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技術 Cell−based assay法に基づいたハイスループット抗体検出方法

出願人 株式会社CeSPIA
発明者 谷村幸宏廣明洋子藤吉好則
出願日 2018年3月6日 (2年8ヶ月経過) 出願番号 2018-039602
公開日 2019年9月12日 (1年2ヶ月経過) 公開番号 2019-152604
状態 未査定
技術分野 ペプチド又は蛋白質 生物学的材料の調査,分析
主要キーワード 赤レーザ 青レーザ 水チャネル 単純拡散 抗サイログロブリン抗体 ザックス ループ部分 患者診断
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この項目の情報は公開日時点(2019年9月12日)のものです。
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図面 (20)

課題

多発性硬化症視神経脊髄炎スペクトラム疾患、および抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患を含む、疾患の診断に有用な情報を提供する抗体のハイスループット検出方法を提供すること。

解決手段

CBA法において複数の蛍光標識フローサイトメトリーを用いることで、抗AQP4抗体と抗MOG抗体などの複数の抗体を同時に検出することができる。CBA法に基づいたフローサイトメトリーを用いることで簡便、効率的、高感度に、かつ低コストで、試料中に含まれる抗体をハイスループットに検出する。また、生細胞を使用し精確な抗原タンパク質三次元立体構造を維持することにより検出感度が大幅に向上した。さらに、一度の測定において複数種類の抗体を同時に検出することができ、一度の測定において定量性のある膨大なデータを取得することができる。

概要

背景

多発性硬化症(multiple sclerosis:MS)は、オリゴデンドロサイトによって髄鞘が形成される脳・脊髄視神経などの中枢神経系に生じる慢性炎症脱髄疾患であり、時間的・空間的に病変が多発することを特徴とする。ここで、脱髄とは髄鞘が後天的に破壊される形態変化を指す。通常、詳細な病歴聴取や経時的な神経学診察により時間的・空間的な病変の多発性が証明され、他の疾患を十分に除外することで診断確定される。

一方、主として視神経と脊髄に由来する症候を呈する患者の中には、視神経脊髄炎スペクトラム疾患(neuromyelitis optica spectrum disorders:NMOSD)の病態を有する患者が含まれている。典型的な視神経脊髄炎(NMO)は、重度視神経炎横断性脊髄炎を特徴とする炎症性中枢神経疾患である。2004年にNMOに特異なIgG(NMO−IgG)が発見され、さらにアストロサイト足突起に高密度発現する水チャネルタンパク質であるアクアポリン−4(aquaporin-4:AQP4)がその標的抗原であることが報告された(特許文献1、非特許文献1)。典型的なNMOに加えて、視神経炎(再発性あるいは両眼性)や3椎体以上の長い脊髄炎のみの症例も、視神経脊髄炎関連疾患(NMO spectrum disorders:NMOSD)として同じ範疇の疾患として捉えられている。抗AQP4抗体はNMO/NMOSDにおける血液中バイオマーカーとして確立しており、特異的診断価値が認められている。このため、抗AQP4抗体検査は、NMO/NMOSDの診断と治療方針の決定にとって極めて重要な検査となる。

抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患は、近年新しい疾患概念として認識されつつある中枢神経系の炎症性脱髄疾患である。MOG(ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質;myelin oligodendrocyte glycoprotein)はミエリン鞘を構成する成分の一つであり、抗MOG抗体はこのMOGを認識する自己抗体である。抗MOG抗体が認められる患者の中には、抗AQP4抗体陰性NMO/NMOSDや再発性視神経炎、急性散在性脳脊髄炎の病態を有する患者が含まれている。本願では、抗MOG抗体陽性の脱髄疾患を広く捉えて抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患と記載する。抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患は、MSならびに抗AQP4抗体陽性NMO/NMOSDと異なる疾患群であることが報告されている(非特許文献2)。

これらの状況をふまえ脱髄性疾患患者に対する多発性硬化症の診断においては、視神経脊髄炎関連疾患などを鑑別する必要があるため、抗体検査を実施することが推奨されている。

概要

多発性硬化症、視神経脊髄炎スペクトラム疾患、および抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患を含む、疾患の診断に有用な情報を提供する抗体のハイスループット検出方法を提供すること。CBA法において複数の蛍光標識フローサイトメトリーを用いることで、抗AQP4抗体と抗MOG抗体などの複数の抗体を同時に検出することができる。CBA法に基づいたフローサイトメトリーを用いることで簡便、効率的、高感度に、かつ低コストで、試料中に含まれる抗体をハイスループットに検出する。また、生細胞を使用し精確な抗原タンパク質三次元立体構造を維持することにより検出感度が大幅に向上した。さらに、一度の測定において複数種類の抗体を同時に検出することができ、一度の測定において定量性のある膨大なデータを取得することができる。

目的

本発明は、多発性硬化症、視神経脊髄炎スペクトラム疾患、および抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患を含む、疾患の診断に有用な情報を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

被検者由来する試料中における2mn種の抗体を同時に検出または測定する方法であって、mは1以上の整数であり、nは1以上の整数であり、第1から第2mnの抗原タンパク質発現する細胞を調製する工程、該第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーター分析する工程を含む、方法。

請求項2

第1から第2mnの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、請求項1記載の方法。

請求項3

第1から第mnの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、請求項1または2記載の方法。

請求項4

第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。

請求項5

第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、請求項4記載の方法。

請求項6

第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、請求項4または5記載の方法。

請求項7

前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。

請求項8

前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜2mn−1種の細胞のみを使用することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。

請求項9

前記m段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項4〜8のいずれか一項記載の方法。

請求項10

前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項6〜9のいずれか一項記載の方法。

請求項11

第1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つがAQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体グリシン受容体GABAB受容体ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼLDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。

請求項12

被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞であって、mは1以上の整数であり、nは1以上の整数であり、第1から第mnの抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である細胞のうち、2以上を調製する工程、該2以上の細胞を含む2以上の細胞懸濁液を調製する工程、該2以上の細胞懸濁液の各々に対して被検者に由来する1種類の試料が加えられるように、該2以上の細胞懸濁液に2以上の試料を加える工程、該2以上の細胞懸濁液を1つの容器中で混合し、蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該混合した細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。

請求項13

第1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質である、請求項12記載の方法。

請求項14

第1から第2mnの抗原タンパク質が同一のタンパク質を含む、請求項12記載の方法。

請求項15

第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、請求項12〜14のいずれか一項記載の方法。

請求項16

前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜2mn−1種の細胞のみを使用することを特徴とする、請求項12〜15のいずれか一項記載の方法。

請求項17

前記m段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項12〜16のいずれか一項記載の方法。

請求項18

前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項12〜17のいずれか一項記載の方法。

請求項19

1以上の被検者に由来する2mn個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、mは1以上の整数であり、nは1以上の整数であり、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、1以上の被検者に由来する第1から第2mnの試料を、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、被検者に由来する試料を加えた第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を1つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。

請求項20

第1から第2mnの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、請求項19記載の方法。

請求項21

第1から第mnの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、請求項19または20記載の方法。

請求項22

第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、請求項19〜21のいずれか一項記載の方法。

請求項23

第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、請求項22記載の方法。

請求項24

第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、請求項22または23記載の方法。

請求項25

前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、請求項19〜24のいずれか一項記載の方法。

請求項26

第1から第2mnの抗原タンパク質が同じタンパク質である、請求項19〜25のいずれか一項記載の方法。

請求項27

第1から第2mnの抗原タンパク質が異なるタンパク質を含む、請求項19〜25のいずれか一項記載の方法。

請求項28

前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜2mn−1種の細胞のみを使用し、2〜2mn−1種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することを特徴とする、請求項19〜27のいずれか一項記載の方法。

請求項29

前記m段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項22〜28のいずれか一項記載の方法。

請求項30

前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、請求項24〜29のいずれか一項記載の方法。

請求項31

第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、請求項19〜30のいずれか一項記載の方法。

請求項32

第1から第2mnの試料が全て異なる試料である、請求項19〜31のいずれか一項記載の方法。

請求項33

第1から第2mnの試料が同一の試料を含む、請求項19〜31のいずれか一項記載の方法。

請求項34

被検者に由来する試料が血清血漿全血脳脊髄液唾液、および尿から成る群より選択される、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。

請求項35

前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、請求項2〜18、20〜34のいずれか一項記載の方法。

請求項36

前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、OregonGreen、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、請求項4〜18、22〜35のいずれか一項記載の方法。

請求項37

前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、OregonGreen、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、請求項7〜18、25〜36のいずれか一項記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、試料中に含まれる抗体をcell-based assay法に基づきハイスループットに検出する方法に関する。より詳細には、自己免疫疾患に関連する自己抗体、例えば視神経脊髄炎スペクトラム疾患(NMOSD)および抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患に関連する自己抗体を含む、複数の抗体を同時に、または個々の抗体を複数の試料について同時に検出する方法に関し、特に、アクアポリン−4(AQP4)およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)に対する抗体を検出する方法に関する。また、本発明は、これらの抗体の検出に基づく、疾患の診断方法にも関する。

背景技術

0002

多発性硬化症(multiple sclerosis:MS)は、オリゴデンドロサイトによって髄鞘が形成される脳・脊髄視神経などの中枢神経系に生じる慢性炎症脱髄疾患であり、時間的・空間的に病変が多発することを特徴とする。ここで、脱髄とは髄鞘が後天的に破壊される形態変化を指す。通常、詳細な病歴聴取や経時的な神経学診察により時間的・空間的な病変の多発性が証明され、他の疾患を十分に除外することで診断確定される。

0003

一方、主として視神経と脊髄に由来する症候を呈する患者の中には、視神経脊髄炎スペクトラム疾患(neuromyelitis optica spectrum disorders:NMOSD)の病態を有する患者が含まれている。典型的な視神経脊髄炎(NMO)は、重度視神経炎横断性脊髄炎を特徴とする炎症性中枢神経疾患である。2004年にNMOに特異なIgG(NMO−IgG)が発見され、さらにアストロサイト足突起に高密度発現する水チャネルタンパク質であるアクアポリン−4(aquaporin-4:AQP4)がその標的抗原であることが報告された(特許文献1、非特許文献1)。典型的なNMOに加えて、視神経炎(再発性あるいは両眼性)や3椎体以上の長い脊髄炎のみの症例も、視神経脊髄炎関連疾患(NMO spectrum disorders:NMOSD)として同じ範疇の疾患として捉えられている。抗AQP4抗体はNMO/NMOSDにおける血液中バイオマーカーとして確立しており、特異的診断価値が認められている。このため、抗AQP4抗体検査は、NMO/NMOSDの診断と治療方針の決定にとって極めて重要な検査となる。

0004

抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患は、近年新しい疾患概念として認識されつつある中枢神経系の炎症性脱髄疾患である。MOG(ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質;myelin oligodendrocyte glycoprotein)はミエリン鞘を構成する成分の一つであり、抗MOG抗体はこのMOGを認識する自己抗体である。抗MOG抗体が認められる患者の中には、抗AQP4抗体陰性NMO/NMOSDや再発性視神経炎、急性散在性脳脊髄炎の病態を有する患者が含まれている。本願では、抗MOG抗体陽性の脱髄疾患を広く捉えて抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患と記載する。抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患は、MSならびに抗AQP4抗体陽性NMO/NMOSDと異なる疾患群であることが報告されている(非特許文献2)。

0005

これらの状況をふまえ脱髄性疾患患者に対する多発性硬化症の診断においては、視神経脊髄炎関連疾患などを鑑別する必要があるため、抗体検査を実施することが推奨されている。

