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技術 凝集の検出および測定のための方法

出願人 セラノスアイピーカンパニーエルエルシー
発明者 ポールパテルサマルサアネカルイアンギボンズエリザベスエー.ホームズスワプナジョシ
出願日 2019年6月18日 (10ヶ月経過) 出願番号 2019-112705
公開日 2019年9月5日 (7ヶ月経過) 公開番号 2019-148610
状態 未査定
技術分野 生物学的材料の調査,分析
主要キーワード 信号パラメーター 二値コード 事前固定 照明配列 有機アルデヒド 位置合わせ特徴 テクスチャー特徴 CMOS画像センサー
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年9月5日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題

凝集検定遂行および分析するための方法、組成物、システム、および機器の提供。

解決手段

一態様では、凝集検定の画像分析のための方法が提供される。別の態様では、凝集検定を遂行するための方法が提供される。一態様では、前記方法は、ウイルスまたはウイルスに対する抗体を含む、様々な分子の検出のために用いられ得る。別の態様では、前記方法は、被験者の有効な免疫化を決定するために用いられ得る。本明細書で提供される開示中の、被験者からの生物学的サンプルを含む、混合物中の粒子凝集検定方法を含む実施形態では、この方法は、サンプル中のウイルスまたは抗体の量の決定を許容する。

概要

背景

凝集または分子または細胞の凝集は、様々な有用な生物学的検定基礎を形成する。赤血球凝集反応(hemagglutinationまたはhaemagglutination)は、赤血球細胞RBC)を含む凝集の特異的な形態である。この現象は、臨床検査室では、血液型、血液中ウイルスの存在および/もしくは量ならびに/または特定の抗感染薬抗体を決定するために用いられる。赤血球凝集反応は、RBCが中程度の撹拌に対して安定な、巨視的な格子構造を形成することを引き起こす。これらの構造は、凝集していないRBCから、目視による観察で区別され得る、このことは様々な従来の検定方法の基礎を形成している。

赤血球凝集反応は、ウイルス、バクテリア、抗体,および他の因子(例えば、レクチン)により引き起こされ得る。例えば、A型抗原に結合する抗体は、AまたはAB型のRBCを含むサンプル中で赤血球凝集反応を誘導する。同様に、ウイルスおよび細胞表面分子に結合するウイルスの抗原は赤血球凝集反応を誘導し得る。ウイルスは、宿主細胞上の分子に結合する、タンパク質ヘマグルチニン”を含み得る。例えば、ヘマグルチニン・タンパク質は、RBCなどの宿主細胞の膜上のシアル酸に結合し得る。ウイルスを含むサンプルの様々な希釈において、赤血球凝集反応を観察することにより、ウイルスの力価概算される。これらの方法によりバクテリアが検出されおよび定量される。

赤血球凝集反応検定の高度に有用な応用に関わらず、現行の方法は、比較的遅く、主観的であり、およびいくつかの目的にとっては信頼性がない。従来の前処理プロトコルは、12〜24時間かかり、および目視による検査は定量的決定を行うためには着実な方法ではない。赤血球凝集反応検定は、しばしば時間が必須的である設定で遂行される(例えば、ウイルスの発生の拡散防止のため、または緊急輸血の間)。従って、当技術分野では、凝集の検出および測定.のための改良された方法に対する大きな要求がある。

概要

凝集検定を遂行および分析するための方法、組成物、システム、および機器の提供。一態様では、凝集検定の画像分析のための方法が提供される。別の態様では、凝集検定を遂行するための方法が提供される。一態様では、前記方法は、ウイルスまたはウイルスに対する抗体を含む、様々な分子の検出のために用いられ得る。別の態様では、前記方法は、被験者の有効な免疫化を決定するために用いられ得る。本明細書で提供される開示中の、被験者からの生物学的サンプルを含む、混合物中の粒子凝集の検定方法を含む実施形態では、この方法は、サンプル中のウイルスまたは抗体の量の決定を許容する。なし

目的

項目30)
生物学的サンプル中の抗体の存在を決定するための方法であって、前記抗体は選択的にウイルス粒子に結合し、前記方法は:
(a)赤血球、ウイルス粒子、および前記抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記ウイルス粒子との相互作用を介する赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および
(b)(a)と同時に、または後続して、前記混合物を、その頂部に開口部を有する容器であって、内部は底部まで円錐形の容器の中に提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

本願明細書に記載の発明。

技術分野

0001

[発明の相互参照
本出願は、2012年7月18日に出願された米国特許予備出願第61/673,215号による優先権を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

背景技術

0002

凝集または分子または細胞の凝集は、様々な有用な生物学的検定基礎を形成する。赤血球凝集反応(hemagglutinationまたはhaemagglutination)は、赤血球細胞RBC)を含む凝集の特異的な形態である。この現象は、臨床検査室では、血液型、血液中ウイルスの存在および/もしくは量ならびに/または特定の抗感染薬抗体を決定するために用いられる。赤血球凝集反応は、RBCが中程度の撹拌に対して安定な、巨視的な格子構造を形成することを引き起こす。これらの構造は、凝集していないRBCから、目視による観察で区別され得る、このことは様々な従来の検定方法の基礎を形成している。

0003

赤血球凝集反応は、ウイルス、バクテリア、抗体,および他の因子(例えば、レクチン)により引き起こされ得る。例えば、A型抗原に結合する抗体は、AまたはAB型のRBCを含むサンプル中で赤血球凝集反応を誘導する。同様に、ウイルスおよび細胞表面分子に結合するウイルスの抗原は赤血球凝集反応を誘導し得る。ウイルスは、宿主細胞上の分子に結合する、タンパク質ヘマグルチニン”を含み得る。例えば、ヘマグルチニン・タンパク質は、RBCなどの宿主細胞の膜上のシアル酸に結合し得る。ウイルスを含むサンプルの様々な希釈において、赤血球凝集反応を観察することにより、ウイルスの力価概算される。これらの方法によりバクテリアが検出されおよび定量される。

0004

赤血球凝集反応検定の高度に有用な応用に関わらず、現行の方法は、比較的遅く、主観的であり、およびいくつかの目的にとっては信頼性がない。従来の前処理プロトコルは、12〜24時間かかり、および目視による検査は定量的決定を行うためには着実な方法ではない。赤血球凝集反応検定は、しばしば時間が必須的である設定で遂行される(例えば、ウイルスの発生の拡散防止のため、または緊急輸血の間)。従って、当技術分野では、凝集の検出および測定.のための改良された方法に対する大きな要求がある。

課題を解決するための手段

0005

改良された凝集検定のための、方法、組成物、システムおよび機器が提供される。一態様では、凝集反応分析のための改良された画像化技法が提供される。別の態様では、時間を減少させおよび/または凝集反応の正確性を増加するための方法が提供される。別の態様では、凝集反応のための改良された試薬が提供される。別の態様では、凝集反応を遂行または分析するための改良された機器が提供される。追加的な改良も提供され、および本開示は、追加的な態様を含む。本明細書において開示される複数の改良も共に用いられ得る。

0006

一態様では、生物学的サンプル中の抗体の存在を決定するための方法が提供され、前記抗体は、選択的にウイルスの粒子に結合し、およびこの方法は以下のステップを含む:(a)赤血球、ウイルスの粒子および抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、ウイルスの粒子との相互作用による赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および(b)混合物中で凝集が起きるかを検出することであって、凝集の不在は抗体の存在を示し、および前記ステップ(a)〜(b)は1時間未満で生じる。別の関連するが個別の態様では、この方法は(a)赤血球、ウイルスの粒子、および抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルを、ウイルスの粒子との相互作用による赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および(b)光学的機器の支援により、混合物の画像を捕捉することを含み、画像中の赤血球−ウイルスの粒子クラスターの存在が、凝集の発生および検出可能な量の抗体の欠如を示し、およびクラスターの不在は、凝集の欠如および検出可能な量の抗体の存在を示す。いくつかの実施形態では、顕微鏡的な混合物の画像が得られる。

0007

別の態様では、生物学的サンプル中のウイルス粒子の存在を決定するための方法が提供され、この方法は:(a)赤血球または修飾された赤血球細胞、ウイルスの粒子、および抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルを、ウイルスの粒子との相互作用による赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および(b)混合物中で凝集が起きるかを検出することを含み、凝集の存在はウイルスの粒子の存在を示し、および前記ステップ(a)〜(b)は1時間未満で生じる。関係するが個別の態様では、生物学的サンプル中のウイルス粒子の存在を決定する方法は:(a)赤血球およびウイルスの粒子を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、ウイルスの粒子との相互作用による赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および(b)光学的機器の支援により、混合物の画像を捕捉することを含み、画像中の赤血球−ウイルスの粒子のクラスターの存在が、凝集の発生および検出可能な量のウイルスの粒子の存在を示し、およびクラスターの不在は、凝集の欠如および検出可能な量のウイルスの粒子の欠如を示す。いくつかの実施形態では、顕微鏡的な混合物の画像が得られる。

0008

別の態様では、被験者の有効な免疫化を決定するための:(a)ウイルス粒子に対する第一のワクチンの第一の用量で免疫化された被験者からの生物学的サンプルを得ること(b)赤血球、ウイルスの粒子および抗体を含む生物学的サンプルの混合物を、ウイルスの粒子との相互作用による赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および(c)サンプル中のウイルスに対する抗体の濃度を、赤血球の凝集により形成されたクラスターに基づき決定することを含む方法が提供され、および前記ステップ(b)〜(c)は1時間未満で生じる。関係するが個別の態様では、この方法は(a)ウイルス粒子に対する第一のワクチンの第一の用量で免疫化された被験者からの生物学的サンプルを得ること;(b)赤血球、ウイルス粒子、および生物学的サンプルの混合物を、ウイルス粒子との相互作用による赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;(c)光学的機器の支援により、混合物の画像を捕捉すること;および(d)サンプル中のウイルスに対する抗体の濃度を、赤血球の凝集により形成されたクラスターに基づき決定することを含み、画像中の赤血球−ウイルス粒子クラスターの存在が、凝集の発生および検出可能な量の抗体の欠如を示し、およびクラスターの不在が、凝集の欠如および検出可能な量の抗体の存在を示す。いくつかの実施形態では、顕微鏡的な混合物の画像が得られる。

0009

実施形態では、赤血球は、例えば、グルタルアルデヒドによる処理によりあらかじめ固定化され得る。所望の場合には、赤血球はシチメンメンチョウ赤血球細胞または他のヒト以外のRBCを含み得る。

0010

主題の方法のいずれかにより検出されたウイルス粒子は、任意のタイプの凝集ウイルスを含み得る。例えばおよび制限なしに、B型肝炎ウイルスHBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、およびインフルエンザウイルスのいずれの株も本明細書において開示される方法により検出され得る。いくつかの態様では、本明細書において開示されるいずれかの方法により検出された抗体は、凝集ウイルスなどの任意の凝集粒子に対するものであり得る。例えばおよび制限なしに、HBV、HCVおよびインフルエンザウイルスのいずれの株に対する抗体も検出され得る。

0011

本明細書において開示される方法のいずれかにおいて利用される生物学的サンプルは、限定はされないが、新鮮なまたは抗凝固処理された全血血漿および血清を含む、処理されたまたは未処理の適切な体液であることができる。いくつかの例では、血漿または血清は、ウイルス粒子に対するワクチンを投与された被験者からのものである。所望の場合には、生物学的サンプルは、例えば、前記生物学的サンプルをノイラミニダーゼと、2時間、1時間、30分、20分、10分、5分未満または更に短い時間などの適切な時間の間、インキュベートすることにより、ノイラミニダーゼにより、前処理され得る。

0012

いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法において使用される様々なステップは、約2時間、60分、45分、30分以下以内、または約30〜約60分の間で完了し得る。

0013

一態様では、本明細書において提供されるものは、画像分析に基づく、凝集を分析する方法である。一実施形態では、画像分析方法が、RBCの容積運動の分析または円錐形ウエルまたは管の中の凝集検定中の粒子の可視化のために用いられる。別の実施形態では、画像分析方法が、RBCの微細構造監視または粒子懸濁物の可視化のために、顕微鏡的なRBCの画像の分析、または凝集検定中の懸濁物中の粒子の可視化のために用いられる。

0014

一態様では、本明細書において提供されるものは方法RBCの容積の運動および粒子の可視化のための画像分析のための方法である。一実施形態では、反応容器(例えば、反応管またはウエル)中の指定された場所を用いる凝集反応の画像分析のための方法が提供される。一実施形態では、凝集反応の充填された細胞の走査を用いる、凝集反応の画像分析のための方法が提供される。一実施形態では、面積および/または凝集反応の充填された細胞の周囲の長さの決定を用いる、凝集反応の画像分析のための、方法が提供される。いくつかの態様では、充填された細胞は、ボタンおよび/または滴領域を含む。。

0015

いくつかの実施形態では、凝集の存在は、赤血球−ウイルス粒子クラスターの形成により証明され、および前記クラスターは、光学的機器の画像化領域中に捕捉される。光学的機器は、制限なしにカメラ、顕微鏡、光学的スキャナー、センサー検出器、または任意の他の適切な画像化機器を含み得る。所望の場合には、凝集反応の分析は、前記画像のそれぞれに捕捉された個々の赤血球の中心から中心への距離に基づく前記クラスターのサイズを計算することにより遂行され得る。

0016

いくつかの実施形態では、被験者の有効な免疫化を決定するための方法は、生物学的サンプル中の抗体濃度が、所定のレベルよりも低い場合に、第一のウイルス粒子に対する、ワクチンの第二の用量を被験者に投与するステップを更に含むことができる。

0017

更に提供されるものは以下を含むキットである:あらかじめ固定された赤血球、ウイルス粒子、および抗体またはウイルスの検出のためのキットを使用するユーザーに対する使用説明書。そのような使用説明書は無線的に送信されおよび自動化されたシステムにおいて遂行され得る。

0018

実施形態では、本明細書において提供されるものは、混合物中の粒子の凝集の検定方法であり、この方法は:凝集粒子との相互作用を介して、可視化粒子の凝集を許容する条件下で、可視化粒子および凝集粒子を含む混合物を生成すること;少なくとも1つの混合物の画像を取得すること;および混合物中の粒子の凝集の測定を得るために、画像を分析することを含む。

0019

本明細書で提供される開示中の可視化粒子を含む実施形態では、この可視化粒子はRBCまたはミクロスフェアである。

0020

本明細書で提供される開示中の凝集粒子を含む実施形態では、この凝集粒子は、ウイルス、ウイルス粒子、または抗体である。

0021

本明細書で提供される開示中の画像を取得することを含む実施形態では、この画像はCCDまたはCMOS画像センサーにより得られる。

0022

本明細書で提供される開示中の画像を取得することを含む実施形態では、この画像は光学的機器により得られる。

0023

本明細書で提供される開示中の凝集粒子を含む実施形態では、この凝集粒子は被験者からの生物学的サンプル中に提供される。

0024

本明細書で提供される開示中の生物学的サンプルを含む実施形態では、この生物学的サンプルは血漿または血清を含む。

0025

本明細書で提供される開示中の凝集粒子を含む実施形態では、この凝集粒子はウイルスである。

0026

本明細書で提供される開示中の凝集粒子を含む実施形態では、この凝集粒子は抗体である。

0027

本明細書で提供される開示中の、被験者からの生物学的サンプルを含む、混合物中の粒子凝集の検定方法を含む実施形態では、この方法は、サンプル中のウイルスまたは抗体の量の決定を許容する。

0028

本明細書で提供される開示中の、凝集粒子および可視化粒子を含む、混合物中の粒子凝集の検定方法を含む実施形態では、、混合物は、凝集粒子に特異的に結合し、および凝集粒子と可視化粒子との相互作用を阻害する抗体更に含む。実施形態では、抗体が被験者からの生物学的サンプル中の混合物に提供される。実施形態では、この生物学的サンプル血漿または血清を含む。実施形態では、この方法は、サンプル中の抗体の量の決定を許容する。

0029

本明細書で提供される開示中の、凝集粒子および可視化粒子を含む混合物および混合物の画像を取得することを含む実施形態では、この画像は、混合物を生成してから、それぞれ10秒、30秒、1分、2、分、5分、10分、15分20分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、または8時間以内で得られる。

0030

本明細書で提供される開示中の、混合物中の粒子の凝集を得るために、凝集粒子および可視化粒子を含む混合物の画像を分析することを含む実施形態では、この画像を分析することは画像中の目的の領域(ROI)を特定することを含む。

0031

本明細書で提供される開示中のROIを含む実施形態では、このROIは可視化粒子および凝集粒子を含む混合物の撮像された情報を含む。

0032

本明細書で提供される開示中の、凝集粒子および可視化粒子を含む混合物中の粒子の凝集の測定を含む実施形態では、この混合物中の粒子の凝集の測定は、凝集または非凝集の定性的測定である。

