図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2019年8月15日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題

標的生体実体を標的にする生化学実体候補をスクリーニングする方法を提供すること。

解決手段

標的生化学的実体を標的にする候補生化学的実体をスクリーニングするのに有益な方法、および標的生化学的実体のための結合部分を同定するのに有益な方法が本明細書において記載される。本発明は、標的生体分子を標的にする薬物候補をスクリーニングする方法であって、第1のシグナルと第2のシグナルの間のシグナル差に基づいて薬物候補を選択するステップを含む方法を提供する。シグナル差は、in vivoまたはin vitroの薬理特性の差を示す。第1のシグナルは、標的生体分子を第1の候補と接触させることによる標的生体分子と第1の候補の間の結合の際に生成され、第2のシグナルは、標的生体分子を第2の候補と接触させることによる標的生体分子と第2の候補の間の結合の際に生成される。

概要

背景

疾患を処置する薬物の発見のための努力は、ゲノム研究および生物学的スクリーニングコンビナトリアルケミストリーならびにコンピュータ技術におけるハイスループット技術によって革新されてきた。しかし、科学者は有効な薬物を求めて莫大な数の可能性のある薬物候補をなおより分けねばならない。

アロステリックモジュレーターを同定するために従来のスクリーニング技術を使用することは、困難な作業である。天然リガンドよりタイト阻害剤の結合を補助するのに十分な深いポケット活性部位に有するものは、全てのタンパク質のわずか約15%だけである。アロステリックモジュレーターを同定するために、酵素などの標的のための活性アッセイを使用することができ、また使用されてきたが、そのアッセイには複数のタンパク質が一般的に関与し、モジュレーターの作用は目的の標的以外のものに向けられる可能性があるので、作用機構を判定するのは面倒である可能性がある。そのようなモジュレーターのスクリーニングは、競合的阻害剤を非競合的阻害剤から選別すること、次に後者の群でアロステリックモジュレーターを非特異的モジュレーター(アグリゲーター、高化学量結合剤など)から選別することを含む。

概要

標的生体実体を標的にする生化学実体候補をスクリーニングする方法を提供すること。標的生化学的実体を標的にする候補生化学的実体をスクリーニングするのに有益な方法、および標的生化学的実体のための結合部分を同定するのに有益な方法が本明細書において記載される。本発明は、標的生体分子を標的にする薬物候補をスクリーニングする方法であって、第1のシグナルと第2のシグナルの間のシグナル差に基づいて薬物候補を選択するステップを含む方法を提供する。シグナル差は、in vivoまたはin vitroの薬理特性の差を示す。第1のシグナルは、標的生体分子を第1の候補と接触させることによる標的生体分子と第1の候補の間の結合の際に生成され、第2のシグナルは、標的生体分子を第2の候補と接触させることによる標的生体分子と第2の候補の間の結合の際に生成される。なし

目的

本発明は、標的生体分子を標的にする薬物候補をスクリーニングする方法であって、第1のシグナルと第2のシグナルの間のシグナル差に基づいて薬物候補を選択するステップを含む方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

本明細書に記載の発明。

技術分野

0001

相互参照
本出願は、2013年6月13日に出願された米国仮特許出願第61/834,782号の利益を主張し、当該出願は、その全体が本明細書において参考として援用される。

背景技術

0002

疾患を処置する薬物の発見のための努力は、ゲノム研究および生物学的スクリーニングコンビナトリアルケミストリーならびにコンピュータ技術におけるハイスループット技術によって革新されてきた。しかし、科学者は有効な薬物を求めて莫大な数の可能性のある薬物候補をなおより分けねばならない。

0003

アロステリックモジュレーターを同定するために従来のスクリーニング技術を使用することは、困難な作業である。天然リガンドよりタイト阻害剤の結合を補助するのに十分な深いポケット活性部位に有するものは、全てのタンパク質のわずか約15%だけである。アロステリックモジュレーターを同定するために、酵素などの標的のための活性アッセイを使用することができ、また使用されてきたが、そのアッセイには複数のタンパク質が一般的に関与し、モジュレーターの作用は目的の標的以外のものに向けられる可能性があるので、作用機構を判定するのは面倒である可能性がある。そのようなモジュレーターのスクリーニングは、競合的阻害剤を非競合的阻害剤から選別すること、次に後者の群でアロステリックモジュレーターを非特異的モジュレーター(アグリゲーター、高化学量結合剤など)から選別することを含む。

課題を解決するための手段

0004

本発明は、標的生体分子を標的にする薬物候補をスクリーニングする方法であって、第1のシグナルと第2のシグナルの間のシグナル差に基づいて薬物候補を選択するステップを含む方法を提供する。シグナル差は、in vivoまたはin vitroの薬理特性の差を示す。第1のシグナルは、標的生体分子を第1の候補と接触させることによる標的生体分子と第1の候補の間の結合の際に生成され、第2のシグナルは、標的生体分子を第2の候補と接触させることによる標的生体分子と第2の候補の間の結合の際に生成される。第1のシグナルおよび第2のシグナルは、表面選択技術を使用して第2高調波発生活性部分によって発生する。第1の分子および第2の分子は、標的生体分子中の結合部位を標的にする類似の足場コアを有する。任意選択で、選択ステップの前に、本方法は、標的生体分子を第1の候補と接触させ、標的生体分子と第1の候補の間の結合の際に第1のシグナルを検出するステップ、および標的生体分子を第2の候補と接触させ、標的生体分子と第2の候補の間の結合の際に第2のシグナルを検出するステップをさらに含む。任意選択で、第1の分子および第2の分子は、標的生体分子中の結合部位を標的にする同じ足場コアを有する。任意選択で、本方法は、第1のシグナルと第2のシグナルの間のシグナル差を生じさせることをさらに含む。任意選択で、シグナル差は、ノイズレベルを1%またはそれを超えて上回る。任意選択で、シグナル差は、ノイズレベルを10%またはそれを超えて上回る。任意選択で、第2の候補は、所望のin vivoまたはin vitroの薬理特性に関連した参照分子である。任意選択で、正のシグナル差は、in vivoまたはin vitroの薬理特性の向上を示す。任意選択で、負のシグナル差は、in vivoまたはin vitroの薬理特性の向上を示す。任意選択で、シグナルは濃度で正規化される。任意選択で、シグナルは、正規化された第2高調波発生強度であってもよい。任意選択で、本方法は、選択された薬物候補を動物でスクリーニングするステップをさらに含む。

0005

本発明は、標的生体分子を標的にする薬物候補をスクリーニングする方法であって、標的生体分子および候補分子結合複合体を、候補分子と同じ結合部位を標的にする参照分子と接触させる際に生成されるシグナルに基づいて薬物候補を選択するステップを含む方法も提供する。参照分子は、in vivoまたはin vitroの薬理特性に関連している。シグナルは、表面選択技術を使用して第2高調波発生活性部分によって発生される。候補分子および参照分子は、標的生体分子中の結合部位を標的にする同じまたは類似の足場コアを有する。任意選択で、選択ステップの前に、本方法は、標的生体分子を候補分子と接触させるステップであり、候補分子は標的生体分子中の結合部位に結合し、それによって結合複合体を形成する、ステップと、結合複合体を参照分子と接触させるステップと、結合複合体を参照分子と接触させる際にシグナルを検出するステップとをさらに含む。任意選択で、ノイズレベルを1%以下で上回るシグナルは、参照分子と比較して同等であるまたは増加したin vivoもしくはin vitroの薬理特性を示す。任意選択で、ノイズレベルを10%以下で上回るシグナルは、参照分子と比較して同等であるまたは増加したin vivoもしくはin vitroの薬理特性を示す。任意選択で、シグナルは濃度で正規化される。任意選択で、シグナルは、正規化された第2高調波発生強度であってもよい。任意選択で、本方法は、選択された薬物候補を動物でスクリーニングするステップをさらに含む。

0006

本発明は、標的生体分子を標的にする薬物候補をスクリーニングする方法であって、標的生体分子および参照分子の結合複合体を、参照分子と同じ結合部位を標的にする候補分子と接触させる際に生成されるシグナルに基づいて薬物候補を選択するステップを含む方法も提供する。参照分子は、in vivoまたはin vitroの薬理特性に関連している。シグナルは、表面選択技術を使用して第2高調波発生活性部分によって発生される。第1の候補および参照分子は、標的生体分子中の結合部位を標的にする同じまたは類似の足場コアを有する。任意選択で、選択ステップの前に、本方法は、標的生体分子を参照分子と接触させるステップであり、参照分子は標的生体分子中の結合部位に結合し、それによって結合複合体を形成する、ステップと、結合複合体を候補分子と接触させるステップと、結合複合体を候補分子と接触させる際にシグナルを検出するステップとをさらに含む。任意選択で、ノイズレベルを1%を超えて上回るシグナルは、参照分子と比較して同等であるまたは増加したin vivoもしくはin vitroの薬理特性を示す。任意選択で、ノイズレベルを10%を超えて上回るシグナルは、参照分子と比較して同等であるまたは増加したin vivoもしくはin vitroの薬理特性を示す。任意選択で、シグナルは濃度で正規化される。任意選択で、シグナルは、正規化された第2高調波発生強度であってもよい。任意選択で、本方法は、選択された薬物候補を動物でスクリーニングするステップをさらに含む。

0007

本発明は、標的生体分子のための結合部分を同定する方法であって、第1のシグナルと第2のシグナルの間のシグナル差に基づいて選択される、第1の候補および第2の候補の構造を比較することによって結合部分を同定するステップを含む方法も提供する。シグナル差は、第1の分子中の結合部分の存在および第2の分子中の結合部分の非存在を示す。第1のシグナルは、標的生体分子を第1の分子と接触させることによる標的生体分子と第1の分子の間の結合の際に生成される。第2のシグナルは、標的生体分子を第2の分子と接触させることによる標的生体分子と第2の分子の間の結合の際に生成される。第1のシグナルおよび第2のシグナルは、表面選択技術を使用して第2高調波発生活性部分によって発生される。第1の分子および第2の分子は、標的生体分子中の結合部位を標的にする同じまたは類似の足場コアを有する。任意選択で、シグナル差は、in vivoまたはin vitroの薬理特性の差を示す。任意選択で、シグナル差は、ノイズレベルを1%またはそれを超えて上回る。任意選択で、シグナル差は、ノイズレベルを10%またはそれを超えて上回る。任意選択で、同定ステップの前に、本方法は、標的生体分子を第1の分子と接触させ、標的生体分子と第1の分子の間の結合の際に第1のシグナルを検出するステップ、および標的生体分子を第2の分子と接触させ、標的生体分子と第2の分子の間の結合の際に第2のシグナルを検出するステップをさらに含む。任意選択で、本方法は、第1のシグナルと第2のシグナルの間のシグナル差を生じさせるステップをさらに含む。任意選択で、シグナルは濃度で正規化される。任意選択で、シグナルは、正規化された第2高調波発生強度であってもよい。

0008

本発明は、標的生体分子のための結合部分を同定する方法であって、標的生体分子および候補分子の結合複合体を、候補分子と同じ結合部位を標的にする参照分子と接触させる際に生成されるシグナルに基づいて選択される、候補分子および参照分子の構造を比較することによって結合部分を同定するステップを含む方法も提供する。シグナルは、参照分子中の結合部分の存在および候補分子中の結合部分の非存在を示す。シグナルは、表面選択技術を使用して第2高調波発生活性部分によって発生される。候補分子および参照分子は、標的生体分子中の結合部位を標的にする同じまたは類似の足場コアを有する。任意選択で、ノイズレベルを1%以下で上回るシグナルは、参照分子と比較して同等であるまたは増加したin vivoもしくはin vitroの薬理特性を示す。任意選択で、ノイズレベルを10%以下で上回るシグナルは、参照分子と比較して同等であるまたは増加したin vivoもしくはin vitroの薬理特性を示す。任意選択で、同定ステップの前に、本方法は、標的生体分子を候補分子と接触させるステップであり、候補分子は標的生体分子中の結合部位に結合し、それによって結合複合体を形成する、ステップと、結合複合体を参照分子と接触させるステップと、結合複合体を参照分子と接触させる際にシグナルを検出するステップとをさらに含む。任意選択で、シグナルは濃度で正規化される。任意選択で、シグナルは、正規化された第2高調波発生強度であってもよい。

0009

本発明は、標的生体分子のための結合部分を同定する方法であって、標的生体分子および参照分子の結合複合体を、参照分子と同じ結合部位を標的にする候補分子と接触させる際に生成されるシグナルに基づいて選択される、候補分子および参照分子の構造を比較することによって結合部分を同定するステップを含む方法をさらに提供する。シグナルは、参照分子中の結合部分の存在および候補分子中の結合部分の非存在を示す。シグナルは、表面選択技術を使用して第2高調波発生活性部分によって発生される。候補分子および参照分子は、標的生体分子中の結合部位を標的にする同じまたは類似の足場コアを有する。任意選択で、ノイズレベルを1%を超えて上回るシグナルは、参照分子と比較して同等であるまたは増加したin vivoもしくはin vitroの薬理特性を示す。任意選択で、ノイズレベルを10%を超えて上回るシグナルは、参照分子と比較して同等であるまたは増加したin vivoもしくはin vitroの薬理特性を示す。任意選択で、同定ステップの前に、本方法は、標的生体分子を参照分子と接触させるステップであり、参照分子は標的生体分子中の結合部位に結合し、それによって結合複合体を形成する、ステップと、結合複合体を候補分子と接触させるステップと、結合複合体を候補分子と接触させる際にシグナルを検出するステップとをさらに含む。任意選択で、シグナルは濃度で正規化される。任意選択で、シグナルは、正規化された第2高調波発生強度であってもよい。

0010

任意選択で、in vivoの薬理特性は、治療効能である。任意選択で、in vivoの薬理特性は、臨床効能特性である。任意選択で、in vivoの薬理特性は、薬物動態学的特性である。任意選択で、in vivoの薬理特性は、臨床毒性学的特性である。任意選択で、in vivoの薬理特性は、前臨床毒性学的特性である。任意選択で、in vivoの薬理特性は、薬力学特性である。任意選択で、in vivo薬理学変数は、治療指数である。任意選択で、結合部位は活性部位である。任意選択で、結合部位はアロステリック結合部位である。任意選択で、標的生体分子は、タンパク質である。任意選択で、標的生体分子は、DNAである。任意選択で、標的生体分子は、アルファシヌクレインである。任意選択で、本方法は、選択された薬物候補を動物でスクリーニングするステップをさらに含む。任意選択で、薬物候補は、小分子である。任意選択で、薬物候補は、タンパク質である。任意選択で、薬物候補は、抗体である。任意選択で、薬物候補は、生物学的に優れているまたは生物学的に類似の薬物である。任意選択で、薬物候補は、テトラスルホン酸フタロシアニン誘導体または類似体である。任意選択で、薬物候補は、アルファシヌクレインに対する抗体である。任意選択で、薬物候補は、ソラネズマブまたはバピニューズマブの生物学的同等体である。