0006

国際公開パンフレットWO2005/051178

先行技術

0007

Lennon et al., JEM, Vol.202, No.4, August 15, 2005, 473-477.
Kaneko et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, Vol.87, No.11, November, 2016, 1257-1259

発明が解決しようとする課題

0008

本発明は、多発性硬化症、視神経脊髄炎スペクトラム疾患、および抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患を含む、疾患の診断に有用な情報を提供する抗体のハイスループットな検出方法を提供することを目的の一つとする。また、本発明の目的には、抗体の検出をより簡便かつ高感度に行う手法を提供することも含まれる。

課題を解決するための手段

0009

本発明者らは、Cell-based assay法(CBA法)に基づいたフローサイトメトリーを用いることで簡便、効率的、高感度に、かつ低コストで、試料中に含まれる抗体をハイスループットに検出することを可能とする手法を開発した。本発明により、検体処理の簡便化を実現すると共に、検体処理からデータ取得までにかかる時間を大幅に削減することに成功した。また、生細胞を使用し精確な抗原タンパク質三次元立体構造を維持することによる検出感度の大幅な向上に成功した。また、一度の測定において複数種類の抗体を同時に検出することに成功し、一度の測定において定量性のある膨大なデータを取得することに成功した。本発明者らが開発した手法により、例えば抗AQP4抗体、抗MOG抗体、抗NMDA抗体、抗LGI1抗体、抗CASPR2抗体、抗AMPA受容体抗体、抗グリシン受容体抗体、抗GABAB受容体抗体、抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体、抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ抗体、抗LDL受容体関連タンパク質4抗体、抗リアノジン受容体抗体、抗ジヒドロピリジン受容体抗体および抗kv1.4抗体などの複数の抗体を単一の試料から同時に高感度に検出することができる。また、本発明者らが開発した手法により、複数の試料に含まれる抗体の検出を同時に行うことが可能となる。本発明の手法の態様には、以下が包含される:

0010

A:12種類の抗体の同時検出方法
[態様A1]被検者に由来する試料中における第1から第12の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第3の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第4の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第5の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第6の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第7の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第8の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第9の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第10の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第11の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第12の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーター分析する工程
を含む、方法。
[態様A2]第1から第12の抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はバイシストニック(IRES発現ベクター(IRES:Internal Ribosome Entry Site)を用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様A1記載の方法。
[態様A3]第1から第6の抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第7から第12の抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様A1またはA2記載の方法。
[態様A4]第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されている、態様A1〜A3のいずれか記載の方法。
[態様A5]第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様A1〜A4のいずれか記載の方法。
[態様A6]第2、第5、第8および第11の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3、第6、第9および第12の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である、態様A1〜A5のいずれか記載の方法。
[態様A7]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様A1〜A6のいずれか記載の方法。
[態様A8]被検者に由来する試料が血清血漿全血脳脊髄液唾液、および尿から成る群より選択される、態様A1〜A7のいずれか記載の方法。
[態様A9]第1から第12の抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、それぞれAQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様A1〜A8のいずれか記載の方法。
[態様A10]前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様A2〜A9のいずれか記載の方法。
[態様A11]前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様A4〜A10のいずれか記載の方法。
[態様A12]前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様A7〜A11のいずれか記載の方法。
[態様A13]前記第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜11種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様A1〜A12のいずれか記載の方法。
[態様A14]被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞であって、第1から第12の抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1から第6の抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第7から第12の抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されており、そして、第2、第5、第8および第11の抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3、第6、第9および第12の抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である細胞のうち、2以上を調製する工程、該2以上の細胞を含む2以上の細胞懸濁液を調製する工程、該2以上の細胞懸濁液の各々に対して被検者に由来する1種類の試料が加えられるように、該2以上の細胞懸濁液に2以上の試料を加える工程、該2以上の細胞懸濁液を1つの容器中で混合し、蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該混合した細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。
[態様A15]第1から第12の抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質である、態様A14記載の方法。
[態様A16]第1から第12の抗原タンパク質が同一のタンパク質を含む、態様A14記載の方法。
[態様A17]第1から第12の抗原タンパク質が、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様A14〜A16のいずれか記載の方法。
[態様A18]前記第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜11種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様A14〜A17のいずれか記載の方法。

0011

B:4種類の抗体の同時検出方法
[態様B1]被検者に由来する試料中における第1の抗体、第2の抗体、第3の抗体、および第4の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第3の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第4の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1から第4の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様B2]第1から第4の抗原タンパク質のぞれそれが蛍光タンパク質と融合しているか又は第1から第4の抗原タンパク質のぞれそれがIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様B1記載の方法。
[態様B3]第1および第2の抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又は第1および第2の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第3および第4の抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又は第3および第4の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様B1またはB2記載の方法。
[態様B4]第2の抗原タンパク質を発現する細胞および第4の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されている、態様B1〜B3のいずれか記載の方法。
[態様B5]第2の抗原タンパク質を発現する細胞および第4の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様B1〜B4のいずれか記載の方法。
[態様B6]第1から第4の抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又は第1から第4の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第2の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第2の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能であり、第4の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様B1またはB2記載の方法。
[態様B7]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様B1〜B6のいずれか記載の方法。
[態様B8]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様B1〜B7のいずれか記載の方法。
[態様B9]第1から第4の抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、それぞれAQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様B1〜B8のいずれか記載の方法。
[態様B10]前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様B2〜B9のいずれか記載の方法。
[態様B11]前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様B4〜B10のいずれか記載の方法。
[態様B12]前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様B7〜B11のいずれか記載の方法。
[態様B13]前記第1から第4の抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜3種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様B1〜B12のいずれか記載の方法。

0012

C:2種類の抗体の同時検出方法
[態様C1]被検者に由来する試料中における第1の抗体および第2の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1および第2の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様C2]第1および第2の抗原タンパク質のぞれそれが蛍光タンパク質と融合しているか又は第1および第2の抗原タンパク質のぞれそれがIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様C1記載の方法。
[態様C3]第1の抗原タンパク質が第1の蛍光タンパク質と融合しているか又は第1の抗原タンパク質がIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2の抗原タンパク質が第2の蛍光タンパク質と融合しているか又は第2の抗原タンパク質がIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とが同一の蛍光タンパク質である、態様C1またはC2記載の方法。
[態様C4]第1の抗原タンパク質が第1の蛍光タンパク質と融合しているか又は第1の抗原タンパク質がIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2の抗原タンパク質が第2の蛍光タンパク質と融合しているか又は第2の抗原タンパク質がIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様C1またはC2記載の方法。
[態様C5]第2の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されている、態様C1〜C4のいずれか記載の方法。
[態様C6]第2の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体で標識されている、態様C1〜C5のいずれか記載の方法。
[態様C7]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様C1〜C6のいずれか記載の方法。
[態様C8]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様C1〜C7のいずれか記載の方法。
[態様C9]第1および第2の抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、それぞれAQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様C1〜C8のいずれか記載の方法。
[態様C10]前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様C2〜C9のいずれか記載の方法。
[態様C11]前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様C5〜C10のいずれか記載の方法。
[態様C12]前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様C7〜C11のいずれか記載の方法。

0013

D:抗AQP4抗体および抗MOG抗体の同時検出方法
[態様D1]被検者に由来する試料中における抗AQP4抗体および抗MOG抗体を同時に検出または測定する方法であって、
AQP4タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
MOGタンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該AQP4タンパク質を発現する細胞と該MOGタンパク質を発現する細胞とを含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様D2]AQP4タンパク質が蛍光タンパク質と融合している、態様D1記載の方法。
[態様D3]MOGタンパク質が蛍光タンパク質と融合している、態様D1またはD2記載の方法。
[態様D4]AQP4タンパク質が融合している蛍光タンパク質とMOGタンパク質が融合している蛍光タンパク質とが同一である、態様D3記載の方法。
[態様D5]AQP4タンパク質を発現する細胞およびMOGタンパク質を発現する細胞のいずれか一方または両方が蛍光色素もしくは蛍光タンパク質で標識されている、態様D4記載の方法。
[態様D6]AQP4タンパク質を発現する細胞およびMOGタンパク質を発現する細胞のいずれか一方または両方が蛍光色素もしくは蛍光タンパク質の接合した抗体で標識されている、態様D4またはD5記載の方法。
[態様D7]AQP4タンパク質が融合している蛍光タンパク質とMOGタンパク質が融合している蛍光タンパク質とが異なるものである、態様D3記載の方法。
[態様D8]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様D1〜D7のいずれか記載の方法。
[態様D9]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、および脳脊髄液から成る群より選択される、態様D1〜D8のいずれか記載の方法。
[態様D10]AQP4タンパク質が融合している蛍光タンパク質がEGFPである、態様D2〜D9のいずれか記載の方法。
[態様D11]MOGタンパク質が融合している蛍光タンパク質がEGFPである、態様D3〜D9のいずれか記載の方法。
[態様D12]AQP4タンパク質を発現する細胞およびMOGタンパク質を発現する細胞のいずれか一方がHoechst 33342で標識されている、態様D5〜D11のいずれか記載の方法。
[態様D13]前記二次抗体がAlexa Fluor 647で標識されている、態様D8〜D12のいずれか記載の方法。

0014

E:4n種類の抗体の同時検出方法
[態様E1]被検者に由来する試料中における4n種の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
nは1以上の整数であり、
第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含み、
第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、
同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能である、
方法。
[態様E2]第1から第4nの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様E1記載の方法。
[態様E3]第1から第2nの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2n+1から第4nの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様E1またはE2記載の方法。
[態様E4]第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されている、態様E1〜E3のいずれか記載の方法。
[態様E5]第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様E1〜E4のいずれか記載の方法。
[態様E6]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様E1〜E5のいずれか記載の方法。
[態様E7]前記第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜4n−1種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様E1〜E6のいずれか記載の方法。
[態様E8]前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様E1〜E7のいずれか記載の方法。
[態様E9]被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞であって、nは1以上の整数であり、第1から第4nの抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1から第2nの抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2n+1から第4nの抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されており、そして、第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能である細胞のうち、2以上を調製する工程、該2以上の細胞を含む2以上の細胞懸濁液を調製する工程、該2以上の細胞懸濁液の各々に対して被検者に由来する1種類の試料が加えられるように、該2以上の細胞懸濁液に2以上の試料を加える工程、該2以上の細胞懸濁液を1つの容器中で混合し、蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該混合した細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。
[態様E10]第1から第4nの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質である、態様E9記載の方法。
[態様E11]第1から第4nの抗原タンパク質が同一のタンパク質を含む、態様E9記載の方法。
[態様E12]前記第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜4n−1種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様E9〜E11のいずれか記載の方法。
[態様E13]前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様E9〜E12のいずれか記載の方法。