0033

本明細書で提供される開示中の、凝集粒子および可視化粒子を含む混合物中の粒子の凝集の測定を含む実施形態では、この混合物中の粒子の凝集の測定は、凝集程度の定量的測定である。

0034

本明細書で提供される開示中の、凝集粒子および可視化粒子を含む混合物の画像を取得することを含む実施形態では、2つ以上の混合物の画像が得られる。

0035

本明細書で提供される開示中の、凝集粒子および可視化粒子を含む混合物の少なくとも1つの画像を取得すること、および混合物中の粒子の凝集の測定のために画像を分析することを含む実施形態では、この画像を分析することは、画像中のクラスターの同定を含む。

0036

本明細書で提供される開示中の、画像中のクラスターの同定を含む方法を含む実施形態では、この方法は、画像中のクラスターのサイズまたは数を決定することを更に含む。

0037

本明細書で提供される開示中の、画像中のクラスターの同定を含む実施形態では、この画像中のクラスターの同定は、画像中の可視化粒子の間の距離を決定することを含む。

0038

本明細書で提供される開示中の〜画像中の可視化粒子の間の距離を決定することを含む実施形態では、この可視化粒子の間の距離を決定することは、画像中の可視化粒子の間の中心から中心への距離を決定することを含む。

0039

本明細書で提供される開示中の、凝集粒子および可視化粒子を含む混合物の少なくとも1つの画像を取得すること、および混合物中の粒子の凝集の測定を得るために画像を分析することを含む実施形態では、この画像を分析することは、画像中の第一の可視化粒子および第二の可視化粒子の間の中心から中心への距離を決定することを更に含む。実施形態では、この画像を分析することは、画像中の第一の可視化粒子および第二の可視化粒子の位置を決定することを更に含む。

0040

本明細書で提供される開示中の、画像中の可視化粒子および凝集粒子を含むクラスターの同定を含む方法を含む実施形態では、この可視化粒子および凝集粒子を含むクラスターの同定は、第一の可視化粒子および第二の可視化粒子を同定することを含み、可視化粒子および第二の可視化粒子の間の中心から中心への距離は、第一または第二の可視化粒子のいずれかの直径よりも、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、2.5、3、または5倍より大きい。

0041

本明細書で提供される開示中の、画像中の可視化粒子および凝集粒子を含むクラスターの同定を含む方法を含む実施形態では、この可視化粒子および凝集粒子を含むクラスターの同定は、第一の可視化粒子および第二の可視化粒子を同定することを含み、可視化粒子および第二の可視化粒子の間の中心から中心への距離は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、または50umよりも大きい。

0042

本明細書で提供される開示中の、画像中の可視化粒子および凝集粒子を含むクラスターの同定を含む方法を含む実施形態では、この可視化粒子および凝集粒子を含むクラスターの同定は、少なくとも3つの可視化粒子のクラスターを同定することを含み、可視化粒子のそれぞれは、その粒子の中心が、クラスター中の他の2つの可視化粒子のそれぞれの中心から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、または50um以内にあるように位置づけられる。

0043

本明細書で提供される開示中の、画像中の可視化粒子および凝集粒子を含むクラスターの同定を含む方法を含む実施形態では、この画像中のクラスターの同定は、カットオフ値距離を選択することを含み、互いにカットオフ値の距離よりも小さい距離に存在する粒子は、たがいに付随し合うと見なされる。

0044

本明細書で提供される開示中の〜カットオフ値の距離を選択することを含む実施形態では、このカットオフ値の距離を選択することは、画像中の2つ以上の粒子についての動径分布関数を計算することを含む。

0045

本明細書で提供される開示中の、混合物中の粒子の凝集の測定を取得するために、凝集粒子および可視化粒子を含む混合物の少なくとも1つの画像を取得することならびに画像を分析することを含む実施形態では、この画像を分析することは、可視化粒子および凝集粒子を含む混合物の、撮像された情報を含む画像の領域からの特徴抽出を含む。

0046

本明細書で提供される開示中の、画像からの特徴抽出を含む実施形態では、この特徴抽出 は、可視化粒子および凝集粒子を含む混合物のテクスチャーを分析することを含む。

0047

本明細書で提供される開示中の、可視化粒子および凝集粒子を含む混合物の撮像された情報を含む画像のテクスチャーを分析することを含む実施形態では、この混合物のテクスチャーを分析することは、撮像された情報をローカルバイナリーパターン演算子(ローカル・バイナリー・パターン演算子)で分析することを含む。

0048

本明細書で提供される開示中の、画像からの特徴抽出を含み、特徴抽出が可視化粒子および凝集粒子の混合物のテクスチャーを分析することを含む実施形態では、この特徴抽出は、可視化粒子および凝集粒子を含む混合物の撮像された情報を含む、画像の領域の1つ以上のカラーチャネルでの信号の強度を解析することを更に含む。

0049

本明細書で提供される開示中の、可視化粒子および凝集粒子を含む混合物のテクスチャーを分析することを含む実施形態では、混合物の構造を分析することは、ローカル・バイナリー・パターン演算子から得られた情報を、可視化粒子および凝集粒子の混合物を含む既知のの凝集状態の1つ以上の画像からのローカル・バイナリー・パターン情報であらかじめ訓練されている、アルゴリズムに入力することを含む。

0050

本明細書で提供される開示中の、混合物中の粒子の凝集の測定を取得するために、凝集粒子および可視化粒子を含む混合物の、少なくとも1つの画像を取得することならびに画像を分析することを含む実施形態では、この画像を分析することは、混合物の画像からの特徴抽出情報を、可視化粒子および凝集粒子を含む、既知の凝集状態の参照混合物の画像からの特徴抽出情報と比較することを含む。

0051

本明細書の他の場所に記載されるように、凝集検定および凝集阻害検定は異なるが、しかし関連する検定である。従って、実施形態では、本明細書のシステム、試薬、“凝集検定”のための方法などの記述は、文脈が明確に他のことを支持しない限り、凝集検定および凝集阻害検定の両方に適用され得る。同様に、実施形態では、本明細書のシステム、試薬、“凝集検定”のための方法などの記述は、文脈が明確に他のことを支持しない限り、凝集検定および凝集阻害検定の両方に適用され得る。例えば、凝集および凝集阻害検定の両方が、検定における可視化粒子凝集の程度を分析することを含むことができ、および従って、可視化粒子の凝集の程度を分析するために本明細書で提供されるシステム、試薬および方法は、凝集検定および凝集阻害検定の両方に適用され得る。

0052

この要旨は、以下の発明の詳細な説明で更に記載される概念単純化された形態における選択を紹介するために提供される。この要旨は、主張される主題の主要な特徴または本質的な特性を特定することを意図しておらず、主張される主題の範囲を限定するために用いられることを意図していない。
[参照による組み込み]

