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技術 抗肥満組成物及び抗肥満剤

出願人 独立行政法人国立高等専門学校機構
発明者 池松真也
出願日 2019年2月12日 (1年2ヶ月経過) 出願番号 2019-022891
公開日 2019年8月29日 (8ヶ月経過) 公開番号 2019-142846
状態 未査定
技術分野 食品の着色及び栄養改善 化合物または医薬の治療活性 植物物質含有医薬
主要キーワード 横方向切断 定温乾燥機 自動分析装置用 撮影写真 レインボー 切断方向 飲食品添加物 科学研究
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年8月29日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (14)

課題

本発明は、「さんかくシビラン」の抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物飲食品組成物または飲食品添加物血中脂質中性脂肪遊離脂肪酸)上昇抑制剤インスリン分泌促進剤及びレプチン分泌促進剤を提供することを課題とする。

解決手段

本発明は、さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物、飲食品組成物または飲食品添加物、血中脂質(中性脂肪、遊離脂肪酸)上昇抑制剤、インスリン分泌促進剤及びレプチン分泌促進剤であることを特徴とする。

概要

背景

肥満は、主に(1)前駆脂肪細胞分化及び脂肪蓄積肥大化)、(2)脂肪細胞数の増加、により進行する。
つまり、前駆脂肪細胞は、線維芽細胞同様の形態や増殖能を有するが、分化誘導因子刺激により、成熟脂肪細胞に分化し、脂肪を蓄積(肥大化)する。
そして、肥大化が進行すると脂肪細胞数が増加するが、これが肥満を進行させる原因である。
そこで、前駆脂肪細胞の分化や脂肪の蓄積を抑制することが、肥満の予防になると考えられている。

発明者は、これまでに縄県内で採れる様々な未利用生物資源について鋭意研究を行ってきたところ、沖縄県内の一部の地域に自生する「さんかくシビラン」(Talinum triangulare)の抽出物が、抗肥満活性を有することを見出した。

なお、特許文献1には、スベリヒユ科(Portulacaceae)ハゼラン(Talinum)属植物が、マクロファージでのTNF-α産生のみならず、脂肪組織からのTNF-α産生に対しても抑制作用を示す有効成分を含有していることが開示されているが、このハゼラン(Talinum)属植物は、発明者が抽出物に抗肥満活性を有することを見出した「さんかくシビラン」(Talinum triangulare)とは、同属であるが別種の植物である。

概要

本発明は、「さんかくシビラン」の抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物飲食品組成物または飲食品添加物血中脂質中性脂肪遊離脂肪酸)上昇抑制剤インスリン分泌促進剤及びレプチン分泌促進剤を提供することを課題とする。本発明は、さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物、飲食品組成物または飲食品添加物、血中脂質(中性脂肪、遊離脂肪酸)上昇抑制剤、インスリン分泌促進剤及びレプチン分泌促進剤であることを特徴とする。

目的

特開2003-026586






本願発明は、「さんかくシビラン」の抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬、医薬組成物、飲食品組成物及び飲食品添加物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

さんかくシビラン抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物

請求項2

さんかくシビランのまたは葉からの抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物。

請求項3

さんかくシビランの茎または葉を切断して得られた抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物。

請求項4

請求項1乃至3のいずれか一項に記載の抽出物を有効成分として含む、飲食品組成物または飲食品添加物

請求項5

さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、血中脂質上昇抑制剤

請求項6

前記血中脂質中性脂肪であることを特徴とする請求項5に記載の血中脂質上昇抑制剤。

請求項7

前記血中脂質が遊離脂肪酸であることを特徴とする請求項5に記載の血中脂質上昇抑制剤。

請求項8

さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、インスリン分泌促進剤

請求項9

さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、レプチン分泌促進剤

技術分野

0001

本発明は、抗肥満効果を有する医薬医薬組成物飲食品組成物及び飲食品添加物に関する。

背景技術

0002

肥満は、主に(1)前駆脂肪細胞分化及び脂肪蓄積肥大化)、(2)脂肪細胞数の増加、により進行する。
つまり、前駆脂肪細胞は、線維芽細胞同様の形態や増殖能を有するが、分化誘導因子刺激により、成熟脂肪細胞に分化し、脂肪を蓄積(肥大化)する。
そして、肥大化が進行すると脂肪細胞数が増加するが、これが肥満を進行させる原因である。
そこで、前駆脂肪細胞の分化や脂肪の蓄積を抑制することが、肥満の予防になると考えられている。

