーカーOCT4(緑)及びTRA181(赤)に関して染色された誘導iPSCクローンの免疫蛍光分析を示す図である。
CRE媒介切断後のSSEA4+/TRA181+/CD30+96ウェルプレートソーティングクローンの画像を示す図である。コロニーは、元々ヒト線維芽細胞から誘導され、レンチウイルス因子OCT4、ECAT1、UTF1、NANOG、及びESRRBで再プログラムされ、次いで導入遺伝子のために切断されたiPSCクローンからソーティングされた。ソーティングされたコロニーは、iPSC表現型を示す。

0182

A.概要
多能性細胞の生成及び維持のための現行の方法は、自発的分化がなく、高分解能/高クローン性単一細胞継代及び大規模拡大が容易なフットプリントを含まない多能性細胞の均質培養を、依然として実現していない。基底状態多能性細胞は、これらの課題を克服する品質及び特性をもたらし得る。しかしながら、現在まで、フィーダーを含まない条件下での基底状態多能性細胞のハイスループット生成のための、信頼性のある堅牢な方法は存在しない。したがって、現行の方法は、産業または臨床グレードの多能性細胞の生成には好適となり得ない。本明細書において企図される発明は、基底状態多能性の、またはその特性を有する安定した多能性細胞の堅牢な生成の必要性に対処し、産業及び臨床用途に好適な安定した多能性細胞の製造における問題を解決する。

0183

概して、本発明は、多能性細胞、特に、基底状態多能性細胞を含む自発的分化が低減された細胞の改善された製造のための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、段階特異的に細胞シグナル伝達経路の小分子モジュレータを利用し、培養方法及び多能性細胞の誘導方法が下流における使用の変動性及び/またはゲート活性の原因とならない点まで多能性細胞の誘導及び維持を可能にする、複数段階培養基盤に関する。さらに、本明細書において企図される培養基盤は、改善されたゲノム安定性、改善された未分化状態、低減された自発的分化、改善された培養物均質性、培養における改善された生残性、解離、及び単一多能性細胞の継代、ならびに、導入遺伝子またはフットプリントを使用しない基底状態多能性までの細胞の再プログラムを伴う、フィーダーを含まない条件下での多能性細胞の誘導及び維持を可能にする。したがって、本明細書において企図される組成物及び方法は、産業及び臨床用途に適切な多能性細胞、ならびに/または基底状態多能性細胞の製造を可能にする。

0184

現在まで、小分子駆動基盤は、再プログラムを向上させ、ヒト細胞から誘導されたフットプリントを含まない人工多能性幹細胞(iPSC)の単一細胞及びFF培養を補助することは示されていない(Nichols and Smith,2012)。本明細書において企図される培養基盤は、部分的に、段階特異的な小分子阻害剤の特定の組み合わせの適用を提供し、多能性幹細胞の迅速及び堅牢な再プログラムならびに安定な長期培養を可能にする。様々な実施形態において、基底状態多能性を含む改善された未分化多能性状態を誘引または維持するための培養基盤が提供される。本明細書において企図される基盤はまた、ヒトiPSC(hiPSC)における基底状態多能性の生成及び維持のための堅牢な培養系を提供する。一実施形態において、培養基盤は、導入遺伝子またはフットプリントを使用しない再プログラム方法を可能にする。具体的実施形態において、本明細書において企図される基盤は、導入遺伝子を含まないhiPSCの多重誘導及び維持における主要な課題を克服するhiPSCの製造のための改善された方法を示す。

