図面 (/)

技術 メラノーマの処置および診断

出願人 ザロックフェラーユニヴァーシティ
発明者 タヴァズィソハイルペンチェヴァノラジー.
出願日 2019年4月25日 (1年2ヶ月経過) 出願番号 2019-083874
公開日 2019年9月12日 (9ヶ月経過) 公開番号 2019-151646
状態 未査定
技術分野 酵素、微生物を含む測定、試験 突然変異または遺伝子工学 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 非環式または炭素環式化合物含有医薬 ペプチド又は蛋白質 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬
主要キーワード 容器機構 基部面 含有密度 説明用資料 コロイド状酸化ケイ素 サイズ限界 物理的性 進行表
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年9月12日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題

メラノーマ診断処置のための新規薬剤及び方法の提供。

解決手段

ガンを処置するための方法であって、その必要性のある対象にLXRアゴニスト投与することを含み、前記LXRアゴニストが、前記ガンの転移伝播を遅くするのに十分なレベルにまでApoEの発現レベル又は活性レベルを増大させるのに十分な量で投与される、方法。

概要

背景

メラノーマ悪性腫瘍であり、下部表皮における異常なメラノサイトから発達し、血液系およびリンパ系を介して体内遠位部位に転移し得る。メラノーマは皮膚ガン症例の5%未満を占めるにもかかわらず、はるかにより危険であり、皮膚ガンに伴う死者大多数に関わっている。世界中で、メラノーマの発生率が、驚くべき割合で増大し続けてきており、メラノーマを発症する生涯リスクが合衆国において男性については1/58もの大きさである(非特許文献1)。悪性メラノーマ死亡率もまた、世界中で劇的に上昇し続けている。2006年のWHO報告書によれば、約48,000名のメラノーマ関連死亡が1年あたり世界中で生じている(非特許文献2)。合衆国では、ほぼ70,000名の人々が2010年の間にメラノーマと診断され、およそ9,000名がこの疾患により死亡すると予想されるであろうことが見積もられた(非特許文献3)。

いくつかの従来的なガン治療法が転移性メラノーマを処置する際に使用されているにもかかわらず、それらは効果的ではない。したがって、転移性メラノーマは依然として、処置することが最も困難なガンの1つであり、また、最も恐れられている新生物の1つである。したがって、メラノーマの診断および処置のための新規薬剤および方法が求められている。

概要

メラノーマの診断、処置のための新規な薬剤及び方法の提供。ガンを処置するための方法であって、その必要性のある対象にLXRアゴニスト投与することを含み、前記LXRアゴニストが、前記ガンの転移の伝播を遅くするのに十分なレベルにまでApoEの発現レベル又は活性レベルを増大させるのに十分な量で投与される、方法。なし

目的

本発明は、上述の必要性を、メラノーマの診断および処置のための薬剤および方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

ガン処置するための方法であって、その必要性のある対象にLXRアゴニスト投与することを含み、前記LXRアゴニストが、前記ガンの転移伝播を遅くするのに十分なレベルにまでApoEの発現レベルまたは活性レベルを増大させるのに十分な量で投与される、方法。

請求項2

ガンを処置するための方法であって、その必要性のある対象に、前記ガンを処置するのに十分な量でApoEポリペプチドを投与することを含む方法。

請求項3

遊走性ガンの伝播を遅らせる方法であって、その必要性のある対象に、前記遊走性ガンの該伝播を遅らせるのに十分な量でLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法。

請求項4

前記LXRアゴニストがLXRβアゴニストである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

前記LXRアゴニストがApoEの発現レベルをインビトロにおいて少なくとも2.5倍増大させる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

前記LXRβアゴニストがLXRαよりもLXRβに対して選択的である、請求項5に記載の方法。

請求項7

前記LXRβアゴニストが、LXRαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも2.5倍大きいLXRβに対する活性を有する、請求項6に記載の方法。

請求項8

前記LXRβアゴニストが、LXRαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも10倍大きいLXRβに対する活性を有する、請求項6または7に記載の方法。

請求項9

前記LXRβアゴニストが、LXRαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも100倍大きいLXRβに対する活性を有する、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

前記LXRアゴニストが、LXRαに対する前記アゴニストの活性の少なくとも2.5倍以内であるLXRβに対する活性を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

前記遊走性ガンが転移性ガンである、請求項4〜10のいずれか一項に記載の方法。

請求項12

前記転移性ガンが、遊走性細胞遊走および/または浸潤を示す細胞を含む、請求項11に記載の方法。

請求項13

前記転移性ガンが、内皮動員および/または血管形成を示す細胞を含む、請求項11または12に記載の方法。

請求項14

前記遊走性ガンが、腹膜腔胸膜腔心膜腔またはクモ膜下腔の表面に播種することを介して伝播する、請求項4〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項15

前記遊走性ガンがリンパ系を介して伝播する、請求項4〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項16

前記遊走性ガンが血行を介して伝播する、請求項4〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項17

前記遊走性ガンが細胞遊走ガンである、請求項4〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項18

前記細胞遊走ガンが非転移性の細胞遊走ガンである、請求項17に記載の方法。

請求項19

前記遊走性ガンが、卵巣ガン中皮腫または原発性ガンである、請求項18に記載の方法。

請求項20

ガン幹細胞またはガン始原細胞の増殖または成長阻害するための方法であって、前記細胞を、前記細胞の増殖または成長を阻害するのに十分な量でLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドと接触させることを含む方法。

請求項21

ガンの腫瘍播種速度を低下させる方法であって、その必要性のある対象に、腫瘍播種を低下させるのに十分な量でLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法。

請求項22

ガンの転移性結節形成を低下させるか、または処置する方法であって、その必要性のある対象に、ガンの前記転移性結節形成を処置するのに十分な量でLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法。

請求項23

前記ガンが、乳ガン結腸ガン、腎細胞ガン非小細胞肺ガン肝細胞ガン、胃ガン、卵巣ガン、膵臓ガン食道ガン前立腺ガン肉腫およびメラノーマからなるリストから選択される、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。

請求項24

前記ガンがメラノーマである、請求項23に記載の方法。

請求項25

前記ガンが乳ガンである、請求項23に記載の方法。

請求項26

前記ガンが腎細胞ガンである、請求項23に記載の方法。

請求項27

前記ガンが膵臓ガンである、請求項23に記載の方法。

請求項28

前記ガンが非小細胞肺ガンである、請求項23に記載の方法。

請求項29

前記ガンが結腸ガンである、請求項23に記載の方法。

請求項30

前記ガンが卵巣ガンである、請求項23に記載の方法。

請求項31

前記ガンが薬物抵抗性のガンである、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。

請求項32

前記ガンが、ベムラフェニブダカルバジン、CTLA4阻害剤BRAF阻害剤MEK阻害剤、PD1阻害剤またはPDL1阻害剤に対して抵抗性である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。

請求項33

式I〜式IVのいずれか1つの化合物または化合物番号1〜化合物番号39のいずれかの化合物あるいはそれらの医薬的に許容される塩からなるリストから選択されるLXRアゴニストを投与することを含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。

請求項34

前記LXRアゴニストが化合物1またはその医薬的に許容される塩である、請求項33に記載の方法。

請求項35

前記LXRアゴニストが化合物2またはその医薬的に許容される塩である、請求項33に記載の方法。

請求項36

前記LXRアゴニストが化合物3またはその医薬的に許容される塩である、請求項33に記載の方法。

請求項37

前記LXRアゴニストが化合物12またはその医薬的に許容される塩である、請求項33に記載の方法。

請求項38

前記LXRアゴニストが化合物25またはその医薬的に許容される塩である、請求項33に記載の方法。

請求項39

前記LXRアゴニストが化合物38またはその医薬的に許容される塩である、請求項33に記載の方法。

請求項40

前記LXRアゴニストが化合物39またはその医薬的に許容される塩である、請求項33に記載の方法。

請求項41

ApoEポリペプチドを投与することを含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。

請求項42

前記ApoEポリペプチドがLRP1またはLRP8の活性レベルまたは発現レベルを増大させる、請求項41に記載の方法。

請求項43

前記ApoEポリペプチドが、LRP1、LRP8、ApoE2受容体LDL受容体またはVLDL受容体に結合する、請求項41または42に記載の方法。

請求項44

前記ApoEポリペプチドがApoEの受容体結合領域(RBR)である、請求項41〜43のいずれかに記載の方法。

請求項45

抗増殖剤を投与することをさらに含み、前記LXRアゴニストおよび前記抗増殖剤が、一緒になって遊走性ガンの進行を遅らせるのに十分な量で投与される、請求項33〜40のいずれか一項に記載の方法。

請求項46

前記LXRアゴニストおよび前記抗増殖剤が、一緒になって前記対象を処置するために効果的である量で互いに28日以内に投与される、請求項45に記載の方法。

請求項47

抗増殖剤を投与することをさらに含み、前記ApoEポリペプチドおよび前記抗増殖剤が、一緒になって遊走性ガンの進行を遅らせるのに十分な量で投与される、請求項41〜44のいずれか一項に記載の方法。

請求項48

前記ApoEポリペプチドおよび前記抗増殖剤が、一緒になって前記対象を処置するために効果的である量で互いに28日以内に投与される、請求項47に記載の方法。

請求項49

メラノーマを、その処置を必要とする対象において処置するための方法であって、(a)該対象において、DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、肝臓X受容体(LXR)およびmiR−7からなる群から選択される転移抑制因子の発現レベルまたは活性レベルを増大させること、あるいは、(b)該対象において、miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908およびCTGFからなる群から選択される転移促進因子の発現レベルまたは活性レベルを低下させることを含む方法。

請求項50

前記メラノーマが転移性である、請求項49に記載の方法。

請求項51

前記増大させる工程が、(i)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8またはLXRの配列を有するポリペプチド;(ii)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8またはLXRをコードする配列を有する核酸;(iii)LRP1、LRP8またはLXRに対するリガンド;および(iv)miR−7をコードするRNAi剤のうちの1つまたは複数を前記対象に投与することによって行われる、請求項49または50に記載の方法。

請求項52

前記増大させる工程が、miR−199a−3p、miR−199a−5pおよびmiR−1908からなる群から選択されるマイクロRNAの発現レベルまたは活性レベルを低下させることによって行われる、請求項49または50に記載の方法。

請求項53

前記低下させる工程がmiR−Zip技術によって行われる、請求項52に記載の方法。

請求項54

前記低下させる工程がロックド核酸(LNA)技術によって行われる、請求項52に記載の方法。

請求項55

前記低下させる工程がアンタゴミル(antagomir)によって行われる、請求項52に記載の方法。

請求項56

LRP1に対する前記リガンドまたはLRP8に対する前記リガンドが小分子または抗体である、請求項52に記載の方法。

請求項57

ApoEまたはDNAJA4の発現レベルを増大させる前記工程が、LXRの活性レベルまたは発現レベルを増大させることによって行われる、請求項50に記載の方法。

請求項58

LXRの活性レベルを増大させる前記工程が、LXRアゴニストを前記対象に投与することによって行われる、請求項57に記載の方法。

請求項59

前記LXRアゴニストが式I〜式IVのいずれか1つの化合物である、請求項58に記載の方法。

請求項60

対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを決定するための方法であって、前記対象からサンプルを得ること;前記サンプルにおいて、(i)miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908およびCTGFからなる群から選択される転移促進因子の第1の発現レベル、または、(ii)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、肝臓X受容体(LXR)およびmiR−7からなる群から選択される転移抑制因子の第2の発現レベルを測定すること;ならびに前記第1の発現レベルを第1の所定の参照値と比較し、または、前記第2の発現レベルを第2の所定の参照値と比較し、それにより、(a)前記第1の発現レベルが第1の所定の参照値を超えているならば、または、(b)前記第2の発現レベルが第2の所定の参照値を下回っているならば、前記対象は、転移性メラノーマを有することが決定され、または、転移性メラノーマを有する危険性があることが決定されることを含む方法。

請求項61

前記第1の所定の参照値および第2の所定の参照値が、転移性メラノーマを有しないコントロール対象から得られる、請求項60に記載の方法。

請求項62

前記サンプルが体液サンプルである、請求項60に記載の方法。

請求項63

前記サンプルが腫瘍サンプルである、請求項60に記載の方法。

請求項64

前記サンプルが母斑サンプルである、請求項60に記載の方法。

請求項65

前記サンプルがヒト皮膚サンプルである、請求項60に記載の方法。

請求項66

前記測定する工程が、前記第1の発現レベルと前記第2の発現レベルとの両方を測定することを含む、請求項60に記載の方法。

請求項67

前記サンプルが体液サンプルである、請求項66に記載の方法。

請求項68

前記サンプルが、腫瘍サンプル、母斑サンプルまたはヒト皮膚サンプルである、請求項66に記載の方法。

請求項69

複数の特有の位置を有する支持体、ならびに下記の核酸:(i)miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908およびCTGFからなる群から選択される転移促進因子をコードする核酸またはその相補体に対して相補的である配列を有する少なくとも1つの核酸、あるいは(ii)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、肝臓X受容体(LXR)およびmiR−7からなる群から選択される転移抑制因子をコードする核酸またはその相補体に対して相補的である配列を有する少なくとも1つの核酸の任意の組合せを含むアレイであって、それぞれの核酸が前記支持体の特有の位置に固定化される、アレイ。

請求項70

メラノーマの転移可能性を対象において診断するためのキットであって、DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、肝臓X受容体(LXR)およびmiR−7からなる群から選択される転移抑制因子遺伝子発現産物に特異的に結合する第1の試薬、またはmiR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908およびCTGFからなる群から選択される転移促進因子遺伝子の発現産物に特異的に結合する第2の試薬を含むキット。

請求項71

前記第2の薬剤が、前記抑制因子遺伝子または促進因子遺伝子あるいはその相補体に対して相補的である配列を有するプローブである、請求項70に記載のキット。

請求項72

免疫アッセイハイブリダイゼーションアッセイまたはPCRアッセイを行うための試薬をさらに含む、請求項70に記載のキット。

請求項73

請求項69に記載されるアレイを含む、請求項70に記載のキット。

請求項74

メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な化合物を特定する方法であって、(i)miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908およびCTGFからなる群から選択されるマーカー遺伝子プロモーター作動可能に連結される核酸によってコードされるレポーター遺伝子発現する試験細胞を得ること;(ii)前記試験細胞を試験化合物さらすこと;(iii)前記試験細胞における前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定すること;(iv)前記発現レベルをコントロールレベルと比較すること;ならびに(v)前記比較により、前記発現レベルが前記コントロールレベルよりも低いことが示されるならば、前記試験化合物を、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な候補物として選択することを含む方法。

請求項75

メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な化合物を特定する方法であって、(i)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、肝臓X受容体(LXR)およびmiR−7からなる群から選択されるマーカー遺伝子のプロモーターに作動可能に連結される核酸によってコードされるレポーター遺伝子を発現する試験細胞を得ること;(ii)前記試験細胞を試験化合物にさらすこと;(iii)前記試験細胞における前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定すること;(iv)前記発現レベルをコントロールレベルと比較すること;ならびに(v)前記比較により、前記発現レベルが前記コントロールレベルよりも大きいことが示されるならば、前記試験化合物を、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な候補物として選択することを含む方法。

請求項76

前記コントロールレベルが、前記試験化合物にさらされていないことを除いて前記試験細胞と同じであるコントロール細胞から得られる、請求項74または75に記載の方法。

請求項77

前記レポーター遺伝子が前記マーカー遺伝子と同じである、請求項74または75に記載の方法。

請求項78

内皮動員を、その阻害を必要とする対象において阻害するための方法であって、CTGFの発現または活性を阻害する薬剤を前記対象に投与することを含む方法。

請求項79

前記対象が、病理学的な血管形成によって特徴づけられる障害を有する、請求項78に記載の方法。

請求項80

前記障害が、ガン、眼障害または炎症性障害である、請求項79に記載の方法。

請求項81

前記ガンが転移性メラノーマである、請求項80に記載の方法。

請求項82

腫瘍細胞浸潤を、その阻害を必要とする対象において阻害するための方法であって、CTGFの発現または活性を阻害する薬剤を前記対象に投与することを含む方法。

請求項83

前記腫瘍細胞が転移性メラノーマ細胞である、請求項82に記載の方法。

請求項84

転移性ガンを、その処置を必要とする対象において処置するための方法であって、CTGFの発現または活性を阻害する薬剤を前記対象に投与することを含み、該ガンがメラノーマである、方法。

請求項85

前記薬剤が、抗体、核酸、ポリペプチドまたは小分子化合物である、請求項78〜84のいずれかに記載の方法。

請求項86

前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項85に記載の方法。

請求項87

転移性ガンを、その処置を必要とする対象において処置するための方法であって、miR−7の発現または活性を増大させる薬剤を前記対象に投与することを含む方法。

請求項88

前記ガンが転移性メラノーマである、請求項87に記載の方法。

請求項89

前記薬剤が、抗体、核酸、ポリペプチドまたは小分子化合物である、請求項87または88に記載の方法。

請求項90

前記薬剤がmiR−7活性を有する、請求項87〜89のいずれかに記載の方法。

請求項91

前記核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項89に記載の方法。

請求項92

前記オリゴヌクレオチドが、配列番号36〜38からなる群から選択される配列を含む、請求項91に記載の方法。

関連出願の相互参照

0001

本出願は米国仮特許出願第61/682,339号(2012年8月13日出願)および米国仮特許出願第61/784,057号(2013年3月14日出願)の優先権を主張する。これらの出願の内容はそれらの全体において参照によって本明細書中に組み込まれる。

技術分野

0002

本発明は、遊走性ガンおよびメラノーマ診断および処置に関連する。

背景技術

0003

メラノーマは悪性腫瘍であり、下部表皮における異常なメラノサイトから発達し、血液系およびリンパ系を介して体内遠位部位に転移し得る。メラノーマは皮膚ガン症例の5%未満を占めるにもかかわらず、はるかにより危険であり、皮膚ガンに伴う死者大多数に関わっている。世界中で、メラノーマの発生率が、驚くべき割合で増大し続けてきており、メラノーマを発症する生涯リスクが合衆国において男性については1/58もの大きさである(非特許文献1)。悪性メラノーマ死亡率もまた、世界中で劇的に上昇し続けている。2006年のWHO報告書によれば、約48,000名のメラノーマ関連死亡が1年あたり世界中で生じている(非特許文献2)。合衆国では、ほぼ70,000名の人々が2010年の間にメラノーマと診断され、およそ9,000名がこの疾患により死亡すると予想されるであろうことが見積もられた(非特許文献3)。

0004

いくつかの従来的なガン治療法が転移性メラノーマを処置する際に使用されているにもかかわらず、それらは効果的ではない。したがって、転移性メラノーマは依然として、処置することが最も困難なガンの1つであり、また、最も恐れられている新生物の1つである。したがって、メラノーマの診断および処置のための新規薬剤および方法が求められている。

先行技術

0005

Jemal他、2008、CA:Cancer J.Clin.、58:71〜96
Lucas他(2006)、Environmental Burden of Disease Series.13.World Health Organization.ISBN92−4−159440−3
米国ガン学会;www.cancer.org

課題を解決するための手段

0006

本発明は、上述の必要性を、メラノーマの診断および処置のための薬剤および方法を提供することによって対処する。本発明は、少なくとも部分的には、転移性メラノーマにおいて脱調節される協同的なmiRNA−タンパク質ネットワークの予想されなかった発見に基づいている。このネットワークには、多くの転移抑制因子および転移促進因子が含まれる。

0007

1つの局面において、本発明は、ガンを処置するための方法であって、その必要性のある対象にLXRアゴニスト投与することを含み、LXRアゴニストが、当該ガンの転移の伝播を遅くするのに十分なレベルにまでApoEの発現レベルまたは活性レベルを増大
させるのに十分な量で投与される方法を特徴とする。

0008

別の局面において、本発明は、ガンを処置するための方法であって、その必要性のある対象に、当該ガンを処置するのに十分な量でApoEポリペプチドを投与することを含む方法を特徴とする。

0009

別の局面において、本発明は、遊走性ガンの伝播を遅らせる方法であって、その必要性のある対象にLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法を特徴とする。

0010

上述の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、LXRアゴニストはLXRβアゴニストである。特定の実施形態において、LXRアゴニストはApoEの発現レベルをインビトロにおいて少なくとも2.5倍増大させる。特定の実施形態において、LXRβアゴニストはLXRαよりもLXRβに対して選択的である。他の実施形態において、LXRβアゴニストは、LXRαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも2.5倍大きいLXRβに対する活性を有する。いくつかの実施形態において、LXRβアゴニストは、LXRαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも10倍大きいLXRβに対する活性を有する。さらなる実施形態において、LXRβアゴニストは、LXRαに対する前記アゴニストの活性よりも少なくとも100倍大きいLXRβに対する活性を有する。特定の実施形態において、LXRアゴニストは、LXRαに対する前記アゴニストの活性の少なくとも2.5倍以内であるLXRβに対する活性を有する。

0011

いくつかの実施形態において、遊走性ガンは転移性ガンである。転移性ガンには、遊走性細胞遊走および/または浸潤を示す細胞を挙げることができ、ならびに/あるいは、内皮動員および/または血管形成を示す細胞を挙げることができる。他の実施形態において、遊走性ガンは細胞遊走ガンである。なおさらに他の実施形態において、細胞遊走ガンは非転移性の細胞遊走ガンである。

0012

遊走性ガンは、腹膜腔胸膜腔心膜腔またはクモ膜下腔の表面に播種することを介して伝播するガンであり得る。代替では、遊走性がんは、リンパ系を介して伝播するガン、または、血行を介して伝播するガンであり得る。

0013

特定の実施形態において、遊走性ガンは、非転移性の細胞遊走ガンである細胞遊走ガンであり、例えば、卵巣ガン中皮腫または原発性ガンなどである。

0014

関連する局面において、本発明は、ガンの転移を阻害するための、または軽減させるための方法であって、LXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。

0015

別の局面において、本発明は、ガン幹細胞またはガン始原細胞の増殖または成長を阻害するための方法であって、当該細胞を、前記細胞の増殖または成長を阻害するのに十分な量でLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。

0016

さらに別の局面において、本発明は、ガンの腫瘍播種速度を低下させる方法であって、その必要性のある対象に、腫瘍播種を低下させるのに十分な量でLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。

0017

なおさらにさらなる局面において、本発明は、ガンの転移性結節形成を低下させるか、または処置する方法であって、その必要性のある対象に、ガンの前記転移性結節形成を処
置するのに十分な量でLXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。

0018

他の実施形態において、ガンは、乳ガン結腸ガン、腎細胞ガン非小細胞肺ガン肝細胞ガン、胃ガン、卵巣ガン、膵臓ガン食道ガン前立腺ガン肉腫またはメラノーマである。いくつかの実施形態において、ガンはメラノーマである。他の実施形態において、ガンは乳ガンである。特定の実施形態において、ガンは腎細胞ガンである。さらなる実施形態において、ガンは膵臓ガンである。他の実施形態において、ガンは非小細胞肺ガンである。いくつかの実施形態において、ガンは結腸ガンである。さらなる実施形態において、ガンは卵巣ガンである。

0019

他の実施形態において、ガンは薬物抵抗性のガンである。さらなる実施形態において、ガンは、ベムラフェニブダカルバジン、CTLA4阻害剤、PD1阻害剤またはPDL1阻害剤に対して抵抗性である。

0020

いくつかの実施形態において、上記方法は、式I〜式IVのいずれか1つの化合物または化合物番号1〜化合物番号39のいずれかの化合物あるいはそれらの医薬的に許容される塩からなるリストから選択されるLXRアゴニストを投与することを含む。いくつかの実施形態において、LXRアゴニストは化合物1またはその医薬的に許容される塩である。他の実施形態において、LXRアゴニストは化合物2またはその医薬的に許容される塩である。特定の実施形態において、LXRアゴニストは化合物3またはその医薬的に許容される塩である。さらなる実施形態において、LXRアゴニストは化合物12またはその医薬的に許容される塩である。いくつかの実施形態において、LXRアゴニストは化合物25またはその医薬的に許容される塩である。他の実施形態において、LXRアゴニストは化合物38またはその医薬的に許容される塩である。さらなる実施形態において、LXRアゴニストは化合物39またはその医薬的に許容される塩である。