0003

発明者は、これまでに縄県内で採れる様々な未利用生物資源について鋭意研究を行ってきたところ、沖縄県内の一部の地域に自生する「さんかくシビラン」(Talinum triangulare)の抽出物が、抗肥満活性を有することを見出した。

0004

なお、特許文献1には、スベリヒユ科(Portulacaceae)ハゼラン(Talinum)属植物が、マクロファージでのTNF-α産生のみならず、脂肪組織からのTNF-α産生に対しても抑制作用を示す有効成分を含有していることが開示されているが、このハゼラン(Talinum)属植物は、発明者が抽出物に抗肥満活性を有することを見出した「さんかくシビラン」(Talinum triangulare)とは、同属であるが別種の植物である。

先行技術

0005

特開2003-026586

発明が解決しようとする課題

0006

本願発明は、「さんかくシビラン」の抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬、医薬組成物、飲食品組成物及び飲食品添加物を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

0007

本発明は、
さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物
であることを特徴とする。

0008

本発明は、
さんかくシビランのまたは葉からの抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物
であることを特徴とする。

0009

本発明は、
さんかくシビランの茎または葉を切断して得られた抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物
であることを特徴とする。

0010

本発明は、
上記したいずれかの抽出物を有効成分として含む、飲食品組成物または飲食品添加物
であることを特徴とする。

0011

本発明は、
さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、血中脂質上昇抑制剤
であることを特徴とする。

0012

本発明は、
上記した血中脂質中性脂肪である血中脂質上昇抑制剤
であることを特徴とする。

0013

本発明は、
上記した血中脂質が遊離脂肪酸である血中脂質上昇抑制剤
であることを特徴とする。

0014

本発明は、
さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、インスリン分泌促進剤
であることを特徴とする。

0015

本発明は、
さんかくシビランの抽出物を有効成分として含む、レプチン分泌促進剤
であることを特徴とする。

発明の効果

0016

本発明によれば、「さんかくシビラン」の抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬、医薬組成物、飲食品組成物及び飲食品添加物を提供できる。

図面の簡単な説明

0017

3T3-L1細胞位相差顕微鏡撮影写真(×100)
分化誘導スケジュールを示した図
蛍光強度測定箇所を示した図
脂肪滴蛍光強度(乾燥及び冷凍処理抽出液の抗肥満活性試験)の測定結果を表したグラフ
各種抽出液添加細胞の位相差顕微鏡撮影写真(×100)
脂肪滴蛍光強度(乾燥及び冷凍処理抽出液の抗肥満活性試験)の測定結果を表したグラフ
脂肪滴蛍光強度(生茎及び生葉抽出液の抗肥満活性試験結果)の測定結果を表したグラフ
細胞の生存率の測定結果を表したグラフ
各群の体重変化を表したグラフ
中性脂肪測定結果を表したグラフ
遊離脂肪酸測定結果を表したグラフ
レプチン測定結果を表したグラフ
インスリン測定結果を表したグラフ

実施例

0018

<実施例1>
本発明にかかる「さんかくシビラン」の抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬組成物及び飲食品組成物または飲食品添加物について、次のとおり説明する。

0019

1.抽出液
(1)試料
さんかくシビランは、茎と葉を使った。
それぞれを乾燥(水分含量5%以下)、冷凍(−80℃)、未処理の3つ処理方法によって試料を得た。
茎の「冷凍」と「未処理」の2つの試料は、茎を縦(茎の長さ方向と同じ向き)と横(茎の長さ方向に対して直交する断面方向)とで切断方向を分け、抗肥満活性がある成分を効率良く抽出できる方法を検討した。
なお、試料ごとの違いは、次の表1のとおりである。

