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技術 HBV感染に対する抗ウイルス剤としてのスルファモイルベンズアミド誘導体

出願人 バルークエス.ブルームバーグインスティテュートドレクセルユニバーシティ
発明者 グオ,ジュ-タオシュ,シャオドンブロック,ティモシー,エム.
出願日 2019年4月16日 (1年8ヶ月経過) 出願番号 2019-077562
公開日 2019年9月12日 (1年3ヶ月経過) 公開番号 2019-151639
状態 未査定
技術分野 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 フラン系化合物 5員環以上窒素含有飽和複素環式化合物 6員以上のNS含有複素環式化合物 ピリジン系化合物 化合物または医薬の治療活性 水添ピリジン系化合物 非環式または炭素環式化合物含有医薬 有機低分子化合物及びその製造
主要キーワード コアアセンブリ 関連科 引用箇所 粒子ゲル 物理的要因 浸透調節剤 不活性フィラー マイルストーン
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年9月12日)のものです。
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図面 (3)

課題

B型肝炎ウイルスHBV)感染の処置のための、HBVのプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤として有用な化合物の提供。

解決手段

下記式で示す、(R)−5−sec−ブチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロベンズアミドまたはその塩、(S)−5−sec−ブチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミドまたはその塩を含む、経口配合物錠剤カプセル口腔形態、トローチロゼンジ液体、懸濁液または溶液である、前記配合物。

概要

背景

発明の背景
B型肝炎ウィルスHBV)感染は、依然として主要な公衆衛生問題のままである。現在、世界中で推計3億5千万人の人々および米国内で140万人が、慢性的にHBVに感染している(McMahon, 2005)。処置せずに放置した場合、これらの個人の約3分の1が、肝硬変および肝細胞癌などの重篤肝疾患により死亡するであろう(Lee, 1997; Lok, 2004)。

慢性B型肝炎の管理のために7種の医薬品が現在入手可能であり、これはアルファインターフェロン標準品およびペグ型)の2種の配合物およびHBVDNAポリメラーゼ阻害する5種のヌクレオシ(チ)ド類似体(ラミブジンアデフォビルエンテカビルテルビブジン、およびテノフォビル)を含む(Keeffe et al., 2008)。現在において、好ましい第1選択療法の選択は、エンテカビル、テノフォビルまたはペグ−インターフェロンアルファ−2aである。しかしながら、第1選択療法オプションを用いても、ペグ−インターフェロン アルファ−2aは、処置された患者の3分の1にのみわずかな血清学的マイルストーンを達成するのに有効であり、重篤な副作用を頻繁に伴う(Janssen et al., 2005; Lau et al., 2005; Perrillo, 2009)。エンテカビルおよびテノフォビルは極めて強力なHBV阻害剤であるが、長期間または場合により生涯にわたる処置が、HBV複製を継続的に抑制するために要求され、これは薬剤抵抗性ウィルスの発生のために最終的に機能しなくなり得る(Dienstag, 2009)。ゆえに、国立アレルギー感染病研究所(NIAID)により最優先関心領域として列挙されている慢性B型肝炎の新規、安全かつ効果的な治療の導入についての差し迫った必要性がある。

HBVは、ヘパドナウイルス科に属する非細胞変性型、肝臓向性DNAウィルスである。プレゲノム(pg)RNAは、HBV DNAの逆転写複製のためのテンプレートであり、ウィルス性DNAポリメラーゼを伴うヌクレオカプシドへのそのカプシド形成は、引き続くウィルスDNA合成に必須である。プレゲノムRNA(pg)カプシド形成の阻害は、HBV複製を阻止し、HBVの処置への新規の治療手法を提供するであろう。

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臨床的に、プレゲノムRNA(pg)カプシド形成の阻害は以下の治療的利点を提供する:第1に、プレゲノムRNA(pg)カプシド形成の阻害は、現在の医薬に耐性がない、または現在の医薬から利益を享受しない患者の部分母集団のための追加の選択肢を提供することにより、現在の医薬を補完するであろう(Akbar et al., 2009; Liaw, 2009; Peters, 2009; Wiegand, van Bommel, およびBerg)。第2に、これらの特徴のある抗ウィルス機構に基づいて、プレゲノムRNA(pg)カプシド形成の阻害は、現在入手可能なDNAポリメラーゼ阻害剤に耐性のあるHBV変異体に対し有効であろう(ZoulimおよびLocarnini, 2009)。第3に、ヒト免疫不全ウイルスHIV)感染のための高活性抗レトロウイルス療法(HAART)のように(EsteおよびCihlar)、プレゲノムRNA(pg)カプシド形成の阻害剤のDNAポリメラーゼ阻害剤との併用治療は、HVB複製を相乗的に抑制し、薬剤耐性の発生を回避し、およびしたがって慢性B型肝炎感染のためのより安全かつより効果的な処置を提供するであろう。

B型肝炎ウィルスに感染した患者の治療において疾患修飾するのみならず有効である新規の抗ウィルス薬についての長年にわたる要求がある。また、薬剤耐性B型肝炎ウィルスに感染した患者の治療において疾患修飾するのみならず有効である新規の抗ウィルス薬についての明確かつ目下の要求がある。 本発明は、B型肝炎ウィルスに感染した患者の治療において疾患修飾するのみならず有効である新規の抗ウィルス薬についての要求を対処する。
発明の概要

概要

B型肝炎ウイルス(HBV)感染の処置のための、HBVのプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤として有用な化合物の提供。下記式で示す、(R)−5−sec−ブチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロベンズアミドまたはその塩、(S)−5−sec−ブチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミドまたはその塩を含む、経口配合物。錠剤カプセル口腔形態、トローチロゼンジ液体、懸濁液または溶液である、前記配合物。なし

目的

プレゲノムRNA(pg)カプシド形成の阻害は、HBV複製を阻止し、HBVの処置への新規の治療手法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
0件

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請求項1

B型肝炎ウィルスHBV)感染および関連疾患の処置のための方法であって、前記方法は、有効量の少なくとも1種の式(I):式中、R1は、水素であり;R2は、水素、メチルトリフルオロメチルフッ素および塩素からなる群から選択され;R3は、水素、メチル、フッ素および塩素からなる群から選択され;R4は、水素、フッ素、塩素およびメチルからなる群から選択され;R5は、水素および塩素からなる群から選択され;R7は、水素、塩素、フッ素および臭素からなる群から選択され;R9は、水素、メチル、フッ素および塩素からなる群から選択され;Rxは、NH2,からなる群から選択される;を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を対象に投与することを含む、前記方法。

請求項2

少なくとも1の化合物が、2−クロロ−5−スルファモイル−N−3−メチルフェニルベンズアミド;4−フルオロ−3−スルファモイル−N−(3−トリフルオロメチル−フェニル)−ベンズアミド;N−(2−クロロ−5−トリフルオロメチル−フェニル)−4−フルオロ−3−スルファモイル−ベンズアミド;N−フェニル−3−スルファモイル−ベンズアミド;5−sec−ブチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;3−ジエチルスルファモイル−N−フェニル−ベンズアミド;5−ジエチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;2−クロロ−5−ジエチルスルファモイル−N−m−トリル−ベンズアミド;N−(4−クロロ−フェニル)−3−ジエチルスルファモイル−ベンズアミド;5−アリルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−5−ジプロピルスルファモイル−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロヘプチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロヘプチルスルファモイル−2−フルオロ−N−p−トリル−ベンズアミド;5−シクロヘキシルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;2−ブロモ−5−シクロヘキシルスルファモイル−N−フェニル−ベンズアミド;4−クロロ−3−シクロヘキシルスルファモイル−N−(4−フルオロ−フェニル)−ベンズアミド;3−シクロヘキシルスルファモイル−4−メチル−N−フェニル−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−4−フルオロ−3−(2−メチル−シクロヘキシルスルファモイル)−ベンズアミド;3−シクロペンチルスルファモイル−N−フェニル−ベンズアミド;5−シクロペンチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロペンチルスルファモイル−2−フルオロ−N−(4−フルオロ−フェニル)−ベンズアミド;5−シクロペンチルスルファモイル−N−(3,5−ジメチルフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;3−シクロペンチルスルファモイル−4−フルオロ−N−3−メチルフェニル−ベンズアミド;5−シクロペンチルスルファモイル−N−(3,5−ジクロロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;3−[(フラン−2−イルメチル)−スルファモイル]−N−フェニル−ベンズアミド;N−(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)−5−[(フラン−2−イルメチル)−スルファモイル]−2−メチル-ベンズアミド;2−フルオロ−N−(3−フルオロ−フェニル)−5−[(フラン−2−イルメチル)−スルファモイル]−ベンズアミド;N−(3,5−ジクロロフェニル)−2−フルオロ−5−[(フラン−2−イルメチル)−スルファモイル]−ベンズアミド;4−フルオロ−3−[(フラン−2−イルメチル)−スルファモイル]−N−3−メチルフェニル−ベンズアミド;5−[(4−クロロ−3−フェニルカルバモイルベンゼンスルホニルアミノ)−メチル]−フラン−2−カルボン酸メチルエステル;N−(3−クロロ−フェニル)−5−(2−シクロヘキサ−1−エニルエチルスルファモイル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−(2−シクロヘキサ−1−エニル−エチルスルファモイル)−N−(3,5−ジメチルフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−(2−シクロヘキサ−1−エニル−エチルスルファモイル)−N−(3,5−ジメチルフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;N−(3−クロロ−フェニル)−4−フルオロ−3−[(ピリジン−3−イルメチル)−スルファモイル]−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−5−フェネチルスルファモイル−ベンズアミド;N−(3−クロロ−フェニル)−2−フルオロ−5−フェネチルスルファモイル−ベンズアミド;5−ベンジルスルファモイル−N−(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−ベンジルスルファモイル−2−クロロ−N−フェニル−ベンズアミド;N−(4−クロロ−フェニル)−5−[2−(3,4−ジメトキシ−フェニル)−エチルスルファモイル]−2−フルオロ-ベンズアミド;5−(2−クロロ−ベンジルスルファモイル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;3−(2−クロロ−ベンジルスルファモイル)−N−(4−クロロ−フェニル)−4−フルオロ−ベンズアミド;2−フルオロ−5−(4−メトキシフェニルスルファモイル)−N−3−メチルフェニル−ベンズアミド;2−フルオロ−5−(4−フルオロ−フェニルスルファモイル)−N−3−メチルフェニル−ベンズアミド;N−(4−クロロ−フェニル)−3−(3−フルオロ−フェニルスルファモイル)−ベンズアミド;N−(4−クロロ−フェニル)−3−2−メチルフェニルスルファモイル−ベンズアミド;N−フェニル−3−m−トリルスルファモイル−ベンズアミド;N−フェニル−3−o−トリルスルファモイル−ベンズアミド;3−(ベンジル−エチル−スルファモイル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−4−フルオロ−ベンズアミド;5−(アゼパン−1−スルホニル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;4−メチル−N−フェニル−3−(ピペリジン−1−スルホニル)−ベンズアミド;4−メチル−N−フェニル−3−(ピペリジン−1−スルホニル)−ベンズアミド;4−クロロ−N−(3−フルオロ−フェニル)−3−(モルホリン−4−スルホニル)−ベンズアミド;4−クロロ−N−フェニル−3−(チオモルホリン4−スルホニル)−ベンズアミド;5−sec−ブチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−ジエチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−アリルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−5−ジプロピルスルファモイル−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロヘプチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−(アゼパン−1−スルホニル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロヘキシルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロペンチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−5−フェネチルスルファモイル−ベンズアミド;5−(2−クロロ−ベンジルスルファモイル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;およびこれらの薬学的に許容可能な形態からなる群から選択される少なくとも1種の要素である、請求項1に記載の方法。

