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課題

本発明は、オリゴヌクレオチド全身性インビボ送達のための方法を提供する。

解決手段

本発明は、生物細胞細胞質及び組織に注目の核酸配列を送達するために、オリゴヌクレオチドに連結された1又は複数のHESの存在を利用する。送達ベヒクルは細胞及び生物にとって非毒性である。送達は配列非依存性であり、そして受容体非依存的態様で膜を通過するので、送達されるオリゴヌクレオチドは、生きた細胞の細胞質及び核における相補的配列を標的とすることができる。細菌又はウイルス由来配列もまた標的化され得る。この方法は、生きた生物中の、特定の蛋白質発現をコードする遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、ディサー(Dicer)基質、miRNA、anti-miRNA、又は任意の核酸配列の送達のために使用され得る。生きた生物には、哺乳類、植物、並びに細菌、原生動物及びウイルスの如き微生物が含まれる。

概要

背景

過去数十年にわたり、療法剤としてのオリゴヌクレオチドの使用は、多くの興味焦点であった。特定の遺伝子の転写遮断及び特定のタンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列の付加の両方が、癌、感染性疾患、及び神経変性状態を含む多くの病的状態の療法として試みられてきた。更に、潜在的なオリゴヌクレオチドを基礎とする薬物及び薬物剤形の合成的、免疫的、及び生物物理的性質に取り組むために、多くの化学的アプローチが開発されてきた。しかしながら、溶液での及びエクスビボ系での幾つかの成功にも拘わらず、生物の存在する細胞膜及び細胞外マトリクスの如き生物的障壁、並びに細胞壁の如き感染性因子構造成分を通ってのオリゴヌクレオチドの送達は最適には至っていない。したがって、イン−ビボでの細胞及び組織内の分子標的への接近性が、オリゴヌクレオチド療法分野の発達を限定している。

不運にも、印象的なデータを生成するためにインフルエンザウイルスの如き感染体の遺伝子を標的とするインビトロ既知研究が続けれれている間に、インビボの結果は遅れをとった。療法の舞台(すなわち、インビボ効果)への基礎的化学発見からの過渡ギャップにおいて遭遇する主要な問題は、生物流体におけるオリゴクレヲチド組成物の貧弱な細胞内取込み、低い生物学的利用能、及び速い分解であることが広く認識されている。インビトロとインビボとの間のオリゴヌクレヲチドの有効性の前記のギャップの理由には、(1)オリゴヌクレオチドの通過に抵抗する原形質膜及び細胞外マトリクスの如き物理的障壁、(2)オリゴヌクレオチドの安定性を減少させる血漿の如き生物流体中のヌクレアーゼ、及び(3)細胞外自己凝集、細胞内エンドリソゾーム捕捉及び/又はしばしば細胞への低い特異性による、有効性のために必要な注目の細胞の細胞質に、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドが入ることができないという事実、が含まれる。

インビトロとインビボとの間のオリゴヌクレヲチドの有効性の前記のギャップの追加の理由には、許容できない毒性(しばしば、インビトロテッティングにおいて検出できない)に導く多くのオリゴヌクレオチドによる生来のインビボ免疫応答の開始及びオリゴヌクレオチドの生物利用性を低下させる血漿蛋白質とオリゴヌクレオチドとの複合体形成が含まれる。したがって、インビトロのみでのオリゴヌクレオチドの生物活性が、インビボで投与された場合の類似の、又はそれについていずれかの生物活性を誘発するか否かを合理的に予測するものではないことが広く知られている。したがって、組織への浸透を増強し、細胞標的化及び細胞に入ることを改良し、そして所望の生物標的において細胞内生利用性を増強する新規な送達系を研究するための多くの努力が行なわれてきた。

DNA及びRNA配列の送達の限界の幾つかを克服するための最近の努力において、注目のオリゴヌクレオチド配列に結合した又はそれを包埋する、脂質、糖及び蛋白質から構成される送達ベヒクル(vehicle)、例えばリポソーム、及び脂質ナノ粒子コレステロール接合体、及び抗体接合体が開発されている。しかしながら、これらの剤形の何れも、疾患治療におけるその期待される役割を達成するための、オリゴヌクレオチド療法の分野のためのオリゴヌクレオチド積荷の送達を可能にしていない。したがって、オリゴヌクレオチドに基礎を置く療法剤の改良されたイン−ビボ送達系の需要が存在する。

概要

本発明は、オリゴヌクレオチドの全身性イン−ビボ送達のための方法を提供する。本発明は、生物の細胞の細胞質及び組織に注目の核酸配列を送達するために、オリゴヌクレオチドに連結された1又は複数のHESの存在を利用する。送達ベヒクルは細胞及び生物にとって非毒性である。送達は配列非依存性であり、そして受容体非依存的態様で膜を通過するので、送達されるオリゴヌクレオチドは、生きた細胞の細胞質及び核における相補的配列を標的とすることができる。細菌又はウイルス由来配列もまた標的化され得る。この方法は、生きた生物中の、特定の蛋白質の発現をコードする遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、ディサー(Dicer)基質、miRNA、anti-miRNA、又は任意の核酸配列の送達のために使用され得る。生きた生物には、哺乳類、植物、並びに細菌、原生動物及びウイルスの如き微生物が含まれる。なし

目的

本発明は、修飾されたオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド模倣物を含めてのオリゴヌクレオチドのための改良されたイン−ビボ送達を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

対象に療法的オリゴヌクレオチド送達するための組成物において、当該組成物は、療法的オリゴヌクレオチドを含む療法的有効量のH−タイプ励起構造(H-type excitonic structure;HES)−オリゴヌクレオチドを含んで成り、当該療法的オリゴヌクレオチドは、インビボ核酸配列に特異的にハイブリダイズし、そして当該核酸によりコードされ又は制御される蛋白質のレベルを変更する、ことを特徴とする前記組成物。

請求項2

前記療法的オリゴヌクレオチドが、約8ヌクレオチド〜約750ヌクレオチドである、請求項1に記載の組成物。

請求項3

前記療法的オリゴヌクレオチドが1本鎖である、請求項1に記載の組成物。

請求項4

前記療法的オリゴヌクレオチドが2本鎖である、請求項1に記載の組成物。

請求項5

前記HES−オリゴヌクレオチドが、1又は複数のHESを形成することができる3又はそれより多くのフルオロフォアを含んで成る、請求項1に記載の組成物。

請求項6

前記療法的オリゴヌクレオチドが、siRNA、shRNA、miRNA、ダイサー(Dicer)基質アプタマー(aptamer)、デコイ(decoy)及びアンチセンスから選択されるメンバーである、請求項1に記載の組成物。

請求項7

前記療法的オリゴヌクレオチドが、RNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の組成物。

請求項8

前記療法的アンチセンスオリゴヌクレオチドが、RNAにハイブリダイズしたとき、RNAse Hのための基質である、請求項7に記載の組成物。

請求項9

前記療法的アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ギャップマー(gapmer)である、請求項8に記載の組成物。

請求項10

前記療法的アンチセンスオリゴヌクレオチドが、RNAにハイブリダイズしたとき、RNAse Hのための基質でない、請求項7に記載の組成物。

請求項11

前記療法的アンチセンスオリゴヌクレオチドが、DNA又はDNA模倣物である、請求項7に記載の組成物。

請求項12

療法的アンチセンスオリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドが、2'−位に修飾を含む修飾された糖成分、PNAモチーフ、又はモルホリノモチーフ(morpholino motif)を含んで成る、請求項10に記載の組成物。

請求項13

前記療法的アンチセンスオリゴヌクレオチドが、(a)mRNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド内にある配列;(b)miRNAのヌクレオチド1−10;(c)mRNAの5'−非翻訳領域における配列;(d)mRNAの3'−非翻訳領域における配列;(e)mRNAのイントロンエキソン連結部;(f)オリゴヌクレオチドにより結合されたとき、miRNAのプロセシング遮断するプレカーサー−miRNA(pre-miRNA)又は一次(プライマー)−miRNA(pri-miRNA)における配列;及び(g)RNAのイントロン/エキソン連結部及びイントロン/エキソン連結部の5'の1〜50ヌクレオ塩基の領域;から成る群から選択されるRNAの標的領域に特異的にハイブリダイズすることができる、請求項7に記載の組成物。

請求項14

前記療法的オリゴヌクレオチドが、RNAインターフェアレンス(RNAi)を誘導することができる、請求項1に記載の組成物。

請求項15

前記療法的オリゴヌクレオチドが、siRNA、shRNA又はダイサー(Dicer)基質である、請求項14に記載の組成物。

請求項16

前記療法的オリゴヌクレオチドがshRNAである、請求項14に記載の組成物。

請求項17

18〜35ヌクレオチド長である、請求項16に記載の療法的オリゴヌクレオチド。

請求項18

18〜35ヌクレオチドの長さを有する、請求項15に記載の療法的オリゴヌクレオチド。

請求項19

前記療法的オリゴヌクレオチドがダイサー(dicer)基質であり、そして組成物が、それぞれが18〜25ヌクレオチドの長さを有し、そして2ヌクレオチド3'オーバーハングを有する2つの相補的核酸鎖を含む、請求項15に記載の組成物。

請求項20

2'OME、ロックされた核酸(LNA)、αLNA、2'−フルオロ(2'F)、2'-O(CH2)2OCH3、2'-OCH3(2'-O-メチル)、PNA及びモルホリノから選択される1又は複数の修飾されたヌクレオシドモチーフを含む、請求項1に記載の組成物。

請求項21

修飾されたヌクレオシドモチーフが、LNA又はαLNA(ここで、メチレン(−CH2−)n基が2'酸素原子及び4'炭素原子架橋し、nは1又は2である)である、請求項20に記載の組成物。

請求項22

前記LNA又はαLNAが、5'位にメチル基を含む、請求項21に記載の組成物。

請求項23

ホスホロチオエートホスホジチオエート、ホスホラミド、3'−メチレンホスホネート、O−メチルホスホロアミジエート、PNA及びモルホリノから選択される1又は複数の修飾されたヌクレオシド間連結を含む、請求項1に記載の組成物。

請求項24

C-5プロピン及び5-メチルCから選択される1又は複数の修飾されたヌクレオ塩基を含む、請求項1に記載の組成物。

請求項25

対象における標的核酸又は蛋白質対象の調節、対象における核酸の過剰発現又は過小発現により特徴付けられる疾患又は障害治療、対象における蛋白質の過剰発現又は過小発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、対象における異常な核酸又は蛋白質の異常な発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、における請求項1〜24のいずれか1項に記載の組成物の使用。

請求項26

エクス−ビボでの、細胞中の標的核酸又は蛋白質の調節、エクス−ビボでの、核酸の過剰発現又は過小発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、エクス−ビボでの、蛋白質の過剰発現又は過小発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、エクス−ビボでの、異常な核酸又は蛋白質の異常な発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、における請求項1〜24のいずれか1項に記載の組成物の使用。

請求項27

療法的有効量の療法的オリゴヌクレオチドを含む、1又は複数のHES−オリゴヌクレオチドを含んで成る組成物において、当該療法的オリゴヌクレオチドは、イン−ビボで標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし、そして当該核酸によりコードされ又は制御される蛋白質のレベルを変更し、全身的送達の後、イン−ビボでの、細胞中の標的核酸又は蛋白質対象の調節、全身的送達の後、イン−ビボでの、対象における核酸の過剰発現又は過小発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、全身投与された場合、イン−ビボでの、対象における蛋白質の過剰発現又は過小発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、イン−ビボでの、対象における異常な核酸又は蛋白質の異常な発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療、における使用のための組成物、ここで前記HES−オリゴヌクレオチドは10分より長い持続する血漿半減期を有する。

請求項28

感染性疾患、癌、増殖性疾患又は障害、神経性疾患又は障害、及び炎症性疾患又は障害、免疫系の疾患又は障害、心臓血管系の疾患又は障害、代謝性疾患又は障害、骨格系の疾患又は障害、及び皮膚又は眼の疾患又は障害から選択される疾患又は障害、の治療のための、請求項27に記載の組成物の使用。

請求項29

感染性疾患、癌、増殖性疾患又は障害、神経性疾患又は障害、及び炎症性疾患又は障害、免疫系の疾患又は障害、心臓血管系の疾患又は障害、代謝性疾患又は障害、骨格系の疾患又は障害、及び皮膚又は眼の疾患又は障害から選択される疾患又は障害の治療のための、請求項28に記載の組成物の使用。

請求項30

白血病の治療のための、請求項28に記載の組成物の使用。

請求項31

ウイルス感染の治療のための、請求項28に記載の組成物の使用。

請求項32

転移性癌の治療のための、請求項28に記載の組成物の使用。

請求項33

寄生体感染の治療のための、請求項28に記載の組成物の使用。

技術分野

0001

本発明は、オリゴヌクレオチド療法の分野に関する。特に、本発明は、修飾されたオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド模倣物を含めてのオリゴヌクレオチドのための改良されたインビボ送達を提供する。

背景技術

0002

過去数十年にわたり、療法剤としてのオリゴヌクレオチドの使用は、多くの興味焦点であった。特定の遺伝子の転写遮断及び特定のタンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列の付加の両方が、癌、感染性疾患、及び神経変性状態を含む多くの病的状態の療法として試みられてきた。更に、潜在的なオリゴヌクレオチドを基礎とする薬物及び薬物剤形の合成的、免疫的、及び生物物理的性質に取り組むために、多くの化学的アプローチが開発されてきた。しかしながら、溶液での及びエクス−ビボ系での幾つかの成功にも拘わらず、生物の存在する細胞膜及び細胞外マトリクスの如き生物的障壁、並びに細胞壁の如き感染性因子構造成分を通ってのオリゴヌクレオチドの送達は最適には至っていない。したがって、イン−ビボでの細胞及び組織内の分子標的への接近性が、オリゴヌクレオチド療法分野の発達を限定している。

0003

不運にも、印象的なデータを生成するためにインフルエンザウイルスの如き感染体の遺伝子を標的とするインビトロ既知研究が続けれれている間に、インビボの結果は遅れをとった。療法の舞台(すなわち、インビボ効果)への基礎的化学発見からの過渡ギャップにおいて遭遇する主要な問題は、生物流体におけるオリゴクレヲチド組成物の貧弱な細胞内取込み、低い生物学的利用能、及び速い分解であることが広く認識されている。インビトロとインビボとの間のオリゴヌクレヲチドの有効性の前記のギャップの理由には、(1)オリゴヌクレオチドの通過に抵抗する原形質膜及び細胞外マトリクスの如き物理的障壁、(2)オリゴヌクレオチドの安定性を減少させる血漿の如き生物流体中のヌクレアーゼ、及び(3)細胞外自己凝集、細胞内エンドリソゾーム捕捉及び/又はしばしば細胞への低い特異性による、有効性のために必要な注目の細胞の細胞質に、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドが入ることができないという事実、が含まれる。

0004

インビトロとインビボとの間のオリゴヌクレヲチドの有効性の前記のギャップの追加の理由には、許容できない毒性(しばしば、インビトロテッティングにおいて検出できない)に導く多くのオリゴヌクレオチドによる生来のインビボ免疫応答の開始及びオリゴヌクレオチドの生物利用性を低下させる血漿蛋白質とオリゴヌクレオチドとの複合体形成が含まれる。したがって、インビトロのみでのオリゴヌクレオチドの生物活性が、インビボで投与された場合の類似の、又はそれについていずれかの生物活性を誘発するか否かを合理的に予測するものではないことが広く知られている。したがって、組織への浸透を増強し、細胞標的化及び細胞に入ることを改良し、そして所望の生物標的において細胞内生利用性を増強する新規な送達系を研究するための多くの努力が行なわれてきた。

0005

DNA及びRNA配列の送達の限界の幾つかを克服するための最近の努力において、注目のオリゴヌクレオチド配列に結合した又はそれを包埋する、脂質、糖及び蛋白質から構成される送達ベヒクル(vehicle)、例えばリポソーム、及び脂質ナノ粒子コレステロール接合体、及び抗体接合体が開発されている。しかしながら、これらの剤形の何れも、疾患治療におけるその期待される役割を達成するための、オリゴヌクレオチド療法の分野のためのオリゴヌクレオチド積荷の送達を可能にしていない。したがって、オリゴヌクレオチドに基礎を置く療法剤の改良されたイン−ビボ送達系の需要が存在する。