0020

0021

(2)抽出方法
(1)の各試料を、100g(湿重量)に対して350mlのMilli-Q水を加え、オートクレーブ(SX-500、TOMY社)で105℃、5minの条件で熱水抽出を行った。
得られた上清に4倍量の99.5%のエタノール(富士フィルム和光純薬(Wako)株式会社)を加え,-30℃で1時間以上静置した。
高速遠心機(Suprema21、TOMY社、ローター:NA-16)にて4℃、9500rpm、10minの遠心分離を行った。
上清を廃棄し、35℃の定温乾燥機(OFW-600S、Lot No.42596162、アズワン株式会社)に静置して、エタノールを完全に除き、エタノール沈殿物を得た。
得られた沈殿物に、Milli-Q水またはPBSを加え、沈殿物を溶解した。
これを0.22μmフィルター付シリンジを用いて濾過滅菌を行い、得られた溶液を抽出液として試験に用いた。

0022

2.使用細胞株及び細胞培養培地
(1)使用細胞株
抗肥満活性評価試験には、前駆脂肪細胞である3T3-L1(マウス胎児線維芽細胞、前駆脂肪細胞:国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所JCRB細胞バンクより購入)を用いた。
本細胞株は、休止期に分化誘導をかけることで脂肪細胞へと分化し、脂肪を蓄積するため、分化誘導後7日目には多数の脂肪滴を確認することができた(図3)。

0023

(2)細胞培養培地
3T3-L1細胞の培養には、次の表2のとおり、分化誘導前後で組成が異なる培地3種(Maintenance Medium,Differentiation Activation Medium(D/A),Differentiation Maintenance Medium(D/M))を用い、CO2インキュベーターASTEC社製,Water jacket type)内でCO2濃度5%、37℃の条件下で培養を行った。

0024

0025

D/A,D/M培地には、分化誘導剤であるinsulin,Dexamethasone(Dex),3-isobuthyl-methylxanthine(IBMX)を添加した。

0026

3.抗肥満活性試験
(1)分化誘導及び抽出液添加
3T3-L1細胞を96well plateに4×103cells/100μl/wellの密度播種し、2日間の培養でコンフルエントな状態にした。
培地は、 Maintenance Mediumを用いた。
その後さらに2日間培養を継続後、分化誘導剤を含むD/A培地に入れ替え、分化誘導を行った(分化誘導0日目)。
この時点で、各抽出液を10%(v/v)添加した。
N数は3とした。
分化誘導7日目まで、2〜3日おきにD/M培地に交換し、培養を継続した。
培地交換の都度、抽出液を添加した(図2)。

0027

(2)脂肪滴の蛍光強度測定
分化誘導7日目に脂肪滴の蛍光染色を行った。
培地を取り除いた後、PBS(生理食塩水)で細胞表面を一度洗浄した。
AdipoRed(Lonza Japan社)を各wellに200μlずつ添加し、10min以上遮光下で静置した。
マイクロプレートリーダー(Tecan社)にて励起波長485nm、検出波長572nmで蛍光強度を測定した。
1つのwell内で5箇所(図3)の蛍光強度を測定し、その平均値を各wellの値とした。
ソフトウェアは、i-controlを用いた。
得られた値をもとに、1サンプルにつき3wellの蛍光強度の平均値及び標準偏差を算出後、グラフを作成した。
細胞が剥離していた箇所の蛍光強度は除外して計算を行った。

0028

4.結果
(1)抽出液の調製
熱水抽出液10mlから22.5mgのエタノール沈殿物が得られた。
これを熱水抽出液と同量の水に再溶解したため、濃度は2.25mg/mlになった。
冷凍処理の抽出液について、粘度が高く0.22μmフィルター詰まりが頻繁に発生したため、0.45μmフィルターを通した後に0.22μmフィルター濾過滅菌を行った。
これらの水溶液を抗肥満活性試験に供した。

0029

(2)抗肥満活性試験結果
ア)乾燥,冷凍
乾燥及び冷凍の各試料において脂肪蓄積抑制効果を確認することができた。
冷凍の試料は、茎の切断方向による活性の変化は見られなかった(図4未分化な細胞は分化誘導をかけずにMaintenance Mediumにて培養を続けた。分化後7日の細胞は抽出液を添加しなかった。)。
顕微鏡観察によれば、抽出液を添加せずに分化誘導した細胞に比べ、抽出液を添加した細胞では、脂肪滴が少なかった(図5)。
次に、それぞれの抽出液の有効濃度目安を確認すため、添加量を10%(v/v)(最終濃度:225ng/ml)から1%(v/v)(最終濃度:22.5 ng/ml)に変更した。
その結果、1%濃度でも、僅かだが脂肪蓄積が抑制されていた(図6)。
イ)未処理抽出液(葉部、茎部
茎を縦方向に切断した試料4の抽出液を添加した細胞では、脂肪蓄積の増加が見られ、横方向に切断した試料5の抽出液を添加した細胞では、脂肪蓄積の減少が見られた(図7)。
また、切断しない葉から得た抽出液では、脂肪蓄積量の変化が見られなかったのに対し、1cm幅に切断した葉から得た抽出液では、茎の抽出液よりも高い脂肪蓄積抑制効果が示された(図7)。

