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図面 (20)

課題

CD22上に存在するエピトープに特異的な抗体の提供。

解決手段

CD22のエピトープに特異的に結合する抗体であって、アミノ酸配列EVQLVESGGGLVKPGGSLX1LSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNX2LYLQMX3SLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQGTVTVSS(X1は、KまたはRであり、X2は、SまたはTであり、X3は、NまたはSである)を有するVH領域を含む免疫グロブリン重鎖と、免疫グロブリン軽鎖とを含む抗体。

概要

背景

概要

CD22上に存在するエピトープに特異的な抗体の提供。CD22のエピトープに特異的に結合する抗体であって、アミノ酸配列EVQLVESGGGLVKPGGSLX1LSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNX2LYLQMX3SLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQGTVTVSS(X1は、KまたはRであり、X2は、SまたはTであり、X3は、NまたはSである)を有するVH領域を含む免疫グロブリン重鎖と、免疫グロブリン軽鎖とを含む抗体。A

目的

抗CD22の重鎖(図7A)および軽鎖(図7B)可変領域のアミノ酸配列を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

発明の詳細な説明に記載された物。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2012年7月19日に出
願された米国仮特許出願番号第61/673,630号の優先利益を主張する。

0002

序論
Igスーパーファミリーに属する系統限定B細胞抗原であるCD22は、多くの種類の
悪性B細胞の表面、および正常な成熟リンパ細胞上に発現される。

0003

本開示は、CD22に特異的な抗体を提供する。また、種々の治療診断、および監視
用途に有用な抗体も提供される。

図面の簡単な説明

0004

キメラまたはヒト化抗CD22抗体重鎖図1A)および軽鎖図1B)をコードする構築物を示す。
同上。
ヒト化抗CD22抗体とビオチン化親キメラ抗CD22抗体との固定化CD22への結合についての競合を示すグラフである。
同上。
同上。
同上。
同上。
抗体を試験するための健常ドナーのT細胞増殖応答を示す。
同上。
同上。
同上。
ヒト化抗CD22抗体のRaji細胞への結合、およびRaji細胞による抗体の内在化を示す。
変異抗体のヒトCD22に対する結合親和性を示す。
ヒト化抗CD22変異体凝集を示す。
同上。
同上。
同上。
抗CD22の重鎖(図7A)および軽鎖(図7B可変領域のアミノ酸配列を提供する。
同上。
抗CD22抗体の変異抗体9〜20のアミノ酸配列を提供する。
同上。
同上。
同上。
同上。
CD22アイソフォームのアミノ酸配列を提供する(上から下へ:配列番号:35〜38)。
同上。
同上。

0005

定義
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体または免
グロブリン、抗原との特異的結合を保持する抗体の断片(Fab、Fv、scFv、お
よびFd断片を含むがこれらに限定されない、)、キメラ抗体ヒト化抗体一本鎖抗体
、ならびに抗体の抗原結合部分および非抗体タンパク質を含む融合タンパク質を含む。抗
体は、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を産生する酵素蛍光タンパク質等を用
いて検出可能に標識されてもよい。抗体はさらに、特異的結合対メンバー、例えばビオ
チン(ビオチンアビジン特異的結合対のメンバー)等の他の部分にコンジュゲートされ
てもよい。抗体は、ポリスチレンプレートまたはビーズ等を含むがこれらに限定されない
固体支持体に結合してもよい。抗原との特異的結合を保持するFab’、Fv、F(ab
’)2、および/または他の抗体断片、ならびにモノクローナル抗体も、これらの用語に
包含される。抗体は、一価または二価であり得る。

0006

「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、例えば、インタクトな抗体の抗原結合領域
または可変領域を含む。抗体断片の例として、Fab、Fab’、F(ab’)2、およ
びFv断片;ダイアボディ線形抗体(Zapata et al.,Protein
Eng.8(10):1057−1062(1995));一本鎖抗体分子;および抗体
断片から形成される多特異的抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、各々が単一の抗
結合部位を有する「Fab」断片と称される2つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶
化する能力を反映する名称である、残りの「Fc」断片とを産生する。ペプシン処理は、
2つの抗原結合部位を有し、なおも抗原と架橋結合することが可能な、F(ab’)2断
片を生じる。

0007

「Fv」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。こ
の領域は、緊密に非共有結合的会合した1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメ
インとのダイマーからなる。この構成において、各可変ドメインの3つのCDRが相互作
用して、VH−VLダイマーの表面上の抗原結合部位を画定する。集合的に、6つのCD
Rが、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、たとえ単一の可変ドメイン(ま
たは抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)であっても、抗原を認識して結
合する能力を有するが、その親和性は完全な結合部位よりも低い。

0008

「Fab」断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も
含む。Fab断片は、重鎖CH1ドメインカルボキシル末端に、抗体ヒンジ領域からの
1つ以上のシステインを含む数個の残基が付加していることによってFab’断片とは異
なる。Fab’−SHは、定常ドメインのシステイン残基複数可)が遊離チオール基を
担持するFab’の本明細書における名称である。F(ab’)2抗体断片は、元々、間
にヒンジシステインを有するFab’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的
結合は既知である。

0009

任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメイン
のアミノ酸配列に基づいて、κカッパ)およびλ(ラムダ)と称される2つの明らかに
異なる種類の一方に割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸
列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリン
の5つの主要なクラス、IgAIgDIgEIgG、およびIgMが存在し、これ
らのうちのいくつかは、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、お
よびIgA2といったサブクラス(アイソタイプ)にさらに分割されてもよい。

0010

一本鎖Fv」または「sFv」抗体断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、
これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。いくつかの実施形態において
、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間にポリペプチドリンカーをさ
らに含み、sFvが抗原結合に所望される構造を形成することを可能にする。sFvの概
説については、Pluckthun in The Pharmacology of
Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenbur
g and Moore eds.,Springer−Verlag,New Yor
k,pp.269−315(1994)を参照されたい。

0011

「ダイアボディ」という用語は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、
該断片は、同じポリペプチド鎖(VH−VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に接続され
た重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖上の2つのドメイン間で対形成するには短か
過ぎるリンカーを用いることにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対形
成させ、2つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第404,
097号、国際公開第WO93/11161号、およびHollinger et al
.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444−6448(19
93)に、より詳細に記載されている。

0012

本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、2つの物質可逆的結合平衡
定数を指し、解離定数(Kd)として表される。親和性は、無関係のアミノ酸配列に対す
る抗体の親和性よりも、少なくとも1倍大きい、少なくとも2倍大きい、少なくとも3倍
大きい、少なくとも4倍大きい、少なくとも5倍大きい、少なくとも6倍大きい、少なく
とも7倍大きい、少なくとも8倍大きい、少なくとも9倍大きい、少なくとも10倍大き
い、少なくとも20倍大きい、少なくとも30倍大きい、少なくとも40倍大きい、少な
くとも50倍大きい、少なくとも60倍大きい、少なくとも70倍大きい、少なくとも8
0倍大きい、少なくとも90倍大きい、少なくとも100倍大きいか、もしくは少なくと
も1000倍大きい、またはそれ以上であり得る。標的タンパク質に対する抗体の親和性
は、例えば、約100ナノモル(nM)〜約0.1nM、約100nM〜約1ピコモル
pM)、または約100nM〜約1フェムトモル(fM)以上であり得る。本明細書で使
用される場合、「結合活性」という用語は、2つ以上の物質の複合体の希釈後の解離に対
する抵抗性を指す。「免疫反応性」および「優先的に結合する」という用語は、抗体およ
び/または抗原結合断片に関して、本明細書において同義に使用される。

0013

「結合」という用語は、塩架橋および水架橋等の相互作用を含む、例えば、共有結合
静電的、疎水性、ならびにイオン性および/または水素結合性の相互作用に起因する2
つの分子間の直接的会合を指す。主題の抗CD22は、CD−22ポリペプチド内のエピ
トープに特異的に結合する。非特異的結合は、約10−7M未満の親和性の結合、例えば
、10−6M、10−5M、10−4M等の親和性の結合を指す。

0014

本明細書で使用される場合、「CDR」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖
ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる不連続な抗原結合部
位を意味することが意図される。CDRは、Kabat et al.,J.Biol.
Chem.252:6609−6616(1977);Kabat et al.,U.
S.Dept.of Health and Human Services,“Seq
uences of proteins of immunological inte
rest”(1991);Chothia et al.,J.Mol.Biol.19
6:901−917(1987);およびMacCallum et al.,J.Mo
l.Biol.262:732−745(1996)に記載されており、その定義は、互
いに対して比較した時のアミノ酸残基重複またはサブセットを含む。それにもかかわら
ず、抗体または移植抗体またはその変異体のCDRを指すためのいずれかの定義の適用は
、本明細書において定義および使用される用語の範囲内であることが意図される。上に列
挙した参考文献の各々によって定義されるCDRを包含するアミノ酸残基を、比較として
下の表1に記載する。

0015

本明細書で使用される場合、抗体可変領域に言及して使用される場合の「フレームワー
ク」という用語は、抗体の可変領域内のCDR領域以外の全てのアミノ酸残基を意味する
ことが意図される。可変領域のフレームワークは、一般的に約100〜120アミノ酸長
の不連続なアミノ酸配列であるが、CDR以外のアミノ酸のみを指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」という用語は、CDRによって分離
されたフレームワークの各ドメインを意味することが意図される。

0016

「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定および分離され、かつ/または回
収された抗体である。その天然環境の混入成分は、抗体の診断または治療上の使用を妨げ
る物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質
含み得る。いくつかの実施形態において、抗体は、(1)ローリー法によって決定した場
合に、抗体の90重量%を上回るまで、95重量%を上回るまで、もしくは98重量%を
上回るまで、例えば99重量%を上回るまで、(2)スピニングカップ配列決定装置の使
用によってN末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程
度まで、または(3)クマシーブルー染色もしくは銀染色を用いた還元条件もしくは非還
元条件下でのラウリル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PA
GE)によって均質になるまで、精製される。単離された抗体は、抗体の天然環境の少な
くとも1つの成分が存在しなくなるため、組換え細胞内にin situで抗体を含む。
場合によっては、単離された抗体は、少なくとも1つの精製ステップによって調製される

0017

本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」等の用語は、所望の薬理学的およ
び/または生理学的効果を得ることを指す。該効果は、疾患もしくはその症状を完全にも
しくは部分的に防止するという点において予防的であり得、かつ/または、疾患および/
もしくは疾患に起因する悪影響の部分的もしくは完全な治癒という点において治療的であ
り得る。本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任
意の治療を包含し、(a)疾患にかかりやすい可能性があるが、まだそれを有すると診断
されていない対象において疾患の発症を予防すること、(b)疾患を阻害すること、すな
わち、その発生を停止すること、および(c)疾患を軽減すること、すなわち、その疾患
退行を引き起こすことを含む。

0018

「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書において同
義に使用され、ネズミラットマウス)、非ヒト霊長類、ヒト、イヌネコ有蹄動物
(例えば、ウマウシヒツジブタヤギ)等を含むがこれらに限定されない哺乳動物
を指す。

0019

「治療的有効量」または「効果的な量」は、疾患を治療するために哺乳動物または他の
対象に投与された場合に、そのような疾患の治療を達成するのに十分な主題の抗CD22
Abの量を指す。「治療的有効量」は、抗CD22Ab、疾患およびその感受性、ならび
に治療を受ける対象の年齢、体重等に応じて変化する。

0020

生物試料」は、個人から得られる様々な試料の種類を包含し、診断アッセイまたはモ
タリンアッセイに使用することができる。この定義は、血液および他の生物学的起源
液体試料固体組織試料、例えば、生検標本もしくは組織培養物またはそれに由来する
細胞およびその子孫を包含する。この定義は、例えば、試薬による処理、可溶化、または
ポリヌクレオチド等の特定の成分の濃縮等により、それらの調達後にいずれかの方法で操
作された試料を包含する。「生物試料」という用語は、臨床試料を包含し、また、培養物
中の細胞、細胞上清細胞溶解物血清血漿生物学的流体、および組織試料も包含す
る。場合によっては、生物試料はB細胞を含む。

0021

本発明をさらに説明する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されるも
のではなく、そのため、当然、変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は、
添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される専門用語は、
特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定的であることを意図しないこ
とも理解されたい。

0022

値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値の間の各介在値(別途文脈が明
確に指示しない限り、下限値の単位の10分の1まで)、ならびにその記載される範囲内
の任意の他の記載される値または介在値が本発明に包含されることを理解されたい。これ
らのより小さい範囲の上限値および下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよ
く、記載される範囲内の任意の具体的に除外された限度に従って本発明内にも包含される
。記載される範囲がそれらの限度のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含され
る限度のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に包含される。

0023

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発
明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に
記載されるものと類似するかまたは同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または
試験に用いられ得るが、好ましい方法および材料を次に記載する。本明細書に記載される
全ての刊行物は、その刊行物が引用されることに関連して方法および/または材料を開示
および記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。

0024

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「and」、
および「the」は、文脈上、別途明確に指示されない限り、複数形の指示対象を含むこ
とに留意されたい。したがって、例えば、「抗体(an antibody)」への言及
は、複数のそのような抗体を含み、「(the)CDR」への言及は、1つ以上のCDR
、および当該者に既知であるその均等物への言及を含む等である。さらに、特許請求の範
囲は、あらゆる任意選択的な要素を除外するように起草される場合があることに留意され
たい。そのため、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して、「単独で」、「
のみ」等の排他的用語の使用、または「否定的」な限定の使用の先行詞としての役割を果
たすことが意図される。

0025

本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日より前の開示についてのみ提供される
。本明細書中のいかなる記載も、本発明が、先行発明のために、そのような刊行物に先行
する権利を有しないことの許諾であると解釈されるべきではない。さらに、提供される公
開日は、実際の公開日とは異なる可能性があり、それらは個別に確認する必要があり得る

