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課題

オリゴヌクレオチド治療薬インビボ送達の欠点に対処する、受容体特異的リガンドコンジュゲートした新しいiRNA剤およびこれらを調製する方法を提供する。

解決手段

式(I)の少なくとも1つのサブユニットを含むiRNA剤であって、式中、AおよびBは、それぞれ独立して、O、N(RN)、またはSであり;XおよびYは、それぞれ存在ごとに独立して、H、OH、ヒドロキシ保護基リン酸基ホスホジエステル基活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基ホスホロアミダイト固体担体、-P(Z’)(Z’’)O-ヌクレオシド、-P(Z’)(Z’’)O-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイド親油性物質ポリマー、-P(Z’)(Z’’)O-リンカー-OP(Z’’’)(Z’’’’)O-オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、-P(Z’)(Z’’)-式(I)、-P(Z’)(Z’’)-、または-リンカー-Rであり;RはLG、-リンカー-LGであるか、または明細書化学式7に示す分岐鎖としての複数の-リンカー-LGを含む構造を有し、LGは、それぞれ存在ごとに独立して、糖質、例えば、単糖二糖三糖四糖オリゴ糖多糖であり;RNは、それぞれ存在ごとに独立して、H、メチルエチルプロピルイソプロピルブチル、またはベンジルであり;かつZ’、Z’’、Z’’’、およびZ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、OまたはSである。

概要

背景

オリゴヌクレオチド化合物は、医学において重要な治療用途を有する。特定の疾患の原因となる遺伝子をサイレンシングするためにオリゴヌクレオチドを用いることができる。遺伝子サイレンシングは、翻訳阻害することによってタンパク質の生成を妨げる。重要なことに、遺伝子サイレンシング剤は、疾患と関連するタンパク質の機能を阻害する従来型の小有機化合物に取って代わるものとして有望視されている。siRNA、アンチセンスRNA、およびマイクロRNAは、遺伝子サイレンシングによってタンパク質の生成を妨げるオリゴヌクレオチドである。

RNA干渉、すなわち「RNAi」は、二本鎖RNAdsRNA)が遺伝子発現を阻止することができるという観察を説明するために、Fireおよび同僚らが最初に作り出した用語である(非特許文献1)。短いdsRNAは、脊椎動物を含む、多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを導くものであり、遺伝子機能を研究するための新しいツールを提供している。RNAiは、サイレンシングトリガー相同メッセンジャーRNAを壊す配列特異的な多成分ヌクレアーゼである、RNA誘導サイレンシング複合体RISC)によって仲介される。RISCは、二本鎖RNAトリガーに由来する短いRNA(約22ヌクレオチド)を含有することが知られているが、この活性タンパク質成分はまだ分かっていない。

siRNA化合物は、種々の診断目的および治療目的に有望な薬剤である。siRNA化合物は、遺伝子の機能を同定するために用いることができる。さらに、siRNA化合物は、疾患を引き起こす遺伝子をサイレンシングすることによって作用する新しいタイプの医薬品として大きな可能性を提供する。中枢神経学的疾患、炎症性疾患代謝障害腫瘍感染性疾患、および眼疾患を含む多くの疾患を治療するための干渉RNA治療剤を開発する研究が現在進行中である。

siRNAは、潜在的な抗ウイルス治療薬として極めて有効であることが示されており、最近多くの例が公表されている。ウイルスゲノム中の標的に向けられるsiRNA分子は、インフルエンザ(非特許文献2〜3)、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)(非特許文献4)、B型肝炎ウイルスHBV)(非特許文献5)、C型肝炎ウイルス(非特許文献6〜7)、およびSARSコロナウイルス(非特許文献8)の動物モデルにおいて、ウイルス力価を数桁、飛躍的に低下させる。

アンチセンス法とは、mRNAまたはDNAのような細胞核酸の正常な必須機能(例えば、タンパク質合成)が妨げられるような、比較的短いオリゴヌクレオチドのmRNAまたはDNAへの相補的ハイブリダイゼーションのことである。ハイブリダイゼーションは、ワトソンクリック塩基対を介したRNAまたは一本鎖DNAに対するオリゴヌクレオチドの配列特異的な水素結合である。このような塩基対を互いに相補的であると言う。

Cohen(非特許文献9)によって論じられている、標的配列発現レベルを変化させる天然に存在する事象には、2つの種類があると考えられる。第一の、ハイブリダイゼーション停止は、オリゴヌクレオチド阻害剤が、標的核酸に結合し、その結果、単なる立体障害によって、必須タンパク質(ほとんどの場合、リボソーム)の核酸への結合が妨げられる終結事象を説明するものである。メチルホスホネートオリゴヌクレオチド(非特許文献10)、およびα−アノマーオリゴヌクレオチドは、2つの最も広く研究されているアンチセンス剤であり、これらは、ハイブリダイゼーション停止によって核酸機能を妨げる考えられている。

アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列の発現レベルを変化させるもう1つの手段は、標的mRNAへのハイブリダイゼーションと、それに続く細胞内RNアーゼHによる標的RNAの酵素的切断によるものである。2'-デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が標的RNAとハイブリダイズし、この二重鎖がRNアーゼH酵素を活性化して、RNA鎖を切断し、それによって、このRNAの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、この種のアンチセンス終結事象によって作用するアンチセンス薬剤の最も著明な例である。

これらのおよび他の核酸をベースにした治療を使用する機会は大いに有望であり、現在の伝統的な医学では対処できない医学的問題の解決策を提供する。増々多くの疾患関連遺伝子の場所と配列が同定されつつあり、種々の疾患についての核酸をベースにした治療法臨床試験が、現在進行中である。

オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の治療薬としての適用の進歩にも関わらず、改善された薬理学的特性(例えば、血清定性、適切な臓器または細胞への送達、および膜貫通送達)を有するオリゴヌクレオチドが必要とされている。核酸およびオリゴヌクレオチドの膜貫通送達の改善に向けた努力において、タンパク質担体、抗体担体リポソーム性送達系、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合ウイルスベクター、およびリン酸カルシウムを介する形質転換が利用されている。しかしながら、これらの技術の多くは、膜貫通輸送が可能な細胞の種類と、このような輸送を達成するのに必要な条件とによって限定される。

インビボでの細胞への効率的な送達には、特異的な標的化と細胞外環境、特に血清タンパク質からの相当な保護とが必要とされる。特異的な標的化を達成する1つの方法は、標的化部分をiRNA剤コンジュゲートさせることである。標的化部分は、iRNA剤を所要標的部位に標的化するのに役立つ。標的化部分によって送達が改善され得る1つの方法は、受容体を介するエンドサイトーシス活性によるものである。この取込み機構は、膜構造陥入を介してまたは送達系と細胞膜との融合によって、膜受容体に結合したiRNA剤が、膜で囲まれた領域の内側に移動することを伴う。このプロセスは、特異的リガンドが受容体に結合した後の、細胞表面受容体または膜受容体の活性化によって開始される。受容体を介する多くのエンドサイトーシス系が知られ、研究されており、これには、糖(例えば、ガラクトースマンノース、マンノース−6−リン酸)、ペプチド、およびタンパク質(例えば、トランスフェリンアシアロ糖タンパク質ビタミンB12、インスリン、および上皮増殖因子(EGF))を認識するものが含まれる。アシアロ糖タンパク質受容体(ASGP−R)は、肝細胞に極めて大量に存在する高容量受容体である。ASGP−Rは、N-アセチル-D-ガラクトサミン(GalNAc)に対してD-Galよりも50倍高い親和性を示す。これまでの研究により、nMの親和性を得るには多価性が必要である一方、糖間で間隔が空いていることも非常に重要であることが示されている。

D−マンノースに対して高い親和性を有するマンノース受容体は、糖質をベースにしたもう1つの重要なリガンド−受容体ペアである。マンノース受容体は、マクロファージおそらく樹状細胞などの特定の細胞型で高発現している。これらの細胞に薬物分子を標的とするために、マンノースコンジュゲートおよびマンノシル化された薬物担体が首尾よく使用されている。例えば、非特許文献11〜14を参照されたい。

コレステロールまたは脂肪酸などの親油性部分は、核酸などの親水性の高い分子に結合した場合、血漿タンパク質結合を大幅に向上させ、結果的に循環半減期を向上させることができる。さらに、リポタンパク質などの特定の血漿タンパク質への結合が、対応するリポタンパク質受容体(例えば、LDL受容体HDL受容体、またはスカベンジャー受容体SR−B1)を発現する特定の組織での取込みを増大させることが示されている。例えば、非特許文献15〜16を参照されたい。標的化送達手法の細胞内トラフィッキングを改善するために、親油性コンジュゲートを標的化リガンドと組み合わせて使用することもできる。

概要

オリゴヌクレオチド治療薬のインビボ送達の欠点に対処する、受容体特異的リガンドにコンジュゲートした新しいiRNA剤およびこれらを調製する方法を提供する。式(I)の少なくとも1つのサブユニットを含むiRNA剤であって、式中、AおよびBは、それぞれ独立して、O、N(RN)、またはSであり;XおよびYは、それぞれ存在ごとに独立して、H、OH、ヒドロキシ保護基リン酸基ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基ホスホロアミダイト固体担体、-P(Z’)(Z’’)O-ヌクレオシド、-P(Z’)(Z’’)O-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイド親油性物質ポリマー、-P(Z’)(Z’’)O-リンカー-OP(Z’’’)(Z’’’’)O-オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、-P(Z’)(Z’’)-式(I)、-P(Z’)(Z’’)-、または-リンカー-Rであり;RはLG、-リンカー-LGであるか、または明細書化学式7に示す分岐鎖としての複数の-リンカー-LGを含む構造を有し、LGは、それぞれ存在ごとに独立して、糖質、例えば、単糖二糖三糖四糖オリゴ糖多糖であり;RNは、それぞれ存在ごとに独立して、H、メチル、エチルプロピルイソプロピルブチル、またはベンジルであり;かつZ’、Z’’、Z’’’、およびZ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、OまたはSである。なし

目的

本発明は、新規の糖質コンジュゲートおよびiRNA剤のインビボ送達に有利なこれらのコンジュゲートを含むiRNA剤、ならびにインビボでの治療的使用に好適なiRNA組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

次式(I)に示す構造を有する化合物を含むiRNA剤:式中、AおよびBは、それぞれ存在ごとに独立して、O、N(RN)、またはSであり;RNは、それぞれ存在ごとに独立して、HまたはC1-C6アルキルであり;XおよびYは、それぞれ存在ごとに独立して、H、保護基リン酸基ホスホジエステル基活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基ホスホロアミダイト固体担体、-P(Z’)(Z’’)O-ヌクレオシド、-P(Z’)(Z’’)O-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイドポリマーヌクレオチド、ヌクレオシド、-P(Z’)(Z’’)O-リンカー-OP(Z’’’)(Z’’’’)O-オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、-P(Z’)(Z’’)-式(I)、-P(Z’)(Z’’)-、または-リンカー-Rであり;Rは、LGであるかまたは以下に示す構造:を有し;LGは、それぞれ存在ごとに独立して、リガンドであり;かつZ’、Z’’、Z’’’、およびZ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、OまたはSである。

請求項2

次式(I’)に示す構造を有する化合物を含むiRNA剤:式中、AおよびBは、それぞれ存在ごとに独立して、O、N(RN)、またはSであり;XおよびYは、それぞれ存在ごとに独立して、H、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-P(Z’)(Z’’)O-ヌクレオシド、-P(Z’)(Z’’)O-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、-P(Z’)(Z’’)O-R1-Q’-R2-OP(Z’’’)(Z’’’’)O-オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、-P(Z’)(Z’’)-式(I)、-P(Z’)(Z’’)-、または-Q-Rであり;Rは、L1であるか、または次式(II)〜(V):に示す構造を有し;q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B、およびq5Cは、それぞれ存在ごとに独立して、0〜20であり、ここで、繰り返し単位は、同一であっても異なっていてもよく;QおよびQ’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、-(P7-Q7-R7)p-T7-、または-T7-Q7-T7’-B-T8’-Q8-T8であり;P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、P7、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C、T7、T7’、T8、およびT8’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、またはCH2Oであり;Bは、-CH2-N(BL)-CH2-であり;BLは、-TB-QB-TB’-RXであり;Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C、Q7、Q8、およびQBは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン置換アルキレンであり、ここで、1つ以上のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R’’)、C≡C、またはC(O)の1つ以上で中断または終結されることがあり;TBおよびTB’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OC(O)、OC(O)O、NHC(O)、NHC(O)NH、NHC(O)O、CH2、CH2NH、またはCH2Oであり;RXは、親油性物質ビタミンペプチド糖質エンドソーム溶解成分、ステロイド、テルペン、またはカチオン性脂質であり;R1、R2、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C、R7は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、またはヘテロシクリルであり;L1、L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B、およびL5Cは、それぞれ存在ごとに独立して、糖質であり;R’およびR’’は、それぞれ存在ごとに独立して、H、C1-C6アルキル、OH、SH、またはN(RN)2であり;RNは、それぞれ存在ごとに独立して、H、メチルエチルプロピルイソプロピルブチル、またはベンジルであり;Raは、Hまたはアミノ酸側鎖であり;Z’、Z’’、Z’’’、およびZ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、OまたはSであり;pはそれぞれ存在ごとに独立して、0〜20である。

請求項3

前記iRNA剤が二本鎖である、請求項1に記載のiRNA剤。

請求項4

前記化合物が前記鎖の1つの3’末端にある、請求項3に記載のiRNA剤。

請求項5

前記化合物がセンス鎖の3’末端にある、請求項4に記載のiRNA剤。

請求項6

前記iRNA剤が、少なくとも1つの次式(VI)の構造をさらに含む、請求項1に記載のiRNA剤:式中、X6およびY6は、それぞれ存在ごとに独立して、H、ヒドロキシル保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-P(Z’)(Z’’)O-ヌクレオシド、-P(Z’)(Z’’)O-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイド、ポリマー、-P(Z’)(Z’’)O-R1-Q’-R2-OP(Z’’’)(Z’’’’)O-オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、-P(Z’)(Z’’)-式(I)もしくは-P(Z’)(Z’’)-であり;Q6は、存在しないか、または-(P6-Q6-R6)v-T6-であり;P6およびT6は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、またはCH2Oであり;Q6は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、1つ以上のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R’’)、C≡C、またはC(O)の1つ以上で中断または終結されることがあり;R6は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、またはヘテロシクリルであり;R’およびR’’は、それぞれ存在ごとに独立して、H、C1-C6アルキル、OH、SH、またはN(RN)2であり;RNは、それぞれ存在ごとに独立して、H、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり;Raは、Hまたはアミノ酸側鎖であり;Z’、Z’’、Z’’’、およびZ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、OまたはSであり;vはそれぞれ存在ごとに独立して、0〜20を表し;RLは、親油性物質またはカチオン性脂質である。

