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技術 HTPゲノム操作プラットフォームによる微生物株の改良

出願人 ザイマージェンインコーポレイテッド
発明者 ザックサーバーエリックジェデディアディーンショーンマンチェスターキャサリンゴラマイケルフラッシュマンエリンシェルマンアーロンキンボールショーンシィジカバーバラフレウェントーマストレイナーケネスエス.ブルーノ
出願日 2019年5月20日 (1年7ヶ月経過) 出願番号 2019-094458
公開日 2019年9月26日 (1年2ヶ月経過) 公開番号 2019-162131
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 核酸・ペプチド類を含むライブラリー技術 微生物、その培養処理
主要キーワード 操作プラットフォーム 位置作業 接合サイクル 性能分布 ヒルクライミング マシンヘッド 線形手法 白色セル
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年9月26日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題

解決手段

本開示は、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、および高度な機械学習プロトコール統合するHTP微生物ゲノム操作プラットフォームを提供する。この統合プラットフォームは、一式のHTP分子ツールセットを利用して、HTP遺伝子設計ライブラリーを生み出す。これらのライブラリーは、とりわけ、科学的洞察および反復パターン認識から得られる。本明細書に記載のHTPゲノム操作プラットフォームは、微生物株宿主にとらわれず、したがって、分類群全体にわたってインプリメントすることができる。さらに、開示したプラットフォームは、目的の任意の微生物宿主パラメータモジュレートまたは改善するようにインプリメントすることができる。

概要

背景

人間は、目的の産物を生成するのに千年間にわたって微生物細胞生合成経路の力を利用してきており、その最古の例としては、アルコール、酢、チーズ、およびヨーグルトがある。これらの産物は、今日でも依然として大きな需要があり、また、微生物が産生可能な産物のレパートリーが増え続けている。遺伝子操作技術の出現により、科学者は、様々な生物体中に新規生合成経路を設計およびプログラムして、広い範囲の工業、医療用、および消費者向け製品生産することが可能になった。実際に、微生物細胞培養が、低分子抗生物質ワクチン殺虫剤酵素燃料、および工業用化学物質におよぶ産物を生産するのに現在使用されている。

最新工業用微生物によって産生される多数の産物を考慮すると、エンジニアが、所与の微生物が標的産物を産生することができる速度および効率を改善するのに極めて大きいプレッシャーの下にあることは驚くに当たらない。

様々な手法が、関与する微生物を「改良する」ことによって生物学に基づく工業プロセス経済性を改善するのに使用されてきた。例えば、多くの製薬工業および化学工業では、微生物培養親株が化学物質またはUV放射線への曝露によって連続的に変異され、生産性収率、および力価などの性能増大について引き続いてスクリーニングされる、微生物株改良プログラムを利用する。この変異誘発プロセスは、株が産物性能の適当な増大を実証するまで広範に繰り返される。次いで後続の「改善された」株は、商業生産で利用される。

上記に暗示したように、変異誘発による改善された工業用微生物株の同定は、時間がかかり、非効率である。このプロセスは、まさにその本質から、計画性のないものであり、産物産出について望ましい結果を有する変異の際の1つのつまずきを利用する。

伝統的な微生物株改良プログラムが非効率であるだけでなく、このプロセスは、高い程度の有害な変異誘発性ロード(mutagenic load)を有する工業用株に至る場合もある。
これらのタイプのプログラムに供された工業用株における変異の蓄積は、かなり大きなものとなり得、性能改善の速度における最終的な停滞に至り得る。

概要

HTゲノム操作プラットフォームによる微生物株の改良の提供。本開示は、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、および高度な機械学習プロトコール統合するHTP微生物ゲノム操作プラットフォームを提供する。この統合プラットフォームは、一式のHTP分子ツールセットを利用して、HTP遺伝子設計ライブラリーを生み出す。これらのライブラリーは、とりわけ、科学的洞察および反復パターン認識から得られる。本明細書に記載のHTPゲノム操作プラットフォームは、微生物株宿主にとらわれず、したがって、分類群全体にわたってインプリメントすることができる。さらに、開示したプラットフォームは、目的の任意の微生物宿主パラメータモジュレートまたは改善するようにインプリメントすることができる。

目的

本開示は、伝統的な微生物株改良プログラムに関連した無数の問題を被らないハイスループット(HTP)微生物ゲノム操作プラットフォームを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

本明細書に記載の発明。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本願は、2015年12月7日に出願された米国仮出願第62/264,232号、2016年4月27日に出願された米国非仮出願第15/140,296号、および2016年7月29日に出願された米国仮出願第62/368,786号の優先権の利益を主張し、これらのそれぞれは、すべての目的のために、すべての記載、参照、図面および特許請求の範囲を含むその全体において参照によって本明細書に組み込まれる。

0002

本開示は、ハイスループットHTP)微生物ゲノム操作を対象とする。開示されるHTPゲノム操作プラットフォームは、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、および高度な機械学習プロトコール統合する。この統合プラットフォームは、一式のHTP分子ツールセットを利用して、HTP遺伝子設計ライブラリーを生み出す。これらのライブラリーは、とりわけ、科学的洞察および反復パターン認識から得られる。
配列表に関する陳述

0003

本願に添付された配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供されており、参照により本明細書に組み込まれている。配列表を含有するテキストファイル名称は、ZYMR_001_01WO_SeqList_ST25.txtである。テキストファイルは、約5KBであり、2016年12月7日に作成されたものであり、EFS−Webを介して電子的に提出されている。

背景技術

0004

人間は、目的の産物を生成するのに千年間にわたって微生物細胞生合成経路の力を利用してきており、その最古の例としては、アルコール、酢、チーズ、およびヨーグルトがある。これらの産物は、今日でも依然として大きな需要があり、また、微生物が産生可能な産物のレパートリーが増え続けている。遺伝子操作技術の出現により、科学者は、様々な生物体中に新規生合成経路を設計およびプログラムして、広い範囲の工業、医療用、および消費者向け製品生産することが可能になった。実際に、微生物細胞培養が、低分子、抗生物質ワクチン殺虫剤酵素燃料、および工業用化学物質におよぶ産物を生産するのに現在使用されている。

0005

最新工業用微生物によって産生される多数の産物を考慮すると、エンジニアが、所与の微生物が標的産物を産生することができる速度および効率を改善するのに極めて大きいプレッシャーの下にあることは驚くに当たらない。

0006

様々な手法が、関与する微生物を「改良する」ことによって生物学に基づく工業プロセス経済性を改善するのに使用されてきた。例えば、多くの製薬工業および化学工業では、微生物培養親株が化学物質またはUV放射線への曝露によって連続的に変異され、生産性収率、および力価などの性能増大について引き続いてスクリーニングされる、微生物株改良プログラムを利用する。この変異誘発プロセスは、株が産物性能の適当な増大を実証するまで広範に繰り返される。次いで後続の「改善された」株は、商業生産で利用される。

0007

上記に暗示したように、変異誘発による改善された工業用微生物株の同定は、時間がかかり、非効率である。このプロセスは、まさにその本質から、計画性のないものであり、産物産出について望ましい結果を有する変異の際の1つのつまずきを利用する。

0008

伝統的な微生物株改良プログラムが非効率であるだけでなく、このプロセスは、高い程度の有害な変異誘発性ロード(mutagenic load)を有する工業用株に至る場合もある。
これらのタイプのプログラムに供された工業用株における変異の蓄積は、かなり大きなものとなり得、性能改善の速度における最終的な停滞に至り得る。

発明が解決しようとする課題

0009

よって、伝統的な株改良プログラムに固有の上述した欠点を被らず、有益な変異を発見および統合するプロセスを大いに加速する工業用微生物を操作する新しい方法についての当技術分野における大きな必要性が存在する。

0010

さらに、微生物株改良の分野において現在使用されている時代遅れの有害なプロセスによって開発された工業用株を「再建する」方法の緊急の必要性が存在する。

課題を解決するための手段

0011

本開示は、伝統的な微生物株改良プログラムに関連した無数の問題を被らないハイスループット(HTP)微生物ゲノム操作プラットフォームを提供する。

0012

さらに、本明細書で教示されるHTPプラットフォームは、数10年のランダム変異誘発に基づく株改良プログラムによって有益でない変異を蓄積してきた工業用微生物を再建する(rehabilitate)ことができる。

0013

開示されるHTPゲノム操作プラットフォームは、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、および高度な機械学習プロトコールを統合する。この統合プラットフォームは、一式のHTP分子ツールセットを利用して、HTP遺伝子設計ライブラリーを生み出す。これらのライブラリーは、とりわけ、科学的洞察および反復パターン認識から得られる。

0014

教示されるHTP遺伝子設計ライブラリーは、微生物において試験するための特定のゲノム変更のライブラリーを提供することによって、ゲノム操作プロセスドライバーとして機能する。特定のライブラリーまたはライブラリーの組合せを利用して操作された微生物は、結果として生じる成果、例えば、目的の産物の産生についてHTP様式で効率的にスクリーニングされる。HTP遺伝子設計ライブラリーを利用して微生物において試験するための特定のゲノム変更を明らかにし、次いでこれらの変更を内包する宿主微生物ゲノムを引き続いてスクリーニングするこのプロセスは、効率的な反復様式でインプリメントされる。一部の態様では、ゲノム操作キャンペーン反復サイクルまたは「ラウンド」は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、またはそれ超の反復/サイクル/ラウンドであり得る。

0015

よって、一部の態様では、本開示は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000またはそれ超の「ラウンド」のHTP遺伝子操作(例えば、SNPスワップ、PROスワップ、STOPスワップ、またはこれらの組合せのラウンド)を行う方法を教示する。

0016

一部の実施形態では、本開示は、各後続のHTP遺伝子操作ラウンドが先のラウンドの遺伝子操作で同定された遺伝的バリエーションに基づく線形手法を教示する。他の実施形態では、本開示は、各後続のHTP遺伝子操作ラウンドが先に行われた分析を含む任意の先のラウンドの遺伝子操作、および別個のHTP遺伝子操作ブランチで同定された遺伝的バリエーションに基づく非線形手法を教示する。

0017

これらの反復サイクルからのデータは、大規模データ分析およびパターン認識を可能にし、それは統合プラットフォームによって利用され、HTP遺伝子設計ライブラリー実装の後続のラウンドを通知する。したがって、教示されるプラットフォームで利用されるHTP遺伝子設計ライブラリーは、大規模データパターン認識アルゴリズムから利益を得、各反復ラウンドの微生物操作によってより有益となる高度に動的なツールである。

0018

一部の実施形態では、本開示の遺伝子設計ライブラリーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、またはそれ超の個々の遺伝子変化(例えば、少なくともXの数のPROスワップライブラリーにおけるプロモーター:遺伝子組合せの)を含む。

0019

一部の実施形態では、本開示は、HTP株改良法の微生物株への適用を記述する実例およびテキストを提供する。一部の実施形態では、本開示の株改良法は、任意の宿主細胞に適用可能である。

0020

一部の実施形態では、本開示は、所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット(HTP)方法であって、a)同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと;b)所望の表現型について最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;c)それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;d)所望の表現型について後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;e)微生物が所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップc)〜d)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の微生物株を含む新しいHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップとを含む、方法を教示する。

0021

一部の実施形態では、本開示は、最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、SNPスワップ微生物株ライブラリー、開始/停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも1つであることを教示する。

0022

一部の実施形態では、本開示は、それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を作製する方法であって、組み合わされた遺伝的バリエーションのそれぞれが、最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーまたは先行するステップのHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーに由来する、方法を教示する。

0023

一部の実施形態では、後続の複数の微生物における遺伝的バリエーションの組合せは、最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーまたは先行するステップのHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーにおける遺伝的バリエーションのすべての可能な組合せのサブセットを含むことになる。

0024

一部の実施形態では、本開示は、後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーまたは先行するステップのHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーにおける遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーであることを教示する。

0025

例えば、先のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが遺伝的バリエーションA、B、C、およびDのみを有している場合、前記バリエーションの部分的コンビナトリアルは、それぞれがAB、AC、またはADの遺伝的バリエーションのユニークな組合せのいずれかを含む3種の微生物を含む後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを含むことができる(変異が表される順序は重要でない)。先行するステップのHTP遺伝子設計ライブラリーの遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーは、それぞれがAB、AC、AD、BC、BD、またはCDの遺伝的バリエーションのユニークな組合せのいずれかを含む6種の微生物を含むはずである。

0026

一部の実施形態では、本開示の方法は、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも1つの方法を利用してゲノムを撹乱することを教示する。