0026

本開示は、CD22に特異的な抗体を提供する。また、種々の治療、診断、および監視
用途に有用な抗体も提供される。

0027

抗体
主題の抗体は、CD22ポリペプチドに特異的に結合し、エピトープは、CD22抗原
内のアミノ酸残基(例えば、図9A〜Cに示されるCD22のアミノ酸配列のアミノ酸1
〜847内、アミノ酸1〜759内、アミノ酸1〜751、またはアミノ酸1〜670内
)を含む。

0028

CD22エピトープは、図9A〜Cに示されるヒトCD22アイソフォーム4のアミノ
酸配列の約500個のアミノ酸〜約670個のアミノ酸の連続的なストレッチに対して、
少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、
少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミ
ノ酸配列同一性を有するポリペプチドによって形成されてもよい。CD22エピトープは
図9A〜Cに示されるヒトCD22アイソフォーム3のアミノ酸配列の約500個のア
ミノ酸〜約751個のアミノ酸の連続的なストレッチに対して、少なくとも約75%、少
なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少
なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有する
ポリペプチドによって形成されてもよい。CD22エピトープは、図9A〜Cに示される
ヒトCD22アイソフォーム2のアミノ酸配列の約500個のアミノ酸〜約759個のア
ミノ酸の連続的なストレッチに対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少な
くとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少な
くとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドによって形
成されてもよい。CD22エピトープは、図9A〜Cに示されるヒトCD22アイフォ
ーム1のアミノ酸配列の約500個のアミノ酸〜約847個のアミノ酸の連続的なストレ
ッチに対して、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なく
とも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または
100%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドによって形成されてもよい。

0029

主題の抗体は、CD22への高い親和性結合を示す。例えば、主題の抗体は、少なくと
も約10−7M、少なくとも約10−8M、少なくとも約10−9M、少なくとも約10
−10M、少なくとも約10−11M、もしくは少なくとも約10−12M、または10
−12Mを上回る親和性でCD22に結合する。主題の抗体は、CD22上に存在するエ
ピトープに、約10−7M〜約10−8M、約10−8M〜約10−9M、約10−9M
〜約10−10M、約10−10M〜約10−11M、もしくは約10−11M〜約10
−12M、または10−12Mを上回る親和性で結合する。

0030

本開示の抗CD22抗体は、場合によっては、その細胞表面上にCD22を発現する細
胞においてアポトーシス誘導することができる。

0031

「CD22抗原」または「CD22ポリペプチド」は、図9A〜Cに示されるCD22
アイソフォーム1、2、3、または4のアミノ酸配列の、約500個のアミノ酸(aa)
から、約847個のaa(アイソフォーム1)まで、約759個のaa(アイソフォーム
2)まで、約751個のaa(アイソフォーム3)まで、または約670個のaa(アイ
フォーム4)までの連続的なストレッチに対して、少なくとも約75%、少なくとも約
80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約
99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる

0032

「抗体」という用語は、エピトープに結合することが可能な1つ以上(例えば、1つも
しくは2つ)の重鎖可変領域(VH)および/または1つ以上(例えば、1つもしくは2
つ)の軽鎖可変領域(VL)、あるいはその細断片を含むタンパク質を指す。VHおよび
VL領域は、「フレームワーク領域(FR)」と称される、より保存された領域が散在
る「相補性決定領域(CDR)」と称される超可変領域にさらに細分化することができる
。FRおよびCDRの範囲は正確に画定されている(Kabat,et al.(199
1)Sequences of Proteins of Immunological
Interest,Fifth Edition,U.S.Department o
f Health and ヒトServices,NIH Publication
No.91−3242;Chothia et al.(1987)J.Mol.Bio
l.196:901−917を参照のこと)。VHは、以下の順序でN末端からC末端
配置された3つのCDRおよび4つのFRを含むことができる:FR1、CDR1、FR
2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。同様に、VLは、以下の順序でN末端からC
末端に配置された3つのCDRおよび4つのFRを含むことができる:FR1、CDR1
、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

0033

抗体のVH鎖またはVL鎖は、重鎖定常領域または軽鎖定常領域の全部または一部をさ
らに含むことができ、それによって、それぞれ、重鎖または軽鎖免疫グロブリンを形成す
る。一実施形態において、抗体は、2つの重鎖および2つの軽鎖の4量体であり、重鎖お
よび軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互接続される。重鎖定常領域は、3つ
のドメインCH1、CH2およびCH3から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイ
ンCLから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含
む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の種々の細胞および補体系の第1の成分を含
む宿主の組織および因子への抗体の結合を媒介する。「抗体」という用語は、IgA型、
IgG型、IgE型、IgD型、IgM型、およびそれらの亜型のインタクトな免疫グロ
ブリンを含む。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、IgGアイソタイプである
。いくつかの実施形態において、主題の抗体は、IgG1アイソタイプである。

0034

本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子
によって実質的にコードされる1つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認識
されているヒト免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α(IgA1およびIgA2)、γ(
IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならび
に多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。全長免疫グロブリン軽鎖(約25kDま
たは214個のアミノ酸)は、N末端の可変領域遺伝子(約110個のアミノ酸)および
C末端のκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。全長免疫グロブリン重鎖(約
50kDまたは446個のアミノ酸)は、N末端の可変領域遺伝子(約116個のアミノ
酸)およびC末端の他の前述の定常領域遺伝子のうちの1つ、例えば、(約330個のア
ミノ酸をコードする)γによってコードされる。いくつかの実施形態において、主題の抗
体は、全長免疫グロブリン重鎖および全長免疫グロブリン軽鎖を含む。

0035

いくつかの実施形態において、主題の抗体は、全長免疫グロブリン重鎖および全長免疫
グロブリン軽鎖を含まず、代わりに、全長免疫グロブリン重鎖および全長免疫グロブリン
軽鎖の抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合断片は、別々のポリ
ペプチド鎖上に含まれており、他の実施形態において、抗原結合断片は、単一のポリペプ
チド鎖内に含まれる。「抗原結合断片」という用語は、上述のCD22に特異的に結合す
ることが可能な全長抗体の1つ以上の断片を指す。結合断片の例として、(i)Fab断
片(VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価の断片);(ii)F(ab
’)2断片(ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合される2つのFab断片を含む
二価の断片);(iii)(VHドメインおよびCH1ドメインからなる)Fd断片;(
iv)(抗体の単一アームのVHドメインおよびVLドメインからなる)Fv断片;(v
)(VHドメインからなる)dAb断片;(vi)単離されたCDR;(vii)(VH
ドメインとVLドメインが対になって一価の分子を形成するような組換え手段を用いて、
合成リンカーによって結合される抗体の単一アームのVHドメインおよびVLドメインか
らなる)一本鎖Fv(scFv);(viii)(VHドメインとVLドメインが、対に
ならないで一価の分子を形成するように結合し、scFvの各1つのVHが、他のscF
vのVLドメインと対になって二価の分子を形成する、2つのscFvからなる)ダイア
ディ;(ix)(少なくとも2つの抗原結合領域からなり、各領域が異なるエピトープ
に結合している)二重特異性抗体が挙げられる。いくつかの実施形態において、主題の抗
体断片はFab断片である。いくつかの実施形態において、主題の抗体断片は一本鎖抗体
(scFv)である。

0036

いくつかの実施形態において、主題の抗体は、組換えまたは修飾抗体、例えば、キメラ
抗体、ヒト化抗体、脱免疫化抗体、またはin vitro生成抗体である。本明細書で
使用される「組換え」または「修飾」抗体という用語は、(i)宿主細胞トランスフェ
クトした組換え発現ベクターを用いて発現させる抗体;(ii)組換えコンビナトリアル
抗体ライブラリーから単離された抗体;(iii)ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導
入した動物(例えば、マウス)から単離された抗体;または(iv)ヒト免疫グロブリン
遺伝子配列を他のDNA配列スプライシングすることを含む任意の他の手段によって調
製されたか、発現させたか、作製されたか、または単離された抗体等の、組換え手段によ
って調製されたか、発現させたか、作製されたか、または単離された全ての抗体を含むこ
とが意図される。そのような組換え抗体は、ヒト化抗体、CDR移植抗体、キメラ抗体、
脱免疫化抗体、およびin vitro生成抗体を含み、任意選択的に、ヒト生殖系列
疫グロブリン配列に由来する定常領域を含むことができる。

0037

いくつかの実施形態において、主題の抗体は、アミノ酸配列EVQLVESGGGLV
PGGSLX1LSCAASGFAFSIYDMSWVRQAPGKGLEWVAYI
SSGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNX2LYLQMX3SLRAE
DTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQGTVTVSS(配列番号1
)(X1は、K(Lys)またはR(Arg)であり;X2は、S(Ser)またはT(
Thr)であり;X3は、N(Asn)またはS(Ser)である)を有するVH領域を
含む重鎖と、b)免疫グロブリン軽鎖とを含む。

0038

結果として得られる抗体がCD22に特異的に結合する限り、軽鎖は、任意の好適なV
Lアミノ酸配列を有することができる。

0039

例示的なVLアミノ酸配列として、

0040

IQMTSPSSSASGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKP
GKAVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQQ
DFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK(配列番号7;VK1)、

0041

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKP
GKAVKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQP
EDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK(配列番号8;VK2)、お
よび

0042

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKP
GKAPKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQP
EDFATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK(配列番号9;VK4)が挙
げられる。

0043

したがって、例えば、主題の抗CD22抗体は、a)配列番号1)に記載のアミノ酸配
列を有するVH領域を含む重鎖と、VK1のVL領域を含む軽鎖とを含むことができる。
他の場合において、主題の抗CD22抗体は、a)配列番号1)に記載のアミノ酸配列
を有するVH領域を含む重鎖と、VK2のVL領域を含む軽鎖とを含むことができる。さ
らに他の場合において、主題の抗CD22抗体は、a)配列番号1)に記載のアミノ酸配
列を有するVH領域を含む重鎖と、VK4のVL領域を含む軽鎖とを含むことができる。

0044

場合によっては、主題の抗CD22抗体は、a)アミノ酸配列DIQMTQSPSSX
1SASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAX2KLLIY
YTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQX3EDFATYFC
QQGNTLPWTFGGGTKVEIK(配列番号2)(X1は、L(Leu)または
V(Val)であり;X2は、V(Val)またはP(Pro)であり;X3は、Q(G
ln)またはP(Pro)である)を含む免疫グロブリン軽鎖と、b)免疫グロブリン重
鎖とを含む。重鎖は、

0045

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQA
PGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNTLY
LQMSSLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQGTLVT
VSS (配列番号3;VH3)、

0046

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSIYDMSWVRQA
PGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLY
LQMSSLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQGTLVT
VSS (配列番号4;VH4)、

0047

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQA
PGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLY
LQMNSLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQGTLVT
VSS (配列番号5;VH5)、および

0048

EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSIYDMSWVRQA
PGKGLEWVAYISSGGGTTYYPDTVKGRFTISRDNAKNSLY
LQMSSLRAEDTAMYYCARHSGYGSSYGVLFAYWGQGTLVT
VSS(配列番号6;VH6)から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。

0049

主題の抗体を使用するのに好適なリンカーは、「可動性リンカー」を含む。存在する場
合、リンカー分子は、一般的に、結合された領域間のある程度の柔軟な動き許容するの
に十分な長さである。リンカー分子は、一般的に、約6〜50原子の長さである。またリ
ンカー分子は、例えば、アリールアセチレン、2〜10単量体単位を含むエチレングリコ
ールオリゴマージアミン、二酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであってもよい
。ポリペプチドに結合することができる他のリンカー分子は、本開示を考慮して使用され
得る。

0050

主題の抗体は、「ヒト化」抗体であってもよい。「ヒト化抗体」という用語は、実質的
ヒト抗体鎖に由来する可変領域フレームワーク残基(アクセプター免疫グロブリンまた
は抗体と称される)と、実質的にマウス抗体に由来する少なくとも1つのCDR(ドナー
免疫グロブリンまたは抗体と称される)とを含む少なくとも1つの鎖を含む抗体を指す。
Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1
0029 10033(1989)、米国特許第5,530,101号、米国特許第5,
585,089号、米国特許第5,693,761号、国際公開第WO90/07861
号、および米国特許第5,225,539号を参照のこと。定常領域(複数可)は、存在
する場合、実質的にまたは完全に、ヒト免疫グロブリンにも由来し得る。ヒト化抗体の作
製方法は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第7,256,273号を参照
のこと。

0051

例えば、ヒト可変ドメインフレームワークが、CDRの起源であるマウス可変フレーム
ワークと同じかまたは同様の立体構造をとる場合、マウスCDRをヒト可変ドメインフレ
ームワークに置換することにより、それらの正確な空間的配向を保持することができる。
これは、そのフレームワーク配列が、CDRが由来するマウス可変フレームワークドメイ
ンとの高度な配列同一性を示すヒト抗体からヒト可変ドメインを得ることによって達成す
ることができる。重鎖および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じかまたは異なるヒト抗
体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であってもよいか
、またはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であってもよい。Kettleboro
ugh et al.,Protein Engineering 4:773(199
1);Kolbinger et al.,Protein Engineering
6:971(1993)を参照のこと。

0052

マウスドナー免疫グロブリンおよび適切なヒトアクセプター免疫グロブリンの相補性決
定領域を同定したら、次のステップは、結果として得られるヒト化抗体の特性を最適化す
るために、これらの成分のどの残基(存在する場合)を置換するべきかを決定することで
ある。一般に、マウス残基の導入は、ヒトにおいて抗体によるヒト抗マウス抗体(HA
A)応答を誘発するリスクを増大させるため、マウスによるヒトアミノ酸残基の置換は最
小限に抑えられるべきである。当該技術分野で認識されている免疫応答を決定する方法は
、特定の患者においてまたは臨床試験の間にHAMA応答を監視するために行うことがで
きる。ヒト化抗体を投与された患者には、前記治療薬の投与の開始時におよび全体を通し
免疫原性の評価が行われてもよい。HAMA応答は、例えば、表面プラズモン共鳴技術
(BIACORE)および/または固相ELISA分析を含む当業者に既知の方法を用い
て、患者由来血清試料中でヒト化治療試薬に対する抗体を検出することによって測定さ
れる。多くの実施形態において、主題のヒト化抗体は、ヒト対象において実質的にHAM
A応答を誘発しない。