請求項7

RLが親油性物質である、請求項6に記載のiRNA剤。

請求項8

RLがコレステロールである、請求項6に記載のiRNA剤。

請求項9

RLがである、請求項6に記載のiRNA剤。

請求項10

Rが、式(II)、式(III)、式(IV)、または式(V)である、請求項2に記載のiRNA剤。

請求項11

Rが、次式(V):の構造を有する、請求項10に記載のiRNA剤。

請求項12

Rがである、請求項11に記載のiRNA剤。

請求項13

Rがである、請求項11に記載のiRNA剤。

請求項14

前記化合物が、構造を有する、請求項2に記載のiRNA剤。

請求項15

前記化合物が、構造を有する、請求項2に記載のiRNA剤。

請求項16

前記化合物が、構造を有する、請求項2に記載のiRNA剤。

請求項17

細胞における標的遺伝子発現を調節する方法であって、前記細胞に請求項1に記載のiRNA剤を提供する工程を含む方法。

請求項18

前記標的遺伝子が、第VII因子、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFβ遺伝子、Erb-B遺伝子、Src遺伝子、CRK遺伝子、GRB2遺伝子、RAS遺伝子、MEKK遺伝子、JNK遺伝子、RAF遺伝子、Erk1/2遺伝子、PCNA(p21)遺伝子、MYB遺伝子、JUN遺伝子、FOS遺伝子、BCL-2遺伝子、サイクリンD遺伝子VEGF遺伝子、EGFR遺伝子、サイクリンA遺伝子、サイクリンE遺伝子、WNT-1遺伝子、β-カテニン遺伝子、c-MET遺伝子PKC遺伝子、NFKB遺伝子、STAT3遺伝子、サバイビン遺伝子、Her2/Neu遺伝子、トポイソメラーゼI遺伝子、トポイソメラーゼIIα遺伝子、p73遺伝子の突然変異、p21(WAF1/CIP1)遺伝子の突然変異、p27(KIP1)遺伝子の突然変異、PPM1D遺伝子の突然変異、RAS遺伝子の突然変異、カベオリンI遺伝子の突然変異、MIBI遺伝子の突然変異、MTAI遺伝子の突然変異、M68遺伝子の突然変異、腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異、およびp53腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。

請求項19

単独でまたは薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と組み合わせて請求項1に記載のiRNA剤を含む薬学的組成物

関連出願の相互参照

0001

本出願は、米国仮特許出願第60/992,309号(2007年12月4日出願);米国仮特許出願第61/013,597号(2007年12月13日出願);米国仮特許出願第61/127,751号(2008年5月14日出願);米国仮特許出願第61/091,093号(2008年8月22日出願);および米国仮特許出願第61/097,261号(2008年9月16日出願)に対する優先権の利益を主張する。

技術分野

0002

本発明は、糖質コンジュゲートを用いた治療剤送達の分野に関する。特に、本発明は、新規の糖質コンジュゲートおよびiRNA剤インビボ送達に有利なこれらのコンジュゲートを含むiRNA剤、ならびにインビボでの治療的使用に好適なiRNA組成物を提供する。さらに、本発明は、これらの組成物を作製する方法、および例えば、さまざまな疾患状態の治療のために、これらの組成物を用いてこれらのiRNA剤を細胞に導入する方法を提供する。

背景技術

0003

オリゴヌクレオチド化合物は、医学において重要な治療用途を有する。特定の疾患の原因となる遺伝子をサイレンシングするためにオリゴヌクレオチドを用いることができる。遺伝子サイレンシングは、翻訳阻害することによってタンパク質の生成を妨げる。重要なことに、遺伝子サイレンシング剤は、疾患と関連するタンパク質の機能を阻害する従来型の小有機化合物に取って代わるものとして有望視されている。siRNA、アンチセンスRNA、およびマイクロRNAは、遺伝子サイレンシングによってタンパク質の生成を妨げるオリゴヌクレオチドである。

0004

RNA干渉、すなわち「RNAi」は、二本鎖RNAdsRNA)が遺伝子発現を阻止することができるという観察を説明するために、Fireおよび同僚らが最初に作り出した用語である(非特許文献1)。短いdsRNAは、脊椎動物を含む、多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを導くものであり、遺伝子機能を研究するための新しいツールを提供している。RNAiは、サイレンシングトリガー相同メッセンジャーRNAを壊す配列特異的な多成分ヌクレアーゼである、RNA誘導サイレンシング複合体RISC)によって仲介される。RISCは、二本鎖RNAトリガーに由来する短いRNA(約22ヌクレオチド)を含有することが知られているが、この活性タンパク質成分はまだ分かっていない。

0005

siRNA化合物は、種々の診断目的および治療目的に有望な薬剤である。siRNA化合物は、遺伝子の機能を同定するために用いることができる。さらに、siRNA化合物は、疾患を引き起こす遺伝子をサイレンシングすることによって作用する新しいタイプの医薬品として大きな可能性を提供する。中枢神経学的疾患、炎症性疾患代謝障害腫瘍感染性疾患、および眼疾患を含む多くの疾患を治療するための干渉RNA治療剤を開発する研究が現在進行中である。

0006

siRNAは、潜在的な抗ウイルス治療薬として極めて有効であることが示されており、最近多くの例が公表されている。ウイルスゲノム中の標的に向けられるsiRNA分子は、インフルエンザ(非特許文献2〜3)、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)(非特許文献4)、B型肝炎ウイルスHBV)(非特許文献5)、C型肝炎ウイルス(非特許文献6〜7)、およびSARSコロナウイルス(非特許文献8)の動物モデルにおいて、ウイルス力価を数桁、飛躍的に低下させる。

0007

アンチセンス法とは、mRNAまたはDNAのような細胞内核酸の正常な必須機能(例えば、タンパク質合成)が妨げられるような、比較的短いオリゴヌクレオチドのmRNAまたはDNAへの相補的ハイブリダイゼーションのことである。ハイブリダイゼーションは、ワトソンクリック塩基対を介したRNAまたは一本鎖DNAに対するオリゴヌクレオチドの配列特異的な水素結合である。このような塩基対を互いに相補的であると言う。

0008

Cohen(非特許文献9)によって論じられている、標的配列発現レベルを変化させる天然に存在する事象には、2つの種類があると考えられる。第一の、ハイブリダイゼーション停止は、オリゴヌクレオチド阻害剤が、標的核酸に結合し、その結果、単なる立体障害によって、必須タンパク質(ほとんどの場合、リボソーム)の核酸への結合が妨げられる終結事象を説明するものである。メチルホスホネートオリゴヌクレオチド(非特許文献10)、およびα−アノマーオリゴヌクレオチドは、2つの最も広く研究されているアンチセンス剤であり、これらは、ハイブリダイゼーション停止によって核酸機能を妨げる考えられている。

0009

アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列の発現レベルを変化させるもう1つの手段は、標的mRNAへのハイブリダイゼーションと、それに続く細胞内RNアーゼHによる標的RNAの酵素的切断によるものである。2'-デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が標的RNAとハイブリダイズし、この二重鎖がRNアーゼH酵素を活性化して、RNA鎖を切断し、それによって、このRNAの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、この種のアンチセンス終結事象によって作用するアンチセンス薬剤の最も著明な例である。

0010

これらのおよび他の核酸をベースにした治療を使用する機会は大いに有望であり、現在の伝統的な医学では対処できない医学的問題の解決策を提供する。増々多くの疾患関連遺伝子の場所と配列が同定されつつあり、種々の疾患についての核酸をベースにした治療法臨床試験が、現在進行中である。

0011

オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の治療薬としての適用の進歩にも関わらず、改善された薬理学的特性(例えば、血清定性、適切な臓器または細胞への送達、および膜貫通送達)を有するオリゴヌクレオチドが必要とされている。核酸およびオリゴヌクレオチドの膜貫通送達の改善に向けた努力において、タンパク質担体、抗体担体リポソーム性送達系、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合ウイルスベクター、およびリン酸カルシウムを介する形質転換が利用されている。しかしながら、これらの技術の多くは、膜貫通輸送が可能な細胞の種類と、このような輸送を達成するのに必要な条件とによって限定される。

0012

インビボでの細胞への効率的な送達には、特異的な標的化と細胞外環境、特に血清タンパク質からの相当な保護とが必要とされる。特異的な標的化を達成する1つの方法は、標的化部分をiRNA剤にコンジュゲートさせることである。標的化部分は、iRNA剤を所要標的部位に標的化するのに役立つ。標的化部分によって送達が改善され得る1つの方法は、受容体を介するエンドサイトーシス活性によるものである。この取込み機構は、膜構造陥入を介してまたは送達系と細胞膜との融合によって、膜受容体に結合したiRNA剤が、膜で囲まれた領域の内側に移動することを伴う。このプロセスは、特異的リガンドが受容体に結合した後の、細胞表面受容体または膜受容体の活性化によって開始される。受容体を介する多くのエンドサイトーシス系が知られ、研究されており、これには、糖(例えば、ガラクトースマンノース、マンノース−6−リン酸)、ペプチド、およびタンパク質(例えば、トランスフェリンアシアロ糖タンパク質ビタミンB12、インスリン、および上皮増殖因子(EGF))を認識するものが含まれる。アシアロ糖タンパク質受容体(ASGP−R)は、肝細胞に極めて大量に存在する高容量受容体である。ASGP−Rは、N-アセチル-D-ガラクトサミン(GalNAc)に対してD-Galよりも50倍高い親和性を示す。これまでの研究により、nMの親和性を得るには多価性が必要である一方、糖間で間隔が空いていることも非常に重要であることが示されている。

0013

D−マンノースに対して高い親和性を有するマンノース受容体は、糖質をベースにしたもう1つの重要なリガンド−受容体ペアである。マンノース受容体は、マクロファージおそらく樹状細胞などの特定の細胞型で高発現している。これらの細胞に薬物分子を標的とするために、マンノースコンジュゲートおよびマンノシル化された薬物担体が首尾よく使用されている。例えば、非特許文献11〜14を参照されたい。

0014

コレステロールまたは脂肪酸などの親油性部分は、核酸などの親水性の高い分子に結合した場合、血漿タンパク質結合を大幅に向上させ、結果的に循環半減期を向上させることができる。さらに、リポタンパク質などの特定の血漿タンパク質への結合が、対応するリポタンパク質受容体(例えば、LDL受容体HDL受容体、またはスカベンジャー受容体SR−B1)を発現する特定の組織での取込みを増大させることが示されている。例えば、非特許文献15〜16を参照されたい。標的化送達手法の細胞内トラフィッキングを改善するために、親油性コンジュゲートを標的化リガンドと組み合わせて使用することもできる。

先行技術

0015

Fireら(1998) Nature 391,806-811;Elbashirら(2001) Genes Dev.15,188-200
2Geら(2004) Proc.Natl.Acd.Sci.USA,101,8676-8681;Tompkinsら(2004) Proc.Natl.Acd.Sci.USA,101,8682-8686
Thomasら(2005) Expert Opin.Biol.Ther.5,495-505
Bitkoら(2005) Nat.Med.11,50-55
Morrisseyら(2005) Nat.Biotechnol.23,1002-1007
Kapadia(2003) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100,2014-2018
Wilsonら(2003) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100,2783-2788
Liら(2005) Nat.Med.11,944-951
Oligonucleotides:Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRCPress,Inc.,1989,Boca Raton,Fla.
Millerら(1987) Anti-Cancer Drug Design,2,117-128
Biessenら(1996) J.Biol.Chem.271,28024-28030
Kinzelら(2003) J.Peptide Sci.9,375-385
Barrattら(1986) Biochim.Biophys.Acta 862,153-64
Dieboldら(2002) Somat.Cell Mol.Genetics 27,65-74
Bijsterbosch,M.K.,Rump,E.Tら(2000) Nucleic AcidsRes.28,2717-25
Wolfrum,C.,Shi,S.ら(2007) 25,1149-57

発明が解決しようとする課題

0016

上記のようなオリゴヌクレオチド治療薬のインビボ送達の欠点に対処する、受容体特異的リガンドにコンジュゲートした新しいiRNA剤およびこれらを調製する方法が明白に必要とされている。本発明は、この極めて重要な目的に関するものである。

課題を解決するための手段

0017

一態様では、本発明は、少なくとも1つの糖質リガンド、例えば、単糖二糖三糖四糖オリゴ糖多糖とコンジュゲートしているiRNA剤を提供する。糖質がコンジュゲートされたこれらのiRNA剤は、特に、肝臓実質細胞を標的とする。一実施形態では、iRNA剤は、2つ以上の糖質リガンド、好ましくは2つまたは3つの糖質リガンドを含む。一実施形態では、iRNA剤は、1つ以上のガラクトース部分を含む。別の実施形態では、iRNA剤は、少なくとも1つ(例えば、2つまたは3つまたはそれより多く)のラクトース分子を含む(ラクトースは、ガラクトースに結合したグルコースである)。別の実施形態では、iRNA剤は、少なくとも1つ(例えば、2つまたは3つまたはそれより多く)のN-アセチル-ガラクトサミン(GalNAc)、N-Ac-グルコサミン(GluNAc)またはマンノース(例えば、マンノース−6−リン酸)を含む。一実施形態では、iRNA剤は、少なくとも1つのマンノースリガンドを含み、このiRNA剤はマクロファージを標的とする。

0018

一態様では、本発明は、糖質リガンドを含むiRNA剤を特色とし、この糖質リガンドの存在は、iRNA剤の肝臓への送達を増大させることができる。したがって、糖質リガンドを含むiRNA剤は、肝臓での発現が所望されない遺伝子を標的とするのに有用であり得る。例えば、糖質リガンドを含むiRNA剤は、肝炎ウイルス(例えば、C型肝炎B型肝炎A型肝炎D型肝炎E型肝炎F型肝炎、G型肝炎、またはH型肝炎)による核酸発現を標的とすることができる。

0019

一実施形態では、糖質がコンジュゲートされたiRNA剤は、C型肝炎ウイルスの遺伝子を標的とする。別の実施形態では、C型肝炎ウイルスの遺伝子を標的とするiRNA剤は、肝炎(例えば、急性肝炎もしくは慢性肝炎)、すなわち、肝臓の炎症を有するか、または肝臓の炎症を発症する危険性があるヒトに投与することができる。糖質がコンジュゲートされたiRNA剤、例えば、HCVの遺伝子を標的とするiRNA剤による治療の候補となるヒトは、HCV感染を示す症状、例えば、黄疸腹痛肝肥大、および倦怠感を示すことがある。

0020

一実施形態では、糖質がコンジュゲートされたiRNA剤は、HCVの5’コア領域を標的とする。この領域は、開始メチオニンにまたがるリボソームの足指紋(toe−print)のすぐ下流にある。別の実施形態では、iRNA剤は、HCVの非構造タンパク質(例えば、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、またはNS5B)のいずれか1つを標的とする。別の実施形態では、iRNA剤は、HCVのE1遺伝子、E2遺伝子、またはC遺伝子を標的とする。

0021

別の実施形態では、糖質がコンジュゲートされたiRNA剤は、B型肝炎ウイルス(HBV)を標的とし、このiRNA剤は、HBVの遺伝子、例えば、HBVのプロテインX(HBx)遺伝子の配列と実質的に同様の配列を有する。

0022

糖質がコンジュゲートされたiRNA剤は、望ましくない細胞増殖を特徴とする障害血液学的障害、代謝障害、および炎症を特徴とする障害を含む、他の肝障害を治療するために使用することもできる。肝臓の増殖障害は、例えば、良性または悪性の障害、例えば、癌(例えば、肝細胞癌(HCC)、肝転移、または肝芽腫)であり得る。肝臓の血液学的障害または炎症障害は、例えば、凝固因子が関わる障害、補体を介する炎症、または線維化であり得る。肝臓の代謝疾患には、脂質異常症およびグルコース調節の異常が含まれる。一実施形態では、肝障害は、この肝障害に関与する遺伝子中の配列と実質的に同一の配列を有する1つ以上のiRNA剤を投与することによって治療される。

0023

一実施形態では、糖質がコンジュゲートされたiRNA剤は、肝臓で発現する核酸、例えば、ApoB RNA、c−jun RNA、β−カテニンRNA、またはグルコース−6−リン酸mRNAを標的とする。

0024

例えば、グルコース代謝関連障害、例えば、糖尿病(例えば、2型糖尿病)の治療のために、グルコース−6−リン酸を標的とするiRNAを対象に投与して、肝臓のグルコース産生を阻害することができる。このiRNA剤を、この障害の危険性がある個体に投与して、この障害の発症またはこの障害の症状を遅延させることができる。