0011

本開示は、生化学実体をスクリーニングする方法であって、(a)6つまたはそれを超える候補生化学的実体を含むライブラリーを用意するステップであり、6つまたはそれを超える候補生化学的実体は、(i)候補生化学的実体の各々の150g/mol以内の分子量、(ii)候補生化学的実体の各々の30%以内の分子量、(iii)候補生化学的実体の各々の原子が15個以内の化学式、(iv)候補生化学的実体の各々の間の15未満の全原子数の差、(v)5未満の炭素原子数の差、(vi)5未満の水素原子数の差、(vii)5未満の窒素原子数の差、(viii)5未満の酸素原子数の差、(ix)5未満の硫黄原子数の差、(x)候補生化学的実体の各々の10%以内のlog Dで測定される極性、(xi)候補生化学的実体の各々の10%以内のlog P(分配係数)で測定される極性、(xii)候補生化学的実体の各々の10%以内のPSA(極性表面積)で測定される極性、(xiii)同一の足場コア、(xiv)グラフ理論で測定される化学的類似性、(xv)0.85を超えるTanimoto(またはJaccard)係数T、(xvi)3未満の芳香族基数の差、(xvii)3未満の複素環基数の差、(xviii)3未満の単環基数の差、(xix)3未満の縮合環系数の差、および(xx)3未満の二重結合数の差からなる群から選択される1つまたは複数の構造類似性パラメータを使用して判定するときに構造的に類似している、ステップと、(b)標的生化学的実体の第1の立体配置状態を測定し、それによってベースラインを作成するステップと、(c)候補生化学的実体の各々を同じ標的生化学的実体と接触させるステップと、(d)標的生化学的実体の第2の立体配置状態を測定するステップと、(e)第2の立体配置状態を使用して標的生化学的実体のシグネチャーを判定するステップと、(f)シグネチャーに基づいて候補生化学的実体から1つまたは複数の生化学的実体を選択するステップとを含む方法を提供する。

0012

一部の場合には、第1または第2の立体配置状態を測定するステップは、内部全反射(TIR)を使用することができる。一部の場合には、第1または第2の立体配置状態を測定するステップは、第2高調波発生(SHG)を使用することができる。

0013

一部の場合には、シグネチャーを判定するステップは、標的生化学的実体の立体配置状態の動態学的(リアルタイム)変化を測定するステップを含むことができる。他の場合には、シグネチャーを判定するステップは、標的生化学的実体の立体配置状態のエンドポイント変化を測定するステップを含むことができる。さらに他の場合には、シグネチャーを判定するステップは、シグナルのシグナル強度を測定するステップを含むことができる。さらなる場合には、シグネチャーを判定するステップは、ベースラインを使用する。

0014

一部の場合には、本方法は、コンピュータ実行可能プログラムを使用して、1つまたは複数の構造類似性パラメータに基づいて6つまたはそれを超える候補生化学的実体を分析するステップをさらに含むことができる。他の場合には、本方法は、コンピュータ実行可能プログラムを使用して、シグネチャーを分析するステップをさらに含むことができる。

0015

候補生化学的実体の各々は、標的生化学的実体の立体配置状態において異なる変化を生成することができる。さらに、ステップ(c)での接触の際に、候補生化学的実体の各々は異なるシグネチャーを生じ得る。

0016

本方法は、標的生化学的実体の立体配置状態の変化を、公知の立体配置モジュレーターによって生成される立体配置状態の変化と比較するステップをさらに含むことができる。公知の立体配置モジュレーターは、公知の薬物であってもよい。本方法は、公知の立体配置モジュレーターによって誘導される立体配置状態の変化に最も類似している立体配置状態の変化に基づいて、1つまたは複数の生化学的実体を選択するステップをさらに含むことができる。一部の場合には、公知の立体配置モジュレーターによって生成される立体配置状態の変化は、薬理特性または機能的効果に相関する可能性がある。

0017

一部の場合には、候補生化学的実体の少なくとも2つは、類似の薬理特性または機能的効果を有する。他の場合には、候補生化学的実体の少なくとも2つは、類似の薬理特性または機能的効果を有しない。さらに、1つまたは複数の生化学的実体は、公知の薬理特性または公知の機能的効果とのシグネチャーの相関に基づいて選択することができる。

0018

第1の立体配置状態は、標的生化学的実体を薬剤インキュベートした後に測定することができる。例えば、薬剤は、ライブラリーからの候補生化学的実体であってもよい。

0019

本方法は、i)ベースラインと比較したシグネチャーの大きさの変化、ii)ベースラインと比較したシグネチャーの方向の変化、およびiii)候補生化学的実体の接触の際のシグネチャーの単位時間あたりのシグナルの速度の変化からなる群から選択されるシグネチャーパラメータを測定するステップをさらに含むことができる。さらに、i)第1の候補生化学的実体との接触の際のベースラインと比較したシグネチャーの大きさの変化は、第2の候補生化学的実体との接触の際のベースラインと比較したシグネチャーの大きさの変化の50%以内であること、ii)第1の候補生化学的実体との接触の際のベースラインと比較したシグネチャーの方向の変化は、第2の候補生化学的実体との接触の際のベースラインと比較したシグネチャーの方向の変化と同じであること、およびiii)第1の候補生化学的実体との接触の際のシグネチャーの単位時間あたりのシグナルの速度の変化は、第2の候補生化学的実体との接触の際のシグネチャーの単位時間あたりのシグナルの速度の変化の2倍以内であることからなる群から選択される1つまたは複数のシグネチャー類似性パラメータを使用して判定したときに、第1の候補生化学的実体によって生じるシグネチャーおよび第2の候補生化学的実体によって生じるシグネチャーは、類似してもよい。

0020

本開示は、生化学的実体をスクリーニングする方法であって、(a)6つまたはそれを超える候補生化学的実体を含むライブラリーを用意するステップと、(b)標的生化学的実体の第1の立体配置状態を測定し、それによってベースラインを作成するステップと、(c)候補生化学的実体の各々を同じ標的生化学的実体と接触させるステップと、(d)標的生化学的実体の第2の立体配置状態を測定するステップと、(e)第2の立体配置状態を使用して少なくとも第1および第2の候補生化学的実体のシグネチャーを判定するステップと、(f)第1の生化学的実体のシグネチャーを第2の生化学的実体のシグネチャーと比較するステップと、(g)(f)での比較に基づいて、候補生化学的実体から1つまたは複数の生化学的実体を選択するステップとを含む方法も提供する。

0021

一部の場合には、6つまたはそれを超える候補生化学的実体は、(i)候補生化学的実体の各々の150g/mol以内の分子量、(ii)候補生化学的実体の各々の30%以内の分子量、(iii)候補生化学的実体の各々の原子が15個以内の化学式、(iv)候補生化学的実体の各々の間の15未満の全原子数の差、(v)5未満の炭素原子数の差、(vi)5未満の水素原子数の差、(vii)5未満の窒素原子数の差、(viii)5未満の酸素原子数の差、(ix)5未満の硫黄原子数の差、(x)候補生化学的実体の各々の10%以内のlog Dで測定される極性、(xi)候補生化学的実体の各々の10%以内のlog P(分配係数)で測定される極性、(xii)候補生化学的実体の各々の10%以内のPSA(極性表面積)で測定される極性、(xiii)同一の足場コア、(xiv)グラフ理論で測定される化学的類似性、(xv)0.85を超えるTanimoto(またはJaccard)係数T、(xvi)3未満の芳香族基数の差、(xvii)3未満の複素環基数の差、(xviii)3未満の単環基数の差、(xix)3未満の縮合環系数の差、および(xx)3未満の二重結合数の差からなる群から選択される1つまたは複数の構造類似性パラメータを使用して判定するときに、構造的に類似している。

0022

本方法は、コンピュータ実行可能プログラムを使用して、シグネチャーを分析するステップをさらに含むことができる。候補生化学的実体の各々は、標的生化学的実体の立体配置状態において異なる変化を生成することができる。一部の場合には、(c)での接触の際に、候補生化学的実体の各々は異なるシグネチャーを生じ得る。一部の場合には、生化学的実体の1つまたは複数のシグネチャーは、公知の薬理特性または公知の機能的効果と相関する。さらなる場合には、候補生化学的実体の少なくとも2つは、類似の薬理特性または機能的効果を有する。

0023

本方法は、i)ベースラインと比較したシグネチャーの大きさの変化、ii)ベースラインと比較したシグネチャーの方向の変化、およびiii)候補生化学的実体の接触の際のシグネチャーの単位時間あたりのシグナルの速度の変化からなる群から選択されるパラメータを測定するステップをさらに含むことができる。さらに、i)第1の候補生化学的実体との接触の際のベースラインと比較したシグネチャーの大きさの変化は、第2の候補生化学的実体との接触の際のベースラインと比較したシグネチャーの大きさの変化の50%以内であること、ii)第1の候補生化学的実体との接触の際のベースラインと比較したシグネチャーの方向の変化は、第2の候補生化学的実体との接触の際のベースラインと比較したシグネチャーの方向の変化と同じであること、およびiii)第1の候補生化学的実体との接触の際のシグネチャーの単位時間あたりのシグナルの速度の変化は、第2の候補生化学的実体との接触の際のシグネチャーの単位時間あたりのシグナルの速度の変化の2倍以内であることからなる群から選択される1つまたは複数のシグネチャー類似性パラメータを使用して判定したときに、第1の候補生化学的実体によって生じるシグネチャーおよび第2の候補生化学的実体によって生成されるシグネチャーは類似してもよい。

0024

本開示は、生化学的実体を分類する方法であって、(a)生化学的実体のライブラリーを用意するステップであり、生化学的実体の各々は異なる分子構造を含む、ステップと、(b)ライブラリー中の少なくとも1つの生化学的実体を同じ標的生化学的実体と接触させるステップと、(c)標的生化学的実体の立体配置状態を測定するステップと、(d)立体配置状態を使用してシグネチャーを判定するステップと、(e)シグネチャーを使用して構造−活性関係SARカタログを作成するステップとを含む方法をさらに提供する。

0025

一部の場合には、SARを作成するステップは、シグネチャーを結合特性機能的特性、効能、力価選択性またはそれらの組合せと相関させるステップを含むことができる。一部の場合には、SARを作成するステップは、シグネチャーを候補生化学的実体の1つまたは複数の構造パラメータと相関させるステップを含むことができ、前記構造パラメータは、分子量、化学式、全原子数、炭素原子数、水素原子数、窒素原子数、酸素原子数、硫黄原子数、log Dによって測定される極性、log Pによって測定される極性、PSA(極性表面積)によって測定される極性、足場コア、グラフ理論で測定される化学的類似性、Tanimoto(またはJaccard)係数T、芳香族基数、複素環基数、単環基数、縮合環系数および二重結合数からなる群から選択することができる。

0026

本方法は、接触ステップの前に標的生化学的実体の立体配置状態を測定し、それによってベースラインを生成するステップをさらに含むことができる。本方法は、薬理特性または機能的効果と関連する生化学的実体の少なくとも1つの中の結合部分を判定するために、SARを分析するステップをさらに含むことができる。

0027

一部の場合には、シグネチャーを判定するステップは、標的生化学的実体の立体配置状態の動態学的(リアルタイム)変化を測定するステップを含むことができる。他の場合には、シグネチャーを判定するステップは、標的生化学的実体の立体配置状態のエンドポイント変化を測定するステップを含む。シグネチャーは、標的生化学的実体の立体配置状態の変化を示すことができる。本方法は、コンピュータ実行可能プログラムを使用して、シグネチャーを分析するステップをさらに含むことができる。

0028

生化学的実体のライブラリーは、薬物候補を含むことができる。標的生化学的実体は、薬物標的であってもよい。薬物標的は、公知の薬理特性または公知の機能的効果を有することができる。本方法は、SARカタログまたはシグネチャーと、公知の薬理特性または公知の機能的効果との相関に基づいて、1つまたは複数の生化学的実体を選択するステップをさらに含むことができる。

0029

本方法は、i)ベースラインと比較したシグネチャーの大きさの変化、ii)ベースラインと比較したシグネチャーの方向の変化、およびiii)候補生化学的実体の接触の際のシグネチャーの単位時間あたりのシグナルの速度の変化からなる群から選択されるシグネチャーパラメータを測定するステップをさらに含むことができる。さらに、i)第1の候補生化学的実体との接触の際のベースラインと比較したシグネチャーの大きさの変化は、第2の候補生化学的実体との接触の際のベースラインと比較したシグネチャーの大きさの変化の50%以内であること、ii)第1の候補生化学的実体との接触の際のベースラインと比較したシグネチャーの方向の変化は、第2の候補生化学的実体との接触の際のベースラインと比較したシグネチャーの方向の変化と同じであること、およびiii)第1の候補生化学的実体との接触の際のシグネチャーの単位時間あたりのシグナルの速度の変化は、第2の候補生化学的実体との接触の際のシグネチャーの単位時間あたりのシグナルの速度の変化の2倍以内であることからなる群から選択される1つまたは複数のシグネチャー類似性パラメータを使用して判定したときに、第1の候補生化学的実体によって生じるシグネチャーおよび第2の候補生化学的実体によって生じるシグネチャーは類似してもよい。
参照による組込み

0030

この明細書で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的および個々に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

0031

本発明の新規特徴は、添付の特許請求の範囲で詳細に示される。本発明の特徴および利点のより深い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明および付随図への参照によって得られる。

図面の簡単な説明

0032

図1Aは、第2高調波発生によって測定したときに、スペルミンおよびスペルミジンがアルファシヌクレインの立体配置変化を誘導することを示す。5mMスペルミンへのアルファシヌクレインの曝露の際のSHG応答をリアルタイムで示す代表的トレース。矢印は、スペルミン添加を表す。SHG強度の変化は、注射直前の値に正規化される。

0033

図1Bは、SHGによって測定されるアルファシヌクレイン立体配置でのスペルミンの用量反応曲線を示す。用量曲線(logスケールプロットされている)は、所与濃度のスペルミンを5μMアルファシヌクレインに加え、SHG強度の変化を測定することによって判定された。各濃度についてのSHG強度の変化は、シフト(本明細書では「変化」とも呼ばれる)パーセントとして数量化された。

0034

図1Cは、3mMスペルミジンへのアルファシヌクレインの曝露の際のSHG応答をリアルタイムで示す代表的トレースを提供する。矢印は、スペルミジン添加を表す。SHG強度の変化は、注射直前の値に正規化される。

0035

図1Dは、SHGによって測定されるアルファシヌクレイン立体配置でのスペルミジンの用量反応曲線を示す。用量曲線(logスケールでプロットされている)は、所与濃度のスペルミジンを5μMアルファシヌクレインに加え、SHG強度の変化を測定することによって判定された。各濃度についてのSHG強度の変化は、シフトパーセントとして数量化された。エラーバー=SEM。N=3。

0036

図1Eは、スペルミン−スペルミジン競合アッセイの数量化を示す。1mMスペルミンおよび3mMスペルミジン対照は、それぞれ左および中央のカラムに示す。1mMスペルミンとプレインキュベートされた試料への3mMスペルミジンの添加を、右のカラムに示す。SHG強度の変化は、シフトパーセントとしてプロットした。エラーバー=SEM。N=4。

0037

図2Aは、第2高調波発生に基づくMaybridge Ro3断片ライブラリーのスクリーニングを示す。アルファシヌクレインのスペルミン誘導立体配置変化の阻害剤についてMaybridge Ro3断片ライブラリーをスクリーニングするために使用したSHG応答を示す代表的トレース。左には、5mMスペルミンへのアルファシヌクレインの曝露の一般的な応答を示す。右には、5mMスペルミンに曝露した際に1mM化合物Aとプレインキュベートしたアルファシヌクレインの応答を示し、ベースラインに対し無視できる変化を示している。

0038

図2Bは、スペルミン(上)および化合物A(下)の化学構造図式的に例示する。

0039

図2Cは、アルファシヌクレインのスペルミン誘導立体配置変化の阻害剤についてMaybridge Ro3断片ライブラリーをスクリーニングするために使用したSHG応答を示す代表的トレースを提供する。左には、5mMスペルミンに曝露した際のアルファシヌクレインの一般的なSHG応答を示す代表的トレースを示す。中央には、5mMスペルミンへの曝露の後に1mM化合物AとプレインキュベートしたアルファシヌクレインのSHG応答を示し、ベースラインに対し無視できる変化を示している。右には、1mM化合物Aへのアルファシヌクレインの曝露の際のSHG応答をリアルタイムで示す代表的トレースを示す。矢印は、化合物A添加を表す。SHG強度の変化は、注射直前の値に正規化される。