0053

ヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸は、それらがCDR立体構造お
よび/または抗原への結合に及ぼすと考えられる影響に基づいて、置換のために選択され
る。ヒト可変フレームワーク領域を有するマウスCDR領域の不自然並置は、不自然な
構造的制約を生じる可能性があり、特定のアミノ酸残基の置換によって修正されない限
り、結合親和性の損失を引き起こす。

0054

置換のためのアミノ酸残基の選択は、一部、コンピュータモデリングによって決定され
てもよい。免疫グロブリン分子三次元画像を生成するためのコンピュータハードウェア
およびソフトウェアは、当該技術分野で既知である。一般に、分子モデルは、免疫グロブ
リン鎖またはそのドメインに関する解明済の構造から出発して生成される。モデル化され
る鎖は、アミノ酸配列類似性について解明済みの三次元構造の鎖またはドメインと比較さ
れ、最も高い配列類似性を示す鎖またはドメイン(単数または複数)が、分子モデルの構
築の出発点として選択される。少なくとも50%の配列同一性を共有する鎖またはドメイ
ンが、モデリングのために選択され、好ましくは、少なくとも60%、70%、80%、
90%、またはそれ以上の配列同一性を共有する鎖またはドメインが、モデリングのため
に選択される。解明済みの出発構造は、モデル化されている免疫グロブリン鎖またはドメ
イン内の実際のアミノ酸と、出発構造内のアミノ酸との間の違いを許容するように修飾さ
れる。次いで、修飾された構造が、複合免疫グロブリンに組み立てられる。最後に、モデ
ルは、エネルギー最小化によって、また全ての原子が互いから適切な距離内にあること、
ならびに結合の長さおよび角度が化学的に許容される限度内にあることを検証することに
よって、精密化される。

0055

CDRおよびフレームワーク領域は、Kabat,Sequences of Pro
teins of Immunological Interest(National
Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987
and 1991)によって定義される通りである。代替の構造の定義は、Chothi
a et al.,J.Mol.Biol.196:901(1987);Nature
342:878(1989);およびJ.Mol.Biol.186:651(198
9)(集合的に「Chothia」と称される)によって提唱されている。上記Kaba
tによって定義されるフレームワーク残基が、上記Chothiaによって定義されるよ
うな構造ループ残基を構成する場合、マウス抗体中に存在するアミノ酸が、ヒト化抗体へ
の置換のために選択されてもよい。「CDR領域に隣接する」残基は、ヒト化免疫グロブ
リン鎖の一次配列内のCDRのうちの1つ以上に直接隣接する位置、例えば、Kabat
によって定義されるようなCDRまたはChothiaによって定義されるようなCDR
に直接隣接する位置にあるアミノ酸残基を含む(例えば、Chothia and Le
sk JMB 196:901(1987)を参照)。これらのアミノ酸は、CDR内の
アミノ酸と相互作用する可能性が特に高く、アクセプターから選択された場合、ドナーC
DRを歪め、親和性を低下させる。さらに、隣接するアミノ酸は、抗原と直接相互作用し
てもよく(Amit et al.,Science,233:747(1986))、
ドナーからこれらのアミノ酸を選択することは、元の抗体において親和性を提供する全て
の抗原接触を維持するために望ましいかもしれない。

0056

いくつかの実施形態において、主題の抗体は、scFv多量体を含む。例えば、いくつ
かの実施形態において、主題の抗体は、scFv二量体(例えば、2つのタンデムscF
vを含む(scFv2))、scFv三量体(例えば、3つのタンデムscFvを含む(
scFv3))、scFv四両体(例えば、4つのタンデムscFvを含む(scFv4
))、または4つより多くのscFvの多量体(例えば、タンデム)である。scFv単
量体は、約2アミノ酸〜約10アミノ酸長、例えば、2aa、3aa、4aa、5aa、
6aa、7aa、8aa、9aa、または10aaの長さのリンカーを介して、タンデム
に結合することができる。好適なリンカーは、例えば、(Gly)xを含み、xは、2〜
10の整数である。他の好適なリンカーは、上述したものである。いくつかの実施形態に
おいて、上述のように、主題のscFV多量体中のscFv単量体の各々がヒト化される

0057

いくつかの実施形態において、主題の抗体は、免疫グロブリンの定常領域(例えば、F
c領域)を含む。Fc領域は、存在する場合、ヒトFc領域であってもよい。定常領域が
存在する場合、抗体は、軽鎖定常領域および重鎖定常領域の両方を含むことができる。好
適な重鎖定常領域は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を含む。本明
細書に記載される抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEを含む全種類の
定常領域と、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含むあらゆるアイソタイ
プを有する抗体を含む。好適な重鎖Fc領域の例は、ヒトアイソタイプIgG1 Fcで
ある。軽鎖定常領域は、λまたはκであり得る。主題の抗体(例えば、主題のヒト化抗体
)は、1つより多くのクラスまたはアイソタイプからの配列を含むことができる。抗体は
、2つの軽鎖および2つの重鎖を含む四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Fab、
Fab’ F(ab’)2、およびFvとして、または軽鎖および軽鎖可変ドメインがス
ペーサーによって結合された一本鎖抗体として、発現させることができる。

0058

いくつかの実施形態において、主題の抗体は、カルボキシル末端に遊離チオール(−S
H)基を含み、遊離チオール基は、抗体を第2のポリペプチド(例えば、主題の抗体を含
む別の抗体)、足場担体等に付着させるために使用することができる。

0059

いくつかの実施形態において、主題の抗体は、1つ以上の天然には存在しないアミノ酸
を含む。いくつかの実施形態において、天然にはコードされないアミノ酸は、カルボニル
基、アセチル基アミノオキシ基ヒドラジン基ヒドラジド基セミカルバジド基、ア
ジド基、またはアルキン基を含む。好適な天然には存在しないアミノ酸については、例え
ば、米国特許第7,632,924号を参照のこと。天然には存在しないアミノ酸の包含
により、ポリマー、第2のポリペプチド、足場等への結合を提供することができる。例え
ば、水溶性ポリマーに結合された主題の抗体は、カルボニル基を含む水溶性ポリマー(例
えば、PEG)を、アミノオキシヒドラジンヒドラジド、またはセミカルバジド基を
含む天然にはコードされないアミノ酸を含む主題の抗体と反応させることにより作製する
ことができる。別の例として、水溶性ポリマーに結合された主題の抗体は、アルキン含有
アミノ酸を含む主題の抗体を、アジド部分を含む水溶性ポリマー(例えば、PEG)と反
応させることにより作製することができる:いくつかの実施形態において、アジドまたは
アルキン基は、アミド結合を介してPEG分子と結合される。「天然にはコードされない
アミノ酸」は、20の共通アミノ酸のうちの1つまたはピロリジンまたはセレノステイ
ンではないアミノ酸を指す。「天然にはコードされないアミノ酸」と同義に用いられ得る
他の用語は、「天然ではないアミノ酸」、「非天然のアミノ酸」、「天然には存在しない
アミノ酸」、およびそれらの様々なハイフン付およびハイフンの付かない型である。「天
然にはコードされないアミノ酸」という用語は、天然にコードされたアミノ酸(20の共
通アミノ酸またはピロリジンおよびセレノシステインを含むが、これらに限定されない)
の修飾(例えば、翻訳後修飾)によって生じるが、それら自体は、成長中のポリペプチド
鎖内に翻訳複合体によって天然の状態では組み込まれないアミノ酸も含むが、これらに限
定されない。そのような天然には存在しないアミノ酸の例として、限定されないが、N−
アセチルグルコサミニル−L−セリン、N−アセチルグルコサミニル−L−スレオニン
およびO−ホスホチロシンが挙げられる。

0060

本開示はまた、対象となる付着部分、例えば、検出可能な標識、薬物、半減期延長部分
等を有する抗CD22抗体も提供する。抗体の修飾は、様々な合成および/または組換え
方法によって達成することができる。抗体に付着する部分(単数または複数)は、多様な
機能または特徴おのうちの1つ以上を提供することができる。例示的な部分として、検出
可能な標識(例えば、色素標識(例えば、発色団フルオロフォア)、生物物理学的プロ
ーブ(スピン標識核磁気共鳴(NMRプローブ)、フェルスター共鳴エネルギー移動
(FRET)型標識(例えば、フルオロフォア/消光剤対の少なくとも1つのメンバーを
含むFRET対の少なくとも1つのメンバー)、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET
)型標識(例えば、BRET対の少なくとも1つのメンバー)、免疫検出可能なタグ(例
えば、FLAG、His(6)等);水溶性ポリマー(例えば、ペグ化);精製用タグ
例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる単離を促進するため(例えば、FLA
Gエピトープの付着;膜局在化ドメイン(例えば、脂質またはグリコシルホスファチジ
イノシトール(GPI)−型アンカー);固定用タグ(例えば、選択可能な付着を含む
、ポリペプチドの表面への付着を促進するため);薬物(例えば、例えば、薬物の抗体へ
の付着による、薬物標的化を促進するため)等が挙げられる。

0061

いくつかの実施形態において、主題の抗体は、ポリマー(例えば、ポリペプチド以外の
ポリマー)に結合される(例えば、共有結合)。好適なポリマーは、例えば、生体適合性
ポリマー、および水溶性生体適合性ポリマーを含む。好適なポリマーは、合成ポリマー
よび天然に存在するポリマーを含む。好適なポリマーは、例えば、置換もしくは非置換の
直鎖もしくは分岐鎖ポリアルキレンポリアルケニレン、もしくはポリオキシアルキレ
ンポリマー、または分岐もしくは非分岐の多糖類、例えば、ホモもしくはヘテロ多糖を含
む。好適なポリマーは、例えば、エチレンビニルアルコールコポリマー(一般には、一般
名EVOHまたは商品名EVALによって知られる);ポリブチルメタクリレート;ポリ
ヒドロキシバレレート);ポリ(L−乳酸);ポリカプロラクトン;ポリ(ラクチ°−
co−グリコリド);ポリ(ヒドロキシブチレート);ポリ(ヒドロキシブチレート−c
o−バレレート);ポリジオキサノンポリオルトエステルポリ酸無水物;ポリ(グリ
コール酸);ポリ(D,L−乳酸);ポリ(グリコール酸−co−トリメチレンカーボ
ート);ポリホスホエステル;ポリホスホエステルウレタン;ポリ(アミノ酸);シア
アクリレート;ポリ(トリメチレンカーボネート);ポリ(イミノカーボネート);コポ
リ(エーテルエステル)(例えば、ポリ(エチレンオキシド)−ポリ(乳酸)(PEO
PLA)コポリマー);ポリアルキレンオキサレートポリホスファゼン生体分子
例えば、フィブリンフィブリノゲンセルロースデンプンコラーゲンおよびヒアル
ロン酸;ポリウレタンケイ素ポリエステルポリオレフィンポリイソブチレンおよ
エチレンαオレフィンコポリマー;アクリルポリマーおよびコポリマー;ハロゲン化
ビニルポリマーおよびコポリマー、例えば、塩化ポリビニルポリビニルエーテル、例え
ば、ポリビニルメチルエーテル;ハロゲン化ポリビニリデン、例えば、フッ化ポリビニリ
デンおよび塩化ポリビニリデン;ポリアクリロニトリル;ポリビニルケトン;ポリビニル
芳香族、例えばポリスチレンポリビニルエステル、例えば、ポリ酢酸ビニルビニル
量体同士のコポリマーおよびオレフィンとのコポリマー、例えば、エチレン−メチルメタ
クリレートコポリマー、アクリロニトリル−スチレンコポリマー、ABS樹脂、およびエ
レン酢酸ビニルコポリマーポリアミド、例えば、Nylon 66およびポリカプ
ラクタムアルキド樹脂ポリカーボネートポリオキシメチレンポリイミド;ポリ
エーテル;エポキシ樹脂;ポリウレタン;レーヨン;レーヨン−トリアセテートセルロ
ース;酢酸セルロース酪酸セルロース;酢酸酪酸セルロースセロファン硝酸セルロ
ース;プロピオン酸セルロースセルロースエーテルアモルファスTeflon;ポリ
エチレングリコール);およびカルボキシメチルセルロースを含む。

0062

好適な合成ポリマーは、非置換および置換の直鎖または分岐鎖ポリ(エチレングリコー
ル)、ポリ(プロピレングリコール)ポリ(ビニルアルコール)、およびそれらの誘導体
、例えば、置換ポリ(エチレングリコール)、例えば、メトキシポリ(エチレングリコー
ル)、およびそれらの誘導体を含む。好適な天然に存在するポリマーは、例えば、アルブ
ミン、アミロースデキストラングリコーゲンおよびそれらの誘導体を含む。

0063

好適なポリマーは、500Da〜50000Da、例えば、5000Da〜40000
Da、または25000〜40000Daの範囲の平均分子量を有することができる。例
えば、いくつかの実施形態において、主題の抗体が、ポリ(エチレングリコール)(PE
G)またはメトキシポリ(エチレングリコール)ポリマーを含む場合、PEGまたはメト
キシポリ(エチレングリコール)ポリマーは、約0.5キロダルトン(kDa)〜1kD
aの範囲、約1kDa〜5kDa、5kDa〜10kDa、10kDa〜25kDa、2
5kDa〜40kDa、または40kDa〜60kDaの範囲の分子量を有することがで
きる。

0064

上述のように、いくつかの実施形態において、主題の抗体は、PEGポリマーに共有結
合される。いくつかの実施形態において、主題のscFv多量体は、PEGポリマーに共
有結合される。タンパク質のペグ化に好適な方法および試薬は、当該技術分野で周知であ
り、例えば、米国特許第5,849,860号に見出だすことができる。タンパク質との
コンジュゲーションに好適なPEGは、一般的に、室温で水溶性であり、一般式R(O−
CH2−CH2)nO−Rを有し、式中、Rは、水素、または、例えば、アルキルもしく
アルカノール基等の保護基であり、nは、1〜1000の整数である。Rは、保護基で
あり、一般的に1〜8個の炭素を有する。

