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技術 ワクチンにおけるデングウイルスキメラ構築物に関する組成物および方法

出願人 タケダワクチン,インコーポレイテッドザガバメントオブザユナイテッドステイツオブアメリカアズリプリゼンテッドバイザセクレタリーオブザデパートメントオブヘルスアンドヒューマンサービシーズ
発明者 スティンチコム、ダンティ.キニー、クレールキニー、リチャードエム.ライブングッド、ジルエイ.
出願日 2019年6月5日 (10ヶ月経過) 出願番号 2019-105307
公開日 2019年9月5日 (7ヶ月経過) 公開番号 2019-146594
状態 未査定
技術分野 微生物、その培養処理 化合物または医薬の治療活性 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 突然変異または遺伝子工学 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 復帰レベル トレーサブル サーモメータ 製造製品 トータルシステム t位置 許容基準 復帰率
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重要な関連分野

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図面 (11)

課題

弱毒デングウイルスおよびデングウイルス構築物組成物、使用および製造を報告する。

解決手段

組成物は、デングウイルスの1種以上の血清型の構築物、例えばデング−1(DEN−1)ウイルス、デング−2(DEN−2)ウイルス、デング−3(DEN−3)またはデング−4(DEN−4)ウイルス構築物を含むことができる。他の実施形態において、本願に開示される構築物は、1つ以上のデングウイルス構築物に対するワクチンを生成するために組成物中で組み合わされてもよく、これはその後、哺乳類細胞中で継代されてもされなくてもよい。

概要

背景

デングウイルスによる感染は、痛みを伴う発熱を様々な重症度でもたらし得る。今のところ、デングウイルスの4種類の血清型が特定されており、これらはデング−4(DEN−4)と組み合わされたデング−1(DEN−1)、デング−2(DEN−2)、またはデング−3(DEN−3)である。デング熱はデングウイルスの感染によって生じる。他の亜型も将来発見されるかもしれない(例えばDEN−5)。デングウイルス血清型1〜4は、デング出血熱(DHF)およびデングショック症候群(DSS)を引き起こすこともある。感染の最も深刻な結果であるDHFおよびDSSは生命に関わることがある。デングウイルスは毎年5千万〜1億症例の消耗性デング熱、500,000症例のDHF/DSS、および20,000を超える死亡例を引き起こしている。今のところ、デング熱から防御するための有効なワクチンはなく、この疾患に対する薬物療法もない。駆除する努力も、流行地域でのデングの大流行やこの疾患の更なる地理的拡大を防ぐのに効果を上げていない。推定では、35億人がデングウイルスの感染に脅かさている。さらに、デングウイルスは、アジア、中央アメリカアメリカ、およびカリブ海のような流行地域への旅行者の発熱の一番の原因である。

全4種のデングウイルス血清型は、世界の熱帯地域の全域特有であり、世界的に見て、熱帯地域の人に対して最も脅威的な蚊媒介性ウイルスとなっている。デングウイルスは主にネッタイシマカAedes aegypti)を介してヒトに伝染する。1種のデングウイルス血清型に感染すると、その血清型による再感染から生涯にわたり防御されるが、他の3種のデングウイルス血清型のうちの1つによる二次感染は防御しない。実際、1種のデングウイルス血清型による以前の感染は、異なる血清型に二次感染した時に深刻な疾患(DHF/DSS)のリスクを高める可能性がある。有効なワクチンを開発することが、この世界的な流行性疾患を予防および抑制するのに重要なアプローチとなる。多数回の免疫は、旅行者にとって、およびデングウイルスの流行国における公衆衛生活動にとって、完全なワクチン接種率を達成するのを困難にしている。

概要

弱毒生デングウイルスおよびデングウイルス構築物組成物、使用および製造を報告する。組成物は、デングウイルスの1種以上の血清型の構築物、例えばデング−1(DEN−1)ウイルス、デング−2(DEN−2)ウイルス、デング−3(DEN−3)またはデング−4(DEN−4)ウイルス構築物を含むことができる。他の実施形態において、本願に開示される構築物は、1つ以上のデングウイルス構築物に対するワクチンを生成するために組成物中で組み合わされてもよく、これはその後、哺乳類細胞中で継代されてもされなくてもよい。

目的

本発明のキメラウイルスの製造方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

改変された弱毒生デング−2ウイルス株PDK−53に由来する非構造タンパク質をコードする第1のヌクレオチド配列、および、デング−1に由来する少なくとも1つの構造タンパク質をコードする第2のヌクレオチド配列を含む核酸キメラであって、前記弱毒生デング−2ウイルスは、核酸3823位に突然変異を含む少なくとも1つの更なる突然変異をさらに含み、NS2A遺伝子のアミノ酸116位がイソロイシンに代わりロイシンであり、さらに4407位に突然変異を含み、NS2Bのアミノ酸92位がグルタミン酸に代わりアスパラギン酸である、核酸キメラ。

請求項2

前記弱毒生デング−2ウイルスは、7148位に突然変異をさらに含み、NS4Bのアミノ酸108位がトレオニンに代わりイソロイシンである、請求項1に記載の核酸キメラ。

請求項3

前記弱毒生デング−2ウイルスは、7311位に突然変異をさらに含む、請求項1に記載の核酸キメラ。

請求項4

前記第2のヌクレオチド配列は、2384位に突然変異をさらに含むデング−1に由来するEタンパク質をコードするとともに、前記Eタンパク質のアミノ酸483位がグリシンに代わりアラニンである、請求項1に記載の核酸キメラ。

請求項5

請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸キメラによってコードされるポリペプチド

請求項6

請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸キメラ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物

請求項7

請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸キメラによってコードされるポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

請求項8

対象においてデングウイルスに対する免疫応答誘導するために用いられる請求項6または7に記載の医薬組成物。

請求項9

請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸キメラの配列をコードするベクター

請求項10

改変された弱毒生デング−2ウイルス株PDK−53をコードする核酸配列を含む核酸であって、前記弱毒生デング−2ウイルスは、592位の突然変異であって、prMのアミノ酸52位がリジンに代わりグルタミン酸である突然変異、および8803位の突然変異であって、NS5のアミノ酸412位がイソロイシンに代わりバリンである突然変異を含む少なくとも1つの更なる突然変異をさらに含む、核酸。

請求項11

前記弱毒生デング−2ウイルスは7156位に突然変異をさらに含み、NS4Bのアミノ酸111位がロイシンに代わりフェニルアラニンである、請求項10に記載の核酸。

請求項12

前記弱毒生デング−2ウイルスは、核酸6481位の突然変異であって、NS4A遺伝子のアミノ酸36位がアラニンに代わりプロリンである突然変異をさらに含む、請求項10に記載の核酸。

請求項13

請求項10〜12のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。

請求項14

請求項10〜12のいずれか一項に記載の核酸、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

請求項15

請求項10〜12のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

請求項16

対象においてデングウイルスに対する免疫応答を誘導するために用いられる請求項14または15に記載の医薬組成物。

請求項17

請求項10〜12のいずれか一項に記載の核酸をコードするベクター。

請求項18

改変された弱毒生デング−2ウイルス株PDK−53に由来する非構造タンパク質をコードする第1のヌクレオチド配列、および、デング−3に由来する少なくとも1つの構造タンパク質をコードする第2のヌクレオチド配列を含む核酸キメラであって、前記第2のヌクレオチド配列は、1603位に突然変異をさらに含むデング−3に由来するEタンパク質をコードし、前記Eタンパク質のアミノ酸223位がトレオニンに代わりセリンである、核酸キメラ。

請求項19

前記弱毒生デング−2ウイルスは、7620位の突然変異を含む少なくとも1つの更なる突然変異をさらに含む、請求項18に記載の核酸キメラ。

請求項20

前記弱毒生デング−2ウイルスは、核酸6436位に突然変異をさらに含み、N42A遺伝子のアミノ酸23位がアスパラギン酸に代わりアスパラギンである、請求項18に記載の核酸キメラ。

請求項21

請求項18〜20のいずれか一項に記載の核酸キメラによってコードされるポリペプチド。

請求項22

請求項18〜20のいずれか一項に記載の核酸キメラ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

請求項23

請求項18〜20のいずれか一項に記載の核酸キメラによってコードされるポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

請求項24

対象においてデングウイルスに対する免疫応答を誘導するために用いられる請求項22または23に記載の医薬組成物。

請求項25

請求項18〜20のいずれか一項に記載の核酸キメラの配列をコードするベクター。

請求項26

改変された弱毒生デング−2ウイルス株PDK−53に由来する非構造タンパク質をコードする第1のヌクレオチド配列、および、デング−4に由来する少なくとも1つの構造タンパク質をコードする第2のヌクレオチド配列を含む核酸キメラであって、前記弱毒生デング−2ウイルスは、核酸3674位に突然変異を含む少なくとも1つの更なる突然変異をさらに含み、NS2A遺伝子のアミノ酸66位がアスパラギン酸に代わりグリシンであり、6437位に突然変異をさらに含み、NS4Aのアミノ酸21位がアラニンに代わりバリンである、核酸キメラ。

請求項27

前記弱毒生デング−2ウイルスは、3773位に突然変異をさらに含み、NS2Aのアミノ酸99位がリジンに代わりアルギニンである、請求項26に記載の核酸キメラ。

請求項28

前記弱毒生デング−2ウイルスは、5391位に突然変異をさらに含む、請求項26に記載の核酸キメラ。

請求項29

前記弱毒生デング−2ウイルスは、7026位に突然変異をさらに含む、請求項26に記載の核酸キメラ。

請求項30

前記弱毒生デング−2ウイルスは、7538位に突然変異をさらに含み、NS4Bのアミノ酸238位がセリンに代わりフェニルアラニンである、請求項26に記載の核酸キメラ。

請求項31

前記弱毒生デング−2ウイルスは、9750位に突然変異をさらに含む、請求項26に記載の核酸キメラ。

請求項32

前記弱毒生デング−2ウイルスは、225位に突然変異をさらに含む、請求項26に記載の核酸キメラ。

請求項33

請求項26〜32のいずれか一項に記載の核酸キメラによってコードされるポリペプチド。

請求項34

請求項26〜32のいずれか一項に記載の核酸キメラ、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

請求項35

請求項26〜32のいずれか一項に記載の核酸キメラによってコードされるポリペプチド、および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

請求項36

対象においてデングウイルスに対する免疫応答を誘導するために用いられる請求項34または35に記載の医薬組成物。

請求項37

請求項26〜32のいずれか一項に記載の核酸キメラをコードするベクター。

請求項38

請求項1〜4、18〜20及び26〜32のいずれか一項に記載の核酸キメラ、ならびに請求項10〜12のいずれか一項に記載の核酸のうちの1つ以上と、薬学的に許容される担体とを含む免疫原性組成物

請求項39

請求項1〜4、18〜20及び26〜32のいずれか一項に記載の核酸キメラ、または請求項10〜12のいずれか一項に記載の核酸によってコードされた1つ以上のポリペプチドを含む免疫原性組成物。

請求項40

前記組成物は全4種のデングウイルス血清型を含む、請求項38または39に記載の組成物。

請求項41

黄熱ウイルスダニ媒介性脳炎ウイルス日本脳炎ウイルスウエストナイルウイルスC型肝炎ウイルス、およびこれらの2つ以上の組合せのうちから選択されるフラビウイルスに対する免疫原性組成物をさらに含む、請求項38または39に記載の組成物。

請求項42

請求項1〜4、18〜20及び26〜32のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸キメラ;請求項10〜12のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸;または請求項6、7、14、15、22、23、34、35、および38〜41のいずれか一項に記載の少なくとも1つの組成物、および容器を含むキット

請求項43

請求項1〜4、18〜20及び26〜32のいずれか一項に記載の核酸キメラ、または請求項10〜12のいずれか一項に記載の核酸を1つ以上含む弱毒生ウイルス

請求項44

表3の核酸配列を含む1つ以上の核酸配列によってコードされる、核酸またはポリペプチド。

技術分野

0001

連邦政府資金による研究〕
本願に開示されるいくつかの実施形態は、アメリカ国立衛生研究所の認可番号R43AI084291−01によって一部援助された。米国政府は対象の発明を実施する特定の権利を有し得る。

0002

〔分野〕
本願の実施形態は、デングウイルス構築物およびそのワクチン組成物に関する組成物、方法、使用および製造工程を報告する。いくつかの実施形態は、キメラフラビウイルスウイルス構築物を含むがそれに限定されない組成物に関し、上記ウイルス構築物は単独で、または他の構築物と組み合わされてワクチン組成物に使用することができる。ある実施形態では、組成物は、デングウイルスの2種以上の血清型、例えばデング−1(DEN−1)ウイルス、デング−2(DEN−2)ウイルス、デング−3(DEN−3)ウイルスおよび/またはデング−4(DEN−4)ウイルスの構築物を含むことができる。他の実施形態において、組換え弱毒キメラデングワクチン(DENVax)ウイルスの安全性および遺伝子安定性を向上できる製造戦略。ある実施形態は、ワクチン組成物において安全かつ有効であることが確認されたデングウイルスキメラ構築物と組み合わされた少なくとも1つの弱毒生デングウイルスを含み、ここで、上記構築物は、細胞培養で更なる継代を経たものである。

背景技術

0003

デングウイルスによる感染は、痛みを伴う発熱を様々な重症度でもたらし得る。今のところ、デングウイルスの4種類の血清型が特定されており、これらはデング−4(DEN−4)と組み合わされたデング−1(DEN−1)、デング−2(DEN−2)、またはデング−3(DEN−3)である。デング熱はデングウイルスの感染によって生じる。他の亜型も将来発見されるかもしれない(例えばDEN−5)。デングウイルス血清型1〜4は、デング出血熱(DHF)およびデングショック症候群(DSS)を引き起こすこともある。感染の最も深刻な結果であるDHFおよびDSSは生命に関わることがある。デングウイルスは毎年5千万〜1億症例の消耗性デング熱、500,000症例のDHF/DSS、および20,000を超える死亡例を引き起こしている。今のところ、デング熱から防御するための有効なワクチンはなく、この疾患に対する薬物療法もない。駆除する努力も、流行地域でのデングの大流行やこの疾患の更なる地理的拡大を防ぐのに効果を上げていない。推定では、35億人がデングウイルスの感染に脅かさている。さらに、デングウイルスは、アジア、中央アメリカ、アメリカ、およびカリブ海のような流行地域への旅行者の発熱の一番の原因である。

0004

全4種のデングウイルス血清型は、世界の熱帯地域の全域特有であり、世界的に見て、熱帯地域の人に対して最も脅威的な蚊媒介性ウイルスとなっている。デングウイルスは主にネッタイシマカAedes aegypti)を介してヒトに伝染する。1種のデングウイルス血清型に感染すると、その血清型による再感染から生涯にわたり防御されるが、他の3種のデングウイルス血清型のうちの1つによる二次感染は防御しない。実際、1種のデングウイルス血清型による以前の感染は、異なる血清型に二次感染した時に深刻な疾患(DHF/DSS)のリスクを高める可能性がある。有効なワクチンを開発することが、この世界的な流行性疾患を予防および抑制するのに重要なアプローチとなる。多数回の免疫は、旅行者にとって、およびデングウイルスの流行国における公衆衛生活動にとって、完全なワクチン接種率を達成するのを困難にしている。

0005

本願の実施形態は、キメラデングウイルス構築物の組成物、方法および使用に関する。いくつかの実施形態において、組成物は、弱毒化デングウイルス骨格を、少なくとも1種の他のデングウイルス血清型に由来する構造遺伝子と共に有するキメラデングウイルス構築物を含むことができる。他の実施形態は、1つ以上のキメラデングウイルスと組み合わされた少なくとも1つの弱毒生ウイルスに関する。他の実施形態は、改変型DEN−2骨格(例えばP1(継代1)の開始骨格としてPDK−53、および、P2、P3、・・・P8・・・P10等と表される継代変動性許容細胞株でのin vitroでの継代および増殖後))および、DEN−1、DEN−2、DEN−3またはDEN−4の1つ以上の構造要素を有するキメラデングウイルスの組成物を含むことができる。他の実施形態では、対象に導入されるとその対象における1つ以上のデングウイルスに対する免疫応答を生成する免疫原性組成物が製造される。したがって、本願で企図される構築物は、in vitroで生成および継代することができ、各継代は、薬学的に許容されるワクチン組成物への使用が意図された弱毒化デングウイルスをもたらす。ある実施形態では、弱毒生ウイルスは、単独の、または1つ以上のキメラデングウイルスと組み合わされた、弱毒生デング−2ウイルスとすることができる。