0185

本発明の実践は、具体的に異なるように指定されない限り、当該技術分野の技術の範囲内である、化学生化学有機化学分子生物学微生物学組換えDNA技術遺伝学免疫学細胞生物学幹細胞プロトコル細胞培養及び遺伝子導入生物学の従来の方法を使用し、その多くは例示のめに以下に記載される。そのような技術は、文献中に十分説明されている。例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001);Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989);Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982);Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,updated July 2008);Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methodsfrom Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley−Interscience;Glover,DNA Cloning:A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985);Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992);Guthrie and Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press,New York,1991);Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,Ed.,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1985);Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984);Animal Cell Culture(R.Freshney,Ed.,1986);Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);Fire et al.,RNA Interference Technology:From Basic Science to Drug Development(Cambridge University Press,Cambridge,2005);Schepers,RNA Interference in Practice(Wiley−VCH,2005);Engelke,RNA Interference(RNAi):The Nuts&Bolts of siRNA Technology(DNA Press,2003);Gott,RNA Interference,Editing,and Modification:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology; Human Press,Totowa,NJ,2004);Sohail,Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application(CRC,2004);Clarke and Sanseau,microRNA:Biology,Function&Expression(Nuts&Bolts series; DNA Press,2006);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986);論文、Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory);Harlow and Lane,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1998);Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987);Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I−IV(D.M.Weir and C.Blackwell,eds.,1986);Riott,Essential Immunology,6th Edition,(Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988);Embryonic Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2002);Embryonic Stem Cell Protocols:Volume I:Isolation and Characterization(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2006);Embryonic Stem Cell Protocols:Volume II:Differentiation Models(Methods in Molecular Biology)(Kurstad Turksen,Ed.,2006);Human Embryonic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kursad Turksen Ed.,2006);Mesenchymal Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Darwin J.Prockop,Donald G.Phinney,and Bruce A.Bunnell Eds.,2008);Hematopoietic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Medicine)(Christopher A.Klug,and Craig T.Jordan Eds.,2001);Hematopoietic Stem Cell Protocols(Methods in Molecular Biology)(Kevin D.Bunting Ed.,2008) Neural Stem Cells:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Leslie P.Weiner Ed.,2008);Hogan et al.,Methods of Manipulating the Mouse Embyro(2nd Edition,1994);Nagy et al.,Methods of Manipulating the Mouse Embryo(3rd Edition,2002)、及びThe Zebrafish book.A guide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio),4th Ed.,(Univ.of Oregon Press,Eugene,OR,2000)を参照されたい。

0186

本明細書において引用される全ての出版物、特許及び特許出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0187

B.定義
別段に定義されていない限り、本明細書において使用される技術的及び科学的用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の目的において、以下の用語は、以下のように定義される。

0188

詞「a」、「an」及び「the」は、本明細書において、冠詞の文法的な目的語の1つまたは2つ以上(すなわち少なくとも1つ)を指すように使用される。例として、「要素(an element)」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。

0189

選択肢(例えば「または」)の使用は、選択肢のいずれか一方、両方、またはその任意の組み合わせを意味するように理解されるべきである。

0190

「及び/または」という用語は、選択肢のいずれか一方、または両方を意味するように理解されるべきである。

0191

本明細書において使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さと比較して、最大15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%だけ異なる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに関して、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さ±15%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、または±1%の範囲を指す。

0192

本明細書において使用される場合、「実質的に」または「本質的に」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さと比較して、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%以上の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態において、「本質的に同じ」または「実質的に同じ」という用語は、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さとほぼ同じ数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。

0193

本明細書において使用される場合、「〜を実質的に含まない」及び「〜を本質的に含まない」という用語は、交換可能に使用され、細胞集団または培養培地等の組成物を説明するために使用される場合、指定された物質を含まない、例えば指定された物質を95%含まない、96%含まない、97%含まない、98%含まない、99%含まない、または従来の手段により測定した場合検出不可能である組成物を指す。組成物の特定の物質または構成成分の非存在を指す場合、「〜が存在しない」という用語にも同様の意味が適用され得る。

0194

本明細書において使用される場合、「認め得る」という用語は、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量もしくは長さの範囲、または1つ以上の標準的方法により容易に検出可能であるイベントを指す。「認め得ない(not−appreciable)」及び「認め得ない(not appreciable)」という用語は、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量もしくは長さの範囲、または標準的方法により容易に検出可能でない、もしくは検出不可能であるイベントを指す。一実施形態において、イベントは、5%、4%、3%、2%、1%、0.1%、0.01%、0.001%またはそれ未満の確率で生じる場合、認め得ない。

0195

本出願全体を通して、文脈により別の意味が求められない限り、「備える(comprise)」、「備える(comprises)」及び「備える(comprising)」は、示されたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むことを暗示するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の除外を暗示しないものとして理解される。具体的実施形態において、「含む」、「有する」、「含有する」、及び「備える」という用語は、同義的に使用される。

0196

「〜からなる」とは、「〜からなる」とう語句付随するものを含み、それに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であり、他の要素は存在し得ないことを示す。

0197

「本質的に〜からなる」とは、その語句に付随して列挙された任意の要素を含み、列挙された要素に関して本開示において特定された活動または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「本質的に〜からなる」という語句は、列挙された要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択ではなく、列挙された要素の活動または作用に影響するか否かに依存して、存在してもしなくてもよいことを示す。

0198

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「具体的実施形態」、「関連した実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加的実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせは、実施形態に関連して説明される具体的な特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して、上記の語句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を指すわけではない。さらに、具体的な特徴、構造、または特性は、1つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされてもよい。