請求項3

少なくとも1種の化合物が、さらに少なくとも1種の賦形剤を含む組成物中で投与される、請求項1に記載の方法。

請求項4

少なくとも1種の化合物が、2−クロロ−5−スルファモイル−N−3−メチルフェニル−ベンズアミド;4−フルオロ−3−スルファモイル−N−(3−トリフルオロメチル−フェニル)−ベンズアミド;N−(2−クロロ−5−トリフルオロメチル−フェニル)−4−フルオロ−3−スルファモイル−ベンズアミド;N−フェニル−3−スルファモイル−ベンズアミド;5−sec−ブチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;3−ジエチルスルファモイル−N−フェニル−ベンズアミド;5−ジエチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;2−クロロ−5−ジエチルスルファモイル−N−m−トリル−ベンズアミド;N−(4−クロロ−フェニル)−3−ジエチルスルファモイル−ベンズアミド;5−アリルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−5−ジプロピルスルファモイル−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロヘプチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロヘプチルスルファモイル−2−フルオロ−N−p−トリル−ベンズアミド;5−シクロヘキシルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;2−ブロモ−5−シクロヘキシルスルファモイル−N−フェニル−ベンズアミド;4−クロロ−3−シクロヘキシルスルファモイル−N−(4−フルオロ−フェニル)−ベンズアミド;3−シクロヘキシルスルファモイル−4−メチル−N−フェニル−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−4−フルオロ−3−(2−メチル−シクロヘキシルスルファモイル)−ベンズアミド;3−シクロペンチルスルファモイル−N−フェニル−ベンズアミド;5−シクロペンチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロペンチルスルファモイル−2−フルオロ−N−(4−フルオロ−フェニル)−ベンズアミド;5−シクロペンチルスルファモイル−N−(3,5−ジメチルフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;3−シクロペンチルスルファモイル−4−フルオロ−N−3−メチルフェニル−ベンズアミド;5−シクロペンチルスルファモイル−N−(3,5−ジクロロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;3−[(フラン−2−イルメチル)−スルファモイル]−N−フェニル−ベンズアミド;N−(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)−5−[(フラン−2−イルメチル)−スルファモイル]−2−メチル−ベンズアミド;2−フルオロ−N−(3−フルオロ−フェニル)−5−[(フラン−2−イルメチル)−スルファモイル]−ベンズアミド;N−(3,5−ジクロロフェニル)−2−フルオロ−5−[(フラン−2−イルメチル)−スルファモイル]−ベンズアミド;4−フルオロ−3−[(フラン−2−イルメチル)−スルファモイル]−N−3−メチルフェニル−ベンズアミド;5−[(4−クロロ−3−フェニルカルバモイル−ベンゼンスルホニルアミノ)−メチル]−フラン−2−カルボン酸メチルエステル;N−(3−クロロ−フェニル)−5−(2−シクロヘキサ−1−エニル−エチルスルファモイル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−(2−シクロヘキサ−1−エニル−エチルスルファモイル)−N−(3,5−ジメチルフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−(2−シクロヘキサ−1−エニル−エチルスルファモイル)−N−(3,5−ジメチルフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;N−(3−クロロ−フェニル)−4−フルオロ−3−[(ピリジン−3−イルメチル)−スルファモイル]−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−5−フェネチルスルファモイル−ベンズアミド;N−(3−クロロ−フェニル)−2−フルオロ−5−フェネチルスルファモイル−ベンズアミド;5−ベンジルスルファモイル−N−(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−ベンジルスルファモイル−2−クロロ−N−フェニル−ベンズアミド;N−(4−クロロ−フェニル)−5−[2−(3,4−ジメトキシ−フェニル)−エチルスルファモイル]−2−フルオロ-ベンズアミド;5−(2−クロロ−ベンジルスルファモイル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;3−(2−クロロ−ベンジルスルファモイル)−N−(4−クロロ−フェニル)−4−フルオロ−ベンズアミド;2−フルオロ−5−(4−メトキシ−フェニルスルファモイル)−N−3−メチルフェニル−ベンズアミド;2−フルオロ−5−(4−フルオロ−フェニルスルファモイル)−N−3−メチルフェニル−ベンズアミド;N−(4−クロロ−フェニル)−3−(3−フルオロ−フェニルスルファモイル)−ベンズアミド;N−(4−クロロ−フェニル)−3−2−メチルフェニルスルファモイル−ベンズアミド;N−フェニル−3−m−トリルスルファモイル−ベンズアミド;N−フェニル−3−o−トリルスルファモイル−ベンズアミド;3−(ベンジル−エチル−スルファモイル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−4−フルオロ−ベンズアミド;5−(アゼパン−1−スルホニル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;4−メチル−N−フェニル−3−(ピペリジン−1−スルホニル)−ベンズアミド;4−メチル−N−フェニル−3−(ピペリジン−1−スルホニル)−ベンズアミド;4−クロロ−N−(3−フルオロ−フェニル)−3−(モルホリン−4−スルホニル)−ベンズアミド;4−クロロ−N−フェニル−3−(チオモルホリン4−スルホニル)−ベンズアミド;5−sec−ブチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−ジエチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−アリルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−5−ジプロピルスルファモイル−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロヘプチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−(アゼパン−1−スルホニル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロヘキシルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロペンチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−5−フェネチルスルファモイル−ベンズアミド;5−(2−クロロ−ベンジルスルファモイル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;およびこれらの薬学的に許容可能な形態からなる群から選択される少なくとも1種の要素である、請求項3に記載の方法。

請求項5

B型肝炎ウィルス(HBV)感染および関連疾患の処置のための方法であって、前記方法は、有効量の少なくとも1種の式(II):水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで:Rxは、からなる群から選択される;を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を対象に投与することを含む、前記方法。

請求項6

少なくとも1種の化合物が、5−sec−ブチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−ジエチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−アリルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−5−ジプロピルスルファモイル−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロヘプチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−(アゼパン−1−スルホニル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロヘキシルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロペンチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−5−フェネチルスルファモイル−ベンズアミド;5−(2−クロロ−ベンジルスルファモイル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;およびこれらの薬学的に許容可能な形態からなる群から選択される少なくとも1種の要素である、請求項5に記載の方法。

請求項7

少なくとも1種の化合物が、さらに少なくとも1種の賦形剤を含む組成物中で投与される、請求項5に記載の方法。

請求項8

少なくとも1種の化合物が、5−sec−ブチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−ジエチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−アリルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−5−ジプロピルスルファモイル−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロヘプチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−(アゼパン−1−スルホニル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロヘキシルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;5−シクロペンチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−5−フェネチルスルファモイル−ベンズアミド;5−(2−クロロ−ベンジルスルファモイル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド;およびこれらの薬学的に許容可能な形態からなる群から選択される少なくとも1種の要素である、請求項7に記載の方法。

請求項9

B型肝炎ウィルス(HBV)感染および関連疾患の処置のための方法であって、前記方法は、有効量の少なくとも1種の式(III):水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで:R10は、水素、メチル、塩素および臭素からなる群から選択され;Ryは、からなる群から選択される;を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を対象に投与することを含む、前記方法。

請求項10

少なくとも1種の化合物が、3−(アゼパン−1−スルホニル)−N−ベンジル−4−クロロ−ベンズアミド;N−ベンジル−4−クロロ−3−(ピペリジン−1−スルホニル)−ベンズアミド;N−ベンジル−4−メチル−3−(4−メチル−ピペリジン−1−スルホニル)−ベンズアミド;N−ベンジル−3−ベンジルスルファモイル−4−メチル−ベンズアミド;3−(3−ベンジルカルバモイル−ベンゼンスルホニルアミノ)−安息香酸;N−ベンジル−4−ブロモ−3−ジエチルスルファモイル−ベンズアミド;およびこれらの薬学的に許容可能な形態からなる群から選択される少なくとも1種の要素である、請求項9に記載の方法。

請求項11

少なくとも1種の化合物が、さらに少なくとも1種の賦形剤を含む組成物中で投与される、請求項9に記載の方法。

請求項12

少なくとも1種の化合物が、3−(アゼパン−1−スルホニル)−N−ベンジル−4−クロロ−ベンズアミド;N−ベンジル−4−クロロ−3−(ピペリジン−1−スルホニル)−ベンズアミド;N−ベンジル−4−メチル−3−(4−メチル−ピペリジン−1−スルホニル)−ベンズアミド;N−ベンジル−3−ベンジルスルファモイル−4−メチル−ベンズアミド;3−(3−ベンジルカルバモイル−ベンゼンスルホニルアミノ)−安息香酸;N−ベンジル−4−ブロモ−3−ジエチルスルファモイル−ベンズアミド;およびこれらの薬学的に許容可能な形態からなる群から選択される少なくとも1種の要素である、請求項11に記載の方法。

請求項13

B型肝炎ウィルス(HBV)感染および関連疾患の処置のための方法であって、前記方法は、有効量の少なくとも1種の式(IV):を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を対象に投与することを含む、前記方法。

請求項14

少なくとも1種の化合物が、さらに少なくとも1種の賦形剤を含む組成物中で投与される、請求項13に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2011年7月1日に出願された米国仮出願No.61/503830の利益を請求し、これは全範囲において参照として本明細書に組み込まれる。

0002

発明の分野
本発明は、プレゲノムRNAカプシド形成阻害剤として有益な、B型肝炎ウィルスHBV)感染および関連疾患の処置のために有用な化合物および方法を記載する。

背景技術

0003

発明の背景
B型肝炎ウィルス(HBV)感染は、依然として主要な公衆衛生問題のままである。現在、世界中で推計3億5千万人の人々および米国内で140万人が、慢性的にHBVに感染している(McMahon, 2005)。処置せずに放置した場合、これらの個人の約3分の1が、肝硬変および肝細胞癌などの重篤肝疾患により死亡するであろう(Lee, 1997; Lok, 2004)。

0004

慢性B型肝炎の管理のために7種の医薬品が現在入手可能であり、これはアルファインターフェロン標準品およびペグ型)の2種の配合物およびHBVDNAポリメラーゼ阻害する5種のヌクレオシ(チ)ド類似体(ラミブジンアデフォビルエンテカビルテルビブジン、およびテノフォビル)を含む(Keeffe et al., 2008)。現在において、好ましい第1選択療法の選択は、エンテカビル、テノフォビルまたはペグ−インターフェロンアルファ−2aである。しかしながら、第1選択療法オプションを用いても、ペグ−インターフェロン アルファ−2aは、処置された患者の3分の1にのみわずかな血清学的マイルストーンを達成するのに有効であり、重篤な副作用を頻繁に伴う(Janssen et al., 2005; Lau et al., 2005; Perrillo, 2009)。エンテカビルおよびテノフォビルは極めて強力なHBV阻害剤であるが、長期間または場合により生涯にわたる処置が、HBV複製を継続的に抑制するために要求され、これは薬剤抵抗性ウィルスの発生のために最終的に機能しなくなり得る(Dienstag, 2009)。ゆえに、国立アレルギー感染病研究所(NIAID)により最優先関心領域として列挙されている慢性B型肝炎の新規、安全かつ効果的な治療の導入についての差し迫った必要性がある。