0021

上記方法はさらに、抗増殖剤を投与することを含むことができ、この場合、前記LXRアゴニストおよび前記抗増殖剤が、一緒になって遊走性ガンの進行を遅らせるのに十分である量で投与される。例えば、抗増殖剤およびLXRアゴニストを、一緒になって上記対象を処置するために効果的である量で、それぞれの28日以内(例えば、21日以内、14日以内、10日以内、7日以内、5日以内、4日以内、3日以内、2日以内または1日以内)において、または、他の24時間以内(例えば、12時間以内、6時間以内、3時間以内、2時間以内もしくは1時間以内、または同時)において投与することができる。

0022

いくつかの実施形態において、上記方法は、ApoEポリペプチドを投与することを含む。ApoEポリペプチドフラグメントはLRP1またはLRP8の活性レベルまたは発現レベルを増大させることができ、ならびに/あるいは、ApoEポリペプチドはLRP1またはLRP8に結合することができ、ApoEポリペプチドはApoEの受容体結合領域(RBR)であることが可能である。上記方法はさらに、抗増殖剤を投与することを含むことができ、この場合、前記ApoEポリペプチドおよび前記抗増殖剤が、一緒になって遊走性ガンの進行を遅らせるのに十分である量で投与される。例えば、抗増殖剤およびApoEポリペプチドを、一緒になって上記対象を処置するために効果的である量で、それぞれの28日以内(例えば、21日以内、14日以内、10日以内、7日以内、5日以内、4日以内、3日以内、2日以内または1日以内)において、または、他の24時間以内(例えば、12時間以内、6時間以内、3時間以内、2時間以内もしくは1時間以内、または同時)において投与することができる。

0023

いくつかの実施形態において、医薬組成物はさらに、抗増殖活性を有するさらなる化合物を含む場合がある。抗増殖活性を有するさらなる化合物は、様々な化合物の群から、例
えば、化学療法剤および細胞毒性剤分化誘導剤(例えば、レチノイン酸ビタミンDサイトカイン)、ホルモン剤免疫学的薬剤ならびに抗血管新生剤などから選択することができる。化学療法剤および細胞毒性剤には、アルキル化剤細胞毒性抗生物質代謝拮抗剤ビンカアルカロイドエトポシド類およびその他(例えば、パクリタキセルタキソールドセタキセルタキソテール、シス−プラチン)が含まれるが、これらに限定されない。抗増殖活性を有するさらなる化合物のリストを、L.Brunton、B.ChabnerおよびB.Knollman(編)、Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics、第12版、2011年、McGraw Hill Companies、New York、NYに見出すことができる。

0024

上記方法はさらに、アルキル化剤、白金剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤抗腫瘍抗生物質有糸分裂阻害剤アロマターゼ阻害剤チミジル酸シンターゼ阻害剤、DNAアンタゴニストファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤ポンプ阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤リボヌクレオシドレダクターゼ阻害剤、TNFアルファのアゴニスト/アンタゴニスト、エンドセリン受容体アンタゴニストレチノイン酸受容体アゴニスト、免疫調節剤、ホルモン剤および抗ホルモン剤光線力学的薬剤、チロシンキナーゼ阻害剤アンチセンス化合物コルチコステロイド類、HSP90阻害剤、プロテオソーム阻害剤(例えば、NPI−0052)、CD40阻害剤、抗CSI抗体、FGFR3阻害剤、VEGF阻害剤MEK阻害剤サイクリンD1阻害剤、NF−κB阻害剤、アントラサイクリン類、ヒストンデアセチラーゼキネシン阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、COX2阻害剤、mTOR阻害剤カルシニューリンアンタゴニストIMiD、または、増殖性疾患を処置するために使用される他の薬剤からなる群から選択される抗増殖性化合物を投与することを含む場合がある。そのような化合物の例が表1に提供される。

0025

別の局面において、本発明は、メラノーマ(例えば、転移性メラノーマ)を、その処置を必要とする対象において処置するための方法を特徴とする。この方法は、(a)当該対象において、DNAJA4、アポリポタンパク質E(ApoE)、LRP1、LRP8、肝臓X受容体(LXR、例えば、LXR−アルファおよびLXR−ベータの両方)およびmiR−7からなる群から選択される転移抑制因子の発現レベルまたは活性レベルを増大させること、あるいは、(b)当該対象において、miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908およびCTGFからなる群から選択される転移促進因子の発現レベルまたは活性レベルを低下させることを含む。

0026

この方法において、増大させる工程は、下記の(i)〜(iv)のうちの1つまたは複数を当該対象に投与することによって行うことができる:(i)DNAJA4、ApoEまたはApoEフラグメント、LRP1、LRP8、あるいは、LXRの配列を有するポリペプチド、(ii)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8またはLXRをコードする配列を有する核酸、(iii)LRP1、LRP8またはLXRに対するリガンド、および、(iv)miR−7をコードするRNAi剤。LRP1リガンドまたはLRP8リガンドの例には、ApoEの受容体結合部分、抗LRP1抗体または抗LRP8抗体、および、小分子リガンドが含まれる。一例において、ApoEの発現レベルを増大させることを、LXRの活性レベルまたは発現レベルを増大させることによって行うことができる。DNAJA4の発現レベルを増大させることもまた、LXRの活性レベルまたは発現レベルを増大させることによって行うことができる。LXRの活性レベルは、LXRのリガンド、例えば、下記で開示されるような式I〜式IVの化合物などを当該対象に投与することによって増大させることができる。増大させる工程はまた、miR−199a−3p、miR−199a−5pおよびmiR−1908からなる群から選択されるマイクロRNAの発現レベルまたは活性レベルを低下させることによって行うことができる。こ
の目的を達成するために、この技術分野において知られている多くの技術を使用することができ、これらには、下記の実施例において記載されるようなmiR−Zip技術、ロックド核酸(LNA)技術およびアンタゴミル(antagomir)技術が含まれるが、これらに限定されない。

0027

別の局面において、本発明は、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを決定するための方法を提供する。この方法は、対象からサンプルを得ること;当該サンプルにおいて、(i)miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908およびCTGFからなる群から選択される転移促進因子の第1の発現レベル、または、(ii)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXRおよびmiR−7からなる群から選択される転移抑制因子の第2の発現レベルを測定すること;ならびに、第1の発現レベルを第1の所定の参照値と比較すること、または、第2の発現レベルを第2の所定の参照値と比較することを含む。対象は、(a)第1の発現レベルが第1の所定の参照値を超えているならば、または、(b)第2の発現レベルが第2の所定の参照値を下回っているならば、転移性メラノーマを有することが決定されるか、または、転移性メラノーマを有する危険性があることが決定される。第1の所定の参照値および第2の所定の参照値を、転移性メラノーマを有しないコントロール対象から得ることができる。1つの実施形態において、測定する工程は、第1の発現レベルと第2の発現レベルとの両方を測定することを含む。サンプルは、体液サンプル腫瘍サンプル母斑サンプルまたはヒト皮膚サンプルであることが可能である。

0028

別の局面において、本発明は、複数の特有の位置を有する支持体と、(i)miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908およびCTGFからなる群から選択される転移促進因子をコードする核酸またはその相補体に対して相補的である配列を有する少なくとも1つの核酸、あるいは、(ii)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXRおよびmiR−7からなる群から選択される転移抑制因子をコードする核酸またはその相補体に対して相補的である配列を有する少なくとも1つの核酸の任意の組合せとを含むアレイを提供する。好ましくは、それぞれの核酸が支持体の特有の位置に固定化される。このアレイは転移性メラノーマの診断および予後のために使用することができる。

0029

したがって、本発明はまた、メラノーマの転移可能性を対象において診断するためのキットを提供する。キットは、DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXRおよびmiR−7からなる群から選択される転移抑制因子遺伝子発現産物に特異的に結合する第1の試薬、または、miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908およびCTGFからなる群から選択される転移促進因子遺伝子の発現産物に特異的に結合する第2の試薬を含む。第2の薬剤は、抑制因子遺伝子または促進因子遺伝子あるいはその相補体に対して相補的である配列を有するプローブであることが可能である。キットはさらに、免疫アッセイハイブリダイゼーションアッセイまたはPCRアッセイを行うための試薬を含むことができる。1つの実施形態において、キットは上述のアレイを含有した。

0030

別の局面において、本発明は、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な化合物を特定する方法を提供する。この方法は、(i)miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908およびCTGFからなる群から選択されるマーカー遺伝子プロモーター作動可能に連結される核酸によってコードされるレポーター遺伝子発現する試験細胞を得ること;(ii)試験細胞を試験化合物さらすこと;(iii)試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを測定すること;(iv)発現レベルをコントロールレベルと比較すること;ならびに(v)比較により、発現レベルがコントロールレベルよりも低いことが示
されるならば、試験化合物を、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な候補物として選択することを含む。

0031

本発明は、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な化合物を特定する別の方法を提供する。この方法は、(i)DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXRおよびmiR−7からなる群から選択されるマーカー遺伝子のプロモーターに作動可能に連結される核酸によってコードされるレポーター遺伝子を発現する試験細胞を得ること;(ii)試験細胞を試験化合物にさらすこと;(iii)試験細胞におけるレポーター遺伝子の発現レベルを測定すること;(iv)発現レベルをコントロールレベルと比較すること;ならびに(v)比較により、発現レベルがコントロールレベルよりも大きいことが示されるならば、試験化合物を、メラノーマを処置するために、あるいは、内皮動員、ガン細胞浸潤または転移性血管形成を阻害するために有用な候補物として選択することを含む。

0032

上述の特定方法において、レポーター遺伝子は、この技術分野において知られている標準的なレポーター遺伝子(例えば、LaxZ遺伝子、GFP遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子など)、あるいは、上述の転移抑制因子遺伝子または転移促進因子遺伝子の1つであることが可能である。これらの方法において、コントロールレベルは、試験化合物にさらされていないことを除いて試験細胞と同じであるコントロール細胞から得ることができる。

0033

別の局面において、本発明は、内皮動員を、その阻害を必要とする対象において阻害するための方法、または、腫瘍細胞浸潤を、その阻害を必要とする対象において阻害するための方法、または、転移性ガンを、その処置を必要とする対象において処置するための方法であって、CTGFの発現または活性を阻害する薬剤を当該対象に投与することによる方法を提供する。対象は、ガン(例えば、転移性メラノーマ)、眼障害および炎症性障害(これらに限定されない)を含めて、病理学的な血管形成によって特徴づけられる障害を有するものであることが可能である。腫瘍細胞の一例が転移性のメラノーマ細胞である。薬剤の例には、抗体、核酸、ポリペプチドおよび小分子化合物が含まれる。好ましい実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。

0034

別の局面において、本発明は、内皮動員を、その阻害を必要とする対象において阻害するための方法、または、腫瘍細胞浸潤を、その阻害を必要とする対象において阻害するための方法、または、転移性ガンを、その処置を必要とする対象において処置するための方法であって、miR−7の発現または活性を増大させる薬剤を当該対象に投与することによる方法を提供する。腫瘍細胞の一例が転移性のメラノーマ細胞である。薬剤の例には、抗体、核酸、ポリペプチドまたは小分子化合物が含まれる。一例において、薬剤はmiR−7活性を有する。核酸はオリゴヌクレオチドであることが可能である。オリゴヌクレオチドは、配列番号36〜38からなる群から選択される配列を含むことができる。

0035

本明細書中で使用される場合、「遊走性ガン」は、腫瘍を形成するガン細胞が遊走し、続いて、最初の腫瘍の部位とは異なる他の部位において悪性移植物として成長するガンを示す。ガン細胞は、体腔内に伝播するために腹膜腔、胸膜腔、心膜腔またはクモ膜下腔の表面に播種することを介して、リンパ細胞の浸潤によるリンパ系への浸潤、ならびに、局所リンパ節および遠位リンパ節への輸送、次いで、身体の他の部分への輸送を介して、血液細胞の浸潤による血行性伝播を介して、または、周囲組織への浸潤を介して遊走する。遊走性ガンには、転移性腫瘍および細胞遊走ガン(例えば、卵巣ガン、中皮腫および原発性肺ガンなど、これらのそれぞれが細胞の遊走によって特徴づけられる)が含まれる。

0036

本明細書中で使用される場合、「遊走性ガンの伝播を遅くする」は、新しい病巣の形成を弱めるか、または停止させること、あるいは、腫瘍負荷縮小させること、停止させること、または逆行させることを示す。

0037

本明細書中で使用される場合、「転移性腫瘍」は、腫瘍を形成するガン細胞が、リンパ系を介して、または、血行性伝播を介して転移するか、または、対象の体内において1つの場所から別の場所(1つまたは複数)に伝播する大きい能力を有するか、あるいは、リンパ系を介して、または、血行性伝播を介して転移すること、または、対象の体内において1つの場所から別の場所(1つまたは複数)に伝播することを開始し、例えば対象の体内に二次的腫瘍を生成する、腫瘍またはガンを示す。そのような転移挙動により、悪性腫瘍が示される場合がある。場合によっては、転移挙動には、腫瘍細胞の細胞遊走挙動および/または細胞浸潤挙動における増大が伴うことがある。

0038

本明細書中で使用される場合、「転移の伝播を遅くする」は、新しい病巣の形成を弱めるか、または停止させること、あるいは、腫瘍負荷を縮小させること、停止させること、または逆行させることを示す。

0039

用語「ガン」は、どのようなガンであれ、悪性の新生物性細胞の増殖によって引き起こされるガンを示し、例えば、腫瘍、新生物、ガン腫、肉腫、白血病およびリンパ腫などを示す。

0040

本明細書中で使用される場合、「薬物抵抗性(の)ガン」は、どのようなガンであれ、表2における抗増殖剤に対して抵抗性であるガンを示す。

0041

転移性であるとして定義され得るガンの例には、非小細胞肺ガン、乳ガン、卵巣ガン、結腸直腸ガン胆道ガン、膀胱ガン、脳ガン(神経膠芽細胞腫および髄芽細胞腫を含む)、子宮頸ガン、絨毛ガン、子宮内膜ガン、食道ガン、胃ガン、血液学的新生物、多発性骨髄腫、白血病、上皮内新生物、肝臓ガン、リンパ腫、神経芽細胞腫口腔ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、肉腫、皮膚ガン(メラノーマ、基底細胞ガン、扁平上皮ガンを含む)、精巣ガン、間質性腫瘍、胚細胞腫瘍甲状腺ガンおよび腎臓ガンが含まれるが、これらに限定されない。

0042

「増殖」は、本出願において使用される場合、(細胞)要素を構成することに起因する類似する形態(細胞)の複製または増加を伴う。

0043

「細胞遊走」は、本出願において使用される場合、周囲組織へのガン細胞による浸潤、および、ガン細胞の遠位器官における脈管構造から出るための血管壁横断を伴う。

0044

「細胞遊走ガン」によって、周囲組織へのガン細胞による浸潤、および、ガン細胞の遠位器官における脈管構造から出るための血管壁の横断によって遊走するガンが意味される。

0045

「非転移性(の)細胞遊走ガン」は、本明細書中で使用される場合、リンパ系を介して、または、血行性伝播を介して遊走しないガンを示す。

0046

本明細書中で使用される場合、「細胞−細胞の接着」は、セレクチン分子とセレクチン特異的リガンドとの間での相互作用を介した少なくとも2つの細胞の間における接着を示す。細胞−細胞の接着は細胞遊走を含む。

0047

細胞接着関連障害」が、細胞−細胞の接着または遊走から生じるか、あるいは、細胞
−細胞の接着または遊走に関連づけられるいずれかの疾患または障害として本明細書中では定義される。細胞接着障害にはまた、免疫系または炎症系不適切な活性化、正常から外れた活性化または正常でない活性化から生じるどのような疾患または障害も含まれる。そのような疾患には、心筋梗塞細菌感染症またはウイルス感染症、転移性状態(例えば、ガン)が含まれるが、これらに限定されない。本発明はさらに、LXRアゴニストまたはApoEポリペプチドを投与することによって細胞接着障害を処置するための方法を特徴とする。

0048

本明細書中で使用される場合、「ガン幹細胞」または「ガン始原細胞」は、正常な幹細胞に関連する特徴を有するガン細胞、具体的には、特定のガンサンプルにおいて見出されるすべての細胞タイプを生じさせる能力を有するガン細胞を示す。したがって、ガン幹細胞は、おそらくは他の非腫瘍原性ガン細胞とは対照的に、腫瘍原性、すなわち、腫瘍形成性である。ガン幹細胞は、異なった集団として腫瘍において持続していることがあり、新しい腫瘍を生じさせることによってガンの再発および転移の原因となることがある。

0049

本明細書中で使用される場合、「腫瘍播種」は、腫瘍細胞クラスターの流出、および、最初の腫瘍の部位とは異なる部位における悪性移植物としてのそれらのその後の成長を示す。