0053

本明細書において言及される、全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許及び特許出願のそれぞれが、参照により組み込まれるために、あたかも明確に、及び個々に参照により示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
生物学的サンプル中の抗体の存在を決定するための方法であって前記抗体は選択的にウイルス粒子に結合し、前記方法は:
(a)赤血球、ウイルス粒子、および前記抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記ウイルス粒子との相互作用を介する赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および
(b)混合物中で凝集が起きるかを検出することを含み、この凝集の不在は前記抗体の存在を示し、
前記ステップ(a)〜(b)は1時間未満で生じる方法。
(項目2)
前記赤血球があらかじめ固定された、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記赤血球が、グルタルアルデヒドによる処理によりあらかじめ固定された、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記赤血球が、シチメンチョウ赤血球細胞を含む、項目1〜3のいずれかに記載の方法。
(項目5)
前記ウイルス粒子がインフルエンザウイルスを含む、項目1〜4のいずれかに記載の方法。
(項目6)
前記生物学的サンプルが、血漿または血清を含む、項目1〜5のいずれかに記載の方法。
(項目7)
前記血漿または血清が、ウイルス粒子に対するワクチンを投与された被験者からのものである、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記生物学的サンプルが、ノイラミニダーゼにより前処理された、項目1〜7のいずれかに記載の方法。
(項目9)
前記処理が、生物学的サンプルをノイラミニダーゼと共にインキュベートすることにより遂行され、および前記混合物中のノイラミニダーゼ最終的な濃度が0.1〜1.5U/Lである、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記が、前記サンプルを活性なノイラミニダーゼと30分未満インキュベートすることにより遂行される、項目8に記載の方法。
(項目11)
前記生物学的サンプルがステップ(a)に先立って、連続的に希釈される、項目1〜10のいずれかに記載の方法。
(項目12)
前記ステップ(a)〜(b)が約30〜60分で生じる、項目1〜11のいずれかに記載の方法。
(項目13)
前記前記凝集の存在が、赤血球−ウイルス粒子クラスターの形成により証明され、および前記クラスターは、光学的機器の画像化領域において捕捉され、および前記検出ステップは:
(i)前記光学的機器により、前記クラスターの複数の画像を、前記画像化領域の異なる位置において捕捉すること;および
(ii)凝集の発生を前記画像の分析に基づいて検出することを含む、項目1〜12のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記光学的機器がカメラを含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記光学的機器が顕微鏡を含む、項目13または14のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記画像化領域が、ミクロ流体性チャネルの中に存在する、項目13〜15のいずれかに記載の方法。
(項目17)
前記分析が、前記画像のそれぞれにおいて捕捉された個々の赤血球の中心から中心への距離に基づいて、前記クラスターのサイズを計算することを含む、項目13〜16のいずれかに記載の方法。
(項目18)
前記ステップ(a)が、前記ウイルス粒子および前記生物学的サンプルの混合物を、赤血球を添加する前にインキュベートすることを含む、項目13〜17のいずれかに記載の方法。
(項目19)
生物学的サンプル中の抗体の存在を決定するための方法であって前記抗体は選択的にウイルス粒子に結合し、前記方法は:
(a)赤血球、ウイルス粒子、および前記抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記ウイルス粒子との相互作用を介する赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および
(b)光学的機器の支援により、混合物の画像を捕捉することを含み、画像中の赤血球−ウイルスの粒子クラスターの存在が、凝集の発生および検出可能な量の抗体の欠如を示し、およびクラスターの不在は、凝集の欠如および検出可能な量の抗体の存在を示す方法。
(項目20)
前記赤血球−ウイルス粒子クラスターの形成が、前記画像に捕捉された、赤血球の中心から中心への距離を評価することにより決定される、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記ステップ(a)が、前記ウイルス粒子および前記生物学的サンプルの混合物を、赤血球を添加する前にインキュベートすることを含む、項目19または20のいずれかに記載の方法。
(項目22)
生物学的サンプル中の抗体の存在を決定するための方法であって、前記抗体は選択的にウイルス粒子に結合し、前記方法は:
(a)赤血球、およびウイルス粒子を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記ウイルス粒子との相互作用を介する赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および
(b)前記混合物中で、凝集が発生するかを検出することを含み、前記凝集の存在が、前記ウイルス粒子の存在を示し、
ステップ(a)〜(b)は1時間未満で生じる方法。
(項目23)
生物学的サンプル中のウイルス粒子の存在を決定するための方法であって:
(a)赤血球およびウイルスの粒子を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、ウイルスの粒子との相互作用による赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および
(b)光学的機器の支援により、混合物の画像を捕捉することを含み、画像中の赤血球−ウイルスの粒子のクラスターの存在が、凝集の発生および検出可能な量のウイルスの粒子の存在を示し、およびクラスターの不在は、凝集の欠如および検出可能な量のウイルスの粒子の欠如を示す方法。
(項目24)
被験者の有効な免疫化を決定するための方法であって、前記方法は:
(a)ウイルス粒子に対する第一のワクチンの第一の用量で免疫化された被験者からの生物学的サンプルを得ること
(b)赤血球、ウイルスの粒子および抗体を含む生物学的サンプルの混合物を、ウイルスの粒子との相互作用による赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および
(c)サンプル中のウイルスに対する抗体の濃度を、赤血球の凝集により形成されたクラスターに基づき決定することを含み、
および前記ステップ(b)〜(c)は1時間未満で生じる方法。
(項目25)
被験者の有効な免疫化を決定するための方法であって、前記方法は:
(a)ウイルス粒子に対する第一のワクチンの第一の用量で免疫化された被験者からの生物学的サンプルを得ること;
(b)赤血球、ウイルス粒子、および生物学的サンプルの混合物を、ウイルス粒子との相互作用による赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;
(c)光学的機器の支援により、混合物の画像を捕捉すること;および
(d)サンプル中のウイルスに対する抗体の濃度を、赤血球の凝集により形成されたクラスターに基づき決定することを含み、
画像中の赤血球−ウイルス粒子クラスターの存在が、凝集の発生および検出可能な量の抗体の欠如を示し、およびクラスターの不在が、凝集の欠如および検出可能な量の抗体の存在を示す方法。
(項目26)
前記抗体の濃度が、所定のレベルよりも低い場合に、前記ウイルス粒子に対する第一のワクチンの第二の用量を前記被験者に投与することを更に含む、項目23または24び記載の方法。
(項目27)
前記抗体の濃度が、所定のレベルよりも低い場合に、前記ウイルス粒子に対する第一のワクチンの第二のワクチンを前記被験者に投与することを更に含む、項目23または24び記載の方法。
(項目28)
キットであって:あらかじめ固定された赤血球、ウイルス粒子、および前記キットを抗体またはウイルスの検出に使用するための使用説明書を含むキット。
(項目29)
前記画像が顕微鏡的な画像である、項目19、23または25のいずれかに記載の方法。
(項目30)
生物学的サンプル中の抗体の存在を決定するための方法であって、前記抗体は選択的にウイルス粒子に結合し、前記方法は:
(a)赤血球、ウイルス粒子、および前記抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記ウイルス粒子との相互作用を介する赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および
(b)(a)と同時に、または後続して、前記混合物を、その頂部に開口部を有する容器であって、内部は底部まで円錐形の容器の中に提供すること;
(c)少なくとも前記混合物の一部分が前記容器の頂部における開口部に、傾斜の前よりは近づくことができるように、および少なくともサンプルの一部分が前記容器の中に傾斜の後よりは残存するように前記容器を傾斜すること;および
(d)光学的機器の支援により、前記混合物の画像を捕捉することを含み、前記傾斜された容器内の赤血球の位置は、サンプル中の前記抗体の存在または量を決定するために用いられ得る方法。
(項目31)
生物学的サンプル中のウイルス粒子の存在を決定するための方法であって、前記ウイルス粒子は選択的に抗体に結合され、前記方法は:
(a)赤血球、前記抗体、および前記ウイルス粒子を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記ウイルス粒子との相互作用を介する赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;
(b)(a)と同時に、または後続して、前記混合物を、その頂部に開口部を有する容器であって、内部は底部まで円錐形の容器の中に提供すること;
(c)少なくとも前記混合物の一部分が前記容器の頂部における開口部に、傾斜の前よりは近づくことができるように、および少なくともサンプルの一部分が前記容器の中に傾斜の後よりは残存するように前記容器を傾斜すること;および
(d)光学的機器の支援により、前記混合物の画像を捕捉することを含み、前記傾斜された容器内の赤血球の位置は、サンプル中の前記ウイルス粒子の存在または量を決定するために用いられ得る方法。
(項目32)
前記容器内に、分析のための1つ以上のゾーンが存在するかまたは確立され、および光学的信号が、それぞれのゾーンの上で測定される、項目30または31に記載の方法。
(項目33)
前記1つ以上のゾーンの上で測定された光学的信号が、サンプル中の凝集したまたは凝集していない赤血球の量の決定に用いられ得る、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記容器内に、分析のための軸が、存在するか、または確立され、および光学的信号が、前記軸に沿って測定される、項目30または31に記載の方法。
(項目35)
前記軸は、ボタン部分の中心を貫通し、および存在する場合には、充填された赤血球の涙滴部分は、前記容器の底部に存在する、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記軸の沿って測定された光学的信号が、サンプル中の凝集した、または凝集していない赤血球の量を測定するために用いられる得る、項目34または35のいずれかに記載の方法。
(項目37)
前記容器の底に充填された赤血球が特定され、および前記充填された赤血球の面積または周囲の長さが測定される、項目30または31のいずれかに記載の方法。
(項目38)
前記方法が、前記充填された赤血球のボタン、および随意的に、涙滴領域の特定のために、パターン認識方法を用いることを更に含む、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記充填された赤血球の面積または周囲の長さが、前記サンプル中の凝集した、または凝集していない赤血球の量を決定するために用いられ得る、項目37または38のいずれかに記載の方法。
(項目40)
生物学的サンプル中の抗体の存在を決定するための方法であって、前記抗体は選択的に凝集粒子に結合し、前記方法は:
(a)可視化粒子、前記凝集粒子、および前記抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記凝集粒子との相互作用を介する可視化粒子の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および
(b)前記混合物中で凝集が生じるかを検出することを含み、前記凝集の不在は前記抗体の存在を示し、
前記ステップ(a)〜(b)は1時間未満で生じる方法。
(項目41)
前記可視化粒子がミクロスフェアである、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記凝集粒子がウイルス、プリオン、またはバクテリアを含む、項目40または41のいずれかに記載の方法。
(項目43)
前記生物学的サンプルが血漿または血清を含む、項目40〜42のいずれかに記載の方法。
(項目44)
前記血漿または血清が、前記凝集粒子に対するワクチンを投与された被験者からのものである、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記生物学的サンプルがノイラミニダーゼにより前処理された、項目40〜44のいずれかに記載の方法。
(項目46)
前記処理が、前記生物学的サンプルをノイラミニダーゼとインキュベートすることにより遂行され、および前記ノイラミニダーゼの前記混合物中の最終的な濃度が0.1〜1.5U/Lである、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記処理が、前記サンプルを活性なノイラミニダーゼと30分未満インキュベートすることにより遂行される、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記生物学的サンプルがステップ(a)に先立って連続的に希釈される、項目40〜47のいずれかに記載の方法。
(項目49)
前記ステップ(a)〜(b)が約30〜60分で生じる、項目40〜48のいずれかに記載の方法。
(項目50)
前記凝集の存在が、可視化粒子−凝集粒子クラスターの形成により証明され、および前記クラスターが、光学的機器の画像化領域により捕捉され、および前記検出ステップは:
(i)前記クラスターの複数の画像を、前記画像化領域の異なる位置において、前記光学的機器により捕捉すること;および
(ii)前記凝集の発生を、前記画像の分析に基づいて検出することを含む、項目40〜49のいずれかに記載の方法。
(項目51)
前記光学的機器がカメラを含む、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記光学的機器が、顕微鏡を含む、項目50に記載の方法。
(項目53)
前記画像化領域が、ミクロ流体性チャネルの中に存在する、項目50〜52のいずれかに記載の方法。
(項目54)
前記分析が、前記クラスターのサイズを、前記画像のそれぞれに捕捉された、個々の赤血球の中心から中心への距離に基づいて計算することを含む、項目50〜53のいずれかに記載の方法。
(項目55)
前記ステップ(a)が、赤血球を加える前に、前記ウイルス粒子および前記生物学的サンプルの混合物をインキュベートすることを含む、項目40〜54のいずれかに記載の方法。
(項目56)
生物学的サンプル中の抗体の存在を決定するための方法であって、前記抗体は選択的に凝集粒子に結合し、前記方法は:
(a)可視化粒子、前記凝集粒子、および前記抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記凝集粒子との相互作用を介する可視化粒子の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および
(b)光学的機器の支援により、前記混合物の画像を捕捉することを含み、前記画像中の可視化粒子−凝集粒子クラスターの存在が前記凝集の発生、および検出可能な量の前記抗体の欠如を示し、および前記クラスターの不在が、前記凝集の欠如および前記検出可能な量の前記抗体の存在を示す方法。
(項目57)
前記可視化粒子−凝集粒子クラスターの形成が、前記画像中に捕捉された、個々の可視化粒子の中心から中心への距離を評価することにより決定される、項目56に記載の方法。
(項目58)
前記ステップ(a)が、前記可視化粒子を加える前に、前記凝集粒子および前記生物学的サンプルの混合物をインキュベートすることを含む、項目56または57のいずれかに記載の方法。
(項目59)
生物学的サンプルの凝集粒子の存在を決定するための方法であって:
(a)可視化粒子、および前記凝集粒子を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記凝集粒子との相互作用を介する可視化粒子の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および
(b)前記混合物中で、凝集が生じるかを検出することを含み、前記凝集の存在は前記凝集粒子の存在を示し、
およびステップ(a)〜(b)は1時間未満で生じる方法。
(項目60)
生物学的サンプルの凝集粒子の存在を決定するための方法であって:
(a)可視化粒子、および前記凝集粒子を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記凝集粒子との相互作用を介する可視化粒子の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および
(b)光学的機器の支援により、前記混合物の画像を捕捉することを含み、前記画像中の可視化粒子−凝集粒子クラスターの存在が前記凝集の発生、および検出可能な量の前記凝集粒子の存在を示し、および前記クラスターの不在が、前記凝集の欠如および前記検出可能な量の前記凝集粒子の欠如を示す方法。
(項目61)
被験者の有効な免疫化を決定するための方法であって:
(a)ウイルス粒子に対する第一のワクチンの第一の用量で免疫化された被験者からの生物学的サンプルを取得すること;
(b)可視化粒子、前記凝集粒子、および前記生物学的サンプルの混合物を、前記凝集粒子との相互作用による前記可視化粒子の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および
(c)前記サンプル中の前記凝集粒子に対する抗体の濃度を、前記可視化粒子の凝集により形成されたクラスターに基づき決定することを含み、
および前記ステップ(b)〜(c)は1時間未満で生じる。
(項目62)
被験者の有効な免疫化を決定するための方法であって:
(a)ウイルス粒子に対する第一のワクチンの第一の用量で免疫化された被験者からの生物学的サンプルを取得すること;
(b)可視化粒子、前記凝集粒子、および前記生物学的サンプルの混合物を、前記凝集粒子との相互作用による前記可視化粒子の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;
(c)光学的機器の支援により前記混合物の画像を捕捉すること;および
(d)前記サンプル中の前記凝集粒子に対する抗体の濃度を、前記可視化粒子の凝集により形成されたクラスターに基づき決定することを含み、
前記画像中の可視化粒子−凝集粒子クラスターの存在が、前記凝集の発生および検出可能な量の前記抗体の欠如を示し、および前記クラスターの不在が、前記凝集の欠如および検出可能な量の前記抗体の存在を示す方法。
(項目63)
前記抗体濃度が所定のレベルより低い場合に前記凝集粒子に対する前記第一のワクチンの第二の用量を、前記被験者に投与することを更に含む、項目61または62のいずれかに記載の方法。
(項目64)
前記抗体濃度が所定のレベルより低い場合に前記凝集粒子に対する記第二のワクチンを、前記被験者に投与することを更に含む、項目61または62のいずれかに記載の方法。
(項目65)
キットであって:可視化粒子、凝集粒子、および抗体または凝集粒子検出のために前記キットを使用するためのユーザーへの使用説明書を含むキット。
(項目66)
前記可視化粒子がミクロスフェアである、項目65に記載のキット。
(項目67)
前記画像が顕微鏡的な画像である、項目19、23、25、56、60、または62のいずれかに記載の方法。
(項目68)
生物学的サンプル中の抗体の存在を決定するための方法であって、前記抗体は選択的に凝集粒子に結合し、前記方法は:
(a)可視化粒子、前記凝集粒子、および前記抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記凝集粒子との相互作用を介する可視化粒子の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;
(b)(a)と同時に、または後続して、前記混合物を、その頂部に開口部を有する容器であって、内部は底部まで円錐形の容器の中に提供すること;
(c)少なくとも前記混合物の一部分が前記容器の頂部における開口部に、傾斜の前よりは近づくことができるように、および少なくともサンプルの一部分が前記容器の中に傾斜の後よりは残存するように前記容器を傾斜すること;および
(d)光学的機器の支援により、前記混合物の画像を捕捉することを含み、前記傾斜された容器内の赤血球の位置は、サンプル中の前記抗体の存在または量を決定するために用いられ得る方法。
(項目69)
生物学的サンプルの凝集粒子の存在を決定するための方法であって,
前記凝集粒子は抗体に選択的にに結合し、前記方法は:
(a)可視化粒子、前記抗体、および前記凝集粒子を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記凝集粒子との相互作用を介する可視化粒子の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;
(b)(a)と同時に、または後続して、前記混合物を、その頂部に開口部を有する容器であって、内部は底部まで円錐形の容器の中に提供すること;
(c)少なくとも前記混合物の一部分が前記容器の頂部における開口部に、傾斜の前よりは近づくことができるように、および少なくともサンプルの一部分が前記容器の中に傾斜の後よりは残存するように前記容器を傾斜すること;および
(d)光学的機器の支援により、前記混合物の画像を捕捉することを含み、前記傾斜された容器内の赤血球の位置は、サンプル中の前記凝集粒子の存在または量を決定するために用いられ得る方法。
(項目70)
前記容器内に、分析のための1つ以上のゾーンが存在するかまたは確立され、および光学的信号が、それぞれのゾーンの上で測定される、項目68または69に記載の方法。
(項目71)
前記1つ以上のゾーンの上で測定された光学的信号が、サンプル中の凝集したまたは凝集していない可視化粒子の量を測定するために用いられる得る、項目70に記載の方法。
(項目72)
前記容器内に、分析のための軸が、存在するか、または確立され、および光学的信号が、前記軸に沿って測定される、項目68または69に記載の方法。
(項目73)
前記軸は、ボタン部分の中心を貫通し、および存在する場合には、充填された赤血球の涙滴部分は、前記容器の底部に存在する、項目72に記載の方法。
(項目74)
前記軸の沿って測定された光学的信号が、サンプル中の凝集した、または凝集していない可視化粒子の量を測定するために用いられる得る、項目72または73のいずれかに記載の方法。
(項目75)
前記容器の底に充填された可視化粒子が特定され、および前記充填された可視化粒子の面積または周囲の長さが測定される、項目68または69のいずれかに記載の方法。
(項目76)
前記方法が、前記充填された可視化粒子のボタン、および随意的に、涙滴領域の特定のために、パターン認識方法を用いることを更に含む、項目75に記載の方法。
(項目77)
前記充填された可視化粒子の面積または周囲の長さが、前記サンプル中の凝集した、または凝集していない可視化粒子の量を決定するために用いられ得る、項目75または76のいずれかに記載の方法。
(項目78)
複数の画像が収集され、および前記複数の画像がビデオにより収集される、項目19、23、25、30、31、56、60、62、68、または69のいずれかに記載の方法。
(項目79)
前記方法が、ポイントオブサービスの位置で遂行される、項目1〜27、29〜64、または67〜78のいずれかに記載の方法。
(項目80)
混合物中の可視化粒子の凝集の検定方法であって:
A)凝集粒子との相互作用を介して、前記可視化粒子の凝集を許容する条件下で、前記可視化粒子および前記凝集粒子を含む混合物を生成すること;
B)少なくとも1つの前記混合物の画像を取得すること;および
C)前記混合物中の前記可視化粒子の凝集の測定を得るために、前記画像を分析すること
を含む方法。
(項目81)
前記可視化粒子がRBCまたはミクロスフェアである、項目80に記載の方法。
(項目82)
前記凝集粒子がウイルス粒子または抗体である、項目80または81のいずれかに記載の方法。
(項目83)
前記画像がCCDまたはCMOS画像センサーにより取得される、項目80〜82のいずれかに記載の方法。
(項目84)
前記画像が光学的機器により取得される、項目80〜83のいずれかに記載の方法。
(項目85)
前記凝集粒子が被験者からの生物学的サンプル中に提供される、項目80〜84のいずれかに記載の方法。
(項目86)
前記生物学的サンプルが血漿または血清を含む、項目85に記載の方法。
(項目87)
前記凝集粒子がウイルス粒子である、項目85に記載の方法。
(項目88)
前記凝集粒子が抗体である、項目85に記載の方法。
(項目89)
サンプル中のウイルス粒子または抗体の量を決定することを更に含む、項目85〜88のいずれかに記載の方法。
(項目90)
前記凝集粒子の少なくとも1つの凝集粒子に特異的に結合する抗体を更に含み、および前記可視化粒子の可視化粒子と前記凝集粒子の相互作用を阻害する、項目80〜89のいずれかに記載の方法。
(項目91)
前記被験者からの生物学的サンプル中の混合物に前記抗体が提供される、項目90に記載の方法。
(項目92)
前記生物学的サンプルが、血漿または血清を含む、項目91に記載の方法。
(項目93)
前記サンプル中の前記抗体の量を決定することを更に含む、項目91または92に記載の方法。
(項目94)
前記混合物の画像が、前記混合物の生成から1時間以内で取得される、項目80〜93のいずれかに記載の方法。
(項目95)
画像を分析することが、画像中の目的の領域(ROI)を特定することを含む、項目80〜94のいずれかに記載の方法。
(項目96)
前記ROIが、前記混合物の撮像された情報を含み、前記混合物が可視化粒子および凝集粒子を含む、項目95に記載の方法。
(項目97)
前記混合物中の前記可視化粒子の凝集の測定が、前記可視化粒子の凝集または非凝集の定性的測定である、項目80〜96のいずれかに記載の方法。
(項目98)
前記混合物中の前記可視化粒子の凝集の測定が、前記可視化粒子の凝集の程度の定量的測定である、項目80〜96のいずれかに記載の方法。
(項目99)
前記混合物2つ以上の画像が取得される、項目80〜98のいずれかに記載の方法。
(項目100)
前記凝集が、可視化粒子および凝集粒子を含むクラスターの形成により証明され、および前記画像を分析するステップが、画像中のクラスターを特定することを含む、項目80〜99のいずれかに記載の方法。
(項目101)
画像中のクラスターのサイズまたは数を決定することを更に含む、項目100に記載の方法。
(項目102)
画像中のクラスターを特定する前記ステップが、画像中の可視化粒子の間の距離を決定することを含む、項目100に記載の方法。
(項目103)
前記画像中の可視化粒子の間の距離を決定するステップが、画像中の可視化粒子の中心から中心への距離を決定することを含む、項目102に記載の方法。
(項目104)
前記画像を分析するステップが、画像中の第一の可視化粒子および第二の可視化粒子の中心から中心への間の距離を決定することを含む、項目80〜103に記載の方法。
(項目105)
画像中の前記第一の可視化粒子および第二の可視化粒子の位置を決定することを更に含む、項目104に記載の方法。
(項目106)
前記クラスターを特定するステップが、第一の可視化粒子および第二の可視化粒子を特定することを含み、前記第一の可視化粒子および第二の可視化粒子の中心から中心の間の距離が、第一または第二の可視化粒子のいずれかの直径の1.5倍を超えない、項目100〜105に記載の方法。
(項目107)
前記クラスターを特定するステップが、第一の可視化粒子および第二の可視化粒子を特定することを含み、前記第一の可視化粒子および第二の可視化粒子の中心から中心の間の距離が、12μmを超えない、項目100〜106に記載の方法。
(項目108)
前記クラスターを特定するステップが、少なくとも3つの可視化粒子を特定することを含み、前記3つの可視化粒子のそれぞれが、前記可視化粒子の中心が、前記他の2つの可視化粒子の中心から15μmを超えない位置にあるように位置づけられる、項目100〜105に記載の方法。
(項目109)
前記クラスターを特定するステップが、カットオフ値の距離を選択することを含み、前記カットオフ値の距離未満の距離に互いに存在する可視化粒子は、互いに会合していると見なされる、項目100〜108に記載の方法。
(項目110)
前記カットオフ値の距離を選択するステップが2つ以上の画像中の可視化粒子についての動径分布関数を計算することを含む、項目109に記載の方法。
(項目111)
前記画像を分析するステップが、前記混合物の画像の領域から特徴を抽出することを含む、項目80〜110のいずれかに記載の方法。
(項目112)
前記特徴を抽出するステップが、記前記混合物のテクスチャーを分析することを含む、項目111に記載の方法。
(項目113)
前記混合物のテクスチャーを分析するステップが、ローカル・バイナリー・パターン演算子により画像を分析することを含む、項目112に記載の方法。
(項目114)
前記特徴を抽出することが、前記画像の領域中の1つ以上の色チャネルにおける信号強度を分析することを含む、項目112または113に記載の方法。
(項目115)
前記混合物のテクスチャーを分析するステップが、前記ローカル・バイナリー・パターン演算子から得られた情報を、既知の凝集状態の混合物の1つ以上の画像からのローカル・バイナリー・パターン情報により、前もって訓練されたアルゴリズムに入力することを含む、項目113に記載の方法。
(項目116)
前記画像を分析するステップが、前記混合物の画像からの特徴抽出情報を、既知の凝集状態の対照混合物の画像からの特徴抽出情報と比較することを含み、前記対照混合物は、可視化粒子および凝集粒子を含む、項目80〜115のいずれかに記載の方法。
(項目117)
ステップA)〜C)が1時間以下で遂行される、項目80〜116のいずれかに記載の方法。

図面の簡単な説明

0054

図面において、

0055

図1は、赤血球細胞の凝集を描いている。

0056

図2は、それにより、凝集した、および凝集していないサンプルが区別され得る従来のペレット検定を図示している。

0057

図3は、それにより、凝集した、および凝集していないサンプルが、円錐型管中で区別され得る従来のペレット検定を図示している。

0058

図4は、A)ウイルスに媒介された細胞の凝集およびB)抗体に媒介された細胞の凝集を描いている。

0059

図5は、ウイルスに媒介された細胞の凝集の抗体に媒介された阻害を描いている。

0060

図6は、容器中の指定された場所での、画像分析による可視化粒子の全体の動きの分析に関連する概略図を描いている。パネルAは、凝集していない、部分的に凝集した、および凝集したサンプル中のゾーンの全域にわたる可視化粒子の動きを描いている。パネルBは、可視化粒子の面積よりも小さなゾーンを描いている。