0030

以上のことから、茎の乾燥及び冷凍の各試料並びに未処理(横方向切断)の試料、さらに、葉(切断)の試料からの抽出液には、脂肪蓄積抑制効果を確認できた。
したがって、これらの抽出液を含む医薬組成物は、抗肥満効果を有する。
また、これらの抽出液を含む飲食品組成物または飲食品添加物も、抗肥満効果が得られ、例えば、飲料、加工食品調味料食品添加物及びサプリメントなどの食品としても提供できる。

0031

<実施例2>
本発明にかかる「さんかくシビラン」の抽出物を有効成分として含む、抗肥満効果を有する医薬について、次のとおり説明する。

0032

1.抽出液
(1)試料
さんかくシビランは、輪切り(5mm以下)にした茎部を使った。

0033

(2)抽出方法
茎を輪切りにしたさんかくシビラン100g(湿重量)に対し、350mlのMilli-Q水を加え、オートクレーブ(SX-500、TOMY社)で105℃、5minの条件で熱水抽出を行った。
得られた上清に4倍量の99.5%のエタノール(富士フィルム和光純薬(Wako)株式会社)を加え、-30℃で1時間以上静置した。
高速遠心機(Suprema21、TOMY社、ローター:NA-16)にて4℃、9500rpm、10minの遠心分離を行った。
上清を廃棄し、35℃の定温乾燥機(OFW-600S、Lot No.42596162、アズワン株式会社)に静置して、エタノールを完全に除き、エタノール沈殿物を得た。
得られた沈殿物に、Milli-Q水またはPBSを加え、沈殿物を溶解した。
これを0.22μmフィルター付シリンジを用いて濾過滅菌を行い、得られた溶液を抽出液として試験に用いた。

0034

2.使用細胞株及び細胞培養培地
(1)使用細胞株
細胞毒性試験には、前駆脂肪細胞である3T3-L1(マウス胎児線維芽細胞、前駆脂肪細胞:国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所JCRB細胞バンクより購入)を用いた。

0035

(2)細胞培養培地
3T3-L1細胞の培養には、10% calf serum及び抗生物質ペニシリン及びストレプトマイシンを最終濃度100units/mL)含有DMEM(以下「DMED培地」という。)を用い、CO2インキュベーター(ASTEC社製,Water jacket type)内でCO2濃度5%、37℃の条件下で培養を行った。

0036

3.細胞毒性試験
96well plateに1.0×104cells/100μl/wellの密度で播種して培養した24時間後の3T3-L1細胞に、抽出液を、終濃度が、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0(mg/ml)になるように添加(培養液の液量に対して10%(v/v))した。
抽出液添加後、さらに24時間培養を継続した。
その後、細胞の生存を確認するため、Premix WST-1試薬タカラバイオ株式会社)を各wellに10μlずつ添加し、CO2インキュベーター(ASTEC社製,Water jacket type)内で2時間培養を行った。
その後、マイクロプレートリーダー(サンライズレインボーサーモ、テカンジャパン株式会社)を用いて、波長440nm、対照波長660nmの条件で吸光度を測定し、MTT Assay(WST-1 Assay)にて細胞の生存率を評価した。
細胞生存率は、抽出液未添加細胞(Control)を100%として算出した。
図8は、PBS(生理食塩水)のみを添加した場合の細胞活性を100%としたときの抽出液の添加濃度ごとの生存率を示したものである。
添加濃度が最も低い0.125mg/mlでは活性はほぼ100%、0.25mg/mlでは約95%、0.5および1.0mg/mlでは約90%、最高濃度の2mg/mlでは約86%の細胞生存率であった。
そこで、添加濃度が最も高い2mg/mlで、マウスの血清試験を行った。