0006

ある実施形態では、複数のデングウイルス血清型のキメラデングウイルス構築物は、配列番号1、9、17、および25で示される核酸配列または配列番号2、10、18、および26で示されるポリペプチド配列を有する継代7(P7)の弱毒化ウイルスまたはキメラウイルスを含むことができる。本願では、本明細書に記載の任意の弱毒生ウイルスを任意の代数で継代させたものが、提示されるデングウイルス(例えば血清型1〜4)に対する免疫応答を誘導するための免疫原性組成物に使用可能であると考えられる。これらの実施形態に従って、単離したP−8弱毒生ウイルスを含む免疫原性組成物を、選択された構築物に応じた1種以上のデングウイルス血清型に対する免疫原性応答を誘導するために、対象に投与することができる。さらに、弱毒生ウイルスは、これらのキメラウイルスのうちの1つ以上と組み合わせることができる。これは、その後の各細胞継代(例えば、アフリカミドリザルVero細胞産生、以降「Vero細胞」)において単離/生成された弱毒生ウイルスの各々について考慮される。本願では、デングウイルスを産生可能なあらゆる細胞株(例えば、GMP準拠して作られたセルバンクFDAまたはEMAが許可したもの)が、製造規模で、あるいは、デングウイルスに対するワクチンまたは免疫原性組成物中でのその後の使用のために本願で適切と考えられる態様で、いずれのウイルス構築物の継代にも使用されると考えられる。

0007

他の実施形態において、本願で考慮される組成物は、他の免疫原性組成物と組み合わせることができ、ここで、他の免疫原性組成物は、他のフラビウイルス、例えばウエストナイルウイルス日本脳炎または他の任意のフラビウイルスのキメラ構築物および/または弱毒生ウイルスに対するものである。ある実施形態では、単一の組成物を複数のフラビウイルスに対して用いることができる。

0008

ある実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、DEN−1、DEN−2、DEN−3および/またはDEN−4のうちの1種以上に対するキメラデングウイルスを、単独で、または弱毒生デングウイルス組成物と組み合わせて含むことができる。

0009

他の実施形態において、構築物は対象に導入された時にそのウイルスの弱毒性または安全性に影響を与えることなく増殖または生成を増大させる適応突然変異を、そのウイルスの構造領域または非構造領域に有する構築物を含むことができる。ある実施形態では、企図されるキメラデングウイルス構築物はいずれも、骨格として用いられる特定の突然変異を有する弱毒生DEN−2ウイルスを含むことができ、その弱毒生DEN−2 PDKウイルスは、他のデングウイルス血清型のprM(プレメンブレン構造タンパク質およびE(エンベロープ)構造タンパク質のうちの1つ以上の構造タンパク質を更に含む。さらに、DEN−2骨格は、所定の組成物(例えばキメラデングウイルス2/1、2/3または2/4)を投与した時に対象においてその組成物に対する免疫応答の生成を増強させるか、またはその免疫応答を増進するために、更なる突然変異を含むことができる。

0010

いくつかの実施形態において、構造タンパク質遺伝子は、弱毒生デングウイルスの一部である1つまたは2つの突然変異を有するDEN−2骨格上に、DEN−1、DEN−2、DEN−3またはDEN−4のprM遺伝子およびE遺伝子を含むことができる。例えば、デング構築物は、特定の実施形態ではDENVax−1−A、DENVax−2−F、DENVax−3−F、およびDENVax−4−Fと名付けられた構築物(実施例の節を参照)を含むことができ、ここで、DEN−2骨格は、安全かつ免疫応答を誘導するのに有効であることが以前に実証されているDEN−2弱毒生ウイルスからの1つ以上の突然変異(例えば、P1または他の以前の継代ウイルスあるいはPDK−53に見られないもの)を有する。本願のDEN−2弱毒生ウイルスは、もともと使われていたDEN−2弱毒生ウイルスの改善版である。本発明のキメラ構築物は、第2のデングウイルス血清型の1つ以上の構造タンパク質を有する改変型弱毒化DEN−2 PDK−53骨格を含むことができ、ここで、構造タンパク質は、そのキメラ構築物に対する免疫原性応答を増強する更なる突然変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、弱毒化DEN−2 PDK−53が獲得した特定の突然変異は、P1構築物とは異なる、製造等のための望ましい特性をもたらし得る構築物において、保存的アミノ酸変化を生成することができ、またはできない。

0011

他の実施形態において、弱毒生DEN−2ゲノムは、デングウイルス血清型1(DEN−1)およびデングウイルス血清型3(DEN−3)、デングウイルス血清型4(DEN−4)の構築物を作製するために使用することができ、DEN−2ウイルスゲノムの1つ以上の構造タンパク質遺伝子が、それぞれDEN−1、DEN−3またはDEN−4の1つ以上の構造タンパク質遺伝子に置換され得る。いくつかの実施形態において、構造タンパク質は第2のデングウイルスのCタンパク質、prMタンパク質またはEタンパク質とすることができる。ある実施形態では、構造タンパク質遺伝子はDEN−1、DEN−3またはDEN−4のprM遺伝子およびE遺伝子を含む。これらのハイブリッドウイルスは、親の弱毒化DEN−2の弱毒表現型を維持しつつ、DEN−1、DEN−3またはDEN−4の表面抗原発現する。

0012

本願に開示される構築物は、弱毒化DEN−2ウイルスを骨格として用いてDEN−1、DEN−3およびDEN−4の表面抗原を発現するDEN−4、DEN−2、DEN−1、およびDEN−3のキメラ構築物を含むことができる。

0013

ある実施形態では、本発明の組成物は、本願に開示される単一のキメラデングウイルス構築物および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物を含むことができる。あるいは、本発明の組成物は、本願に開示される2つ以上または3つ以上のキメラデングウイルス構築物を含む組成物と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含むことができる。これらの実施形態に従って、本願で企図される1つ以上のデングウイルスキメラ構築物は、1つ以上の弱毒生デングウイルスと組み合わせることができる。ある実施形態では、弱毒生ウイルスは弱毒生DEN−2ウイルスとすることができ、ここで、NCR領域、NS1領域または他の領域における更なる突然変異が免疫応答を増強するか、ウイルス増殖を高めるか、または改善された弱毒生デングウイルスのための他の改善を強化する。

0014

ある実施形態では、DENV−2ワクチンの弱毒化位置であるヌクレオチド5’NCR−57−T、NS1−53−Asp、およびNS3−250−Valは以前に決定されており、これらの変化のすべてが、4種のDENVaxウイルスの共通のPDK−53ウイルス特異的遺伝的背景共有されている。これらのワクチン候補の以前に確立されたin vitroおよびin vivo弱毒表現型ならびに上記3つの弱毒化位置の遺伝子配列は、cGMPに準拠して製造されたDENVaxシードについて注意深くモニタリングされた。この報告は、マスターウイルスシード(MVS)の製造に用いる方策ならびにデングウイルスワクチン組成物の製造に用いる場合のそれらの遺伝子のおよび表現型の特徴解析について説明する。これらのMVSは、臨床材料の製造および最終的には市販のワクチン供給に使用することができる。

0015

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、特定の実施形態をさらに実証するために含められている。いくつかの実施形態は、これらの図面のうちの1つ以上を、単独で、もしくは提示された特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、よりよく理解されよう。

図面の簡単な説明

0016

本発明の例示的なキメラ構築物を反映した例示的なチャートを示し、DEN−2/DEN−4を以前に作製された構築物および野生型デングウイルスと比較している。
弱毒生DEN−2骨格(更なる突然変異を伴う)、および、デング−2構造要素を置換する構造要素として第2のデングウイルス血清型(例えばDENVax−1 MVS)を用いて様々な応答を比較した例示的なヒストグラムプロットを示す。このプロットは、DENVax MVSのプラークサイズを表す。野生型デングウイルスおよび以前に公開されたリサーチグレードのワクチン候補ウイルスを対照および比較用に含めた。このプロットは、デングウイルス構築物の、対照デングウイルスキメラ構築物と比較して改善された生産を表している。
DENVax MVS(マスターウイルスシード)の温度感受性を表す例示的なヒストグラムプロットを示す。野生型デングウイルスおよび以前に公開されたリサーチグレードのワクチン候補ウイルスを、MVSグレードとの比較のために含めた。
対照と比較した、C6/36細胞におけるDENVax MVSのウイルス増殖を表す例示的なヒストグラムプロットを示す。野生型デングウイルスおよびリサーチグレードのワクチン候補ウイルスを、DENVax MVSとの比較のために含めた。
A〜Cは、新生マウスにおける神経毒性の例示的なプロットを示す。いくつかの実験プールした結果は、104pfuのウイルスでic攻撃したCDC−ICR(n=72)およびTaconic−ICR(n=32)新生マウスにおけるwt DENV−2 16681ウイルスの神経毒性を要約している(A)。Taconic−ICRマウスにおいて、104pfu(B)または103pfu(C)の用量で試験したDENVax MVSの神経毒性。1つの実験での1グループ当たりの試験動物の数(n=16)または2つの実験のプールでの数(n=31または32)が示されている。
DENVax MVS、WVS、およびBVSのプラークサイズを表す例示的なヒストグラムを示す。アガロースオーバーレイ下のVero細胞またはLLC−MK2細胞中のウイルスプラークの平均プラーク直径±SD(エラーバー)をpi9日目に測定した。野生型DENVおよび以前に公開されたリサーチグレードのワクチン候補ウイルスを対照および比較のために含めた。
C6/36細胞におけるDENVax MSV、WVS、およびBVSの増殖を、これらの大規模製造後のこのin vitro弱毒化マーカーの保持を評価するため2種類のインキュベーション温度で表す例示的なヒストグラムプロットを示す。
C6/36細胞におけるDENVax MVS、WVS、およびBVSの制限された増殖をプロットした例示的なヒストグラムを表す。C6/36細胞で複製されたウイルスのpi7日目の平均力価±SD(エラーバー)。wtデングウイルスおよび以前に公開されたリサーチグレードのワクチン候補ウイルスを比較のために含めた。
A〜Bは、新生ICRマウスにおけるDENVax MVSの神経毒性のデータの例示的なグラフを示す。(A)104PFUの用量でのウイルスのIC接種。(B)103PFUの用量でのウイルスのIC接種。
新規な弱毒生ウイルスと以前に作製された弱毒生デングウイルスとを比較した例示的なチャートを示す。

実施例

0017

〔定義〕
本願で使用される場合、「1つの」とは、1つもしくは1つより多くの事項を意味する場合がある。

0018

本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒトのような哺乳類や、家畜化または野生の哺乳類(例えば、イヌネコ、他の家庭用ペット(例えば、ハムスターモルモット、マウス、ラット)、フェレットウサギブタウマウシプレーリードッグ、野生げっ歯類、または動物園動物)を含み得るが、これらに限定されない。

0019

本願で使用する場合、「ウイルスキメラ」、「キメラウイルス」、「フラビウイルスキメラ」および「キメラフラビウイルス」という用語は、デング−2ウイルスのヌクレオチド配列の一部、そしてさらにデング−2ウイルスに由来しないか、異なるデングウイルスに由来するヌクレオチド配列を含む構築物を意味することがある。「デングキメラ」は少なくとも2種の、異なるフラビウイルスではないが異なるデングウイルスの血清型を含む。したがって、他のデングウイルスまたはフラビウイルスの例には、デング−1ウイルス、デング−3ウイルス、デング−4ウイルス、ウエストナイルウイルス、日本脳炎ウイルスセントルイス脳炎ウイルスダニ媒介性脳炎ウイルス黄熱ウイルスおよびこれらの任意の組合せ由来の配列が挙げられるがこれらに限定されない。

0020

本願で使用する「核酸キメラ」は、デング−2ウイルスのヌクレオチド配列の一部を含む核酸配列と、さらにデング−2ウイルスのヌクレオチド配列と同じ起源のものではないヌクレオチド配列とを含む本発明の構築物を意味することがある。それに応じて、本願に開示される任意のキメラフラビウイルスまたはフラビウイルスキメラは核酸キメラの一例として認識され得る。

0021

本願で使用する場合、「弱毒生ウイルス」は、突然変異しているか、あるいはワクチンまたは他の免疫原性組成物における使用特性のために選択された野生型ウイルスを意味する場合があり、いくつかの特性は、低下した毒性、安全性、有効性または向上した増殖等を含み得る。

0022

〔説明〕
以下の節では、様々な実施形態を詳述するために、様々な例示的な組成物および方法が説明されている。当業者には、様々な実施形態の実施にあたり、本明細書に概説された詳細の全てを採用することも、あるいはその幾つかさえ採用することも必要なく、むしろ、濃度、時間その他の詳細は通常の実験によって変更可能であることが明らかであろう。いくつかの場合、周知の方法や構成要素はこの説明には含められていない。

0023

本発明の実施形態によれば、本分野の従来技術に含まれる分子生物学、タンパク質化学微生物学、および組換えDNA技術が採用されてもよい。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば、サムルックフリッチュおよびマニアティス(Sambrook,Fritsch&Maniatis)、分子クローニング実験室マニュアル(A Laboratory Manual)、第2版、1989年、コールドスプリングハーバーラボラトリープレスニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー;動物細胞培養(Animal Cell Culture)、R.I.フレシュニー(R.I.Freshney)編、1986年を参照されたい。

0024

本願の実施形態は、対象における1種以上のデングウイルス血清型に対する免疫応答を個々にまたは同時に誘導するための組成物、方法および使用に関する。これらの実施形態に従って、弱毒化デングウイルスおよび核酸キメラが生成され、本願に開示されるワクチン組成物に使用される。いくつかの実施形態は、改変型または突然変異型デング構築物またはキメラに関する。他の実施形態は、デングウイルスの構造タンパク質のアミノ酸配列改変するための突然変異の導入に関し、その突然変異はそのウイルスの免疫原性を高める。

0025

全4種の血清型の弱毒生デングウイルスは、野生型ウイルスを細胞培養で継代することによって開発されている。これらは、フラビウイルス、特にデングウイルス感染および/または疾患に対する免疫付与に最も有望な弱毒生ワクチン候補の一部である。これらのワクチン候補は、それらのデング血清型の組合せ、継代に用いる細胞株、および継代させた回数により命名されてきた。したがって、PDK細胞で13回継代させたデング血清型1野生型ウイルスはDEN−1 PDK−13ウイルスと表される。他のワクチン候補はDEN−2 PDK−53、DEN−3PGMK−30/FRhL−3(例えば、初代ミドリザル腎細胞で30回継代させ、その後アカゲザル胎児肺細胞で3回継代させたものおよびDEN−4 PDK−48)である。これら4つの候補ワクチンウイルスは、それぞれ、野生型親DEN−1 16007、DEN−2 16681、DEN−3 16562およびDEN−4 1036ウイルスの組織培養継代により誘導された。