図面の簡単な説明

0025

核酸への糖(単糖)のコンジュゲーション二本鎖核酸の3’-末端(I)および5’-末端(II)ならびに一本鎖核酸の3’-末端(III)および5’-末端(IV)へのガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション。二本鎖核酸は、2つの3’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの3’-末端に1つの突出を有するか、または突出を有さない可能性があり;Qは、OまたはSである。
核酸への糖(単糖)のコンジュゲーション。(V)両方の鎖(センスおよびアンチセンスまたはガイド鎖)の3’-末端;(VI)1つの鎖(センスまたはアンチセンス)の3’-末端および第2の相補鎖の5’-末端、ならびに(VII)両方の鎖の5’-末端へのガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション。二本鎖核酸は、2つの3’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの3’-末端に1つの突出を有するか、または突出を有さない可能性がある。
核酸への糖(単糖)のコンジュゲーション。1つの鎖(センスまたはアンチセンス/ガイド鎖)の3’-末端および5’-末端へのガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション。二本鎖核酸は、2つの3’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの3’-末端に1つの突出を有するか、または突出を有さない可能性がある。
核酸への糖(単糖)のコンジュゲーション。センス鎖またはアンチセンス鎖の3’-末端(IX)および5’-末端(X)へのガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション;q=0〜10。二本鎖核酸は、2つの3’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの3’-末端に1つの突出を有するか、または突出を有さない可能性がある。
核酸への糖(単糖)のコンジュゲーション。オリゴヌクレオチドの3’-末端と5’-末端(XI);3’-末端(XII)、および5’-末端(XIII)へのガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション;q=0〜10。
核酸への糖(単糖)のコンジュゲーション。追加のスペーサーで分離されている核酸へのガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション:XIV−アルキルスペーサーおよび/またはPEGスペーサー二本鎖核酸との3’-末端コンジュゲート;XV−アルキルスペーサーおよび/またはPEGスペーサーとの5’-末端コンジュゲート;XVIおよびXVII−一本鎖核酸/オリゴヌクレオチドの対応する3’-末端コンジュゲートおよび5’-末端コンジュゲート。A、Bは、アルキルスペーサーまたはPEGスペーサー、およびその組合せを表し、Q’=CH2、O、S、S-S、NH、またはNMeである。二本鎖核酸は、2つの3’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの3’-末端に1つの突出を有するか、または突出を有さない可能性がある。
核酸への糖(単糖)のハイブリッドコンジュゲート。二本鎖核酸へのガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどおよび第2選択リガンドのコンジュゲーション:XX−3’-末端の連続的なコンジュゲーション;XXI−センスまたはアンチセンス上の3’-末端リガンドと5’-末端プテロイン酸類似体;XXII−センスまたはアンチセンス上の5’-末端リガンドと3’-末端プテロイン酸類似体;XXIII−センスもしくはアンチセンスの5’-末端上のプテロイン酸類似体およびアンチセンスもしくはセンスの3’-末端上の一般に好まれるリガンドまたはこれと逆のもの;XXIV−二本鎖核酸のセンス鎖またはアンチセンス鎖の5’-末端への選択リガンドとプテロイン酸類似体の連続的なコンジュゲーション。Lは、選択リガンドである。
核酸への糖(単糖)のハイブリッドコンジュゲート。一本鎖核酸へのガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどおよび第2選択リガンドのコンジュゲーション:XXV−3’-末端または5’-末端の連続的なコンジュゲーション;XXVI−3’-末端リガンドまたは5’-末端リガンドおよび5’-末端プテロイン酸類似体または3’-プテロイン酸類似体。Lは、一般に好まれるリガンドである。
核酸への糖(単糖)のコンジュゲート。スペーサー/テザーを有する脂質または脂質様分子(XIII)およびスペーサー/テザーを有さない脂質または脂質様分子(XIX)へのガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション。
核酸への糖の結合。二本鎖核酸の3’-末端(XX)および5’-末端(XXI)ならびに一本鎖核酸の3’-末端(XXII)および5’-末端(XXIII)への3分岐のガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション。二本鎖核酸は、2つの3’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの3’-末端に1つの突出を有するか、または突出を有さない可能性があり;Qは、OまたはSである。
核酸への糖(単糖)の結合。(XXIV)両方の鎖(センスおよびアンチセンスまたはガイド鎖)の3’-末端;(XXV)1つの鎖(センスまたはアンチセンス)の3’-末端および第2の相補鎖の5’-末端、ならびに(XXVI)両方の鎖の5’-末端への3分岐のガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどのコンジュゲーション;R、X、Y、Z、およびQの定義については、図1を参照されたい。二本鎖核酸は、2つの3’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの3’-末端に1つの突出を有するか、または突出を有さない可能性がある。同様に、図3図9の単分岐の糖部分(単数または複数)は、図10図11に記載されている3分岐の糖部分(単数または複数)で置換されている。
核酸へのオリゴ糖のコンジュゲーション。二本鎖核酸の3’-末端(XXVII)および5’-末端(XXVIII)ならびに一本鎖核酸の3’-末端(XXIX)および5’-末端(XXX)へのガラクトース、N−アセチルガラクトサミン、マンノース、グルコース、グルコサミン、フコース、ラクトースなどの類似体または誘導体のコンジュゲーション。二本鎖核酸は、2つの3’-突出を有するか、センスもしくはアンチセンスの3’-末端に1つの突出を有するか、または突出を有さない可能性があり;Qは、OまたはSである。同様に、図2〜9の糖部分(単数または複数)は、図12に記載されているオリゴ糖部分で置換されている。
切断可能なジスルフィド結合を有する3分岐GalNAc二本鎖オリゴヌクレオチドコンジュゲート。
切断可能なジスルフィド結合を有する3分岐GalNAc二本鎖オリゴヌクレオチドコンジュゲート。
ガラクトース-siRNAコンジュゲートのインビボでのapoB遺伝子サイレンシング。
リン酸結合を介して1つに連結されているコレステロールと(GalNAc)3の構造。
糖脂質-siRNAコンジュゲート戦略
アシアロ糖タンパク質受容体の結合親和性と多価性。
単純モノマーからの多分岐コンジュゲートの合成。
LDLとHDLの充填および肝臓標的化用の糖脂質−siRNAコンジュゲート。
糖脂質−siRNAコンジュゲート:合成。
siRNAへの糖質コンジュゲーション用のモノマー。
GalNAcビルディングブロックの合成。
GalNAcビルディングブロックの合成(II)。
肝標的化用のGalNAcクラスター
siRNAへのコンジュゲーション用の糖質(GalNAc)クラスター。
多価GalNAc-siRNAコンジュゲート。
5’コンジュゲーション用の糖質ビルディングブロック。
マンノースコンジュゲートのビルディングブロックの合成。
合成後の糖質コンジュゲートのビルディングブロック。
コレステロールがコンジュゲートされたsiRNAとコレステロール-(GalNAc)3がコンジュゲートされたsiRNAによる遺伝子サイレンシングの比較。
コレステロールがコンジュゲートされたsiRNAとコレステロール-(GalNAc)3がコンジュゲートされたsiRNAによる血清コレステロールレベルに対する効果の持続期間の比較。
コレステロールがコンジュゲートされたsiRNAとコレステロール-(GalNAc)3がコンジュゲートされたsiRNAによるCy3標識siRNAの取込みの比較。
コンジュゲートの設計検討の概略図。
コンジュゲートの設計の概略図。
2分岐コンジュゲートと3分岐コンジュゲート。
本発明の2つの異なるコンジュゲート。
コンジュゲートにおけるジスルフィド結合のいくつかの例示的な配置。
糖質がコンジュゲートされたsiRNAによるFVIIのインビボサイレンシング。
糖質がコンジュゲートされたsiRNAによるFVIIのインビボサイレンシング。
糖質がコンジュゲートされたsiRNAによるApoBのインビボサイレンシング。
糖質がコンジュゲートされたsiRNAによるApoBのインビボサイレンシング。
糖質がコンジュゲートされたsiRNAによるApoBのインビトロサイレンシング。
インビトロ取込み中の糖質がコンジュゲートされたsiRNAとASGRリガンドアシアロフェツイン(ASF)との競合
糖質コンジュゲートのインビトロでの受容体結合と取込み。
ガラクトースコンジュゲートとインビボ遺伝子サイレンシング。

0026

本発明は、糖質部分をiRNA剤にコンジュゲートさせることによって、iRNA剤の1つ以上の特性を最適化することができるという発見に基づいている。多くの場合、糖質部分を、iRNA剤の修飾サブユニットに結合させる。例えば、iRNA剤の1つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、別の部分、例えば、糖質リガンドが結合している非糖質(好ましくは環状)担体と置換することができる。サブユニットのリボース糖がそのように置換されているリボヌクレオチドサブユニットを、本明細書ではリボース置換修飾サブユニット(RRMS)と呼ぶ。環状担体は、炭素環系であってもよく(すなわち、環原子が全て炭素原子である)、または複素環系であってもよい(すなわち、1つ以上の環原子がヘテロ原子、例えば、窒素酸素硫黄であり得る)。環状担体は、単環系であってもよく、または2つ以上の環(例えば、融合環)を含有してもよい。環状担体は、完全飽和環系であってもよく、または1つ以上の二重結合を含有してもよい。

0027

担体にはさらに、(i)少なくとも1つの「骨格結合点」、好ましくは2つの「骨格結合点」、および(ii)少なくとも1つの「テザリング結合点」が含まれる。本明細書で使用される「骨格結合点」とは、リボ核酸骨格(例えば、リン酸骨格、または修飾リン酸骨格(例えば、硫黄含有骨格))中への担体の組込みに好適である、官能基(例えば、ヒドロキシル基)、または一般に、利用可能な結合を指す。いくつかの実施形態での「テザリング結合点」(TAP)とは、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子(骨格結合点を提供する原子とは異なる)を指す。この部分は、例えば、糖質(例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖)であることができる。任意で、選択された部分は、介在テザーによって環状担体に接続されている。したがって、環状担体は、多くの場合、別の化学的実体(例えば、構成環に対するリガンド)の組込みもしくはテザリングに好適な官能基(例えば、アミノ基)を含み、または一般に、別の化学的実体(例えば、構成環に対するリガンド)の組込みもしくはテザリングに好適な結合を提供する。

0028

一態様では、本発明は、次式CI)に示す構造を有する化合物を特色とする。



式中、
AおよびBは、それぞれ存在ごとに独立して、水素保護基、任意で置換された脂肪族、任意で置換されたアリール、任意で置換されたヘテロアリールポリエチレングリコール(PEG)、ホスフェートジホスフェートトリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエートホスホチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基ホスホロアミダイト固体担体、-P(Z1)(Z2)-O-ヌクレオシド、または-P(Z1)(Z2)-O-オリゴヌクレオチド(式中、Z1およびZ2は、それぞれ存在ごとに独立して、O、S、N(アルキル)、または任意で置換されたアルキルである)であり;
J1およびJ2は、それぞれ存在ごとに独立して、O、S、NRN、任意で置換されたアルキル、OC(O)NH、NHC(O)O、C(O)NH、NHC(O)、OC(O)、C(O)O、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(S)NH、OC(S)NH、OP(N(RP)2)O、またはOP(N(RP)2)であり;かつ
式(CI)中の担体は、環状基または非環状基であり;環状基は、ピロリジニルピラゾニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニルピペラジニル、[1,3]ジオキソランオキサゾリジニルイソキサゾリジニル、モルホニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニルピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択されることが好ましく;非環状基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択されることが好ましい。

0029

好ましい実施形態では、リガンドは、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、多糖である。

0030

一実施形態では、化合物は、次式(CII)に示すピロリン環系である。



式中、
Eは、存在しないか、またはC(O)、C(O)O、C(O)NH、C(S)、C(S)NH、SO、SO2、もしくはSO2NHであり;
R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、およびR18は、それぞれ存在ごとに独立して、H、-CH2ORa、またはORbであり、
RaおよびRbは、それぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、任意で置換されたアラルキル、任意で置換されたアルケニル、任意で置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-P(Z1)(Z2)-O-ヌクレオシド、または-P(Z1)(Z2)-O-オリゴヌクレオチド、-P(Z1)(O-リンカー-RL)-O-ヌクレオシド、または-P(Z1)(O-リンカー-RL)-O-オリゴヌクレオチドであり;
R30は、それぞれ存在ごとに独立して、-リンカー-RLまたはR31であり;
RLは、水素またはリガンドであり;
R31は、C(O)CH(N(R32)2)(CH2)hN(R32)2であり;
R32は、それぞれ存在ごとに独立して、H、-RL、-リンカー-RL、またはR31であり;
Z1は、それぞれ存在ごとに独立して、OまたはSであり;
Z2は、それぞれ存在ごとに独立して、O、S、N(アルキル)、または任意で置換されたアルキルであり;かつ
hは、それぞれ存在ごとに独立して、1〜20である。

0031

ピロリンをベースにしたクリック担体(click-carrier)については、R11が-CH2ORaでかつR3がORbであるか;またはR11が-CH2ORaでかつR9がORbであるか;またはR11が-CH2ORaでかつR17がORbであるか;またはR13が-CH2ORaでかつR11がORbであるか;またはR13が-CH2ORaでかつR15がORbであるか;またはR13が-CH2ORaでかつR17がORbである。ある実施形態では、CH2ORaおよびORbはジェミナル置換されていてもよい。4-ヒドロキシプロリンをベースにした担体については、R11が-CH2ORaでかつR17がORbである。それゆえに、ピロリンをベースにした化合物と4-ヒドロキシプロリンをベースにした化合物は、結合回転がその特定の結合に関して制限されている(例えば、環が存在することによって生じる制限がある)結合(例えば、炭素−炭素結合)を含有し得る。したがって、CH2ORaおよびORbは、上述の任意の組合せにおいて互いに対してシスであってもまたはトランスであってもよい。したがって、全てのシス/トランス異性体が明示的に含まれる。化合物は、1つ以上の不斉中心を含有する場合もあり、そのため、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマー、ならびにジアステレオマー混合物として生じる。それらの化合物のすべてのこのような異性体形態が明示的に含まれる(例えば、CH2ORaとORbを担持する中心は両方とも、R立体配置を有することができるか;両方ともS立体配置を有することができるか;または一方の中心がR立体配置を有することができかつ他方の中心がR立体配置を有することができ、また、これと逆のことが言える)。

0032

一実施形態では、R11がCH2ORaでかつR9がORbである。

0033

一実施形態では、Rbは固体担体である。

0034

一実施形態では、式(CII)の担体は、ホスホロアミダイトであり、すなわち、RaまたはRbのうちの1つが、-P(O-アルキル)N(アルキル)2、例えば、-P(OCH2CH2CN)N(i-プロピル)2である。一実施形態では、Rbは、-P(O-アルキル)N(アルキル)2である。

0035

実施形態では、化合物は、次式(CIII)に示すようなリボース環系である。



式中、
Xは、O、S、NRN、またはCRP2であり;
Bは、それぞれ存在ごとに独立して、水素、任意で置換されたされた天然または非天然のヌクレオ塩基、-リンカー-RLと結合した任意で置換されたされた天然ヌクレオ塩基または-リンカー-RLと結合した任意で置換されたされた非天然ヌクレオ塩基であり;
R1、R2、R3、R4、およびR5は、それぞれ存在ごとに独立して、H、OR6、F、N(RN)2、または-J-リンカー-RLであり;
Jは、存在しないか、O、S、NRN、OC(O)NH、NHC(O)O、C(O)NH、NHC(O)、NHSO、NHSO2、NHSO2NH、OC(O)、C(O)O、OC(O)O、NHC(O)NH、NHC(S)NH、OC(S)NH、OP(N(RP)2)O、またはOP(N(RP)2)であり;
R6は、それぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、任意で置換されたアラルキル、任意で置換されたアルケニル、任意で置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-P(Z1)(Z2)-O-ヌクレオシド、-P(Z1)(Z2)-O-オリゴヌクレオチド、-P(Z1)(Z2)-式(CIII)、-P(Z1)(O-リンカー-RL)-O-ヌクレオシド、-P(Z1)(O-リンカー-RL)-O-オリゴヌクレオチド、または-P(Z1)(O-リンカー-RL)-O-式(CIII)がであり;
RNは、それぞれ存在ごとに独立して、H、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアルケニル、任意で置換されたアルキニル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、任意で置換されたアラルキル、任意で置換されたヘテロアリール、またはアミノ保護基であり;
RPは、それぞれ存在ごとに独立して、H、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアルケニル任意で置換されたアルキニル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、または任意で置換されたヘテロアリールであり;
RLは、水素またはリガンドであり;
Z1およびZ2は、それぞれ存在ごとに独立して、O、S、N(アルキル)、または任意で置換されたアルキルであり;
ただし、RLは、少なくとも1度は存在し、さらにRLは、少なくとも1度はリガンドである。