0061

図7は、信号強度対図6に描かれたサンプルのゾーン番号の、サンプルのグラフを示す。

0062

図8は、スキャニングを用いる画像分析による可視化粒子の全体の動きの分析のために用いられ得る、容器の底の充填された細胞のボタンおよび涙滴領域を貫く軸を描いている。

0063

図9は、信号強度対凝集していない、凝集した、および部分的に凝集したサンプルについての図8に描かれた軸に沿った位置番号の、サンプルのグラフを示している。三角形マークされた線は、凝集したサンプル、正方形でマークされた線は、部分的に凝集したサンプル、および菱形でマークされた線は凝集したサンプルである。

0064

図10は、面積または周辺の長さの画像分析による、可視化粒子の全体の動きの分析に用いられ得る、充填された可視化粒子のボタン(面積A/1005)領域および涙滴(面積B/1010)領域の周辺の長さの特定を示す概略図である。

0065

図11は、図10中の分析を示す、サンプルのグラフであり、面積A(1005)および面積B(1010)の%面積の間の関係、凝集の程度、および面積Bの面積Aに対する比を描いている。菱形でマークされた線が面積A、正方形でマークされた線が面積B、および三角形でマークされた線が面積B/面積Aの比である。

0066

図12は、非凝集サンプルA)および凝集サンプルB)についての代表的な顕微鏡画像を示す。

0067

図13は、6つのサンプル、サンプル1〜5および参照のクラスターのサイズの分布(左側のグラフ)、および6つのサンプルのそれぞれについて計算された会合因子(右側のグラフ)を示す。右側のグラフの差し込み図は、充填された赤血球の流動率(flow characteristics)を、プレートチルト(plate tilting)法および目視による観察を用いて測定された、同じサンプルの巨視的な画像である。差し込み図の左の列は、プレートチルト前のウエルの画像、および差し込み図の右の列は、プレートチルト後のウエルの画像である。

0068

図14は、A)会合因子の顕微鏡的な分析、B)ペレット検定の巨視的な目視画像、C)閾値デジタル化に付された、ペレット検定の巨視的な走査画像、およびD)ペレット検定の巨視的な走査画像の分析の間の比較を示す。B)およびC)は、それぞれ、A)およびD)において分析されたサンプルの画像を含む。B)およびC)は、充填された赤血球の流動率を、プレートチルト法および目視による観察を用いて測定された、ペレット検定の画像を示す。パネルB)およびC)において、ウエルは、底部から頂部に向かい1〜6と番号付けされ、および右の行および左の行のそれぞれのウエルは、同じ検定条件での反復である。D)において、菱形でマークされた線はC)の右列の細胞の面積であり、三角形でマークされた線は、C)の左列の細胞の面積であり正方形でマークされた線は、C)の右列の細胞の周辺長であり、およびX印でマークされた線は、C)の左列の細胞の周辺長である。
図14は、A)会合因子の顕微鏡的な分析、B)ペレット検定の巨視的な目視画像、C)閾値デジタル化に付された、ペレット検定の巨視的な走査画像、およびD)ペレット検定の巨視的な走査画像の分析の間の比較を示す。B)およびC)は、それぞれ、A)およびD)において分析されたサンプルの画像を含む。B)およびC)は、充填された赤血球の流動率を、プレートチルト法および目視による観察を用いて測定された、ペレット検定の画像を示す。パネルB)およびC)において、ウエルは、底部から頂部に向かい1〜6と番号付けされ、および右の行および左の行のそれぞれのウエルは、同じ検定条件での反復である。D)において、菱形でマークされた線はC)の右列の細胞の面積であり、三角形でマークされた線は、C)の左列の細胞の面積であり正方形でマークされた線は、C)の右列の細胞の周辺長であり、およびX印でマークされた線は、C)の左列の細胞の周辺長である。
図14は、A)会合因子の顕微鏡的な分析、B)ペレット検定の巨視的な目視画像、C)閾値デジタル化に付された、ペレット検定の巨視的な走査画像、およびD)ペレット検定の巨視的な走査画像の分析の間の比較を示す。B)およびC)は、それぞれ、A)およびD)において分析されたサンプルの画像を含む。B)およびC)は、充填された赤血球の流動率を、プレートチルト法および目視による観察を用いて測定された、ペレット検定の画像を示す。パネルB)およびC)において、ウエルは、底部から頂部に向かい1〜6と番号付けされ、および右の行および左の行のそれぞれのウエルは、同じ検定条件での反復である。D)において、菱形でマークされた線はC)の右列の細胞の面積であり、三角形でマークされた線は、C)の左列の細胞の面積であり正方形でマークされた線は、C)の右列の細胞の周辺長であり、およびX印でマークされた線は、C)の左列の細胞の周辺長である。

0069

図15は、従来の受容体破壊酵素RDE)法で前処理されたもの(斜線で満たされたもの)および本明細書で提供されるノイラミニダーゼを使用する方法で前処理されたもの(黒で満たされたもの)の間の比較を示す。

0070

図16は、示されるようにRDE法による、および本明細書で提供されるノイラミニダーゼ法による血漿サンプルの前処理と参照との比較を示す。

0071

図17は、従来のHAI(赤血球凝集反応阻害検定)方法に起因する抗体力力価に対してプロットされた、本開示のHAI方法に起因する抗体力力価を示す。

0072

図18は、3つの異なるウイルスの抗原である、H1N1、H3N2、およびインフルエンザBの従来のHAI方法による抗体力価に対してプロットされた、本開示のHAI方法による結果を示す。

0073

図19は、凝集検定中の粒子の例示的なX−軸上の距離r(ピクセルでの)およびY−軸上のg(r)を有する、動径分布関数のプロットを示す。

0074

図20は、本明細書で提供される方法の実施形態によるサンプルの凝集を評価するための例示的なステップを提供するフローチャートである。

0075

図21は、凝集の検定を含む例示的なチップの画像を示し;図21A、21B、および21Cは、異なる被験者からのサンプルによる検定を示す。
図21は、凝集の検定を含む例示的なチップの画像を示し;図21A、21B、および21Cは、異なる被験者からのサンプルによる検定を示す。

0076

本明細書において提供されるものは、赤血球またはミクロスフェアなどの選択的に凝集し得る他の粒子の凝集の発生を検出することによる、サンプル中のウイルス粒子、凝集粒子、抗原または抗原に対する抗体についての検定に関係する、組成物、システム、機器、および方法である。
I.総論
A.定義

0077

詞“a”、“an”および“the”は非制限的である。例えば、“themethod”は、フレーズの意味の最も広い定義を含み、1つよい多い方法であることができる。

0078

「被験者」は、ヒトまたは動物であってよい。この被験者は生きていても、または死んでいてもよい。この被験者は、患者臨床試験被検者、または前臨床試験の被験者であってよい。被験者は、診断治療、および/または疾患予防を受けることができる。この被験者は、医療専門家ケアの下にあっても、またはなくてもよい。

0079

「血液サンプル」は、血液または任意の血液の分画、血液誘導体などのサンプルである。血漿は、血液分画の一例である。この血液サンプルは、任意の適切な容積を有することができ、任意の適切な方法により得られることができ、任意の時間に被験者の任意の部位から採取されることができ、および任意の適切な容器に採取されることなどができる。血液 は、栄養素および酸素などの必要な物質を細胞に送達し、および代謝的な廃棄産物を同じ細胞から運び去る、特殊化した動物(ヒトを含む)内の体液である。血液サンプルは、任意の適切な添加物、随意的に1つ以上の抗凝固剤を有することができる。「血液サンプル」は、希釈された血液サンプルも含む。

0080

「血漿」は、全血中の血液細胞がその中に通常は懸濁する血液の液体構成成分である。それは、細胞外流体(細胞の外側の全ての体液)の血管内の流体部分である。それはほとんど水であり(容積により約93%)および溶解したタンパク質、グルコース凝固因子無機イオンホルモンおよび二酸化炭素(血漿は、排せつ産物の輸送の主な媒体である)。血液血漿は抗凝固剤を含む血液の管を、血液細胞が管の底に沈降するまで遠心分離機内で回転する(遠心分離する)ことにより調製されることができる。この血液血漿は次いで吸引されるか、または抜き取られる。

0081

「血液血清」はフィブリンフィブリノーゲンまたは他の凝固因子のない血液血漿である(すなわち、全血マイナス両方の細胞および凝固因子)。

0082

血液サンプルは、「非静脈ルート」、すなわち、血液が静脈および動脈から針により採血されない、により得られ得る。非静脈ルートは、血液サンプルが、静脈血脱酸素された血液)または動脈血酸素化された血液)のいずれかであるかは、限定しない。静脈血および動脈血の両方が適切である。身体の毛細血管から血液を得ることは、非静脈ルートの一例である。

0083

指先の突き刺し」、「指先穿刺」、または同様のものは、血液サンプルを非静脈ルートにより得るために適切な方法の一例である。ここで、鋭い先端または刃が、指(または身体の任意の他の部分)の皮膚を貫通するために用いられることができ、血液が身体から発することを引き起こす。指先穿刺は、かかと、随意的に、例えば乳児のかかとに行うことができる。血液は、毛細管ピペット、拭い綿、滴下、または当技術分野で周知の任意の他の機構を用いて採取し得る。

0084

本明細書で、「凝集」(“agglutination”または“aggregation”)、もしくはその文法的な等価物は、それにより分子または細胞などの粒子が、空間中で経時的にクラスターを形成するプロセスを意味する。結果として生成する凝集物は、凝集していない個別の粒子とは、少なくともいくつかの異なる性質を有し、およびこれらの凝集物の検出または測定の検定は有用な情報を提供する。

0085

用語「ウイルス粒子」は、ウイルスまたはウイルスの構成要素を含む、任意の分子または物質を含む。この用語は全ウイルス、と同時にウイルスの一部分を含む。ウイルス粒子は、ウイルスの抗原を含む。ウイルス抗原は、制限なしに、ウイルスのポリペプチド核酸、および炭水化物を含む。

0086

用語「赤血球」は、いかなる生命体からの、いかなる形態の赤血球細胞をも含む。従って、この用語は、新鮮な、変更されていない、赤血球細胞と同時に、化学的または他の処理に付された赤血球細胞も含む。この用語は哺乳類鳥類爬虫類両生類魚類無脊椎動物、または任意の他のタイプの生命体からの赤血球細胞を含む。

0087

「画像」は、特定の物理的な対象と同様の見かけを有する、任意の人工物、例えば二次元写真、写真の一組、またはビデオである。画像は、カメラによる光の捕捉を含み得る。

0088

画像は「画素化され」得る、つまり画像はピクセルを含むことを意味する。

0089

本明細書において使用される、「ポイント・オブ・サービス」の位置は、被験者がサービス(例えば検査、監視、治療、診断、ガイダンスサンプル収集、ID確認、医療サービス、非医療サービス等)を受けることのできる場所を含むことができ、および、制限なく、被験者の自宅、被験者の勤務先ヘルスケア提供者(例えば、医師)の場所、病院、緊急治療室手術室診療所ヘルスケア専門家執務室、臨床検査室、小売店[例えば薬局(例えば、小売り薬局、臨床薬局、病院薬局)、ドラッグストアスーパーマーケット食品雑貨店、等]、運搬用車両(例えば自家用車ボートトラックバス航空機バイク救急自動車移動ユニット消防車/トラック、救命救急車、司法遂行車両、警察車両、又は前記被験者を一点から他へ移動するよう設定されている車両等)、移動医療ケアユニット可動ユニット、学校、デイケアセンター手荷物検査場、戦場、健康支援生活住居政府オフィスオフィスビルディングテント体液サンプル取得施設(例えば血液収集センター)、被験者がアクセスを望み得る位置の入り口の場所またはその近くの場所、被験者がアクセスを望み得る機器上またはその近くの場所、被験者がアクセスを望み得る場所またはその近くの場所(例えば、被験者がコンピュータにアクセスしたい場合には、そのコンピュータの位置)、サンプル処理機器がサンプルを受け取る位置、または本明細書の別の場所に記載される任意の他のポイント・オブ・サービス位置を含み得る。いくつかの実施形態では、ポイント・オブ・サービスはポイント・オブ・ケアである。本明細書において使用される、「ポイント・オブ・ケア」は、被験者が医療関連サービス(例えば、治療、試験、監視、診断、カウンセリングサンプル採取など)を受けることのできる、被験者または被験者の近傍の任意の位置(例えば、被験者の自宅または勤務先、グローサリー・ストアドラッグ・ストア、医療クリニック、病院、学校など)を指す。

0090

「ビデオ」画像は、経時的に順次収集された一連の画像である。ビデオ画像は、例えば、少なくとも1フレーム/分、少なくとも1フレーム/10秒、少なくとも1フレーム/秒、少なくとも10フレーム/秒、少なくとも20フレーム/秒、少なくとも30フレーム/秒、少なくとも40フレーム/秒、少なくとも50フレーム/秒、少なくとも100フレーム/秒、または少なくとも200フレーム/秒を含む、任意の速度で収集され得る。
B.一般的考察

0091

赤血球凝集反応検定は、複雑および遅いプロトコルにより多年にわたって用いられている。凝集反応の特徴は、大きな構造が共に、比較的弱い力により保持されることである(非共有結合タンパク質−タンパク質相互作用)。そのようなプロセスは、細胞懸濁物の撹拌および混合のような機械的な力に反応する。凝集の特徴は、反応物のみではなく、その反応が生じる容器の形状にも依存することである。温度、溶媒組成物、タンパク質、炭水化物(例えば、デキストラン)および他の(例えば、ポリエチレングリコールポリマーなどのポリマーの存在は、すべて反応への効果を有する。一般的な凝集反応の概略図が図1に示される。

0092

凝集反応を読むために、いくつかの光学的方法が現在用いられている。

0093

図2に示される最初の方法では、反応容器はまっすぐな側面を持つ円形の管である。凝集した赤血球は、凝集していない細胞よりも早く沈降する。十分な時間の経過後に、凝集した細胞反応生成物は、凝集した細胞のペレットと共に透明な上澄みを示す一方、凝集していない細胞反応は、凝集していない細胞が懸濁物.中に残ったままで、混濁したままである。

0094

第二の方法は、図3に図示される。円錐形の管を用いることは、いくらかの凝集した赤血球細胞が、管の底部に分散された格子マットの形成を引き起こす一方で、いくらかの凝集した赤血球細胞は、溶液中に懸濁されたままであることが見出されている。対照的に、凝集していない細胞のほとんどが、管の側面を転がり落ちて管の狭い底部チップで「ボタン」を形成するが、このボタンは緩やかに充填される。凝集検定の後で、円錐形の管中の細胞が、凝集しているか、または凝集していないかを特定することを助けるために、細胞が検定において沈降するための十分な時間を与えられた後に、円錐形の管は傾けられることができる。図3におけるように、そのような管がある角度で傾けられたとき、凝集していない細胞のボタンは、流れて「涙滴」の形をした塊を形成する一方、凝集した細胞は大幅に少ない流れを示す。

0095

本明細書で提供される、凝集検定のための、方法、組成物、システムおよび機器は、既存の技術に対して複数の利点を有する。

0096

一態様では、結合検定を用いる、ウイルス粒子の存在を決定する方法が提供される。本明細書でより詳細が提供されるように、一態様では、この検定では、ウイルス粒子が存在する場合、赤血球に結合しおよび赤血球−ウイルス粒子クラスターを形成し、ならびに従って凝集を引き起こす。これは赤血球凝集反応検定(HA)と称される。図4、パネルAを参照されたい。

0097

更なる態様では、結合検定を用いる、抗体の存在を決定する方法が提供される。本明細書でより詳細が提供されるように、一態様では、この検定では、抗体が存在する場合、赤血球に結合しおよび赤血球−ウイルス粒子クラスターを形成し、ならびに従って凝集を引き起こす。これは赤血球凝集反応検定(HA)と称される。図4、パネルBを参照されたい。

0098

一態様では、競争検定を用いる、抗体の存在を決定する方法が提供される。本明細書でより詳細が提供されるように、一態様では、この検定では、抗体が存在する場合、ウイルス粒子の表面に結合し、従ってウイルス粒子が赤血球に結合し、および赤血球−ウイルス粒子クラスターを形成することを防止する。従って、ウイルス粒子に対する抗体が、凝集の不在または阻害をもたらす。赤血球凝集反応検定阻害(HAI)と称される。図5を参照されたい。