0026

ある実施形態において、弱毒生デング−2 PDK−53ワクチンウイルスは、様々なヌクレオチド差を含む集団のウイルスの混合物を含んでいた。弱毒化突然変異遺伝子解析後、特定の弱毒化特徴の概要をまとめ、それをcDNA感染性クローン作出した。この感染性クローンからRNAを転写し、新規に特徴解析され誘導されたPDK−53−Vero−DEN−2−P1ウイルスの継代1として、Vero細胞に導入した(例えば表1を参照)。この弱毒化ウイルスは各DEN血清型について作製したが、DEN−1、DEN−3およびDEN−4については、prMおよびE遺伝子は3つの別個のcDNA感染性クローン中で操作し、これにより4つの別個のPDK−53−Veroウイルスを生成した(ここではPDK−53−Vero−DEN−2−P1、PDK−53−Vero−DEN−1−P1、PDK−53−Vero−DEN−3−P1、およびPDK−53−Vero−DEN−4−P1と名付ける)。これらの弱毒化ワクチンウイルス株をVero細胞で10回継代させ(表1)、各別個の系統は、Vero細胞内での増殖に適応すると、突然変異を獲得した(表3)。本明細書における特定の実施形態は、これらの弱毒生デングウイルスの誘導および使用に関する。

0027

これらの弱毒化ウイルスを用いた以前のヒト治験により、DEN−2 PDK−53がヒトでは最低の感染用量(5プラーク形成単位すなわちPFUの50%最少感染量)であり、強い免疫原性であり、明らかな安全性に関する問題を生じないことが示されている。DEN−1 PDK−13、DEN−3PGMK−30/FRhL−3およびDEN−4 PDK−48ワクチンウイルス候補は、ヒトでそれぞれ10,000、3500、および150PFUの、より高い50%最少感染量を有する。ヒト対象で100%セロコンバージョンを達成するのに必要な一価DEN−2 PDK−53ウイルスまたはDEN−4 PDK−48ウイルスでの免疫は1回のみであったが、ヒトへの感染用量の高さが上位2つのDEN−1 PDK−13およびDEN−3 PGMK−30/FRhL−3ウイルスについては、同じセロコンバージョン率を達成するには追加免疫が必要であった。

0028

DEN−2 PDK−53ウイルスワクチン候補(PDK−53とも略される)は、弱毒化に関するいくつかの測定可能生物学的マーカーを有し、これらは温度感受性、小さいプラークサイズ、蚊C6136細胞培養における低下した複製、無傷の蚊における低下した複製、哺乳期マウスに対する神経毒性の喪失、およびサルにおけるウイルス血症発症率の低下を含む。候補PDK−53ワクチンの治験は、ヒトでの安全性および免疫原性を実証した。さらに、PDK−53ワクチンは、ヒトワクチンレシピエントにおいてデングウイルス特異的T細胞記憶応答を誘導する。本明細書のいくつかの実施形態は、本願に開示のキメラ構築物に使用されるDEN−2 PDK−53の改善について記載する。

0029

デング−2ウイルス骨格および別のデングウイルス血清型の少なくとも1つの構造タンパク質を有する免疫原性フラビウイルスキメラは、デングウイルスキメラの調製に用いることができ、デングウイルスキメラの製造方法が記載される。免疫原性デングウイルスキメラは、感染を最小化、抑制、または個体を1つ以上の血清型、例えばデングウイルス血清型DEN−1、DEN−2、DEN−3およびDEN−4の単独または組合せによる感染に対し免疫する免疫原性組成物として、薬学的に許容される担体中、単独で、または組み合わせで提供される。組み合わされると、免疫原性デングウイルスキメラは、フラビウイルスの2つ以上の種または株による感染に対する同時の防御を与える多価ワクチン(例えば二価三価四価)として使用することができる。ある実施形態では、デングウイルスキメラは、既知デングウイルス血清型に対する二価、三価、または四価ワクチンとして有用な免疫原性組成物中で組み合わされるか、または異なるフラビウイルスに由来する1つ以上のタンパク質をコードする核酸を含むことにより、他の病原性フラビウイルスに対する免疫を与える。

0030

いくつかの実施形態において、本願で提供される非病原性の免疫原性デングウイルスキメラは、弱毒化デング−2ウイルス(例えばPDK−53)の非構造タンパク質遺伝子またはその等価物、および、対象においてそれに対する免疫原性を誘導しようとするフラビウイルスの1つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその免疫原性タンパク質を含む。例えば、いくつかの実施形態は、ウイルス骨格として弱毒化デング−2ウイルスPDK−53ゲノムと、PDK−53ゲノムのカプシド、プレメンブレン/メンブレン、またはエンベロープあるいはこれらの組合せをコードする1つ以上の構造タンパク質遺伝子であって、DEN−1、DEN−3またはDEN−4、あるいは防御対象となる他のフラビウイルス、例えば異なるフラビウイルスまたは異なるデングウイルス血清型に由来する1つ以上の対応する構造タンパク質遺伝子で置換されている、1つ以上の構造タンパク質遺伝子とを含むキメラに関する。これらの実施形態に従って、本願に開示の核酸キメラは弱毒化デング−2ウイルスの機能性を有することができ、非病原性であるが、他のフラビウイルスに加え、DEN−1、DEN−3またはDEN−4の構造遺伝子産物の抗原エピトープを発現し、免疫原性である(例えば、対象において遺伝子産物に対する免疫応答を誘導する)。その結果、これらのDNA構築物は感染性クローンからRNAを転写するのに用いられ、このRNAはVero細胞に再び導入されてP1で新しい子孫ウイルスを生産する。これらの新子孫ウイルスはPDK−53とは区別可能である。(例えばP1〜P10を参照)。

0031

別の実施形態において、核酸キメラは、限定するものではないが、弱毒化デング−2ウイルスに由来する非構造タンパク質をコードする第1のヌクレオチド配列と、デング−4ウイルス単独または別のフラビウイルスとの組合せに由来する構造タンパク質をコードする第2のヌクレオチド配列とを有する核酸キメラとすることができる。他の実施形態において、弱毒化デング−2ウイルスは、1つ以上の突然変異アミノ酸を有するワクチン株PDK−53とすることができる(実施例参照)。これらの更なる突然変異は、弱毒生デング−2としての、または本願に開示のキメラ構築物としての望ましい使用特性を与える。いくつかの実施形態は、第2のデングウイルスのC、prMまたはEタンパク質のうちの1つ以上の構造タンパク質を含む。

0032

他の態様は、キメラウイルスが、例えば対照PDK−53デング−2ゲノムに、標的デングウイルス血清型に対する免疫原性応答との干渉を低減させるためのヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、欠失または挿入を含んでもよいことを含む。これらの改変は、単独で、または本願に開示の例示的な改変と組み合わせて、構造タンパク質および非構造タンパク質になされてもよく、弱毒化ウイルスの継代により生成することができ、1種以上のデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導するための改善された組成物を得ることができる。

0033

本願に開示されるある実施形態は、組換え技術を用いて必要な置換を適切な骨格ゲノムに挿入することによる本発明のキメラウイルスの製造方法を提供する。本願の他の実施形態は、確立された(例えば安全かつ有効な)弱毒生キメラウイルスを更なる改善のために継代させることに関する。ある実施形態では、本願で用いるデング−2骨格は、表3に提示される1つ以上の突然変異を含むことができる。他の実施形態において、本願のデング−デングキメラは表3に提示される1つ以上の突然変異を含むことができる。さらに他の実施形態において、デング−デングキメラは各キメラにつき、Den−2/Den−1、Den−2/Den−3またはDen−2/Den−4に関して表3に提示したような突然変異の全てを含むことができる。表3の構築物により示される弱毒生ウイルスを含む医薬組成物も企図される。例えば、一価、二価、三価、または四価組成物が、表3に示されるようなキメラおよび弱毒生デング−2ウイルスを用いる本願の用途に企図される。

0034

ある実施形態において、本願で企図される弱毒生DEN−2改変体は、医薬組成物に製剤化することができる。ここで、医薬組成物は単独で、またはデング−デングキメラあるいはデング−フラビウイルスキメラと組み合わせて投与することができる。ある実施形態において、二価、三価または四価組成物は、対象への単回の適用または複数回の適用で投与することができる。

0035

フラビウイルスキメラ
デングウイルス型1〜4(DEN−1からDEN−4)は蚊媒介性フラビウイルス病原体である。フラビウイルスゲノムは、5’非コード領域(5’−NC)、それに続くカプシドタンパク質(C)コード領域、それに続くプレメンブレン/メンブレンタンパク質(prM)コード領域、それに続くエンベロープタンパク質(E)コード領域、それに続く非構造タンパク質(NS1−NS2A−NS2B−NS3−NS4A−NS4B−NS5)をコードする領域、最後に3’非コード領域(3’NC)を含む。ウイルス構造タンパク質はC、prMおよびEであり、非構造タンパク質はNS1〜NS5である。構造タンパク質および非構造タンパク質は、単一のポリプロテインとして翻訳され、細胞内プロテアーゼおよびウイルスプロテアーゼによってプロセシングされる。

0036

フラビウイルスキメラは、デングウイルスまたはフラビウイルス科のウイルス種の1つの種または血清型に由来する非構造タンパク質遺伝子と、デングウイルスまたはフラビウイルス科のウイルス種の異なる種または血清型に由来するタンパク質遺伝子、例えば構造タンパク質遺伝子とを融合させることにより形成される構築物とすることができる。あるいは、本発明のフラビウイルスキメラは、デングウイルスまたはフラビウイルス科のウイルス種の1つの種または血清型に由来する非構造タンパク質遺伝子と、他のデングウイルス血清型または他のフラビウイルス科のウイルスから選択されるポリペプチドまたはタンパク質の合成をもたらす更なるヌクレオチド配列とを融合させることにより形成される構築物である。

0037

他の実施形態において、本願で提供される非病原性かつ免疫原性のフラビウイルスキメラは、弱毒化デング−2ウイルスの非構造タンパク質遺伝子またはその等価物と、それに対する免疫原性を与えようとするフラビウイルスの1つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその抗原性タンパク質とを含む。適切なフラビウイルスは、限定するものではないが、表1に挙げられたものを含む。

0038

キメラの構築に用いられる他の適切なデングウイルスは、野生型、病原性DEN−1 16007、DEN−2 16681、DEN−3 16562およびDEN−4 1036、ならびに弱毒化ワクチン株DEN−1 PDK−13、DEN−2 PDK−53、DEN−3 PMK−30/FRhL−3およびDEN−4 PDK−48であり得る。DEN−1、DEN−2、DEN−3およびDEN−4野生型/弱毒化ウイルスペアの間の遺伝子の差異は、そのウイルスゲノムによってコードされたアミノ酸配列における変化に沿って考慮される。

0039

DEN−2 PDK−53の配列表は、DEN−2 PDK−53−V改変体に対応しており、ゲノムヌクレオチド5270位がAからTに突然変異し、ポリプロテインのアミノ酸1725位すなわちNS3タンパク質のアミノ酸250位はバリン残基を含む。このヌクレオチド突然変異を含まないDEN−2 PDK−53改変体であるDEN−2 PDK−53−Eは、PDK−53−Vとはこの1つの位置のみで異なる。DEN−2 PDK−53−Eはヌクレオチド5270位にAを有し、ポリプロテインアミノ酸1725位、NS3タンパク質アミノ酸250位にグルタミン酸を有する。本明細書中の実施形態は、別個の宿主細胞(例えばVero細胞、表1参照)で1回以上継代させた改変型PDK53を含むことが理解され、ここには本願で企図されるワクチン組成物での望ましい使用特性が創出される。

0040

ある実施形態において、キメラの名称は、DEN−2ウイルス特異的感染性クローン改変骨格、および他のデングウイルスまたは他のフラビウイルスの構造遺伝子(prM−EまたはC−prM−E)インサートに基づくことができる。デング−2用骨格のDEN−2の後に、挿入される構造遺伝子の株が続く。1つのDEN−2骨格改変体が数字名称の次の文字に反映される。キメラが構築された1つの特定のDEN−2骨格改変体は、ハイフンの後に置かれる下記の文字で示され、親16681(P)、PDK−53−E(E)、またはPDK−53−V(V);最後の文字は親(P)株またはそのワクチン誘導体(V)に由来するC−prM−E構造遺伝子、あるいは親(P)株もしくはそのワクチン誘導体(V1)に由来するprM−E構造遺伝子を示す。例えば、DEN−2/1−VPは、NS3−250のバリンおよび野生型DEN−1 16007に由来するC−prM−E遺伝子を含む弱毒化DEN−2 PDK−53V骨格を含むキメラを提供する;DEN−2/1−VVはデング−1のワクチン株DEN−1 PDK−13とのDEN−2 PDK−53V骨格を提供する;DEN−2/1−VP1はDEN−2 PDK−53V骨格および野生型DEN−1 16007に由来するprM−E遺伝子を提供する;DEN−2/3−VP1はDEN−2 PDK−53V骨格および野生型DEN−3 16562に由来するprM−E遺伝子を提供する;DEN−2/4VP1はDEN−2 PDK−53V骨格および野生型DEN−4 1036に由来するprM−E遺伝子を提供する。本願に開示の他のキメラが同じ方式で指定される。

0041

一実施形態において、本願に開示のキメラは弱毒化デング−2ウイルスPDK−53ゲノムをウイルス骨格として含み、PDK−53ゲノムのC、prMおよびEタンパク質またはそれらの組合せをコードする構造タンパク質遺伝子は、デング−1、デング−3またはデング−4ウイルスの、および任意選択で、防御対象となる別のフラビウイルス、例えば異なるフラビウイルスまたは異なるデングウイルス株の対応する構造タンパク質遺伝子で置換されていてもよい。

0042

非構造タンパク質領域において、GlyからAspへの(野生型からPDK−53への)突然変異が非構造タンパク質NS1−53(ゲノムヌクレオチド2579位)で発見され;LeuからPheへの(野生型からPDK−53への)突然変異が非構造タンパク質NS2A−181(ゲノムヌクレオチド4018位)で発見され;GluからValへの(野生型からPDK−53への)突然変異が非構造タンパク質NS3−250(ゲノムヌクレオチド5270位)で発見され;GlyからAlaへの突然変異(野生型からPDK−53への)が非構造タンパク質NS4A−75(ゲノムヌクレオチド6599位)で発見された。本発明の弱毒生DEN−2ウイルスは、表3の任意のキメラまたは弱毒生デング−2ウイルスに提示されるような突然変異をさらに含む。

0043

PDK−53ウイルス株は、ゲノムヌクレオチド5270に混合遺伝子型を有する。ウイルス集団のかなりの部分(約29%)は、NS3−250−Val突然変異ではなく、野生型DEN−2 16681ウイルスに存在する突然変異していないNS3−250−Gluをコードする。両方の遺伝的変異体は非病原性であるため、この突然変異は非病原性キメラにおいて必須ではない。

0044

以前、弱毒化PDK−53ウイルス株の非病原性が、非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列および5’非コード領域における突然変異に起因する可能性があることが発見された。例えば、NS1−53における単一の突然変異、NS1−53および5’NC−57における2つの突然変異、NS1−53およびNS3−250における2つの突然変異、ならびにNS1−53、5’NC−57およびNS3−250における3つの突然変異は、DEN−2ウイルスの弱毒化をもたらす。したがって、これらの位置にそのような非保存的アミノ酸置換またはヌクレオチド置換を含むあらゆるデング−2ウイルスのゲノムを、本願に開示の改変型PDK−53ウイルスを誘導するためのベース配列に使用することができる。所望であれば、5’非コード領域のステムループ構造のステムにおける別の突然変異が、更なる非病原性表現型安定性を提供し得る。この領域への突然変異は、ウイルス複製に重要な潜在的な二次構造を妨害する。DENおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスウイルスにおけるこの短い(たった6ヌクレオチド残基長)ステムにおける単一の突然変異は、ヘアピン構造の形成を妨害する。ステム構造における更なる突然変異は、ウイルス生存能力を維持しつつ、この位置の復帰の可能性を低下させる。

0045

本願に開示の突然変異は、限定するものではないが、対象とする細胞株(例えばVero細胞)で一度継代された更なる特徴を有する自然発生または選択されたクローンを含む当分野において既知の任意の方法によって達成することができる。当業者には、本願に記載のような、そして当分野で周知のような病原性スクリーニングアッセイを使用して病原性骨格構造と非病原性骨格構造とを識別可能であることが理解される。