0199

「ex vivo」という用語は、概して、生物の外で生じる活動、例えば、好ましくは自然条件を最小限に改変した生物の外の人工的環境において、生体組織内または生体組織上で行われる実験または測定を指す。具体的実施形態において、「ex vivo」手順は、生物から取り出され、通常は無菌条件下で、また典型的には数時間から約24時間までであるが、状況によっては48時間または72時間までの間実験室装置内で培養された生体細胞または組織を含む。ある特定の実施形態において、そのような組織または細胞は、回収及び凍結されてもよく、またその後ex vivo処理のために解凍されてもよい。生体細胞または組織を使用した数日を超える期間続く組織培養実験または手順は、典型的には「in vitro」とみなされるが、ある特定の実施形態において、この用語はex vivoと交換可能に使用され得る。

0200

「in vivo」は、概して、生物内で生じる活動を指す。

0201

本明細書において使用される場合、「再プログラム」または「脱分化」または「細胞能力の増加」または「発生能の増加」という用語は、細胞の能力を増加させる、または細胞をより分化していない状態に脱分化する方法を指す。例えば、増加した細胞能力を有する細胞は、非再プログラム状態における同じ細胞と比較して、発生上の可塑性を有する(すなわち、より多くの細胞型に分化し得る)。換言すれば、再プログラムされた細胞は、非再プログラム状態の同じ細胞よりも分化していない状態にある細胞である。

0202

本明細書において使用される場合、「能力」という用語は、細胞が利用し得る全ての発生上の選択肢の合計(すなわち、発生能)を指す。細胞能力は、最も高い発生能を有する最も可塑性の細胞である全能幹細胞から、最も低い発生能を有する最も非可塑性の細胞である最終分化細胞までの範囲の連続であることが、当業者に認識される。細胞能力の連続は、全能細胞、多能性細胞、多分化能細胞、少分化能細胞単分化能細胞、及び最終分化細胞を含むが、これらに限定されない。

0203

本明細書において使用される場合、「多能性」という用語は、体または身体(すなわち本体)の全ての系統を形成する細胞の能力を指す。例えば、胚幹細胞は、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の3つの胚葉のそれぞれから細胞を形成することができる多能性幹細胞の種類である。

0204

多能性は、部分的に、細胞の多能性特性を評価することにより決定され得る。多能性特性は、(i)多能性幹細胞形態;(ii)無制限自己再生の可能性;(iii)SSEA1(マウスのみ)、SSEA3/4;SSEA5、TRA1−60/81;TRA1−85、TRA2−54、GCTM−2、TG343、TG30、CD9、CD29、CD133/プロミニン、CD140a、CD56、CD73、CD90、CD105、OCT4、NANOG、SOX2、CD30及び/またはCD50を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞マーカーの発現;(iv)3つ全ての体細胞系統(外胚葉、中胚葉及び内胚葉)への分化能力;(v)3つの体細胞系統からなる奇形腫形成;ならびに(vi)3つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成を含むが、これらに限定されない。

0205

後期胚盤胞の胚盤葉上層幹細胞(EpiSC)に類似した「プライム」または「準安定」状態の多能性、及び初期着床前胚盤胞の内部細胞塊に類似した「ナイーブ」または「基底」状態の多能性の、2種類の多能性が以前に説明されている。両方の多能性状態が上述のような特性を示すが、ナイーブまたは基底状態は、さらに、(i)雌性細胞におけるX染色体の事前不活性化または再活性化、(ii)単細胞培養中の改善されたクローン性及び生残性、(iii)DNAメチル化の全体的低減、(iv)発生制御遺伝子プロモーターへのH3K27me3抑制クロマチンマーク堆積の低減、ならびに(v)プライム状態多能性細胞に対する分化マーカーの発現の低減を示す。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、次いでサイレンシングまたは得られた多能性細胞から除去される細胞再プログラムの標準的方法は、概して、プライム状態の多能性の特性を有すると見られる。標準的多能性細胞培養条件下において、そのような細胞は、外因性導入遺伝子発現が維持されない限りプライム状態のままであり、基底状態の特性が観察される。

0206

本明細書において使用される場合、「多能性幹細胞形態」という用語は、胚幹細胞の古典的な形態の特徴を指す。正常な胚幹細胞形態は、丸く小さい形状を特徴とし、高い核対細胞質比、顕著な核小体の存在、及び典型的な細胞間間隔を有する。

0207

本明細書において使用される場合、「遺伝子発現プロファイル」、「遺伝子発現シグニチャー」、「遺伝子発現パネル」、「遺伝子パネル」、または「遺伝子シグニチャー」という用語は、細胞または細胞の集団を別の細胞または細胞の集団から区別するのに役立つ、複数の遺伝子の発現または発現のレベルを指す。例えば、自発的分化を防止するために培地中に維持された多能性細胞の集団は、同じ培地中に維持されていない同じ起源の多能性細胞の対照集団と比較して、分化遺伝子の発現の低下を含む遺伝子発現プロファイルを示し得る。

