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図面 (11)

課題

無傷細胞壁を有する植物細胞官能化直鎖核酸カセット分子非侵襲的送達するためのナノ粒子を用いた方法の提供。

解決手段

細胞壁を有する植物細胞に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、細胞壁を有する植物細胞を提供する工程;対象とする官能化直鎖核酸カセット分子でナノ粒子を被覆する工程;細胞壁を有する前記植物細胞と前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程;ならびに細胞壁を含む前記植物細胞に前記ナノ粒子および前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる工程を含む、方法。

概要

背景

ナノ粒子は、特定の動物細胞にDNAを送達するために利用されている独特性質を有す
る。特定のDNA被覆ナノ粒子細胞壁を有していない細胞インキュベートされた場合、
細胞はナノ粒子を取り込み、DNAにコードされた遺伝子を発現し始めることが見出されて
いる。3-5 nmのサイズ範囲内の半導体ナノ粒子(例えば、量子ドット(「QD」))はまた
、細胞内に分子を送達するための担体として使用されてきた。DNAおよびタンパク質は、Q
D表面に付着した特定のリガンドに結合させることができる。例えば、Patolsky, et al.
(2003) J. Am. Chem. Soc. 125:13918参照のこと。カルボン酸またはアミン被覆された量
ドットは、チオール基を含む分子に架橋することができ(例えば、Dubertret et al. (
2002) Science 298:1759; Akerman, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:
12617; Mitchell, et al. (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:8122を参照)、または標準
バイオコンジュゲーションプロトコルを用いて、N-ヒドロキシスクシニミル(N-hydrox
ysuccinimyl)(「NHS」)のエステル基を含む分子に架橋することができる。例えば、Pi
naud, et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:6115; Bruchez, et al. (1998) Science 2
81:2013を参照のこと。量子ドットの表面に分子を付着するための代替的な方法は、ビオ
チン化タンパク質、オリゴヌクレオチド、または抗体へのストレプトアビジン被覆量子ド
ットの結合を介して行われる。例えば、Dahan, et al. (2003) Science 302:442; Pinaud
, et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:6115; Wu, et al. (2003) Nature Biotechnol.
21:41; Jaiswal, et al. (2003) Nature Biotechnol. 21:47; and Mansson, et al. (20
04) Biochem. Biophys. Res. Commun. 314:529を参照のこと。

植物への外来核酸分子の送達は、植物の細胞壁の存在のために困難なものとなっている
。現在の方法は、植物の形質転換のための侵襲的な送達に依存している。植物細胞では、
細胞壁は、外因的に適用される分子の送達に対する障壁となっている。多くの侵襲的な細
胞送達方法、例えば、微粒子銃送達(遺伝子銃)、マイクロインジェクションエレクト
ポレーション、およびアグロバクテリウム媒介形質転換は、細胞壁に囲まれた植物細胞
への遺伝子および小分子の送達を達成するために採用されているが、タンパク質の送達は
、マイクロインジェクションすることによってのみ達成されている。植物細胞への核酸
子のナノ粒子送達が所望される場合には、細胞壁は、植物のプロトプラスト粒子を添加
する前に取り除かれる。例えば、Torney, et al. (2007) Nature Nanotechnol. 2:295300
を参照のこと。

さらに、アグロバクテリウム媒介形質転換のような従来の植物形転換技術は、組換え
プラスミドの使用を必要とする。そのため、これらの従来技術は、付着された外来遺伝子
と共に、望ましくはないが、宿主ゲノム細菌ベクターバックボーン配列を組み込むとい
う結果となる。例えば、Kohli et al. (1999) Plant J. 17:591601; およびMeza et al.
(2002) Nucleic AcidsRes. 30(20):455666を参照のこと。移植片におけるベクターバッ
ボーン配列の存在は、微粒子銃転移手順において全く無駄である。さらに、ベクターバ
ックボーン配列は、二次構造を形成する際の組換えホットスポットなどのATリッチな配列
を提供することで、非正統的組換えを促進する傾向がある。Muller et al. (1999) J. Mo
l. Biol. 291:2946。ベクターバックボーン配列は、さらに隣接する植物ゲノムDNAに相同
な新しい長さの「フィラー」DNAを生成し得、これは環境に逃げ得る。Kohli et al. (199
8) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:72038; Pawlowski and Somers (2000) Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 95:1210610;Svitashev etal. (2002) Plant J. 32:43345。

粒子衝突(particle bombardment)を用いて導入遺伝子カセットでの形質転換は、組織
培養において、ならびに稲(イネ)およびポテトジャガイモ)において成功したに限ら
れている。Fu etal. (2000) Transgenic Res. 9:119; Loc et al. (2002) Mol. Breeding
9:23144; Romano et al. (2003) Transgenic Res. 12:46173; and Agrawal et al. (200
5) Mol. Breeding 16:24760。これらの微粒子銃技術は、単純な統合パターンを有するト
ランスジェニックイネおよびポテトの大きな割合を生成することが示唆されている。ベク
ターバックボーン配列を欠いている直鎖遺伝子構築物の2つのグループ(GUSおよびbar、
ならびに1Ax1およびbar)が、エリート小麦(Triticum aestivum L.)の品種EM12に粒子
衝撃により独立して導入され、低コピー数導入遺伝子の組み込みを伴う遺伝的に安定し
トランスジェニック植物回収された。Yao et al. (2006) J. Exp. Botany 57(14):37
3746。微粒子銃衝撃による形質転換頻度は0.2〜0.6の間であることが観察された。前出。
3つの可能な要素(すなわち、導入遺伝子の統合の前に鎖状体化する(concatemerization
)量を減らすこと、導入遺伝子再配列の発生を制限すること、および統合イベント時に異
なる導入遺伝子間の相同な相互作用を防止すること)が簡単なハイブリダイゼーション
ターンで表される単純な無傷ジェニック座を生成するために一緒に作動することが示唆さ
れている。Agrawal et al. (2005), supra。前掲

粒子衝突およびWhiskers(商標)(米国特許番号5464765および5302523を参照のこと)
は、制限酵素消化されたDNA断片とともに、この時点で無傷の細胞壁を有する植物細胞
直鎖DNAカセットを送達する唯一経路である。

概要

無傷の細胞壁を有する植物細胞に官能化直鎖核酸カセット分子非侵襲的に送達するためのナノ粒子を用いた方法の提供。細胞壁を有する植物細胞に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、細胞壁を有する植物細胞を提供する工程;対象とする官能化直鎖核酸カセット分子でナノ粒子を被覆する工程;細胞壁を有する前記植物細胞と前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程;ならびに細胞壁を含む前記植物細胞に前記ナノ粒子および前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる工程を含む、方法。なし

目的

さらに、ベクターバ
ックボーン配列は、二次構造を形成する際の組換えホットスポットなどのATリッチな配列
を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

細胞壁を有する植物細胞に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、細胞壁を有する植物細胞を提供する工程;対象とする官能化直鎖核酸カセット分子でナノ粒子被覆する工程;細胞壁を有する前記植物細胞と前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程;ならびに細胞壁を含む前記植物細胞に前記ナノ粒子および前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる工程を含む、方法。

請求項2

ナノ粒子が、前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子と相互作用する官能基を含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

ナノ粒子が、ストレプトアビジンQD共役ナノ粒子である、請求項2に記載の方法。

請求項4

さらに、細胞壁を含む前記植物細胞の区画に、前記ナノ粒子の取り込ませる工程を含む、請求項1に記載の方法。

請求項5

さらに蛋白質を標的とする細胞内区画で前記ナノ粒子を被覆する工程を含む、請求項4に記載の方法。

請求項6

前記区画が、細胞質ゾル、核、液胞膜プラスチドエチオプラスト有色体白色体脂肪体、プロテイプラストアミロプラスト葉緑体、および二重膜内腔からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。

請求項7

細胞壁を有する前記植物細胞が、商業作物種から植物細胞である、請求項1に記載の方法。

請求項8

前記植物細胞が、タバコニンジントウモロコシ菜種、菜種、綿、ヤシ落花生ダイズイネ属シロイヌナズナ属トウゴマ属、およびサトウキビ細胞からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。

請求項9

前記植物細胞が、分裂組織カルス花粉、葉、、根、根、花、種子、さや、およびからなる群から選択された組織由来のものである、請求項7に記載の方法。

請求項10

細胞壁を有する前記植物細胞が培養細胞である、請求項1に記載の方法。

請求項11

前記ナノ粒子が、半導体ナノ粒子量子ドット、正に帯電したナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆されたナノ粒子、多孔質粒子メソポーラスナノ粒子、シリカナノ粒子ポリマーナノ粒子タングステンナノ粒子ゼラチンナノ粒子ナノシェルナノコア(nanocores)、ナノスフェアナノロッド、および磁性ナノ粒子からなる群から選択される請求項1に記載の方法。

請求項12

前記ナノ粒子が、半導体ナノ粒子である、請求項11に記載の方法。

請求項13

半導体ナノ粒子が、量子ドットである、請求項12に記載の方法。

請求項14

前記ナノ粒子が、金ナノ粒子である、請求項11に記載の方法。

請求項15

さらに、前記ナノ粒子の表面を誘導体化する工程を含む、請求項1に記載の方法。

請求項16

前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、DNA、RNA、RNAi分子、および遺伝子からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1に記載の方法。

請求項17

前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、遺伝子を含む、請求項16に記載の方法。

請求項18

前記遺伝子が、外来タンパク質遺伝子農学的遺伝子、またはマーカー遺伝子である、請求項17に記載の方法。

請求項19

前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子が、核酸配列のPCR増幅から得られる、請求項1に記載の方法。

請求項20

核酸配列が、プラスミドコスミド人工染色体酵母人工染色体、および細菌人工染色体からなる群から選択される核酸分子から得られる、請求項19に記載の方法。

請求項21

さらに前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を安定的に組み込んだ細胞を選択する工程を含む、請求項16に記載の方法。

請求項22

前記選択した細胞が、再生可能な細胞である、請求項21に記載の方法。

請求項23

さらに再生可能な細胞から植物細胞を再生する工程を含む、請求項22に記載の方法。

請求項24

植物材料に対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を導入する方法であって、植物細胞、植物組織、植物からなる群から選択される植物材料を提供する工程;ナノ粒子を提供する工程;対象とする官能化直鎖核酸カセット分子で前記ナノ粒子を被覆する工程;細胞壁を有する前記細胞と前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程;前記植物材料に前記ナノ粒子および前記対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を取り込ませる工程を含む、方法。

請求項25

前記植物材料が、胚、分裂組織、カルス、花粉、葉、葯、根、根、花、種子、さや、および茎からなる群から選択される植物組織である、請求項24に記載の方法。

請求項26

植物へ形質移入するための方法であって、植物細胞を提供する工程;官能化直鎖核酸カセット分子と相互作用し得るナノ粒子を提供する工程;植物において形質を発現させるための手段でナノ粒子を被覆する工程;前記植物細胞と前記被覆されたナノ粒子とを互いに接触させる工程;前記植物細胞に前記ナノ粒子および前記植物において前記形質を発現させるための手段を取り込ませる工程;前記形質転換植物細胞から植物全体を再生させる工程、および前記植物を繁殖させる工程を含む、方法。

請求項27

前記形質が、対象とするタンパク質の発現、雄性不稔除草剤耐性害虫抵抗性細菌性病害に対する抵抗性真菌性病害に対する抵抗性、およびウイルス性病害に対する抵抗性からなる群から選択される、請求項26に記載の方法。

技術分野

0001

優先権の主張
本出願は、2010年7月7日に出願された「官能化(finctionalized)直鎖DNAカセット
生産及び植物における量子ドット/ナノ粒子媒介送達」についての米国仮特許出願シリア
ル番号61/362,222の出願日の利益を主張する。

0002

技術分野
本発明は、無傷細胞壁を有する植物細胞官能化直鎖核酸カセット分子非侵襲的
送達するナノ粒子を用いた方法に関する。

背景技術

0003

ナノ粒子は、特定の動物細胞にDNAを送達するために利用されている独特性質を有す
る。特定のDNA被覆ナノ粒子が細胞壁を有していない細胞インキュベートされた場合、
細胞はナノ粒子を取り込み、DNAにコードされた遺伝子を発現し始めることが見出されて
いる。3-5 nmのサイズ範囲内の半導体ナノ粒子(例えば、量子ドット(「QD」))はまた
、細胞内に分子を送達するための担体として使用されてきた。DNAおよびタンパク質は、Q
D表面に付着した特定のリガンドに結合させることができる。例えば、Patolsky, et al.
(2003) J. Am. Chem. Soc. 125:13918参照のこと。カルボン酸またはアミン被覆された量
ドットは、チオール基を含む分子に架橋することができ(例えば、Dubertret et al. (
2002) Science 298:1759; Akerman, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:
12617; Mitchell, et al. (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:8122を参照)、または標準
バイオコンジュゲーションプロトコルを用いて、N-ヒドロキシスクシニミル(N-hydrox
ysuccinimyl)(「NHS」)のエステル基を含む分子に架橋することができる。例えば、Pi
naud, et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:6115; Bruchez, et al. (1998) Science 2
81:2013を参照のこと。量子ドットの表面に分子を付着するための代替的な方法は、ビオ
チン化タンパク質、オリゴヌクレオチド、または抗体へのストレプトアビジン被覆量子ド
ットの結合を介して行われる。例えば、Dahan, et al. (2003) Science 302:442; Pinaud
, et al. (2004) J. Am. Chem. Soc. 126:6115; Wu, et al. (2003) Nature Biotechnol.
21:41; Jaiswal, et al. (2003) Nature Biotechnol. 21:47; and Mansson, et al. (20
04) Biochem. Biophys. Res. Commun. 314:529を参照のこと。