0015

F:12種類の試料中の抗体の同時検出方法
[態様F1]1以上の被検者に由来する12種類の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
1以上の被検者に由来する第1から第12の試料を、第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞を1つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様F2]第1から第12の抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様F1記載の方法。
[態様F3]第1から第6の抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第7から第12の抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様F1またはF2記載の方法。
[態様F4]第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されている、態様F1〜F3のいずれか記載の方法。
[態様F5]第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様F1〜F4のいずれか記載の方法。
[態様F6]第2、第5、第8および第11の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3、第6、第9および第12の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である、態様F1〜F5のいずれか記載の方法。
[態様F7]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様F1〜F6のいずれか記載の方法。
[態様F8]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様F1〜F7のいずれか記載の方法。
[態様F9]第1から第12の抗原タンパク質が同じタンパク質である、態様F1〜F8のいずれか記載の方法。
[態様F10]第1から第12の抗原タンパク質が異なるタンパク質を含む、態様F1〜F8のいずれか記載の方法。
[態様F11]前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様F2〜F10のいずれか記載の方法。
[態様F12]前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様F4〜F11のいずれか記載の方法。
[態様F13]前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様F7〜F12のいずれか記載の方法。
[態様F14]前記第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜11種の細胞のみを使用し、2〜11種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することを特徴とする、態様F1〜F13のいずれか記載の方法。
[態様F15]第1から第12の抗原タンパク質が、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様F1〜F14のいずれか記載の方法。
[態様F16]第1から第12の試料が全て異なる試料である、態様F1〜F15のいずれか記載の方法。
[態様F17]第1から第12の試料が同一の試料を含む、態様F1〜F15のいずれか記載の方法。

0016

G:4n種類の試料中の抗体の同時検出方法
[態様G1]1以上の被検者に由来する4n個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、
nは1以上の整数であり、
第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
1以上の被検者に由来する第1から第4nの試料を、第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞を1つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含み、
第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、
同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能である、
方法。
[態様G2]第1から第4nの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様G1記載の方法。
[態様G3]第1から第2nの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2n+1から第4nの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様G1またはG2記載の方法。
[態様G4]第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されている、態様G1〜G3のいずれか記載の方法。
[態様G5]第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている、態様G1〜G4のいずれか記載の方法。
[態様G6]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様G1〜G5のいずれか記載の方法。
[態様G7]第1から第4nの抗原タンパク質が同じタンパク質である、態様G1〜G6のいずれか記載の方法。
[態様G8]第1から第4nの抗原タンパク質が異なるタンパク質を含む、態様G1〜G6のいずれか記載の方法。
[態様G9]前記第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜4n−1種の細胞のみを使用し、2〜4n−1種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することを特徴とする、態様G1〜G8のいずれか記載の方法。
[態様G10]前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様G1〜G9のいずれか記載の方法。
[態様G11]第1から第4nの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様G1〜G10のいずれか記載の方法。
[態様G12]第1から第4nの試料が全て異なる試料である、態様G1〜G11のいずれか記載の方法。
[態様G13]第1から第4nの試料が同一の試料を含む、態様G1〜G11のいずれか記載の方法。

0017

H:2mn種類の抗体の同時検出方法
[態様H1]被検者に由来する試料中における2mn種の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
mは1以上の整数であり、
nは1以上の整数であり、
第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様H2]第1から第2mnの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様H1記載の方法。
[態様H3]第1から第mnの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様H1またはH2記載の方法。
[態様H4]第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、
第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、態様H1〜H3のいずれか記載の方法。
[態様H5]第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、態様H4記載の方法。
[態様H6]第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、態様H4またはH5記載の方法。
[態様H7]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様H1〜H6のいずれか記載の方法。
[態様H8]前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜2mn−1種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様H1〜H7のいずれか記載の方法。
[態様H9]前記m段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様H4〜H8のいずれか記載の方法。
[態様H10]前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様H6〜H9のいずれか記載の方法。
[態様H11]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様H1〜H10のいずれか記載の方法。
[態様H12]第1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質であり、第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つがAQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様H1〜H11のいずれか記載の方法。
[態様H13]前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様H2〜H12のいずれか記載の方法。
[態様H14]前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様H4〜H13のいずれか記載の方法。
[態様H15]前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様H7〜H14のいずれか記載の方法。
[態様H16]被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞であって、mは1以上の整数であり、nは1以上の整数であり、第1から第mnの抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である細胞のうち、2以上を調製する工程、該2以上の細胞を含む2以上の細胞懸濁液を調製する工程、該2以上の細胞懸濁液の各々に対して被検者に由来する1種類の試料が加えられるように、該2以上の細胞懸濁液に2以上の試料を加える工程、該2以上の細胞懸濁液を1つの容器中で混合し、蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該混合した細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む、方法。
[態様H17]第1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ互いに異なるタンパク質である、態様H16記載の方法。
[態様H18]第1から第2mnの抗原タンパク質が同一のタンパク質を含む、態様H16記載の方法。
[態様H19]第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様H16〜H18のいずれか記載の方法。
[態様H20]前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜2mn−1種の細胞のみを使用することを特徴とする、態様H16〜H19のいずれか記載の方法。
[態様H21]前記m段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様H16〜H20のいずれか記載の方法。
[態様H22]前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様H16〜H21のいずれか記載の方法。

0018

I:2mn種類の試料中の抗体の同時検出方法
[態様I1]1以上の被検者に由来する2mn個の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法であって、
mは1以上の整数であり、
nは1以上の整数であり、
第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞をそれぞれ別個の容器中に調製する工程、
1以上の被検者に由来する第1から第2mnの試料を、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、
被検者に由来する試料を加えた第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を1つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法。
[態様I2]第1から第2mnの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される、態様I1記載の方法。
[態様I3]第1から第mnの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である、態様I1またはI2記載の方法。
[態様I4]第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、
第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、態様I1〜I3のいずれか記載の方法。
[態様I5]第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能である、態様I4記載の方法。
[態様I6]第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、態様I4またはI5記載の方法。
[態様I7]前記細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を含む、態様I1〜I6のいずれか記載の方法。
[態様I8]第1から第2mnの抗原タンパク質が同じタンパク質である、態様I1〜I7のいずれか記載の方法。
[態様I9]第1から第2mnの抗原タンパク質が異なるタンパク質を含む、態様I1〜I7のいずれか記載の方法。
[態様I10]前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞より選択される2〜2mn−1種の細胞のみを使用し、2〜2mn−1種類の試料中における抗体を同時に検出または測定することを特徴とする、態様I1〜I9のいずれか記載の方法。
[態様I11]前記m段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様I4〜I10のいずれか記載の方法。
[態様I12]前記n段階の強度で標識された細胞に、非標識の細胞が含まれる、態様I6〜I11のいずれか記載の方法。
[態様I13]被検者に由来する試料が血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から成る群より選択される、態様I1〜I12のいずれか記載の方法。
[態様I14]前記蛍光タンパク質が、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、およびKikumeGRから成る群より選択される、態様I2〜I13のいずれか記載の方法。
[態様I15]前記蛍光色素もしくは蛍光タンパク質がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択される、態様I4〜I14のいずれか記載の方法。
[態様I16]前記二次抗体がAcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy Green FM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるいずれかで標識されている、態様I7〜I15のいずれか記載の方法。
[態様I17]第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つが、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から成る群より選択される、態様I1〜I16のいずれか記載の方法。
[態様I18]第1から第2mnの試料が全て異なる試料である、態様I1〜I17のいずれか記載の方法。
[態様I19]第1から第2mnの試料が同一の試料を含む、態様I1〜I17のいずれか記載の方法。