0037

4.抗肥満活性試験
(1)モデルマウス
生後5週齢のマウス(雄性、C57BL/6J、日本チャースリバー株式会社)を次の3群(1群あたり4匹)に分けて、各群2か月間、次の飼料を2日ごとに新しいものと交換しながら、給餌器にて自由に給餌させた。
A)普通食群:マウス特殊系繁殖用飼料(CMFオリエンタ酵母工業株式会社)
毎日1回定時に、経口ゾンデ(DISPOSABLE 経口ゾンデFLEXIBLE TYPE マウス用滅菌済(有限会社フチガミ器械))と注射筒ツベルクリン用(テルモ株式会社))を用いて、PBS(生理食塩水)を300マイクロリットル経口投与
B)高脂肪食群:D12492(60kcal%脂肪含有、Research Diets社)
毎日1回定時に、経口ゾンデ(DISPOSABLE 経口ゾンデ FLEXIBLE TYPE マウス用滅菌済(有限会社フチガミ器械))と注射筒(ツベルクリン用(テルモ株式会社))を用いて、PBS(生理食塩水)を300マイクロリットル経口投与
C)抽出液投与群:D12492(60kcal%脂肪含有、Research Diets社)
毎日1回定時に、経口ゾンデ(DISPOSABLE 経口ゾンデ FLEXIBLE TYPE マウス用滅菌済(有限会社フチガミ器械))と注射筒(ツベルクリン用(テルモ株式会社))を用いて、終濃度2mg/mlの抽出液を300マイクロリットル経口投与

0038

各群のマウスは、個別代謝ケージ(SN-783-0、アズワン株式会社)を用いて1匹ずつ飼育し、体重変化を測定した。
図9は、各群の体重変化を示している。

0039

給餌から2か月後に採血し、血清中の中性脂肪、遊離脂肪酸、レプチン、インスリンを測定した。
血液は、ヒートブロックにて37℃、1時間インキュベート、4℃で一晩静置して血餅凝集させた。
スパーテルで血餅を剥がした後に微量遠心分離機で1200xG、4℃、15min遠心分離して血清回収し、-80℃にて凍結した。
血清中の各成分の分析は、富士フイルム和光純薬株式会社に委託した。
測定の詳細と測定結果は、次のとおりである。
なお、測定結果は各群の平均値±標準誤差で示し、統計的検定は、ANOVA解析後、Tukey-Kramer法にて多重比較検定を行い、危険率p<0.05で有意差有りと判定した。

0040

(2)中性脂肪測定
測定方法酵素法
使用試薬:Lタイプワコー TG・M(和光純薬)
測定装置日立7180型自動分析装置
測定結果:図10に示す。
抽出液投与群の中性脂肪測定値は、有意に下がった。特に、普通食群よりも低かった。

0041

(3)遊離脂肪酸(NEFA)測定
試験方法:酵素法(自動分析装置用試薬−HR NEFA−HR(和光純薬)
使用試薬:自動分析装置用試薬−HR NEFA−HR(和光純薬)
測定装置:日立7180型自動分析装置
測定結果:図11に示す。
抽出液投与群は、高脂肪食群との間に有意差は認められなかったが、普通食群とほぼ同等値であり、平均値は高脂肪食群より低かった。

0042

(4)レプチン測定
試験方法:ELISA法
使用試薬:マウス/ラットレプチン測定キット(森永生科学研究所)
測定装置:MTP-300MICROPLATE READER
測定結果:図12に示す。
抽出液投与群は、高脂肪食群との間に有意差は認められなかったが、4個体とも高いレプチン値(12.0、7.3、7.4、25.6以上)を示し、平均して、高脂肪食群よりも高かった。
また、抽出液投与群は、普通食群との間には有意差があり(0.03)、抽出液を投与するとレプチンの放出が盛んになることが明らかになった。

0043

(5)インスリン測定
試験方法:ELISA法
使用試薬:超高感度マウスインスリン測定キット(森永生科学研究所)
測定装置:MTP-300MICROPLATE READER
測定結果:図13に示す。
抽出液投与群は、インスリン値が高かった。

0044

(6)まとめ
以上の測定結果から、さんかくシビランの抽出物には、血中脂質(中性脂肪、遊離脂肪酸)の上昇を抑制する効果があり、レプチンやインスリンの分泌を促進する効果があることから、抗肥満効果を有する医薬として利用可能である。

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