0004

植物への外来核酸分子の送達は、植物の細胞壁の存在のために困難なものとなっている
。現在の方法は、植物の形質転換のための侵襲的な送達に依存している。植物細胞では、
細胞壁は、外因的に適用される分子の送達に対する障壁となっている。多くの侵襲的な細
胞送達方法、例えば、微粒子銃送達(遺伝子銃)、マイクロインジェクションエレクト
ポレーション、およびアグロバクテリウム媒介形質転換は、細胞壁に囲まれた植物細胞
への遺伝子および小分子の送達を達成するために採用されているが、タンパク質の送達は
、マイクロインジェクションすることによってのみ達成されている。植物細胞への核酸
子のナノ粒子送達が所望される場合には、細胞壁は、植物のプロトプラスト粒子を添加
する前に取り除かれる。例えば、Torney, et al. (2007) Nature Nanotechnol. 2:295300
を参照のこと。

0005

さらに、アグロバクテリウム媒介形質転換のような従来の植物形転換技術は、組換え
プラスミドの使用を必要とする。そのため、これらの従来技術は、付着された外来遺伝子
と共に、望ましくはないが、宿主ゲノム細菌ベクターバックボーン配列を組み込むとい
う結果となる。例えば、Kohli et al. (1999) Plant J. 17:591601; およびMeza et al.
(2002) Nucleic AcidsRes. 30(20):455666を参照のこと。移植片におけるベクターバッ
ボーン配列の存在は、微粒子銃転移手順において全く無駄である。さらに、ベクターバ
ックボーン配列は、二次構造を形成する際の組換えホットスポットなどのATリッチな配列
を提供することで、非正統的組換えを促進する傾向がある。Muller et al. (1999) J. Mo
l. Biol. 291:2946。ベクターバックボーン配列は、さらに隣接する植物ゲノムDNAに相同
な新しい長さの「フィラー」DNAを生成し得、これは環境に逃げ得る。Kohli et al. (199
8) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:72038; Pawlowski and Somers (2000) Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 95:1210610;Svitashev etal. (2002) Plant J. 32:43345。

0006

粒子衝突(particle bombardment)を用いて導入遺伝子カセットでの形質転換は、組織
培養において、ならびに稲(イネ)およびポテトジャガイモ)において成功したに限ら
れている。Fu etal. (2000) Transgenic Res. 9:119; Loc et al. (2002) Mol. Breeding
9:23144; Romano et al. (2003) Transgenic Res. 12:46173; and Agrawal et al. (200
5) Mol. Breeding 16:24760。これらの微粒子銃技術は、単純な統合パターンを有するト
ランスジェニックイネおよびポテトの大きな割合を生成することが示唆されている。ベク
ターバックボーン配列を欠いている直鎖遺伝子構築物の2つのグループ(GUSおよびbar、
ならびに1Ax1およびbar)が、エリート小麦(Triticum aestivum L.)の品種EM12に粒子
衝撃により独立して導入され、低コピー数導入遺伝子の組み込みを伴う遺伝的に安定し
トランスジェニック植物回収された。Yao et al. (2006) J. Exp. Botany 57(14):37
3746。微粒子銃衝撃による形質転換頻度は0.2〜0.6の間であることが観察された。前出。
3つの可能な要素(すなわち、導入遺伝子の統合の前に鎖状体化する(concatemerization
)量を減らすこと、導入遺伝子再配列の発生を制限すること、および統合イベント時に異
なる導入遺伝子間の相同な相互作用を防止すること)が簡単なハイブリダイゼーション
ターンで表される単純な無傷ジェニック座を生成するために一緒に作動することが示唆さ
れている。Agrawal et al. (2005), supra。前掲

0007

粒子衝突およびWhiskers(商標)(米国特許番号5464765および5302523を参照のこと)
は、制限酵素消化されたDNA断片とともに、この時点で無傷の細胞壁を有する植物細胞
に直鎖DNAカセットを送達する唯一経路である。

0008

細胞壁を有する植物細胞に対象とする(of interest)分子を導入するための、ナノ
子および直鎖化核酸分子の使用のための方法および組成物が、本明細書中に記載される。
本開示の方法のいくつかの実施形態は、安定的に形質転換された遺伝的に改変された繁殖
力のある植物を生産するために使用し得る。いくつかの実施形態では、官能化直鎖核酸
セット分子の特徴的な性質により、望ましくない核酸配列(例えば、限定はしないが、ベ
クターバックボーン配列)無しに、対象とする特定の遺伝子配列を送達することが可能に
なる。

0009

実施形態では、いくつかの異なるタイプのナノ粒子が、細胞壁を有する植物細胞を形質
転換するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、官能化直鎖核酸カ
セット分子でPEG化され得る。特定の実施形態では、ナノ粒子は、量子ドットのような半
導体ナノ粒子(「QD」)または金ナノ粒子であり得る。他の実施形態では、官能化直鎖核
カセット分子は、直鎖状プラスミドDNAであり得る。代替的な実施形態では、官能化直
鎖核酸カセット分子は、ホスフィノトリシン-N-アセチルトランスフェラーゼ(PAT)およ
び/または黄色蛍光タンパク質(YFP)をコードする配列を含んでもよい。

0010

また、細胞壁を有する植物細胞に対象とする分子を導入するための方法が開示され、こ
こで、この方法は、細胞壁を有する植物細胞に提供する工程;少なくとも1種類の対象と
する官能化直鎖核酸カセット分子でナノ粒子の表面を被覆する工程;細胞壁を有する植物
細胞および対象とする官能化直鎖核酸カセット分子(群)で被覆されたナノ粒子を、互い
に接触して配置する工程;およびナノ粒子および官能化直鎖核酸カセット分子(群)の細
胞壁を含む植物細胞への取り込みを可能にする工程を含み得る。特定の実施形態では、対
象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、対象とする遺伝子を含む、ビオチン化された直
鎖化した二本鎖DNA分子であり得る。さらなる実施形態では、対象とする官能化直鎖核酸
カセット分子は、対象とする遺伝子を含む、化学的に改変されていない二本鎖DNA分子で
あり得る。特定の実施形態では、ナノ粒子は、量子ドットストレプトアビジンナノ粒子で
あり得る。官能化直鎖核酸カセット分子は、異なる官能基を利用して様々な試薬を用いて
ナノ粒子に結合させてもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質および
/または他の分子、例えば、互換性のある官能基(functional groups)を有する殺虫剤
表面を官能化されて(functionalized)いてもよい。いくつかの実施形態では、複数のタイ
プの分子がナノ粒子の表面に結合されていてもよい。したがって、特定の実施形態では、
細胞透過性農薬および直鎖化された核酸カセット分子が、例えば、生体分子標的送達
を容易にするために、ナノ粒子の表面に同時に官能化され得る。

0011

さらに、植物へ形質を移入するための方法が開示される。いくつかの実施形態では、本
方法は、植物細胞を提供する工程;植物における形質を発現させるための手段によりナノ
粒子の表面を被覆する工程;植物細胞、および植物内で形質を発現させるための手段で被
覆されたナノ粒子を互いに接触して配置する工程;ナノ粒子、および植物内で形質を発現
させるための手段を植物細胞へ取り込ませて、形質転換植物細胞を産生する工程;形質転
換植物細胞から植物全体を再生する工程;ならびに植物を繁殖させる工程を含み得る。い
くつかの実施形態では、本発明の方法に従って移入し得る形質は、雄性不稔除草剤耐性
害虫抵抗性、および細菌性病害真菌症、および/またはウイルス性病害に対する抵抗
性:から選択された形質を含むが、これらに限定されない。

0012

また、植物の植物体への(in planta)変換のために使用され得る本発明の方法が開示
される。いくつかの実施形態では、植物は、シロイヌナズナ属の植物、例えば、シロイヌ
ナズナから選択し得る。特定の実施形態では、植物体への形質転換により形質転換された
植物は、コロンビア生態型シロイヌナズナ植物から選択し得る。

0013

さらに、遺伝的に改変された(GM)植物細胞およびそれらを生成するための方法が開示
され、ここで、その植物細胞は、本発明の方法を介して導入され1つ以上の核酸を有する
。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの対象とする遺伝子及び選択マーカーを含む
プラスミドが、本発明に係るナノ粒子を介して、細胞壁を有する植物細胞に導入され得る
。さらなる実施形態では、少なくとも1つの対象とする遺伝子および/または選択マーカー
を安定的に組み込んだ安定した形質転換体が選択され得る。代替的な実施形態では、少な
くとも1つの対象とする遺伝子を含む植物細胞が、対象とする分子を含む他の細胞を生成
するために増殖され得る。他の実施形態では、対象とする分子を含む植物細胞は、対象と
する分子を含む植物全体を再生するために使用し得る再生可能な細胞であり得る。

0014

さらに組織培養で使用するために対象とする分子を含む再生可能な植物細胞を生成する
方法が開示される。組織培養は、再生可能な細胞と実質的に同一の遺伝子型を有する植物
を再生し得る。そのような組織培養における再生可能な細胞は、例えば、プロトプラ
スト、分裂細胞カルス花粉、葉、、根、根の先端、花、種子、ポッド、または
あり得る。さらに、いくつかの実施形態は、本発明の組織培養物から再生した植物を提供
する。

0015

さらに、所望の形質または対象とする核酸分子を含む安定化した植物系統を生成するた
めの方法が開示され、ここで、所望の形質または対象とする核酸分子は、植物の細胞壁を
横切ったナノ粒子の取り込みにより最初に導入され得る。安定化した植物系統を生成する
方法は、当業者に周知であり、自殖戻し交配ハイブリッド生産、集団への交配(cros
ses to populations)などの技術が含まれ得るが、これらに限定されない。したがって、
細胞壁を横切ってナノ粒子の取り込みにより植物細胞(またはその先祖)に最初に導入さ
れた、所望の形質または対象とする核酸分子を含む植物および植物細胞がまた、開示され
る。細胞壁を横切るナノ粒子の取り込みによって植物またはセル(またはその先祖)に最
初に導入された、所望の形質または対象とする核酸分子を含む植物細胞は、第一世代(F1
)のハイブリッド細胞、種子、および/または所望の特性を有する植物を生産するために
、他の、異なる、植物細胞との交雑で使用し得る。

0016

上述の例示的態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態が、以下の説
明を参照することにより明らかになる。

図面の簡単な説明

0017

図1は、非直鎖プラスミドpDAB3831の図を含む。
図2は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。
図2は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。
図2は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。
図2は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。
図2は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。
図2は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。
図2は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。
図2は、プラスミドpDAB3831のDNA配列を含む。bp 7666-3870からのDNA断片を、PCRを用いて増幅し、安定的に組み込まれたT2植物を生成したシロイヌナズナ形質転換のために使用した。
図3は、デンドリマー形質転換シロイヌナズナゲノム由来のホスフィノトリシンNアセチルトランスフェラーゼ(PAT)DNA配列とNCBIデータベースからのPAT配列との間の配列のアラインメントを含む。
図4は、形質転換シロイヌナズナゲノム由来の黄色蛍光タンパク質(YFP)DNA配列とNCBIデータベースからのYFPの配列との間の配列アラインメントを含む。

0018

配列表
列番号:1は、プラスミドpDAB3831から4.6kbpの完全な発現カセットを増幅するため
に使用されるフォワードプライマー配列:
/5Biosq/TGAAAGTGTACATCAACGAA
を示す。

0019

配列番号2は、プラスミドpDAB3831から4.6kbpの完全な発現カセットを増幅するために
使用されるリバースプライマー配列
/5Biosq/CCGCAACTATTTCAACAC
を示す。

0020

配列番号:3は、YFP遺伝子を増幅するために使用したフォワードプライマー配列:TGTT
CCACGGCAAGATCCCCTACGを示す。

0021

配列番号:4は、YFP遺伝子を増幅するために使用されるリバースプライマー配列:TATT
CATCTGGGTGTGATCGGCCAを示す。

0022

配列番号:5は、PAT遺伝子を増幅するために使用したフォワードプライマー配列:GGAG
AGGAGACCAGTTGAGATTAGを示す。

0023

配列番号:6は、PAT遺伝子を増幅するために使用されるリバースプライマー配列:AGAT
CTGGGTAACTGGCCTAACTGを示す。

0024

I. いくつかの実施形態の概要
非侵襲的な遺伝子導入を可能にする本発明の方法は、望ましい形質を有する遺伝子組
換え植物を生成するために非常に役立ち得る。非侵襲的な遺伝子導入は、このような栽培
植物に、望ましいインプットアウトプット、および農業的形質を組み込むなどの分野の
ために、細胞内の分子部位を特異的に標的化し、編集することを容易にし得る。記載され
ている方法はまた、現在技術が制限されている、植物の一過性形質転換、木もしくは野菜
作物形質移入し、病害抵抗性を付与するための技術の拡大のための非GMOの選択肢とし
て有用であり得る。