0040

図3Aは、化合物Aの特徴付けを例示する。1mM化合物Aへのアルファシヌクレインの曝露の際のSHG応答をリアルタイムで示す代表的トレースを示す。矢印は、化合物A添加を表す。SHG強度の変化は、注射直前の値に正規化される。

0041

図3Bは、SHGによって測定されるアルファシヌクレイン立体配置での化合物Aの用量反応曲線を提供する。用量曲線(logスケールでプロットされている)は、所与濃度の化合物Aを5μMアルファシヌクレインに加え、SHG強度の変化を測定することによって判定された。各濃度についてのSHG強度の変化は、シフトパーセントとして数量化された。エラーバー=SEM。N=3。

0042

図3Cは、スペルミン−化合物A競合アッセイの数量化を示す。5mMスペルミン対照は、左に示す。スペルミンとプレインキュベートした試料への1mMまたは100μMの化合物Aの添加を、それぞれ中央および右のカラムに示す。SHG強度の変化は、シフト(本明細書で「変化」とも呼ぶ)パーセントとしてプロットした。

0043

図3Dは、スペルミン−化合物A競合アッセイの数量化を示す。5mMスペルミンおよび1mM化合物A単独のSHG強度の一般的な変化パーセントは、それぞれ第1および第2のカラムに示す。スペルミンとプレインキュベートした試料への1mMまたは100μMの化合物Aの添加の際のSHG強度の変化を、それぞれ第3および第4のカラムに示す。1mMの化合物Aとのインキュベーション後の5mMスペルミンの添加の際のSHG強度の変化は、第5のカラムに示す。SHG強度の変化は、変化パーセントとしてプロットした。エラーバー=SEM。N=3。

0044

図4Aは、化合物Aがアルファシヌクレインのスペルミン誘導立体配置変化の高度に特異的な阻害剤であることを示す。プログラムSimFinderによって予測されたMaybridge Ro3ライブラリーからの上位5つの化合物A類似体の化学構造である。

0045

図4Bは、化合物Aの上位5つの化学的類似体に曝露した際のアルファシヌクレインの立体配置変化の数量化を示す。5μMアルファシヌクレインを含有するウェルに各類似体を加え、SHG強度の変化を測定した。比較目的のために、1mMのスペルミン添加の一般的なSHG応答を示す代表的データセットが含まれる。SHG強度の変化は、シフトパーセントとしてプロットした。エラーバー=SEM。N=3。

0046

図4Cは、類似体−スペルミン競合アッセイでのアルファシヌクレインの立体配置変化の数量化を示す。指示された化合物A類似体を25分間5μMのアルファシヌクレインとプレインキュベートし、1mMスペルミンに曝露した際のSHG強度の変化を測定した。比較目的のために、化合物A+1mMスペルミン競合アッセイからの一般的なSHG応答を示す代表的データセットが含まれる。SHG強度の変化は、シフトパーセントとしてプロットした。

0047

図4Dは、化合物Aの上位5つの化学的類似体に曝露した際のアルファシヌクレインの立体配置変化の数量化を示す。5μMアルファシヌクレインを含有するウェルに各類似体を1mMの最終濃度で加え、SHG強度の変化を測定した。比較目的のために、1mMの化合物A添加の一般的なSHG応答を示す代表的データセットが含まれる。SHG強度の変化は、変化パーセントとしてプロットした。エラーバー=SEM。N=3。

0048

図4Eは、1:12のモル比の類似体1(左)、類似体2(中央)および類似体5(右)の存在下での、アルファシヌクレインの1H−15N共鳴化学シフト摂動分析を提供する。エラーバー=SEM。N=3。

0049

図5Aは、アルファシヌクレイン凝集阻害剤フタロシアニンテトラスルホネートは異なるSHGシグネチャーを生成することを示す。10μMのPcTへのアルファシヌクレインの曝露の際のSHG応答をリアルタイムで示す代表的トレース。矢印は、PcT添加の時間を示す。SHG強度の変化は、シフトパーセントとしてプロットした。エラー=SEM。N=5。

0050

図5Bは、スペルミン、スペルミジンおよびフタロシアニンテトラスルホネートに曝露した際のアルファシヌクレインのSHG強度の変化の数量化を示す。5mMのスペルミンは左に示し、3mMのスペルミジンは中央に示し、10μMのPcTは右に示す。SHG強度の変化は、変化パーセントとしてプロットした。エラーバー=SEM。N=4。

0051

図6Aは、2−D HSQCMRが、化合物Aはタンパク質のC末端領域のスペルミンと同じ部位に結合することを示すことを示す。

0052

図6Bは、化合物Aの非存在下(黒)および存在下(赤)における100μMのアルファシヌクレインの1H−15NNMRスペクトルの重なりの詳細を示す。

0053

図6Cは、1:10のモル比の化合物Aの存在下でのアルファシヌクレインの1H−15N共鳴の化学シフト摂動分析を示す。

0054

図6Dは、化合物A(3mM)の非存在下(黒)および存在下(赤)でのMTSL標識A90Cアルファシヌクレイン(100μM)中のアミドプロトン常磁性緩和強化プロファイルを示す。

0055

図7Aは、チオフラビンTアッセイが、化合物Aはアルファシヌクレインの凝集速度をin vitroでおよそ2倍増加させることを示すことを示す。

0056

図7Bは、化合物Aの存在下(左)および非存在下(右)で得られたアルファシヌクレインフィブリル電子顕微鏡写真である。

0057

図8は、ドーパミンの添加の際のアルファシヌクレインのSHG強度の動態学的(リアルタイム)変化を示す。

0058

図9は、バッファー単独または1mMのドーパミンの添加の際のアルファシヌクレインのSHG強度の平均変化の数量化を示す。

0059

本発明の種々の実施形態が本明細書で示され、記載されたが、そのような実施形態は例示としてだけ提供されることは当業者に明らかになる。本発明を逸脱しない範囲で、当業者は多くの変形、変化および置換を思いつくことができる。本明細書に記載される本発明の実施形態への様々な代替物を使用することができることを理解すべきである。本発明の異なる態様は個々に、総合的にまたは互いと一緒に評価することができると理解される。
定義

0060

本明細書で使用される場合、「第2高調波」は、基本的な光線周波数の2倍である光の周波数を指す。

0061

本明細書で使用される場合、「表面選択的」は、非線形光学技術、例えば第2高調波発生または和/差周波発生または当技術分野で公知の他の表面特異的技術を指す。

0062

本明細書で使用される場合、「和周波発生」(SFG)は、1つの周波数(Ω1)の光が別の周波数(Ω2)の光と混合されて和周波数(Ω1+Ω2)の応答を与える、非線形光学技術である(Yang, G、Shen, YR、Optics Letters、9巻(11号):510〜512頁、1984年;Shen, YR、Annual Review of Physical Chemistry 40巻(1号):327〜350頁、1989年)。例えば、SFGは、それらの特徴的振動遷移を通して表面での分子の検出のために特に有益であり、この場合は、本質的に、可視的および赤外線の周波数におけるΩ1およびΩ2についての表面選択的赤外分光分析である。用語「SHG」または「第2高調波発生」が本明細書で使用される場合、SFGおよび「和周波発生」は、SHGの代わりに当業技術者周知の方法を置き換えて使用することができるものと理解される。

0063

非線形活性部分」は、本明細書で使用される場合、超偏光率を有する物質である。

0064

「第2高調波活性部分」は、本明細書で使用される場合、それを(例えば、より)非線形光学活性にするために、分子(例えば、酵素などのタンパク質)、粒子細胞または相(例えば、脂質二重層)に付着させるまたは組み入れる(例えば、共有結合または非共有結合で付着させる、遺伝的に組み入れる、等)ことができる、非線形活性部分、粒子または分子を指す。

0065

本明細書で使用される場合、「アロステリック」、「アロステリックモジュレーター」または「アロステリック候補」は、活性部位以外の部位に主に結合し、SHGまたはSFGにより判定するときに(例えば、結合部位に隣接する1つまたは複数の位置および/または結合部位に隣接していない1つまたは複数の位置で)立体配置変化を引き起こすことができ、したがってアロステリック作用機構を通してそれらの効果を発揮することができる、分子、部分または物質を指す。

0066

「活性部位」または「活性結合部位」は、本明細書で使用される場合、その形状および電荷ポテンシャルの結果、様々な共有結合および/または非共有結合力を通して別の薬剤(例えば、リガンド、タンパク質、ポリペプチドペプチド、DNAもしくはRNAを含む核酸、分子、化合物、抗生物質または薬物、分子、部分、基質生成物、類似体または阻害剤)と好都合相互作用または関連し、タンパク質の機能(例えば、触媒作用シグナル伝達および/またはエフェクター活性化)が発揮される標的タンパク質の領域を指す。

0067

本明細書に規定する用語「リガンド」は、別の分子に結合する任意の分子、例えば別のものに結合する1つのタンがパク質、タンパク質に結合する炭水化物またはタンパク質に結合する小分子を含む。

0068

本明細書で使用される場合、「非線形」は、入射光線(別名、基本波)の周波数を変換することが可能な光学技術を指す。非線形光線は、そのような変換、例えば第2高調波から生じる光線(例えば、高次周波数光線)である。第2高調波、和周波または差周波発生では、非線形光線は首尾一貫して発生される。第2高調波発生(SHG)では、基本光線の2つの光子が界面によって事実上散乱し、第2高調波の1つの光子を生成する。本明細書では、「非線形光学」または「表面選択的非線形」とも呼ぶ。

0069

本明細書で使用される用語「非線形活性」または「非線形的に活性」は、入射放射光線(複数可)によって推進されるときに非線形光学放射線を発生する、分子、粒子、界面または相の能力一般特性も指す。

0070

本明細書で非線形の光学的方法に言及するときは、「検出」または「検出すること」は、プローブ−標的相互作用(例えば、タンパク質と候補化合物の間の相互作用)の特性、または相互作用の効果を検出する、測定する、または、非線形の光学的光の特性(例えば、強度、波長偏光もしくは電磁放射線に共通する他の特性)と相関させるために表面選択的非線形光学的放射の特性を使用することができる技術を指す。

0071

この明細書全体に記載されたあらゆる最大数値限界は、それより低いあらゆる数値限界が本明細書に明示的に記述されたものとして、そのようなより低い数値限界を含むものとする。この明細書全体に記載されたあらゆる最小数値限界は、それより高いあらゆる数値限界が本明細書に明示的に記述されたものとして、そのようなより高い数値限界を含む。この明細書全体に記載されたあらゆる数値範囲は、それより狭いあらゆる数値範囲が本明細書に全て明示的に記述されたものとして、そのようなより広い数値範囲に入るより狭い数値範囲を含む。
序論

0072

本明細書において、標的生化学的実体を標的にする候補生化学的実体および/または結合部分(例えば、候補生化学的実体に関連した結合部分(複数可))、例えばin vivoまたはin vitroの薬理特性に関連した候補生化学的実体および/または結合部分をスクリーニングするための方法が提供される。これらの方法は、表面選択的技術を使用して第2高調波発生(SHG)活性部分、和周波発生(SFG)活性部分または差周波発生(DFG)活性部分(例えば、候補、標的または両方に付着するもの)によって発生するシグナルに基づく。本方法は、標的と異なる候補の間の結合の際に生成される2つまたはそれを超える候補のシグナルを比較するステップを含むことができる。一部の場合には、候補は、同じまたは類似の足場コアを有する生化学的実体(例えば、分子)であってもよい。一部の場合には、生化学的実体は、標的生体分子を標的にする薬物候補(および/またはそれと関連した結合部分(複数可))を含むことができる。

0073

一部の実施形態では、本明細書の方法は、標的生体分子を標的にする薬物候補(および/またはそれと関連した結合部分)、例えばin vivoまたはin vitroの薬理特性に関連した候補または結合部分などをスクリーニングするために使用することができる。一部の場合には、薬物候補は、同じまたは類似の足場コアを有する分子であってもよい。薬物候補(および/またはそれと関連した結合部分)および標的生体分子に関して記載される本開示の任意の態様は、少なくとも一部の配置の任意の型の候補生化学的実体(および/または結合部分)および任意の型の標的生化学的実体に等しく適用することができる。例えば、本開示は細胞に適用することができる。さらに、参照分子に関して記載される本開示の任意の態様は、少なくとも一部の配置の任意の型の参照生化学的実体に等しく適用することができる。

0074

構造類似性は、ある程度機能的類似性につながると一般に考えられている。しかし、構造類似性だけで、特定の機能、特にin vivoの薬理特性と相関するとは限らない。したがって、構造をベースとしたデザインによって作成される薬物候補は、リード化合物を同定するために様々なin vivoまたはin vitroアッセイを使用して広くスクリーニングしなければならない。この過程冗長で、時間がかかり、高価であり、しばしば無駄であり、現代の薬物発見で主要なボトルネックの1つになっている。

0075

一態様では、本開示は、生化学的実体をスクリーニングする方法であって、(a)複数の候補生化学的実体を含むライブラリーを用意するステップであり、候補生化学的実体は、1つまたは複数の構造類似性パラメータを使用して判定するときに構造的に類似している、ステップと、(b)標的生化学的実体の第1の立体配置状態を測定し、それによってベースラインを作成するステップと、(c)候補生化学的実体の各々を標的生化学的実体と接触させるステップと、(d)標的生化学的実体の第2の立体配置状態を測定するステップと、(e)第2の立体配置状態を使用して標的生化学的実体のシグネチャーを判定するステップと、(f)シグネチャーに基づいて候補生化学的実体から1つまたは複数の生化学的実体を選択するステップとを含む方法を提供する。

0076

別の態様では、本開示は、生化学的実体をスクリーニングする方法であって、(a)複数の候補生化学的実体を含むライブラリーを用意するステップと、(b)標的生化学的実体の第1の立体配置状態を測定し、それによってベースラインを作成するステップと、(c)候補生化学的実体の各々を標的生化学的実体と接触させるステップと、(d)標的生化学的実体の第2の立体配置状態を測定するステップと、(e)第2の立体配置状態を使用して少なくとも第1および第2の候補生化学的実体のシグネチャーを判定するステップと、(f)第1の生化学的実体のシグネチャーを第2の生化学的実体のシグネチャーと比較するステップと、(g)(f)での比較に基づいて、候補生化学的実体から1つまたは複数の生化学的実体を選択するステップとを含む方法を提供する。

0077

さらなる態様では、本開示は、生化学的実体を分類する方法であって、(a)生化学的実体のライブラリーを用意するステップであり、生化学的実体の各々は異なる分子構造を含む、ステップと、(b)ライブラリー中の少なくとも1つの生化学的実体を同じ標的生化学的実体と接触させるステップと、(c)標的生化学的実体の立体配置状態を測定するステップと、(d)立体配置状態を使用してシグネチャーを判定するステップと、(e)シグネチャーを使用して構造−活性関係(SAR)カタログを作成するステップとを含む方法を提供する。

0078

一部の場合には、SARを作成するステップは、シグネチャーを結合特性、機能的特性、効能、力価、選択性またはそれらの組合せと相関させるステップを含むことができる。一部の場合には、SARを作成するステップは、シグネチャーを候補生化学的実体の1つまたは複数の構造パラメータと相関させるステップを含むことができ、前記構造パラメータは以下からなる群から選択される:分子量、化学式、全原子数、炭素原子数、水素原子数、窒素原子数、酸素原子数、硫黄原子数、log Dによって測定される極性、log
Pによって測定される極性、PSA(極性表面積)によって測定される極性、足場コア、グラフ理論で測定される化学的類似性、Tanimoto(またはJaccard)係数T、芳香族基数、複素環基数、単環基数、縮合環系数および二重結合数。

0079

本方法は、薬理特性または機能的効果に関連する生化学的実体の少なくとも1つの中の結合部分を判定するために、SARを分析するステップをさらに含むことができる。一部の場合には、接触させるステップの前に標的生化学的実体の立体配置状態を測定し、それによってベースラインを作成することができる。