0050

本明細書中で使用される場合、「転移性結節」は、最初の腫瘍の部位とは異なる部位における体内での腫瘍細胞の凝集物を示す。

0051

本発明の1つまたは複数の実施形態の詳細が下記の説明において示される。本発明の他の特徴、目的および利点が、説明から、また、請求項から明らかであろう。

図面の簡単な説明

0052

ヒトメラノーマ転移の内因性促進因子としてのmiR−1908、miR−199a−3pおよびmiR−199a−5pの体系的特定。(A)独立したMeWo転移性派生物およびA375転移性派生物において、それらのそれぞれの親細胞に対してアップレギュレーションされるmiRNAの分散正規化されたマイクロアレイ発現値を例示するヒートマップ。それぞれのヒートマップ列の平均からの標準偏差の変化がカラーマップによって示される。(B)アップレギュレーションされることがマイクロアレイハイブリダイゼーションによって見出されるmiRNAを、MeWo−LM2転移性派生物においてqRT−PCRによって確認した。n=3。(C)miR−199a、miR−1908、miR−214またはコントロールヘアピンに対する前駆体を過剰発現する4×104個の親MeWo細胞を静脈内注入した後における肺での転移性コロニー形成バイオルミネセンス画像化プロット。肺を注入後63日で取り出し、H&E染色した。n=5。(D)miR−1908(m1908 KD)、miR−199a−3p(m199a3p KD)、miR−199a−5p(m199a5p KD)を阻害する短いヘアピン(miR−Zip)またはコントロール配列(shCTRL)を発現する4×104個のLM2細胞を静脈内注入した後における肺転移に対応するバイオルミネセンス画像化プロットおよびH&E染色された肺。肺を注入後49日で取り出し、H&E染色した。n=5〜8。(E)miR−1908、miR−199a−3p、miR−199a−5pまたはコントロール配列のmiR−Zip誘導サイレンシングを伴う2×105個のA375−LM3転移性派生物による肺でのコロニー形成をバイオルミネセンス画像化によって42日目に定量化した。n=5〜8。(F)miR−199a−3p、miR−199a−5pおよびmiR−1908の発現レベルを、MSKCC患者から得られる非転移原発性メラノーマ皮膚病変部(n=38)および転移原発性メラノーマ皮膚病変部(n=33)のコホートにおいてqRT−PCRによって盲検様式で求めた。n=71。すべてのデータが平均±SEMとして表される。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。図12もまた参照のこと。
miR−1908、miR−199a−3pおよびmiR−199a−5pは、メラノーマ転移進行を調節することにおける二重の細胞自律役割/細胞非自律的役割を示す。(A)miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する1×106個の親MeWo細胞を免疫不全マウス皮下注入し、原発性腫瘍体積を経時的にモニターした。n=4〜6。(B)miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する1×105個の親MeWo細胞を、トランスウエルマトリゲル被覆挿入物を通って24時間にわたって浸潤させ、それぞれの挿入物の基部側に浸潤する細胞の数を定量化した。n=7。(C〜D)miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908またはコントロール配列のmiR−Zip誘導阻害を伴う1×105個の高転移性のMeWo−LM2細胞(C)およびA375−LM3細胞(D)を細胞浸潤アッセイに供した。n=6〜8。(E)miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する5×104個のMeWo細胞をウエルの底部に播種し、1×105個のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、トランスウエルの挿入物を通って16時間にわたってガン細胞に向かって遊走させた。内皮動員能を、それぞれの挿入物の基部側に遊走するHUVECの数を定量化することによって測定した。n=7。(F〜G)miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908またはコントロール配列について阻害される5×104個のMeWo−LM2細胞(F)およびA375−LM3細胞(G)による内皮動員。n=6〜10。(H)miR−199−3p、miR−199a−5p、miR−1908またはコントロール配列について枯渇化される2×105個の高転移性MeWo−LM2細胞を静脈内注入した後に形成される転移性結節についての百分率血管密度分布累積割合プロット。肺の切片ヒトビメンチン(青色)およびMECA−32(赤色)について免疫組織化学的に二重染色し、ビメンチン染色に基づいて区別されるそれぞれの転移性結節の内部における百分率MECA−32陽性面積を定量化した。n=211個の結節(コントロールKD);n=60個の結節(m199a3p KD);n=138個の結節(m199a5p KD);n=39個の結節(m1908 KD)。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、100μm。図13もまた参照のこと。
miR−199aおよびmiR−1908の共通標的遺伝子としてのApoEおよびDNAJA4の特定。(A)miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する低転移性のMeWo細胞と、高転移性のMeWo−LM2細胞とにおける、qRT−PCRによって測定されるApoEおよびDNAJA4のmRNAレベルを示すヒートマップ。カラーマップにより、それぞれのヒートマップ列の平均からの標準偏差の変化が例示される。(B)miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する親MeWo細胞における、野生型のApoE 3’UTR/CDSルシフェラーゼ融合物およびDNAJA4 3’UTR/CDSルシフェラーゼ融合物、または、miRNA標的部位変異型のApoE 3’UTR/CDSルシフェラーゼ融合物およびDNAJA4 3’UTR/CDSルシフェラーゼ融合物の安定性を測定する異種ルシフェラーゼレポーターアッセイ。n=3〜4。(C)miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908またはコントロール配列の発現が沈黙させられたMeWo−LM2細胞における野生型のApoE 3’UTR/CDSルシフェラーゼ融合物およびDNAJA4 3’UTR/CDSルシフェラーゼ融合物の安定性。n=4。(D)miR−199a−3p、miR−199a−5pおよびmiR−1908によるApoE 3’UTR/CDS標的化およびDNAJA4 3’UTR/CDS標的化の実験由来モデルの概略。(E)高転移性のMeWo−LM2派生物およびそれらの低転移性の親細胞株における野生型およびmiRNA標的部位変異型のApoE 3’UTR/CDSルシフェラーゼ融合物およびDNAJA4 3’UTR/CDSルシフェラーゼ融合物のルシフェラーゼ活性。n=4。(F)コントロールベクターを発現するか、あるいは、ApoEまたはDNAJA4を過剰発現する1×105個のMeWo−LM2細胞によるマトリゲル浸潤能。n=4。(G)コントロールベクター、あるいは、ApoEまたはDNAJA4のための過剰発現ベクターにより形質導入される5×104個のMeWo−LM2細胞による内皮動員能。n=6。(H〜I)ApoE、DNAJA4またはコントロール配列を標的化する短いレンチウイルスヘアピンにより形質導入される低転移性の親MeWo細胞をそれらのマトリゲル浸潤能(H)および内皮細胞動員能(I)について評価した。n=6〜8。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、100μm。図14もまた参照のこと。
miR−199aおよびmiR−1908によるApoEおよびDNAJA4の直接的な標的化は、転移浸潤、内皮動員およびコロニー形成を促進する。(A〜D)コントロールshRNA、あるいは、ApoEまたはDNAJA4をmiR−1908阻害の状況(m1908 KD;A、B)またはmiR−199a−5p阻害の状況(m199a5p KD;C、D)で標的化するshRNAを発現する高転移性LM2細胞を細胞浸潤アッセイ(A、C)および内皮動員アッセイ(B、D)に供した。n=6〜8。(E〜F)コントロールヘアピン、あるいは、ApoE、DNAJA4またはコントロール配列をmiR−1908サイレンシングの状況(E)またはmiR−199a−5aサイレンシングの状況(F)で標的化するヘアピンを発現する1×105個のLM2細胞を静脈内注入した後における肺転移を表すバイオルミネセンス画像化プロットおよびH&E染色された肺。n=5。(G〜H)ApoEまたはDNAJA4を過剰発現する、あるいは、コントロールベクターをmiR−1908過剰発現の状況で発現する親MeWo細胞をマトリゲル浸潤表現型(G)および内皮動員表現型(H)について分析した。(I〜J)コントロールshRNA、または、ApoEおよびDNAJA4を標的化するshRNAを発現するA375−LM3派生物を、miR−199a−3p、miR−199a−5pおよびmiR−1908を標的化するLNAのカクテル、または、コントロールLNAにより形質導入し、マトリゲル浸潤アッセイ(I)および内皮動員アッセイ(J)において分析した。n=4。(K)miR−1908について阻害され、かつ、ApoE、DNAJA4またはコントロール配列を標的化するshRNAにより形質導入されるMeWo−LM2細胞によって形成される転移性結節についての、累積割合プロットで表される血管密度分布。図4Eからの肺の切片をヒトビメンチン(青色)および内皮マーカーMECA−32(赤色)について免疫細胞化学的に二重染色した。それぞれのビメンチン陽性結節の内部における百分率MECA−32陽性面積を定量化した。n=39個の結節(shCTRL);n=97(shAPOE1);n=38(shAPOE2);n=200(shDNAJA41);n=19(shDNAJA42)。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、100μm。図15もまた参照のこと。
メラノーマ細胞により分泌されるApoEはメラノーマ浸潤および内皮動員を阻害し、一方、ApoEの遺伝的欠失は転移を速める。(A〜B)MeWo−LM2転移性派生物およびそれらの親細胞(A)、ならびに、miR−199a−5p、miR−1908またはコントロール配列について沈黙させられるLM2細胞(B)から得られる馴化培地におけるELISAによって定量化される細胞外ApoEレベル。n=3。(C)ApoE中和抗体1D7(10〜40μg/mL)またはIgG(40μg/mL)を細胞培地に加え、親MeWo細胞によるマトリゲル浸潤を評価した。n=4〜6。(D)1D7抗体(40μg/mL)またはコントロールIgG抗体(40μg/mL)の存在下における親MeWo細胞による内皮動員。n=4。(E)マトリゲル浸潤および内皮動員の表現型を、細胞培地に加えられるウシ血清アルブミンBSA)(100μM)または組換えApoE3(100μM)の存在下、LM2細胞において評価した。n=7〜10。(F〜G)miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908またはコントロール配列の発現が沈黙させられたLM2細胞を、IgG抗体またはApoE中和1D7抗体(40μg/mL)の存在下、マトリゲル浸潤能(F)および内皮動員能(G)について調べた。n=5〜6。(H)DNAJA4またはコントロール配列を標的化するshRNAにより形質導入される親MeWo細胞から得られる馴化培地におけるELISAによって定量化されるApoEレベル。n=3。(I〜J)DNAJA4のshRNA誘導サイレンシングを有する親MeWo細胞を、BSA(100μM)または組換えApoE3(100μM)のどちからの存在下、マトリゲル浸潤表現型(I)および内皮動員表現型(J)について分析した。n=4。(K)母斑サンプル(n=9)、原発性メラノーマサンプル(n=6)および遠位メラノーマ転移物サンプル(n=19)における、アレイに基づくApoE発現レベル。(L)高転移性MeWo−LM2細胞を100μg/mLでの組換えApoE3またはBSAの存在下でインキュベーションした。24時間後、4×104個の細胞をNOD−SCIマウスに静脈内注入し、肺でのコロニー形成をバイオルミネセンス画像化によってモニターした。n=6。(M)ApoEの遺伝的ヌルC57BL/6マウスまたはそれらの野生型コントロール同腹子に静脈内注入される5×104個のB16F10マウスメラノーマ細胞による肺転移。肺バイオルミネセンス定量化および代表的なH&E染色された肺は注入後19日に対応する。n=8〜18。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、100μm。
メラノーマ浸潤および内皮動員に対するApoEの影響を媒介する異なったメラノーマ細胞受容体および内皮細胞受容体の特定。(A)マトリゲル浸潤能を、BSA(100μΜ)または組換えApoE3(100μΜ)のどちらかの存在下、LDLR、VLDLR、LRP8、LRP1またはコントロール配列を標的化するsiRNAにより形質導入される1×105個のLM2細胞において調べた。n=4〜7。(B)miR−1908またはコントロール配列を標的化する短いヘアピンにより形質導入される1×105個のMeWo−LM2細胞を、LRP1を標的化するsiRNAまたはコントロールsiRNAによりトランスフェクションし、マトリゲル浸潤アッセイに供した。n=4。(C)miR−1908阻害の状況における、LRP1またはコントロール配列を標的化するsiRNAにより形質導入される1×105個のLM2細胞による肺でのコロニー形成のバイオルミネセンス画像化。n=5。(D)BSA(100μΜ)または組換えApoE3(100μΜ)と24時間プレインキュベーションされる1×105個の内皮細胞を5×105個のLM2細胞による内皮動員表現型について分析した。n=3〜4。(E)1×105個の内皮細胞を、LDLR、VLDLR、LRP1、LRP8またはコントロール配列を標的化するsiRNAにより形質導入し、miR−1908またはコントロール配列について阻害されるLM2細胞に向かってトランスウエル系において遊走させた。n=4〜12。(F)細胞培地に加えられるIgG抗体(40μg/mL)または1D7抗体(40μg/mL)の存在下における1×105個の内皮細胞によるトランスウエル遊走。n=6〜8。(G)BSA(100μΜ)または組換えApoE3(100μΜ)の存在下における、LRP8またはコントロール配列を標的化するsiRNAにより形質導入される1×105個の内皮細胞によるトランスウエル遊走。n=6〜7。(H)1×105個の内皮細胞を、LRP8またはコントロール配列を標的化するsiRNAにより形質導入し、トランスウエル走化性遊走をApoE勾配に沿って評価した。n=6〜8。(I)BSA(10μg/mL)、VEGF(400ng/mL)+BSA(10μg/mL)、または、VEGF(400ng/mL)+組換えApoE3(10μg/mL)を含有する、マウスの腹側わき腹の上方において皮下に埋め込まれたマトリゲルプラグの中への内皮動員。n=3〜6。(J)5×104個のB16F10マウスメラノーマ細胞を野生型マウスまたはApoE遺伝的ヌルマウスに静脈内注入した後に形成される肺転移性結節の内部における血管密度。図5Mからの肺の切片をMECA−32について免疫組織化学的に染色し、細胞への色素沈着に基づいて輪郭が示されるそれぞれの転移性結節の内部における百分率MECA−32陽性面積を定量化した。n=17〜20。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、100μm。
メラノーマ転移における、miR−199a−3p、miR−199a−5pおよびmiR−1908の間での臨床的および治療的な協同性(A〜D)。患者の原発性メラノーマ病変部のmiR−199a−3p発現レベル(A)、miR−199a−5p発現レベル(B)、miR−1908発現レベル(C)、または、3つのmiRNAの総発現レベル(D)の関数として患者の転移非存在生存を表すMSKCCコホート(n=71)についてのカプラン・マイヤー曲線。原発性腫瘍のmiRNA発現レベルまたは総miRNA発現レベル(miR−199a−3p、miR−199a−5pおよびmiR−1908の発現の和)が集団についてのメジアンを超えた患者をmiRNA発現陽性(赤色)として分類し、一方、原発性腫瘍がこれらの所与miRNAをこのメジアンよりも低いレベルで発現した患者をmiRNA発現陰性(青色)として分類した。(E)miR−1908、miR−199a−3pまたはmiR−199a−5pをそれぞれ個々に標的化するLNA、3つすべてのmiRNAを標的化するLNAの組合せ、あるいは、コントロールLNAによりトランスフェクションされる高転移性LM2細胞による肺転移。トランスフェクション後48時間で、1×105個の細胞を免疫不全マウスに静脈内注入した。n=5〜6。(F)コントロールLNA(LNA−CTRL)、または、miR−1908、miR−199a−3p、miR−199a−5pを標的化するLNAのカクテル(LNA−3miRNAs)により、無胸腺ヌードマウスへの心臓内注入の48時間前にトランスフェクションされた1×105個のLM2細胞による全身転移。n=5。(G)心臓内注入後28日目における、LNA−CTRLのLM2細胞およびLNA−3miRNAsのLM2細胞から生じる全身転移病巣の数。n=5。(H〜I)LNA−CTRLのLM2細胞およびLNA−3miRNAsのLM2細胞の心臓内注入後28日目における骨転移(H)および脳転移(I)のバイオルミネセンスシグナル定量化。n=5。(J)4×104個の高転移性MeWo−LM2細胞を免疫低下マウスに尾静脈注入し、これらのマウスを、miR−1908、miR−199a−3pおよびmiR−199a−5pを標的化するインビボ最適化LNAのカクテルにより12.5mg/kgの総用量で、または、模擬PBSコントロールにより、4週間にわたって週に2回、静脈内投与により処置した。肺でのコロニー形成をバイオルミネセンス画像化によって評価した。56日目に取り出される代表的なH&E染色された肺が示される。n=5〜6。(K)ApoE媒介のメラノーマ細胞LRP1受容体シグナル伝達および内皮細胞LRP8受容体シグナル伝達を標的化することを介する、メラノーマにおける転移性浸潤、内皮動員およびコロニー形成のmiRNA依存的調節のモデル。
ApoE/LRP1シグナル伝達のmiRNA依存的標的化は、CTGFの誘導を介してガン細胞浸潤および内皮動員を促進させる。(A)qRT−PCR分析によって求められる、下記の細胞における分散正規化されたCTGF発現レベルのヒートマップ:(1)MeWo親細胞およびMeWo−LM2細胞、(2)miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現するMeWo親細胞、ならびに、(3)ApoEまたはコントロール配列を標的化する短いヘアピンにより形質導入されるMeWo親細胞。カラーマップは平均からの標準偏差の変化を示す。(B)ELISAによって求められる、ApoEノックダウンを有するMeWo親細胞からの馴化培地におけるCTGFレベル。n=6;p値は片側スチューデントt検定に基づく。(C)LRP1ノックダウンまたはコントロールノックダウンの状況で組換えApoEにより処置される高転移性MeWo−LM2細胞からの馴化培地における、ELISAによって定量化されるCTGFレベル。n=3〜4;p値は片側スチューデントt検定に基づく。(D〜E)shRNA誘導のApoEノックダウンを有する親MeWo細胞を、(1)CTGFまたはコントロール配列を標的化する無関係なsiRNAによりトランスフェクションし、あるいは、(2)CTGF中和抗体(20μg/mL)またはIgGコントロール抗体(20μg/mL)の存在下でインキュベーションし、細胞を細胞浸潤アッセイ(D)および内皮動員アッセイ(E)に供した。n=6〜8;p値は片側スチューデントt検定に基づく。スケールバーは100μMを示す。すべてのデータが平均±SEMとして表される。
CTGFは、miRNA依存的な転移性浸潤、内皮動員およびコロニー形成を媒介する。(A)コントロールヘアピンを発現するか、あるいは、miR−199aまたはmiR−1908を過剰発現する1×105個の親MeWo細胞を、図に示されるように、CTGFを標的化する阻止抗体(20μg/mL)またはコントロールのIgG抗体(20μg/mL)の存在下におけるトランスウエル細胞浸潤アッセイに供した。n=4〜10;p値は片側スチューデントt検定に基づく。すべてのデータが平均±SEMとして表される。(B)コントロールヘアピンを発現するか、あるいは、miR−199aまたはmiR−1908を過剰発現する親MeWo細胞による内皮動員。アッセイ開始時に、CTGFを標的化する中和抗体(20μg/mL)またはコントロールのIgG抗体(20μg/mL)を示されるように内皮細胞に加え、1×105個の内皮細胞をトランスウエル遊走アッセイにおいて5×104個のガン細胞に向かって遊走させた。n=3〜8;p値は片側スチューデントt検定に基づく。(C)miR−199aまたはmiR−1908の過剰発現の状況における、CTGFについてノックダウンされる5×104個の親MeWo細胞による肺転移のバイオルミネセンス画像化。n=5〜6;p値を、片側マンホイットニーt検定を使用して求めた。すべてのデータが平均±SEMとして表される。
LXRアゴニストのGW3965による処置はメラノーマ細胞のApoEレベルを上昇させ、ガン細胞浸潤、内皮動員および転移性コロニー形成を抑制する。(A〜B)親MeWo細胞を、示された濃度でのDMSOまたはGW3965の存在下でインキュベーションした。48時間後、総RNAを抽出し、ApoEのレベル(A)およびDNAJA4のレベル(B)をqRT−PCRによって求めた。n=3。(C)GW3965またはDMSOにより48時間にわたって前処理される1×105個の親MeWo細胞による細胞浸潤。n=6〜7;p値は片側スチューデントt検定に基づく。すべてのデータが平均±SEMとして表される。(D)GW3965またはDMSOにより48時間にわたって前処理される5×104個の親MeWo細胞による内皮動員。n=6〜7;p値は片側スチューデントt検定に基づく。(E)マウスに、GW3965(20mg/kg)を含有する穀物固形飼料、または、コントロール餌を与えた。10日後、4×104個の親MeWo細胞をマウスに尾静脈注入し、これらのマウスに実験期間中を通して、GW3965含有固形飼料またはコントロール餌を連続して与えた。肺でのコロニー形成をバイオルミネセンス画像化によって評価した。n=5〜6;p値を、片側マン・ホイットニーt検定を使用して得た。すべてのデータが平均±SEMとして表される。
メラノーマ転移の内因性抑制因子としてのmiR−7の特定。(A)miR−7を阻害する短いヘアピン(miR−Zip)を発現する4×104個の親MeWo細胞(miR−7 KD)を静脈内注入した後における肺での転移性コロニー形成のバイオルミネセンス画像化プロット。肺を注入後63日で取り出し、H&E染色した。n=5。(B)miR−7についての前駆体またはコントロールヘアピンを過剰発現する4×104個のLM2細胞による肺転移。肺でのコロニー形成をバイオルミネセンス画像化によって毎週モニターし、肺を注入後77日目に取り出した。n=5。すべてのデータが平均±SEMとして表される;p値を、片側マン−ホイットニーt検定を使用して求めた。*p<0.05、**p<0.01。
高転移性のヒトメラノーマ細胞株派生物についてのインビボ選抜、ならびに、転移促進因子miRNAとしてのmiR−199a−3p、miR−199a−5pおよびmiR−1908の特定。(A〜B)MeWo−LM2転移性派生物(A)およびA375−LM3転移性派生物(B)ならびにそれらのそれぞれの親細胞株に対応する肺転移のバイオルミネセンス画像化およびH&E染色された肺の代表的な画像。4×104個のMeWo−Par/MeWo−LM2細胞および1×105個のA375−Par/A375−LM3細胞をNOD−SCIDマウスに静脈内注入し、肺を72日目および49日目にそれぞれ取り出し、H&E染色した。n=4〜5。(C)miR−199a−5p、miR−199a−3p、miR−1908およびmiR−214の発現レベルをA375−LM3転移性派生物およびそれらの親細胞においてqRT−PCRによって求めた。n=3。(D)親MeWo細胞を、コントロールヘアピンを発現するか、あるいは、miR−199a(miR−199a−3pおよびmiR−199a−5pの両方)、miR−1908またはmiR−214を生じさせるプレ−miRNAヘアピン構築物を発現するレトロウイルスにより形質導入した。標的miRNAの発現レベルをqRT−PCRによって求めた。n=3。(E)図1CからのH&E染色された肺切片を、miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する親MeWo細胞から生じる転移性結節の数について分析した。n=3。(F)miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908またはコントロール配列の発現が沈黙させられたLM2細胞によって形成される転移性結節の数を図1DからのH&E染色された肺切片において分析した。n=3。すべてのデータが平均±SEMとして表される。
miR−199aおよびmiR−1908は増殖をインビトロにおいて阻害し、細胞浸潤および内皮動員を選択的に促進させる。(A)miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する2.5×104個のMeWo細胞を三連で播種し、生細胞を5日後に計数した。n=3。(B)1×105個の低転移性の親MeWo細胞および高転移性のLM2細胞をトランスウエルアッセイにおけるそれらのマトリゲル通過浸潤能について比較した。n=3〜4。(C)1×105個の内皮細胞を6ウエルプレートに播種し、単層を形成させた。miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する2×105個の親MeWo細胞を内皮単層の上に播種し、30分間インキュベーションした。それぞれの単層をその後で画像化し、内皮細胞に接着するガン細胞の数を定量化した。n=3。(D)miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する1×106個の親MeWo細胞を、0.2%のメチルセルロースが補充される細胞培地を含有する低接着性プレートに播種した。懸濁状態での48時間の後、死細胞および生細胞の数を定量化した。n=3。(E)miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する5×105個の親MeWo細胞を6ウエルプレートに播種し、低血清培地において48時間インキュベーションし、その後、生細胞の数を定量化した。n=4。(F)miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する親MeWo細胞によるコロニー形成。50個の細胞を6cmのプレートに播種し、形成されたコロニーの数を2週間後に定量化した。n=4。(G)5×104個の親MeWo細胞およびLM2細胞をウエルの底部に播種し、それらの内皮細胞動員能について評価した。n=6〜8。(H)miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する親MeWo細胞によって形成される転移性結節についての、累積割合プロットとして示される百分率血管密度。図1Cからの肺切片をヒトビメンチンおよびMECA−32について免疫組織化学的に二重染色し、ヒトビメンチン染色によって与えられる総結節面積に対するMECA−32陽性面積を、ImageJを使用して定量化した。n=43個の結節(コントロール);n=117個の結節(miR−199a OE);n=55個の結節(miR−1908 OE)。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、100μm。
miR−199aおよびmiR−1908はApoEおよびDNAJA4を収斂的かつ協同的に標的とする。(A)miR−199a−3p、miR−199a−5pおよびmiR−1908に共通な推定される標的遺伝子の特定をもたらす統合的な実験的取り組みを示すベン図。それぞれのmiRNAの過剰発現のときに1.5倍超の差でダウンレギュレーションされる遺伝子のトランスクリプトームプロファイリングを、それぞれのmiRNAのサイレンシングのときに1.5倍を超えてアップレギュレーションされる遺伝子と重ね合わせ、また、それらの親細胞株に対して転移性LM2細胞において1.5倍超の差でダウンレギュレーションされる遺伝子と重ね合わせた。(B〜D)miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現する親MeWo細胞(B)、親MeWo細胞およびそれらの高転移性のLM2派生細胞株(C)、ならびに、miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908またはコントロール配列のmiR−Zip媒介サイレンシングを有するMeWo−LM2細胞(D)における、qRT−PCRによって測定されるApoEおよびDNAJA4の発現レベル。n=3。(E)miR−199a−3p、miR−199a−5p、miR−1908またはコントロール配列の阻害を有する高転移性LM2細胞における、miR−199a−3p、miR−199a−5pまたはmiR−1908の標的部位変異型のApoE 3’UTR/CDSルシフェラーゼ融合物およびDNAJA4 3’UTR/CDSルシフェラーゼ融合物の安定性を測定する異種ルシフェラーゼレポーターアッセイ。n=3〜4。(F)MeWo−LM2細胞を、コントロールベクターを発現するレトロウイルス、あるいは、ApoEまたはDNAJA4を生じさせる過剰発現ベクターを発現するレトロウイルスにより形質導入した。標的遺伝子の発現レベルをqRT−PCRによって求めた。(G)ApoE、DNAJA4またはコントロール配列を標的化するレンチウイルスshRNAにより形質導入される親MeWo細胞における、qRT−PCRによって求められるApoEおよびDNAJA4の発現レベル。すべてのデータが平均±SEMとして表される。
miR−199a/miR−1908とApoE/DNAJA4との間におけるエピシス相互作用(A〜D)。MeWo−LM2細胞を、miR−1908のmiR−Zip誘導サイレンシングの状況(A、B)、miR−199a−5pのmiR−Zip誘導サイレンシングの状況(C、D)、または、コントロール配列のmiR−Zip誘導サイレンシングの状況で、ApoEを標的化するレンチウイルスshRNA(A、C)、DNAJA4を標的化するレンチウイルスshRNA(B、D)、または、コントロールshRNAにより形質導入した。標的遺伝子のレベルをqRT−PCRによって分析した。(E)コントロールヘアピン、あるいは、ApoE、DNAJA4またはコントロール配列をmiR−1908阻害の状況で標的化する(図4Eで使用されるshRNAとは無関係な)shRNAを発現する1×105個のLM2細胞による肺転移のバイオルミネセンス画像化。代表的なバイオルミネセンス画像およびH&E染色された肺は注入後42日目に対応する。n=5。(F〜G)ApoEおよびDNAJA4の発現レベルを、コントロールベクター、あるいは、ApoEまたはDNAJA4のための過剰発現ベクターをmiR−1908過剰発現(F)またはmiR−199a過剰発現(G)の状況で発現するレトロウイルスにより形質導入される親MeWo細胞においてqRT−PCRによって分析した。(H〜I)miR−199a過剰発現の状況でApoEまたはDNAJA4を過剰発現する、あるいは、コントロールベクターを発現する親MeWo細胞を浸潤表現型(H)および内皮動員表現型(I)について調べた。n=7〜8。(J)miR−1908過剰発現の状況でApoEまたはDNAJA4を過剰発現する、あるいは、コントロールベクターを発現する4×104個の親MeWo細胞による肺転移のバイオルミネセンス画像化。代表的なバイオルミネセンス画像およびH&E染色された肺は注入後56日に対応する。n=4〜8。(K)ApoEおよびDNAJA4またはコントロール配列を標的化するshRNA構築物を発現するレンチウイルスにより形質導入される高転移性のA375−LM3派生物における、qRT−PCRによって求められるApoEおよびDNAJA4の発現レベル。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、100μm。
細胞外ApoEは、ガン細胞または内皮細胞の増殖および生存に対する何らかの影響とは無関係にメラノーマ浸潤および内皮動員の表現型を阻害する。(A)細胞外ApoEレベルを、miR−199a、miR−1908またはコントロールヘアピンを過剰発現するMeWo細胞からの馴化培地においてELISAによって測定した。n=3。(B〜C)3×104個のMeWo−LM2細胞(B)または内皮細胞(C)をBSA(100μΜ)またはAPOE(100μΜ)の存在下で培養し、細胞増殖を、生細胞の数をそれぞれの示された時点で計数することによって経時的にモニターした。n=3。(D〜E)BSA(100μΜ)またはAPOE(100μΜ)の存在下での血清飢餓の状況におけるMeWo−LM2細胞(D)または内皮細胞(E)の生存。n=3。(F〜G)ApoEのmRNA発現レベルを、コントロールヘアピン、または、DNAJA4を標的化する短いヘアピン構築物を発現するレンチウイルスにより形質導入される親MeWo細胞(F)、および、コントロールベクター、または、DNAJA4のための過剰発現ベクターを発現するレトロウイルスにより形質導入されるLM2細胞(G)において評価した。n=3。(H〜I)コントロールベクター、または、DNAJA4のための過剰発現ベクターを発現するレトロウイルスにより形質導入されるLM2細胞を、IgG抗体(40μg/mL)または1D7抗体(40μg/mL)(ApoE中和抗体)の存在下でのトランスウエルアッセイにおいて、それらのマトリゲル通過浸潤能(H;n=6〜8)および内皮細胞動員能(I;n=4)について評価した。すべてのデータが平均±SEMとして表される。