0027

現在開示した方法の一部の実施形態では、最初の複数の微生物は、工業生産株微生物に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む。

0028

現在開示した方法の一部の実施形態では、最初の複数の微生物は、S1Gen1で表される工業生産株微生物、およびSnGennで表されるこれらに由来する任意の数の後続の微生物世代を含む。

0029

一部の実施形態では、本開示は、SNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、a)参照微生物株および第2の微生物株を提供するステップであって、第2の微生物株は、参照微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;b)参照微生物株または第2の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、参照微生物株と第2の微生物株との間の複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップとを含む、方法を教示する。

0030

SNPスワップライブラリーの一部の実施形態では、参照微生物株のゲノムが撹乱されて、第2の微生物株内に見出される同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が付加される。

0031

本開示のSNPスワップライブラリー方法の一部の実施形態では、第2の微生物株のゲノムが撹乱されて、参照微生物株内に見出されない同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が除去される。

0032

一部の実施形態では、SNPスワップライブラリーの遺伝的バリエーションは、参照微生物株と第2の微生物株との間で同定されたすべての遺伝的バリエーションのサブセットを含む。

0033

一部の実施形態では、SNPスワップライブラリーの遺伝的バリエーションは、参照微生物株と第2の微生物株との間の同定された遺伝的バリエーションのすべてを含む。

0034

一部の実施形態では、本開示は、工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、a)親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、工業用微生物株は、親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;b)親系統微生物株または工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、親系統微生物株と工業用微生物株との間の複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと;c)参照微生物株に対する表現型性能改善について最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、前記微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと;d)それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;e)参照微生物株に対する表現型性能改善について後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、前記微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと;f)微生物株が、工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するSNPスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の微生物株を含む新しいSNPスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップとを含む、方法を教示する。

0035

一部の実施形態では、本開示は、工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、親系統微生物株のゲノムが撹乱されて、工業用微生物株内に見出される同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が付加される、方法を教示する。

0036

一部の実施形態では、本開示は、工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、工業用微生物株のゲノムが撹乱されて、親系統微生物株内に見出されない同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が除去される、方法を教示する。

0037

一部の実施形態では、本開示は、プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、a)基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;b)基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、基準微生物株に内在する標的遺伝子の1つに作動可能に連結したプロモーターラダー由来のプロモーターの1つを含む、ステップとを含む、方法を教示する。

0038

一部の実施形態では、本開示は、所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法であって、a)基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;b)基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、基準微生物株に内在する標的遺伝子の1つに作動可能に連結したプロモーターラダー由来のプロモーターの1つを含む、ステップと;c)所望の表現型について最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;d)それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;e)所望の表現型について後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;f)微生物が所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップとを含む、方法を教示する。

0039

一部の実施形態では、本開示は、ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、a)基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;b)基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した基準微生物株に内在する標的遺伝子の1つを含む、ステップとを含む、方法を教示する。

0040

一部の実施形態では、本開示は、所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法であって、a)基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;b)基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した基準微生物株に内在する標的遺伝子の1つを含む、ステップと;c)所望の表現型について最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;d)それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;e)所望の表現型について後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;f)微生物が所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップとを含む、方法を教示する。

0041

一部の実施形態では、本開示は、(a)(1)1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および(2)対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された(populated with)予測モデルアクセスするステップと;(b)遺伝子変
化を表す予測モデルに試験入力(test input)を適用するステップであって、試験入力
は、これらの遺伝子変化を組み入れ候補微生物株に対応する、ステップと;(c)予測モデルに少なくとも部分的に基づいて候補微生物株の表現型性能を予測するステップと;(d)これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて候補微生物株の第1のサブセットを選択するステップと;(e)候補微生物株の第1のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと;(f)これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて候補微生物株の第2のサブセットの選択物を得るステップと;(g)(2)選択された候補微生物株の第2のサブセットの対応する測定された性能とともに(1)選択された候補微生物株の第2のサブセットに対応する入力を予測モデルの訓練セットに加えるステップと;(h)少なくとも1つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで、(b)〜(g)を繰り返すステップとによって候補微生物株の設計を反復して改善することを教示する。一部の場合では、予測モデルへの試験入力の第1の適用の間に、試験入力によって表される遺伝子変化が、1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み、試験入力の後続の適用の間に、試験入力によって表される遺伝子変化が、候補微生物株の先に選択された第2のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む。

0042

一部の実施形態では、第1のサブセットの選択は、上位性効果に基づき得る。これは、第1のサブセットの第1の選択の間に、1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと、少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも2つの候補微生物株を第1のサブセットに含めるために選択するステップとによって達成することができる。

0043

一部の実施形態では、本発明は、候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用する方法であって、少なくとも1つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと;少なくとも2つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも2つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、相違点の程度が、少なくとも2つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと;選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップとを含む、方法を教示する。一部の場合では、少なくとも2つの選択された遺伝子変化が設計される微生物バックグラウンド株は、測定された応答性能を表すデータが得られた少なくとも1つの微生物バックグラウンド株と同じである。

0044

一部の実施形態では、本開示は、単一タイプの遺伝子微生物ライブラリーのみを利用するHTP株改良法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、SNPスワップライブラリーのみを利用するHTP株改良法を教示する。他の実施形態では、本開示は、PROスワップライブラリーのみを利用するHTP株改良法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、STOPスワップライブラリーのみを利用するHTP株改良法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、開始/停止コドンスワップライブラリーのみを利用するHTP株改良法を教示する。

0045

他の実施形態では、本開示は、2つまたはそれ超のタイプの遺伝子微生物ライブラリーを利用するHTP株改良法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、SNPスワップライブラリーおよびPROスワップライブラリーを組み合わせるHTP株改良法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、SNPスワップライブラリーおよびSTOPスワップライブラリーを組み合わせるHTP株改良法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、PROスワップライブラリーおよびSTOPスワップライブラリーを組み合わせるHTP株改良法を教示する。

0046

他の実施形態では、本開示は、複数のタイプの遺伝子微生物ライブラリーを利用するHTP株改良法を教示する。一部の実施形態では、遺伝子微生物ライブラリーは、組合せ変異(例えば、1つまたは複数の遺伝子に適用されるプロモーター/ターミネーター組合せラダー)を生成するように組み合わせられる。さらに他の実施形態では、本開示のHTP株改良法は、1つまたは複数の伝統的な株改良法と組み合わせることができる。

0047

一部の実施形態では、本開示のHTP株改良法は、改良された宿主細胞をもたらす。すなわち、本開示は、1つまたは複数の宿主細胞性質を改善する方法を教示する。一部の実施形態では、改善される宿主細胞性質は、宿主細胞によって産生される目的の産物の体積生産性比生産性、収率、または力価からなる群から選択される。一部の実施形態では、改善される宿主細胞性質は、体積生産性である。一部の実施形態では、改善される宿主細胞性質は、比生産性である。一部の実施形態では、改善される宿主細胞性質は、収率である。

0048

一部の実施形態では、本開示のHTP株改良法は、HTP株改良法に供されない対照宿主細胞に対して1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、150%、200%、250%、300%、またはそれ超の少なくとも1つの宿主細胞性質の改善(例えば、これらの間の任意の範囲および部分範囲を組み入れての、目的の生体分子の収率または生産性のX%の改善)を呈する宿主細胞をもたらす。一部の実施形態では、本開示のHTP株改良法は、SNPスワップ、PROスワップ、STOPスワップ、およびこれらの組合せからなる群から選択される。

0049

よって、一部の実施形態では、本開示のSNPスワップ方法は、SNPスワップ方法に供されない対照宿主細胞に対して、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、150%、200%、250%、300%、またはそれ超の少なくとも1つの宿主細胞性質の改善(例えば、これらの間の任意の範囲および部分範囲を組み入れての、目的の生体分子の収率または生産性のX%の改善)を呈する宿主細胞をもたらす。