0036

一実施形態では、式(CI)中の担体は、非環状基であり、「非環状担体」と呼ばれる。好ましい非環状担体は、下記の式(CIV)または式(CV)に示す構造を有することができる。

0037

一実施形態では、化合物は、次式(CIV)に示す構造を有する非環状担体である。



式中、
Wは、存在しないか、O、S、および N(RN)(式中、RNは、それぞれ存在ごとに独立して、H、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアルケニル、任意で置換されたアルキニル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、任意で置換されたアラルキル、任意で置換されたヘテロアリール、またはアミノ保護基である)であり;
Eは、存在しないか、またはC(O)、C(O)O、C(O)NH、C(S)、C(S)NH、SO、SO2、もしくはSO2NHであり;
RaおよびRbは、それぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、任意で置換されたアラルキル、任意で置換されたアルケニル、任意で置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-P(Z1)(Z2)-O-ヌクレオシド、-P(Z1)(Z2)-O-オリゴヌクレオチド、-P(Z1)(O-リンカー-RL)-O-ヌクレオシド、または-P(Z1)(O-リンカー-RL)-O-オリゴヌクレオチドであり;
R30は、それぞれ存在ごとに独立して、リンカー-RLまたはR31であり;
RLは、水素またはリガンドであり;
R31は、-C(O)CH(N(R32)2)(CH2)hN(R32)2であり;
R32は、それぞれ存在ごとに独立して、H、-RL、-リンカー-RL、またはR31であり;
Z1は、それぞれ存在ごとに独立して、OまたはSであり;
Z2は、それぞれ存在ごとに独立して、O、S、N(アルキル)、または任意で置換されたアルキルであり;
hは、それぞれ存在ごとに独立して、1〜20であり;かつ
r、s、およびtは、それぞれ存在ごとに独立して、0、1、2、または3である。

0038

rとsが異なる場合、第3炭素は、R配置かまたはS配置のいずれかであることができる。好ましい実施形態では、xとyは1であり、zは0である(例えば、担体はセリノールをベースにしている)。非環状担体は、任意で、例えば、ヒドロキシアルコキシパーハロアルキルで置換することができる。

0039

一実施形態では、化合物は、次式(CV)に示す構造を有する非環状担体である。



式中、
Eは、存在しないか、またはC(O)、C(O)O、C(O)NH、C(S)、C(S)NH、SO、SO2、もしくはSO2NHであり;
RaおよびRbは、それぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、任意で置換されたアルキル、任意で置換されたアリール、任意で置換されたシクロアルキル、任意で置換されたアラルキル、任意で置換されたアルケニル、任意で置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール(PEG)、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、ホスホノチオエート、ホスホノジチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-P(Z1)(Z2)-O-ヌクレオシド、-P(Z1)(Z2)-O-オリゴヌクレオチド、-P(Z1)(Z2)-式(I)、-P(Z1)(O-リンカー-RL)-O-ヌクレオシド、または-P(Z1)(O-リンカー-RL)-O-オリゴヌクレオチドであり;
R30は、それぞれ存在ごとに独立して、リンカー-RLまたはR31であり;
RLは、水素またはリガンドであり;
R31は、-C(O)CH(N(R32)2)(CH2)hN(R32)2であり;
R32は、それぞれ存在ごとに独立して、H、-RL、-リンカー-RL、またはR31であり;
Z1は、それぞれ存在ごとに独立して、OまたはSであり;
Z2は、それぞれ存在ごとに独立して、O、S、N(アルキル)、または任意で置換されたアルキルであり;
hは、それぞれ存在ごとに独立して、1〜20であり;かつ
rおよびsは、それぞれ存在ごとに独立して、0、1、2、または3である。

0040

RRMSは、本明細書に記載される環状担体に加えて、同時係属および同時所有の米国出願第10/916,185号明細書(2004年8月10日出願)、米国出願第10/946,873号明細書(2004年9月21日出願)、および米国出願第10/985,426号明細書(2004年11月9日出願)、米国出願第10/833,934号明細書(2007年8月3日出願)、米国出願第11/115,989号明細書(2005年4月27日出願)、および米国出願第11/119,533号明細書(2005年4月29日出願)に記載されている環状担体および非環状担体を含むことができ、これらの内容は各々、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。

0041

したがって、一態様では、本発明は、次式(I)に示す構造を有するモノマーを特色とする。



式中、
AおよびBは、それぞれ存在ごとに独立して、O、N(RN)、またはSであり;
RNはそれぞれ存在ごとに独立して、HまたはC1-C6アルキルであり;
XおよびYは、それぞれ存在ごとに独立して、H、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-P(Z’)(Z’’)O-ヌクレオシド、-P(Z’)(Z’’)O-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイドポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、-P(Z’)(Z’’)O-リンカー-OP(Z’’’)(Z’’’)O-オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、-P(Z’)(Z’’)-式(I)、-P(Z’)(Z’’)-、または-リンカー-Rであり;
RはLGであるかまたは以下に示す構造を有し:



LGはそれぞれ存在ごとに独立して、リガンド、例えば、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、多糖であり;
Z’、Z’’、Z’’’、およびZ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、OまたはSである。

0042

「リンカー」という用語は、化合物の2つの部分を接続する有機部分である。リンカーは、典型的には、直接的な結合、または原子、例えば、酸素もしくは窒素、単位、例えば、NR1、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH、または原子鎖、例えば、置換アルキルもしくは非置換アルキル置換アルケニルもしくは非置換アルケニル、置換アルキニルもしくは非置換アルキニル、アリールアルキルアリールアルケニルアリールアルキニルヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキルヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニルアルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール(ここで、1つ以上のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、置換アリールまたは非置換アリール置換ヘテロアリールまたは非置換ヘテロアリール置換複素環または非置換複素環によって中断または終結されることがあり;R8は、水素、アシル、脂肪族、または置換脂肪族である)を含む。一実施形態では、リンカーは、1〜24個の原子、好ましくは4〜24個の原子、好ましくは6〜18個の原子、より好ましくは8〜18個の原子、および最も好ましくは8〜16個の原子である。

0043

一実施形態では、リンカーは、-[(P-Q’’-R)q-X-(P’-Q’’’-R’)q’]q”-T-であり、
式中、
P、R、T、P’、R’、およびTは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、CH2O;NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CH=N−O、



またはヘテロシクリルであり;
Q’’およびQ’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、-(CH2)n-、-C(R1)(R2)(CH2)n-、-(CH2)nC(R1)(R2)-、-(CH2CH2O)mCH2CH2-、または-(CH2CH2O)mCH2CH2NH-であり;
Xは、存在しないかまたは切断可能な結合基であり;
Raは、Hまたはアミノ酸側鎖であり;
R1およびR2は、それぞれ存在ごとに独立して、H、CH3、OH、SH、またはN(RN)2であり;
RNは、それぞれ存在ごとに独立して、H、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルブチル、またはベンジルであり;
q、q’、およびq’’は、それぞれ存在ごとに独立して、0〜20であり、ここで、繰り返し単位は同一であっても異なっていてもよく;
nは、それぞれ存在ごとに独立して、1〜20であり;かつ
mは、それぞれ存在ごとに独立して、0〜50である。

0044

一実施形態では、リンカーは、少なくとも1つの切断可能な結合基を含む。

0045

ある実施形態では、リンカーは、分岐状リンカーである。分岐状リンカーの分岐点は、少なくとも三価であり得るが、四価五価、もしくは六価の原子、またはこのような複数の原子価を示す基であってもよい。ある実施形態では、分岐点は、-C、-CH、-C(CH2-)(CH2-)CH2-、-C(H)(CH2-)CH2-、-N、-N(Q)-C、-O-C、-S-C、-SS-C、-C(O)N(Q)-C、-OC(O)N(Q)-C、-N(Q)C(O)-C、または-N(Q)C(O)O-Cであり、式中、Qはそれぞれ存在ごとに独立して、Hまたは任意で置換アルキルである。他の実施形態では、分岐点は、グリセロールまたはグリセロール誘導体である。

0046

切断可能な結合基
切断可能な結合基とは、細胞外では十分に安定であるが、標的細胞内に入ると切断され、リンカーが結び付いている2つの部分を放出する基のことである。好ましい実施形態では、切断可能な結合基は、対象の血液中または(例えば、血液中もしくは血清中で見られる条件を模倣もしくは代表するように選択することができる)第2の参照条件下よりも少なくとも10倍以上、好ましくは少なくとも100倍以上速く、標的細胞内または(例えば、細胞内条件を模倣もしくは代表するように選択することができる)第1の参照条件下で分解される。

0047

切断可能な結合基は、切断因子(例えば、pH、レドックス電位、または分解分子の存在)の影響を受けやすい。一般に、切断因子は、血清中または血液中よりも細胞内により高いレベルまたは活性で広まるかまたは多く見られる。このような分解因子の例としては、例えば、酸化酵素もしくは還元酵素または還元剤(例えば、細胞内に存在する、レドックス切断可能な結合基を還元によって分解することができるメルカプタン)を含む、特定の基質のために選択されるかまたは基質特異性がないレドックス剤エステラーゼエンドソームまたは酸性環境を作り出すことができる薬剤(例えば、5以下のpHを生じさせる薬剤);一般酸として作用することによって、酸切断可能な結合基を加水分解または分解することができる酵素、ペプチダーゼ(基質特異的である可能性がある)、およびホスファターゼが挙げられる。

0048

切断可能な結合基(例えば、ジスルフィド結合)は、pHによる影響を受けやすい可能性がある。ヒト血清のpHは7.4であるが、平均の細胞内pHは、わずかにより低く、約7.1〜7.3の範囲である。エンドソームのpHは、より酸性で、5.5〜6.0の範囲であり、リソソームのpHは、さらにより酸性で、5.0前後である。いくつかのリンカーは、好ましいpHで切断される切断可能な結合基を有しており、その結果、カチオン性脂質を細胞内のリガンドから放出するか、または所望の細胞区画中に放出する。

0049

リンカーは、特定の酵素によって切断され得る切断可能な結合基を含むことができる。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基の種類は、標的される細胞によって決まり得る。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に結合させることができる。肝臓細胞はエステラーゼが豊富であり、それゆえに、リンカーはエステラーゼが豊富でない細胞型よりも効果的に肝臓細胞で切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、腎皮質、および精巣が挙げられる。

0050

ペプチド結合を含有するリンカーは、ペプチダーゼが豊富な細胞型(例えば、肝臓細胞および滑膜細胞)を標的とする場合に使用することができる。

0051

一般に、候補となる切断可能な結合基の好適性は、候補となる結合基を切断する分解因子(または条件)の能力試験することによって評価することができる。また、候補となる切断可能な結合基を、血液中でのまたは標的以外の他の組織と接触させたときの切断に抵抗する能力について試験することも望ましい。したがって、第1の条件と第2の条件の間の切断に対する相対的感受性を決定することができ、この場合、第1の条件は、標的細胞内での切断を示すように選択され、第2の条件は他の組織または生体液(例えば、血液もしくは血清)での切断を示すように選択される。評価は、無細胞系で、細胞で、細胞培養で、器官培養もしくは組織培養で、または動物全体で行なうことができる。無細胞条件または培養条件で最初の評価を行ない、さらなる評価によって動物全体で確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清(または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)と比較して、少なくとも2倍、4倍、10倍、または100倍速く細胞内で(または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で)切断される。

0052

レドックス切断可能な結合基
切断可能な結合基の1つのクラスは、還元または酸化によって切断されるレドックス切断可能な結合基である。還元切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基(-S-S-)である。候補となる切断可能な結合基が、好適で「還元切断可能な結合基」であるかどうか、または例えば、特定のiRNA部分および特定の標的化剤とともに使用するのに好適であるかどうかを決定するために、本明細書に記載される方法に注目することができる。例えば、候補は、ジチオスレイトール(DTT)、または細胞(例えば、標的細胞)で観察される切断の速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を用いる他の還元剤とともにインキュベートすることによって評価することができる。候補は、血液条件または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価することもできる。好ましい実施形態では、候補化合物は、血液中で最大限で10%切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液(または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)と比較して、少なくとも2倍、4倍、10倍、または100倍速く、細胞内で(または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)分解される。候補化合物の切断の速度を、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で、標準的な酵素動力学アッセイを用いて測定し、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較することができる。

0053

リン酸ベースの切断可能な結合基
リン酸ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞内のリン酸基を切断する薬剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの結合基の例は、-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-である。これらの候補は、上記の方法と類似の方法を用いて評価することができる。

0054

酸切断可能な結合基
酸切断可能な結合基とは、酸性条件下で切断される結合基のことである。好ましい実施形態では、酸切断可能な結合基は、pH約6.5以下(例えば、約6.0、5.5、5.0、またはそれ未満)の酸性環境において、または一般酸として作用することができる酵素などの薬剤によって切断される。細胞において、特定の低pHのオルガネラ(例えば、エンドソームおよびリソソーム)は、酸切断可能な結合基に対する切断環境を提供することができる。酸切断可能な結合基の例としては、ヒドラゾンエステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能な基は、一般式-C=NN-,、C(O)O、または-OC(O)を有し得る。好ましい実施形態は、エステル(アルコキシ基)の酸素に結合した炭素が、アリール基置換アルキル基、または三級アルキル基(例えば、ジメチルペンチル、もしくはt−ブチル)である場合である。これらの候補は、上記の方法と類似の方法を用いて評価することができる。

0055

エステルベースの結合基
エステルベースの切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例としては、アルキレン基、アルケニルレン基、およびアルキニレン基が挙げられるが、これらに限定されない。エステル切断可能な結合基は、一般式-C(O)O-または-OC(O)-を有する、これらの候補は、上記の方法と類似の方法を用いて評価することができる。

0056

ペプチドベースの結合基
ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基とは、アミノ酸の間で形成されてオリゴペプチド(例えば、ジペプチドトリペプチドなど)およびポリペプチドを生じさせるペプチド結合のことである。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基(-C(O)NH-)は含まれない。アミド基は、任意のアルキレンアルケニレン、またはアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じさせる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断可能基は、通常、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じさせるペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含むものではない。ペプチドベースの切断可能な結合基は一般式−NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)−(式中、RAおよびRBは、2つの隣接するアミノ酸のR基である)を有する。これらの候補は、上記の方法と類似の方法を用いて評価することができる。本明細書で使用される場合、「糖質」とは、少なくとも6個の炭素原子を有する1つ以上の単糖単位(線状、分岐状、もしくは環状であり得る)から構成され、各々の炭素原子に酸素原子窒素原子、もしくは硫黄原子が結合しているそれ自体が糖質である化合物か、または各々が少なくとも6個の炭素原子を有する1つ以上の単糖単位(線状、分岐状、もしくは環状であり得る)から構成され、各々の炭素原子に酸素原子、窒素原子、もしくは硫黄原子が結合している糖質部分をその一部として有する化合物のいずれかを指す。代表的な糖質には、糖類(単糖、二糖、三糖、および約4〜9個の単糖単位を含有するオリゴ糖)、ならびに多糖類(例えば、デンプングリコーゲンセルロース、および多糖ゴム)が含まれる。具体的な単糖には、C5以上(好ましくはC5〜C8)の糖;二糖および三糖には、2つまたは3つの単糖単位(好ましくはC5〜C8)を有する糖が含まれる。