0005

HBVは、ヘパドナウイルス科に属する非細胞変性型、肝臓向性DNAウィルスである。プレゲノム(pg)RNAは、HBV DNAの逆転写複製のためのテンプレートであり、ウィルス性DNAポリメラーゼを伴うヌクレオカプシドへのそのカプシド形成は、引き続くウィルスDNA合成に必須である。プレゲノムRNA(pg)カプシド形成の阻害は、HBV複製を阻止し、HBVの処置への新規の治療手法を提供するであろう。

0006

.
臨床的に、プレゲノムRNA(pg)カプシド形成の阻害は以下の治療的利点を提供する:第1に、プレゲノムRNA(pg)カプシド形成の阻害は、現在の医薬に耐性がない、または現在の医薬から利益を享受しない患者の部分母集団のための追加の選択肢を提供することにより、現在の医薬を補完するであろう(Akbar et al., 2009; Liaw, 2009; Peters, 2009; Wiegand, van Bommel, およびBerg)。第2に、これらの特徴のある抗ウィルス機構に基づいて、プレゲノムRNA(pg)カプシド形成の阻害は、現在入手可能なDNAポリメラーゼ阻害剤に耐性のあるHBV変異体に対し有効であろう(ZoulimおよびLocarnini, 2009)。第3に、ヒト免疫不全ウイルスHIV)感染のための高活性抗レトロウイルス療法(HAART)のように(EsteおよびCihlar)、プレゲノムRNA(pg)カプシド形成の阻害剤のDNAポリメラーゼ阻害剤との併用治療は、HVB複製を相乗的に抑制し、薬剤耐性の発生を回避し、およびしたがって慢性B型肝炎感染のためのより安全かつより効果的な処置を提供するであろう。

0007

B型肝炎ウィルスに感染した患者の治療において疾患修飾するのみならず有効である新規の抗ウィルス薬についての長年にわたる要求がある。また、薬剤耐性B型肝炎ウィルスに感染した患者の治療において疾患修飾するのみならず有効である新規の抗ウィルス薬についての明確かつ目下の要求がある。 本発明は、B型肝炎ウィルスに感染した患者の治療において疾患修飾するのみならず有効である新規の抗ウィルス薬についての要求を対処する。
発明の概要

0008

本発明は、B型肝炎ウィルス(HBV)感染および関連疾患の処置のためのHBVのプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤として有用な式(I)で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法に向けられる。



水和物、溶媒和物薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで:
R1は、水素である;
R2は、水素、メチルトリフルオロメチルフッ素および塩素からなる群から選択される;
R3は、水素、メチル、フッ素および塩素からなる群から選択される;
R4は、水素、フッ素、塩素およびメチルからなる群から選択される;
R5は、水素および塩素からなる群から選択される;
R7は、水素、塩素、フッ素および臭素からなる群から選択される;
R9は、水素、メチル、フッ素および塩素からなる群から選択される;
Rxは、NH2,



からなる群から選択される;

0009

本発明は、B型肝炎ウィルス(HBV)感染および関連疾患の処置のためのHBVのプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤として有用な式(II)で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法にさらに向けられる。



水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで:
Rxは、



からなる群から選択される;

0010

本発明は、B型肝炎ウィルス(HBV)感染および関連疾患の処置のためのHBVのプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤として有用な式(III)で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法にさらに向けられる。



水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで:
R10は、水素、メチル、塩素および臭素からなる群から選択される;
Ryは、



からなる群から選択される;

0011

本発明は、B型肝炎ウィルス(HBV)感染および関連疾患の処置のためのHBVのプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤として有用な式(IV)で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法にさらに向けられる。



水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含む。

0012

本発明は、さらに、有効量の1種または2種以上の本発明にかかる化合物および賦形剤を含む組成物に関する。

0013

本発明は、また、例えばHBV感染を含むプレゲノムRNAカプシド形成を伴う疾患を処置または予防するための方法に関し、ここで、前記方法は、有効量の本発明にかかる化合物または組成物を対象に投与することを含む。

0014

本発明は、さらにまた、例えばHBV感染を含むプレゲノムRNAカプシド形成を伴う疾患を処置または予防するための方法に関し、ここで、前記方法は、有効量の1種または2種以上の本発明にかかる化合物および賦形剤を含む組成物を対象に投与することを含む。

0015

本発明は、また、HBV感染と関連する疾病または疾患およびプレゲノムRNAカプシド形成と関連する疾病を処置または予防するための方法に関する。ここで、前記方法は、有効量の本発明にかかる化合物または組成物を対象に投与することを含む。

0016

本発明は、また、HBV感染と関連する疾病または疾患およびプレゲノムRNAカプシド形成と関連する疾病を処置または予防するための方法に関し、ここで、前記方法は、有効量の1種または2種以上の本発明にかかる化合物および賦形剤を含む組成物を対象に投与することを含む。

0017

これらおよび他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲の解釈から当業者に明らかとなるであろう。本明細書中における全ての百分率比率および割合は、他に規定されない限り、重量による。全ての温度は、他に規定されない限り、セ氏温度においてである。引用された全ての文献は、関連する部分において、参照により本明細書中に組み込まれ、どの文献の引用箇所も、本発明についての従来技術であるとの自白として解釈されるものではない。

図面の簡単な説明

0018

図面の簡単な説明
図1:HepDES19細胞におけるHBVDNA複製についての本発明の選択された化合物の効果。HepDES19細胞を、未処理のままにした(対照)または6日間、示された濃度の本開示の化合物で処理した。細胞内のヌクレオカプシド関連HBV DNAを抽出し、電気泳動法により1.5%アガロースゲル中で分離させ、サザンブロットハイブリダイゼーションにより測定した。略語:rcDNA弛緩環状DNAdslDNA:線状二本鎖DNA;ssDNA:単鎖DNA

0019

図2:ラミブジンおよびBay 41−4109とのDVR−23の抗ウィルス活性の比較。HepDES19細胞を、未処理のままにした(NT)または4日間、示された濃度(μM)のDVR−23、ラミブジンまたはBay 41−4109で処理した。細胞質核関連HBVDNA複製中間体を抽出し、サザンブロットハイブリダイゼーションにより測定した。RC、LおよびSSは、それぞれ、弛緩型環状、線状二本鎖および単鎖HBV DNAを示す。

0020

図3:本発明の化合物の抗ウィルス機構。AML12HBV10細胞を未処理のままにした(NT)または2日間、示された濃度の開示の化合物DVR−1、DVR−56およびDVR−23で、それぞれ、処理した。Bay−4109(5μM)またはAT−61(25μM)を、陽性対照として供した。(A)細胞内ウィルスRNAをノーザンブロットハイブリダイゼイションにより測定した。(B)ヌクレオカプシドの合計量を粒子ゲルアッセイにより測定した。(C)カプシド化されたpgRNAを抽出し、ノーザンブロットにより計測した。(D)膜上でのヌクレオカプシドのアルカリ処理、続いての粒子ゲルアッセイおよびHBV−特異的リボプローブを用いてハイブリダイズすることにより、ヌクレオカプシド関連HBV DNAを定量した。(E)HBVDNA複製中間体を抽出し、サザンブロットハイブリダイゼーションにより測定した。発明の詳細な説明

0021

本発明のプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤は、プレゲノムRNAカプシド形成、例えばHBV感染に関連する疾病を処置および予防することが可能である。プレゲノム(pg)RNAは、HBV DNAの逆転写複製のためのテンプレートであり、ウィルス性DNAポリメラーゼを伴うヌクレオカプシドへのそのカプシド形成は、引き続くウィルスDNA合成に必須である。理論により限定されることを望むことなく、プレゲノムRNAカプシド形成の阻害は、プレゲノムRNAカプシド形成、例えばHBV感染に関連する疾病を改善する、緩和するまたはさもなければ制御できるようにすることができると信じられている。本発明のプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤は、現在の臨床用途におけるHBV抗ウィルス薬から化学的におよび機構的に区別されるHBV感染の処置のための新規かつ安全な抗ウィルス剤を特定する明確かつ満たされていない要求に対処する。

0022

臨床的に、本発明のプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤は、現在の医薬に耐性がない、または現在の医薬から利益を享受しない患者の部分母集団のための追加の選択肢を提供することにより、現在の医薬を補完する (Akbar et al., 2009; Liaw, 2009; Peters, 2009; Wiegand, van Bommel, およびBerg)。加えて、本発明のプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤は、現在入手可能なDNAポリメラーゼ阻害剤に耐性のあるHBV変異体に対し有効であるかもしれない(Zoulim and Locarnini, 2009)。さらに、本発明のプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤のDNAポリメラーゼ阻害剤との併用治療は、HVB複製を相乗的に抑制し、薬剤耐性の発生を回避し得、慢性B型肝炎感染のためのより安全かつより効果的な処置を提供する(Billioud et al., 2011)。

0023

本明細書を通じて、組成物が特定の成分(component)を有する(having)、含む(including)または含む(comprising)ものとして記載される場合、またはプロセスが具体的なプロセスステップを有する(having)、含む(including)または含む(comprising)ものとして記載される場合、本教示の組成物はまた、列挙された成分から本質的になる(consist essentially of)またはからなり(consist of)、プロセスは、列挙されたプロセスステップから本質的になる(consist essentially of)またはからなる(consist of)ことが期待される。

0024

本願において、要素(element)または成分が含まれるおよび/または列挙された要素もしくは成分から選択されるといわれている場合、要素または成分は、列挙された要素または成分のいずれか1つであり得、2または3以上の列挙された要素または成分からなる群から選択され得ると理解されるべきである。

0025

本明細書において、単数形の使用は、他に規定されない限り、複数形を包含する(逆の場合も同じ)。加えて、用語「約」の使用が定量値の前である場合、本教示は、また、他に具体的に規定されない限り、特定の定量値そのものを含む。

0026

ステップの順序またはある動作を行うための順序は、本教示が使用可能である限り重要でないと理解されるべきである。さらに、2または3以上のステップまたは動作は、同時に実施され得る。

0027

本明細書において、用語「ハロゲン」は、塩素、臭素、フッ素およびヨウ素を意味するものとする。

0028

本明細書において、他に断りのない限り、単独で用いられても置換基の部分として用いられても、「アルキル」および/または「脂肪族」は、1〜20個の炭素原子またはこの範囲内の任意の数、例えば1〜6個の炭素原子または1〜4個の炭素原子を有する直鎖または分岐炭素鎖をいう。炭素原子の指定された数(例えば、C1〜6)は、独立してアルキル部位におけるまたはより大きなアルキル含有置換基への炭素原子の数をいう。アルキル基の非限定の例は、メチル、エチル、n−プロピル、iso−プロピル、n−ブチル、sec−ブチル、iso−ブチル、tert−ブチルなどを含む。アルキル基は、任意に置換され得る。置換されたアルキル基の非限定の例は、ヒドロキシメチルクロロメチル、トリフルオロメチル、アミノメチル、1−クロロエチル、2−ヒドロキシエチル、1,2−ジフルオロエチル、3−カルボキシプロピルなどを含む。(C1〜6アルキル)2アミノなどの複数のアルキル基を有する置換基において、アルキル基は同一であっても異なっていてもよい。