0050

よって、一部の実施形態では、本開示のPROスワップ方法は、PROスワップ方法に供されない対照宿主細胞に対して、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、150%、200%、250%、300%、またはそれ超の少なくとも1つの宿主細胞性質の改善(例えば、これらの間の任意の範囲および部分範囲を組み入れての、目的の生体分子の収率または生産性のX%の改善)を呈する宿主細胞をもたらす。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット(HTP)方法であって、
a.同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと;
b.該所望の表現型について該最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
c.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
d.該所望の表現型について該後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
e.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップc)〜d)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、ゲノム操作のHTP方法
(項目2)
前記最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、SNPスワップ微生物株ライブラリー、開始/停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも1つを含む、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目3)
前記後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、前記最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーである、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目4)
前記後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、前記最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーのサブセットである、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目5)
前記後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーである、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目6)
前記後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーのサブセットである、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目7)
前記ゲノムを撹乱するステップが、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも1つの方法を利用することを含む、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目8)
前記最初の複数の微生物が、工業生産株微生物に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目9)
前記最初の複数の微生物が、S1Gen1で表される工業生産株微生物、およびSnGennで表されるこれらに由来する任意の数の後続の微生物世代を含む、項目1に記載のゲノム操作のHTP方法。
(項目10)
SNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
c.参照微生物株および第2の微生物株を提供するステップであって、該第2の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
d.該参照微生物株または該第2の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第2の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
を含む、方法。
(項目11)
前記参照微生物株のゲノムが撹乱されて、前記第2の微生物株内に見出される前記同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が付加される、項目10に記載のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
(項目12)
前記第2の微生物株のゲノムが撹乱されて、前記参照微生物株内に見出されない前記同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が除去される、項目10に記載のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
(項目13)
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第2の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、項目10に記載のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
(項目14)
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第2の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目10に記載のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法。
(項目15)
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、
a.親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと;
c.参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該個々の微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと;
f.微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するSNPスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいSNPスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
(項目16)
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第2の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを構成する、項目15に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
(項目17)
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する複数の個々の微生物株が、一緒に、前記参照微生物株と前記第2の微生物株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目15に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
(項目18)
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目15に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
(項目19)
前記親系統微生物株のゲノムが撹乱されて、前記工業用微生物株内に見出される前記同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が付加される、項目15に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
(項目20)
前記工業用微生物株のゲノムが撹乱されて、前記親系統微生物株内に見出されない前記同定された一塩基多型、DNA挿入、またはDNA欠失の1つまたは複数が除去される、項目15に記載の工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための方法。
(項目21)
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
c.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
d.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと
を含む、方法。
(項目22)
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法であって、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
(項目23)
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目22に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のプロモータースワップ方法。
(項目24)
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
c.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
d.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと
を含む、方法。
(項目25)
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法であって、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
(項目26)
結果として生じる遺伝的バリエーションのユニークな組合せを有する後続の複数の個々の微生物株が、一緒に、先行するステップでスクリーニングされた前記個々の微生物株に存在するすべての前記遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを構成する、項目25に記載の所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のターミネータースワップ方法。
(項目27)
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるためのハイスループット(HTP)ゲノム操作システムであって、
1つまたは複数のプロセッサー、および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと;
b.該所望の表現型について該最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
c.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
d.該所望の表現型について該後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
e.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップc)〜d)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目28)
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップと;
b.該所望の表現型について該最初のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
c.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
d.該所望の表現型について該後続のHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
e.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップc)〜d)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目29)
SNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.参照微生物株および第2の微生物株を提供するステップであって、該第2の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該参照微生物株または該第2の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第2の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目30)
SNPスワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.参照微生物株および第2の微生物株を提供するステップであって、該第2の微生物株は、該参照微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該参照微生物株または該第2の微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該参照微生物株と該第2の微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目31)
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと;
c.参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと;
f.微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するSNPスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいSNPスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目32)
工業用微生物株の表現型性能を再建および改善するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.親系統微生物株およびそれに由来する工業用微生物株を提供するステップであって、該工業用微生物株は、該親系統微生物株内に存在しない一塩基多型、DNA挿入、およびDNA欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと;
b.該親系統微生物株または該工業用微生物株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該親系統微生物株と該工業用微生物株との間の該複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと;
c.参照微生物株に対する表現型性能改善について該最初のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該参照微生物株に対する表現型性能改善について該後続のSNPスワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、該微生物株に追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと;
f.微生物株が、該工業用微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するSNPスワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいSNPスワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目33)
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目34)
プロモータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目35)
所望の表現型を獲得するためにプロモータースワッピングによって微生物を進化させるゲノム操作システムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目36)
所望の表現型を獲得するためにプロモータースワッピングによって微生物を進化させるための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、該プロモーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つに作動可能に連結した該プロモーターラダー由来のプロモーターの1つまたは複数を含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のプロモータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するプロモータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいプロモータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目37)
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目38)
ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生成するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目39)
所望の表現型を獲得するために微生物をターミネータースワッピングによって進化させるゲノム操作システムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目40)
所望の表現型を獲得するために微生物をターミネータースワッピングによって進化させるための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.基準微生物株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、該ターミネーターラダーは、該基準微生物株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと;
b.該基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該複数の個々の微生物株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、該ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、該ターミネーターラダー由来のターミネーターの1つまたは複数に作動可能に連結した該基準微生物株に内在する該標的遺伝子の1つを含む、ステップと;
c.該所望の表現型について該最初のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
d.それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも2つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと;
e.該所望の表現型について該後続のターミネータースワップ微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと;
f.微生物が該所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップd)〜e)を1回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するターミネータースワップ微生物株ライブラリーの少なくとも2つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいターミネータースワップ微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目41)
候補微生物株の設計を反復して改善するためのコンピューター実装方法であって、
a.(1)1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および(2)対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと;
b.遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと;
c.該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと;
d.これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第1のサブセットを選択するステップと;
e.該候補微生物株の該第1のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと;
f.これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第2のサブセットの選択物を得るステップと;
g.(2)該選択された候補微生物株の第2のサブセットの対応する測定された性能とともに、(1)該選択された候補微生物株の第2のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと;
h.(b)〜(g)を繰り返すステップと
を含む、方法。
(項目42)
(b)〜(g)を繰り返すステップが、少なくとも1つの候補微生物株の測定された表現型性能が、性能測定基準を満たすまで(b)〜(g)を繰り返すことを含む、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記予測モデルへの試験入力の第1の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み;
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第2のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、項目41に記載の方法。
(項目44)
前記候補微生物株の前記第1のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、項目41に記載の方法。
(項目45)
上位性効果に少なくとも部分的に基づく前記第1のサブセットの前記選択が、
該第1のサブセットの第1の選択の間に、
前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
を含む、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記第1のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第1のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第1のサブセット候補微生物株が、該第1のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第1のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさらに含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
候補微生物株の設計を反復して改善するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
a.(1)1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および(2)対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと;
b.遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと;
c.該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと;
d.これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第1のサブセットを選択するステップと;
e.該候補微生物株の該第1のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと;
f.これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第2のサブセットの選択物を得るステップと;
g.(2)該選択された候補微生物株の第2のサブセットの対応する測定された性能とともに、(1)該選択された候補微生物株の第2のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと;
h.(b)〜(g)を繰り返すステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目48)
前記命令が、前記1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、前記システムに、少なくとも1つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで(b)〜(g)を繰り返させる、項目47に記載のシステム。
(項目49)
前記予測モデルへの試験入力の第1の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み;
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第2のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、項目47に記載のシステム。
(項目50)
前記候補微生物株の前記第1のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、項目47に記載のシステム。
(項目51)
前記命令が、前記1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、前記システムに、前記第1のサブセットの第1の選択の間に、
前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、項目50に記載のシステム。
(項目52)
前記命令が、前記1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、前記システムに、前記第1のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第1のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第1のサブセット候補微生物株が、該第1のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第1のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、項目51に記載のシステム。
(項目53)
候補微生物株の設計を反復して改善するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
a.(1)1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および(2)対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された予測モデルにアクセスするステップと;
b.遺伝子変化を表す該予測モデルに試験入力を適用するステップであって、該試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと;
c.該予測モデルに少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の表現型性能を予測するステップと;
d.これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第1のサブセットを選択するステップと;
e.該候補微生物株の該第1のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと;
f.これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて該候補微生物株の第2のサブセットの選択物を得るステップと;
g.(2)該選択された候補微生物株の第2のサブセットの対応する測定された性能とともに、(1)該選択された候補微生物株の第2のサブセットに対応する入力を該予測モデルの該訓練セットに加えるステップと;
h.(b)〜(g)を繰り返すステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目54)
前記命令が、実行されるとき、前記1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、少なくとも1つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで(b)〜(g)を繰り返させる、項目53に記載のコンピューター可読媒体。
(項目55)
前記予測モデルへの試験入力の第1の適用の間に、該試験入力によって表される前記遺伝子変化が、前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み;
試験入力の後続の適用の間に、該試験入力によって表される該遺伝子変化が、先に選択された候補微生物株の第2のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む、項目53に記載のコンピューター可読媒体。
(項目56)
前記候補微生物株の前記第1のサブセットの前記選択が、上位性効果に少なくとも部分的に基づく、項目53に記載のコンピューター可読媒体。
(項目57)
前記命令が、実行されるとき、前記1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、前記第1のサブセットの第1の選択の間に、
前記1つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、該1つまたは複数のバックグラウンド微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、項目56に記載のコンピューター可読媒体。
(項目58)
前記命令が、実行されるとき、前記1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、前記第1のサブセットの後続の選択の間に、
遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、先の第1のサブセット候補微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップであって、該先の第1のサブセット候補微生物株が、該第1のサブセットの先の選択の間に選択された株である、ステップと;
少なくとも2つの候補微生物株内に組み入れられる該遺伝子変化の適用に応じて、該先の第1のサブセット候補微生物株の該性能尺度の相違点の該程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの候補微生物株を該第1のサブセットに含めるために選択するステップと
をさせる、項目53に記載のコンピューター可読媒体。
(項目59)
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するためのコンピューター実装方法であって、
少なくとも1つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと;
少なくとも2つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも2つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと;
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
を含む、方法。
(項目60)
前記少なくとも2つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも1つの微生物バックグラウンド株と同じである、項目59に記載の方法。
(項目61)
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するためのシステムであって、
1つまたは複数のプロセッサー;および
該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つに作用的にカップリングされ、該1つまたは複数のプロセッサーの少なくとも1つによって実行されるとき、該システムに、
少なくとも1つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと;
少なくとも2つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも2つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと;
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
をさせる、記憶された命令を有する1つまたは複数のメモリー
を備える、システム。
(項目62)
前記少なくとも2つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも1つの微生物バックグラウンド株と同じである、項目61に記載のシステム。
(項目63)
候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用するための命令を記憶している1つまたは複数の非一時的コンピューター可読媒体であって、該命令は、1つまたは複数の演算デバイスによって実行されるとき、該1つまたは複数の演算デバイスの少なくとも1つに、
少なくとも1つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと;
少なくとも2つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、該少なくとも2つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、
相違点の該程度が、該少なくとも2つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと;
該選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップと
をさせる、非一時的コンピューター可読媒体。
(項目64)
前記少なくとも2つの選択された遺伝子変化が設計される前記微生物バックグラウンド株が、測定された応答性能を表すデータが得られた前記少なくとも1つの微生物バックグラウンド株と同じである、項目63に記載のコンピューター可読媒体。

図面の簡単な説明

0051

図1は、多様性プール中のバリエーションを増加させるための本開示のDNA組換えの方法を示す。物理的または酵素的化学的な手段により、DNA切片、例えば、関連のある種からのゲノム領域を切断することができる。切断したDNA領域融解し、再アニールさせ、その結果、オーバーラップする遺伝子領域が、ポリメラーゼ伸長反応を開始する。産物が1つまたは複数の出発配列に由来するエレメントを含むキメラDNA再アセンブルされるまで、後続の融解/伸長反応を実施する。

0052

図2は、選択された配列の改変(例えば、スワップするための100個のSNP)を用いて、新しい宿主生物を生成するための本開示の方法の概要を示す。手短に述べると、方法は以下を含む:(1)所望のDNA挿入断片を、設計し、アセンブリー反応において1つまたは複数の合成オリゴを組み合わせることによって生成する、(2)DNA挿入断片を、形質転換プラスミド中にクローニングする、(3)完成したプラスミドを、所望の産生株中に移入させ、そのプラスミドが宿主株のゲノム中に組み込まれる、および、(4)選択マーカーおよび他の望まれないDNAエレメントを、宿主株からループアウトする。DNAアセンブリーの各ステップは、追加の、品質管理QC)のステップ、例えば、増幅およびシーケンシングのためにプラスミドをE.coli細菌中にクローニングするステップも含むことができる。

0053

図3は、本開示の形質転換プラスミドアセンブリー、および宿主生物中へのそのプラスミドの組込みを示す。挿入断片DNA(insert DNA)を、アセンブリー反応において1つまたは複数の合成オリゴを組み合わせることによって生成する。所望の配列を含有するDNA挿入断片に、ゲノムの標的領域に相同なDNAの領域を隣接させる。これらの相同領域は、ゲノムの組込みを促進し、一旦組み込まれると、続くステップでベクター骨格のDNAをループアウトするように設計されたダイレクトリピート領域を形成する。アセンブルされたプラスミドは、挿入断片DNAを含有し、任意選択で、1つまたは複数の選択マーカーも含有する。

0054

図4は、選択された、宿主株に由来するDNAの領域をループアウトするための手順を示す。挿入されたDNAおよび宿主ゲノムのダイレクトリピート領域は、組換え事象において「ループアウトする」ことができる。選択マーカーについて対抗選択された細胞は、ダイレクトリピート領域が隣接するループDNAの欠失を含有する。

0055

図5は、本開示の株改良プロセスの実施形態を示す。遺伝子改変を含有する宿主株配列(遺伝子設計)を、多様な株バックグラウンドにおいて、株性能の改善(株構築)について試験する。有益な変異を示す株を分析し(ヒットIDおよび分析)、データを、さらに分析するために、ライブラリー(とりわけ、例えば、SNPスワップライブラリー、PROスワップライブラリーおよびそれらの組合せ)に保存する。追加の反復分析のために、本開示の選択規則により、1つまたは複数のライブラリーに由来するエレメントの組合せについて予測される効果に基づいて新たに提案される宿主株配列が生成される。

0056

図6は、本開示の実施形態のうちの1つのDNAアセンブリー、形質転換および株スクリーニングのステップを示す。図6Aは、DNA断片を構築するためのステップ、前記DNA断片をベクター中にクローニングするためのステップ、前記ベクターを宿主株中に形質転換するためのステップ、および選択配列を対抗選択によりループアウトするためのステップを示す。図6Bは、ハイスループット培養するためのステップ、スクリーニングするためのステップ、および選択された宿主株を評価するためのステップを示す。この図はまた、培養物タンク中の、選択された株の培養、スクリーニングおよび評価を行う任意選択のステップも示す。
図6は、本開示の実施形態のうちの1つのDNAアセンブリー、形質転換および株スクリーニングのステップを示す。図6Aは、DNA断片を構築するためのステップ、前記DNA断片をベクター中にクローニングするためのステップ、前記ベクターを宿主株中に形質転換するためのステップ、および選択配列を対抗選択によりループアウトするためのステップを示す。図6Bは、ハイスループット培養するためのステップ、スクリーニングするためのステップ、および選択された宿主株を評価するためのステップを示す。この図はまた、培養物タンク中の、選択された株の培養、スクリーニングおよび評価を行う任意選択のステップも示す。

0057

図7は、本開示の自動化されたシステムの一実施形態を示す。本開示は、宿主生物のクローニング、形質転換、培養、スクリーニングおよび/またはシーケンシングが可能な多様なモジュールを有する自動化されたロボットシステムの使用を教示する。

0058

図8は、本開示の宿主株改良プログラムの実施形態の概要を示す。

0059

図9は、およそ3.2×106個の塩基対を含むCorynebacterium glutamicumのゲノムを描写する。

0060

図10は、本開示の形質転換の実験結果を示す。0.5kb〜5.0kbの範囲のDNA挿入断片を、Corynebacterium glutamicumのゲノムの(相対的な位置1〜24として示す)多様な領域への挿入に対して標的化した。明るい色により、組込みの成功を示し、一方、より暗い色により、挿入の失敗を示す。

0061

図11は、第2のラウンドのHTP操作PROスワッププログラムの結果を示す。PROスワップの第1のラウンドの間に同定したプロモーター::遺伝子の上位の組合せを、本開示の方法に従って分析して、宿主の性能に対して相加的またはコンビナトリアルに有益な効果を示す可能性があろう、前記変異の組合せを同定した。したがって、第2のラウンドのPROスワップ変異体は、多様なプロモーター::遺伝子の変異の対の組合せを含んだ。結果として得られた第2のラウンドの変異体を、選択された生体分子の宿主細胞の収率の差についてスクリーニングした。有益な効果を示すことが予測されていた、変異の組合せの対が、円を用いて強調されている。