図面の簡単な説明

0019

被検者に由来する試料中における抗AQP4抗体および抗MOG抗体の同時検出の際に使用する細胞サンプル作製手順を例示した図である。
図1で作製した細胞サンプルを用いて行う、フローサイトメトリー解析の方法を示した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(58女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。
視神経脊髄炎関連疾患患者(58歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図3−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(58歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図3−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーター展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(58歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図3−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図3−3と図3−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。
視神経脊髄炎関連疾患患者(58歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図3−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(58歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図3−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(58歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図3−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図3−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうちの30.4%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗AQP4抗体陽性であると判断した。
視神経脊髄炎関連疾患患者(58歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図3−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図3−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうち僅かに0.35%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗MOG抗体陰性であると判断した。
視神経脊髄炎関連疾患患者(44歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。
視神経脊髄炎関連疾患患者(44歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図4−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(44歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図4−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(44歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図4−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図4−3と図4−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。
視神経脊髄炎関連疾患患者(44歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図4−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(44歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図4−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(44歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図4−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図4−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうちの28.3%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗AQP4抗体陽性であると判断した。
視神経脊髄炎関連疾患患者(44歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陽性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図4−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図4−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの14.0%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗MOG抗体陽性であると判断した。
視神経脊髄炎関連疾患患者(57歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体弱陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。
視神経脊髄炎関連疾患患者(57歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体弱陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図5−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(57歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体弱陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図5−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(57歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体弱陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図5−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図5−3と図5−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。
視神経脊髄炎関連疾患患者(57歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体弱陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図5−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(57歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体弱陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図5−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。
視神経脊髄炎関連疾患患者(57歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体弱陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図5−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図5−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに0.12%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗AQP4抗体陰性であると判断した。
視神経脊髄炎関連疾患患者(57歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体弱陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図5−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図5−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの3.50%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗MOG抗体弱陽性であると判断した。
多発性硬化症患者(23歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。
多発性硬化症患者(23歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図6−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。
多発性硬化症患者(23歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図6−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。
多発性硬化症患者(23歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図6−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図6−3と図6−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。
多発性硬化症患者(23歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図6−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。
多発性硬化症患者(23歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図6−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。
多発性硬化症患者(23歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図6−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図6−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに0.26%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗AQP4抗体陰性であると判断した。
多発性硬化症患者(23歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図6−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図6−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの20.1%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗MOG抗体陽性であると判断した。
多発性硬化症患者(50歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。
多発性硬化症患者(50歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図7−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。
多発性硬化症患者(50歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図7−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。
多発性硬化症患者(50歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図7−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図7−3と図7−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。
多発性硬化症患者(50歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図7−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。
多発性硬化症患者(50歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図7−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。
多発性硬化症患者(50歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図7−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図7−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに0.44%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗AQP4抗体陰性であると判断した。
多発性硬化症患者(50歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図7−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図7−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうち僅かに0.24%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗MOG抗体陰性であると判断した。
視神経炎患者(78歳男性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。
視神経炎患者(78歳男性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図8−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。
視神経炎患者(78歳男性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図8−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。
視神経炎患者(78歳男性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図8−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図8−3と図8−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。
視神経炎患者(78歳男性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図8−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。
視神経炎患者(78歳男性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図8−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。
視神経炎患者(78歳男性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図8−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図8−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに0.26%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗AQP4抗体陰性であると判断した。
視神経炎患者(78歳男性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図8−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図8−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの21.4%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗MOG抗体陽性であると判断した。
再発性急性散在性脳脊髄炎患者(15歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。
再発性急性散在性脳脊髄炎患者(15歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図9−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。
再発性急性散在性脳脊髄炎患者(15歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図9−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。
再発性急性散在性脳脊髄炎患者(15歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図9−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図9−3と図9−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。
再発性急性散在性脳脊髄炎患者(15歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図9−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。
再発性急性散在性脳脊髄炎患者(15歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図9−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。
再発性急性散在性脳脊髄炎患者(15歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図9−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図9−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに0.40%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗AQP4抗体陰性であると判断した。
再発性急性散在性脳脊髄炎患者(15歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陽性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図9−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在する(本データでは、図9−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうちの6.40%の細胞が存在する)ことから、本血清は抗MOG抗体陽性であると判断した。
健常者(24歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。
健常者(24歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図10−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。
健常者(24歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図10−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。
健常者(24歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図10−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図10−3と図10−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。
健常者(24歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図10−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342陽性細胞群に対してP6ゲートを作成した図である。
健常者(24歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図10−5のHoechst 33342陰性細胞群ならびに陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。
健常者(24歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図10−5のP5ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗AQP4抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図10−5のP5ゲートHoechst 33342陰性細胞群のうち僅かに0.076%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗AQP4抗体陰性であると判断した。
健常者(24歳女性)から採取した血清の検査結果(抗AQP4抗体陰性かつ抗MOG抗体陰性)を示したフローサイトメトリー解析の図である。図10−5のP6ゲートをEGFP蛍光強度とAlexa Fluor 647蛍光強度で展開した等高線プロットである。検査血清に抗MOG抗体が含まれている場合、Q2領域に細胞集団が存在するプロットとなる。本等高線プロットの形状、ならびにQ2領域に細胞集団が存在しない(本データでは、図10−5のP6ゲートHoechst 33342陽性細胞群のうち僅かに0.061%の細胞しか存在しない)ことから、本血清は抗MOG抗体陰性であると判断した。
第1の抗原タンパク質を発現する細胞、第2の抗原タンパク質を発現する細胞、第3の抗原タンパク質を発現する細胞を、第1の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の3群に分けたフローサイトメトリー解析の図である。本データでは第1の蛍光色素としてHoechst 33342を使用した。同様の手法を用いることで、3種類の細胞、具体的には第3n−2の抗原タンパク質を発現する細胞、第3n−1の抗原タンパク質を発現する細胞、第3nの抗原タンパク質を発現する細胞(nは2以上の整数)に対して、第1の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の3群に分けることができる。横軸を前方散乱光(Forward Scatter:FSC)、縦軸を側方散乱光(Side Scatter:SSC)としたドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP1ゲートを作成した図である。50000細胞の測定を行った。
第1の抗原タンパク質を発現する細胞、第2の抗原タンパク質を発現する細胞、第3の抗原タンパク質を発現する細胞を、第1の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の3群に分けたフローサイトメトリー解析の図である。本データでは第1の蛍光色素としてHoechst 33342を使用した。同様の手法を用いることで、3種類の細胞、具体的には第3n−2の抗原タンパク質を発現する細胞、第3n−1の抗原タンパク質を発現する細胞、第3nの抗原タンパク質を発現する細胞(nは2以上の整数)に対して、第1の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の3群に分けることができる。図11−1のP1ゲート内に含まれる死細胞を7−AAD染色試薬を用いて除去し、生細胞に対するP2ゲートを作成した図である。
第1の抗原タンパク質を発現する細胞、第2の抗原タンパク質を発現する細胞、第3の抗原タンパク質を発現する細胞を、第1の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の3群に分けたフローサイトメトリー解析の図である。本データでは第1の蛍光色素としてHoechst 33342を使用した。同様の手法を用いることで、3種類の細胞、具体的には第3n−2の抗原タンパク質を発現する細胞、第3n−1の抗原タンパク質を発現する細胞、第3nの抗原タンパク質を発現する細胞(nは2以上の整数)に対して、第1の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の3群に分けることができる。図11−2のP2ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP3ゲートを作成した図である。
第1の抗原タンパク質を発現する細胞、第2の抗原タンパク質を発現する細胞、第3の抗原タンパク質を発現する細胞を、第1の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の3群に分けたフローサイトメトリー解析の図である。本データでは第1の蛍光色素としてHoechst 33342を使用した。同様の手法を用いることで、3種類の細胞、具体的には第3n−2の抗原タンパク質を発現する細胞、第3n−1の抗原タンパク質を発現する細胞、第3nの抗原タンパク質を発現する細胞(nは2以上の整数)に対して、第1の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の3群に分けることができる。図11−3のP3ゲートをFSCのHeightとWidthパラメーターで展開したドットプロットを作成し、目的の細胞集団に対するP4ゲートを作成した図である。図11−3と図11−4によって、細胞集団に含まれるダブレットを除去した。
第1の抗原タンパク質を発現する細胞、第2の抗原タンパク質を発現する細胞、第3の抗原タンパク質を発現する細胞を、第1の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の3群に分けたフローサイトメトリー解析の図である。本データでは第1の蛍光色素としてHoechst 33342を使用した。同様の手法を用いることで、3種類の細胞、具体的には第3n−2の抗原タンパク質を発現する細胞、第3n−1の抗原タンパク質を発現する細胞、第3nの抗原タンパク質を発現する細胞(nは2以上の整数)に対して、第1の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の3群に分けることができる。図11−4のP4ゲートをHoechst 33342青色蛍光強度とSSCで展開したドットプロットを作成し、Hoechst 33342陰性細胞群に対してP5ゲートを、Hoechst 33342弱陽性細胞群に対してP6ゲートを、Hoechst 33342強陽性細胞群に対してP7ゲートを作成した図である。
第1の抗原タンパク質を発現する細胞、第2の抗原タンパク質を発現する細胞、第3の抗原タンパク質を発現する細胞を、第1の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の3群に分けたフローサイトメトリー解析の図である。本データでは第1の蛍光色素としてHoechst 33342を使用した。同様の手法を用いることで、3種類の細胞、具体的には第3n−2の抗原タンパク質を発現する細胞、第3n−1の抗原タンパク質を発現する細胞、第3nの抗原タンパク質を発現する細胞(nは2以上の整数)に対して、第1の蛍光色素染色により、陰性群、弱陽性群、強陽性群の3群に分けることができる。図11−5のHoechst 33342陰性細胞群、弱陽性細胞群ならびに強陽性細胞群を、Hoechst 33342青色蛍光強度を横軸とした1次元ヒストグラムで示した図である。
ヒトAQP4M23cDNA配列を示す図である。図中に示される配列は、ストップコドン下線)を含んでいるが、使用する発現ベクターの種類によっては、ストップコドン(TGA)を削った配列を用いてもよい。
ヒトMOGアイソフォームα1前駆体のcDNA配列を示す図である。図中に示される配列は、ストップコドン(下線)を含んでいるが、使用する発現ベクターの種類によっては、ストップコドン(TGA)を削った配列を用いてもよい。

0020

上述のとおり、本発明者らは、Cell-based assay法(CBA法)に基づいたフローサイトメトリーを用いることで簡便、効率的、高感度に、かつ低コストで、試料中に含まれる抗体をハイスループットに検出することを可能とする手法を開発した。本発明により、検体処理の簡便化を実現すると共に、検体処理からデータ取得までにかかる時間を大幅に削減することに成功した。また、生細胞を使用し精確な抗原タンパク質三次元立体構造を維持することによる検出感度の大幅な向上に成功した。また、一度の測定において複数種類の抗体を同時に検出することに成功し、一度の測定において定量性のある膨大なデータを取得することに成功した。本発明者らが開発した手法により、抗AQP4抗体、抗MOG抗体、抗NMDA抗体、抗LGI1抗体、抗CASPR2抗体、抗AMPA受容体抗体、抗グリシン受容体抗体、抗GABAB受容体抗体、抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体、抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ抗体、抗LDL受容体関連タンパク質4抗体、抗リアノジン受容体抗体、抗ジヒドロピリジン受容体抗体および抗kv1.4抗体などの複数の抗体を単一の試料から同時に高感度に検出することができる。また、本発明者らが開発した手法により、複数の試料に含まれる抗体の検出を同時に行うことが可能となる。以下に、本発明を詳細に説明する。

0021

多発性硬化症(MS)
多発性硬化症(multiple sclerosis:MS)は、上述のとおり、オリゴデンドロサイトによって髄鞘が形成される脳・脊髄・視神経などの中枢神経系に生じる慢性炎症性脱髄疾患であり、時間的・空間的に病変が多発するのが特徴である。ここで、脱髄とは髄鞘が後天的に破壊される形態変化を指す。通常、詳細な病歴聴取や経時的な神経学的診察により時間的・空間的な病変の多発性を証明し、他の疾患を十分に除外することで診断を確定させる必要がある。このため、厚生労働省によるMSの指定難病診断基準と、その基盤となるMcDonald診断基準(2010年版)では、鑑別診断を行うことの重要性が説かれている。MSとの鑑別診断が必要な疾患は、視神経脊髄炎(neuromyelitis optica:NMO)、急性散在性脳脊髄炎、頸椎症性脊髄症脊髄空洞症脊髄小脳変性症、神経ベーチェット病、神経サルコイドーシスミトコンドリア脳筋症進行性多巣性白質脳症などが挙げられる。視神経脊髄炎を鑑別するためには、視神経脊髄炎に特異的なIgG(抗AQP4抗体[NMO−IgGとしても知られる])を測定する血液検査が必須である。

0022

視神経脊髄炎スペクトラム疾患(NMOSD)
視神経脊髄炎(neuromyelitis optica:NMO)は、重度の視神経炎と横断性脊髄炎を特徴とする炎症性中枢神経疾患である。最近までNMOは多発性硬化症(MS)との関連が議論されてきたが、2004年にNMOに特異なIgG(NMO−IgG)が発見され、さらにアストロサイトの足突起に高密度に発現する水チャネルタンパク質であるアクアポリン−4(AQP4)がその標的抗原であることが報告された。

0023

アクアポリン(AQP)は細胞膜に存在する水チャネルであり、MIP(major intrinsic proteins)ファミリーに属する膜内在タンパク質一種である。アクアポリンはファミリーを形成しており、そのファミリーは2つのサブファミリー、アクアポリンとアクグリセロポリンに大別される。アクアポリンサブファミリーは水分子のみを選択的に透過する水チャネルから構成される。これに対し、アクアグリセロポリンサブファミリーに属する水チャネルは、水分子の他にグリセロール尿素等の水溶性分子を通す性質を持っている。現在、哺乳類ではAQP0からAQP12までの13種類のアイソフォームが同定されている。

0024

AQP4はアクアポリンサブファミリーに属する水チャネルである。ホモ四量体を形成して機能しており、脳に優勢的に発現している。脳の中でも特に、血管を取り巻くアストロサイトの足突起や、視床下部ラメラ構造状のグリア細胞上衣細胞などに顕著に発現していることが明らかとなっている。また、AQP4はアストロサイトのマーカータンパク質の一つである。ヒトと齧歯類ではAQP4のアミノ酸配列はほんの僅かに異なっている。AQP4には2種類のアイソフォーム、AQP4M1とAQP4M23が存在する。AQP4M23は結晶性アレイと呼ばれる格子状のアレイ構造を形成することができるが、AQP4M1は結晶性アレイを形成することができず、脳内の結晶性アレイのサイズはこの2種類のアイソフォームの発現比率によって制御されている。

0025

NMOはアストロサイトが主に破壊される疾患である点が、MSとの大きな相違点である。血液脳関門のアストロサイトの足突起に豊富に存在しているAQP4に対する循環自己抗体が、補体や細胞を介してアストロサイトの傷害とそれに引き続く神経の炎症や脱髄を引き起こす。NMOは、MSのようなオリゴデンドロサイトを中心とした中枢神経の炎症性脱髄疾患とは異なり、AQP4を標的抗原とした自己免疫性アストロサイトパチーというべきものと考えられる。

0026

典型的なNMOの診断基準としては、2006年に発表されたWingerchukらの基準が広く用いられてきた。
(1)視神経炎
(2)急性脊髄炎、および
(3)以下の3項目のうち2項目以上を満たすこと
− 3椎体以上の連続性の脊髄病変
− Patyの脳MRI基準を満たさない
− NMO−IgG(抗AQP4抗体)陽性

0027

その後、典型的なNMOに加えて、視神経炎(再発性あるいは両眼性)や3椎体以上の長い脊髄炎のみの症例も、視神経脊髄炎スペクトラム疾患(NMO spectrum disorders:NMOSD)として、同じ範疇の疾患として捉えられるようになったが、NMOおよびNMOSDの基準のいずれも満たさないものの、血清抗AQP4抗体が陽性である病態も存在し、その治療反応性はNMO/NMOSDと同等であることが指摘され、近年では抗AQP4抗体が陽性である病態を広義のNMOSDと捉えることが一般的となっている。