0099

一態様では、本明細書で提供される方法は、凝集検定のためのサンプル前処理時間を30分以下の短さに減少させる。一態様では、このことは、サンプル前処理の間にノイラミニダーゼを使用することにより達成され得る。

0100

別の態様では、本明細書で提供される方法は、赤血球凝集反応検定試薬セットを単純化させ得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、全ての赤血球凝集反応検定に対して、単純で安定なタイプの赤血球細胞調製(またはミクロスフェアなどの、その等価物)を用いる。安定なタイプの赤血球調製の例は、グルタルアルデヒドによる固定化により安定化されたシチメンチョウ赤血球である。そのような固定化された細胞は、本質的には無期限に安定である(対照的に新鮮な赤血球は、毎日調製されなければならず日ごとに変動する)。固定化は、ウイルスのヘマグルチニンまたは他の凝集粒子が結合する細胞表面受容体不活性化しない。異なる動物種からの新鮮な赤血球および細胞も開示された方法において用いられ得る。

0101

いくつかの態様では、本開示の方法は、検定ステップの組み合わせを含む。従来のHAI方法は、少なくとも2つの別個インキュベーション(処理された抗体を含むサンプルとウイルスの抗原との反応が1つ、プラス赤血球との反応が1つ、合計で約60分)を用いる一方で、本明細書で提供される方法は単一のインキュベーションを用い得る。そのようなインキュベーションは、約45分以下、約30分以下、約25分以下、約20分以下、約15分以下、約10分以下、約5分以下、約4分以下、約3分以下、約2分以下、または約1分以下かかるなど、従来の方法におけるよりも大幅に短くあることができる。特定の実施形態では、2ステップも用いられ得る。

0102

いくつかの態様では、本開示の方法は、凝集反応を加速する。凝集反応は、検定媒質の組成物に対して感受性である。例えば、ポリマー(タンパク質、デキストランなどの炭水化物ポリマー)との電荷−電荷相互作用および弱い相互作用などの全てが凝集速度および終点に対して広範囲の効果を有する。グルタルアルデヒドで固定化されたシチメンチョウ赤血球のいくつかの実施形態では、アルブミンが凝集反応を約4倍に加速できる。

0103

本開示の方法は、凝集終点の客観分析を更に提供する。画像分析は、赤血球凝集反応検定を客観的および定量的に、サンプルの滴定の必要性なしに読み取るために用いられることができる。画像分析のための特定の方法は、2011年1月21日に出願された米国特許仮出願第61/435,250号において提供され、この出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0104

一実施形態では、円錐形の管の反応容器中の凝集検定のデジタル画像採集される。この画像は、「涙滴」形成(赤血球柱の長さ)の程度を測定するために、解釈され得る。別の実施形態では、可視化粒子の「クラスター分析」は、以下に詳細が記されるように遂行され得る。この方法は、非常に短い時間の後で、凝集反応が読み取られることを可能にする。

0105

更に、本明細書で提供される方法は、合計の凝集検定時間を減少させ得る。表1は、従来の方法および本明細書で例示的な提供される凝集阻害検定方法の実施形態との比較を提供する。以下の表1に示されるように、本明細書で提供される方法は検定時間の20分の1より大きい減少、および凝集検定プロトコルの複雑性の大幅な減少をもたらし得る。

0106

本明細書において開示される方法は、客観的で、動的な読み取りの使用により、更に試薬の連続的な希釈の必要性を除去できる。

0107

本方法の1つ以上のステップは、ポイント・オブ・サービスの位置またはポイント・オブ・ケアの位置において遂行され得る。本明細書において開示される方法の実施においては、ポイント・オブ・ケアの位置は、医療従事者が、特定の被験者に関する検定データに基づいて、迅速に被験者のための治療を決定することを可能にする。
II.検定
A.赤血球凝集反応検定(HA検定)

0108

一態様では、本明細書において提供されるものは赤血球凝集反応検定(HA)に関する、方法、組成物、機器、およびシステムである。赤血球凝集反応検定は、赤血球凝集反応による、ウイルス、バクテリア、抗体または他の赤血球凝集粒子検出の方法の方法として使用され得る。

0109

赤血球の凝集は、赤血球凝集反応と称されることができる。

0110

本明細書において使用される、用語「可視化粒子」は、凝集し、および巨視的にまたは顕微鏡的に検出される任意の細胞または粒子を指す。「可視化粒子」は、制限なしに、赤血球、他の細胞、およびミクロスフェアを含む。

0111

本明細書において使用される、用語「凝集粒子」は、細胞に結合し、および凝集を引き起こすか、または粒子の可視化を引き起こす、任意の分子または生命体を指す。「凝集粒子」は、制限なしに、ウイルス、ウイルス粒子、および抗体を含む。

0112

いくつかの態様では、「赤血球凝集反応検定」または「赤血球凝集反応阻害検定」として本明細書に記載される検定は、HAまたはHAI検定において、適切な対応する凝集粒子とともに、RBCの役割で機能する赤血球細胞ではない可視化粒子(例えば、ミクロスフェア、バクテリア)によっても遂行され得る。更に、HAI検定は、可視化粒子の凝集を凝集粒子により阻害するために、任意の凝集粒子と結合し得る、任意の抗体について検定するために遂行されることができる。

0113

一態様では、本明細書において提供されるものは赤血球凝集反応の改良された検出の方法および測定と同様に、赤血球凝集反応の阻害の改良された検出および測定の方法である。赤血球凝集反応の検出または測定のための検定はHA検定と称される。赤血球凝集反応の阻害の検出または測定のための検定は、HAI検定と称される。図4は、A)ウイルスおよびB)抗体により誘起される赤血球凝集反応のプロセスを図示している。ウイルスにより誘導された赤血球凝集反応は、例えば、ウイルスまたはウイルス粒子の存在の検出またはウイルスの力力価としても知られる、その量の定量のために用いられ得る。抗体により誘導された凝集は、例えば、サンプル中の赤血球の血液型を決定するために用いられ得る。

0114

一実施形態では、本明細書で提供されるものは、以下のものを含む生物学的サンプル中のウイルス粒子の存在を決定するための方法である:(a)赤血球およびウイルス粒子を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、ウイルス粒子との相互作用による赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および(b)混合物中で凝集が起きるかを検出することであって、凝集の存在はウイルス粒子の存在を示し、およびステップ(a)〜(b)は1時間未満で生じる。凝集の検出および分析は、本明細書で提供されるように遂行される。

0115

別の態様では、本明細書で提供されるものは、以下のものを含む生物学的サンプル中の凝集粒子の存在を決定するための方法である:(a)可視化粒子およびa凝集粒子を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、凝集粒子との相互作用を介する、可視化粒子の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および(b)前記混合物中で前記凝集が生じるかを検出することであって、前記凝集の存在が、前記凝集粒子の存在を示し、およびステップ(a)〜(b)は1時間未満で生じる。凝集の検出および分析は、本明細書で提供されるように遂行される。

0116

凝集の検出は、一般的に顕微鏡と連結され得る、スキャナー、カメラ、検出器、またはセンサーなどの画像化機器を用いて凝集の画像を撮影することを含む。

0117

一般に、検定は、96−穴マイクロタイタープレートまたはその等価物などの反応を保持する能力を持つ機器を用いて遂行される。前処理された、検出されるべきウイルス粒子または凝集粒子を含む生物学的サンプルは、希釈剤緩衝液(例えば、BSAを含むPBS)により連続的に希釈される。次いで、懸濁物中のあらかじめ固定されたRBCまたは可視化粒子が加えられることができ、次いで穏やかに混合される。この反応は適切な時間の期間、例えば、合計約15分インキュベートされる。しかしながら、約10または5分またはよれより短い、または20、25、30、35、40、50、60分、またはそれより長いなどの、15分より短いか、または長い合計のインキュベーションが用いられることができる。インキュベーションは室温(すなわち、25℃)、または約4、8、12、14、16、20、30、35、40、45、50、55、60、65、または70℃なその、室温よりも低いか、または高い温度で行われ得る。インキュベーションの温度及び持続時間は、検定の速度および正確性の両方を達成するために、最適化され得る。前記プレートはスキャナー上で読み取られることができ、およびプレートの最終的な終点の画像が、好適にはプレートが、約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、または75°などの、20〜75°の角度で傾けられた時に撮影され得る。

0118

いくつかの実施形態では、凝集検定の画像が、顕微鏡を含む光学的機器により捕捉される。これらの実施形態では、検定は、あらかじめ固定されたRBCまたは可視化粒子が反応に加えられた後に、ウエル(または反応を保持する他の構造)からの少量のサンプル(例えば、1〜2μL)が、キュベットまたはチップ中に直接移送され、および顕微鏡を含む光学的機器下に撮像される以外は一般に上述のように遂行される。本明細書においてより詳細に記載されるように会合因子を計算するために、画像が、収集されおよび分析され得る。

0119

凝集検定を行う持続時間は、一般に検定の速度および正確性の両方を達成するために最適化される。いくつかの実施形態では、検定および検出凝集の遂行は約10分以下、15分以下、20分以下、30分以下、40分分以下、50以下、または60分以下などの1時間未満時間で生じる。いくつかの実施形態では、検定および検出凝集の遂行は1時間を超えるが、しかし2、3、4、5、6、7、または8時間未満で生じる。

0120

いくつかの実施形態では、凝集ウイルスを含まないことが知られるサンプルを用いて、観察された凝集が、凝集ウイルスまたは凝集粒子に起因することを確実にするためにHA検定が遂行される(すなわち陰性対照)。いくつかの実施形態では、凝集ウイルスを含むことが知られるサンプルを用いて、検定に用いられた赤血球または可視化粒子が、凝集を受ける能力があるかを確実にするためにHA検定が遂行される(すなわち陽性対照)。
B.赤血球凝集反応阻害検定(HAI検定)

0121

一態様では、本明細書において提供されるものは、赤血球凝集反応阻害検定(HAI)に関する方法、組成物、機器、およびシステムである。赤血球凝集反応阻害検定は、赤血球凝集反応を阻害するサンプルの能力を測定する。HAI検定は、例えば、凝集ウイルスまたは凝集粒子に結合し、および凝集させるための能力を阻害する能力を有する抗体の存在の検出または測定のために有用である。そのような結合の存在は、ウイルスまたは凝集粒子に対する抗体の存在の有用な指標である。

0122

図5を参照して、赤血球凝集反応の阻害の概略的な略図が描かれている。いくつかの実施形態では、ウイルスを含む試薬が、選択的にウイルスに結合する抗体を含み得るサンプルとインキュベートされる。ウイルス粒子に結合し得る抗体は、ウイルス粒子の赤血球凝集反応を誘導する能力に干渉し得る。赤血球凝集反応の阻害は、従って抗体の存在を指示するために役立つ。このように、HAI検定は、生物学的サンプル中の抗体を検出または測定するために用いられ得る。

0123

従来のアプローチにおいては、HAI検定は少なくとも3つのステップで遂行される:(1)抗体を含むことが疑われるサンプルの前処理;(2)最大24時間までの、前処理された、抗体を含むことが疑われるサンプルのウイルスとのインキュベーション(ウイルスへの抗体は、ウイルス粒子上のヘマグルチニンに結合し、ヘマグルチニンの不活性化状態にする);および(3)ステップ(2)からの物質の不活性化、および次いで赤血球の調製(新鮮に作成された)が加えられ、およびその混合物は合計約2時間インキュベートされる。

0124

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、3つの別個のステップの必要性を除去することにより従来の方法を改善する。いくつかの実施形態では、赤血球細胞およびウイルスの抗原試薬は単一の試薬に組み合わせられる。いくつかの実施形態では、凝集粒子および可視化粒子は、単一の試薬に組み合わせられる。
B1.抗体の検出

0125

一態様では、生物学的サンプル中の抗体の存在を決定するための方法が提供され、この抗体は、選択的にウイルス粒子に結合し、およびこの方法は以下を含む:(a)赤血球、ウイルス粒子、および前記抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、前記ウイルス粒子との相互作用を介する赤血球の凝集を許容する条件下でインキュベートすること;および(b)混合物中で凝集が起きるかを検出することであって、この凝集の不在は前記抗体の存在を示し、および前記ステップ(a)〜(b)は1時間未満で生じる。この凝集の検出および分析は、本明細書で提供されるように遂行される。

0126

一態様では、生物学的サンプル中の抗体の存在を決定するための方法が提供され、この抗体は、選択的に凝集粒子に結合し、およびこの方法は以下を含む:(a)可視化粒子、凝集粒子、および抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルの混合物を、凝集粒子との相互作用を介する可視化粒子の凝集を許容する条件下においてインキュベートすること;および(b)混合物中で凝集が起きるかを検出することであって、凝集の不在が抗体の存在を示し、およびステップ(a)〜(b)は1時間未満で生じる。この凝集の検出および分析は、本明細書で提供されるように遂行される。

0127

いくつかの実施形態では、ウイルス粒子および生物学的サンプは、赤血球が加えられる前に、共にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、凝集粒子および生物学的サンプルは、可視化粒子が加えられる前に共にインキュベートされる。
B2.ウイルス粒子または赤血球凝集粒子の検出

0128

別の態様では、HAI検定は、特定のウイルス粒子または凝集粒子を検出または測定するために用いられる。特定のウイルス粒子または凝集粒子を含むことが疑われるサンプルが、凝集について、選択的に特定のウイルス粒子または凝集粒子に結合することが知られる、(試薬)抗体の固定された量の既知の量の存在または不在下で検定される。もしサンプルが、抗体の存在下にそれでも凝集を誘導すると、このサンプルは、目的の特定のウイルス粒子または凝集粒子を含まない(または単に低い量で含む)(しかし、異なるウイルスまたは凝集粒子を含む可能性がある)。一方もし、特定の抗体の存在下で、凝集が阻害されることが観察されると、次いでこのサンプル中のウイルス粒子または凝集粒子は、目的の特定のウイルスまたはウイルス粒子に似つかわしい。

0129

いくつかの実施形態では、HAI検定は、未知の量のウイルスまたは抗体の滴定なしで遂行される。本明細書での、この方法の客観的分析は、RBCの凝集の状態でのわずかな変化に対してさえも、高度の感受性を提供する。この高い分解能は、凝集/非凝集の間の厳密な転移点を決定することにおける曖昧さを低下させる。このことは滴定の必要性を除去することができ、検定プロトコルを大幅に単純化させる。

0130

いくつかの実施形態では、凝集ウイルスまたは凝集粒子を含まないことが知られるサンプルを用いて、観察された凝集が、凝集ウイルスまたは凝集粒子に起因することを確実にするためにHA検定が遂行される(すなわち陰性対照)。いくつかの実施形態では、HAI検定が、凝集ウイルスまたは凝集粒子を含むが、抗体を欠如することが知られるサンプルを用いて、検定に用いられる赤血球または可視化粒子が凝集を受ける能力を有することを確実にするために遂行される(すなわち陽性対照)。この対照は、それから抗体により誘導される阻害が決定され得る、凝集に対するベースラインの測定を設定することを支援し得る。
C.生物学的サンプル

0131

一態様では、本明細書において提供されるものは生物学的サンプル中の抗体の存在、ウイルス粒子、抗原、または凝集粒子の存在を決定するための方法である。

0132

本明細書での「生物学的サンプル」は、生物学的ソースから導出されるサンプルを意味する。生物学的サンプルの例は、限定はされないが、血液、血清、唾液、尿、胃液および消化液涙液糞便精液液、腫瘍組織から導出された間質液、眼液、体組織、または脊髄液を含む。被験者の組織サンプルの例は、限定はされないが、結合組織筋肉組織神経組織上皮組織軟骨、または骨を含む。これらのサンプルは、ヒトまたは動物から提供され得る。これらのサンプルは、生きているまたは死んでいる被験者から採集され得る。これらのサンプルは、被験者から新鮮に採取され得るか、または何らかの前処理、貯蔵。または輸送を受けることができる。

0133

いくつかの実施形態では、前記生物学的サンプルは、血液から導出された血漿または血清を含む。

0134

いくつかの実施形態では、血液、血漿または血清は、抗原に対するワクチンを投与された被験者(例えば、ヒト)から導出され得る。この抗原は、例えば、ウイルス粒子または凝集粒子であり得る。

0135

被験者は、サンプルを提供することができ、および/またはサンプルは、被験者から採取されることができる。被験者はヒトまたは動物であってよい。この被験者は生きていても、または死んでいてもよい。この被験者は患者、臨床試験の被験者、または前臨床試験の被験者であってよい。被験者は、診断、治療、監視および/または疾患予防を受けることができる。この被験者は、医療専門家のケアの下にあっても、またはなくてもよい。この被験者は、任意の年齢の、幼児小児成人または老人であってよい。