0062

図12は、E.coli中に形質転換したプラスミドに関するプラスミドアセンブリーの成功について試験した実験結果を示す。1kbおよび2kbの挿入配列を含有するプラスミドについては、4つのコロニーを選べば、13%の失敗率を実践するのに十分である。より大きな挿入は、一貫性のある結果をなしとげるのに、追加のコロニースクリーニングを必要とする場合がある。

0063

図13は、Corynebacterium glutamicumの挿入ベクターによる形質転換の成功について試験した実験結果を示す。2kbおよび5kbのDNA挿入断片のサイズは、高い形質転換率を示し、アセンブリーの失敗率は低かった。

0064

図14は、Corynebacterium glutamicumにおけるループアウト選択の結果を示す。形質転換された細菌のスクロース耐性により、sacB選択マーカーがループアウトされたことが示される。DNA挿入断片のサイズが、ループアウト効率に影響を及ぼすようには見えない。

0065

図15は、相関性の尺度を使用して計算した類似性マトリックスである。マトリックスにより、SNPバリアント間の機能類似性が描写される。低い機能類似性を有するSNPの統合は、より高い機能類似性を有するSNPの統合とは対照的に、株性能を改善する可能性がより高いことが期待される。

0066

図16A〜Bは、上位性マッピングの実験結果を示す。低い機能類似性を有するSNPスワップとPROスワップとの組合せにより、改良された株性能が得られる。図16Aは、すべてのSNP/PROスワップの機能類似性によりクラスター化された樹状図を示す。図16Bは、産物の収率により測定した場合の、宿主株の、統合したSNPの性能を示す。より大きなクラスターの距離が、宿主株の統合性能の改善と相関する。

0067

図17A〜Bは、多様性プール中の株バリアント間のSNPの差を示す。図17Aは、この実験の株の間の関係を示す。株Aは、野生型の宿主株である。株Bは、中間の、操作された株である。株Cは、工業生産用の株である。図17Bは、各株において、ユニークなSNPおよび共有されているSNPの数を同定するグラフである。

0068

図18は、本開示の方法に従う第1のラウンドのSNPスワッピングの実験を示す。(1)CからのSNPをすべて、基準株A中に個々および/またはコンビナトリアルにクローニングする(AからCへの「ウェーブアップ」)。(2)CからのSNPをすべて、市販株Cから個々および/またはコンビナトリアルに除去する(CからAへの「ウェーブダウン」)。(3)BからのSNPをすべて、基準株A中に個々および/またはコンビナトリアルにクローニングする(AからBへのウェーブアップ)。(4)BからのSNPをすべて、市販株Bから個々および/またはコンビナトリアルに除去する(BからAへのウェーブダウン)。(5)CにユニークなSNPをすべて、個々および/またはコンビナトリアルに市販株B中にクローニングする(BからCへのウェーブアップ)。(6)CにユニークなSNPをすべて、市販株Cから個々および/またはコンビナトリアルに除去する(CからBへのウェーブダウン)。

0069

図19は、プロモータースワップのプロセスにおいて利用される遺伝子標的の例を示す。

0070

図20は、同定した遺伝子標的についてプロモータースワップのプロセスを実施するために利用されている例示的なプロモーターライブラリーを示す。PROスワップ(すなわち、プロモータースワップ)のプロセスにおいて利用されるプロモーターは、P1〜P8であり、それらの配列および同一性は、表1に見出すことができる。

0071

図21は、プロモータースワッピングの遺伝子の結果は、標的とされる特定の遺伝子に依存することを示す。

0072

図22は、リシンの収率に対する性能に有意に影響を及ぼす改変を示す、例示的なHTPプロモータースワッピングのデータを示す。X軸は、プロモータースワップ遺伝子設計微生物株ライブラリー内の異なる株を表し、Y軸は、各株についてのリシンの収率の相対的な値を含む。グラフ上の各文字が、PROスワップの標的遺伝子を表す。各データ点が、反復を表す。データは、本明細書に記載の、HTPの適用例に適応させた分子ツール(すなわち、PROスワップ)は、目的の化合物または分子を産生するために、効率的に、微生物株を創製し、その株性能を最適化することが可能であることを実証している。この場合、目的の化合物は、リシンであった;しかし、教示するPROスワップの分子ツールを利用して、任意の目的の化合物の産生を最適化し、かつ/または増加させることができる。当業者であれば、いかにして所望の化合物の産生をコードする標的遺伝子を選び、次いで、教示するPROスワップの手順を利用するかを理解するはずである。本明細書で教示するリシンの収率の増加を例示するのに示したデータと、本出願中に提示する詳細な開示とにより、PROスワップの分子ツールが、HTPゲノム操作の広く適用可能な進歩となり得ることを当業者は容易に認識するはずである。

0073

図23は、検討中インプットデータについての相対的な株性能の分布を示す。ゼロの相対的な性能は、操作された株がプレート中の基準株に等しく良好に機能したことを示す。本明細書に記載するプロセスは、ゼロを有意に上回って機能する可能性がある株を同定するように設計される。

0074

図24は、相対的な株性能の平均変化(増加または減少)を示す線形回帰係数値を示し、該株性能は、表示する株中に組み入れている各遺伝子変化と関連がある。

0075

図25は、予測される株の設計の上位100個についての変化の組成(composition of change)を示す。x軸に、潜在的な遺伝子変化(dss変異はSNPスワップであり、Pcg変異はPROスワップである)のプールを列挙し、y軸に、順位を示す。黒色セルにより、候補の設計における特定の変化の存在を示し、一方、白色のセルにより、そうした変化の不在を示す。この特定の例では、上位100個の設計はすべて、pcg3121_pgi、pcg1860_pyc、dss_339およびpcg0007_39_lysaの変化を含有する。加えて、上位の候補の設計は、dss_034、dss_009の変化を含有する。

0076

図26は、本開示の実施形態のうちの1つの、DNAアセンブリーおよび形質転換のステップを示す。フローチャートは、DNA断片を構築するためのステップ、前記DNA断片をベクター中にクローニングするためのステップ、前記ベクターを宿主株中に形質転換するためのステップ、および選択配列を対抗選択によりループアウトするためのステップを示す。

0077

図27は、ハイスループット培養するためのステップ、スクリーニングするためのステップ、および選択された宿主株を評価するためのステップを示す。この図はまた、培養物タンク中の、選択された株の培養、スクリーニングおよび評価を行う任意選択のステップも示す。

0078

図28は、本開示のプロモーターラダーに従って一連調節性発現を示す、例示的なプロモーターの発現プロファイルを示す。プロモーターAの発現は、細菌培養誘導期ピークに達し、一方、プロモーターBおよびCはそれぞれ、対数期および定常期にピークに達する。

0079

図29は、本開示のプロモーターラダーに従って一連の調節性の発現を示す、例示的なプロモーターの発現プロファイルを示す。プロモーターAの発現は、選択された基質を添加すると、即時にピークに達するが、基質の濃度が低下するにつれて、検出不能なレベルに急速に戻る。プロモーターBの発現は、選択された基質を添加すると、即時にピークに達し、基質の対応する低下と一緒に、ゆっくり低下して、検出不能なレベルに戻る。プロモーターCの発現は、選択された基質を添加すると、ピークに達し、培養全体を通して、基質が消散してしまった後でさえ、高度な発現状態を維持する。

0080

図30は、本開示のプロモーターラダーに従って一連の構成性の発現レベルを示す、例示的なプロモーターの発現プロファイルを示す。プロモーターAは、最も低い発現を示し、それに続いて、プロモーターBおよびCがそれぞれ、発現レベルを増加させる。

0081

図31は、株改良のための本開示のLIMSシステムの実施形態を図示する。

0082

図32は、本開示のLIMSシステムの実施形態のクラウドコンピューティングの実装を図示する。

0083

図33は、本開示の反復予測株設計ワークフローの実施形態を示す。

0084

図34は、本開示の実施形態に従う、コンピューターシステムの実施形態を図示する。

0085

図35は、本開示の一実施形態に従うDNAアセンブリーに関連するワークフローを示す。このプロセスは、4つの段階:重要部分(part)の生成、プラスミドアセンブリー、プラスミドのQC、および形質転換のためのプラスミドの調製に分けられる。重要部分の生成の間に、オリゴのシーケンシングのベンダーから、Laboratory Information Management System(LIMS)により設計されたオリゴを発注し、宿主生物から標的配列PCRにより増幅するために使用する。これらのPCRの重要部分は、清浄して、混入物を除去し、断片の分析により、すなわち、観察される断片サイズと理論的な断片サイズとのin silicoでの品質管理比較、およびDNAの定量を行って、成功について評価する。重要部分を、酵母中にアセンブリーベクターと一緒に形質転換し、プラスミド中に相同組換えによりアセンブルする。アセンブルされたプラスミドを、酵母から単離し、E.coli中に形質転換して、続いて、アセンブリーの品質管理および増幅を行う。プラスミドアセンブリーの品質管理の間に、各プラスミドのいくつかの複製物を単離し、ローリングサークル増幅RCA)を使用して増幅し、正確なアセンブリーについて酵素消化および断片の分析により評価する。QCプロセス中に同定した正確にアセンブルされたプラスミドをヒットピッキングし、恒久的なストックを生成し、プラスミドDNAを抽出し、定量してから、標的宿主生物中に形質転換する。

0086

図36は、ターミネーターT1〜T8の効果を、2つの培地中で2つの時点にわたり特徴付けた実験結果を示す。条件Aおよび条件Cは、BHI培地についての2つの時点を表し、一方、B点およびD点は、HTP試験培地についての2つの時点を表す。

0087

図37は、UV変異誘発などの従来の株改良アプローチの有効性と、本開示のHTP操作の方法論とを比較した実験結果を示す。圧倒的多数のUV変異は、宿主細胞の性能の目立った増加をもたらさなかった。対照的に、本開示のPROスワップの方法論は、宿主細胞の性能の1.2〜2倍の増加を示す変異体を高い比率で産生した。

0088

図38は、第1のラウンドのHTP操作SNPスワッププログラムの結果を示す。186個の個別のSNP変異を同定し、基準株上に個々にクローニングした。結果として得られた変異体を、選択された生体分子の宿主細胞の収率の差についてスクリーニングした。

0089

図39は、第2のラウンドのHTP操作SNPスワッププログラムの結果を示す。第1のラウンドのSNPスワッププログラムからの176個の個別のSNP変異を、第1のラウンドのSNPプログラムの間に同定した有益なSNPを含有する第2のラウンドの宿主細胞株中に個々にクローニングした。したがって、結果として得られた変異体は、2つの変異を組み合わせた対の効果を表す。選択された生体分子に関して、宿主細胞の収率(Y軸)および生産性(X軸)における差についてのスクリーニングの結果を示す。

0090

図40は、タンク発酵バリデーション実験の結果を示す。HTP SNPスワップの第2のラウンドからの変異の上位の対を、発酵タンク中で培養した。選択された生体分子(すなわち、リシン)に関して、宿主細胞の収率および生産性についての結果を示す。認め得るように、本発明者らは、1つのラウンドのゲノム操作において、PROスワップ手順を利用して、特定のPROスワップ変異体(zwf)が、基準株と比較して(すなわち、基準株と、基準株+zwfとを比較して)、選択された生体分子の収率の増加を示すことを決定した。次いで、本発明者らは、別のラウンドのゲノム操作を実施し、この場合、SNPスワップ手順を使用して、前記PROスワップ変異体と組み合わせた場合に、生体分子の収率に影響を及ぼすことができる有益なSNP変異を決定した。PROスワップ手順とSNPスワップ手順との組合せにより、これまでのPROスワップのみの変異体よりも(すなわち、基準株+zwf+SNP121と、これまでに論じた基準株+zwfとを比較して)、さらに高い収率を有する変異体が創製された。この図は、本開示のPROスワップ手順とSNPスワップ手順とを組み合わせることによってなしとげることができる収率の劇的な改善を示す。PROスワップゲノム操作キャンペーンとSNPスワップゲノム操作キャンペーンとを組み合わせる態様では、目的の生体分子/産物の収率および/または生産性を、基準株と比べて、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%またはそれ超だけ増加させることができる。

0091

図41は、第1のラウンドのHTP操作PROスワッププログラムの結果を示す。本開示の方法に従って、宿主の性能と関連があると考えられる、選択された遺伝子を、プロモーターラダーと組み合わせて、第1のラウンドのPROスワップライブラリーを創製した。結果として得られた変異体を、選択された生体分子(すなわち、リシン)の宿主細胞の収率の差についてスクリーニングした。