0057

「単糖」という用語は、アロースアルトース、アラビノースクラジノースエリトロース、エリスルロース、フルクトース、D−フシトール、L−フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、D−ガラクトミニトール、N−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、N−アセチル−グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース−6−リン酸、グロースグリセルアルデヒド、L−グリセロ−D−マンノス−ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドースリキソースマンノサミン、マンノース、マンノース−6−リン酸、プシコースキノボースキノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロースセドヘプツロースソルボースタガトースタロース酒石酸トレオースキシロース、およびキシルロースの基を含む。単糖は、D体またはL体であることができる。単糖はさらに、デオキシ糖アルコールヒドロキシ基を水素に置換したもの)、アミノ糖(アルコールヒドロキシ基をアミノ基に置換したもの)、チオ糖(アルコールヒドロキシ基をチオールに置換したもの、またはC=OをC=Sに置換したもの、または環状形態の環酸素を硫黄に置換したもの)、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖(環炭素を窒素に置換したもの)、イミノ糖(環酸素を窒素に置換したもの)、ホスファノ糖(環酸素をリンに置換したもの)、ホスファ糖(環炭素をリンに置換したもの)、C−置換単糖(非末端炭素原子における水素を炭素で置換したもの)、不飽和単糖アルジトールカルボニル基をCHOH基で置換したもの)、アルドン酸アルデヒド基カルボキシ基に置換したもの)、ケトアルドン酸、ウロン酸アルダル酸などであってもよい。アミノ糖としては、アミノ単糖、好ましくは、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸ムラミン酸、ラクトースジアミンアコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミンフォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン(kansosamine)、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン(purpurosamine)、ロドサミンが挙げられる。単糖などは、さらに置換することができるということが理解される。

0058

「二糖」、「三糖」、および「多糖」という用語は、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチンアミロースアピオースアルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオースセロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチンコリトースシクロデキストリンシマロースデキストリン、2−デオキシリボース、2−デオキシグルコースジギノースジギタロースジギトキソースエバロース、エベミトロース(evemitrose)、フルクトオリゴ糖ガルトオリゴ糖(galto-oligosaccharide)、ゲンチアノース、ゲンチオビオースグルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリンイヌリン、イソレボグルコセノンイソマルトースイソマルトトリオース、イソパノースコジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β−マルトースマルトリオース、マンナン−オリゴ糖、マンニノトリオース、メレチトースメリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、ニゲロース、ノジリミシンノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオースプリベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノースサルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホローススタキオースストレプトーススクロース、α,α−トレハローストラハロサミン、ツラノースチベロースキシロビオースウンベリフェロースなどの基を含む。さらに、「二糖」、「三糖」、および「多糖」などは、さらに置換することができるということが理解される。二糖には、アミノ糖およびその誘導体、特に、C-4'位で誘導体化されたミカミノースまたはC-6'位で誘導体化された4デオキシ−3−アミノグルコースも含まれる。

0059

一実施形態では、化合物は、次式(I’)に示す構造を有する。



式中、
AおよびBは、それぞれ存在ごとに独立して、O、N(RN)、またはSであり;
XおよびYは、それぞれ存在ごとに独立して、H、保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-P(Z’)(Z’’)O-ヌクレオシド、-P(Z’)(Z’’)O-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイド、ポリマー、ヌクレオチド、ヌクレオシド、-P(Z’)(Z’’)O-R1-Q’-R2-OP(Z’’’)(Z’’’’)O-オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、-P(Z’)(Z’’)-式(I)、-P(Z’)(Z’’)-、または-Q-Rであり;
Rは、L1であるか、または次式(II)〜(V)に示す構造を有し:



q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B、およびq5Cは、それぞれ存在ごとに独立して、0〜20を表し、ここで、繰り返し単位は、同一であっても異なっていてもよく;
QおよびQ’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、-(P7-Q7-R7)p-T7-、または-T7-Q7-T7’-B-T8’-Q8-T8であり;
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、P7、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C、T7、T7’、T8、およびT8’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、またはCH2Oであり;
Bは-CH2-N(BL)-CH2-であり;
BLは-TB-QB-TB’-Rxであり;
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C、Q7、Q8、およびQBは、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンであり、ここで、1つ以上のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R’)、C≡C、またはC(O)の1つ以上で中断または終結されることがあり;
TBおよびTB’は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OC(O)、OC(O)O、NHC(O)、NHC(O)NH、NHC(O)O、CH2、CH2NH、またはCH2Oであり;
Rxは、親油性物質(例えば、コレステロール、コール酸アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオールメントール、1,3−プロパンジオールヘプタデシル基パルミチン酸ミリスチン酸、O3−(オレオイルリトコール酸、O3−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン)、ビタミン(例えば、葉酸ビタミンAビタミンEビオチンピリドキサール)、ペプチド、糖質(例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖)、エンドソーム溶解成分、ステロイド(例えば、ウバオール、ヘシゲニンジオスゲニン)、テルペン(例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニンフリーデリン、エピフリーデラノル誘導体化リトコール酸)、またはカチオン性脂質であり;
R1、R2、R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C、R7は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、



またはヘテロシクリルであり;
L1、L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B、およびL5Cは、それぞれ存在ごとに独立して、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり;
R’およびR’’は、それぞれ存在ごとに独立して、H、C1-C6アルキル、OH、SH、またはN(RN)2であり;
RNは、それぞれ存在ごとに独立して、H、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり;
Raは、Hまたはアミノ酸側鎖であり;
Z’、Z’’、Z’’’、およびZ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、OまたはSであり;
pは、それぞれ存在ごとに独立して、0〜20である。

0060

いくつかの実施形態では、式(I’)は、下記構造を有する。

0061

いくつかの実施形態では、式(I’)は、下記構造を有する。

0062

いくつかの実施形態では、式(I’)は、下記構造を有する。

0063

いくつかの実施形態では、式(I’)は、下記構造を有する。

0064

いくつかの実施形態では、式(I’)は、下記構造を有する。

0065

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0066

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0067

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0068

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0069

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0070

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0071

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0072

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0073

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0074

いくつかの好ましい実施形態では、Rは下記のものである。

0075

いくつかの好ましい実施形態では、Rは下記のものである。

0076

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。

0077

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0078

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは、下記構造を有する。

0079

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは、下記構造を有する。

0080

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは、下記構造を有する。

0081

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは、下記構造を有する。

0082

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは、下記構造を有する。

0083

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは、下記構造を有する。

0084

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0085

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0086

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0087

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0088

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0089

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0090

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0091

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0092

いくつかの実施形態では、Rは下記のものである。

0093

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。

0094

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。

0095

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。

0096

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。

0097

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。

0098

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。

0099

いくつかの好ましい実施形態では、L2AとL2Bは両方とも同じである。

0100

いくつかの実施形態では、L2AとL2Bは両方とも異なっている。

0101

いくつかの好ましい実施形態では、L3AとL3Bは両方とも同じである。

0102

いくつかの実施形態では、L3AとL3Bは両方とも異なっている。

0103

いくつかの好ましい実施形態では、L4AとL4Bは両方とも同じである。

0104

いくつかの実施形態では、L4AとL4Bは両方とも異なっている。

0105

いくつかの好ましい実施形態では、L5AとL5BとL5Cは全て同じである。

0106

いくつかの実施形態では、L5AとL5BとL5Cのうちの2つが同じである。

0107

いくつかの実施形態では、L5AとL5Bが同じである。

0108

いくつかの実施形態では、L5AとL5Cが同じである。

0109

いくつかの実施形態では、L5BとL5Cが同じである。

0110

別の態様では、本発明は、少なくとも1つの式(I)のモノマーを含むiRNA剤を特色とする。

0111

いくつかの実施形態では、iRNA剤は、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの式(I)のモノマー、より好ましくは1つ、2つ、または3つの式(I)のモノマー、より好ましくは1つまたは2つの式(I)のモノマー、一層より好ましくはわずか1つの式(I)のモノマーを含む。

0112

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは全て、二本鎖iRNA剤の同じ鎖上にある。

0113

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは、二本鎖iRNA剤の別々の鎖上にある。

0114

いくつかの実施形態では、iRNA剤中の式(I)のモノマーは全て同じである。

0115

いくつかの実施形態では、iRNA剤中の式(I)のモノマーは全て異なっている。

0116

いくつかの実施形態では、iRNA剤中の式(I)の一部のモノマーだけが同じである。

0117

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは、iRNA剤中で互いに隣接している。

0118

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは、iRNA剤中で互いに隣接していない。

0119

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは、iRNA剤の5’末端、3’末端、内部位置、3’末端と5’末端の両方、5’末端と内部位置の両方、3’末端と内部位置の両方、および3つの位置の全て(5’末端と3’末端と内部位置)にある。

0120

いくつかの好ましい実施形態では、Rxはコレステロールである。

0121

いくつかの好ましい実施形態では、Rxはリトコール酸である。

0122

いくつかの好ましい実施形態では、Rxはオレイルリトコール酸である。

0123

いくつかの好ましい実施形態では、Rxは、下記構造を有する。

0124

いくつかの好ましい実施形態では、BLは、下記構造を有する。

0125

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。

0126

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。

0127

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。

0128

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。



(式中、YはOまたはSであり、nは3〜6である)。

0129

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。



(式中、YはOまたはSであり、nは3〜6である)。

0130

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。

0131

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。



(式中、XはOまたはSである)。

0132

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。



(式中、Rは、OHまたはNHCOOHである)。

0133

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。



(式中、Rは、OHまたはNHCOOHである)。

0134

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)のモノマーは、下記式(VII)(式中、RはOまたはSである)のリンカーを介してiRNA剤に結合している。

0135

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。



(式中、Rは、OHまたはNHCOOHである)。

0136

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。

0137

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。



(式中、Rは、OHまたはNHCOOHである)。

0138

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。



(式中、Rは、OHまたはNHCOOHである)。

0139

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。



(式中、Rは、OHまたはNHCOOHである)。

0140

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)は、下記構造を有する。



(式中、Rは、OHまたはNHCOOHである)。

0141

いくつかの実施形態では、iRNA剤は式(I)のモノマーに加えて、次式(VI)に示す構造を有するモノマーを有する。



式中
X6およびY6は、それぞれ存在ごとに独立して、H、OH、ヒドロキシル保護基、リン酸基、ホスホジエステル基、活性化されたリン酸基、活性化された亜リン酸基、ホスホロアミダイト、固体担体、-P(Z’)(Z’’)O-ヌクレオシド、-P(Z’)(Z’’)O-オリゴヌクレオチド、脂質、PEG、ステロイド、ポリマー、-P(Z’)(Z’’)O-R1-Q’-R2-OP(Z’’’)(Z’’’’)O-オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド、-P(Z’)(Z’’)-式(I)もしくは-P(Z’)(Z’’)-であり;
Q6は、存在しないか、または-(P6-Q6-R6)v-T6-であり;
P6およびT6は、それぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、またはCH2Oであり;
Q6はそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、置換アルキレンであり、ここで、1つ以上のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R’)、C≡C、またはC(O)の1つ以上で中断または終結されることがあり;
R6はそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、



またはヘテロシクリルであり;
R’およびR’’は、それぞれ存在ごとに独立して、H、C1-C6アルキル、OH、SH、またはN(RN)2であり;
RNは、それぞれ存在ごとに独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり;
Raは、Hまたはアミノ酸側鎖であり;
Z’、Z’’、Z’’’、およびZ’’’’は、それぞれ存在ごとに独立して、OまたはSであり;
vは、それぞれ存在ごとに独立して、0〜20を表し;
RLは、親油性物質(例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3−(オレオイル)リトコール酸、O3−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン)、ビタミン(例えば、葉酸、ビタミンA、ビオチン、ピリドキサール)、ペプチド、糖質(例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖)、エンドソーム溶解成分、ステロイド(例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン)、テルペン(例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸)、またはカチオン性脂質である。

0142

いくつかの実施形態では、1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ)の式(I)のモノマーに加えて、1つ以上(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ)の式(VI)のモノマーがiRNA剤中に存在する。

0143

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)のモノマー1つと式(VI)のモノマー1つだけがiRNA剤中に存在する。

0144

いくつかの実施形態では、RLはコレステロールである。

0145

いくつかの実施形態では、RLはリトコール酸である。

0146

いくつかの実施形態では、RLはオレイルリトコール酸である。

0147

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは、式(VI)のモノマーと共有結合している。

0148

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)のモノマーは、リン酸結合、例えば、ホスホジエステル結合ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合を介して、式(VI)のモノマーと結合している。

0149

いくつかの好ましい実施形態では、式(I)のモノマーは、式(VI)のモノマーを介してiRNA剤に結合している。

0150

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーは、iRNA剤と式(VI)のモノマーの間に介在している。

0151

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーと式(II)のモノマーは、互いに直接結合している。

0152

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーと式(II)のモノマーは、互いに直接結合していない。

0153

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーと式(IV)のモノマーは、二本鎖iRNA剤の別々の鎖上にある。

0154

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーと式(IV)のモノマーは、iRNA剤の反対の末端にある。

0155

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーと式(IV)のモノマーは、iRNA剤の同じ末端にある。

0156

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーまたは式(IV)のモノマーの一方がiRNA剤の内部位置にあると同時に、もう一方がiRNA剤の末端位置にある。

0157

いくつかの実施形態では、式(I)のモノマーと式(IV)のモノマーは両方とも、iRNA剤の内部位置にある。

0158

いくつかの好ましい実施形態では、式(IV)のモノマーは、下記構造を有する。

0159

いくつかの実施形態では、本発明のiRNA剤は、












からなる群から選択され、
式中、リガンドはPK調節物質であり、X=OまたはSであり、Y=OまたはSであり、PEGは、分子量(MW)200〜100,000の、w-OH PEG、w-アミノPEG、ω-メトキシPEG、ω-SH PEG、ω-プロパルギルPEG、ω-アジドPEG、およびω-リガンドPEGである。

0160

エンドソーム溶解成分
二重層膜を容易には横断することができない、巨大分子薬物および親水性薬物分子については、細胞のエンドソーム/リソソーム区画閉じ込められることが、これらの薬物および薬物分子の作用部位に効果的に送達する上での最大の障害であると考えられる。近年、この問題に対処するために、多くの手法や戦略が工夫されてきた。リポソーム製剤については、融合性脂質を製剤中に使用することが最も一般的な手法となっている(Singh,R.S.,Goncalves,C.ら(2004). On the Gene Delivery Efficacies of pH-Sensitive Cationic Lipidsvia Endosomal Protonation. A Chemical Biology Investigation. Chem.Biol.11,713-723.)。プロトン化および/またはpH誘導性立体構造変化を通じてpH感受性のエンドソーム溶解活性を示す他の成分には、荷電したポリマーおよびペプチドが含まれる。Hoffman,A.S.,Stayton,P.S.ら(2002). Design of "smart" polymers that can direct intracellular drug delivery. Polymers Adv.Technol.13,992-999;Kakudo,Chaki,T.,S.ら(2004). Transferrin-Modified Liposomes Equipped with a pH-Sensitive Fusogenic Peptide:An Artificial Viral-like Delivery System. Biochemistry 436,5618-5628;Yessine,M.A.およびLeroux,J.C.(2004). Membrane-destabilizing polyanions:interaction with lipid bilayers and endosomal escape of biomacromolecules. Adv. Drug Deliv.Rev.56,999-1021;Oliveira,S.,van Rooy,I.ら(2007). Fusogenic peptides enhance endosomal escape improving siRNA-induced silencing of oncogenes. Int.J.Pharm.331,211-4に例を見出すことができる。これらは、リポソームまたはリポプレックス(lipoplex)などの、薬物送達系との関連で一般に使用されている。リポソーム製剤を用いる、葉酸受容体を介する送達については、例えば、pH感受性の融合性ペプチドがリポソームに組み入れられ、取込みの過程での薬物の放出を改善することによって活性を増強することが示されている(Turk,M.J.,Reddy,J.A.ら(2002). Characterization of a novel pH-sensitive peptide that enhances drug release from folate-targeted liposomes at endosomal pHs. Biochim.Biophys.Acta 1559,56-68)。