0006

本発明は、H−型励起構造HES)を含むオリゴヌクレオチド複合体、並びにこれらの複合体の製造及び使用の方法に関する。本発明は、1本鎖、2本鎖及び多本鎖オリゴヌクレオチド配列への1又は複数のHESの結合が、イン−ビボ系において見出されるHES−オリゴヌクレオチド配列の生理境界を通しての増加した送達をもたらすという、本発明者らの重要な発見に部分的に基づいている。

0007

遺伝子発現変更療法におけるRNAi及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、PNA(PNAs)及びPMOsの使用を制限する最も堅固な障害の一つは、真核細胞によるこれらの化合物の低い取込みであった。このことは、現在利用可能な送達方法と共に、実際の細胞に入る化合物の隔離(sequestration)及び/又は変質(degradation)により増加され;細胞に入るのは主としてエンドサイトーシスによる。当業者に直ぐに明らかなように、本発明の非−毒性HES−オリゴヌクレオチド複合体が配列非依存受動核酸を介して細胞に送達される際の驚くべき高い効率、及びこれらのオリゴヌクレオチドが細胞内リソゾームと共に同時局在化しないという本発明者らによる発見は、本発明のHES−オリゴヌクレオチド送達ベヒクルが、すべての細胞内空間/区画(compartment)に入る可能性を有することを示す。したがって、例えば、研究、診断及び療法の分野において本質的に無限定の用途が存在する。特定の態様において、本発明は、疾患、障害又は状態の治療又は予防のための、HES及び少なくとも1つの療法的オリゴヌクレオチドを含んで成るHES−オリゴヌクレオチド複合体の全身性(syst3emic)イン−ビボ送達に関する。

0008

更に、現在利用可能な送達方法をもって、外因性核酸配列に対する哺乳類細胞における生来の抗ウイルス防御誘導が、同様に、療法的オリゴヌクレオチドの開発及び使用を有意に制限している。本発明者らは、HES−オリゴヌクレオチドが低い毒性(10倍より高い濃度における決定されたオリゴヌクレオチドのイン−ビボ細胞負荷レベル)を有することを発見し、そして実際に、驚くべきことに、HES−オリゴヌクレオチドの化学的連結が、他の送達ベヒクルをもって観察されるインターフェロン応答に比べて、宿主対象(すなわち、マウス)におけるインターフェロン応答を誘導しないことを見出した。したがって、追加の態様において、本発明は、投与された外因性核酸(すなわち、オリゴヌクレオチド)に対する宿主におけるインターフェロン応答を限定する方法を包含し、この方法は、1、2、3又はそれより多くのオリゴヌクレオチドをHESに連結してHES−オリゴヌクレオチド複合体を形成し、そして当該HES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んで成る。

0009

幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体送達ベヒクルは、注目の核酸の存在をイン−ビボで同定及び/又は定量するための診断剤として使用される。他の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体送達ベヒクルは、宿主生物における感染物、例えば哺乳類組織におけるウイルス又は細菌、の存在を同定するために使用される。これらの態様において、当該複合体のHESの崩壊の際に生ずる蛍光の変化が、細胞中核酸標的配列への、当該複合体中の1又は複数のHES−オリゴヌクレオチド配列の結合についてのイン−ビボマーカーとして役立ちうる。したがって、幾つかの態様において、本発明の複合体は、診断的用途及び療法的用途の両方を有する。このアプローチはまた、宿主中の異常遺伝子のコピー数をイン−ビボで定量するために使用され得る。

0010

更なる態様において、本発明は、疾患又は障害についての核酸バイオマーカーのレベルの変化をイン−ビボで検出するための方法を提供し、当該方法は、前記核酸バイオマーカーと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチドを対象に投与し、当該対象における蛍光のレベルを決定し、そしてこの蛍光レベルを、HES−オリゴヌクレオチドが投与された対照としての対象について得られたそれとを比較することを含んで成り、ここで、対照と比べて変化した蛍光が、前記対象が核酸バイオマーカーの変化したレベルを有することを示す。このアプローチはまた、宿主由来の異常遺伝子のコピー数をイン−ビボで定量するためにも使用され得る。

0011

幾つかの態様において、疾患又は障害は、癌、線維症増殖性疾患又は障害、神経疾患又は障害、及び炎症性疾患又は障害、免疫系の疾患又は障害、心臓血管系の疾患又は障害、代謝性疾患又は障害、骨格系の疾患又は障害、或いは皮膚又は眼の疾患又は障害である。

0012

追加の態様において、本発明の方法は、異なる疾患又は障害の間を同定及び/又は区別するために使用される。本発明の方法は同様に、特に、正常な及び疾患性の(例えば癌性の)組織又は細胞の間を区別する変化した核酸(例えば、DNA及びRNA)プロファイルを決定するため、疾患性の細胞の異なるサブタイプの間(例えば、異なる癌及び特定の癌のサブタイプの間)を区別するため、異なる疾患状態を生じさせるか又は当該疾患状態と関連する変異(例えば発癌性変異)の間を区別するため、及び組織の由来(特に、転移した腫瘍)を同定するために使用され得る。

0013

本発明は、核酸、及び当該調節された核酸によりコードされる又は制御される蛋白質を調節するための組成物及び方法を提供する。特定の態様において、本発明は、mRNA、小さい非コードRNA(例えば、miRNA)、遺伝子又は蛋白質のレベル、発現プロセッシング又は機能を調節するための組成物及び方法を提供する。特定の態様において、本発明は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することにより、オリゴヌクレオチドを細胞にイン−ビボで送達する方法を提供する。特定の態様において、前記オリゴヌクレオチドは療法的オリゴヌクレオチドである。

0014

更に、幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチドにおけるオリゴヌクレオチドは、療法的オリゴヌクレオチドであり、そして当該療法的オリゴヌクレオチドが標的核酸に特異的にハイブリダイズする場合に増加した蛍光において生ずるHESの破壊又は有意な喪失が、当該療法的オリゴヌクレオチドが標的核酸に送達されそして当該標的核酸にハイブリダイズしたことを示す。したがって、幾つかの態様において、本発明は、標的核酸への療法的オリゴヌクレオチドのイン−ビボでの送達のモニタリング及び/又は定量のための方法を提供し、当該方法は、前記標的核酸に特異的にハイブリダイズする療法的オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチドを対象に投与し、そして当該対象の細胞又は組織における蛍光のレベルを決定することを含んで成り、ここで、対照細胞又は組織と比べての、前記細胞又は組織における増加した蛍光が、前記療法的オリゴヌクレオチドが前記標的核酸に送達されそして当該標的核酸とハイブリダイズしたことを示す。

0015

追加の態様において、本発明は療法的オリゴヌクレオチドを対象に送達するための組成物に向けられ、ここで、当該組成物は、療法的有効量の療法的オリゴヌクレオチドと作用可能に関連する1又は複数のH−型励起構造(HES)を含んで成り、当該療法的オリゴヌクレオチドは、核酸配列にイン−ビボで特異的にハイブリダイズし、そして当該核酸によりコードされるか又は制御される蛋白質のレベルを調節するものである。幾つかの態様において、前記療法的オリゴヌクレオチドは、約8ヌクレオチド〜約750ヌクレオチドの長さを有する。幾つかの態様において、前記療法的オリゴヌクレオチドは、約10ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドの長さを有する。

0016

幾つかの態様において、前記療法的オリゴヌクレオチドは1本鎖である。幾つかの態様において、前記療法的オリゴヌクレオチドは2本鎖である。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、1又は複数のHESを形成することができる3又はそれより多くのフルオロフォアを含んで成る。更なる態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、ダイサー(Dicer)基質アプタマー(aptamer)、デコイ(decoy)及びアンチセンスから選択されるメンバーである。更なる態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA又はDNA模倣物である。

0017

幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中の療法的オリゴヌクレオチドは、RNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。更なる態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAにハイブリダイズしたときRNAse Hの基質である。特定の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはキャップマー(gapmer)である。幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートホスホジチオエート、ホスホラミド、3'−メチレンホスホネート、O−メチルホスホロアミジエート、PNA及びモルホリノから選択される1又は複数の修飾されたヌクレオシド間連結を含む。追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、C-5プロピン及び5-メチルCから選択される1又は複数の修飾されたヌクレオ塩基を含む。

0018

幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは、2'−位に修飾を含む修飾された糖成分、PNAモチーフ、又はモルホリノモチーフ(morpholino motif)を含む。更なる態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは、2'OME、LNA、αLNA、2'−フルオロ(2'F)、2'-O(CH2)2OCH3及び2'-OCH3(2'-O-メチル)から選択される修飾されたヌクレオシドモチーフを含む。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシドモチーフは、LNA又はαLNA(ここで、メチレン(−CH2−)n基が2'酸素原子及び4'炭素原子架橋し、nは1又は2である)である。更なる態様において、LNA又はαLNAは、5'位にメチル基を含む。

0019

追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中の療法的オリゴヌクレオチドは、RNAに特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドであるが、しかしながら当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、RNAにハイブリダイズしたときRNAse Hの基質ではない。幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA又はDNA模倣物である。幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミド、3'−メチレンホスホネート、O−メチルホスホロアミジエート、PNA及びモルホリノから選択される1又は複数の修飾されたヌクレオシド間連結を含む。

0020

追加の態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、C-5プロピン及び5-メチルCから選択される1又は複数の修飾されたヌクレオ塩基を含む。幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは、2'−位に修飾を含む修飾された糖成分、PNAモチーフ、又はモルホリノモチーフ(morpholino motif)を含む。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、2'−位に修飾を含む修飾された糖成分、PNAモチーフ、又はモルホリノモチーフ(morpholino motif)を含んで成る。

0021

追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、2'OME、LNA、αLNA、2'−フルオロ(2'F)、2'-O(CH2)2OCH3及び2'-OCH3(2'-O-メチル)から選択される1又は複数の修飾されたヌクレオシドモチーフを含む。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシドモチーフは、LNA又はαLNA(ここで、メチレン(−CH2−)n基が2'酸素原子及び4'炭素原子を架橋し、nは1又は2である)である。更なる態様において、LNA又はαLNAは、5'位にメチル基を含む。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレシドは、2'OME、LNA、αLNA、2'−フルオロ(2'F)、2'-O(CH2)2OCH3及(2'OME)び2'-OCH3(2'-O-メチル)から選択される修飾されたヌクレオシドモチーフを含む。

0022

更なる態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド中の療法的オリゴヌクレオチドは、
(a)mRNAのAUG開始コドンの30ヌクレオチド内にある配列;
(b)miRNAのヌクレオチド1−10;
(c)mRNAの5'−非翻訳領域における配列;
(d)mRNAの3'−非翻訳領域における配列;
(e)mRNAのイントロンエキソン連結部;
(f)オリゴヌクレオチドにより結合されたとき、miRNAのプロセシングを遮断するプレカーサー−miRNA(pre-miRNA)又は一次(プライマリー)−miRNA(pri-miRNA)における配列;及び
(g)RNAのイントロン/エキソン連結部及びイントロン/エキソン連結部の5'の1〜50ヌクレオ塩基の領域;
に特異的にハイブリダイズする配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

0023

他の態様において、本発明は、医療的オリゴヌクレオチドを対象に送達するための組成物に向けられ、ここで当該組成物は、療法的有効量の療法的オリゴヌクレオチドと作用可能に関連する1又は複数のH−型励起構造(HES)を含んで成り、当該医療的オリゴヌクレオチドは、核酸配列とイン−ビボで特異的にハイブリダイズし、そして当該核酸によりコードされ又は制御される蛋白質のレベルを、RNAインターフェアランス(RNAi)の誘導を介して調節するものである。幾つかの態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA又はダイサー(Dicer)基質である。更なる態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、18〜35ヌクレオチドの長さを有する。

0024

幾つかの態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、ダイサー(dicer)基質であり、それぞれ18〜25ヌクレオチドの長さを有する2本の相補的核酸鎖を含み、そして2個のヌクレオチドの3'オーバーハングを有する。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、ダイサー(Dicer)酵素活性によりプロセシングされるdsRNA又はdsRNA模倣物である。追加の態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、RNAインターフェアレンスを誘導することができるRNA又はRNA模倣物である。幾つかの態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミド、3'−メチレンホスホネート、O−メチルホスホロアミジエート、PNA及びモルホリノから選択される1又は複数の修飾されたヌクレオシド間連結を含む。追加の態様において、療法的オリゴヌクレオチドは、C-5プロピン及び5-メチルCから選択される1又は複数の修飾されたヌクレオ塩基を含む。

0025

幾つかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは、2'−位に修飾を含む修飾された糖成分、PNAモチーフ、又はモルホリノモチーフ(morpholino motif)を含む。更なる態様において、療法的オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは、2'OME、LNA、αLNA、2'−フルオロ(2'F)、2'-O(CH2)2OCH3(2'-OME)及び2'-OCH3(2'-O-メチル)から選択される修飾された糖モチーフを含む。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシドモチーフは、LNA又はαLNA(ここで、メチレン(−CH2−)n基が2'酸素原子及び4'炭素原子を架橋し、nは1又は2である)である。更なる態様において、LNA又はαLNAは、5'位にメチル基を含む。

0026

本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、細胞へのオリゴヌクレオチドの高度に効果的なイン−ビボ送達を提供し、そして標的核酸及び蛋白質のレベル及び活性を調節することにおける、限定の無い適用を本質的に有する。HES−オリゴヌクレオチドは、医療用途において特に有用である。

0027

幾つかの態様において、本発明は、対象において標的核酸を調節する方法を提供し、当該方法は、当該対象にHES−オリゴヌクレオチド複合体を投与することを含んで成り、ここで当該複合体のオリゴヌクレオチドは、当該標的核酸に対して実質的に相補的な配列を含み、核酸に特異的にハイブリダイズしそして核酸のレベルを調節し、またはそのプロセシング若しくは機能を干渉する。幾つかの態様において、標的核酸はRNAであり、更なる態様において、RNAはmRNA又はmiRNAである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、対象の1又は複数の細胞又は組織において、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%又は少なくとも50%、標的RNAのレベルを低下させる。幾つかの態様において、標的核酸はDNAである。

0028

本発明はまた、核酸を調節する、及び調節された核酸によりコードされ又は制御される蛋白質を調節するための組成物及び方法を提供する。特定の態様において、本発明は、mRNA、小さい非−コードRNA(例えば、miRNA)、遺伝子及び蛋白質のレベル、発現、プロセシング又は機能を調節するための組成物及び方法を提供する。

0029

1つの態様において、対象において標的核酸の活性を阻害し、そして/又はその発現を低下させる方法を提供し、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含んで成るHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、核酸を含んで成る又はコードする核酸に標的化され、そして細胞における当該核酸のレベルを低下させ、そして/又はその機構を干渉するものである。特定の態様において、標的核酸は、小さい非−コードRNA、例えばmiRNAである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸に対して実質的に相補的な配列を含んで成る。

0030

追加の態様において、本発明は、標的RNAの発現の低下が必要な対象において標的RNAの発現を低下させる方法を提供し、当該方法は、当該対象にアンチセンスHES−オリゴヌクレオチド複合体を投与することを含んで成る。特定の態様において、当該複合体中のオリゴヌクレオチドは、当該標的mRNAに結合したとき、RNAse Hの基質である。更なる態様において、オリゴヌクレオチドはギャップマー(gapmer)である。

0031

追加の態様において、本発明は、対象における核酸の発現又は活性を増加させる方法を提供し、当該方法は、当該対象に、オリゴヌクレオチドを含んで成るHES−オリゴヌクレオチド複合体を投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、当該核酸を含んで成るか若しくはコードする又は当該核酸の内因性発現、プロセッシング又は機能を増加させ(例えば、当該核酸をコードする遺伝子中の制御配列に結合することによる)、そして細胞中での核酸のレベルを増加させ、及び/又はその機能を増加させるものである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、当該核酸を含んで成るか又はコードする核酸と実質的に同じ配列を含んで成る。

0032

本発明はまた、対象における核酸の過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害を治療する方法を含み、当該方法は、前記対象に、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を全身的に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、核酸を含んで成るか又はコードする核酸に対して標的化されており、そして前記対象において前記核酸のレベルを低下させ、そして/またはその機能に干渉するものである。