0046

フラビウイルスキメラの構築
本願に開示のフラビウイルスキメラは、対応するPDK−53遺伝子を除去し、それをデング−1、デング−3またはデング−4ウイルス遺伝子または当分野で既知の他の遺伝子に置換する組換え操作を用いて、それに対する免疫が望まれるフラビウイルスの1つ以上の構造タンパク質遺伝子をPDK−53デングウイルスゲノム骨格にスプライシングすることにより、または当分野で知られている他の方法により製造することができる。

0047

別法として、配列表に提供された配列を用いて、フラビウイルスタンパク質をコードする核酸分子を既知の核酸合成技術を用いて合成し、適切なベクターに挿入してもよい。したがって、非病原性かつ免疫原性のウイルスは、当業者に既知の組み換え操作技術を用いて製造される。

0048

標的遺伝子は、DEN−1、DEN−3、DEN−4または他のフラビウイルスに関して、対象とするフラビウイルス構造タンパク質をコードする骨格に挿入することができる。挿入されるフラビウイルス遺伝子は、Cタンパク質、PrMタンパク質および/またはEタンパク質をコードする遺伝子とすることができる。デング−2骨格に挿入される配列は、PrM構造タンパク質およびE構造タンパク質の両方をコードすることができる。デング−2骨格に挿入される配列は、C構造タンパク質、prM構造タンパク質およびE構造タンパク質の全てまたはそれらのうちの1つをコードすることができる。

0049

他のフラビウイルスまたはデングウイルス血清型の構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む適切なキメラウイルスまたは核酸キメラは、非病原性を示す前述した弱毒表現型マーカーについてそれらをスクリーニングすることにより、また、免疫原性についてそれらをスクリーニングすることにより、ワクチンとしての有用性について評価することができる。抗原性および免疫原性は、当業者に知られている日常的なスクリーニング手順により、フラビウイルス抗体または免疫反応性血清とのin vitroまたはin vivo反応性を利用して評価することができる。

0050

デングウイルスワクチン
ある実施形態において、キメラウイルスおよび核酸キメラは、免疫原またはワクチンとして有用な弱毒生ウイルスを提供することができる。いくつかの実施形態は、デング−4ウイルスに対する高い免疫原性を示すと同時に、危険な病原性または致死的効果をもたらさないキメラを含む。

0051

対象においてDHF/DSSの発症率を低減するため、ウイルスの全4種の血清型に対する同時免疫を提供する四価ワクチンが必要とされている。四価ワクチンは、本願の弱毒生デング−2ウイルスと上述したデング−2/1、デング−2/3、およびデング−2/4キメラとを、多価ワクチンとしての投与に適切な薬学的担体中で組み合わせることにより製造される。

0052

本発明のキメラウイルスまたは核酸キメラは、病原性または弱毒化DEN−2ウイルス骨格に、野生型または弱毒生ウイルスのいずれかの構造遺伝子を含むことができる。例えば、キメラは野生型DEN−4 1036ウイルス、その候補ワクチン誘導体の構造タンパク質遺伝子を、いずれかのDEN−2バックグランドにおいて発現してもよい。

0053

本願に記載のキメラに用いられるウイルスは、当分野で既知の技術を用いて増殖させることができる。増殖培養物の生存能力および表現型特徴を評価するために、その後、ウイルスプラーク滴定が実施され、プラークがカウントされる。野生型ウイルスを培養細胞株を通して継代させ、弱毒化候補開始材料を誘導することができる。

0054

キメラ感染性クローンは、入手できる様々なデング血清型クローンから構築することができる。所望であれば、ウイルス特異的cDNAフラグメントクローニング遂行してもよい。構造タンパク質遺伝子または非構造タンパク質遺伝子を含むcDNAフラグメントは、デングウイルスRNAから、様々なプライマーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応RTPCR)により増幅される。増幅されたフラグメントは、他の中間体クローンの切断部位にクローニングされる。中間体キメラデングウイルスクローンは、その後、挿入されたデングウイルス特異的cDNAの正確性を評価するために配列解析される。

0055

デング血清型ウイルスの構造タンパク質遺伝子領域および/または非構造タンパク質遺伝子領域をベクターに挿入することにより構築されるフルゲノム長キメラプラスミドは、当業者に周知の組換え技術を用いて得ることができる。

0056

ヌクレオチドおよびアミノ酸解析
DEN−2 16681ウイルスのNS1−53−Glyは、今日までに配列解析されているダニ媒介性ウイルスを含むほぼ全てのフラビウイルスにおいて保存されているため、DEN−2 PDK−53ワクチンウイルスにおけるNS1−53突然変異は、このウイルスの弱毒表現型に重要である。DEN−4ワクチンウイルスはまた、NS1タンパク質の253位にアミノ酸突然変異を含むことができる。この位置は、DEN−4 PDK−48ワクチンウイルスにおいてはGlnからHisへの突然変異であり、デングウイルスの全4種の野生型血清型でGlnである。このGln残基は、フラビウイルス属の中で、デングウイルスに特有である。NS1タンパク質は、フラビウイルスに感染した細胞から分泌される糖タンパク質である。これは感染細胞の表面に存在し、NS1特異的抗体はウイルスに感染した個体の血清に存在する。NS1タンパク質で免疫された動物またはNS1特異的抗体で受動的に免疫された動物の防御が報告されている。NS1タンパク質は早期ウイルスRNA複製に関与すると考えられる。

0057

DEN−1、−2、−3および−4弱毒化株のNS2A、NS2B、NS4A、およびNS4Bタンパク質に生じる突然変異は性質上保存的である。DEN−2およびDEN−4ワクチンウイルスのそれぞれNS4A−75およびNS4A−95突然変異は、デングウイルスの間のアミノ酸保存部位に生じたが、一般的なフラビウイルスの間では生じなかった。

0058

フラビウイルスNS3タンパク質は少なくとも2つの認識された機能を有する。すなわち、ウイルスプロテイナーゼおよびRNAヘリカーゼ/NPTアーゼである。698aa長(DEN−2ウイルス)NS3タンパク質は、アミノ末端セリンプロテアーゼドメイン(NS3−51−His、−75−Asp、−135−Ser触媒三残基)およびそれに続くRNAヘリカーゼ/NTPアーゼ機能に関する配列モチーフ(NS3−196−GAGKT、−284−DEAH、−459−GRIGR)を含む。DEN−1、DEN−2、またはDEN−3ウイルスのNS3タンパク質における突然変異は、いずれも認識されたモチーフ内には生じなかった。DEN−1 PDK−13ウイルスにおけるNS3−510 TryからPheへの突然変異は保存的である。野生型DEN−2、−3および−4ウイルスはこの位置にPheを含むため、TryからPheへの突然変異がDEN−1ウイルスの弱毒化に寄与することは考えにくい。DEN−1 PDK−13ウイルスにおけるNS3−182 GluからLysへの突然変異は、大部分の蚊媒介性フラビウイルスでAspまたはGluとして保存された位置に生じており、弱毒化に何らかの役割を担っている可能性がある。この突然変異はGAGKTヘリカーゼモチーフの15アミノ酸残基上流に位置した。以前の報告で述べたように、DEN−2 16681ウイルスにおけるNS3−250−Gluは黄熱ウイルスを除く全ての蚊媒介性フラビウイルスで保存されている。

0059

核酸プローブは、DEN−1、DEN−3およびDEN−4ウイルスをコードする核酸分子またはその相補的配列と選択的にハイブリダイズする。「選択的」または「選択的に」という用語は、他の核酸とハイブリダイズしてデングウイルスの十分な検出を妨げることのない配列を意味する。したがって、ハイブリダイズ用核酸配列の設計において、選択性試料中に存在する他の成分に依存するであろう。ハイブリダイズ用核酸は、ハイブリダイズする相手である核酸のセグメントと少なくとも70%相補性を有しなければならない。核酸を説明するために本願で使用される場合、「選択的にハイブリダイズする」という用語は、偶発的に無作為にハイブリダイズする核酸を含まず、したがって、「選択的なハイブリダイズ」と同じ意味を持つ。本発明の選択的にハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする配列のセグメントと少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、および99%、好ましくは85%以上の相補性を有し得る。

0060

コード核酸またはその核酸の相補鎖または逆鎖に選択的にハイブリダイズする配列、プローブおよびプライマーが企図される。核酸との特異的ハイブリダイゼーションは、その核酸に機能的な種特異的ハイブリダイゼーション能力を維持させる限り、軽度の改変や置換を生じさせてもよい。「プローブ」は、相補的核酸配列と選択的にハイブリダイズしてそれを検出または増幅するためのプローブまたはプライマーとして使用可能な核酸配列を意味し、そのプローブは長さが約5〜100ヌクレオチド、または好ましくは約10〜50ヌクレオチド、または最も好ましくは約18〜24ヌクレオチドの間で変動可能である。

0061

プライマーとして用いられる場合、組成物は、標的分子の異なる領域にハイブリダイズして所望の領域を増幅する好ましくは少なくとも2つの核酸分子を含む。プローブまたはプライマーの長さに応じて、標的領域は70%相補的塩基から完全相補性までの範囲とすることができ、依然としてストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。例えば、デングウイルスの存在を検出する目的のために、ハイブリダイズ用核酸(プローブまたはプライマー)とそれがハイブリダイズする配列との間の相補性の程度は、少なくとも、他の有機体から核酸とのハイブリダイゼーションを識別するのに十分である。

0062

DEN−4、DEN−3またはDEN−1ウイルス(例えば構造要素)をコードする核酸配列を、プラスミド等のベクターに挿入することができ、生命体において組換え発現させて(例えばデング−2骨格中に)組換えデングウイルスペプチドおよび/またはポリペプチドおよび/またはウイルスを産生させることができる。

0063

核酸検出方法
本願に記載のワクチンウイルスの各々の診断である迅速遺伝子試験が本発明により提供される。本発明のこの実施形態は、ウイルス血症を発症したワクチン接種されたヒトの血清から単離されたウイルスの解析を促進し、また、候補ワクチンウイルスで免疫された非ヒト霊長類におけるウイルス血症の特徴解析を促進する。

0064

配列は、後述するように、逆転写/ポリメラーゼ連鎖反応(RT/PCR)、ならびに、cDNAアンプリコンを増幅するように設計されたフォワードアンプライマーおよびリバースアンプライマーを用いて、ウイルスゲノムRNAテンプレートから増幅されたcDNAアンプリコンの検出を報告するのに役立つ診断用TaqMan(登録商標)プローブを含む。ある例において、アンプライマーの1つはワクチンウイルス特異的突然変異をアンプライマーの3’末端に含むように設計されている。この設計は試験をワクチン株に対し更に効果的に特異的にする。その理由は、標的部位でのプライマーの伸長および結果的に増幅は、ウイルスRNAテンプレートがその特定の突然変異を含む場合にのみ生じるためである。

0065

自動化PCRに基づく核酸配列検出システム、あるいは核酸検出のための他の既知の技術を用いることができる。TaqManアッセイは、試料核酸テンプレートからPCR生成されたアンプリコンのリアルタイム可視化および定量の自動化が可能な高度に特異的かつ感度の高いアッセイである。TaqMan(登録商標)は、特定の配列の存在または不在を判定することができる。このアッセイでは、フォワードおよびリバースプライマーは標的突然変異部位の上流および下流にそれぞれアニーリングするように設計される。いずれかのアンプライマーよりも約10℃高い融解温度を有するように設計され、ワクチンウイルス特異的ヌクレオチド突然変異またはその相補体(検出されるRT/PCRアンプリコンの鎖に依存する)を有する特異的検出プローブが、このアッセイの第3のプライマー成分を構成する。

0066

ワクチンウイルスゲノムの1つにおいて突然変異した位置を特異的に検出するように設計されたプローブは、ワクチン特異的ヌクレオチドをプローブの中央に含み得る。このプローブは、ウイルスRNAテンプレートがワクチンウイルス特異的である場合、TaqMan(登録商標)アッセイにおいて検出可能な蛍光をもたらし得る。しかしながら、野生型DENウイルスに由来するゲノムRNAテンプレートでは、単一ヌクレオチドミスマッチ親ウイルスがDENウイルスである場合)、あるいは可能性として2つ以上のミスマッチ(他の野生型DENウイルスに生じ得る)に起因して、プローブハイブリダイゼーションの効率が低下し得、意味のある蛍光をもたらさないであろう。DNAポリメラーゼは、ミスマッチしたプローブを切断してレポーター色素を放出するよりも、ミスマッチしたプローブをRT/PCRアンプリコンテンプレートから外す傾向が強い(TaqMan(登録商標)対立遺伝子識別(Allelic Discrimination)アッセイ、アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems))。

0067

診断的遺伝子試験の1つの方策は、分子標識を利用することである。分子標識方策は、アンプリコンのRT/PCR増幅のための、および、プローブの両端にレポーター色素およびクエンチャー色素を含むプローブによるアンプリコン内での特異的配列の検出のためのプライマーも利用する。このアッセイでは、プローブはステム−ループ構造を形成する。分子標識アッセイは、TaqMan(登録商標)アッセイで用いられるものとは異なるクエンチャー色素およびレポーター色素を採用する。

0068

医薬組成物
本願の実施形態は、対象に対する、in vivo薬剤投与に適した生物学的に適合性の形態での組成物の投与を提供する。「in vivo投与に適した生物学的に適合性の形態」は、活性作用剤(例えば、実施形態の医薬化学物質、タンパク質、遺伝子)の投与される形態であって、活性作用剤の治療効果があらゆる毒性効果を上回る形態を意味する。薬学的に活性な量の医薬組成物の投与は、所望の結果を達成するのに必要な用量および期間での有効な量と定義される。例えば、薬学的に活性な量の化合物は、個体の病気の状態、年齢性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体の性能等の要因に応じて変動し得る。投薬レジメンは、最適な治療的応答を提供するように調整され得る。

0069

一実施形態において、化合物(例えば実施形態の医薬化合物、タンパク質、ペプチド等)は好都合な様式、例えば、皮下、静脈内、経口投与吸入、皮内、経皮適用、経膣適用、局所適用鼻腔内または直腸投与により投与されてもよい。投与の経路に応じて、活性化合物は保護バッファー(例えばFTA、F127/トレハロースアルブミン)中に含有されてもよい。一実施形態において、組成物は経口投与され得る。別の実施形態において、組成物は静脈内投与され得る。一実施形態において、組成物は鼻腔内投与、例えば吸入され得る。さらに別の実施形態において、組成物は無針システム(例えばPharmajet(商標))または他の皮内投与システムを用いて皮内投与され得る。

0070

組成物は、適切な担体または希釈剤中で対象に投与されるか、酵素阻害剤と共に、またはリポソーム等の適切な担体中で投与されてもよい。「薬学的に許容される担体」という用語は、本願で使用される場合、生理食塩水緩衝剤水溶液等の希釈剤を含むことを意図している。化合物を、不活性化を防ぐ材料でコーティングするか、そのような材料と共に投与する必要がある場合もある。活性作用剤は非経口的に、または腹腔内に投与されてもよい。グリセロール液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物ならびに油中に懸濁液を調製してもよい。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製物微生物の増殖を防ぐ保存剤または他の安定化製剤(例えばFTA)を含有してもよい。

0071

注射用に適した医薬組成物は、当分野で既知の手段により投与され得る。例えば、滅菌水溶液水溶性である場合)または懸濁液、および滅菌注射用溶液または懸濁液の即席調製用滅菌粉末が使用され得る。全ての場合において、組成物は滅菌することができ、注射可能である程度に流体とすることができる。製造および保管条件下で安定であってもよく、細菌および菌類等の微生物の汚染作用に対し保護されていてもよい。薬学的に許容される担体は、例えば、水、エタノールポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。例えば、レシチン等のコーティングの使用により、懸濁液の場合には要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物の抑制は、加熱、洗浄性物質への曝露照射殺菌あるいは様々な抗細菌剤または抗菌剤の添加により達成することができる。

0072

滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物(例えば、1種以上のデングウイルス血清型に対する免疫応答を誘導する化合物)を適切な溶媒に、必要に応じて上記に列挙した材料との1つ以上の組み合わせで含有させ、濾過滅菌することにより調製することができる。