0028

いずれにせよ、抗AQP4抗体検査が、典型的なNMOを含むNMOSDの診断と治療方針の決定において極めて重要な検査であることに変わりはない。血清中の抗AQP4抗体の有無を調べることによりMSとの鑑別診断を行うことができる。MSとNMO/NMOSDの鑑別診断が重要であるのは、その治療方法が異なるためである。MSの病態修飾薬のいくつかはNMO/NMOSDを増悪させる可能性が指摘されており、他方、一般にMSでは効果に乏しい免疫抑制剤がNMO/NMOSDでは有効となることが多い。

0029

抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患
上述のとおり、抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患は、MSならびに抗AQP4抗体陽性NMO/NMOSDと異なる疾患群であることが報告されている。MOG(ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質)はミエリン鞘を構成する成分の一つであり、抗MOG抗体はこのMOGを認識する自己抗体である。

0030

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)は、中枢神経系の神経の髄鞘形成において重要であると考えられる糖タンパク質であり、ヒトでは、このタンパク質はMOG遺伝子によってコードされている。MOGの主要な分子機能はまだ分かっていないが、ミエリン鞘の構造形成に必要な「接着分子」として働いていると推測されている。ヒトのMOGのcDNAコード領域は、ラットマウスおよびウシに対する相同性が高く、高度に保存されていることが示されている。ヒトMOG遺伝子のmRNAには、選択的スプライシングにより、少なくとも9個のアイソフォームが存在している。

0031

抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患の臨床所見は、MSおよび抗AQP4抗体陽性NMO/NMOSDのいずれとも異なる場合と酷似している場合があるため、臨床所見だけでの判断が難しいことも多い。しかし、抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患は、抗AQP4抗体陽性NMO/NMOSDと比較すると、視神経炎が多い、両眼同時の視神経炎が多い、若い患者が多い、男性が多い、下部脊髄炎が多い、単相性再発が無い例が多い、軽症例が多くステロイドで改善が良好であることが多いなどの傾向があることが分かってきている。またMSと比較しても臨床所見が酷似している場合もあるため、抗MOG抗体検査も、MSとの鑑別診断を行う上で極めて重要な検査となりうる。脱髄性疾患患者の臨床所見から疾患がMSであると考え、MSに対して効果のあるフィンゴリモド投与したが効果が無く、血清中の抗MOG抗体を調べることで抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患である(フィンゴリモドは抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患には効果がなく、神経症状憎悪させる可能性がある)と判明した臨床例もあることから、脱髄性疾患患者診断における抗MOG抗体検査は、極めて重要な検査となりうる。脱髄性疾患患者に対する多発性硬化症の診断においては、視神経脊髄炎関連疾患や抗MOG抗体関連疾患/MOG抗体疾患などを鑑別する必要があるため、抗体検査を実施することが推奨されている。

0032

その他の抗体
MSの鑑別診断を行う上では、上記の抗AQP4抗体と抗MOG抗体に加えて、抗核抗体リウマチ因子甲状腺関連自己抗体(抗TSH受容体抗体、抗サイログロブリン抗体、抗ぺルオキシダーゼ抗体)、抗SS−A抗体、抗SS−B抗体、抗アセチルコリン受容体抗体などを検出することも有用となりうる。また、自己免疫性脳炎の診断を行う上で、抗NMDA抗体、抗LGI1抗体、抗CASPR2抗体、抗AMPA受容体抗体、抗グリシン受容体抗体、抗GABAB受容体抗体などを検出することも有用となりうる。また、重症筋無力症の診断を行う上で、抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体、抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ抗体、抗LDL受容体関連タンパク質4抗体、抗リアノジン受容体抗体、抗ジヒドロピリジン受容体抗体、抗kv1.4抗体などを検出することも有用となりうる。

0033

抗体検出方法
生物学的試料中における抗体の検出には、様々な免疫学的検査法が用いられうる。代表的な例としては、免疫組織化学、抗原タンパク質を発現させたヒト胎児HEK)293細胞あるいはその他の細胞を基質とした免疫細胞化学あるいはフローサイトメトリー、単離した抗原タンパク質あるいは細胞・組織抽出液を基質とした放射性免疫沈降法あるいは蛍光免疫沈降法、ウエスタンブロッティング酵素結合免疫測定法ELISA)などが挙げられる。

0034

抗AQP4抗体を検出するにあたって最も感度の高い測定方法は、AQP4を細胞に発現させ被検者血清と反応させるCBA(cell-based assay)法であり、この細胞をスライドガラス上に固定して行う間接免疫蛍光法非特異的結合が問題になる)、組換えAQP4を用いたELISA法、マウス脳組織切片を用いた間接免疫蛍光法などはCBA法に比べると感度が低い。また、CBA法以外のこれらの測定方法では偽陰性例や偽陽性例が生じることがあるため、CBA法での測定が推奨されている。

0035

感度の高い抗AQP4抗体検査法としては、例えば、ヒトAQP4M23を細胞に発現させて被検者血清と反応させ、被検者IgGがAQP4の細胞外領域に結合していることを間接蛍光抗体法やフローサイトメトリーによって確認するCBA(cell-based assay)法が挙げられる。本発明者らは、本願において詳細に述べているように、フローサイトメトリーを用いたCBA法により非常に高感度かつ定量性のあるデータを得ることができる検査方法を実現することに成功した。

0036

CBA(cell-based assay)法
CBA法による試料に含まれる抗体の検出方法とは、任意の細胞に目的の抗原タンパク質の遺伝子を導入後、試料と反応させ、目的の抗体を認識する標識二次抗体を用いて標識シグナルを検出する方法を指す。

0037

CBA法に使用する細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来のCHO−K1細胞を用いることができるが、これに限定はされない。例えば、HEK293細胞、HEK293T細胞、CHO細胞、COS1細胞、COS7細胞、HeLa細胞Jurkat細胞L細胞MDCK細胞、PC12細胞、Sf9細胞などを利用してもよい。また、これらの細胞に任意のタンパク質を安定発現させた細胞株(例えばCHO−ICAM−1細胞)を利用してもよい。また、株化された培養細胞で、目的の抗原タンパク質を内在的に発現している細胞を使用することもできる。例えば、目的の抗原タンパク質がAQP4の場合、H4細胞やU−87MG細胞などを利用してもよい。また、組織から採取した細胞で、目的の抗原タンパク質(例えばAQP4やMOG)を発現している細胞を使用することもできる。例えば、脳のグリア細胞の一種であるアストロサイトにはAQP4が高発現していることが知られている。ヒトAQP4とラットAQP4、あるいはヒトAQP4とマウスAQP4の配列は殆どが同じであるため、脳から単離したヒトアストロサイトやラットアストロサイト、マウスアストロサイトを用いて測定することも可能である。AQP4を発現している器官として、脳の他に腎臓筋肉なども挙げられる。また、脳のグリア細胞の一種であるオリゴデンドロサイトにMOGが発現していることがわかっている。ヒトMOG、ラットMOG、マウスMOGは配列が殆ど同じであるため、これらの脳組織由来のオリゴデンドロサイトも測定に用いることができる。CBA法に使用する細胞は、Hoechst 33342などを用いて蛍光標識しておいてもよい。Hoechst 33342などを用いて蛍光標識する際には、染色の度合いを調整することで、区別可能な複数種の細胞を調製することができる。例えば、Hoechst 33342で処理をしていない細胞、Hoechst 33342を最終濃度0.1μg/mLとなるように加えて37℃で20分間インキュベートした細胞、そして最終濃度5μg/mLとなるように加えて37℃で20分間インキュベートした細胞を用意することにより、Hoechst 33342の蛍光強度で区別可能な3種類の細胞を用意することができる。インキュベートの際に加える最終濃度や反応時間などを調整することにより、条件を細分化し、区別可能な細胞の種類を増やすことも可能である。このような細胞の染色に使用される蛍光色素はHoechst 33342に限定はされない。また、複数の蛍光色素を併用してもよく、染色の対象は、核、細胞膜、細胞質細胞小器官、脂質、および糖鎖などを含む、細胞を構成する任意の構造単位であってもよい。また、使用する細胞の細胞膜に恒常的に発現しているタンパク質に対する抗体を使用して蛍光標識してもよい。CBA法に使用する細胞には、目的の抗原タンパク質、例えば、AQP4とMOGのうち、いずれか一つを導入することができる。場合によっては、CBA法に使用する細胞には、AQP4とMOGの両方を導入してもよい。抗原タンパク質を導入していない細胞は、ネガティブコントロールとして使用することができる。CBA法に使用する細胞には、AQP4とMOG以外の他の抗原タンパク質が導入されていてもよく、また複数種類の細胞(例えばCHO−K1細胞とHEK293細胞)を併用してもよい。

0038

CBA法に使用する細胞には、1回膜貫通型タンパク質、2回膜貫通型タンパク質、3回膜貫通型タンパク質、4回膜貫通型タンパク質、5回膜貫通型タンパク質、6回膜貫通型タンパク質、7回膜貫通型タンパク質、8回膜貫通型タンパク質、9回膜貫通型タンパク質、10回膜貫通型タンパク質、11回膜貫通型タンパク質、12回膜貫通型タンパク質、13回膜貫通型タンパク質、14回膜貫通型タンパク質、15回膜貫通型タンパク質、16回膜貫通型タンパク質、17回膜貫通型タンパク質、18回膜貫通型タンパク質、19回膜貫通型タンパク質、20回膜貫通型タンパク質、21回膜貫通型タンパク質、22回膜貫通型タンパク質、23回膜貫通型タンパク質、24回膜貫通型タンパク質、25回膜貫通型タンパク質、26回膜貫通型タンパク質、27回膜貫通型タンパク質、28回膜貫通型タンパク質、29回膜貫通型タンパク質、または30回膜貫通型タンパク質などを含む、細胞膜に存在するタンパク質を抗原タンパク質として導入することができる。よって、本発明に係る方法の実施態様には、試料中に含まれる、1回膜貫通型タンパク質、2回膜貫通型タンパク質、3回膜貫通型タンパク質、4回膜貫通型タンパク質、5回膜貫通型タンパク質、6回膜貫通型タンパク質、7回膜貫通型タンパク質、8回膜貫通型タンパク質、9回膜貫通型タンパク質、10回膜貫通型タンパク質、11回膜貫通型タンパク質、12回膜貫通型タンパク質、13回膜貫通型タンパク質、14回膜貫通型タンパク質、15回膜貫通型タンパク質、16回膜貫通型タンパク質、17回膜貫通型タンパク質、18回膜貫通型タンパク質、19回膜貫通型タンパク質、20回膜貫通型タンパク質、21回膜貫通型タンパク質、22回膜貫通型タンパク質、23回膜貫通型タンパク質、24回膜貫通型タンパク質、25回膜貫通型タンパク質、26回膜貫通型タンパク質、27回膜貫通型タンパク質、28回膜貫通型タンパク質、29回膜貫通型タンパク質、30回膜貫通型タンパク質などを含む、細胞膜に存在するタンパク質を認識する個々の抗体(例えば自己抗体)を独立に検出する方法であって、単一試料におけるこれらの任意の複数の抗体(例えば12種類の抗体)の有無を同時測定によって解析を行うことができる方法が包含される。