0033

更なる態様において、本発明は、対象における蛋白質の過剰発現により特徴付けられる疾患又は障害を治療する方法を含み、当該方法は、前記対象に、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、前記蛋白質をコードする核酸に対して標的化されており、又は前記対象において、前記蛋白質の内因性発現、プロセシング又は機能を低下させるものである。幾つかの態様において、前記核酸はDNA、mRNA又はmiRNAである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、siRNA、shRNA、miRNA、抗−miRNA、ダイサー(dicer)基質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはsiRNA、miRNA、リボザイム(ribozyme)及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択される。

0034

追加の態様において、本発明はまた、対象における蛋白質の異常な発現により特徴付けられる疾患又は障害を全身的に治療する(例えば、軽減する)方法を含み、当該方法は、オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体を対象に投与することを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、前記蛋白質をコードするmRNAに特異的にハイブリダイズし、そして標的RNAのスプライシングを変更する(例えば、特定のスプライス生成物生産又は過剰生産が疾患において関連する場合にエキソンスキッピングを促進する)ものである。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドは、2'−位における修飾を含む少なくとも1つの修飾された糖成分を含んで成る。特定の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、2'OME又は2’アリルである。

0035

追加の態様において、修飾されたオリゴヌクレオチドは、LNA、αLNA(例えば、5'位に立体的に嵩高な成分(例えば、メチル基)を含むLNA又はαLNA)である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、PNA又はホスホロジアミデートモルホリノ(PMO)である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド配列は、AUG開始コドンの30ヌクレオチド以内の配列、標的RNAの5'若しくは3'非翻訳領域における配列、又は標的mRNAのスプライシングを変更する配列に特異的にハイブリダイズする。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、デュセン型筋ジストロフィーDMD)における標的mRNAのスプライシングを変更する配列に特異的にハイブリダイズする。更なる態様において、変更されたスプライシングは、生ずるmRNAのエキソン51のスピキングをもたらす。

0036

他の態様において、オリゴヌクレオチドは、異常に発現されるRecQヘリカーゼファミリーメンバーにおける標的mRNAのスプライシングを変更する配列に特異的にハイブリダイズする。更なる態様において、変更されたスプライシングは、スプライス変更された標的mRNAによりコードされるヘリカーゼのヘリカーゼ活性及び/又は少なくとも部分的なDNA結合を回復させる。特定の態様において、RecQヘリカーゼファミリーメンバーは、ワーナー(Werner)蛋白質(WRN)である。他の態様において、RecQヘリカーゼファミリーメンバーは、RecQL1である。

0037

種々の態様において、本発明は、対象におけるイン−ビボで、又はエクス−ビボで、細胞中の標的核酸又は蛋白質を調節するために使用する組成物を提供する。本発明のHES−オリゴヌクレオチド組成物は、例えば、イン−ビボ又はエクス−ビボでの、対象における核酸又は蛋白質の過剰発現、過小発現及び/又は異常発現により特徴付けられる疾患又は障害の治療において用途を有する。感染性疾患、癌、増殖性疾患又は障害、神経性疾患又は障害、及び炎症性疾患または障害、免疫系の疾患又は障害、心臓血管系の疾患又は障害、代謝性疾患又は障害、骨格系の疾患又は障害、及び皮膚又は眼の疾患又は障害、から選択される例示的疾患又は障害の治療における発明の組成物の使用もまた、本発明に含まれる。

0038

追加の態様において、本発明は、細胞核再プログラミングの方法を提供する。幾つかの態様において、1又は複数のmiRNA、又は1又は複数のmiRNA模倣物及び/又は阻害剤を含むHES−オリゴヌクレオチドが細胞、例えばヒト及びマウスの体細胞にエクス−ビボで投与され、当該細胞が、誘導された多能性幹細胞(iPSC)又は胚幹ES)−様多能性細胞の1又は複数の性質を有するように再プログラミングされる。本発明の、非−毒性の高度に効果的なHES−オリゴヌクレオチド送達系は、常用のオリゴヌクレオチド送達系(例えば、米国特許公開US2010/0075421、US 2009/0246875、US 2009/0203141、及びUS 2008/0293143を参照のこと)に比べて、細胞の再プログラミングのための送達方法に非常に増加した効率を提供する。

0039

定義
本明細書において、下記の略号を使用される。
「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」なる用語は、共有結合した少なくとも2個のヌクレオチドに関する。本発明の核酸/オリゴヌクレオチドは、好ましくは、1本鎖または2本鎖であり、そして一般にホスホジエステル結合を含む。但し、下に概略記載するように、幾つかの場合には、例えば下記のものを含んで成る他の主鎖を有する核酸/オリゴヌクレオチド類似体が含まれる:

0040

ホスホラミド(phosphoramide):例えば、Beaucage et al. Tetrahedron 49(10):1925 (1993))及びその中に引用されている文献:Letsinger J. Org. Chem. 35:3800 (1970); Sprinzl et al. Eur. J. Biochem. 81 :579 (1977);Letsinger et al. Nucl. AcidsRes. 14:3587 (1986); Sawai et al. Chem. Lett. 805 (1984);Letsinger et al. J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988);及びPauwels et al. Chemica Scripta 26: 1419 (1986), Chemica Scripta 26; 1419 (1986)を参照のこと:これらの文献のそれぞれの全内容を引用により本明細書に組み入れる。
ホスホラチオエート(phosphorathioate)(Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437;及び米国特許第5,644,048号:当該文献の全内容を引用により本明細書に組み入れる。

0041

ホスホロジチオエート(phosphorodithioate):Briu et al. J. Am. Chem. Soc. 111 :2321 (1989))。
O-メチルホスホロアミジエート結合:例えば、Eckstein, Oligonucleoetides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press)を参照のこと。
ペプチド核酸主鎖及び結合:例えば、Egholm J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992);Meier et al. Chem. Int. Ed. Engl. 31 : 1008 (1992);Nielsen Nature 365:566 (1993); Carlsson et al. Nature 380:207 (1996)を参照のこと:これらの文献の全内容を引用により本明細書に組み入れる。

0042

他の類似体核酸/オリゴヌクレオチドには、陽性主鎖を有するもの(例えば、Dempcy et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:6097 (1995)を参照のこと:当該文献の全内容を引用により本明細書に組み入れる)、非−イオン性主鎖を有するもの(例えば、米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号及び第4,469,863号;Angew. Chem. Intl, Ed. English 30:423 (1991);Letsinger et al. J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988);Letsinger et al. Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994);Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook;Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994);Jeffs et al. J. Biomolecular NMR34: 17 (1994); Chaturvedi et al., Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)を参照のこと:これらの文献のそれぞれの全内容を引用により本明細書に組み入れる)、及び米国特許第5,235,033号及び第5,034,506号、及びChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookに記載されている非−リボース主鎖が含まれる。

0043

1又は複数のカルボキシル糖を含む核酸/オリゴヌクレオチドもまた、核酸/オリゴヌクレオチドの定義に含まれる(例えば、Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. pp 169-176 (1995)を参照のこと)。この文献の全内容を引用により本明細書に組み入れる。幾つかの核酸/オリゴヌクレオチド類似体が、Rawls, C & E News Jun. 2 1997 page 35に記載されており、この文献の記載の全体を引用により本明細書に組み入れる。リボース−リン酸鎖のこれらの修飾は、例えば、標識のごとき追加の成分の付加を促進するため、又は生理的環境でのそのような分子の安定性及び半減期を増加させるために行われる。

0044

本発明において使用されるオリゴヌクレオチドの核酸/オリゴヌクレオチド主鎖は、約5ヌクレオチド〜約750ヌクレオチドに亘る。本発明において使用される好ましいオリゴヌクレオチドの核酸/オリゴヌクレオチド主鎖は、約5ヌクレオチド〜約500ヌクレオチドに亘り、そして好ましくは約10ヌクレオチド〜100ヌクレオチドの長さである。本明細書で使用される場合、数に関連して使用される「約」または「およそ」なる用語は、参照される数の0.25%、0.5%、1%、5%又は10%以内の任意の数を意味する。

0045

本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の少なくとも領域に特異的にハイブダイズすることができるヌクレオシド及び/又はヌクレオチドモノマーポリマー構造を有する。上に示したように、HES−オリゴヌクレオチドは、天然対応物、及び天然の及び非天然のモノマーの組み合わせと同様に機能する、天然の塩基、糖及び糖間(主鎖)連結、非天然修飾モノマー又はその部分を含んで成る化合物(例えば、オリゴヌクレオチド類似体又は模倣物)を包含するが、それらに限定されない。本明細書で使用される場合、「修飾された」又は「修飾」なる用語は、出発の又は天然のオリゴマー化合物、例えばオリゴヌクレオチド、からの任意の置換及び/又は任意の変化を包含する。オリゴヌクレオチドへの修飾は、ヌクレオシド間連結、糖成分、又は塩基成分に対する置換又は変化、例えば本明細書に記載されているもの及び当業界で知られているものを包含する。

0046

「アンチセンス」は、本明細書で使用される場合、5'から3'の方向に記載して、標的核酸の対応する領域の逆相補体を含み、そして/又は生理的条件下で標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド配列を意味する。したがって、幾つかの態様において、用語「アンチセンス」は、小さい非コードRNA、非翻訳mRNA、及び/又はゲノムDNA配列の対応する領域に逆相補体を含んで成るオリゴヌクレオチドを意味する。特定の態様において、本発明の複合体中のアンチセンスHES−オリゴヌクレオチドは、一旦標的核酸にハイブリダイズした後、標的遺伝子の発現、標的遺伝子のレベル、又は標的核酸によりコードされる蛋白質のレベルの低下を誘導し、又は開始することができる。

0047

「相補的」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドのモノマー成分と、標的にされる核酸(例えば、DNA、mRNA、及び非−コードRNA、例えばmiRNA)中のヌクレオチドとの間の、対合(pairing)のための容量を意味する。例えば、オリゴヌクレオチドの或る位置のヌクレオチドが、DNA/RNA分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができれば、当該オリゴヌクレオチド及びDNA/RNAはその位置において相補的であると考えられる。

0048

この発明の文脈において、「ハイブリダイゼ—ション」は、オリゴヌクレオチドと相補的核酸配列との対合を意味する。このような対合は典型的には水素結合を含み、当該水素結合は、オリゴヌクレオチドの相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基(ヌクレオ塩基)と、標的核酸配列との間のWatson-Crick, Hoogsteen又は逆Hoogsteen水素結合であることができる(例えば、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の対応する領域の逆相補的ヌクレオチド配列を含む)。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは標的核酸に特異的にハイブリダイズする。用語「特異的にハイブリダイズする」及び「特異的にハイブリダイズし得る」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸(すなわち、DNA又はRNA)との間に安定な且つ特異的な結合が生ずる程度に十分な相補性を示すために、交換可能に使用される。特異的にハイブリダイズし得るためには、オリゴヌクレオチドは、その標的核酸配列に対して100%相補的である必要はないと理解される。

0049

特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列への当該オリゴヌクレオチドの結合が、当該標的核酸の正常な機能を妨害し、そしてそれからの発現の喪失又は変更された有用性をもたらす場合に、特異的にハイブリダイズし得ると考えられる。好ましい態様において、特異的結合が望まれる条件下(例えば、イン−ビボ測定又は治療の場合の生理的条件下、及びイン−ビトロ測定の場合の測定が行われる条件下)で、不所望の非−標的配列へのオリゴヌクレオチドの非−特異的結合を回避又は最小にするのに十分な程度の相補性が存在する。最小の非−特異的ハイブリダイゼ—ション事象を伴って標的核酸への特異的ハイブリダイゼ—ションのために条件が最適である時を日常的に決定することは、十分に当業者のレベルの範囲内にある。

0050

したがって、幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、それが特異的にハイブリダイズする標的DNA又はRNA配列の領域の対応する相補性配列に比べて、1、2又は3つの塩基置換を含む。幾つかの態様において、非−相補的ヌクレオ塩基の位置は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの5'又は3'末端である。追加の態様において、非−相補的ヌクレオ塩基は、オリゴヌクレオチド中の内部位置に存在する。オリゴヌクレオチド中に2個又はそれより多くの非−相補的ヌクレオ塩基が存在する場合、それらは連続的(すなわち連結されている)、非−連続的、又は両方である。幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸内の標的領域に対して、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の配列同一性を有する。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸内のポリヌクレオチド配列に対して100%の配列同一性を有する。

0051

パーセント同一性は、それに対してオリゴヌクレオチドは比較される対応する核酸配列に対して同一である塩基の数にしたがって計算される。この同一性は、オリゴマー化合物(すなわち、オリゴヌクレオチド)の全長にわたるか、又はオリゴヌクレオチドの部分内であろう(例えば、オリゴヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチドのパーセント同一性を決定するために、27−マーのヌクレオ塩基1−20が20−マーと比較されるであろう)。オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のパーセント同一性は、当業界で知られているアラインメントプログラム及びBLASTプログラム(基本的地域的アラインメント検索ツール)を用いて決定され得る(例えば、Altschul et al, J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990); Zhang and Madden, Genome Res., 7, 649-656 (1997)を参照のこと)。

0052

本明細書で使用される場合、用語「標的核酸」及び「標的をコードする核酸」は、標的化され得る任意の核酸を包含するように使用され、限定的ではなく、所与の分子標的(すなわち、蛋白質又はポリペプチド)をコードするDNA、このようなDNAから転写されるRNA(miRNA、pre-mRNA及びmRNAを含む)、及び更にこのようなRNAに由来するcDNAが含まれる。妨害されるべき例示的なDNAの機能には、複製、転写及び翻訳が含まれる。標的核酸の機能に対するこのような妨害の全体的効果は、標的分子の発現の調節である。本発明の文脈において、「調節」は、例えば遺伝子の発現における、量的変化、増加(刺激)又は減少(阻害)の何れか、を意味する。RNAレベルの低下を介しての遺伝子発現の阻害が、本発明に従う調節の好ましい形態である。

0053

クロモフォア」は、光りの吸収を担当する基、構造、又は分枝である。典型的なクロモフォアは、それぞれ特徴的な吸収スペクトルを有する。
「フルオロフォア」は、特徴的な波長において光を吸収し、そして次に、最も典型的には特徴的に異なる波長において光を再放出するクロモフォアである。フルオロフォアは当業界においてよく知られており、そしてキサンテン(xanthene)、キサンテン誘導体ロダミン(rhodamine)及びロダミン誘導体シアニン(cyanine)及びシアニン誘導体クマリン(coumarin)及びクマリン誘導体、並びにランタニドイオン系列キレーターを含むが、これ等に限定されない。フルオロフォアは、光りを吸収するが特徴的に再放出しないクロモフォアから区別される。

0054

「H−型励起構造」(HES)は、2又はそれ以上のフルオロフォアであって、それらの遷移双極子が平行配置で配置されており、励起された一重項状態分裂をもたらすものを意味し、基底状態と高い励起状態との間の遷移が認められると考えられ、そして基底状態と低い励起状態との間の遷移は禁じられると考えられる。或る種のフルオロフォアに関連するHESの形成は当業界で知られており、そして本発明は、オリゴヌクレオチド(例えば、診断的及び治療的オリゴヌクレオチド)へのこれ等のフルオロフォアの取付け、及び得られるHES−オリゴヌクレオチドの、本明細書に記載の方法に従っての使用を含む。本発明の方法に従って使用され得るHES形成フルオロフォアの例は、本明細書に開示され、又は当業界で知られており、そしてキサンテン(xanthene)、キサンテン誘導体、シアニン(cyanine)及びシアニン誘導体、クマリン(coumarin)及びランタニドイオン系列のキレーターを含むが、これ等に限定されない。

0055

用語「HES−オリゴヌクレオチド」は、HESを形成する2又はそれより多くのフルオロフォアを含む1又は複数のオリゴヌクレオチド鎖(例えば、同じ、相補的又は異なるオリゴヌクレオチド配列を含む、線状又は環状のオリゴヌクレオチドの1本鎖、2本鎖、3本鎖又はそれより多くの鎖)の複合体を意味する。HES−オリゴヌクレオチドのフルオロフォアは、集合HES−オリゴヌクレオチドが1又は複数のHESを含む限り、1つのオリゴヌクレオチド又は異なる複数のオリゴヌクレオチド内で、5'及び/又は3'主鎖ホスフェート及び/又は他の塩基に取付けることができる。フルオロフォアは、任意には、リンカー、例えば柔軟性脂肪族鎖を介してオリゴヌクレオチドに取付けられる。