0029

本明細書において、単独で用いられても置換基の部分として用いられても、「アルケニル」および「アルキニル」基は、2または3個以上の、好ましくは2〜20個の炭素原子を有する直鎖または分岐炭素鎖をいい、ここでアルケニル鎖は鎖中に少なくとも1個の2重結合を有し、およびアルキニル鎖は鎖中に少なくとも1個の3重結合を有する。アルケニルおよびアルキニル基は、任意に置換され得る。アルケニル基の非限定の例は、エテニル、3−プロペニル、1−プロペニル(また2−メチルエテニル)、イソプロペニル(また2−メチルエテン−2−イル)、ブテン−4−イルなどを含む。置換されたアルケニル基の非限定の例は、2−クロロエテニル(また2−クロロビニル)、4−ヒドロキシブテン−1−イル、7−ヒドロキシ−7−メチルオクタ−4−エン−2−イル、7−ヒドロキシ−7−メチルオクタ−3,5−ジエン−2−イルなどを含む。アルキニル基の非限定の例は、エチニルプロパ−2−イニル(またプロパルギル)、プロピン−1−イルおよび2−メチル−ヘキサ−4−イン−1−イルを含む。置換されたアルキニル基の非限定の例は、5−ヒドロキシ−5−メチルヘキサ−3−イニル、6−ヒドロキシ−6−メチルヘプタ−3−イン−2−イル、5−ヒドロキシ−5−エチルヘプタ−3−イニルなどを含む。

0030

本明細書において、単独で用いられても置換基の部分として用いられても、「シクロアルキル」は、例えば3〜14個の環炭素原子、好ましくは3〜7個もしくは3〜6個の環炭素原子または3〜4個の環炭素原子を有する環化アルキル、アルケニルおよびアルキニル基を含む非芳香族炭素含有環をいい、任意に1または2個以上(例えば、1、2、または3個)の2重または3重結合を含有する。シクロアルキル基は、単環式(例えばシクロヘキシル)または多環式(例えば縮合架橋および/またスピロ環系を含有する)であり得、炭素原子は環系の内部または外部に配置される。シクロアルキルのいずれの適切な環の位置も、定義される化学構造共有的に結合され得る。シクロアルキル環は、任意に置換され得る。シクロアルキル基の非限定の例は:シクロプロピル、2−メチル−シクロプロピル、シクロプロペニル、シクロブチル、2,3−ジヒドロキシシクロブチル、シクロブテニルシクロペンチルシクロペンテニルシクロペンタジエニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニルシクロヘプチル、シクロオクタニル、デカリニル、2,5−ジメチルシクロペンチル、3,5−ジクロロシクロヘキシル、4−ヒドロキシシクロヘキシル、3,3,5−トリメチルシクロヘキサ−1−イル、オクタヒドロペンタレニル、オクタヒドロ−1H−インデニル、3a,4,5,6,7,7a−ヘキサヒドロ−3H−インデン−4−イル、デカヒドロアズレニルビシクロ[6.2.0]デカニル、デカヒドロナフタレニル、およびドデカヒドロ−1H−フルオレニルを含む。用語「シクロアルキル」はまた、2環式炭化水素環である炭素環を含み、この非限定的な例は、ビシクロ−[2.1.1]ヘキサニル、ビシクロ[2.2.1]ヘプタニル、ビシクロ[3.1.1]ヘプタニル、1,3−ジメチル[2.2.1]ヘプタン−2−イル、ビシクロ[2.2.2]オクタニルおよびビシクロ[3.3.3]ウンデカニルを含む。

0031

ハロアルキル」は、特定数の炭素原子を有し、1または2個以上のハロゲンで置換された分岐または直鎖の両方の飽和脂肪族炭化水素基をいう。ハロアルキル基は、パーハロアルキル基を含み、ここで、アルキル基の全ての水素はハロゲンにより置換されている(例えば、−CF3、−CF2CF3)。ハロアルキル基はハロゲンに加えて1または2個以上の置換基により任意に置換され得る。ハロアルキルの例は、これに限定されないが、フルオロメチル、ジクロロエチル、トリフルオロメチル、トリクロロメチルペンタフルオロエチル、およびペンタクロロエチル基を含む。

0032

用語「アルコキシ」は、基−O−アルキルをいい、ここで、アルキル基は上に定義した通りである。アルコキシ基は、任意に置換されてもよい。用語「C3−C6環状アルコキシ」は3〜6個の炭素原子および少なくとも1個の酸素原子を含有する環をいう(例えば、テトラヒドロフランテトラヒドロ−2H−ピラン)。C3〜C6環状アルコキシ基は任意に置換されてもよい。

0033

単独で用いられても他の基の部分として用いられても、用語「アリール」は本明細書において6炭素員の不飽和芳香族単環式環としてまたは10〜14炭素員の不飽和芳香族多環式環と定義される。アリール環は、例えば、1または2個以上の水素原子を置換可能な1または2以上の部分によりそれぞれ任意に置換されたフェニルまたはナフチル環であり得る。アリール基の非限定の例は:フェニル、ナフチレン−1−イル、ナフチレン−2−イル、4−フルオロフェニル、2−ヒドロキシフェニル、3−メチルフェニル、2−アミノ−4−フルオロフェニル、2−(N,N−ジエチルアミノ)フェニル、2−シアノフェニル、2,6−ジ−tert−ブチルフェニル、3−メトキシフェニル、8−ヒドロキシナフチレン−2−イル、4,5−ジメトキシナフチレン−1−イル、および6−シアノ−ナフチレン−1−イルを含む。アリール基はまた、例えば、1また2以上の飽和または部分飽和の炭素環(例えば、ビシクロ[4.2.0]オクタ−1,3,5−トリエニル、インダニル)と縮合したフェニルまたはナフチル環を含み、これは、芳香族および/または飽和もしくは部分飽和の環の1または2個以上の炭素原子において置換し得る。

0034

用語「アリールアルキル」または「アラルキル」は、基−アルキル−アリールをいい、ここで、アルキルおよびアリール基は、本明細書において定義した通りである。本発明のアラルキル基は、任意に置換されている。アリールアルキル基の例は、例えば、ベンジル、1−フェニルエチル、2−フェニルエチル、3−フェニルプロピル、2−フェニルプロピル、フルオレニルメチルなどを含む。

0035

単独で用いられても他の基の部分として用いられても、「複素環の(heterocyclic)」および/または「複素環(heterocycle)」および/または「ヘテロシクリル(heterocylyl)」は、本明細書において3〜20原子を有する1または2以上の環、ここで、少なくとも1個の環中の1個の原子が窒素(N)、酸素(O)または硫黄(S)から選択されるヘテロ原子であり、かつ、ここでさらにヘテロ原子を含む環が非芳香族である、として定義される。2または3以上の縮合環を含む複素環基において、環を持つ非ヘテロ原子は、アリール(例えばインドリニル、テトラヒドロキノリニルクロマニル)であってもよい。例となる複素環基は、その1〜5個が独立して窒素(N)、酸素(O)または硫黄(S)から選択されるヘテロ原子である3〜14個の環原子を有する。複素環基中の1または2個以上のNまたはS原子は、酸化され得る。複素環基は、任意に置換され得る。

0036

1個の環を有する複素環単位の非限定の例は:ジアジリニル、アジリジニル、ウラリルアゼチジニルピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニルイソオキサゾリニルイソオキサゾリルチアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリニル、オキサチアゾリジノニル、オキサゾリジノニル、ヒダトイニル、テトラヒドロフラニルピロリジニルモルホリニルピペラジニルピペリジニルジヒドロラニル、テトラヒドロピラニルピペリジン−2−オニルバレロラクタム)、2,3,4,5−テトラヒドロ−1H−アゼピニル、2,3−ジヒドロ−1H−インドール、および1,2,3,4−テトラヒドロ−キノリンを含む。2または3以上の環を有する複素環単位の非限定の例は、ヘキサヒドロ−1H−ピロリジニル、3a,4,5,6,7,7a−ヘキサヒドロ−1H−ベンゾ[d]イミダゾリル、3a,4,5,6,7,7a−ヘキサヒドロ−1H−インドリル、1,2,3,4−テトラヒドロキノリニル、クロマニル、イソクロマニル、インドリニル、イソインドリニルおよびデカヒドロ−1H−シクロオクタ[b]ピロリルを含む。

0037

単独で用いられても他の基の部分として用いられても、用語「ヘテロアリール」は、本明細書において5〜20原子を有する1または2以上の環、ここで、少なくとも1個の環中の1個の原子が窒素(N)、酸素(O)または硫黄(S)から選択されるヘテロ原子であり、かつ、ここでさらにヘテロ原子を含む環が芳香族である、として定義される。2または3以上の縮合環を含むヘテロアリール基において、環を持つ非ヘテロ原子は、炭素環(例えば、6,7−ジヒドロ−5H−シクロペンタピリミジンまたはアリール(例えばベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリニル)であってもよい。例となるヘテロアリール基は、5〜14個の環原子を有し、1〜5個の独立して窒素(N)、酸素(O)または硫黄(S)から選択されるヘテロ原子を含有する。ヘテロアリール基中の1または2個以上のNまたはS原子は、酸化され得る。ヘテロアリール基は、任意に置換され得る。1個の環を有するヘテロアリール環の非限定の例は:1,2,3,4−テトラゾリル、[1,2,3]トリアゾリル、[1,2,4]トリアゾリル、トリアジニルチアゾリル、1H−イミダゾリル、オキサゾリル、フラニル、チオフェンイル、ピリミジニル、2−フェニルピリミジニル、ピリジニル、3−メチルピリジニルおよび4−ジメチルアミノピリジニルを含む。2または3以上の縮合環を含むヘテロアリール環の非限定の例は:ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリルベンズチアゾリル、ベンズトリアゾリル、シンノリニル、ナフチリジニル、フェナントリジニル、7H−プリニル、9H−プリニル、6−アミノ−9H−プリニル、5H−ピロロ[3,2−d]ピリミジニル、7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジニル、ピリド[2,3−d]ピリミジニル、2−フェニルベンゾ[d]チアゾリル、1H−インドリル、4,5,6,7−テトラヒドロ−1−H−インドリル、キノキサリニル、5−メチルキノキサリニル、キナゾリニル、キノリニル、8−ヒドロキシ-キノリニルおよびイソキノリニルを含む。

0038

上述したヘテロアリール基の1つの非限定例は、1〜5個の炭素環原子および独立して窒素(N)、酸素(O)または硫黄(S)から選択されるヘテロ原子である少なくとも1個の環原子(好ましくは1〜4個のヘテロ原子である環原子)を有するC1〜C5ヘテロアリールである。C1〜C5ヘテロアリールの例は、これに限定されないが、トリアジニル、チアゾール−2−イル、チアゾール−4−イル、イミダゾール−1−イル、1H−イミダゾール−2−イル、1H−イミダゾール−4−イル、イソオキサゾリン−5−イル、フラン−2−イル、フラン−3−イル、チオフェン−2−イル、チオフェン−4−イル、ピリミジン−2−イル、ピリミジン−4−イル、ピリミジン−5−イル、ピリジン−2−イル、ピリジン−3−イル、およびピリジン−4−イルを含む。

0039

他に断りのない限り、2個の置換基が一緒に用いられて特定数の環原子を有する環を形成する(例えば、R2およびR3が窒素(N)と一緒に用いられてこれらが結合して3〜7環員を有する環を形成する)場合、環は、炭素原子および任意に独立して窒素(N)、酸素(O)または硫黄(S)から選択される1または2個以上(例えば1〜3個)の追加のヘテロ原子を有し得る。環は、飽和しているか部分的に飽和し得、任意に置換され得る。

