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課題

費用効果がよく、迅速かつ簡便にできる核酸シークエンシングプラットフォームの提供。

解決手段

(a)固体支持体型の電荷センサテザー係留したポリメラーゼを準備するステップと、(b)ヌクレオチドの存在を電荷センサによって検出できるよう1つ又は複数のヌクレオチドを準備するステップと、及び(c)鋳型核酸に対して相補的新生ストランドへのヌクレオチドの組み込みを検出するステップと、を有する核酸シークエンシング(塩基配列決定)方法。

概要

背景

DNAシークエンシングのための現在市場入手可能なプラットフォームは比較的コス
トがかかる。これらプラットフォームの大部分は、いわゆる「シークエンシング・バイ
シンセシス」手法を使用するもので、これはすなわち、DNAポリマーを合成するととも
に、成長するポリマー構造に対する各モノマー(すなわち、ヌクレオチド)の付加を検出
するからである。鋳型DNAストランドが厳密に新たなDNAポリマーの合成を導くため
、合成中に成長するストランドに付加された一連ヌクレオチドモノマーから鋳型DNA
シークエンス塩基配列)を推測できる。反応をモニタリングするのに、比較的高額な
ハードウェア、例えば、レーザー検出光学系、及び複雑な流体送給システムを使用する
。現在最も成功している市販プラットフォームも、シークエンシング・バイ・シンセシス
手法を開始する前に、DNA鋳型を増幅するために高額な試薬及びハードウェアを必要と
している。これらプラットフォームの複雑さ及び出費が、DNAシークエンシング技術に
明らかな必要性がある幾つかの臨床的及び研究的環境における使用の妨げとなっていた。

概要

費用効果がよく、迅速かつ簡便にできる核酸シークエンシングのプラットフォームの提供。(a)固体支持体型の電荷センサテザー係留したポリメラーゼを準備するステップと、(b)ヌクレオチドの存在を電荷センサによって検出できるよう1つ又は複数のヌクレオチドを準備するステップと、及び(c)鋳型核酸に対して相補的新生ストランドへのヌクレオチドの組み込みを検出するステップと、を有する核酸シークエンシング(塩基配列決定)方法。

目的

本発明は、さらに、反応成分を電荷センサに付着させる方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

反応成分を電荷センサに付着させる方法において、(a)複数個の電荷センサであって、前記電荷センサのそれぞれが複数の反応成分を付着させる能力を有する、該複数個の電荷センサを備える固体支持体を準備するステップと、(b) 複数の特定タイプの反応成分であって、前記複数の特定タイプの前記反応成分のそれぞれが忌避部分に結合する、該複数の特定タイプの反応成分を含む流体を準備するステップと、並びに(c)以下の条件、すなわち、(i) 前記複数の特定タイプの反応成分が前記複数個の電荷センサに流体連通する、(ii)前記固体支持体における前記電荷センサの個数より多い数の前記特定タイプの反応成分が前記流体内に存在する、(iii) 前記流体から前記特定タイプの反応成分が前記電荷センサに付着する、及び(iv)前記反応成分のそれぞれに結合した前記忌避部分により、前記複数の反応成分における1つより多い数の反応成分が前記各電荷センサに付着するのを阻害するという条件下で、前記固体支持体に前記流体を接触させるステップと、を有する、方法。

請求項2

請求項1記載の方法において、前記反応成分のタイプは、核酸酵素とする、方法。

請求項3

請求項2記載の方法において、前記忌避部分は核酸を有するものとする、方法。

請求項4

請求項2記載の方法において、前記核酸酵素はポリメラーゼとする、方法。

請求項5

請求項2記載の方法において、前記忌避部分は、核酸ナノボールを有するものとする、方法。

請求項6

請求項2記載の方法において、前記反応成分は、少なくとも2つの異なるタイプのポリメラーゼを有するものとし、前記異なるタイプのポリメラーゼが、前記固体支持体の個別の電荷センサに付着する、方法。

請求項7

請求項6記載の方法において、前記異なるタイプのポリメラーゼは、同一タイプのヌクレオチド新生核酸ストランドに取り込むとき、前記電荷センサが検出可能な相互に区別できるシグナルを生成する、方法。

請求項8

請求項1記載の方法において、前記反応成分のタイプは、受容体リガンド、核酸、及び酵素からなるグループから選択されるものとする、方法。

請求項9

請求項1記載の方法において、前記忌避部分は、前記複数の反応成分のうち1つより多い数の反応成分が前記各電荷センサに付着するのを立体的に妨害する空間容積部を占める、方法。

請求項10

請求項1記載の方法において、前記忌避部分は、前記複数の反応成分のうち1つより多い数の反応成分が前記各電荷センサに付着するのを静電的に妨害する電荷極性を有する、方法。

請求項11

請求項1記載の方法において、前記各電荷センサは、前記特定タイプの反応成分のうち2つより多くの数の反応成分を付着する能力を有する、方法。

請求項12

請求項1記載の方法において、さらに、前記反応成分が前記電荷センサに付着した後に、結合した忌避部分を前記反応成分から除去するステップを有する、方法。

請求項13

請求項12記載の方法において、前記結合した忌避部分を前記反応成分から除去する前、かつ前記反応成分が前記電荷センサに付着した後に、前記流体を前記固体支持体から除去する、方法。

請求項14

請求項1記載の方法において、前記ステップ(c) の後に、少なくとも50%の前記電荷センサに、前記特定タイプの単一反応成分が付着する、方法。

請求項15

請求項1記載の方法において、前記特定タイプの反応成分は、電界印加することによって前記電荷センサに能動的に輸送される、方法。

請求項16

請求項1記載の方法において、前記特定タイプの反応成分は、導電性テザーの形成によって前記流体から前記電荷センサに付着する、方法。

請求項17

請求項16記載の方法において、前記導電性テザーは、ドープしたポリチオフェンポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)、ポリアセチレンポリピロールポリアニリンポリフルオレンポリフェニレン、ポリピレン、ポリアズレン、ポリナフタレンポリカルバゾールポリインドール、又はポリアゼピンを含む、方法。

請求項18

反応成分を電荷センサに付着させる方法において、(a)複数個の電荷センサであって、それぞれが複数の反応成分を付着させる能力を有する、該複数個の電荷センサを備える固体支持体を準備するステップと、(b) 複数の特定タイプの反応成分を含む流体を準備するステップと、(c)以下の条件、すなわち、(i) 前記複数の特定タイプの反応成分が前記複数個の電荷センサに流体連通する、(ii)前記固体支持体における前記電荷センサの個数より多い数の前記特定タイプの反応成分が前記流体内に存在する、及び(iii) 前記流体から前記特定タイプの反応成分が前記電荷センサに付着して、これにより、前記流体から前記特定タイプの複数反応成分が付着した修飾電荷センサを形成する、という条件下で、前記固体支持体に前記流体を接触させるステップと、並びに(d)前記各修飾電荷センサから1つ又はそれ以上の前記特定タイプの反応成分を除去して、前記特定タイプの単一反応成分が前記各修飾電荷センサに付着した状態にする除去ステップと、を有する、方法。

請求項19

請求項18記載の方法において、前記反応成分又は前記電荷センサは、開裂可能テザーの前駆体を有する、方法。

請求項20

請求項19記載の方法において、前記流体からの前記反応成分は、前記開裂可能テザーの形成によって前記電荷センサに付着する、方法。

請求項21

請求項20記載の方法において、前記除去ステップは、前記開裂可能テザーのサブセットを開裂させて、前記反応成分のサブセットを前記修飾電荷センサから分離するステップを含む、方法。

請求項22

請求項21記載の方法において、前記開裂可能テザーは、光化学的開裂、電気化学的開裂、電界、機械的撹拌化学的開裂、又は熱により開裂する、方法。

請求項23

請求項18記載の方法において、前記反応成分のタイプを核酸酵素とする、方法。

請求項24

請求項23に記載の方法において、前記核酸酵素を、ポリメラーゼとする、方法。

請求項25

請求項24に記載の方法において、前記反応成分は、少なくとも2つの異なるタイプのポリメラーゼを有するものとし、前記ステップ(d) の後に、前記異なるタイプのポリメラーゼが、前記固体支持体の電荷センサに付着し、また前記電荷センサ上に存在する、方法。

請求項26

請求項25に記載の方法において、前記異なるタイプのポリメラーゼは、同一タイプのヌクレオチドを新生核酸ストランドに取り込むとき、前記電荷センサが検出可能な相互に区別できるシグナルを生成する、方法。

請求項27

請求項18記載の方法において、前記反応成分のタイプは、受容体、リガンド、核酸、及び酵素からなるグループから選択されるものとする、方法。

請求項28

請求項18記載の方法において、前記各電荷センサは、前記反応成分のうち2つより多くの数の反応成分を付着する能力を有する、方法。

請求項29

請求項18記載の方法において、前記ステップ(d) の後に、少なくとも50%の前記電荷センサに、前記特定タイプの単一反応成分が付着する、方法。

請求項30

請求項18記載の方法において、前記特定タイプの反応成分は、電界を印加することによって前記電荷センサに能動的に輸送される、方法。

請求項31

請求項18記載の方法において、前記除去ステップは、前記1つ又はそれ以上の特定タイプの反応成分を前記各修飾電荷センサから分解して、前記特定タイプの単一反応成分が前記各修飾電荷センサに付着した状態にする分解ステップを含む、方法。

請求項32

請求項31記載の方法において、前記分解ステップの前に、保護部分が前記単一反応成分に結合し、前記保護部分は、前記特定タイプの単一反応成分が分解するのを抑制する、方法。

請求項33

請求項32記載の方法において、さらに、前記分解ステップの後に、前記保護部分を前記特定タイプの単一反応成分から除去するステップを有する、方法。

請求項34

請求項32記載の方法において、前記反応成分のタイプは核酸酵素とし、前記保護部分は核酸を有するものとする、方法。

請求項35

請求項18記載の方法において、前記ステップ(d) は、(i) 1つ又はそれ以上の前記特定タイプの反応成分を前記各修飾電荷センサから除去する除去ステップ、(ii)前記特定タイプの複数反応成分の存在から前記特定タイプの単一反応成分の存在を区別するよう前記電荷センサをモニタリングするステップ、及び(iii) 前記除去ステップを中止して、前記特定タイプの単一反応成分が前記各修飾電荷センサに付着した状態にするステップを含む、方法。

請求項36

請求項18記載の方法において、前記特定タイプの反応成分又は前記電荷センサは、導電性テザーの前駆体を有する、方法。

請求項37

請求項18記載の方法において、前記流体からの前記特定タイプの反応成分は、導電性テザーの形成によって前記電荷センサに付着する、方法。

請求項38

請求項36記載の方法において、前記導電性テザーは、ドープしたポリチオフェン、ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリアニリン、ポリフルオレン、ポリフェニレン、ポリピレン、ポリアズレン、ポリナフタレン、ポリカルバゾール、ポリインドール、又はポリアゼピンを含む、方法。

請求項39

核酸シークエンシング方法において、(a)固体支持体型の電荷センサにテザー係留したポリメラーゼを準備するステップと、(b) 1つ又は複数の標識付けしたヌクレオチドを準備して、標識が前記電荷センサ近傍にあるとき前記標識の存在を前記電荷センサによって検出できるようにするステップと、及び(c)前記電荷センサを用いて、鋳型核酸に対して相補的な新生ストランドへの前記標識付けしたヌクレオチドの取り込みを検出する検出ステップと、を有する、方法。

請求項40

請求項39記載の方法において、前記ポリメラーゼは、核酸を含むテザーにより前記固体支持体型の電荷センサにテザー係留する、方法。

請求項41

請求項39記載の方法において、前記標識付けしたヌクレオチドは、ヌクレオチドのα-、β-、又はγ-リン酸塩側の位置で標識付けする、方法。

請求項42

請求項39記載の方法において、前記標識は、オリゴヌクレオチドを含む、方法。

請求項43

請求項42記載の方法において、前記ポリメラーゼは、核酸を含むテザーにより前記固体支持体型の電荷センサにテザー係留し、また前記オリゴヌクレオチドは、不動化された核酸に対して交雑できるものとする、方法。