0136

任意のサンプルの容積が被験者から提供され得る。容積の例は、限定はされないが、約10mL以下、5mL以下、3mL以下、1mL以下、500μL以下、400μL以下、300μL以下、250μL以下、200μL以下、170μL以下、150μL以下、125μL以下、100μL以下、75μL以下、50μL以下、25μL以下、20μL以下、15μL以下、10μL以下、9μL以下、8μL以下、7μL以下、6μL以下、5μL以下、4μL以下、3μL以下、2μL以下、1μL以下、750nL以下、500nL以下、250nL以下、100nL以下、50nL以下、20nL以下、10nL以下、5nL以下、1nL以下、500pL以下、100pL以下、50pL以下、または1pL以下を含み得る。サンプルの量は、約一滴のサンプルであってよい。サンプルの量は、非静脈的ルートから採取された量であってよい.。サンプルの量は、指先の突き刺し。または指先穿刺から採取される量であってよい。本明細書において記載されるものを含む、任意の容積、が、本明細書において開示される方法において用いられ得る。C1.生物学的サンプルの前処理

0137

いくつかの実施形態では、非特異的なバックグラウンドを低下させるために、生物学的サンプルが前処理される。

0138

前処理は、一般に、生物学的サンプルに付随するバックグラウンドまたは偽陽性の測定を低減するための処理を含む。血液血清および血漿は、しばしばウイルスのヘマグルチニンに結合しおよび凝集反応の阻害を引き起こす因子[特にウイルスに対する抗体ではない糖タンパク質]を含む。そのような糖タンパク質の主要なクラスは、タンパク質に共有結合的に連結したポリシアル酸鎖を有する。そのようなタンパク質の存在は、HAI検定において測定された抗体力価をって上昇させ、およびHA検定において、測定されたウイルス粒子力価を偽って低下させる。この問題を除外するために、HAまたはHAI検定を行う前に、干渉因子を除去するために、サンプルは前処理されることができる。

0139

2つの酵素が、一般に凝集反応において、バックグラウンドを減少させるためのサンプル前処理のために用いられる:(1)糖タンパク質または糖脂質に結合したシアル酸を開裂させる受容体破壊酵素(“RDE”)(例えば、コレラろ液;例えば、Sigma−Aldrich、製品番号C8772、および(2)エキソまたはエンドポリシアル酸を開裂するノイラミニダーゼ(例えば、VibriocholeraからのタイプIII、1−5ユニット/mgタンパク質;例えば、Sigma−Aldrich、製品番号N7885)。従来の前処理方法は、RDEを約20時間の使用する。

0140

いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、ノイラミニダーゼにより前処理される。ノイラミニダーゼは、ノイラミンさんグリコシド結合を開裂するリコシド加水分解酵素の酵素のクラスを称する。ノイラミニダーゼ酵素はウイルスを含む一連の生命体に見出される酵素の大きなファミリーである。ノイラミニダーゼは、受容体などのタンパク質からその末端シアル酸残基加水分解触媒する能力により、シアリダーゼとも呼ばれる。ノイラミニダーゼの主要なクラスは、ウイルスのノイラミニダーゼ、バクテリアのノイラミニダーゼ、哺乳類のノイラミニダーゼ、リソソームのシアリダーゼ、細胞質のシアリダーゼ、および膜シアリダーゼを含む。

0141

いくつかの実施形態では、生物学的サンプルノイラミニダーゼによる前処理は、反応速度における利点を提供する。いくつかの実施形態では、サンプル前処理は、サンプルをノイラミニダーゼと30分未満インキュベートすることにより遂行される。

0142

実施例ofノイラミニダーゼ処理の例が、本明細書において提供される。一般に、適正な量のノイラミニダーゼが、血清または血漿に加えられ、および反応に適切な温度(例えば、約4、8、10、15、20、25、30、35、37、40、45、50、55、60、65、または70℃で)で、適切な時間の期間インキュベートされる。反応に加えられるノイラミニダーゼの量は、酵素の活性および血清の性質に依存する。いくつかの反応では、約0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2、8、3、4、5、6、7、8、9または10ユニット(U)ノイラミニダーゼ/リットル前処理ステップにおいて用いられる。ノイラミニダーゼは、適切な緩衝溶液(例えば、100mM酢酸ナトリウム、pH5.5、0.15MNaCl、4mMCaCl2)において調製される。いくつかの実施形態では、処理は、生物学的サンプルを、ノイラミニダーゼと、約10、15、20、25、30、40、50、60、90、または120分未満インキュベートすることにより遂行される。ノイラミニダーゼ反応は、ノイラミニダーゼ酵素を不活性するために用いられるが、サンプルに対しては全くか、または最小の損傷しか与えない溶液である「停止溶液」により停止され得る。一実施例では、停止溶液はpH8.2のリン酸ナトリウム溶液中の1.5%クエン酸ナトリウムである。一実施例では、停止溶液を用いる停止反応は、5倍容積のpH8.2のリン酸ナトリウム溶液中の1.5%クエン酸ナトリウムをノイラミニダーゼ反応に加えて、およびその混合物を56℃で5分間インキュベートすることにより行われる。

0143

いくつかの実施形態では前記前処理は、生物学的サンプルをノイラミニダーゼとインキュベートすることにより遂行され、および混合物中のノイラミニダーゼの最終濃度は、約0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、または2U/リットル、またはそれより大きいか、または小さい。

0144

不活性化の後、前記反応は、室温まで放冷される。いくつかの実施形態では、処理されたサンプルは本明細書において提供される検定に使用されるに先立ち希釈(例えば、1:2、1:3、1:4、1:5、または1:10希釈)される。

0145

検定は、生物学的サンプル、抗原、赤血球、ウイルス粒子、凝集粒子、可視化粒子、抗体、またはそれらの任意の組み合わせの連続的希釈により遂行され得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、連続的希釈の必要性は、迅速な凝集の検定分析について、本明細書において記載される方法の使用により、減少されるかまたは除去される。
D.標的の分析

0146

本明細書において提供される方法は、生物学的サンプル中の標的の検体を検出するために用いられる。標的の検体は、制限なしに、抗体、抗原、ウイルス粒子、バクテリア粒子、または凝集粒子であることができる。
D1.抗体標的検体

0147

一態様では、生物学的サンプル中の抗体の検出および測定方法が提供される。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は選択的にウイルス粒子に結合する。いくつかの実施形態では、検出可能な抗体は選択的に凝集粒子に結合する。

0148

いくつかの実施形態では、サンプルは赤血球を凝集させる能力を有するウイルス粒子上の1つ以上のエピトープに結合する抗体を含む任意の抗血清であるか、または赤血球を凝集させる能力を有することが疑われる任意の抗血清であってよい。代替的にまたは追加的に、前記抗血清は、ヘマグルチニンタンパク質上の1つ以上のエピトープに結合する抗体を含む任意の抗血清であるか、またはヘマグルチニンタンパク質の1つ以上のエピトープに結合する能力を有する抗体を含むことが疑われる任意の抗血清であってよい。代替的にまたは追加的に、前記抗血清は、凝集粒子上に存在する1つ以上のエピトープに結合する抗体を含む抗血清であってよい。前記抗血清は、ヒト、トリウマウサギマウスヤギブタモルモットまたはラットなどの任意の生存しているソースから得られる血清であってよい。抗血清の生存しているソースは、特定の抗原により免疫化されることができるが、この生存しているソースは、特に抗原に曝露される必要はない。前記抗血清は、ウイルス、ヘマグルチニンタンパク質、または凝集粒子に結合する抗体を含むように、生体外で生成された血清であってもよい。前記抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってよい。更に、前記抗体は完全な長さであるか、またはFab、F(ab)2、またはFvフラグメントなどの抗原結合フラグメント、および単鎖抗体であってよい。前記抗体は、天然に発生する抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってもよい。そのソースには関わらず、凝集ウイルス、ヘマグルチニンタンパク質、または凝集粒子に結合するいかなる抗体も検定において用い得る。ヘマグルチニンまたは凝集粒子に特異的に結合し、および凝集を妨げるかまたは阻害する他のタイプの試薬も用い得る。そのような結合剤の例は、制限なしに、アプタマーおよびレクチンを含む。

0149

いくつかの実施形態では、血漿、血清、または抗血清サンプルは、凝集ウイルスまたは凝集粒子に対するワクチンを投与された被験者から得られる。従って、本明細書において提供されるものは、被験者からのサンプル中の凝集ウイルスまたは凝集粒子に対する抗体の存在を、本開示のHAI検定を用いて、検出および/または測定することにより評価される、被験者の有効な免疫化を決定するための方法でもある。

0150

業者は、特定の検定において用いられる抗血清または抗体の濃度が、抗血清のソース、抗血清中の抗体のタイプ、抗血清中の抗体の親和性、抗血清の非抗体構成要素の濃度、サンプル容積、および検定で用いられる他の構成要素のソースおよび濃度などの一連の異なる因子に依存することを理解するであろう。更に、検定で用いられる前記抗血清の濃度は、いくつかの場合には、抗血清中の抗体が従来のHAI検定において赤血球凝集反応が生じることを妨げ得る、抗血清の最も低い希釈の既知の値に基づき得る。より高いおよびより低い抗血清の濃度が、この希釈に基づいて、本明細書で提供される検定の開始点として用いられ得る。例えば、もし1:128希釈が従来のHAI検定において、赤血球凝集反応が妨げられる、この抗血清の最も低い希釈である場合、実施形態では、1:64、1:128、1:512、1:1024、1:2048、1:4096および1:8192の希釈が本明細書で提供される方法において用いられ得る。当業者は、2またはいくつかの他の数の倍数に基づいて、抗血清の任意の希釈、または任意の一連の希釈が用いられ得ることを理解するであろう。一態様では、検定の最終的混合物中の抗体の濃度は、約、例えば、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10、20、30、40、または50nMであり得る。別の態様では、検定の最終的混合物中の抗体の濃度は、約、例えば、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、2・g/mL、4・g/mL、6・g/mL、8・g/mL、10・g/mL、または20・g/mLであり得る。そのような態様においては、ウイルスのエピトープに対する抗血清中の抗体の解離定数(KD)は、約0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40または50nMであり得る。一態様では、最終検定混合物中のウイルスの濃度は、約5、10、15、または20赤血球凝集反応単位/mL。赤血球凝集反応単位(HA単位)は、赤血球凝集反応が従来のHA検定において生じるウイルスの最も低い希釈である。

0151

本開示の方法は、サンプル中の抗体の検出および/または測定のための改良を提供し、およびいくつかの実施形態では、この方法を遂行する合計の時間の量は、500、400、300、200、180、160、140、120、100、90、75、60、45、40、30、25、50、15、10、または5分未満である。いくつかの実施形態では、この方法を遂行する合計の時間の量は、約30〜60分である。

0152

実施形態では、目的のサンプルの抗体の量を決定するためのHAI検定において、既知の量のウイルスまたは他の凝集粒子および/または既知の量の可視化粒子が未知の量の目的の抗体を含むサンプルと共に用いられる。目的の抗体は、既知の量のウイルスまたは他の凝集粒子に特異的に結合し得る。実施形態では、目的の抗体を含むサンプルの、既知の量のウイルスまたは他の凝集粒子が可視化粒子を凝集させる能力に対する影響の測定は、サンプル中の目的の抗体の量の決定を可能にし得る。目的の抗体のウイルスまたは他の凝集粒子への結合は、前記粒子が可視化粒子を凝集させることを阻害し得る。これらの検定では、サンプル中の、ウイルスまたは他の凝集粒子に対する抗体の存在は、粒子の凝集活性を低下または除去し得る。
D2.ウイルス粒子検体

0153

別の態様では、本明細書において提供されるものは、生物学的サンプル中のウイルス粒子の存在を決定するための方法である。

0154

多くのウイルスが、RBCの表面上に存在する分子に結合する。このことの帰結は、特定の濃度において、ウイルスの懸濁物は表面受容体に結合するか、またはN−アセチルノイラミン酸を含む受容体の修飾により、RBCを凝集させることである。複数のRBCの単一のウイルス粒子またはバクテリアへの結合は、RBCの凝集(赤血球凝集反応)をもたらす。このように凝集を促進するウイルスは、凝集ウイルスと称される。いくつかの実施形態では、本開示の方法は凝集ウイルスを検出または測定するために用いられる。他の実施形態では、本開示の方法は、凝集ウイルスへの抗体を検出または測定するために用いられる。

0155

凝集ウイルスは、限定はされないが、ピコルナウイルスコロナウイルストガウイルスフラビウイルスラブドウイルスパラミクソウイルスオルトミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルスレオウイルスレトロウイルス、パピロマウイルス、パルボウイルスヘルペスウイルスポックスウイルス肝炎ウイルス、および海綿状ウイルスを含む多くの異なるタイプのウイルスを含む。他の凝集ウイルスは、インフルエンザ、単純ヘルペスウイルス1および2、はしか、デング、疱瘡ポリオHIV、H1N1ソロモン諸島型、H3N2ウイスコンシン型ウイルス、トリH5N1ベトナム型ウイルス、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、およびインフルエンザウイルスの任意の株を含み得る。

0156

更なる凝集ウイルスは、ヒト以外の霊長類のウイルスを含み、その限定しない例は、オランウータンヘルペスウイルス1、オランウータンヘルペスウイルス3、オナガザルヘルペスウイルス1(BウイルスHVsimiae)、オナガザルヘルペスウイルス2(SA8)、オナガザルヘルペスウイルス3(SA6)、オナガザルヘルペスウイルス4(SA15)、オナガザルヘルペスウイルス5(アフリカミドリザルサイトメガロウイルス)、オナガザルヘルペスウイルス6(リバプールバーベットモンキー(Liverpool vervet monkey)ウイルス)、オナガザルヘルペスウイルス7(パタスモンキー(Patas monkey)HV;MMVまたはPHV delta HV)、オナガザルヘルペスウイルス8(アカゲザル(Rhesusmonkey)サイトメガロウイルス)、オナガザルヘルペスウイルス9(メディカルレーク(Medical Lake)・マカクLVサル水痘帯状疱疹HV(Medical Lake macaque LV simian varicella HV))、オナガザルヘルペスウイルス10(アカゲザル白血球随伴LVIT株(Rhesus leukocyte assoc.LV strain IT))、オナガザルヘルペスウイルス12(LVヒヒ属(LVpapio)、ヒヒLV(baboon LV))、オナガザルヘルペスウイルス13(ヘルペスウイルスシクロピス(cyclopis))、オナガザルヘルペスウイルス14(アフリカミドリザルEBV様ウイルス)、オナガザルヘルペスウイルス15(アカゲザルEBV様HV(RhesusEBV−likeHV))、クモザルヘルペスウイルス1(クモザルHV)、クモザル亜科ヘルペスウイルス2(HV ateles)、マーモセット科ヘルペスウイルス(HVサギナス(saguinus))、マーモセットヘルペスウイルス(SSG、マーモセットサイトメガロウイルス)、オマキザルヘルペスウイルス1(カプチン(Capuchin) HV)、オマキザル科ヘルペスウイルス2(カプチン(Capuchin) HV)、オランウータンヘルペスウイルス1(チンパンジーHV;panHV)、オランウータンヘルペスウイルス2(オランウータンHV)、オランウータンヘルペスウイルス3(ゴリラHV)、リスザルヘルペスウイルス1(マーモセットHV、ヘルペスT、HV)、タマリナス(tamarinus)、HV広鼻類(platyrrhinae)、(タイプリスザルヘルペスウイルス2)リスザルHV、およびHVリスザル(saimiri)。

0157

凝集ウイルスは、限定はされないが、以下を含む哺乳類のウイルスを称することができる:ウシヘルペスウイルス1−5、ヒツジヘルペスウイルス1−2、アルセラフィンヘルペスウイルス1、パルボウイルス(マウス微小ウイルスアリューシャミンク秒、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルスニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、HBパルボウイルス、H−lパルボウイルス、キルハム(Kilham)ラットラピーヌ(lapine)パルボウイルス、ミンク腸炎を含む)エリスロウイルス(アデノ随伴タイプ1−5、ウシアデノ随伴、イヌアデノ随伴、ウマアデノ随伴、ヒツジアデノ随伴を含む)。

0158

凝集ウイルスの更なる非制限的な例は以下を含み得る:カリフラワーモザイク、バドナウイルス、ジェミニウイルス、植物レトロウイルス、クリプトウイルスラブドウイルス科トマト軟化えそ(Tomato Spotted mosaic)、テヌイウイルス、ジャガイモウイルス、ポチウイルス科、クロステロウイルス、ターニップイエローモザイク(Turnip Yellow mosaic)、トマトブッシイモザイク(Tomato Bushy mosaic)、ルテオウイルス、セキウイルス科、タバコモザイク、ササゲモザイク、ダイコンひだ葉モザイク(Pean Enation mosaic)、アカクローバー葉脈モザイク(Red Clover vein mosaic)、ブロムモザイク(Brome mosaic)、キュウリモザイク、アルファルファモザイク、オオムギ萎縮(Barley yellow mosaic)、テンサイそう根病(Beet Necrotic yellow vein)、およびdsRNAウイルス