0208

本明細書において使用される場合、「分化マーカー遺伝子」または「分化遺伝子」という用語は、その発現が、多能性細胞等の細胞内で生じる細胞分化を示す遺伝子を指す。分化マーカー遺伝子は、次の遺伝子:FOXA2、FGF5、SOX17、XIST、NODAL、COL3A1、OTX2、DUSP6、EOMES、NR2F2、NR0B1、CXCR4、CYP2B6、GATA3、GATA4、ERBB4、GATA6、HOXC6、INHA、SMAD6、RORA、NIPBL、TNFSF11、CDH11、ZIC4、GAL、SOX3、PITX2、APOA2、CXCL5、CER1、FOXQ1、MLL5、DPP10、GSC、PCDH10、CTCFL、PCDH20、TSHZ1、MEGF10、MYC、DKK1、BMP2、LEFTY2、HES1、CDX2、GNAS、EGR1、COL3A1、TCF4、HEPH、KDR、TOX、FOXA1、LCK、PCDH7、CD1D FOXG1、LEFTY1、TUJ1、T遺伝子(Brachyury)及びZIC1を含むが、これらに限定されない。

0209

本明細書において使用される場合、「分化マーカー遺伝子プロファイル」もしくは「分化遺伝子プロファイル」、「分化遺伝子発現プロファイル」、「分化遺伝子発現シグニチャー」、「分化遺伝子発現パネル」、「分化遺伝子パネル」、または「分化遺伝子シグニチャー」という用語は、複数の分化マーカー遺伝子の発現または発現のレベルを指す。

0210

具体的実施形態において、自発的分化の減少を示す多能性細胞の集団は、分化マーカー遺伝子の発現の減少または分化マーカー遺伝子プロファイルにより特徴付けられ得る。例えば、多能性細胞または多能性細胞の集団における自発的分化の減少は、所与の培養条件のセットが、同じ培養条件を有さない対照多能性細胞または多能性細胞の集団の分化マーカー遺伝子の発現と比較して、1つ以上の分化マーカー遺伝子の発現の少なくとも10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、またはそれ以上の減少をもたらした場合に示され得る。

0211

「遺伝子発現」は、本明細書において使用される場合、多能性細胞、または多能性細胞を含む細胞の集団等の生体試料における遺伝子の発現の相対的レベル及び/または発現のパターンを指す。具体的実施形態において、多能性細胞は、iPSCである。

0212

本発明の細胞を特徴付ける遺伝子の発現を検出するための、当該技術分野において利用可能な任意の方法が、本明細書において包含される。本明細書において使用される場合、「発現を検出する」という用語は、遺伝子のRNA転写産物またはその発現産物の数量または存在を決定することを意味する。遺伝子の発現を検出するための、すなわち遺伝子発現プロファイリングのための方法は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、免疫組織化学的方法、及びプロテオミクスに基づく方法を含む。方法は、一般に、関心のある遺伝子の発現産物(例えばmRNA)を検出する。いくつかの実施形態において、PCRに基づく方法、例えば逆転写PCR(RT−PCR)(Weis et al.,TIG 8:263−64,1992)、及びアレイに基づく方法、例えばマイクロアレイ(Schena et al.,Science 270:467−70,1995)が使用される。

0213

接着」は、槽に付着する細胞、例えば、適切な培養培地の存在下で無菌プラスチック(またはコーティングプラスチック細胞培養皿またはフラスコに付着する細胞を指す。細胞のある特定のクラスは、それらが細胞培養槽に接着しない限り、培養物中で保持されない、または成長しない。細胞のある特定のクラス(「非接着細胞」)は、接着せずに培養物中で維持及び/または増殖される。

0214

「培養」または「細胞培養」は、in vitro環境における細胞の維持、成長及び/または分化を指す。「細胞培養培地(Cell culture media)」、「培養培地(Cell culture media)」(それぞれの場合において単数形は「medium」)、「補充物」及び「培地補充物」は、細胞培養物育成する栄養組成物を指す。

0215

「育成する」は、組織または体の外での、例えば無菌プラスチック(またはコーティングプラスチック)細胞培養皿またはフラスコ内での細胞の保持、繁殖(成長)及び/または分化を指す。「育成」は、栄養物ホルモンならびに/または細胞の繁殖及び/もしくは保持に役立つ他の因子の源として、培養培地を利用してもよい。

0216

本明細書において使用される場合、「解離した」細胞は、他の細胞または表面(例えば培養プレート表面)から実質的に分離または精製された細胞を指す。例えば、細胞は、機械的または酵素的方法により、動物または組織から解離され得る。代替として、in vitroで凝集する細胞は、例えば、クラスタ、単一細胞または単一細胞及びクラスタの混合物の懸濁液中に解離させることにより、互いから酵素的または機械的に解離され得る。さらに別の代替の実施形態において、接着細胞は、培養プレートまたは他の表面から解離される。したがって、解離は、細胞外基質(ECM)及び基板(例えば培養表面)との細胞相互作用破壊、または細胞間のECMの破壊を含み得る。