0065

主題の抗体にコンジュゲートされるPEGは、直鎖である。主題のタンパク質にコン
ゲートされるPEGは、分岐鎖であってもよい。米国特許第5,643,575号に記
載されるような分岐鎖PEG誘導体、Shearwater Polymers, In
c.のカタログポリエチレンGlycol Derivatives 1997−1
998」に記載されるような「星形PEG」および多アームPEG。星形PEGは、技術
分野に記載されている(例えば、米国特許第6,046,305号を含む)。

0066

主題の抗体は、グリコシル化することができ、例えば、主題の抗体は、共有結合された
炭水化物または多糖部分を含むことができる。抗体のグリコシル化は、典型的にはN結合
型またはO結合型のいずれかである。N結合は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部
分の付着を指す。Xがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列アスパラ
ギン−X−セリンおよびアスパラギン−X−スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化
物部分の酵素的付着の認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリ
ペプチド配列のうちのいずれかの存在が、潜在的なグリコシル化部位を作成する。O結合
型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの、
N−アセチルガラクトサミンガラクトース、またはキシロースといった糖類のうちの1
つの付着を指すが、5−ヒドロキシプロリンまたは5−ヒドロキシリジンも用いられ得る
。グリコシル化は、例えば、所望のグリコシル化機構を有する宿主細胞における組換え生
成によって、達成することができる。

0067

抗体へのグリコシル化部位の付加は、上記トリペプチド配列のうちの1つ以上を含むよ
うにアミノ酸配列を改変することにより、都合よく達成される(N結合型グリコシル化部
位の場合)。改変はまた、元の抗体の配列に対する1つ以上のセリンまたはスレオニン残
基の付加または置換によってなされてもよい(O結合型グリコシル化部位の場合)。同様
に、グリコシル化部位の除去は、抗体の天然グリコシル化部位内のアミノ酸改変によって
達成されてもよい。

0068

主題の抗体は、例えば、グルタルアルデヒド、ホモ二官能性架橋剤、またはヘテロ官能
性架橋剤を用いて、第2の部分(例えば、脂質、主題の抗体以外のポリペプチド、合成ポ
リマー、炭水化物等)に共有結合することができる。グルタルアルデヒドは、それらのア
ミノ部分を介してポリペプチドに架橋する。ホモ二官能性架橋剤(例えば、ホモ二官能性
イミドエステル、ホモ二官能性N−ヒドロキシサクシニミジル(NHS)エステル、また
はホモ二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤)は、2つ以上の反応性部分を含み、結合さ
れるポリペプチドの混合物を含む溶液に架橋剤が添加される一段階反応に用いることがで
きる。ホモ二官能性NHSエステルおよびイミドエステルは、アミノ含有ポリペプチド
架橋する。穏かなアルカリ性のpHでは、イミドエステルが1級アミンのみと反応してイ
ドアミドを形成し、架橋されたポリペプチドの全体的な電荷は影響を受けない。ホモ二
官能性スルフヒドリル反応性架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン(BMH)、1,5−ジ
フルオロ−2,4−ジニトロベンゼン(DFDNB)、および1,4−ジ−(3’,2’
ピリジルジチオプロピオンアミドブタンDPDPB)を含む。

0069

ヘテロ二官能性架橋剤は、2つ以上の異なる反応性部分(例えば、アミン反応性部分お
よびスルフヒドリル反応性部分)を有し、アミンまたはスルフヒドリル反応性部分を介し
てポリペプチドのうちの一方に架橋され、次いで、未反応部分を介して他のポリペプチド
と反応させる。ピリジルジスルフィド架橋剤等の複数のヘテロ二官能性ハロアセチル架橋
剤が利用可能である。カルボジイミドは、カルボキシルをアミンとカップリングさせてア
ミド結合をもたらす、ヘテロ二官能性架橋試薬の古典的な例である。

0070

主題の抗体は、固体支持体に固定化することができる。好適な支持体は、当該技術分野
で周知であり、とりわけ、市販のカラム材料ポリスチレンビーズラテックスビーズ
磁気ビーズコロイド金属粒子ガラスおよび/またはケイ素のチップおよび表面、ニト
ロセルロースストリップナイロン膜シートデュラサイト反応トレーウェル(例
えば、マルチウェルプレート)、プラスチックチューブ等を含む。固体支持体は、例えば
、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボ
ネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および改質セルロース、ポリアク
ルアミド、アガロース、およびマグネタイトを含む、様々な物質のいずれを含んでもよい
。主題の抗体を固体支持体に固定化するための好適な方法は周知であり、イオン性、疎水
性、共有結合性の相互作用等を含むが、これらに限定されない。固体支持体は、例えば、
水溶液中で可溶性または不溶性であってもよい。いくつかの実施形態において、好適な固
体支持体は、一般的に水溶液中で不溶性である。

0071

主題の抗体は、いくつかの実施形態において、検出可能な標識を含むことができる。好
適な検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的電気的、光学的、
または化学的手段によって検出可能なあらゆる組成物を含む。好適な標識は、磁気ビーズ
(例えば、Dynabeads(商標))、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオ
シアナートテキサスレッドローダミン緑色蛍光タンパク質赤色蛍光タンパク質、
黄色蛍光タンパク質等)、放射標識(例えば、3H、125I、35S、14C、または
32P)、酵素(例えば、西ワサビペルオキシダーゼアルカリホスファターゼルシ
フェラーゼ、および酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)で一般的に使用される他の酵
素)、コロイド金または色ガラスまたはプラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリプ
ピレンラテックス等)ビーズ等の比色標識を含むが、これらに限定されない。

0072

いくつかの実施形態において、主題の抗体は、造影剤または放射性同位体を含み、造影
剤または放射性同位体は、例えば、撮像において、例えば、ヒトに対して実行される撮像
手順において、検出可能な標識として使用するのに好適なものである。標識の非限定的な
例として、1231I(ヨウ素)、18F(フッ素)、99Tc(テクネチウム)、11
1In(インジウム)、および67Ga(ガリウム)等の放射性同位体、ならびに、ガド
リニウム(Gd)、ジスプロシウム、および鉄等の造影剤が挙げられる。放射性Gd同位
体(153Gd)も利用可能であり、非ヒト哺乳動物における撮像手順に好適である。

0073

主題の抗体は、標準的な技術を用いて標識することができる。例えば、主題の抗体は、
クロラミンTまたは1,3,4,6−テトラクロロ−3α,6α−ジフェニルグリコルリ
ルを用いてヨウ素化することができる。フッ素付加のために、フッ化物イオン変位反応に
よる合成中にフッ素を主題の抗体に加える。そのような放射性同位体を有するタンパク質
の合成の検討については、Muller−Gartner,H.,TIB Tech.,
16:122−130(1998)およびSaji,H.,Crit.Rev.Ther
.Drug Carrier Syst.,16(2):209−244(1999)を
参照のこと。主題の抗体はまた、標準的な技術によって造影剤で標識することもできる。
例えば、主題の抗体は、Gdジエチレントリアミン五酢酸(GdDTPA)またはGdテ
トラアザシクロドデカンテトラ酢酸(GdDOTA)等の低分子Gdキレートを抗体にコ
ンジュゲートすることによりGdで標識することができる。Caravan et al
.,Chem.Rev.99:2293−2352(1999)およびLauffer
et al.,J.Magn.Reson.Imaging,3:11−16(1985
)を参照のこと。主題の抗体は、例えば、ポリリジン−Gdキレートを抗体にコンジュゲ
ートすることによりGdで標識することができる。例えば、Curtet et al.
,Invest.Radiol.,33(10):752−761(1998)を参照の
こと。代替として、主題の抗体は、Gdキレート剤脂質を含む常磁性重合リポソーム
アビジンおよびビオチン化抗体とともにインキュベートすることによりGdで標識するこ
とができる。例えば、Sipkins et al.,Nature Med.,4:6
23−626(1998)を参照のこと。

0074

主題の抗体に結合することができる適切な蛍光タンパク質は、限定されないが、例えば
、米国特許第6,066,476号、同第6,020,192号、同第5,985,57
7号、同第5,976,796号、同第5,968,750号、同第5,968,738
号、同第5,958,713号、同第5,919,445号、同第5,874,304号
に記載されるオワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質またはその変異体または誘導体;例
えば、改良型FP(例えば、Clontech,Inc.から市販されている多くのそ
のようなGFP);赤色蛍光タンパク質;黄色蛍光タンパク質;例えば、Matz et
al.(1999)Nature Biotechnol.17:969−973に記
載される花虫類種に由来する様々な蛍光タンパク質および有色タンパク質のいずれか等を
含む。

0075

主題の抗体は、いくつかの実施形態において、「放射線不透過性」標識、例えば、X線
を用いて容易に可視化することができる標識を含む。放射線不透過性物質は、当業者に周
知である。最も一般的な放射線不透過性物質は、限定されないが、ヨウ化物臭化物、ま
たはバリウム塩を含む。他の放射線不透過性物質も既知であり、有機ビスマス誘導体(例
えば、米国特許第5,939,045号を参照)、放射線不透過性マルチウレタン(米国
特許第5,346,981号を参照)、有機ビスマス複合材料(例えば、米国特許第5,
256,334号を参照)、放射線不透過性バリウム多量体複合体(例えば、米国特許第
4,866,132号を参照)等を含む。

0076

主題の抗体を、いくつかの実施形態において、融合パートナー、例えば、リガンド;エ
ピトープタグ;ペプチド;および抗体以外のタンパク質等に結合(例えば、共有結合また
非共有結合)させる。好適な融合パートナーは、in vivoでの安定性強化(例
えば、血清半減期の増加)を付与する;精製の容易さ等を提供する;細胞からの融合タン
パク質の分泌を提供する;エピトープタグ、例えば、(His)n、例えば、6His等
を提供する;細胞からの融合タンパク質の分泌を提供する;エピトープタグ、例えば、G
ST、ヘマグルチニン(HA;例えば、CYPYDVPDYA;配列番号10)、FLA
G(例えば、DYKDDDDK;配列番号11)、c−myc(例えば、CEQKLIS
EEDL;配列番号12)等を提供する;検出可能なシグナル、例えば、検出可能な生成
物を産生する酵素(例えば、β−ガラクトシダーゼルシフェラーゼ)、またはそれ自体
が検出可能なタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光
タンパク質等を提供する;多量体化、例えば、免疫グロブリンのFc部等の多量体ドメイ
ン等を提供する、ペプチドおよびポリペプチドを含む。

0077

融合はまた、例えば、同定または精製に有用な、固体支持体に固定化されたもの等の、
結合パートナーと相互作用することができるペプチド配列を含む親和性ドメインも含むこ
とができる。ヒスチジン等の連続した単一アミノ酸は、タンパク質と融合させると、ニッ
ケルセファロース等の樹脂カラムへの高い親和性結合によって、融合タンパク質の一段階
精製に用いることができる。親和性ドメインの例として、His5(HHHHH)(配列
番号13)、HisX6(HHHHHH)(配列番号14)、C−myc(EQKLIS
EEDL)(配列番号15)、Flag(DYKDDDDK)(配列番号16)、Str
epTag(WSHPQFEK)(配列番号17)、赤血球凝集素、例えば、HAタグ(
YPYDVPDYA;配列番号18)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST
)、チオレドキシンセルロース結合ドメイン、RYIRS(配列番号19)、Phe−
His−His−Thr(配列番号20)、キチン結合ドメイン、S−ペプチド、T7ペ
プチド、SH2ドメイン、C末端RNAタグ、WEAAAREACCECCARA(配
列番号21)、金属結合ドメイン、例えば、亜鉛結合ドメイン、または、例えば、カル
ウム結合タンパク質、例えば、カルモジュリントロポニンC、カルシニューリンB、ミ
シン軽鎖、リカバリン、S−モジュリン、ビジニン、VILIP、ニューロカルシン
ヒポカルシン、フリクエニン、カルトクチンカルパイン大サブユニット、S100タ
ンパク質、パルブアルブミンカルビンジンD9K、カルビンジンD28K、およびカル
レチニン、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、MyoD、ロイシンジッパー
列、ならびにマルトース結合タンパク質に由来するドメイン等のカルシウム結合ドメイン
が挙げられる挙げられる。

0078

いくつかの実施形態において、主題の抗体は、ポリアミン修飾を含む。主題の抗体は、
天然に存在するかまたは合成であるポリアミンで修飾することができる。例えば、米国特
許第5,670,477号を参照のこと。有用な天然に存在するポリアミンは、プトレシ
ン、スペルミジンスペルミン、1,3−ジアミノプロパンノルスペルミジン、合成ホ
モスペルジンテルミンテルモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミ
ン、およびカナバルミンを含む。プトレシン、スペルミジン、およびスペルミンは、特に
有用である。合成ポリアミンは、実験式CXHYNZで構成され、1〜6個のNR部分ま
たはN(R)2部分(式中、Rは、H、(C1−C4)アルキル、フェニル、またはまた
ベンジルである)をさらに含む、環式または非環式の、分枝または非分枝の3〜12炭
素原子炭化水素鎖であり得る。ポリアミンは、任意の標準的な架橋法を用いて抗体に結
合させることができる。

0079

いくつかの実施形態において、主題の抗体は、炭水化物部分を含むように修飾され、炭
化物部分は、抗体に共有結合することができる。いくつかの実施形態において、主題の
抗体は、脂質部分を含むように修飾され、脂質部分は、抗体に共有結合することができる
。好適な脂質部分は、例えば、N−ラウロイル、N−オレオイル等のN−脂肪族アシル基
ドデシルアミン、オレオイルアミン等の脂肪族アミン;C3〜C16長鎖脂肪族脂質
等を含む。例えば、米国特許第6,638,513を参照のこと。いくつかの実施形態に
おいて、主題の抗体は、リポソームに組み込まれる。