0080

ライブラリーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000または1000、またはそれを超える候補生化学的実体を含むことができる。一部の例では、ライブラリーは6つまたはそれを超える候補生化学的実体を含むことができる。さらなる例では、ライブラリーは20つまたはそれを超える候補生化学的実体を含むことができる。さらに、生化学的実体のライブラリーは、薬物候補を含むことができる。

0081

候補生化学的実体は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれを超える数の構造類似性パラメータを使用して判定したときに、構造的に類似していてもよい。一部の例では、候補生化学的実体は、3つまたはそれを超える数の構造類似性パラメータを使用して判定したときに構造的に類似していてもよい。さらなる例では、候補生化学的実体は、5つまたはそれを超える数の構造類似性パラメータを使用して判定したときに構造的に類似していてもよい。構造類似性パラメータの例には、これらに限定されないが、
(i)候補生化学的実体の各々の10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300g/mol以内の分子量、
(ii)候補生化学的実体の各々の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、22%、24%、26%、28%、30%、35%、40%、45%または50%以内の分子量、
(iii)候補生化学的実体の各々の原子数が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900または1000個以内の化学式、
(iv)候補生化学的実体の各々の間の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900または1000未満の全原子数の差、
(v)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20未満の炭素原子数の差、
(vi)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20未満の水素原子数の差、
(vii)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20未満の窒素原子数の差、
(viii)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20未満の酸素原子数の差、
(ix)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20未満の硫黄原子数の差、
(x)候補生化学的実体の各々の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、22%、24%、26%、28%、30%、35%、40%、45%または50%以内のlog Dで測定される極性、
(xi)候補生化学的実体の各々の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、22%、24%、26%、28%、30%、35%、40%、45%または50%以内のlog P(分配係数)で測定される極性、
(xii)候補生化学的実体の各々の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、22%、24%、26%、28%、30%、35%、40%、45%または50%以内のPSA(極性表面積)で測定される極性、
(xiii)同一の足場コア、
(xiv)グラフ理論で測定される化学的類似性、
(xv)0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98または0.99を超えるTanimoto(またはJaccard)係数T、
(xvi)1、2、3、4、5、6、7、8、9または10未満の芳香族基数の差、
(xvii)1、2、3、4、5、6、7、8、9または10未満の複素環基数の差、
(xviii)1、2、3、4、5、6、7、8、9または10未満の単環基数の差、
(xix)1、2、3、4、5、6、7、8、9または10未満の縮合環系数の差、
および(xx)1、2、3、4、5、6、7、8、9または10未満の二重結合数の差
が含まれる。

0082

一部の場合には、標的生化学的実体は、天然変性タンパク質(intrinsically disordered protein)であってもよい。例えば、天然変性タンパク質は、アルファシヌクレインであってもよい。一部の場合には、標的生化学的実体は、薬物標的であってもよい。一部の場合には、標的生化学的実体は、公知の立体配置モジュレーターを有さないこともある。

0083

一部の場合には、標的生化学的実体を薬剤とインキュベートした後に第1の立体配置状態を測定することができる。例えば、薬剤は、ライブラリーからの候補生化学的実体であってもよい。

0084

一部の場合には、立体配置状態(複数可)は、内部全反射(TIR)を使用して測定することができる。一部の場合には、立体配置状態(複数可)は、第2高調波発生(SHG)を使用して測定することができる。

0085

一部の場合には、シグネチャーを判定するステップは、標的生化学的実体の立体配置状態の動態学的(リアルタイム)変化を測定するステップを含むことができる。他の場合には、シグネチャーを判定するステップは、標的生化学的実体の立体配置状態のエンドポイント変化を測定するステップを含むことができる。さらに他の場合には、シグネチャーを判定するステップは、シグネチャーのシグナル強度を測定するステップを含むことができる。さらなる場合には、シグネチャーの判定は、ベースラインを使用することができる。さらに、シグネチャーは、標的生化学的実体の立体配置状態の変化を示すことができる。

0086

一部の場合には、候補生化学的実体は、コンピュータ実行可能プログラムを使用して、1つまたは複数の構造類似性パラメータに基づいて分析することができる。他の場合には、シグネチャーは、コンピュータ実行可能プログラムを使用して分析することができる。

0087

候補生化学的実体の各々は、標的生化学的実体の立体配置状態において異なる変化を生成することができる。さらに、候補生化学的実体の各々は異なるシグネチャーを発生することができる。

0088

一部の場合には、標的生化学的実体の立体配置状態の変化を、公知の立体配置モジュレーターによって生成される立体配置状態の変化とさらに比較することができる。一部の場合には、公知の立体配置モジュレーターは、公知の薬物であってもよい。一部の場合には、生化学的実体は、公知の立体配置モジュレーターによって誘導される立体配置状態の変化に最も類似している立体配置状態の変化に基づいて選択することができる。さらに、公知の立体配置モジュレーターによって生成される立体配置状態の変化は、薬理特性または機能的効果に相関する可能性がある。

0089

一部の場合には、生化学的実体の1つもしくは複数のシグネチャーまたはSARカタログは、公知の薬理特性または公知の機能的効果と相関することができる。1つまたは複数の生化学的実体は、公知の薬理特性または公知の機能的効果とのシグネチャーまたはSARカタログの相関に基づいてさらに選択することができる。

0090

一部の場合には、候補生化学的実体の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90または100個は、類似の薬理特性または機能的効果を有する。他の場合には、候補生化学的実体の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90または100個は、類似の薬理特性または機能的効果を有さない。

0091

本開示で提供される方法は、シグネチャーパラメータを測定するステップをさらに含むことができる。シグネチャーパラメータの例には、これらに限定されないが、
i)ベースラインと比較したシグネチャーの大きさの変化、
ii)ベースラインと比較したシグネチャーの方向の変化、および
iii)候補生化学的実体の接触の際のシグネチャーの単位時間あたりのシグナルの速度の変化
が含まれる。

0092

一部の場合には、1、2、3またはそれを超える数のシグネチャー類似性パラメータを使用して判定したときに、第1の候補生化学的実体によって発生されるシグネチャーおよび第2の候補生化学的実体によって発生されるシグネチャーは類似してもよい。シグネチャー類似性パラメータの例には、これらに限定されないが、
i)第1の候補生化学的実体と接触する際のベースラインと比較したシグネチャーの大きさの変化は、第2の候補生化学的実体と接触する際のベースラインと比較したシグネチャーの大きさの変化の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、22%、24%、26%、28%、30%、35%、40%、45%または50%以内であること、
ii)第1の候補生化学的実体と接触する際のベースラインと比較したシグネチャーの方向の変化は、第2の候補生化学的実体と接触する際のベースラインと比較したシグネチャーの方向の変化と同じであること、および
iii)第1の候補生化学的実体と接触する際のシグネチャーの単位時間あたりのシグナルの速度の変化は、第2の候補生化学的実体と接触する際のシグネチャーの単位時間あたりのシグナルの速度の変化の1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、22%、24%、26%、28%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、100%(1倍)、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%または200%(2倍)以内であること
が含まれる。

0093

下の例で詳述されるように、本発明は、候補によって発生されるSHGシグナル(またはSFGシグナル、DFGシグナル)をそのin vivoまたはin vitroの薬理特性、特にそのin vivo特性と相関させる方法を提供する。したがって、本発明は、1つまたは複数の所望のin vivoもしくはin vitroの薬理特性を有する薬物候補について効率的にスクリーニングする方法を提供し、あらゆる候補についての高価なin vivoまたはin vitroアッセイを不必要にする。
I.標的分子を標的にする薬物候補をスクリーニングする方法

0094

本明細書において、標的生体分子を標的にする薬物候補をスクリーニングする方法が提供される。本方法は、任意の薬物候補、例えば標的生体分子中の結合部位を標的にする同じまたは類似の足場コアを有する薬物候補などをスクリーニングするのに有益である。
A.同じまたは類似の足場を有する薬物候補

0095

小分子薬物との関連で、「足場」は、1つまたは複数の追加の化学部分を共有結合させる、改変するまたは削除して、共通の構造要素を有する複数の分子を形成することができる小さい標的結合分子を指す場合がある。例示的な部分には、ハロゲン原子ヒドロキシル基メチル基ニトロ基カルボキシル基または任意の他の型の分子群が含まれる。足場の特徴には、例えば、足場の上の1つまたは複数の置換基標的分子結合部位中の結合ポケットに位置するように標的分子結合部位に結合すること;コンビナトリアルライブラリーを容易に構築できるように、特に合成反応によって化学改変することができる化学的に扱いやすい構造を有すること;追加の望ましい特徴、例えば、リガンドが細胞および/または特異的器官活発輸送されることを可能にする、または追加の分析のためにリガンドがクロマトグラフィーカラムに付着されることを可能にすることを達成するために、足場またはライブラリーメンバーを改変してリガンドを形成することができるように、タンパク質結合部位への足場の結合に干渉しない部分を付着させることができる化学的位置を有することが含まれてもよい。したがって、分子足場は、in vivoまたはin vitroの薬理特性(例えば、結合親和性および/または特異性)を向上させる改変より前の小さな同定された標的結合分子であってもよい。

0096

小分子薬物との関連で、「足場コア」は、様々な置換基を付着させることができる分子足場のコア構造を指す場合がある。したがって、特定の化学クラスのいくつかの足場分子について、足場コアは全ての足場分子に共通である。多くの場合には、足場コアは、1つまたは複数の環構造からなるまたはそれを含むことができる。足場群は、足場コアを共有し、したがって全て1つの足場分子の誘導体とみなすことができる化合物のセットを指す。

0097

生物学的製剤との関連で、「足場」は、生物学的薬物が別の分子(例えば、タンパク質、DNA、RNA、金属、ペプチド、多糖)と相互作用することを可能にするアミノ酸残基またはヌクレオチドのセット(例えば、最小限のセット)を指す場合がある。例えば、足場は、モチーフ固有の特異的幾何学形状を有するアミノ酸残基またはヌクレオチドを含むことができる。この幾何学形状は、アミノ酸残基間の距離、アミノ酸残基間の角度およびアミノ酸残基の配向包含する。

0098

生物学的製剤との関連で、「足場コア」は、全ての足場分子に共通するコンセンサスアミノ酸残基またはヌクレオチドのセットを指す場合がある。突然変異などの置換、欠失、挿入が足場コアに加えられてもよい。したがって、特定の生物学的製剤クラスのいくつかの足場分子について、足場コアは全ての足場分子に共通である。足場群は、足場コアを共有し、したがって全て1つの足場分子の誘導体とみなすことができる生物学的製剤のセットを指す。足場群の中の生物学的製剤分子は、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%またはそれを超える配列相同性を共有することができる。

0099

足場または足場コアは、標的生体分子中の結合部位を標的にすることができる。結合部位は、活性結合部位またはアロステリック結合部位であってもよい。一般的に言うと、結合部位は、リガンドが結合することができる(共有結合または非共有結合で)標的分子のエリアである。結合部位は特定の形状を組み入れ、1つまたは複数の結合ポケットを含有することができる。特定の形状は、標的生体分子のクラス内で、例えば分子ファミリー内でしばしば保存される。クラス内の結合部位は、保存された構造、例えば部分、結合ポケットの存在および/または結合部位もしくは結合部位の一部分での静電荷を含有することができ、その全ては結合部位の形状に影響することができる。結合ポケットは、結合部位中の特定の容積を指す。結合ポケットは、標的分子の原子に少なくとも部分的に囲まれている、結合部位中の特定の空間である。したがって、結合ポケットは、結合部位中の特定の形状、窪みまたは空洞である。結合ポケットは、別の分子の非共有結合で重要である特定の化学基または構造、例えば、分子間のイオン水素結合ファンデルワールスまたは疎水性の相互作用に寄与する基を含有することができる。

0100

本明細書で提供される方法は、小分子および生物学的製剤(例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、抗体)を含む任意の薬物候補をスクリーニングするために使用することができる。例えば、本方法は、アルファシヌクレインを標的にする小分子または抗体薬物のスクリーニングのために有益である。一部の方法では、リード化合物またはリード生物学的製剤が同定される。リード化合物またはリード生物学的製剤に基づいて、一連の候補化合物または生物学的製剤を設計および選択することができる。例えば、候補化合物または生物学的製剤を作成するために、コンピュータモデリング方法を使用することができる。

0101

一部の場合には、候補化合物または生物学的製剤は、コンピュータによって作成された標的生体分子の結合ポケットにドッキングすることができる。一部のコンピュータモデリング方法では、標的生体分子の公知のリード化合物または生物学的製剤の実験的に判定された性質、例えば、標的生体分子−アゴニストまたは標的生体分子−アンタゴニスト共結晶結晶構造に候補を重ね合わせることができる。候補および標的生体分子(またはそのセグメント)の構造適合度、および相互作用のエネルギーを予測するために、分子最適化技術を使用することができる。構造適合度は、結合ポケットの環境内で候補小分子がどれくらい空間を物理的に占めることができるかを決定する。この目的のために様々な方法で標的生体分子(および候補)の表面輪郭を構築することができる。例えば、表面を構築するために原子のファンデルワールス半径が使用される。相互作用のエネルギーは、非経験的方法(密度関数理論方法など)によって、または実験的方法分子力学方法など)によって計算することができる。相互作用のエネルギーは、上記の方法の混成によって計算することもできる。分子最適化技術は分子屈曲性も可能にし、それは結合長結合角度および結合ねじれの変化を可能にすることを示す。

0102

標的生体分子(または標的生体分子の適当な一部)の構造情報は、X線結晶学によって直接的に、相同性モデリングによって間接的に、またはその組合せによって得ることができる。相同性モデリングは、標的生体分子の一部だけの構造を得るために実施してもよい。これは、鋳型として公知の構造の1つの類似部分を使用して一般的に達成される。この目的のために様々な方法およびソフトウェアを使用することができる。例えば、SWISS−MODEL:自動化されたタンパク質相同性モデリングサーバー(Schwede,
T.、Kopp, J.、Guex, N.、Peitsch, M.、Nucleic AcidsResearch(2003年)31巻(13号):3381〜3385頁)に記載される方法およびソフトウェアを使用することができる。米国特許第7,384,773号およびその中の参考文献によって教示されるソフトウェアおよび方法をモデリングのために使用することもできる。

0103

機械読取り可能データを処理するために、いくつかのプログラムを使用することができる。例えば、コンピュータプログラムDOCKおよびその変形が広く使用されている(Lorber, D.およびShoichet, B.、Protein Science、7巻:938〜950頁、1998年)。他の例示的なプログラムには、Autodock(Scripps Research Institute、La Jolla、Calif.)、QUANTA(Molecular Simulations、San Diego、Calif.)、Insight(Molecular Simulations、San Diego、Calif.)、SYBYL(TRIPOS,Inc.、St.Louis、Mo.)およびLEAPFROG(TRIPOS,Inc.、St.Louis、Mo.)が含まれる。

0104

「ライブラリー」は、本開示の方法で使用する一群の生化学的実体(例えば候補生化学的実体)を指す場合がある。例えば、生化学的実体のライブラリーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000または10000、またはそれを超える数の生化学的実体を含むことができる。