0217

本明細書において使用される場合、「濃縮する」及び「濃縮すること」という用語は、細胞の組成物等の組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「濃縮された」は、細胞集団等の細胞の組成物を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量的割合が、濃縮される前の細胞の集団におけるそのような構成成分の割合と比較して増加した細胞の集団を指す。例えば、細胞の集団等の組成物は、標的細胞型(すなわち特定の特性を有する細胞)に関して濃縮されてもよく、したがって、濃縮される前の細胞の集団内に存在する標的細胞の割合と比較して、標的細胞型の割合またはパーセントが増加していてもよい。細胞の集団は、当該技術分野において知られている細胞選択及びソーティング方法により、標的細胞型に関して濃縮されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞の集団は、本明細書の実施例において説明されるようなソーティングまたは選択プロセスにより濃縮される。具体的実施形態において、標的細胞集団に関して濃縮する方法は、標的細胞集団に関して少なくとも約20%細胞集団を濃縮し、すなわち、濃縮された細胞集団は、比例して、集団が濃縮される前の集団内よりも約20%多い標的細胞型を含む。一実施形態において、標的細胞集団に関して濃縮する方法は、標的細胞集団に関して、比例して少なくとも約30+%、40+%、50+%、60+%、70+%、80%、85%、90%、95%、97%、98%もしくは99%、または少なくとも約98%、または具体的実施形態において約99%細胞集団を濃縮する。

0218

ある特定の実施形態において、細胞の集団は、多能性細胞、または多能性特性を示す細胞の量に関して濃縮される。本発明の具体的実施形態において、再プログラムを受ける細胞の集団は、多能性の特性、例えば、SSEA3、SSEA4、TRA 1−60、TRA−1−81、CD30またはCD50を含むがこれらに限定されない多能性マーカーの発現を有する標的細胞に関して濃縮される。

0219

具体的実施形態において、細胞の集団、例えば再プログラムを受ける細胞の集団は、例えばCD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、またはCD7を含み得る、分化細胞系統または非多能性細胞に特異的な表面マーカーを使用して、非多能性細胞が枯渇している。したがって、得られる細胞集団は、多能性細胞が濃縮された細胞の集団であると説明され得る。

0220

具体的実施形態において、濃縮された細胞は、異なる遺伝子またはタンパク質発現プロファイル、例えば、SSEA3、SSEA4、TRA 1−60、TRA−1−81、CD30及びCD50等の少なくとも2つの多能性マーカーの細胞表面発現を有する。いくつかの実施形態において、濃縮された細胞は、2つ以上の多能性マーカーを含む。具体的実施形態において、濃縮された細胞は、TRA−181またはTRA−160と組み合わせてSSEA4を発現する。より具体的な実施形態において、濃縮された細胞は、SSEA4、TRA181、及びCD30を発現する。一実施形態において、細胞の集団は、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、70%、75%、80%、90%、95%、97%、98%、または99%の濃縮された細胞、例えば多能性細胞を含む。

0221

したがって、いくつかの実施形態において、多能性細胞に関して細胞の集団を濃縮する方法は、細胞集団を、SSEA3、SSEA4、TRA 1−60、TRA−1−81、CD30及びCD50等の多能性マーカーの細胞表面発現に基づいてソーティングすることと、そのようなマーカーを発現する細胞の分画を回収して、多能性細胞が濃縮された細胞の集団を得ることを含む。他の実施形態において、細胞の集団は、細胞集団を、CD13、CD26、CD34、CD45、CD31、CD46、及びCD7等の、分化している、または分化した細胞のマーカーの細胞表面発現に基づいてソーティングすること、ならびに、そのような細胞の細胞集団を枯渇させて、多能性細胞が濃縮された細胞の集団を得ることにより、多能性細胞に関して濃縮される。具体的実施形態において、細胞集団は、CD13の発現に基づいてソーティングされ、細胞集団からCD13+細胞が除去されて、多能性細胞が濃縮された細胞の集団が得られる。

0222

本明細書において使用される場合、「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、第2の種類の細胞と共培養されて第2の種類の細胞が成長し得る環境を提供する(フィーダー細胞が第2の細胞型を補助するための成長因子及び栄養物を提供するため)1つの種類の細胞を説明するために使用される用語である。フィーダー細胞は、任意選択で、それらが補助している細胞とは異なる種からのものである。例えば、幹細胞を含むある特定の種類のヒト細胞は、マウス胎児線維芽細胞及び不死化マウス胎児線維芽細胞の初代培養物により補助され得る。フィーダー細胞は、典型的には、他の細胞と共培養される場合、それらが補助している細胞の過剰成長を防止するために、放射線照射またはマイトマイシンC等の抗分裂剤による処理によって不活性化され得る。上記に限定されず、1つの特定のフィーダー細胞の種類は、ヒトフィーダー、例えばヒト皮膚線維芽細胞であってもよい。別のフィーダー細胞の種類は、マウス胎児線維芽細胞(MEF)であってもよい。