0025

最近の特許出願(米国特許出願第60/978,059)は、種々のナノ粒子の有効荷重(nanopa
rticle-pay-loads)を使用して、とりわけ、環状プラスミドDNAを送達する、ナノ粒子に
基づくDNA送達の非侵襲的な手段を示し、シロイヌナズナ植物のT1種子における導入遺伝
子の安定的な組み込み明確に示す。そこで作製された環状プラスミドDNAを含有するトラ
スジェニック植物は、所望の除草剤耐性の表現型を示し、少なくとも4回同時にグル
シネートアンモニウム電磁界ベル噴霧した場合、高いレベルの耐性を示した。米国
特許出願第60/978,059は、とりわけ、環状プラスミドDNAを用いて正に帯電した金ナノ粒
子によるシロイヌナズナの形質転換を実証した。本研究は、とりわけ、植物の安定した遺
伝的形質転換のための官能化直鎖核酸カセット分子の使用について記載する。

0026

米国特許出願第60/978,059は、とりわけ、正に帯電したナノ粒子媒介プラスミドDNA送
達を記載した。しかし、直鎖プラスミドベースの送達を使用して導入遺伝子の安定したゲ
ノムへの組み込みを実証したことは、現在までに報告されていない。本開示は、植物にお
ける安定した形質転換のためのナノ粒子媒介官能化直鎖核酸カセット分子の使用について
記載する。分子解析は、本発明の方法によってpat遺伝子およびyfp遺伝子で形質転換され
トランスジェニックT1シロイヌナズナ植物において、YFPと共にPATの発現を示した。T1
トランスジェニック植物は繁殖力があり、種子を産生する。これらの種子を増殖させても
よいし、分離分析は、分子およびタンパク質の分析とともに行うことができる。

0027

植物における単純なDNA組み込みイベントの生成を可能にする方法が開示され、それに
よってその後の遺伝子移入努力を効率化する。官能化直鎖核酸カセット分子の使用は、
例えば、プラスミドに比べて遺伝子形質転換での利点を提供する。例えば、官能化直鎖核
酸カセット分子は、ベクターバックボーン配列または選択マーカー遺伝子を含んでいなく
てもよい。II. 条件

0028

以下説明およびの表では、多くの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲
を含む明細書及び特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が
提供される:

0029

戻し交配:本明細書で使用される「戻し交配」という用語は、栽培者がハイブリッド後
代を両親のいずれかと(例えば、F1ハイブリッドの第一世代をF1ハイブリッドの親の遺伝
子型のいずれかと)繰り返し交配させるプロセスであり得る。

0030

胚:本明細書で使用される「胚」という用語は、成熟した種子の中に含まれている小さ
な植物を指すことがある。

0031

ナノ粒子:本明細書で使用される用語「ナノ粒子」は、少なくとも1つのナノスケール
次元、例えば、100nm未満の微細な粒子を指すことがある。本発明での使用に適したナノ
粒子は、1nm〜0.84(mの大きさを有し得る。ナノ粒子の一つのクラスは、「量子ドット」
(QD)である。量子ドットは、1nm - 10 nm、例えば、2〜4 nmのメジアン径を有し得る。
ナノ粒子の他の種類には、金ナノ粒子、金被覆されたナノ粒子、多孔性ナノ粒子メソ
孔性ナノ粒子、シリカのナノ粒子、ポリマーナノ粒子(例えば、デンドリマー)、タング
テンのナノ粒子、ゼラチンナノ粒子ナノシェルナノコア(nanocores)、ナノスフ
ェア、ナノロッド磁気ナノ粒子、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに
限定されない。

0032

利用可能なナノ粒子の中でも、発光半導体ナノ結晶(量子ドット)は、生体イメージ
グおよびセンシングにおける多くの実証された適用例を提供する。それらの有用性は、大
きなタンパク質のそれに匹敵する独特の光物的特性およびサイズの組み合わせに由来す
る。親水性CdSeのZnS量子ドットの流体力学半径は、5nm(分子リガンド交換したナノキ
ャップの場合)からブロック共重合体内にカプセル化されたナノ結晶の20nmまで様々であ
る。単一の量子ドットは、強化された結合活性を有する多官能化量子ドットバイオコンジ
ゲートを提供するために、いくつかの生体分子(例えば、抗体、ペプチド、および核酸
分子)に結合させることができる。さらに、それらの化学および光分解に対する強い抵抗
性は、特定の生物学的プロセスの長期の蛍光モニタリングを潜在的に可能にし得る。Nie
およびEmory(1997)Science 275:1102-6。金属親和性自己組織化およびビオチンアビ
ン結合に基づく複数の非共有結合方式により、更なる精製を必要とせずに同じ複合体内
同時に適用し得、細胞内環境でさえ安定している多機能量子ドットバイオコンジュゲート
が提供される。Yezhelyevら、(2008) J. Am. Chem. Soc. 130(28):900612。平均10個のYF
PおよびQDあたり名目上50の細胞透過性ペプチドCPP)を利用することによって、少なく
とも300 kDaの分子量および150オングストロームの空間的な広がりを有するタンパク質荷
物(cargo)の細胞内送達を達成し得る。前掲。QD-b-PEコンジュゲートの送達される荷物
は、より大きな範囲のサイズおよび分子量を有し(例えば、コンジュゲートあたり平均2.
5ストレプトアビジン-b-PE)、送達されるアセンブリは、潜在的に103 kDaを超える分子
量および500オングストロームに近い全体寸法を有する。高いb-PE価を有するコンジュゲ
ートが使用された場合、分子量およびサイズは大幅に増加し得る。

0033

核酸分子:センスおよびアンチセンス鎖の両方のRNA、cDNA、ゲノムDNA、人工染色体
ACE)、ならびに上記の合成フォームおよび混合ポリマーを含むことができるポリマー形
態のヌクレオチド。ヌクレオチドは、リボヌクレオチドデオキシリボヌクレオチド、ま
たはいずれかのタイプのヌクレオチドの改変された形態を指す。本明細書で使用される「
核酸分子」は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。特に指定のない限り
、核酸分子は、通常、長さが少なくとも10塩基である。この用語は、DNAの一本鎖および
二本鎖形態を含む。核酸分子は含めるかまたは天然に存在するヌクレオチド、ならびに天
然および/または非天然のヌクレオチド結合によって互いに結合された改変ヌクレオチド
の両方を含み得る。

0034

作動可能に連結された:第1の核酸配列は、第二の核酸配列と機能的な関係にあるとき
、第1の核酸配列は、第二の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーター
コード配列転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターがコード配列に作動
可能に連結されている。組換えにより産生された場合、同じリーディングフレーム内で2
つのタンパク質コード領域を結合するために必要ならば、作動可能に連結された核酸配列
は連続していてもよい。しかし、核酸は、作動可能に連結されるために連続している必要
はない。

0035

PEG化:本明細書で使用される用語「PEG化」は、ナノ粒子の表面が生体適合性の改善の
ためにポリエチレングリコール(PEG)で修飾されているナノ粒子(例えば、金ナノ粒子
、及び量子ドット)を指すことがある。PEG化ナノ粒子は、特定の細胞および組織への強
化された送達効率のために、様々なターゲティングリガンド(例えば、ペプチド及び抗体
)でさらに被覆されていてもよい。PEGは、例えば、立体安定化効果を介してタンパク質
非特異的吸着を低減することによってその被覆されたナノ粒子の血液循環時間延長
るために、様々な薬物、リポソーム、および高分子ミセルを有するナノ粒子に結合されて
きた。

0036

量子ドット:本明細書で使用される用語「量子ドット」(QD)(時々ナノクリスタル
としても知られる)は、3つの空間方向のすべてにおいて、伝導帯電子価電子帯の正
孔、または励起子(伝導帯の電子および価電子帯の正孔の結合されたペア)の動きを閉じ
込める半導体ナノ構造を指すことがある。閉じ込めは、例えば、静電ポテンシャル(外部
電極ドーピング、歪み、不純物などによって生成される)、異なる半導体材料との間の
インタフェースの存在(例えば、コアシェルナノシステムにおける)、半導体表面(例え
ば、半導体ナノ結晶)の存在、またはそれらの組み合わせが原因である可能性がある。量
子ドットは、量子化された離散的エネルギースペクトルを有し得る。対応する波動関数
は、量子ドット内に空間的に局在化し得るが、結晶格子の多くの周期にわたって延びてい
てもよい。量子ドットは、小さな有限な数(例えば、1〜100のオーダー)の伝導帯電子、
価電子帯ホール、または励起子(すなわち、有限の数の電気素量)を含む。

0037

量子ドットは、II-VI、III-VI、またはIV-V物質周期群で構成された結晶であり得る
半導体材料の特別なクラスである。それらの大きさは、例えば、直径2-10ナノメートル
10-50原子)の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、量子ドットは、セレン化カド
ミウム硫化亜鉛コアシェル(CdSe/ZnS)製であり得、バルク物質のものから性質的に発
散した有用な範囲の電気的および光学的特性を有していてもよい。その高い量子収率、高
モル吸光係数、および退色に対する高い耐性のために、量子ドットナノ粒子は、イン
ボおよびインビトロでの造影剤として研究されている。

0038

グリホサートに対する耐性:グリホサートの投与に対する耐性は、グリホサートのその
用量で生き残る植物の能力(すなわち、植物は殺され得ない)を指す。場合により、耐性
植物は、一時的に黄色、またはそうでなければ、いくつかのグリホサート誘発傷害(例え
ば、過剰な分げつおよび/または増殖阻害)を示すが、回復し得る。

0039

安定化:本明細書で使用される用語「安定化」は、同じ種類の近交系植物の第1世代か
ら次の世代に再現性をもって受け継がれる植物の特性を指すことがある。

0040

導入遺伝子:本明細書で使用される用語「導入遺伝子」は、外因性核酸配列を指す場合
がある。一例では、導入遺伝子は、遺伝子配列(例えば、除草剤抵抗性遺伝子);工業的
又は薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子;または望ましい農業形質をコードする遺
伝子である。さらに別の例では、導入遺伝子は、アンチセンス核酸配列であり、ここでそ
のアンチセンス核酸配列の発現は、標的核酸配列の発現を阻害する。導入遺伝子は、導入
遺伝子(例えば、プロモーター)に作動可能に連結された調節配列を含み得る。いくつか
の実施形態では、ナノ粒子媒介形質転換により導入される対象とする官能化直鎖核酸カセ
ット分子は、導入遺伝子を含む。しかし、他の実施形態では、対象とする官能化直鎖核酸
カセット分子は、内因性核酸配列(但し内因性核酸配列の追加のゲノムコピーが望まれる
);または宿主生物における標的核酸分子に対してアンチセンス配向である核酸配列を含
む。

0041

取り込み:本明細書中で使用される「取り込み」という用語は、細胞壁や細胞膜を横切
る、ナノ粒子(例えば、量子ドット、または金ナノ粒子)のような粒子の移動(transloc
ation)を指すことがあり、ここで、移動は、粒子が取り込まれる細胞以外の何かによっ
て粒子に与えられる運動量のみの結果としては発生しない。単に粒子に与えられる運動量
の結果として細胞壁または細胞膜を横切って粒子の移動を起こす装置または方法の非限定
的な例は、微粒子銃、遺伝子銃、マイクロインジェクション、および/またはインペール
フェクション(impalefection)技術である。

0042

III.植物細胞の安定な形質転換のためのナノ粒子を用いた核酸分子送達
A.概要
本発明は、例えば、遺伝的形質転換および安定したトランスジェニック植物の開発のた
めの官能化直鎖核酸カセット分子のナノ粒子媒介転送を使用して植物を形質転換するため
の新しい方法を記載する。特定の実施形態に係る方法は、他の形質転換法と比較した場合
トランスジェニック生物の急速な生成だけでなく、所望のゲノム改変のためのいくつか
の可能性もまた提供する。本発明の実施形態は、ナノ粒子媒介直鎖化プラスミドDNAの送
達を介して生成された最初に報告された安定した形質転換植物につながっている。開示さ
れる遺伝子組み換えの方法は、植物の遺伝的形質転換の伝統的な方法から逸脱し、微粒子
送達に依存せず、そしてトランスジェニック作物を生成するために非常に役立ち得る。

0043

トランスジェニック植物は、典型的には、アグロバクテリウム媒介または粒子衝撃形質
転換によって生成される。対象とする遺伝子に加えて、トランスジェニック植物は、多く
の場合、抗生物質または除草剤に対する耐性を付与する、例えば、ベクターバックボーン
配列および選択マーカー遺伝子を必ず含む。選択マーカー遺伝子およびベクターバックボ
ーン配列が、DNA転移手順において余分でありかつ望ましくないので、ベクターフリート
ランスジェニック植物の生成が有利である。いくつかの実施形態の方法により可能となる
ベクターバックボーン配列の除去は、相同組換えの量および組み込みプロセスに対する組
換えエレメントの影響を制限し得る。

0044

本発明の実施形態では、直鎖核酸カセットの非侵襲ナノ粒子媒介送達によるトランス
ェニック植物の直接生成が今や、例えば、フローラルディップ法を介して達成され得る。
このような方法は、それがなければ当該分野で利用可能であるものよりも、所望の植物の
変換を行うための簡単な方法を提供し得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ベクタ
フリーかつマーカーフリーなトランスジェニック植物を生成するために用いることがで
きる。いくつかの実施形態では、形質転換法は、組織培養とは無関係であるので、性的に
植物を再生するためにより便利で実用的であり得る。