0161

ある実施形態では、本発明のエンドソーム溶解成分は、pH依存的な膜活性および/または融合性を示すポリカチオン性のペプチドまたはペプチド模倣体であってもよい。ペプチド模倣体は、ペプチドを模倣するよう設計された、タンパク質様の小さい鎖であり得る。ペプチド模倣体は、分子の特性を変化させるために既存のペプチドを修飾すること、または通常とは異なるアミノ酸もしくはその類似体を用いてペプチド様の分子を合成することによって生じ得る。ある実施形態では、これらは、ペプチドと比較して、安定性および/または生物学的活性が向上している。ある実施形態では、エンドソーム溶解成分は、エンドソームpH(例えばpH5〜6)で活性のある立体構造をとる。「活性のある」立体構造とは、エンドソーム溶解成分が、エンドソームの溶解および/または本発明のモジュラー組成物、もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体構造のことである。

0162

化合物のライブラリーについては、溶血アッセイを用いて、中性pHと比べたエンドソームpHでのそれらの示差的な膜活性についてスクリーニングしてもよい。この方法で単離される見込みのある候補は、本発明のモジュラー組成物の成分として使用し得る。本発明の組成物および方法で使用されるエンドソーム溶解成分を同定するための方法は、化合物のライブラリーを提供する工程;血液細胞をライブラリーのメンバーと接触させる工程、ここで、接触が起こる培地のpHは制御される;これらの化合物が中性pH(例えば、約pH7〜8)と比べて低いpH(例えば、約pH5〜6)で血液細胞の示差溶解を誘導するかどうかを決定する工程を含み得る。

0163

例示的なエンドソーム溶解成分としては、GALAペプチド(Subbaraoら,Biochemistry,1987,26:2964-2972)、EALAペプチド(Vogelら,J.Am.Chem.Soc.,1996,118:1581-1586)、およびこれらの誘導体(Turkら,Biochem.Biophys.Acta,2002,1559:56-68)が挙げられる。ある実施形態では、エンドソーム溶解成分は、pHの変化に応答して電荷またはプロトン化が変化する化学基(例えば、アミノ酸)を含有してもよい。エンドソーム溶解成分は、線状または分岐状であってもよい。エンドソーム溶解成分の例示的な一次配列としては、H2N-(AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC)-CO2H;H2N-(AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC)-CO2H;およびH2N-(ALEALAEALEALAEA)-CONH2が挙げられる。

0164

ある実施形態では、2つ以上のエンドソーム溶解成分を本発明のiRNA剤に組み入れてもよい。いくつかの実施形態では、これは、式(I)のモノマーに加えて、2つ以上の同じエンドソーム溶解成分をiRNA剤に組み入れることを伴う。他の実施形態では、これは、式(I)のモノマーに加えて、2つ以上の異なるエンドソーム溶解成分をiRNA剤に組み入れることを伴う。

0165

これらのエンドソーム溶解成分は、例えば、エンドソームpHで立体構造を変化させることによって、エンドソームからの脱出を仲介し得る。ある実施形態では、エンドソーム溶解成分は、中性pHでランダムコイル立体構造をとって存在し、エンドソームpHで両親媒性ヘリックスへと再編成し得る。この立体構造転移の結果として、これらのペプチドがエンドソームの脂質膜に挿入し、エンドソームの内容物を細胞質へと漏れ出させ得る。立体構造転移はpH依存的であるので、エンドソーム溶解成分は、血液中(pH約7.4)を循環する間、ほとんどまたは全く融合活性を示すことができない。融合活性は、エンドソーム溶解成分による脂質膜の破壊を引き起こす活性と定義される。融合活性の一例は、エンドソーム溶解成分によるエンドソーム膜の破壊であり、これは、エンドソームの溶解、または本発明のモジュラー組成物(例えば核酸)の1つ以上の成分のエンドソームから細胞質への漏出および輸送をもたらす。

0166

本明細書に記載される溶血アッセイに加えて、好適なエンドソーム溶解成分は、当業者により、他の方法を用いて試験および同定することができる。例えば、pH環境に応答する(例えば、pH環境によって電荷を変化させる)化合物の能力を、常法によって(例えば、細胞アッセイで)試験することができる。ある実施形態では、試験化合物を、細胞と混合するかまたは細胞と接触させ、例えば、エンドサイトーシスによって、細胞に試験化合物を取り込ませる。その後、接触させた細胞からエンドソーム調製物を作製し、このエンドソーム調製物を対照細胞からのエンドソーム調製物と比較することができる。対照細胞と比べた、接触させた細胞由来のエンドソーム画分の変化(例えば、減少)は、試験化合物が融合剤として機能することができることを示す。あるいは、接触させた細胞と対照細胞を、例えば、顕微鏡法(例えば、光学顕微鏡法または電子顕微鏡法)で評価して、細胞内のエンドソーム集団の違いを決定することができる。試験化合物および/またはエンドソームを標識して、例えば、エンドソームの漏出を定量化することができる。

0167

別のタイプのアッセイでは、本明細書に記載されるiRNA剤を、1つ以上の試験融合剤または推定融合剤を用いて構築する。iRNA剤は、可視化しやすいように標識することができる。ひとたびiRNA剤が細胞に取り込まれた際の、エンドソームからの脱出を促進するエンドソーム溶解成分の能力を、エンドソーム調製物の調製によって、または細胞の細胞質中の標識iRNA剤を可視化することができる顕微鏡技術によって評価することできる。ある他の実施形態では、遺伝子発現の阻害、または任意の他の生理的パラメータを、エンドソーム脱出の代用マーカーとして使用してもよい。

0168

他の実施形態では、円偏光二色性分光法を用いて、pH依存的な構造転移を示す化合物を同定することができる。

0169

ステップアセイを実施することもできる。この2ステップアッセイにおいては、第1のアッセイで、試験化合物だけでpHの変化に応答する能力を評価し、第2のアッセイで、試験化合物を含むモジュラー組成物がpHの変化に応答する能力を評価する。

0170

ペプチド
本発明とともに使用するのに好適なペプチドは、天然ペプチド(例えば、tatペプチドまたはアンテナペディアペプチド)、合成ペプチド、またはペプチド模倣体であることができる。さらに、ペプチドは、修飾ペプチドであることができ、例えば、ペプチドは、非ペプチド結合またはペプチド結合、およびD−アミノ酸を含むこともできる。ペプチド模倣体(本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる)は、天然ペプチドと同様の明確な3次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のオリゴヌクレオチドへの結合は、例えば、細胞による認識および吸収を高めることによって、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的分布に影響を及ぼし得る。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分の長さは、約5〜50アミノ酸、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50アミノ酸であることができる(例えば、表1参照)。

0171

ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチドカチオン性ペプチド両親媒性ペプチド、または(例えば、主にTyr、Trp、もしくはPheからなる)疎水性ペプチドであることができる。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束されたペプチド、または架橋されたペプチドであることができる。別の代替において、ペプチド部分は、疎水性の膜転位配列(MTS)を含むことができる。例示的な疎水性MTS含有ペプチドは、アミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAPを有するRFGFである。疎水性MTSを含有するRFGF類似体(例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAP)をも標的化部分であることができる。ペプチド部分は、細胞膜を横断して、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子運ぶことができる、「送達」ペプチドであることができる。例えば、HIVTatタンパク質由来の配列(GRKKRRQRRRPPQ)およびショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質(RQKIWFQNRRMKWKK)由来の配列は、送達ペプチドとして機能することができることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、または1ビーズ1化合物(OBOC)コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドなどの、DNAのランダムな配列によってコードされることができる(Lamら,Nature,354:82-84,1991)。脂質に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸(RGD)ペプチド、またはRGD模倣体などの細胞標的化ペプチドであることが好ましい。ペプチド部分の長さは、約5アミノ酸〜約30アミノ酸の範囲であることができる。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体構造特性を増大させるための、構造的修飾を有することができる。下記のうちの任意の構造的修飾を利用することができる。

0172

RGDペプチド部分は、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる(Zitzmannら,Cancer Res.,62:5139-43,2002)。RGDペプチドは、肺、腎臓脾臓、または肝臓を含む、種々の組織の腫瘍への標的化を促進することができる(Aokiら,Cancer Gene Therapy 8:783-787,2001)。RGDペプチドは、脂質粒子の腎臓への標的化を促進することが好ましい。RGDペプチドは、線状または環状であることができ、かつ修飾する(例えば、特定の組織への標的化を促進するためにグリコシル化またはメチル化する)ことができる。例えば、グリコシル化されたRGDペプチドは、αvβ3を発現する腫瘍細胞を標的とすることができる(Haubnerら,Jour.Nucl.Med.,42:326-336,2001)。

0173

増殖細胞濃縮されているマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、RGDを含有するペプチドおよびペプチド模倣体は、癌細胞、特に、Ivν3インテグリン提示する細胞を標的とすることができる。このように、RGDペプチド、RGDを含有する環状ペプチド、D−アミノ酸を含むRGDペプチド、および合成RGD模倣体を使用することができる。RGDに加えて、Iv−ν3インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管新生を制御するために使用することができる。

0174

「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞(例えば、細菌細胞または真菌細胞)、または哺乳類細胞(例えば、ヒト細胞)を透過することができる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α−ヘリックス線状ペプチド(例えば、LL-37もしくはセロピンP1)、ジスルフィド結合含有ペプチド(例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシン、もしくはバクテネシン)、またはわずか1種または2種のアミノ酸を主に含有するペプチド(例えば、PR-39もしくはインドリシジン)であることができる。細胞透過ペプチドは、核局在化シグナルNLS)を含むこともできる。例えば、細胞透過ペプチドは、HIV−1 gp41の融合ペプチドドメインSV40ラージT抗原のNLSとに由来するMPGなどの、2つの部分からなる両親媒性ペプチドであることができる(Simeoniら,Nucl.AcidsRes.31:2717-2724,2003))。

0175

iRNA剤
iRNA剤は、標的遺伝子と十分に相同な領域を含み、かつヌクレオチドに関して、iRNA剤またはその断片が標的遺伝子の下方調節を仲介することができるほどの十分な長さであるべきである。(説明しやすくするために、本明細書では、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドという用語を、RNA剤の1つ以上のモノマーサブユニットに関して使用する場合がある。本明細書での「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の用法は、修飾RNAまたはヌクレオチド代用物の場合、修飾ヌクレオチド、または1つ以上の位置での代用物置換部分も示すことができるということが理解されよう。)したがって、iRNA剤は、標的RNAに対して少なくとも部分的に、およびいくつかの実施形態では、完全に、相補的な領域であるか、またはこのような領域を含む。iRNA剤と標的の間に完全な相補性がある必要はないが、対応性は、iRNA剤、またはその切断産物が、例えば、標的RNA(例えば、mRNA)のRNAi切断によって、配列特異的なサイレンシングを導くことが可能となる程度に十分でなければならない。相補性、すなわち、標的鎖との相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。多くの場合、特にアンチセンス鎖における完全な相補性が所望されるものの、いくつかの実施形態は、特にアンチセンス鎖において、(標的RNAに対して)1つ以上の、または例えば、6つ、5つ、4つ、3つ、2つ、もしくはそれより少ないミスマッチを含むことができる。特にアンチセンス鎖におけるミスマッチは、末端領域で最も許容され、かつ、存在する場合は、末端領域(単数または複数)において、例えば、5’末端および/または3’末端から6、5、4、または3ヌクレオチド以内であり得る。センス鎖に要求されるのは、分子の全体的な二本鎖の性質を維持するためにアンチセンス鎖と十分に相補的であることのみである。

0176

本明細書の他の箇所で論じられるように、およびその全体が参照により組み入れられる文献において、iRNA剤は、多くの場合、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を含む。iRNA剤の一本鎖領域は、多くの場合、修飾されているか、またはヌクレオシド代用物を含み、例えば、不対領域またはヘアピン構造の領域(例えば、2つの相補的な領域を繋ぐ領域)は、修飾またはヌクレオシド代用物を有することができる。例えば、エキソヌクレアーゼに対して、iRNA剤の1つ以上の3'末端または5'末端を安定化する修飾またはアンチセンスsiRNA剤がRISCに入るように有利に働く修飾も想定される。修飾は、C3(またはC6、C7、C12)アミノリンカーチオールリンカーカルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー(C3、C6、C7、C12、無塩基、トリエチレングリコールヘキサエチレングリコール)、特別なビオチン試薬またはフルオレセイン試薬(これらは、ホスホロアミダイトとして生じ、RNA合成の間に複数のカップリングが行なえるように、DM保護ヒドロキシル基を別に有する)を含むことができる。

0177

iRNA剤としては次のようなものが挙げられる:インターフェロン応答を誘発するのに十分な長さの分子(これらは、Dicer(Bernsteinら,2001.Nature,409:363-366)によって切断され、RISC(RNA誘導サイレンシング複合体)内に入ることができる);およびインターフェロン応答を誘発しない程度に十分に短い分子(これらの分子もDicerによって切断され、かつ/またはRISC内に入ることができる)、例えば、RISC内に入ることができる大きさの分子(例えば、Dicer切断産物に類似した分子)。インターフェロン応答を誘発しない程度に十分に短い分子を、本明細書では、「siRNA剤またはより短いiRNA剤」と呼ぶ。本明細書で使用される「siRNA剤またはより短いiRNA剤」とは、例えば、ヒト細胞内で有害なインターフェロン応答を誘導しないぐらい十分に短い、例えば、60、50、40、または30ヌクレオチド対未満の二重鎖領域を有するRNA剤(例えば、二本鎖RNA剤または一本鎖剤)を指す。siRNA剤、またはその切断産物は、例えば、標的RNAに対してRNAiを誘導することによって、標的遺伝子を下方調節することができ、この場合、標的は内在性の標的RNAまたは病原体の標的RNAを含み得る。

0178

siRNA剤の各鎖の長さは、30、25、24、23、22、21、または20ヌクレオチド以下であることができる。鎖の長さは、少なくとも19であってもよい。例えば、各鎖の長さは、21〜25ヌクレオチドであることができる。siRNA剤は、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチド対の二重鎖領域、および1つ以上の突出、または1つもしくは2つの、2〜3ヌクレオチドの3'突出を有してもよい。