0039

上記の細胞膜に存在するタンパク質には、Gタンパク質共役型受容体、イオンチャネル型受容体電位依存性イオンチャネル機械刺激感受性チャネル一過性受容器電位チャネル、陽イオンチャネル陰イオンチャネル、サイトカイン受容体増殖因子受容体酵素共役型受容体、APCスーパーファミリー、ABC輸送体スーパーファミリー、単純拡散型輸送体、受動輸送型輸送体、能動輸送型輸送体、リン脂質輸送体、ATP駆動型ポンプATP合成酵素免疫グロブリンスーパーファミリー、細胞接着分子CD抗原、脂質アンカー型タンパク質グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型タンパク質、水チャネル、糖タンパク質、低密度リポタンパク質受容体、スカベンジャー受容体ギャップ結合チャネル、Fc受容体Toll様受容体細胞死受容体トランスフェリン受容体トランスロカーゼ電位依存性ホスファターゼ小胞輸送タンパク質核膜孔複合体、内在性膜タンパク質表在性膜タンパク質などが含まれる。測定に使用する任意の細胞に対して発現させるタンパク質は上記のいずれかのファミリーに属する任意のタイプであってよく(例えば水チャネルの場合はAQP1でもよいし、AQP4でもよいし、AQP10でもよい)、目的の膜タンパク質に2種類以上のアイソフォームが存在する場合、任意のタイプを選択することができ(例えばAQP4の場合、AQP4M1でもAQP4M23でもよい)、目的の膜タンパク質が多量体で構成される際は任意のサブユニットホモならびにヘテロで選択することができる(例えばグリシン受容体の場合、α1サブユニットのホモ5量体でもよく、α3サブユニットのホモ5量体でもよく、α1サブユニットとβサブユニットのヘテロ5量体でもよい)。

0040

具体的な同時測定の一例として、単一試料中に、抗NMDA受容体抗体、抗LGI1抗体、抗CASPR2抗体、抗AMPA受容体抗体、抗グリシン受容体抗体、抗GABAB受容体抗体が含まれているかどうかを同時測定によって解析することができる。この測定は被検者が、自己免疫性脳炎、モルヴァン症候群アイザックス症候群、小脳失調錐体外路症状ミオクローヌス神経性強直末梢神経障害自律神経障害てんかん認知症などの臨床型・神経症候を呈する際に適用することができる。

0041

抗NMDA受容体抗体が認識するNMDA受容体、抗AMPA受容体抗体が認識するAMPA受容体、抗グリシン受容体抗体が認識するグリシン受容体は上記のイオンチャネル型受容体に分類される。抗LGI1抗体が認識するLGI1(leucine-rich glioma-inactivated protein-1 )、抗CASPR2抗体が認識するCASPR2(contactin-associated protein-2 )は電位依存性カリウムチャネル(voltage-gated potassium channel:VGKC)と細胞膜上で複合体を形成している。抗GABAB受容体抗体が認識するGABAB受容体 は上記のGタンパク質共役型受容体に分類される。

0042

また別の一例として、単一試料中に、抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体、抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ抗体、抗LDL受容体関連タンパク質4抗体、抗リアノジン受容体抗体、抗ジヒドロピリジン受容体抗体、抗kv1.4抗体が含まれているかどうかを同時測定によって解析することができる。この測定は被検者が、重症筋無力症の症候を呈する際に適応することができる。

0043

抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体が認識するニコチン性アセチルコリン受容体、抗リアノジン受容体抗体が認識するリアノジン受容体は、上記のイオンチャネル型受容体に分類される。抗筋特異的受容体型チロシンキナーゼ抗体が認識する筋特異的受容体型チロシンキナーゼは、上記のサイトカイン受容体に分類される。抗LDL受容体関連タンパク質4抗体が認識するLDL受容体関連タンパク質4は、上記の低比重リポタンパク質受容体に分類される。抗ジヒドロピリジン受容体抗体が認識するジヒドロピリジン受容体は、L型Ca2+チャネルであり、上記の電位依存性イオンチャネルに分類される。抗kv1.4抗体が認識するkv1.4は、上記の電位依存性イオンチャネルに分類される。

0044

さらにまた別の一例として、単一検体に、抗AQP4抗体ならびに抗MOG抗体が含まれているかどうかを同時測定によって解析することができる。この測定は被検者が、視神経炎、視覚障害、脊髄炎、脳脊髄炎脳幹脳炎などの臨床型・神経症候を呈する際に適応することができる。抗AQP4抗体が認識するAQP4は上記の水チャネルに分類される。抗MOG抗体が認識するMOGは上記の糖タンパク質に分類される。

0045

したがって、本発明に係るいくつかの態様は、上記のタンパク質に対する抗体の検出または測定の結果を指標とする、上記の疾患の診断方法に関する。また、本発明に係るいくつかの態様は、そのような診断結果に基づき、治療様式を決定することを含む、疾患の治療方法にも関する。

0046

抗原タンパク質の遺伝子導入には、例えば、pEGFP-N3などの発現ベクターを用いることができるが、これに限定はされない。細胞へのトランスフェクション利用可能なベクターは、当業者には様々なものが知られている。また、ベクターをトランスフェクトする際には、Lipofectamine 3000などのトランスフェクション試薬を用いることができる。様々なトランスフェクション試薬(例えば、FuGENE HDなど)が当業者には公知である。ベクターに組み込むAQP4遺伝子(例えば、AQP4M23遺伝子)やMOG遺伝子などの配列は、当業者であればGenBankなどのデータベースから容易に入手できる。抗原タンパク質の細胞への遺伝子導入の際には、例えば、ウイルスベクタープラスミドリポソームゲノム編集などの技術を利用してもよい。導入する抗原タンパク質は、必ずしも全長を含むものでなくともよく、断片であってもよい。また、導入する抗原タンパク質は、欠失、挿入、置換などの変異を含むものであってもよく、また、複数の任意の抗原タンパク質を組み合わせたキメラタンパク質であってもよい。さらに、導入する抗原タンパク質には、EGFPなどの蛍光タンパク質を融合させておくことができる。種々の蛍光タンパク質(例えば、Sirius、EBFP、ECFP、mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP、TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana、KusabiraOrange、mOrange、TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed、mRasberry、mPlum、PS-CFP、Dendra2、Kaede、EosFP、KikumeGRなど)が当業者には公知であり、利用可能である。蛍光タンパク質は、好ましくは、抗原タンパク質(例えば、AQP4、MOG)のC末端領域に融合させることができるが、これに限定はされない。pEGFP-N3を用いた場合には、抗原タンパク質のC末端にEGFPが融合される。蛍光タンパク質は、抗原タンパク質のN末端領域やループ部分などに融合するように設計してもよい。

0047

抗原タンパク質の遺伝子導入には、IRES発現ベクターを用いてもよい。IRES(Internal Ribosome Entry Site:配列内リボソーム進入部位)は、タンパク質合成のプロセスの一部として、キャップ非依存的な翻訳の開始を可能とするRNA配列要素である。IRES含有バイシストロン性ベクターは、2つのタンパク質を同じRNA転写物から個別に同時発現させることを可能とする。IRES発現ベクターを用いて抗原タンパク質と蛍光タンパク質とを発現させた場合、蛍光タンパク質の検出される細胞では、ほぼ100%目的の抗原タンパク質も発現している。市販のIRES発現ベクターとしては、例えば、クロンテック社のLiving Colors pIRES2 Vectorなどがある。本発明の方法においては、pEGFP-N3等の蛍光タンパク質融合発現ベクターとIRES発現ベクターとを組み合わせて用いることもできる。

0048

抗原タンパク質の発現は、一過性発現であってもよく、また安定発現であってもよい。抗原タンパク質を発現するように改変した細胞と、被検者由来の試料とを反応させる際には、例えば、105cells/100μLの細胞懸濁液に対して10μLの被検者血清を加え、4℃で15分間のインキュベートを行う。細胞の量、試料の量、温度、時間は、当業者であれば必要に応じて適宜調整することができる。本発明の方法によれば、複数アッセイ同時処理が可能であるため、サンプルの作製や測定に必要とされる時間や試料の量は従来のCBA法に比べて大幅に削減される。被検者由来の試料としては、血清のほかに、全血、血漿、脳脊髄液、涙、唾液、尿なども利用されうる。被検者は、哺乳動物、特にヒト、例えば、脱髄性疾患の症状を呈しているヒトである。

0049

二次抗体は、被検者由来の試料中に含まれる自己抗体を認識する。二次抗体の標識としては、例えば、蛍光標識を用いることができる。二次抗体は、典型的には抗ヒトIgG抗体であるが、抗ヒトIgM抗体、抗ヒトIgA抗体、抗ヒトIgE抗体、抗ヒトIgD抗体なども使用されうる。二次抗体として有用な蛍光色素で標識された抗ヒトIgG抗体は、多くの製品が市販されており、容易に入手できる。蛍光標識された細胞試料は、フローサイトメーターを用いて検出することができる。蛍光標識は例えば、Alexa Fluor 647でありうるが、これに限定はされない。

0050

本発明の方法において、蛍光標識は例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、および7-AADから成る群より選択されるものが使用されうる。本発明においては、単一のレーザーにより励起される複数の蛍光標識(例えば、EGFPとPE-Cy7)を組み合わせて使用してもよい。

0051

フローサイトメトリー
フローサイトメトリー解析は、CBA法によって被検者由来試料および二次抗体と反応させた細胞に対して、例えば、ベクトン・ディキンソン社製FACSAriaIIを用いて行うことができる。本発明の方法によれば、例えば3種類の波長のレーザー(例えば、488nm青レーザー、640nm赤レーザー、355nmUVレーザー)を用いて2種類以上の抗体を分析することができ、また、4種類の波長のレーザー(例えば、青、赤、黄、およびUV)を用いて4種類以上(例えば、12種類、18種類、24種類)の抗体を分析することができる。例えば、EGFPとPE-Cy7は青レーザーにより、Alexa Fluor 647は赤レーザーにより、mCherryは黄レーザーにより、Hoechest 33342はUVレーザーにより、それぞれ励起される。使用するレーザーは、例えば、UVレーザーの代わりに紫レーザーを、黄レーザーの代わりに黄緑レーザーを選択してもよい。また、使用するレーザーの組み合わせは任意でよい。測定したフローサイトメトリーデータの解析には、例えば、FlowJoを使用することができる。フローサイトメトリーデータの解析により、被検者由来試料中の抗体を検出および/または測定することができる。

0052

検出および測定
本発明の方法によれば、被検者に由来する試料中における複数の抗体、例えば、2種類、4種類、6種類、8種類、12種類、16種類、18種類、24種類、またはそれ以上の種類の抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。また、本発明の方法によれば、1以上の被検者に由来する複数の試料中、例えば、2種類、4種類、6種類、8種類、12種類、16種類、18種類、24種類、またはそれ以上の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。フローサイトメーターを用いることで、複数種の抗体の検出および/または測定、あるいは複数の試料中における抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。

0053

(12種類の抗体の同時検出)
本発明の一つの態様としては、被検者に由来する試料中における12種類の抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。フローサイトメーターを用いることで、12種類の抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。一つの態様において、本方法は、第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第3の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第4の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第5の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第6の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第7の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第8の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第9の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第10の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第11の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第12の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。

0054

いくつかの態様において、本発明の方法では、第1から第12の抗原タンパク質は蛍光タンパク質と融合していてもよい。抗原タンパク質と融合した蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第1から第6の抗原タンパク質が第1の蛍光タンパク質と融合しており、第7から第12の抗原タンパク質が第2の蛍光タンパク質と融合している場合、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。