請求項44

請求項39記載の方法において、前記ポリメラーゼは、前記電荷センサに対して、10,9,8,7,6,5,4,3,2,1nmよりも短い近傍位置に保持される、方法。

請求項45

請求項39記載の方法において、前記標識を、取り込み後に前記ヌクレオチドから開裂する、方法。

請求項46

請求項45記載の方法において、前記標識を、前記ポリメラーゼによって開裂する、方法。

請求項47

請求項39記載の方法において、前記標識付けしたヌクレオチドの1つ又はそれ以上のタイプは、複数の異なるタイプの電荷標識を有する、方法。

請求項48

請求項47記載の方法において、前記1つ又はそれ以上の標識したヌクレオチドは、4タイプのヌクレオチドそれぞれに対して固有の電荷標識を有する、方法。

請求項49

請求項47記載の方法において、前記電荷標識は、負の電荷標識であるものとする、方法。

請求項50

請求項49記載の方法において、前記負の電荷標識は、リン酸基DMT、カルボキシル基アミノ酸、及び/又はFMOCのうち1つ又はそれ以上を含む、方法。

請求項51

請求項47記載の方法において、前記電荷標識は、正の電荷標識であるものとする、方法。

請求項52

請求項51記載の方法において、前記正の電荷標識は、アミノ酸又は第1級アミンを含む、方法。

請求項53

請求項39記載の方法において、前記1つ又はそれ以上の標識付けしたヌクレオチドは4つの異なる電荷標識を含むものとし、また前記標識付けしたヌクレオチドそれぞれは、同一の不動化されたテザー配列に対して交雑できるオリゴヌクレオチドを含むものとする、方法。

請求項54

請求項39〜53のうちいずれか一項記載の方法において、前記電荷センサは、捕捉オリゴヌクレオチド官能化し、また前記標識付けしたヌクレオチドは、1つ又はそれ以上の捕捉ヌクレオチドに対して交雑するオリゴヌクレオチド標識を含むものとする、方法。

請求項55

請求項39〜53のうちいずれか一項記載の方法において、前記電荷センサは、ナノワイヤFETを備える、方法。

請求項56

請求項55記載の方法において、前記電荷センサは、電荷センサのアレイの一部とする、方法。

請求項57

請求項55記載の方法において、前記ナノワイヤは、カーボンナノチューブを含む、方法。

請求項58

請求項39記載の方法において、前記検出ステップは、順次の複数の取り込み事象を検出するステップを含む、方法。

請求項59

請求項39記載の方法において、前記固体支持体は、ポリメラーゼにテザー係留した複数個の電荷センサを備え、前記ステップ(c) は、前記複数のポリメラーゼにおける各ポリメラーゼの位置で鋳型核酸に対して相補的な新生ストランドへの前記標識付けしたヌクレオチドの取り込みを検出するステップを含む、方法。

請求項60

請求項59記載の方法において、前記複数のポリメラーゼは、少なくとも2つの異なるタイプのポリメラーゼを含む、方法。

請求項61

請求項60記載の方法において、前記異なるタイプのポリメラーゼは、同一タイプのヌクレオチドを新生核酸ストランドに取り込むとき、前記電荷センサが検出可能な相互に区別できるシグナルを生成する、方法。

請求項62

請求項61記載の方法において、前記検出ステップは、前記相互に区別できるシグナルを区別し、またこれにより複数の核酸の配列を決定するステップを含む、方法。

請求項63

請求項59記載の方法において、少なくとも50%の前記電荷センサに、単一ポリメラーゼが付着する、方法。

請求項64

請求項39記載の方法において、前記ポリメラーゼは、導電性テザーにより前記固体支持体型の電荷センサにテザー係留する、方法。

請求項65

請求項59記載の方法において、導電性テザーは、ドープしたポリチオフェン、ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリアニリン、ポリフルオレン、ポリフェニレン、ポリピレン、ポリアズレン、ポリナフタレン、ポリカルバゾール、ポリインドール、又はポリアゼピンを含む、方法。

請求項66

核酸シークエンシング方法において、(a)固体支持体型の電荷センサにテザー係留したポリメラーゼを準備するステップと、(b) ポリメラーゼが1つ又はそれ以上のヌクレオチドタイプの付加を触媒して、核酸鋳型に相補的な核酸を形成する条件、及び1つ又はそれ以上の異なるヌクレオチドタイプの付加が、前記電荷センサによって検出される立体配座シグナル変化を前記ポリメラーゼから生成する条件の下で、前記ポリメラーゼを鋳型核酸及び1つ又はそれ以上の異なるヌクレオチドタイプに接触させるステップと、(c)前記電荷センサを用いて前記ポリメラーゼから前記シグナル変化を検出する検出ステップと、及び(d)前記1つ又はそれ以上の異なるヌクレオチドタイプの付加に関して前記シグナル変化の割合、極性、大きさ又は持続時間を決定し、これにより鋳型核酸のヌクレオチド配列を決定するステップと、を有する、方法。

請求項67

請求項66記載の方法において、前記1つ又はそれ以上の異なるヌクレオチドタイプは、少なくとも1つの非天然ヌクレオチド類似体を含む、方法。

請求項68

請求項67記載の方法において、前記立体配座のシグナル変化の割合、極性、大きさ又は持続時間は、異なるヌクレオチドタイプに関して互いに区別可能である、方法。

請求項69

請求項67記載の方法において、前記1つ又はそれ以上の異なるヌクレオチドタイプは、少なくとも4つの非天然ヌクレオチド類似体を含む、方法。

請求項70

請求項66記載の方法において、前記ポリメラーゼは、立体配座的に標識付けし、これにより前記電荷センサによって検出される少なくとも1つの非天然の標識部分を有する、方法。

請求項71

請求項70記載の方法において、前記標識部分は、負の電荷標識であるものとする、方法。

請求項72

請求項71記載の方法において、前記負の電荷標識は、リン酸基、DMT、アミノ酸、及び/又はFMOCのうち1つ又はそれ以上を含む、方法。

請求項73

請求項70記載の方法において、前記標識部分は、正の電荷標識であるものとする、方法。

請求項74

請求項73記載の方法において、前記正の電荷標識は、アミノ酸又は第1級アミンを含む、方法。

請求項75

請求項66記載の方法において、前記固体支持体は、ポリメラーゼにテザー係留した複数個の電荷センサを備え、前記ステップ(b) は、ポリメラーゼが少なくとも4つの異なるヌクレオチドタイプの順次の付加を触媒して、核酸鋳型に相補的な核酸を形成する条件の下で、前記ポリメラーゼを前記鋳型核酸及び前記少なくとも4つの異なるヌクレオチドタイプに接触させるステップを含み、前記ステップ(c) は、前記電荷センサを用いて前記ポリメラーゼから一連の前記シグナル変化を検出するステップを含み、また前記ステップ(d) は、前記鋳型核酸のヌクレオチド配列を決定するステップを含む、方法。

請求項76

請求項75記載の方法において、前記複数のポリメラーゼは、少なくとも2つの異なるタイプのポリメラーゼを含む、方法。

請求項77

請求項76記載の方法において、前記異なるタイプのポリメラーゼは、同一タイプのヌクレオチドを新生核酸ストランドに取り込むとき、前記電荷センサが検出可能な相互に区別できるシグナルを生成する、方法。

請求項78

請求項77記載の方法において、前記検出ステップは、前記相互に区別できるシグナルを区別し、またこれにより複数の核酸の配列を決定するステップを含む、方法。

請求項79

請求項75記載の方法において、少なくとも50%の前記電荷センサに、単一ポリメラーゼが付着する、方法。

請求項80

請求項66記載の方法において、前記ポリメラーゼは、導電性テザーにより前記固体支持体型の電荷センサにテザー係留する、方法。

請求項81

請求項80記載の方法において、前記導電性テザーは、ドープしたポリチオフェン、ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリアニリン、ポリフルオレン、ポリフェニレン、ポリピレン、ポリアズレン、ポリナフタレン、ポリカルバゾール、ポリインドール、又はポリアゼピンを含む、方法。

請求項82

請求項66〜81のうちいずれか一項記載の方法において、前記電荷センサは、ナノワイヤFETを備える、方法。

請求項83

核酸シークエンシング方法において、(a)固体支持体型の電荷センサにテザー係留したポリメラーゼを準備するステップと、(b)可逆的ターミネーター部分を有する1つ又は複数の標識付けしたヌクレオチドを準備して、標識が前記電荷センサ近傍にあるとき前記標識の存在を前記電荷センサによって検出できるようにするステップと、(c)前記電荷センサを用いて、鋳型核酸に対して相補的な新生ストランドへの前記1つ又は複数の標識付けしたヌクレオチドの取り込み、及びこれによる可逆的に終端した新生ストランドの形成を検出する検出ステップと、(d) 前記可逆的に終端した新生ストランドを修飾して、前記新生ストランドがヌクレオチドを一層取り込めるようにするステップと、及び(e)前記ステップ(b) 〜(d) を繰り返して前記鋳型核酸の配列を取得するステップと、を有する、方法。

請求項84

請求項83記載の方法において、単一ポリメラーゼを前記各電荷センサにテザー係留する、方法。

請求項85

請求項83記載の方法において、複数ポリメラーゼを前記各電荷センサにテザー係留する、方法。

請求項86

請求項85記載の方法において、前記検出ステップ前に、鋳型核酸には、各電荷センサの位置で、鋳型配列鎖状体的反復をコード化する核酸のサブユニットとして、複数のポリメラーゼを設ける、方法。

請求項87

請求項86記載の方法において、前記検出ステップ前に、前記鎖状体的反復をコード化する核酸を開裂して、それぞれが単一鋳型配列を含む個別の分子を形成する、方法。

請求項88

請求項86記載の方法において、前記鎖状体的反復をコード化する核酸は、ローリングサークル増幅によって生成される、方法。

請求項89

請求項83記載の方法において、前記ポリメラーゼは、核酸を含むテザーにより前記固体支持体型の電荷センサにテザー係留する、方法。

請求項90

請求項83記載の方法において、前記1つ又はそれ以上の標識付けしたヌクレオチドは、ヌクレオチドのγ-リン酸塩側の位置で標識付けする、方法。

請求項91

請求項83記載の方法において、前記標識は、オリゴヌクレオチドを含む、方法。

請求項92

請求項91記載の方法において、前記ポリメラーゼは、核酸を含むテザーにより前記固体支持体型の電荷センサにテザー係留し、また前記オリゴヌクレオチドは、不動化された核酸に対して交雑できるものとする、方法。

請求項93

請求項83記載の方法において、前記ポリメラーゼは、前記電荷センサに対して、10,9,8,7,6,5,4,3,2,1nmよりも短い近傍位置に保持される、方法。

請求項94

請求項83記載の方法において、前記標識を、取り込み後に前記ヌクレオチドから開裂する、方法。

請求項95

請求項94記載の方法において、前記標識を、前記ポリメラーゼによって開裂する、方法。

請求項96

請求項83記載の方法において、前記1つ又はそれ以上の標識付けしたヌクレオチドは、複数の異なるタイプの電荷標識を有する、方法。

請求項97

請求項96記載の方法において、前記1つ又はそれ以上の標識したヌクレオチドは、4タイプのヌクレオチドそれぞれに対して固有の電荷標識を有する、方法。

請求項98

請求項96記載の方法において、前記電荷標識は、負の電荷標識であるものとする、方法。

請求項99

請求項98記載の方法において、前記負の電荷標識は、リン酸基、DMT、アミノ酸、及び/又はFMOCのうち1つ又はそれ以上を含む、方法。

請求項100

請求項98記載の方法において、前記電荷標識は、正の電荷標識であるものとする、方法。

請求項101

請求項100記載の方法において、前記正の電荷標識は、第1級アミンを含む、方法。

請求項102

請求項83記載の方法において、前記1つ又はそれ以上の標識付けしたヌクレオチドは4つの異なる電荷標識を含むものとし、また前記標識付けしたヌクレオチドそれぞれは、同一の不動化されたテザー配列に対して交雑できるオリゴヌクレオチドを含むものとする、方法。

請求項103

請求項83〜102のうちいずれか一項記載の方法において、前記電荷センサは、捕捉オリゴヌクレオチドで官能化し、また前記標識付けしたヌクレオチドは、1つ又はそれ以上の捕捉ヌクレオチドに対して交雑するオリゴヌクレオチド標識を含むものとする、方法。