0080

本開示の抗CD22抗体が共有結合された異種部分を含む場合、異種部分を直接的にま
たはリンカーを介して抗CD22の重鎖および/または軽鎖に結合することができる。好
適なリンカーは容易に選択することができ、1アミノ酸長(例えば、Gly)〜20アミ
ノ酸長、2アミノ酸長〜15アミノ酸長、3アミノ酸長〜12アミノ酸長(4アミノ酸長
〜10アミノ酸長、5アミノ酸長〜9アミノ酸長、6アミノ酸長〜8アミノ酸長、または
7アミノ酸長〜8アミノ酸長を含む)等の任意の好適な異なる長さであってもよく、1、
2、3、4、5、6、または7アミノ酸長であってもよい。

0081

可動性リンカーの例として、グリシンポリマー(G)n、グリシン−セリンポリマー(
例えば、(GS)n、GSGGSn(配列番号22)、およびGGGSn(配列番号23
)を含み、式中、nは、少なくとも1の整数である)、グリシン−アラニンポリマー、ア
ラニン−セリンポリマー、および当該分野で既知の他の可動性リンカーが挙げられる。グ
リシンおよびグリシン−セリンポリマーは、これらのアミノ酸のどちらも比較的構造化
れておらず、したがって成分間の中立的なテザーとしての役割を果たし得るため、興味
い。グリシンポリマーは、グリシンが、アラニンよりも有意に大きなΦ‐Ψ空間に到達し
、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ないため、特に興味深い(Sche
raga,Rev.Computational Chem.11173−142(19
92)を参照のこと)。例示的な可動性リンカーとして、限定されないが、GGSG(配
列番号24)、GGSGG(配列番号25)、GSGSG(配列番号26)、GSGGG
(配列番号27)、GGGSG(配列番号28)、GSSSG(配列番号29)等が挙げ
られる。当業者は、上述の任意の要素にコンジュゲートしたポリペプチドの設計が、全て
または部分的に可動性であるリンカーを含むことができ、そのため、リンカーが、可動性
リンカーだけでなく、可動性の低い構造を付与する1つ以上の部分も含むことができるこ
とを認識するであろう。

0082

抗体の修飾のための方法
抗体は、様々な方法のいずれかの使用により、共有結合的に付着した異種部分(例えば
、検出可能な標識、薬物等)を有するように修飾することができる。本開示は、対象とな
る部分にコンジュゲートされた抗CD22抗体を提供し、対象となる部分にコンジュゲー
トされた抗CD22抗体は、「抗CD22抗体コンジュゲート」と称される。本開示の抗
CD22抗体コンジュゲートは、1)対象となる部分にコンジュゲートされたIg重鎖
定常領域、および対象となる部分にコンジュゲートされたIg軽鎖定常領域;2) 対象
となる部分にコンジュゲートされたIg重鎖定常領域、および対象となる部分にコンジュ
ゲートされていないIg軽鎖定常領域、または3)対象となる部分にコンジュゲートされ
ていないIg重鎖定常領域、および対象となる部分にコンジュゲートされたIg軽鎖定常
領域を含む。主題の抗CD22抗体コンジュゲートは、VHおよび/またはVLドメイン
も含むことができる。

0083

一例において、抗体は、異種部分の付着のための化学ハンドルとして機能することがで
きる2−ホルミルグリシン残基を含むように修飾することができる。例えば、本開示の抗
CD22の重鎖および/または軽鎖定常領域は、2−ホルミルグリシン生成酵素(FGE
)の作用によって2−ホルミルグリシン(FGly)を含むように変換されることが可能
な、スルファターゼモチーフのアミノ酸配列を含むように修飾することができる。そのよ
うなスルファターゼモチーフはまた、本明細書においてFGE修飾部位と称されてもよい
。FGEが免疫グロブリンポリペプチド内に位置するスルファターゼモチーフとして作用
するという点において、FGEの作用は、配列特異的な様式で誘導される。対象となる部
分は、タグ化Igポリペプチドの変換されたアルデヒドタグのFGly残基のアルデヒド
との反応のための反応パートナーの構成要素として提供される。対象となる部分の、アル
デヒドタグ化IgポリペプチドのFGly残基への付着を達成するために、多様な市販の
試薬を使用することができる。例えば、多数の対象となる部分のアミノオキシ、ヒドラ
ン、またはチオセミカルバジド誘導体が、好適な反応パートナーであり、容易に利用可能
であるか、または標準的な化学的方法を用いて作製することができる。

0084

例えば、ポリ(エチレングリコール)(PEG)部分をタグ化Igポリペプチドに付着
させるために、標準プロトコルを用いて、モノアミノ−PEGおよびアミノオキシグリシ
ンからアミノオキシ−PEG を作製することができる。次いで、アミノオキシ−PEG
を変換された(例えば、FGly修飾)アルデヒドタグ化Igポリペプチドと反応させて
PEG部分の付着を提供することができる。変換されたアルデヒドタグ化ポリペプチド
へのビオチン部分の送達は、アミノオキシビオチンビオチンヒドラジド、または2,4
ジニトロフェニルヒドラジンを用いて達成することができる。

0085

アルデヒドタグの最小スルファターゼモチーフは、通常、5または6アミノ酸残基長で
あり、通常、6アミノ酸残基長以下である。Igポリペプチド中に提供されるスルファ
ーゼモチーフは、16,15、14、13、12、11、10、9、8、または7アミノ
酸残基長未満のスルファターゼモチーフを定義するために、少なくとも5または6アミノ
酸残基であり、例えば、5〜16、6〜16、5〜15、6〜15、5〜14、6〜14
、5〜13、6〜13、5〜12、6〜12、5〜11、6〜11、5〜10、6〜10
、5〜9、6〜9、5〜8、または6〜8アミノ酸残基長であってもよい。特定の実施形
態において、用いられるスルファターゼモチーフは、以下の式によって説明することがで
きる:

0086

X1Z1X2Z2X3Z3 (I)

0087

式中、

0088

Z1は、システインまたはセリンであり((C/S)によっても表すことができる);

0089

Z2は、プロリンまたはアラニン残基のいずれかであり((P/A)によっても表すこ
とができる);

0090

Z3は、塩基性アミノ酸(例えば、アルギニン(R)であり、かつリジン(K)もしく
はヒスチジン(H)であってもよく、通常はリジンである)、または脂肪族アミノ酸(ア
ラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)、バリン(V)、イソロイシン(I)、
もしくはプロリン(P)、通常、A、G、L、V、もしくはIであり;

0091

X1は、存在するかまたは存在せず、存在する場合は任意のアミノ酸であってもよいが
、通常、脂肪族アミノ酸、硫黄含有アミノ酸、または極性の非荷電アミノ酸(すなわち、
芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外)であり、通常、L、M、V、SまたはT、より
一般的にはL、M、S、またはVであるが、但し、スルファターゼモチーフが標的ポリペ
プチドのN末端にある場合はX1が存在し、

0092

X2およびX3は、独立して任意のアミノ酸であってもよいが、通常、脂肪族アミノ酸
、極性の非荷電アミノ酸、または硫黄含有アミノ酸(すなわち、芳香族アミノ酸または荷
電アミノ酸以外)であり、例えば、S、T、A、V、GまたはC、例えば、S、T、A、
VまたはGである。一例において、アルデヒドタグは、式L(C/S)TPSR(配列番
号30)、例えば、LCTPSR(配列番号31)またはLSTPSR(配列番号32)
のタグである。したがって、本開示は、アルデヒドタグ化Ig重鎖および/またはアルデ
ヒドタグ化Ig軽鎖を含む抗体を提供し、アルデヒドタグ化Ig抗体は、そのようなスル
ファターゼモチーフを含む重鎖および/または軽鎖のIg定常領域のアミノ酸配列を含む

0093

一般に、標的ポリペプチドのアルデヒドタグのスルファターゼモチーフ中のシステイン
またはセリンのFGlyへの変換を促進するために用いられるFGEは、アルデヒドタグ
に存在するスルファターゼモチーフに応じて選択される。FGEは、アルデヒドタグ化ポ
リペプチドが発現される宿主細胞に固有であってもよいか、または宿主細胞を遺伝子操作
して適切なFGEを発現させてもよい。いくつかの実施形態において、ヒトFGEに適合
性のスルファターゼモチーフを使用して、FGEを発現するヒト細胞または宿主細胞(通
常、ヒトFGEを発現するように遺伝子操作された哺乳類細胞)でアルデヒドタグ化タン
パク質を発現させることが望ましい場合もある。一般に、FGly修飾抗体の作製に使用
するのに好適なFGEは、天然に存在する源から得られてもよいか、または合成的に生成
されてもよい。例えば、適切なFGEは、FGEを天然に産生するか、またはFGEをコ
ードする組換え遺伝子を発現するように遺伝子操作された生物学的源から得ることができ
る。多数のFGEをコードする核酸が、当該技術分野で既知であり、手軽である。

0094

FGEがスルファターゼモチーフに作用すると、Z1が酸化されて2−ホルミルグリシ
ン(FGly)残基を生成する。さらに、FGEが媒介する変換、および対象となる部分
を含む反応パートナーとの反応の両方に続いて、上述の式のZ1に位置するFGlyが対
象となる部分(例えば、検出可能な標識、水溶性ポリマー、ポリペプチド、薬物等)に共
有結合される。したがって、本開示は、FGly部分を含むように修飾された抗CD22
抗体を提供し、抗CD22抗体は、以下の式のFGly変換スルファターゼモチーフを含
む:

0095

X1(FGly)X2Z2X3Z3

0096

式中、

0097

X1は、存在するかまたは存在せず、存在する場合は任意のアミノ酸であるが、但し、
スルファターゼモチーフがポリペプチドのN末端にある場合はX1が存在し、

0098

X2およびX3は、各々、独立して任意のアミノ酸であり、

0099

Z3は、塩基性アミノ酸であり、

0100

FGly修飾抗CD22抗体は、折り畳まれた状態にある場合、溶媒接触可能表面上の
FGly基を表す。いくつかの実施形態において、FGly変換スルファターゼモチーフ
は、式L(FGly)TPSR(配列番号33)のモチーフである。

0101

上述のように、FGly 部分を含むように修飾された主題の抗CD22抗体は、FG
ly 部分を介して抗CD22抗体に共有結合された対象となる異種部分(例えば、検出
可能な標識、水溶性ポリマー、ポリペプチド、薬物等)を含むようにさらに修飾すること
ができる。したがって、本開示は、抗CD22抗体コンジュゲート(本明細書において「
抗CD22コンジュゲート」とも称される)を提供し、抗CD22コンジュゲートは、以
下の式を含む:

0102

X1(FGly’)X2Z2X3Z3 (I’)

0103

式中、

0104

FGly’は、共有結合的に付着した部分を有する2−ホルミルグリシン残基であり、

0105

Z2は、プロリンまたはアラニン残基のいずれかであり((P/A)によっても表すこ
とができる);Z3は、塩基性アミノ酸(例えば、アルギニン(R)であり、かつリジン
(K)もしくはヒスチジン(H)であってもよく、通常はリジンである)、または脂肪族
アミノ酸(アラニン(A)、グリシン(G)、ロイシン(L)、バリン(V)、イソロイ
シン(I)、もしくはプロリン(P)、通常、A、G、L、V、もしくはIであり;

0106

X1は、存在してもまたは存在しなくてもよく、存在する場合は任意のアミノ酸であっ
てもよいが、通常、脂肪族アミノ酸、硫黄含有アミノ酸、または極性の非荷電アミノ酸(
すなわち、芳香族アミノ酸または荷電アミノ酸以外)であり、通常、L、M、V、Sまた
はT、より一般的にはL、M、またはVであるが、但し、スルファターゼモチーフが標的
ポリペプチドのN末端にある場合はX1が存在し、

0107

X2およびX3は、独立して任意のアミノ酸であってもよいが、通常、脂肪族アミノ酸
、硫黄含有アミノ酸、または極性の非荷電アミノ酸(すなわち、芳香族アミノ酸または荷
電アミノ酸以外)であり、通常、S、T、A、V、GまたはCであり、より一般的にはS
、T、A、VまたはGである。いくつかの実施形態において、モチーフは、式L(FGl
y’)TPSR(配列番号34)のモチーフである。

0108

薬物
場合によっては、本開示の抗CD22抗体は、抗体の重鎖および/または軽鎖に共有結
合された薬物を含む。「薬物」は、低分子薬ペプチド薬毒素(例えば、細胞毒)等を
含む。

0109

本明細書で使用される「低分子薬」は、化合物、例えば、対象となる薬学的活性を示し
、一般的に、約800Da以下、または2000Da以下の分子量であるが、最大5kD
aまでの分子を包含してもよく、約10kDaまでの大きさであってもよい、有機化合物
を指す。小さい無機分子は、炭素原子を含まない分子を指し、小さい有機分子は、少なく
とも1つの炭素原子を含む化合物を指す。

0110

本明細書で使用される「ペプチド薬」は、アミノ酸含有ポリマー化合物を指し、天然に
存在するおよび天然には存在しないペプチド、オリゴペプチド環状ペプチド、ポリペプ
チド、およびタンパク質、ならびにペプチド模倣物を包含することを意味する。ペプチド
薬は、化学合成によって得られてもよいか、または遺伝子操作された源(例えば、組換え
源)から生成されてもよい。ペプチド薬は、分子量に幅があってもよく、200Da〜1
0kDa以上の分子量であってもよい。