0056

HES-オリゴヌクレオチドは、1、2、3、4、又はそれより多くのHESを含むことができる。更に、HES−オリゴヌクレオチド中のHESは、2、3、4又はそれより多くの同じ又は異なるフルオロフォアを含むことができる。例えば、Toptygin et al, Chem. Phys. Lett 277:430-435 (1997)を参照のこと。幾つかの態様において、HESは、本発明のHES−オリゴヌクレオチド間のフルオロフォア凝集の結果として形成される。幾つかの態様において、HESは、HESを形成することができるフルオロフォアにより単一標識された本発明のオリゴヌクレオチド間のフルオロフォア凝集の結果として形成される。

0057

本明細書において使用する場合、用語「医薬として許容される」又は「生理的に許容できる」及びこれ等の文法的変形は、それらが組成物、キャリアー希釈剤及び試薬に関する場合、交換可能に使用され、そして療法的に禁止される不所望の生理的効果、例えば吐気めまい急性蠕動などを伴わないで、対象(例えば、哺乳類、例えばマウス、ラットウサギ、又は霊長類、例えばヒト)に又は対象上に投与することができることを示す。

0058

本明細書において使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチドを含んで成る医薬組成物」は、HES−オリゴヌクレオチド複合体及び医薬として許容される希釈剤を含んで成る組成物を意味する。例えば、適当な医薬として許容される希釈剤はリン酸緩衝塩溶液である。

0059

「修飾の安定化」又は「モチーフの安定化」とは、ヌクレアーゼの存在下で、ホスホジエステルヌクレオシド間連結により連結された2'−デオキシヌクレオシドにより提供される安定化に較べて増強された安定性を提供することを意味する。したがって、このような修飾は、オリゴヌクレオチドに、「増強されたヌクレアーゼ安定性」を提供する。修飾の安定化は、少なくともヌクレオシドの安定化及びヌクレオシド間連結基の安定化を含む。

0060

用語「イン−ビボ生物」は、再生成長及び発達のごとき刺激並びに安定な全体としての恒常性の維持が可能な連続生物系を意味する。例には哺乳類、植物、及び微生物、例えば細菌、原生動物及びウイルスが含まれる。
用語「対象」は、任意の動物(例えば、哺乳類)を意味し、特定の処理の受容者であるヒト、非−ヒト霊長類齧歯類などを含むがこれらに限定されない。典型的には、用語「対象」及び「患者」は、ヒト対象に関しては交換可能に使用される。

0061

用語「投与する」及び「投与」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドのごとき化学物質を、イン−ビボ又はエクス−ビボで対象に加えることを意味する。したがって、「投与する」は、対象へのHES−オリゴヌクレオチドの直接的付加、並びに細胞とHES−オリゴヌクレオチド複合体の接触及びこれに続く当該接触された細胞の対象への導入、の両方を含む。1つの態様においては、対象から取り出された細胞がHES−オリゴヌクレオチドと接触され、そして次に当該接触された細胞が対象に再導入される。

0062

用語「接触させる」は、化学物質、例えばオリゴヌクレオチドを、イン−ビボ生物、例えば哺乳類、植物、細菌、又はウイルスに加えることを意味する。哺乳類については、接触の一般的経路は、経口(口を通して)、局所(皮膚)、経粘膜経鼻頬側下、、眼、直腸)、吸入)、経筋(筋肉)及び静脈内(静脈)を含む。細菌及びウイルスについては、接触が宿主生物の細胞又は組織内への送達であろう。

0063

「処理する」又は「処理」は、症状、併合症、又は疾患の生化学的事象、状態又は障害の開始を回避又は遅延させるため、症状を軽減するため、あるいは疾患、状態又は障害の更なる進行を阻止又は阻害するために、HES−オリゴヌクレオチドを投与することを含む。処理は、予防的(疾患の開始の回避又は遅延、或いはその臨床的又は潜在的症状の顕在化の回避)、或いは疾患、状態又は障害の顕在化後の症状の療法的抑制又は軽減であることができる。処理は、HES−オリゴヌクレオチド複合体を含む組成物のみを用いてもよく、或いは1、2、3、又はそれより多くの追加の療法剤との組合せであってもよい。

0064

用語「療法的有効量」は、所望の療法的結果を達成するため、及び/又は対象における疾患又は障害を「処理する」ために効果的なHES−オリゴヌクレオチド複合体(療法剤)又は他の薬剤の量を意味する。用語「療法的有効量」はまた、疾患の進行の遅延、生存期間延長、及び/又は疾患の1若しくは複数の症状、もしくは疾患を有する対象における疾患の進行の改善を達成するために要求される量を意味することができる。

0065

例えば、癌の場合、HES−オリゴヌクレオチド複合体の療法的有効量は、血管新生及び新生血管形成を減少させ、癌細胞の数を減少させ、HES−オリゴヌクレオチド複合体の療法的有効量は、腫瘍のサイズを減少させ、癌細胞の末梢器官への浸潤を阻害し(すなわち、遅くし又は停止し)、腫瘍転移を阻害し(すなわち、遅くし又は停止し)、腫瘍の増殖又は腫瘍の発生率を阻害又は遅延し、癌細胞に対する免疫応答を刺激し、そして/又は癌に関連する1又は複数の症状を救済するであろう。

0066

感染性疾患の場合、HES−オリゴヌクレオチド複合体の療法的有効量は、感染物(例えば、ウイルス負荷)の減少した数に関連し、そして/又は感染物により惹起される感染に関連する1又は複数の症状又は状態の改善に関連するであろう。「療法的有効量」はまた、投与量及び必要な時間において、所望の療法結果を達成するために効果的な量を意味するであろう。本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体の療法的有効量は、対象の疾患状態、年齢性別及び体重、並びに対象において所望の応答を惹起するHES−オリゴヌクレオチド複合体の能力、のごとき因子にしたがって変わるであろう。療法的有効量はまた、HES−オリゴヌクレオチド複合体の毒性又は有害効果に比べて、療法的に有利な効果が勝るような量である。

0067

治療指数(therapeutic index)は、HES−オリゴヌクレオチド複合体の、所望の効果を惹起する投与量に対する不所望の効果を生成する投与量の比率である。本発明の開示の文脈において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、活性が維持されており、しかし不所望の効果が減少しまたは存在しない場合、「改良された治療指数」を示す。例えば、改良された治療指数を有するHES−オリゴヌクレオチド複合体は、不所望の効果、例えば免疫刺激活性をもたらすことなく、又は少なくとも複合体の投与を禁止する程度に不所望の効果をもたらすことなく、miRNA活性を阻害する能力を維持する。

0068

本明細書で使用される場合、「療法的オリゴヌクレオチド」は、所望の療法結果を達成し、そして/又は十分な量で投与される場合に、又はエクス−ビボで対象における疾患又は障害を「処理する」ことができるオリゴヌクレオチドを意味する。このような好ましい結果には、例えば、疾患の進行を遅らせること、生存時間の延長、及び/又は疾患を有する対象における疾患、疾患の進行、又は疾患関連状態の指標の1又は複数における改善が含まれる。療法的オリゴヌクレオチドの例には、siRNA、shRNA、ダイサー(Dicer)基質(例えば、dsRNA)、miRNA、抗−miRNA、アンチセンス、デコイ(decoy)、アプタマー(aptamer)、及びsiRNA、miRNA、リボザイム(ribozyme)、アンチセンスオリゴヌクレオチド又は蛋白質コード配列を発現することができるプラスミドが含まれる。所望の療法的結果を達成することができないプローブ及びプライマーのごときオリゴヌクレオチドは、この開示の目的のために療法的オリゴヌクレオチドとは考えられない。

0069

平均して、mRNAの1%未満がアンチセンスオリゴヌクレオチドのための適当な標的である。本発明のHES−オリゴヌクレオチドへの導入のために適当な多くのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本明細書に記載され、又は当業界において知られている。同様に、適当な療法的オリゴヌクレオチドが、当業界で知られているガイドラインアルゴリズム及びプログラムを用いて日常的に設計することができる(例えば、Aartsma-Rus et al., Mol Ther 17(3) 548-553 (2009)及びReynoldset al., Nat. Biotech. 22(3):326-330 (2004)、並びにZhang et al., Nucleic Acids Res. 31e72 (2003)を参照のこと、これらの文献のそれぞれの内容が、引用により本明細書に繰り入れられる)。

0070

適当な療法的オリゴヌクレオチドは同様に、商業的に入手可能なプログラムを用いて日常的に設計することができる(例えば、MysiRNA-Designer, AsiDesigner (Bioinformatics Research Center, KRIBB)、siRNA Target Finder (Ambion)、Block-iT RNAi Designer (Invitrogen)、Gene specific siRNA selector (The Wistar Institute)、siRNA Target Finder (GeneScript)、siDESIGN Center (Dharmacon)、SiRNA at Whitehead、siRNA Design (IDT), D: T7 RNAi Oligo Designer (Dudek P and Picard D.)、sfold-software、及びRNAstructure 4.5);インターネットで入手可能なプログラム、例えばヒトスプライシングファインダーソフトウエアー(例えば".umd.be/HSF/")及びTargetfinder("bioit.org.cn/ao/targetfinder"から入手可能);及び商業的提供者(例えば、Gene Tools,LLC)を参照のこと)。場合によっては、文脈が特に断らない限り、本明細書において、HES−オリゴヌクレオチド及び療法的オリゴヌクレオチドは相互交換的に使用される。

図面の簡単な説明

0071

図1aは、200μLの緩衝液PBS)又はダイサー(Dicer)基質の注射の3時間後にBALB/Cマウスから単離された血液細胞フィールドヒストグラムを示す。後者はこれらのマウスに存在しない遺伝子の配列を含む。細胞は、1.5 mg/kgの濃度でのPBS又はダイサー(Dicer)基質の1回のip注射の後で単離された。
図1bは、200μLの緩衝液(PBS)又はダイサー(Dicer)基質の注射の3時間後にBALB/Cマウスから単離された血液細胞のフィールドヒストグラムを示す。後者はこれらのマウスに存在しない遺伝子の配列を含む。細胞は、PBS、1.5 mg/kgの濃度でのダイサー(Dicer)基質、又は0.75 mg/kgの濃度でのダイサー(Dicer)基質、の1回のip注射の後で単離された。
図1cは、種々の時間、すなわちダイサー(Dicer)基質の1回のip投与(1.0mg/kg)の後1、3、5及び24時間後に単離された細胞からの蛍光をヒストグラム形式で示す。これらのデータは、対照動物からのヒストグラム(t=0と表示される)上に重ねられている。1、3及び5時間におけるダイサー(Dicer)基質に曝露された細胞における約2logの蛍光強度は、対照動物からのそれらとの比較において、3時間における最大取り込み、及び24時間までの細胞内オリゴヌクレオチドの喪失を示した。すべての群の光散乱特性は、高度に生存性の細胞及びHES−担持オリゴヌクレオチドの不存在を示した。更に、24時間動物からのシグナルの喪失は、HES−オリゴヌクレオチドの非毒性代謝と一致する。

0072

図2は、(左欄)放射スペクトル、及び(右欄)相互添加の前(上方の2列)及び後(下列)のRNAのフルオロフォアで標識された各相補的単鎖のhplcクロマトグラムを示す。図の中央欄は、センス鎖のみ(0秒と約80秒の間)及びそれに続くアンチセンス鎖の添加後(約80秒)での蛍光強度を示す。
図3は、組換えダイサー(Dicer)酵素の添加後の時間の関数としての、RNAの標識されたセンス鎖と標識されたアンチセンス鎖との間で形成された2本鎖の蛍光強度を示す。

0073

図4は、eGFPについてトランスジェニックであるマウスからの単一血液細胞の蛍光強度を示す。対照細胞からのヒストグラムと、eGFPを標的化する2本鎖RNAの曝露された細胞のヒストグラムとが重ねられている。

0074

病的状態、例えば癌、感染性疾患、及び神経変性疾患、の検出及び処理のための分子標的は、ユニークなDNA及びRNA配列であることができる。このような標的と相補的配列を含むプローブとの結合、すなわちハイブリダイゼ—ションとして知られる工程、についての研究は、高い精度及び特異性をもって行われてきており、これ等のデータは現在利用できない処理の開発についての楽観性の基礎を提供した。しかしながら、このような研究の多くは、非生理的条件下で、例えば溶液中で、又は透過性にされた若しくは固定された細胞及び組織において行われてきた。あいにく、生理的条件下で同じプローブが試された場合、透過性障壁、例えば宿主の細胞膜、細胞外マトリクス又は細胞壁の存在と相俟って相補配列のサイズ及び電荷のため、それらの標的接近性がかなり限定され、効率の低下が生じた。したがって、過去10年の間、多くの資源が、イン-ビボで遺伝子の転写及び翻訳を遮断することができるオリゴヌクレオチド配列を送達する方法の開発に向けられた。

0075

送達方法を開発するために、生物的アプローチ及び化学的アプローチの両方が用いられてきた。例えば、生物的アプローチは、プロモーターにより発現される配列の幾つかのウイルスベクターの作成であり、他方化学に基礎を置く送達ベヒクルは、コレステロール、糖、アプタマー(aptamer)及び抗体を含めての種々の分子と核酸との接合により作製された。しかしながら、最も研究されたイン−ビボ化学的送達系は、脂質二重層から構成される小胞であるリポソーム中に核酸が封入されるナノ粒子を使用した。後者は、増強された安定性を有するポリエチレングリコール(PEG)ポリマーにより修飾される場合、SNALPを称され、そしてときには更に、特定の細胞型上の受容体への標的化のために、ナノ粒子表面上のペプチドリガンドにより更に修飾される。

0076

上記のアプローチにより若干の成功が達成されたが、次の問題点に遭遇した:ウイルス性送達を用いて、宿主において免疫原性を開始する高い可能性が存在する。更に、ウイルス配列における変異による宿主での変異及び異常な遺伝子発現の危険性をモニターしなければならない。イン-ビボ化学的送達ベヒクルに関しては、あいにく、特異性についての増強された修飾をもってしても、送達が次の点に欠けることが示されている:(1)標的細胞による特異的取込み。むしろ、細内皮系の細胞は、食細胞−様過程により、核酸構成物、特にナノ粒子を非特異的に取り込む。(2)所望の細胞の標的化が好結果である場合でさえ、送達ベヒクルを伴う又は伴わないプローブの内在化はしばしば、オリゴヌクレオチドがリソソーム内で止まる細胞のエンドサイトシス系に向けてであり、この場合、化学環境、例えば低pHが、(a)核酸の破壊、又は(b)細胞質中の標的化されるmRNA又は核内のDNAからの隔離をもたらし得る。

0077

上記の送達ヘヒクルに対して、本発明は、従来の送達技法を用いて要求される投与に比べて、療法効果を達成するのに桁違いに少ない投与量を要求する高度に効果的なイン−ビトロ及びイン−ビボオリゴヌクレオチド送達系を提供する。本発明のHES−オリゴヌクレオチ送達ドベヒクルは、配列非依存性であり(例えば、核酸、修飾された核酸、PNA、モルホリノの送達)、そして細胞エンドサイトシス系をバイパスするために受動拡散を利用し、それによりすべての細胞内環境へのアクセスを提供し、そしてオリゴヌクレオチド(例えば、医療的オリゴヌクレオチド、例えばsiRNA、shRNA、ダイサー(Dicer)基質(例えばdsRNA)、miRNA、抗−miRNA、デコイ(decoy)、アプタマー(aptamer)及び例えば細胞質中の標的化RNA又は核中のDNAに対するアンチセンス)の送達を増加させる。