0045

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、非侵襲的に非アグロバクテリウム互換
性植物および/またはそれらの組織培養懸濁細胞を形質転換する能力を提供し得る。この
ような方法は、多大な機会を提供し得る。望ましいインプットおよび農業形質は、同じ形
質転換手順で複数の遺伝子送達が必要とし得る。いくつかの実施形態において、本発明の
方法は、複数の核酸分子の送達を可能にする一方で、もしできるなら煩わしいかもしれな
い対象とする全ての遺伝子を含む大きなプラスミドを構築する必要性を排除する。

0046

B.核酸分子
特定のタンパク質またはRNA産物(例えば、干渉RNA(「RNAi」))をコードする遺伝子
の単離および特徴付けを可能にした分子生物学的手法出現により、植物生物学の分野で
科学者たちは、例えば、特定の方法で細胞の形質を変えるために、外来遺伝子、またはネ
ティブもしくは内因性遺伝子の追加または改変されたバージョンおそらく異なるプロ
モーターによって駆動される)を含めるために、細胞のゲノムを操作することに強い興味
を抱いてきた。このような外来の追加の遺伝子および/または改変された遺伝子は、本明
細書中で「導入遺伝子」と総称される。導入遺伝子は、例えば、対象とするタンパク質を
コードし得、またはRNAiに転写され得る。過去15〜20年間で、トランスジェニック細胞
産生するためのいくつかの方法が開発されており、特定の実施形態では、本発明は、細胞
の形質転換されたバージョン、および細胞壁を有する植物細胞に1以上の官能化直鎖核酸
カセット分子を、細胞壁を横切るナノ粒子の取り込みを介して導入することによってそれ
らを製造する方法に関する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は合成直鎖状DNAカセ
ットに含まれていてもよい。

0047

細胞の形質転換は、調節エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー終結配列
、またはその組み合わせ)の制御下にある、または作動可能に連結されている遺伝子を含
む核酸分子を含み得る。したがって、核酸分子は、1つ以上のこのような機能的に連結さ
れた遺伝子/調節エレメントの組み合わせを含み得る。

0048

実施形態では、対象とする核酸分子は、官能化直鎖核酸カセット分子であり得る。直鎖
核酸カセット分子は、例えば、そこに含まれる発現カセットの切り出しのために、少なく
とも一つの制限エンドヌクレアーゼによる環状プラスミドの消化により、生成され得る。
制限エンドヌクレアーゼは、プラスミドのヌクレオチド配列内の1つまたは複数の認識部
位でプラスミドを切断する。したがって、プラスミドが少なくとも一つの特定の制限エン
ヌクレアーゼで消化して、1つ以上の特定の直鎖核酸カセット分子の生成を可能にする
ように設計し得る。あるいは、与えられたプラスミドのヌクレオチド配列は、1つ以上の
特定の直鎖核酸カセット分子の生成を可能にする1つ以上の特定の制限エンドクレアー
ゼの認識部位を探索し得る。環状プラスミドまたは直鎖核酸分子内の特定の場所で開裂
制限部位を選択することにより、得られる直鎖核酸カセット分子が前駆体の核酸分子か
ら1つ以上の配列を欠如するように生成できる。例えば、無関係な(extraneous)核酸配
列(例えば、ベクターバックボーン、選択マーカー(例えば、細菌選択マーカー)、およ
標的細胞のゲノムDNAと相同である不要な核酸配列)を欠いた直鎖核酸カセット分子が
生成され得る。あるいは、無関係な核酸配列を欠いている直鎖核酸カセット分子を合成し
得る。

0049

直鎖核酸カセット分子は、連続的な熱循環システムを用いて合成し得る。PCT国際公開W
O 2008/045288を参照のこと。連続的サーマルサイクラーは、小さな管を使用するのでは
なく、異なる温度帯を繰り返し通過する一定のまたは連続した流体の流れを使用して、DN
Aを増幅する。PCR反応合物は、PCR反応混合物が非混和性であるキャリア流体注入
れ、その後キャリア流体は複数の温度ゾーンを通過し、PCR反応混合物内でのDNAの増幅を
促進する。サンプル中に存在する特定のDNA配列は、それが温度帯から周期的に通過する
際に、増幅される。PCR産物ゲルろ過カラムで精製し、その後精製し得る。

0050

核酸分子は、異なる官能基を有する様々な試薬を用いてナノ粒子に結合させ得る。ナノ
粒子への核酸分子の結合体化のための様々な化学反応を表1に示す。

0051

対象とする直鎖核酸カセット分子が1または複数の遺伝子を含む実施形態において、そ
の遺伝子(単数または複数)は優性または劣性対立遺伝子であってもよい。例えば、その
遺伝子(単数または複数)は、除草剤抵抗性、虫害抵抗性細菌抵抗性抵抗性真菌
抗性、ウイルス性病害抵抗性、雄の妊性、雄性不稔、栄養価の増大、および産業利用とし
てこのような形質を与えてもよい。これらの形質および他の形質を付与する遺伝子は、当
該技術分野において知られ、任意の遺伝子は、本発明の方法に従って、細胞壁を含む細胞
に導入してもよい。

0052

直鎖化およびナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクターマーカー遺伝子
直鎖化およびナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクターは、マーカーを含む形質
転換細胞がネガティブ選択(すなわち、選択可能なマーカー遺伝子を含まない細胞の増殖
阻害)、またはポジティブ選択(すなわち、遺伝子マーカーによってコードされる産物に
ついてのスクリーニング)のいずれかによって回収されるようにする例えば調節エレメン
トに作動可能に連結された少なくとも1つの遺伝子マーカーを任意に含むことができる。
形質転換のための多数の選択可能なマーカー遺伝子は、当該技術分野において周知であり
、例えば、限定されないが、抗生物質もしくは除草剤であり得る選択的化学物質を代謝的
解毒する酵素をコードする遺伝子、または阻害剤非感受性であり得る変化した標的を
コードする遺伝子を含む。また、特定のポジティブ選択方法は当該技術分野において知ら
れている。しかしながら、いくつかの実施形態では、直鎖核酸カセット分子は、マーカー
遺伝子を含まない。

0053

ある種の核酸分子を用いた植物の形質転換に適していてもよい1つの選択可能なマーカ
ー遺伝子は、カナマイシンへの抵抗性を付与する、場合により植物調節シグナルの制御下
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII(nptII)遺伝子である。例えばFral
eyら, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 4803を参照されたい。使用してもよ
い別の選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質ハイグロマイシンへの抵抗性を付与するハ
グロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。例えば、Vanden Elzenら, (198
5) Plant Mol. Biol., 5: 299を参照されたい。

0054

本発明の方法に用いてもよい追加的な選択可能なマーカー遺伝子は、細菌起源のもの、
例えば、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトラン
スフェラーゼ、アミノグリコシド−3’−アデニルトランスフェラーゼ、およびブレオ
イシンなどの抗生物質に対する抵抗性を付与するものを含む。Hayfordら, (1988) Plant
Physiol. 86: 1216; Jonesら, (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86;Svabら, (1990) Plant
Mol. Biol. 14: 197; およびHilleら, (1986) Plant Mol. Biol. 7: 171を参照されたい
。他の選択可能なマーカー遺伝子はグリホセートグルホシネート;またはブロモキシニ
ルなどの除草剤への抵抗性を付与してもよい。Comaiら, (1985) Nature 317:741-744; Go
rdon-Kammら, (1990) Plant Cell 2:603-618; およびStalkerら, (1988) Science 242:41
9-423を参照されたい。

0055

本発明の方法に用いてもよい他の選択可能なマーカー遺伝子は、細菌起源のものではな
いものを含む。これらの遺伝子は、例えば、限定されないが、マウスジヒドロ葉酸還元
素;植物5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸合成酵素;および植物アセト乳酸
成酵素を含む。Eichholtzら, (1987) Somatic Cell Mol. Genet. 13:67; Shahら, (1986)
Science 233:478; およびCharestら, (1990) Plant Cell Rep. 8:643を参照されたい。

0056

植物の形質転換に適したマーカー遺伝子の他の種類は、抗生物質などの毒性物質への抵
抗性についての形質転換細胞の直接的な遺伝的選択よりも形質転換されたと仮定される植
物細胞のスクリーニングを必要とする場合がある。これらの遺伝子は、特定の組織におけ
遺伝子発現空間分布を定量または可視化するために特に有用であり、遺伝子発現の調
査のためにそれらが遺伝子または遺伝子制御配列に融合され得るため、しばしば「レポー
ター遺伝子」と称される。形質転換細胞をスクリーニングするために通常使用される遺伝
子としては、限定されないが、β−グルクロニダーゼ(GUS);β−ガラクトシダーゼ
ルシフェラーゼ;およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられ
る。Jefferson, (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387; Teeriら, (1989)EMBO J. 8:343
; Konczら, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84:131; およびDeBlockら, (1984) E
MBO J. 3 : 1681を参照されたい。近年、植物組織破壊を必要としないGUS活性を可
視化するためのこれらのインビボ法が利用可能になっている。Molecular Probes publica
tion 2908 (1993) Imagene Green(商標), 1-4頁; およびNalewayら, (1991) J. Cell Bio
l. 115: 151a。

0057

より最近になって、蛍光タンパク質をコードする遺伝子(例えば、GFP、EGFP、
BFP、ECFP、およびYFP)が、原核細胞および真核細胞における遺伝子発現の
ためのマーカーとして利用されている。Chalfieら, (1994) Science 263: 802を参照され
たい。したがって、蛍光タンパク質および蛍光タンパク質の突然変異は、いくつかの実施
形態において、スクリーニング可能なマーカーとして使用され得る。

0058

ナノ粒子を介した取り込みのための発現ベクター:プロモーター
直鎖核酸カセット分子に含まれる遺伝子は、必要に応じて、調節エレメント、例えばプ
ロモーターを含むヌクレオチド配列によって駆動してもよい。プロモーターのいくつかの
種類は、単独またはプロモーターとの組み合わせで使用され得る他の調節エレメントと同
様に、形質転換の技術分野において今や周知である。

0059

プロモーターは、転写の開始点より上流であってもよく、RNAポリメラーゼおよび/
または転写を開始する他のタンパク質の認識および結合に関与してもよいDNAの領域で
ある。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始できるプロモーターであり
得る。発生調節下のプロモーターの例としては、葉;根;種子;繊維;木部導管仮導管
;または厚壁組織などのある種の組織において転写を優先的に開始するプロモーターが挙
げられる。このようなプロモーターは、「組織優先的」と称される。ある種の組織におい
てだけ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と称される。「細胞型」特異的プ
ロモーターは、1または複数の器官、例えば根または葉における維管束細胞でのある種の
細胞型において主に発現を駆動する。「誘導可能な」プロモーターは、環境制御下にある
場合があるプロモーターであり得る。誘導可能なプロモーターによる転写に影響し得る環
境条件の例としては、限定されないが、嫌気性条件または光の存在が挙げられる。組織特
異的、組織優先的、細胞型特異的、および誘導可能なプロモーターは、「非構成的」プロ
モーターの種類を構成する。「構成的」プロモーターは、大部分の環境条件下で活性であ
ってよいプロモーターである。

0060

1.誘導可能なプロモーター
誘導可能なプロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得
る。場合により、誘導可能なプロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可
能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る
。誘導可能なプロモーターにより、転写速度誘導剤に反応して増加する。

0061

任意の誘導可能なプロモーターは、本発明の実施形態において用いることができる。Wa
rdら, (1993) Plant Mol. Biol. 22: 361-366を参照されたい。例示的な誘導可能なプロ
モーターは、限定されないが、銅に反応するACEI系由来のもの(Mettら, (1993) Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 4567-4571);ベンゼンスルホンアミド除草剤緩和剤
反応するトウモロコシ由来のIn2遺伝子(Hersheyら, (1991) Mol. Gen Genetics 227:
229-237; およびGatzら, (1994) Mol. Gen. Genetics 243: 32-38);ならびにTn10
由来のTet抑制因子(Gatzら, (1991) Mol. Gen. Genetics 227: 229-237)を含む。特
に有用な誘導可能なプロモーターは、植物が通常は反応しない誘導剤に反応するプロモ
ターであってもよい。このような例示的な誘導可能なプロモーターは、ステロイドホルモ
ン遺伝子由来の誘導可能なプロモーターであり、その転写活性グルココルチコステロ
ホルモンによって誘導され得る。Schenaら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8
8: 0421。

0062

2.構成的プロモーター
構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得る、
または構成的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得
るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。

0063

様々な構成的プロモーターを、本発明の実施形態において利用することができる。例示
的な構成的プロモーターは、限定されないが、CaMV由来の35Sプロモーターなどの
植物ウイルス由来のプロモーター(Odellら, (1985) Nature 313: 810-812);イネアク
チン遺伝子由来のプロモーター(McElroyら, (1990) Plant Cell 2: 163-171);ユビキ
チン(Christensenら, (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632、およびChristensenら, (
1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); pEMU(Lastら, (1991) Theor. Appl. Gene
t. 81: 581-588); MAS(Veltenら, (1984) EMBO J. 3:2723-2730);トウモロコシ
ヒストン(Lepetitら, (1992) Mol. Gen. Genetics 231: 276-285、およびAtanassova
ら, (1992) Plant Journal 2(3): 291-300);ならびにALSプロモーター、Xba1/
NcoI断片5’からセイヨウアブラナ(Brassica napus)ALS3構造遺伝子(または
前記Xba1/NcoI断片と類似のヌクレオチド配列)を含む。国際PCT公開第WO
96/30530号を参照されたい。