0179

標的RNAに対する相同性および標的遺伝子を下方調節する能力に加え、iRNA剤は、以下の特性のうちの1つ以上を有してもよい:
(1)iRNA剤は、下記のRNA剤の項で示される式VII、VIII、IX、またはXのものであり得る;
(2)一本鎖の場合、iRNA剤は、1つ以上のリン酸基または1つ以上のリン酸基の類似体を含む5’修飾を有し得る;
(3)極めて多くの数の、または全ての、ヌクレオシドに対してさえ修飾がなされているにもかかわらず、iRNA剤は、正確な塩基対の形成、および例えば、標的RNAの切断によって、標的の下方調節を可能にするのに十分な、相同な標的RNAとの二重鎖構造の形成が可能であるように適切な3次元構造で塩基(または修飾塩基)を提示することができるアンチセンス鎖を有し得る;
(4)極めて多くの数の、または全ての、ヌクレオシドに対してさえ修飾がなされているにもかかわらず、iRNA剤は、「RNA様」特性をなお有し得る。すなわち、iRNA剤は、リボヌクレオチドベースの内容物だけに限られないか、またはリボヌクレオチドベースの内容物が一部ですらあるとしても、RNA分子の全体的な構造的特性、化学的特性、および物理的特性を有し得る。例えば、iRNA剤は、例えば、全てのヌクレオチド糖が、例えば、2’ヒドロキシルの代わりに2’フルオロを含有するセンス鎖および/またはアンチセンス鎖を含有することができる。このデオキシリボヌクレオチド含有剤はなおRNA様特性を示すことが期待され得る。理論に束縛されることを望まないが、電気陰性フッ素は、リボースのC2’位に結合する場合、軸配向好む。フッ素のこの空間的優先傾向は、糖にC3’エンドパッカー(endo pucker)を取ることを強制することできる。これは、RNA分子に観察されるのと同じパッカリング様式であり、RNAに特徴的なAファミリーヘリックスを生じる。さらに、フッ素は、良好な水素結合受容体であるため、RNA構造を安定化することが知られている水分子と同じ水素結合相互作用参与することができる。2’糖位置の修飾部分は、デオキシリボヌクレオチドのH部分よりもリボヌクレオチドのOH部分に特徴的であるH結合に入ることが可能である。特定のiRNA剤は、糖の全部、または少なくとも50、75、80、85、90、もしくは95%にC3’エンドパッカーを示すか、RNAに特徴的なAファミリー型ヘリックスを生じることができるくらい十分な量の糖にC3’エンドパッカーを示すか、C3’エンドパッカー構造でない糖を約20個、10個、5個、4個、3個、2個、または1個しか持たない。修飾の性質にかかわらず、およびRNA剤が、特に、突出または他の一本鎖領域にデオキシヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドを含有し得るが、DNA分子、または分子中のヌクレオチドの50、60、もしくは70%よりも多く、もしくは二重鎖領域中のヌクレオチドの50、60、もしくは70%よりも多くがデオキシリボヌクレオチドである任意の分子、または2’位がデオキシである修飾デオキシリボヌクレオチドは、RNA剤の定義から除外されることは確実である。

0180

本明細書で使用される「一本鎖iRNA剤」とは、単一分子から構成されたiRNA剤のことである。一本鎖iRNA剤は、鎖内対形成によって形成される二重鎖領域を含んでもよく、例えば、一本鎖iRNA剤は、ヘアピン構造もしくはパンハンドル(pan handle)構造であるか、またはヘアピン構造もしくはパンハンドル構造を含み得る。一本鎖iRNA剤は、標的分子に関してアンチセンスであってもよい。ある実施形態では、一本鎖iRNA剤は、5’リン酸化されているか、または5’プライム末端にホスホリル類似体を含む。5’-リン酸修飾には、RISCを介した遺伝子サイレンシングと適合可能なものが含まれる。好適な修飾としては、5’モノホスフェート((HO)2(O)P−O−5’);5’ジホスフェート((HO)2(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’トリホスフェート((HO)2(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’−グアノシンキャップ(7−メチル化または非メチル化)(7m−G−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’−アデノシンキャップ(Appp)、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造(N−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’モノチオホスフェート(ホスホロチオエート;(HO)2(S)P−O−5’);5’モノジチオホスフェート(ホスホロジチオエート;(HO)(HS)(S)P−O−5’)、5’−ホスホロチオレート((HO)2(O)P−S−5’);酸素/硫黄置換モノホスフェート、ジホスフェート、およびトリホスフェートの任意のさらなる組合せ(例えば、5’−α−チオトリホスフェート、5’−γ−チオトリホスフェートなど)、5’−ホスホロアデート((HO)2(O)P−NH−5’、(HO)(NH2)(O)P−O−5’)、5’−アルキルホスホネート(R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、RP(OH)(O)−O−5’、(OH)2(O)P−5’−CH2)、5’−アルキルエーテルホスホネート(R=アルキルエーテル=メトキシメチル(MeOCH2−)、エトキシメチルなど、例えば、RP(OH)(O)−O−5’)が挙げられる(これらの修飾は、二本鎖iRNAのアンチセンス鎖に関しても使用することができる)。

0181

一本鎖iRNA剤は、RISC複合体に入り、RISCを介した標的mRNAの切断に関与することができるぐらい十分に長くてもよい。一本鎖iRNA剤の長さは、少なくとも14ヌクレオチド、および他の実施形態では、少なくとも15、20、25、29、35、40、または50ヌクレオチドである。ある実施形態では、一本鎖iRNA剤の長さは、200、100、または60ヌクレオチド未満である。

0182

ヘアピンiRNA剤は、17、18、19、29、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチド対に等しいか、または少なくとも17、18、19、29、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチド対の二重鎖領域を有する。二重鎖領域の長さは、200、100、または50以下である。ある実施形態では、二重鎖領域の範囲の長さは、15〜30、17〜23、19〜23、および19〜21ヌクレオチド対である。ヘアピンは、いくつかの実施形態では、3’に、また、ある実施形態では、ヘアピンのアンチセンス側に、一本鎖突出または末端不対領域を有してもよい。いくつかの実施形態では、突出の長さは、2〜3ヌクレオチドである。

0183

本明細書で使用される「二本鎖(ds)iRNA剤」とは、鎖間ハイブリダイゼーションによって二重鎖構造の領域が形成され得る、2つ以上の、場合によっては2つの、鎖を含むiRNA剤である。

0184

二本鎖iRNA剤のアンチセンス鎖の長さは、14、15、16、17、18、19、25、29、40、もしくは60ヌクレオチドに等しくてもよく、または少なくとも14、15、16、17、18、19、25、29、40、もしくは60ヌクレオチドであってもよい。二本鎖iRNA剤のアンチセンス鎖の長さは、200、100、または50ヌクレオチド以下であってもよい。範囲の長さは、17〜25、19〜23、および19〜21ヌクレオチドであってもよい。

0185

二本鎖iRNA剤のセンス鎖の長さは、14、15、16、17、18、19、25、29、40、もしくは60ヌクレオチドに等しくてもよく、または少なくとも14、15、16、17、18、19、25、29、40、もしくは60ヌクレオチドであってもよい。二本鎖iRNA剤のセンス鎖の長さは、200、100、または50ヌクレオチド以下であってもよい。範囲の長さは、17〜25、19〜23、および19〜21ヌクレオチドであってもよい。

0186

二本鎖iRNA剤の二本鎖部分の長さは、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40、もしくは60ヌクレオチド対に等しくてもよく、または少なくとも14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40、もしくは60ヌクレオチド対であってもよい。二本鎖iRNA剤の二本鎖部分の長さは、200、100、または50ヌクレオチド対以下であってもよい。範囲の長さは、15〜30、17〜23、19〜23、および19〜21ヌクレオチド対であってもよい。

0187

多くの実施形態では、dsiRNA剤は、内在性分子によって(例えば、Dicerによって)切断されて、より小さいds iRNA剤(例えば、siRNA剤)を産生することができるくらいに十分大きい。

0188

二本鎖iRNA剤のアンチセンス鎖とセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましい場合がある。センス鎖とアンチセンス鎖は、同じ修飾または同じ部類の修飾を有することもあれば、異なる修飾を有することもあり、例えば、場合によっては、センス鎖のみを修飾することが望ましい場合がある。例えば、センス鎖を不活性化するために、センス鎖のみを修飾することが望ましい場合があり、例えば、センス鎖を不活性化して、活性のあるsiRNA/タンパク質またはRISCの形成を妨げるために、センス鎖を修飾することができる。これは、センス鎖の5’−リン酸化を妨げる修飾によって(例えば、5’−O−メチルリボヌクレオチドを用いる修飾によって)遂行することができる(Nykanenら(2001)ATPrequirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway.Cell 107,309-321参照)。例えば、単に5'-OHをO−MeではなくHによって置換することなどの、リン酸化を妨げる他の修飾も使用することもできる。あるいは、大きな嵩高い基を5’−ホスフェートに付加して、ホスホジエステル結合に変えてもよいが、ホスホジエステラーゼがこのような結合を切断して、機能的なsiRNAの5’−末端を放出し得るので、これはあまり望ましくない可能性がある。アンチセンス鎖修飾には、5’リン酸化、および本明細書で論じられる任意の他の5’修飾、特に、一本鎖iRNA分子に関する節において上で論じられた5’修飾が含まれる。

0189

dsiRNA剤が、分子の一方または両方の末端で一本鎖領域または不対領域を含むように、センス鎖とアンチセンス鎖を選択し得る。したがって、ds iRNA剤は、突出、例えば、1つもしくは2つの5’突出もしくは3’突出、または2〜3ヌクレオチドの3’突出を含有するように対形成した、センス鎖とアンチセンス鎖を含有し得る。多くの実施形態は、3’突出を有する。あるsiRNA剤は、一本鎖突出を有し、いくつかの実施形態では、各末端に1ヌクレオチドまたは2ヌクレオチドまたは3ヌクレオチドの長さの3’突出を有する。突出は、一方の鎖が他方の鎖よりも長いこと、または同じ長さの2つの鎖がジグザグ状なっていることの結果として生じ得る。5’末端はリン酸化されていてもよい。

0190

いくつかの実施形態では、二重鎖領域の長さは、例えば、上で論じられたsiRNA剤の範囲において、15〜30ヌクレオチド長、または18、19、20、21、22、および23ヌクレオチド長である。siRNA剤は、天然のDicerによって長いdsiRNAからプロセッシングされた産物と長さおよび構造が類似していることがあり得る。siRNA剤の2つの鎖が結合(例えば、共有結合)している実施形態も含まれる。ヘアピン、または所要の二本鎖領域、および3’突出を与える他の一本鎖構造も本発明の範囲内にある。

0191

dsiRNA剤およびsiRNA剤を含む、本明細書に記載される単離されたiRNA剤は、標的RNA、例えば、mRNA(例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物)のサイレンシングを仲介することができる。便宜上、このようなmRNAを、本明細書では、サイレンシングされるmRNAとも呼ぶ。このような遺伝子を標的遺伝子とも呼ぶ。一般に、サイレンシングされるRNAは、内在性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、mRNA以外のRNA(例えば、tRNA)、およびウイルスRNAを標的とすることもできる。

0192

本明細書で使用される場合、「RNAiを仲介する」という語句は、配列特異的な様式で、標的RNAをサイレンシングする能力を指す。理論に束縛されることを望まないが、サイレンシングでは、RNAiの機構またはプロセスおよびガイドRNA(例えば、21〜23ヌクレオチドのsiRNA剤)が使用されると考えられている。

0193

本明細書で使用される場合、「特異的にハイブリダイズ可能な」または「相補的な」は、本発明の化合物と標的RNA分子の間で安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。特異的結合には、特異的結合が所望される条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合には、生理的条件下で、またはインビトロアッセイの場合には、そのアッセイが行なわれる条件下で、非標的配列に対するオリゴマー化合物非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性が必要とされる。非標的配列は、典型的には、少なくとも5ヌクレオチド異なっている。

0194

一実施形態では、iRNA剤は、iRNA剤が標的mRNAによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングするように、標的RNA、例えば、標的mRNAに「十分に相補的」である。別の実施形態では、iRNA剤は、標的RNAに「厳密に相補的」であり、例えば、標的RNAとiRNA剤は、例えば、厳密に相補的な領域でワトソン−クリック塩基対のみからできたハイブリッドを形成するようにアニールする。「十分に相補的な」標的RNAは、標的RNAに厳密に相補的な(例えば、少なくとも10ヌクレオチドの)内部領域を含むことができる。さらに、いくつかの実施形態では、iRNA剤は、単一ヌクレオチドの相違を特異的に区別することができる。この場合、iRNA剤は、厳密な相補性が、単一ヌクレオチドの違いがある(例えば、7ヌクレオチド以内の)領域に見られる場合のみにRNAiを仲介する。

0195

本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、100、200、300、または400ヌクレオチド未満の長さの核酸分子(RNAまたはDNA)を指す。

0196

本明細書で論じられるRNA剤は、未修飾のRNA、ならびに、例えば、効力を改善するために修飾されたRNA、およびヌクレオシド代用物のポリマーを含む。未修飾のRNAとは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天然に存在する、例えば、ヒトの体内に天然に存在するのと同じかまたは本質的に同じである分子を指す。当技術分野では、稀であるかまたは通常とは異なるが、天然に存在するRNAを修飾RNAと呼ぶことが多く、例えば、Limbachら (1994) Summary:the modified nucleosides of RNA,Nucleic AcidsRes.22:2183−2196を参照されたい。(典型的には転写後修飾の結果であることが明白なので)修飾RNAと呼ばれることが多い、このような稀であるかまたは通常とは異なるRNAは、本明細書で使用される「未修飾のRNA」という用語の範囲内にある。修飾RNAは、1つ以上の核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天然に存在するものと異なる、例えば、ヒトの体内に存在するものと異なる分子を指す。これらは修飾「RNA」と呼ばれるが、当然、修飾されているのでRNAではない分子を含むことになる。ヌクレオシド代用物とは、リボリン酸骨格が非リボリン酸構築物で置換されている分子のことであり、この非リボリン酸構築物は、ハイブリダイゼーションが、リボリン酸骨格の場合に見られるのと実質的に同様(例えば、リボリン酸骨格の非荷電模倣物)であるように、塩基が正しい空間的関係性で提示されることを可能にする。上記の全ての例が本明細書で論じられる。

0197

以下の考察の大部分は、一本鎖分子について言及するものである。本発明の多くの実施形態では、二本鎖iRNA剤(例えば、部分的二本鎖iRNA剤)が想定されている。したがって、以下に記載される一本鎖構造からできた二本鎖構造(例えば、2つの別々の分子が接触して二本鎖領域を形成している場合、または分子内対形成によって二本鎖領域が形成されている場合(例えば、ヘアピン構造))は、本発明の範囲内にある。長さについては、本明細書の他の箇所で記載されている。

0198

核酸はサブユニットのポリマーであるので、以下に記載される修飾の多く(例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Oの修飾)は、核酸内で繰り返される位置で生じる。修飾が核酸中のこれらの位置全てで生じる場合もあるが、多くの場合、そうではない。例として、修飾は、3’末端位置または5’末端位置でのみで生じ得、末端領域で、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でまたは鎖の最後の2、3、4、5、もしくは10ヌクレオチドでのみ生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその両方で生じ得る。修飾は、RNAの二本鎖領域でのみ生じ得るか、またはRNAの一本鎖領域でのみ生じ得る。例えば、非結合O位置でのホスホロチオエート修飾は、一方もしくは両方の末端で生じ得るか、末端領域で、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でもしくは鎖の最後の2、3、4、5、もしくは10ヌクレオチドでのみ生じ得るか、または二本鎖領域と一本鎖領域において、特に末端で生じ得る。5’末端(単数または複数)をリン酸化することができる。

0199

いくつかの実施形態では、例えば、安定性を高めるために、突出に特定の塩基を含めるか、または一本鎖突出(例えば、5’突出もしくは3’突出、もしくはその両方)に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが可能である。例えば、突出にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいことがある。いくつかの実施形態では、3’突出または5’突出中の塩基の全てまたはいくつかを、例えば、本明細書に記載される修飾を用いて、修飾する。修飾には、例えば、リボース糖の2’OH基での修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりとしてのデオキシリボヌクレオチド(例えば、デオキシチミジン)の使用、およびリン酸基での修飾(例えば、ホスホロチオエート修飾)が含まれることができる。突出が標的配列と相同である必要はない。

0200

修飾およびヌクレオチド代用物を以下で論じる。

0201

上記の式VIIに示すスキャフォールドは、リボ核酸の一部を表す。塩基性成分は、リボース糖、塩基、末端リン酸、およびリン酸ヌクレオチド間リンカーである。塩基が、天然の塩基、例えば、アデニンウラシルグアニン、またはシトシンである場合、糖は、(図示したように)未修飾の2’ヒドロキシルリボース糖であり、W、X、Y、およびZは全てOであり、式VIIは、天然の未修飾オリゴリボヌクレオチドを表す。