ApoEは、細胞浸潤および内皮動員を、メラノーマ細胞のLRP1受容体および内皮細胞のLRP8受容体を標的化することによって阻害する。(A)LRP1またはコントロール配列に対するsiRNAにより形質導入される1×105個のLM2細胞をマトリゲル通過浸潤能について分析した。n=9〜12。(B)miR−199a−5pまたはコントロール配列について阻害される1×105個のMeWo−LM2細胞をLRP1標的化siRNAまたはコントロールsiRNAによりトランスフェクションし、それらのマトリゲル浸潤能について調べた。n=4。(C)コントロールsiRNAまたはLRP1標的化siRNAにより形質導入されるMeWo−LM2 miR−1908 KD細胞が注入されたNOD−SCIDマウスから56日目に取り出される代表的なH&E染色された肺(図6Cを参照のこと)。(D〜E)1×105個の内皮細胞をLRP8標的化siRNAまたはコントロール配列によりトランスフェクションし、短いコントロールヘアピンを発現する5×104個のMeWo−LM2細胞(D;n=8)、あるいは、miR−199a−5pまたはコントロール配列について阻害される5×104個のMeWo−LM2細胞(E;n=4)に向かってトランスウエル遊走させた。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、100μm。
miR−199aおよびmiR−1908のLNA型阻害はメラノーマ転移を抑制する。(A)コントロールLNA、または、miR−199a−3p、miR199a−5pおよびmiR−1908を標的化するLNAのカクテルにより形質導入される2.5×104個のMeWo−LM2細胞によるインビトロ細胞増殖。生細胞の数を5日後に定量化した。n=3。(B)コントロールLNA、または、miR−199a−3p、miR199a−5pおよびmiR−1908を標的化するLNAのカクテルによりトランスフェクションされる高転移性のA375−LM3派生物による肺でのコロニー形成。トランスフェクション後48時間で、5×105個の細胞をNOD−SCIDマウスに静脈内注入し、肺でのコロニー形成を、バイオルミネセンスを35日後に測定することによって求めた。n=5〜6。(C)これら3つのmiRNAを標的化するLNAのカクテル、または、模擬PBSコントロール処置(図7J)により処置されるマウスの重量を週に2回モニターした。n=5〜6。すべてのデータが平均±SEMとして表される。
LXRβシグナル伝達の活性化はメラノーマ細胞浸潤および内皮動員を抑制する。(A)NCI−60メラノーマ細胞株コレクションにおけるLXRイソ型およびRXRイソ型の、マイクロアレイに基づく発現レベルを示すヒートマップ。これらの遺伝子についてのヒートマップが核ホルモン受容体ファミリーのより大きなヒートマップ(図20)から抽出される。カラーマップ凡例により、それぞれの細胞株におけるすべてのマイクロアレイ・プロファイリングされた遺伝子(39,000を超える転写変異体)の平均発現値に対するそれぞれの受容体の発現値についての標準偏差における変化が示される。(B)1×105個のMeWoヒトメラノーマ細胞、5×104個のHT−144ヒトメラノーマ細胞、5×105個のSK−Mel−2ヒトメラノーマ細胞および5×104個のSK−Mel−334.2ヒトメラノーマ細胞による細胞浸潤。細胞を、1μMでのDMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンにより72時間処理し、トランスウエルでのマトリゲル浸潤アッセイに供した。n=48。(C)5×104個のMeWoヒトメラノーマ細胞、HT−144ヒトメラノーマ細胞、SK−Mel−2ヒトメラノーマ細胞およびSK−Mel−334.2ヒトメラノーマ細胞を、これらのメラノーマ細胞を1μMでのDMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンにより72時間処理した後、トランスウエル遊走アッセイで、1×105個の内皮細胞を動員するそれらの能力について試験した。n=4〜8。(D〜E)コントロールshRNA、あるいは、LXRαまたはLXRβを標的化するshRNAを発現する1×105個のMeWoヒトメラノーマ細胞(D)および1×105個のHT−144ヒトメラノーマ細胞(E)を、これらの細胞を1μMでのDMSO、GW3965またはT0901317により72時間処理した後で細胞浸潤アッセイに供した。n=4〜12。(F〜G)LXRαまたはLXRβを標的化するレンチウイルスshRNA、あるいは、コントロールshRNAにより形質導入される5×104個のMeWo細胞(F)および5×104個のHT−144細胞(G)を、1μMでのDMSO、GW3965またはT0901317により72時間処理し、トランスウエル遊走アッセイで、1×105個の内皮細胞を動員するそれらの能力について試験した。n=7〜8。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、50μm。*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001、****p<0.0001。
メラノーマにおける核ホルモン受容体発現の分析ならびにインビトロ細胞成長に対するLXRアゴニストおよびRXRアゴニストに対する影響(これらは図19(A〜G)に関連づけられる)。(A)すべての核ホルモン受容体ファミリーメンバーのマイクロアレイに基づく発現レベルを様々なメラノーマ系統のNCI−60コレクションにわたって示すヒートマップ。それぞれの受容体の発現レベルが、それぞれの細胞株においてマイクロアレイによって検出されるすべての遺伝子(39,000を超える転写変異体)の平均発現レベルを下回る、または超える標準偏差の数字として示される。(B)2.5×104個のMeWoヒトメラノーマ細胞、HT−144ヒトメラノーマ細胞またはSK−Mel−334.2ヒトメラノーマ細胞を6ウエルプレートに播種し、1μMでのDMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンの存在下で培養した。生細胞を播種後5日目に計数した。n=3〜6。(C)2.5×104個のMeWo細胞、HT−144細胞またはSK−Mel−334.2細胞を三連で置床し、DMSO、GW3965、T0901317またはベキサロテンを1μMで含有する培地において5日間インキュベーションし、その後、死細胞の数を、トリパンブルー死細胞染色を使用して定量化した。n=3。(D〜G)コントロールshRNA、あるいは、LXRαまたはLXRβを標的化するshRNAを発現するMeWoヒトメラノーマ細胞(D、E)およびHT−144ヒトメラノーマ細胞(F、G)における、qRT−PCRによって求められるLXRαおよびLXRβの相対的発現。すべてのデータが平均±SEMとして表される。
治療的なLXR活性化はメラノーマ腫瘍成長を阻害する。(A〜B)C57BL/6−WTマウスに皮下注入される5×104個のB16F10マウスメラノーマ細胞による原発性腫瘍成長。腫瘍成長が体積で5mm3〜10mm3に達した後、マウスには連続して、コントロール固形飼料、あるいは、GW3965が補充される固形飼料(20mg/kg/日または100mg/kg/日)(A)、または、T0901317が補充される固形飼料(20mg/kg/日)(B)を与えた。示される代表的な腫瘍画像は、最終日(d12)に取り出された腫瘍に対応する。n=10〜18(A)、8〜10(B)。(C〜E)免疫低下マウスに皮下注入された1×106個のMeWoヒトメラノーマ細胞(C)、7.5×105個のSK−Mel−334.2ヒトメラノーマ細胞(D)および2×106個のSK−Mel−2ヒトメラノーマ細胞(E)による原発性腫瘍成長。腫瘍成長が体積で5mm3〜10mm3に達した後、マウスを無作為に、コントロール餌、または、GW3965が補充される餌(示されるように20mg/kgまたは100mg/kg)に割り当てた。示される腫瘍画像は測定の最終日に対応する。n=6〜34(C)、8(D)、5(E)。(F)5×104個のB16F10細胞をC57BL/6−WTマウスに皮下注入した。腫瘍成長が150mm3に達したとき、マウスには連続して、コントロール固形飼料、または、GW3965(150mg/kg)を含有する固形飼料を与え、腫瘍成長を毎日測定した。n=6〜13。(G〜I)通常の固形飼料、または、GW3965(100mg/kg)が補充される固形飼料が、体積で5mm3〜10mm3である腫瘍を形成したときに与えられるマウスに、5×104個のB16F10細胞(G)、1×106個のMeWo細胞(H)および7.5×105個のSK−Mel−334.2細胞(I)を皮下移植した後におけるマウス全生存。n=6〜9(F)、4〜7(H)、3〜6(I)。(J〜L)コントロール餌またはGW3965補充餌(20mg/kg)による35日間のマウス処置に対する応答での1×106個のMeWoヒトメラノーマ細胞によって形成される皮下メラノーマ腫瘍における、マウス内皮細胞抗原MECA−32についての免疫組織化学的染色によって求められる腫瘍の内皮細胞密度(J)、増殖性マーカーKi−67についての染色によって求められる腫瘍細胞増殖(K)、および、切断型カスパーゼ−3についての染色によって求められる腫瘍細胞アポトーシス(L)。n=5。腫瘍体積を、(最少直径)2×(最大直径)/2として計算した。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、5mm(A〜D)、50μm(J、K)、25μm(L)。
LXRβアゴニズムはメラノーマ腫瘍成長を抑制する(これは図21(A〜E)に関連づけられる)。(A)コントロール餌、あるいは、GW3965が補充される餌(20mg/kg/日または100mg/kg/日)またはT0901317が補充される餌(20mg/kg)が65日間与えられるマウスの重量測定。n=5〜6。
LXRアゴニズムは肺および脳へのメラノーマ転移を抑制する。(A)MeWo細胞をDMSOまたはGW3965(1μM)により48時間にわたって前処理し、4×104個の細胞を、NOD Scidマウスに、尾静脈を介して静脈内注入した。肺でのコロニー形成を毎週のバイオルミネセンス画像化によってモニターした。最終日(d70)に対応する代表的なH&E染色された肺が示される。n=4〜5。(B〜C)コントロール固形飼料、あるいは、GW3965(20mg/kg)またはT0901317(20mg/kg)を含有する固形飼料がガン細胞注入の10日前に始まって与えられるNOD Scidマウスに静脈内注入された4×104個のMeWo細胞による肺転移のバイオルミネセンス画像化。代表的なH&E染色された肺が画像化最終日に対応する。n=5〜6。(B〜C)コントロール固形飼料、あるいは、GW3965(20mg/kg)またはT0901317(20mg/kg)を含有する固形飼料がガン細胞注入の10日前に始まって与えられるNOD Scidマウスに静脈内注入された4×104個のMeWo細胞による肺転移のバイオルミネセンス画像化。代表的なH&E染色された肺が画像化最終日に対応する。n=5〜6。(F)コントロール餌またはGW3965補充餌(100mg/kg)が注入後0日目に開始して与えられる無胸腺ヌードマウスに1×105個のMeWo脳転移性派生物細胞を心臓内注入した後における全身および脳の光子束。n=7。(G)GW3965処置が腫瘍切除後の肺転移を抑制することができるかを評価するために使用される実験的同所性転移モデルの概略。(H)コントロール餌、または、GW3965(100mg/kg)を含有する餌が、1×106個のMeWoメラノーマ細胞によって形成されるサイズ一致(体積で約300mm3)の皮下メラノーマ腫瘍を切除した後の1ヶ月間にわたって与えられたNOD Scidマウスにおける、バイオルミネセンス画像化によって求められるエクスビボ肺光子束。ヒトビメンチンについて染色される代表的な肺もまた示される。n=7〜9。(I)4×104個のMeWo細胞を、NOD Scidマウスに静脈内注入した。転移が始まった後(これが、d42においてバイオルミネセンス画像化によって検出された)、マウスには、コントロール餌またはGW3965餌(100mg/kg)が、示されるように与えられ、肺でのコロニー形成の進行を毎週測定した。n=6。(J)コントロール餌、または、GW3965(100mg/kg)が補充される餌が、(I)において示されるように与えられるNOD Scidマウスから最終日(d77)に取り出されているH&E染色された肺における肉眼的転移性結節の数。n=4〜5。(K)コントロール固形飼料またはGW3965補充固形飼料(20mg/kg)がガン細胞注入の10日前に開始して連続して与えられたNOD−Scidマウスに4×104個のMeWo細胞を静脈内注入した後における全マウス生存。n=5〜6。すべてのデータが平均±SEMとして表される。
遺伝的主導のメラノーマ進行のLXR活性化療法による抑制。(A)4−HT(25mg/kg)の3日間連続での腹腔内投与による全身的メラノーマ誘導の後におけるTyr::CreER;BrafV600E/+;Ptenlox/+C57BL/6マウスの全生存。1回目の4−HT注射の後、マウスを無作為に、コントロール餌、または、GW3965(100mg/kg)が補充される餌に割り当てた。n=10〜11。(B)コントロール固形飼料、または、GW3965(100mg/kg)が補充される固形飼料が(A)において記載されるようなメラノーマ誘導のときに与えられるTyr::CreER;BrafV600E/+;Ptenlox/loxマウスにおいて35日目に測定される背側皮膚面積の百分率として表されるメラノーマ腫瘍負荷量。n=4〜5。(C)コントロール固形飼料、または、GW3965(100mg/kg)を含有する固形飼料が(A)において記載されるようなメラノーマ進行の全体的誘導の後で与えられたTyr::CreER;BrafV600E/+;Ptenlox/loxマウスにおいて死後に検出される、唾液腺リンパ節への肉眼的転移性結節の数。n=7〜8。(D)1×105個のBrafV600E/+;Pten−/−;CDKN2A−/−原発性メラノーマ細胞を同系のC57BL/6−WTマウスに皮下注入した後における腫瘍成長。腫瘍成長が体積で5mm3〜10mm3に達したとき、マウスには、コントロール固形飼料、または、GW3965(100mg/kg)が補充される固形飼料を与えた。n=16〜18。(E)1×105個のBrafV600E/+;Pten−/−;CDKN2A−/−メラノーマ細胞が皮下注入され、かつ、腫瘍成長が体積で5mm3〜10mm3に達した後でGW3965餌(100mg/kg)またはコントロール餌により処置されるC57BL/6−WTマウスの全生存。n=7〜8。(F)C57BL/6−WTマウスに静脈内注入される1×105個のBrafV600E/+;Pten−/−;CDKN2A−/−原発性メラノーマ細胞による肺でのコロニー形成。ガン細胞注入後直ちに、マウスを無作為に、実験の残り期間についてはコントロール餌またはGW3965補充餌(100mg/kg)に割り当てた。n=14〜15。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、2mm(B)、5mm(D)。
遺伝的主導のメラノーママウスモデルにおけるメラノーマ進行のLXR媒介抑制(これは図24(A〜C)に関連づけられる)。(A)4−HT(25mg/kg)の3日間連続での腹腔内投与による全身的メラノーマ誘導の後におけるTyr::CreER;BrafV600E/+;Ptenlox/loxC57BL/6マウスの全生存。1回目の4−HT注射の後、マウスを無作為に、コントロール餌、または、GW3965(100mg/kg)が補充される餌に割り当てた。n=7。(B)腹腔内4−HT投与によるメラノーマ誘導の43日後に撮影される、コントロール餌またはGW3965補充餌(100mg/kg)が与えられるTyr::CreER;BrafV600E/+;Ptenlox/loxC57BL/6マウスの代表的な画像。
GW3965処置に対する応答でのMeWoヒトメラノーマ細胞における50個の最もアップレギュレーションされた遺伝子のリスト。
LXRβの活性化はメラノーマ細胞におけるApoE発現を誘導する;ApoEはインビトロでのメラノーマ進行表現型のLXRβ依存的抑制を媒介する。(A〜C)MeWoヒトメラノーマ細胞(A)、HT−144ヒトメラノーマ細胞(B)およびWM−266−4ヒトメラノーマ細胞(C)を、示された濃度でのGW3965またはT0901317により48時間処理し、ApoEの発現レベルをqRT−PCRによって分析した。n=3。(D)1μMでのDMSO、GW3965またはT0901317により72時間処理されるHT−144ヒトメラノーマ細胞から集められる血清非含有馴化培地における、ELISAによって定量化される細胞外ApoEタンパク質レベル。n=3〜4。(E〜F)1μMでのDMSO、GW3965またはT0901317により72時間処理される5×104個のHT−144細胞を、アッセイ開始時にそれぞれのトランスウエルに40μg/mLで加えられるApoE中和抗体(1D7)またはIgGコントロール抗体の存在下において細胞浸潤表現型(E)および内皮動員表現型(F)について試験した。n=4。(G〜H)コントロールshRNA、または、ApoEを標的化するshRNAを発現し、かつ、1μMでのDMSOまたはGW3965によりそれぞれのアッセイの前の72時間にわたって処理される1×105個および5×104個のMeWo細胞によってそれぞれもたらされる細胞浸潤(G)および内皮動員(F)。n=7〜8。(I〜J)コントロールshRNA、あるいは、LXRαまたはLXRβを標的化するshRNAにより形質導入され、続いて、1μMでのDMSO、GW3965またはT0901317により48時間処理されるMeWo細胞(I)およびHT−144細胞(J)における、qRT−PCRによって定量化される相対的ApoE発現。n=3〜9。(K)コントロールshRNA、あるいは、LXRαまたはLXRβを標的化するshRNAにより形質導入され、続いて、1μMでのDMSOまたはGW3965により72時間処理されるHT−144細胞から集められる血清非含有馴化培地における、ELISAによって測定される細胞外ApoEタンパク質レベル。n=3。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、50μm。
LXRβの活性化は、メラノーマ浸潤および内皮動員を、メラノーマ細胞のApoE発現を転写的強化することによって抑制する。(A)マルチエンハンサーエレメント1(ME.1)配列またはマルチエンハンサーエレメント2(ME.2)配列の下流側に融合されるApoEプロモーターから駆動され、1μMでのDMSO、GW3965またはT0901317により24時間処理されるMeWo細胞にトランスフェクションされるルシフェラーゼ活性。n=4〜8。(B)細胞外ApoEタンパク質レベルを、1μMでのDMSO、GW3965またはT0901317により72時間処理されるMeWo細胞から集められる血清非含有馴化培地においてELISAによって定量化した。n=3〜4。(C)1μMでのDMSO、GW3965またはT0901317により72時間にわたって前処理される1×105個のMeWo細胞による細胞浸潤。アッセイ開始時に、ApoE中和抗体(1D7)またはIgGコントロール抗体を、示されるようにそれぞれのトランスウエルに40μg/mLで加えた。n=7〜8。(D)1μMでのDMSO、GW3965またはT0901317により72時間にわたって前処理される5×104個のMeWo細胞を、1×105個の内皮細胞を40μg/mLでの1D7抗体またはIgG抗体の存在下で動員するそれらの能力について試験した。n=6〜8。(E)1μMでのDMSOまたはGW3965により72時間処理されるSK−Mel−334.2原発性ヒトメラノーマ細胞からの血清非含有馴化培地における、ELISAによって定量化される細胞外ApoEタンパク質レベル。n=4。(F〜G)1μMでのGW3965により72時間にわたって前処理される5×104個のSK−Mel−334.2細胞を、40μg/mLでの1D7抗体またはIgG抗体の存在下における細胞浸潤アッセイ(F)および内皮動員アッセイ(G)に供した。n=7〜8。(H)ME.1エンハンサーエレメントまたはME.2エンハンサーエレメントに融合されるApoEプロモーターの活性を、コントロールshRNA、あるいは、LXRαまたはLXRβを標的化するshRNAを発現するMeWo細胞におけるルシフェラーゼレポーター活性を24時間にわたるDMSOまたはGW3965(1μM)の存在下で測定することにより求めた。n=3〜8。(I)ELISAによって定量化される細胞外ApoEタンパク質レベルを、GW3965またはT0901317(1μM)による72時間の処理に対する応答での、コントロールshRNA、あるいは、LXRαまたはLXRβを標的化するshRNAを発現するヒトMeWoメラノーマ細胞から集められる血清非含有馴化培地において評価した。n=3〜8。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、50μm。
LXRアゴニストの治療的送達はメラノーマ由来のApoE発現および全身的なApoE発現をアップレギュレーションする。(A〜B)C57BL/6マウスに注入されるB16F10マウスメラノーマ細胞によって形成される皮下腫瘍における、qRT−PCRによって定量化されるApoE発現レベル。5mm3の腫瘍が形成された後、マウスには、コントロール餌、あるいは、GW3965(20mg/kg)を含有する餌(A)、または、T0901317(20mg/kg)を含有する餌(B)を7日間与えた。n=3〜4。(C〜E)コントロール固形飼料、または、GW3965(20mg/kg)が補充される固形飼料が与えられたNOD Scidマウスに移植されたMeWoヒトメラノーマ細胞によって形成される原発性腫瘍(C)、肺転移物(D)および脳転移物(E)におけるApoE転写物発現。ApoEのレベルを、ガン細胞注入後の35日目(C)、153日目(D)および34日目(E)に評価した。n=3〜5。(F)LXRα、LXRβおよびApoEの相対的発現レベルを、コントロールヘアピン、あるいは、マウスLXRαを標的化するshRNA(sh_mLXRα)、マウスLXRβを標的化するshRNA(sh_mLXRβ)、または、マウスApoEを標的化するshRNA(sh_mApoE)を発現するB16F10マウスメラノーマ細胞においてqRT−PCRによって求めた。(G〜H)コントロールshRNA、あるいは、マウスLXRβまたはマウスApoEを標的化するshRNAを発現するB16F10細胞における、qRT−PCRによって測定されるApoEのmRNAレベル(G)およびABCA1のmRNAレベル(H)。細胞を5μMでのDMSOまたはGW3965により48時間処理した。n=3。(I)コントロール餌またはGW3965補充餌(20mg/kg)が10日間与えられるLXRα−/−マウスまたはLXRβ−/−マウスから取り出される全身白血球における、qRT−PCRによって測定されるABCA1のmRNAレベル。n=3〜4。(J)マウスの皮膚組織および肺組織における、SAGEタグの頻度として表されるApoEのmRNAの相対的発現を、NCIにより資金提供されるCancer Genome Anatomy Project(CGAP)から入手可能である公開されているmSAGE Expression Matrixデータベースを使用して求めた。(K)コントロールの非選抜MeWo親細胞に対する、肺転移性結節から分離されるMeWoメラノーマ細胞(LM2)、または、原発性腫瘍における、qRT−PCRによって求められるApoEのmRNAの相対的発現。n=3。
LXRβアゴニズムは、メラノーマの腫瘍成長および転移を、メラノーマ由来のApoE発現および全身的なApoE発現を誘導することによって抑制する。(A)コントロール固形飼料、あるいは、GW3965(20mg/kg)またはT0901317(20mg/kg)が補充される固形飼料が10日間与えられる野生型マウスから取り出される脂肪組織、肺組織および脳組織溶解物におけるApoEタンパク質レベルのウエスタンブロット測定。(B)(A)において示されるウエスタンブロットに基づくApoEタンパク質発現の定量化。総チューブリンを正規化のための内因性コントロールとして使用した。n=3〜5。(C)コントロール餌、あるいは、GW3965またはT0901317が補充される餌が20mg/kgで10日間与えられるマウスから得られる全身白血球における、qRT−PCRによって求められるApoEの発現レベル。n=3〜6。(D)B16F10コントロール細胞、あるいは、マウスLXRαを標的化するshRNA(sh_mLXRα)、または、マウスLXRβを標的化するshRNA(sh_mLXRβ)を発現するB16F10細胞を、C57BL/6−WTマウス、LXRα−/−マウスまたはLXRβ−/−マウスに皮下注入した。腫瘍が体積で5mm3〜10mm3に達すると、マウスには、コントロール餌、または、GW3965(20mg/kg)が補充される餌を7日間与え、その後、最終的な腫瘍体積を測定した。終了点において取り出された代表的な腫瘍画像が右側パネルに示される。n=6〜18。(E)コントロール餌またはGW3965補充餌(20mg/kg)が10日間与えられるLXRα−/−マウスまたはLXRβ−/−マウスから取り出される全身白血球における、qRT−PCRによって定量化されるApoE転写物レベル。n=3〜5。(F)5×104個のB16F10コントロール細胞、あるいは、マウスApoEを標的化するshRNA(sh_mApoE)をC57BL/6−WTマウスまたはApoE−/−マウスにおいて発現するB16F10細胞による皮下腫瘍成長。体積で5mm3〜10mm3である腫瘍が形成された後、マウスには、コントロール餌、または、GW3965(20mg/kg)が補充される餌を7日間与え、最終的な腫瘍体積を定量化した。測定最終日(d12)に取り出された腫瘍の代表的な画像が右側に示される。n=8〜18。(G)コントロールshRNAまたはsh_mApoEにより形質導入され、かつ、C57BL/6−WTマウスまたはApoE−/−マウスに静脈内注入される5×104個のB16F10細胞による肺でのコロニー形成。ガン細胞注入の10日前に開始して、マウスをコントロール餌による処理またはGW3965補充餌(20mg/kg)による処置に割り当てた。肺転移物をバイオルミネセンス画像化によってd22において定量化した。終了点(d22)において取り出された代表的な肺が右側パネルに示される。n=5〜10。(H)MSKCCにおける患者から得られる非転移性(n=39)および転移性(n=34)の原発性メラノーマ皮膚病変部サンプルにおける、盲検での免疫組織化学的分析によって求められるApoEタンパク質発現。ApoE陽性染色細胞面積の割合を総腫瘍面積の百分率として定量化した。(I)患者の転移非存在生存を患者の原発性メラノーマ病変部におけるApoEタンパク質発現の関数として示す、MSKCCコホート(n=71)についてのカプラン・マイヤー曲線。ApoEのレベルが集団のメジアンを超えていたメラノーマをApoE陽性(pos)として分類し、これに対して、ApoEの発現がこのメジアンを下回っている腫瘍をApoE陰性(neg)として分類した。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、5mm(DおよびF)、100μm(H)。
LXRβの活性化は、ダカルバジンおよびベムラフェニブに対して抵抗性であるメラノーマ系統のインビボ成長を抑制する。(A)細胞培地に4日間加えられる様々な用量のダカルバジン(DTIC)に対する応答における、2.5×104個のB16F10親細胞およびインビトロ由来のB16F10 DTIC抵抗性細胞によるインビトロ細胞成長。n=3。(B〜D)C57BL/6−WTマウスに皮下注入される5×104個のDTIC感受性B16F10親細胞(B)または5×104個のDTIC抵抗性B16F10細胞(C)による腫瘍成長。腫瘍成長が体積で5mm3〜10mm3に達した後、マウスをダカルバジン(50mg/kg、i.p.、毎日)またはコントロールビヒクルにより処置し、通常の固形飼料、または、GW3965(100mg/kg)が補充される固形飼料に無作為に割り当てた。最終日の腫瘍体積測定結果が(D)に示される。n=8〜16(B)、7〜8(C)。(E〜F)DTIC処置またはGW3965処置に対する応答における、DTIC感受性MeWo親細胞およびインビボ由来のDTIC抵抗性MeWoヒトメラノーマ細胞による腫瘍成長。5×105個の細胞を、NOD Scidガンママウスに皮下注入した。体積で5mm3〜10mm3である腫瘍が形成された後、マウスを盲検的に、コントロール処置、あるいは、DTIC処置(50mg/kg、i.p.、2日の休薬処置間隔を伴う5日サイクルで毎日投与される)、または、GW3965補充餌処置(100mg/kg)に割り当てた。最終日の腫瘍測定結果が(F)に示される。n=6〜8。(G)腫瘍が体積で5mm3〜10mm3にまで成長した後で、コントロール餌、または、GW3965(100mg/kg)が補充される餌に割り当てられたNOD Scidガンママウスに皮下注入された2×106個のSK−Mel−239ベムラフェニブ抵抗性クローン細胞による腫瘍成長。n=7〜8。(H)2×106個のSK−Mel−239ベムラフェニブ抵抗性細胞を移植した後における全マウス生存。腫瘍が体積で5mm3〜10mm3にまで成長すると、マウスには連続して、コントロール餌、または、GW3965(100mg/kg)が補充される餌を与えた。n=7。(I)メラノーマ進行表現型の抑制を媒介することにおけるLXRβ活性化療法による全身的ApoEおよびメラノーマ自律的ApoEの関与を示す実験的に導かれるモデル。細胞外ApoEは、メラノーマ細胞のLRP1受容体および内皮細胞のLRP8受容体を標的化することを介してメラノーマ細胞浸潤および細胞非自律的な内皮動員を協調的に阻害することによってそれぞれ、メラノーマの転移を抑制する。すべてのデータが平均±SEMとして表される。スケールバー、5mm。
ヒトメラノーマ細胞による腫瘍成長のダカルバジン誘導の抑制。(A)Nod SCIDガンママウスに皮下注入される5×105個のDTIC感受性MeWo親細胞による腫瘍成長。腫瘍が5mm3〜10mm3の体積に達したとき、マウスをコントロールビヒクルまたはDTIC(50mg/kg、i.p.、2日の休薬処置間隔を伴う5日サイクルで毎日投与される)により処置し、腫瘍体積を週に2回測定した。n=6。
多数のガンタイプにわたる細胞浸潤のApoE媒介抑制。(A〜B)5×104個のMUM2Bヒトぶどう膜メラノーマ細胞およびOCM1ヒトぶどう膜メラノーマ細胞、(C〜E)5×104個のMDA−231ヒト三重陰性乳ガン細胞、MDA−468ヒト三重陰性乳ガン細胞およびBT549ヒト三重陰性乳ガン細胞、(F〜G)5×104個のPANC1ヒト膵臓ガン細胞およびBXPC−3ヒト膵臓ガン細胞、ならびに、(H〜I)5×104個の786−00ヒト腎臓ガン細胞およびRCC4ヒト腎臓ガン細胞を、マトリゲル被覆トランスウエル挿入物を通って浸潤するそれらの能力についてインビトロにおいて試験した。BSAおよび組換えApoEをアッセイ開始時に100μg/mLで細胞培地に加えた。n=4。すべてのデータが平均±SEMとして表される;*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
ヒトメラノーマ細胞におけるApoE発現に対するLXRアゴニスト(LXR−623、WO−2007−002563(Ex.19)、WO−2010−0138598(Ex.9)およびSB742881)の影響。(A〜D)MeWoヒトメラノーマ細胞を、DMSO、あるいは、LXRアゴニストのLXR−623(A)、WO−2007−002563(B)、WO−2010−0138598(C)またはSB742881(D)により、500nM、1μMまたは2μMで48時間処理した。その後、ApoEの発現レベルをqRT−PCRによって定量化した。n=3。すべてのデータが平均±SEMとして表される。*p<0.05、**p<0.01。
LXRアゴニストのGW3965による処置は、腎臓ガン、膵臓ガンおよび肺ガンのインビトロ腫瘍細胞浸潤を阻害する。(A〜C)1μMでのDMSOまたはGW3965によりアッセイ前の72時間にわたって処置された5×104個のRCCヒト腎臓ガン細胞(A)、5×104個のPANC1ヒト膵臓ガン細胞(B)および5×104個のH460ヒト肺ガン細胞(C)によるトランスウエルでのマトリゲル浸潤。n=4。すべてのデータが平均±SEMとして表される。*p<0.05、**p<0.01。
LXRアゴニストのGW3965による処置は乳ガン腫瘍成長をインビボにおいて阻害する。NOD Scidガンママウスの乳房脂肪パッドに注入される2×106個のMDA−468ヒト乳ガン細胞による原発性腫瘍成長。ガン細胞注入の2日前に、マウスを、コントロール餌処置、または、GW3965(75mg/kg)が補充される餌に割り当て、対応する餌で実験期間中を通して維持した。n=8。すべてのデータが平均±SEMとして表される。***p<0.001。
インビトロでのメラノーマ進行表現型に対するLXRアゴニスト(LXR−623、WO−2007−002563(Ex.19)、WO−2010−0138598(Ex.9)およびSB742881)の影響。(A)DMSO、LXR−623、WO−2007−002563(Ex.19)、WO−2010−0138598(Ex.9)またはSB742881によりそれぞれ1μMで72時間にわたって前処理される1×105個のMeWoヒトメラノーマ細胞による細胞浸潤。マトリゲル被覆されたトランスウエル挿入物の基部側に浸潤する細胞の数を定量化した。n=5。(B)DMSO、LXR−623、WO−2007−002563(Ex.19)、WO−2010−0138598(Ex.9)またはSB742881によりそれぞれ1μMで72時間にわたって前処理される5×104個のMeWo細胞による内皮動員。ガン細胞を24ウエルプレートの底に播種した。内皮細胞をそれぞれのウエルに取り付けられるトランスウエル挿入物に播種し、ガン細胞に向かって遊走させた。それぞれのトランスウエル挿入物の基部側に遊走する内皮細胞の数を定量化した。n=4〜5。すべてのデータが平均±SEMとして表される。*p<0.05、**p<0.01。
インビボでの腫瘍成長に対するLXRアゴニスト(LXR−623、WO−2007−002563(Ex.19)、WO−2010−0138598(Ex.9)およびSB742881)の影響。(A〜D)7週齢のC57BL/6マウスに皮下注入される5×104個のB16F10マウスメラノーマ細胞による腫瘍成長。腫瘍が体積で5mm3〜10mm3に達した後、マウスを無作為に、コントロール餌処置、20mg/kg/日でのLXR−623補充餌処置(A)、100mg/kg/日でのWO−2007−002563(Ex.19)補充餌処置(B)、10mg/kg/日または100mg/kg/日でのWO−2010−0138598(Ex.19)補充餌処置(C)、あるいは、100mg/kg/日でのSB742881補充餌処置(D)に割り当てた。n=8〜10。すべてのデータが平均±SEMとして表される。