0073

調剤されたら、溶液が投与製剤適合した態様で、治療上有効な量となるように投与される。製剤は、上述した注射用溶液のタイプなどの様々な剤形で容易に投与される。組成物は、筋肉内、皮下、皮内、鼻腔内および腹腔内投与に特に適していると考えられる。1:1、1:2または他の比率(例えば所与のデングウイルス血清型のPFU)などの特定の比率が模索されてもよい。

0074

活性治療剤は、混合物中に所定の比率で調剤されてもよい。単一用量または複数の用量を、所与の状況(例えば旅行の前、デング熱の流行前)に対する適切なスケジュールで投与することができる。

0075

別の実施形態において、鼻腔用溶液またはスプレーエアロゾルまたは吸入剤対象化合物送達に用いられてもよい。他の投与方法に適切な更なる製剤は、坐薬およびペッサリを含む。

0077

医薬組成物は、活性材料を体からの迅速な排出から保護する担体、例えば持続放出製剤又はコーティング等と共に調製されてもよい。そのような担体は、限定するものではないが、マイクロカプセル化送達システム、および生分解性生体適合性ポリマー(例えば、エチレン酢酸ビニルポリ無水物ポリグリコール酸ポリオルトエステルポリ乳酸および他の既知のもの)等の制御放出製剤を含む。

0078

医薬組成物は、移植副作用を抑制または緩和するのに、かつ/または拒絶反応を軽減または抑制するのに効果的な量および頻度で投与される。厳密な用量および治療の継続期間は、既知の試験プロトコルを用いて、または組成物を当分野で既知のモデルシステムで試験し、そこから推定することにより経験的に決定され得る。また、用量は症状の重症度とともに変動し得る。医薬組成物は一般に、治療上有効な効果を発揮し、かつ望ましくない副作用を最小化するように製剤され、投与される。一般に、約102〜106PFUの用量範囲を最初に投与することができ、任意選択で、必要に応じて2回目の投与を30日以内から最大180日後までに続けてもよい。ある実施形態において、対象は本願に開示の一価、二価、三価または四価の組成物の二重の投与を受けてもよく、ここで、組成物は単一組成物混合物であるか、異なるデングウイルス血清型の所定の組成物を有する。いくつかの実施形態において、DEN2/4キメラが弱毒生デング−1等の他のデングウイルス血清型よりも高濃度で存在してもよい。

0079

任意の特定の対象について、個々の必要性に従って特定の投薬レジメンが時間をかけて調整されてもよいことは明らかであろう。
一実施形態において、本願に開示の組成物は対象に皮下または皮内投与することができる。

0080

弱毒生デングウイルスを含む医薬組成物は、個体、特にヒトに対し、例えば皮下、筋肉内、鼻腔内、経口、局所、経皮、非経口、胃腸内、経気管支、および経肺胞投与されてもよい。局所的投与は、治療上有効量のセリンプロテアーゼ阻害剤を含有する局所適用クリームゲルリンス液等により達成される。経皮投与は、セリンプロテアーゼ阻害剤が皮膚を浸透血流へ入るのを可能にするクリーム、リンス液、ゲル等の適用により達成される。また、浸透圧ポンプを投与に用いてもよい。必要な用量は、治療される特定の症状、投与方法および体からの分子の排除速度と共に変動し得る。

0081

本発明の方法の特定の実施形態において、対象はヒトまたは獣医動物および/または家畜化動物あるいは家畜または野生動物等の哺乳類であってもよい。
治療方法
本発明の一実施形態において、方法は、本願で企図される弱毒生および/またはキメラウイルス構築物の一価、二価、三価または四価製剤を用いたデングウイルス血清型に対する免疫応答の誘導を提供する。

0082

本発明の実施形態は、下記の非限定的な実施例によってさらに例証される。これらはいかなる場合にも、それらの範囲に限定を課すものと解釈されないものとする。反対に、本明細書中の説明を読めば、これらの様々な他の実施形態、変更例、および等価物が当業者には明確に理解され、それら自体を、本発明の趣旨または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく示唆し得る。

0083

〔実施例〕
以下の実施例は、本明細書に示される特定の実施形態を実証するために含められる。以下の実施例において開示された技術が、本明細書に開示される実施において十分に機能することが見出されている代表的な技術に従っており、よってその実施の好ましい形態を構成するとみなすことができることは、当業者には理解されるはずである。しかしながら、当業者は本開示に鑑みれば、開示されるある種の実施形態では、本願の趣旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であり、依然として同様のまたは類似の結果を得られることを理解するはずである。

0084

〔実施例1〕
いくつかの例示的方法において、本願では「マスターウイルスシード(MVS)」と呼ぶものを作製するために使用される組成物が開示される。これらの組成物は、DEN−1、DEN−2、DEN−3、およびDEN−4等の1つ以上の弱毒生デングウイルスから誘導され得る。特定の方法では、組成物は、DENVax−1、DENVax−2、DENVax−3、およびDENVax−4と呼ばれる本願に開示される特定の構築物を含むがこれらに限定されない1つ以上の弱毒生デングウイルスから誘導され得る。他の例示的方法において、これらの組成物を製造し特徴解析するのに用いられる方策が提供される。さらに他の実施形態において、四価デングウイルス製剤およびこれらの製剤の遺伝子のおよび表現型の特徴解析が提供される。

0085

プレマスターDENVaxウイルスの製造および解析
デングウイルス(例えばDENVax)の連続的増幅および精製等の特定の手順を実施してプレマスターデングウイルスシードを作製した。まず、完全長組換えDENVaxcDNAから転写されたウイルスRNAを産生の保証された細胞(例えばVero細胞)に導入することによりDENVaxウイルスを再誘導して、P1(継代1)ウイルスシードを得た。デング−1からデング−4の各々からの4つのP1ウイルスを、続いて増幅し、プラークを精製して候補プレマスターワクチンP7シードを得た(表1参照)。特定の試験を実施してデングウイルスの各継代を解析した。例えば、完全長ゲノム配列解析により、P2(継代2)シードウイルスの全4種が、それらの同種の祖先である、研究的に誘導されたリサーチグレードの候補ワクチンウイルスと遺伝子的に同一であることが実証された。元のプラーク表現型もP2ウイルスで維持されていた。デングウイルスの各血清型(例えばDENVax1〜4)についてP2シードから6つのプラーク精製ウイルス(P3A〜F)を単離し、各単離プラークを更に2回、直接プラーク精製した。各ウイルスの3回目のプラーク精製物(P5)をVero細胞で2度増幅し(P6A〜FおよびP7A〜F)、潜在的なプレマスターP7DENVaxシードを作成した(表1)。

0086

0087

P7 DENVaxシードの特徴解析、例えばP7シードのゲノム配列およびプラーク表現型の解析、およびP2シードとの比較(表2)のために、いくつかの試験を更に実施した。P7ウイルスのプラーク表現型はP2シードに大体類似していた。いくつかの例示的実験において、ウイルス力価をモニタリングした。P7シードのうち、5つのウイルスを除く大部分でウイルス力価は6.0 log pfu/ml超に達した。Vero細胞での10回以上の連続継代後の60を超える候補ワクチンウイルスシードのゲノム配列解析は、DENV−2 PDK−53遺伝子ベクターの3つの主要な弱毒化決定要因のうちNS1−53およびNS3−250に復帰事象がないことを示した。これは、これらの2つの位置が候補ワクチンウイルスシードにおいて非常に安定であることを示唆している。これら2つの部位について、フォワードおよびリバース両方の配列解析から生成された、24の候補株の全配列クロマトグラムは、NS1−53およびNS3−250位置に明らかな僅かなヌクレオチド集団も一切なく相同であった。NS1およびNS3部位とは反対に、多数回連続継代されたリサーチグレードのワクチンウイルスからは、5’NCR−57弱毒化位置で異なるレベルの復帰が確認された。これは、この位置が細胞培養での多数回の継代後、NS1およびNS3よりも安定でない可能性があることを示唆している。そのため、5’NCR−57位置における復帰率をリアルタイムRT−PCRで正確に測定するため、高感度ミスマッチ増幅アッセイ(TaqMAMA)を開発した。いくつかの研究において、全24のP7シードの5’NCR−57復帰率をTaqMAMAで測定した。アッセイ中、各ウイルスにつきインプットのウイルスRNAの濃度に応じて、TaqMAMAの感度限界の範囲は0.01%〜0.07%の復帰率となった。これは、コンセンサスゲノム配列解析により検出可能な感度限界である10〜30%の復帰率よりも遥かに感度が高い。得られたデータは、24のP7ウイルスのうち15で復帰が最少または検出不能(<0.07%)であり、1つのウイルス(DENVax−3−D)でほぼ100%の復帰であり、8つのウイルス(1つのDENVax−1、1つのDENVax−2、2つのDENVax−3、および4つのDENVax−4)で0.08%から12.85%の範囲の部分的復帰であったことを示している(表2)。24のP7ウイルスのうち、TaqMAMAで測定された5’NCR57復帰が低レベルであった16種について、完全長ゲノム配列解析を実施した。配列決定されたウイルスは他の2つのDENVax弱毒化決定要因(NS1−53、NS3−250)を維持しており、全てが、元の操作した組換えcDNAクローンに存在しない更なる突然変異を獲得していた(表2)。1つの例示的標的ワクチン組成物において、DENVax−1−A、DENVax−2−F、DENVax−3−F、およびDENVax−4−Fを、各血清型について標的プレマスターシードとして選択した。その理由は、これらの遺伝子型およびプラーク表現型が、元々設計されたワクチン組換え体のそれらに最もよく似ていたためである。DENVax−1−A、DENVax−2−F、およびDENVax−4−Fは2つの、DENVax−3−Fは1つの非同義突然変異を有していた。この証拠は、これらの4つのプレマスターシードで観察されたこれらの更なる突然変異がウイルスの安全性の問題または免疫原性の変更を生じないことを示唆している。MVSを作製するために、これらのプレマスターシードを更に増幅した(P7と表されるマスターシード、表1)。

0088

本願で提供される例示的な方法は、ワクチン保証Vero細胞を形質転換してワクチンウイルスを生成するために、純粋供給源としてクローニングされたcDNAプラスミドからin vitroで転写されたウイルスRNA精製物を用いた。製造されたワクチンシードが最適な純度および遺伝子安定性であるようにするため、製造工程には連続的プラーク精製およびフルゲノム配列解析を含めた。DENVaxの各血清型の潜在的なプレマスターシードとして、6つのクローニングウイルスを調製した。TaqMAMAおよび完全ゲノム配列解析を含むゲノム解析により、ならびにウイルスプラーク表現型の特徴解析により、各血清型(血清型1〜4)につき、マスターウイルスシード生成に進めるためのプレマスターシードが選択された。選択されたプレマスターシードの復帰は5’NCR−57位置で検出不能であった(<0.01%または<0.07%)。これらのゲノムには1または2個のアミノ酸置換があり、以前に観察された小プラークの表現型を維持した。

0089

0090

〔実施例2〕
いくつかの例示的方法において、マスターウイルスシード、ワーキングウイルスシードおよびバルクウイルスシードの組成物、ならびにそれらの遺伝子のおよび表現型の特徴解析が説明される。これらの組成物は、臨床材料の製造、そして究極的には市販のワクチン供給のために提供される。製造されたワクチンシードの組成物が、治験材料の製造に最適な純度および遺伝子安定性であるようにするため、製造工程には連続的プラーク精製およびフルゲノム配列解析を含めた。

0091

MVS、WVS、およびBVSの製造および製造品質管理
いくつかの研究では、保証されたVero細胞中でプレマスターP7シードを増幅することにより4DENVaxのMVSを製造した。他の研究では、MVSを用いて細胞ファクトリーで大量のWVSを作製した。さらに、DENVaxのBVSストックをWVSから増幅し、ヒト治験用の四価薬剤製品混合物として製剤化した。製品リリース品質管理は、MVS、WVS、およびBVSの全てについての同一性感染力価無菌性マイコプラズマ、ならびにin vitroおよびin vivo外来物質(adventitious agent)試験を含むがこれらに限定されないいくつかの例示的方法で実施された。全てのシードが、血清型特異的RT−PCRアッセイを用いたウイルス同一性試験に合格し、これは、その血清型に対応する正の増幅および異種血清型の負の増幅を示した(データは示されていない)。マイコプラズマおよび外来物質は、MVS、WVS、またはBVSストックでは検出されなかった。

0092

MVS、WVS、およびBVSの遺伝子解析
ある例示的な方法において、選択されたプレMVS(P7)からのMVSの作成後、上記で選択された株を生成し、個々のウイルスRNAを再度配列解析した。完全長ゲノム配列解析により、DNVax−1のMVSはそのプレマスターシードと同一であったが、WVSおよびその後のBVSは、E−483およびNS4B−108に2つの更なる置換を獲得したことが判明した(表2および3参照)。E−483のAla置換は、MVSでは遺伝子型の一部を代表したが、BVSでは主要な遺伝子型となった。DENVax−2およびDENVax−3はそれらのプレマスターシードのそれぞれと同一であった(表2および3)。DENVax−2 MVSはそのマスターシードと同一であり、WVSおよびBVSはNS4A−36およびNS4B−111に2つの更なる突然変異を有した。どちらの突然変異も、WVSでは部分的であり、BVSでは主要な遺伝子型であった。DENVax−3のMVSもやはりそのプレマスターシードと同一であったが、WVSおよびBVSはNS4A−23に更なるaa置換を含んでいた。DENVax−4 MVSは、MVSの製造中、NS2A−99位置に更なる(LysからLys/Arg混合遺伝子型への)アミノ酸突然変異を獲得した(表3)。そのWVSおよびBVSはNS2A−99Lys/Arg混合遺伝子型を維持し、BVSは更にNS4B−238Ser/Phe混合遺伝子型を有した。コンセンサス配列結果は、MVS、WVSおよびBVが、5’NCR−57、NS1−53、およびNS3−250位置の3つの弱毒化遺伝子決定要因を保持したことも裏付けた。TaqMAMAによる最低安定性弱毒化位置の解析では、5’NCR−57復帰率がMVSでは<0.7%から0.13%であり、WVSでは≦0.07%であり、BVSでは<0.07から0.21%であったことが実証された。5’NCR−57位置での3%の復帰は、ワクチンロット受け入れについての最大許容率であると考えられた(表3)。

0093

0094

フルゲノム配列解析により、更なるアミノ酸突然変異がDENVax−4 MVSに生じ、一方、他の3つのpDENVax MVSロットは、それらのプレマスターシードのコンセンサスゲノム配列を保持したことが分かった。全体では、P1シードの誘導物からプレマスター(P7)シードまで、1つか2つの非同義突然変異が所与のシードで生じたのみであった。P1からMVS(P8)シードまで、任意の所与のDENVaxシードで2〜7個のヌクレオチド置換が同定され、これらの置換のうち2〜3個のみがアミノ酸変化をもたらした。よって、僅かな変化が生じた。RNAウイルスはそれらのゲノム複製物でエラーを生じやすく、そのため、細胞継代中のフラビウイルスゲノムの遺伝子上の置換は予想外のものではない。MVSにおけるサイレント変異はいずれも、ウイルス複製に影響を及ぼし得る5’または3’NCR内にはなかった。DENVax−2のprM−52におけるLys−Gluの変化、およびDENVax−4のNS2A−66におけるAsp−Glyの置換のみが、保存的変化ではなかった。DENVax−4のNS2A−66変異は、DENV−2 PDK−53の非構造的骨格部分にある。NS2A−66位置は、DENV−2の様々な株では通常Aspであるが、DENV−4では通常Glyである。DENVax−4におけるAspからGlyへの変化は、Vero細胞におけるDENVax−4の適合に関係している可能性がある。DENVax−2 prM−52突然変異は、prMの、成熟ウイルス粒子から切り出されるC末端部分に存在する。いくつかの例示的方法において、MVSシードのいずれの突然変異もワクチンの弱毒表現型をあまり変化させないことを確認するために、表現型の特徴解析を行った。