0040

本発明の目的のために、1個のヘテロ原子を含む縮合環単位のみならずスピロ環状環、二環状環などは、ヘテロ原子含有環に対応する環ファミリーに属すると考えられる。例えば、以下の式:



を有する1,2,3,4−テトラヒドロキノリンは、本発明の目的のために、複素環単位と考えられる。以下の式:



を有する6,7−ジヒドロ−5H−シクロペンタピリミジンは、本発明の目的のために、ヘテロアリール単位と考えられる。縮合環単位がヘテロ原子を飽和およびアリール環の両方の中に含有する場合、アリール環は、優位であり、環が割り当てられるカテゴリーの種類を決定するであろう。例えば、以下の式:



を有する1,2,3,4−テトラヒドロ−[1,8]ナフチリジンは、本発明の目的のために、ヘテロアリール単位と考えられる。

0041

置換基名において用語またはこれらの接頭辞、語基のいずれかが現れた場合いつでも、当該名前は本明細書において提供されたこれらの限定を含むものと解釈される。例えば、用語「アルキル」もしくは「アリール」またはこれらの接頭辞、語基のいずれかが置換基の名前(例えば、アリールアルキル、アルキルアミノ)中に現れた場合いつでも、名前は、「アルキル」または「アリール」について上で与えられたこれらの限定を含むものとして解釈される。

0042

用語「置換された」は、本明細書を通じて用いられる。用語「置換された」は、本明細書において、非環式であれ環式であれ、1または2個以上の水素原子が本明細書において定義された1個の置換基またはいくつか(例えば1〜10)の置換基で置き換えられた部分をいう。置換基は、1個の部分にある1または2個の水素原子を同時に置き換えることができる。加えて、これらの置換基は2個の隣接する炭素上の2個の水素原子を置き換えて前記置換基、新規な部分または単位を形成することができる。例えば、1個の水素原子の置き換えを必要とする置換された単位は、ハロゲン、ヒドロキシルなどを含む。2個の水素原子の置き換えは、カルボニルオキシイミノなどを含む。隣接する炭素原子からの2個の水素原子の置き換えは、エポキシなどを含む。用語「置換された」は、置換基によって置き換えられた1または2個以上の水素原子を有する部分を示すために、本明細書を通じて用いられる。部分が「置換された」と記載された場合、任意の数の水素原子が置き換えられてもよい。例えば、ジフルオロメチルは置換されたC1アルキルであり;トリフルオロメチルは置換されたC1アルキルであり;4−ヒドロキシフェニルは、置換された芳香環であり;(N,N−ジメチル−5−アミノ)オクタニルは置換されたC8アルキルであり;3−グアニジノプロピルは置換されたC3アルキルであり;および2−カルボキシピリジニルは置換されたヘテロアリールである。

0043

例えば本明細書において定義されるアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アリール、複素環およびヘテロアリール基などの本明細書において定義される可変の基は、任意に置換され得る。任意に置換された基は、このようにして示されるであろう。

0044

本発明の目的のために、用語「化合物」、「類似体」および「物質の組成物」は、十分に等しく本明細書中で記載される全てのエナンチオマー形態、ジアステレオマー形態、塩などを含むプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤を表し、用語「化合物」、「類似体」および「物質の組成物」は、本明細書を通して互換的に用いられる。

0045

本明細書中に記載される化合物は、不斉原子(またキラル中心ともいう)を含み得、化合物の幾つかは1または2個以上の不斉原子または中心を含み得、これはしたがって光学異性体(エナンチオマー)およびジアステレオマーを生じさせる。本明細書中において記載される本教示および化合物はこのようなエナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびにラセミ体および分割された鏡像異性的に純粋なRおよびS立体異性体、ならびにこれらの薬学的に許容可能な塩を含む。光学異性体を、当業者に知られた標準的な手順により純粋な形態で得ることができ、これは限定されることなくジアステレオマー塩形成、速度論的分割および不斉合成を含む。本教示はまた、アルケニル部位(例えば、アルケンおよびイミン)を含む化合物のシスおよびトランス異性体を包含する。本教示が全ての可能な位置異性体およびこの混合物を包含することはまた理解され、これは当業者に知られ、限定されることなくカラムクロマトグラフィー薄層クロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーを含む標準的な分離手順により純粋な形態で得ることができる。

0046

酸性部分を有し得る本教示の化合物の薬学的に許容可能な塩は、有機および無機塩基を用いて形成され得る。脱プロトン化利用可能な酸性水素の数に応じてモノおよびポリアニオン性塩の両方が考えられる。塩基と形成する適切な塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩などの金属塩、例えばナトリウムカリウムまたはマグネシウム塩モルホリンチオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ−、ジ−もしくはトリ−低級アルキルアミン(例えば、エチル−tert−ブチル−、ジエチル−、ジイソプロピル−、トリエチル−、トリブチル−またはジメチルプロピルアミン)またはモノ−、ジ−もしくはトリヒドロキシ低級アルキルアミン(例えば、モノ−、ジ−またはトリエタノールアミン)と形成したものなどのアンモニア塩および有機アミン塩を含む。無機塩基の具体的な非限定の例は、NaHCO3、Na2CO3、KHCO3、K2CO3、Cs2CO3、LiOH、NaOH、KOH、NaH2PO4、Na2HPO4およびNa3PO4を含む。分子内塩もまた形成し得る。同様に、本明細書中において開示される化合物が塩基部分を含む場合、塩は有機または無機酸を用いて形成し得る。例えば、塩は、以下の酸から形成し得る:酢酸プロピオン酸乳酸ベンゼンスルホン酸安息香酸カンファースルホン酸クエン酸酒石酸コハク酸ジクロロ酢酸エタンスルホン酸ギ酸フマル酸グルコン酸グルタミン酸馬尿酸臭化水素酸塩酸イセチオン酸、乳酸、マレイン酸リンゴ酸マロン酸マンデル酸メタンスルホン酸粘液酸ナフタレンスルホン酸硝酸シュウ酸、パモン酸、パントテン酸リン酸フタル酸、プロピオン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、トルエンスルホン酸およびカンファースルホン酸ならびに他の既知の薬学的に許容可能な酸。

0047

本明細書において用語「処置する(treat)」および「処置すること(treating)」および「処置(treatment)」は、患者が患っていると疑われる疾患を部分的にまたは完全に緩和する、阻害する、改善するおよび/または軽減することをいう。

0048

本明細書において「治療効果のある(therapeutically effective)」および「有効量(effective dose)」は、所望する生化学的活性または効果を生じさせる物質または量をいう。

0049

言及される場合を除き、用語「対象」または「患者」は、互換的に用いられ、ヒト患者および非ヒト霊長類などの哺乳動物ならびにウサギラットハツカネズミおよび他の動物などの実験動物をいう。したがって、本明細書において用語「対象」または「患者」は、本発明の化合物を投与可能な任意の哺乳動物の患者または対象を意味する。本発明の例となる態様において、本発明の方法にかかる処置のための対象患者を特定するために、一般に認められたスクリーニング方法が用いられて目標とされるもしくは疑われる疾病もしくは疾患に関連する危険因子を決定するまたは対象中の存在する疾病もしくは疾患の状況を決定する。これらのスクリーニング方法は、例えば、目標とされるもしくは疑われる疾病もしくは疾患に関連し得る危険因子を決定する従来の精密検査を含む。これらおよび他のルーチンの方法は臨床医に本発明の方法および化合物を用いて治療を必要とする患者を選択することを許容する。

プレゲノムRNAカプシド形成阻害剤

0050

B型肝炎ウィルス(HBV)感染および関連疾患の処置のために有用な本発明のプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤は式(I)を有するスルファモイルベンズアミド誘導体であり、全てのエナンチオマーおよびジアステレオマー形態ならびにこれらの薬学的に許容可能な塩を含む;



水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで:
R1は、水素である;
R2は、水素、メチル、トリフルオロメチル、フッ素および塩素からなる群から選択される;
R3は、水素、メチル、フッ素および塩素からなる群から選択される;
R4は、水素、フッ素、塩素およびメチルからなる群から選択される;
R5は、水素および塩素からなる群から選択される;
R7は、水素、塩素、フッ素および臭素からなる群から選択される;
R9は、水素、メチル、フッ素および塩素からなる群から選択される;
Rxは、NH2,



からなる群から選択される;

0051

本発明は、B型肝炎ウィルス(HBV)感染および関連疾患の処置のためのプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤として有用な式(II)で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法にさらに向けられる。



水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで:
Rxは、



からなる群から選択される;

0052

本発明は、B型肝炎ウィルス(HBV)感染および関連疾患の処置のためのプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤として有用な式(III)で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法にさらに向けられる。



水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含み、ここで:
R10は、水素、メチル、塩素および臭素からなる群から選択される;
Ryは、



からなる群から選択される;

0053

本発明は、B型肝炎ウィルス(HBV)感染および関連疾患の処置のためのプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤として有用な式(IV)で表されるスルファモイルベンズアミド誘導体の使用の新規な方法にさらに向けられる。



水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩、プロドラッグおよびこれらの複合体を含む。

0054

本発明の化合物が名付けられ、本明細書に言及される方法を明示する目的のため、式:



を有する化合物は、化学名2−クロロ−5−スルファモイル−N−3−メチルフェニル−ベンズアミドを有する。

0055

本発明の化合物が名付けられ、本明細書に言及される方法を明示する目的のため、式:



を有する化合物は、化学名5−(2−ブチルスルファモイル)−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミドを有する。

0056

本発明の化合物が名付けられ、本明細書に言及される方法を明示する目的のため、式:



を有する化合物は、化学名N−ベンジル−4−ブロモ−3−ジエチルスルファモイル−ベンズアミドを有する。

0057

本発明の化合物が名付けられ、本明細書に言及される方法を明示する目的のため、式:



を有する化合物は、化学名5,5,11−トリオキソ−10,11−ジヒドロ−5H−5l6−ジベンゾ[b,f][1,4]チアゼピン−8−カルボン酸ベンジルアミドを有する。

0058

本発明の目的のために、ラセミ化合物の式、例えば:



で描かれる化合物は、十分に等しく式:



もしくは式:



を有する2種のエナンチオマーのいずれかまたはそれらの混合物、あるいは第2のキラル中心が存在する場合には、全てのジアステレオマーを表す。

0059

いくつかの態様において、R1は、水素である。

0060

いくつかの態様において、R2は、水素である。

0061

いくつかの態様において、R2は、メチルである。

0062

いくつかの態様において、R2は、トリフルオロメチルである。

0063

いくつかの態様において、R2は、フッ素である。

0064

いくつかの態様において、R2は、塩素である。

0065

いくつかの態様において、R3は、水素である。

0066

いくつかの態様において、R3は、メチルである。

0067

いくつかの態様において、R3は、フッ素である。

0068

いくつかの態様において、R3は、塩素である。

0069

いくつかの態様において、R4は、水素である。

0070

いくつかの態様において、R4は、メチルである。

0071

いくつかの態様において、R4は、フッ素である。

0072

いくつかの態様において、R4は、塩素である。

0073

いくつかの態様において、R5は、水素である。

0074

いくつかの態様において、R5は、塩素である。

0075

いくつかの態様において、R7は、水素である。

0076

いくつかの態様において、R7は、塩素である。

0077

いくつかの態様において、R7は、フッ素である。

0078

いくつかの態様において、R7は、臭素である。

0079

いくつかの態様において、R9は、水素である。

0080

いくつかの態様において、R9は、メチルである。

0081

いくつかの態様において、R9は、フッ素である。

0082

いくつかの態様において、R9は、塩素である。

0083

いくつかの態様において、Rxは、NH2である。

0084

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0085

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0086

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0087

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0088

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0089

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0090

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0091

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0092

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0093

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0094

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0095

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0096

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0097

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0098

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0099

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0100

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0101

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0102

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0103

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0104

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0105

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0106

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0107

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0108

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0109

いくつかの態様において、Rxは、



である。

0110

いくつかの態様において、R10は、水素である。

0111

いくつかの態様において、R10は、メチルである。

0112

いくつかの態様において、R10は、塩素である。

0113

いくつかの態様において、R10は、臭素である。

0114

いくつかの態様において、Ryは、



である。

0115

いくつかの態様において、Ryは、



である。

0116

いくつかの態様において、Ryは、



である。

0117

いくつかの態様において、Ryは、



である。

0118

いくつかの態様において、Ryは、



である。

0119

いくつかの態様において、Ryは、



である。

0120

例による態様は、式(V)を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を含む:



式中、R1、R2、R3、R5、R7およびR9の非限定の例は、表1において以下に定義される。

0121

例による態様は、式(VI)を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を含む:



式中、R2、R3、R4、R7、R9およびRxの非限定の例は、表2において以下に定義される。

0122

例による態様は、式(II)を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を含む:



式中、Rxの非限定の例は、表3において以下に定義される。

0123

例による態様は、式(III)を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を含む:



式中、Ryの非限定の例は、表3において以下に定義される。

0124

例による態様は、式(IV)を有する化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩形態を含む:

0125

本明細書において供された全ての態様において、適切な任意の置換基の例は、請求された発明の範囲を限定することを意図しない。本発明の化合物は、本明細書において供されたあらゆる置換基または置換基の組み合わせを含むことができる。

0126

本教示の化合物は、当業者に知られた標準的な合成方法および手順を用いることにより、市販の出発材料、文献において知られた化合物または容易に調製される中間体から、本明細書において概説される手順に従い調製され得る。有機分子の調製ならびに官能基転換および操作のための基準的な合成方法および手順は、関連科学文献からまたは当該分野における標準的な教科書から容易に得られることができる。典型的なまたは好ましい工程条件(すなわち、反応温度、時間、反応物質モル比溶媒、圧力など)が与えられた場合、他の工程条件もまた特に明記されない限り用いられ得る。最適な反応条件は、用いられる特定の反応物質または溶媒によって異なり得るが、しかしそのような条件はルーチンの最適化手順により当業者によって決定され得る。有機合成の分野における当業者は、提示された合成ステップ性質および順序は、本明細書において記載される化合物の構造を最適化する目的のために代わり得ることを理解するであろう。

0127

本明細書において記載される工程は、当該分野に知られた任意の適切な方法に従い監視され得る。例えば、生成物の生成は、核磁気共鳴分光法(例えば1Hまたは13C)、赤外線分光法光度分析(例えばUV−可視)などの分光学的手段によりまたは高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィーGC)、ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)もしくは薄層クロマトグラフィー(TLC)などのクロマトグラフィーにより監視され得る。

0128

化合物の調製は、種々の化学基の保護および脱保護を伴い得る。保護および脱保護の必要性および適当な保護基の選択は、当業者により容易に決定され得る。保護基の化学は、例えば、Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed. (Wiley & Sons, 1991)において見出され得、この全体の開示を本明細書において全ての目的について参照により組み入れる。

0129

本明細書に記載される反応または工程は、有機合成の分野における当業者により容易に選択され得る適切な溶媒中で実施され得る。適切な溶媒は典型的には、反応が行われる温度、すなわち溶媒の凝固点から溶媒の沸点に及ぶ温度にて実質的に反応物質、中間体および/または生成物と非反応性である。与えらえた反応は、1種の溶媒または1種以上の溶媒の混合物中で行われ得る。特定の反応ステップに応じて、特定の反応ステップのための適切な溶媒が選択され得る。

0130

これらの教示の化合物は、有機化学の分野において知られた方法により調製され得る。これらの教示の化合物の調製において用いられる試薬は、商業的に得ることができる、または文献に記載される標準的な手順により調製され得る。

0131

以下の例は、代表的な式(II)で表される化合物を調製するための方法を提供する。熟練した実行者は、本発明の追加の化合物を調製するために、当業者に知られた適当な試薬、出発物質および精製方法をいかに置換するか理解するであろう。

0132

例1:5−シクロペンチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミドの合成(DVR−56):

0133

CH2Cl2中の5−クロロスルホニル−2−フルオロ−安息香酸(A、0.506g、0.0021mol)、シクロペンチルアミン(B、0.1806g、0.00212mol)およびジイソプロピルエチルアミン(DIEA、1.1mL、0.00636mol)を室温にて一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、粗成生物シリカゲルクロマトグラフィー(10%AcOHを含むMeOH)/CH2Cl2)により精製し、5−シクロペンチルスルファモイル−2−フルオロ−安息香酸(C、0.55g、90%)を与えた。真空下にて一晩乾燥させたのち、SOCl2(5mL)中のC(0.48g、0.0016mol)を80℃にて3時間加熱し、この後、SOCl2を蒸発させ、残渣を一晩乾燥した。残渣を次にテトラヒドロフラン(5mL)に溶解させ、3,4−ジフルオロフェニルアミン(D、0.216g、0.00167mol)を添加し、その後にジイソプロピルエチルアミン(0.5mL)が続いた。混合物を70℃まで一晩加熱した。溶媒を蒸発させ、その後に酢酸エチル抽出を行った。シリカゲルクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)による精製後、0.3g(45%)の5−シクロペンチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド(DVR−56)を得た。

0134

例2:5−sec−ブチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド(DVR−23)の合成

0135

CH2Cl2中の5−クロロスルホニル−2−フルオロ−安息香酸(A、0.506g、0.0021mol)、sec−ブチルアミン(E、0.155g、0.00212mol)およびDIEA(1.1mL、0.00636mol)を室温にて一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、粗成生物をシリカゲルクロマトグラフィー(10%AcOHを含むMeOH)/CH2Cl2)により精製し、5−sec−ブチルスルファモイル−2−フルオロ−安息香酸(F、0.56g、96%)を与えた。真空下にて一晩乾燥させたのち、SOCl2(5mL)中のF(0.56g、0.0020mol)を80℃にて3時間加熱し、この後、SOCl2を蒸発させ、残渣を一晩乾燥した。残渣を次にテトラヒドロフラン(5mL)に溶解させ、3,4−ジフルオロフェニルアミン(D、0.26g、0.0020mol)を添加し、その後にDIEA(0.8mL)が続いた。混合物を70℃まで一晩加熱した。溶媒を蒸発させ、その後に酢酸エチル抽出を行った。シリカゲルクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)による精製後、0.45g(57%)の5−sec−ブチルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド(DVR−23)を得た。

0136

例3:5−シクロヘキシルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド(DVR−45)の合成

0137

CH2Cl2中の5−クロロスルホニル−2−フルオロ−安息香酸(A、0.508g、0.0021mol)、シクロヘキシルアミン(G、0.211g、0.00212mol)およびDIEA(1.1mL、0.00636mol)を室温にて一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、粗成生物をシリカゲルクロマトグラフィー(10%AcOHを含むMeOH)/CH2Cl2)により精製し、5−シクロヘキシルスルファモイル−2−フルオロ−安息香酸(H、0.6g、95%)を与えた。真空下にて一晩乾燥させたのち、SOCl2(5mL)中のH(0.22g、0.737mmol)を80℃にて2時間加熱し、この後、SOCl2を蒸発させ、残渣を一晩乾燥した。残渣を次にテトラヒドロフラン(5mL)に溶解させ、3,4−ジフルオロフェニルアミン(D、95mg、0.737mmol)を添加し、その後にDIEA(0.8mL)が続いた。混合物を70℃まで一晩加熱した。溶媒を蒸発させ、その後に酢酸エチル抽出を行った。シリカゲルクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン)による精製後、0.192g(63%)の5−シクロヘキシルスルファモイル−N−(3,4−ジフルオロフェニル)−2−フルオロ−ベンズアミド(DVR−45)を得た。

配合物

0138

本発明はまた、本発明にかかるプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤を含む組成物または配合物に関する。一般に、本発明の組成物は、B型肝炎ウィルス(HBV)感染および関連疾患の処置に有用であるために有効な有効量の1種または2種以上の本発明にかかるスルファモイルベンズアミド誘導体およびそれらの塩および1種または2種以上の賦形剤を含む。

0139

本発明の目的のために「賦形剤」および「担体」は本発明の記載を通して互換的に用いられ、前記用語は本明細書において「安全かつ有効な医薬組成物を配合する実務において用いられる成分」と定義される。

0140

配合者は、賦形剤が安全、安定および機能的な医薬の送達に役立つために主に用いられ、送達のための全体のビヒクルの部分としてのみならず、活性成分受容者による有効な吸収を達成する手段として役立つことを理解するであろう。賦形剤は、不活性なフィラーであるものとして単純かつ直接的に役割を果たすことができ、または本明細書において用いられる賦形剤は、pH安定化系または成分のへ安全に送達することを確実にする被覆材であることができる。配合者は、また本発明の化合物が向上した細胞有効性薬物動態特性ならびに向上した経口バイオアベイラビリティーを有するという事実を活用し得る。

0141

本教示は、また、少なくとも1種の本明細書に記載された化合物および1種または2種以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。このような担体の例は、当業者に周知であり、および許容可能な医薬手順、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th edition, ed. Alfonoso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985)において記載されたものに従い調製され得、この全体の開示を全ての目的について本明細書に参照により組み込む。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容可能」とは、毒物学的観点から薬学的用途において使用が許容される物質をいう。したがって、薬学的に許容可能な担体は、配合物において他の成分と混合可能であり、生物学的に許容可能なものである。補足の活性成分が、また、医薬組成物中へ取り込まれ得る。

0142

本教示の化合物は経口的にまたは非経口的に、ニートでまたは従来の薬学的担体と組み合わせて投与され得る。適用可能な固体担体は、風味剤潤滑剤、可溶化剤懸濁化剤、フィラー、流動促進剤圧縮補助剤(compression aid)、結合剤または錠剤崩壊剤または封入材料としてまた作用し得る1種または2種以上の物質を含み得る。化合物は従来の方法、例えば、既知の抗ウィルス剤に用いられるものと同様の方法で、配合され得る。本明細書に開示された化合物を含む経口配合物は、錠剤、カプセル口腔形態(buccal forms)、トローチロゼンジおよび経口液、懸濁液または溶液を含む任意の従来用いられた経口形態を含み得る。粉末において、担体は微粉化した固体であり得、これは微粉化した化合物との混合剤である。錠剤において、本明細書において開示された化合物は、必要な圧縮特性を有する担体と適切な割合で混合され、所望する形状および寸法に圧縮され得る。粉末および錠剤は、99%までの化合物を含有し得る。

0143

カプセルは、本明細書において開示された1種または2種以上の化合物と、薬学的に許容可能なデンプン(例えばトウモロコシジャガイモまたはタピオカデンプン)、糖、人口甘味剤粉末セルロース(例えば、結晶および微結晶セルロース)、小麦粉ゼラチンガムなどの不活性フィラーおよび/または希釈剤との混合物を含有し得る。