発明の詳細な説明

0053

本発明は、細胞の正常でない増殖、分化または生存を防止するか、または軽減するための方法を特徴とする。例えば、本発明の化合物は、腫瘍がサイズにおいて増大するか、または、転移性状態に達するという危険性を減らすことにおいて、あるいは、腫瘍をサイズにおいて増大させないか、または、転移性状態に至らせないことにおいて有用である場合がある。本発明の主題化合物は、ガンの進行または発達を停止させるために投与される場合がある。加えて、本発明には、本発明の主題化合物を、ガンが再発する危険性を減らす
ために、または、ガンの再発を防止するために使用することが含まれる。

0054

転移性進行は、共通する細胞表現型に関与する様々な一連エフェクタータンパク質が首尾一貫して発現されることを必要とする(GuptaおよびMassague、2006、Cell、127、679〜695;HanahanおよびWeinberg、2011、Cell、144、646〜674;TalmadgeおよびFidler、2010、Cancer Res.、70、5649〜5669;Hynes、2003、Cell、113、821〜823)。そのような協調した発現状態が、転移する原発性乳ガンの遺伝子発現プロフィルにおいて明らかであり(Wang他、2005、Lancet、365、671〜679)、同様にまた、高まった転移活性呈示する様々なヒトガン細胞クローンのプロフィルにおいて明らかである(Kang他、2003、Cancer Cell、3、537〜549;Minn他、2005、Nature、436、518〜524)。近年では、転写後調節が、協調した発現状態および表現型レベルの制御の広範囲にわたる、また、堅固な様式として明らかになってきている。転移調節活性を有する転写後調節因子の最も研究されているクラスが、小さい非コードRNA(miRNA)である(Bartel、2009、Cell、136、215〜233;Fabian他、2010、Annu.Rev.Biochem.、79、351〜379;Filipowicz他、2008、Nat.Rev.Genet.、9、102〜114)。転移促進因子miRNA(Ma他、2007、Nature、449、682〜688;Huang他、2008、Nat.Cell Biol.、10、202〜210)および転移抑制因子miRNA(Tavazoie他、2008、Nature、451、147〜152)が乳ガンにおいて初めて発見された。その後の研究により、他のガンタイプの腫瘍形成および転移における調節的役割を有するさらに多くのmiRNAが明らかにされた(Hatziapostolou他、2011、Cell、147、1233〜1247;Hurst他、2009、Cancer Res.、69、7495〜7498;Olson他、2009、Genes Dev.、23、2152〜2165;Zhang他、2010、Oncogene、29、937〜948)。多くの場合において、ヒトガンサンプルにおけるこれらのmiRNAの発現レベルは、転移におけるそれらの実験的役割を裏づけている。したがって、脱調節されたmiRNA発現(Garzon他、2010、Nat.Rev.Drug Discov.、9、775〜789;LujambioおよびLowe、2012、Nature、482、347〜355)、および、より近年には、長い非コードRNAの脱調節された発現(Calin他、2007、Nat.Rev.Cancer、6、857〜866;Gupta他、2010、Nature、464、1071〜1076;Guttman他、2009、Nature、458、223〜227;Huarte他、2010、Cell、142、409〜419;Loewer他、2010、Nat.Genet.、42、1113〜1117)、同様にまた、内因性miRNAが結合するために競合する非コード偽遺伝子の脱調節された発現(Poliseno他、2010、Nature、465、1033〜1038)が、ヒトガンの広範囲にわたる特徴であるようである。特異的なmiRNAが転移性進行に及ぼす堅固な制御に関する様々な手がかりが、ただ1つだけの転移抑制因子miRNAによる多数の転移遺伝子の協調した標的化が劇的な転移抑制効果に関わっていたことを示す初期の研究からもたらされた(Tavazoie他、2008、Nature、451、147〜152)。様々なmiRNAによるそのような多岐にわたる遺伝子標的化が、これらの調節因子特徴づける特徴であることが明らかになってきている。

0055

概念的レベルにおいて、ガンにおける遺伝子発現の多岐にわたる調節の必要性が容易に理解される。miRNAが、転移のために要求される多数の遺伝子を標的化するその能力によって、堅固な転移抑制を発揮し得るかもしれない。遺伝子的または後成的機構を介するmiRNAのサイレンシングが、転移の多数の促進因子を脱抑制することによってガンの進行を容易に促進させるであろうと思われる(Png他、2011、Nature、
481、190〜194)。多数の転移調節性miRNAによるただ1つだけの遺伝子の収斂的調節のための役割がよりにおわされる。転移性進行の堅固な抑制因子として作用した重要な遺伝子が存在したならば、このシナリオが現れるであろう。多数のmiRNAによるこの遺伝子の収斂的かつ協同的な標的化により、そのような重要な転移抑制因子遺伝子の最大のサイレンシングが達成され得るかもしれない。このシナリオは、遺伝的欠失とは対照的に、標的遺伝子の完全な喪失が細胞によって許容され得ないかもしれない場合に認められるかもしれず、この遺伝子は、例えば、代謝作用を媒介するために低いレベルで要求されるであろうと思われる。この可能性を考えれば、協同的な転移促進因子miRNAについての探索により、転移抑制のために非常に重要である新規な遺伝子が発見されるかもしれず、また、転移防止のためのより効果的な処置に対する治療的洞察がもたらされるかもしれない。

0056

本明細書中に開示されるように、体系的であるインビボ選抜に基づく取り組みを介して、一組のmiRNAが、メラノーマ、すなわち、発生率が増大している非常に広まっているガン(GarbeおよびLeiter、2009、Clin.Dermatol.、27、3〜9)を有する多数の患者に由来する多数の無関係な転移性系統において脱調節されることが確認された。本明細書中に開示されるように、miR−1908、miR−199a−3pおよびmiR−199a−5pが、代謝遺伝子ApoEおよび熱ショックタンパク質DNAJA4の収斂的な標的化を介してメラノーマ転移の堅固な内因性促進因子として作用する。機能喪失分析、機能獲得分析およびエピスタシス分析により、ApoEのシグナル伝達を最大限に沈黙させる協同的なmiRNAネットワークの輪郭が明らかになる。ガン細胞により分泌されるApoEにより、転移性浸潤および内皮動員が阻害され、このことが、メラノーマ細胞および内皮細胞における異なった受容体に対するその作用を介して媒介される。これらのmiRNAは、メラノーマの転移性再発を発症する患者を特定することにおける著しい予後能を示しており、一方、これらのmiRNAを標的化するLNAの治療的送達により、メラノーマ転移が著しく阻害される。外科的切除後のメラノーマ転移を防止するための効果的な治療法が現在不足していること(Garbe他、2011、Oncologist、16、5〜24)は、メラノーマの転移性進行の改善された分子的かつ機構的な理解を必要としている。この目的を達成するために、本明細書中に開示される発見は、メラノーマ進行に関与するいくつかの重要な新規な非コード遺伝子およびコード遺伝子を明らかにしており、また、メラノーマ転移について危険性が大きい患者を特定すること、および、そのような患者を処置することの両方のための新規な手段をもたらしている。

0057

下記には、上述のネットワークのメンバー核酸配列およびアミノ酸配列ならびにいくつかの他の配列が示される。

0058

APOE−RNA配列(配列番号1)


APOE−アミノ酸配列(配列番号2)

下線が施された残基136〜残基150はApoEのLRP結合ドメインを表す)

DNAJA4イソ型1−RNA配列(配列番号3)



DNAJA4イソ型1−アミノ酸配列(配列番号4)


DNAJA4イソ型2−RNA配列(配列番号5)


DNAJA4イソ型2−アミノ酸配列(配列番号6)


DNAJA4イソ型3−RNA配列(配列番号7)



DNAJA4イソ型3−アミノ酸配列(配列番号8)


LRP1−RNA配列(配列番号9)





LRP1−アミノ酸配列(配列番号10)



LRP8イソ型1−RNA配列(配列番号11)




LRP8イソ型1−アミノ酸配列(配列番号12)


LRP8イソ型2−RNA配列(配列番号13)




LRP8イソ型2−アミノ酸配列(配列番号14)


LRP8イソ型3−RNA配列(配列番号15)




LRP8イソ型3−アミノ酸配列(配列番号16)


LRP8イソ型4−RNA配列(配列番号17)




LRP8イソ型4−アミノ酸配列(配列番号18)


CTGF−RNA配列(配列番号19)


CTGF−アミノ酸配列(配列番号20)

LXR−aイソ型1:RNA配列(配列番号21)


LXR−a(NR1H3)イソ型1:アミノ酸配列(配列番号22)


LXR−a(NR1H3)イソ型2:RNA配列(配列番号23)



LXR−a(NR1H3)イソ型2:アミノ酸配列(配列番号24)


LXR−a(NR1H3)イソ型3:RNA配列(配列番号25)


LXR−a(NR1H3)イソ型3:アミノ酸配列(配列番号26)


LXR−a(NR1H3)イソ型4:RNA配列(配列番号27)


LXR−a(NR1H3)イソ型4:アミノ酸配列(配列番号28)



LXR−b(NR1H2)イソ型1:RNA配列(配列番号29)


LXR−b(NR1H2)イソ型1:アミノ酸配列(配列番号30)


LXR−b(NR1H2)イソ型2:RNA配列(配列番号31)



LXR−b(NR1H2)イソ型2:アミノ酸配列(配列番号32)


has−miR−199a−1配列(配列番号33)
GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGAGGCUCUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGC

has−miR−199a−2配列(配列番号34)
AGGAAGCUUCUGGAGAUCCUGCUCCGUCGCCCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGACAAUGCCGUUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGACUGGGCAAGGGAGAGCA

has−miR−1908配列(配列番号35)
CGGGAAUGCCGCGGCGGGGACGGCGAUUGGUCCGUAUGUGUGGUGCCACCGGCCGCCGGCUCCGCCCCGGCCCCCGCCCC

has−miR−7−1配列(配列番号36)
UUGGAUGUUGGCCUAGUUCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUUUUAGAUAACUAAAUCGACAACAAAUCACAGUCUGCCAUAUGGCACAGGCCAUGCCUCUACAG

has−miR−7−2配列(配列番号37)
CUGGAUACAGAGUGGACCGGCUGGCCCCAUCUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUGUCUUACUGCGCUCAACAACAAAUCCCAGUCUACCUAAUGGUGCCAGCCAUCGCA

has−miR−7−3配列(配列番号38)
AGAUUAGAGUGGCUGUGGUCUAGUGCUGUGUGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUUCUGAUGUACUACGACAACAAGUCACAGCCGGCCUCAUAGCGCAGACUCCCUUCGAC

miR−Zip 199a−3p配列(配列番号39)
GATCCGACAGTAGCCTGCACATTAGTCACTTCCTGTCAGTAACCAATGTGCAGACTACTGTTTTTTGAATT

miR−Zip 199a−5p配列(配列番号40)
GATCCGCCCAGTGCTCAGACTACCCGTGCCTTCCTGTCAGGAACAGGTAGTCTGAACACTGGGTTTTTGAATT

miR−Zip 1908配列(配列番号41)
GATCCGCGGCGGGAACGGCGATCGGCCCTTCCTGTCAGGACCAATCGCCGTCCCCGCCGTTTTTGAATT

miR−Zip 7配列(配列番号42)
GATCCGTGGAAGATTAGTGAGTTTATTATCTTCCTGTCAGACAACAAAATCACTAGTCTTCCATTTTTGAATT

このネットワークのメンバーは、転移性メラノーマを処置するための標的として使用することができる。加えて、これらのメンバーは、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを決定するためのバイオマーカーとして、あるいは、そのような障害を有する患者の予後を明らかにするための、または、そのような障害を有する患者の監視のためのバイオマーカーとして使用することができる。したがって、本発明は、転移性メラノーマを、これらのメンバーの1つまたは複数を標的化することによって処置する方法、当該ガンを阻害するための治療療法効力を明らかにする方法、および、抗ガン剤を特定する方法を包含する。また、対象が転移性メラノーマを有するかどうか、または、転移性メラノーマを有する危険性があるかどうかを診断する方法、および、当該障害を発症する危険性があると考えられる対象をスクリーニングする方法も提供される。本発明はまた、上述の方法を行うために好適である様々なキットを包含する。

0059

ApoEポリペプチド
用語「ポリペプチドまたはペプチド」には、本明細書中で使用される場合、ネットワークに関与する特定のドメインまたは部分を有する、上述の転移抑制因子のいずれかの組換えまたは合成により製造された融合体またはキメラ体が含まれる。これらの用語はまた、ペプチドのアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体(例えば、原核生物細胞における発現のために有用である付加されたアミノ末端メチオニンを有するもの)を包含する。

0060

「アポリポタンパク質ポリペプチドまたはApoEポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、長さが10アミノ酸残基〜200アミノ酸残基の間のペプチドであるアポリポタンパク質のアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体を含めて、生来型アポリポタンパク質の機能をインビボまたはインビトロのどちらにおいてであれ模倣するペプチド、薬物または化合物を意味し、そのようなペプチドは、アミド結合を含有する天然型アミノ酸または非天然型アミノ酸のどちらをも含有することができる。アポリポタンパク質のペプチドフラグメントは、生体内におけるそれらの安定性または生物学的利用能を改善するために、この技術分野において知られているように改変される場合があり、また、アミノ酸側鎖に様々な結合を介して結合される有機化合物を含有する場合がある。

0061

1つの局面において、本発明者らの発明は、TQQIRLQAEIFQAR(マウス)(配列番号43)またはAQQIRLQAEAFQAR(ヒト)(配列番号44)のアミノ酸配列を有する単離されたapoEp1.Bペプチド、あるいは、当該ペプチドのアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体を使用するための方法である。本発明にはまた、apoEp1.Bペプチドあるいはそのアナログ、フラグメント、伸長物または誘導体をコードする核酸分子が含まれる。

0062

用語「アナログ」には、どのようなペプチドであれ、1つまたは複数の残基が、機能的に類似する残基により保存的に置換されている、生来型ペプチドと実質的に同一であるアミノ酸残基配列を有するペプチドで、生来型ペプチドを模倣する能力を示すペプチドが含
まれる。保存的置換の例には、1つの非極性疎水性)残基(例えば、アラニンイソロイシンバリンロイシンまたはメチオニンなど)を別の非極性(疎水性)残基の代わりに使用すること、1つの極性親水性)残基を別の極性(親水性)残基の代わりに使用すること、例えば、アルギニンリシンとの間、グルタミンアスパラギンとの間、グリシンセリンとの間などにおける置換、1つの塩基性残基(例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジンなど)を別の塩基性残基の代わりに使用すること、または、1つの酸性基(例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸など)を別の酸性残基の代わりに使用することが含まれる。