0095

DENVaxウイルスは、製造工程中の高い遺伝子安定性を示した。5’NCR、NS1−53、およびNS3−250における3つの特定されたDENV−2 PDK−53弱毒化位置は、プレマスター株からバルクワクチン調製までのDENVaxの連続継代時も、コンセンサスゲノム配列において安定したままであった。5’NCR−57位置の高感度TaqMAMAは、各デングウイルス血清型のMVS、WVS(P9/ワーキング)、およびBVS(ワクチン用バルクウイルスシード(Bulk Virus Seed))での最小または検出不能な復帰を示した。DENVax BVS調製物(P10等価物)の5’NCR−57復帰率は、Vero細胞において10回連続継代後にリサーチグレードワクチン候補物において展開された5’NCR−57復帰率(4〜74%の復帰)よりも有意に低かった。本願で提供するDENVaxシードの大規模製造のための方策は、その候補ワクチンウイルスにおいて弱毒化マーカーを保持した遺伝子的に安定なワクチンシードをもたらした。

0096

DENVax MVSのプラーク表現型
1つの例示的方法において、DENVax MVSのプラーク表現型を野生型デングウイルスと、およびこれらと同種のリサーチグレードキメラウイルスとVero細胞において比較した(図2)。DENVax−1、−2、および−3のMVSの全てが、それらの野生型ホモログよりも有意に小さく、かつそれらの同種リサーチグレードウイルスに非常によく似た(0.4mm差以内の)プラークをVero細胞内で形成した。また、DENVax−4 MVSは野生型DENV−4よりも有意に小さかったが、元の実験室由来のD2/4−Vキメラよりは僅かに大きかった(0.9mm差)。

0097

図2は、DENVax MVSのプラークサイズを対照野生型ウイルスおよびリサーチグレードワクチン候補ウイルスと比較して示した例示的なヒストグラムを表す。アガロースオーバーレイ下のVero細胞におけるウイルスプラークの平均プラーク直径(mm)±SD(エラーバー)をpi9日目に測定した。黒のバーで表す野生型DENウイルス、および白のバーで表す以前に公開されたリサーチグレードワクチン候補ウイルスを、灰色のバーで表すDENVaxマスターワクチンシードに対する対照および比較のために含めた。

0098

DENVax MVSの温度感受性
別の例示的方法において、Vero細胞における温度感受性をDENVax MVSについて調査し、それらの同種野生型および元のリサーチグレードキメラワクチンウイルスと比較した。野生型(wt)DENV−3 16562は温度感受性ではなかった。wtデングウイルス血清型1およびデングウイルス血清型−4は、39℃で中程度に温度感受性であった(39℃での力価は、37℃よりも約1.0 log10pfu/ml低かった。図3)。wtデングウイルス血清型−2 16681は、調査したwtデングウイルスの中で最も温度感受性であり、39℃で力価が100分の1に低下した。DENVax−1、−2、および−3はそれらの元の同種リサーチグレードキメラワクチンウイルスと同程度の温度感受性であった(図2)。これらのDENVax株では、39℃での力価は2.0〜3.0 log10pfu/ml低下した。DENVax−4も温度感受性であり、力価の5分の1の低下を示した。しかし、元のリサーチグレードD2/4−Vは、力価の約10分の1の低下を示した。最終安定化DENVax−4 MVSはF127(および、これらの製剤を安定化することが知られている他の作用剤(FTA))を含み、これはデングウイルスの熱安定性を高めることが示された。DENVax−4 MVSにおけるF127の存在は、Vero細胞培養アッセイにおいて、ウイルスのあまりはっきりしない温度感受性に貢献するように思われる。別の実験において、F127の存在しないMVS誘導性DENVax−4株の温度感受性をさらに評価した。株からF127を除去するために、ウイルスRNAをDENVax−4バルクウイルス調製物から単離し、Vero細胞に導入した。このF127の存在しないDENVax−4ウイルスは、pi3日目、D2/4Vリサーチ株と同程度(力価が1.5 log10pfu/ml低下)の温度感受性のようであった(図3)。

0099

図3は、DENVax MVSの温度感受性を示す例示的なヒストグラムを表す。野生型デングウイルスおよび以前に公開されたリサーチグレードワクチン候補ウイルスを比較のために含めた。DENVax−4 MVSは、このアッセイでのウイルスの温度感受性の結果をマスキングし得る更なるF−127を含む。F127の存在しないサロゲートDENVax−4を解析する別の実験も含められた。37℃または39℃で、Vero細胞において複製されたウイルスの平均力価±SD(エラーバー)。

0100

蚊C6/36細胞におけるDENVax MVS複製
リサーチグレードキメラワクチンウイルスはC6/36細胞において骨格DENV−2 PDK53ウイルスの弱毒表現型を維持したという知識の下、いくつかの例示的方法において、DENVax MVSをC6/36細胞で増殖させ、これらのin vitro弱毒表現型の維持について評価した。wtデングウイルスに比べ、DENVax−1、DENVax−2およびDENVax−4 MVSは、C6/36細胞においてpi6日目に有意な増殖低下(少なくとも3 log10pfu/mlの低下)を示した(図4)。DENVax−3 MSVも、wtDENV−3 16562と比べて増殖の低下を示したが、それほど顕著な低下ではなかった(1〜2 log10pfu/mlの低下)。しかしながら、DENVax−3シードロットのC6/36力価は元のリサーチグレードキメラD2/3−VワクチンウイルスのC6/36力価に類似していた(1 log10pfu/ml以内の差)。

0101

図4は、C6/36細胞におけるDENVax MVS(灰色のバー)の制限された増殖を、wtデングウイルス(黒いバー)およびリサーチグレードワクチンウイルス(白いバー)と比較してプロットした例示的なヒストグラムを示す。pi6日目、C6/36細胞で複製されたウイルスの平均力価±SD(エラーバー)。

0102

蚊個体におけるウイルス感染率播種率、および伝染率
いくつかの例示的方法において、DENVaxの感染率および播種率をそれらの親のwtデングウイルスと比較した。ある例示的な実験において、ネッタイシマカで経口感染実験を実施した。感染性の血液飼料逆滴定してウイルス力価を測定し、各血清型について親のデングウイルスとDENVaxとの間でウイルス力価が類似している(1 log10pfu/ml未満の差)血液飼料を用いた実験のみを、比較のために表4に含めた。DENVax−1、DENVax−2、およびリサーチグレードD2 PDK−53−VV45Rは、経口給餌では蚊を感染させず、これはそれらの親ウイルスであるDENV−1 16007(44%感染)およびDEN−2 16681(43.3%感染)とは有意に異なっている(p<0.0001)。DENVax−1および−2によって感染した蚊は存在しなかったため、これら2つのワクチンウイルスについて播種の心配はほとんどあるいは全くなかった。DENVax−4は一部の蚊を経口給餌により感染させたが(55匹中2匹)、感染率は親wtウイルスのDENV−4 1036(50匹中8匹)よりも有意に低かった(p<0.05)。DENVax−3は、ウイルス力価5.2±0.02 log10pfu/mlの血液飼料を用いた2つの実験(表4)では蚊を全く感染させず、ウイルス力価6.0 log10pfu/mlの血液飼料を用いた別の実験では30匹中1匹の蚊だけが感染した(データは示されていない)。しかしながら、wtデングウイルス−3 16562も5.2 log10pfu/mlでの感染率は非常に低く(8%)、この率は、6.2 log10pfu/mlのより高い血液飼料ウイルス力価を用いた別の実験でも上昇しなかった(3%、蚊30匹中1匹が陽性、データは示されていない)。野生型(wt)デングウイルス−3およびデングウイルス−4はwtデングウイルス−1およびデングウイルス−2よりも有意に低い感染率であったが、感染した蚊における平均ウイルス力価は類似していた(3.1〜3.9 log10pfu/蚊)。対照的に、2匹の感染した蚊のDENVax−4力価は両方とも最低限(0.7 log10pfu/蚊)であり、これはwtデングウイルス血清型−4 1036に感染した蚊の力価(3.9±1.5pfu/蚊)の1000分の1であった。

0103

感染した蚊について、中腸からの播種はウイルスが肢に存在するか否かを調べることにより評価することができる。4つの親DENVは36.3%〜62.5%の範囲の播種率をもたらし、肢からのこれらの平均ウイルス力価(log10pfu)は0.9±0.3から2.2±0.7の間であった(陰性サンプルを除く)。これら2匹のDENVax−4感染蚊はいずれも肢へのウイルス播種をもたらさなかった(表4)。播種されたウイルスは肢で検出されたが、4つのwtデングウイルスはいずれも経口感染蚊の唾液では検出されなかった。このことは、経口給餌条件が、これらのDENVの伝染率を測定するのに十分な感度でない可能性があることを示唆している。したがって、他の例示的な方法において、直接IT接種による高ストリンジェント人工的蚊感染を続いて実施した(表4)。DENVax−4を除く全てのウイルス(wtおよびDENVax)が、IT接種されたネッタイシマカの100%の感染を達成した。DENVax−4接種ではウイルス力価が他の3つのウイルス接種よりも僅かに低かったが、それでも接種された蚊の70%を感染させるのに成功した。IT接種による高い体幹感染率にもかかわらず、全4種のDENVaxウイルスが、wtデングウイルス(43〜87%、表4)と比較して有意に低い(p<0.005)または検出不能の伝染率(0〜10%)を示した。DENVaxウイルスは、経口給餌後に感染および播種をほとんどあるいは全く示さず、また、高ストリンジェントIT結果はこれらのDENVaxウイルスのネッタイシマカにおける最低限の伝染能力を確認した。

0104

0105

ベクター適性は弱毒生フラビウイルスワクチンウイルスにとって重要な安全性要素である。以前、リサーチグレードDENV−2 PDK−53−VV45Rウイルスおよびwt誘導体をネッタイシマカで試験し、NS1−53−Asp弱毒化突然変異は、損なわれた蚊複製にとって支配的な決定因子であることを発見した。DENV−2 PDK−53ワクチンの他の2つの主要な弱毒化位置である5’NCR−57−TおよびNS3−250−Valも、蚊における複製に対し何らかの阻害作用を示し、したがって蚊ベクター適性に更に重複する制限を提供した。本明細書に記載のいくつかの例示的方法を、蚊の経口およびIT感染ならびに全4種のDENVax株の複製を試験するために使用した。DENVax−1、−2、および−3は、ネッタイシマカ蚊を経口感染では全く感染させなかった(表4)。DENVax−4は経口曝露された蚊の3.6%を感染させたのみであり(これはwtDENV−4よりも有意に低いレベルである)、蚊の体幹における複製平均力価はwtDENV−4感染蚊よりも低かった。驚くべきことに、DENVax−4は感染した蚊の肢で検出されており、DENVax−4は経口感染後に蚊の中腸から播種できないことを示唆している。DENVax−1、−2、および−4の感染率は、いずれもそれらの対応するwtのものよりも有意に低かったが、DENVax−3とwtDENV−3 16562との間では、両方のウイルスで感染率が非常に低かったため、この差は有意ではなかった。同じタイ王国のメーソートから収集したネッタイシマカで評価したDENVの他のwt株と比較して、DENVaxの作出に使用した親wtデングウイルス株では、経口感染による感染率および播種率が低いようであった。黄熱(YF)17DワクチンベースのChimeriVax−DENワクチンの作出に用いられたwtDENV−1 PUO359、DENV−2 PUO218、DENV−3 PaH881/88、およびDENV−4 1288は、47〜77%の範囲の感染率であった。反対に、YF17Dワクチンはネッタイシマカを感染させることができない。ChimeriVax株はこれらの高感染性wtDENV由来のprM−Eを含んでいたが、ChimeriVaxは、そのYF17D複製骨格の蚊弱毒表現型を維持する。本明細書に提示された結果は、DENV−2 PDK−53骨格の蚊弱毒化がDENVax株で維持されたことも示す。さらに、本明細書に記載の組成物に含有される構築物における蚊感染性の低いwtデングウイルス株の使用は、更なる安全性特性を提供する。

0106

経口感染結果は、DENVaxが最少の蚊感染性および播種能力を有することを示している。さらに、より感度が高く、よりストリンジェントなIT感染実験を実施して、ネッタイシマカによって伝染されるDENVaxの潜在能力をさらに解析した。IT結果は、全4種のDENVaxウイルスで、それらの対応するwtと比較して蚊感染能力が検出不能または最低であることを示した。DENVax伝染は、理論的には(1)ベクターが、蚊の中腸を感染させるのに十分なウイルス血症力価をワクチンに供給する場合、(2)ウイルスが中腸上皮内複製可能であり、その後中腸から出て播種可能な場合、および(3)播種されたウイルスが唾液腺で複製可能であり、伝染に十分なウイルスを唾液で吐き出せる場合にのみ生じ得る。蚊を感染させるのに必要なヒトウイル血症閾値は十分に確立されていないが、天然wtDENV感染後、ヒトウイルス血症は106〜108蚊感染用量50(MID50)/mlとなり得る。このMID50は、蚊への希釈ヒト血漿の直接IT接種に基づいた。非ヒト霊長類におけるDENVaxの解析は、DENVax免疫後のウイルス血症力価が非常に低く(2.4 log10pfu/ml未満)、2〜7日間続くことを示した。このウイルス血症レベルの低さおよびDENVaxの蚊への感染、播種、および伝染能力の低さを考慮すると、これらのワクチンウイルスが自然環境で蚊によって伝染し、あるいはウイルス血症を引き起こすとは考えにくい。

0107

したがって、1種、2種、3種または全4種のデングウイルス血清型に対する安全かつ効果的なワクチンを製造するために、任意の血清型の任意の継代物(P1〜P10)が組成物に使用可能であることが提案される。

0108

哺乳期マウスにける神経毒性
元のリサーチグレードワクチンウイルスは、DVBD/CDCでセンター内に維持された新生ICRマウスにおける神経毒性に関して高度に弱毒化された。これらのマウスは全て、104pfuでの各ワクチンウイルスのic(脳内)攻撃を生き延びた。一方、wtデングウイルス血清型−2 16681ウイルスは、様々な実験においてこれらのCDC−ICRマウスの62.5%〜100%の死亡率をもたらした。いくつかの実験では、タコニックラブズ(Taconic Labs)から入手した市販のICRマウス(Taconic−ICR)を用いて新生マウスにおける神経毒性を調査した。新生Taconic−ICRマウスは、以前のCDC−ICRマウスよりも、デングウイルス血清型−2に対して有意に感染しやすいことが観察された。図5Aは104pfuのウイルスでic攻撃されたTaconic−ICR新生マウスおよびCDC−ICRコロニーにおけるwtデングウイルス血清型−2 16681の神経毒性をまとめたものである。Taconic−ICRマウス(32匹のマウスで100%死亡率、平均生存時間8.3±0.5日)は、以前のCDC−ICRマウス(72匹のマウスで91%致死率、平均生存時間14.6±2.3日)よりも、icデングウイルス血清型−2 16681攻撃に対し、より影響を受けやすかった。

0109

他の例示的な方法において、1つ(n=16)または2つ(n=31〜32)の実験で、DENVax MVSの神経毒性を評価するために、Taconic−ICRマウスを最初に約104pfuの用量のwtデングウイルス血清型−2 16681、D2 PDK−53 VV45R、D2/3−V、またはDENVax1〜4ウイルスでic(脳内)攻撃した(図5B)。この用量で、D2/3−VリサーチグレードウイルスならびにDENVax−1およびDENVax−3 MVSは完全に弱毒化された神経毒性表現型を示した(疾患および死亡なし)。予想通り、wtデングウイルス血清型−2は「致死性」であり、平均マウス生存時間AST)は8.3±0.8日であることが分かった。これらのデングウイルス血清型−2−感受性Taconic−ICRマウスにおいて、D2 PDK−53−VV45Rリサーチグレードウイルスは81.3%の死亡率をもたらした。DENVax−2 MVSおよびDENVax−4 MVSはTaconic−ICRにおいて一様に致死性であり、それぞれ9.8±1.7、10.2±1.4、および11.3±0.4日のAST値を示した。