請求項104

請求項83〜102のうちいずれか一項記載の方法において、前記電荷センサは、ナノワイヤFETを備える、方法。

請求項105

請求項104記載の方法において、前記電荷センサは、電荷センサアレイの一部とする、方法。

請求項106

請求項104記載の方法において、前記ナノワイヤは、カーボンナノチューブを含む、方法。

請求項107

請求項83記載の方法において、前記検出ステップは、順次の複数の取り込み事象を検出するステップを含む、方法。

請求項108

請求項83記載の方法において、前記固体支持体は、ポリメラーゼにテザー係留した複数個の電荷センサを備え、前記ステップ(c) は、前記複数のポリメラーゼにおける各ポリメラーゼの位置で鋳型核酸に対して相補的な新生ストランドへの前記1つ又はそれ以上の標識付けしたヌクレオチドの取り込みを検出するステップを含む、方法。

請求項109

請求項108記載の方法において、前記複数のポリメラーゼは、少なくとも2つの異なるタイプのポリメラーゼを含む、方法。

請求項110

請求項109記載の方法において、前記異なるタイプのポリメラーゼは、同一タイプのヌクレオチドを新生核酸ストランドに取り込むとき、前記電荷センサが検出可能な相互に区別できるシグナルを生成する、方法。

請求項111

請求項110記載の方法において、前記検出ステップは、前記相互に区別できるシグナルを区別し、またこれにより複数の核酸の配列を決定するステップを含む、方法。

請求項112

請求項108記載の方法において、少なくとも50%の前記電荷センサに、単一ポリメラーゼが付着する、方法。

請求項113

請求項83記載の方法において、前記ポリメラーゼは、導電性テザーにより前記固体支持体型の電荷センサにテザー係留する、方法。

請求項114

請求項113記載の方法において、前記導電性テザーは、ポリチオフェン、又はポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)を含む、方法。

請求項115

請求項39〜114のうちいずれか一項記載の方法において、前記ポリメラーゼは、3′→5′エキソヌクレアーゼ機能がないものとする、方法。

請求項116

請求項115記載の方法において、前記ポリメラーゼは、3′−5′ドメインがないものとする、方法。

請求項117

請求項116記載の方法において、前記ポリメラーゼは、BsuDNAポリメラーゼIにおける大きな断片を有する、方法。

請求項118

請求項117記載の方法において、前記BsuDNAポリメラーゼIにおける大きな断片を修飾し、クレノウ断片のO螺旋フィンガ領域からの残基を含むものとする、方法。

請求項119

請求項39〜114のうちいずれか一項記載の方法において、前記固体支持体型の電荷センサは、長さに沿って均一な幅を有する、方法。

請求項120

請求項39〜114のうちいずれか一項記載の方法において、前記固体支持体型の電荷センサは、長さに沿って可変の幅を有する、方法。

請求項121

請求項39〜114のうちいずれか一項記載の方法において、前記固体支持体型の電荷センサは第1の幅を有し、前記第1の幅内にそれより実質的に狭い幅の領域を有する、方法。

請求項122

請求項121記載の方法において、前記実質的に狭い幅の領域は、第1の幅の直径の50%又はそれよい多い直径を有する、方法。

請求項123

請求項121記載の方法において、前記ポリメラーゼを、前記実質的に狭い幅の領域に付着することで前記固体支持体型の電荷センサにテザー係留する、方法。

請求項124

請求項39〜114のうちいずれか一項記載の方法において、前記ポリメラーゼは、天然リボヌクレオチド又は天然リボヌクレオチド類似体を含むテザーにより前記固体支持体型の電荷センサにテザー係留する、方法。

請求項125

請求項124記載の方法において、前記標識は、天然リボヌクレオチド又は天然リボヌクレオチド類似体を含む、方法。

請求項126

請求項125記載の方法において、前記標識の天然リボヌクレオチド又は天然リボヌクレオチド類似体は、前記テザーの天然リボヌクレオチド又は天然リボヌクレオチド類似体に対して交雑する、方法。

請求項127

請求項124記載の方法において、前記標識は、天然デオキシリボヌクレオチド又は天然デオキシリボヌクレオチド類似体を含む、方法。

請求項128

請求項127記載の方法において、前記標識の天然デオキシリボヌクレオチド又は天然デオキシリボヌクレオチド類似体は、前記テザーの天然リボヌクレオチド又は天然リボヌクレオチド類似体に対して交雑する、方法。

請求項129

請求項39〜114のうちいずれか一項記載の方法において、前記ポリメラーゼは、天然デオキシリボヌクレオチド又は天然デオキシリボヌクレオチド類似体を含むテザーにより前記固体支持体型の電荷センサにテザー係留する、方法。

請求項130

請求項129記載の方法において、前記標識は、天然リボヌクレオチド又は天然リボヌクレオチド類似体を含む、方法。

請求項131

請求項130記載の方法において、前記標識の天然リボヌクレオチド又は天然リボヌクレオチド類似体は、前記テザーの天然デオキシリボヌクレオチド又は天然デオキシリボヌクレオチド類似体に対して交雑する、方法。

技術分野

0001

この出願は、2015年6月5日に出願された米国特許仮出願第62/171,523号、2015年5月14
日に出願された米国特許仮出願第62/161,709号、2014年10月27日に出願された米国特許仮
出願第62/069,198号及び2014年7月15日に出願された米国特許仮出願第62/024,856号に基
づいて優先権を主張し、それぞれの出願の内容を参照により本明細書に援用するものとす
る。

0002

本発明は、バイオセンサに基づく検出、及びより具体的には、核酸シークエンシング
塩基配列決定)に使用できるバイオセンサに関する。

背景技術

0003

DNAシークエンシングのための現在市場入手可能なプラットフォームは比較的コス
トがかかる。これらプラットフォームの大部分は、いわゆる「シークエンシング・バイ
シンセシス」手法を使用するもので、これはすなわち、DNAポリマーを合成するととも
に、成長するポリマー構造に対する各モノマー(すなわち、ヌクレオチド)の付加を検出
するからである。鋳型DNAストランドが厳密に新たなDNAポリマーの合成を導くため
、合成中に成長するストランドに付加された一連ヌクレオチドモノマーから鋳型DNA
シークエンス塩基配列)を推測できる。反応をモニタリングするのに、比較的高額な
ハードウェア、例えば、レーザー検出光学系、及び複雑な流体送給システムを使用する
。現在最も成功している市販プラットフォームも、シークエンシング・バイ・シンセシス
手法を開始する前に、DNA鋳型を増幅するために高額な試薬及びハードウェアを必要と
している。これらプラットフォームの複雑さ及び出費が、DNAシークエンシング技術に
明らかな必要性がある幾つかの臨床的及び研究的環境における使用の妨げとなっていた。

発明が解決しようとする課題

0004

したがって、核酸シークエンシングのプラットフォームを改善して、より一層費用効果
がよく、迅速かつ簡便にできるようにする必要性がある。本発明はこの必要性に対処し、
また他の利点をも生ずる。

課題を解決するための手段

0005

本発明は、第1の核酸シークエンシング方法を提供する。この方法は、(a)固体支持体
型の電荷センサテザー係留したポリメラーゼを準備するステップと、(b) 1つ又は複数
の標識(ラベル)付けしたヌクレオチドを準備して、標識が電荷センサ近傍にあるとき標
識の存在を電荷センサによって検出できるようにするステップと、及び(c)鋳型核酸に対
して相補的新生ストランドへの標識付けしたヌクレオチドの組み込みを検出するステッ
プと、を有することができる。

0006

本発明は、さらに、反応成分を電荷センサに付着させる方法を提供する。この方法は、
(a)複数個の電荷センサであって、それぞれが複数の反応成分を付着させる能力を有する
、該複数個の電荷センサを備える固体支持体を準備するステップと、(b) 複数の特定タイ
プの反応成分を含む流体を準備するステップと、並びに(c) 以下の条件、すなわち、(i)
前記複数の特定タイプの反応成分が前記複数個の電荷センサに流体連通する、(ii) 前記
固体支持体における前記電荷センサの個数より多い数の前記特定タイプの反応成分が前記
流体内に存在する、及び(iii) 固体支持体において、各電荷センサに単一反応成分が付着
する結果となる状態で、前記流体から前記特定タイプの反応成分が前記電荷センサに付着
する、という条件下で、前記固体支持体に前記流体を接触させるステップと、を有する。

0007

幾つかの実施形態において、反応成分を電荷センサに付着させる方法は、(a)複数個の
電荷センサであって、それぞれが複数の反応成分を付着させる能力を有する、該複数個の
電荷センサを備える固体支持体を準備するステップと、(b) 複数の特定タイプの反応成分
であって、それぞれが忌避部分に結合する、該複数の特定タイプの反応成分を含む流体を
準備するステップと、並びに(c)以下の条件、すなわち、(i)前記複数の特定タイプの反応
成分が前記複数個の電荷センサに流体連通する、(ii)前記固体支持体における前記電荷
ンサの個数より多い数の前記特定タイプの反応成分が前記流体内に存在する、(iii)前記
流体から前記特定タイプの反応成分が前記電荷センサに付着する、及び(iv)前記反応成分
のそれぞれに結合した前記忌避部分により、前記複数の反応成分における1つより多い数
の反応成分が前記各電荷センサに付着するのを阻害するという条件下で、前記固体支持体
に前記流体を接触させるステップと、を有することができる。

0008

反応成分を電荷センサに付着させる方法は、(a)複数個の電荷センサであって、それぞ
れが複数の反応成分を付着させる能力を有する、該複数個の電荷センサを備える固体支持
体を準備するステップと、(b) 複数の特定タイプの反応成分を含む流体を準備するステッ
プと、(c) 以下の条件、すなわち、(i)前記複数の特定タイプの反応成分が前記複数個の
電荷センサに流体連通する、(ii)前記固体支持体における前記電荷センサの個数より多い
数の前記特定タイプの反応成分が前記流体内に存在する、及び(iii)前記流体から前記特
定タイプの反応成分が前記電荷センサに付着して、これにより、前記流体から複数反応成
分が付着した変容電荷センサを形成する、という条件下で、前記固体支持体に前記流体を
接触させるステップと、並びに(d)前記各変容電荷センサから1つ又はそれ以上の前記特
定タイプの反応成分を除去して、前記特定タイプの単一反応成分が前記各変容電荷センサ
に付着した状態にする除去ステップと、を有することができる。

0009

本発明は、核酸シークエンシング方法を提供する。この方法は、(a)固体支持体型の電
荷センサにテザー係留したヌクレオチド結合タンパク質(例えば、ポリメラーゼ)を準備
するステップと、(b) 1つ又は複数の標識付けしたヌクレオチドを準備して、標識が前記
電荷センサ近傍にあるとき前記標識の存在を前記電荷センサによって検出できるようにす
るステップと、及び(c)前記電荷センサを用いて、前記タンパク質への前記標識付けした
ヌクレオチドの結合を検出する検出ステップと、を有することができる。

0010

特別な実施形態において、核酸シークエンシング方法は、(a)固体支持体型の電荷セン
サにテザー係留したポリメラーゼを準備するステップと、(b) 1つ又は複数の標識付けし
たヌクレオチドを準備して、標識が前記電荷センサ近傍にあるとき前記標識の存在を前記
電荷センサによって検出できるようにするステップと、及び(c)前記電荷センサを用いて
、鋳型核酸に対して相補的な新生ストランドへの前記標識付けしたヌクレオチドの取り込
みを検出する検出ステップと、によって実施することができる。

0011

本発明により提供される核酸シークエンシング方法は、(a)固体支持体型の電荷センサ
にテザー係留したポリメラーゼを準備するステップと、(b)可逆的ターミネーター部分を
有する1つ又は複数の標識付けしたヌクレオチドを準備して、標識が前記電荷センサ近傍
にあるとき前記標識の存在を前記電荷センサによって検出できるようにするステップと、
(c)前記電荷センサを用いて、鋳型核酸に対して相補的な新生ストランドへの前記1つ又
は複数の標識付けしたヌクレオチドの取り込み、及びこれによる可逆的に終端した新生ス
トランドの形成を検出する検出ステップと、(d) 前記可逆的に終端した新生ストランドを
変容させて、前記新生ストランドがヌクレオチドを一層取り込めるようにするステップと
、及び(e) 前記ステップ(b) 〜(d) を繰り返して前記鋳型核酸の配列を取得するステップ
と、を有することができる。