0063

表現「保存的置換」にはまた、化学的誘導体化された残基を非誘導体化残基の代わりに使用することが、そのようなポリペプチドが必要不可欠な活性を呈示するという条件のもとで含まれる。上記ペプチドのアナログには、下記の配列を有するペプチドが含まれる:TAQIRLQAEIFQAR(配列番号45)、TQAIRLQAEIFQAR(配列番号46)、TQQARLQAEIFQAR(配列番号47)およびTQQIALQAEIFQAR(配列番号48)。

0064

「誘導体」は、1つまたは複数の残基が機能的側鎖の反応によって化学的に誘導体化されているペプチドを示す。そのような誘導体化された分子には、例えば、フリーアミノ基が、アミン塩酸塩、p−トルエンスルホニル基カルボベンゾキシ基、t−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するために誘導体化されているそのような分子が含まれる。フリーのカルボキシル基が、塩、メチルエステルおよびエチルエステルまたは他のタイプのエステルあるいはヒドラジドを形成するために誘導体化される場合がある。フリーのヒドロキシル基が、O−アシル誘導体またはO−アルキル誘導体を形成する誘導体化される場合がある。ヒスチジンのイミダゾール窒素が、N−im−ベンジルヒスチジンを形成する誘導体化される場合がある。また、20個の標準的アミノ酸の1つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するそのようなペプチドも含まれる。例えば、4−ヒドロキシプロリンプロリンの代わりに使用される場合がある;5−ヒドロキシリシンがリシンの代わりに使用される場合がある;3−メチルヒスチジンがヒスチジンの代わりに使用される場合がある;ホモセリンがセリンの代わりに使用される場合がある;また、オルニチンがリシンの代わりに使用される場合がある。本発明のポリペプチドにはまた、必要不可欠な活性が維持される限り、どのようなポリペプチドであれ、配列が本明細書中に示されるポリペプチドの配列に対して残基の1つまたは複数の付加および/または欠失を有するポリペプチドが含まれる。

0065

用語「フラグメント」は、どのような主題ペプチドであれ、アミノ酸残基配列が本明細書中に示されるペプチドのアミノ酸残基配列よりも短いアミノ酸残基配列を有する主題ペプチドを示す。

0066

用語「伸長物」は、どのような主題ペプチドであれ、本発明のペプチドのアミノ酸配列よりも(カルボキシ末端またはアミノ末端のどちらにおいてでも)1つまたは2つのアミノ酸によって長くなっているアミノ酸配列を有する主題ペプチドを示す。好ましくは、伸長がアミノ末端において行われる。上記ペプチドのフラグメントおよび伸長物には、下記の配列を有するペプチドが含まれる:QTQQIRLQAEIFQAR(配列番号49)およびQQIRLQAEIFQAR(配列番号50)。

0067

様々なApoEポリペプチドおよびそれらの調製方法が米国特許第6,652,860号に記載される(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)。

0068

LXRアゴニスト
本発明の方法は、LXRアゴニストを転移の防止および処置のために投与することを含
むことができる。LXRアゴニストは、下記に示される式I、式II、式IIIまたは式IVに従う化合物であることが可能である。

0069

式Iが下記において提供される:

0070

またはその医薬的に許容される塩、但し、式Iにおいて、
Arはアリール基である;
R1は、−OH、−CO2H、−O−(C1〜C7)アルキル、−OC(O)−、−(C1〜C7)アルキル、−O−(C1〜C7)ヘテロアルキル、−OC(O)−(C1〜C7)ヘテロアルキル、−NH2、−NH(C1〜C7)アルキル、−N((C1〜C7)アルキル)2および−NH−S(O)2(C1〜C5)アルキルからなる群から選択されるものである;
R2は、(C1〜C7)アルキル、(C1〜C7)ヘテロアルキル、アリールおよびアリール(C1〜C7)アルキルからなる群から選択されるものである;
X1、X2、X3、X4、X5およびX6はそれぞれが独立して、H、(C1〜C5)アルキル、(C1〜C5)ヘテロアルキル、FおよびClからなる群から選択されるものであり、但し、X1〜X6のうちの最大でも3つが、H、(C1〜C5)アルキル、(C1〜C5)ヘテロアルキルである;かつ
Yは、−N(R12)S(O)m−、−N(R12)S(O)mN(R13)−、−N(R12)C(O)−、−N(R12)C(O)N(R13)−、−N(R12)C(S)−および−N(R12)C(O)O−からなる群から選択される二価連結基であり、
但し、R12およびR13はそれぞれが独立して、H、(C1〜C7)アルキル、(C1〜C7)ヘテロアルキル、アリールおよびアリール(C1〜C7)アルキルからなる群から選択され、また、必要に応じて、Yが−N(R12)S(O)m−または−N(R12)S(O)mN(R13)−であるときには、R12は、ArまたはR2に対する共有結合による結合を介してArまたはR2にそれぞれ融合する5員環または6員環を形成し、この場合、下付き添え字mは1〜2の整数である;
但し、R1がOHであり、かつ、−Y−R2が−N(R12)S(O)m−R2または−N(R12)C(O)N(R13)−R2であり、Arに結合する第四級炭素に対してパラ位に結合するとき、および、R2が、フェニル、ベンジルまたはベンゾイルであるときには、i)R12またはR13の少なくとも1つが水素以外であり、かつ、電子吸引性置換基を含有し、あるいは、ii)R2が、アミノ、アセトアミド、ジ(C1〜C7)アルキルアミノ、(C1〜C7)アルキルアミノ、ハロゲンヒドロキシニトロまたは(C1〜C7)アルキルとは異なる成分により置換され、あるいは、iii)R2のベンゼン環部分が、Y基に加えて、または、Yに対する結合点に加えて少なくとも3つの独立して選択された基により置換される。

0071

いくつかの実施形態において、Yは−N(R12)S(O)2−であり、かつ、R1は
OHである。

0072

したがって、式Iの化合物には、下記に示される構造を有する化合物が含まれるが、これに限定されない:



式Iの化合物は、米国特許第6,316,503号(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)によって記載されるように合成することができる。

0073

式IIが下記において提供される:



(式中、
R1はHである;
X1は、結合、C1〜C5アルキル、−C(O)−、−C(=CR8R9)−、−O−、−S(O)t−、−NR8−、−CR8R9−、−CHR23、−CR8(CR9)−、−C(CR8)2−、−CR8(OC(O)R9)−、−C=NOR9−、−C(O)NR8−、−CH2O−、−CH2S−、−CH2NR8−、−OCH2−、−SCH2−、−NR8CH2−または



である;
R2は、H、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C3〜C6シクロアルキル、−CH2OH、C7〜C11アリールアルキル、フェニル、ナ
フチル、C1〜C3ペルフルオロアルキル、CN、C(O)NH2、CO2R12、または、C1〜C3アルキル、C2〜C4アルケニル、C2〜C4アルキニル、C1〜C3アルコキシ、C1〜C3ペルフルオロアルキル、ハロゲン、−NO2、−NR8R9、−CN、−OH、および、1個〜5個のフッ素により置換されるC1〜C3アルキルから独立して選択される群の1つまたは複数によって独立して置換されるフェニルであり、あるいは、R2は、ピリジンチオフェンベンゾイソオキサゾールベンゾチオフェンオキサジアゾールピロールピラゾール、イミダゾールおよびフランからなる群から選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、C1〜C3アルキル、C1〜C3アルコキシ、C1〜C3ペルフルオロアルキル、ハロゲン、−NO2、−NR8R9、−CN、および、1個〜5個のフッ素により置換されるC1〜C3アルキルから独立して選択される1つ〜3つの基により置換される場合がある;
X2は結合または−CH2−である;
R3は、フェニル、ナフチル、あるいは、C1〜C3アルキル、ヒドロキシ、フェニル、アシル、ハロゲン、−NH2、−CN、−NO2、C1〜C3アルコキシ、C1〜C3ペルフルオロアルキル、1個〜5個のフッ素により置換されるC1〜C3アルキル、NR14R15、−C(O)R10、
−C(O)NR10R11、−C(O)NR11A、−C≡CR8、−CH=CHR8、−WA、−C≡CA、−CH=CHA、−WYA、−WYNR11−A、
−WYR10、−WY(CH2)jA、−WCHR11(CH2)jA、−W(CH2)jA、−W(CH2)jR10、−CHR11W(CH2)jR10、
−CHR11W(CH2)jA、−CHR11NR12YA、−CHR11NR12YR10、ピロール、−W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、
−W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、−(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、−CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、−C≡CA(CH2)kD(CH2)pZ、−W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZおよび−W(CH2)jZから独立して選択される1つ〜4つの基によって独立して置換されるフェニルまたはナフチルであり、
あるいは、R3は、ピリミジン、チオフェン、フラン、ベンゾチオフェン、インドールベンゾフランベンゾイミダゾールベンゾチアゾールベンゾオキサゾールおよびキノリンから選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、C1〜C3アルキル、C1〜C3アルコキシ、ヒドロキシ、フェニル、アシル、ハロゲン、−NH2、−CN、−NO2、C1〜C3ペルフルオロアルキル、1個〜5個のフッ素により置換されるC1〜C3アルキル、−C(O)R10、−C(O)NR10R11、−C(O)NR11A、−C≡CR8、−CH=CHR8、−WA、−C≡CA、−CH=CHA、−WYA、−WYR10、−WY(CH2)jA、
−W(CH2)jA、−W(CH2)jR10、−CHR11W(CH2)jR10、−CHR11W(CH2)jA、−CHR11NR12YA、−CHR11NR12YR10、
−WCHR11(CH2)jA、−W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、−W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、−(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、−CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、−C≡CA(CH2)kD(CH2)pZ、−W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZおよび−W(CH2)jZ
から独立して選択される1つ〜3つの基により置換される場合がある;
Wは、結合、−O−、−S−、−S(O)−、−S(O)2−、−NR11−または−N(COR12)−である;
Yは、−CO−、−S(O)2−、−CONR13、−CONR13CO−、−CONR13SO2−、−C(NCN)−、−CSNR13、−C(NH)NR13または−C(O)O−である;
jは0〜3である;
kは0〜3である;
tは0〜2である;
Dは、結合、−CH=CH−、−C≡C−、−C=、−C(O)−、フェニル、−O−、−NH−、−S−、−CHR14−、−CR14R15−、−OCHR14、−OCR14R15−または−CH(OH)CH(OH)−である;
pは0〜3である;
Zは、−CO2R11、−CONR10R11、−C(NR10)NR11R12、−CONH2NH2、−CN、−CH2OH、−NR16R17、フェニル、CONHCH(R20)COR12、フタルイミドピロリジン−2,5ジオンチアゾリジン−2,4−ジオン、テトラゾリル、ピロール、インドール、オキサゾール、2−チオキソ−1,3−チアゾリニン−4−オン、C1〜C7アミン、C3〜C7環状アミン、または、1個〜2個のOH基により置換されるC1〜C3アルキルであり、但し、前記ピロールは場合により、−CO2CH3、−CO2H、−COCH3、−CONH2および−CNからなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換され、
前記C1〜C7アミンは場合により、−OH、ハロゲン、−OCH3および−C≡CHからなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換され、
前記フェニルは場合により、CO2R11により置換され、かつ、前記C3〜C7環状アミンは場合により、−OH、−CH2OH、C1〜C3アルキル、−CH2OCH3、−CO2CH3および−CONH2からなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により置換され、かつ、前記オキサゾールは場合により、CH2CO2R11により置換される;
Aは、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダンまたはビフェニルであり、この場合、それらのそれぞれが場合により、ハロゲン、C1〜C3アルキル、C2〜C4アルケニル、C2〜C4アルキニル、アシル、ヒドロキシ、ハロゲン、−CN、−NO2、−CO2R11、−CH2CO2R11、フェニル、C1〜C3ペルフルオロアルコキシ、C1〜C3ペルフルオロアルキル、−NR10R11、−CH2NR10R11、−SR11、1個〜5個のフッ素により置換されるC1〜C6アルキル、1個〜2個のOH基により置換されるC1〜C3アルキル、1個〜5個のフッ素により場合により置換されるC1〜C6アルコキシ、または、1個〜2個のCF3基により場合により置換されるフェノキシから独立して選択される1つ〜4つの基により置換される場合がある;あるいは
Aは、ピロール、ピリジン、ピリジン−N−オキシド、ピリミジン、ピラゾール、チオフェン、フラン、キノリン、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、イソオキサゾール、インドール、ベンゾ[1,3]−ジオキソール、ベンゾ[1,2,5]−オキソジアゾールイソクロメン−1−オン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、2,3−ジ−5ヒドロベンゾ[1,4]−ジオキシンビテイニルキナゾリン−2,4−9[3H]ジオンおよび3−H−イソベンゾフラン−1−オンから選択される複素環であり、この場合、それらのそれぞれが場合により、ハロゲン、C1〜C3アルキル、アシル、ヒドロキシ、−CN、−NO2、C1〜C3ペルフルオロアルキル、−NR10R11、−CH2NR10R11、−SR11、1個〜5個のフッ素により置換されるC1〜C3アルキル、および、1個〜5個のフッ素により場合により置換されるC1〜C3アルコキシから独立して選択される1つ〜3つの基により置換される場合がある;
R4、R5およびR6はそれぞれが独立して、−Hまたは−Fである;
R7は、C1〜C4アルキル、C1〜C4ペルフルオロアルキル、ハロゲン、−NO2、−CN、フェニル、あるいは、ハロゲン、C1〜C2アルキルおよびOHから独立して選択される1つまたは2つの基により置換されるフェニルである;
但し、X1R2が水素を形成するならば、R3は、
(a)−W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、−W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、−(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、−CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、−C≡CA(CH2)kD(CH2)pZま
たは−W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZによって置換されるフェニル(但し、フェニル成分はさらに場合により、C1〜C2アルキル、C1〜C2ペルフルオロアルキル、ハロゲンおよびCNから独立して選択される1つまたは2つの基により置換される);および
(b)ピリミジン、チオフェンおよびフランから選択される複素環(但し、これらのそれぞれが、−W(CH2)jA(CH2)kD(CH2)pZ、−W(CR18R19)A(CH2)kD(CH2)pZ、−(CH2)jWA(CH2)kD(CH2)pZ、−CH=CHA(CH2)kD(CH2)pZ、−C≡CA(CH2)kD(CH2)pZまたは−W(CH2)jC≡CA(CH2)kD(CH2)pZのうちの1つによって置換される)
から選択される;
それぞれのR8は独立して、−HまたはC1〜C3アルキルである;
それぞれのR9は独立して、−HまたはC1〜C3アルキルである;
それぞれのR10は独立して、−H、−CH、C1〜C3アルコキシ、C1〜C7アルキル、C3〜C7アルケニル、C3〜C7アルキニル、C3〜C7シクロアルキル、−CH2CH2OCH3、2−メチル−テトラヒドロ−フラン、2−メチル−テトラヒドロ−ピラン、4−メチル−ピペリジンモルホリン、ピロリジン、あるいは、1個または2個のC1〜C3アルコキシ基により場合により置換されるフェニルであり、但し、前記C1〜C7アルキルは場合により、C1〜C3アルコキシ、C1〜C3チオアルコキシおよびCNから独立して置換される1つ、2つまたは3つの基により置換される;
それぞれのR11は独立して、−H、C1〜C3アルキルまたはR22であり、あるいは、R10およびR11は、同じ原子に結合するとき、前記原子と一緒になって、
C1〜C3アルキル、OHおよびC1〜C3アルコキシから独立して選択される1つまたは2つの基により場合により置換される5員〜7員の飽和環、あるいは、1個または2個のヘテロ原子を含有し、C1〜C3アルキル、OHおよびC1〜C3アルコキシから独立して選択される1つまたは2つの基によって場合により置換される5員〜7員の環
を形成する:
それぞれのR12は独立して、−HまたはC1〜C3アルキルである;
それぞれのR13は独立して、−HまたはC1〜C3アルキルである;
それぞれのR14およびR15は独立して、C1〜C7アルキル、C3〜C8シクロアルキル、C2〜C7アルケニル、C2〜C7アルキニル、−CH、−F、C7〜C14アリールアルキルであり、但し、前記アリールアルキルは場合により、NO2、C1〜C6アルキル、C1〜C3ペルハロアルキル、ハロゲン、CH2CO2R11、フェニルおよびC1〜C3アルコキシから独立して選択される1つ〜3つの基により置換され、あるいは、R12およびR15は、それらが結合する原子と一緒になって、3員〜7員の飽和環を形成することができる;
それぞれのR16およびR17は独立して、水素、C1〜C3アルキル、C1〜C3アルケニル、C1〜C3アルキニル、フェニル、ベンジルまたはC3〜C8シクロアルキルであり、但し、前記C1〜C3アルキルは場合により、1つのOH基により置換され、かつ、前記ベンジルは場合により、C1〜C3アルキルおよびC1〜C3アルコキシから選択される1つ〜3つの基により置換され、あるいは、R16およびR17は、それらが結合する原子と一緒になって、C1〜C3アルキル、−OH、CH2OH、−CH2OCH3、−CO2CH3および−CONH2からなる群から独立して選択される1つまたは2つの置換基により場合により置換される3員〜8員の複素環を形成することができる;
それぞれのR18およびR19は独立して、C1〜C3アルキルである;
それぞれのR20は独立して、H、フェニル、または、天然に存在するアルファアミノ酸の側鎖である;
それぞれのR22は独立して、CH2COOHにより場合により置換されるアリールアルキルである;かつ
それぞれのR23はフェニルである)
またはその医薬的に許容される塩。

0074

式IIの化合物は、米国特許第7,576,215号(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)に記載されるように合成することができる。式IIの化合物は、化合物26〜化合物32のいずれかまたはその医薬的に許容される塩であることが可能である。



式IIIが下記において提供される:



(式中、
Xは、水素、C1〜C8アルキル、ハロ、−OR10、−NR10R11、ニトロ、シアノ、−COOR10または−COR10から選択される;
Zは、CH、CR3またはNであり、但し、ZがCHまたはCR3であるときには、kは0〜4であり、かつ、tは0または1であり、また、ZがNであるときには、kは0〜3であり、かつ、tは0である;
Yは、−O−、−S−、−N(R12)−および−C(R4)(R5)−から選択される;
W1は、C1〜C6アルキル、C0〜C6アルキル、C3〜C6シクロアルキル、アリールおよびHetから選択され、但し、前記C1〜C8アルキル、C3〜C8シクロアルキル、ArおよびHetは場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ、C1〜C6アルキル、C3〜C6アルケニル、C3〜C6アルキニル、−C0〜C6アルキル−CO2R12、−C0〜C6アルキル−C(O)SR12、−C0〜C6アルキル−CONR13R14、−C0〜C6アルキル−COR15、−C0〜C6アルキル−NR13R14、−C0〜C6アルキル−SR12、−C0〜C6アルキル−OR12、−C0〜C6アルキル−SO3H、−C0〜C6アルキル−SO2NR13R14、−C0〜C6アルキル−SO2R12、−C0〜C6アルキル−SOR15、−C0〜C6アルキルOCOR15、−C0〜C6アルキル−OC(O)NR13R14、−C0〜C6アルキル−OC(O)OR15、−C0〜C6アルキル−NR13C(O)OR15、−C0〜C6アルキル−NR13C(O)NR13R14および−C0〜C6アルキル−NR13COR15から独立して選択される1つまたは複数の基により置換され、この場合、前記C1〜C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
W2は、H、ハロ、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、−C0〜C6アルキル−NR13R14、−C0〜C6アルキル−SR12、−C0〜C6アルキル−OR12、−C0〜C6アルキルCO2R12、−C0〜C6アルキル−C(O)SR12、−C0〜C6アルキルCONR13R14、−C0〜C6アルキル−COR15、−C0〜C6アルキルOCOR15、−C0〜C6アルキル−OCONR13R14、−C0〜C6アルキル−NR13CONR13R14、−C0〜C6アルキル−NR13COR15、−C0〜C6アルキル−Het、−C0〜C6アルキル−Arおよび−C0〜C6アルキル−C3〜C7シクロアルキルから選択され、但し、前記C1〜C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換され、かつ、前記−C0〜C6アルキル−Het、−C0〜C6アルキル−Arおよび−C0〜C6アルキル−C3〜C7シクロアルキルのC3〜C7シクロアルキル部分、Ar部分およびHet部分は場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ、C1〜C6アルキル、C3〜C6アルケニル、C3〜C6アルキニル、−C0
〜C6アルキル−CO2R12、−C0〜C6アルキル−C(O)SR12、−C0〜C6アルキル−CONR13R14、−C0〜C6アルキル−COR15、−C0〜C6アルキル−NR13R14、−C0〜C6アルキル−SR12、−C0〜C6アルキル−OR12、−C0〜C6アルキル−SO3H、−C0〜C6アルキル−SO2NR13R14、−C0〜C6アルキル−SO2R12、−C0〜C6アルキル−SOR15、−C0〜C6アルキル−OCOR15、−C0〜C6アルキル−OC(O)NR13R14、−C0〜C6アルキル−OC(O)OR15、−C0〜C6アルキル−NR13C(O)OR15、−C0〜C6アルキル−NR13C(O)NR13R14および−C0〜C6アルキル−NR13COR15から独立して選択される1つまたは複数の基により置換され、この場合、前記C1〜C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
W3は、H、ハロ、C1〜C6アルキル、−C0〜C6アルキル−NR13R14、−C0〜C6アルキルSR12、−C0〜C6アルキル−OR12、−C0〜C6アルキル−CO2R12、−C0〜C6アルキル−C(O)SR12、−C0〜C6アルキル−CONR13R14、
−C0〜C6アルキル−COR15、−C0〜C6アルキル−OCOR15、−C0〜C6アルキル−OCONR13R14、−C0〜C6アルキルNR13CONR13R14、
−C0〜C6アルキル−NR13COR15、−C0〜C6アルキル−Het、−C1〜C6アルキル−Arおよび−C1〜C6アルキル−C3〜C7シクロアルキルからなる群から選択され、
但し、前記C1〜C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
Qは、C3〜C8シクロアルキル、ArおよびHetから選択され、但し、前記C3〜C8シクロアルキル、ArおよびHetは場合により非置換であるか、あるいは、ハロ、シアノ、ニトロ、C1〜C6アルキル、C3〜C6アルケニル、C3〜C6アルキニル、−C0〜C6アルキルCO2R12、−C0〜C6アルキル−C(O)SR12、−C0〜C6アルキルCONR13R14、−C0〜C6アルキル−COR15、−C0〜C6アルキルNR13R14、−C0〜C6アルキル−SR12、−C0〜C6アルキル−OR12、−C0〜C6アルキル−SO3H、−C0〜C6アルキル−SO2NR13R14、−C0〜C6アルキル−SO2R12、−C0〜C6アルキル−SOR15、−C0〜C6アルキル−OCOR15、−C0〜C6アルキル−OC(O)NR13R14、−C0〜C6アルキル−OC(O)OR15、−C0〜C6アルキルNR13C(O)OR15、−C0〜C6アルキル−NR13C(O)NR13R14および−C0〜C6アルキル−NR13COR15から独立して選択される1つまたは複数の基により置換され、この場合、前記C1C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
pは0〜8である;
nは2〜8である;
mは0または1である;
qは0または1である;
tは0または1である;
それぞれのR1およびR2は独立して、H、ハロ、C1〜C6アルキル、C3〜C6アルケニル、C3〜C6アルキニル、−C0〜C6アルキル−NR13R14、−C0〜C6アルキル−OR12、−C0〜C6アルキル−SR12、−C1〜C6アルキル−Het、−C1〜C6アルキル−Arおよび−C1〜C6アルキル−C3〜C7シクロアルキルから選択されるか、あるいは、R1およびR2は、それらが結合する炭素と一緒になって、3員〜5員の炭素環式環または複素環式環を形成し、この場合、前記複素環式環は、N、OおよびSから選択される1つまたは複数のヘテロ原子を含有し、但し、前記C1〜C6アルキルのいずれもが場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ
置換基によって置換される;
それぞれのR3は同じまたは異なり、独立して、ハロ、シアノ、ニトロ、C1〜C6アルキル、C3〜C6アルケニル、C3〜C6アルキニル、−C0〜C6アルキル−Ar、−C0〜C6アルキル−Het、−C0〜C6アルキル−C3〜C7シクロアルキル、−C0〜C6アルキル−CO2R12、−C0〜C6アルキル−C(O)SR12、−C0〜C6アルキル−CONR13R14、−C0〜C6アルキル−COR15、−C0〜C6アルキル−NR13R14、−C0〜C6アルキル−SR12、−C0〜C6アルキル−OR12、−C0〜C6アルキル−SO3H、−C0〜C6アルキルSO2NR13R14、−C0〜C6アルキル−SO2R12、−C0〜C6アルキルSOR15、−C0〜C6アルキル−OCOR15、−C0〜C6アルキル−OC(O)NR13R14、−C0〜C6アルキル−OC(O)OR15、−C0〜C6アルキル−NR13C(O)OR15、−C0〜C6アルキル−NR13C(O)NR13R14および−C0〜C6アルキル−NR13COR15から選択され、但し、前記C1〜C6アルキルは場合により非置換であるか、あるいは、1つまたは複数のハロ置換基によって置換される;
それぞれのR4およびR5は独立して、H、ハロ、C1〜C6アルキル、−C0〜C6アルキル−Het、−C0〜C6アルキル−Arおよび−C0〜C6アルキル−C3〜C7シクロアルキルから選択される;
R6およびR7はそれぞれが独立して、H、ハロ、C1〜C6アルキル、−C0〜C6アルキル−Het、−C0〜C6アルキル−Arおよび−C0〜C6アルキル−C3〜C7シクロアルキルから選択される;
R8およびR9はそれぞれが独立して、H、ハロ、C1〜C6アルキル、−C0〜C6アルキル−Het、−C0〜C6アルキル−Arおよび−C0〜C6アルキル−C3〜C7シクロアルキルから選択される;
R10およびR11はそれぞれが独立して、H、C1〜C12アルキル、C3〜C12アルケニル、C3〜C12アルキニル、
−C0〜C8アルキル−Ar、−C0〜C8アルキル−Het、−C0〜C8アルキル−C3〜C7シクロアルキル、−C0〜C8アルキル−O−Ar、−C0〜C8アルキル−O−Het、
−C0〜C8アルキル−O−C3〜C7シクロアルキル、−C0〜C8アルキル−S(O)x−C0〜C6アルキル、−C0〜C8アルキル−S(O)x−Ar、−C0〜C8アルキル−S(O)x−Het、−C0〜C8アルキル−S(O)x−C3〜C7シクロアルキル、−C0〜C8アルキル−NH−Ar、−C0〜C8アルキル−NH−Het、−C0〜C8アルキル−NH−C3〜C7シクロアルキル、−C0〜C8アルキル−N(C1〜C4アルキル)−Ar、−C0〜C8アルキル−N(C1〜C4アルキル)−Het、−C0〜C8アルキル−N(C1〜C4アルキル−C3〜C7シクロアルキル、−C0〜C8アルキル−Ar、−C0〜C8アルキル−Hetおよび−C0〜C8アルキル−C3〜C7シクロアルキルから選択され、この場合、xは、0、1または2であり、
あるいは、R10およびR11は、それらが結合する窒素と一緒になって、N、OおよびSから選択される1つまたは複数のさらなるヘテロ原子を場合により含有する4員〜7員の複素環式環を形成し、但し、前記C1〜C12アルキル、C3〜C12アルケニルまたはC3〜C12アルキニルは場合により、ハロ、−OH、−SH、−NH2、−NH(非置換C1〜C6アルキル)、−N(非置換C1〜C6アルキル)(非置換C1〜C6アルキル)、非置換の−OC1〜C6アルキル、−CO2H、−CO2(非置換C1〜C6アルキル)、−CONH2、−CONH(非置換C1〜C6アルキル)、−CON(非置換C1〜C6アルキル)(非置換C1〜C6アルキル)、−SO3H、−SO2NH2、−SO2NH(非置換C1〜C6アルキル)および−SO2N(非置換C1〜C6アルキル)(非置換C1〜C6アルキル)の群から独立して選択される置換基の1つまたは複数によって置換される;
R12は、H、C1〜C6アルキル、C3〜C6アルケニル、C3〜C6アルキニル、−C0〜C6アルキル−Ar、−C0〜C6アルキル−Hetおよび−C0〜C6アル
ル−C3〜C7シクロアルキルから選択される;
それぞれのR13およびそれぞれのR14は独立して、H、C1〜C6アルキル、C3〜C6アルケニル、C3〜C6アルキニル、−C0〜C6アルキル−Ar、−C0〜C6アルキル−Hetおよび−C0〜C6アルキル−C3〜C7シクロアルキルから選択され、あるいは、R13およびR14は、それらが結合する窒素と一緒になって、N、OおよびSから選択される1つまたは複数のさらなるヘテロ原子を場合により含有する4員〜7員の複素環式環を形成する;
R15は、C1〜C6アルキル、C3〜C6アルケニル、C3〜C6アルキニル、−C0〜C6アルキル−Ar、−C0〜C6アルキル−Hetおよび−C0〜C6アルキル−C3〜C7シクロアルキルから選択される)
またはその医薬的に許容される塩。