0064

3.組織特異的または組織優先的プロモーター
組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可能に連結され得
る。場合により、組織特異的プロモーターは、細胞における発現のための遺伝子に作動可
能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る
。組織特異的プロモーターに作動可能に連結した対象とする遺伝子を用いて形質転換され
た植物は、特定の組織において導入遺伝子のタンパク質産物排他的または優先的に産生
され得る。

0065

任意の組織特異的または組織優先的プロモーターを、本発明の実施形態において利用す
ることができる。例示的な組織特異的または組織優先的プロモーターは、限定されないが
、例えば、ファゼオリン遺伝子由来のプロモーターなどの根優先プロモーター(Muraiら,
(1983) Science 23: 476-82、およびSengupta-Gopalanら, (1985) Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 82: 3320-4);例えばcabまたはrubisco由来のプロモーターなど
の葉特異的および光誘導プロモーター(Simpsonら, (1985)EMBO J. 4(11): 2723-2729、
およびTimkoら, (1985) Nature 318: 579-82);例えば、LAT52由来のプロモーター
などの葯特異的プロモーター(Twellら, (1989) Mol. Gen. Genetics 217: 240-5)、例
えば、Zm13由来のプロモーターなどの花粉特異的プロモーター(Guerreroら, (1993)
Mol. Gen. Genetics 244: 161-8)および例えば、apg由来のプロモーターなどの小胞
子優先的プロモーター(Twellら, (1993) Sex. Plant Reprod. 6: 217-24)を含む。

0066

導入遺伝子によって生成されるタンパク質の、葉緑体空胞ペルオキシソームグリ
オキシソーム;細胞壁;もしくはミトコンドリアなどの細胞内コンパートメントへの輸送
、またはアポプラストへの分泌は、対象とするタンパク質をコードする遺伝子のシグナル
配列から5’および/または3’領域をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結す
ることによって達成してもよい。その遺伝子の5’および/または3’末端での標的化配
列は、例えば、タンパク質合成およびプロセシング中に、コードされたタンパク質がどこ
で最終的にコンパートメント化され得るかを決定することができる。代わりに、そのよう
な細胞内コンパートメント標的化タンパク質は、所望の細胞内コンパートメントに対象と
する核酸分子で被覆されたナノ粒子を指向するために直接ナノ粒子に連結してもよい。

0067

シグナル配列の存在は、細胞内小器官もしくは細胞内コンパートメントのいずれか、ま
たはアポプラストへの分泌にポリペプチドを指向してもよい。多数のシグナル配列が当該
技術分野において知られている。例えば、Beckerら, (1992) Plant Mol. Biol. 20: 49;
Close, P.S., Master's Thesis, Iowa State University (1993), Knoxら, (1987) Plant
Mol. Biol. 9: 3-17; Lernerら, (1989) Plant Physiol. 91: 124-9; Fontesら, (1991)
Plant Cell 3: 483-96; Matsuokaら, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 834;
Gouldら, (1989) J. Cell. Biol. 108: 1657; Creissenら, (1991) Plant J. 2: 129; K
alderonら, (1984) Cell 39: 499-509; Steifelら, (1990) Plant Cell 2: 785-93を参照
されたい。

0068

外来タンパク質遺伝子および農学的遺伝子
本発明の実施形態によるトランスジェニック植物は、商業的な量で外来タンパク質を生
成し得る。したがって、形質転換された植物の選択および繁殖のための技術は、従来の方
法で収穫される複数のトランスジェニック植物を生産する。次に、外来タンパク質は対象
とする組織から、またはバイオマス全体から抽出され得る。植物バイオマスからのタンパ
ク質抽出は、例えば、HeneyおよびOrr, (1981) Anal. Biochem. 114: 92-6で検討されて
いる既知の方法によって達成され得る。

0069

本発明のいくつかの態様において、外来タンパク質の商業的生産のために提供される植
物材料は、植物、植物組織、または植物細胞であってもよい。いくつかの態様において、
対象とするバイオマスは植物種子であってよい。より高レベルの発現を示すトランスジェ
ニック植物について、遺伝子地図は、例えば、組み込まれたDNA分子近似染色体
置を同定する従来のRFLP、PCRおよびSSR分析を介して作成してもよい。この点
に関する例示的な方法について、GlickおよびThompson, Methodsin Plant Molecular Bi
ology and BiotechnologyCRCPress, Boca Raton 269: 284 (1993)を参照されたい。染
体位置に関する地図情報は、例えば対象のトランスジェニック植物の所有権の保護、ま
たはバイオセーフティ評価において有用であり得る。認可されていない繁殖が行われ、他
生殖質との交雑物が作製され得る場合、組み込み領域の地図は、疑われる植物について
の同様の地図と、後者が対象の植物と共通の起源を有するかどうかを決定するために比較
され得る。地図の比較は、ハイブリダイゼーション、RFLP、PCR、SSRおよび配
列決定を含み得、その全ては従来型の技術である。

0070

同様に、農業的遺伝子は、形質転換された細胞またはそれらの後代において発現され得
る。より具体的には、植物は、農業的目的での種々の表現型を発現するために本発明の方
法を介して遺伝子操作され得る。この点において使用され得る例示的な遺伝子として、限
定されないが、以下に分類されるものが挙げられる。

0071

1.有害生物または病害への抵抗性を付与する遺伝子:
A)植物の病害抵抗性遺伝子。植物の防御は、植物における病害抵抗性遺伝子(R)の
産物と病原体中の対応する非病原性(Avr)遺伝子の産物との間の特定の相互作用によ
ってしばしば活性化される。植物種は、特定の病原体株に抵抗性である植物を操作するた
めにクローン化された抵抗性遺伝子を用いて形質転換され得る。例えばJonesら, (1994)
Science 266: 789(クラドスポリウム・フルバム(Cladosporium fulvum)への抵抗性の
ためのトマトCf−9遺伝子のクローニング);Martinら, (1993) Science 262: 1432(
シュードモナスシリンゲ(Pseudomonas syringae)病原型への抵抗性のためのトマトP
to遺伝子。トマトはプロテインキナーゼをコードする);Mindrinosら, (1994) Cell 7
8: 1089(シュードモナス・シリンゲへの抵抗性のためのRSP2遺伝子)を参照された
い。

0072

B)例えばダイズシストセンチュウ(soybean cyst nematode)などの有害生物への抵
抗性を付与する遺伝子。例えば、国際PCT公開第WO96/30517号;国際PCT
公開第WO93/19181号を参照されたい。

0073

C)バチルスチューリンゲンシスタンパク質、その誘導体、またはそれをモデル化
合成ポリペプチド。例えば、Geiserら, (1986) Gene 48: 109(Btδ−エンドトキシ
ン遺伝子のクローニングおよびヌクレオチド配列)を参照されたい。さらに、δ−エンド
トキシン遺伝子をコードするDNA分子は、例えばATCC受入番号40098;671
36;31995;および31998でAmerican Type Culture C
ollection(Manassas,VA)から購入することができる。

0074

D)レクチン。例えば、Van Dammeら, (1994) Plant Molec. Biol. 24: 25(いくつか
のクンシラン(Clivia miniata)マンノース結合レクチン遺伝子のヌクレオチド配列を参
照されたい)。

0075

E)例えばアビジンなどのビタミン結合タンパク質。国際PCT公開第US93/06
487号(害虫に対する殺幼虫剤(larvicide)としてのアビジンおよびアビジン相同体
の使用)を参照されたい。

0076

F)酵素阻害剤、例えばプロテアーゼもしくはプロテイナーゼ阻害剤、またはアミラー
ゼ阻害剤。例えば、Abeら, (1987) J. Biol. Chem. 262: 16793(イネシステインプロテ
イナーゼ阻害剤のヌクレオチド配列);Huubら, (1993) Plant Molec. Biol. 21: 985(
タバコプロテイナーゼ阻害剤IをコードするcDNAのヌクレオチド配列);Sumitaniら
, (1993) Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1243(ストレプトマイセスニトスポレウ
ス(Streptomyces nitrosporeus)アルファアミラーゼ阻害剤のヌクレオチド配列)お
よび米国特許第5,494,813号を参照されたい。

0077

G)例えばエクジステロイドまたは幼若ホルモン、それらの変異体、それらに基づく模
倣物、またはそれらのアンタゴニストもしくはアゴニストなどの昆虫特異的ホルモンまた
フェロモン。例えば、Hammockら, (1990) Nature 344: 458(クローン化された幼若
ルモンエステラーゼ、幼若ホルモンの不活性化因子バキュロウイルス発現)を参照され
たい。

0078

H)影響を受けた有害生物の生理機能を発現によって破壊する昆虫特異的ペプチドまた
神経ペプチド。例えば、Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269: 9(発現クローニングは
昆虫利尿ホルモン受容体をコードするDNAを産出する);およびPrattら, (1989) Bioc
hem. Biophys. Res. Comm. 163: 1243(アロスタチンディプロプテラパンタタ(Diplo
ptera puntata)において同定され得る)を参照されたい。米国特許第5,266,31
7号(昆虫特異的な麻痺性神経毒をコードする遺伝子)も参照されたい。

0079

I)天然でヘビスズメバチまたは任意の他の生物によって産生される昆虫特異的毒液
。例えば、Pangら, (1992) Gene 116: 165(サソリ昆虫毒性ペプチドをコードする遺伝子
の植物における異種性発現)を参照されたい。

0080

J)モノテルペンセスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸フェニルプロパノ
イド誘導体または殺虫活性を有する別の非タンパク質性分子の高度集積に関連する酵素。

0081

K)生物学的に活性な分子、例えば天然または合成での、解糖系酵素タンパク質分解
酵素;脂肪分解酵素;ヌクレアーゼ;シクラーゼトランスアミナーゼ;エステラーゼ;
ヒドロラーゼホスファターゼキナーゼホスホリラーゼポリメラーゼエラスター
ゼ;キチナーゼ;またはグルカナーゼ翻訳後修飾を含む修飾に関与する酵素。国際PC
T公開第WO93/02197号(カルラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列)を参照された
い。キチナーゼをコードする配列を含むDNA分子は、例えばATCCから受入番号39
637および67152で得ることができる。Kramerら, (1993) Insect Biochem. Molec
. Biol. 23: 691(タバコイモムシキチナーゼをコードするcDNAのヌクレオチド配列
);およびKawalleckら, (1993) Plant Molec. Biol. 21: 673(パセリubi4−2ポリ
ユビキチン遺伝子のヌクレオチド配列)も参照されたい。

0082

L)シグナル伝達刺激する分子。例えば、Botellaら, (1994) Plant Molec. Biol. 2
4: 757(リョクトウカルモジュリンcDNAクローンについてのヌクレオチド配列);お
よびGriessら, (1994) Plant Physiol. 104: 1467(トウモロコシカルモジュリンcDN
Aクローンのヌクレオチド配列)を参照されたい。

0083

M)疎水性モーメントペプチド。例えば、国際PCT公開第WO95/16776号(
真菌性植物病原体を抑制するタキプレシンペプチド誘導体);および国際PCT公開第
WO95/18855号(病害抵抗性を付与する合成抗菌性ペプチド)を参照されたい。

0084

N)膜透過酵素、チャネル形成剤またはチャネル遮断剤。例えば、Jaynesら, (1993) P
lant Sci 89: 43(青枯病菌(Pseudomonas solanacearum)に抵抗性のトランスジェニッ
タバコ植物を提供するセクロピン−β溶解性ペプチド類似物の異種性発現)を参照され
たい。

0085

O)ウイルス性侵襲性タンパク質またはそれら由来の複合毒素。例えば、形質転換され
た植物細胞におけるウイルス被覆タンパク質蓄積は、被覆タンパク質遺伝子が由来し得
ウイルスによって、および関連するウイルスによってもたらされるウイルス感染および
/または病害の進行への抵抗性を与える。Beachyら, (1990) Ann. rev. Phytopathol. 28
: 451を参照されたい。被覆タンパク質媒介抵抗性は形質転換植物に、アルファルファ
ザイクウイルス、キュウリモザイクウイルスタバコ条斑病ウイルス、ジャガイモウイル
スX、ジャガイモウイルスY、タバコエッチウイルス、タバコ茎壊疽ウイルスおよびタバ
モザイクウイルスに対して与えられている。同文献。

0086

P)昆虫特異的抗体またはそれら由来の免疫毒素。したがって、昆虫の消化管において
重要な代謝機能を標的とする抗体は、影響される酵素を不活性化し、昆虫を死滅させても
よい。Taylorら, Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microb
e Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994)(一本鎖抗体断片の生成を介するトラン
スジェニックタバコにおける酵素の不活性化)を参照。

0087

Q)ウイルス特異的抗体。例えば、Tavladorakiら, (1993) Nature 366: 469(組換え
抗体遺伝子を発現するトランスジェニック植物はウイルス攻撃から防御される)を参照さ
れたい。