0111

場合によっては、薬物は、毒素、例えば、細胞毒である。高等植物に遍在するタンパク
質のクラスであるリボソーム不活性化タンパク質(RIP)は、そのような細胞毒の例で
ある。1型および2型に分割されるRIPは、真核生物タンパク質合成の強力な阻害剤
しての作用のために毒性である。1型RIPは、リボソーム不活性化作用を有する単一ペ
プチド鎖から構成され、2型タンパク質は、細胞結合特性を有するB鎖ジスルフィド
合した、本質的に1型タンパク質と同等であるA鎖から構成される。特定のアデニン塩基
のN−グリコシド結合は、真核生物リボソームの28SrRNAの高度に保存されたル
ープ領域においてRIPによって加水分解的に切断され、それによって真核細胞における
翻訳を不活性化する。例えば、米国特許第5,744,580号を参照のこと。ゲロニン
ドデカンドリン、トリコサンチン、トリコキリン(tricokirin)、ブリオジ
ン、オシロイバナ抗ウイルスタンパク質MAP)、オオムギリボソーム不活性化タンパ
ク質(BRIP)、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質(PAPS)、サポリン、ルフィン
、およびモモルジンは、1型RIPの例であり、リシンおよびアブリンは、2型RIPの
例である。好適な細胞毒の例として、これらに限定されないが、リシン、アブリン、ジフ
リア毒素、シュードモナス外毒素(例えば、PE35、PE37、PE38、PE40
等)、サポリン、ゲロニン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質(PAP)、ボツリヌス
素、ブリオジン、モモルジン、およびブーガニンが挙げられる。

0112

場合によっては、薬物は、癌化学療法剤である。癌化学療法剤は、癌細胞の増殖を低下
させる非ペプチド性(すなわち、非タンパク質性)化合物を含み、細胞傷害性薬剤および
細胞分裂阻害剤を包含する。化学療法剤の非限定的な例として、アルキル化剤ニトロソ
ウレア代謝拮抗剤抗腫瘍性抗生物質、植物(ビンカアルカロイド、およびステロ
ドホルモンが挙げられる。また、ペプチド化合物も使用することができる。

0113

好適な癌化学療法剤は、ドラスタチンならびにその活性類似体および誘導体と、アウリ
スタチンならびにその活性類似体および誘導体を含む。例えば、国際公開第WO96/3
3212号、同第WO96/14856号、およびUSPN6,323,315号を参照
のこと。例えば、ドラスタチン10またはアウリスタチンPEは、本開示の抗体−薬物コ
ンジュゲートに含めることができる。好適な癌化学療法剤はまた、マイタンシノイドなら
びにその活性類似体および誘導体(例えば、EP1391213;およびLiu et
al(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618−86
23を参照)と、デュオカルマイシンならびにその活性類似体および誘導体(例えば、合
類似体KW−2189およびCB1−TM1を含む)を含む。

0114

細胞増殖を減少させるように作用する薬剤は、当該技術分野で既知であり、広く使用さ
れている。そのような薬剤は、限定されないが、メクロレタミン、シクロホスファミド
Cytoxan(商標))、メルファラン(L−サルコリシン)、カルムスチン(BCN
U)、ロムスチン(CCNU)、セムスチン(メチル−CCNU)、ストレプトゾシン
クロロゾトシン、ウラシルマスタードクロルメチンイホスファミドクロラムブシル
ピポブロマントリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミンブスルファ
ン、ダカルバジン、およびテモゾロミドを含む、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェン
マスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン誘導体スルホン酸アルキル、およびトリ
アゼンを含む。

0115

代謝拮抗剤は、限定されないが、シタラビン(CYTOSAR−U)、シトシンアラ
ノシド、フルオロウラシル(5−FU)、フロクスウリジン(FudR)、6−チオグア
ニン、6−メルカプトプリン(6−MP)、ペントスタチン5−フルオロウラシル(5
−FU)、メトトレキセート、10−プロパルギル−5,8−ジデアザフォレート(PD
DF、CB3717)、5,8−ジデアザテトラヒドロ葉酸DDATHF)、ロイコ
リン、フルダラビンホスフェート、ペントスタチン、およびゲムシタビンを含む、葉酸
似体、ピリミジン類似体プリン類似体、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む。

0116

好適な天然の生成物およびそれらの誘導体、(例えば、ビンカアルカロイド抗腫瘍
生物質、酵素、リンホカイン、およびエピポフィトキシン)は、限定されないが、A
ra−C、パクリタキセル(Taxol(登録商標))、ドセタキセル(Taxoter
e(登録商標))、デオキシコホルマイシンマイトマイシン−C、L−アスパラギナー
ゼ、アザチオプリンブレキナル;アルカロイド、例えば、ビンクリスチンビンブラス
チン、ビノレルビンビンデシン等;ポドフィロトキシン、例えば、エトポシド、テニポ
シド等;抗生物質、例えば、アントラサイクリン塩酸ダウノルビシンダウノマイシン
ルビマイシン、セルビジン)、イダルビシンドキソルビシンエピルビシン、およ
モルホリノ誘導体等.;フェノキシゾンビスシクロペプチド(phenoxizone
biscyclopeptides)、例えば、ダクチノマイシン塩基性糖ペプチド
例えば、ブレオマイシンアントラキノングリコシド、例えば、プリカマイシン(ミト
マイシン);アントラセンジオン、例えば、ミトキサントロンアジリノピロロインド
ジオン、例えば、マイトマイシン;大環状免疫抑制剤、例えば、サイクロスポリン、F
K−506(タクロリムス、Prograf)、ラパマイシン等を含む。

0117

他の抗増殖性の細胞傷害性薬剤は、Navelbene、CPT−11、アナストラゾ
ール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン、シクロホスファミド、イホサミド
、およびドロロキサフィンを含む。

0118

抗増殖性活性を有する微小管作用剤も使用に適しており、限定されないが、アロコル
チン(NSC 406042)、ハリコンドリンB(NSC 609395)、コルヒチ
ン(NSC 757)、コルヒチン誘導体(例えば、NSC 33410)、ドルスタ
ン10(NSC 376128)、メイタンシン(NSC 153858)、リゾキシン
(NSC 332598)、パクリタキセル(Taxol(登録商標))、Taxol(
登録商標)誘導体、ドセタキセル(Taxotere(登録商標))、チオコルヒチン
NSC 361792)、トリチルステリン硫酸ビンブラスチン硫酸ビンクリス
ン、天然および合成のエポチロン(限定されないが、エポチロンA、エポチロンB、ディ
スコデルモリド;エストラムスチン、ノコダゾール等を含む)を含む。

0119

使用に適したホルモン調節物質およびステロイド合成類似体を含む)は、限定されな
いが、アドレノコルチコステロイド、例えば、プレドニゾンデキサメタゾン等;エス
ゲンおよびプレゲスチン、例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン酢酸メドロ
キシプロゲステロン酢酸メゲストロールエストラジオールクロミフェンタモキシ
フェン等;ならびに副腎皮質抑制薬、例えば、アミノグルテチミド;17α−エチニル
ストラジオールジエチルスチルベストロールテストステロンフルオキシメステロン
プロピオン酸ドロモスタノロンテストラクトンメチルプレドニゾロン、メチル−テ
ストステロンプレドニゾロントリアムシノロンクロロトリアニセン、ヒドロキシプ
ロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン
ロイプロリドフルタミド(Drogenil)、トレミフェン(Fareston)
、およびZoladex(登録商標)を含む。エストロゲンは、増殖および分化刺激
るため、エストロゲン受容体に結合する化合物が、この活性を遮断するために使用される

0120

他の好適な化学療法剤は、金属複合体、例えば、シスプラチン(cis−DDP)、カ
ルボプラチン等;尿素、例えば、ヒドロキシ尿素;およびヒドラジン、例えば、N−メチ
ルヒドラジン;エピドフィロトキシン;トポイソメラーゼ阻害剤プロカルバジン;ミト
キサントロンロイコボリンテガフール等を含む。対象となる他の抗増殖剤は、免疫抑
制薬、例えば、ミコフェノール酸サリドマイドデスオキシスパガリン、アザスポリン
レフルノミドミゾリビン、アザスピランSKF 105685);Iressa(
登録商標)(ZD1839、4−(3−クロロ−4−フルオロフェニルアミノ)−7−
メトキシ−6−(3−(4−モルホリニルプロポキシキナゾリン)等を含む。

0121

タキサンは、使用に適している。「タキサン」は、パクリタキセル、および任意の活性
タキサン誘導体またはプロドラッグを含む。「パクリタキセル」(本明細書において、例
えば、ドセタキセル、TAXOL□、TAXOTERE□、(ドセタキセルの製剤)、パ
クリキセルの10−デスアセチル類似体、およびパクリタキセルの3’N−デスベンゾ
イル−3’N−t−ブトキシカルボニル類似体等の類似体、製剤、および、誘導体を含む
と理解されたい)は、当業者に公知である技術を用いて容易に調製されてもよいか(国際
公開第WO94/07882号、同第WO94/07881号、同第WO94/0788
0号、同第WO94/07876号、同第WO93/23555号、同第WO93/10
076号;米国特許第5,294,637号、同第5,283,253号、同第5,27
9,949号、同第5,274,137号、同第5,202,448号、同第5,200
,534号、同第5,229,529号、および欧州特許第590,267号も参照のこ
と)、または例えば、Sigma Chemical Co.、St.Louis,Mo
.(セイヨウイチイ由来のT7402;またはウンナンイチイ由来のT−1912)を含
む様々な商業供給源から得られてもよい。

0122

パクリタキセルは、パクリタキセルの一般的な化学的に利用可能な形態だけではなく、
類似体および誘導体(例えば、上記のようなTaxotere□、ドセタキセル)および
パクリタキセルコンジュゲート(例えば、パクリタキセル−PEG、パクリタキセル−デ
キストラン、またはパクリタキセル−キシロース)も指すと理解されたい。

0123

また、親水性誘導体および疎水性誘導体の両方を含む様々な既知の誘導体も、「タキサ
ン」という用語に含まれる。タキサン誘導体は、限定されないが、国際特許出願第WO9
9/18113号に記載されるガラクトースおよびマンノース誘導体;国際公開第WO9
9/14209号に記載されるピペラジノおよび他の誘導体;国際公開第WO99/09
021号、国際公開第WO98/22451号、および米国特許第5,869,680号
に記載されるタキサン誘導体;国際公開第WO98/28288号に記載される6−チオ
誘導体;米国特許第5,821,263号に記載されるスルフェンアミド誘導体;ならび
に米国特許第5,415,869号に記載されるタキソール誘導体を含む。限定されない
が、国際公開第WO98/58927号、国際公開第WO98/13059号、および米
国特許第5,824,701号に記載されるものを含むパクリタキセルのプロドラッグを
さらに含む。

0124

抗体の生成方法
主題の抗体は、任意の既知の方法、例えば、タンパク質合成のための従来の合成法、組
換えDNA法等によって生成することができる。

0125

主題の抗体が一本鎖ポリペプチドである場合、それは、標準的な化学的ペプチド合成
術を用いて合成することができる。ポリペプチドが化学的に合成される場合、固相または
液相を介して合成を進めることができる。配列のC末端アミノ酸を不溶性の支持体に付着
させた後、配列中の残りのアミノ酸を連続的に付加する固相ポリペプチド合成(SPPS
)は、主題の抗体の化学合成のための好適な方法の一例である。FmocおよびBoc等
の種々の形態のSPPSが、主題の抗体を合成するために利用可能である。固相合成のた
めの技術は、Barany and Merrifield,Solid−Phase
Peptide Synthesis;pp.3−284 in The Peptid
es:Analysis,Synthesis,Biology.Vol.2:Spec
ial Methodsin Peptide Synthesis,Part A.
,Merrifield, et al.J.Am.Chem.Soc.,85:214
9−2156(1963);Stewart et al.,Solid Phase
Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.
,Rockford, Ill.(1984);およびGanesan A.2006
Mini Rev.Med Chem.6:3−10、およびCamarero JA
et al.2005 Protein Pept Lett.12:723−8に記載
されている。端的に述べると、小さな不溶性の多孔質ビーズを、ペプチド鎖が構築された
機能単位で処理する。カップリング/脱保護のサイクルを繰り返した後、付着した固相の
遊離N末端アミンを、N保護アミノ酸単位にカップリングさせる。次いで、この単位を脱
保護し、さらなるアミノ酸を付着させ得る新しいN末端アミンを露出させる。ペプチドは
、固相上に固定化された状態に留まり、切断される前に濾過プロセスを経る。

0126

主題の抗体の生成には標準的な組換え法を用いることができる。例えば、任意選択的に
定常領域に結合された軽鎖および重鎖可変領域をコードする核酸が、発現ベクターに挿入
される。軽鎖および重鎖は、同じかまたは異なる発現ベクターにクローニングすることが
できる。免疫グロブリン鎖をコードするDNAセグメントは、免疫グロブリンポリペプチ
ドの発現を確実にする発現ベクター(複数可)中の制御配列作動可能に連結される。発
現制御配列は、限定されないが、プロモーター(例えば、天然に会合しているかまたは異
種のプロモーター)、シグナル配列エンハンサーエレメント、および転写終止配列を含
む。発現制御配列は、真核生物宿主細胞(例えば、COSまたはCHO細胞)を形質転換
するかまたはトランスフェクトすることが可能なベクター中の真核生物プロモーター系で
あってもよい。一旦、ベクターが適切な宿主に組み込まれると、宿主は、高レベルのヌク
レオチド配列配列、ならびに抗体の収集および精製に好適な条件下に維持される。

0127

コードの退縮のために、様々な核酸配列が、各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードす
ることができる。望ましい核酸配列は、新規固相DNA合成、または所望のポリヌクレオ
チドの早期に調製された変異体のポリメラーゼ連鎖反応PCR変異誘発のいずれかに
よって生成することができる。オリゴヌクレオチド媒介性の変異誘発は、標的ポリペプチ
ドDNAの置換、欠失、および挿入変異体を調製するための好適な方法の一例である。A
delman et al.,DNA2:183(1983)を参照のこと。端的に述べ
ると、標的ポリペプチドDNAは、一本鎖DNA鋳型に対して所望の突然変異をコードす
るオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって改変される。ハイブリダイゼー
ション後、DNAポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込み、標
的ポリペプチドDNA内の選択された改変をコードする鋳型の第2の相補性鎖全体を合成
する。

0128

好適な発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、または宿主染色体DNAの不
可欠な部分としてのいずれかで、宿主生物において複製可能である。一般的に、発現ベク
ターは、所望のDNA配列で形質転換した細胞の検出を可能にするための選択マーカー
例えば、アンピシリン耐性ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン
耐性、またはネオマイシン耐性)を含む。