0012

さらに、核酸シークエンシング方法を提供し、この方法は、(a)固体支持体型の電荷セ
ンサにテザー係留したポリメラーゼを準備するステップと、(b) ポリメラーゼが1つ又は
それ以上のヌクレオチドタイプの付加を触媒して、核酸鋳型に相補的な核酸を形成する条
件、及び1つ又はそれ以上の異なるヌクレオチドタイプが、前記電荷センサによって検出
される立体配座シグナル変化を前記ポリメラーゼから生成する条件の下で、前記ポリ
ラーゼを鋳型核酸及び1つ又はそれ以上の異なるヌクレオチドタイプに接触させるステッ
プと、(c)前記電荷センサを用いて前記ポリメラーゼから前記シグナル変化を検出するス
テップと、及び(d)前記1つ又はそれ以上の異なるヌクレオチドタイプの付加に関して前
記シグナル変化の割合、極性、大きさ又は持続時間を決定し、これにより鋳型核酸のヌク
レオチド配列を決定するステップと、を有する。

図面の簡単な説明

0013

テザー(係留紐状体)によって電荷センサに付着させたポリメラーゼを示す。
核酸テザーにより電荷センサに付着させ、かつ電荷に基づいて又はセンサ近接することに基づいて区別できるヌクレオチドに結合したポリメラーゼを示す。
核酸テザーにより電荷センサに付着させ、かつ電荷に基づいて区別できるヌクレオチドに結合したポリメラーゼを示す。
電荷センサに係留させたポリメラーゼを示し、この場合、電荷センサがヌクレオチドにおける標識に結合可能な複数のオリゴヌクレオチドにも付着する状態を示す。
標識のオリゴヌクレオチド部分の端部における2個の負に帯電した酸素を有するヌクレオチド標識を示す。
電荷センサを用いて検出できる電荷タグを示す。
クレノウ断片(PolIxx0)及びBsu-LF(Bsuxxx1)の整列したシークエンスを示し、この場合、クレノウ断片のO-螺旋フィンガ領域の位置及びBsu-LFにおける整列した位置をボックス表示する。さらに、右側の挿入図にはクレノウ断片のO−螺旋フィンガにおける数個の残基の3次元的位置ナノチューブモデル並置させた状態のモデルを示す。
挟縮領域を有する電荷センサ及び挟縮領域で電荷センサにテザー係留したポリメラーゼを示す。ポリメラーゼは核酸の鋳型ストランド及び新生ストランドと錯体を形成する。
局所酸化を用いてシリコンに挟縮部を導入する方法を提示する図表を示す。
核酸シークエンス(10個のNのシークエンスとして包括的に表現した)を有するテザーによりポリメラーゼ(Pol)に付着した電荷センサを示す。ポリメラーゼは、標的核酸及び4つの異なるヌクレオチド(それぞれはATP,GTP, CTP及びTTP)に関連付けられる標識用の結合部位と錯体を形成する。
核酸シークエンス(10個のNのシークエンスとして包括的に表現した)を有するテザーによりポリメラーゼ(Pol)に付着した電荷センサを示す。ポリメラーゼは、標的核酸及び標識付けしたCTP類似体アナログ)と錯体を形成する。CTPアナログにおける標識は、イノシン(I)及びテザーにおける相補的領域(ABC)と交雑する特異性領域(A′B′C′)を有する核酸領域を含む。
4つの異なるヌクレオチド類似体の結合によって電荷センサに対する4つの異なる位置状態におけるテザー係留したポリメラーゼを示す。各ヌクレオチド類似体は、他の3つのヌクレオチド類似体と同一長さのオリゴヌクレオチド部分を有するが、各ヌクレオチド類似体は、他のヌクレオチド類似体が結合する領域に比較するとテザーの異なる領域に結合する特異結合シークエンス(配列)を有する。

実施例

0014

本発明の実施形態は、概して、核酸シークエンシング手順で検出されるヌクレオチド取
込み事象のような用途に有用な単独分子検出のための装置、組成物及び方法に関する。高
処理能力で長いシークエンシング読取りを行う改良した検出システムに対する要望があ
る。本明細書に記載する本発明の実施形態はこの要望を満たし、また他の利点も生ずる。

0015

相補的金属酸化物半導体(CMOS)に基づく感知スキームが核酸シークエンシングに
用いられてきた。現行のCMOSに基づく感知スキームは、SBS反応で生ずるDNA重
合化の副生成物(例えば、陽子又はピロリン酸塩のいずれか)の電気化学的検出活用
る。これら方法は、光が要らずまた標識無しでよいという利点がある。光が要らないこと
は、反応には検出用の高額な光学系が不要となる。標識無しでよい試薬を使用するとき、
一般的に試薬を調合するコスト及び複雑さが削減される。しかし、現行のCMOSに基づ
く感知スキームにおける欠点は、検出すべき反応副生成物移動性を有して、自然と反応
ゾーンから拡散しがちであり、この結果、多重化シークエンシング反応を試行するとき、
隣接部位間でのクロストークを生ずるおそれがある。多くのゲノムの大きなサイズ及び典
型的シークエンシング反応の限定された読取り長さを考慮すると、シークエンシング技術
における研究及び臨床的用途のための所望被度カバレージ)レベルを得るのに極めて重
要である。

0016

本発明は、概して核酸シークエンシング用に、並びに核酸検出及び他の解析用に使用で
きる独特な検出モダリティを提供する。例示的実施形態を図1に示す。簡単に言うと、ポ
メラーゼ1は、テザー(係留紐状体)3により、シリコンナノワイヤ製の電界効果トラ
ンジスタFET)2におけるゲート5に対して不動化する。随意的に、ナノワイヤはシ
リコン以外の材料により形成できる、又はナノワイヤをナノチューブに代えることができ
る。随意的に、テザー3は導電性ポリマーストランドとすることができ、このことは、テ
ザーのポリメラーゼ近傍端部における正電荷6、及びテザーのポリメラーゼから遠位であ
り、ゲート5に付着させた端部における負電荷7によって示す。シークエンシングすべき
ssDNA4は、ヌクレオチド及び他の試薬とともに、溶液内に導入した後に、ポリメラ
ゼ1に結合される。相補的ストランドが合成されるとき、FET2の近傍の電荷分布に乱
れを生じ、この乱れは、ポリメラーゼ1の立体配座変化の結果として、又はFET2の近
傍における電気的活性を有するタグで変更された可能性のあるヌクレオチドの存在に起因
して生ずる。電荷分布におけるそれらの変更をナノワイヤFET2によって感知し、また
FET相互コンダクタンス電流変調として検出する。

0017

本明細書に記載したFETに基づく装置及び方法の幾つかの利点としては、(1) 単独分
感受性が適正スケールのFETにより得ることができる点、(2) 検出される電荷分布が
ポリメラーゼの近傍に限局し、したがって、隣接FET間でのクロストークが回避される
ことにより高度な並列化(いわゆる多重化可能性)が容易となる点、(3)導電性テザーの
随意的な使用により電荷分布をゲートに伝送するのを支援し、また生体液からの望ましく
ないスクリーニング効果を最小限にする点、及び(4)シリコン製のナノワイヤFETは、
半導体製造設備互換性のあるプロセスを用いて都合よく製造できる点がある。

0018

本明細書に使用する用語は、他に明記しない限り通常の意味でとるものと理解されたい
。本明細書で使用する用語の数種類の例及びそれらの定義を以下に述べる。

0019

本明細書で使用する用語「アレイ」は、1つ又は複数の固相基板に付着される電荷セン
サ又は分子の集合体に言及するもので、電荷センサ又は分子は、それらの相対的場所にし
たがってそれぞれが互いに区別できるものとする。アレイは、固相基板上の異なるアド
ス指定可能な場所にそれぞれが位置する互いに異なる分子を含むことができる。それに代
えて、アレイは、それぞれが異なる分子を支持する個別の固相基板を含むことができ、こ
の場合、異なるプローブ分子は、固相基板が付着する表面上における固相基板の場所に従
って、又は流体流のような液体内の固相基板の場所に従って、識別することができるもの
とする。アレイにおける分子は、核酸プライマー核酸プローブ、核酸鋳型、又はポリメ
ラーゼ及びエキソヌクレアーゼのような核酸酵素とすることができる。

0020

本明細書で使用する用語「付着した(attached)」は、互いに接合、固着、接着、連結
又は結合している2つの物の状態に言及するものである。例えば、ポリメラーゼのような
反応成分は、電荷センサのような固相成分に対して共有結合性又は非共有結合性の結合に
よって付着することができる。共有結合原子間で電子対共有することに特徴がある。
非共有結合は、電子対の共有を伴わない化学的結合であって、また例えば、水素結合、イ
オン結合、ファン・デル・ワールス力親水性相互作用、及び疎水性相互作用がある。

0021

本明細書で使用する用語「電荷センサ」は、その表面での又は包囲する電界内における
摂動電気信号に変換する検出デバイスを意味することを意図する。例えば、電荷センサ
は、反応成分の到来又は退去を電気信号に変換することができる。電荷センサは、さらに
、2つの反応成分間の相互反応、又は単一反応成分における配座変化を電気信号に変換す
ることもできる。典型的な電荷センサとしては、電界効果トランジスタ(FET)、例え
ば、カーボンナノチューブ(CNT)、単一壁カーボンナノチューブ(SWNT)に基づ
くFET、シリコンナノワイヤ(SiNW)に基づくFET、グラフェンナノリボンに基
づくFET(及びMoS2、シリセン等のような2次元材料から作製した関連のナノリボ
ンFET)、トンネルFET(TFET)、及び急峻閾値下勾配デバイス(例えば、Swam
inathan et al., Proceedings of the 51st Annual Design Automation Conference on D
esign Automation Conference, pg 1-6, ISBN: 978-1-4503-2730-5 (2014)、及びIonescu
et al., Nature 479, 329-337 (2011)参照)がある。本発明による方法及び装置に使用
することができるFETセンサ及びSWNTセンサの例としては、米国特許出願公開第2
013/0078622号に記載されているものがあり、この文献は、参照によって本明
細書に組み入れられるものとする。

0022

本明細書で使用する用語「開裂可能テザー(cleavable tether)」は、化学的又は物理
的処理によって選択的に破壊できる結合を有する化学的リンカー結合体)を意味するこ
とを意図する。概して、この結合破壊は、化学的又は物理的処理に対して選択的であり、
存在する他の反応成分に大きな悪影響を及ぼさない。開裂可能テザーは、限定しないが、
光、塩基、酸、熱、酵素及び化学試薬のような、作用物質で選択的結合破壊を受け易い。
電界及び物理的アジテーションも使用してテザーを開裂することができる。好適な実施形
態において、このリンカーはヌクレオチドリンカーである。幾つかの事例において、この
リンカーは、配列特異的制限エンドヌクレアーゼによる開裂部位を有する。しかし、配列
特異的開裂部位は、本明細書に記載の方法に従って使用される幾つかのリンカーには存在
する必要はない。

0023

本明細書で使用する用語「鎖状体的反復(concatameric repeat)」は、単一核酸分子
における特定ヌクレオチド配列の連続的に反復する列(ストリング)を意味することを意
図している。鎖状体的反復は、例えば、ローリングサークル増幅(RCA:rolling ci
rcle amplification)によって生ずることができ、これにより反復されるヌクレオチド配
列は、RCAによって複製される鋳型の相補体となる。

0024

本明細書で使用する用語「導電性テザー」は、電気導通できる化学的リンカーを意味
することを意図し、これにより電界の電気的効果を伝送することができる。導電性テザー
を使用して、反応成分を電荷センサに化学的に結合し、また反応成分と電荷センサとの間
で電気を導通させることができる。典型的な導電性テザーとしては、限定しないが、ドー
プしたポリチオフェン、ポリ(3,4-エチレンジオキシチオフェン)、ポリアセチレン、ポ
ピロールポリアニリンポリフルオレンポリフェニレン、ポリピレン、ポリアズレ
ン、ポリナフタレンポリカルバゾールポリインドール、又はポリアゼピンの構造があ
る。導電性テザーとして有用なリンカーは、米国特許出願公開第2010/007384
7号にも記載されており、この文献は、参照によって本明細書に組み入れられるものとす
る。

0025

本明細書で使用する用語「(立体)配座シグナル変化」は、分子の一部における構造、
形状、又は構成の変化に応じて分子からの検出可能なシグナル発現消失、又は変更を
意味する。例えば、このシグナル変化は、分子の第1部分と相互作用する分子の第1部分
に対する標識の相互作用における変化に起因することがあり得る。この用語は、特別に述
べられるとき、分子と特異的に結合する反応物質に対する標識の相互作用における変化に
起因して、又は分子の触媒活性から生ずる生成物に対する標識の相互作用における変化に
起因して、分子の標識から生ずるシグナル変化から区別することを意図する。