0088

R)病原体または寄生生物によって天然で生成される発生停止タンパク質。例えば、真
菌エンドα−1,4−D−ポリガラクツロナーゼは、植物細胞壁ホモ−α−1,4−D−
ガラクツロナーゼ可溶化することによって真菌のコロニー形成および植物栄養素の放出
を促進する。Lambら, (1992) Bio/Technology 10: 1436を参照されたい。Toubartら, (19
92) Plant J. 2: 367(マメエンドポリガラクツロナーゼ阻害タンパク質をコードする遺
伝子のクローニングおよび特徴付け)も参照されたい。

0089

S)植物によって天然で生成される発生停止タンパク質。例えば、Logemannら, (1992)
Bio/Technology 10: 305(オオムギリボソーム不活性化遺伝子を発現するトランスジェ
ニック植物は真菌性病害への抵抗性が増大している)を参照されたい。

0090

2.除草剤への抵抗性を付与する遺伝子
A)成長点または分裂組織を阻害する、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素
などの除草剤。この分類の例示的な遺伝子は、例えば、Leeら, (1988)EMBO J. 7: 1241
、 およびMikiら, (1990) Theor. Appl. Genet. 80: 449によってそれぞれ記載される突
然変異体ALSおよびAHAS酵素をコードする。

0091

B)例えば、突然変異体5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸合成酵素(EPS
P)遺伝子(組換え核酸の導入および/または種々の形態の天然EPSP遺伝子のインビ
突然変異誘発を介して);それぞれaroA遺伝子およびグリホセートアセチルトラン
スフェラーゼ(GAT)遺伝子;他のホスホノ化合物、例えば、ストレプトマイセスハ
イグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus)およびストレプトマイセスビリジク
ロモゲネス(Streptomyces viridichromogenes)を含むストレプトマイセス種由来のグル
ホシネートホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)遺伝子;およびピ
リジノキシまたはフェノキシプロプリオン酸ならびにシクロヘキソン類(ACCase阻
害剤をコードする遺伝子)によって付与されるグリホセート抵抗性。例えば、米国特許第
4,940,835号および米国特許第6,248,876号(植物にグリホセート抵抗
性を付与し得るEPSPの形態のヌクレオチド配列)を参照されたい。突然変異体aro
A遺伝子をコードするDNA分子は、ATCC受入番号39256で得ることができる。
米国特許第4,769,061号(突然変異体aroA遺伝子のヌクレオチド配列)も参
照されたい。欧州特許出願第0333033号および米国特許第4,975,374号は
、L−ホスフィノトリシンなどの除草剤への抵抗性を付与し得るグルタミン合成酵素遺伝
子のヌクレオチド配列を開示している。例示的なPAT遺伝子のヌクレオチド配列は、欧
州出願第0242246号、およびDeGreefら, (1989) Bio/Technology 7: 61(PAT活
性をコードするキメラbar遺伝子を発現するトランスジェニック植物の生成)において
提供される。フェノキシプロプリオン酸、ならびにセトキシジムおよびハロキシホップ
どのシクロヘキソン類への抵抗性を付与する遺伝子の例は、Marshallら, (1992) Theor.
Appl. Genet. 83: 435によって記載されているAcc1−S1、Acc1−S2およびA
cc1−S3遺伝子を含む。グリホセート抵抗性を付与できるGAT遺伝子は、例えば、
WO2005012515に記載されている。2,4−D,フェノキシプロピオン酸およ
ピリジロキシオーキシン除草剤への抵抗性を付与する遺伝子は、例えばWO20051
07437に記載されている。

0092

C)トリアジン(psbAおよびgs+遺伝子)またはベンゾニトリルニトリラーゼ
遺伝子)などの光合成を阻害する除草剤。例えばPrzibilaら, (1991)Plant Cell 3:169(
突然変異体psbA遺伝子をコードするプラスミドでのクラミドモナスの形質転換)を参
照されたい。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第4,810,648
号に開示され、これらの遺伝子を含むDNA分子はATCC受入番号53435;674
41;および67442で入手可能である。Hayesら, (1992) Biochem. J. 285: 173(グ
ルタチオンS−トランスフェラーゼをコードするDNAのクローニングおよび発現)も参
照されたい。

0093

3.次のような付加価値のある形質を付与するまたはそれに寄与する遺伝子
A)例えば、植物のステアリン酸含有量を増加させるためにステアリルACP不飽和化
酵素のアンチセンス遺伝子を用いて植物を形質転換することによる、修飾された脂肪酸
謝。Knultzonら, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 2624を参照されたい。

0094

B)フィチン酸塩含有量の減少。フィターゼをコードする遺伝子の導入は、フィチン酸
塩の分解を増強し、形質転換された植物により多くの遊離リン酸塩を増やしてもよい。例
えば、Van Hartingsveldtら, (1993) Gene 127: 87(クロコウジカビ(Aspergillus nige
r)フィターゼ遺伝子のヌクレオチド配列)を参照されたい。フィチン酸塩含有量を減ら
す遺伝子を導入してもよい。例えばトウモロコシにおいて、これはクローニング、および
続く、フィチン酸の低レベルによって特徴付けられるトウモロコシ突然変異体に関与し得
る単一対立遺伝子に関連するDNAの再導入によって達成され得る。Raboyら, (1990) Ma
ydica 35: 383を参照されたい。

0095

C)例えば、デンプン分枝様式を変化させる酵素をコードする遺伝子を用いて植物を
形質転換することによって生じた修飾された炭水化物組成物。例えば、Shirozaら, (1988
) J. Bacteol. 170: 810(連鎖球菌突然変異体フルクトース転移酵素遺伝子のヌクレオ
ド配列);Steinmetzら, (1985) Mol. Gen. Genet. 20: 220(レバンスクラーゼ遺伝子)
;Penら, (1992) Bio/Technology 10: 292(α−アミラーゼ);Elliotら, (1993) Plant
Molec. Biol. 21: 515(トマトインベルターゼ遺伝子のヌクレオチド配列);Sogaardら
, (1993) J. Biol. Chem. 268: 22480(オオムギα−アミラーゼ遺伝子);およびFisher
ら, (1993) Plant Physiol. 102: 1045(トウモロコシ胚乳デンプン分枝酵素II)を参
照されたい。

0096

C.ナノ粒子
本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞壁を含む植物細胞に対象とする官能化直鎖
核酸カセット分子を導入する方法が提供される。いくつかの実施形態において、この方法
は、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を用いて被覆させたナノ粒子を細胞と接触さ
せて配置し、細胞壁を通したナノ粒子の取り込みを可能にすることを含んでもよい。特定
の実施形態において、ナノ粒子は、可逆的にまたは不可逆的に、対象とする官能化直鎖核
酸カセット分子を含み、それで被覆され、またはその他の方法でそれに結合および/また
担持してもよい。これらおよびさらなる実施形態において、ナノ粒子は、対象となる官
能化核酸カセット分子上の基と反応する基で官能化され、対象となる官能化直鎖核酸カセ
ット分子に結合したナノ粒子を生成し得る。特定のの実施形態において、対象とする官能
化直鎖核酸カセット分子は、細胞壁を有する植物細胞との接触前にナノ粒子に導入され、
または細胞壁を有する植物細胞にナノ粒子の導入と同時であってもよい。本発明の実施形
態において使用され得るナノ粒子の例は、限定されないが、量子ドット;他の半導体ナノ
粒子;正に帯電したナノ粒子;金ナノ粒子;金被覆ナノ粒子;多孔性ナノ粒子;メソ多孔
性ナノ粒子;シリカナノ粒子;ポリマーナノ粒子(例えばデンドリマー);タングステン
ナノ粒子;ゼラチンナノ粒子;ナノシェル;ナノコア;ナノスフェア;ナノロッド;およ
び磁気ナノ粒子含む。

0097

本発明の特定の実施形態では、ナノ粒子の表面は官能化されてもよく、それは、例えば
、ナノ粒子の表面への他の物質の標的化された取り込み、または可逆的もしくは不可逆的
な結合を可能し得る。非限定的な例として、ナノ粒子(例えば、量子ドット)の表面は、
例えば、アルカンチオレート(alkanethiolate)の自己組織化単分子膜で官能化され得、
これはさらに官能化または誘導体化し得る。さらに非限定的な例では、ナノ粒子の表面は
、それ自体が、例えば、ストレプトアビジンさらに官能化または誘導体化され得るリンカ
ーで誘導体化し得る。一つの実施形態では、ナノ粒子は、PEG化し得る。他の実施形態で
は、ナノ粒子は、1つ以上のコア(活性または不活性)、立体コート(活性または不活性
)、開裂可能な結合、および/または標的分子またはリガンドを含み得るか、またはこれ
らで多官能化され得る。

0098

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ストレプトアビジンQDコンジュゲートであり得
る。ストレプトアビジンQDコンジュゲートは、半導体材料(CdSe)のナノメートルスケ
ールの結晶(これは、その材料の光学的特性を改善するために、さらなる半導体シェル
ZnS)で被覆されている)から作られている。それは、605nm付近発光極大を有する狭
い、対称的な発光スペクトルを有する。コア・シェル素材はさらに、材料が生体分子に結
合させること、およびその光学特性を保持することを可能にするポリマーシェルで被覆さ
れている。このポリマーシェルが直接ストレプトアビジンに結合されている。ストレプト
アビジンQDコンジュゲートは、大きい高分子または蛋白質(約15〜20 nm)のサイズで
ある。表面は、様々な水性緩衝液中のサンプルとともにインキュベートされた場合、低い
非特異的シグナルを有するように調製される。量子ドットを活性エステルカップリング
応を介して直接ストレプトアビジンに結合し得る。これは、高特異的生物学的活性を有す
るストレプトアビジン量子ドット複合体を生じる表面(典型的には、5〜10 個のストレ
トアビジン/量子ドット複合体)上に共有結合により結合されたストレプトアビジンを有
する材料が得られる。

0099

本発明の実施形態によれば、細胞壁を有する植物細胞は、損傷を受けていない細胞壁全
体を含む任意の植物細胞であってもよい。細胞壁を有する細胞の例は、限定されないが、
藻類;タバコ;ニンジン;トウモロコシ;キャノーラナタネ;綿;パームピーナッツ
大豆サトウキビオリザ種(Oryza sp.);シロイヌナズナ種(Arabidopsis sp.);
およびトウゴマ種(Ricinus sp.)を含む。本発明の実施形態は、任意の組織、または、
限定されないが、胚;分裂組織細胞;カルス;花粉、例えば、半数体および2倍半数体の
小胞体;葉;葯;根;根端;花;種子;;茎;および組織培養物を含めて、その中に見
出されるあらゆる箇所由来の細胞壁を含む細胞を含んでもよい。

0100

本発明の特定の実施形態において、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、本発明
に係る細胞壁を有する植物細胞に送達され得る任意の官能化直鎖核酸カセット分子であっ
てもよい。対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、限定されないが、DNA;RNA
RNAi分子;遺伝子;プラスミド;コスミド;YAC;およびBACの核酸配列を含
んでもよい。対象とする官能化直鎖核酸カセット分子は、細胞壁を有する植物細胞に、例
えば、限定されないが、ポリペプチド;酵素;ホルモン;糖ペプチド;糖類;脂肪;シグ
ナル伝達ペプチド;抗体;ビタミン;メッセンジャーセカンドメッセンジャーアミノ
酸;cAMP薬剤;除草剤;殺菌剤;抗生物質;および/またはそれらの組み合わせと
同時に導入してもよい。

0101

量子ドットのようなナノ粒子は、Dubertretら(2002)Science 298:1759のプロトコル
を使用して、または当業者の裁量によりそこから修正されたプロトコルによって、PEGで
官能化し得る。例えば、TOPO(トリオクチルホスフィンオキシド)で被覆されたCdSe/ZnS
量子ドットは、クロロホルム中のPEG PEで懸濁し、続いて溶剤蒸発及び得られるPEG化
量子ドットの水での可溶化をさせ得る。

0102

本発明の態様において、ナノ粒子は、細胞の様々な部分に取り込まれ得る。ナノ粒子が
取り込まれ得る位置の例は、限定されないが、細胞質ゾル;核;液胞膜色素体;エチオ
プラスト有色体白色体脂肪体;タンパク質プラスト;アミロプラスト;葉緑体;お
よび二重膜管腔を含む。他の実施形態では、細胞壁を含む細胞へのナノ粒子の取り込み
は、シンプラスト的またはアポプラスト的経路を介して行ってもよい。

0103

D.安定に形質転換された植物細胞
本発明に係る安定に形質転換された植物細胞は、ナノ粒子を媒介した形質転換によって
、対象とする官能化直鎖核酸カセット分子を用いて形質転換され得る任意の植物細胞であ
ってもよい。したがって、植物細胞は、双子葉植物または単子葉植物から単離し、または
そこから培養してもよい。また、植物細胞は、植物組織または植物全体に存在してもよい
。本発明に係る双子葉植物由来の安定に形質転換された植物細胞の非制限的な例は、アル
ファルファ;豆類ブロッコリキャベツ;ニンジン;カリフラワーセロリ白菜;綿
キュウリナスレタスメロンエンドウコショウ;ピーナッツ;ジャガイモ;カ
ボチャ;ダイコン;ナタネ;ホウレンソウ;大豆;スカッシュサトウダイコン;ヒマワ
リ;タバコ;トマト;およびスイカを含む。本発明に係る単子葉植物由来の安定に形質転
換された植物細胞の非制限的な例は、コーンタマネギ;イネ;ソルガム;小麦;ライ麦
キビ;サトウキビ;オートムギライ小麦スイッチグラスおよび芝草を含む。