0223

本明細書において使用される場合、「フィーダーを含まない」(FF)環境は、例えば、フィーダー細胞を本質的に含まない、及び/またはフィーダー細胞の育成により事前に調整されていない細胞培養物または培養培地等の環境を指す。「事前に調整された」培地は、培地中で所定期間、例えば少なくとも1日フィーダー細胞が育成された後に採取された培地を指す。事前調整された培地は、培地中で育成されたフィーダー細胞により分泌された成長因子及びサイトカインを含む、多くのメディエーター物質を含有する。

0224

ゲノム安定性は、DNAを忠実に複製し、DNA複製プロセスの完全性を維持する細胞の能力を指す。本明細書において使用される場合、「ゲノム安定細胞」及び「ゲノム安定性を有する細胞」という用語は、正常ヒト体細胞に対する突然変異及び染色体異常の頻度に実質的に類似した突然変異及び染色体異常(例えば転座異数性複製数多様性及び重複)の頻度を示す細胞を指す。

0225

「成分」は、細胞の成長及び/または分化を維持及び/または促進するために細胞培養培地中に使用され得る、元来化学的または生物学的な任意の化合物または他の材料を指す。「構成成分」、「栄養物」及び「成分」という用語は、交換可能に使用され得る。細胞培養培地に使用される従来の成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン脂肪酸タンパク質等を含み得るが、これらに限定されない。ex vivoで細胞の育成を促進及び/または維持する他の成分は、所望の効果のために必要に応じて当業者により選択され得る。

0226

「単離する」または「単離すること」は、その自然環境から組成物または材料を分離及び回収すること、例えば組織または体からの個々の細胞または細胞培養物の分離を指す。一態様において、細胞の集団または組成物は、細胞、及び細胞が自然において関連し得る材料を実質的に含まない。細胞の標的集団に関連して、「単離された」または「精製された」または「実質的に純粋な」は、全細胞集団を構成する標的細胞に関して、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、及び具体的実施形態において少なくとも約95%純粋である細胞の集団を指す。細胞の集団または組成物の純度は、当該技術分野において周知の適切な方法により評価され得る。例えば、多能性細胞の実質的に純粋な集団は、全細胞集団を構成する多能性細胞に関して、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、及び具体的実施形態において少なくとも約95%、及びある特定の実施形態において約98%純粋である細胞の集団を指す。「本質的に純粋な」という用語は、本明細書において、「実質的に純粋な」と交換可能に使用される。

0227

「継代」または「継代すること」は、細胞が所望の程度まで増殖した際に、複数の細胞培養表面または槽に細胞を小分け及び播種する行為を指す。いくつかの実施形態において、「継代」または「継代すること」は、細胞を小分け、希釈及び播種することを指す。細胞が初代培養表面または槽から表面または槽の後続のセットに継代されると、後続の培養は、本明細書において「二次培養」または「第1継代」等と呼ぶことができる。新たな培養槽への小分け及び播種の各行為は、1つの継代とみなされる。

0228

「播種」は、細胞が細胞培養槽に接着する、またはそれに展着するように、細胞(複数を含む)を培養槽内に入れることを指す。

0229

「多能性因子」は、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、細胞の発生能を増加させることができる薬剤をさす。多能性因子は、限定されることなく、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び細胞の発生能を増加させることができる小分子を含む。例示的な多能性因子は、例えば、転写因子及び小分子再プログラム剤を含む。

0230

「増殖する」は、2つの本質的に同一の細胞に、または数が増加する(例えば再生する)細胞の集団に分裂する1つの細胞の性質を指す。

0231

「繁殖」は、組織または体の外で、例えばプラスチック(またはコーティングプラスチック)細胞培養皿またはフラスコ等の無菌容器内で細胞を成長させる(例えば細胞増殖により再生する)ことを指す。

0232

初期培養物」は、単離された細胞が培養培地を有する第1の培養槽内に入れられる場合の細胞、組織及び/または培養物を指す。細胞、組織及び/または培養物は、保持されてもよく、及び/または増殖されてもよいが、細胞、組織及び/または培養物が第1の槽内に維持される限り、細胞、組織及び/または培養物は初期培養物と呼ばれる。