0092

図42は、本開示の実施形態に従って、微生物株を設計するための変異の選択における上位性効果の考慮事項を示すフローチャートである。

0093

図43A〜Bは、本開示の方法に従うA.nigerの形質転換およびバリデーションの結果を示す。図43Aは、A.nigerの形質転換体の96ウェル培地プレート写真である。形質転換された培養物は、aygAにおける変異を含み、このことにより、細胞が、黒色の代わりに、より薄い黄色に見えるようになる(形質転換されたウェルは、白色の円で囲まれている)。図43Bは、形質転換されたA.nigerの変異体の次世代シーケンシングの結果を示す。X軸は、形質転換されていない親株との標的DNAの配列同一性を表す。Y軸は、期待される変異との標的DNAの配列同一性を表す。チャートの右下辺りのデータ点は、親株との高い類似性、および期待される形質転換された配列との低い類似性を示す。チャートの左上辺りのデータ点は、期待される形質転換された配列に対する高い類似性、および親株との低い同一性を示す。中央にあるデータ点は、複数の核を有する異核共存体を表す可能性がある。

0094

図44A〜Bは、A.nigerにおけるSNPスワップのインプリメンテーションを示す。図44Aは、SNPスワップの各SNPについての遺伝子の編集の設計を示す。図はさらに、pyrG遺伝子を、aygA野生型遺伝子遺伝子座中に導入する共形転換も示す。図44Bは、A.nigerの形質転換体をスクリーニングするための96ウェル培地プレートの2つの写真である。薄黄色のコロニーは、aygA遺伝子の破壊が成功している形質転換体を表わす。

0095

図45は、次世代シーケンシングの結果に基づく、成功したA.niger変異体形質転換体(上のボックス)を同定する品質管理(QC)チャートを示す。培養プレートから選択された黄色コロニーのうち、全部で29.2%が、期待されるSNPの遺伝子変化を示す。

0096

図46は、形質転換されたA.nigerの変異体の次世代シーケンシングの結果を示す。X軸は、形質転換されていない親株との標的DNAの配列同一性を表す。Y軸は、期待される変異との標的DNAの配列同一性を表す。チャートの右下辺りのデータ点は、親株との高い類似性、および期待される形質転換された配列との低い類似性を示す。チャートの左上辺りのデータ点は、期待される形質転換された配列に対する高い類似性、および親株との低い同一性を示す。中央にあるデータ点は、複数の核を有する異核共存体を表す可能性がある。

0097

図47は、本開示の収率モデルに関して、訓練データの測定された性能と比した予測される性能のドットプロットである。基礎をなすモデルは、(4次多項式カーネルを用いる)カーネルリッジ回帰モデルである。モデルを、1864個のユニークな遺伝子構築物および関連する表現型の性能に対して訓練する。適合させたモデルは、0.52のr2値を有する。

0098

図48は、本開示の予測アルゴリズムにより生成された候補の設計の遺伝子構成を示す。これらの候補の設計を、HTPの構築および分析に提出した。ここでは、候補の設計は、親株idと導入された変異(複数可)との組合せとして定義される。

0099

図49は、本開示の予測アルゴリズムにより生成され、本開示のHTP構築法に従って構築した候補の設計の測定された性能と比した予測される性能のドットプロットである。この図は、モデルが、候補株の性能を許容できる精度内で予測することができることを示す。

0100

図50は、親株に対する候補株の収率のパーセント変化を示す箱ひげ図である。y軸上では、0.01の値が、1%に相当する。この図は、コンピューターモデルにより設計された株(薄い灰色)が、それらに対応する親株を上回る測定可能な改善をなしとげることを示す。加えて、図は、これらのモデル基準株の改善の大きさが、ヒト専門家が設計した株によりなしとげられた改善に匹敵することも示す。

0101

図51は、コンピューターモデルにより設計された株(暗灰色)およびヒト専門家により設計された株(薄い灰色)についての収率による性能の分布を示す。コンピューターにより設計された株は、より密な分布を示し、獲得中央値がより高かった。

0102

図52は、コンピューターにより生成された候補株(薄い灰色)またはヒト専門家により生成された候補株(暗灰色)の絶対的な収率を示す箱ひげ図である。結果は、親株毎に総計されている。

0103

定義
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。

0104

用語「a」または「an」は、そのエンティティの1つまたは複数を指し、すなわち、複数形の指示対象を指すことができる。したがって、用語「a」または「an」、「1つまたは複数」および「少なくとも1つ」は、本明細書で互換的に使用される。さらに、不定詞「a」または「an」による「要素」への言及は、文脈により唯一の要素が存在することが明確に要求されない限り、1つを超える要素が存在する可能性を除外しない。

0105

本明細書で使用される場合、用語「細胞生物」、「微生物(microorganism)」、また
は「微生物(microbe)」は、広く解釈されるべきである。これらの用語は、互換的に使
用され、これらに限定されないが、2つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌および原生生物を含む。一部の実施形態では、本開示は、本開示内に存在するリスト/表および図面の「微生物(microorganism)」または「細胞生物」ま
たは「微生物(microbe)」に言及する。この特徴付けは、表および図面の同定された分類学的な属だけでなく、同定された分類学的な種、ならびに前記表または図面内の任意の生物体の様々な新規のおよび新しく同定または設計された株も参照することができる。同じ特徴付けが、実施例などの本明細書の他の部分におけるこれらの用語の記述にも当てはまる

0106

用語「原核生物」は、当技術分野で認識されており、核または他の細胞小器官を含有しない細胞を指す。原核生物は一般に、2つのドメイン、細菌および古細菌の1つに分類される。古細菌と細菌ドメインの生物体間の決定的な差異は、16SリボソームRNA内のヌクレオチド塩基配列の基本的な差異に基づく。

0107

用語「古細菌」は、Mendosicutes門の生物体のカテゴリー分類を指し、典型的には、珍しい環境内で見つかり、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸欠如を含めたいくつかの判定基準によって原核生物の残りと区別される。ssrRNA分析に基づいて、古細菌は、2つの系統学的に別個の群:CrenarchaeotaおよびEuryarchaeotaからなる。これらの生理機能に基づいて、古細菌は、3つのタイプ:メタン生成菌メタンを産生する原核生物);高度好塩菌(非常に高濃度の塩(NaCl)で生きる原核生物);および高度(超)好熱菌(thermophilus)(非常に高温で生きる原核生物)へと整理することができる。古細菌を細菌と区別する統一的古細菌フィーチャ(すなわち、細胞壁内にムレインが無いこと、エステル結膜脂質など)に加えて、これらの原核生物は、これらをその特定の生息環境に適応させるユニークな構造的または生化学属性を呈する。Crenarchaeotaは、超好熱性硫黄依存性原核生物から主になり、Euryarchaeotaは、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。

0108

「細菌」または「真正細菌」は、原核生物体のドメインを指す。細菌は、以下の少なくとも11の別個の群を含む:(1)2つの主要な亜門:(1)高G+C群(Actinomycetes、Mycobacteria、Micrococcus、その他)(2)低G+C群(Bacillus、Clostridia、Lactobacillus、Staphylococci、Streptococci、Mycoplasmas)が存在するグラム陽性グラム+)細菌;(2)Proteobacteria、例えば、紅色光合成非光合成グラム陰性細菌(最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む);(3)ラン藻類、例えば、酸素発生型光合成生物;(4)スピロヘータおよび関連種;(5)Planctomyces;(6)Bacteroides、Flavobacteria;(7)Chlamydia;(8)緑色硫黄細菌;(9)緑色非硫黄細菌嫌気性光合成生物も);(10)放射線抵抗性ミクロコッカスおよび類縁体;(11)ThermotogaおよびThermosipho thermophiles。

0109

真核生物」は、細胞が、膜内に囲まれた核および他の小器官を含有する任意の生物体である。真核生物は、分類群EukaryaまたはEukaryotaに属する。真核細胞原核細胞(上述の細菌および古細菌)から分離する決定的なフィーチャは、これらが膜結合型小器官、特に、遺伝物質を含有し、核包膜によって囲まれている核を有することである。

0110

用語「遺伝的に改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、および「組換え株」は、本明細書で互換的に使用され、本開示のクローニングおよび形質転換方法によって遺伝的に改変された宿主細胞を指す。よって、この用語は、宿主細胞(例えば、細菌、酵母細胞真菌細胞、CHO、ヒト細胞など)であって、それが由来した天然に存在する生物体と比較して、それが変更された、改変された、または異なる遺伝子型および/または表現型(例えば、遺伝子改変が微生物のコーディング核酸配列に影響するとき)を呈するように遺伝的に変更、改変、または操作された、宿主細胞を含む。一部の実施形態では、この用語は、問題の特定の組換え宿主細胞だけでなく、このような宿主細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。

0111

用語「野生型微生物」または「野生型宿主細胞」は、天然に存在する細胞、すなわち、遺伝的に改変されていない細胞を記述する。

0112

用語「遺伝子操作された」は、宿主細胞のゲノムの任意のマニピュレーション(例えば、核酸の挿入、欠失、変異、または置き換えによる)を指すことができる。

0113

用語「対照」または「対照宿主細胞」は、遺伝子改変または実験処置の効果を決定するための適切な比較宿主細胞(comparator host cell)を指す。一部の実施形態では、対照宿主細胞は、野生型細胞である。他の実施形態では、対照宿主細胞は、処置宿主細胞を差別化する遺伝子改変(複数可)を除いて、遺伝的に改変された宿主細胞と遺伝的に同一である。一部の実施形態では、本開示は、対照宿主細胞としての親株(例えば、株改良プログラムの基礎として使用されたS1株)の使用を教示する。他の実施形態では、宿主細胞は、処置宿主細胞において試験されている特異的プロモーターまたはSNPを欠く遺伝的に同一の細胞であり得る。

0114

本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子(複数可)」は、遺伝子の1つまたは複数の代替形態のいずれかを意味し、これらの対立遺伝子すべては、少なくとも1つの形質または特性と関係する。二倍体細胞では、所与の遺伝子の2つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占有する。

0115

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座(locus)」(遺伝子座(loci)複数形)
は、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見出される染色体上の具体的な1つもしくは複数の場所または部位を意味する。

0116

本明細書で使用される場合、用語「遺伝的に連結された」は、2種またはそれ超の形質であって、これらが交雑によって分離するのが困難であるように、繁殖中に高い割合で共遺伝される、形質を指す。

0117

本明細書で使用される「組換え」または「組換え事象」は、染色体交差または独立組合せを指す。

0118

本明細書で使用される場合、用語「表現型」は、個々の遺伝子構造(すなわち、遺伝子型)と環境との間の相互作用から生じる個々の細胞、細胞培養物、生物体、または生物体の群の観察可能な特性を指す。

0119

本明細書で使用される場合、用語「キメラの」または「組換えの」は、核酸配列またはタンパク質配列を記述するとき、少なくとも2つの異種ポリヌクレオチドもしくは2つの異種ポリペプチドを連結して単一の巨大分子にする、または少なくとも1つの天然の核酸もしくはタンパク質配列の1つもしくは複数のエレメントを再編成する核酸またはタンパク質配列を指す。例えば、用語「組換えの」は、例えば、化学合成による、または遺伝子操作技法による核酸の単離セグメントのマニピュレーションによる、配列の2つの別の方法で分離されたセグメントの人工の組合せを指すことができる。

0120

本明細書で使用される場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、天然に存在することが知られていない、または天然に存在しないヌクレオチド配列である。一般に、このような合成ヌクレオチド配列は、任意の他の天然に存在するヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも1つのヌクレオチド差異を含む。

0121

本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはこれらの類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造を指し、よって、二本鎖および一本鎖DNA、ならびに二本鎖および一本鎖RNAを含む。これは、修飾核酸、例えば、メチル化および/またはキャッピングされた核酸、修飾塩基、主鎖修飾を含有する核酸なども含む。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用される。

0122

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連したDNAの任意のセグメントを指す。よって、遺伝子は、これらに限定されないが、コード配列および/またはこれらの発現に要求される調節配列を含む。遺伝子は、例えば、他のタンパク質認識配列を形成する非発現DNAセグメントも含み得る。遺伝子は、目的の源からのクローニング、または公知のもしくは予測された配列情報からの合成を含めた、様々な源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含み得る。