0104

除草剤グルホシネートアンモニウム(GLA)は、グルホシネート耐性遺伝子を発現する
トランスジェニック植物をスクリーニングするために、フィールドレベルの濃度で噴霧し
得る。本発明の方法を用いて生成したシロイヌナズナのT1は、グルホシネートのフィー
ルドレベルの用量の5つの連続した適用(例えば、発後7日を開始日として一日おきに
に対して、除草剤耐性を示している。これらのトランスジェニック植物からのゲノムDNA
をPCRによりpatおよびyfpの存在について分析し、その結果は、patおよびyfp標的DNA配列
を示している。PCR産物の配列決定の結果は、本発明の方法を用いて生成されたT1シロイ
ヌナズナ中でのpatおよびyfp導入遺伝子の正確な配列を明らかにした。

0105

本発明に係るトランスジェニック植物は、本発明の方法によって産生された安定に形質
転換された植物細胞から再生し得る。このような植物は、任意の方法で使用または栽培す
ることができ、ここで、対象とする核酸分子の存在が望ましい。従って、トランスジェニ
ック植物は、ナノ粒子媒介形質転換を介して官能化直鎖核酸カセット分子で形質転換し、
そして当業者に公知の任意の方法によってトリミングされ、栽培されることにより、とり
わけ、1または複数の所望の特性を有するように操作し得る。

0106

以下の実施例は、ある特定の特徴および/または実施形態を説明するために提供される
。これらの実施例は、例示される特定の特徴または実施形態に本発明を限定するものと解
釈されるべきではない。

0107

実施例1:植物細胞の形質転換のためのナノ粒子の調製
DNA;プラスミドDNAの調製
pDAB3831プラスミドDNA(図1)を単離し、直鎖DNA/ストレプトアビジン被覆量子ドット
による植物の形質転換のために調製した。このプラスミドは、シロイヌナズナユビキチン
10プロモーター(AtUbi10)によって駆動されるPAT選択マーカー遺伝子およびキャッサバ
葉脈モザイクウイルスプロモーター(CsVMV)によって駆動されるフィラジウム黄色蛍光
タンパク質遺伝子(PhiYFP)を含む。形質転換実験を、直鎖化DNAを用いて試験した。

0108

pDAB3831を直鎖化するために、PCR反応を完了させた。pDAB3831を、連続サーマルサイ
クリングシステムを用いてPCR増幅した。PCT国際公開WO 2008/045288。サンプルを以下を
含むように調製した:12% MgCl2(25mM)、0.33% TaqDNAポリメラーゼ(5単位/μL)
、2.0% dNTP(アデノシン三リン酸(dATP)、デオキシシチジン三リン酸(dCTP)、デオ
キシグアノシン三リン酸(dGTP)、およびデオキシチミジン(deothythimidine)三リン
酸(dTTP))、8.0%テンプレート(2μg/mL)、61.66%プルロニックF108溶液(1.5%
溶液)、4%フォワードプライマー、4%リバースプライマー、及び8%の反応緩衝液(10
倍濃度)。システムの隣接セクタを、それぞれ解離アニーリング、および伸長のために
、95℃、59℃、および72℃の温度に設定した。PCR反応混合物を20psiで加圧容器を使用し
て、システムを介してポンピングした。反応混合物温度制御本体に供給した後、鉱物油
を使用して、チューブの長さ全体を通してサンプルをプッシュした。反応混合物の流速
流量弁で0.25 mL/分に制御した。サンプル中に存在する特定のDNA配列を、温度帯を通し
て周期的に渡すに従って増幅した。30サイクル後、内容物を採取した。PCR産物をゲル
カラムで精製し、続いてエタノール沈殿させた。精製した産物のサンプルを、Agilent
Bioanalyzer(商標)上で、ならびにアガロースゲル電気泳動上で分析し、PCR産物のサイ
ズおよび濃度を確認した。

0109

上記のPCRに使用したテンプレートは、DASプラスミドpDAB3831であった。フォワード
ライマー配列番号:1およびリバースプライマー配列番号:2を合成して、遺伝子およびそ
れらのプロモーターの両方を含む4.6kbpの完全な発現カセット(すなわち、直鎖化され
たDNA)を増幅した。さらに、ナノ粒子の表面に直線二本鎖DNAの結合を容易にするために
、ビオチンTEGCEホスホラミダイトを使用してプライマーリン酸基にビオチン分子を化
学的に結合させた。このホスホラミダイトは、トリエチレングリコールリンカーに基づく
伸長した15原子混合極性スペーサーアームを有する。オリゴの残りの部分からビオチン機
能を分離する伸長スペーサーアームの利点は、ストレプトアビジン分子に結合する時にす
べての可能な立体障害の影響を低減することである。フォワードプライマーを標識したと
きに、ビオチンは、DNAの先頭にある。リバースプライマーを標識したときに、ビオチン
はDNA断片の終端にある。したがって、ビオチン化(両方向)DNA断片は、ストレプトアビ
ジンで被覆されたナノ粒子に結合させることができる。ビオチン化オリゴおよび連続熱循
環システムを使用して、約20mgの直鎖状DNA断片を生成した。

0110

直鎖DNA /ナノ粒子の複合体化
ストレプトアビジン被覆量子ドットは、Evident Technology(トロイ、ニューヨーク
)から入手した。1 mLのストレプトアビジン被覆量子ドット(4 nmol)を0.5mgのビオチ
ン化した直鎖化プラスミドDNAとともに30分間室温でインキュベートし、直鎖状DNA/QD複
合体を形成した。

0111

実施例2:シロイヌナズナの花芽の形質転換
植物体形質転換のための植物材料
種子の同期された発芽は、T0植物における花発生の均質性を確実するために重要であ
る。シロイヌナズナ(A. thaliana)cv.コロンビア種子は、0.1%(w/v)寒天
溶液中に懸濁され、4℃にて48時間インキュベートし、層別化を完了した。60mgの
種子を計量し、15mLチューブに移した。13mLの0.1%(w/v)寒天溶液を添
加し、種子が均一に分散するまでボルテックスを行った。これは、4.6mg種子/1m
Lの0.1%(w/v)寒天溶液(または約230種子/mL)の種子溶液濃度を作製す
る。6本のチューブ(72mL溶液)を調製し、各トレイに18(31/2インチ)ポッ
トを含む4平面に植え付けた。種子溶液を4℃にて48時間インキュベートし、層別化を
完了した。各ポットは、個別に、ポットあたり1.0mLの層状化種子溶液で植え付けら
れた。全てのポットを植え付けたとき、繁殖ドームをトレイに配置し、土壌水分を保持し
た。ドームを植え付け日後の5日に除いた。種子を発芽させ、植物を長日条件下(16時
間明/8時間暗)、120〜150μmol/m2秒の光度にて、一定の温度(22℃)
および湿度(40〜50%)下でConviron(登録商標)(モデルCMP4030
およびCMP3244、Controlled Environments Limit
ed,Winnipeg,Manitoba,Canada)において生育した。植物は
、植物を植え付けた後の10〜14日間、Hoagland溶液、続いてDI水で水を与
え、湿らせてはないが、土壌水分を保持した。植え付けの日から4週間後、花を摘み、二
番花のより均等な生育を生じさせた。植え付け後の第5週で、形質転換プロセスのために
植物を調製した。

0112

植物体形質転換
シロイヌナズナ(A. thaliana)cv.コロンビアの直鎖DNA/QDを媒介した形質
転換は、CloughおよびBentの変更したプロトコルを用いて完了した。CloughおよびBent (
1998) Plant J. 16:735-43。20mLの懸濁液は、0.5mgの直鎖DNAおよび4nM
のPQDの濃度で直鎖DNA/QD複合体溶液を用いて作製され、シロイヌナズナ植物(
大部分は、いくつかの受精した長角果(fertilized silique)を有する未成熟花房)の
処置に使用された。植物を浸漬する前に、0.05%(v/v)(250μL/500m
L)〜0.005%の濃度にしたSilwet L−77を直鎖DNA/PQD溶液に添
加し、十分に混合した。植物の上記地上部分は、穏やかに撹拌しながら、直鎖DNA/P
QD溶液に30秒間浸漬された。処理された植物は、それらの側に30分間、暗くして2
2〜24℃にて置かれた。植物は、上述される条件下、Convironに移され、成熟
するまで生育させ、種子を回収した。

0113

選択トレイ(10.5’’×21’’×1’’トレイ)を用いて、バルク回収種子をT
0植物からスクリーニングし、各トレイでは約10,000個の種子があった。2つの対
照を用いて、選択噴霧が正しく行われたことを確認した;Col−0負の形質転換体対照
、および正の形質転換体対照としてPAT(ホスピノトリシンアセチルトランスフェラー
ゼ)選択可能なマーカーのために同型の種子でスパイクされたコロンビアCol−0野生
型。同期を達成するために、種子は、植え付け前の48時間、0.1%(w/v)寒天溶
液に層状化された。選択トレイあたり10,000個の種子を与えるために、200mg
の種子を0.1%(w/v)寒天溶液に添加し、種子が均一に懸濁されるまでボルテック
スした。次に、層状化された種子は、SunshineミックLP5で満たされた選択
トレイ上に植え付けられ、Hoagland溶液を用いて地下潅漑された。有効である選
択噴霧について、40mLの懸濁された種子が選択トレイに均一に植え付けられることは
重要である。植え付け後、繁殖ドームを各選択トレイ上に配置し、植物を選択のために生
育した。繁殖ドームは、植え付け後の約5日で除かれた。

0114

実施例3:形質転換されたシロイヌナズナの分析
形質転換された植物の選択
新たに回収されたT1種子は、室温にて7日間乾燥させた。T1種子は26.5×51c
mの発芽トレイに植え付けられ、各々は、予め40mLの0.1%(w/v)アガロース
溶液に懸濁され、4℃にて2日間保存され、休眠要件を完了し、同期された種子発芽を確
認された、層状化されたT1種子の200mgアリコート(約10,000個の種子)を
受け入れた。

0115

Sunshine MixLP5は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでHo
agland溶液で地下潅漑され、次に重力排水された。層状化された種子の各40mL
アリコートは、ピペットを用いてバーミキュライトに均一に植え付けられ、4〜5日間、
湿式ドームで覆われた。ドームは、グルホシネートの発芽後噴霧を用いて、初期の形質転
換体の選択前1日に取り除かれた。

0116

植え付け後の7日(DAP)に、T1植物(それぞれ子葉および2−4−lf段階)は
、1塗布あたり280g ae/haグルホシネートの有効速度で送達するために、De
Vilbiss圧縮された空気噴霧チップを用いて、10mL/トレイ(703L/ha
)の噴霧体積で、Liberty除草剤(200g ae/Lグルホシネート、Baye
r Crop Sciences,KansasCity,MO)の0.2%(w/v
)溶液を用いて5日以内に連続して5回噴霧された。生き残ったもの(活性に生育してい
る植物)は、最終噴霧後の4〜7日に同定され、鉢植え媒体(Metro Mix 36
0)を用いて調製された3インチのポットに個別に移された。移された植物は、3〜4日
間、湿式ドームで覆われ、以前の通り22℃の生育チャンバーに置かれ、または温室に直
接移された。ドームは、その後、取り出され、植物は、温室(22±5℃、50±30%
RH、14時間明:10時間暗、最小500μE/m2s1自然+追加の光)内で生育され
た。

0117

導入遺伝子のゲノム組み込みのための分子分析および証拠
シロイヌナズナ(A. thaliana)トランスジェニック植物由来のゲノムDNAは、製造
業者の指示書に従って、植物DNAZOL(商標)(Invitrogen)を用いて、
週齢の植物の葉材料から抽出された。PCRプライマーは、YFPおよびPAT導入遺
伝子を検出するために設計された。YFPプライマーは配列番号1および配列番号2とし
て示される。PATプライマーは配列番号5および配列番号6として示される。

0118

導入遺伝子のgDNAPCR増幅
PATおよびYFPについてのPCR増幅反応は、TaKaRa ExTaq(商標)
キット(Takara,Otsu,Shiga,Japan)を用いて完了された。遺伝
子産物は、50μLの全反応体積において増幅された。PCR反応は、100ngゲノム
DNA鋳型、1×ExTaq反応緩衝液、0.2mMのdNTP、10pMolの各プラ
イマー、および0.025単位/μLのExTaqを含んだ。以下のPCR条件を用いた
:96℃で5分間の1サイクル、および以下の条件:94℃で15秒間、65℃で30秒
間、72℃で1分間、および最終伸長72℃で7分間の31サイクル。PCR増幅産物
、0.8%TAEアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色に
よって視覚化された。DNA断片は、QIAEX(商標)IIゲル精製キット(Qiag
en,Valencia,CA)を用いて、アガロースゲルから精製された。

0119

PCR断片は、高度なSanger配列決定技術(MWG Biotech,Hunt
sville,AL)を用いて、PATフォワードプライマー(配列番号5)とYFPフ
ワードプライマー(配列番号3)により配列決定された。配列データは、Sequen
cherソフトウェアを用いて分析された。