0144

有用な錠剤配合物は、従来の圧縮、湿式造粒法または乾式造粒法により製造され得、限定されないが、ステアリン酸マグネシウムステアリン酸ラウリル硫酸ナトリウムタルク、糖、ラクトースデキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロースメチルセルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムカルボキシメチルセルロースカルシウムポリビニルピロリドンアルギン酸アカシアガムキサンタンガムクエン酸ナトリウム、複合ケイ酸塩炭酸カルシウムグリシンスクロースソルビトール第二リン酸カルシウム硫酸カルシウム、ラクトース、カオリンマンニトール塩化ナトリウム低融点ワックスおよびイオン交換樹脂を含む薬学的に許容可能な希釈剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、表面改質剤界面活性剤を含む)、懸濁または安定化剤を利用し得る。表面改質剤は、ノニオン性およびアニオン性表面改質剤を含む。表面改質剤の代表例は、限定されないが、ポロキサマー188、塩化ベンザルコニウムステアリン酸カルシウムセトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ろうソルビタンエステルコロイド状二酸化ケイ素リン酸塩ドデシル硫酸ナトリウムケイ酸アルミニウムマグネシウムおよびトリエタノールアミンを含む。本明細書における経口配合物は、化合物の吸収を変更するための標準の遅延または徐放性配合剤を利用し得る。経口配合物は、また、本明細書において開示される化合物を必要に応じ適当な可溶化剤または乳化剤を含む水または果汁中に投与することからなることもできる。

0145

液体担体は、溶液、懸濁液、エマルションシロップエリキシル剤の調製においておよび吸入送達のために用いられ得る。本教示の化合物は、水、有機溶媒、もしくは両方の混合物または薬学的に許容可能な油もしくは油脂などの薬学的に許容可能な液体担体に溶解するまたは懸濁し得る。液体担体は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤保存料甘味料、風味剤、懸濁化剤、増粘剤着色剤粘度調整剤、安定化剤、浸透調節剤などの他の適切な薬学的添加剤を含み得る。経口および非経口投与のための液体担体の例は、限定されないが、水(部分的に本明細書において記載した添加剤を含む、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液などのセルロース誘導体)、アルコール一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む)およびこれらの誘導体並びに油(分画されたココナッツ油およびラッカセイ油)を含む。非経口投与のために、担体はオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油状エステルであり得る。無菌の液体担体は、非経口投与のための組成物を形成する無菌液体中において用いられる。加圧型の組成物のための液体担体は、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容可能な高圧ガスであり得る。

0146

無菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、腹腔内または皮下注射により利用され得る。無菌溶液もまた、静脈内投与され得る。経口投与のための組成物は、液体固体形態のいずれかであり得る。

0147

好ましくは、医薬組成物は、単位剤形、例えば、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、乳液顆粒または座薬の形態である。このような形態において、医薬組成物は、適当な量の化合物を含有する単位用量に細分化され得る。単位剤形は、包装された組成物、例えば、小包粉末、バイアルアンプル充填済シリンジまたは液体を含有する小袋であり得る。あるいは、単位剤形形態はカプセルまたは錠剤そのものであるか、またはそれは包装形態にある適切な数のこのような組成物であり得る。このような単位剤形は、約1mg/kgの化合物〜約500mg/kgの化合物を含有し得、単一の用量でまたは2または3以上の用量で与えられ得る。このような用量は、経口、インプラント経由、非経口(筋肉内、腹腔内および皮下注射を含む)、経直腸経膣および経皮を含む化合物を受容者の血流に向かわせるのに有用な任意の方法において投与され得る。

0148

特定の疾病状態または障害の処置または阻害のために投与される場合、有効用量は、用いられる特定の化合物、投与方法、処置される疾患の重症度、ならびに処置される個体に関連する種々の物理的要因に応じて変わりうることが理解される。治療用途において、本教示の化合物は、治療するのにまたは疾病の症状およびその合併症を少なくとも部分的に改善するのに十分な量で疾病をすでに患っている患者に提供され得る。特定の個体の処置において用いられる用量は典型的に主観的に担当医によって決定されなければならない。伴う変数は、特定の疾患およびその状態ならびに患者の大きさ、年齢および反応パターンを含む。

0149

ある場合には、限定されないが、定量吸入器呼吸動性吸入器、多用量型粉末吸入器、ポンプ圧搾作動(squeeze−actuated)噴霧スプレーディスペンサーエアロゾルディスペンサーエアロゾルネブライザーなどの機器を用いて、患者の気道に直接化合物を投与することが望ましい可能性がある。鼻腔内または気管支内吸入による投与のために、本教示の化合物は液体組成物固体組成物またはエアロゾル組成物に配合され得る。液体組成物は、例として、薬学的に許容可能な溶媒中に溶解した、部分的に溶解した、または懸濁した1種または2種以上の本教示の化合物を含み得、例えばポンプまたは圧搾作動噴霧スプレーディスペンサーにより投与され得る。溶媒は、例えば、等張食塩水または静菌水であり得る。固体組成物は、例により、ラクトースまたは気管支使用に許容可能な他の不活性粉末と混合された1種または2種以上の本教示の化合物を含む粉末製剤であり得、例えば、エアロゾルディスペンサーまたは固体組成物を包み込むカプセルを破壊または破裂させて固体組成物を吸入のために輸送するデバイスにより投与され得る。エアロゾル組成物は、例により1種または2種以上の本教示の化合物、高圧ガス、界面活性剤および共溶媒を含み得、例えば、定量デバイスにより投与され得る。高圧ガスは、クロロフルオロカーボン(CFC)、ヒドロフルオロアルカン(HFA)または生理学的におよび環境的に許容可能な他の高圧ガスであり得る。

0150

本明細書において記載される化合物は、非経口的にまたは腹腔内投与され得る。これらの化合物またはこれらの薬学的に許容可能な塩、水和物もしくはエステルの溶液または懸濁液は、ヒドロキシル−プロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水中において調製され得る。分散液もまた、油中グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中において調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下において、これらの製剤は典型的に微生物成長を抑制する保存剤を含有する。

0151

注射のために適切な医薬形態は、無菌水性溶液または分散液および即時の注射可能な溶液または分散液の調製のための無菌粉末を含み得る。いくつかの態様において、形態は、無菌であり、その粘度はシリンジを流れることを許容する。形態は好ましくは製造および貯蔵の条件下において安定であり、細菌および菌類などの微生物の汚染作用に対して保護され得る。担体は、例えば、水、エタノールポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール)、これらの適切な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。

0152

本明細書において記載される化合物は経皮的に、すなわち体の表面および上皮および粘膜組織を含む肉体の官の内壁を越えて投与され得る。このような投与は、ローションクリームフォームパッチ、懸濁液、溶液および座薬(経直腸的および経膣的)中の薬学的に許容可能な塩、水和物またはエステルを含む本教示の化合物を用いて行われ得る。

0153

経皮投与は、本明細書において開示された化合物などの化合物および化合物に対して不活性であり得、皮膚に対して無毒であり得、および皮膚を介した血流への体内吸収のための化合物の配送を可能とし得る担体を含む経皮パッチの使用を通じて達成し得る。担体は、クリームおよび軟膏ペーストゲル、および閉鎖デバイスなどの任意の数の形態をとり得る。クリームおよび軟膏は、粘性のある液体または水中油もしくは油中水型のいずれかの半固体エマルションであり得る。化合物を含む石油または親水性石油中に分散された吸収性の粉末からなるペーストもまた、適切である。担体を伴うまたは伴わない化合物を含むリザーバーを覆う半透膜、化合物を含むマトリックスなどの種々の閉鎖デバイスが化合物を血流に放出するために用いられる。他の閉鎖デバイスは、文献において知られている。

0154

本明細書において記載される化合物は、経直腸的にまたは経膣的に、従来の座薬の形態で投与され得る。座薬配合物は、座薬の融点を変更するためのワックスの追加を伴うまたは伴わないココアバターおよびグリセリンを含む従来の材料から製造され得る。種々の分子量のポリエチレングリコールなどの水溶性座薬基剤もまた使用され得る。

0155

脂質配合物またはナノカプセルは、in vitroまたはin vivoのいずれかで本教示の化合物を宿主細胞へ導入するために用いられ得る。脂質配合物およびナノカプセルは、当該分野に知られた方法により調製される。

0156

本教示の化合物の有効性を向上させるために、化合物を標的疾病の処置に有効な他の剤と組み合わせることが望ましい場合がある。例えば、標的疾病を処置するのに有効な他の活性化合物(すなわち、他の活性成分または剤)は、本教示の化合物とともに投与され得る。他の剤は、本明細書において開示される化合物と同時にまたは異なる時間で投与され得る。

0157

本教示の化合物は、哺乳動物、例えばヒト患者における病理学的な疾患または疾病の処置または阻害に有用であり得る。本教示はしたがって、哺乳動物にその薬学的に許容可能な塩を含む本教示の化合物または薬学的に許容可能な担体と組み合わせたもしくは共同した本教示の化合物を含む医薬組成物を提供することにより、病理学的な疾患または疾病の処置するまたは阻害する方法を提供する。本教示の化合物は単独でまたは病理学的な疾患もしくは疾病の処置もしくは阻害のための他の治療的に有効な化合物もしくは治療と組み合わせて投与され得る。

0158

本発明にかかる化合物の非限定の例は、約0.001mg〜約1000mgの1種または2種以上の本発明にかかるプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤および1種または2種以上の賦形剤;約0.01mg〜約100mgの1種または2種以上の本発明にかかるプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤および1種または2種以上の賦形剤;約0.1mg〜約10mgの1種または2種以上の本発明にかかるプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤;および1種または2種以上の賦形剤を含む。

手順

0159

以下の手順が、HBVのプレゲノムRNAカプシド形成阻害剤として化合物を評価し、選択するのに用いられ得る。

0160

本発明のHBV複製阻害剤は、HBV感染に関連する疾病を処置し、予防することができる。表5〜9において提示された結果は、標準MTTアッセイ(Promega)を使用することにより50μMまで測定可能細胞毒性を有することなく、テトラサイクリンを誘発させる形で強いHBV複製を支援する不死化マウス肝細胞(AML12)−由来安定細胞株(AML12HBV10)において、本発明の化合物がHBV複製を阻害することを実証した。

0161

表5、6、7、8および9において提示されるように、本開示の化合物の抗ウィルス効果をAML12HBV10細胞において測定した。AML12HBV10は、テトラサイクリンを誘発させる形で強いHBV複製を支援する不死化マウス肝細胞(AML12)−由来安定細胞株である(Xu et al.)。細胞をウェルあたり2×104細胞の密度で96ウェルプレート播種し、テトラサイクリンの不在下で10%ウシ胎仔血清とともにDMEM/F12培地中で培養して、pgRNA複製およびHBVDNA複製をさせた。播種1日後、細胞を50μM〜0.39μMにおよぶ試験化合物連続希釈法を用いて48時間未処理または処理した。その後各ウェルに10mM Tris−HCl(pH 7.6)、1mMEDTA、100mM NaClおよび1% NP−40を含有する100μlの溶解緩衝液を添加することにより細胞を溶解させ、37℃で30分間インキュベートした。各ウェルからの半量(50μl)の細胞溶解物を等量の0.5M NaOHおよび1.5M NaClを含有する変性溶液と併せた。5分のインキュベーションの後、100μlの中和溶液(1M Tris−HCl、pH 7.4、1.5M NaCl)を各ウェルに添加した。変性細胞溶解物(全体として200μl)を96−ウェルドット−ブロットニュフォールド(Biorad)を用いてナイロン膜に適用した。細胞溶解物中のHBV DNAをHBVマイナス鎖DNAに特異的なアルファ−32P−UTP−標識リボプローブを用いたドットブロットハイブリダイゼーションにより測定した。本開示の化合物の抗ウィルス効果を50%までHBV DNAの量が減少した濃度(EC50)として示した。