0105

生化学的実体は、構造的に類似していてもよい。これらに限定されないが、分子量;化学式;全原子数;特定の原子(例えば炭素水素窒素酸素および/もしくは硫黄)の数;極性;足場コア;グラフ理論で測定される化学的安定性;Tanimoto(もしくはJaccard)係数T;芳香族基、複素環基、単環基および/もしくは縮合環系の数;または二重結合数を含む1つまたは複数の構造類似性パラメータに基づいて、2つまたはそれを超える生化学的実体を構造的に類似していると判定することができる。例えば、2つまたはそれを超える生化学的実体の分子量が互いに10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、600、700、800、900または1000g/mol以内であるならば、2つまたはそれを超える生化学的実体は構造的に類似していると判定することができる。あるいは、2つまたはそれを超える生化学的実体の分子量が互いに5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%または50%以内にあるならば、2つまたはそれを超える生化学的実体は構造的に類似していると判定することができる。一部の場合には、2つまたはそれを超える生化学的実体の各々の化学式の原子数が互いに1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30個以内にあるならば、2つまたはそれを超える生化学的実体は構造的に類似していると判定することができる。一部の場合には、2つまたはそれを超える生化学的実体の各々の間の全原子数の差が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30未満であるならば、2つまたはそれを超える生化学的実体は構造的に類似していると判定することができる。さらなる場合には、2つまたはそれを超える生化学的実体の各々の間の1つまたは複数の特定の原子(例えば、炭素、水素、窒素、酸素および/または硫黄原子)の数の差が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20未満であるならば、2つまたはそれを超える生化学的実体は構造的に類似していると判定することができる。例えば、炭素原子数の差が5未満であり、および/または酸素原子数の差が3未満であるならば、2つまたはそれを超える生化学的実体は構造的に類似していると判定することができる。一部の場合には、2つまたはそれを超える生化学的実体の極性[例えば、log D、log P(分配係数)またはPSA(極性表面積)によって測定したときに]が互いに1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、12%、14%、16%、18%、20%、25%、30%、35%、40%、45%または50%以内にあるならば、2つまたはそれを超える生化学的実体は構造的に類似していると判定することができる。一部の場合には、2つまたはそれを超える生化学的実体が同じ足場コア(上で規定される)を有するならば、2つまたはそれを超える生化学的実体は構造的に類似していると判定することができる。他の場合には、2つまたはそれを超える生化学的実体がグラフ理論で測定したときに化学的類似性を示すならば、2つまたはそれを超える生化学的実体は構造的に類似していると判定することができる。さらなる場合には、2つまたはそれを超える生化学的実体が0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.81、0.82、0.83、0.84、0.85、0.86、0.87、0.88、0.89、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98または0.99を超えるTanimoto(またはJaccard)係数Tを示すならば、2つまたはそれを超える生化学的実体は構造的に類似していると判定することができる。一部の場合には、2つまたはそれを超える生化学的実体の各々において芳香族基、複素環基、単環基および/または縮合環系の数の差が1、2、3、4、5、6、7、8、9または10未満であるならば、2つまたはそれを超える生化学的実体は構造的に類似していると判定することができる。一部の場合には、2つまたはそれを超える生化学的実体の各々において二重結合の数の差が1、2、3、4、5、6、7、8、9または10未満であるならば、2つまたはそれを超える生化学的実体は構造的に類似していると判定することができる。

0106

さらに、2つまたはそれを超える生化学的実体は、化学分析ソフトウェアによって判定することができる。化学分析ソフトウェアの例には、限定されずにSpinitex、ToxmatchおよびSimfinderが含まれる。
B.薬物候補の選択

0107

薬物候補、例えば同じまたは類似の足場コアを有する薬物候補は、開示の方法を使用してスクリーニングすることができる。これらの方法は、表面選択的技術を用いてSHG部分、SFG部分またはDFG部分(例えば、候補、標的または両方に付着するもの)によって発生されるシグナルに基づく。シグナルは、標的と候補分子の間の結合の際に生成され、検出される。

0108

驚くべきことに本発明において、同じまたは類似の足場を共有する異なる薬物候補の間の構造類似性にもかかわらず、これらの薬物候補が様々な程度の差を有するシグナルを発生することができることが発見された。一部の場合には、下の例で詳述されるように、2つの構造的に緊密に関連している候補は全く異なるシグナルを発生することができ、2つの構造的に異なる分子は非常に類似しているシグナルを生成することができる。より驚くべきことに、本発明において、検出されたシグナル差がin vivoまたはin vitroの薬理特性の差に相関することが発見された。したがって、本発明の方法は、1つまたは複数の所望のin vivoもしくはin vitroの薬理特性を有する化合物および生物学的製剤をスクリーニングするのに使用することができる。薬物候補は、本発明の様々な実施形態に従ってスクリーニングすることができる。
1.直接比較

0109

一部の例では、2つまたはそれを超える分子から発生されるシグナルは、互いと比較される。化学的ライブラリーからの薬物候補または、例えば本明細書に記載されるコンピュータモデリング方法から作成され、選択される薬物候補の間で比較することができる。薬物候補と参照分子の間で比較することもできる。参照分子は、公知の薬物、またはリード化合物、またはさもなければin vivoもしくはin vitroの薬理特性(例えば、所望の特性)に関連する分子であってもよい。参照分子および薬物候補は、標的生体分子中の結合部位を標的にする同じまたは類似の足場コアを有することができる。

0110

一部の方法では、標的生体分子は、2つまたはそれを超える候補、例えば、標的生体分子中の結合部位を標的にする同じまたは類似の足場コアを有する2つの候補と並行して接触させる。シグナルは、標的生体分子と各候補の間の結合の際に生成される。異なる候補によって生成されるシグナルを数量化し、互いと比較する。異なる候補によって生成されるシグナルの間の差が生じ得る。差は、正の差または負の差であってもよい。一部の場合には、正の差は、in vivoまたはin vitroの薬理特性の向上と相関する。一部の場合には、正の差は、in vivoまたはin vitroの薬理特性の低減と相関する。他の場合には、負の差は、in vivoまたはin vitroの薬理特性の向上と相関する。一部の他の場合には、負の差は、in vivoまたはin vitroの薬理特性の低減と相関する。

0111

差は、in vivoまたはin vitroの薬理特性の差を示すので、この差に基づいて薬物候補を選択することができる。例えば、正の差がin vivoまたはin vitroの薬理特性の向上と相関する場合は、より高いシグナルを有する候補が選択される。負の差がin vivoまたはin vitroの薬理特性の向上と相関する場合は、より低いシグナルを有する候補が選択される。

0112

同様に、薬物候補は、異なる薬物候補によって発生されるシグナルを単にランク付けすることによって選択することができる。シグナルの増加がin vivoまたはin vitroの薬理特性の向上と相関する場合は、より高いシグナルを有する候補が選択される。シグナルの減少がin vivoまたはin vitroの薬理特性の向上と相関する場合は、より低いシグナルを有する候補が選択される。

0113

異なる候補および参照分子のシグナルは、濃度で正規化することができる。一部の方法では、ノイズレベルを1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、100%、200%、300%、400%、500%またはそれを超えて上回るシグナル差は、in vivoまたはin vitroの薬理特性の差を示す。
2.候補分子とのプレインキュベーション

0114

一部の例では、薬物候補および参照分子からのシグナルは、間接的に比較される。参照分子は、公知の薬物、またはリード化合物、またはさもなければin vivoもしくはin vitroの薬理特性(例えば、所望の特性)に関連する分子であってもよい。参照分子は、候補分子と同じ結合部位を標的にすることができる。参照分子および薬物候補は、標的生体分子中の結合部位を標的にする同じまたは類似の足場コアを有することができる。

0115

具体的には、標的生体分子は、薬物候補と最初に接触させて、標的生体分子と候補分子との結合複合体を形成する。次に、結合複合体を参照分子と接触させる。下の例で詳述されるように、結合複合体を参照分子と接触させる際に生成されるシグナルは、その分子のin vivoまたはin vitroの薬理特性と相関する。参照分子と比較して候補分子が低減したin vivoまたはin vitroの薬理特性を有するならば、シグナルは結合複合体を参照分子と接触させる際に検出することができる。参照分子と比較して候補分子が増加したin vivoまたはin vitroの薬理特性を有するならば、シグナルを検出できないまたはわずかなシグナルだけを検出することができる。したがって、この相関に基づいて候補分子をスクリーニングし、選択することができ、すなわち、シグナルなしまたは小さいシグナルは、参照分子と比較して増加したまたは少なくとも同等のin vivoもしくはin vitroの薬理特性を示す。

0116

異なる候補および参照分子のシグナルは、濃度で正規化することができる。シグナルは、正のシグナルまたは負のシグナルであってもよい。一部の方法では、ノイズレベルを1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、100%または200%以下で上回るシグナルは、参照分子と比較して増加したまたは少なくとも同等のin vivoもしくはin vitroの薬理特性を示す。一部の例では、参照分子と比較して増加したまたは少なくとも同等のin vivoもしくはin vitroの薬理特性を有する候補を選択または同定するためのカットオフ値として、1%、5%または10%以下のシグナルが使用される。
3.参照分子とのプレインキュベーション

0117

一部の例では、薬物候補および参照分子からのシグナルは、間接的に比較される。参照分子は、公知の薬物、またはリード化合物、またはさもなければin vivoもしくはin vitroの薬理特性(例えば、所望の特性)に関連する分子であってもよい。参照分子は、候補分子と同じ結合部位を標的にすることができる。参照分子および薬物候補は、標的生体分子中の結合部位を標的にする同じまたは類似の足場コアを有することができる。

0118

具体的には、標的生体分子は、参照候補と最初に接触させて、標的生体分子と参照分子との結合複合体を形成する。次に、結合複合体を候補分子と接触させる。参照分子と比較して候補分子が低減したin vivoまたはin vitroの薬理特性を有するならば、シグナルを検出できないまたはわずかなシグナルだけを検出することができる。参照分子と比較して候補分子が増加したin vivoまたはin vitroの薬理特性を有するならば、シグナルは結合複合体を参照分子と接触させる際に検出することができる。したがって、この相関に基づいて候補分子をスクリーニングし、選択することができ、すなわち、シグナルは、参照分子と比較して増加したまたは少なくとも同等のin vivoもしくはin vitroの薬理特性を示す。

0119

異なる候補および参照分子のシグナルは、濃度で正規化することができる。シグナルは、正のシグナルまたは負のシグナルであってもよい。一部の方法では、ノイズレベルを1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、100%または200%を超えて上回るシグナルは、参照分子と比較して増加したまたは少なくとも同等のin vivoもしくはin vitroの薬理特性を示す。一部の例では、参照分子と比較して増加したまたは少なくとも同等のin vivoもしくはin vitroの薬理特性を有する候補を選択または同定するためのカットオフ値として、1%、5%または10%を超えるシグナルが使用される。
A.他のアッセイ

0120

本明細書に記載される方法を使用して所望の特性を有する薬物候補が同定されると、1つまたは複数のin vivoもしくはin vitroアッセイによってその特性を確認することができる。

0121

in vitroアッセイには、限定されずに、結晶学核磁気共鳴スペクトル法質量分析および細胞アッセイが含まれてもよい。細胞アッセイの一般原理は当技術分野で周知であり、薬物候補が細胞に(例えば、エレクトロポレーション受動拡散マイクロインジェクションなどによって)送達され、測定される特定の薬物候補の活性によって影響を受けることが知られている細胞表現型の変化などの活性エンドポイントが測定される方法を含む。

0122

in vivoアッセイは、動物モデル(例えば、完全な動物または動物器官)で薬物候補をスクリーニングすることを含む。したがって、特定の活性に関連する表現型の検出可能な変化を引き起こすそれらの能力について、薬物候補を細胞モデルまたは動物モデルでさらに試験することができる。細胞培養に加えて、動物モデルで疾患を処置するその能力について薬物候補を試験するために動物モデルを使用することができる。
B.in vivoまたはin vitroの薬理特性

0123

上記のように、in vivoまたはin vitroの薬理特性を判定するために、検出されたシグナルまたはシグナルの差を使用することができる。一部の場合には、薬理特性は、薬物動態特性を含むことができる。本明細書に記載される方法を使用してスクリーニングすることができる関連するin vitroの薬理特性には、限定されずに、結合親和性、結合特異性および結合力が含まれる。本明細書に記載される方法を使用してスクリーニングすることができる関連するin vivoの薬理特性には、限定されずに、治療的効能、薬物動態特性、前臨床毒性特性、臨床効能特性、臨床毒性特性および臨床安全性特性が含まれる。

0124

検出されたシグナルまたはシグナルの差は、機能的効果を判定するために使用することができる。例えば、検出されたシグナルまたはシグナルの差は、機能的表現型(例えば、in vivo)、作用機構(例えば、in vivoもしくはin vitro)またはその組合せと相関することができる。一部の例では、検出されたシグナルの差は、薬物候補によって生成されるシグナルと公知の薬物によって生成されるシグナルとの比較から生じることができ、ここで、薬物候補の機能的効果(例えば機能的表現型、作用機構)は、検出されたシグナル(例えばSHGシグネチャー、SFGシグネチャーまたはDFGシグネチャーと公知の薬物のそれとの類似性に基づいて判定することができる。一部の場合には、in vitroおよび/またはin vivoの薬理特性は機能的効果と関連または関係することができ、逆もまた同じである。例えば、治療的効能、結合親和性または任意の他のin vitroもしくはin vivoの薬理特性は、本明細書に記載される方法を使用して判定される作用機構に関連することができる。したがって、in vitroまたはin vivoの薬理特性のスクリーニングに関して記載される本開示の任意の態様は、少なくとも一部の配置でのin vitroまたはin vivoの機能的表現型および/もしくは作用機構のスクリーニングに等しく適用することができる。

0125

治療的効能は、対象(例えば、ヒト、動物)での薬物または候補薬物治療効果を指す。治療的効能は、薬物または候補薬物の、(a)疾患状態もしくは病態発症の可能性を低減するかもしくはそれらの発症を遅延させることによって疾患状態もしくは病態の発生を阻止する能力、または(b)疾患状態もしくは病態に伴う臨床症状の一部もしくは全部を低減もしくは排除する能力である。

0126

関連する薬物動態特性には、生物学的利用能(すなわち、インタクトな薬物として全身循環に到達する用量の割合)、未結合割合(すなわち、薬物が血漿または血液中で結合する程度;[未結合薬物濃度]/[全薬物濃度])、薬物代謝酵素によって代謝される薬物の割合、血漿薬物濃度時間曲線下の全面積、および単位時間あたりの薬物が除去された血液の量が含まれる。

0127

関連する前臨床毒性特性には、50%治療用量(TD50;試験動物の50%が所望の治療転帰を達成する医薬品の用量)、50%致死量(LD50;試験動物の50%が死亡する医薬品の用量)および治療指数(LD50/TD50の比;薬物固有の毒性の尺度)が含まれる。

0128

関連する臨床効能特性には、1つの所望の結果に到達するために処置する必要がある患者数および確率比(対照の間で所望の結果に到達しない確率と比較した処置症例の間で所望の結果に到達する確率)が含まれる。

0129

関連する臨床毒性特性には、1つの毒性結果を有するために処置する必要がある患者数および確率比(対照の間で薬物毒性に到達しない確率と比較した処置症例の間で薬物毒性に到達する確率)が含まれる。

0130

一部の場合には、検出されたシグナルまたはシグナル差は、in vitroだけでなくin vivoの薬理特性とも相関する。一部の場合には、検出されたシグナルまたはシグナル差はin vivoの薬理特性と相関するが、in vitroの薬理特性と相関しない。一部の場合には、検出されたシグナルまたはシグナル差はin vitroの薬理特性と相関するが、in vivoの薬理特性と相関しない。

0131

一部の場合には、検出されたシグナルまたはシグナル差は、複数のin vivoまたはin vitroの薬理特性と相関する。例えば、一部の場合には、検出されたシグナルまたはシグナル差は、結合親和性だけでなく他の特性、例えば治療的効能、薬物動態特性、前臨床毒性、臨床効能または臨床毒性とも相関する。

0132

一部の場合には、検出されたシグナルまたはシグナル差は、一部のin vivoまたはin vitroの薬理特性の差と相関するが、他のin vivoまたはin vitroの薬理特性の差と相関しない。例えば、一部の場合には、検出されたシグナルまたはシグナル差は治療的効能、薬物動態特性、前臨床毒性、臨床効能または臨床毒性と相関するが、結合親和性、結合特異性または結合力と相関しない。
II.標的生体分子のための結合部分を同定する方法