0075

いくつかの実施形態において、Xは水素であり、pは0であり、tは0であり、ZはCHであり、かつ、Yは−O−である。

0076

さらなる実施形態において、Xは水素であり、pは0であり、tは0であり、ZはCHであり、かつ、Yは−O−であり、W1およびW2はフェニルであり、W3は水素であり、qは1であり、かつ、R8およびR9は水素である。

0077

他の実施形態において、Xは水素であり、pは0であり、tは0であり、ZはCHであり、かつ、Yは−O−であり、W1およびW2はフェニルであり、W3は水素であり、qは1であり、かつ、R8およびR9は水素であり、かつ、QはArである。

0078

したがって、式IIIの化合物には、下記に示される構造を有する化合物、GW3965[2]およびSB742881[25]が含まれるが、これらに限定されない:



式IIIの化合物は、米国特許第7,365,085号および同第7,560,586号(これらは参照によって本明細書中に組み込まれる)に記載されるように合成することができる。
式IVが下記に示される:



またはその医薬的に許容される塩、但し、式IVにおいて、
J11は−N=であり、かつ、J21は−CR300−であり、または、J11は−CR200−であり、かつ、J21は=N−である;
R00は、G1、G21またはRNである;
R200は、G1、G21またはRCである;
R300およびR400は独立して、RCまたはQであり、但し、R300、R400およびR500のうちのただ1つだけがQである;
Qは、C3〜6シクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり、それぞれが場合により、1つ〜4つのRQにより置換されるか、あるいは、Qは−X−Y−Zであり、但し、それぞれのRQが独立して、アリールオキシアラルキルオキシ、アリールオキシアルキル、アリールC0〜C6アルキルカルボキシ、C(R110)=C(R110)−COOH、オキソ、=S、−Z、−Y’−Zまたは−X−Y−Zであり、それぞれのRQは場合により、1つ〜4つのR80により置換される;
R500は、G1、G21、QまたはRCであり、但し、この場合、R00、R200およびR500のうちのただ1つがG1であり、かつ、R00、N=およびR500のうちのただ1つがG21である;
G21は−J0−K0であり、式中、J0およびK0は独立して、アリールまたはヘテロアリールであり、それぞれが場合により、1つ〜4つのRK基により置換され、それぞれのRKが独立して、水素、ハロゲン、CR110=CR110COOR110、ニトロ、−Z、−Y−Zまたは−X−Y−Zである;
G1は−L10−Rであり、但し、L10は、結合、L50、L60、−L50−L60−L50−または−L60−L50−L50−であり、これらの式において、
それぞれのL50が独立して、−[C(R150)2]m−であり、
それぞれのL60が独立して、−CS−、−CO−、−SO2−、−O−、−CON(R110)−、−CONR110N(R110)−、−C(=NR110)−、−C(NOR11)−、−C(=N−N(R110)2)−、−C3〜C8シクロアルキル−または−ヘテロシクリル−であり、前記シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、1つ〜4つのR140基により置換され、あるいは、それぞれのL60が独立して、C2〜C6アリジイルであり、前記アリジイル鎖は場合により、−C(R100)2−、−C(R110)2C(R110)z−、−C(R11)C(R110)−、−C(R110)2O−、−C(R110)zNR110−、−C C−、−O−、−S−、−N(RO)CO−、−N(R100)CO2−、−CON(R110)−、−CO−、−CO2−、−OC(=O)−、−OC(=O)N(R100)−、−SO2−、−N(R100)SO2−または−SO2N(R100)によって中断され、
Rが、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリールまたは−(C3〜C6)シクロアルキルであり、但し、Rは場合により、1つ〜4つのRAにより置換され、この場合、それぞれのRAが独立して、ハロゲン、ニトロ、ヘテロシクリル、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、C3〜C8シクロアルキル、(C3〜C8シ
クロアルキル)−C1〜C6アルキル−、(C3〜C8シクロアルケニル)−C1〜C6アルキル−、(C3〜C8シクロアルキル)−C1〜C6アルケニル−、アリールアルキル、アリールオキシ、アリールC1〜6アルコキシ、C1〜C6ハロアルキル、SO2R110、OR110、SR110、N3、SOR110、COR110、SO2N(R110)2、SO2NR110COR110、C≡N、C(O)OR110、CON(R110)2、−CON(R110)OR110、OCON(R110)2、−NR110COR110、NR110CON(R110)2、NR110COOR110、−C(=N−OH)R110、−C(=S)N(R110)2、
−S(=O)N(R110)2、−S(=O)OR110、−N(R110)S(=O)2R110、−C(=O)N(R110)N(R110)2、−OC(=O)−R110、−OC(=O)−OR110またはN(R11)2であり、
かつ、それぞれのRAが場合により、独立して−ハロゲン、−C1〜C6アルキル、アリールオキシ、C0〜6アルキルSO2R110、C0〜6アルキルCOOR110、C1〜6アルコキシアリール、C1〜C6ハロアルキル、
−SO2R110、−OR110、−SR110、−N3、−SO2R110、−COR110、−SO2N(R110)2、−SO2NR110COR110、−C≡N、−C(O)OR110、
−CON(R110)2、−CON(R110)OR110、−OCON(R110)2、−NR110COR110、−NR110CON(R110)2、−NR110COOR110または−N(R110)2である1つ〜4つの基により置換される;
RNは−L31−R60であり、但し、L31は、結合、−X3(CHz)n−X3−、−(CH2)m−X3−(CH2)n−または−(CH2)1+w,−Y3−(CH2)w−であり、これらの式において、それぞれのwが独立して、0〜5であり、かつ、それぞれのX3が独立して、結合、−C(R110)2−、−C(R110)2C(R110)2−、−C(R110)=C(R110)−、−C≡C−、−CO−、−CS−、−CONR100−、−C(=N)(R100)−、−C(=N−OR110)−、−C[=N−N(R110)2]、−CO2−、−SO2−または−SO2N(R110)−であり、かつ
Y3が、−O−、−S−、−NR70−、−N(R100)CO−、−N(R110)CO2−、−OCO−、−OC(=O)N(R100)−、−NR100CONR100−、−N(R110)SO2−または−NR100CSNR100−であり、
あるいは、L31はC2〜C6アリジイル鎖であり、但し、前記アリジイル鎖は場合により、−C(R110)2−、
−C(R110)2C(R110)2−、−C(R110)=C(R110)−、−C(R110)2O−、−C(R110)2NR110−、−C≡C−、−O−、−S−、−N(R100)CO−、
−N(R100)CO2−、−CON(R100)−、−CO−、−CO2−、−O(C=O)−、−O(C=O)N(R110)−、−SO2−、−N(R100)SO2−または−SO2N(R100)−によって中断され、
R60が、C1〜C6アルキル、C1〜C6ハロアルキル、アリール、C3〜C8シクロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、−CN、
−C(=O)R110、−C(=O)OR110、−C(=O)N(R110)2、−N(R110)2、−SO2R110、−S(=O)2N(R110)2、−C(=O)N(R110)N(R110)2または−C(=O)N(R11)(OR110)であり、但し、前記アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、1つ〜4つのR60aにより置換され、この場合、
それぞれのR60aが独立して、−Z、−Y’−Zまたは−X−Y−Zである;
それぞれのRCは独立して、−L30−R70であり、但し、
それぞれのL30が独立して、結合または−(CH2)m−V10−(CH2)n−であり、式中、
V10は、−C(R110)2−、−C(R110)2C(R110)2、−C(R110)=C(R110)−、−C(R110)2O−、−C(R110)2NR110−、−C≡C−、−O−、
−S−、−NR10−、−N(R100)CO−、−N(R100)CO2−、−OCO−、−CO−、−CS−、−CONR100−、−C(=N−R110)−、−C(=N−OR110)−、
−C[=N−N(R110)2]、−CO2−、−OC(=O)−、−OC(=O)N(R100)−、SO2−、−N(R100)SO2−、−SO2N(R100)−、−NR100CONR100−、−NR100CSNR100−、C3〜C6シクロアルキルまたはC3〜C6シクロハロアルキルであり、
あるいは、それぞれのL30が独立して、C2〜C6アリジイルであり、但し、前記アリジイル鎖は場合により、−C(R110)2−、−C(R110)2C(R110)2−、−C(R110)C(R110)−、−C(R110)2O−、−C(R110)2NR110−、−C≡C−、−O−、−S−、−N(R100)CO−、
−N(R100)CO2−、−NR110−、−CON(R100)−、−CO−、−CO2−、−O(C=O)−、−O(C=O)N(R100)−、−SO2−、−N(R100)SO2−または−SO2N(R100)−によって中断され、
それぞれのR70が独立して、水素、ハロゲン、ニトロ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、−Z、−Y−Zまたは−X−YZであり、
この場合、前記アリール、ヘテロアリールおよびヘテロシクリルはそれぞれが場合により、1つ〜4つのR70aにより置換され、但し、それぞれのR70aが独立し、アリールオキシ、アラルキルオキシ、アリールオキシアルキル、アリールC0〜C6アルキルカルボキシ、C(R110)=C(R110)COOH、オキソ、−Z、−Y’−Zまたは−X−Y−Zであり、かつ、それぞれのR70aが場合により、1つ〜4つのR80により置換され、但し、それぞれのR80が独立して、ハロゲン、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ、C1〜C8ハロアルキル、C1〜C8ハロアルキル(OR110)、C0〜C6アルキルOR110、C0〜C6アルキルCON(R110)2、C0〜C6アルキルCOR110、C0〜C6アルキルCOOR110またはC0〜C6アルキルSO2R110である;
それぞれのR100は独立して、−R110、−C(=O)R110、−CO2R110または−SO2R110である;
それぞれのR110は独立して、−水素、−C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、−C1〜C6アルキニル、−C1〜C6ハロアルキルまたは−N(R12)2であり、但し、R110のいずれもが場合により、R120の1つ〜4つの基により置換される:
それぞれのR120は独立して、ハロゲン、シアノ、ニトロ、オキソ、−B(OR130)、C0〜C6アルキルN(R13)2、C1〜C6ハロアルキル、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ、(C0〜C6アルキル)C=O(OR130)、C0〜C6アルキルOR130、C0〜C6アルキルCOR130、
C0〜C6アルキルSO2R130、C0〜C6アルキルCON(R13)2、C0〜C6アルキルCONR130OR130、C0〜C6アルキルSO2N(R130)2、C0〜C6アルキルSR130、C0〜C6ハロアルキルOR130、C0〜C6アルキルCN、−C0〜C6アルキN(R13)2、−NR13SO2R13または−OC0〜6アルキルCOOR130である;
それぞれのR130は独立して、水素、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニルまたはC2〜C6アルキニルである;
それぞれのR140は独立して、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルコキシ、ハロゲン、C1〜C6ハロアルキル、C0〜C6アルキルCON(R110)o、C0〜C6アルキルCONR110R10、C0〜C6アルキルOR110またはC0〜C6アルキルCOOR110である;かつ
それぞれのR150は独立して、水素、ハロゲン、OR130、(C1〜C6)アルキルまたは(C1〜C6)ハロアルキルであり、但し、
それぞれのアルキルは場合により、それぞれが独立してハロゲン、シアノ、ニトロ、アジド、OR130、C(O)R130、C(O)OR13C(O)N(R130)2、N(R130)2、N(R130)C(O)R130、N(R130)S(O)2R130、−OC(O)OR130、OC(O)N(R130)2、N(R130)C(O)OR130、N(R130)C(O)N(R130)、SR130、S(O)R130、S(O)2R’またはS(O)2N(R130)2である少なくとも1つの基により置換され、あるいは、(同じ原子または異なる原子に結合する)2つのR150は一緒になって、C3〜C6シクロアルキルを形成することができる;
それぞれのXは独立して、−O−、−S−または−N(R100)−である;
それぞれのYは独立して、−[C(R150)2]p−または−C2〜C6アルケニルであり、但し、pは、1、2、3、4、5または6である;
それぞれのY’は独立して、−[C(R150)2]p−、−C2〜C6アルケニルC3〜C8シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、但し、前記シクロアルキルまたはヘテロシクリルは場合により、1つ〜3つのZ基により置換される:
それぞれのZは独立して、−H、ハロゲン、−OR110、−SR110、−C(=O)R110、−C(=O)OR110、−C(=O)N(R110)2、
−N(R100)2、−N3、−NO2、−C(=N−OH)R110、−C(=S)N(R110)2、−CN、−S(=O)R110、−S(=O)N(R110)2、−S(=O)OR110、
−S(=O)2R110、S(=O)2N(R110)2、−NR110COR110、−N(R110)C(=O)N(R110)2、−N(R110)COOR110、−N(R110)S(=O)2R110、−C(=O)N(R110)N(R110)2、−C(=O)N(R110)(OR110)、−OC(=O)−R110、−OC(=O)−OR110または−OC(=O)−N(R110)2である;かつ
それぞれのmおよびnは独立して、0、1、2、3、4、5または6である。

0079

いくつかの実施形態において、式IVの化合物は下記の式Vまたは式VIの構造を有する:



他の実施形態において、式VIの化合物は下記の式VIIの構造を有する:



さらに他の実施形態において、式VIの化合物は下記の式VIIIの構造を有する:



なおもさらなる実施形態において、式VIの化合物は下記の式IXの構造を有する:



したがって、本発明の方法において有用であり得る式IVの化合物には、下記に示される構造を有する化合物およびそれらのその医薬的に許容される塩が含まれるが、これらに限定されない:







また、本発明の方法において有用であり得る式IVの化合物は、下記の化合物を含むリストから選択される:
33、2−(1−(3クロロ−3’−フルオロ−4’−(ヒドロキシメチル)−5’−(メチルスルホニル)ビフェニル−4−イル)−2−(2−(2,6ジクロロフェニルプロパン−2−イル)−1H−イミダゾール−4−イル)プロパン−2−オール;34、2−(2−(2(2−クロロ−3−フルオロフェニル)プロパン−2−イル)−1−(3’−フルオロ−4’−(ヒドロキシメチル)−5’(メチルスルホニル)ビフェニル−4−イル)−1H−イミダゾール−4−イル)プロパン−2−オール;35、2−(2−(2(2,6−ジクロロフェニル)プロパン−2−イル)−1−(3’−フルオロ−4’−(ヒドロキシメチル)−5’(メチルスルホニル)ビフェニル−4−イル)−1H−イミダゾール−4−イル)プロパン−2−オール;36、2−(2−(2(2,6−ジクロロフェニル)プロパン−2−イル)−1−(3,3’−ジフルオロ−4’−(ヒドロキシメチル)−5’(メチルスルホニル)ビフェニル−4−イル)−1H−イミダゾール−4−イル)プロパン−2−オール;および、37、2−(2−[1(2,6−ジクロロフェニル
エチル]−1−[3,3’−ジフルオロ−4’−(ヒドロキシメチル)−5’(メチルスルホニル)ビフェニル−4−イル]−1H−イミダゾール−4−イル)プロパン−2−オール。化合物12はまた、WO2010 0138598のEx.9として知られている。化合物38はまた、WO2007 002563のEx.19として知られている。化合物39はまた、WO2012 0135082として知られている。

0080

式IVの化合物は、PCT公開番号US2010/0069367および国際公開WO2010/138598(これらは参照によって本明細書中に組み込まれる)に記載されるように合成することができる。

0081

転移の処置および/または防止のために使用することができるLXRアゴニストは化合物24またはその医薬的に許容される塩が可能である:



さらなる実施形態において、転移の処置および/または防止のために使用することができる化合物が、下記からなるリストにおけるPCT公開公報において見出され得る:WO2006/094034、WO2008/049047、WO2009/020683、WO2009/086138、WO2009/086123、WO2009/086130、WO2009/086129、WO2007/002559、WO2007/002563、WO2007/081335、WO2006/017055、WO2006/102067、WO2009/024550、US2006/0074115、US2006/0135601、WO2009/021868、WO2009/040289、WO2007/047991、WO2007/050425、WO2006/073363、WO2006/073364、WO2006/073365、WO2006/073366、WO2006/073367、US2009/0030082、WO2008/065754、JP2008/179562、WO2007/092065、US2010/0069367、US7998995、US7247748、WO2010/138598、US7365085、US75776215、US63136503、US2004/0072868、US2005/0107444、US2005/0113580、US2005/0131014、US2005/0282908、US2009/0286780(これらは参照によって本明細書中に組み込まれる)。

0082

LXRαおよびLXRβは、ほぼ同じ時期に多数のグループによって最初に発見されたものであり(Apfel他、1994;Willy他、1995;Song他、1994;Shinar他、1994;Teboul他、1995)、グルコースコレステロールおよび脂肪酸の代謝に関与する遺伝子の転写を媒介するためにコレステロールおよびその酸化誘導体によって内因的に活性化される核ホルモン受容体のファミリーに属する(Janowski他、1996;CalkinおよびTontonoz、2012)。脂質代謝とガン細胞成長との間における入り組んだつながり(Cairns他、2011)を考えれば、メラノーマにおけるLXRβの遍在的発現は偶然の一致であるとは考えられず、これにより、メラノーマ細胞は、その成長を持続するために脂質およびリポタンパク質粒子を合成することができるからである。しかしながら、同時に、そのような安定した基礎的な発現レベルは、LXRβ活性化療法に対するメラノーマ細胞の広範囲にわたる応答性によって例示されるように、LXRβを理想的な治療標的にしている。

0083

様々な化合物が、LXRβまたはLXRαに対する選択性を有することが示されている。この選択性が、増大した活性および/または低下した標的外影響を可能にしているかもしれない。LXRβまたはLXRαに対して選択性を有する化合物の例が表1に示される。

0084

本明細書中で使用される場合、LXRαおよびLXRβにおけるLXRアゴニストの活性に対する参照は、Spencer他、Journal of Medicinal Chemistry、2001、44、886〜897(これは参照によって本明細書中に組み込まれる)に記載されるリガンドセンシングアッセイ(LiSA)を使用して測定されるような活性を示す。いくつかの実施形態において、LXRアゴニストは、リガンドセンシングアッセイにおいて1μM未満のEC50(例えば、0.5nm〜500nM、10nM〜100nM)を有する。例えば、本発明の方法は、LXRαに対する当該アゴニストの活性よりも少なくとも3倍大きいLXRβに対する活性を有するLXRβアゴニスト、または、LXRαに対する当該アゴニストの活性よりも少なくとも10倍大きいLXRβに対する活性を有するLXRβアゴニスト、または、LXRαに対する当該アゴニストの活性よりも少なくとも100倍大きいLXRβに対する活性を有するLXRβアゴニスト、または、LXRαに対する当該アゴニストの活性の少なくとも3倍以内であるLXRβに対する活性を有するLXRβアゴニストを使用して行うことができる。LiSAアッセイアッセイにおける「より大きい活性」という用語は、より低いEC50を示す。例えば、GW3965[2]は、LXRα(EC50=190)と比較して、LXRβ(EC50=30)に対するおよそ6倍より大きい活性を有する。