0110

いくつかの例示的方法において、wtデングウイルス血清型−2 16681ウイルスの神経毒性を、D2 PDK−53 VV45R、DENVax−2 MVSおよびDENVax−4 MVSと、ならびにD2/4−Vリサーチグレードウイルスと、10分の1の用量(103pfu、図5C)で比較した。wtデングウイルス血清型−2は、この低い攻撃用量で、9.0±1.4日のASTで一様に致死的な神経毒性表現型を維持した。他の4種のウイルスは中間型の神経毒性表現型を示し、神経毒性の程度は血清型特異的であった。D2 PDK−53−VV45RウイルスおよびそのDENVax−2 MVSの同種物は有意な弱毒化を示した(それぞれ、13.1±3.8日のASTで32.3%の生存率、および10.5±3.4日のASTで31.2%の生存率)。DENVax−4 MVSおよびリサーチグレードD2/4−Vウイルスは両方とも、神経毒性に関して高度に弱毒化されていた(それぞれ、18.8±5.8日のASTで81.3%の生存率、および100%の生存率)。この結果は、DENVax−1および−3のMVSが完全な神経毒性の弱毒化を示し、一方、DENVax−2および−4 MVSロットは、それらの同種リサーチグレードウイルスワクチン候補に非常によく似た弱毒表現型を維持したことを示唆した。

0111

図5A〜5Cは、wtデングウイルス血清型−2および種々の弱毒化デングウイルスを含む様々な組成物で処置した新生マウスにおける神経毒性を示す例示的なグラフを表す。多数の実験のプールした結果は、104pfuのウイルス(A)でic攻撃したCDC−ICR(n=72)およびTaconic−ICR(n=32)新生マウスにおけるwtデングウイルス血清型−2 16681ウイルスの神経毒性をまとめている。104pfu(B)または103pfu(C)の用量でのTaconic−ICRマウスにおけるDENVax MVS試験の神経毒性。1つの実験(n=16)または2つのプールされた実験(n=31または32)において試験された動物の1群当たりの数が示されている。

0112

WVS、およびBVSのプラーク表現型
WVSおよびBVSのプラーク表現型をMVS、wtデングウイルスおよびそれらの同種の実験室由来のリサーチグレードキメラとVero細胞において比較するために、ある調査を行った(図6)。各ワクチンウイルスにつき10個(ただしwtDENV−1、−3、および−4については減らした数)のプラークから平均プラークサイズを計算した。DENVax−1、−2、および−3のMVSウイルスはいずれも、Vero細胞において、それらのwtホモログよりも有意に小さく、同種リサーチグレードウイルスと非常に近い(0.4mm差以内)プラークを形成した。DENVax−4 MVSもwtDENV−4よりも有意に小さかったが、元の実験室由来のD2/4−Vキメラよりは僅かに(0.9mm)大きかった。DENVax−2を除き、DENVax−1、−3、−4のWVSおよびBVSはいずれも、それらのwtホモログから形成されるプラークよりも有意に小さいプラークサイズを維持した。DENVax−2 WVSおよびBVSは、Vero細胞においてwtDENV−2ウイルスのプラークに近いプラークを形成したが、LLC−MK2細胞で試験したところ、DENVax−2製造シードの全てが、wtDENV−2のものよりも幾分小さく(1.4±0.4)、実験室由来のD2 PDK−53−VV45Rに近い(1.0±0.3)プラークを形成した(図6)。

0113

小さいプラーク表現型、温度感受性、蚊細胞における低下した複製、蚊による低下した感染/播種/伝染、および新生ICRマウスにおける低下した神経毒性を含むウイルス弱毒化の表現型マーカーの評価を、MVSストックの組成物について決定した。結果は、全てのDENVaxが、予想された、元のリサーチグレードワクチンウイルスに似た弱毒表現型を維持することを示した。弱毒化の原因となる突然変異がMVS、WVSおよびBVの全てで保存されていることを考慮すると、弱毒表現型はヒト治験用に製造された材料で維持されると予想することができる。

0114

図6は、DENVax MVS、WVS、およびBVSのプラークサイズを示す例示的なヒストグラムを表す。アガロースオーバーレイ下のVero細胞またはLLC−MK2細胞内のウイルスプラークの、pi9日目に測定された平均プラーク直径±SD(エラーバー)。wtDENVおよび以前に公開されたリサーチグレードワクチン候補ウイルスを対照および比較のために含めた。

0115

蚊C6/36細胞内でのウイルス複製
以前の研究により、リサーチグレードPDK−53ベースキメラワクチンウイルスは、C6/36細胞内で骨格DENV−2 PDK53ウイルスの弱毒表現型を維持することが実証された。いくつかの例示的方法において、DENVax MSV、WVS、およびBVSをC6/36細胞内で増殖させ、大規模製造後のこのin vitro弱毒化マーカーの維持について評価した。wtデングウイルスと比較して、DENVax−3を除き、製造されたシードはC6/36細胞内でpi6日目に顕著な増殖低下(少なくとも3 log10pfu/ml)を示した(図7)。DENVax−3シードもwtDENV−3 16562と比べて低下した増殖を示したが、それほど顕著な低下ではなかった(1〜2 log10pfu/ml)。しかし、DENVax−3シードロットの力価は元のリサーチグレードキメラD2/3−Vワクチンウイルスと同程度であった(1 log10pfu/ml差以内)。

0116

図8は、C6/36細胞におけるDENVax MVS、WVS、およびBVSの制限された増殖をプロットした例示的なヒストグラムを表す。pi7日目にC6/36細胞内で複製されたウイルスの平均力価±SD(エラーバー)。wtデングウイルスおよび以前に公開されたリサーチグレードワクチン候補ウイルスを比較のために含めた。

0117

哺乳期マウスにおける神経毒性
新生ICRマウスにおける神経毒性を解析するために更なる実験を行った。頭蓋内への104PFUの用量で、wtDENV−2 16681およびD2 PDK−53−VV45Rに対する生存率は、ICRマウスではそれぞれ0%および18.8%であった(図9A)。しかし、CDC ICRマウスでは、wtDENV−2 16681に対しては約20%であり、D2 PDK−53−VV45Rに対しては100%であった。この研究では、104PFUの用量のDENVax−1およびDENVax−3 MVSはマウスに対して弱毒化されたが(生存率100%)、DENVax−2およびDENVax−4のMVSは、104PFUを超える用量で100%の死亡率をもたらした(図5A)。しかしながら、103PFU用量のウイルスで試験したところ、DENVax−2(生存率31.3%)およびDENVax−4(生存率81.3%)はwtデングウイルス血清型−2 16681(生存率0%)に対し低下した神経毒性を示し、これらの生存率は、それぞれリサーチグレードワクチン候補D2PKD−53−VV45R(32.3%)およびD2/4−V(100%)と同程度であった(図9B)。wtDENV−1、−3、または−4は、この研究では比較のために含めなかったが、以前の研究はwtDENV−1 16007がCDC−ICRマウスにおいてic経路により弱毒化されたのに対し、wtDENV−3 16562およびDENV−4 1036は両方ともCDC−ICRマウスに対し高毒性(生存率0%)であったことを実証した。これら3つのwtDENVは、より感受性の高いTaconic ICRマウスでは同程度またはそれ以上の毒性を示すと考えられる。したがって、これらのwtデングウイルスをそれらの同種DENVax MVSとの比較のために含めることは無益であると考えられた。この研究は、全4種のDENVax MVSおよび元の実験室由来の候補ワクチンウイルスが、wtDENV−2 16681と同程度のマウス弱毒表現型を提示することを示した。

0118

図9A〜9Bは、新生ICRマウスにおけるDENVax MVSの神経毒性のデータの例示的なグラフを表す。(A)104PFU用量でのウイルスのIC接種。(B)103PFU用量でのウイルスのIC接種
DENVaxの全シードロットを、同一性、無菌性、および望ましくない物質の不在について試験した。フルゲノム配列解析により、1つの余分なアミノ酸突然変異がDENVax−4 MVSに生じたが、他の3つのDENVax MVSは、それらのプレマスターシードのコンセンサスゲノム配列を保持していることが判明した。WVSロットでは、DENVax−3は1つの余分なアミノ酸突然変異を獲得し、他の3つの血清型は、それらのプレマスターシードに対し2つの余分なアミノ酸置換を蓄積した。4つのBVSロット全てのゲノム配列がそれらのWVSロットと同一であった。P2シードからプレマスター(P7)シードまでの全体で、僅か1つまたは2つの非サイレント変異が所与のシードに生じた。プレマスターシードとBCS(P10)シードとの間では、僅か1〜2個のヌクレオチド置換が見られ、それらはいずれもNS2A、4A、または4Bに生じた(残基E−483の保存されたグリシンおよびアラニンをもたらす単一ヌクレオチド変化例外)。P2からBVS(P10)シードまで、合計で3〜8個のヌクレオチド置換が所与のDENVaxシードで同定され、これらの置換のうち僅か2〜4個がアミノ酸変化をもたらした。BVSにおけるサイレント変異はいずれも、ウイルス複製に影響を及ぼし得る5’−および3’−NCR領域内にはなかった。これらの結果は、DENVaxウイルスが、製造中、遺伝子的に高度に安定であることを示唆している。5’NCR、NS1−53、およびNS3−250に位置する定義された3つのDENV−2 PDK−53弱毒化位置は、BVSストックを生成するためにDENVaxを連続継代しても、コンセンサスゲノム配列において変化していなかった。5’−NCR−57位置の高感度TaqMAMAは、DENVaxのMVS、WVS、およびBVSにおける最少のまたは検出不能な復帰を示した。0.21%の最高の復帰率がDENVax−2 BVSにおいて確認された。P10等価BVSの復帰率(<0.07%〜0.21%)は、Vero細胞での連続継代後に他のワクチン候補に生じた復帰率よりも有意に低かった(P10までに4〜74%の復帰)。これは、DENVaxシードのこの大規模製造の方策が、候補ワクチンウイルスにおいて遺伝子安定性を維持し、弱毒化マーカーを保持することに関して成功することを示唆している。

0119

本願に開示されるMVSストックは、将来的にWVSおよびBVSロットの製造に用いられ得るため、ウイルス弱毒表現型の評価のフルパネル(これらは、小さいプラーク表現型、温度感受性、蚊細胞における低下した複製、蚊個体における低下した感染/播種/伝染、および新生ICRマウスにおける低下した神経毒性を含む)を、全MVSまたはそれらの等価サロゲートストックに対して実施した。WVSおよびBVSストックについては、弱毒化を確認するために、プラークサイズ、蚊細胞における感染性も実施した。結果は、DENVaxの4種の血清型のMVSストックの全てが、元の実験室由来のワクチンウイルスと類似した小さいプラーク、C6/36細胞における低下した複製、および低下したマウス神経毒性等の、予想された弱毒表現型を維持したことを示した(図6、8、および9)。図3および7に示すように、DENVax−4を除く他の3つのDENVaxのMVSストックの全てが39℃でTSであった。

0120

WVSおよびBVSストックについては、2つの弱毒表現型、すなわち小さいプラークおよびC6/36細胞における低下した複製を解析および確認した。MVSとBVSとの間の遺伝子の変化は極僅かしかないため、これらはMVSのように弱毒表現型を保持すると予想された。この報告で説明した実験に加え、Ag129マウスおよび非ヒト霊長類における製造されたDENVaxの安全性および免疫原性を試験した。

0121

cGMPに準拠したDENVax MVS、WVS、およびBVSストックの製造を実証するための例示的な方法がここで提供される。BVSストックを、現在ヒト治験評価中の四価DENVaxを製造するために使用した。製造されたMVSの遺伝子安定性および安全性を最適化するための特有の製造方策が、いくつかの例示的方法において提供された。DENVaxの主要な弱毒化位置は既に十分に特徴解析されているので、ゲノム解析とTaqMAMAとを統合してMVSを作製するのに最適なプレマスターシードを特定するために、高感度かつ定量可能なSNPアッセイのTaqMAMAを開発した。MVSの遺伝子特性および表現型特性を完全に解析して、ウイルスがワクチン安全性について望ましい弱毒性を保持していることを確かめた。これは、プレマスターからBVSストックまでの製造中に全主要弱毒化遺伝子座について効率的に解析可能な唯一の弱毒生ウイルスワクチンかもしれない。ここに提供される結果は、戦略的に設計された弱毒生ワクチンのワクチン安全性における利点を実証した。

0122

図10は、新規な弱毒生ウイルスと以前に作製された弱毒生デングウイルスとを比較した例示的な表を表す。対照ウイルス(例えば16681)、または他の弱毒生デング−2ウイルスと異なるところの突然変異が示されている。

0123

〔材料と方法〕
ウイルスおよび細胞
DENV−1 16007、DENV−2 16681、DENV−3 16562、およびDENV−4 1034を野生型(wt)DENV対照とし、これらは4つの組換えDENVaxワクチン候補の親遺伝子型ウイルスであった。DENVax前駆リサーチグレードウイルスとして、D2/1−V、D2 PDK−53−VV45R、D2/3−V、およびD2/4−Vと称するものが、以前に調製および特徴解析された。ワクチン製造のためのマスターおよびワーキングセルバンクの作製に用いたVero(アフリカミドリザル腎臓)細胞は、世界保健機関(WHO)によってワクチン製造について特徴解析されている米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection:ATCC)CCL81細胞株(WCB−Vero細胞)を起源とした。

0124

cDNAクローンからの組換え生DENVaxウイルスの誘導
cGMP製造条件下で候補ワクチンウイルスを再誘導するため、以前に作出されたDENV感染性cDNAクローンである、完全ゲノム長ウイルスcDNAを含有するpD2−PDK−53−VV45R、pD2/1−V、pD2/4−V、およびin vitroライゲーションpD2/3−Vを用いて、以前に説明されたようなin vitro転写により新しいウイルスRNA転写産物を生成した。簡潔に述べると、XbaI直鎖化DENVゲノムcDNAをプロテイナーゼKで処理し、フェノールクロロホルムで抽出し、エタノール中で沈殿させてあらゆる残留タンパク質を除去した。その後、転写前にRNaseフリーのTris−EDTAバッファーに懸濁させた。AmpliScribe T7高収率転写キットエピセンターテクノロジーズ(Epicentre Technologies))を用いて、メーカー推奨プロトコルにしたがってin vitro転写を実施した。RNA転写産物に5’末端Aキャップを付加するため、RNAのAキャップアナログであるm7G(5’)ppp(5’)A(ニューイングランドバイオラブズ(New England BioLabs))を、2時間の転写反応中に組み込ませた。続いて試料をDNaseIで処理してテンプレートcDNAを消化し、その後、低pHフェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行って残留DNAおよびタンパク質を除去した。精製されたRNA転写産物をRNaseフリーの水に懸濁させ、20μlのアリコートに分けて、細胞の形質転換の準備が整うまで−80℃で保管した。RNA転写産物の完全性および濃度をアガロースゲル電気泳動により解析した。各20μlアリコートは、エレクトロポレーションで0.4〜1×107個の産生保証Vero細胞を形質転換するのに十分なゲノム長のウイルスRNAを含んでいると推定された。

0125

各RNA転写産物のWCB−Vero細胞へのトランスフェクションは、シャンタ・バイオテクニクス(Shantha Biotechnics)のcGMP設備で実施した。DENVax RNA転写産物を解凍し、400μlのVero細胞懸濁液(1×107細胞/ml)と混合し、Gene Pulser Xcellトータルシステム(バイオラッドラボラトリーズ(BioRad Laboratories))によるエレクトロポレーションのために、予備冷却した滅菌エレクトロポレーションキュベット(4mmギャップ)に移した。各試料を250V/∞オーム/500μFで一度パルスし、室温で10〜15分間インキュベートし、30mlの細胞増殖培地(10%FBSを含むMEM)を含有する75cm2フラスコに移し、36℃±1℃、5%CO2で6〜11日間インキュベートした。培地回収し、遠心分離により清澄化し、安定化し、小アリコートに分けて−60℃以下で保管した。形質転換で得られた候補ワクチンストック(継代レベル1についてはP1と称する)のウイルス力価を、Vero細胞におけるプラーク滴定アッセイにより決定し、DENVaxシードの更なる増殖に使用した。