0078

特に、好ましい態様において、本発明は、細胞の細胞質及び/又は核及び生物の組織にイン−ビボで注目の核酸配列を送達するために、オリゴヌクレオチド及び2又は複数のHESを形成することができるフルオロフォアを含んで成るHES−オリゴヌクレオチド複合体を用いる。HES−オリゴヌクレオチド送達ベヒクルは、細胞及び生物に対して無毒である。本発明の送達ベヒクルの優れた配列非依存性の細胞膜透過性は、受容体非−依存性態様で膜を通過し、そして生きた細胞の細胞質及び核内の相補的核酸配列へのオリゴヌクレオチドの増加した送達及び標的化を導く、HES−オリゴヌクレオチド複合体に含まれるオリゴヌクレオチドの能力を促進する。

0079

本発明のHES−オリゴヌクレオチド送達系はまた、細菌又はウイルス由来の核酸配列を標的化するためにも用いることができる。更に、本発明のHES−オリゴヌクレオチド送達ベヒクルは、広範囲の診断的及び機能的オリゴヌクレオチドをイン−ビボで細胞に送達する用途を有し、当該オリゴヌクレオチドには、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、ダイサー(Dicer)基質、リボザイム、miRNA、抗−miRNA、アプタマー(aptamer)、デコイ(decoy)、蛋白質コード配列、又は生きた生物中の任意の核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。このような生きた生物には、例えば、哺乳類、植物、及び微生物、例えば細菌、原生動物、及びウイルスが含まれる。

0080

本発明の観点又は態様がマーカッシュ群又は他の代替物の群分けにより記載される場合、本発明は、全体としてリストされる全群のみならず、群の個々の各メンバー及び主群の全ての可能性ある亜群、及びまた、1又は複数のメンバーを欠く主群も含む。本発明はまた、特許請求される群メンバーの任意の1又は複数の明示的排除も予想する。

0081

「A及び/又はB」の如きにおいて使用される「及び/又は」なる語は、A及びBの両方;A又はB;Aのみ;Bのみ、を含むことが意図される。同様に、「A、B及び/又はC」の如き句において使用される「及び/又は」なる語は、次の態様:A、B、及びC;A、B、又はC;A又はCF;A又はB;B又はC;A及びC;A及びB;B及びC;Aのみ;Bのみ;並びにCのみ、を含むことが意図される。

0082

本発明のオリゴヌクレオチド複合体中のフルオロフォアは、複合体中でホモ型の又はヘテロ型の同種のフルオロフォアを有するHESを形成することができる、複合体中の任意のフルオロフォアであることができる。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、H−型励起構造を形成することができる2つのフルオロフォアを含む。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、H−型励起構造を形成することができる3、4、5又はそれより多くのフルオロフォアを含む。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、H−型励起構造を形成することができる約2〜20、約2〜10、約2〜6、又は約2〜4のフルオロフォアを含む。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、H−型励起構造を形成することができる3,4、5又はそれより多くのフルオロフォアを含んでなる。

0083

2又はそれより多くのフルオロフォアは、それらの集合蛍光が、例えば溶液中約1μM又はそれ以下においてそれらが分離される場合のフルオロフォアの集合蛍光に比べて検出可能に低い場合、HES中で相互に消光(quench)されると言われる。個々のフルオロフォアのスペクトルと比べてのHES吸収スペクトルの最大は、より短い波長にシフト(すなわち、ブルーシフト)されるべき最大の吸収波長を示す。H−型励起構造(以下、「HES」と記す)又は集合体の蛍光強度は、その成分の蛍光強度より低い強度を示す。H−型励起構造又は集合体の、吸収スペクトルのブルーシフト又は蛍光強度挙動の低下の何れかは、シグナルレポーター成分の指標として使用することができる。好ましい態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中の2又はそれより多くのフルオロフォアは、少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%。より好ましくは少なくとも80%、そして最も好ましくは少なくとも90%、95%、又は更に少なくとも99%で、増強又は消光する。H−型励起構造を形成することができるフルオロフォアの例には、キサンタン類、シアニン類及びクンマリン類が含まれる。

0084

幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、カルボキシダイン110、カルボキシテトラメチルロダミン、カルボキシロダミン−X、ジエチルアミノクマリン及びカルボシアニン色素から選択されるフルオロフォアを含む。

0085

更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、ロダミングリーン(Rhodamine Green)(商標カルボン酸サクシンイミジルエステル又は塩酸塩;ロダミングリーン(商標)カルボン酸トリフルオロアセタミド又はサクシンイミジルエステル;ロダミングリーン(商標)−Xサクシンイミジルエステル又は塩酸塩;ロドルグリーン(Rhodol Green)(商標)カルボン酸、N,0-ビス-(トリフルオロアセチル)又はサクシンイミドエステル;ビス-(4-カルボキシピぺリジニル)スルホンロダミン又はジ(サクシンイミジルエステル);5-(及び-6)-カルボキシナフトフルオレセイン;5−(及び−6)−カルボキシナフトフルオレセイン;サクシンイミジルエステル;5-カルボキシロダミン6G塩酸塩;6-カルボキシロダミン6G塩酸塩;5-カルボキシロダミン6Gサクシンイミジルエステル;6-カルボキシロダミン6Gサクシンイミジルエステル;5-(及び-6)-カルボキシロダミン6Gサクシンイミジルエステル;5-カルボキシ-2',4',5',7'-テトラブロモスルホンフルオレセインサクシンイミジルエステル又はビス-(ジイソプロピルエチルアンモニウム)塩;5-カルボキシテトラメチルロダミン;6-カルボキシテトラメチルロダミン;5-(及び-6)-カルボキシテトラメチルロダミン;5-カルボキシテトラメチルロダミンサクシンイミジルエステル;6-カルボキシテトラメチルロダミンサクシンイミジルエステル;5-(及び-6)- カルボキシテトラメチルロダミンサクシンイミジルエステル;6-カルボキシ-X-ロダミン;5-カルボキシ-X-ロダミンサクシンイミジルエステル;6-カルボキシ-X-ロダミンサクシンイミジルエステル;5-(及び-6)-カルボキシ-X-ロダミンサクシンイミジルエステル;5-カルボキシ-X-ロダミントリエチルアンモニウム塩;リッサミン(Lissamine)(商標)ロダミンBスルホニルクロリドマラカイトグリーンイソチオシアネート;ロダミンレッド(Rhodamine Red)(商標)-Xサクシンイミジルエステル;6-(テトラメチルロダミン-5-(及び-6)-カルボキサミド)ヘキサン酸サクシンイミジルエステル;テトラメチルロダミン-5-イソチオシアネート;テトラメチルロダミン-6-イソチオシアネート;テトラメチルロダミン-5-(及び-6)イソチオシアネート;テキサスレッド(Texas Red)(登録商標)スルホニル;テキサスレッド(登録商標)スルホニルクロリド;テキサスレッド(登録商標)-X STPエステル又はナトリウム塩;テキサスレッド(登録商標)-Xサクシンイミジルエステル;テキサスレッド(登録商標)-Xサクシンイミジルエステル;X-ロダミン-5-(及び-6)-イソチオシアネート;及びカルボシアニン類から成る群から選択されるフルオロフォアを含む。

0086

幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、異なるフルオロフォアから形成されるヘテロHESを含む。特定の態様において、ヘテロ−HESは、ロダミン又はロダミン誘導体、及びフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体、又は2つのカルボシアニンを含む。更なる態様において、ヘテロ−HESは、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセインサクシンイミジルエステル;5-(及び-6)-カルボキシエオシン;5-カルボキシフルオレセイン;6-カルボキシフルオレセイン;5-(及び-6)-カルボキシフルオレセイン;5-カルボキシフルオレセイン-ビス-(5-カルボキシメトキシ-2-ニトロベンジル)エステル、-アラニン-カルボキサミド、又はサクシンイミジルエステル;5-カルボキシフルオレセインサクシンイミジルエステル;6-カルボキシフルオレセインサクシンイミジルエステル;;5-(及び-6)- カルボキシフルオレセインサクシンイミジルエステル;5-(4,6-ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン;2',7'-ジフルオロフルオレセイン;エオシン-5-イソチオシアネート;エリスロシン-5-イソチオシアネート;6-(フルオレセイン-5-カルボキサミド)ヘキサン酸又はサクシンイミジルエステル;6-(フルオレセイン-5(及び-6)-カルボキサミド)ヘキサン酸又はサクシンイミジルエステル;フルオレセイン-5-EXサクシンイミジルエステル;フルオレセイン-5-イソチオシアネート;及びフルオレセイン-6-イソチオシアネート、から選択されるフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体を含む。

0087

オリゴヌクレオチド
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)又はこれらの模倣物のオリゴマー又はポリマーを意味する。この用語は、天然ヌクレオ塩基、糖、及びヌクレオシド間共有結合(主鎖)から構成されるオリゴヌクレオチド(すなわち、非−修飾オリゴヌクレオチド)、並びに非−天然ヌクレオ塩基、糖、及び/又はヌクレオシド間結合を有するオリゴマー化合物、及び/又は同様に機能するDNA及び/又はRNAの類似体(すなわち、核酸「模倣物」(mimetics又はmimics)を含む。このような模倣オリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば核酸標的に対する増強された親和性及びヌクレアーゼの存在下での増加した安定性などの好ましい性質のため、天然型を超えて好ましい。

0088

例えば、本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド主鎖の1又は複数のリボース環モルホリン環により置き換えられているモルホリノ(MNO)、及びヌクレオチド主鎖の1又は複数のリボース環がモルホリン環により置き換えられておりそして負に荷電したサブユニット間結合が荷電を有しないホスホロジアミデート結合により置き換えられているホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー(PMO)を含む。同様に、用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドの1又は複数の糖リン酸主鎖がアミド含有主鎖に置きかえられているPNAを包含する。この明細書の目的のため、及び時には当業界において言及されるように、そのヌクレオシド間主鎖にリン原子を有しない修飾されたオリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオチドであると考えられる。更に、オリゴヌクレオチドはオリゴマーとも称される。

0089

本発明のHES−オリゴヌクレオチドベヒクルの送達は、配列非−依存性であり、そしてそれ故のHES−オリゴヌクレオチドベヒクルに含まれるオリゴヌクレオチドは、細胞に導入されることが好ましいことが知られている核酸又は模倣物の任意の形態であってよい。

0090

HES−オリゴヌクレオチドベヒクル中のオリゴヌクレオチドは、1本鎖、2本鎖、環状又はヘアピン形オリゴヌクレオチドの形態であることができる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1本鎖DNA、RNA、又は核酸模倣物(例えば、PMO、MNO、PNA、又は1若しくは複数の修飾されたヌクレオチド、例えば2'OME及びLNAを含むオリゴヌクレオチド)である。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、2本鎖DNA、RNA、核酸模倣物、DNA/核酸模倣物、2本鎖DNA、DNA/RNA、RNA核酸模倣物である。

0091

本発明者らが、驚くべきことに発見したところによれば、HES−オリゴヌクレオチド例えばssDNA及びdsRNAを含む複合体は、従来のオリゴヌクレオチド送達ベヒクルにより要求される投与に比べて数桁少ないオリゴヌクレオチドを必要とする卓越した配列非−依存性細胞内送達を示す。本発明の複合体に含まれる1本鎖核酸の例には、アンチセンス、siRNA、shRNA、リボザイム、miRNA、抗miRNA、トリプレクス形成性オリゴヌクレオチド及びアプタマー(aptamer)が含まれるが、これらに限定されない。

0092

幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、1本鎖DNA(ssDNA)である。好ましい態様において、ssDNAオリゴヌクレオチドの少なくとも部分は、標的RNAと特異的にハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド−RNAの2本鎖を形成する。更なる好ましい態様において、オリゴヌクレオチド−RNAの2本鎖は、RNase開裂メカニズム(例えば、RNase H)に対して感受性である。幾つかの態様において、複合体中の1本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾された主鎖連結、少なくとも1つの修飾された糖、及び/又は少なくとも1つの修飾されたヌクレオ塩基(例えば、本明細書に記載のもの)を含んで成る。

0093

幾つかの態様において、複合体中の1本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾された主鎖連結、少なくとも1つの修飾された糖、及び/又は少なくとも1つの修飾されたヌクレオ塩基(例えば、本明細書に記載のもの)を含んで成り、そしてRNAase開裂メカニズムに対して感受性のオリゴヌクレオチド−RNAの2本鎖を形成することができる。特定の態様において、1本鎖オリゴヌクレオチドは、ギャップマー(gapmer)(すなわち、本明細書に記載されているもの、又は当業界で知られているもの)である。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾された主鎖連結、少なくとも1つの修飾された糖、及び/又は少なくとも1つの修飾されたヌクレオ塩基を含んで成り、それは、RNase開裂メカニズム(本明細書に記載されているように)に対するオリゴヌクレオチドの感受性を低下させる。特定の態様において、1本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの2'OME、LNA、MNO又はPNAモチーフを含んで成る。

0094

本発明者らが驚くべきことに発見したところによれば、2本鎖オリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体は、従来のオリゴヌクレオチド送達ベヒクルに比べて、卓越した2本鎖オリゴヌクレオチドの配列非−依存性細胞内送達を示す(やはり、ナノモル及び中程度マイクロモルの範囲で)。本発明の複合体に含まれる2本鎖DNAオリゴヌクレオチドの例には、dsRNAi及びダイサー(dicer)基質及び他のRNAインターフェアランス試薬、及び構造遺伝子及び/又は制御領域及び停止領域に対応する配列が含まれるが、これらに限定されない。

0095

幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、線状2本鎖RNA(dsRNA)である。好ましい態様において、ds-RNAは、RNase開裂メカニズム(例えば、ダイサー(Dicer)及びドロシャ(Drosha)(RNase III酵素))に対して感受性である。追加の態様において、dsRNAは、細胞のRNA誘導サイレンシング複合体(RNA Induced Silencing Complex)(RISC))に挿入されうる。更なる態様において、dsRNAのRNA鎖は、RNA標的の開裂を行なうためにRISC複合体を使用することができる。

0096

追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、2本鎖オリゴヌクレオチドを含み、当該2本鎖オリゴヌクレオチドでは、一方又は両方のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾された主鎖連結、少なくとも1つの修飾された糖、及び/又は少なくとも1つの修飾されたヌクレオ塩基を含む。好ましい態様において、2本鎖オリゴヌクレオチドは、RNase開裂メカニズム(例えば、ダイサー(Dicer)及びドロシャ(Drosha)(RNase III酵素)に対して感受性である。追加の態様において、2本鎖オリゴヌクレオチドは、細胞のRNA誘導サイレンシング複合体(RNA Induced Silencing Complex)(RISC))に挿入されうる。更なる態様において、2本鎖オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖は、RNA標的の開裂を行なうためにRISC複合体を使用することができる。

0097

更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は3本鎖オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは3本鎖DNA/RNAキメラを含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド複合体は、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含んで成り、当該オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの修飾された主鎖連結、少なくとも1つの修飾された糖、及び/又は少なくとも1つの修飾されたヌクレオ塩基を含んで成る。特定の態様において、複合体中の少なくとも1つのオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの2'OME、LNA、MNO及びPNAモチーフを含んで成る。

0098

HES−オリゴヌクレオチドベヒクル中のオリゴヌクレオチドは、日常的に、線状に調製されるが、連結されることができ、あるいは環状に調製され、そしてまた分枝形成も含まれる。別々のオリゴヌクレオチドが特異的にハイブリダイズして2本鎖を形成することができ、当該2本鎖は平滑末端を有することができ、又は1端又は両端にオーバーハングを含むことができる。特定の態様において、本発明の複合体に含まれる2本鎖オリゴヌクレオチド(例えば、dsRNA、及びオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも1つが核酸模倣物である2本鎖オリゴヌクレオチド)は、21〜25ヌクレオチドの長さであり、そして1端又は両端に1、2、又は3ヌクレオチドのオーバーハングを有する。

0099

本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、一般に、核酸又は模倣体の特定の形態、及び意図される用途に依存して種々の長さを有することができる。幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中の核酸/オリゴヌクレオチドは、約5ヌクレオチド〜約500ヌクレオチド、そして好ましくは約10ヌクレオチド〜約100ヌクレオチドの長さに亘る。

0100

幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列に対して相補的である少なくとも8個の連続するヌクレオ塩基を含んで成る。種々の関連する態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、約8〜約100モノマーサブユニット(ここで、用語「ヌクレオチド」と交換可能に使用される)、又は約8〜約50ヌクレオチドの長さを有する。