0085

本明細書中で使用される場合、用語「ApoE発現のレベルをインビトロにおいて増大させる」は、ある特定のLXRアゴニストがApoE発現のレベルを5μM未満の濃度(例えば、100nM〜2μMの濃度、1μM以下の濃度)で実施例21のqPCRアッセイにおいて2.5倍増大させることができることを示す。このインビトロ効果を示すLXRアゴニストが本発明の方法における使用のために非常に有効であり得る。

0086

用語「アルキル」は、本出願において使用される場合、飽和した分岐型または非分岐型の脂肪族一価置換基に関連する。アルキル置換基は1個〜100個の炭素原子(例えば、1個〜22個の炭素原子、1個〜10個の炭素原子、1個〜6個の炭素原子、1個〜3個の炭素原子)を有する。したがって、アルキル置換基の例には、メチル、エチル、n−プロピルイソプロピルn−ブチルイソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、n−ペンチルおよびn−へキシルが含まれる。

0087

用語「アルコキシ」は、式−ORの化学置換基を表しており、但し、式中、Rは、別途指定されない限り、場合により置換されたC1〜C6アルキル基である。いくつかの実施形態において、アルキル基は置換されることが可能であり、例えば、アルコキシ基は、本
明細書中で定義されるような置換基を1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つ有することができる。

0088

用語「アルコキシアルキル」は、アルコキシ基により置換されるアルキル基として記載されるヘテロアルキル基(これは本明細書中で定義される通りである)を表す。例示的な非置換のアルコキシアルキル基は2個〜12個の間の炭素を含む。いくつかの実施形態において、アルキルおよびアルコキシはそれぞれがさらに、それぞれの基について本明細書中で定義されるような1つ、2つ、3つまたは4つの置換基により置換され得る。

0089

本明細書中で使用される場合、用語「シクロアルキル」は、単環式二環式または三環式の置換基を示し、但し、これらは飽和していてもよく、あるいは、部分的に飽和していてもよく、すなわち、1つまたは複数の二重結合を有する。単環式置換基が、3個〜8個の炭素原子を含有する飽和環状炭化水素基によって例示される。単環式シクロアルキル置換基の例には、シクロプロピルシクロブチルシクロペンチルシクロペンテニルシクロヘキシル、シクロへキセニルシクロヘプチルおよびシクロオクチルが含まれる。二環式の縮合シクロアルキル置換基が、別のシクロアルキル環縮合するシクロアルキル環によって例示される。二環式シクロアルキル置換基の例には、デカリンおよび1,2,3,7,8,8a−ヘキサヒドロナフタレンなどが含まれるが、これらに限定されない。三環式のシクロアルキル置換基が、さらなるシクロアルキル置換基に縮合するシクロアルキル二環式縮合環によって例示される。

0090

本出願において使用される用語「アルキレン」は、飽和した分岐型または非分岐型の脂肪族の二価置換基に関連する(例えば、アルキレン置換基は、1個〜6個の炭素原子、1個〜3個の炭素原子を有する)。したがって、アルキレン置換基の例には、メチレンエチレントリメチレンプロピレンテトラメチレンイソプロピリデンペンタメチレンおよびヘキサメチレンが含まれる。

0091

用語「アルケニレンまたはアルケニル」は、本出願において使用される場合、二重結合を2つの隣接する炭素原子の間に有する不飽和の分岐型または非分岐型の脂肪族の二価置換基である(例えば、アルケニレン置換基は、2個〜6個の炭素原子、2個〜4個の炭素原子を有する)。したがって、アルケニレン置換基の例には、ビニレン、1−プロペニレン、2−プロペニレン、メチルビニレン、1−ブテニレン、2−ブテニレン、3−ブテニレン、2−メチル−1−プロペニレン、2−メチル−2−プロペニレン、2−ペンテニレン、2−ヘキセニレンが含まれるが、これらに限定されない。

0092

用語「アルキニレンまたはアルキニル」は、本出願において使用される場合、三重結合を2つの隣接する炭素原子の間に有する不飽和の分岐型または非分岐型の脂肪族の二価置換基である(例えば、アルキニレン置換基は、2個〜6個の炭素原子、2個〜4個の炭素原子を有する)。アルキニレン置換基の例には、エチニレン、1−プロピニレン、1−ブチニレン、2−ブチニレン、1−ペンチニレン、2−ペンチニレン、3−ペンチニレンおよび2−ヘキシニレンが含まれるが、これらに限定されない。

0093

用語「アルカジエニレン」は、本出願において使用される場合、2つの二重結合を2つの隣接する炭素原子の間に有する不飽和の分岐型または非分岐型の脂肪族の二価置換基である(例えば、アルカジエニレン置換基は4個〜10個の炭素原子を有する)。したがって、アルカジエニレン置換基の例には、2,4−ペンタジエニレン、2,4−ヘキサジエニレン、4−メチル−2,4−ペンタジエニレン、2,4−ヘプタジエニレン、2,6−ヘプタジエニレン、3−メチル−2,4−ヘキサジエニレン、2,6−オクタジエニレン、3−メチル−2,6−ヘプタジエニレン、2−メチル−2,4−ヘプタジエニレン、2,8−ノナジエニレン、3−メチル−2,6−オクタジエニレン、2,6−デカジエニレ
ン、2,9−デカジエニレンおよび3,7−ジメチル−2,6−オクタジエニレンの各置換基が含まれるが、これらに限定されない。

0094

用語「ヘテロ脂肪族置換基またはヘテロアルキル」は、本明細書中で使用される場合、1つまたは複数の炭素原子がヘテロ原子により、例えば、酸素原子イオウ原子窒素原子リン原子またはケイ素原子により置換されている一価または二価の置換基を示し、但し、この場合、窒素原子およびイオウ原子は場合により酸化される場合があり、また、窒素ヘテロ原子は場合により四級化される場合がある。ヘテロ原子のO、NおよびSは、ヘテロ脂肪族置換基のどのような内部位置においてでも置かれる場合がある。例には、−CH2−CH2−O−CH3、−CH2−CH2−NH−CH3、−CH2−CH2−N(CH3)−CH3、−CH2−S−CH2−CH3、−S(O)−CH3、−CH2−CH2−S(O)2−CH3、−CH=CH−O−CH3、−CH2−CH=N−OCH3および−CH=CH−N(CH3)−CH3が含まれる。ヘテロ脂肪族置換基は線状または分岐型および飽和型または不飽和型である場合がある。

0095

1つの実施形態において、ヘテロ脂肪族置換基は1個〜100個(例えば、1個〜42個の炭素原子)を有する。さらに別の実施形態において、ヘテロ脂肪族置換基はポリエチレングリコール残基である。

0096

本明細書中で使用される場合、「芳香族置換基またはアリール」は、少なくとも1つの環が芳香族であり、かつ、非置換であってもよい、または置換されていてもよい、10個までの原子をそれぞれの環に有する安定な単環式炭素環、二環式炭素環または多環式炭素環のどのようなものも意味することが意図される。そのような芳香族置換基の例には、フェニル、p−トルエニル(4−メチルフェニル)、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリルアントリルまたはアセナフチルが含まれる。芳香族置換基が二環式であり、かつ、1つの環が非芳香族である場合には、結合が芳香族環を介してであることが理解される。

0097

用語「アルキルアリール置換基またはアリールアルキル」は、含有される水素への1つまたは複数の結合が、上記で記載されるようないずれかのアリール置換基への結合によって置き換えられる上記で記載されるようなアルキル置換基を示す。アリールアルキル置換基は、アルキル置換基からの結合を介して本発明の化合物におけるカルボニル基につながることが理解される。アリールアルキル置換基の例には、ベンジル(フェニルメチル)、p−トリフルオロメチルベンジル(4−トリフルオロメチルフェニルメチル)、1−フェニルエチル、2−フェニルエチル、3−フェニルプロピルおよび2−フェニルプロピルなどが含まれるが、これらに限定されない。

0098

用語「ヘテロ芳香族置換基またはヘテロアリール」は、本明細書中で使用される場合、少なくとも1つの環が芳香族であり、かつ、O、NおよびSからなる群から選択される1個〜4個のヘテロ原子を含有する、10個までの原子をそれぞれの環に有する安定な単環式環二環式環または多環式環を表す。二環式のヘテロ芳香族置換基には、
a)1個の窒素原子を有する6員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する、
b)2個の窒素原子を有する5員または6員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する、c)1個の窒素原子を1個の酸素原子または1個のイオウ原子のどちらかと一緒に有する5員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する、あるいは
d)O、NおよびSから選択される1個のヘテロ原子を有する5員の芳香族(不飽和)複素環式環に縮合する
フェニル環ピリジン環ピリミジン環またはピリジジン(pyrididine)環が含まれる。

0099

この定義の範囲の範囲内であるヘテロアリール基には、下記の基が含まれるが、それらに限定されない:ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラニル、ベンゾピラゾリルベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリルカルバゾリルカルボリニル、シンノリニル、フラニル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリルイソオキサゾリルナフトピリジニルオキサジアゾリルオキサゾリルオキサゾリンイソオキサゾリンオキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニルピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジルピリミジルピロリル、キナゾリニルキノリルキノキサリニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリルチエニルトリアゾリル、アゼチジニルアジリジニル、1,4−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジオゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリン。ヘテロアリール置換基が二環式であり、かつ、1つの環が非芳香族であるか、または、ヘテロ原子を含有しない場合には、結合がそれぞれ、芳香族環を介して、または、ヘテロ原子含有環を介してであることが理解される。ヘテロアリールが窒素原子を含有するならば、対応するそのN−オキシドもまた本発明によって包含されることが理解される。

0100

脂肪族置換基、ヘテロ脂肪族置換基、芳香族置換基およびヘテロ芳香族置換基は場合により、下記の様々な基(これらに限定されない)を含む下記の置換基のいずれか1つまたは複数により1回または複数回、同じようにまたは異なるように置換され得る:脂肪族置換基、ヘテロ脂肪族置換基、芳香族置換基およびヘテロ芳香族置換基、アリール、ヘテロアリール;アルキルアリール;ヘテロアルキルアリール;アルキルヘテロアリール;ヘテロアルキルヘテロアリール;アルコキシ;アリールオキシ;ヘテロアルコキシ;ヘテロアリールオキシアルキルチオアリールチオ;ヘテロアルキルチオ;ヘテロアリールチオ;F;Cl;Br;I;−OH;−NO2;−CN;−CF3;−CH2CF3;−CHCl2;−CH2OH;−CH2CH2OH;−CH2NH2;−CH2SO2CH3;−C(O)Rx;−CO2(Rx);−CON(Rx)2;−OC(O)Rx;−OCO2Rx;−OCON(Rx)2;−N(RX)2;−S(O)Rx;−S(O)2Rx;−NRx(CO)Rx、但し、これらの式において、Rxのそれぞれの存在には独立して、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂肪族、複素環式、芳香族、ヘテロ芳香族、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアルキルアリールまたはヘテロアルキルヘテロアリールが含まれるが、これらに限定されず、この場合、上記および本明細書中に記載される脂肪族置換基、脂環式置換基、ヘテロ脂肪族置換基、複素環式置換基、アルキルアリール置換基またはアルキルヘテロアリール置換基のいずれもが、置換または非置換で、分岐型または非分岐型で、飽和型または不飽和型であってもよく、また、上記および本明細書中に記載される芳香族置換基、ヘテロ芳香族置換基、アリール置換基、ヘテロアリール置換基、(アルキル)アリール置換基または(アルキル)ヘテロアリール置換基のいずれもが置換または非置換であってもよい。加えて、いずれか2つの隣接する置換基は一緒になって、置換された、または非置換である4員、5員、6員または
7員の脂環式置換基または複素環式置換基を表すことがあることが理解されるであろう。一般に適用可能な置換基のさらなる例が、下記に示される具体的な実施形態によって例示される。

0101

用語「ハロ」および用語「ハロゲン」は、F、Cl、BrおよびIからなる群から選択されるハロゲン原子を示す。

0102

用語「ハロゲン化アルキル置換基、ハロアルキル」は、少なくとも1つのハロゲン原子により置換される上記で定義されるようなアルキル置換基を示す。1つの実施形態において、ハロゲン化アルキル置換基はペルハロゲン化される。別の実施形態において、ペルフルオロアルキルは、式CnF2n+1の一価のペルフルオロ化された置換基であるハロゲン化アルキル置換基を示す。例えば、ハロゲン化アルキル置換基は1個〜6個の炭素原子(例えば、1個〜3個の炭素原子)を有する場合がある。したがって、アルキル基の例には、トリフルオロメチル、2,2,2−トリフルオロエチル、n−ペルフルオロプロピル、n−ペルフルオロブチルおよびn−ペルフルオロペンチルが含まれる。

0103

用語「アミノ」は、本明細書中で使用される場合、−N(RN1)2を表し、但し、式中、それぞれのRN1が独立して、H、OH、NO2、N(RN2)2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、N−保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリール、シクロアルキル、アルクシクロアルキル(alkcycloalkyl)、ヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)、アルクヘテロシクリル(alkheterocyclyl)(例えば、アルクヘテロアリール(alkheteroaryl))であり、あるいは、2つのRN1が一緒になって、ヘテロシクリルまたはN−保護基を形成し、かつ、それぞれのRN2が独立して、H、アルキルまたはアリールである。好ましい実施形態において、アミノは−NH2または−NHRN1であり、但し、式中、RN1は独立して、OH、NO2、NH2、NRN22、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、アルキルまたはアリールであり、それぞれのRN2は、H、アルキルまたはアリールであり得る。用語「アミノアルキル」は、本明細書中で使用される場合、アミノ基(これは本明細書中で定義される通りである)によって置換されるアルキル基(これは本明細書中で定義される通りである)として記載されるヘテロアルキル基(これは本明細書中で定義される通りである)を表す。アルキルおよびアミノはそれぞれがさらに、それぞれの基について本明細書中に記載されるような1つ、2つ、3つまたは4つの置換基により置換され得る。例えば、アルキル部分はオキソ(=O)置換基を含む場合がある。

0104

本明細書中で使用される場合、用語「アリールオキシ」は、酸素原子を介して別の残基につながれる芳香族系またはヘテロ芳香族系を示す。O−アリールの典型的な一例がフェノキシである。同様に、「アリールアルキル」は、炭素鎖(飽和または不飽和)(そのヘテロ形態を含む)を介して、典型的には、飽和であるときにはC1〜C8の炭素鎖、C1〜C6の炭素鎖、または、より具体的にはC1〜C4の炭素鎖もしくはC1〜C3の炭素鎖(それらのヘテロ形態を含む)を介して、あるいは、不飽和であるときにはC2〜C8の炭素鎖、C2〜C6の炭素鎖、C2〜C4の炭素鎖またはC2〜C3の炭素鎖(それらのヘテロ形態を含む)を介して別の残基につながれる芳香族系またはヘテロ芳香族系を示す。より確かには、したがって、アリールアルキルには、上記において同様に定義されるようなアルキル成分、ヘテロアルキル成分、アルケニル成分、ヘテロアルケニル成分、アルキニル成分またはヘテロアルキニル成分につながれる上記で定義されるようなアリール基またはヘテロアリール基が含まれる。典型的なアリールアルキルには、アリール(C6〜C12)アルキル(C1〜C8)、アリール(C6〜C12)アルケニル(C2〜C8)またはアリール(C6〜C12)アルキニル(C2〜C8)、加えて、それらのヘテロ形態が挙げられるであろう。典型的な一例がフェニルメチルであり、これは一般にはベン
ジルと呼ばれる。

0105

芳香族基またはヘテロ芳香族基における、必要に応じた典型的な置換基には、ハロ、CN、NO2、CF3、OCF3、COOR’、CONR’2、OR’、SR’、SOR’、SO2R’、NR’2、NR’(CO)R’、NR’C(O)OR’、NR’C(O)NR’2、NR’SO2NR’2またはNR’SO2R’が独立して含まれ、但し、これらにおいて、それぞれのR’は独立して、H、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリールおよびアリール(これらのすべてが上記で定義される通りである)から選択される場合により置換された基である;あるいは、置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、O−アリール、O−ヘテロアリールおよびアリールアルキルから選択される場合により置換された基である。

0106

非芳香族基(例えば、アルキル基、アルケニル基およびアルキニル基)における必要に応じた置換基は典型的には、本明細書中において別途記されるような場合を除いて、芳香族基またはヘテロ芳香族基について好適である置換基の同じリストから選択される。非芳香族基にはまた、=Oおよび=NOR’(式中、R’は、H、または、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアリールおよびアリール(これらのすべてが上記で定義される通りである)から選択される場合により置換された基である)から選択される置換基が含まれる場合がある。

0107

一般に、置換基(例えば、アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール(上記で定義されるすべてのヘテロ形態を含む))は自身が場合により、さらなる置換基によって置換される場合がある。これらの置換基の性質は、上記の基本的構造における置換基に関して列挙される性質と類似している。したがって、ある置換基の1つの実施形態がアルキルである場合、このアルキルは場合により、置換が化学的意味をなし、かつ、置換がアルキル自体のサイズ限界を損なわない置換基として列記される残りの置換基によって置換される場合がある;例えば、アルキルによって、またはアルケニルによって置換されるアルキルは、これらの実施形態については炭素原子の上限を単に拡大するであろうと考えられ、含まれない。しかしながら、アリール、アミノおよびハロなどによって置換されるアルキルは含まれるであろう。例えば、基が置換される場合、当該基は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの置換基により置換される場合がある。必要に応じた置換基には、下記の基が含まれるが、それらに限定されない:C1〜C6アルキルまたはヘテロアリール、C2〜C6アルケニルまたはヘテロアルケニル、C2〜C6アルキニルまたはヘテロアルキニル、ハロゲン;アリール、ヘテロアリール、アジド(−N3)、ニトロ(−NO2)、シアノ(−CN)、アシルオキシ(−OC(=O)R’)、アシル(−C(=O)R’)、アルコキシ(−OR’)、アミド(−NR’C(=O)R’’または−C(=O)NRR’)、アミノ(−NRR’)、カルボン酸(−CO2H)、カルボン酸エステル(−CO2R’)、カルバモイル(−OC(=O)NR’R’’または−NRC(=O)OR’)、ヒドロキシ(−OH)、イソシアノ(−NC)、スルホナート(−S(=O)2OR)、スルホンアミド(−S(=O)2NRR’または−NRS(=O)2R’)またはスルホニル(−S(=O)2R)、但し、これらの式において、それぞれのRまたはR’は、H、C1〜C6アルキルまたはヘテロアリール、C2〜C6アルケニルまたはヘテロアルケニル、2C〜6Cアルキニルまたはヘテロアルキニル、アリールまたはヘテロアリールから独立して選択される。置換された基は、例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つまたは9つの置換基を有する場合がある。

0108

用語「ヘテロシクリル、複素環式またはHet」は、本明細書中で使用される場合、別途指定される場合を除き、窒素、酸素およびイオウからなる群から独立して選択される1
個、2個、3個または4個のヘテロ原子を含有する、例えば、3員環、4員環、5員環、6員環または7員環である環状のヘテロアルキルまたはヘテロアルケニルを表す。5員環は0〜2つの二重結合を有し、6員環および7員環は0〜3つの二重結合を有する。用語「ヘテロシクリル」はまた、1つまたは複数の炭素および/またはヘテロ原子が単環式環の2つの非隣接メンバーを架橋する架橋された多環式構造を有する複素環式化合物を表し、例えば、キヌクリニル基を表す。用語「ヘテロシクリル」には、上記複素環式環のいずれかが、1つ、2つまたは3つの炭素環式環(例えば、アリール環シクロヘキサン環シクロヘキセン環シクロペンタン環シクロペンテン環)または別の単環式の複素環式環(例えば、インドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリルおよびベンゾチエニルなど)に縮合する二環式基、三環式基および四環式基が含まれる。

0109

本発明の化合物の一部は1つまたは複数のステレオジェン中心を含む可能性があり、したがって、様々な異性形態で、例えば、立体異性体および/またはジアステレオマーで存在する可能性がある。したがって、本発明の化合物およびそれらの医薬組成物は、個々のエナンチオマー、ジアステレオマーまたは幾何異性体の形態である場合があり、あるいは、立体異性体の混合物の形態である場合がある。特定の実施形態において、本発明の化合物はエナンチオピュアな化合物である。特定の他の実施形態において、立体異性体またはジアステレオマーの混合物が提供される。そのうえ、本発明の化合物が互変異性形態で存在するとき、それぞれの互変異性体が本明細書中では包含される。

0110

さらに、特定の化合物が、本明細書中に記載されるように、別途示される場合を除き、Z異性体またはE異性体のどちらかとして存在し得る1つまたは複数の二重結合を有する場合がある。本発明はさらに、化合物を、他の異性体を実質的に含まない個々の異性体として、また、代替では、様々な異性体の混合物として、例えば、立体異性体のラセミ混合物として包含する。上述の化合物自体に加えて、本発明はまた、これらの化合物の医薬的に許容される誘導体、および、本発明の1つまたは複数の化合物と、1つまたは複数の医薬的に許容される賦形剤または添加剤とを含む組成物を包含する。

0111

処置方法
本明細書中に開示されるように、miR−1908、miR−199a−3p、miR−199a−5pおよびCTGFが、メラノーマにおいて転移性浸潤、内皮動員およびコロニー形成の内因性の転移促進因子として特定され、一方、DNAJA4、ApoE、LRP1、LRP8、LXRおよびmiR7が、同じプロセスの転移抑制因子または転移阻害剤として機能する。加えて、これらのmiRNAがApoEおよび熱ショック因子DNAJA4を収斂的に標的化することが見出された。ガンにより分泌されるApoEは、浸潤および内皮動員を、メラノーマ細胞のLRP1受容体および内皮細胞のLRP8受容体を活性化することによってそれぞれ抑制する。DNAJA4はその結果として、ApoE発現を誘導する。これらのmiRNAは、ヒトでの転移の結末が強く予測するものである。miR−199a−3p、miR−199a−5pおよびmiR−1908を標的化するロックド核酸(LNA)による前処置では、多数の器官への転移が阻害され、一方、これらのLNAの治療的送達では、マウスモデルにおけるヒトメラノーマ細胞の転移が著しく抑制される。

0112

したがって、本発明は、メラノーマを、転移抑制因子の1つの発現レベルまたは活性レベルを対象において増大させることを介して処置するための方法を提供する。この増大させることが、とりわけ、転移抑制因子であるDNAJA4、ApoE、LRP1およびLRP8の1つまたは複数の強制された発現によって、あるいは、miR−199a−3p、miR−199a−5pおよびmiR−1908の1つまたは複数の発現レベルまたは活性レベルを低下させることによって達成することができる。加えて、処置を、転移促進
因子の1つまたは複数の発現レベルまたは活性レベルを低下させることによって達成することができる。

0113

本発明はまた、血管形成性の障害または血管形成の障害を対象において処置するための方法を提供する。用語「血管形成性の障害」、用語「血管形成の障害」および用語「血管形成障害」は本明細書中では交換可能に使用され、病理学的な血管形成によって特徴づけられる障害を示す。病理学的な血管形成によって特徴づけられる障害は、正常でない血管形成または正常から外れた血管形成が単独で、または他との組合せで、当該障害の原因、開始または症状の一因となる障害を示す。この障害の例には、様々なガン(例えば、血管形成した腫瘍)、眼障害および炎症性障害など含まれる。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