0026

本明細書に使用する用語「(立体)配座的に標識付けした」は、分子につき使用される
とき、分子構造の変化、分子形状の変化、又は分子の一部における構成の変化に応答する
少なくとも1つの標識を有することを意味する。分子は、例えば、ポリメラーゼ、逆転写
酵素、エキソヌクレアーゼ、又は以下に説明するような他の核酸酵素とすることができる
。分子の一部は、例えば、分子構造内における原子間に生ずる1つ又は複数の化学的結合
周りの回転に起因して相対位置が変化する原子とすることができる。分子の一部は、当
業界で一般的に知られているような巨大分子の領域とすることができる。例えば、ポリメ
ラーゼは、フィンガ(指)領域、パーム)領域、及びサム親指)領域と称される領
域を含んでいる。タンパク質の場合、その一部は、第2級、第3級又は第4級の構造領域
とすることができる。標識は、例えば、共有結合によって分子に付着させることができる
。しかし、標識は、分子に付着させる必要はなく、例えば、分子の近傍に位置させるだけ
でもよい。特別な実施形態において、標識は、ヌクレオチド又は核酸のような分子の反応
物質又は生成物に付着させない。

0027

本明細書で使用する用語「異なる(different)」は、核酸につき使用するときには、
核酸が互いに同一でないヌクレオチド配列を有することを意味する。2つ又は複数の異な
る核酸は、それらの全長に沿って異なるヌクレオチド配列を有することができる。それに
代えて、2つ又は複数の異なる核酸は、それらの長さの大部分に沿って異なるヌクレオ
ド配列を有することができる。例えば、2つ又は複数の異なる核酸は、2つ又は複数の分
子にとって互いに異なる標的ヌクレオチド配列を有するとともに、2つ又は複数の分子に
とって互いに同一の普遍的配列部分を有することができる。用語「異なる」は、ポリメラ
ーゼ及び核酸酵素のような他の分子にも同様に適用することができる。

0028

本明細書で使用する用語「各(each)」は、事項の集合につき使用するときには、集合
における個別事項を識別することを意図するが、必ずしも集合におけるすべての事項につ
いて言及するものではない。例外は、明確な記述又は文脈がそうでないと明言する場合に
起こる。

0029

本明細書で使用する用語「流体連通(fluidic communication)」は、流体内の分子及
び流体に接触する部位につき使用するときには、流体に接触するよう、又は部位に進入
るよう流体内で移動できる分子の能力に言及する。この用語はさらに、部位から分離又は
退去して溶液に進入できる分子の能力にも言及する。流体連通は、分子が、部位に進入す
る、部位に接触する、部位から分離する及び/又は部位から退去するのを阻止するバリ
がないとき生ずる。しかし、流体連通は、流体連通は、アクセスが完全に阻止されない限
り、拡散が遅延する、減少する、又は変動する場合でも存在すると理解されたい。

0030

本明細書で使用する用語「標識(label)」は、反応成分につき使用するときには、検
出可能な反応成分又は反応成分の検出可能な部分を意味することを意図する。有用な標識
は、電荷センサが検出できる電荷標識(電荷タグとも称する)である。標識は、検出すべ
き反応成分に固有のもの(例えば、ポリメラーゼの荷電アミノ酸)とすることができる、
又は標識は、反応成分に固有でないのもの(例えば、アミノ酸非天然的に生じた修飾)
とすることができる。幾つかの実施形態において、標識は、個別の機能を有する複数部分
を含むことができる。例えば、標識はリンカー成分(例えば、核酸)及び電荷タグ成分を
含むことができる。

0031

本明細書で使用する用語「非天然(non-natural)」は、分子部分につき使用するとき
には、人間による技術的介入によって摂動を受けない自然の環境又は生体系における分子
に付着することが見られない部分に言及することを意図する。一般的に、非天然部分は分
子の合成的修飾部であり、これにより分子は、非修飾分子又は天然修飾部を有する分子と
構造的又は化学的に区別される。本明細書で使用する用語「非天然(non-natural)」
は、プロセスで用いる類似体(アナログ)につき使用されるときには、プロセスを生ずる
自然環境内では見られない類似体を意味することを意図する。一般的に非天然類似体は、
類似体が属する分類における別タイプの分子とは構造的又は化学的に区別される合成類似
体である。

0032

本明細書で使用する用語「核酸(nucleic acid)」は、従来技術で使用されている構成
成分であることを意図し、また自然発生的核酸又はその機能類似体(アナログ)を含む。
とくに有用な機能類似体は、配列特異的に核酸と交雑することができる、又は特定ヌクレ
オチド配列を複製するための鋳型として使用できるものである。自然発生的核酸は、概し
リン酸ジエステル結合を含む主鎖を有する。類似体構造は、ペプチド核酸(PNA)又
ロックト核酸(LNA:locked nucleic acid)のような従来既知の様々な構造のうち
任意なものを含む代替的主鎖結合があり得る。自然発生的核酸は、概して、デオキシリボ
ース糖(例えば、デオキシリボ核酸(DNA)に見られる)、又はリボース糖(例えば、リ
ボ核酸(RNA)に見られる)を有する。

0033

核酸は、従来既知のこれら糖部分における様々な類似体のうち任意なものを含むことが
できる。核酸は、天然又は非天然の塩基を含むことができる。この点に関して、天然デオ
キシリボ核酸は、アデニンチアミンシトシン、又はグアニンからなるグループから選
択される1つ又は複数の塩基を有することができ、またリボ核酸は、ウラシル、アデニン
、シトシン、又はグアニンからなるグループから選択される1つ又は複数の塩基を有する
ことができる。核酸に含めることができる有用な非天然の塩基は従来既知である。

0034

本明細書で使用する用語「ヌクレオチド」は、天然のヌクレオチド、その類似体、リボ
ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドジデオキシリボヌクレオチド、及びヌクレオ
チドとして知られた他の分子を含むことを意図する。この用語は、ポリマー内に存在する
モノマー(単量体)のユニットに言及するのに使用して、DNA又はRNAのストランド
に存在するサブユニットを識別する。この用語は、さらに、必ずしもポリマーに存在する
必要はない、例えば、ポリメラーゼによって鋳型依存でポリヌクレオチドに取り込むこと
ができる分子に存在する必要はない分子に言及するのにも使用できる。この用語は、例え
ば、5′炭素に0,1,2,3個又はそれ以上のリン酸塩有するヌクレオシドユニットに
言及することができる。例えば、四リン酸塩ヌクレオチド及び五リン酸塩ヌクレオチドが
特に有用であり得る。典型的な天然ヌクレオチドとしては、限定しないが、ATP,UT
P,CTP,GTP,ADPUDP,CDPGDPAMP,UMP,CMP,GM
P,dATP,dTTP,dCTP,dGTP,dADP,dTDP,dCDP,dGD
P,dAMP,dTMP,dCMP,及びdGMPがある。

0035

本明細書においてヌクレオチド類似体とも称される非天然ヌクレオチドは、自然生体系
で存在しない、又は自然環境、例えば、ポリメラーゼを発現させる非組み換え型細胞内の
ポリメラーゼによってはポリヌクレオチド内にほとんど取り込まれないヌクレオチドを含
む。特に有用な非天然ヌクレオチドとしては、同一ワトソンクリック相補的塩基を有す
る天然ヌクレオチドのような他のヌクレオチドがポリメラーゼによってストランド内に取
り込まれる速度よりも相当速い又は遅い速度で、ポリメラーゼによってストランド内に取
り込まれるヌクレオチドがある。例えば、非天然ヌクレオチドは、天然ヌクレオチドの取
り込み速度に比べると、少なくとも2倍差、5倍差、10倍差、25倍差、50倍差、1
00倍差、1000倍差、10000倍差、又はそれ以上の倍差の速度で取り込まれるこ
とがあり得る。非天然ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド内に取り込まれた後、さらに拡
張可能となり得る。例としては、3′水酸基を有するヌクレオチド類似体、又は3′側に
ターミネーター部分を有し、この部分は、ヌクレオチド類似体を取り込んだポリヌクレオ
チドの更なる拡張を可能にするよう除去できるものであるヌクレオチド類似体がある。使
用できる可逆的ターミネーターの例は、例えば、米国特許第7,427,673号、同第
7,414,116号、及び同第7,057,026号、並びに国際公開第91/066
78号及び同第07/123744号があり、これら文献は、参照によって本明細書に組
み入れられるものとする。幾つかの実施形態において、3′ターミネーター部分を有する
ヌクレオチド類似体、又は3′水酸基がないヌクレオチド類似体(例えば、ジデオキシヌ
クレオチド類似体)を使用することができ、この使用は、ヌクレオチド類似体を取り込ん
だポリヌクレオチドがそれ以上拡張しない条件の下で行うことができる。幾つかの実施形
態において、ヌクレオチドは可逆的ターミネーター部分を含まない、又はヌクレオチドは
非可逆的ターミネーターを含まない、又はヌクレオチドは何らターミネーター部分を含ま
ないものとする。5′側に一時的変異モディフィケーション)を有するヌクレオチド類
似体も有用である。

0036

本明細書で使用する用語「保護部分(protection moiety)」は、反応成分が特定反応
を受けるのを防止するよう反応成分に付着する化合物又は化合物の一部を意味することを
意図する。例えば、核酸分子は核酸酵素に結合することができ、これにより、核酸分子は
核酸酵素が処理によって分解又は一時的変異をするのを防止し、さもないとその処理が酵
素の分解又は一時的変異を引き起こすことになる。抗体も反応成分に結合して、反応成分
の分解、不活性化、又は他の反応を防止するよう作用する。

0037

本明細書で使用する用語「反応成分(reaction component)」は、反応に関与する分子
を意味する。その例としては、例えば、反応で消費される反応物質、反応のよって生ずる
生成物、反応を促進する酵素、溶媒、塩、緩衝液、及び他の分子がある。

0038

本明細書で使用する用語「忌避部分(repellant moiety)」は、或る空間を占有して他
の分子がその空間を占めるのを阻害若しくは抑制する分子、又はその空間の近傍に他の分
子が併存するのを抑制する分子を意味することを意図する。忌避部分は、立体排除力、電
斥力疎水性−疎水性反発力、又は他の力により作用することができる。

0039

本明細書で使用する用語「ターミネーター部分(terminator moiety)」は、ヌクレオ
チドにつき使用するとき、ヌクレオチドの一部であって、そのヌクレオチドが第2ヌクレ
オチドと共有結合を形成するのを抑制又は阻害する、該ヌクレオチドの一部を意味する。
例えば、ペントース部分を有するヌクレオチドの場合では、ターミネーター部分は、ヌク
レオチドの3′酸素と第2ヌクレオチドの5′リン酸塩との間にリン酸ジエステル結合が
形成されるのを阻害することができる。ターミネーター部分は、核酸ポリマーに存在する
モノマー単位であるヌクレオチドの一部とする、又は遊離ヌクレオチド(例えば、ヌクレ
オチド三リン酸)の一部とすることができる。ヌクレオチドの一部であるターミネーター
部分は可逆的なものとすることができ、これにより、ターミネーター部分は、ヌクレオチ
ドが第2ヌクレオチドと共有結合を形成できるものになるよう修飾することができる。特
別な実施形態において、ターミネーター部分、例えば、可逆的ターミネーター部分は、ヌ
クレオチド類似体におけるペントース部分の3′側又は2′側に付着することができる。

0040

本明細書で使用する用語「固体支持体(solid support)」は、水性液体内で不溶性
ある剛性基板に言及する。この基板は、非多孔質又は多孔質とすることができる。基板は
、随意的に、液体を吸収できるものとする(例えば、多孔性に起因して)ものの、基板は
、液体を吸収するときほとんど膨張せず、また液体を乾燥によって除去したときほとんど
収縮しない十分な剛性を有するのが一般的である。非多孔質固体支持体は、概して液体又
ガスに対して不浸透性である。典型的な固体支持体としては、限定するものではないが
ガラス及び改質若しくは機能化したガラス、プラスチックアクリルポリスチレン
スチレン及び他の材料のコポリマーポリプロピレンポリエチレンポリブチレン、ポ
ウレタンテフロン登録商標)、環状オレフィンポリイミド等々を含む)、ナイロ
ン、セラミックス樹脂ゼオノアシリカ若しくはシリコン及び改質シリコンを含むシ
リカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス光ファイバ束、及びポリマーがある。幾つ
かの実施形態にとって特に有用な固体支持体はフローセル装置内に配置する。典型的なフ
ローセルを以下に詳細に説明する。