0126

DENVaxウイルスシードの製造
製造されたロットの最適な遺伝子安定性および安全性を確実にするように設計された方策によって、P1ウイルスシードを用いてDENVaxプレマスター、マスター、ワーキング、およびバルクウイルスシードロットを増殖させた。この方策は、3回の連続したプラーク精製、および、継続的なシード製造用の最適なクローンウイルス集団を選択するための様々な継代レベルでのウイルスの遺伝子解析を含んでいた(表1)。簡潔に述べると、形質転換した細胞から回収したP1シードを、0.001のMOIでのVero細胞の感染により一度増幅させ、P2シードを生成した。P2シードストックのアリコートをプラーク表現型および完全ウイルスゲノム配列解析により評価した。遺伝子が確認されたP2ストックを、下記のプラーク滴定の節で説明するようなオーバーレイ培地を伴うVero細胞単層プレーティングし、十分に単離されたプラークを形成した。ニュートラルレッドで可視化した後、ワクチンウイルスの4種の血清型の各々から6つの別個のプラークを単離し(プラーククローンA〜F)、0.5mlの培地と混合した(継代P3)。

0127

6つのプラーク懸濁液のそれぞれを更に2回のプラーク精製に供し、それぞれ2度および3度プラーク精製された継代P4およびP5のウイルスシードを得た。P5ウイルスを2回の連続するVero継代により増幅し、P7シードストックを生成した。

0128

全24のP7シードをスクリーニングするために、スポットシークエンシング、および/または、前述のTaqman(登録商標)に基づくミスマッチ増幅突然変異アッセイ(Taqman(登録商標)−based mismatched amplification mutation assay:TaqMAMA)を用いた3つの主要なDENVax弱毒化位置の遺伝子解析、ならびにプラーク表現型解析を行った。適切な当初の特性を有するシードを、続いてフルゲノム配列解析により更に特徴解析した。これらの解析の結果、DENV−2 PDK−53弱毒化突然変異の存在、最少ゲノム配列変化、および予測されるプラーク表現型に基づき、各DENVax血清型の6つ(クローンA〜F)のP7シードのうちの1つをプレマスターシードとすべく選択した。各選択されたプレマスターシードを、Vero細胞の複数の175cm2フラスコ中0.001のMOIでのウイルスの1回の継代によりマスターウイルスシード(MVSまたはP8)に展開した。DENVax−4 MVS以外は、マスターウイルスシードを感染後(post infection:pi)8〜10日目に回収した。感染後(pi)6〜10日目にMVSストックを回収し、遠心分離により清澄化し、スクロースリン酸グルタミン酸溶液最終濃度はそれぞれ7.5%スクロース、3.4mMリン酸二水素カリウム、7.2mMリン酸水素二カリウム、5.4mMグルタミン酸ナトリウム)および0.95〜1.90%FBS(最終濃度)の添加により安定化した。DENVax−4 MVSは、収率を最適化するために異なる方法で調製した。簡潔に述べると、細胞の複数のフラスコを、0.1%F−127(商標)、DENVウイルス熱安定性を高めることが実証されているポロキサマー407(他のEO−POブロックコポリマーが評価されており、ここで置換可能である。発行された特許を参照)の存在下、0.001のMOIでDENVax−4プレマスターシードにより感染させた。感染性培地をpi6〜10日目に回収し、17%FBS(最終濃度)で安定化させ、プールし、冷凍した。全4種のDENVax MVSストックを1mlのアリコートに分け、−60℃以下で保管した。

0129

DENVaxワーキングウイルスシード(WVS)は、0.001のMOIでのMVSのVero細胞培養における1回継代により調製した。製造工程は、多層細胞ファクトリー(6360cm2)で培養したこと以外はMVSの製造と同様であった。WVSストックを10μMフィルターおよび0.45μMフィルターで濾過し、MVSで使用したのと同じ安定化剤で安定化し、30mlのPETGボトルまたは2.0mlクライオバイアルへアリコートに分けて、−60℃以下で保管した。

0130

ある方法において、バルクウイルスシード(BVS)を、0.001のMOIを達成するように希釈したWVS90mLでのコンフルエントVero細胞の多細胞ファクトリー(各6360cm2)感染により製造した。WVS接種物の希釈に用いた培地は、血清を含まない0.1%F−127(商標)を含んでいた。1.5時間の吸着後、細胞をPBSで3回洗浄し、800mlの無血清DMEM培地を各細胞ファクトリーに添加して、ファクトリーを5(±0.5)%CO2中36(±1)℃でインキュベートした。4日間のインキュベーション後、無菌性試験のために培地の小アリコートを回収した。pi5日目から10日目の間にウイルスを回収し、直ちに0.45umポアサイズフィルターで濾過することにより清澄化し、1Lの各清澄化ウイルスプールを、500mlの3×FTAバッファー(PBS中最終濃度15%のトレハロース、1.0%のプルロニック(登録商標)F−127(商標)ポロキサマー407、0.1%のヒトアルブミンUSP、pH7.4)を添加することにより安定化した。安定化したウイルスを1L PETGボトルに分配し、後のプーリングおよび品質管理試験のために−60℃以下で冷凍保管した。ウイルス力価が105PFU/mlを超え、かつ許容できる残留DNAレベルの安定化ウイルス回収物を全て、32℃のウォーターバスで迅速に解凍し、その後無菌でプールおよび混合した。プールした各一価BVSをラベル付けしたPETG容器に分配し、後の使用まで−60℃以下で保管した。

0131

製造製品品質管理
MVS、WVS、およびBVSシードを、同一性、無菌性、および検出可能な外来物質について試験した。各ワクチンストックの同一性は、DENVax血清型特異的プライマーを用いたRT−PCRにより確認した。増幅されたcDNAフラグメントは、4種のDENVax血清型の各々の同定を可能にするE/NS1キメラジャンクション部位を含んでいた。各シードは、ウイルスの同一性および異種DENVax血清型による交差汚染の不在を確認するために、全4種の血清型特異的RT−PCR反応において試験した。無菌性試験はUSP71(米国薬局方セクション71)に準拠して実施した。マイコプラズマ試験を実施した。

0132

シードの製造中に回収した清澄化および安定化していないDENVax回収物を用いて、ウイルス汚染についての下記のin vitroおよびin vivo試験を全て実施した。回収した感染性培地を最初にDENVウサギポリクローナル抗血清(インビラジェン(Inviragen))によって、36±1℃で1時間中和し、DENVを不活性化した。in vitro試験については、中和したシードを25cm2フラスコ内のMRC5、VEROおよびMA104の3種のインジケーター細胞に接種した。陽性CPEまたは血球吸着対照として、それぞれエコーウイルス(CPE対照)またはムンプスウイルス(血球吸着対照)を使用した。全ての細胞を、CPEについて毎日、合計14日モニタリングした。14日の終わりに、培養物上清を除去し、10mLのモルモット赤血球細胞RBC)溶液(3mLのリン酸緩衝生理食塩水中0.5%モルモットRBC、細胞増殖培地で10mLにメスアップ)に置換した。その後フラスコを5±3℃で30分間インキュベートし、続いて室温で30分間インキュベートした。単層をPBSで洗浄し、10×倍率で、血球吸着に関するRBCの星型の集塊が存在するか観察した。

0133

外来物質に関するin vitro試験は、哺乳期マウス、離乳後マウスおよびモルモットにおいて実施した。哺乳期マウスに0.1mlまたは0.01mlのDENV−抗血清中和シード試料を腹腔内(ip)注射で接種した(各用量群につき10匹のマウス)。同様に、10匹の離乳後マウスにそれぞれ0.5mlまたは0.03mlの試料をip接種した。モルモット(5/群)にそれぞれ5.0mLをip接種した。哺乳期マウスを疾病率および死亡率について毎日、接種後合計14日間観察した。離乳後マウスは接種後合計28日間観察し、モルモットは合計42日間観察した。試験項目は、接種した動物の80%以上が観察期間中健康のままである場合に許容基準を満たした。

0134

不純物に関するin vivo試験も、胚発生させたニワトリで実施した。各試験につき、10個の胚発生させたメンドリ卵(9日齢)の尿膜腔液にそれぞれ0.5mLのDENV抗血清中和試料を接種し、35℃で3日間インキュベートした。これら10個の卵から尿膜腔液を採集し、プールし、新しい10個の胚発生卵の尿膜腔液中で継代させ(10〜11日齢;0.5mL/卵)、35℃で更に3日間インキュベートした。同様に、各試料につき、10個の胚発生卵(6〜7日齢)にそれぞれ0.5mL/卵(DENVax−2一価BVS)または0.25mL/卵(DENVax−1、DENVax−3およびDENVax−4 BVS)を卵黄嚢への注射により接種し、35℃で9日間インキュベートした。これら10個の卵から卵黄嚢を採集してプールし、10%懸濁液を新しい10個の胚発生卵の卵黄嚢内で継代させ(6〜7日齢;0.5mL/卵)、35℃で更に9日間インキュベートした。3日間のインキュベーション後、尿膜腔液に接種した卵(初期のものと継代接種したものの両方)を生存率について観察した。ニワトリ、モルモットおよびヒト型赤血球を用いて、尿膜腔液の両方のプールを、4℃および25℃で血球凝集活性について試験した。9日間のインキュベーション後、卵黄嚢に接種した卵(初期のものと継代接種したものの両方)を生存率について観察した。

0135

ウイルスプラークアッセイおよびイムノフォーカスアッセイ
Vero細胞を用いたプラークアッセイまたはイムノフォーカスアッセイによりウイルス力価を測定した。プラークアッセイは、以前に説明されたように、コンフルエントVero細胞の6ウェルプレートにおいて二重アガロースオーバーレイで実施し、これらはDENVaxシードのプラーク表現型を評価するのにも利用した。正確な比較のため、全てのウイルスのプラークサイズを測定し、同じ実験内で比較した。pi9日目にニュートラルレッドで可視化した後、平均プラークサイズ計算のために最大10ウェルの単離したプラークを各ウイルスにつき測定した。wtDENV−1、−3、および−4については、プラークサイズが大きく、しばしば10ウェル単離プラークの測定が不可能であり、測定されたプラークの数は少なくなった。

0136

四価DENVaxは全4種のDENV血清型を含むことから、四価製剤中の各DENVax成分を定量するためにDENV血清型特異的イムノフォーカスアッセイを開発した。個々のDENVax MVSそれぞれのイムノフォーカスアッセイを、プラークアッセイと比較し、ウイルス力価の結果がこれら2つのアッセイの間で同程度であることを確認した。イムノフォーカスアッセイは、連続希釈したウイルスで感染させたコンフルエントVero細胞の6ウェルプレートにおいて行った。細胞を、0.7%高粘度カルボキシメチルセルロースシグマ(Sigma))を含有する平衡塩培地(BSS/YE−LAH培地)オーバーレイで覆い、5%CO2、37℃で7日間インキュベートした。オーバーレイを除去した後、細胞シートをPBSで3回洗浄し、−20℃において冷却80%アセトンで30分間固定し、PBSで1回洗浄し、PBS中2.5%(w/v)の脱脂粉乳、0.5%のTriton(登録商標)X−100、0.05%Tween(登録商標)−20を含有するブロッキングバッファーにより、37℃で30分間ブロッキングした。ブロッキングした細胞を、希釈したDENV血清型特異的MAbである1F1(DENV−1)、3H5(DENV−2)、8A−1(DENV−3)、または1H10(DENV−4)と共に、ブロッキングバッファー中37℃で1時間または4℃で一晩インキュベートし、洗浄バッファー(PBS中0.05%Tween(登録商標)−20)で3回洗浄し、アルカリホスファターゼ結合またはセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合アフィニティピュアヤギ抗マウスIgGジャソン・イムノ・リサーチ・ラボラトリーズ(Jackson Immuno Research Laboratories))と共に37℃で45〜60分間インキュベートした。プレートを3回洗浄し、適切な基質、アルカリホスファターゼ用1ステップBT/BCIPプラスサプレッサーピアス(Pierce))またはHRP用のVector−VIPキット(ベクター・ラブズ(Vector Labs))を発色のために添加した。フォーカスが十分に発展したら、水でリンスすることにより発色を止めた。染色されたイムノフォーカスを直接可視化し、ライトボックス上でカウントした。

0137

遺伝子配列
MVSおよびWVSの完全長ゲノムを配列解析した(下記参照)。簡潔に述べると、QIAmpウイルスRNAキット(キアゲン(Qiagen))を使用してウイルスRNAをDENVaxシードから抽出し、Titan One TubeRT−PCRキット(ロシュアプライド・サイエンス社(Roche Applied Science,Inc.))を使用してゲノム全体をカバーする重複したcDNAフラグメントを増幅した。増幅したcDNAフラグメントをゲルで精製した後、BigDye Terminator v3.1サイクルシークエンシングキット(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems))を用いて、フォワードおよびリバースプライマーにより配列解析した。BigDye XTerminator Purificationキット(アプライドバイオシステムズ)を用いてシークエンス反応をきれいにし、DVBD/CDCで3130xl Geneticアナライザー(アプライドバイオシステムズ)にかけた。ゲノム解析および比較にはLasergene SeqManソフトウェア(DNAスター社(DNAStar,Inc))を用いた。

0138

Taqman(登録商標)に基づくミスマッチ増幅突然変異アッセイ(TaqMAMA)
TaqMAMAは、弱毒化の5’NC−57位置における復帰レベルのより精密な評価を可能にするために開発された高感度の定量的単一ヌクレオチド多型性アッセイであり、この研究のために更に最適化された。MVSおよびWVSから抽出されたウイルスRNAは、wtまたはワクチン5’NC−57領域に特異的なプライマー/Taqmanプローブの両対を用いたTaqMAMAにより解析された。DENV−2のwt配列およびワクチン配列を検出するのに使用したフォワードプライマーは、それぞれD2−41−GCおよびD2−40−TTであった。各ウイルスについて、各フォワードプライマーの3’末端ヌクレオチドは特異的5’NCR−57ヌクレオチドと一致していたが、各プライマーの3’末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドは、ミスマッチ効果を高めるため、DENV−2ウイルスゲノム配列とは異なっていた。リバースプライマーのCD−207とTaqman(登録商標)プローブのCD−169Fは、wtおよびワクチンセットの両方とも同一であった。プライマーおよびプローブの配列、ならびにサイクル条件は以前に説明された。リアルタイムRT−PCRを、iQ5またはCFX−95システム(バイオラッド)で、BioRad iScript RT−PCR(プローブ用)キットを用いて、5μlのウイルスRNAテンプレート、0.4uMの各プライマー、および0.2uMのプローブを含有する25μl反応で行った。各試料につき、各wt特異的およびワクチン特異的反応についてトリプリケート反応を行った。各ウイルス血清型について用意した標準曲線に対してゲノムコピー数を決定した。ここで、RNA標準各遺伝子型特異的cDNAのnt1〜2670を含むプラスミドから誘導された転写産物であった。さらに、全ての実験で最少の交差反応性を確実にするため、異種遺伝子型プライマー/プローブセットにより各RNA標準を試験することによりアッセイの特異性を確認した。結果を、復帰を示したウイルスゲノムの割合として報告した。以前、このアッセイのインプットRNAレベルを制限する高い交差反応性バックグラウンドのために、当初の検出感度は約0.1%の復帰(識別能)であった。以降、改善されたリアルタイムPCR装置および反応キットを用いてアッセイは更に最適化されて、交差反応性バックグラウンドは遥かに高レベル(7〜8 log10コピー)のRNAテンプレートインプットに大幅に低減された。この最適化は、0.01〜0.07%の復帰率にまで、検出感度のかなりの向上をもたらした。

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