0233

「小分子再プログラム剤」または「小分子再プログラム化合物」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、単独で、または他の多能性因子と組み合わせて細胞の発生能を増加させることができる小分子を指す。「小分子」は、約5kD未満、約4kD未満、約3kD未満、約2kD未満、約1kD未満、または約0.5kD未満の分子量を有する薬剤を指す。小分子は、核酸、ペプチド模倣体ペプトイド炭水化物、脂質、または他の有機もしくは無機分子を含むが、これらに限定されない。真菌、細菌、または藻類抽出物等の化学的及び/または生物学的混合物ライブラリが当該技術分野において知られており、ある特定の実施形態において小分子の源として使用され得る。具体的実施形態において、本明細書において使用される小分子再プログラム剤は、10,000ダルトン未満、例えば8000、6000、4000、2000ダルトン未満、例えば50〜1500、500〜1500、200〜2000、500〜5000ダルトンの間の分子量を有する。
C.細胞

0234

具体的実施形態において、本明細書において企図される組成物及び方法を使用して、1つ以上の細胞が培養、解離、及び継代されてもよい。一実施形態において、本明細書において企図される組成物及び方法を使用して、単一細胞が培養、解離、及び継代される。別の実施形態において、本明細書において企図される組成物及び方法を使用して、細胞の集団または複数の細胞が培養、解離、及び継代される。

0235

具体的実施形態における使用に好適な出発細胞集団は、本質的に任意の好適な源から誘導され得、細胞型または多能性の状態に関して不均質または均質であってもよい。好適な細胞は、胎児細胞及び成体細胞を含む。さらに、好適な細胞は、元来哺乳動物細胞であってもよく、例えば、げっ歯類ネコイヌブタヤギヒツジウマウシ、または霊長類からのものであってもよい。一実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。

0236

細胞は、体細胞、非多能性細胞、不完全もしくは部分多能性幹細胞、多分化能細胞、少分化能細胞、単分化能細胞、最終分化細胞、または上記の任意の組み合わせを含む混合細胞集団であってもよい。具体的実施形態における使用に好適な多能性細胞は、自然発生的幹細胞、胚幹細胞、またはiPSCを含むが、これらに限定されない。「混合」細胞集団は、様々な程度の発生能を有する細胞の集団である。例えば、混合細胞集団は、再プログラムを受けている細胞を含んでもよく、したがって混合集団は多能性細胞、部分多能性細胞、及び非多能性細胞、例えば完全分化細胞を含む。

0237

一実施形態において、出発細胞集団は、成体または新生児前駆細胞から選択される。具体的実施形態において、出発幹/前駆体細胞集団は、中胚葉幹/前駆細胞、内胚葉幹/前駆細胞、及び外胚葉幹/前駆細胞からなる群から選択される。

0238

中胚葉幹/前駆細胞の実例は、中胚葉幹/前駆細胞、内皮幹/前駆細胞、骨髄幹/前駆細胞、臍帯幹/前駆細胞、脂肪組織誘導幹/前駆細胞、造血幹/前駆細胞(HSC)、間充織幹/前駆細胞、筋幹/前駆細胞、腎臓幹/前駆細胞、骨幹/前駆細胞、軟骨幹/前駆細胞等を含むが、これらに限定されない。

0239

外胚葉幹/前駆細胞の実例は、神経幹/前駆細胞、網膜幹/前駆細胞、皮膚幹/前駆細胞等を含むが、これらに限定されない。

0240

内胚葉幹/前駆細胞の実例は、肝臓幹/前駆細胞、膵臓幹/前駆細胞、上皮幹/前駆細胞等を含むが、これらに限定されない。

0241

ある特定の実施形態において、出発細胞集団は、膵島細胞CNS細胞、PNS細胞心筋細胞骨格筋細胞平滑筋細胞造血細胞骨細胞肝細胞脂肪細胞腎細胞肺細胞軟骨細胞皮膚細胞瀘胞細胞、血管細胞上皮細胞免疫細胞内皮細胞等からなる群から選択される、不均質または均質細胞集団であってもよい。

0242

D.自発的分化を低減するため、及び基底状態多能性を誘引するための培養基盤
細胞バンキング、疾患モデリング及び細胞治療用途は、高品質多能性細胞の製造に対して益々多くの要求を課している。例えば、ハイスループットのフットプリントを含まないiPSCの誘導、及び大規模生産を可能にするシステムにおけるその拡大は、技術的に実現しにくい状態が続いている。具体的実施形態において、段階特異的培地組成物中での小分子経路阻害剤を使用した多能性細胞の迅速な並列生成、選択及び拡大を可能にする培養基盤が企図される。本明細書において企図される基盤は、完全にフィーダーを含まない環境において、最小限の再プログラミング因子を使用して効率的及び迅速化された再プログラムを補助し、多能性細胞の単一細胞培養及び拡大を可能にしながら、均質及びゲノム安定性多能性集団を維持する。さらに、本明細書において企図される培養基盤は、遺伝的背景とは無関係に、及び導入遺伝子発現とは独立して、hESC及びhiPSCを含む多能性細胞を、自発的分化の低減された状態、及び一般的な多能性の基底状態まで培養することを提供する。