0055

いくつかの態様において、本発明の方法では、第1から第12の抗原タンパク質はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳されてもよい。抗原タンパク質と同一のmRNAから翻訳される蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第1から第6の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第7から第12の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される場合、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、本発明の方法では、例えば、第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されていてもよい。また、例えば、第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されていてもよい。蛍光色素/蛍光タンパク質としては、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどを使用することができる。

0056

いくつかの態様において、本発明の方法では、例えば、第2、第5、第8および第11の抗原タンパク質を発現する細胞は、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3、第6、第9および第12の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で強く標識されていてもよい。ここで、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とは、例えばフローサイトメーター上で区別可能である。蛍光色素/蛍光タンパク質としては、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどを使用することができる。

0057

なお、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質と同様に、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によって細胞を3段階(陰性、弱陽性、強陽性)に標識することにより、18種類の細胞を調製し、18種類の抗体について同時に評価することも可能である。また、4段階の標識と組み合わせることにより、16種類、24種類、32種類の抗体の同時評価も可能となる。

0058

さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。よって、本発明の態様の一つには、被検者に由来する試料中における第1から第12の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第3の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第4の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第5の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第6の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第7の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第8の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第9の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第10の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第11の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第12の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含み、ここで、第1から第12の抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1から第6の抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第7から第12の抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されており、そして第2、第5、第8および第11の抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3、第6、第9および第12の抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である、方法が含まれる。なお、上記二次抗体は、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどで標識されていてもよい。

0059

いくつかの態様において、被検者に由来する試料は血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から選択されてもよい。上記第1から第12の抗原タンパク質は、それぞれ異なるタンパク質であってよく、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から選択されるタンパク質が含まれていてもよい。

0060

上記第1の蛍光タンパク質はEGFPであってもよい。上記第2の蛍光タンパク質はmCherryであってもよい。上記第1の蛍光色素は、EGFPと同じ波長のレーザーで励起することが可能なPE-Cy7であってもよい。上記第2の蛍光色素はHoechst 33342であってもよい。上記二次抗体はAlexa Fluor 647で標識されていてもよい。

0061

第1の蛍光タンパク質と第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質は、同じ波長のレーザーで励起されるものを使用することができる。同様に、第2の蛍光タンパク質と第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質は、同じ波長のレーザーで励起されるものを使用することもできる。本発明において使用される他の蛍光標識についても同様に、単一のレーザーにより複数の標識が励起されるものを組み合わせて使用することができる。

0062

いくつかの態様においては、12未満の種類の抗体の同時検出を行ってもよい。前記第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞のうち、例えば、2〜11種の細胞のみを調製して使用することもできる。

0063

また、いくつかの態様において、本発明の方法は、被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞であって、第1から第12の抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1から第6の抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第7から第12の抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されており、そして、第2、第5、第8および第11の抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3、第6、第9および第12の抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である細胞のうち、2以上を調製する工程、
該2以上の細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、
該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法に関する。これにより、例えば2〜11種の抗体の検査を同時に行うことができる。

0064

また、このような2以上の細胞を含む細胞懸濁液を複数調製し、各々の細胞懸濁液に対して被検者に由来する試料が1種類加えられるように、複数の細胞懸濁液に複数の被検者に由来する試料を加えることにより、複数の試料中の複数の抗体を分析することができる。例えば、3例の被検者に由来する試料を4種類の抗体について、あるいは4例の被検者に由来する試料を3種類の抗体について、同時に検査することができる。

0065

(4種類の抗体の同時検出)
本発明の別の態様としては、被検者に由来する試料中における第1の抗体、第2の抗体、第3の抗体、および第4の抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。フローサイトメーターを用いることで、4種類の抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。一つの態様において、本方法は、第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第3の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第4の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第1から第4の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体は、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどで標識されていてもよい。

0066

いくつかの態様において、本発明の方法では、第1から第4の抗原タンパク質はぞれそれ蛍光タンパク質と融合していてもよい。抗原タンパク質と融合した蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第1および第2の抗原タンパク質が第1の蛍光タンパク質と融合しており、第3および第4の抗原タンパク質が第2の蛍光タンパク質と融合している場合、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、本発明の方法では、第1から第4の抗原タンパク質がIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳されてもよい。抗原タンパク質と同一のmRNAから翻訳される蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第1および第2の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第3および第4の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される場合、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。第2の抗原タンパク質を発現する細胞および第4の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されていてもよい。また、第2の抗原タンパク質を発現する細胞および第4の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されていてもよい。蛍光色素/蛍光タンパク質としては、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどを使用することができる。

0067

いくつかの態様においては、第1から第4の抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又は第1から第4の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第2の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3の抗原タンパク質を発現する細胞が第1の蛍光色素もしくは第2の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが(例えばフローサイトメーターにより)区別可能であり、第4の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質により(例えば、第2の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により)標識されていてもよい。このように標識した細胞を用いることで、4種類の抗体を検出することも可能である。

0068

いくつかの態様において、被検者に由来する試料は血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から選択されてもよい。上記第1から第4の抗原タンパク質は、それぞれ例えばAQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から選択されうる。

0069

上記第1の蛍光タンパク質はEGFPであってもよい。上記第2の蛍光タンパク質はmCherryであってもよい。上記第1の蛍光色素はHoechst 33342であってもよい。上記二次抗体はAlexa Fluor 647で標識されていてもよい。

0070

いくつかの態様においては、4未満の種類の抗体の同時検出を行ってもよい。前記第1から第4の抗原タンパク質を発現する細胞のうち、例えば、3種の細胞のみを調製して使用することもできる。

0071

(2種類の抗体の同時検出)
本発明の別の態様としては、被検者に由来する試料中における第1の抗体および第2の抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。フローサイトメーターを用いることで、2種類の抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。一つの態様において、本方法は、第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第1および第2の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体は、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどで標識されていてもよい。

0072

いくつかの態様において、第1および第2の抗原タンパク質は、ぞれそれ蛍光タンパク質と融合していてもよい。抗原タンパク質と融合した蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第1の抗原タンパク質が第1の蛍光タンパク質と融合しており、第2の抗原タンパク質が第2の蛍光タンパク質と融合している場合、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは同一の蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、本発明の方法では、第1および第2の抗原タンパク質がIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳されてもよい。抗原タンパク質と同一のmRNAから翻訳される蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第1の抗原タンパク質がIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2の抗原タンパク質がIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される場合、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは同一の蛍光タンパク質であってもよい。また、第2の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されていてもよい。また、第2の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されていてもよい。蛍光色素/蛍光タンパク質としては、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどを使用することができる。

0073

第1の抗原タンパク質が第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2の抗原タンパク質が第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される場合、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。

0074

いくつかの態様において、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。被検者に由来する試料は、血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、および尿から選択されてもよい。第1および第2の抗原タンパク質は、それぞれ例えばAQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から選択されうる。

0075

上記第1の蛍光タンパク質はEGFPであってもよい。上記第2の蛍光タンパク質はmCherryであってもよい。上記第1の蛍光色素がHoechst 33342であってもよい。上記二次抗体はAlexa Fluor 647で標識されていてもよい。

0076

(4n種類の抗体の同時検出)
本発明の別の態様としては、被検者に由来する試料中における第1から第4nの抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。ここでnは1以上の整数であり、好ましくは1、2、3、4、5を含む10以下の整数である。フローサイトメーターを用いることで、4n種類の抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。

0077

一つの態様において、本方法は、第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体を標識する蛍光タンパク質および蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。

0078

いくつかの態様において、第1から第4nの抗原タンパク質のそれぞれは、蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳されてもよい。例えば、第1から第2nの抗原タンパク質は、それぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第2n+1から第4nの抗原タンパク質は、それぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されていてもよい。第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されていてもよい。第1から第4の蛍光タンパク質および第1から第2の蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。

0079

いくつかの態様において、第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞は、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能である。例えば、蛍光色素で標識していない細胞、蛍光色素で弱く標識した細胞、蛍光色素で強く標識した細胞といった3段階の強度で標識した細胞を調製することができる。本発明の文脈において、n段階の強度で細胞を標識することには、細胞を標識しないことも含まれる。

0080

いくつかの態様においては、4n未満の種類の抗体の同時検出を行ってもよい。前記第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞のうち、例えば、2〜4n−1種の細胞のみを調製して使用することもできる。

0081

また、いくつかの態様において、本発明の方法は、被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞であって、第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質により非標識を含んでいてもよいn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質により非標識を含んでいてもよいn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞、第2n+1から第3nの抗原タンパク質を発現する細胞、第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞がそれぞれ区別可能であり、第1から第4nの抗原タンパク質のそれぞれが蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞および第3n+1から第4nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されている細胞のうち、2以上を調製する工程、
該2以上の細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、
該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含む、方法に関する。これにより、例えば、2〜4n−1種の抗体の検査を同時に行うことができる。

0082

また、このような2以上の細胞を含む細胞懸濁液を複数調製し、各々の細胞懸濁液に対して被検者に由来する試料が1種類加えられるように、複数の細胞懸濁液に複数の被検者に由来する試料を加えることにより、複数の試料中の複数の抗体を分析することができる。例えば、3例の被検者に由来する試料を4種類の抗体について、あるいは4例の被検者に由来する試料を3種類の抗体について、同時に検査することができる。

0083

(2mn種類の抗体の同時検出)
上述した4n種類の抗体の同時検出において、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質による標識をm段階に分けることにより、2mn種類の抗体の同時検出を行うことができる。よって、本発明の別の態様としては、被検者に由来する試料中における2mn種類の抗体を同時に検出または測定する方法が含まれる。ここでmおよびnは1以上の整数であり、好ましくは1、2、3、4、5を含む10以下の整数である。フローサイトメーターを用いることで、2mn種類の抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。2mnは例えば、2、4、6、8、12、16、18、24、32などの値を取り得る。被検者に由来する試料としては、例えば、血清、血漿、全血、脳脊髄液、涙、唾液、尿などを使用することができる。検出対象の抗体が結合する抗原タンパク質としては、例えば、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、kv1.4などを使用することができる。

0084

一つの態様において、本方法は、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体を標識する蛍光タンパク質および蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。第1から第2mnの抗原タンパク質は、それぞれ互いに異なるタンパク質でありうる。

0085

いくつかの態様において、第1から第2mnの抗原タンパク質のそれぞれは、蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される。また、いくつかの態様において、第1から第mnの抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質である。

0086

いくつかの態様においては、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞のうち、第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとして、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられ、第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識され、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能とされており、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループは、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識され、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能とされうる。第1細胞グループから第m細胞グループは、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されて、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能とされ、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されて、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能とされてもよい。

0087

いくつかの態様においては、上記の第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞は、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能とされ、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞は、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されて、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能とされうる。

0088

別の言い方をすれば、いくつかの態様において、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞は、まず、第1から第mnの細胞からなるグループと、第mn+1から第2mnの細胞からなるグループとに分けられる。この2群の区別は、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質の判別によりなされうる。次に、第1から第mnの細胞からなるグループは、n個の細胞からなるm個の群に分けられる。これらm個の群は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質により各群ごとにm段階の異なる強度でそれぞれ標識されることにより、それぞれ区別されうる。また、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の蛍光強度によりそれぞれ区別されるm個の群にそれぞれ含まれるn個の細胞は、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の異なる強度でそれぞれ標識されることにより、それぞれ区別されうる。同様に、第mn+1から第2mnの細胞からなるグループについても、n個の細胞からなるm個の群に分けられる。これらm個の群は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質により各群ごとにm段階の異なる強度でそれぞれ標識されることにより、それぞれ区別されうる。また、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の蛍光強度によりそれぞれ区別されるm個の群にそれぞれ含まれるn個の細胞は、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の異なる強度でそれぞれ標識されることにより、それぞれ区別されうる。このようにして、蛍光標識に基づきそれぞれ区別可能な2mn種類の細胞が調製されうる。よって、本発明の一つの態様は、蛍光標識に基づきそれぞれ区別可能な2mn種類の細胞の調製方法にも関する。