0041

本明細書で使用する用語「タイプ(又は「種」)」は、同一化学構造を共有する分子を
認識するのに使用する。例えば、ヌクレオチドの混合物には、数種類のdCTP分子を含
むことができる。これらdCTP分子は、互いに同一タイプ又は種であると理解されたい
。同様に、同一ヌクレオチド配列を有する個別DNA分子は同一タイプ又は種である。

0042

以下に記載する及び特許請求の範囲に記載する実施形態は、上述の定義を考慮すること
によって理解できる。

0043

本発明は、核酸シークエンシング手順で検出されるヌクレオチド取り込み事象のような
用途における単一分子検出に有用な装置、組成、及び方法を提供する。本明細書で記載す
る装置、組成、及び方法は、例えば、シークエンシング・バイ・シンセシスのような単一
分子核酸シークエンシング反応に特に有用である。しかし、当然のことながら、本明細書
に記載する装置、組成、及び方法は、限定しないが単一分子検出を含む任意な他の適当な
検出スキームに使用することができる。

0044

本発明は、第1の核酸シークエンシング方法を提供する。この方法は、(a)固体支持体
型の電荷センサにテザー係留したポリメラーゼを準備するステップと、(b) 1つ又は複数
の標識(ラベル)付けしたヌクレオチドを準備して、標識が電荷センサ近傍にあるとき標
識の存在を電荷センサによって検出できるようにするステップと、及び(c)鋳型核酸に対
して相補的な新生ストランドへの標識付けしたヌクレオチドの組み込みを検出するステッ
プと、を有することができる。

0045

第1の核酸シークエンシング方法に使用するポリメラーゼは、核酸を含むテザーにより
固体支持体型の電荷センサにテザー係留することができる。例えば、テザーは、デオキシ
リボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)又はタンパク質核酸(PNA)を含むことがで
きる。

0046

第1の核酸シークエンシング方法の幾つかの実施形態において、前記標識付けしたヌク
レオチドは、ヌクレオチドのγ-リン酸塩側の位置で標識付けする。この標識は、オリゴ
ヌクレオチドから成るものとすることができ、また随意的に、このオリゴヌクレオチドは
、不動化された核酸に対して交雑できるものとする。

0047

さらに、随意的に、第1の核酸シークエンシング方法に使用する不動化された核酸はテ
ザーの一部であり、このテザーはポリメラーゼを固体支持体型の電荷センサに対して不動
化する。

0048

第1の核酸シークエンシング方法の幾つかの実施形態において、ポリメラーゼは、前記
電荷センサに対して、10,9,8,7,6,5,4,3,2,1nmよりも短い近傍位
置に保持される。

0049

第1の核酸シークエンシング方法の幾つかの実施形態において、前記標識は、取り込み
後に、例えば、ポリメラーゼによって前記ヌクレオチドから開裂する。

0050

随意的に、第1の核酸シークエンシング方法の幾つかの実施形態において、1つ又はそ
れ以上の標識付けしたヌクレオチドは、複数の電荷タグを有する。例えば、1つ又はそれ
以上の標識付けしたヌクレオチドは、4タイプのヌクレオチドそれぞれに対して固有の電
荷タグを有することができる。電荷タグは、負の電荷タグを有することができ、例えば、
リン酸基DMT、及び/又はFMOCのうち1つ又はそれ以上からなるものとすること
ができる。代案として、前記電荷タグは、正の電荷タグとすることができ、随意的に、第
1級アミンから成るものとすることができる。

0051

第1の核酸シークエンシング方法における1つ又はそれ以上の標識付けしたヌクレオチ
ドは、複数の不動化されたテザー配列に対して交雑できる複数の異なるオリゴヌクレオチ
ド(すなわち、オリゴヌクレオチド部分)を含むことができる。代替的又は付加的に、複
数の異なるオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼを不動化するのに使用する特定テザー内
の複数の異なる場所で交雑できる。

0052

第1の核酸シークエンシング方法の幾つかの実施形態において、1つ又はそれ以上の標
識付けしたヌクレオチドは4つの異なる電荷タグを含むことができ、また前記標識付けし
たヌクレオチドそれぞれは、同一の不動化されたテザー配列に対して交雑できるオリゴヌ
クレオチドを含むものとする。

0053

第1の核酸シークエンシング方法の幾つかの実施形態において、ポリメラーゼテザー及
び標識付けしたヌクレオチドにおける標識は、互いに相補的に結合するデオキシリボヌク
レオチド、互いに相補的に結合するリボヌクレオチド、リボヌクレオチドに相補的に結合
するデオキシリボヌクレオチドを含む。例えば、ポリメラーゼテザー及び標識付けしたヌ
クレオチドにおける標識は、DNA:DNA二本鎖、RNA:RNA二本鎖、DNA:R
NAヘテロ二本鎖を形成することができる。デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオ
チドは、二本鎖の安定性を増加又は変容させるヌクレオチド類似体とすることができる。
例えば、2’-O-メチル(2’-O-Me)又は2’-フッ素(2’-F)で修飾したリボヌ
クレオチドを使用することができる。2’-O-Me及び2’-FのRNA修飾は、RNA
:RNA二本鎖の溶融温度を1塩基対あたり0.5℃〜1℃だけ上昇するが、DNA:R
NAの安定性には僅かな変化しか生じないことが知られている((Majlessi et al., Nucl
eic AcidsRes. 26:2224-9 (1998)を参照されたく、この参照により本明細書に組み入れ
られるものとする)。修飾されたRNA:RNA塩基対の安定性増加を使用して、以下に
詳述するようにタグをRNAテザーに沿って正確に位置決めすることができる。

0054

さらに、第1の核酸シークエンシング方法において、前記電荷センサは、捕捉オリゴヌ
クレオチドで官能化し、また前記標識付けしたヌクレオチドは、1つ又はそれ以上の捕捉
ヌクレオチドに対して交雑するオリゴヌクレオチド標識を含むことができる。

0055

第1の核酸シークエンシング方法に使用する電荷センサは、ナノワイヤFETとするこ
とができる。随意的に、電荷センサは、カーボンナノチューブとすることができる。

0056

第1の核酸シークエンシング方法における電荷センサは、電荷センサアレイの一部とす
ることができる。

0057

第1の核酸シークエンシング方法における検出ステップは、順次の複数の取り込み事象
を検出するステップを含むことができる。

0058

本明細書に記載の方法及び装置によれば、長い核酸シークエンシングの読取り、迅速な
読取り、シークエンシングの高い処理能力、及びシークエンシングの拡張性のあるプラッ
トフォームを提供することができる。幾つかの実施形態において、1回の読取り精度にお
けるいかなる低下も、本明細書記載の方法及び装置の並列的に行う多数の読取り処理能力
に起因する多重重複読取りを行うことによって軽減することができる。

0059

例示的センサを図1に示す。この図において、ポリメラーゼ1は、準備ができたDNA
鋳型4にヌクレオチドを取り込むことができる反応部位を生ずる。ポリメラーゼ1はテザ
ー3によりナノワイヤFET2に付着する。この装置は単一分子感度をもたらす。反応部
位における電荷分布の変化(例えば、ポリメラーゼ立体配座変化、ヌクレオチド取込み
電荷タグの到着又は離脱、ポリメラーゼの電荷センサに対する近接度変化、等々)をゲー
トに伝達し、また検出することができる。

0060

特別な実施形態において、本発明装置又は方法は、単一分子電荷センサとして極度に縮
小したFinFETトランジスタを使用する。FinFETセンサは、最先端半導体製造
業者の開発の下で既にテクノロジーから恩恵を受けている。さらに、既に公表されたコン
ポーネントを使用することができ、これらコンポーネントとしては、限定しないが、(1)
酵素処理能力をリアルタイム観測するようCNTに対するリゾチームの不動化に使用す
るコンポーネント(Choi et al, Science, 335, 319 (2012) 参照)、(2) DNA処理能
力をリアルタイムで観測するようCNTに対するPol1クレノウ断片の不動化に使用す
るコンポーネント(Olsen et al, J. Amer. Chem. Soc., 135, 7885 (2013) 参照)、 (3
)タンパク質のアロステリック挙動に起因して電荷残基を移動させる変換メカニズム
解明に使用するコンポーネント(Chi et al, NanoLett 13, 625 (2013) 参照)がある。
さらに、本発明方法は、米国特許出願公開第2013/0078622号に記載の装置、
装置コンポーネント、及び方法を採用することもできる。これら参照文献それぞれは、参
照によって本明細書に組み入れられるものとする。

0061

米国特許出願公開第2013/0078622号に記載の装置及び方法は、50〜10
0mMのNaCl内に1〜2nmのデバイ遮蔽距離を提供する。この装置において、アロ
ステリックな挙動は、トランジスタに対するポリメラーゼの付着ポイントの近傍でなけれ
ばならない。さらに、アロステリックな挙動は、異なるタイプのヌクレオチドをリアル
イムに区別できるよう塩基依存でなければならない。この解像度は、以前には実証されて
いなかった。

0062

アロステリックな挙動に基づく検出を利用する幾つかの装置における限界を克服するの
に用いることができる実施形態を図2で示す。ここで、ポリメラーゼは、単一壁カーボン
ナノチューブFET、シリコンナノワイヤFET、又はFinFETのような電荷センサ
に対して不動化することができる。この不動化は、DNA、RNA、PNA、又はそれら
の類似体を含むテザーにより行うことができる。説明を簡便にするため、図は、電荷セン
サにテザー係留した4つのポリメラーゼを示し、各ポリメラーゼは、異なるγリン酸塩で
標識付けしたヌクレオチドタイプに結合している。図示のように、ヌクレオチドは、γリ
酸塩に付着したオリゴヌクレオチド部分を有する。標的核酸の鋳型ストランドに適正に
合致するβ又はγ型のリン酸塩で標識付けしたヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド部分
がテザーに対して一時的に交雑する(例えば、ワトソン・クリック塩基対相補性によって
)のに十分長く鋳型に結合されもするポリメラーゼによって所定位置に保持される。交雑
はオリゴヌクレオチド部分に作用して、電荷センサを流れるトランジスタ電流の変化に起
因する検出可能なシグナルを生成する電荷センサ周りの電場撹乱させる。図表は、電荷
センサの1〜2nm以内の電場に進出するオリゴヌクレオチド部分を示す。適正に合致し
たβ-又はγ-のリン酸塩で標識付けされたヌクレオチドは、鋳型核酸に対して交雑された
新生ストランドに取り込まれる。このことは、次にβリン酸塩と新たに取り込まれたヌク
レオチドとの間の結合を破壊する。この結果、オリゴヌクレオチド部分(ヌクレオチドの
β又はγのいずれかの位置に付着される)は、テザーから自由に脱交雑して電荷センサか
ら拡散し、これにより電荷センサ周りの電場を非撹乱状態に復帰する。それぞれ撹乱状態
にする及び非撹乱状態に戻す電荷センサ周りの電場としてのシグナルの発現及び消失は、
標的核酸の新生ストランドへのヌクレオチド取込みに相関することができる。

0063

特別な実施形態は、γ-リン酸塩で標識付けしたヌクレオチドのポリメラーゼ及びテザ
ーとの相乗的結合を活用することができる。オリゴヌクレオチド:テザー錯体の安定的は
比較的低く、したがって、この錯体は、ポリメラーゼにも結合しないγ-リン酸塩で標識
付けしたヌクレオチドを形成しない(すなわち、溶液内で自由なγ-リン酸塩標識付けヌ
クレオチドはテザーにほぼ結合しない)。しかし、ポリメラーゼに対するヌクレオチド部
分の親和性とテザーに対するオリゴヌクレオチド部分の親和性との相乗効果が合算して、
大きな全体結合親和力を可能にする。幾つかの実施形態において、この相乗効果は、ヌク
レオチド標識とテザーとの間の特異結合親和性の、非特異結合相互作用によって生ずる弱
い親和性に対する組合せを活用することができる。例えば、特異結合は、標準ワトソン・
クリック塩基対の結果として生ずることができ、また非特異結合相互作用は、雑多な塩基
(例えば、イノシン)の天然ヌクレオチドに対する相互作用の結果として生ずることがで
きる。したがって、γ-リン酸塩標識付けヌクレオチドが取込み中にポリメラーゼと結合
するとき、オリゴヌクレオチド部分とテザーとの間における相互作用の安定性を相当増加
させる相乗的結合を生ずる。γ-リン酸塩がポリメラーゼによって開裂した後、相乗効果
喪失し、またオリゴヌクレオチド部分はテザーから解離する。