0133

本明細書において、標的生体分子のための結合部分、例えばin vivoまたはin
vitroの薬理特性と関連する結合部分を同定する方法が提供される。これらの方法は、表面選択的技術を使用してSHG活性部分、SFG活性部分またはDFG活性部分(例えば、候補または標的に付着するもの)によって発生されるシグナルに基づく。一般的に、本方法は、2つまたはそれを超える候補、例えば同じまたは類似の足場コアを有する候補などの構造を比較するステップを含む。同定は、標的および異なる候補の間の結合の際に生成および検出されるシグナルの間のシグナル差に基づく。

0134

上述のように、驚くべきことに、シグナル差がin vivoまたはin vitroの薬理特性の差と相関することが発見された。したがって、本明細書に記載される方法を使用して同定された結合部分は、単に追加の結合部分であるだけでない。むしろ、同定された結合部分は、候補の1つまたは複数の所望のin vivoもしくはin vitroの薬理特性を増強する機能的に関連する部分である。

0135

一部の場合には、同定された結合部分は、in vitroだけでなくin vivoの薬理特性とも相関する。一部の場合には、同定された結合部分はin vivoの薬理特性と相関するが、in vitroの薬理特性と相関しない。一部の場合には、同定された結合部分はin vitroの薬理特性と相関するが、in vivoの薬理特性と相関しない。

0136

一部の場合には、同定された結合部分は、複数のin vivoまたはin vitroの薬理特性と相関する。例えば、一部の場合には、同定された結合部分は、結合親和性だけでなく他の特性、例えば治療的効能、薬物動態特性、前臨床毒性、臨床効能または臨床毒性とも相関する。

0137

一部の場合には、同定された結合部分は、一部のin vivoまたはin vitroの薬理特性の差と相関するが、他のin vivoまたはin vitroの薬理特性の差と相関しない。例えば、一部の場合には、同定された結合部分は治療的効能、薬物動態特性、前臨床毒性、臨床効能または臨床毒性と相関するが、結合親和性、結合特異性または結合力と相関しない。

0138

分子間のシグナル差は、標的生体分子を標的にする薬物候補のスクリーニングのための方法と共に上記の様々な方法に従って測定することができる。例えば、分子間のシグナル差は、2つまたはそれを超える分子から発生されるシグナルを直接的に比較することによって(セクションI.B.1)、標的生体分子および候補分子の結合複合体を参照分子と接触させる際にシグナルを検出することによって(セクションI.B.2)、または標的生体分子および候補分子の結合複合体を候補分子と接触させる際にシグナルを検出することによって(セクションI.B.3)測定することができる。
III.構造−活性関係を判定する方法および/または生化学的実体を分類する方法

0139

本明細書において、構造−活性関係を判定する方法および/または候補生化学的実体もしくはその足場を分類する方法が提供される。構造−活性関係は、例えば、候補生化学的実体のシグネチャー(例えばSHG、SFG、DFG)を使用して判定することができる。一部の場合には、候補生化学的実体のシグネチャーは、別の生化学的実体の検出されたシグネチャーと比較することができる。検出されたシグネチャーの類似性は、薬学的特性または機能的効果を相関させるために使用することができる。

0140

シグネチャーは、例えば、大きさ、方向または単位時間あたりのシグナルを含むことができる。シグネチャーは、ベースラインと比較した大きさもしくは方向の変化、または動態の変化を含むこともできる。ベースラインは、候補生化学的実体を接触させる前に、および任意選択で薬剤(例えば別の候補生化学的実体)とのインキュベーションの後に測定することができる。さらに、シグネチャーは、検出されるシグナルの動態学的(リアルタイム)またはエンドポイント変化を測定することによって生じ得る。

0141

他の生化学的実体は、1つまたは複数の公知の薬理特性または機能的効果(例えば結合特性、機能的特性、効能、力価、選択性、上の任意の組合せ)を有する公知の立体配置モジュレーターであってもよい。そのような場合、候補生化学的実体が公知の立体配置モジュレーターのそれに類似のシグネチャーを生成するならば、候補生化学的実体は1つまたは複数の公知の薬理特性または機能的効果も有すると判定することができる。さらに、候補生化学的実体が公知の立体配置モジュレーターと1つまたは複数の共通の構造パラメータ[例えば、足場、足場コア、分子量、電荷、化学式、特定の原子(例えば炭素、水素、窒素、酸素、硫黄)の全数、極性(例えばlog D、log P、PSAによって測定されるもの)、グラフ理論で測定される化学的類似性、Tanimoto(またはJaccard)係数T、芳香族基数、複素環基数、単環基数、縮合環系数および二重結合数]を有するならば、1つまたは複数の構造パラメータは1つまたは複数の公知の薬理特性もしくは機能的効果に寄与すると判定することもできる。

0142

あるいは、他の生化学的実体は、別の候補生化学的実体であってもよい。候補生化学的実体が類似のシグネチャー(例えばSHGシグネチャー)を生じるならば、候補生化学的実体を共通の薬理特性または機能的効果と相関させるためにそのシグネチャーを使用することができる。これは候補生化学的実体のライブラリー全体に適用することができ、候補生化学的実体はシグネチャーに基づいて群に分けるまたは「分類する」ことができる。一部の例では、類似のシグネチャーを有する候補生化学的実体は、共通の薬理特性または機能的効果を有するとさらに判定することができる。
IV.追加の適用

0143

SHG技術は、溶液中でX線準位感受性により立体配置変化を検出するためのリアルタイム手段を提供し、したがって、標的が、それが利用できる立体配置の全集団サンプリングすることを可能にする。SHG技術は、薬物発見に大きな影響を及ぼすことができる。構造情報は薬物発見において非常に有益な情報および検証を提供し、一般的に生化学的なまたは細胞ベースのアッセイに従う。後者のアッセイはいくつかのヒットをしばしば生じるが、それらは、構造技術によるよりストリンジェントな試験の際、偽陽性であることがわかる。本当のヒット(例えば、真の陽性)を同定する(例えば、選び出す)ためにNMRまたはX線結晶学を用いることは、時間がかかり、しばしば非実用的である(KeseruGMおよびMakara GM、Drug Discovery Today11巻(15〜16号):741〜748頁、2006年)。本発明者らのアプローチは、生化学的スクリーニング、すなわち分子ベースのアッセイの特徴を、動的な構造読み出しと組み合わせる。実質的に、SHGは、生物学的機能同義である構造動態力学および立体配置変化を研究する新しい技術を提供する。この技術の最初の実証において、本発明者らはアルファシヌクレインに及ぼすスペルミンの影響をブロックすることが可能な単一のリガンドを同定し、それがスペルミン自体のように機能するようであることをNMRによって確認した。一次スクリーニングがヒットであることを示す化合物と構造技術によるそれらの以降の確認の間に大きな隔たりがしばしばあるので、これはそれ自体意外で普段と異なる結果である。さらに、公知の結合剤がほとんどなく、C末端領域には他にない標的に対して、このリガンドを同定した。

0144

SHGスクリーニングは、各種モードで使用することができる。例えば、リガンドによって誘導される公知の立体配置変化を阻害するリガンド(例えば、アンタゴニスト)、または目的の1つまたは複数の部位で立体配置変化を単独で誘導するリガンド(例えば、アゴニスト)についてスクリーニングすることができる。追求されるリガンドの型には、治療のためのリード化合物、アロステリックモジュレーターならびに化学生物学および疾患発病研究のためのツール化合物をとりわけ含めることができる。特定のアッセイが公知のツール化合物を含む場合は、その作用機構ならびにその結合親和性に関する情報を提供するために、SHGを使用することができる。ほとんどのスクリーニングライブラリーのかなりの割合は、蛍光性であって蛍光アッセイで読み出しに干渉することができる化合物を含有するが、おそらくSH活性であり、よりストリンジェントなセットの物理化学的性質であるのはごく少数しかない。

0145

溶液中で立体配置変化をリアルタイムで検出することは、X線実験で見られない新しい結合部位、例えばアロステリックなものを明らかにする可能性がある。この技術は、Rasなど現在「薬物投与できない」と考えられている標的のためのアロステリックモジュレーターを同定する手段として、大きく期待されている。この技術の構造感度により、立体配置空間での正しい方向の変化を生成する弱い結合剤でさえも速やかに同定し、最適化することができる。このように、この技術は、いかなる他の方法で同定することができない新しいクラスの薬物を同定し、正確に調整した立体配置的(したがって機能的)効果を有する薬物を開発する道筋を提供する。

0146

タンパク質の立体配置変化は、ほとんどの生物学的過程一次性の機能的事象である。その研究方法は、その本当の空間座標の変化ではなく分子の環境の変化によって引き起こされるシグナルの変化を検出することに一般に頼る。SHGは、本当の空間の構造変化に非常に、および直接的に感受性である。ここで記載されるように、タンパク質が利用できる全立体配置空間をそれがサンプリングできるように、リアルタイムおよび生理的条件下で起こるときにタンパク質の構造変化を部位特異的にスクリーニングするためにSHGを使用することができる。これらの特性は、この技術を、タンパク質の立体配置をモジュレートするリガンド、例えばアロステリック薬または内因性の生物学的モジュレーターを同定するのに理想的にする。複数のプローブ部位で立体配置変化を研究することによって、この技術は、立体配置変化の大域的精査ならびにそれらの特定の部位セットで構造変化を引き起こすリガンドを同定および分類する選択的手段を提供することができる。一部の場合には、SHGスクリーニングプラットホームはプローブの角変化度数)を数量化することもできるので、異なる部位での測定は立体配置変化の原子分解マップを造るための情報を提供することができる。すなわち、この技術は構造生物学および薬物発見の無数の分野においてかなりの影響を及ぼす。
V.シグネチャー

0147

本明細書において本方法は、生化学的実体(例えば、標的生化学的実体)の立体配置状態を測定するために、表面選択的技術、例えばSHG、SFGまたはDFGを使用することを含むことができる。一部の実施形態では、生化学的実体の立体配置状態は、ベースライン(例えば、SHGベースライン)を作成するために表面選択的技術を使用して測定することができる。生化学的実体の立体配置状態は、シグネチャー(例えばSHG、SFGまたはDFGシグネチャー)を生じるために次に表面選択的技術を使用して(例えば、標的生化学的実体を候補生化学的実体と接触させることなどの事象に続いて)再び測定することができる。シグネチャーは、生化学的実体の立体配置状態の変化を示すことができる。例えば、それを第2の生化学的実体と接触させる(例えば、結合する)とき、第1の生化学的実体の立体配置状態は変化することができる。第2の生化学的実体は、その立体配置状態の変化を経ても経なくてもよい。一部の場合には、第1と第2の生化学的実体の両方は、立体配置の変化(例えば、2つの間の結合複合体で)を経てもよい。一部の場合には、第2の生化学的実体は、第1の生化学的実体の立体配置に影響を及ぼす立体配置の変化を経ることができる。

0148

一部の実施形態では、ベースラインを測定することができない。例えば、第1の生化学的実体の第1の立体配置状態は、第1の生化学的実体を第2の生化学的実体と接触させる際に測定することができる。次に、第1の生化学的実体の第2の立体配置状態は、第1の生化学的実体(例えば、第1の生化学的実体の同じコピーまたは第1の生化学的実体の異なるコピー)を第3の生化学的実体と接触させる際に測定することができ、立体配置状態の差は、シグネチャーを引き算するかまたは比較することによって観察することができる。したがって、一部の場合には、シグネチャーはベースラインに対して規定することができる(例えば、ベースライン応答に対するSHG、SFGまたはDFG応答として)。一部の場合には、シグネチャーはベースラインに対して規定することができないか、または共通のベースラインを引き算することによって規定することができる。

0149

本開示の表面選択的技術を使用して生じるシグネチャーは、様々な時間に測定される非線形光学応答(例えば、SHG応答)を含むことができる。例えば、シグネチャーは、生化学的実体の立体配置状態の動態学的(リアルタイム)変化、生化学的実体の立体配置状態のエンドポイント変化、または生化学的実体の立体配置状態の変化を、任意の他の時間(例えば、生化学的実体を別の生化学的実体と接触させる前、その間および/もしくはその後の任意の時間)に、または複数の所定の時間(例えば、接触させる前、接触させる際、接触後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10もしくはそれを超える回数、もしくはその任意の組合せ)に測定することによって生じ得る。一部の場合には、シグネチャーは、非線形光学シグナル強度(例えば、SHG強度)を測定することによって生じ得る。

0150

本開示のシグネチャーは、生化学的実体をスクリーニング、選択および/または評価するための基礎として使用することができる。例えば、生化学的実体は、そのシグネチャー(例えば、相互作用、例えば第1の生化学的実体と第2の生化学的実体との結合などのシグネチャー)に基づいて一群の候補生化学的実体から選択することができる。一部の場合には、選択はシグネチャーを1つまたは複数の他のシグネチャー(例えば、公知の化合物の参照シグネチャー、類似の生化学的実体のシグネチャーなど)と比較することを含むことができる。一例では、公知の立体配置モジュレーターによって誘導される立体配置状態の変化に最も類似している立体配置状態の変化を有する生化学的実体が選択される。公知の立体配置モジュレーターによって生成される立体配置状態の変化は、薬理特性または機能的効果(例えば、作用機構、表現型、臨床特性、結合特性など)に相関する可能性がある。したがって、一部の場合には、類似したまたは実質的に同じ薬理特性または機能的効果を有する生化学的実体を選択するために、比較を使用することができる。別の例では、生化学的実体のシグネチャーが比較され(例えば、第1の生化学的実体のシグネチャーは第2の生化学的実体のシグネチャーと比較される)、生化学的実体(例えば、生化学的実体のセットまたはライブラリーの)は比較に基づいて選択される。別の例では、生化学的実体は、シグネチャーと公知の薬理特性または公知の機能的効果との相関に基づいて選択される。

0151

生化学的実体は、実質的に類似しているまたは異なるシグネチャーを有することができる(例えば、互いに、または参照生化学的実体に、例えば公知の立体配置モジュレーターもしくは承認薬などに)。例えば、スクリーニングアッセイで候補生化学的実体の各々を同じ標的生化学的実体と接触させる際に、候補生化学的実体の各々は異なるシグネチャーを作成することができる。

0152

一部の場合には、本明細書において、シグネチャーは公知の薬理特性または公知の機能的効果と相関していてもよい。例えば、スクリーニングアッセイでの候補生化学的実体(例えば、候補生化学的実体の少なくとも2つ)は、類似の薬理特性または機能的効果を有することができる。薬理特性または機能的効果(例えば、結合親和性、結合特異性、臨床効能、表現型の変化など)は、例えば、少なくとも約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%類似していてもよい、などである。別の例では、スクリーニングアッセイでの候補生化学的実体(例えば、候補生化学的実体の少なくとも2つ)は、類似の薬理特性または機能的効果を有さなくてもよい。薬理特性または機能的効果(例えば、結合親和性、結合特異性、臨床効能、表現型の変化など)は、例えば、多くても約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または99%類似していてもよい、などである。一部の場合には、1つまたは複数の薬理特性もしくは機能的効果での類似性は、対応するシグネチャーでの類似性と相関することができる。他の場合には、1つまたは複数の薬理特性もしくは機能的効果での類似性は、対応するシグネチャーでの類似性と相関しなくてもよい。