0101

追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、約8〜約30ヌクレオチド、約15〜約30ヌクレオチド、約20〜約30ヌクレオチド、約18〜26ヌクレオチド、約19〜25ヌクレオチド、約20〜25ヌクレオチド、又は約21〜25ヌクレオチドの長さを有する。

0102

更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49又は50サブユニット(ヌクレオチド)の長さを有する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、19、20、21、22、23、24又は25ヌクレオチドの長さを有する。

0103

特定の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、21〜25ヌクレオチドの長さを有するRNAオリゴヌクレオチドの2本鎖を含み、そしていずれか又は両方の末端に1、2又は3ヌクレオチドのオーバーハングを有する。他の態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体は、オリゴヌクレオチドの2本鎖を含み、当該オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも一方は21〜25ヌクレオチドの長さの核酸模倣物であり、そして2本鎖オリゴヌクレオチドは何れか又は両方の末端に1、2又は3ヌクレオチドのオーバーハングを有する。

0104

修飾を含むオリゴヌクレオチド
本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、好ましくは、1又は複数の修飾されたヌクレオシド間連結、修飾された糖成分及び/又は修飾されたヌクレオ塩基を含む。このような修飾されたオリゴヌクレオチド(すなわち、模倣物)は、例えば、増強された細胞取込み、核酸標識に対する増強された親和性、ヌクレアーゼの存在下での増加した安定性、及び/又は増加した阻害活性を含む好ましい性質のため、典型的には天然型を超えて好ましい。

0105

修飾されたヌクレオシド間連結
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を維持するオリゴヌクレオチド、及びヌクレオシド主鎖にリン原子を有しないおオリゴヌクレオチドを意味する。幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、1又は複数の修飾されたヌクレオシド間連結を含んで成る。本発明のオリゴヌクレオチド中の修飾されたヌクレオシド間連結は、例えば、ホスホジエステルヌクレオサイド間連結により提供されるヌクレアーゼ安定性に比べて、オリゴヌクレオチドに対する増強されたヌクレアーゼ安定性を提供することが知られている任意の態様のヌクレオシド間連結を含む。

0106

修飾されたヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を維持するヌクレオシド間連結、及びリンを含有しないヌクレオシド間連結が含まれる。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオシド間連結及び非−修飾のヌクレオシド間連結の間で交代する修飾されたヌクレオシド間連結を含んで成る。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間連結の殆どが修飾される。更なる態様において、オリゴヌクレオチド中の全てのヌクレオシド間連結が修飾されている。

0107

好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホジエステル、ホスホトリエステルアミノアルキル−ホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば3'−アルキレンホスホネート、5'−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネートホスホラミデート、例えば3−アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノ−アルキルホスホネート、チオノアキルホスホトリエステル、正常3'−5'連結、これ等の2'−5連結類似体を有するセレノ−ホスフェート及びボロノホスフェート、及び1又は複数のヌクレオシド間連結が3'−3'、5'−5'、又は2'−2'連結である逆転した極性を有するものが含まれる。逆転した極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間連結の最3側に単一3'−3'連結、すなわち塩基脱落でもよい単一の逆転したヌクレオシド残基ヌクレオシド塩基が欠けているか又はそれに代えてヒドロキシル基を有する)を含んで成る。種々の塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。

0108

好ましい態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、少なくとも1個のホスホロチオエート(PS)ヌクレオシド間連結を含み、当該ホスホロチオエート(PS)ヌクレオシド間連結においては、ホスホジエステル結合中の非架橋酸素原子の1つが硫黄により置き換えられている。PSヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドは、通常のワトソンクリック塩基対を形成し、RNaseHを活性化し、細胞送達のために負の電荷を担持し、そして他の追加の好ましい薬理動態特性を示す。幾つかの態様において、前記少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間連結はホスホロチオエートである。

0109

幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオシド間連結の少なくとも2、3、4、5、10又は15は、ホスホロチオエート連結である。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシド間連結の少なくとも1〜10、1〜20、1〜30は、ホスホロチオエート連結である。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシド間連結の少なくとも2、3、4、5、10又は15は、ホスホロチオエート連結である。追加の態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間連結はホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。

0110

幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、2〜5のMOEヌクレオチドのいずれかの末端に接する8〜14塩基のPS−修飾デオキシヌクレオチド「ギャップ」を含むオリゴヌクレオチド(すなわち、MOEギャクマー)を有する。幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、2〜5のLNAヌクレオチドのいずれかの末端に接する8〜14塩基のPS−修飾デオキシヌクレオチド「ギャップ」を含むオリゴヌクレオチド(すなわち、LNAギャックマー)を有する。追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、2〜5のトリシクロ−DNAヌクレオチドのいずれかの末端に接する8〜14塩基のPS−修飾デオキシヌクレオチド「ギャップ」を含むオリゴヌクレオチド(すなわち、tcDNAギャックマー)を有する。

0111

他の適当な、リンを含有する修飾されたヌクレオシド間連結はN3'−P5'ホスホロアミデート(NP)であり、当該N3'−P5'ホスホロアミデート(NP)では、2'−デオキシリボースの3'−ヒドロキシ基が3'−アミノ基により置き換えられている。NPヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドは、相補的RNAに対する高い親和性及びヌクレアーゼに対する耐性を示す。ホスホロアミデートは標的RNAのRNaseH開裂を含まないので、これ等のヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドは、RNA一体化が維持される必要がある場合、例えばオリゴヌクレオチド調節、mRNAスプライシングの場合に用途を有する。

0112

幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオシド間連結の少なくとも2、3、4、5、10又は15は、ホスホロアミデート連結である。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシド間連結の少なくとも1〜10、1〜20、1〜30は、ホスホロアミデート連結である。幾つかの態様において、修飾されたヌクレオシド間連結の少なくとも2、3、4、5、10又は15は、ホスホロアミデート連結である。追加の態様において、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間連結はホスホロアミデートヌクレオシド間連結である。

0113

多くの修飾されたヌクレオシド間連結及びそれらの合成方法が当業界において知られており、そして本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる修飾に包含される。リン含有ヌクレオシド間連結の調製を教示する米国特許の例には、米国特許第3,687,808号、第4,469,863号、第号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,196号、第5,188,897号、第5,194,599号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,489,677号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,527,899号、第5,536,821号、第5,541,306号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,565,555号、第5,602,240号、第5,571,799号、第5,587,361号、第5,625,050号、第5,646,269号、第5,663,312号、第5,672,697号、第5,677,439号、及び第5,721,218号が含まれるが、これらに限定されない。これらの開示のそれぞれを、引用により本明細書に繰り入れる。

0114

リン原子を含まないオリゴヌクレオチドを含むHES−オリゴヌクレオチド複合体もまた本発明に含まれる。このようなオリゴヌクレオチドの例には、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結、ヘテロ原子とアルキル又はシクロアルキルとの混合ヌクレオシド間連結、あるいは1又は複数の短鎖ヘテロ原子又はヘテロサイクルヌクレオシド間連結により形成される主鎖を含むものが含まれる。これらの修飾された主鎖には、モルホリノ連結(ヌクレオシドの糖成分から部分的に形成される);シロキサン主鎖スルフィドスルホキシド及びスルホン主鎖;ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖;メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖;リボアセチル主鎖;アルケン含有主鎖;スルファメート主鎖;メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖;スルホネート及びスルホンアミド主鎖;アミド主鎖;並びに混合N、O、S及びCH2成分部分を有するもの、を含むオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。

0115

リン原子を含まない主鎖を含むオリゴヌクレオチドの製造方法は当業界で知られており、そして米国特許第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,264,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,646,269号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号、第5,677,439号、第5,792,608号に記載されている方法及び組成物を含むが、これらに限定されない。これらの開示のそれぞれを、引用により本明細書に組み入れる。

0116

幾つかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3'−メチレンスルホネート、メチレン(メチルイミノ)(MMIとしても知られる)、モルホリノ、ロックされた核酸、及びペプチド核酸連結から選択される1又は複数の修飾された主鎖連結を含む。修飾された主鎖連結は、均一でもよく、又はRNAse H開裂が支持されない限り、他の連結、特にホスホジエステル又はホスホロチオエート連結と交互であってもよい。

0117

幾つかの態様において、HES複合体は核酸模倣物であるオリゴヌクレオチドを含む。用語「模倣物」は、オリゴヌクレオチドに適用される場合、糖、又は糖及びヌクレオチド間連結の両者がそれに代わる基により置き換えられているオリゴヌクレオチドを含むことが意図される。

0118

幾つかの態様において、本発明の複合体は、1又は複数のモルホリノ連結を有するオリゴヌクレオチドを含む。モルホリノのRNAse及びヌクレアーゼ耐性特性により、それらが特に細胞での転写を制御するのに有用なものとなる。したがって、幾つかの態様において、モルホリノ単位を含む複合体は遺伝子発現を調節するために使用される。幾つかの態様において、モルホリノ単位はホスホロジアミテートモルホリノである。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはモルホリノに対応する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドの全てのモノマーユニットはホスホロジアミデートモルホリノに対応する。特定の態様において、オリゴヌクレオチドの各モノマーユニットはホスホロジアミデートモルホリノ(PMO)に対応する。追加の態様において、モルホリノオリゴヌクレオチド(例えば、PMO)を含有する複合体は、対象におけるmRNAスプライシングを変更するために使用される。追加の態様において、1又は複数のモルホリノヌクレオ塩基、例えばPMOを含む複合体は、アンチセンス剤として使用される。

0119

追加の態様において、本発明のオリゴヌクレオチド複合体は、ペプチド核酸(PNA)である。PNAは、オリゴヌクレオチドの糖ホスフェート主鎖がアミド含有主鎖により置き換えられている核酸模倣物である。特定の態様において、オリゴヌクレオチドのホスフェート主鎖は、アミノエチルグリシン主鎖により置き換えられており、そすてヌクレオ塩基は、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接に結合している。多くのPNA及びPNAの製造方法が当業界で知られている(例えば、Nielsen et al, Science, 254, 1497-150 (1991)、並びに米国特許第5,539,082号、第5,714,331号及び第5,719,262号を参照のこと)これらのそれぞれを、引用によりこの明細書に繰り入れる。PNA含有オリゴヌクレオチドは、増加した安定性及び好ましいハイブリダイゼ—ション動態を提供し、そして非置換対応核酸に比べてDNAより高いRNAに対する親和性を有し、そしてRNAse H介在分解を活性化しない。本発明の含まれるPNAは、PNA類似体、例えばオリゴヌクレオチドの1又は複数のモノマー単位のC2(α)、例えばD−アミノ酸、又はC5(γ)例えばL-アミノ酸(例えば、L-リジン)に正に荷電した基及び/又は1又は複数のキラル拘束立体中心を有する修飾された主鎖を有するPNAを含む。

0120

PNAオリゴヌクレオチドのRNAse及びヌクレアーゼ耐性により、これらは、立体ブロックメカニズムを介しての細胞内でのRNA(例えば、mRNA及びmiRNA)の制御において特に有用なものとなる。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのPNAオリゴヌクレオチドを含んで成る。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのPNAオリゴヌクレオチドを含んで成り、そして染色体2本鎖DNAの鎖侵入により遺伝子発現を調節する。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのPNAオリゴヌクレオチドを含み、そして対象においてmRNAスプライシングを変更する。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのPNAオリゴヌクレオチド、例えばPMOを含み、そしてアンチセンスとして働く。

0121

同様に、モルホリノ含有オリゴヌクレオチドのRNAse及びヌクレアーゼ耐性により、これらのオリゴヌクレオチドは、立体ブロックメカニズムを介して細胞でのRNA(例えば、mRNA及びimRNA)を制御するのに有用となる。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのモルホリノオリゴヌクレオチド例えばPMOを含んで成り、そして染色体2本鎖DNAの鎖侵入により遺伝子発現を調節する。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのモルホリノオリゴヌクレオチド例えばPMOを含んで成り、そして対象においてmRNAスプライシングを変更する。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのモルホリノオリゴヌクレオチド例えばPMOを含んで成り、そしてアンチセンスとして働く。

0122

更に、二環糖含有ヌクレオチドのRNAse及びヌクレアーゼ耐性により、これらのオリゴヌクレオチドは、立体ブロックメカニズムを介して細胞でのRNA(例えば、mRNA及びmiRNA)を制御するのに有用となる。幾つかの態様において、本発明の複合体は少なくとも1つの二環糖含有ヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、二環糖含有ヌクレオチドはロックされた核酸(LNA)である。更なる態様において、LNAは糖リングの3'又は4'炭素原子に結合した2'ヒドロキシル基を有する。更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのロックされた核酸(LNA)を含んで成り、当該ロックされた核酸においては、メチレン(−CH2−)n基が2'酸素原子及び4'炭素原子を架橋し、ここでnは1又は2である。幾つかの態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、二環糖含有ヌクレオチド例えばLNAを含んで成り、そして染色体2本鎖DNAの鎖侵入により遺伝子発現を調節する。他の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの二環糖オリゴヌクレオチド例えばLNAを含み、そして対象におけるmRNAスプライシングを調節する。追加の態様において、HES−オリゴヌクレオチドは少なくとも1つの二環糖オリゴヌクレオチド、例えばLNA、を含んで成り、そしてアンチセンスとそて働く。

0123

修飾された糖成分
幾つかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物は、1又は複数の修飾された糖成分を有する1又は複数のヌクレオシドを含んで成り、当該修飾された糖成分は、天然の又は合成非修飾ヌクレオ塩基に対して、機能的に相互交換可能だとしても、構造的に区別できる。更なる態様において、HES−オリゴヌクレオチド複合体中のオリゴヌクレオチドは、各ヌクレオシド(ユニット)において修飾された糖を含んで成る。

0124

本発明のオリゴヌクレオチドにおいて有用な糖修飾の例には、OH;F;0−、S−若しくはN−アルキル;又はO-アルキル-O-アルキル(式中、アルキル、アルケニル及びアルキニルは置換されているか又は置換されていないC1−C10アルキル又はC2−C10アルケニル又はアルキニルである)から選択される糖置換基を含んで成る化合物が含まれるが、これらに限定されない。

0125

代表的な修飾された糖には、炭素環式又は非環式糖、2'、3'又は4'位の1又は複数に置換基を有する糖、糖の1又は複数の水素原子の代わりに置換基を有する糖、及び糖内の他の2つの原子間に結合を有する糖が含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドにおいて有用な2'−糖置換基の例には、OH;F;O−、S−又はN−アルキル;O−、S−又はN−アルケニル;アリル、アミノ;アジド;チオ;O−アリル;0(CH2)2SCH3;O−、S−又はN−アルキニル;或いはO-アルキル-O-アルキル(アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換された又は非置換のC1〜C10アルキル又はC2〜C10アルケニル及びアルキニルである)が含まれるが、これらに限定されない。

0126

特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、0[(CH2)nO]mCH3、0(CH2)nOCH3、0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、0(CH2)nONH2、及び0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2(ここで、n及びmは1〜約10である)から選択される少なくとも1つの2'−糖置換基を含む。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、C1〜C10低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリールアラルキル、O−アルカリール又はO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、CI、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、S02CH3、ON02、N02、N3、NH2、ヘテロシクロアルキルヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノポリアルキルアミノ、置換されたシリル、RNA開裂基、レポーター基インターカレーター(intercalator)、薬理動態特性を改良するための基、又はオリゴヌクレオチド化合物の薬力学特性を改良するための基、及び類似の性質を有する他の置換基から選択される少なくとも1つの2'−糖置換基を含む。

0127

特定の態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、2'−メトキシエトキシ(2-0--CH2CH2OCH3, aka 2'-MOE)置換基を有する少なくとも1つの2'−置換糖を含んで成る。
幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、2-アリル(2-CH2--CH-CH2)、2'-0-アリル(2'-0--CH2--CH--CH2)、2'-アミノプロポキシ(2'-0CH2CH2CH2NH2)、及び2'-アセトアミド(2'-0--CH2C(--0)NRlRl(ここで、各Rlは独立にH又はCl-Clアルキルである)から選択される少なくとも1つの2'−修飾ヌクレオシドを含んで成る。