0159

以下の科からのウイルスも本開示の方法における使用に含まれる:バキュロウイルス科およびヌディウイルス科、ポリドナウイルス科、アスコウイルス科、ノダウイルス科、テトラウイルス科、テトラウイルス科、トンバスウイルス科、コロナウイルス科フラビウイルス科トガウイルス科ブロモウイルス科、バマウイルス科、トチウイルス科、パルティティウイルス科、ハイポウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科オルトミクソウイルス科ブニヤウイルス科アレナウイルス科レビウイルス科ピコルナウイルス科、セキウイルス科、コモウイルス科、ポチウイルス科、カリシウイルス科アストロウイルス科、ノダウイルス科、イノウイルス科ミクロウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科ヘパドナウイルス科、レトロウイルス科シストウイルス科レオウイルス科ビルナウイルス科、ミオウイルス科サイフォウイルス科、ポドウイルス科、テクティウイルス科、コルチコウイルス科プラズマウイルス科、リポクスウイルス科、フセロウイルス科、ポックスウイルス科、アフリカブタコレラ様ウイルス、イリドウイルス科フィコドナウイルス科、バキュロウイルス科、ヘルペスウイルス科アデノウイルス科、パポヴァウイルス科、ポリドナウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、アストロウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、アルテリウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科、ビマウイルス科、レトロウイルス科、肝炎ウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、パポバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、およびイリドウイルス科。

0160

当業者は、特定の検定において用いられるウイルスの濃度が、ウイルスの正体、サンプル容積、および検定で用いられる他の構成要素のソースおよび濃度などの一連の異なる因子に依存することを理解するであろう。更に、検定で用いられる前記ウイルスの濃度は一般に、赤血球凝集反応が従来のHA検定で生じる、ウイルスの最も低い希釈の既知の値に基づく。この希釈は1赤血球凝集反応単位(“HA単位”または“HAU”)とみなされる。1HAUに基づく、より高いおよびより低いウイルスの濃度が、検定の出発点として用いられ得る。例えば、例えば、もし1:128希釈が従来のHAI検定において、赤血球凝集反応が生じる、最も低いウイルスの希釈である場合、実施形態では、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096および1:8192の希釈が本明細書で提供される方法と用いられ得る。当業者は、2またはいくつかの他の数の倍数に基づいて、ウイルスの任意の希釈、または任意の一連の希釈が用いられ得ることを理解するであろう。
D3.バクテリアの検体

0161

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、RBCの細胞表面の分子または可視化粒子に結合し得る能力を有し、および凝集を誘導し得るバクテリアの検出に用いられ得る。
D4.凝集粒子検体

0162

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、細胞またはミクロスフェアに結合し、および細胞またはミクロスフェアの凝集を引き起こし得る任意の粒子を検出するために用いられ得る。そのような粒子は、本明細書において「凝集粒子」と称される。凝集粒子は、制限なしに、ウイルス、バクテリア、ウイルス粒子、アレルゲン、および抗体を含み得る。他の例では、凝集粒子は、タンパク質および炭水化物RBCの表面または他の細胞(例えば、レクチン)に対する結合特異性を有する。更に、ミクロスフェア(ミクロスフェアは、以下に議論されるように、それらの表面に広範囲の様々な分子を持つように調製され得る)の文脈において、ミクロスフェア表面の分子に結合し得る全ての分子が凝集粒子として機能し得る。
E. 赤血球

0163

一態様では、本開示は、「赤血球」 と互換可能に用いられる、赤血球細胞(“RBC”)の凝集の検出および測定のための方法を提供する。

0164

赤血球は、鉄を含む生体分子であり、酸素と結合し、および血液の赤い色の原因であるヘモグロビンを含む、酸素を送達する細胞である。ウイルスなどの凝集粒子の存在下においてその細胞が凝集する潜在的能力を備えている限り、様々な生命体からの赤血球が、本明細書において開示される方法において用いられ得る。適切な赤血球としては、制限なしに、ガチョウ、ニワトリ、カモ、およびシチメンチョウ赤血球細胞などの鳥類の赤血球、およびヒト赤血球、モルモット赤血球、マウス赤血球、ラット赤血球、ウシ赤血球ウマ赤血球ヤギ赤血球およびヒツジ赤血球などの哺乳類の赤血球を挙げることができる。ヒト赤血球は、A型赤血球、B型赤血球、AB型赤血球、およびO型赤血球などのいかなる血液型のドナーからのものでもあり得る。

0165

いくつかの実施形態では、赤血球は凝集について検定され、および赤血球の濃度が約0.01%ヘマトクリット未満、約0.05%ヘマトクリット未満、約0.1%ヘマトクリット未満、約0.15%ヘマトクリット未満、約0.2%ヘマトクリット未満、約0.5%ヘマトクリット未満、約1%ヘマトクリット未満、約5%ヘマトクリット未満、約10%ヘマトクリット未満、約15%ヘマトクリット未満、約20%ヘマトクリット未満、約30%ヘマトクリット未満、約40%ヘマトクリット未満、または約50%ヘマトクリット未満の濃度で存在するように選ばれることができる。

0166

ヘマトクリット(HtまたはHCT)または血中血球容積(PCV)または赤血球容積分率(EVF)は、赤血球細胞により占有される血液容積パーセンテージである。
E1.赤血球の固定化

0167

いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法を用いて検定される赤血球は前処理される。

0168

従来の赤血球凝集反応法で用いられる赤血球細胞試薬は、複雑な洗浄手順を用いて新鮮に調製されなければならない。従来の手順は労働集約的であり、不便であり、および時間のかかるものである。対照的に、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は単一の安定な固定された赤血球調製物を用いるので、試薬調製は検定を行うときに必要とされる。

0169

前処理は、あらかじめ固定された赤血球を生成するための赤血球の事前固定化(pre−fixation)を含む。赤血球の事前固定化は、血液サンプルから新鮮に赤血球を調製する必要性の除去に起因する検定時間の削減、および均一な事前に固定された赤血球サンプルの使用による、凝集検定の再現性を含む膨大な利点を提供し得る。当技術分野では赤血球の固定化方法は既知であり、および米国特許第5,994,139号に記載されるものを含む。

0170

いくつかの実施形態では、赤血球は、ホルムアルデヒドなどのモノアルデヒド、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド、およびホルムアルデヒドと等価であるパラホルムアルデヒドなどのポリマー性の形態含む有機アルデヒドとの処理によりあらかじめ固定される。いくつかの実施形態では、赤血球はグルタルアルデヒドとの処理によりあらかじめ固定される。この固定された細胞は、本質的に無期限に安定である(対照的に、新鮮な赤血球は毎日調製されなければならず、および日ごとに変動する)。固定化は、ウイルスのヘマグルチニンまたは他の凝集粒子が結合する細胞表面受容体を不活性化しない。

0171

いくつかの実施形態では、動物の赤血球細胞が、新鮮に洗浄された動物のRBCをグルタルアルデヒド緩衝溶液に短時間曝露し、および生理食塩水により完全に洗浄することにより調製される。この処理は、赤血球の自然の抗原性を大部分保存する一方、細胞を一般的に浸透圧性ショック冷凍解凍または免疫溶血反応による溶解に対して抵抗性にする。これらの試薬は、赤血球凝集反応手順において直接用いられ得るか、または赤血球凝集反応検査のための様々なタンパク質と連結され得る。グルタルアルデヒドにより安定化されたRBCは、一般的に0.1%アジ化ナトリウムを含む生理食塩水中の細胞懸濁物として保存される。

0172

グルタルアルデヒド固定化により安定化された赤血球細胞は、ウシ、ネコ、ニワトリ、イヌ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、マウス、ブタ、ラット、ヒツジ、シチメンチョウおよびウサギからのグルタルアルデヒドにより安定化された動物の赤血球細胞を提供する、Fitzgerald Industries(マサチューセッツアクトン(Acton))などの商業的なソースから入手可能であり、これらの全てが本明細書で提供される方法において使用され得る。

0173

いくつかの実施形態では、前記赤血球は、グルタルアルデヒド固定化により安定化されたシチメンチョウ赤血球である。いくつかの実施形態では、異なる動物種からの新鮮な赤血球および細胞も用いられ得る。
F. 他のタイプの細胞

0174

いくつかの実施形態では、赤血球細胞以外の細胞が、これらの細胞がウイルス粒子、抗体、または他の凝集粒子の存在下で凝集する限り、本明細書で提供される方法のために使用され得る。
G. ミクロスフェア

0175

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、その凝集物が顕微鏡的に検出されるために十分大きいという条件で、任意の非細胞分子または粒子の凝集を測定するために用いられる。そのような粒子は本明細書において「ミクロスフェア」と称される。従って、本明細書において提供される検定において、RBCはミクロスフェアで置換されることができ、その表面は、ウイルス粒子、抗体、または他の凝集粒子または検出されるべき物質と線テク的に結合する、抗原または抗体と連結される。

0176

適切なミクロスフェアの例は、ウイルス粒子、抗体、タンパク質、炭水化物、または抗原に容易に結合し、および凝集することができるラテックスミクロスフェアおよび他のミクロスフェアを含む。一実施形態では、前記ミクロスフェアは、ビーズである。いくつかの実施形態では、ミクロスフェアは、ラテックス、金、ガラス、またはシリカを含む。一実施形態では、前記ミクロスフェアは、ウイルス粒子に結合する受容体により被覆されたラテックスミクロスフェアである。一実施形態では、ミクロスフェアは、ヘマグルチニンタンパク質、または血液型抗原(例えば、抗原A、B、D、など)により被覆される。

0177

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、凝集試験のために抗原により被覆されたミクロスフェアを用いる。その名前に関わらず、ミクロスフェアは、制限なしに、球状、直方体円筒状、および不規則を含む任意の形状であってよい。それらは、抗原に結合しおよび凝集検定での使用に適切な任意の物質を含み得る。

0178

抗原はミクロスフェアに連結され得る。抗原のミクロスフェアビーズへの結合のための方法は、当技術分野で周知である。連結は、ミクロスフェアの表面、または外表面から接近できる内表面に対するものであることができる。抗原は、LuminexCorporation(テキサス州オースチン(Austin))より提供されているようなビーズと、製造者推奨に従った2ステップのカルボジイミド処理により連結され得る。いくつかの実施形態では、前記抗原は、前記ミクロスフェアに吸着されるか、または共有結合的に結合される。

0179

いくつかの実施形態では、複数の抗原が用いられることができ、それぞれが別個のまたは同じミクロスフェアに結合される。ミクロスフェアとの連結に用いられる抗原は、本明細書で提供される方法を用いる抗体または凝集粒子により認識され得る、ウイルスの抗原性部分を含む。ウイルスの抗原性部分は、限定はされないが、ウイルスの膜タンパク質および非構造タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、それぞれが異なる抗原または抗体に連結されるミクロスフェアの混合物が用いられ得る
H.非特異的タンパク質および他の分子

0180

いくつかの実施形態では、凝集反応を加速するために非特異的なタンパク質が凝集検定に加えられる。非特異的なタンパク質の添加は、反応を約2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、20倍、または30倍を超えて加速できる。適切な非特異的タンパク質は、限定はされないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリおよびヒトなどの様々な動物からのアルブミンを含む、アルブミンを含む。アルブミンの他の非制限的な例は、ウシ血清アルブミンヒト血清アルブミン、ニワトリ卵白由来アルブミン、ウシラクトアルブミンおよびヒトラクトアルブミン.

0181

加えて、合成ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリエチレンオキシド(PEO))、糖ポリマー(例えば、デキストラン)、デキストラン硫酸ジエチルアミノエチル−デキストラン(DEAE−デキストラン)およびポリビニルピロリドンなどの他の巨大分子種も、凝集を加速するために用いられ得る。

0182

前記検定に加えられる非特異的な添加物の量は変化することができ、および一般的には約0.1〜50mg/mlの間の任意の量であり得る。特定の方法では、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、または50mg/mlの非特異的な添加物が前記検定に加えられる。いくつかの実施形態では、たかだか0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、または50mg/mlの非特異的なが前記検定に加えられる。

0183

非特異的な添加物は、前記検定で用いられる、希釈剤緩衝液または他の緩衝液/試薬に加えられ得る。
I. 提供される凝集検定の特定の利点

0184

本明細書において記載される組成物、方法、システム、および機器は、従来の凝集検定を上回る複数の異なる利点を凝集検定に対して提供する。
I1.増大された感度

0185

実施形態では、本明細書で提供される方法は、従来の凝集検定を上回る凝集検出の増大された感度を有し得る。
I1a.増大された感度−画像分析

0186

一実施形態では、凝集検定感度は、凝集反応(以下で更に議論される)を分析するための画像分析の使用により増大される。画像分析の使用は、検定感度を従来の凝集検定の約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、または100倍に増大させ得る。
I1b.増大された感度−濃度/希釈ステップ

0187

別の実施形態では、凝集検定感度は、凝集粒子(例えば、ウイルス粒子)および可視化粒子(例えば、RBCまたはミクロスフェア)を含む反応混合物濃縮することに次いで、濃縮された物質の希釈、および凝集の後続する分析により増大され得る。この方法において、濃縮ステップにおいて、前記凝集粒子および可視化粒子は、密接な近接にもたらされ、凝集粒子の可視化粒子への結合が促進される。次いで、濃縮された物質を希釈するステップでは、特異的に凝集した可視化粒子だけが、凝集したままで残る(すなわち濃度ステップの間に非特異的に凝集した可視化粒子は、希釈ステップの間には、凝集したままでは残らない)。この方法を用い、検出可能な凝集を生成するために、より少ない凝集粒子が検定で用いられることができる。それに応じて、HAI検定では、より少ないサンプル中の抗体が、凝集阻害を引き起こすために必要となる。従って、より少ない凝集粒子および/より少ない抗体が、凝集または凝集阻害を引き起こすために必要なので、この方法は、凝集検定の感度を増大させ得る。

0188

一実施形態では、凝集検定の感度は、以下のステップを含む方法により凝集検定を遂行することにより増大され得る。第一に、目的の生物学的抗体を含むことが疑われるサンプルが、凝集粒子および可視化粒子と混合されおよびインキュベートされる。いくつかの態様では、前記生物学的サンプルは、可視化粒子の添加の前に凝集粒子とインキュベートされ得る。第二に、凝集粒子、可視化粒子、および目的の抗体を含むことが疑われるサンプルを含む反応は、ペレットを生成するために遠心分離される。典型的には、この方法による遠心分離は、再懸濁が困難な複合体を生成させないために、穏やか(数分間にわたり数百から低い数千xg)である。第三に、上澄みが除去され、および前記ペレットが凝集した粒子または可視化粒子に干渉しない、緩衝液により1〜2回洗浄される。第四に、この洗浄されたペレットが緩衝液に再懸濁される。第五に、この再懸濁された反応混合物が凝集について分析される。

0189

別の実施形態では、抗体を凝集粒子として用いる凝集検定では、洗浄された凝集反応に目的の抗体のタイプに対する抗体を加えることにより、更に検定の感度が増大され得る。一実施形態では、上記に記載される濃度/希釈ステップを含む凝集反応において、目的の抗体がヒトのものである場合、洗浄されたペレットが再懸濁されるときに、抗ヒトグロブリン(クームス(Coombs)試薬)も、再懸濁されたペレットに加えられる。再懸濁されたペレットを抗−ヒトグロブリンとインキュベートした後に、再懸濁された反応が凝集について分析される。この方法では、抗ヒトグロブリンは可視化粒子に結合し得る目的の抗体に結合する。抗−ヒトグロブリン目的の抗体の複数の抗体を寄せ集めることができ、およびこれらの抗体のそれぞれが、1つ以上の可視化粒子に結合できるために、抗ヒトグロブリンの添加は凝集検定の感度を増大させ得る。特定の抗体のタイプを同定するために、この方法の特異性は抗ヒトグロブリンよりはむしろ、抗ヒトIgMIgG、またはIgAを用いることにより更に増大されることができる。
I2.増大された速度

0190

一態様では、本明細書で提供される検定は、速度に関する利点を提供し得る。従来の凝集検定は、少なくとも12〜18時間のインキュベーションを伴う前処理ステップを必要とする。本開示のいくつかの方法では、前処理ステップは、15分未満、30分未満、1時間未満、2時間未満で遂行される。更に、本開示の方法は、従来の手順を用いて4時間かかり得るプロセスである、赤血球の新鮮な調製の必要性を除去する。従来のHAI検定方法では、目的の抗体を含み得るサンプルとウイルスの抗原および赤血球とのインキュベーションは、2つの別個のステップとして行われるが、本明細書において開示される、いくつかの実施形態では、ウイルスの抗原および赤血球が共に目的の抗体を含み得るサンプルに、単一のステップで加えられる。実施形態では、本開示のHA検定またはHAI検定は、1時間未満、1.5時間未満、2時間未満、2.5時間未満、3時間未満で遂行される。