0153

本開示のシグネチャーを生じることは、1つまたは複数の非線形光学(例えば、SHG)パラメータを測定することを含むことができる。例えば、これらのパラメータには、非線形光学(例えば、SHG)ベースラインと比較した非線形光学(例えば、SHG)シグナルの大きさの変化、非線形光学(例えば、SHG)ベースラインと比較した非線形光学(例えば、SHG)シグナルの方向の変化、接触の際の単位時間あたりの非線形光学(例えば、SHG)シグナルの速度の変化、またはその任意の組合せを含めることができる。シグネチャーは、コンピュータ実行可能プログラムを使用して分析することができる。一部の場合には、シグネチャーは、類似性のために分析することができる。一部の場合には、類似のシグネチャーは、本開示のスクリーニング方法で生化学的実体を選択する(または選択しない)ための基礎として使用することができる。一部の場合には、類似のシグネチャーは、本開示の評価方法(例えば、生化学的実体のセットの構造−活性関係(SAR)を作成する)でSARを相関させるかまたは分析するための基礎として使用することができる。

0154

一部の場合には、類似性は、非線形光学(例えば、SHG)パラメータを使用して規定することができる。例えば、第1の生化学的実体によって生成される生じるシグネチャーおよび第2の生化学的実体によって生じるシグネチャーは、1つまたは複数の非線形光学(例えば、SHG)類似性パラメータ(例えば、下の類似性パラメータの任意の組合せ)を使用して判定したときに、類似していてもよい。一部の例では、類似性パラメータは、第1の候補生化学的実体を標的生化学的実体と接触させる際の非線形光学(例えば、SHG)ベースラインと比較した非線形光学(例えば、SHG)シグナルの大きさの変化が、第2の候補生化学的実体を標的生化学的実体と接触させる際の非線形光学(例えば、SHG)ベースラインと比較した非線形光学(例えば、SHG)シグナルの大きさの変化の約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%またはそれを超える%未満以内(例えば、約50%以内)であることであってもよい。一部の例では、類似性パラメータは、第1の候補生化学的実体を標的生化学的実体と接触させる際の非線形光学(例えば、SHG)ベースラインと比較した非線形光学(例えば、SHG)シグナルの方向の変化が、第2の候補生化学的実体を標的生化学的実体と接触させる際の非線形光学(例えば、SHG)ベースラインと比較した非線形光学(例えば、SHG)シグナルの方向の変化と同じであることであってもよい。一部の例では、類似性パラメータは、第1の候補生化学的実体を標的生化学的実体と接触させる際の単位時間あたりの非線形光学(例えば、SHG)シグナルの速度の変化が、第2の候補生化学的実体を標的生化学的実体と接触させる際の単位時間あたりの非線形光学(例えば、SHG)シグナルの速度の変化の約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20倍未満、またはそれより大きくてもよいし(例えば、約2倍)、またはその逆であってもよい。

0155

一部の実施形態では、シグネチャーは、非線形光学(例えば、SHG)シグナル応答特有の形状またはプロファイルを含むことができる。例えば、シグネチャーは所与の数の特色、例えば局所最大値局所最小値屈折点、全体的勾配勾配変化などを有することができる。一部の場合には、これらの特徴または特色は、非線形光学(例えば、SHG)ベースラインと比較して測定することができる。一部の場合には、類似性パラメータは、第1の候補生化学的実体を標的生化学的実体と接触させる際に測定された非線形光学(例えば、SHG)シグナル、および第2の候補生化学的実体を標的生化学的実体と接触させる際に測定された非線形光学(例えば、SHG)シグナルが、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50またはそれを超える数のそのような特色(例えば、局所最大値、局所最小値、屈折点、全体的勾配および/もしくは勾配変化)を共有することであってもよい。一部の場合には、類似性パラメータは、第1の候補生化学的実体を標的生化学的実体と接触させる際に測定された非線形光学(例えば、SHG)シグナルの、局所最大値、局所最小値、屈折点、全体的勾配、勾配変化および/または他のシグナル特色の数の1つまたは複数が、第2の候補生化学的実体を標的生化学的実体と接触させる際に測定された非線形光学の、局所最大値、局所最小値、屈折点、全体的勾配、勾配変化および/または他のシグナル特色の数と同じであることであってもよい。
VI.標的生体分子および参照生化学的実体

0156

本明細書に記載される方法のいずれかで使用するための標的生体分子は、任意の生体分子、例えばタンパク質、DNA、RNAまたは多糖であってもよい。標的生体分子は、ウイルス微生物(細菌、真菌類藻類および原生動物を含む)、無脊椎動物昆虫および虫を含む)、動物、脊椎動物(例えば、哺乳動物鳥類または魚類、ならびに哺乳動物の中では、例えば、ヒト、類人猿サルウシブタヤギラマヒツジラットマウスウサギモルモットネコおよびイヌ)の正常もしくは病的な細胞、または植物の正常もしくは病的な細胞を含む任意の天然供給源からの、天然に存在する物質またはそのサブユニットもしくはドメインであってもよい。あるいは、標的生体分子は、in vitroで作られた、または例えば突然変異、キメラタンパク質もしくは人工タンパク質によって改変された天然に存在しない分子であってもよい。

0157

例えば、標的タンパク質は、糖タンパク質リポタンパク質リンタンパク質または金属タンパク質であってもよい。それは、核、細胞質、膜関連の、または分泌されたタンパク質であってもよい。標的タンパク質は、単一の巨大分子である必要はない。例えば、標的タンパク質は、巨大分子のホモまたはヘテロマルチマー(例えば、限定されずに二量体三量体または四量体)であってもよい。さらに、標的タンパク質は、生理機能を発揮するために1つまたは複数のリガンド、例えば他のタンパク質、オリゴペプチドもしくはポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質または有機もしくは無機の小分子もしくはイオンを必要とする可能性がある。追加の例には、補因子リボソームポリソームおよびクロマチンが含まれる。

0158

標的タンパク質には、限定されずに、天然変性タンパク質(IDP)、例えばアルファシヌクレイン(パーキンソン病との関連が示唆されている)およびCOW(アルツハイマー病との関連が示唆されている)が含まれる。標的タンパク質のさらなる例には、限定されずに、核内受容体オーファン核内受容体、チロシンキナーゼ受容体エンドセリンエリスロポイエチン受容体FAリガンド受容体タンパク質キナーゼ(例えば、プロテインキナーゼCチロシンキナーゼセリンキナーゼトレオニンキナーゼ、ヌクレオチドキナーゼまたはポリヌクレオチドキナーゼ)、タンパク質ホスファターゼ(セリン/トレオニンホスファターゼチロシンホスファターゼ、ヌクレオチドホスファターゼ、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼまたはピロホスファターゼ)、細胞周期調節因子サイクリンcdk2、CDC2、CDC25、P53、RB)、GTPアーゼ、Rac、Rho、Rab、Ras、エンドプロテアーゼエキソプロテアーゼメタロプロテアーゼセリンプロテアーゼシステインプロテアーゼヌクレアーゼポリメラーゼ逆転写酵素インテグラーゼイオンチャネルシャペロニン(例えば、熱ショックタンパク質)、デアミナーゼ、ヌクレアーゼ(例えば、デオキシリボヌクレアーゼリボヌクレアーゼエンドヌクレアーゼエキソヌクレアーゼ)、テロメラーゼプライマーゼヘリカーゼデヒドロゲナーゼ転移酵素ペプチジルトランスフェラーゼトランスアミナーゼ糖転移酵素リボシルトランスフェラーゼアセチル転移酵素、グアニリルトランスフェラーゼまたはメチルトランスフェラーゼ)、加水分解酵素カルボキシラーゼイソメラーゼグリコシダーゼ、デアミナーゼ、リパーゼエステラーゼスルファターゼセルラーゼリアーゼレダクターゼリガーゼまたは細胞ユビキチン化経路プロセシング酵素(例えば、E1、E2もしくはE3酵素、またはデユビキチナーゼ)が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかで使用するための標的タンパク質は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、植物性タンパク質動物性タンパク質およびヒトタンパク質の間で選択される構造および非構造タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ウイルスタンパク質、例えば、限定されずに、インフルエンザウイルスA型肝炎ウイルスB型肝炎ウイルスC型肝炎ウイルスヒト免疫不全ウイルス鳥インフルエンザウイルスエボラウイルスSARSウイルスハンタウイルスまたは東部ウマ脳脊髄炎ウイルスであってもよい。

0159

標的タンパク質は、表面および細胞内受容体の両方を含む受容体であってもよい。一部の実施形態では、標的タンパク質は、核内受容体である。核内受容体は、リガンド活性化転写活性化因子のファミリーである。これらの受容体は、リガンド結合、二量体化トランス活性化およびDNA結合のために、異なるドメインに組織される。ステロイド受容体ファミリーは、糖質コルチコイド鉱質コルチコイドアンドロゲンプロゲスチンおよびエストロゲンのための受容体で構成される大きなファミリーである。受容体活性化は、リガンド結合の際に起こり、これは受容体二量体化および同時活性化タンパク質の結合を可能にする立体配置変化を誘導する。これらの補活性化因子は、次に、DNAへの受容体の結合および以降の標的遺伝子転写活性化を促進する。同時活性化タンパク質の補充に加えて、リガンドの結合は、受容体機能コリプレッサー役割をするタンパク質の結合を解くかまたは阻止する立体配置に受容体を置くと考えられてもいる。リガンドが薬理学的アゴニストである場合は、新しい立体配置は、生物学的シグナル伝達経路の他の構成要素、例えば転写因子と相互作用して標的組織生物学的応答を導き出すものである。リガンドが薬理学的アンタゴニストである場合は、新しい立体配置は、さもなければその受容体を活性化することができる1つまたは複数のアゴニストによって受容体を活性化することができないものである。NRの非網羅リストは、国際特許出願公開第2006/046134号に記載され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる(14〜15頁および図1を参照する)。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかで使用するためのNRは、エストロゲン受容体アンドロゲン受容体糖コルチコイド受容体レチノイン酸受容体アルファ(RARG)、レチノイン酸X受容体(RXR)、ペルオキシゾーム増殖因子活性化受容体(PPAR)、肝臓X受容体アルファ(LXRG)またはプロゲステロン受容体の中から選択することができる。

0160

標的タンパク質は、Gタンパク質共役受容体(7回膜貫通ドメイン受容体として公知)、すなわち、Gタンパク質と共役することによってシグナル伝達を媒介する受容体のスーパーファミリーの任意のメンバーであってもよい。GPCRは、細胞外環境に存在する分子に結合し、細胞中シグナル伝達カスケードを、および最終的に細胞応答を誘発することが可能である膜貫通受容体タンパク質(ヒトの全ゲノムの約5%を占める)の大きなファミリーを構成する。GPCRは、酵母、立襟鞭毛虫および動物を含む真核細胞だけで見出される。これらの受容体に結合して活性化する分子には、限定されずに、光電性化合物、匂い、フェロモンホルモンおよび神経伝達物質が含まれ、小分子からペプチド、さらに大きなタンパク質までサイズは異なる。サイトゾルカルシウムベルに影響するGPCRのクラスの1つの例は、ホスホリパーゼCPLC)経路を活性化し、ホスホイノシチド加水分解をもたらし、異なる第2のメッセンジャーの2つのクラス、すなわちジアシルグリセロールおよびリン酸イノシトールを生じる、Gq型のGタンパク質を通して働く。ジアシルグリセロールは、次に、ある特定のプロテインキナーゼC(PKC)を活性化し、リン酸イノシトール(例えば、限定されずにIP3)は、細胞内貯蔵部位、例えば小胞体筋小胞体筋細胞の場合)および/またはミトコンドリアからのカルシウムの可動化刺激する。これらの受容体に結合して活性化する分子には、限定されずに、光電性化合物、匂い、フェロモン、ホルモンおよび神経伝達物質が含まれ、小分子からペプチド、さらに大きなタンパク質までサイズは異なる。

0161

本明細書に開示される方法で使用するためのGPCRには、限定されずに、Gqタンパク質またはGq/11、アルファ−1アドレナリン受容体(α1−AR)、ウロテンシンUT)受容体、5−HT2および5−HT6セロトニン受容体、ヒポクレチン(オレキシン)受容体、ヒスタミンHI受容体、ブラジキニンB1およびB2受容体、ボンベシンBB2受容体、P2Yプリン受容体アセチルコリン(acetycholine)受容体(例えば、M1、M3およびM5)、mGluR5グルタミン酸受容体バソプレシンV2およびVI受容体、アンジオテンシンGTR1受容体、コレシストキニンCCKARおよびCCKBR受容体、エンドセリンENDRA受容体、グレリンGHSR1a受容体メラトニンMTNR1A受容体、ニューロテンシンNTSR1受容体、血小板活性因子PTAR受容体黄体形成ホルモン受容体(LHR)、卵胞刺激ホルモン受容体(FSHR)、性腺刺激放出ホルモン受容体(GnRHR)およびプロラクチン放出ペプチド受容体PRLHR受容体が含まれる。一部の実施形態では、GPCRはカルシウムセンサータンパク質発現する細胞で内因的に発現される。他の実施形態では、GPCRはカルシウムセンサータンパク質を発現する細胞で異種性に発現される。

0162

標的タンパク質は、キナーゼであってもよい。キナーゼは、ATPなどの高エネルギードナー分子から特異的基質までリン酸基転移する種類の酵素であり、この過程はリン酸化と呼ばれる。キナーゼの最も大きな群の1つはタンパク質キナーゼであり、それは特異的タンパク質の活性に作用して改変する。キナーゼは、シグナルを伝え、細胞中の複雑な過程を制御するために広く使用される。500個を超える異なるキナーゼが、ヒトで同定されている。それらの莫大な多様性、およびシグナル伝達におけるそれらの役割により、それらは異常なキナーゼ発現または調節を特徴とする疾患状態に特に関する研究の対象になっている。

0163

タンパク質キナーゼは、その立体配置はキナーゼ活性を調節すると考えられている、活性化ループまたはAループと呼ばれる大きな柔軟性のあるループを含有する。多くのキナーゼでは、Aループの立体配置は、この領域中の特異的残基のリン酸化によって制御される(Johnson 1996年)。活性化ループは、一般に保存されたAspPheGly配列から始まり、保存されたAlaProGlu配列で終わる。不活性キナーゼの構造では、このループは、基質またはATP結合部位をしばしばブロックする(Hubbard 1994年;Mohammadi 1996年;およびMcTigue 1999年)。チロシンキナーゼはループに1つまたは2つのチロシンを通常有し、MAPKキナーゼはTおよびYでリン酸化されるT[DE]Yモチーフを有し、ほとんどの他のキナーゼはループ中にトレオニンを有する。

0164

本発明の方法で使用するための標的タンパク質は、任意のタンパク質キナーゼに広く適用できる。これらには、タンパク質チロシンキナーゼおよびタンパク質セリンキナーゼを含めることができる。タンパクチロシンキナーゼの非限定例は、pp60c−src、p56lck、ZAPキナーゼ、血小板由来増殖因子受容体チロシンキナーゼ、Bcr−Abl、VEGF(血管内皮細胞増殖因子受容体チロシンキナーゼ、ならびに表皮増殖因子受容体チロシンキナーゼおよび表皮増殖因子受容体様チロシンキナーゼである。本発明で使用するために適用できるセリンプロテインキナーゼの非限定例には、MAP(マイトジェン活性化タンパク質)キナーゼ、プロテインキナーゼC、プロテインキナーゼA、AktおよびCDK(サイクリン依存性プロテインキナーゼ)が含まれる。哺乳動物生物学では、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)ファミリーに属するタンパク質キナーゼは、ras遺伝子の突然変異および増殖因子受容体の調節解除に関連した様々な増殖性細胞疾患(例えば、がんなど)において不適切に活性化される(Magnusonら、Seminars in Cancer Biology、5巻:247〜252頁(1994年))。MAPキナーゼは当技術分野で公知であり、そのようなキナーゼの部分的な非限定リストには、abl、オーロラ−A、オーロラ−B、オーロラ−C、ATK、bcr−abl、Blk、Brk、Btk、c−Kit、c−Met、c−Src、CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、cRaf1、CSF1R、CSK、EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4、ERK、Fak、fes、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGFR5、Fgr、FLK−4、Flt−1、Fms、Fps、Frk、Fyn、Hck、IGF−1R、INS−R、Jak、KDR、Lck、Lyn、MEK、p38、PDGFR、PIK、PKC、PYK2、Ros、Tie1、Tie2、Trk、YesおよびZap70が含まれる。本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、キナーゼはablキナーゼである。