0243

本明細書において企図される培養基盤は、部分的に、培養における自発的分化が低減された産業または臨床グレード多能性細胞の生成に有用である。一実施形態において、非多能性細胞が、多能性細胞となるように誘引され、多能性を維持するように培養される。別の実施形態において、非多能性細胞が、多能性細胞となるように誘引され、培養における低減された自発的分化を達成及び/または維持するように培養される。別の実施形態において、非多能性細胞が、多能性細胞となるように誘引され、基底状態多能性を達成及び/または維持するように培養される。

0244

様々な実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、1つ以上の多能性細胞の基底状態多能性、正常核型、及びゲノム安定性を、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100またはそれ以上の継代(任意の介在する継代数を含む)の間維持する。

0245

他の実施形態において、本明細書において企図される培養基盤は、1つ以上の多能性細胞における低減された自発的分化を、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90、100またはそれ以上の継代(任意の介在する継代数を含む)の間維持する。

0246

一実施形態において、培養基盤は、細胞培養培地、ならびにGSK−3阻害剤、MEK阻害剤及びRho Kinase(ROCK)阻害剤を含む細胞培養培地を含む。様々な実施形態において、本明細書において企図される細胞培養培地は、TGFβ受容体(TGFβR)阻害剤及びALK5阻害剤を含む、TGFβ/アクチビンシグナル伝達経路の阻害剤を含まない、またはそれを有さない。任意の具体的理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、驚くべきことに、TGFβR/ALK5阻害剤が再プログラムの効率を増加させる一方で、これらの阻害剤は多能性細胞集団の長期維持、品質及び均質性に反作用することを発見し、すなわち、TGFβ経路シグナル伝達阻害は、細胞再プログラムの効率を改善したが、自発的分化が低減された均質多能性集団が好ましい場合、より具体的には導入遺伝子発現が存在しない場合、in vitro培養系、特にフィーダー細胞を含まない単一細胞酵素的継代を使用した系における、多能性細胞集団のその後の維持には、この阻害からの解放が必要である。さらに、GSK−3阻害剤及びMEK阻害剤、ならびに任意選択でROCK阻害剤を含むが、TGFβR/ALK5阻害剤を有さない培地中での準安定多能性細胞の培養は、本明細書において開示されるように、多能性細胞を移行させ、自発的分化の低減を達成、及び/または基底状態多能性を達成する。本明細書において企図される培養培地基盤はまた、フィーダーを含まない環境内での多能性細胞の効率的な再プログラム及び長期培養を可能にする。さらに、「ALK5阻害剤」は、非特異的キナーゼ阻害剤を包含することを意図しないが、「ALK5阻害剤」は、ALK5に加えてALK4及び/またはALK7を阻害する阻害剤、例えばSB−431542等を包含するものとして理解されるべきである(例えば、Inman,et al.,J Mol.Pharmacol.62(1):65−74(2002)を参照されたい)。

0247

好ましい実施形態において、培養基盤は、GSK−3阻害剤、MEK阻害剤、Rho Kinase(ROCK)阻害剤、ならびに任意選択でLIF及び/またはbFGFを含む細胞培養培地を含み、TGFβRまたはALK5阻害剤を含むがこれらに限定されないTGFβ/アクチビンシグナル伝達経路の小分子阻害剤を含まない。

0248

追加的実施形態において、細胞培養培地は、サイトカイン及び/または成長因子を実質的に含まず、任意選択でフィーダーを含まない環境である。他の実施形態において、細胞培養培地は、血清抽出物、成長因子、ホルモン、サイトカイン等の補充物を含有する。

0249

1つの好ましい実施形態において、培養基盤は、フィーダーを含まない培養物を含む。

0250

本明細書において企図される培養基盤はまた、自発的発現が低減され、及び/または基底状態多能性を達成する産業または臨床グレード多能性細胞の均質集団の製造等の、多くの利点を提供する。本明細書において使用される場合、「均質」という用語は、各細胞が集団内の他の細胞と同じ、または実質的に同じである細胞の集団を指す。一実施形態において、細胞は、各細胞が、本明細書において企図されるような同じ多能性マーカーの1つ以上、例えばSSEA4及びTRA1−81を発現する場合、集団内の他の細胞と同じである。一実施形態において、細胞の少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上が、集団内の他の細胞と同じまたは実質的に同じである場合、集団は均質である。

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