0129

大腸菌は、主題の抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングするために使用で
きる原核生物宿主細胞の一例である。使用に適した他の微生物宿主は、バチルス・スブチ
リス等の桿菌、ならびにサルモネラセラチア、および種々のシュードモナス種等の他の
腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主において、典型的には宿主細胞と適合性の発現
制御配列(例えば、複製起点)を含む発現ベクターを作製することができる。さらに、乳
糖プロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、βラクタマーゼプロモ
ター系、またはファージλからのプロモーター系等の、任意の数の様々な周知のプロモー
ターが存在する。プロモーターは、典型的には、任意選択的にオペレーター配列を伴って
、発現を制御し、また、転写および翻訳を開始および終了させるためのリボソーム結合部
位配列等を有する。

0130

酵母等の他の微生物もまた発現に有用である。サッカロミセス(例えば、サッカロミセ
ス・セレビシア)およびピキアは、好適な酵母宿主細胞の例であり、好適なベクターは、
所望に応じて発現制御配列(例えば、プロモーター)、複製起点、終止配列等を有する。
典型的なプロモーターは、3−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の解糖酵素を含む。
誘導可能な酵母プロモーターは、中でも、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームC、
ならびにマルトースおよびガラクトース利用を司る酵素からのプロモーターを含む。

0131

微生物に加えて、哺乳動物組織(in vitro細胞培養で増殖させた哺乳動物細胞
)もまた、本発明のポリペプチド(例えば免疫グロブリンまたはその断片をコードするポ
ヌクレオチド)を発現させるおよび精製するために使用することができる。Winna
cker,From Genes to Clones,VCH Publishers
,N.Y.,N.Y.(1987)を参照のこと。好適な哺乳動物宿主細胞は、CHO細
胞株、種々のCos細胞株HeLa細胞骨髄腫細胞株、および形質転換B細胞または
ハイブリドーマを含む。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター
、およびエンハンサー等の発現制御配列(Queen et al.,Immunol.
Rev.89:49(1986))、ならびにリボソーム結合部位、RNAスプライシン
グ部位、ポリアデニル化部位、および転写終止配列等の必要なプロセシング情報部位を含
むことができる。好適な発現制御配列の例は、免疫グロブリン遺伝子、SV40アデノ
ウイルス、ウシパピローマウイルスサイトメガロウイルス等に由来するプロモーターで
ある。Co et al.,J.Immunol.148:1149(1992)を参照
のこと。

0132

一旦合成されると(化学的にまたは組換え的にのいずれかで)、全抗体、それらの二量
体、個々の軽鎖および重鎖、または主題の抗体の他の形態(例えば、scFv等)を、硫
アンモニウム沈殿アフィニティーカラムカラムクロマトグラフィー高速液体クロ
マトグラフィー(HPLC)精製、ゲル電気泳動等を含む当該技術分野の標準的手順に従
って精製することができる(Scopes,Protein Purification
(Springer−Verlag,N.Y.,(1982)を全般的に参照のこと)。
主題の抗体は、実質的に純粋であってもよく、例えば、少なくとも約80%〜85%純粋
、少なくとも約85%〜90%純粋、少なくとも約90%〜95%純粋、または98%〜
99%純粋、またはそれ以上純粋であってもよく、例えば、細胞片、主題の抗体以外の巨
大分子等の混入物を含まない等である。

0133

組成物
本開示は、主題の抗体を含む組成物を提供する。主題の抗体組成物は、主題の抗体に加
えて、塩、例えば、NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4等;緩衝剤、例えば、T
ris緩衝液、N−(2−ヒドロキシエチル)ピぺラジン−N’−(2−エタンスルホン
酸)(HEES)、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、2−(N−
Morpholino)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3−(N−モルホリ
ノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、N−tris[ヒドロキシメチル]メチル−3−
アミノプロパンスルホン酸(TAPS)等;可溶化剤洗浄剤、例えば、Tween−2
0等の非イオン性洗浄剤プロテアーゼ阻害剤グリコール等のうちの1つ以上を含むこ
とができる。

0134

核酸
本開示は、主題の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。主題の抗
体をコードするヌクレオチド配列は、意図する標的細胞(例えば、コードされた抗体を合
成するように遺伝子操作された細胞)におけるヌクレオチド配列の発現を許容するプロモ
ーターおよびエンハンサー等の1つ以上の調節エレメントに作動可能に連結することがで
きる。

0135

好適なプロモーターおよびエンハンサーエレメントは、当該技術分野で既知である。細
菌細胞における発現の場合、好適なプロモーターは、限定されないが、lacI、lac
Z、T3、T7、gpt、λ、P、およびtrcを含む。真核細胞の発現の場合、好適な
プロモーターは、限定されないが、軽鎖および/または重鎖の免疫グロブリン遺伝子プロ
モーターエレメントおよびエンハンサーエレメント;サイトメガウイルス最初期プロモー
ター;単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター;初期および後期SV40プ
ロモーター;レトロウイルスからの長い末端反復に存在するプロモーター;マウスメタロ
チオネイン−Iプロモーター;ならびに種々の当該技術で既知の組織特異的プロモーター
を含む。

0136

いくつかの実施形態において、例えば、酵母細胞における発現の場合、好適なプロモー
ターは、ADH1プロモーター、PGK1プロモーター、ENOプロモーター、PYK1
プロモーター等の構成的プロモーター;またはGAL1プロモーター、GAL10プロモ
ーター、ADH2プロモーター、PHO5プロモーター、CUP1プロモーター、GAL
7プロモーター、MET25プロモーター、MET3プロモーター、CYC1プロモータ
ー、HIS3プロモーター、ADH1プロモーター、PGKプロモーター、GAPDHプ
ロモーター、ADC1プロモーター、TRP1プロモーター、URA3プロモーター、L
EU2プロモーター、ENOプロモーター、TP1プロモーター、およびAOX1(例え
ば、ピキアにおける使用のため)等の調節可能プロモーターである。適切なベクターおよ
びプロモーターの選択は、当業者の通常の技術の範囲内である。

0137

原核生物宿主細胞において使用するのに好適なプロモーターは、限定されないが、バク
リオファージT7RNAポリメラーゼプロモーター;trpプロモーター;lacオ
ペロンプロモーター;ハイブリッドプロモーター、例えば、lac/tacハイブリッド
プロモーター、tac/trcハイブリッドプロモーター、trp/lacプロモーター
、T7/lacプロモーター;trcプロモーター;tacプロモーター等;araBA
Dプロモーター;ssaGプロモーターもしくは関連プロモーター等のin vivo調
節プロモーター(例えば、米国特許公開第20040131637号を参照)、pagC
プロモーター(Pulkkinen and Miller,J.Bacteriol.
,1991:173(1):86−93;Alpuche−Aranda et al.
,PNAS,1992;89(21):10079−83)、nirBプロモーター(H
arborne et al.(1992)Mol.Micro.6:2805−281
3)等(例えば、Dunstan et al.(1999)Infect.Immun
.67:5133−5141;McKelvie et al.(2004)Vacci
ne 22:3243−3255;およびChatfield et al.(1992
)Biotechnol.10:888−892を参照);σ70プロモーター、例えば
コンセンサスσ70プロモーター(例えば、GenBank受入番号AX798980
、AX798961、およびAX798183を参照);定常期プロモーター、例えば、
dpsプロモーター、spvプロモーター等;病原性アイランドSPI−2に由来するプ
ロモーター(例えば、WO96/17951を参照);actAプロモーター(例えば、
Shetron−Rama et al.(2002)Infect.Immun.70
:1087−1096を参照);rpsMプロモーター(例えば、Valdivia a
nd Falkow(1996).Mol.Microbiol.22:367を参照)
;tetプロモーター(例えば、Hillen,W.and Wissmann,A.(
1989)In Saenger,W.and Heinemann,U.(eds),
Topics in Molecular and Structural Biolo
gy, Protein−Nucleic Acid Interaction.Mac
millan,London,UK,Vol.10,pp.143−162を参照);S
P6プロモーター(例えば、Melton et al.(1984)Nucl.Aci
ds Res.12:7035を参照)等が挙げられる。大腸菌等の原核生物において使
用するのに好適な強力なプロモーターは、限定されないが、Trc、Tac、T5、T7
、およびPLambdaを含む。細菌宿主細胞において使用するオペレータの非限定的な
例として、ラクトースプロモーターオペレーターLacIリプレッサータンパク質は、
ラクトースと接触させると立体構造を変化させ、それによってLacIリプレッサータン
パク質がオペレーターに結合するのを防止する)、トリプトファンプロモーターオペレー
ター(トリプトファンと複合体を形成した場合、TrpRリプレッサータンパク質はオペ
レーターに結合する立体構造を有する;トリプトファンの非存在下では、TrpRリプ
ッサータンパク質は、オペレーターに結合しない立体構造を有する)、およびtacプロ
モーターオペレーター(例えば、deBoer et al.(1983)Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.80:21−25を参照)が挙げられる。

0138

主題の抗体をコードするヌクレオチド配列は、発現ベクターおよび/またはクローニン
グベクター内に存在し得る。主題の抗体が2つの別々のポリペプチドを含む場合、2つの
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を同じかまたは別々のベクター内でクローニ
ングすることができる。発現ベクターは、選択可能なマーカー、複製起点、ならびにベク
ターの複製および/または維持を提供する他の特徴を含む。

0139

多数の好適なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、その多くは、主題
組換え構築物を作製するために市販されている。以下のベクターを例として提供する。
細菌:pBs、PhageScript、PsiX174、pBluescript S
K、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stra
tagene、La Jolla,Calif.,USA);pTrc99A、pKK2
23−3、pKK233−3、pDR540、およびpRIT5(Pharmacia、
Uppsala,Sweden)。真核生物:pWLneo、pSV2cat、pOG4
4、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、およ
びpSVL(Pharmacia)。

0140

発現ベクターは、一般的に、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するた
めに、プロモーター配列の近くに位置する都合のよい制限酵素部位を有する。発現宿主
おいて機能する選択可能なマーカーが存在してもよい。好適な発現ベクターは、限定され
ないが、ウイルスベクター(例えば、ワクシニアウイルスポリオウイルス;アデノウイ
ルス(例えば、Li et al.,Invest Opthalmol Vis Sc
i 35:2543 2549,1994;Borras et al.,Gene T
her 6:515 524,1999;Li and Davidson,PNAS
92:7700 7704,1995;Sakamoto et al.,H Gene
Ther 5:1088 1097,1999;国際公開第WO94/12649号、
同第WO93/03769号;同第WO93/19191号;同第WO94/28938
号;同第WO95/11984号および同第WO95/00655号を参照);アデノ随
伴ウイルス(例えば、Ali et al.,Hum Gene Ther 9:81
86,1998,Flannery et al.,PNAS 94:6916 692
1,1997;Bennett et al.,Invest Opthalmol V
is Sci 38:2857 2863,1997;Jomary et al.,G
ene Ther 4:683 690,1997,Rolling et al.,H
um Gene Ther 10:641 648,1999;Ali et al.,
Hum Mol Genet 5:591 594,1996;Srivastava
in WO93/09239、Samulski et al.,J.Vir.(198
9)63:3822−3828;Mendelson et al.,Virol.(1
988)166:154−165;およびFlotte et al.,PNAS(19
93)90:10613−10617を参照);SV40;単純ヘルペスウイルス;ヒト
免疫不全ウイルス(例えば、Miyoshi et al.,PNAS 94:1031
9 23,1997;Takahashi et al.,J Virol 73:78
12 7816,1999を参照);レトロウイルスベクター(例えば、マウス白血病
イルス、脾臓壊死ウイルス、ならびに、ラウス肉腫ウイルスハーベイ肉腫ウイルス、ト
白血病ウイルスヒト免疫不全ウイルス骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイル
ス等のレトロウイルス由来のベクター)等を含む。

0141

上述のように、主題の核酸は、主題の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。主題
の核酸は、上述のように抗CD22重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む

0142

細胞
本開示は、主題の核酸で遺伝子操作された、単離された遺伝子操作された宿主細胞(例
えば、in vitro細胞)を提供する。いくつかの実施形態において、主題の単離さ
れた遺伝子操作された宿主細胞は、主題の抗体を生成することができる。

0143

好適な宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞等の真核生物宿主細胞、および
細菌細胞等の原核生物細胞を含む。宿主細胞への主題の核酸の導入は、例えば、リン酸
ルシウム沈殿法DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トラ
スフクション、電気穿孔法、または他の既知の方法によって実現することができる。

0144

好適な哺乳動物細胞は、初代細胞および不死化細胞株を含む。好適な哺乳動物細胞株
ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類(例えば、マウス、ラット)細胞株等を含
む。好適な哺乳動物細胞株は、限定されないが、HeLa細胞(例えば、America
n Type Culture Collection(ATCC)No.CCL−2)
、CHO細胞(例えば、ATCC番号CRL9618、CCL61、CRL9096)、
Vero細胞、NIH 3T3細胞(例えば、ATCC番号CRL−1658)、Huh
−7細胞、BHK細胞(例えば、ATCC番号CCL10)、PC12細胞(ATCC細
胞CRL1721)、COS細胞、COS−7細胞(ATCC番号CRL1651)、R
AT1細胞、マウスL細胞(ATCC番号CCLI.3)、ヒト胎児由来腎臓(HEK)
293細胞(ATCC番号CRL1573)、HLHepG2細胞等を含む。

0145

好適な酵母細胞は、限定されないが、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ
、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラメ、ピキア・メンブラネファシエンス、ピキ
ア・オプンチエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・グエルク
ウム、ピキア・ピペリ、ピキア・スチプチス、ピキアメタノリカ、ピキア種、サッカロミ
セス・セレビシア、サッカロミセス種、ハンセヌラポリモルファクルイベロミセス
、クルイベロミセス・ラクチスカンジダアルビカンスアスペルギルス・ニデュラン
ス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼトリコデルマリーセイ、クリ
スポリウム・ラクノウエンス、フザリウム種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム
・ベネナツムニューロスポラクラッサクラミドモナスレインハルトチイ等を含む。