0162

AML12HBV10細胞における本開示の化合物の細胞毒性の測定:化合物の細胞毒性を測定するために、AML12HBV10細胞をウェルあたり2×104細胞の密度で96ウェルプレートに播種し、テトラサイクリンの不在下で10%ウシ胎仔血清とともにDMEM/F12培地中で培養して、pgRNA複製およびHBVDNA複製をさせた。播種1日後、細胞を50μM〜0.39μMにおよぶ試験化合物の連続希釈法を用いて48時間未処理または処理した。製造業者(Promega)により提供された手順に従い、MTTアッセイにより細胞の生存率を測定した。化合物の細胞毒性を50%まで細胞の生存率が減少した濃度(CC50)として示した。

0163

図1図2および表10に示される、ヒト肝細胞がん細胞株における本開示の化合物の抗ウィルス活性の測定:ヒト肝細胞がん細胞における本開示の化合物のHBVに対する抗ウィルス活性をさらに確認するために、HepDES19細胞、テトラサイクリンを誘発させる形でHBV複製を支援するヒト肝細胞がん細胞株(Guo et al., 2007)を12−ウェルプレートにウェルあたり5×105細胞の密度で96ウェルプレートに播種し、1μg/mlのテトラサイクリンおよび10%ウシ胎仔血清とともにDMEM/F12培地中で培養した。播種2日後、細胞を10μM〜0.018μMにおよぶ試験化合物の連続希釈法を用いて6日間、テトラサイクリンの不在下で処理または処理した。処理を完了し、12−ウェルプレートの各ウェルに10mM Tris−HCl(pH 8.0)、1mMEDTA、1% NP−40および2%スクロースを含有する0.5mlの溶解緩衝液を添加することにより細胞を溶解させ、37℃で10分間インキュベートした。細胞残屑および核を遠心分離により除去し、上澄みを1.5M NaClを含有する130μlの35%ポリエチレングリコール(PEG)8000と混合した。中の1時間のインキュベーション後、ウイルスヌクレオカプシドを6000×g、5分間、4℃における遠心分離によりペレット化し、続いて0.5mg/mlプロナーゼ(Calbiochem)、0.5%SDS、150mM NaCl、25mM Tris−HCl(pH8.0)および10mM EDTAを含有する400μlの消化緩衝液中で37℃にて1時間消化した。消化混合物フェノールで2回抽出し、DNAをエタノールで沈殿させ、TE緩衝液(10mM Tris−HC1、pH8.0;0.1mM EDTA)中に溶解させた。各ウェルからのDNA試料の半分を1.5%アガロースゲルへの電気泳動により分離した。その後ゲルを0.5M NaOHおよび1.5M NaClを含有する溶液中での変性に供し、続いて1M Tris−HCl(pH 7.4)および1.5M NaClを含有する緩衝液中で中和した。DNAを20XSSC緩衝液中でHybond−XL membrane(GE Health care)上へブロットした。細胞質のHBV核関連HBV DNAの量をサザンブロットハイブリダイゼーションにより測定し、化合物の抗ウィルス活性を50%(EC50)または90%(EC90)までHBV DNAの量が減少した濃度として表した。

0164

ヒト肝細胞がん細胞における本開示の化合物の細胞毒性の測定:HepDES19細胞をウェルあたり6×104細胞の密度で96ウェルプレートに播種し、テトラサイクリンの不在下で10%ウシ胎仔血清とともにDMEM/F12培地中で培養した。播種1日後、細胞を50μM〜0.39μMにおよぶ試験化合物の連続希釈法を用いて6日間未処理または処理した。製造業者(Promega)により提供された手順に従い、MTTアッセイにより細胞の生存率を測定した。化合物の細胞毒性を50%まで細胞の生存率が減少した濃度(CC50)として示した。

0165

HepDES19細胞における本開示の選択的な化合物の抗ウィルス効果を図1に示す。DVR23と2種の既知の抗HBV化合物、ラミブジンおよびBay 41−4109との間における抗ウィルス効果の対象比較を図2に示す。AML12HBV10およびHepDES19における本開示の代表的な化合物の抗ウィルス効果および細胞毒性の概要を表10に示す。これらの結果により、マウス肝細胞由来細胞株(AML12HBV10)においてのみならず、ヒト肝細胞がん細胞株(HepDES19)において本開示の化合物が選択的にHBVを阻害することが明確に実証された。また結果により、DVR−26がラミブジンおよびBay 41−4109と同様の有効性でHBVDNAウィルスを阻害することが実証された。

0166

本発明の化合物のHBVに対する機構的洞察を得るために、12−ウェルプレートにおいて培養されたAML12HBV10細胞をテトラサイクリンの不在下、2日間、一連の濃度のDVR−1、DVR−56またはDVR−23で処理した(Guo et al., 2007)。また、陽性対照として、HBVコアタンパク質量体と結合してその相互作用を誤った方に導き、カプシド形成を防ぐ(Bay41−4109)(Deres et al., 2003; Stray and Zlotnick, 2006)か、コアアセンブリ中間体と相互作用し、中空カプシドの形成を促進するか(AT−61)(Feld et al., 2007; Katen et al., ; King et al., 1998)のいずれかの既知のHBVヌクレオカプシドアセンブリエフェクター、Bay41−4109(5μM)またはAT−61(25μM)で細胞を処理した。細胞内のウィルスmRNA、カプシド化pgRNAおよびヌクレオカプシド関連HBV DNAの量を以下に詳述する方法で分析した。

0167

HBVmRNAの分析のための手順:処理の完了後、全体の細胞RNAをTRIzol試薬(Invitrogen)で抽出した。全体のRNAの5マイクログラムを2.2Mホルムアルデヒドを含有する1.5%アガロースゲル中に溶解させ、20XSSC緩衝液中でHybond−XL membrane(GE Health care)上へ輸送した。HBV mRNAの量をHBVゲノムのプラス鎖に特異的なアルファ−32P−UTP−標識リボプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼイションにより測定した。

0168

カプシド化pgRNAの測定:600μlの溶解緩衝液(50mM Tris−HCl[pH7.5]、1mMEDTA、150mM NaCl、1%NP−40)を12−ウェルプレートの各ウェルに添加することにより、AML12HBV10細胞を溶解させた。核を、5000gで10分間の遠心分離により除去した。試料の半分を6Uのミクロコッカスヌクレアーゼ(Pharmacia)および15μlの100mM CaCl2と混合し、15分間37℃にてインキュベートして遊離核酸を消化した。反応を6μlの0.5M EDTAで停止させ、125μlの1.75M NaCl中の35%ポリエチレングリコール8000を反応に添加することによりカプシドを沈殿させ、氷中で30分間インキュベートし、続いて4℃にて10分間6000gで遠心分離を行った。ペレットを50μlのTNE緩衝液(10mM Tris−HCl[pH8]、100mM NaCl、1mM EDTA)中に再懸濁させた。pgRNAを1mlのTrizolの添加により抽出した。カプシド化pgRNAを2.2Mホルムアルデヒド−1%アガロースゲル中を通して電気泳動させ、ナイロン膜に輸送し、UV架橋(Stratagene)により固定した。ハイブリダイゼーションは、HBVゲノムのプラス鎖に特異的なアルファ−32P−UTP−標識リボプローブで行った。

0169

ウイルスカプシドおよびヌクレオカプシド関連DNA分析の手順:12−ウェルプレートの各ウェルに10mM Tris−HCl(pH 7.6)、100mM NaCl、1mMEDTAおよび1% NP−40を含む300μlの緩衝液を添加することによりHepDES19細胞を溶解させた。細胞残屑を5000g、10分間での遠心分離により除去した。10マイクロリットル清澄化した細胞溶解物を非変性1%アガロースゲル中を通した電気泳動により分画し、TNE緩衝液(10mM Tris−HCl、pH7.6;150mM NaClおよび1mM EDTA)でブロットすることによりニトロセルロースフィルターへ輸送した。HBV核タンパク質に対する抗体(DAKO)で膜をプローブすることによりHBVカプシドを検出した。結合した抗体をIRDye二次抗体により明らかにし、Li−COR Odyssey systemにより可視化した。カプシド関連HBV DNAを検出するために、膜を0.5N NaOHおよび1.5M NaClを含有する緩衝液で5分間処理し、続いて1M TRIS−HClおよび1.5M NaClを含有する緩衝液で5分間中和した。ウイルスDNAをα−32P−UTP(800Ci/mmol、Perkin Elmer)標識マイナス鎖特異的完全長HBVリボプローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出した(Xu et al.)。

0170

HBVDNA複製中間体を分析するために、12−ウェルプレートの各ウェルに10mM Tris−HCl(pH 8.0)、1mMEDTA、1% NP−40および2%スクロースを含有する0.5mlの溶解緩衝液を添加することにより細胞を溶解させた。細胞残屑および核を遠心分離により除去し、上澄み液を130μlの1.5M NaClを含有する35%ポリエチレングリコール8000と混合した。氷中の1時間のインキュベーション後、ウィルスヌクレオカプシドを6000×g、5分間、4℃の遠心分離によりペレット化し、続いて0.5mg/mlプロナーゼ(Calbiochem)、0.5%SDS、150mM NaCl、25mM Tris−HCl(pH8.0)および10mM EDTAを含有する400μlの消化緩衝液中で37℃にて1時間消化した。消化混合物をフェノールで2回抽出し、DNAをエタノールで沈殿させ、TE緩衝液(10mM Tris−HC1、pH8.0;0.1mM EDTA)中に溶解させた。各ウェルからのDNA試料の半分を1.5%アガロースゲルへの電気泳動により分離した。その後ゲルを0.5M NaOHおよび1.5M NaClを含む溶液中での変性に供し、続いて1M Tris−HCl(pH 7.4)および1.5M NaClを含有する緩衝液中で中和した。その後DNAを20XSSC緩衝液中でHybond−XL membrane(GE Health care)上へブロットした。HBV DNA複製中間体をHBVゲノムのマイナス鎖に特異的なアルファ−32P−UTP標識リボプローブを用いてプローブした。

0171

図3に示されるようにDVR−1、DVR−56およびDVR−23は、ウイルスmRNAの量に影響を与えず(パネルA)、しかし用量に依存してカプシド化pgRNAの水準を低減させた(パネルC)。しかしながら、提案された機構と一致して、粒子ゲルアッセイにより、Bay41−4109処理が完全にカプシド形成(パネルB)およびしたがってpgRNAカプシド化およびDNA合成(パネルC、DおよびE)を消失させ、AT−61処理がカプシド形成に影響を与えない(パネルB)が、しかし用量に依存してカプシド化pgRNA(パネルC)およびカプシド関連HBVDNAの量を低減させること(パネルDおよびE)が明らかになった。AT−61と同様に、DVR化合物は、カプシド形成に有意な影響を与えず(パネルB)、しかし用量に依存する形でカプシド化pgRNAおよびカプシド関連HBV DNAの量を低減させた(パネルC、DおよびE)。上記の結果はAT−61と表現型として同様であり、DVR化合物がヌクレオカプシドへのpgRNAカプシド化を抑制し、および中空カプシドの形成をもたらしたことを示唆する。結果として、引き続くHBVDNA複製が生じ得なかった。

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