0123

本明細書で使用される場合、用語「相同の」または「相同体」または「オルソログ」は、当技術分野で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指す。用語「相同性」、「相同の」、「実質的に同様の」、および「実質的に対応する」は、本明細書で互換的に使用される。これらは、核酸断片であって、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介し、またはある特定の表現型を生じさせる核酸断片の能力に影響しない、核酸断片を指す。これらの用語は、本開示の核酸断片の修飾、例えば、最初の無修飾断片と比べて得られる核酸断片の機能的性質を実質的に変更しない1つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入も指す。したがって、当業者が十分に理解するように、本開示は、具体的な例示的な配列より多くを包含することが理解される。これらの用語は、1つの種、亜種、種類、栽培品種、または株内に見出される遺伝子と、別の種、亜種、種類、栽培品種、または株内の対応するまたは等価な遺伝子との間の関係を記述する。本開示の目的に関して、相同配列が比較される。「相同配列」または「相同体」または「オルソログ」は、機能的に関連していると見なされ、考えられ、または知られている。機能的関係は、これらに限定されないが、(a)配列同一性の程度および/または(b)同じもしくは同様の生物学的機能を含めた、いくつかのやり方のいずれか1つにおいて示され得る。好ましくは、(a)および(b)の両方が示される。相同性は、当技術分野で容易に利用可能なソフトウェアプログラム、Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubelら編、1987
年)補遺30、セクション7.718、表7.71に論じられたものなどを使用して決定することができる。いくつかの整列プログラムは、MacVector(Oxford Molecular Ltd、Oxford、U.K.)、ALIGN Plus(Scientific and Educational Software、Pennsylvania)、およびAlignX(VectorNTI、Invitrogen、Carlsbad、CA)である。別の整列プログラムは、デフォルトパラメータを使用するSequencher(Gene Codes、Ann Arbor、Michigan)である。

0124

本明細書で使用される場合、用語「内在性の」または「内在性遺伝子」は、天然に存在する遺伝子であって、それが宿主細胞ゲノム内に天然に見出される場所における天然に存在する遺伝子を指す。本開示との関連で、異種プロモーターを内在性遺伝子に作動可能に連結することは、既存の遺伝子であって、その遺伝子が天然に存在する場所における、既存の遺伝子の前に異種プロモーター配列を遺伝的に挿入することを意味する。本明細書に記載の内在性遺伝子は、本開示の方法のいずれかによって変異された天然に存在する遺伝子の対立遺伝子を含み得る。

0125

本明細書で使用される場合、用語「外因性の」は、用語「異種の」と互換的に使用され、その生来の源(native source)以外の何らかの源に由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性遺伝子」は、非生来の源または場所由来であり、生物系に人工的に供給されたタンパク質または遺伝子を指す。

0126

本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、ヌクレオチド置換、欠失、および/または挿入を指す。例えば、変異は、サイレント置換、付加、または欠失を生じさせるが、コードされるタンパク質の性質もしくは活性、またはタンパク質が作製される方法を変更しない変更を含有する。

0127

本明細書で使用される場合、用語「タンパク質修飾」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、アミノ酸置換アミノ酸修飾、欠失、および/または挿入を指す。

0128

本明細書で使用される場合、用語、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」は、このような配列の最小限のサイズ特性を有する部分、または最大で全長分子の、および全長分子を含めた、全長分子の任意のより大きい断片を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物活性部分をコードすることができる。遺伝子調節エレメントの生物活性部分は、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの1つの部分を単離し、本明細書に記載の活性を評価することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの部分は、4アミノ酸、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸などであり得、最大で全長ポリペプチドまで伸び得る。使用される部分の長さは、特定の用途に依存する。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の部分は、12ヌクレオチドという短さであり得;一部の実施形態では、それは、20ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの部分は、4アミノ酸という短さであり得る。完全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの部分は一般に、4アミノ酸より長いはずである。

0129

バリアントポリヌクレオチドは、DNAシャッフリングなどの変異誘発および組換え誘導(recombinogenic)手順に由来する配列も包含する。このようなDNAシャッフリングのストラテジーは、当技術分野で公知である。例えば、Stemmer(1994年)、PNAS、
91巻:10747〜10751頁;Stemmer(1994年)、Nature、370巻:38
9〜391頁;Crameriら(1997年)、Nature Biotech.、15巻:436〜438
頁;Mooreら(1997年)、J. Mol. Biol.、272巻:336〜347頁;Zhangら
(1997年)、PNAS、94巻:4504〜4509頁;Crameriら(1998年)、Nature、391巻:288〜291頁;ならびに米国特許第5,605,793号および同
第5,837,458号を参照。

0130

本明細書に開示のポリヌクレオチドのPCR増幅に関して、オリゴヌクレオチドプライマーを、目的の任意の生物体から抽出されたcDNAまたはゲノムDNAから対応するDNA配列を増幅するためのPCR反応で使用するのに設計することができる。PCRプライマーを設計しPCRクローニングするための方法は、当技術分野で一般に公知であり、Sambrookら(2001年)、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、New York)に開示されている。Innisら編(1990年)、PCR Protocols: A Guide to Methodsand Applications(Academic Press、New York);InnisおよびGelfand編(1995年)、PCR Strategies(Academic Press、New York);ならびにInnisおよびGelfand編(1999年)PCR Methods Manual(Academic Press、New York)も参照。PCRの公知の方法としては、これらに限定されないが、対プライマーネステッドプライマー、単一特異的プライマー縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを使用する方法が挙げられる。

0131

本明細書で使用される用語「プライマー」は、増幅標的アニールし、DNAポリメラーゼを結合させ、それによって、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、ヌクレオチド、およびDNAポリメラーゼなどの重合のための作用物質の存在下で、かつ適当な温度およびpHで配置されたとき、DNA合成開始点として機能を果たすことができるオリゴヌクレオチドを指す。(増幅)プライマーは、好ましくは、増幅の効率を最大にするために一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための作用物質の存在下で伸長産物の合成をプライムするのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、プライマーの温度および組成(A/T対G/C含有量)を含めた多くの因子に依存する。一対の双方向性プライマーは、PCR増幅などのDNA増幅の技術分野で一般に使用されるように、1つの順方向プライマーおよび1つの逆方向プライマーからなる。

0132

本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、コード配列または機能RNAの発現を制御することができるDNA配列を指す。一部の実施形態では、プロモーター配列は、近位およびより遠位上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性刺激することができるDNA配列であり、プロモーターの固有のエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が生来の遺伝子に由来する場合があり、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成される場合があり、または合成DNAセグメントを含むことさえできる。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型における、または発達の異なる段階における、または異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を指示することができることが当業者によって理解されている。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は、完全に画定されていないので、あるバリエーションのDNA断片は、同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識されている。

0133

本明細書で使用される場合、語句組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えDNAコンストラクト」は、本明細書で互換的に使用される。組換えコンストラクトは、核酸断片の人工の組合せ、例えば、天然に一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む。例えば、キメラコンストラクトは、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが、天然に見出されるものと異なる様式で配列されている調節配列およびコード配列を含み得る。このようなコンストラクトは、それ自体で使用することができ、またはベクターと併せて使用することができる。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本開示の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を順調に形質転換、選択、および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントをよく知っている。当業者は、異なる独立した形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし(Jonesら(1985
年)、EMBO J.、4巻:2411〜2418頁;De Almeidaら(1989年)、Mol. Gen. Genetics、218巻:78〜86頁)、よって、所望の発現レベルおよびパターン
ディスプレイする系(line)を得るために、複数の事象がスクリーニングされなければならないことも認識する。このようなスクリーニングは、とりわけ、DNAのサザン分析mRNA発現ノーザン分析タンパク質発現イムノブロッティング分析、または表現型分析によってなしとげることができる。ベクターは、自発的に複製する、または宿主細胞の染色体内に組み込むことができるプラスミド、ウイルスバクテリオファージ、プロ−ウイルス、ファージミドトランスポゾン人工染色体などであり得る。ベクターは、自律複製していないのRNAポリヌクレオチド、裸のDNAポリヌクレオチド、同じ鎖内のDNAおよびRNAの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲートDNAまたはRNA、ペプチドコンジュゲートDNAまたはRNA、リポソームコンジュゲートDNAなどでもあり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、mRNAまたはタンパク質(前駆体または成熟)の産生を指す。

0134

「作動可能に連結した」は、本文脈において、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、前記さらなるポリヌクレオチドの転写をもたらす連続した配置を意味する。

0135

本明細書で使用される用語「目的の産物」または「生体分子」は、供給原料から微生物によって産生される任意の産物を指す。一部の場合では、目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸合成化合物、燃料、アルコールなどであり得る。例えば、目的の産物または生体分子は、任意の一次または二次細胞代謝産物であり得る。一次代謝産物は、とりわけ、エタノールクエン酸乳酸グルタミン酸グルタメート、リシン、トレオニントリプトファン、および他のアミノ酸、ビタミン多糖などであり得る。二次代謝産物は、とりわけ、ペニシリンのような抗生物質化合物、またはシクロスポリンAのような免疫抑制剤ジベレリンのような植物ホルモンロバスタチンのようなスタチン薬グリセオフルビンのような殺真菌薬などであり得る。目的の産物、または生体分子は、微生物によって産生される任意の細胞内コンポーネント、例えば、カタラーゼアミラーゼプロテアーゼペクチナーゼグルコースイソメラーゼセルラーゼヘミセルラーゼリパーゼラクターゼストレプトキナーゼ、および多くのその他を含めた微生物酵素でもあり得る。細胞内コンポーネントとして、組換えタンパク質、例えば、インスリンB型肝炎ワクチン、インターフェロン顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなども挙げることができる。

0136

用語「炭素源」は一般に、細胞増殖のための炭素の源として使用されるのに適した物質を指す。炭素源としては、これらに限定されないが、バイオマス加水分解物デンプン、スクロース、セルロースヘミセルロースキシロース、およびリグニン、ならびにこれらの基質のモノマーコンポーネントが挙げられる。炭素源は、これらに限定されないが、ポリマー炭水化物、酸、アルコール、アルデヒドケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含めた様々な形態での様々な有機化合物を含み得る。これらとしては、例えば、様々な単糖、例えば、グルコースデキストロース(D−グルコース)など、マルトースオリゴ糖、多糖、飽和もしくは不飽和脂肪酸スクシネートラクテートアセテート、エタノールなど、またはこれらの混合物がある。光合成生物は、光合成の産物として炭素源をさらに産生することができる。一部の実施形態では、炭素源は、バイオマス加水分解物およびグルコースから選択され得る。

0137

用語「供給原料」は、他の産物が作製され得る微生物または発酵プロセスに供給される原料または原料の混合物として定義される。例えば、バイオマスまたはバイオマスに由来する炭素化合物などの炭素源は、発酵プロセスにおいて目的の産物(例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど)を産生する微生物の供給原料である。しかし、供給原料は、炭素源以外の栄養分を含有し得る。

0138

用語「体積生産性」または「生産速度」は、単位時間当たり、媒体の体積当たりに形成される産物の量として定義される。体積生産性は、1時間当たり1リットル当たりのグラム(g/L/h)で報告することができる。

0139

用語「比生産性」は、産物の形成の速度として定義される。比生産性は、1時間当たり細胞乾燥重量(CDW)1グラム当たりの産物のグラム(g/g CDW/h)での比生産性として本明細書でさらに定義される。所与の微生物のOD600に対するCDWの関係を使用して、比生産性を、1時間当たり600nmにおける培養ブロス光学密度(OD)当たり培養培地1リットル当たりの産物のグラム(g/L/h/OD)として表現することもできる。

0140

用語「収率」は、原料の単位重量当たりに得られる産物の量として定義され、基質1g当たりの産物のg(g/g)として表現することができる。収率は、理論的収率のパーセンテージとして表現することができる。「理論的収率」は、産物を作製するのに使用される代謝経路化学量論比によって決まる所与の量の基質あたりに産生され得る産物の最大量として定義される。

0141

用語「力価(titre)」または「力価(titer)」は、溶液の強度または溶液中の物質の濃度として定義される。例えば、発酵ブロス中の目的の産物(例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど)の力価は、発酵ブロス1リットル当たりの溶液中の目的の産物のg(g/L)として記述される。

0142

用語「総力価」は、プロセスにおける初期体積またはプロセスにおける操作体積に対する、プロセスから取り出され、回収される溶液中の目的の産物、適用可能な場合、気相中の目的の産物、および任意の目的の産物を含むがこれらに限定されない、プロセスにおいて産生されるすべての目的の産物の和として定義される。