0128

更なる態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、2-ジメチルアミノオキシエトキシ(2'-0(CH2)2ON(CH3)2基(2'-DMAOE)置換基としても知られる);2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ(2'-0--CH2--0--CH2--N(CH2)2(2'-0-ジメチルアミノエトキシエチル又は2-DMAEOEとしても知られる)置換基;又は2'-O-メチル(2-0--CH3)置換基を有する少なくとも1つの2'−置換糖を含んで成る。更なる態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、2-フルオロ(2-F)置換基を有する少なくとも1つの2'−置換糖を含んで成る。

0129

幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの二環糖を含む。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのロックされた核酸(LNA)を有し、当該ロックされた核酸(LNA)においては、2'−ヒドロキシル基が糖環の3'又は4'炭素原子に結合している。特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのロックされた核酸(LNA)を有し、当該ロックされた核酸(LNA)においては、メチレン(--CH2--)n基(nは1又は2)が2'酸素原子と4'炭素原子を架橋している。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、4'及び2'リボシル環原子間に架橋を有する少なくとも1つの二環の修飾されたヌクレオシドを含み、ここで、当該架橋は、4'-(CH2)-0-2'(LNA);4'-(CH2)-S-2;4'-(CH2)2-0-2'(ENA);4'-C(CH3)2-0-2';4'-CH(CH3)-0-2';4'-CH(CH2OCH3)-0-2';4'-CH2-N(OCH3)-2';4'-CH2-0-N(CH3)-2';4'-CH2-N(R)--0-2';4'-CH2-CH(CH3)-2'及び4'-CH2-C(-CH2)-2'から選択され、ここで、Rは独立に、H、C1-C12アルキル、又は保護基である。

0130

本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドはまた、少なくとも1つの前記の糖構成及び追加のモチーフ、例えばα-L-リボフラノース、β-D-リボフラノース又はα-L-メチレンオキシ(4'-CH2--0-2')を有することができる。更に、本発明のオリゴヌクレオチドにおいて有用なLNA及びその調製は当業界において知られている。例えば、米国特許第6,268,490号、第6,670,461号、第7,217,805号、第7,314,923号及び第7,399,845号;WO 98/39352及びWO 99/14226;並びにSingh et al, Chem. Commun., 4:455-456(1998)を参照のこと。これらの文献のそれぞれに内容を引用により本明細書に組み入れる。

0131

幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されたフラノシル(例えば、リボフラノース)環成分を含んで成る。化学的に修飾されたリボフラノース環の例には、置換基(5'及び2'置換基、そして特に二環核酸(BNA)を形成するための非−ゼミナル還原子を架橋する2'位置を含めて)の付加、S、N(R)、又はC(R1)(R)2(R--H、C1-C12アルキル又は保護基によるリボシル環原子の置き換え、及びこれ等の組み合わせを含むが、これらに限定されない。化学的に修飾された糖の例には、2'-F-5'-メチル置換ヌクレオシド(例えば、WO 2008/101157は特に5',2-ビス置換ヌクレオシドを開示した)又はSによるリボシル環酸素原子の置換及び2'−位における更なる置換(例えば、US20050130923を参照のこと)、或いはBNAの5'-置換(WO 2007/134181、ここでLNAは例えば5-メチル又は5-ビニル基により置換される)が含まれる。

0132

3'末端ヌクレオシド上の糖の3'位又は2'−5'結合オリゴヌクレオチド及び5'−末端ヌクレオチドの5'位における上記の修飾に類似する修飾を有する少なくとも1つのヌクレオチドを含んで成るオリゴヌクレオチドを含む複合体も本発明に含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる2'−修飾ヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、第5,118,800号、第5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,053号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号、第5,700,920号、及び第5,792,747号が含まれるが、これ等に限定されない。これらのそれぞれを、引用により本明細書に組み入れる。

0133

幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの複素環二環核酸を有する。例えば、幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのENAモチーフを有する(例えば、WO 01/49687を参照のこと、この内容を引用により、本明細書に組み入れる)。

0134

追加の態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、6員環による5員フラノースの少なくとも1つの置換を有する。少なくとも1つの態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのシクロへキセン核酸(CeNA)を有する。これらは、相補的DNA又はRNAと安定な2本鎖を形成し、そしてオリゴヌクレオチドを核酸分解から保護する。
幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの三環DNA(tcDNA)を有する。追加の態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体は、2〜5のトリシクロ−DNAヌクレオチドのいずれかの末端に接する8〜14塩基PS−修飾デオキシヌクレオチド「ギャップ」を含むオリゴヌクレオチド(すなわち、tcDNAギャップマー)を有する。

0135

特定の態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート主鎖、及びヘテロ原子主鎖、例えば--CH2--NH--0--CH2--、--CH2--N(CH3)--0--CH2-(メチレン(メチルイミノ)又はMMI主鎖としても知られる)、--CH2--0--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及び--0--N(CH3)--CH2--CH2--並びにアミド主鎖を含む(例えば、米国特許第5,602,240号を参照のこと)。追加の態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデート主鎖構造を有する。更なる態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデートモルホリノ(すなわち、PMO)主鎖構造を有する(例えば、米国特許第5,034,506号を参照のこと、その内容を引用により本明細書に繰り入れる)。

0136

修飾されたヌクレオ塩基
本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドはまた、天然の又は合成された非修飾のヌクレオ塩基と比べて機能的に相互交換可能であるが、構造的に区別できる1又は複数のヌクレオ塩基修飾を含むことができる。

0137

用語「非修飾」又は「天然」ヌクレオチド塩基は、本明細書で使用される場合、プリン塩基であるアデニン(A)及びグアニン(G)、並びにピリミジン塩基であるチミン(T)、シトシン(C)及びウラシル(U)を含む。修飾されたヌクレオ塩基には、合成の及び天然のヌクレオ塩基、例えば5−メチルシトシン(5−me−C)が含まれる。幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの5'メチルシトシン又はC-5プロピンを含んで成る。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチド中の各シトシンはメチルシトシンである。

0138

修飾されたヌクレオ塩基はまた、複素環塩基成分と称され、そして他の合成の又は天然のヌクレオ塩基、例えばキサンチンヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2−プロピル及び他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミン及び2−チオシトシン、5−ハロウラシル及びシトシン、5−プロピニル(--CC--CH3)ウラシル及びシトシン、及びピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6−アゾ−ウラシル、シトシン及びチミン、5−ウラシル(シュードウシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシ及び他の8−置換アデニン及びグアニン、5−ハロ特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチル及び他の5−置換ウラシル及びシトシン、7−メチルグアニン及び7−メチルアデニン、2−F−アデニン、2−アミノ−アデニン、8−アザグアニン及び8−アザアデニン、3−デアザグアニン及び3−デアザアデニンが含まれる。

0139

本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる複素環塩基成分はまた、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環により置き換えられているもの、例えば7−デアザアデニン、7−デアザグアノシン、2−アミノピリジン及び2−ピリドンが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増強するために特に有用なヌクレオ塩基には、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン、並びにN-2, N-6及び0-6置換プリン、例えば2アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシル及び5−プロピニルシトシンが含まれる。

0140

本発明のオリゴヌクレオチドに任意に含まれる追加の修飾されたヌクレオ塩基には、三環ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン(phenoxazine cytidine)(lH-ピリミド[5,4-b][l,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)、フェノチアジンシチジン(phenothiazine cytidine)(lH-ピリミド[5,4-b][l,4]ベンゾチアジン-2(3H)-オン)、G−クランプス(G-clamps)、例えば置換されたフェノキサジンシチジン(例えば、9-(2-アミノエトキシ)-H-ピリミド[5,4- b][l,4]ベンゾキサジン-2(3H)-オン)、カルバゾールシチジン(2H-ピリミド[4,5-b]インドール-2-オン)、ピリドインドールシチジン(H-ピリド[3 ',2':4,5]ピロロ[2,3-d]ピリミジン-2-オン)、又はグアニジウムG−クランプス及び類似体が含まれるが、これらに限定されない。代表的なグアニジノ置換基は米国特許第6,593,466号に開示されており、その記載を引用により本明細書に組み入れる。代表的なアセタミド置換基は米国特許第6,147,200号に開示されており、その記載を引用により本明細書に組み入れる。

0141

本発明の複合体に含まれるオリゴヌクレオチドに包含される多くの修飾されたヌクレオ塩基及びそれらの合成方法は当業界において知られており、例えば、The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, 858-859頁, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990;Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 30:613; 81993);Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, 289-302頁;Crooke, S. Ted.,CRCPress, 1993;並びに米国特許第3,687,808号、第4,845,205号、第5,130,302号、第5,134,066号、第5,175,273号、第5,367,066号、第5,432,272号、第5,434,257号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第5,587,469号、第5,594,121号、第5,596,091号、第5,614,617号、第5,645,985号、第5,646,269号、第5,681,941号、第5,750,692号、第5,830,653号、第5,763,588号、第6,005,096号、第6,028,183号、第6,007,992号、米国特許公開第20030158403号に開示されている修飾されたヌクレオ塩基が含まれ、これらの開示のそれぞれを引用により本明細書に繰り入れる。

0142

キメラオリゴヌクレオチド
本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、1又は複数の修飾されたヌクレオシド間結合、修飾された糖成分、及び/又は修飾されたヌクレオ塩基を含む。幾つかの態様において、オリゴヌクレオチドはキメラオリゴヌクレオチド(例えば、キメラオリゴマー化合物)である。用語「キメラオリゴヌクレオチド」又は「キメラ」は、少なくとも2つの化学的に区別される領域(すなわち、オリゴヌクレオチドの長さに沿って配置された化学的に修飾されたサブユニットのモチーフのパターン及び方向)を含むオリゴヌクレオチドであり、当該領域のそれぞれは少なくとも1つのモノマーユニット、すなわち核酸をベースとするオリゴヌクレオチド化合物の場合はヌクレオチド又はヌクレオシドから作られている。キメラオリゴヌクレオチドはまた、例えばハイブリド(例えば、融合)及びギャップマー(gapmer)とも称されている。このようなキメラオリゴヌクレオチド構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第5,013,830号、第5,149,797号、第5,220,007号、第5,256,775号、第5,366,878号、第5,403,711号、第5,491,133号、第5,565,350号、第5,623,065号、第5,652,355号、第5,652,356号、及び第5,700,922号が含まれるが、これらに限定されない。これらのそれぞれを引用により本明細書に組み入れる。

0143

キメラアンチセンス化合物は典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞取込み、標的核酸に対する増加した結合親和性、及び/又は増加した阻害活性を付与するために修飾された少なくとも1つの領域を含む。例えば、ギャップマー(gapmer)は、3つの領域、すなわち2つの外部領域ウイング)に挟まれた中央領域(ギャップ)、に分けられるヌクレオシドの連続配列を含んで成るキメラオリゴマーである。ギャップマーデザインは、典型的には、RNaseHのための基質として機能する約5〜10の連続する2'−デオキシヌクレオチドの中央領域を含み、典型的には、2'修飾オリゴヌクレオチドの1又は2つの領域と接して(挟まれて)おり、当該2'修飾オリゴヌクレオチドの領域は、増強された標的RNA結合親和性を提供するが、標的RNA分子のRNAse H開裂を支持しない。

0144

したがって、キメラが使用される場合、例えば、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチドに比べて、基質領域を有するより短いオリゴヌクレオチドを用いて匹敵する結果を得ることがしばしば可能である。他のキメラオリゴヌクレオチドは、他の領域に比べて増加した又は低下した親和性の何れかを示す修飾されたヌクレオシドの領域を含む標的についてのオリゴヌクレオチドの長さにわたる変更された結合親和性を提供する領域に頼る。いわゆる、MOE−ギャップマーは、ウイング中に2'−MOE修飾を有し、しばしば完全なPS主鎖を含み、そしてしばしばすべてのシトシン上に5'MeC修飾を含む。

0145

或いは、RNAプロセシングの調節におけるように、RNAse H活性が好ましくない状況について、均一に修飾されたオリゴヌクレオチド、例えば各ヌクレオチド又はヌクレオシド位置におけるRNAse H活性を支持しない修飾されたオリゴヌクレオチドを用いるデザイン、を用いるのが好ましいであろう。本発明において用いる場合、「十分に修飾されたモチーフ」は、本質的に各ヌクレオシドが同じ修飾された糖成分を有するように修飾されている糖修飾ヌクレオシドの連続する配列を含むことを意味する。本発明の十分に修飾されたオリゴヌクレオチドについて好ましい糖修飾ヌクレオシドには、2'-フルオロ(2F)、2'-0(CH2)2OCH3(2'-MOE)、2'-OCH3(2'-0-メチル)、及び二環糖修飾ヌクレオシドが含まれるがこれらに限定されない。1つの観点において、3'及び5'−末端ヌクレオシドは修飾されないで残される。好ましい態様において、修飾されたヌクレオシドは、2-MOE、2'-F、2 -O-Me又は二環糖修飾ヌクレオシドである。

0146

本発明の組成物において使用されるオリゴヌクレオチドは、1又は複数の安定化基を有するように修飾され得る。幾つかの態様において、安定化基は、ヌクレアーゼ安定性のような性質を増強するためにオリゴヌクレオチドの1端又は両端に取付けられる。幾つかの態様において、安定化基はキャップ構造である。「キャップ構造又は末端キャップ成分」は、オリゴヌクレオチドの何れかの末端に導入されている化学的修飾を意味する(例えば、WO 97/26270を参照のこと、この記載を引用により、本明細書に組み入れる)。これらの末端修飾は、末端核酸分子を有するオリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ分解から保護し、そして/又は細胞におけるオリゴヌクレオチドの送達及び/又は局在化を助けるであろう。オリゴヌクレオチドは、5'−末端(5'−キャップ)、3'−末端(3'−キャップ)、又は5'−末端及び3'−末端の両方にキャップを含むことができる。2本鎖オリゴヌクレオチドの場合、キャップは、いずれかの鎖のいずれかの末端又は両端に存在することができる。キャップ構造は当業界において知られており、そして例えば、反転デオキシ塩基脱落キャップ(inverted deoxy abasiccap)を含む。更に、ヌクレアーゼ安定性を付与するためにオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンス)化合物の一端又は両端をキャップするために使用することができる3'及び5'−安定化基には、WO 03/004602に開示されているものが含まれ、その記載を、引用により本明細書に組み入れる。

0147

幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体に含まれるオリゴヌクレオチドの5'−キャップには、反転塩基脱落残基(inverted abasicresidue)(成分)である構造、4',5'-メチレンヌクレオチド;l-(β-D-エリスロフラノシル)ヌクレオチド、4-チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド;1,5-アンヒドロヘキシトールヌクレオチド;L-ヌクレオチド;α-ヌクレオチド;修飾された塩基ヌクレオチド;ホスホロジチオエート結合;スレオ-ペントフラノシルヌクレオチド;非環式3',4'-セコヌクレオチド;非環式3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド;非環式3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド;3-3'-反転ヌクレオチド成分;3'-3'-反転塩基脱落成分;3'-2'-反転ヌクレオチド成分;3-2'-反転塩基脱落成分;1,4-ブタンジオールホスフェート;3'-ホスホラミデート;へキシルホスフェート;アミノへキシルホスフェート;3'-ホスフェート;3'-ホスホロチオエート;ホスホロジチオエート;又は架橋若しくは非架橋メチルホスホネート成分(例えば、WO 97/26270を参照のこと、その記載を引用により本明細書に組み入れる)が含まれる。

0148

幾つかの態様において、本発明のHES−オリゴヌクレオチド複合体に含まれるオリゴヌクレオチドの5'−キャップには、例えば、4',5'-メチレンヌクレオチド;l-(β-D-エリスロフラノシル)ヌクレオチド;4'-チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド;5'-アミノ-アルキルホスフェート;l,3-ジアミノ-2-プロピルホスフェート、3-アミノプロピルホスフェート;6-アミノへキシルホスフェート;1,2-アミノドデシルホスフェート;ヒドロキシプロピルホスフェート;1,5-アンヒドロへキシトールヌクレオチド;L-ヌクレオチド;α-ヌクレオチド;修飾された塩基ヌクレオチド;ホスホロジチオエート;スレオ-ぺントフラノシルヌクレオチド;非環式3',4'-セコヌクレオチド;3,4-ジヒドロキシブチルヌクレオチド;3,5-ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、5'-5'-反転ヌクレオチド成分;5'-5'-反転塩基脱落成分;5'-ホスホロアミデート;5'-ホスホロチオエート;1,4-ブタンジオールホスフェート;5'-アミノ;架橋及び/又は非架橋5'-ホスホラミデート、ホスホロチオエート及び/又はホスホロジチオエート、架橋又は非架橋メチルホスホネート及び5'-メルカプト成分(更に、Beaucage et al, Tetrahedron 49: 1925 (1993)により開示されている安定化基を参照のこと、この記載を引用により、本明細書にくみ入れる)が含まれる。