0064

鋳型ストランドの各位置における新生ストランドに取り込まれるヌクレオチドのタイプ
は、各ヌクレオチドタイプ内に取り込まれる標識の固有特性に基づいて決定することがで
きる。例えば、dNTPの4つのタイプは、オリゴヌクレオチド部分がテザーに対して交
雑する位置、オリゴヌクレオチド部分の長さ、及び/又は標識における荷電部分の存在、
によって区別することができる。図2は、2つの電荷タグ(オリゴヌクレオチド部分の負
帯電リン酸塩以外)及び2つのテザー交雑位置を用いて、4状態識別を得る例を提示する
。とくに、dCTPは負帯電した外因性部分により一意的に標識付けされ、dTTPは正
帯電した外因性部分により一意的に標識付けされ、dATP及びdGTPはいかなる電荷
部分もないことに基づいて他の2つのヌクレオチドタイプと区別され、またdATPはd
GTPから区別され、それらdATP及びdGTPがテザーに交雑されるときのオリゴヌ
クレオチド部分の電荷センサに対する異なる近接度に基づいて区別することができる。

0065

異なるヌクレオチドタイプは、正電荷部分、負電荷部分及び/又はテザー交雑位置の様
々な組合せのうち任意なものに基づいて区別することができると理解されたい。代替的又
は付加的に、異なるヌクレオチドタイプの区別に使用される電荷部分は、電荷が同一の符
号を有する場合であっても電荷強度は異なることがあり得る。図3に示す例示的形態は、
単一テザー交雑位置に基づいて4状態識別及び4つの異なる電荷部分を示す。とくに、d
GTP及びdCTPの双方とも、dATP及びdTTPから区別される負の帯電部分を含
み、またdGTPは、dCTPにおける電荷よりも識別可能に高い電荷に起因してdCT
Pから区別することができる。同様に、dATP及びdTTPは、dTTP部分における
のと比べてdATP部分におけるより高い正電荷により互いに区別することができる。

0066

上述したように、テザーに沿う特異交雑位置におけるタグ配置の精度は、リボヌクレオ
チドを有するテザー及び2′-O-Me及び2′F修飾RNA塩基を有するヌクレオチド標
識を用いて高めることができる。代替的形態は、リボヌクレオチドを有する2′-O-Me
及び2′F修飾リボヌクレオチドを含むテザーを使用することができる、又はテザー及び
標識の双方とも、天然リボヌクレオチドと、2′-O-Me及び2′F修飾リボヌクレオチ
ドの混合物を含むことができる。テザー及び/又は主にRNAから成るオリゴヌクレオチ
ド部分を使用することができるが、DNA由来又はPNA由来のテザー及び/又はオリゴ
ヌクレオチドを使用して、RNAに関連するヌクレアーゼ感受性を回避するのが望ましい
ことがあり得る。例えば、DNA由来又はPNA由来のテザー及び/又はオリゴヌクレオ
チドは、天然リボヌクレオチド又は非天然リボヌクレオチド類似体を含み、上述した結合
の利点を得るとともに、望ましくないヌクレアーゼ消化リスクを軽減することができる
。他の実施形態において、テザーは、ヌクレオチド標識におけるリボヌクレオチドに対し
て相補的な1つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチドを含むことができる、又は代案
として、テザーは、ヌクレオチド標識におけるデオキシリボヌクレオチドに対して相補的
な1つ又はそれ以上のリボヌクレオチドを含むことができる。

0067

ポリメラーゼを電荷センサに付着させるテザーは、本明細書で上述した例示的実施形態
のように、異なるヌクレオチド類似体に関して異なる結合位置を有することができる。2
つ以上のヌクレオチド類似体の結合位置はオーバーラップすることができる、又はオーバ
ラップすることなく個別の位置とすることができる。例えば、図10に示すように、A
TP及びGTP類似体の結合部位は、2つ分のヌクレオチドだけテザー上でオーバーラッ
プする(すなわち、2つの結合部位間にオフセットした1個のヌクレオチドが存在する)
。説明目的のため、テザー配列は、総称的に「N」で示した一連のヌクレオチドとして示
す。相補性、所望交雑強度及び特異性のルールに基づいて、様々な配列のうち任意なもの
を使用することができる。さらに、図10に示すように、テザーにおけるATP及びTT
Pの結合部位はオーバーラップ部分がなく個別であり、1個分のヌクレオチドだけ離散
ている。テザーの長さ、結合部位の長さ、及びヌクレオチド類似体におけるオリゴヌクレ
オチド部分の長さに基づいて、テザーの結合部位のすべてがオーバーラップすることがで
き、又はオーバーラップしないようにすることができる。

0068

ヌクレオチド類似体のオリゴヌクレオチド部分は、テザーにおける相補的配列に特異的
に交雑するヌクレオチド配列を有することができる。幾つかの実施形態において、オリゴ
ヌクレオチド部分は、テザーに対して非特異的に結合する雑多なヌクレオチド位置を含む
ことができる。このような位置は、オリゴヌクレオチド部分とテザーとの間に特異的交雑
構造の形成を促進する弱い相互作用を生ずることができる。例えば、図11に示すように
、オリゴヌクレオチド部分は、弱くではあるが、DNAの4つの天然ヌクレオチドすべて
と雑多に結合することが知られている数個のイノシン(I)を含むことができる。オリゴ
ヌクレオチド部分及びテザーは、オリゴヌクレオチド部分におけるイノシンとテザーにお
ける天然ヌクレオチドとの間における相互作用により弱い錯体を形成することができる。
このことは、シーケンス(配列)の特異的部分(図でABC及びそれらに相補的なA′B
′C′として示す)を、弱い錯体の不在形成を拡散するのに必要とされていたよりもより
迅速に関連付けることができる。さらに、特異的錯体が形成された後には、イノシンは一
層安定性を付与することができる。

0069

図11における例示的オリゴヌクレオチド部分は、特異的配列の両側の側面に隣接する
雑多なヌクレオチド位置を含む。しかし、1又はそれ以上の雑多なヌクレオチド位置は、
特異的配列の5′又は3′側にのみ位置することができる。雑多なヌクレオチド位置の他
の例としては、オリゴヌクレオチド合成縮重することによって形成される位置、又は2
つ以上のタイプのヌクレオチドと雑多に交雑するのが従来既知である他のヌクレオチド類
似体で形成される位置がある。

0070

図10及び図11に示す実施例、並びに上述した他の実施例において、テザーは、ヌク
レオチド類似体のオリゴヌクレオチド部分と交雑する核酸である。他の結合パートナー
、テザー及び標識部分として核酸の代わりに使用することができると理解されたい。結合
部位は、上述したように、核酸に対して個別のもの又はオーバーラップするものとするこ
とができる。さらに、結合部位は、弱い非特異的相互作用パートナーの、強い特異的相互
作用パートナーとの組合せを含むことができる。

0071

上述した数種類の実施形態は、異なる長さのオリゴヌクレオチド部分を有する複数の異
なるヌクレオチド類似体の使用を例示した。このような実施形態において、異なるヌクレ
オチドタイプは、オリゴヌクレオチド部分の異なる長さに基づいて区別することができる
。代案として、異なるヌクレオチド類似体は同一長さのオリゴヌクレオチド部分を有する
ことができる。しかし、各ヌクレオチド類似体は、他のヌクレオチド類似体が結合する領
域ではなく、テザーの異なる領域に結合する特異結合配列を有することができる。図12
に、異なるヌクレオチド類似体に対するポリメラーゼの結合が、4つの識別可能な部位の
うち1つにポリメラーゼを配置する例示的形態を示す。ATP類似体のオリゴヌクレオチ
ド部分は、テザーのポリメラーゼに対する付着ポイントに最も近接するテザー上の場所に
結合し、TTP類似体のオリゴヌクレオチド部分は、テザーのポリメラーゼに対する付着
ポイントに最も遠いテザー上の場所に結合し、またGTP及びCTP類似体のオリゴヌク
レオチド部分は、他の2つのヌクレオチド類似体に関する結合位置から中間的距離にある
テザー上の明確に区別できる場所にそれぞれ結合する。このようにして、ポリメラーゼに
対する異なるヌクレオチド類似体の結合は、電荷センサから異なる距離にポリメラーゼを
位置決めする(例えば、図に示すように、異なるサイズのループをテザーに形成させる)
。異なるヌクレオチドタイプは、電荷センサからのポリメラーゼの異なる距離で生ずるシ
ナルの差に基づいて区別することができる。1つ又はそれ以上のヌクレオチド類似体が
電荷タグ又は他の検出可能な部分(例えば、ヌクレオチド部分に対して遠位にあるオリゴ
ヌクレオチド部分の末端に付着する)を有する実施形態において、オリゴヌクレオチド部
分とテザーとの間における結合は、電荷センサから異なる距離に検出可能な部分を位置決
めする。この場合、異なるヌクレオチドタイプは、電荷センサの検出可能な部分の異なる
距離で生ずるシグナルにおける相違に基づいて区別することができる。

0072

図4図式化した実施形態で示すように、ポリメラーゼを電荷センサに付着させるテザ
ーは、ヌクレオチドに存在するタグに交雑できるものである必要はない。その代わりに、
電荷センサを、検出しようとする1つ又はそれ以上のヌクレオチドタイプに相補的である
1つ又はそれ以上のオリゴヌクレオチドに付着するよう機能化することができる。異なる
ヌクレオチドの識別は、電荷の正負符号、電荷強度、表面付着したオリゴヌクレオチドに
対して交雑するオリゴヌクレオチド部分の長さ、若しくはオリゴヌクレオチド部分が交雑
する表面付着したオリゴヌクレオチドの近接度/場所、又はそれらの組合せに基づいて得
ることができる。

0073

上述の数種類の形態の利点は、例えば、原子精度でゲートの1〜2nm以内の電荷配置
によってスクリーニング問題を克服する点、電荷タグの使用による高いレベルの電流変調
が得られる能力、及び塩基特異的なアロステリック挙動が検出にとって不要であることを
理由としてポリメラーゼに利用可能な空間が広がる点である。

0074

上述の装置及び方法で有用な例示的電荷タグは、例えば、核酸部分の5′末端に位置す
リン酸塩部分である。この部分は、利用可能なオリゴヌクレオチド合成プロトコール
に容易に添加することができ、また図5に示すように、オリゴヌクレオチド部分の末端に
おける2つの負に帯電した酸素となる。オリゴヌクレオチド合成中の化学的リン酸化反応
は、DMT保護基を、2-[2-(4,4’ジメトキシトリチルオキシ)エチルスルフォニル]エチ
ル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイトグレンリサーチから
入手可能、スターリングVA、カタログ番号CPR10-1900)を用いて5′リン酸基に変
換することによって得ることができる。異なる個数の負電荷を有する一連の電荷タグは、
トリス-2,2,2-[3-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)プロピルオキシメチル]エチル-[(2-
シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(グレン・リサーチから入手可
能、スターリングVA、カタログ番号CPR10-1922-xx)、1,3-ビス-[5-(4,4’ -ジメト
キシトリチルオキシ)ペンチルアミド]プロピル-2-[(2-シアノエチル)-( N,N-ジイソプロ
ピル)]-ホスホラミダイト(グレン・リサーチから入手可能、スターリングVA、カタ
グ番号CPR10-1920-xx)、1-[5-(4,4’-ジメトキシトリチルオキシ)ペンチルアミド]-3
-[5-フルオレノメトキシカルボニルオキシペンチルアミド]-プロピル-2-[(2-シアノエチ
ル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(グレン・リサーチから入手可能、スター
リングVA、カタログ番号CPR10-1921-xx)、又はグレン・リサーチから入手可能な若
しくは図6に示すような、様々な数のDMT(4,4’-ジメトキシトリチル)若しくはFmo
c(フルオレニルメチルオキシカルボニル)部分を含むオリゴヌクレオチドデンドリマー
を使用して形成することができる。有用な正帯電タグは、2-[2-(4-モノメトキシトリチル
)アミノエトキシ]エチル-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト
(グレン・リサーチから入手可能、スターリングVA、カタログ番号CPR10-1905-xx)
である。他の有用な正帯電タグは5′第1級アミンであり、これは適正pHで単一の正電
荷を有する。