0143

本明細書で使用される場合、用語「HTP遺伝子設計ライブラリー」または「ライブラリー」は、本開示による遺伝子撹乱のコレクションを指す。一部の実施形態では、本発明のライブラリーは、i)データベースまたは他のコンピューターファイル中の配列情報のコレクション、ii)上述の一連の遺伝子エレメントをコードする遺伝子コンストラクトのコレクション、またはiii)前記遺伝子エレメントを含む宿主細胞株として顕在化させ得る。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、個々のエレメントのコレクション(例えば、PROスワップライブラリーのプロモーターのコレクションまたはSTOPスワップライブラリーのターミネーターのコレクション)を指すことができる。他の実施形態では、本開示のライブラリーは、遺伝子エレメントの組合せ、例えば、プロモーター::遺伝子、遺伝子:ターミネーター、またはさらにはプロモーター:遺伝子:ターミネーターの組合せも指すことができる。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、宿主生物におけるライブラリーの各メンバーを適用する効果と関連したメタデータをさらに含む。例えば、本明細書で使用されるライブラリーは、特定の種における1つまたは複数の表現型に対するこれらの組合せの結果として生じる効果と一緒に、プロモーター::遺伝子配列組合せのコレクションを含み、よって、将来のプロモータースワップにおいて前記組合せを使用することについて将来の予測値を改善することができる。

0144

本明細書で使用される場合、用語「SNP」は、核内低分子多形(複数可)を指す。一部の実施形態では、本開示のSNPは、広く解釈されるべきであり、一塩基多型、配列挿入、欠失、反転、および他の配列置き換えを含む。本明細書で使用される場合、用語「非同義の」または「非同義SNP」は、宿主細胞タンパク質におけるコード変化をもたらす変異を指す。

0145

ゲノム操作の「ハイスループット(HTP)」方法は、自動化設備(例えば、液体ハンドラーまたはプレートハンドラーマシン)の少なくとも1つのピースを利用して、前記方法の少なくとも1つのステップを実行することができる。

0146

株改良の伝統的な方法
株改良の伝統的な手法は、2つのタイプの手法:指向株操作およびランダム変異誘発に広く分類され得る。

0147

株改良の指向操作方法は、特定の生物体の少数の遺伝子エレメントの計画された撹乱を伴う。これらの手法は、典型的には、特定の生合成プログラムまたは発生プログラムモジュレートすることに着目し、前記経路に影響する遺伝因子および代謝因子の先の知識を利用する。その最も単純な実施形態では、指向操作は、特徴付けられた形質(例えば、遺伝子、プロモーター、または測定可能な表現型を生じさせることができる他の遺伝子エレメント)を、1つの生物体から同じまたは異なる種の別の生物体への移入を伴う。

0148

株操作のランダム手法は、性能改善を同定するように設計された広範なスクリーニングに加えて、親株のランダム変異誘発を伴う。これらのランダム変異を生じさせる手法には、紫外線への曝露、またはメタンスルホン酸エチルなどの変異誘発化学物質が含まれる。ランダムで概ね予測不可能であるが、株改良のこの伝統的手法は、より指向性の遺伝子マニピュレーションと比較していくつかの利点を有していた。第1に、多くの工業用生物体は、これらの遺伝子レパートリーおよび代謝レパートリーの観点からあまりよく特徴付けられておらず(かつあまりよく特徴付けられていないままであり)、代替の指向改善手法を不可能でなくとも困難にした。

0149

第2に、比較的よく特徴付けられたシステムにおいてでさえ、工業的性能改善をもたらす遺伝子型の変化は、予測するのが困難であり、時に、既知および未知の機能の多くの遺伝子における累積的変異を必要とする上位性表現型として現れるだけである。

0150

さらに、長年、所与の工業用生物体において指向ゲノム変異を引き起こすのに要求される遺伝的ツールは、利用可能でなく、または非常に遅く、かつ/もしくは使用するのが困難であった。

0151

しかし、伝統的な株改良プログラムの適用の拡大により、所与の株系統における獲得が次第に低減し、最終的にさらなる株効率の可能性が枯渇する。有益なランダム変異は、相対的に希有な事象であり、大きいスクリーニングプールおよび高い変異率を必要とする。これは必然的に、「改善された」株における多くの中立のかつ/または有害な(もしくは部分的に有害な)変異の不慮の蓄積をもたらし、それは、最終的に将来の効率向上に対して重荷となる。

0152

伝統的な累積的改善手法の別の制限事項は、任意の株測定基準に対する任意の特定の変異の効果について分かっている情報が皆無かそれに近いことである。これは基本的に、有益な変異を組み合わせ、統合し、または中立のもしくは有害な変異誘発の「荷物(baggage)」を除去する研究者の能力を制限する。

0153

変異誘発系統内株間で変異をランダムに組み換える他の手法および技術が存在する。例えば、DNAシャッフリング、進化、または分子育種と時に呼ばれる反復的配列組換えのいくつかのフォーマットおよび例は、1994年2月17日に出願された米国特許出願第08/198,431号、1995年2月17日に出願された第PCT/US95/02126号、1995年4月18日に出願された第08/425,684号、1995年10月30日に出願された第08/537,874号、1995年11月30日に出願された第08/564,955号、1996年3月25日に出願された第08/621,859号、1996年3月25日に出願された第08/621,430号、1996年4月18日に出願された第PCT/US96/05480号、1996年5月20日に出願された第08/650,400号、1996年7月3日に出願された第08/675,502号、1996年9月27日に出願された第08/721,824号、および1996年9月27日に出願された第08/722,660号;Stemmer、Science、270巻:1510頁(1995年);Stemmerら、Gene、164巻:49〜53頁(1995年);Stemmer、Bio/Technology、13巻:549〜553頁(1995年);Stemmer、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、91巻:10747〜10751頁(1994年);Stemmer、Nature、370巻:389〜391頁(1994年);Crameriら、Nature Medicine、2巻(1号):1〜3頁(1996年);Crameriら、Nature Biotechnology、14巻:315〜319頁(1996年)に記載されている。これらのそれぞれは、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。

0154

これらとしては、プロトプラスト融合、および変異された株全体にわたるゲノム組換えを促進する全ゲノムシャッフリングなどの技法が挙げられる。酵母および糸状菌などの一部の工業用微生物について、天然の接合サイクル(mating cycle)もペアワイズゲノム
組換えのために活用することができる。このように、有害な変異を、変異体を親株で「戻し交配する」ことによって除去し、有益な変異を統合することができる。さらに、2つの異なる株系統由来の有益な変異を潜在的に組み合わせることができ、それにより、単一の株系統をそのままで変異させることから入手可能であり得るものよりもさらなる改善可能性がもたらされる。しかし、これらの手法は、多くの制限を受けやすく、それらは、本開示の方法を使用して回避される。

0155

例えば、上述した伝統的な組換え手法は、遅く、変異をスワップするのに相対的に少数のランダム組換えクロスオーバー事象を利用し、したがって、任意の所与のサイクルまたは期間内に試みることができる組合せの数が限定される。さらに、先行技術における自然組換え事象は、本質的にランダムであるが、これらもゲノムの位置的バイアスを受けやすい。

0156

最も重要なことに、伝統的な手法はまた、個々の変異の影響についてわずかな情報しか提供せず、組み換えられた変異のランダムな分配に起因して、多くの特定の組合せを生成および評価することができない。

0157

伝統的な株改良プログラムに関連した上述の問題の多くを克服するために、本開示は、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、データ分析、および機械学習プロトコールを統合するユニークなHTPゲノム操作プラットフォームを示す。この統合プラットフォームは、HTP遺伝子設計ライブラリーを構築するのに使用される一式のHTP分子ツールセットを利用する。これらの遺伝子設計ライブラリーは、以下で詳しく述べられる。

0158

教示されるHTPプラットフォームおよびそのユニークな微生物遺伝子設計ライブラリーは、微生物株発生および進化のパラダイムを基本的にシフトする。例えば、工業用微生物株を開発する伝統的な変異誘発ベース方法は、最終的に、何年ものランダム変異誘発にわたって蓄積された重い変異誘発性ロードを背負った微生物に至る。

0159

この問題を解決する(すなわち、これらの微生物によって蓄積された遺伝的荷物を除去する)能力は、数十年にわたって微生物研究者が成し遂げられなかった。しかし、本明細書に開示のHTPプラットフォームを利用すると、これらの工業用株を「再建する」ことができ、有害である遺伝子変異を同定および除去することができる。調和して、有益と同定される遺伝子変異を保持し、一部の場合では、改善することができる。結果として生じる微生物株は、これらの親株と比較して優れた表現型形質(例えば、目的の化合物の改善された産生)を実証する。

0160

さらに、本明細書に教示のHTPプラットフォームは、微生物株性能に対して個々の変異が有する効果を同定し、特徴付け、定量することができる。この情報、すなわち、所与の遺伝子変化xが宿主細胞表現型yに対してどのような効果を有するか(例えば、目的の化合物または産物の産生)を生成することができ、次いで、以下で論じられる微生物HTP遺伝子設計ライブラリーに記憶することができる。すなわち、各遺伝子順列についての配列情報および宿主細胞表現型に対するその効果が1つまたは複数のデータベースに記憶され、後続の分析(例えば、以下で論じられる上位性マッピング(epistasis mapping))に利用可能である。本開示は、遺伝子挿入コンストラクトの形態で、または前記遺伝子順列を含有する1種または複数の宿主細胞生物体の形態で貴重な遺伝子順列を物理的に保存/記憶する方法も教示する(例えば、以下で論じられるライブラリーを参照)。

0161

これらのHTP遺伝子設計ライブラリーをて洗練されたデータ分析および機械学習プロセスと統合された反復プロセスと結びつけると、宿主細胞を改善するための劇的に異なる方法が出現する。したがって、教示されるプラットフォームは、宿主細胞株を開発する先に論じられた伝統的な方法と基本的に異なる。教示されるHTPプラットフォームは、先の方法に関連した欠点の多くを被らない。これらおよび他の利点は、以下で論じられる、HTP分子ツールセットおよび得られる遺伝子設計ライブラリーを参照して明らかである。
遺伝子設計&微生物操作:一式のHTP分子ツールおよびHTP遺伝子設計ライブラリーを利用する株改良の系統的なコンビナトリアル手法

0162

上述した通り、本開示は、株全体にわたる遺伝子変化の反復性系統的導入および除去によって微生物生物体を操作するための新規HTPプラットフォームおよび遺伝子設計ストラテジーを提供する。プラットフォームは、HTP遺伝子設計ライブラリーの創製を可能にし、所与の宿主株への遺伝子変更の効率的なインプリメンテーションを可能にする一式の分子ツールによって支持される。

0163

本開示のHTP遺伝子設計ライブラリーは、特定の微生物株バックグラウンド内に導入され得る可能な遺伝子変更の源として機能を果たす。このように、HTP遺伝子設計ライブラリーは、所与の微生物株の初期のまたはさらなる操作に適用され得る遺伝的多様性の宝庫または遺伝子撹乱のコレクションである。宿主株へのインプリメンテーションのために遺伝子設計をプログラムするための技法は、本明細書にその全体が参照により組み込まれている「Microbial Strain Design System and Methodsfor Improved Large
Scale Production of Engineered Nucleotide Sequences」という表題の、係属中の米国特許出願第15/140,296号に記載されている。

0164

このプラットフォームで利用されるHTP分子ツールセットは、とりわけ、(1)プロモータースワップ(PROスワップ)、(2)SNPスワップ、(3)開始/停止コドン交換、(4)STOPスワップ、および(5)配列最適化を含み得る。本開示のHTP方法は、(6)上位性マッピングプロトコール、を含めたHTPツールセットの統合/コンビナトリアル使用を指示するための方法も教示する。上述した通り、この一式の分子ツールは、単独または組合せのいずれかで、HTP遺伝子設計宿主細胞ライブラリーの創製を可能にする。

0165

実証されるように、教示されるHTP微生物操作プラットフォームとの関連で上述のHTP遺伝子設計ライブラリーを利用すると、有益な「原因となる」変異または遺伝子区画の同定および統合、ならびにまた、受動変異または有害な変異または遺伝子区画の同定および除去が可能になる。この新しい手法は、伝統的なランダム変異誘発または指向遺伝子操作(directed genetic engineering)によって達成することができなかった株性能の急速な改善を可能にする。遺伝的荷重を除去し、または遺伝的荷重を有さない株内に有益な変化を統合すると、さらなる改善を可能にし得る追加のランダム変異誘発の新しい、ロバスト出発点も提供される。

0166

一部の実施形態では、本開示は、オルソゴナルな有益な変化が、変異誘発株系統の様々な個別分岐にわたって同定されるので、これらを、より良好に働く株へと急速に統合することもできることを教示する。これらの変異はまた、変異誘発系統の一部でない株、例えば、指向遺伝子操作によって獲得される改良を有する株へと統合され得る。

0167

一部の実施形態では、本開示は、それが、発現および非発現遺伝子エレメントを含む複数の異なるゲノム領域にわたって変異のゲノムワイドコンビナトリアル効果を分析し、集められた情報(例えば、実験結果)を使用して株を増強させることが予期される変異組合せを予測するという点で公知の株改良手法と異なる。