0149

幾つかの態様において、本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、1又は複数のカチオンテイル(cationic tail)を含んで成る。更なる態様において、オリゴヌクレオチドは、1、2、3、4又はそれより多くの正に荷電したアミノ酸、例えばリジン又はアルギニンと接合している。特定の態様において、オリゴヌクレオチドはPNAであり、そして1又は複数のリジン又はアルギニンが当該分子のC−末端に接合している。更なる態様において、オリゴヌクレオチドはPNAであり、そして1〜4のリジン及び/又はアルギニンがPNA連結に接合している。

0150

1つの態様において、そのような修飾されたオリゴヌクレオチドは、従来的に、接合基を官能基、例えばヒドロキシル又はアミノ基に取付けることにより調製される。通常の接合基には、インターカレーター、レポーター分子ポリアミンポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、及びオリゴヌクレオチドの薬理動態特性又は薬力学特性を増強する基が含まれるが、これらに限定されない。典型的な接合基には、コレステロール、炭水化物ビオイン、フェナジンフォレートフェナンスリジン及びアンスラキノンが含まれる。代表的な接合基は、WO/1993/007883及び米国特許第6,287,860号に開示されており、これらを引用により本明細書に組み入れる。

0151

接合基は、オリゴヌクレオチドの種々の位置に、直接に又は任意の連結基を介して結合させることができる。用語「連結基」は、オリゴマー化合物への接合基の取付けを許容するすべての基を含むことが意図される。連結基は、化学的官能基、接合基、レポーター基及びその他のを、親化合物、例えばオリゴマー化合物の選択的部位に取付けるために有用な2価基である。一般に、2官能連結成分は、2個の官能基を有するヒドロカルビル成分を含んで成る。官能基の一方は、親分子又は注目の化合物に結合するために選択され、そして他方は本質的に任意に選択された基、例えば化学的官能基又は接合基に結合するために選択される。幾つかの態様において、リンカーは、鎖構造、又は反復基、例えばエチレングリコール又はアミノ酸ユニットのオリゴマーを含んで成る。2官能連結成分において日常的に使用される官能基の例には、求核性基と反応するための求電子剤、及び求電子性基と反応するための求核剤が含まれるが、これらに限定されない。

0152

幾つかの態様において、2官能連結成分は、アミノ、ヒドロキシ、カルボン酸、チオール、不飽和(例えば、二重結合又は三重結合)、などを含む。2官能連結成分の若干の非限定的な例には、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(ADO)、サクシンイミジル4-(N-稀イミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボキシレートSMCC)及び6-アミノヘキサン酸AHEX又はAHA)が含まれる。他の連結基には、置換されたC1-C10アルキル、置換された又は非置換のC2-C10アルケニル、又は置換された又は非置換のC2-C10アルキニルが含まれるがこれらに限定されず、ここで、好ましい置換基の非限定的なリストには、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジルフェニルニトロ、チオール、チオアルコキシハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルが含まれるが、これらに限定されない。更なる代表的な連結基は、例えば、WO 94/01550及びWO 94/01550に開示されている。

0153

上記のようなオリゴヌクレオチド接合体の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特特許第4,828,979号、第4,948,882号、第5,109,124号、第5,118,802号、第5,218,105号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,525,465号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717号、第5,580,731号、第5,580,731号、第5,591,584号、第5,512,439号、第5,578,718号、第4,587,044号、第4,605,735号、第4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第4,958,013号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,245,022号、第5,254,469号、第5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第5,317,098号、第5,371,241号、第5,391,723号、第5,416,203号、第5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第5,599,928号、第5,688,941号及び第6,1 14,513号、並びに米国出願公開第2012/0095075号、第2012/0101 148号及び第2012/0128760号が含まれるがこれらに限定されない。これらのそれぞれの全内容を、引用により、本明細書に組み入れる。

0154

追加の関連する態様において、本発明は、HES−オリゴヌクレオチド複合体及び/又はHES−オリゴヌクレオチド複合体を含みそして更に1又は複数の活性剤又は療法剤を含む医薬組成物を含む。1つの態様において、活性剤又は療法剤は核酸である。種々の態様において、核酸は、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、miRNA、抗−miRNA、ダイサー(dicer)基質、デコイ(decoy)、アプタマー(aptamer)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はリボザイム(ribozyme)である。

0155

オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチド及びホスホラミデートは、当業界においてよく確立されている方法により、合成及び/又は修飾することができる。修飾された及び非修飾のヌクレオシドのオリゴマー化は、適当であれば合成について、DNA−様化合物((Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press)及び/又はRNA−様化合物(例えば、Scaringe, Methods23:206-217(2001), 及びGait et al, Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al, Tetrahedron 57:5707-5713 (2001)について、文献の方法により行うことができる。(更に、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Beaucage, S. L. et al (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y., USA,を参照のこと、それらの記載を引用により本明細書に組み入れる。)

0156

オリゴヌクレオチドは好ましくは、適切に保護された試薬及び商業的に入手可能なオリゴヌクレオチド合成機を用いて化学的に合成される。本発明のオリゴヌクレオチドの製造において有用なオリゴヌクレオチド合成試薬の提供者には、Proligo(ハンブルグ、ドイツ)、Dharmacon Research(Lafayette, CO, 米国)、Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford,IL,米国)、Glen Research(Sterling, VA, 米国)、ChemGenes(Ashland, MA, 米国)、及びCruachem(Glasgow, 英国)が含まれるが、これらに限定されない。或いは、オリゴマーは種々のオリゴマーヌクレオチド合成会社、例えばDharmacon Research Inc.,(Lafayette, Colo.)、Qiagen(Germantown, MD)、Proligo 及びAmbionから購入することができる。

0157

或る態様において、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチドの調製は、DNAについて文献:Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Agrawal, Ed., Humana Press, 1993, RNA: Scaringe, Methods, 2001, 23, 206-217;Gait et al, Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Smith, Ed., 1998, 1-36;Gallo et al, Tetrahedron, 57:5707-5713 (2001)、の方法に従って行われる。固相合成のための追加の方法は、米国特許第4,415,732号、第4,458,066号、第4,500,707号、第4,668,777号、第4,725,677号、第4,973,679号、及び第5,132,418号、並びに再発行特許第34,069号に見出されよう。

0158

使用される特定のプロトコールに拘わらず、本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成のよく知られた技法をとおして従来通りにそして日常的に作ることができる。このような合成の装置は、例えば, Gene Forge(RedwoodCity, Calif.)を含めて、幾つかの売り手により販売されている。自動合成技法を含めて、適当な固相技法が、Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, New York, 1991に記載されている。上記に方法に加えて又はそれに代えて(液相合成を含めて)上記のような合成のための他の手段が当業界において知られている。

0159

二環糖修飾モノマー、アデニン、シトシン、グアニン、5−メチル−シトシン、チミン及びウラシルの合成及び調製、並びにそれらのオリゴマー化、及び核酸認識特性は記載されている(Koshkin et al , Tetrahedron, 54:3607-3630 (1998);WO 98/39352 及びWO 99/14226)、これのそれぞれの内容を引用により本明細書に繰り入れる)。他の二環糖修飾ヌクレオシド類似体、例えば4'-CH2--S-2'類似体もまた調製されている(Kumar et al, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2219-2222(1998))。核酸ポリメラーゼの基質としてのオリゴデオキシリボヌクレオチド2本鎖を含む他の二環糖類似体の調製も記載されており(WO 98-DK393 19980914)これらのそれぞれの内容を引用により本明細書に組み入れる。

0160

フルオロフォアをオリゴヌクレオチドに連結する技法、例えば本発明の方法に従って使用される技法は当業界においてよく知られており、そして本発明のHES−オリゴヌクレオチドを調製するために使用することができ、又は日常的に改変することができる。例えば、Connolly et al, Nucleic AcidsRes. 13:4485-4502 (1985);Dreyer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 86:9752-9756 (1989);Nelson et al, Nucleic Acids Res. 17:7187-7194 (1989);Sproat et al, Nucleic Acids Res. 15, 6181-6196 (1987)及びZuckerman et al, Nucleic Acids Res. 15:5305-5321 (1987)を参照のこと。これらのそれぞれの内容を引用により、本明細書に組み入れる。多くのフルオロフォアは通常、適当な反応性部位を有する。或いは、フルオロフォアを誘導体化して他の分子への連結のための反応性部位を提供することができる。第2の分子にカップリングするための官能基により誘導体化されたフルオロフォアは、種々の製造者から商業的に入手することができる。誘導体化は、フルオロフォア自体上の基の単純な置換によってもよく、又はリンカーとの接合によってもよい。

0161

フルオロフォアは、所望により、リンカーを介して、オリゴヌクレオチドの5'及び/又は3'末端主鎖ホスフェート及び/又は他の塩基に結合される。種々の適当なリンカーが当業界において知られており、そして/又は下に検討する。幾つかの態様において、リンカーは、柔軟な脂肪族リンカーである。追加の態様において、リンカーは、C1〜C30の線状又は分枝状の飽和又は不飽和の炭化水素鎖である。幾つかの態様において、リンカーは、C1〜C6の線状又は分枝状の飽和又は不飽和の炭化水素鎖である。追加の態様において、炭化水素鎖リンカーは、1又は複数のヘテロ原子、アリール、又は低級アルキル、ヒドロキシアルキル又はアルコキシにより置換される。

0162

幾つかの態様において、1又は複数の、フルオロフォアで修飾されたヌクレオシド、フルオロフォア及び糖/塩基/及び/又は連結で修飾されたヌクレオシド及び/又はデオキシヌクレオシドホスホラミデートを用いて、自動合成の間に、1又は複数のフルオロフォアがオリゴヌクレオチドに導入される。

0163

幾つかの態様においては、合成後標識化反応において、1又は複数のフルオロフォアがオリゴヌクレオチドに導入される。適切な合成後標識化反応は当業界において知られており、そして本発明のHES−オリゴヌクレオチドを合成するために日常的に使用し、又は改変することができる。幾つかの態様においては、合成後標識化反応において、1又は複数のフルオロフォアがオリゴヌクレオチドに導入され、この場合、合成されたオリゴヌクレオチド中のアミノ−又はチオール修飾されたヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドが、アミン−又はチオール−反応性フルオロフォア、例えばサクシンイミジルエステルフルオロフォアと反応する。

0164

更なる態様においては、1又は複数の同一のフルオロフォアが単一反応においてオリゴヌクレオチドに一体化され、当該単一反応は、色素の反応性形を、フルオロフォアと反応することができる所望の数の反応性基を含むオリゴヌクレオチドと、適当な緩衝液中で、オリゴヌクレオチドへのフルオロフォアの一体化を完成するのに十分な条件下で且つ時間にわたって、接触させることを含む。反応性基は、当業界で知られている標準的技法及び試薬を用いる合成の間に、日常的に、オリゴヌクレオチドに導入することができる。

0165

製剤
HES−オリゴヌクレオチドは、所望により、医薬組成物の調製のために適当な、医薬として許容される希釈剤又は担体、医薬として許容される活性な又は不活性な物質と混合される。したがって、本発明はまた、HES−オリゴヌクレオチド複合体を含む医薬組成物を包含する。医薬組成物の製剤化のための組成物及び方法は、投与の経路、疾患の程度、又は投与量を含むがこれらに限定されない基準の数に依存する。このような考慮は、当業界においてよく理解される。

0166

粘膜又は局所送達のためのHES−オリゴヌクレオチドの投与量は、典型的には、投与当たり約0.1μg〜50mgの範囲にわたり(例えば、AVI-4658(モルホリノ)の如きエキソキッピング薬の場合、試験投与量は30 mg/kg及び50 mg/kg wk IVの薬物の投与を含む)、用途に依存して、毎日毎週、又は毎月、及び任意の他の時間間隔である。しかしながら、投与は実質的により高い又はより低い範囲であることができる。適切な投与ハ範囲及び頻度の決定は、当業者の能力の範囲内である。所与の量の投与は、個々の投与量の形態で又は数回のより少ない投与単位の両方で行なうことができる。

0167

HES−オリゴヌクレオチド複合体を含んで成る医薬組成物は、任意の医薬として許容される塩、エステル、又はそのようなエステルの塩、あるいは任意の他のオリゴヌクレオチドであって、対象、例えばマウス、ラット、ラビット又はヒトに投与後に生物学的に活性な代謝物又はその残物を(直接的に又は間接的に)提供することができるものを含む。したがって、例えば、開示はまた、HES−オリゴヌクレオチド複合体の生理的に及び医薬として許容される塩(すなわち、親化合物の所望の生物活性を維持し、そしてそれに対して不所望の毒性効果を付与しない塩)、プロドラッグ、当該プロドラッグの生理的に及び医薬として許容される塩、及び他の生物同等物にも向けられる。

0168

適切な医薬として許容される塩には、
(a)カチオン類、例えばナトリウムカリウムアンモニウムマグネシウムカルシウムポリアミン類、例えばスペルミン及びスペルミジン、等と共に形成される塩類
(b)無機酸、例えば塩酸臭素水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、等と共に形成される酸付加塩類
(c)有機酸、例えば酢酸蓚酸酒石酸琥珀酸マレイン酸フマル酸グル混酸クエン酸リンゴ酸アスコルビン酸安息香酸タンニン酸パルミチン酸アルギン酸ポリグルタミン酸ナフタレンスルホン酸メタンスルホン酸p−トルエンスルホン酸ナフタレンジスルホン酸ポリガラクチュロン酸、等と共に形成される塩類;並びに
(d)元素アニオン、例えば塩素臭素及び沃素から形成される塩類;
が含まれるが、それらに限定されない。
プロドラッグには、例えば、オリゴヌクレオチドの一端又は両端に追加のヌクレオシドを導入したものであって、体内の内因性ヌクレアーゼにより開裂されて活性なオリゴヌクレオチドを形成するもの、が含まれる。

0169

幾つかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、WO 93/24510及びWO 94/26764に開示されている方法にしたがって、SATE [(S-アセチル-2-チオエチル)ホスフェート]誘導体として調製される。
本発明の文脈において、医薬として許容される希釈剤には、リン酸緩衝塩溶液(PBS)が含まれる。PBSは、乾燥した凍結乾燥型から製剤化される組成物中での使用に適する希釈剤である。幾つかの態様において、医薬として許容される希釈剤には注射用水(WFI)が含まれる。最初に食塩溶液中に調製された医薬組成物に由来する乾燥した粉末形(例えば、凍結乾燥されたもの)である場合、投与されるべきWFIの量は、最適には、前記当欠乾燥形が由来する溶液と同じ体積である。

0170

凍結乾燥形の医薬組成物が特に好ましい。何故なら、これ等の組成物は、例えば注射のために意図される水溶液中に製剤化された組成物に較べて、周囲温度においてより長い安定性を有し、そしてそれ故に、しばしば好ましい従来の医薬オリゴヌクレオチド組成物を基礎とする医薬に較べて、周囲温度より低いそして更にゼロより低い貯蔵温度を必要としないからである。
本発明の医薬組成物には、溶液及び製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、前形成された液体を含むがそれに限定されない種々の化合物から生成され得る。幾つかの態様において、組成物は乾燥粉末形(例えば凍結乾燥したもの)である。

0171

医薬組成物は、従来どおり単位投与形として提供することができ、そして医薬工業においてよく知られている従来法に従って調製することができる。このような技法は、活性成分医薬希釈剤又は担体と一緒にすることを含む。一般に、製剤は、活性成分を、液体担体若しくは最終的に分けられた固体担体又はその両方に均一に且つ直接に一緒にし、そして次に必要であれば製品成型することにより調製される。

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