0202

未修飾のオリゴリボヌクレオチドは、いくつかの用途では最適とは言えない場合があり、例えば、未修飾のオリゴリボヌクレオチドが、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性がある。ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、上記RNA成分の1つ以上に対する化学修飾は、改善された特性を付与することができ、例えば、ヌクレアーゼに対してオリゴリボヌクレオチドをより安定にすることができる。

0203

修飾核酸およびヌクレオチド代用物は、以下のうちの1つ以上を含むことができる:
(i)非結合(XおよびY)リン酸酸素の一方もしくは両方、ならびに/または結合(WおよびZ)リン酸酸素の1つ以上の改変(例えば、置換)(リン酸が末端位置にある場合、位置WまたはZのうちの1つは、天然に存在するリボ核酸中ではさらなる元素にリン酸を結合しない。しかしながら、用語を単純化するために、別途注記される場合を除き、核酸の5’末端のW位と核酸の3’末端の末端Z位とは、本明細書で使用される「結合リン酸酸素」という用語の範囲内にある);
(ii)リボース糖の構成成分(例えば、リボース糖の2’ヒドロキシル)の改変(例えば、置換);
(iii)リン酸部分(括弧I)の、「デホスホ(dephospho)」リンカーによる大規模な置換;
(iv)天然に存在する塩基の修飾または置換;
(v)リボース-リン酸骨格(括弧II)の置換または修飾;
(vi)RNAの3’末端または5’末端の修飾(例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、またはRNAの3’末端もしくは5’末端のいずれかへの、部分(例えば、蛍光標識部分)のコンジュゲーション)。

0204

この文脈で使用される、置換、修飾、改変などの用語は、プロセス限定を意味するものではなく、例えば、修飾とは、参照リボ核酸または天然に存在するリボ核酸から始めて、それを、修飾リボ核酸を産生するように修飾しなければならないことを意味ものではなく、修飾とは、単に、天然に存在する分子との違いを意味するものである。

0205

いくつかの化学的実体の実際の電子構造は、ただ1つの標準的な型(すなわち、ルイス構造)によって十分に表すことはできないことが理解される。理論に束縛されることを望まないが、その代わりに、実際の構造は、集合的に共鳴型または共鳴構造として知られている、2つ以上の標準的な型のあるハイブリッドまたは加重平均であることができる。共鳴構造は、個別的な化学的実体ではなく、紙の上でのみ存在する。共鳴構造は、特定の化学的実体に対する結合電子および非結合電子の配置または「局在」という点においてのみ相互に異なる。1つの共鳴構造が他のものよりも高い程度でハイブリッドに寄与することが可能である。したがって、本発明の実施形態についての記載および図示される説明は、特定の種に対する主要な共鳴型として当技術分野で認識されているものに関してなされる。例えば、任意のホスホロアミデート(非結合酸素の窒素による置換)は、上記の図においてX=OおよびY=Nによって表されよう。

0206

具体的な修飾を以下に詳細に論じる。

0207

リン酸基
リン酸基は、負に荷電した種である。電荷は、2つの非結合酸素原子(すなわち、上記式1中のXおよびY)に均等に分布している。しかしながら、リン酸基は、酸素原子の1つを異なる置換基で置換することによって修飾することができる。RNAリン酸骨格に対するこの修飾の1つの結果は、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性の増大であり得る。したがって、理論に束縛されることを望まないが、いくつかの実施形態では、非荷電リンカーかまたは非対称電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかを生じさせる改変を導入することが望ましい可能性がある。

0208

修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホネートまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄に置換されている。XまたはYのうちの1つだけが改変される状況とは異なり、ホスホロジチオエートにおけるリン中心はアキラルであり、アキラルはオリゴリボヌクレオチドのジアステレオマーの形成を妨害する。ジアステレオマー形成により、個々のジアステレオマーがヌクレアーゼに対するさまざまな耐性を示す調製物を生じさせることが可能である。さらに、キラルリン酸基を含有するRNAのハイブリダイゼーション親和性は、対応する未修飾のRNA種と比べてより低い可能性がある。したがって、理論に束縛されることを望まないが、ジアステレオマー混合物を産生することができないという点で、キラル中心を排除するXとYの両方に対する修飾(例えば、ホスホロジチオエート形成)が望ましい可能性がある。したがって、Xは、S、Se、B、C、H、N、またはOR(Rはアルキルもしくはアリールである)のいずれか1つであることができる。したがって、Yは、S、Se、B、C、H、N、またはOR(Rはアルキルもしくはアリールである)のいずれか1つであることができる。Xおよび/またはYを硫黄で置換することが可能である。

0209

リン酸リンカーは、結合酸素(すなわち、上記式1中のWまたはZ)を、窒素(架橋ホスホロアミデート)、硫黄(架橋ホスホロチオエート)、および炭素(架橋メチレンホスホネート)で置換することによって修飾することもできる。置換は、末端の酸素(位置W(3’)または位置Z(5’))で生じることができる。Wを炭素で置換すること、またはZを窒素で置換することが可能である。

0210

候補となる薬剤を下記のような好適性について評価することができる。

0211

糖基
修飾RNAは、リボ核酸の糖基の全てまたはいくつかの修飾を含むことができる。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、多数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換することができる。理論によって束縛されるものではないが、ヒドロキシルが、2’アルコキシドイオンを形成するように脱プロトン化されることがもはやできないので、安定性の増強が予測される。2’アルコキシドは、リンカーのリン原子への分子内求核攻撃による分解を触媒することができる。再び、理論によって束縛されることを望まないが、2’位でのアルコキシド形成が可能でない改変を導入することが、いくつかの実施形態に対して望ましい可能性がある。

0212

「オキシ」−2’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ(OR、例えば、R=H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖);ポリエチレングリコール(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR;2’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋によって同じリボース糖の4’炭素に接続されている「ロックされた」核酸(LNA);O−AMINE(AMINE=NH2;アルキルアミノジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノジアリールアミノヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミンポリアミノ)およびアミノアルコキシ、O(CH2)nAMINE(例えば、AMINE=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)が挙げられる。メトキシエチル基(MOE)(PEG誘導体である、OCH2CH2OCH3)のみを含有するオリゴヌクレオチドが堅固なホスホロチオエート修飾で修飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは注目すべきことである。

0213

「デオキシ」修飾としては、水素(すなわち、デオキシリボース糖、これは、部分的にdsのRNAの突出部に特に関連する);ハロ(例えば、フルオロ);アミノ(例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸);NH(CH2CH2NH)nCH2CH2−AMINE(AMINE=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ)、NHC(O)R(R=アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖)、シアノ;メルカプト;アルキル−チオ−アルキル;チオアルコキシ;ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニル(これらは任意で、例えば、アミノ官能基で置換されていてもよい)が挙げられる。ある実施形態の他の置換基としては、2’−メトキシエチル、2’−OCH3、2’−O−アリル、2’−C−アリル、および2’−フルオロが挙げられる。

0214

糖基は、リボース中の対応する炭素の立体化学的配置とは反対の立体化学的配置を有する1つ以上の炭素を含有することもできる。したがって、修飾RNAは、例えば、糖としてアラビノースを含有するヌクレオチドを含むことができる。

0215

修飾RNAは、C−1’にヌクレオ塩基を欠く「無塩基」糖を含むこともできる。これらの無塩基糖は、1つ以上の構成成分の糖原子におけるさらなる修飾を含有することもできる。

0216

ヌクレアーゼ耐性最大化するために、2’修飾を、1つ以上のリン酸リンカー修飾(例えば、ホスホロチオエート)と組み合わせて使用することができる。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、2つ以上の異なる修飾を含有するオリゴヌクレオチドである。

0217

候補となる修飾を下記のように評価することができる。

0218

リン酸基の置換
リン酸基は、リン以外のものを含有する接続部(式1中の括弧I参照)に置換することができる。理論によって束縛されることを望まないが、荷電したホスホジエステル基はヌクレアーゼ分解における反応中心なので、これを中性の構造模倣物で置換することは、ヌクレアーゼ安定性の増強を付与するはずであると考えられている。再び、理論によって束縛されることを望まないが、ある態様では、荷電したリン酸基が中性部分に置換される改変を導入することが望ましい可能性がある。

0219

リン酸基を置換することができる部分の例としては、シロキサンカルボネートカルボキシメチルカルバメートアミドチオエーテルエチレンオキシドリンカー、スルホネートスルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。ある実施形態では、置換には、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が含まれてもよい。

0220

候補となる修飾を下記のように評価することができる。

0221

リン酸骨格の置換
リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオチドの代用物(式1中の括弧II参照)に置換されているオリゴヌクレオチド模倣スキャフォールドを構築することもできる。理論によって束縛されることを望まないが、繰り返し荷電した骨格が存在しなければ、ポリアニオンを認識するタンパク質(例えば、ヌクレアーゼ)への結合が減少すると考えられている。再び、理論によって束縛されることを望まないが、ある態様では、塩基が中性の代用骨格によって連結される改変を導入することが望ましい可能性がある。

0222

例としては、モルホリノシクロブチルピロリジン、およびペプチド核酸(PNA)というヌクレオシド代用物が挙げられる。ある実施形態では、PNA代用物を使用してもよい。

0223

候補となる修飾を下記のように評価することができる。

0224

末端修飾
オリゴヌクレオチドの3’末端および5’末端を修飾することができる。このような修飾は、分子の3’末端、5’末端、または両方の末端においてなされ得る。これらの修飾は、末端のリン酸全体または末端リン酸基の1つ以上の原子の修飾または置換を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの3’末端および5’末端を、他の機能的分子実体、例えば、標識部分、例えば、フルオロフォア(例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3色素もしくはCy5色素)または保護基(例えば、硫黄、ケイ素ホウ素、もしくはエステルをベースにしたもの)にコンジュゲートすることができる。機能的分子実体は、リン酸基および/またはスペーサーを介して糖に付着させることが可能である。スペーサーの末端原子は、リン酸基の結合原子または糖のC−3’もしくはC−5’のO基、N基、S基、もしくはC基に接続するかまたはこれらに置き換わることできる。あるいは、スペーサーは、ヌクレオチド代用物(例えば、PNA)の末端原子に接続するかまたはこれに置き換わることができる。これらのスペーサーまたはリンカーとしては、例えば、−(CH2)n−、−(CH2)nN−、−(CH2)nO−、−(CH2)nS−、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH(例えば、n=3または6)、無塩基糖、アミド、カルボキシアミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィドチオ尿素、スルホンアミド、もしくはモルホリノ、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を挙げることができる。「スペーサー/リン酸−機能的分子実体−スペーサーリン酸」という配列が、iRNA剤の2つの鎖の間に介在するとき、この配列は、ヘアピン型RNA剤中のヘアピンRNAループの代わりになることが可能である。3’末端は−OH基とすることができる。理論に束縛されることを望まないが、特定の部分のコンジュゲーションは、輸送特性、ハイブリダイゼーション特性、および特異性特性を改善することができると考えられている。再び、理論に束縛されることを望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端の改変を導入することが望ましい可能性がある。末端修飾の他の例としては、色素、インターカレート剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、プソラレンマイトマイシンC)、ポルフィリンTPPC4、テキサフィリン、サッフィリン)、多環芳香族炭化水素(例えば、フェナジンジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、親油性担体(例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3−ビス−O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3−(オレオイル)リトコール酸、O3−(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン)、およびペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進物質(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾールビスイミダゾールヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のEu3+錯体)が挙げられる。

0225

末端修飾は、本明細書の他の箇所で論じられるような理由を含む多くの理由のために、活性を調節するために、または分解に対する耐性を調節するために加えることができる。活性を調節するために有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体による5’末端の修飾が含まれる。例えば、ある実施形態では、iRNA剤、とりわけアンチセンス鎖は、5’リン酸化されているか、または5’プライム末端にホスホリル類似体を含む。5’リン酸修飾には、RISCを介した遺伝子サイレンシングと適合可能なものが含まれる。好適な修飾には、5’モノホスフェート((HO)2(O)P−O−5’);5’ジホスフェート((HO)2(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’トリホスフェート((HO)2(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’−グアノシンキャップ(7−メチル化または非メチル化)(7m−G−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’−アデノシンキャップ(Appp)、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造(N−O−5’−(HO)(O)P−O−(HO)(O)P−O−P(HO)(O)−O−5’);5’モノチオホスフェート(ホスホロチオエート;(HO)2(S)P−O−5’);5’モノジチオホスフェート(ホスホロジチオエート;(HO)(HS)(S)P−O−5’)、5’−ホスホロチオレート((HO)2(O)P−S−5’);酸素/硫黄置換モノホスフェート、ジホスフェート、およびトリホスフェートの任意のさらなる組合せ(例えば、5’−α−チオトリホスフェート、5’−γ−チオトリホスフェートなど)、5’−ホスホロアミデート((HO)2(O)P−NH−5’、(HO)(NH2)(O)P−O−5’)、5’−アルキルホスホネート(R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、RP(OH)(O)−O−5’、(OH)2(O)P−5’−CH2)、5’−アルキルエーテルホスホネート(R=アルキルエーテル=メトキシメチル(MeOCH2−)、エトキシメチルなど、例えば、RP(OH)(O)−O−5’)が含まれる。

0226

末端修飾は、分解に対する耐性を増大させるのに有用であることもできる。

0227

末端修飾は、分布をモニターするためにも有用であり得るが、このような場合、付加される基には、フルオロフォア(例えば、フルオレセイン)またはAlexa色素(例えば、Alexa 488)が含まれ得る。末端修飾は、取込みを増強するためにも有用であり得るが、このために有用な修飾にはコレステロールが含まれる。末端修飾は、RNA剤を別の部分に架橋するためにも有用であり得るが、このための有用な修飾にはマイトマイシンCが含まれる。

0228

候補となる修飾を下記のように評価することができる。

0229

塩基
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルはRNAに見られる最も一般的な塩基である。これらの塩基は、改善された特性を有するRNAを提供するために修飾または置換することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、これらの塩基を用いて、または合成もしくは天然のヌクレオ塩基(例えば、イノシンチミンキサンチンヒポキサンチン、ヌブラリン(nubularine)、イソグアニシン(isoguanisine)、またはツベルシジン)および上記の修飾のいずれか1つを用いて調製することができる。あるいは、上記の塩基および「汎用的な塩基」のいずれかの置換類似体または修飾類似体を利用することができる。例としては、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、5−ハロウラシルおよび5−ハロシトシン、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン、6−アゾウシル、6−アゾシトシン、および6−アゾチミン、5−ウラシル(シュードウラシル)、4−チオウラシル、5−ハロウラシル、5−(2−アミノプロピル)ウラシル、5−アミノアリルウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシル、および他の8−置換アデニンならびに8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシル、および他の8−置換グアニン、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニン、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン、およびN−2置換プリン、N−6置換プリン、およびO−6置換プリン(2−アミノプロピルアデニンを含む)、5−プロピニルウラシルおよび5−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3−デアザ−5−アザシトシン、2−アミノプリン、5−アルキルウラシル、7−アルキルグアニン、5−アルキルシトシン、7−デアザアデニン、N6,N6−ジメチルアデニン、2,6−ジアミノプリン、5−アミノ−アリル−ウラシル、N3−メチルウラシル、置換1,2,4−トリアゾール、2−ピリジノン、5−ニトロインドール、3−ニトロピロール、5−メトキシウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸、5−メトキシカルボニルメチルウラシル、5−メチル−2−チオウラシル、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオウラシル、5−メチルアミノメチル−2−チオウラシル、3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウラシル、3−メチルシトシン5−メチルシトシン、N4−アセチルシトシン、2−チオシトシン、N6−メチルアデニン、N6−イソペンチルアデニン、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、N−メチルグアニン、またはO−アルキル化塩基が挙げられる。さらなるプリンおよびピリミジンとしては、米国特許第3,687,808号明細書に開示されているもの、「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」,858-859頁,Kroschwitz J.I.編,John Wiley & Sons,1990に開示されているもの、およびEnglischら,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613によって開示されているものが挙げられる。

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