0168

一部の実施形態では、本開示は、i)開示される発明を介した改良に適用できる工業用微生物および他の宿主細胞、ii)下流分析のための多様性プールの生成、iii)大きいバリアントプールをハイスループットスクリーニングおよびシーケンシングするための方法およびハードウェア、iv)ゲノムワイド変異の相乗効果の機械学習コンピューター分析および予測のための方法およびハードウェア、ならびにv)ハイスループット株操作のための方法を教示する。

0169

以下の分子ツールおよびライブラリーは、例示的な微生物例の観点から論じられている。当業者は、本開示のHTP分子ツールは、真核細胞およびより高等生命体を含めた任意の宿主細胞に適合することを認識する。

0170

微生物操作プラットフォームで利用される様々なHTP遺伝子設計ライブラリーの創製を可能にする同定されたHTP分子ツールセットのそれぞれを、次に論じる。

0171

1.プロモータースワップ:プロモータースワップ微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
一部の実施形態では、本開示は、全宿主株表現型に対する有益な効果(例えば、収率または生産性)を生じさせるのに最適な発現性質を有するプロモーターを選択する方法を教示する。

0172

例えば、一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度(例えば、以下に論じられるプロモーターラダー)、または優れた調節性質(例えば、選択された遺伝子のより厳格調節制御)を呈する、宿主細胞内の1つもしくは複数のプロモーターを同定し、かつ/または1つもしくは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を教示する。これらの同定および/または生成されるプロモーターの特定の組合せを、以下でより詳細に説明されるプロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。

0173

次いで、問題のプロモーターラダーは、目的の所与の遺伝子と関連させられる。よって、プロモーターP1〜P8(一連の発現強度を呈するように同定および/または生成された8つのプロモーターを表す)を有し、プロモーターラダーを微生物中の目的の単一遺伝子と関連させる(すなわち、所与の標的遺伝子に作動可能に連結した所与のプロモーターで微生物を遺伝的に操作する)場合、8つのプロモーターの各組合せの効果を、操作された微生物が標的遺伝子と関連した特定のプロモーター(複数可)を除いて他の点では同一の遺伝的バックグラウンドを有することを考慮して、各コンビナトリアル取り組みの結果として生じる操作された株のそれぞれを特徴付けることによって確認することができる。

0174

このプロセスを介して操作された結果として生じる微生物は、HTP遺伝子設計ライブラリーを形成する。

0175

HTP遺伝子設計ライブラリーは、このプロセスを介して形成される実際の物理的な微生物株コレクションを指すことができ、各メンバー株は、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドにおいて、特定の標的遺伝子に作動可能に連結した所与のプロモーターを代表し、前記ライブラリーは、「プロモータースワップ微生物株ライブラリー」と呼ばれる。

0176

さらに、HTP遺伝子設計ライブラリーは、遺伝子撹乱のコレクションを指すことができ、この場合、所与のプロモーターxは、所与の遺伝子yに作動可能に連結しており、前記コレクションは、「プロモータースワップライブラリー」と呼ばれる。

0177

さらに、プロモーターP1〜P8を含む同じプロモーターラダーを利用して微生物を操作することができ、ここで、8つプロモーターのそれぞれは、10の異なる遺伝子標的に作動可能に連結される。この手順の結果は、目的の標的遺伝子に作動可能に連結した特定のプロモーターを除いて、他の点では遺伝的に同一と仮定される80の微生物である。これらの80の微生物は、適切にスクリーニングし、特徴付け、別のHTP遺伝子設計ライブラリーを生じさせることができる。HTP遺伝子設計ライブラリー内の微生物株を特徴付けると、リレーショナルデータベースオブジェクト指向データベース、または大規模分散NoSQLデータベースを含めた任意のデータ記憶コンストラクトに記憶することができる情報およびデータが生じる。このデータ/情報は、例えば、所与の遺伝子標的に作動可能に連結しているときの所与のプロモーター(例えば、P1〜P8)の効果であり得る。このデータ/情報は、プロモーターP1〜P8のうちの2つまたはそれ超を所与の遺伝子標的に作動可能に連結することから生じるより広いセットのコンビナトリアル効果でもあり得る。

0178

8のプロモーターおよび10の標的遺伝子の上述の例は、単に例示的であり、その理由は、この概念は、一連の発現強度および任意の所与の数の標的遺伝子の呈示に基づいて一緒にグループ化された任意の所与の数のプロモーターを用いて適用することができるためである。当業者は、任意の遺伝子標的の前に2つまたはそれ超のプロモーターを作動可能に連結する能力も認識する。よって、一部の実施形態では、本開示は、プロモーターラダー由来の1、2、3、またはそれ超のプロモーターが1つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結したプロモータースワップライブラリーを教示する。

0179

要約すると、様々なプロモーターを利用して生物体内の様々な遺伝子の発現を駆動することは、目的の形質を最適化する強力なツールである。本発明者らが開発したプロモータースワッピングの分子ツールは、少なくとも1つの条件下で少なくとも1つの遺伝子座の発現を変更することが実証されたプロモーター配列のラダーを使用する。次いでこのラダーは、ハイスループットゲノム操作を使用して生物体内の遺伝子の群に系統的に適用される。この群の遺伝子は、いくつかの方法のいずれか1つに基づいて目的の形質に影響を与える高い見込みを有すると決定される。これらは、目的の形質に対する公知の機能もしくは影響に基づく選択物、または先に決定された有益な遺伝的多様性に基づくアルゴリズム選択物を含み得る。一部の実施形態では、遺伝子の選択物は、所与の宿主内のすべての遺伝子を含み得る。他の実施形態では、遺伝子の選択物は、ランダムに選択された所与の宿主内のすべての遺伝子のサブセットであり得る。

0180

次いで、遺伝子に連結したプロモーター配列を含有する生物体の結果として生じるHTP遺伝子設計微生物株ライブラリーが、ハイスループットスクリーニングモデルにおいて性能について評価され、性能を増大させるプロモーター−遺伝子連鎖が決定され、情報がデータベースに記憶される。遺伝子撹乱(すなわち、所与の遺伝子yに作動可能に連結した所与のプロモーターx)のコレクションは、「プロモータースワップライブラリー」を形成し、これは、微生物操作処理で利用される潜在的な遺伝子変更の源として利用することができる。経時的に、より大きいセットの遺伝子撹乱は、より多様な宿主細胞バックグラウンドに対してインプリメントされるので、各ライブラリーは、実験的に確認されたデータのコーパスとしてより強力になり、それを使用して目的の任意のバックグラウンドに対する標的とした変化をより正確かつ予想通りに設計することができる。

0181

生物体内の遺伝子の転写レベルは、生物体挙動に影響するための重要な管理点である。転写は、翻訳(タンパク質発現)としっかりと共役し、このタンパク質は、生物体挙動を決定する量で発現される。細胞は、数千の異なるタイプのタンパク質を発現し、これらのタンパク質は、多数の複雑なやり方で相互作用して機能を生み出す。一連のタンパク質の発現レベルを系統的に変更することによって、機能は、複雑性のために、予測することが困難であるように変更され得る。一部の変更は、性能を増大させることができ、したがって、性能を評価するための機構連関して、この技法は、機能が改善された生物体の生成を可能にする。

0182

低分子合成経路との関連で、酵素は、基質で始まり、目的の低分子で終わる、直鎖または分岐鎖中で該酵素の低分子基質および産物を介して相互作用する。これらの相互作用は、順次連結されるので、このシステムは、分散制御を呈し、1つの酵素の発現の増大は、別の酵素が律速となるまで経路フラックスを増大させることができるだけである。

0183

代謝制御分析(MCA)は、実験データおよび第1原理から、どの1つまたは複数の酵素が律速であるかを決定するための方法である。しかし、MCAは、それが新しい律速な酵素を決定するのに各発現レベル変化後に広範な実験を必要とするので、限定されている。プロモータースワッピングは、この状況において有利であり、その理由は、プロモーターラダーを経路内の各酵素に適用することによって、律速の酵素が見出され、同じことを後続のラウンドで行って律速となる新しい酵素を見出すことができるためである。さらに、機能の読み取りは、目的の低分子のより良好な産生であるので、どの酵素が律速であるかを決定する実験は、産生を増大させる操作と同じであり、よって開発時間を短縮する。一部の実施形態では、本開示は、多ユニット酵素の個々のサブユニットをコードする遺伝子へのPROスワップの適用を教示する。さらに他の実施形態では、本開示は、個々の酵素、または生合成経路全体の調節を担う遺伝子にPROスワップ技法を適用する方法を教示する。

0184

一部の実施形態では、本開示のプロモータースワップツールを使用して、選択された遺伝子標的の最適の発現を同定することができる。一部の実施形態では、プロモータースワップの目標は、標的遺伝子の発現を増大させて代謝経路または遺伝経路における障壁を低減することであり得る。他の実施形態では、プロモータースワップの目標は、標的遺伝子の発現が要求されないとき、前記標的遺伝子の発現を低減して宿主細胞内の不要なエネルギー消費を回避することであり得る。

0185

転写、輸送、またはシグナル伝達のような他の細胞系という状況で、様々な合理的な方法を使用して、どのタンパク質が発現変化の標的であり、その変化が何であるべきかを経験的に試みて見出すことができる。これらの合理的な方法は、性能を改善するものを見出すのに試験されなければならない撹乱の数を低減するが、これらは、かなりのコストでそれを行う。遺伝子欠失スタディにより、その存在が特定の機能に極めて重要であるタンパク質が同定され、次いで重要な遺伝子を過剰発現させることができる。タンパク質相互作用の複雑性に起因して、これは、性能の増大において効果的でないことが多い。細胞におけるタンパク質レベル関数として転写またはシグナル伝達挙動を第1原理から記述することを試みる異なるタイプのモデルが開発された。これらのモデルは、多くの場合、発現変化が異なる機能または改善された機能をもたらし得る標的を示唆する。これらのモデルの根底をなす仮定は、過度単純化されており、パラメータは、測定するのが困難であり、したがって、これらが行う予測は、特に非モデル生物体について誤っていることが多い。遺伝子欠失およびモデル化の両方を用いると、ある特定の遺伝子にどのように影響するかを決定するのに要求される実験は、性能を改善する変化を起こすための後続の仕事と異なる。プロモータースワッピングは、これらの課題を回避し、その理由は、特定の撹乱の重要性を強調する構築された株も、すでに改良された株であるためである。

0186

よって、特定の実施形態では、プロモータースワッピングは、

0187

1.「ラダー」として作用する一連の「x」プロモーターを選択するステップ。理想的にはこれらのプロモーターは、多重ゲノム遺伝子座全体にわたって高度に多様な発現をもたらすことが示されているが、唯一の要件は、これらが遺伝子発現を何らかのやり方で撹乱することである。

0188

2.標的にする一連の「n」遺伝子を選択するステップ。このセットは、ゲノム内のあらゆるオープンリーディングフレーム(ORF)、またはORFのサブセットであり得る。サブセットは、先に実証された有益な撹乱(先のプロモータースワップもしくは先のSNPスワップ)との関連によって、先に生成された撹乱間の上位性相互作用に基づくアルゴリズム選択、標的にする有益なORFに関する仮説に基づく他の選択判定基準によって、またはランダム選択を介して、機能に関連したORFについてのアノテーションを使用して選択することができる。他の実施形態では、「n」標的化遺伝子は、非コードRNAを含めた非タンパク質コード遺伝子を含み得る。

0189

3.以下の遺伝子改変を迅速に、かつ一部の実施形態では、並行して実行するためのハイスループット株操作:生来のプロモーターが標的遺伝子nの前に存在し、その配列が公知であるとき、生来のプロモーターをラダー内のxプロモーターのそれぞれで置き換える。生来のプロモーターが存在せず、またはその配列が未知であるとき、ラダー内のxプロモーターのそれぞれを遺伝子nの前に挿入する(例えば、図21を参照)。このように、株の「ライブラリー」(HTP遺伝子設計ライブラリーとも呼ばれる)が構築され、ライブラリーの各メンバーは、他の点では同一の遺伝子状況(genetic context)においてn標的に作動可能に連結したxプロモーターの一事例である。先に記載したように、プロモーターの組合せを挿入し、ライブラリーが構築される組み合わせの可能性(combinatorial
possibility)の範囲を拡張することができる。

0190

4.1つまたは複数の測定基準に対する株の性能が最適化されている性能を示す状況における株のライブラリーのハイスループットスクリーニング。
を含むマルチステッププロセスである。

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