0191

本開示の方法は、サンプル中のウイルスの検出および/または測定についての改良を提供し、およびいくつかの実施形態では、方法を遂行するための合計の時間の量は、500、400、300、200、180、160、140、120、100、90、75、60、45、30、15、10、5分未満である。いくつかの実施形態では、方法を遂行するための合計の時間の量は、30〜60分である。
I2a.増大された速度−画像分析

0192

一実施形態では、凝集検定の速度は、凝集反応を分析するための画像分析の使用により増大され得る(以下で更に議論される)。
I2b. 増大される速度−試薬および検定 ステップ

0193

他の実施形態では、凝集検定の速度は、凝集 反応の性能および/または分析を加速するための改良された試薬および/または検定 ステップの使用により増大され得る。例えば、本明細書の他の場所に記載されるように、サンプル前処理の任意の1つ以上の改良(例えば、ノイラミニダーゼの使用による)、あらかじめ固定されたRBCまたはミクロスフェアの使用、use of 組み合わされた 検定 ステップの使用(例えば、可視化粒子の添加の前に第一に凝集 粒子および抗体を含むサンプルをインキュベートすることよりも、むしろ凝集 粒子、可視化 粒子、および抗体を含むサンプルの、単一のインキュベーションステップでの混合による)、および検定媒質組成物における改良は、正確な凝集検定結果を得るために必要な時間を減少させ得る。
I3.減少された容積

0194

一態様では、本明細書で提供される方法は、反応容積に関して利点を提供し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される凝集検定方法は、約50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1マイクロリットル以下の反応容積において遂行され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される凝集検定は、約50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1マイクロリットル以下の血液サンプルを用いて遂行され得る。
J.一般−凝集検定

0195

凝集の検出は、一般的にスキャナー、カメラ、検出器、またはセンサーなどの画像化機器を用いて凝集反応生成物の画像を撮影することを含む。いくつかの実施形態では、画像化機器は顕微鏡に連結される。

0196

一般に、検定は、マイクロタイタープレート(96孔、または他の形式)、試験管ミクロチューブ(microfuge tube)、毛細管、ピペットチップまたは他の容器などの反応を保持する能力を持つ機器を用いて遂行される。前処理された検出されるべき抗体を含む生物学的サンプルは、希釈剤緩衝液(例えば、BSAを含むPBS)により、随意的に連続的に希釈される。次に、ウイルス粒子が、容器に加えられることができ、および各容器の内容物が穏やかに混合される。次いで、あらかじめ固定されたRBC懸濁物が加えられることができ、続いて穏やかに撹拌される。この反応は、適切な時間の間、例えば合計約15分、インキュベートされる。しかしながら、約5、10、20、25、30、35、40、50、60分、またはそれより短いか、もしくは長いなどの、15分より短いか、または長い合計のインキュベーションも用いられることができる。このインキュベーションは、室温(すなわち、25℃)、または約4、8、12、14、16、20、30、35、40、45、50、55、60、65、または70℃なその、室温よりも低いか、または高い温度で行われ得る。インキュベーションの温度及び持続時間は、検定の速度および正確性の両方を達成するために、最適化され得る。前記プレートはスキャナー上で読み取られることができ、およびプレートの最終的な終点の画像が、好適にはプレートが、水平に対して約20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、または75°などの、20〜75°の角度で傾けられた時に撮影され得る。

0197

いくつかの実施形態では、凝集検定の画像が、顕微鏡を含む光学的機器により捕捉される。これらの実施形態では、前記検定は、あらかじめ固定されたRBCまたは可視化粒子が反応に加えられた後に、ウエル(または反応を保持する他の構造)からの少量のサンプル(例えば、1〜2μL)が、キュベットまたはチップ中に直接移送され、および顕微鏡を含む光学的機器下に撮像される以外は一般に上述のように遂行される。本明細書においてより詳細に記載されるように会合因子を計算するために、画像が、収集されおよび分析され得る。

0198

凝集検定を行う持続時間は、一般に検定の速度および正確性の両方を達成するために最適化される。いくつかの実施形態では、検定および検出凝集の遂行は約10分以下、15分以下、20分以下、30分以下、40分分以下、50以下、または60分以下などの1時間未満時間で生じる。いくつかの実施形態では、検定および検出凝集の遂行は1時間を超えるが、しかし2、3、4、5、6、7、または8時間未満で生じる。

0199

いくつかの実施形態では、凝集検定は、クラウドコンピューティングインフラストラクチャーを介して、凝集検定の1つ以上のステップが自動化されおよび/または制御される、システムまたは機器上で遂行され得る。例えば、本明細書において記載される凝集検定は、米国特許出願第13/244,947号または米国特許出願第No.13/355,458号に記載されたシステムまたは機器上で遂行されることができ、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

0200

一実施形態では、機器は、凝集に適切な(およびそれにより凝集検定を開始する)条件下で、凝集粒子をサンプルに加える能力を有する構成要素を含み;構成要素は、凝集検定の一組の画像を取得する能力を有し;および構成要素はサンプルの凝集を測定するために、一組の画像を分析する能力を有する。サンプルの凝集を測定するために、一組の画像を分析する能力を有する前記構成要素は、機器内の、凝集検定の2つ以上の画像を得るために構成された構成要素と、同じ装置の一部であることができる。サンプルの凝集を測定するために、一組の画像を分析する能力を有する前記構成要素は、前記機器に埋め込まれ得る。サンプルの凝集を測定するために、一組の画像を分析する能力を有する前記構成要素は、複数のタイプの分析を遂行するために構成されることができ、および/またはそれは、機器内で複数の応用のために用いられ得る。サンプルの凝集を測定するために、一組の画像を分析する能力を有する前記構成要素は、機器から遠隔に配置され得る。サンプルの凝集を測定するために、一組の画像を分析する能力を有する前記構成要素は、クラウド・コンピューティング・インフラストラクチャー(例えば、クラウド・コンピューティング)中に配置され得る。サンプルの凝集を測定するために、一組の画像を分析する能力を有する前記構成要素は、クラウド中に配置されることができ、および前記機器は、このクラウドから動的に制御されるために構成され得る。いくつかの実施形態では、前記機器は、凝集検定分析の結果に基づき二次的手順に影響を及ぼすために構成される。いくつかの実施形態では、本明細書において記載される凝集検定を遂行する能力のある機器は、例えば、米国特許出願第13/244,947号に記載される機器として構成されることができ、この出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0201

一実施形態では、本明細書において開示されるシステムは、凝集に適切な条件下で、およびそれにより凝集検定を開始する、凝集粒子をサンプルに加える能力を有する構成要素;一組の凝集検定の画像を取得する能力のあるカメラ;および前記一組の画像サンプルの凝集を測定するために分析する能力のあるコンピュータを含み得る。サンプルの凝集を測定するために一組の画像の画像を分析するために構成された前記コンピュータは、一組の2つ以上の凝集検定の画像を取得するために構成されたカメラとシステム内の同じの装置の一部分であってよい。サンプルの凝集を測定するために一組の画像の画像を分析するために構成された前記コンピュータは、前記システム内に埋め込まれ得る。サンプルの凝集を測定するために一組の画像の画像を分析するために構成された前記コンピュータは、複数のタイプの分析を遂行するために構成されることが出液、および/またはそれは前記システム内の複数の応用のために用いられる。サンプルの凝集を測定するために一組の画像の画像を分析するために構成された前記コンピュータは、一組の2つ以上の凝集検定の画像を取得するために構成されたカメラから遠隔に配置され得る。サンプルの凝集を測定するために一組の画像の画像を分析するために構成された前記コンピュータは、クラウド中に配置され得る。サンプルの凝集を測定するために一組の画像の画像を分析するために構成された前記コンピュータは、クラウド中に配置されることができ、および前記システムは、前記クラウドから動的に制御されるために構成され得る。前記システムは、凝集検定分析の結果に基づき二次的手順に影響を及ぼすために構成され得る。いくつかの実施形態では、本明細書において記載される凝集検定を遂行する能力のあるシステムは、例えば、米国特許出願第13/244,947号に記載されるシステムとして構成されることができ、この出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
III. 検出および画像分析

0202

一態様では、本開示は、画像分析に基づく凝集、または赤血球凝集反応を分析する有利な客観的な方法を提供する。

0203

円錐形の管またはウエル(タイタープレート中の)における従来の凝集検定では、凝集は、ウエル底部のRBCの低下された移動性(凝集の場合)、またはタイタープレートが傾けられた時の重力下で充填されたRBCの制限された流れ(凝集の欠如の場合)のいずれかの目視による観察によって決定される。凝集の場合のRBCの低下された移動性は、RBCおよび凝集粒子の間の引力に起因する。

0204

凝集反応を読み取るために、いくつかの光学的(可視的な)方法が用いられている。しかしながら、これらの既存の方法は、RBCの互いの結合を、懸濁物のバルクの物質特性を単純な目視による検査により観察することにより検出する。

0205

一態様では、本明細書において提供されるものは画像分析に基づく凝集を分析する方法である。一実施形態では、画像分析方法は、円錐形のウエルまたは管中の凝集検定中の、RBCまたは可視化粒子の全体の動きを分析するために用いられる。別の実施形態では、画像分析方法は、RBCまたは可視化粒子懸濁物の微細構造を調べるために、RBCまたは可視化粒子凝集検定中の懸濁物中の、顕微鏡的な画像を分析するために用いられる。
A.RBC/可視化粒子の全体の動きの画像分析

0206

一態様では、本明細書において提供されるものはRBCおよび可視化粒子の全体の動きの画像分析のための方法である。上記および図3中に記載されるように、円錐形の(V字型の)反応容器(例えば、管または反応ウエル)中では、凝集していない細胞は、一般的に容器の底のゆるやかに充填された「ボタン」内に沈降する一方、凝集した細胞は、一般的に他の細胞により緊密に接着する。従って、もし凝集した細胞を含む円錐形の反応容器が傾けられると、この細胞は、細胞が互いに比較的緊密に接着しているために、一般に容器の底を離れない。対照的に、もし凝集していない細胞を含む反応容器が傾けられると、いくつかの細胞は、一般に重力下にウエルの底部から離れ、「涙滴」型を含む細胞ペレットの形成を導く。上記の事象に関連する、凝集検定の画像分析のための複数の方法が、本明細書において提供される。
A1.全体の動き−反応容器中の指定された場所での画像分析

0207

一実施形態では、反応容器(例えば、反応管またはウエル)中の、指定された場所での凝集反応の画像分析のための方法が提供される。図6はこの方法に関する概略図を示す。この方法では、ゾーン610が反応容器600の底部の中に含まれ、および/またはその隣にある。反応容器600の底部は、細胞605のペレットを含み得る。反応容器の画像が、反応容器を傾ける前、その間、および/またはその後に撮影され得る。細胞の位置は、サンプルの凝集のレベルを決定するため、および/または関連する計算を遂行するために用いられ得る反応容器中の指定されたゾーンへの参照により決定され得る。場合によっては、反応容器を傾けた際に、細胞615の「涙滴」を生じ得る。凝集していない細胞は、涙滴形状を生じる一方、凝集した細胞は涙滴形状を生じない。凝集した細胞は、ペレット化されたままであるか、または「ボタン」形状のままである。場合によっては、検定は細胞の部分的な凝集をもたらし得る。前記ゾーン610は、ボタン細胞および/または涙滴細胞およびバックグラウンドのいくらかの部分を含む領域を包含するアウトラインを有し得るか(図6A)、またはこのゾーンは、ボタンまたは涙滴細胞を含み得る領域のみを占有するより小さなアウトラインを有し得る(図6B)。

0208

一実施形態では、反応容器中の指定されたゾーンを用いる凝集反応の画像分析は以下のステップの1つ以上を含み得る:

0209

第一に、反応混合物を含むウエルのデジタル画像が撮影される。

0210

第二に、この画像が、検定ウエル上の基準マークの参照、またはボタンまたは涙滴の認識のいずれかによる、パターン認識技法を用いて配向される。

0211

第三に、この画像が、反応容器中のゾーンに対して配向される。光学的信号が、それぞれのゾーンの一面でピクセルxピクセルで測定され得る。例えば、白色光照明を用いて測定された信号は:a)%透過光(T)(画像が背面照明で得られた場合にはグレースケール)、またはb)%反射光(R)(画像が正面照射で得られた場合にはグレー・スケール)であり得る。パーセント光透過は、光路中に細胞が存在する場合対細胞が存在しない場合の透過光の比を取ることにより決定され得る;パーセント反射率(reflectance)も類似の様式で決定され得る。%Tおよび%Rのそれぞれの測定は、照明源および検出器を含む。透過の場合、サンプルは、照準線内の、および照明源と検出器の間の、光学的に透明な容器中に配置され得る。照明源から来る光が強度Ioを有し、および検出器に到達する光(サンプルを通過した後に)が強度Iを有する場合、透過率はT=I/Ioを用いて計算される。

0212

第四に、等価率(%T)または反射率(%R)は:(A=−LOG[%T])(ビアー(Beer)の法則)またはK/S(式中K=吸光度およびSは散乱)(クベルカ−ムンク関数(Kubelka−Munk function))の式により、吸光度(A)にそれぞれ変換され得る。ビアーの法則は、測定された吸光度および検体濃度の間の関係である。

0213

AおよびK/Sは、直接光吸収種の濃度にそれぞれ以下のように関係する:A=濃度*・M*l*C(式中、・Mモル吸光計数であり、lはサンプルの経路長であり、およびCは光吸収種である目的の検体の濃度である);K/S=(1−(0.01R)2)/(2*0.01R))。散乱については、前記照明源は、検出器に対しておおむね90度の角度である。この散乱強度は、サンプルにより散乱された光(前記照明源からの)の強度(前記検出器により収集された)である。

0214

図7に示されるように、信号強度(%Tまたは%R)が、ゾーンナンバー図6Aの概略図の)に対してプロットされる場合、応答対凝集の程度(任意の尺度)を示す関係が得られる。

0215

上記の等式は単一の波長には適用されるが、白色光が用いられる場合、前記AまたはK/Sの値は、波長の範囲にわたる平均を表す。これらは、それでも凝集分析についての許容できる結果を提供する。

0216

いくつかの実施形態では、吸光度またはK/Sを測定された信号として用いて、バックグラウンドより大きな信号が各ゾーン内で平均される。更に、吸光度またはK/が、任意の閾値より大きい場合には、この信号は1に、または分析についてのカットオフより少ない場合には、この信号はゼロに設定され得る。
A2.全体の動き−スキャニングを用いる画像分析

0217

一実施形態では、凝集反応の充填された細胞のスキャニングを用いる画像分析のための方法が提供される。この充填された細胞は、ボタンおよび/または涙滴領域を含み得る。図8は、この方法に関する概略図を示す。この方法では、凝集反応は円錐形の容器中で遂行され、およびこの反応容器が次いで傾斜される。次に、ボタンおよび/または涙滴の長軸に沿ってスキャン・ゾーンが確立され得る。分析のためのこの軸は、ボタン、涙滴、またはそれらの組み合わせより短くてもまたは長くてもよい。ボタンの外側の、軸の開始が位置0、および涙滴の外側の位置20が軸の終点であるなど、軸に沿った位置が指定されることができる。速度および正確性の最良の組み合わせに基づいて、位置の数は任意的に選択されることができる。%Tまたは%Rなどの光学的信号のために、軸の長さがが調べられる。前記信号が軸に沿った位置に対してプロットされる。図9は、光学的信号強度対複数のタイプのサンプル(凝集した(三角形)、部分的に凝集した(正方形)、および凝集していない(菱形))についての図8に示される軸に沿った位置の代表的なグラフである。ボタンおよび/または涙滴の長さに沿った前記光学的信号は、サンプル中の凝集のレベルを決定するために、および/または関連する計算を遂行するために用いられ得る。

0218

一実施形態では、ボタンおよび/または涙滴の凝集反応のスキャニングを用いる画像分析は、以下のステップの1つ以上を含む:

0219

第一に、反応混合物を含むウエルのデジタル画像が撮影される。

0220

第二に、この画像が、検定ウエル上の基準マークの参照、またはボタンまたは涙滴の認識のいずれかによる、パターン認識技法を用いて配向される。

0221

第三に、涙滴および/またはボタンの長軸に沿ったスキャン。ゾーンが、is%Tまたは%Rについて調べられる。

0222

第四に、光学的信号(上記の「全体の動き−反応容器中の指定された場所での画像分析」において定義されるもの) が、軸にそって、ピクセルxピクセルで測定される。

0223

第五に、バックグラウンドより大きな信号が、下方および軸に直角ないくつかのピクセルにわたって平均される。

0224

第六に、信号が軸に沿った位置に対してプロットされる。
A3.全体の動き−面積または周囲の長さの画像分析

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