0120

PATおよびYFPのPCRアンプリコンの配列決定結果は、これらの遺伝子について
予期されたヌクレオチド配列と合致していた。これらの結果は、pDAB3831からの
PAT配列およびYFP配列は、ナノ粒子および直鎖DNAカセット形質転換プロトコル
を用いて、シロイヌナズナのgDNAに安定に組み込まれたことを明示する。

0121

本結果は、PATおよびYFP配列が実施例1における正に帯電したナノ粒子を媒介し
た直鎖化DNA送達を通じて送達され、したがって、シロイヌナズナ植物のゲノムDNA
における導入遺伝子の安定なゲノム組み込みの証拠を与えることを示す。

0122

実施例4:培養植物細胞への官能化直鎖核酸カセット分子のナノ粒子を媒介した送達
単一細胞植物材料を調製する。
例えば、BY2細胞およびNT1細胞の両方を用いる。BY2細胞は、緑色でない、増
殖が速いタバコ細胞株である。NT1細胞は、タバコから単離された光独立栄養細胞であ
る。形質転換の3から4日前、1週齢の懸濁培養は、250mLフラスコに50nMのD
AS−PMTI−1(微小管阻害剤)および0.5〜0.1%(v/v)のDMSOを含
む40mlのNT1BまたはLSBY2培地に、2mlのNT1またはBY2培養物を移
すことによって、新鮮な培地に継代培養される。単一細胞は、微小管阻害剤処理後の4日
または7日のいずれかで回収される。使用されるBY2単一細胞は、生存細胞カウント
するために、Beckmanフローサイトメータにより処理される。細胞は、単一細胞が
細胞の細胞質を通じて分布した大多数の色素体(アミロプラスト)を含むことを決定する
ために、共焦点画像システムに接続された微分干渉コントラストDIC顕微鏡を用い
て調べられる。細胞は、3.0OD600の懸濁液1mLを移すことによって、14日ごと
に一度継代培養される。形質転換の標的細胞として培養細胞が用いられる。

0123

ナノ粒子調製および細胞の処理
プラスミドDNAは、直鎖DNA/量子ドット(QD)を媒介した植物形質転換のため
に単離および調製される。プラスミドは、シロイヌナズナユビキチン10プロモーター(
AtUbi10)によって駆動されるPAT選択可能なマーカー遺伝子、およびカッサバ
葉脈モザイクウイルスプロモーター(CsVMV)によって駆動されるフィラジウム黄色
蛍光タンパク質遺伝子(PhiYFP)を含む。プラスミドを含む大腸菌(Escherichia
coli)株は植菌され、37℃にてアンピシリンを含むLuria−Bertaniブロス
中で濁るまで増殖される。DNAは、Qiagen Plasmid Midi−Pre
pキット(Qiagen,Valencia,CA)を用いて単離される。

0124

プラスミドDNAを直鎖化するために、PCR反応を、連続熱サイクリング・システムを使用
して完了する。PCT国際公開WO 2008/045288。サンプルは以下を含むように調製される:1
2% MgCl2(25mM)、0.33% TaqDNAポリメラーゼ(5単位/μL)、2.0% dNTP(アデノ
三リン酸(dATP)、デオキシシチジン三リン酸(dCTP)、デオキシグアノシン三リン酸
(dGTP)、およびデオキシチミジン(deothythimidine)三リン酸(dTTP))、8.0% テ
プレート(2μg/mL)、61.66%プルロニックF108溶液(1.5%溶液)、4%フォワードプ
ライマー、4%リバースプライマー、及び8%の反応緩衝液(10倍濃度)。システムの隣接
セクタを、それぞれ解離、アニーリング、および伸長のために、95℃、59℃、および72℃
の温度に設定した。PCR反応混合物を20psiで加圧容器を使用して、システムを介してポン
ピングした。反応混合物を温度制御本体に供給した後、鉱物油を使用して、チューブの長
さ全体を通してサンプルをプッシュした。反応混合物の流速を流量弁で0.25 mL/分に制御
した。サンプル中に存在する特定のDNA配列を、温度帯を通して周期的に渡すに従って増
幅した。30サイクル後、内容物を採取した。PCR産物をゲルろ過カラムで精製し、続いて
エタノール沈殿させた。精製した産物のサンプルを、Agilent Bioanalyzer(商標)上で
、ならびにアガロースゲル電気泳動上で分析し、PCR産物のサイズおよび濃度を確認した

0125

フォワードプライマーおよびリバースプライマーを合成して、遺伝子およびそれらのプ
ロモーターの両方を含む完全な発現カセット(すなわち、直鎖化されたDNA)を増幅する
。さらに、ナノ粒子の表面への直鎖二本鎖DNAの結合を容易にするために、ビオチンTEG-C
Eホスホラミダイトを使用してプライマーのリン酸基にビオチン分子を化学的に結合させ
る。したがって、ビオチン化(両方向)DNA断片は、ストレプトアビジン被覆されたナノ
粒子に結合させることができる。ビオチン化オリゴおよび連続熱循環システムを使用して
、直鎖状DNA断片がミリグラム量で生成される。

0126

直鎖DNA/ナノ粒子の複合体化
ストレプトアビジン被覆量子ドットは、Evident Technology(トロイ、ニューヨーク州
)から取得される。1 mLのストレプトアビジン被覆量子ドット(4 nmol)を0.5 mgのビオ
チン化直鎖化プラスミドDNA共に30分間室温でインキュベートして、直鎖DNA/QD複合体を
形成する。

0127

1〜3μL/mLの直鎖DNA結合ナノ粒子の濃度は、24ウェルマイクロタイタープレ
ート中の500μLの細胞に添加され、20分間、暗所振とう機上で穏やかに回転させ
る。ナノ粒子は細胞壁を通じて運搬される。

0128

実施例5:多官能化されたナノ粒子を媒介したシロイヌナズナの植物体形質転換
シロイヌナズナについての植物体形質転換は、CloughおよびBent(1998)から修飾された
ものを用いて行うことができる。多官能化されたナノ粒子上のDNA、ならびにホーミン
タンパク質形質導入ドメイン(PTD)およびNLS単位の分子の濃度は、形質転換効
率の増加を達成するために最適化される。

0129

植物材料:健康なシロイヌナズナ植物は、開花するまで土壌において、ポットに入れて
長日下で生育される。第1の束は刈り取られ、多数の第2の束の増殖を促す。植物は、刈
り取られた後のおよそ4〜6日で準備される。シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)
・コロンビア(Col−0)生態型は、花の植物体形質転換のためにバックグラウンド
T0植物)として選択される。種子の同調された発芽は、T0植物における花芽発生の均質
性を確実にするために重要である。野生型種子は、0.1%寒天溶液に懸濁され、4℃に
て48時間インキュベートし、層別化を完了する。薬包紙上で60mgの種子を計量し、
15mLチューブに移す。13mLの0.1%寒天溶液を添加し、種子が均一に分散する
までボルテックスを行う。これは、4.6mg種子/1mL溶液(または約230種子/
mL)の濃度を作製する。6本のチューブ(72mL溶液)を調製し、各トレイに18(
31/2インチ)ポットを含む4平面に植え付け、全2ポットを植え付ける。溶液を4℃
にて48時間インキュベートし、層別化を完了する。各ポットは、個別に、ポットあたり
1.0mLの層状化種子溶液で植え付けられる。全てのポットを植え付けたとき、繁殖ド
ームをトレイに配置し、土壌水分を保持する。ドームを植え付け日後の5日に除く。種子
を発芽させ、植物を長日条件下(16時間明/8時間暗)、120〜150μmol/m
2秒の光度にて、一定の温度(22℃)および湿度(40〜50%)下でConviro
n(登録商標)(モデルCMP4030およびCMP3244、Controlled
Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,C
anada)において生育する。植物は、植物を植え付けた後の10〜14日間、Hoa
gland溶液、続いてDI水で水を与え、湿らせてはないが、土壌水分を保持する。植
え付けの日から4週間後、花を摘み、二番花のより均等な生育を生じさせる。植え付け後
の第5週で、形質転換プロセスのために植物を調製する。

0130

花の処理のためのナノコンジュゲート調製:2〜120nmサイズ範囲のナノ粒子は処
置のために選択され、Derufusら(2007)に従って、直鎖DNAカセットおよびホーミングペプ
チド単位を用いて多官能化される。655または705nmの発光極大を有し、ストレプ
トアビジンおよびアミノ基を用いて修飾された量子ドットを得る。QD濃度は、供給者
よって提供される減衰係数を用いて、595nmでの光学的吸収によって測定される。使
用される架橋剤は、スルホ−LC−SPDP(スルホスクシンイミジル6−(3’−[2
ピリジルジチオ]−プロピオンアミドヘキサノエート)(Pierce)およびスル
ホ−SMCC(スルホスクシンイミジル4−(N−マレイミドメチルシクロヘキサン
1−カルボキシレート)(Sigma)である。アミノ修飾されたストレプトアビジン-
QDは、架橋剤を用いて、ビオチン結合直鎖DNAカセットおよびホーミングペプチド
コンジュゲートされる。QDは、Amicon Ultra−4(100kDaカット
フ)フィルターを用いて、50mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH
7.2に再懸濁される。架橋剤(1000倍過剰)をQDに添加し、1時間反応させる。
サンプルは、10mMのEDTA補足された類似の緩衝液にNAP−5重力カラム(過
剰の架橋剤を除去するため)上で濾過される。ペプチドは、典型的には、凍結乾燥粉末
ら使用される。ペプチドおよび直鎖化DNAカセットは、濾過されたQDに添加され、一
晩4℃にて反応させる。3つのAmiconフィルターを用いて、生成物は、Dulbe
ccoリン酸緩衝生理食塩水PBS)で2回、高塩緩衝液(1.0M塩化ナトリウム、
100mMクエン酸ナトリウム、pH7.2)で2回、PBSでさらに2回濾過される。
高塩洗浄は、PBS洗浄だけでは取り除かれない、静電的に結合されたDNAおよびペプ
チドを除くために必要とされる。スルホ−SMCCは、1つの末端に、アミド結合を形成
するために、アミノ修飾されたQDと反応するN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)
エステルを有する。また、スルホ−LC−SPDPは、任意の1級アミン含有分子と急速
に反応して、安定なアミド結合を形成するアミン反応性N−ヒドロキシスクシンイミド(
NHS)エステルを含む。

実施例

0131

植物体形質転換およびT1抵抗性植物のスクリーニング:最終体積が250〜500m
Lの懸濁液は、ナノ粒子、ホーミングペプチドおよび直鎖DNAカセット(NHD)コンジ
ュゲート溶液を用いて作製され、次にシロイヌナズナ植物(大部分は、いくつかの受精し
た長角果を有する未成熟な花房)を処置に用いる。植物を浸漬する前に、0.05%(2
50ul/500ml)〜0.005%の濃度にしたSilwet L−77をNHpD
コンジュゲート溶液に添加し、十分に混合する。植物の上記地上部分は、穏やかに撹拌し
ながら、NHpDコンジュゲート溶液に2〜30秒間浸漬される。処理された植物は、1
6〜24時間、22〜24℃にてドームまたはカバー下に保持される。植物は、Conv
ironに移され、成熟するまで生育させ、種子を回収する。選択トレイ(10.5’’
×21’’×1’’トレイ)を用いて、バルク回収種子をT0植物からスクリーニングし
、各トレイでは約10,000個の種子がある。2つの対照を用いて、選択噴霧が正しく
行われたことを確認する、Col−0負の形質転換体対照、および正の形質転換体対照と
してPAT(ホスピノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)選択可能なマーカーのため
に同型の種子でスパイクされたコロンビアCol−0野生型。同期を達成するために、種
子は、植え付け前の48時間、0.1%寒天溶液に層状化される。選択トレイあたり10
,000個の種子を与えるために、200mgの種子を0.1%(w/v)寒天溶液に添
加し、種子が均一に懸濁されるまでボルテックスする。次に、層状化された種子は、Su
nshineミックスLP5で満たされた選択トレイ上に植え付けられ、Hoaglan
d溶液を用いて地下潅漑される。有効である選択噴霧について、40mLの懸濁された種
子が選択トレイに均一に植え付けられることは重要である。植え付け後、繁殖ドームを各
選択トレイ上に配置し、先に言及した条件を用いた選択のために、種子を生育する。繁殖
ドームは、植え付け後の約5日で除かれる。苗木は、植え付け後の5日、さらに植え付け
、苗木噴霧後の10日に、1塗布あたり280g/haグルホシネートの有効速度で送達
するために、DeVilbiss圧縮された空気噴霧チップを用いて、10mL/トレイ
(703L/ha)の噴霧体積中のグルホシネートアンモニウム(Bayer Crop
SciencesからのLIBERTY(登録商標)除草剤)の0.2%(v/v)溶液
(20μl/10ml dH2O)を用いて噴霧される。調製するためのLiberty
(登録商標)の量は以下のように計算される:(703L/ha噴霧体積=280GPA
)。(280g ai/ha)×(1ha/703L)×(1L/200g aiグルホ
シネート)=0.20%溶液(または20μL/10mL)。10mLの溶液は、噴霧さ
れるべき各トレイのために20mLシンチレーションバイアルにピペットで入れる。噴霧
は、水平および垂直の塗布パターンを用いて送達される。第2の噴霧後の4〜7日に、除
草剤抵抗性植物を同定する。

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