0089

上記のように、細胞の標識には抗体を用いてもよい。第1から第4の蛍光タンパク質および第1から第2の蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。なお、例えば、蛍光色素で標識していない細胞、蛍光色素で弱く標識した細胞、蛍光色素で強く標識した細胞といった3段階の強度で標識した細胞を調製することができる。本発明の文脈において、m段階あるいはn段階の強度で細胞を標識することには、細胞を標識しないことも含まれる。

0090

例えば、m=3、n=3の場合、18種類の細胞を調製し、18種類の抗体を同時に評価することができる。m=4、n=3の場合、24種類の細胞を調製し、24種類の抗体を同時に評価することができる。

0091

本発明の一つの態様は、よって、被検者に由来する試料中における2mn種の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
mは1以上の整数であり、
nは1以上の整数であり、
第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、
該第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、
該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、
該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに
該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程
を含み、
ここで、第1から第mnの抗原タンパク質がそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質がそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、
第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、
第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質または第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質または第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、
第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である、方法に関する。

0092

いくつかの態様においては、2mn未満の種類の抗体の同時検出を行ってもよい。前記第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞のうち、例えば、2〜2mn−1種の細胞のみを調製して使用することもできる。よって、本発明のいくつかの態様は、被検者に由来する試料中における2mn以下の抗体を同時に検出または測定する方法に関する。

0093

また、いくつかの態様において、本発明の方法は、被検者に由来する試料中における複数の抗体を同時に検出または測定する方法であって、
第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞であって、第1から第mnの抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第mn+1から第2mnの抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、
第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞を第1細胞グループとし、同様に、第n+1から第2nの抗原タンパク質を発現する細胞を第2細胞グループ、第(m−1)n+1から第mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第m細胞グループ、第(2m−1)n+1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞を第2m細胞グループとし、第1から第2mnの抗原タンパク質を発現する細胞がn種類ずつ2mのグループに分けられており、
第1細胞グループから第m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、同様に、第m+1細胞グループから第2m細胞グループが、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質によりm段階の強度でそれぞれ標識されているか又は第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体によりm段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞グループがそれぞれ区別可能であり、
第1細胞グループに属する第1から第nの抗原タンパク質を発現する細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能であり、同様に、第2細胞グループから第2m細胞グループのそれぞれに属するn種類の細胞が、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質によりn段階の強度でそれぞれ標識されており、各段階の強度で標識された細胞がそれぞれ区別可能である細胞のうち、2以上を調製する工程、
を含む、方法に関する。なお、mおよびnは1以上の整数であり、好ましくは1、2、3、4、5を含む10以下の整数である。また、本方法は、2以上の細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、および細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含むものでありうる。

0094

これにより、例えば、2〜2mn−1種の抗体の検査を同時に行うことができる。また、2〜mn例の被検者に由来する試料中における2〜mn種類の抗体を同時に検出または測定することもできる。第1から第2mnの抗原タンパク質はそれぞれ互いに異なるタンパク質であってもよい。第1から第2mnの抗原タンパク質のうち少なくとも一つは、AQP4、MOG、NMDA受容体、LGI1、CASPR2、AMPA受容体、グリシン受容体、GABAB受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体、筋特異的受容体型チロシンキナーゼ、LDL受容体関連タンパク質4、リアノジン受容体、ジヒドロピリジン受容体、およびkv1.4から選択されうる。

0095

上記のように、細胞の標識には抗体を用いてもよい。第1から第4の蛍光タンパク質および第1から第2の蛍光色素の性質は、本発明に係る他の態様に関して記載したものと同様である。なお、例えば、蛍光色素で標識していない細胞、蛍光色素で弱く標識した細胞、蛍光色素で強く標識した細胞といった3段階の強度で標識した細胞を調製することができる。本発明の文脈において、m段階あるいはn段階の強度で細胞を標識することには、細胞を標識しないことも含まれる。

0096

このような2以上の細胞を含む細胞懸濁液を複数調製し、各々の細胞懸濁液に対して被検者に由来する試料が1種類加えられるように、複数の細胞懸濁液に複数の被検者に由来する試料を加えることにより、複数の試料中の複数の抗体を分析することができる。例えば、3例の被検者に由来する試料を4種類の抗体について、あるいは4例の被検者に由来する試料を3種類の抗体について、同時に検査することができる。

0097

(12種類の試料中の抗体の同時検出)
本発明の一つの態様としては、1以上の被検者に由来する12種類の試料中における抗体を同時に検出または測定する方法が提供される。フローサイトメーターを用いることで、12種類の試料中における目的の抗体の検出および/または測定を簡便かつ精確に同時に行うことができる。一つの態様において、本方法は、第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞を個別の容器中において調製する工程、1以上の被検者に由来する第1から第12の試料を、第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞にそれぞれ加えてインキュベートする工程、被検者に由来する試料を加えた第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞を1つの容器中で混合して細胞懸濁液を得る工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含む。ここで、試料を細胞に加えてインキュベートする際には、あらかじめ複数の細胞(例えば第1の抗原タンパク質を発現する細胞と第2の抗原タンパク質を発現する細胞)を混合しておき、それに複数の試料(例えば第1の試料と第2の試料。ここで、第1の試料と第2の試料は同じものであってもよい)を加えてインキュベートしてもよい。さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。なお、二次抗体は、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどで標識されていてもよい。

0098

いくつかの態様において、本発明の方法では、第1から第12の抗原タンパク質は蛍光タンパク質と融合していてもよい。抗原タンパク質と融合した蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第1から第6の抗原タンパク質が第1の蛍光タンパク質と融合しており、第7から第12の抗原タンパク質が第2の蛍光タンパク質と融合している場合、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、本発明の方法では、第1から第12の抗原タンパク質はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳されてもよい。抗原タンパク質と同一のmRNAから翻訳される蛍光タンパク質はそれぞれ同一または異なるものでありうる。例えば、第1から第6の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第7から第12の抗原タンパク質がそれぞれIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳される場合、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であってもよい。いくつかの態様において、本発明の方法では、例えば、第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されていてもよい。また、例えば、第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体により標識されていてもよい。蛍光色素/蛍光タンパク質としては、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどを使用することができる。

0099

いくつかの態様において、本発明の方法では、例えば、第2、第5、第8および第11の抗原タンパク質を発現する細胞は、第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3、第6、第9および第12の抗原タンパク質を発現する細胞が第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で強く標識されていてもよい。ここで、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とは、例えばフローサイトメーター上で区別可能である。蛍光色素/蛍光タンパク質としては、例えば、AcGFP、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 790、AmCyan、APC-Cy5.5、APC-Cy7、APC-eFluor 780、APC-H7、APC-R700、APC、AsRed2、Azami-Green、BB515、BB700、BUV395、BUV496、BUV563、BUV661、BUV737、BUV805、BV421、BV480、BV510、BV570、BV605、BV650、BV711、BV750、BV785、BV786、Calcein pH 9、Calcein AM、Calcein Violet AM、Cascade Blue、Cascade Yellow、CF488A、CF555、CF647、CF660、CF680、CF750、CF770、CFP、CFSE、EosFP、Cy3、Cy5、Cy7、Cytophase Violet、DAPI、Dendra2、DRAQ5、DRAQ7、DsRed、DsRed2、DsRed-Express、DsRed-Monomer、dTomato、DyeCycle Green、DyeCycle Orange、DyeCycle Ruby、DyeCycle Violet、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、EBFP、ECFP、eFluor 405、eFluor 450、eFluor 565NC、eFluor 585NC、eFluor 605NC、eFluor 625NC、eFluor 650NC、eFluor 700NC、EGFP、Emerald 300、EmGFP、EYFP、FITC、Flash Phalloidin Green 488、Flash Phalloidin Red 594、Flash Phalloidin NIR 647、FVS440UV、FVS450、FVS510、FVS520、FVS570、FVS575V、FVS620、FVS660、FVS700、FVS780、GFP、GFP2、HcRed、Hoechst 33258、Hoechst 33342、HyPer、JRed、Kaede、KeimaRed、KikumeGR、KillerRed、KusabiraOrange、Lucifer Yellow、Magnesium Green、Marina Blue、mBanana、mCherry、MidoriishiCyan、MitoSpy GreenFM、MitoSpy Orange CMTMRos、MitoSpy Red CMXRos、MitoTracker Green、MitoTracker Orenge、MitoTracker Red、MitoTracker Deep Red、mOrange、mPlum、mRaspberry、mRFP1、mStrawberry、mTangerine、mTFP1、mTurquoise、Na-Green、Nile Red、Oregon Green、Pacific Blue、Pacific Orange、PE、PE-CF594、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red、PerCP、PerCP-Cy5.5、PerCP-eFluor 710、PhiYFP、PhiYFP-m、Phycocyanin、PicoGreen、PI、PS-CFP、Qdot 525、Qdot 545、Qdot 565、Qdot 585、Qdot 605、Qdot 625、Qdot 655、Qdot 705、Qdot 800、Rho 110、Rho 123、Rhodamine Red、Riboflavin、Sirius、SNARF-1 (pH6)、SNARF-1 (pH9)、SYBR Green、SYTOX Blue、SYTOX Green、SYTOX Orange、SYTOX Red、TagCFP、TagGFP、TagRFP、TagYFP、Texas Red、TMRho、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1、TOTO-3、TurboFP602、TurboGFP、TurboRFP、TurboYFP、V450、V500、Venus、Via-Probe Green、Via-Probe Red、YFP、YO-PRO-1、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、ZsGreen、ZsYellow、7-AADなどを使用することができる。

0100

さらに、細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程の前に、細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程を行うことができる。よって、本発明の態様の一つには、被検者に由来する試料中における第1から第12の抗体を同時に検出または測定する方法であって、第1の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第2の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第3の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第4の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第5の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第6の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第7の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第8の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第9の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第10の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第11の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、第12の抗原タンパク質を発現する細胞を調製する工程、該第1から第12の抗原タンパク質を発現する細胞を含む細胞懸濁液を調製する工程、該細胞懸濁液に被検者に由来する試料を加える工程、該細胞懸濁液に蛍光標識した二次抗体を加える工程、ならびに該細胞懸濁液中の細胞をフローサイトメーターで分析する工程を含み、ここで、第1から第12の抗原タンパク質のそれぞれは蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1から第6の抗原タンパク質はそれぞれ第1の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第1の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第7から第12の抗原タンパク質はそれぞれ第2の蛍光タンパク質と融合しているか又はIRES発現ベクターを用いて第2の蛍光タンパク質と同一のmRNAから翻訳され、第1の蛍光タンパク質と第2の蛍光タンパク質とは異なる蛍光タンパク質であり、第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質で標識されており、そして第2、第5、第8および第11の抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で弱く標識されており、第3、第6、第9および第12の抗原タンパク質を発現する細胞は第2の蛍光色素もしくは第4の蛍光タンパク質で強く標識されており、弱く標識された細胞と強く標識された細胞とが区別可能である、方法が含まれる。第4から第6の抗原タンパク質を発現する細胞および第10から第12の抗原タンパク質を発現する細胞は、第1の蛍光色素もしくは第3の蛍光タンパク質の接合した抗体で標識されていてもよい。

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