0165

キナーゼに関して、数種類の化合物がキナーゼの機能をモジュレートすることが公知である。例えば、I型キナーゼ阻害剤は、キナーゼの活性立体配置を認識する。それらは、ATPによって通常形成される水素結合を模倣する1つから3つの水素結合を提示することによって、ATP結合部位に結合する。理論に縛られることなく、I型キナーゼ阻害剤と対照的に、II型キナーゼ阻害剤はキナーゼの不活性立体配置を認識し、ATP結合部位に直に隣接する疎水性ポケットを占めることによってATPと間接的に競合することができると考えられている。この疎水性ポケットは、活性化ループの特異なDFG外の立体配置によって作られる。これは機能のために必要でないが、一部のII型阻害剤はATP結合部位と直接的に水素結合を形成することができる(GotinkおよびVerheul、Angiogenesis、2010年、13巻(1号):1〜14頁)。他方、III型キナーゼ阻害剤は、活性化ループ以外の部位への結合によって(すなわち、キナーゼのアロステリック部位への結合によって)キナーゼ活性をモジュレートする、非ATP競合的キナーゼ阻害剤である。III型化合物がキナーゼのより保存されていない部位に結合するという事実のために、それらは非常に選択的であり、研究および薬物発見コミュニティにとって益々興味が引かれる。

0166

小さいGTPアーゼのRasファミリーは、ヌクレオチドグアノシン−5’−三リン酸GTP)によって調節される細胞内シグナル伝達分子で構成される。これらのタンパク質は、「オン」および「オフ」状態の両方を有する二元シグナル伝達スイッチとして機能する。「オフ」状態ではRasはヌクレオチドグアノシン二リン酸GDP)に結合し、「オン」状態ではRasはGTPに結合する。したがって、Rasの活性化および非活性化は、活性GTP結合型および不活性GDP結合型の間の循環によって制御される。GTP結合型立体配置では、Rasはその細胞内機能を発揮させる多数のエフェクターに高い親和性を有する。Rasによって調節されるシグナル伝達経路は、アクチン細胞骨格完全性、増殖、分化細胞接着アポトーシスおよび細胞移動と同じくらい多様な過程を制御する。一部の場合には、突然変異は構成的Ras活性化(すなわち、それがGDPに結合しているかどうかにかかわりなく、その「オフ」状態を採用することができないRasタンパク質)をもたらし、異常なシグナル伝達につながる。本明細書において、本方法は、下流Rasエフェクター分子の異常なシグナル伝達を減少させるために、Rasの行動(例えば、がん細胞中の)を特異的にモジュレートすることが可能な化合物をスクリーニングまたは同定するために使用することができる。
本明細書に開示される方法のいずれかで使用するために、任意のRasタンパク質が企図される。3つのヒトras遺伝子は、H−RAS、N−RASおよびK−RAS4AおよびK−RAS4B(2つのK−RASタンパク質は選択的スプライシングから生じる)と呼ばれる、188から189個のアミノ酸の鎖で構成される極めて相同的なタンパク質をコードする。Rasサブファミリー臨床的に最も注目すべきメンバーは、主に多くの種類のがんと結びつけられるために、H−RAS、K−RASおよび、N−RASであるが、このサブファミリーの多くの他のメンバーも同様にあり、例には、限定されないが、DIRAS1、DIRAS2、DIRAS3、ERAS、GEM、MRAS、NKIRAS1、NKIRAS2、NRAS、RALA、RALB、RAP1A、RAP1B、RAP2A、RAP2B、RAP2C、RASD1、RASD2、RASL10A、RASL10B、RASL11A、RASL11B、RASL12、REM1、REM2、RERG、RERGL、RRAD、RRASまたはRRAS2を含めることができる(その開示は参照により完全に組み込まれる、Wennerbergら、2005年、「The Ras superfamily at a glance」、J. Cell. Sci.118巻(Pt5):843〜6頁も参照)。Rasタンパク質の突然変異形も、開示の方法の範囲内での使用のために企図される。

0167

標的タンパク質には、標的タンパク質の突然変異形が含まれる。本明細書で使用される場合、「突然変異」は、標的タンパク質の一次アミノ酸配列などの規定の一次アミノ酸配列中のアミノ酸残基欠失、アミノ酸残基挿入および/または少なくとも1つのアミノ酸残基のアミノ酸残基置換を含む。アミノ酸「置換」は、規定の一次アミノ酸配列の少なくとも1つのアミノ酸構成要素が別のアミノ酸(例えば、システイン残基またはリシン残基)で置き換えられることを意味する。標的タンパク質の一次アミノ酸配列に突然変異または置換を組み入れるための方法は、標準技術により当技術分野で周知である。本明細書に記載される方法で使用するための標的タンパク質は、保存的置換を含むことができる。

0168

標的タンパク質の生物学的特性の実質的な改変は、(a)例えばシートもしくはヘリカル構造のような、置換エリアにおけるポリペプチド主鎖の構造、(b)標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または(c)側鎖のかさの維持に及ぼすそれらの作用が有意に異なる置換を選択することによって達成される。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。

0169

さらなる実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれかで使用するための突然変異標的タンパク質は、1つまたは複数の天然に存在しないまたは改変されたアミノ酸を含むことができる。非天然のアミノ酸には、限定されずに、ホモリシンホモアルギニンホモセリンアゼチジンカルボン酸、2−アミノアジピン酸、3−アミノアジピン酸、ベータアラニンアミノプロピオン酸、2−アミノ酪酸、4−アミノ酪酸、6−アミノカプロン酸、2−アミノヘプタン酸、2−アミノイソ酪酸、3−アミノイソ酪酸(isbutyric acid)、2−アミノピメリン酸、第三ブチルグリシン、2,4−ジアミノイソ酪酸デスモシン、2,2’−ジアミノピメリン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸、N−エチルグリシン、N−エチルアスパラギン、ホモプロリンヒドロキシリシンアロヒドロキシリシン、3−ヒドロキシプロリン4−ヒドロキシプロリンイソデスモシンアロイソロシン、N−メチルアラニン、N−メチルグリシン、N−メチルイソロイシン、N−メチルペンチルグリシン、N−メチルバリンナフトアラニンノルバリンノルロイシンオルニチンシトルリンペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンが含まれる。改変アミノ酸には、可逆的もしくは不可逆的に化学的にブロックされるか、または例えばNメチル化DおよびLアミノ酸、別の官能基に化学改変された側鎖官能基のように、それらのN末端アミノ基もしくはそれらの側鎖基が改変される、天然および非天然のアミノ酸が含まれる。例えば、改変アミノ酸には、メチオニンスルホキシド;メチオニンスルホンアスパラギン酸ベータメチルエステル)、アスパラギン酸の改変アミノ酸;N−エチルグリシン、グリシンの改変アミノ酸;またはアラニンカルボキサミド、アラニンの改変アミノ酸が含まれる。追加の非天然のおよび改変されたアミノ酸、ならびにそれらをタンパク質およびペプチドに組み入れる方法は、当技術分野で公知である(例えば、Sandbergら、(1998年)J. Med. Chem.41巻:2481〜91頁;XieおよびSchultz(2005年)Curr. Opin.
Chem. Biol.9巻:548〜554頁;HodgsonおよびSanderson(2004年)Chem. Soc. Rev.33巻:422〜430頁を参照)。

0170

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法で使用するための突然変異標的タンパク質は、標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームによって、細胞(がん細胞など)から単離することができる。別の実施形態では、本明細書に記載される方法で使用するための突然変異標的タンパク質は、組換えDNA技術によって生成される。組換え発現の代わりに、本明細書に記載される方法で使用するための突然変異標的タンパク質は、標準のペプチド合成技術を使用して化学的に合成することができる。

0171

さらに、候補生化学的実体のシグネチャーを薬理特性および/または機能的効果と相関させるために使用することができる参照シグネチャーを発生させるために、本出願に記載される方法に参照生化学的実体を供することができる。例えば、1つまたは複数の公知の薬理特性および/または機能的効果を有する参照生化学的実体は、候補生化学的実体のライブラリーのシグネチャーと比較することができる参照シグネチャーを有することができる。参照シグネチャーと類似のシグネチャーを有する候補生化学的実体は、1つまたは複数の公知の薬理特性および/または機能的効果と相関させることおよび/またはそれについて試験することができる。

0172

参照生化学的実体は、公知の機能および/または公知の標的を有する任意の公知の薬物であってもよい。参照生化学的実体は、例えば、抗がん薬または消炎薬であってもよい。参照生化学的実体は、限定されずにチロシンキナーゼ阻害剤およびセリン/トレオニンキナーゼ阻害剤を含む、公知のキナーゼ阻害剤であってもよい。参照生化学的実体の例には、限定されずに、Abilify、Nexium、Humira、Crestor、Advair Diskus、Enbrel、Cymbalta、Remicade、Neulasta、Copaxone、Lantus Solostar、Rituxan、Spiriva、Januvia、Atripla、Lantus、Avastin、Lyrica、OxyContin、Epogen、Celebrex、Truvada、Diovan、Gleevec、Herceptin、Lucentis、Vyvanse、Zetia、Namenda、Levemir、Symbicort、Tecfidera、AndroGel、Novolog、エノキサパリンメチルフェニデート、Suboxone、Xarelto、ProAir HFA、Humalog、Alimta、Victoza、Viagra、Seroquel XR、Synagis、Avonex、Renvela、Rebif、Cialis、Gilenya、Nasonex、Stelara、Restasis、ブデソニドアセトアミノフェンヒドロコドン、Flovent HFA、Lovaza、Prezista、Isentress、Janumet、Procrit、ドキシサイクリン、Orencia、アンフェタミン/デキストロアンフェタミン、VESIcare、Dexilant、Neupogen、リドカイン、Lunesta、フェノフィブレート、Zytiga、Reyataz、Sensipar、メトプロロール、Invega Sustenna、Synthroid、Avonex、Prevnar 13、Xolair、レボチロキシン、Benicar、Stribild、Zostavax、Pradaxa、Vytorin、Tamiflu、Xgeva、Evista、Xeloda、Aranesp、Ventolin
HFA、ジバルプロエックスナトリウム、Afinitor、Betaseron、Adderall XRおよびCompleraが含まれる。
VII.非線形活性部分

0173

一部の実施形態では、1つまたは複数の非線形活性(例えば、第2高調波活性)部分または標識は、標的生化学的実体(例えば、生体分子)、候補生化学的実体(例えば、候補分子)、参照生化学的実体(例えば、分子)またはその任意の組合せに付着させるかまたはそれに組み入れることができる。一部の実施形態、例えば構造的に類似の生化学的実体をスクリーニングするための、または構造−活性関係を生じることによって生化学的実体を評価するためのアッセイおよび方法などでは、非線形活性部分または標識は、標的生化学的実体、構造的に類似の生化学的実体のライブラリー中の1つまたは複数の候補生化学的実体、異なる分子構造を有する生化学的実体のセット中の1つまたは複数の生化学的実体、参照生化学的実体またはそれらの任意の組合せに付着させるかまたはそれに組み入れることができる。例えば、第1の生化学的実体を第2の生化学的実体と接触させる(例えば、相互作用、例えば結合事象をもたらす)任意の所与のアッセイでは、第1の生化学的実体および/または第2の生化学的実体は、本明細書に記載される表面選択的技術(例えば、SHG、SFGまたはDFG)を使用して立体配置変化を測定するのに適する標識を含むことができる。

0174

一部の場合には、標識は第2高調波活性部分または標識(別名、SHG部分またはSHG標識)であってもよい。一部の場合には、和周波数活性または差周波数活性部分または標識。一部の場合には、非線形活性部分または標識(本明細書では「部分」または「標識」とも呼ぶ)は、SHG活性、SFG活性、DFG活性またはそれらの組合せであってもよい。

0175

一部の実施形態では、標的生化学的実体(例えば、タンパク質、細胞などの生体分子)は、1つまたは複数の所定位置で標識されてもよい。標識(複数可)は、例えば、活性部位、結合部位、アロステリック結合部位、または生化学的実体(例えば、タンパク質)構造上もしくはその中の任意の他の部位(例えば、アッセイによってスクリーニングされる立体配置変化を受けることができる任意の部位、in vivoまたはin vitroの薬理特性と相関する立体配置変化を受ける任意の部位など)から所与の距離に(例えば、そこでまたはそれに隣接して)置くことができる。

0176

一部の場合には、例えば、開示のスクリーニングおよび評価アッセイを可能にするために、同じ標的生化学的実体の複数のコピーを標的生化学的実体の上またはその中の同じ位置(複数可)で標識することができる。例えば、本開示の系および方法は、非常に類似した構造を有する生化学的実体と接触させた標的生化学的実体の立体配置状態の変化の差を検出するために使用することができる。さらに、立体配置状態の変化の差は、薬理特性または機能的効果と相関することができる。したがって、同一の標識配置は、標的生化学的実体と相互作用する生化学的実体が同じ条件下で評価されること、および標的生化学的実体の立体配置状態の変化の観察される差が、異なる標識配置ではなく、構造、薬理特性、機能的効果などの少なくとも1つの差によることを確かなものにすることができる。

0177

各標識は、標的生化学的実体上の所与の位置(例えば、3D座標)を有することができる。所与の標識は、標的生化学的実体の第1のコピーの上またはその中で第1の位置(例えば、3D座標(x,y)1)、および標的生化学的実体の第2のコピーの上またはその中で第2の位置(例えば、3D座標(x,y)2)を有することができる。一部の例では、第1の位置と第2の位置の間の相対差(例えば|(x,y)1−(x,y)2|/(x,y)1または|(x,y)1−(x,y)2|/(x,y)2)は、約75%、50%、25%、10%、5%、1%未満などであってもよい。一部の例では、第1の位置と第2の位置の間の絶対差は、標的生化学的実体の直径、高さ、幅、横幅または他の特徴的寸法の約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、25%、50%または75%未満であってもよい。

0178

生じる標的生体分子を第2高調波発生に感受性にし、表面選択的技術を使用する界面での研究に適合させるために、部分(例えば、標識)を共有結合または非共有結合的に標的生体分子に結合することができる。標識標的生体分子は、第2高調波発生または和周波発生などの表面選択的技術によって次に研究することができる。外因性部分(例えば、標識)は標的生体分子に事前に付着させることができ、測定の前にいかなる未結合または未反応の標識を標識実体から分離することができる。一実施形態では、第2高調波活性部分(例えば、標識)は、in vitroで標的生体分子に付着させる。

0179

一部の場合には、少なくとも2つの識別可能な第2高調波活性部分(例えば、標識)を使用することができる。次に、発する干渉性の非線形光線の明確な方向を促進するように、付着している2つまたはそれを超える識別可能な標識の配向が選択される。2つまたはそれを超える識別可能な標識は、試料に対して1つまたは複数の偏光方向が付随する1つまたは複数の周波数の複数の基本光線が使用され、少なくとも2つの非線形光線の放射が生じるアッセイで使用することができる。一実施形態では、第2高調波活性部分(例えば、標識)は、複数の個々の第2高調波活性部分(例えば、標識)を含み、その各々は非線形感受率を有し、第2高調波活性部分(例えば、標識)の全体的非線形感受率を増加させるように、互いに対して固定され、限定された配向で結合している。

0180

一部の場合には、第2高調波活性部分(例えば、標識)は、色素である。標的生体分子は、特異的標識または非特異的標識を通して色素によって標識され得る。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

関連する公募課題一覧

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