0146

好適な原核生物細胞は、限定されないが、大腸菌、乳酸菌類サルモネラ菌類、赤痢菌
類等の様々な実験株のいずれかを含む。例えば、Carrier et al.(199
2)J.Immunol.148:1176−1181;米国特許第6,447,784
号;およびSizemore et al.(1995)Science 270:29
9−302を参照のこと。本発明に用いることのできるサルモネラ菌株の例は、限定され
ないが、サルモネラ・チフィおよびサルモネラ・チフィリウムを含む。好適な赤痢菌株は
、限定されないが、シゲラフレックスネリ、シゲラ・ソネイ、および志賀赤痢菌を含む
。典型的には、実験株は非病原性の株である。他の好適な細菌の非限定的な例として、限
定されないが、バチルス・スブチリス、シュードモナス・プジタ、シュードモナス・エル
ジノーサ、シュードモナス・メバロニイ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドバクター
カプスラータ、ロドスピリラムラブラム、ロドコッカス種等を含む。いくつかの実施
形態において、宿主細胞は大腸菌である。

0147

薬学的組成物
本開示は、主題の抗体を含む薬学的組成物を含む組成物を提供する。一般に、製剤は、
有効量の主題の抗体を含む。「有効量」とは、所望の結果、例えば、癌性B細胞数の減少
自己反応性B細胞の数および/または活性の減少をもたらすのに十分な投与量を意味す
る。場合によっては、所望の結果は、少なくとも、B細胞悪性腫瘍の症状の対象と比較し
た軽減である。

0148

製剤
主題の方法において、所望の治療効果または診断効果をもたらすことができる任意の従
来の手段を用いて、主題の抗体を宿主に投与することができる。したがって、治療的投与
のために様々な製剤に薬剤を組み込むことができる。より具体的には、主題の抗体は、適
切な薬学的に許容される担体と組み合わせて薬学的組成物に製剤化することができ、錠剤
カプセル剤散剤顆粒剤軟膏溶剤坐剤注射剤吸入剤、およびエアロゾル剤
等の固体、半固体液体、または気体形状の調製物に製剤化することができる。

0149

医薬剤形中で、主題の抗体は、それらの薬学的に許容される塩の形態で投与されてもよ
いか、またはそれらは単独でもしくは適切な会合において、さらには他の薬学的に活性な
化合物と組み合わせて使用されてもよい。以下の方法および賦形剤は、例示であるに過ぎ
ず、決して限定的ではない。

0150

口調製物の場合、主題の抗体は、錠剤、散剤、顆粒剤、またはカプセル剤を作製する
ために、単独で、または適切な添加剤、例えば、ラクトース、マンニトールトウモロコ
シデンプン、またはジャガイモデンプン等の従来の添加剤;結晶セルロース、セルロース
誘導体、アカシアトウモロコシデンプン、またはゼラチン等の結合剤トウモロコシ
ンプン、ジャガイモデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム等の崩壊剤
タルクまたはステアリン酸マグネシウム等の滑剤、また必要に応じて、希釈剤、緩衝剤
湿潤剤防腐剤、および香味剤と組み合わせて使用することができる。

0151

主題の抗体は、植物油または他の類似する油、合成脂肪酸グリセリド高級脂肪酸エス
テルもしくはプロピレングリコールのエステル等の水性溶媒または非水性溶媒中に、必要
に応じて、可溶化剤、等張剤、懸濁剤乳化剤、安定剤、および防腐剤等の従来の添加剤
とともに、調製物を溶解、懸濁、または乳化することによって、注射用調製物に製剤化す
ることができる。

0152

主題の抗体を含む薬学的組成物は、所望の純度を有する抗体を、任意選択的な生理学
に許容される担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤、および/または等張化剤と混
合することによって調製される。許容される担体、賦形剤、および/または安定剤は、用
いられる投与量および濃度ではレシピエント無毒性であり、リン酸塩クエン酸塩、お
よびその他の有機酸等の緩衝剤;アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニ
ン、およびクエン酸を含む抗酸化剤保存剤エタノールベンジルアルコールフェノ
ール、m−クレゾール、p−クロル−m−クレゾール、メチルもしくはプロピルパラベン
塩化ベンザルコニウム、またはこれらの組み合わせ);アミノ酸、例えば、アルギニン
、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸アスパラギン酸、イソロ
イシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニンチロシン、トリプトファン、メチオニ
ン、セリン、プロリン、およびこれらの組み合わせ;単糖類二糖類、および他の炭水化
物;低分子量(10残基未満)ポリペプチド;ゼラチンまたは血清アルブミン等のタンパ
ク質;EDTA等のキレート化剤トレハロースショ糖、ラクトース、グルコース、マ
ンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトースソルボースラフィノースグル
サミン、N−メチルグルコサミンガラクトサミン、およびノイラミン酸等の糖類;な
らびに/あるいは、Tween、Brij Pluronics、Triton−X、ま
たはポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性表面活性剤を含む。

0153

薬学的組成物は、液体形態凍結乾燥形態、または凍結乾燥形態から再構成された液体
形態であってもよく、凍結乾燥調製物は、投与前滅菌溶液で再構成される。凍結乾燥組
成物を再構成するための標準的な手順は、ある体積の純水(典型的には凍結乾燥中に除去
された体積と同等である)を加え戻すことであるが、非経口投与用の薬学的組成物の生成
のために抗菌剤を含む溶液が使用されてもよい(Chen(1992)Drug Dev
Ind Pharm 18,1311−54も参照のこと)。

0154

主題の薬学的組成物中の例示的な抗体濃度は、約1mg/mL〜約200mg/ml、
または約50mg/mL〜約200mg/mL、または約150mg/mL〜約200m
g/mLの範囲であり得る。

0155

抗体の水性製剤は、pH緩衝溶液中で、例えば、約4.0〜約7.0、または約5.0
〜約6.0の範囲、または代替として約5.5のpHで調製されてもよい。この範囲内の
pHに適した緩衝液の例として、リン酸緩衝液ヒスチジン緩衝液クエン酸緩衝液、コ
ハク酸緩衝液、酢酸緩衝液、および他の有機酸緩衝液が挙げられる。緩衝液の濃度は、例
えば、緩衝液および製剤の所望の浸透圧に応じて、約1mM〜約100mM、または約5
mM〜約50mMの範囲であり得る。

0156

等張化剤は、製剤の浸透圧を調節するために抗体製剤に含められてもよい。例示的な等
張化剤は、塩化ナトリウム塩化カリウムグリセリン、およびアミノ酸グループのいず
れかの成分、糖類、ならびにこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、
水性製剤は等張であるが、高張液または低張液が好適である場合もある。「等張」という
用語は、生理食塩水または血清等の比較される特定の他の溶液と同じ浸透圧を有する溶液
を意味する。等張化剤は、約5mM〜約350mM、例えば、100mM〜350nMの
量で使用されてもよい。

0157

製剤化した抗体の凝集を低減するため、および/または製剤中の微粒子の形成を最小限
に抑えるため、および/または吸着を低減するために、界面活性剤が抗体製剤に加えられ
てもよい。例示的な界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(Tw
een)、ポリオキシエチレンアルキルエーテル(Brij)、アルキルフェニルポリオ
キシエチレンエーテル(Triton−X)、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピ
ンコポリマー(Poloxamer、Pluronic)、およびラウリル硫酸ナトリウ
ム(SDS)を含む。好適なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリ
ソルベート20(Tween 20(商標)の商品名で販売)およびポリソルベート80
(Tween 80(商標)の商品名で販売)である。好適なポリエチレン−ポリプロピ
レンコポリマーの例は、Pluronic(登録商標)F68またはPoloxamer
188(商標)の名称で販売されているものである。好適なポリオキシエチレンアルキ
ルエーテルの例は、Brij(商標)の商品名で販売されているものである。界面活性剤
の例示的な濃度は、約0.001%〜約1%w/vの範囲であり得る。

0158

凍結乾燥プロセスの間の不安定化条件から不安定な活性成分(例えば、タンパク質)を
保護するために、凍結保護剤が加えられてもよい。例えば、既知の凍結保護剤は、糖類(
グルコースおよびショ糖を含む);ポリオール(マンニトール、ソルビトール、およびグ
セロールを含む);ならびにアミノ酸(アラニン、グリシン、およびグルタミン酸を含
む)を含む。凍結保護剤は、約10mM〜500nMの量で含ませることができる。

0159

いくつかの実施形態において、主題の製剤は、主題の抗体と、上で特定した成分(例え
ば、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤)のうちの1つ以上とを含み、エタノール、
ベンジルアルコール、フェノール、m−クレゾール、p−クロール−m−クレゾール、メ
チルまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはこれらの組み合わせ等の1
つ以上の保存剤を本質的に含まない。他の実施形態において、保存剤は、例えば、約0.
001〜約2%(w/v)の範囲の濃度で製剤に含まれる。

0160

例えば、主題の製剤は、非経口投与に好適な液体または凍結乾燥製剤であり得、約1m
g/mL〜約200mg/mLの主題の抗体、約0.001%〜約1%の少なくとも1つ
の界面活性剤、約1mM〜約100mMの緩衝剤、任意選択的に約10mM〜約500m
Mの安定剤、および約5mM〜約305mMの等張化剤を含んでもよく、約4.0〜約7
.0のpHを有する。

0161

別の例として、主題の非経口製剤は、約1mg/mL〜約200mg/mLの主題の抗
体、0.04%w/v Tween 20、20mM L−ヒスチジン、および250m
Mショ糖を含み、5.5のpHを有する、液体または凍結乾燥製剤である。

0162

別の例として、主題の非経口製剤は、1)15mg/mLの主題の抗体、0.04%w
/v Tween 20、20mM L−ヒスチジン、および250mMショ糖を含み、
5.5のpHを有するか、または2)75mg/mLの主題の抗体、0.04%w/v
Tween 20、20mM L−ヒスチジン、および250mMショ糖を含み、5.5
のpHを有するか、または3)75mg/mLの主題の抗体、0.02%w/v Twe
en 20、20mM L−ヒスチジン、および250mMショ糖を含み、5.5のpH
を有するか、または4)75mg/mLの主題の抗体、0.04%w/v Tween
20、20mM L−ヒスチジン、および250mMトレハロースを含み、5.5のpH
を有するか、または6)75mg/mLの主題の抗体、0.02%w/v Tween
20、20mM L−ヒスチジン、および250mMトレハロースを含み、5.5のpH
を有する、凍結乾燥製剤を含む。

0163

別の例として、主題の非経口製剤は、1)7.5mg/mLの主題の抗体、0.022
%w/v Tween 20、120mM L−ヒスチジン、および250 125mM
ショ糖を含み、5.5のpHを有するか、、または2)37.5mg/mLの主題の抗体
、0.02%w/v Tween 20、10mM L−ヒスチジン、および125mM
ショ糖を含み、5.5のpHを有するか、または3)37.5mg/mLの主題の抗体
、0.01%w/v Tween 20、10mM L−ヒスチジン、および125mM
ショ糖を含み、5.5のpHを有するか、、または4)37.5mg/mLの主題の抗
体、0.02%w/v Tween 20、10mM L−ヒスチジン、および125m
Mトレハロースを含み、5.5のpHを有するか、または5)37.5mg/mLの主題
の抗体、0.01%w/v Tween 20、10mM L−ヒスチジン、および12
5mMトレハロースを含み、5.5のpHを有するか、または6)5mg/mLの主題の
抗体、0.02%w/v Tween 20、20mM L−ヒスチジン、および250
mMトレハロースを含み、5.5のpHを有するか、または7)75mg/mLの主題の
抗体、0.02%w/v Tween 20、20mM L−ヒスチジン、および250
mMマンニトールを含み、5.5のpHを有するか、または8)75mg/mLの主題の
抗体、0.02%w/v Tween 20、20mM L−ヒスチジン、および140
M塩化ナトリウムを含み、5.5のpHを有するか、または9)150mg/mLの主
題の抗体、0.02%w/v Tween 20、20mM L−ヒスチジン、および2
50mMトレハロースを含み、5.5のpHを有するか、または10)150mg/mL
の主題の抗体、0.02%w/v Tween 20、20mM L−ヒスチジン、およ
び250mMマンニトールを含み、5.5のpHを有するか、または11)150mg/
mLの主題の抗体、0.02%w/v Tween 20、20mM L−ヒスチジン、
および140mM塩化ナトリウムを含み、5.5のpHを有するか、または12)10
mg/mLの主題の抗体、0.01%w/v Tween 20、20mM L−ヒス
ジン、および40mM塩化ナトリウムを含み、5.5のpHを有する、液体製剤である。

0164

主題の抗体は、吸入によって投与されるエアロゾル製剤中に用いることができる。主題
の抗体は、ジクロロジフルオロメタンプロパン窒素等の許容される加圧噴霧剤に製剤
化することができる。

0165

さらに、主題の抗体は、乳化塩基または水溶性塩基等の様々な塩基とともに混合するこ
とによって坐剤として作製することができる。主題の抗体は、坐剤によって直腸投与する
ことができる。坐剤は、体温では溶解するが室温では凝固する、ココアバターカルボ
クス、およびポリエチレングリコール等のビヒクルを含むことができる。

0166

シロップ剤エリキシル剤、および懸濁剤等の経口または直腸投与のための単位剤形
提供されてもよく、その場合、各投薬単位、例えば、さじ1大さじ1杯、錠剤、ま
たは坐剤は、1つ以上の阻害剤を含む所定量組成物を含む。同様に、注入または静脈内投
与のための単位剤形は、滅菌水、生理食塩水、または別の薬学的に許容される担体中の溶
液として組成物中に主題の抗体を含んでもよい。

0167

「単位剤形」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトおよび動物対象の単位用
量として好適な物理的に個別の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体
、またはビヒクルと関連して所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された本発明の化
合物を所定量含む。主題の抗体の詳細は、用いられる特定の抗体および達成されるべき効
果、ならびに宿主における各抗体に関連する薬力学に依存し得る。

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