0075

表1は、本明細書に記載の装置又は方法に標識として使用できる有用な修飾(改質)剤
及び電荷のリストを示す。

0076

本発明は、反応成分を電荷センサに付着させる方法を提供する。この方法は、(a) 複数
個の電荷センサであって、それぞれが複数の反応成分を付着させる能力を有する、該複数
個の電荷センサを備える固体支持体を準備するステップと、(b) 複数の特定タイプの反応
成分を含む流体を準備するステップと、並びに(c) 以下の条件、すなわち、(i) 前記複数
の特定タイプの反応成分が前記複数個の電荷センサに流体連通する、(ii) 前記固体支持
体における前記電荷センサの個数より多い数の前記特定タイプの反応成分が前記流体内に
存在する、及び(iii) 固体支持体において、各電荷センサに単一反応成分が付着する結果
となる状態で、前記流体から前記特定タイプの反応成分が前記電荷センサに付着する、と
いう条件下で、前記固体支持体に前記流体を接触させるステップと、を有する。

0077

幾つかの実施形態において、反応成分を電荷センサに付着させる方法は、(a)複数個の
電荷センサであって、それぞれが複数の反応成分を付着させる能力を有する、該複数個の
電荷センサを備える固体支持体を準備するステップと、(b) 複数の特定タイプの反応成分
であって、それぞれが忌避部分に結合する、該複数の特定タイプの反応成分を含む流体を
準備するステップと、並びに(c)以下の条件、すなわち、(i)前記複数の特定タイプの反応
成分が前記複数個の電荷センサに流体連通する、(ii)前記固体支持体における前記電荷セ
ンサの個数より多い数の前記特定タイプの反応成分が前記流体内に存在する、(iii)前記
流体から前記特定タイプの反応成分が前記電荷センサに付着する、及び(iv)前記反応成分
のそれぞれに結合した前記忌避部分により、前記複数の反応成分における1つより多い数
の反応成分が前記各電荷センサに付着するのを阻害するという条件下で、前記固体支持体
に前記流体を接触させるステップと、を有することができる。

0078

反応成分を電荷センサに付着させる方法は、(a)複数個の電荷センサであって、それぞ
れが複数の反応成分を付着させる能力を有する、該複数個の電荷センサを備える固体支持
体を準備するステップと、(b) 複数の特定タイプの反応成分を含む流体を準備するステッ
プと、(c) 以下の条件、すなわち、(i)前記複数の特定タイプの反応成分が前記複数個の
電荷センサに流体連通する、(ii)前記固体支持体における前記電荷センサの個数より多い
数の前記特定タイプの反応成分が前記流体内に存在する、及び(iii)前記流体から前記特
定タイプの反応成分が前記電荷センサに付着して、これにより、前記流体から複数反応成
分が付着した変容電荷センサを形成する、という条件下で、前記固体支持体に前記流体を
接触させるステップと、並びに(d)前記各変容電荷センサから1つ又はそれ以上の前記特
定タイプの反応成分を除去して、前記特定タイプの単一反応成分が前記各変容電荷センサ
に付着した状態にする除去ステップと、を有することができる。

0079

有用な電荷デバイスとしては、変換素子と直接空間接触する反応成分を取り込むことが
でき、反応事象を迅速かつ都合よく検出可能な信号に変換できる分析デバイスがある。電
界効果トランジスタ(FET)に基づくデバイスは、反応成分(例えば、ポリメラーゼ)
とトランジスタ表面との間の相互作用を読取り可能な電気信号に直接変換することができ
る。標準的FETにおいて、電流は2つの電極ソース及びドレイン)に接続した導電
路に沿って流れる。ソースとドレインとの間のチャネル伝導性は、薄い誘電体層を介して
容量結合することができる第3(ゲート)電極によってオン/オフ切り換えされる。

0080

特別な実施形態において、FETは、単一分子の検出を行うよう構成する。より具体的
には、これら電荷センサは、単一分子反応の動力学をモニタリングするよう構成すること
ができる。電界効果トランジスタにおいて一般的に見られる任意なタイプの導電チャネル
を本明細書に記載の装置又は方法に使用することができる。典型的な導電チャネルは、金
属、金属酸化物半導体、又はナノワイヤ又はグラフェンのようなナノメートル規模の導
体から形成される。

0081

単一分子の検出に特に有用な電荷センサは単一壁カーボン・ナノチューブ(SWNTs
)である。例えば、Star et al., Nano. Lett. 3, 459 (2003)、Star et al., Org. Lett
. 6, 2089 (2004)、Besterman et al., Nano. Lett. 3, 727 (2003)、Gruner, Anal. Bio
oanal. Chem. 384, 322 (2005)、Chen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 498
4 (2003))、及び米国特許出願公開第2013/0078622号を参照されたい(これ
ら文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする)。SWNTは、一般的に直
径が約1ナノメートルオーダーの極めて小さい導体である。

0082

SWNTは、化学選択的ポリマー、金属、金属酸化物、ナノ粒子、又はタンパク質、核
酸若しくは抗体のような反応成分でコーティングすることができる。例えば、Besterman
et al., Nano. Lett. 3, 727 (2003)、及びChen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
100, 4984 (2003) を参照されたい。単一の反応成分は、本明細書に記載の方法を用いて
これらSWNT及び他の電荷センサに付着させることができる。

0083

幾つかの実施形態において、単一反応成分は、例えば、Goldsmith et al. Science 315
, 77 (2007)に記載の技術を用いて(この文献は参照によって本明細書に組み入れられる
ものとする)、電荷センサ上に単独の共有結合欠損部を形成することによって電荷センサ
に付着させることができる。例えば、SWNTは単独の欠損部を有するよう生産し、様々
な付着用の化学的構造を用いて、SWNTの残りの部分を付加的な反応成分でコーティ
グする必要なく、単一反応成分を反応性欠損部に選択的に結合できるようにする。SWN
Tは、例えば、Chen et al, J. Am. Chem. Soc. 123, 3838 (2001) に記載の技術を用い
て(この文献は参照によって本明細書に組み入れられるものとする)、非共有結合手段に
より反応成分を付着することができる。これら方法は、本明細書に記載のように変更して
、単一反応成分を非共有結合的にSWNTに信頼性高く結合することができる。

0084

SWNTは、1電子ボルトからゼロ電子ボルトまで効果的に変化させることができる電
バンドギャップを有する半導体である。SWNTは導電チャネルとして有用であり、こ
れはすなわち、単一分子感知デバイスは、ゲート電極の有無に関係なく、任意なタイプの
SWNTワイヤから、またガラス、プラスチック又はシリコンの基板上に作製することが
できる。単一分子の検出用に有用なSWNT及びその形態は、米国特許出願公開第201
3/0078622号に記載されており、この文献は、参照によって本明細書に組み入れ
られるものとする。

0085

本明細書に記載の装置又は方法に使用するよう変更できる他の電荷センサとしては、限
定しないが、シリコンナノワイヤ(SiNW)に基づくFET、III-V材料で形成したF
ET、シリコンFinFET、グラフェンナノリボンFET並びにMoS2、シリセン等の
ような2次元材料から作製したナノリボンFET、トンネルFET(TFET)、及び急
峻閾値下勾配デバイス(例えば、Swaminathan et al., Proceedings of the 51st Annual
Design Automation Conference on Design Automation Conference, pg 1-6, ISBN: 978
-1-4503-2730-5 (2014)、及びIonescu et al., Nature 479, 329-337 (2011)参照)があ
る。カーボンナノチューブも有用であり得る。

0086

複数個の電荷センサを電荷センサアレイの形式にして設けることができる。このアレイ
は、少なくとも10個、100個、1×103個、1×104個、又はそれ以上個数の電
荷センサを含むことができる。各個別の電荷センサは、アレイにおける他の電荷センサか
ら分離したアレイにおける離散場所で配置することができる。例えば、各電荷センサは、
固体支持体におけるウェル又は窪みに設けることができる。互いに分離されているときで
さえも、これら場所は、随意的に、バル要件に接触する流体内に存在し得る。このよう
な形態において、多重反応が電荷センサアレイ上で生ずることができ、このことは、共通
試薬をバルク流体送給ですべての電荷センサに送給することによって行うことができる。
例として核酸シークエンシング反応を考慮すると、ヌクレオチドはバルク溶液によりウェ
ル(又は他の形体)のアレイに送給することができ、各ウェル(又は他の形体)は、個別
のシークエンシング反応をホスティングする。ヌクレオチド送給によって、ウェル(又は
他の形体)における並列的シークエンシング反応を生ずる結果となる。

0087

Siナノワイヤのような電荷センサは、10nmよりも小さい幅、及び100nmより
も長い長さの寸法を有することができる。Siナノワイヤ又は他の電荷センサは、10n
m×10nm、50nm×100nm、又はそれより大きいウェル内に配置することがで
きる。例えば、電荷センサが存在するウェルは、少なくとも100nm2、1000nm
2、5000nm2、1×104nm2、又はそれより大きい表面上に開口を有すること
ができる。電荷感知素子からの信号を読み出す回路は、固体支持体の1ミクロン×1ミク
ロン、又はそれより大きい面積を占めることができる。

0088

幾つかの実施形態において、電荷センサは全長に沿って均一幅を有する。代案として、
電荷センサは全長に沿って実質的に可変幅を有することができる。例えば、電荷センサは
、「挟縮」領域に類似の比較的狭小幅の領域を含むことができる。挟縮領域の幅は、例え
ば、電荷センサにおける比較的大きい幅の直径の75%、50%、40%、30%、20
%、10%の直径とすることができる。この挟縮領域は、電荷センサにおけるポリメラー
ゼの帯電残基運動の効果を高める利点をもたらす。他の恩恵は、FETセンサの第1層誘
電体不動態化におけるチャネル作製及び開口形成/整列の緩い公差である。例えば、10
nmの挟縮領域を有する直径20nmの電荷センサが特に有用であり得る。挟縮領域を有
する電荷センサの他の寸法としては、例えば、最大でも10、20、30、40又は50
nmの長さの挟縮領域を有する、少なくとも25、30、35、若しくは40nm又はそ
れ以上の直径がある。それより小さい直径の電荷センサを使用することもでき、例えば、
少なくとも5、10、15、又は20nmの直径の電荷センサが、典型的長さの挟縮領域
を有することができる。幾つかの実施形態において、電荷センサの最大直径は、50、4
0、30、20若しくは10nm、又はそれより小さいものとする。

0089

ポリメラーゼ又は他の酵素のためのテザーは、挟縮領域又は挟縮領域近傍のポイントに
付着させることができる。したがって、テザーは、ポリメラーゼ又はたの酵素を挟縮領域
近傍に限局するよう配置することができる。

0090

挟縮領域を有する電荷センサの例示的実施形態を図8に示す。挟縮領域は、マスク形状
が所望挟縮を生ずるものとなるよう、適正なリソグラフィマスク設計により作製すること
ができる。代案として、リソグラフィパターン形成中に近接効果を利用して、挟縮すべき
領域に密に近接させてセンサに直交するよう電極を配置することによって、電荷センサを
局所的に挟縮することができる。所望挟縮を作成することの他に、近接電極を使用して、
挟縮領域に酵素を位置決めする電気泳動力を発生させる。

0091

他の例示的実施形態を図9に示す。この場合、挟縮は局所的酸化を用いてシリコンに導
入する。第1ステップにおいて、シリコンワイヤは、窒化ケイ素(SiNx)のような酸
化バリアでコーティングする。局所的リソグラフィを用い、酸化バリアをエッチング除去
してシリコンワイヤを露出させることができる。次に部分的にコーティングされたワイヤ
を酸化して、露出した領域でシリコンワイヤの幅を減少させる。さらにエッチングを行っ
て化学的結合のためのシリコン挟縮部を露呈させることができる。

0092

当業者であれば、電荷センサにおける上述した挟縮部の作成方法は例示的なものであっ
て限定的なものではなく、挟縮部は半導体製造に共通する多くの他の方法で作成すること
ができ、例えば、とくに犠牲層選択的堆積及びエッチング、又は付加的リソグラフィマ
スクを使用して作成することができる。

0093

アレイの密度は、1cm2あたり2〜10億個以上にわたる異なる反応部位とすること
ができる。極めて高密度のアレイが本発明に有用であり、例えば、少なくとも約10,0
00,000反応部位/cm2であり、例えば、少なくとも約100,000,000反
応部位/cm2、1,000,000,000反応部位/cm2、約2,000,000
,000反応部位/cm2にも達する、又はそれ以上の密度もあり得る。高密度アレイは
、例えば、約100,000反応部位/cm2〜約10,000,000反応部位/cm
2の範囲にわたる密度にすることもできる。本発明に有用な穏当密度は、約10,000
反応部位/cm2〜約100,000反応部位/cm2である。低密度アレイは、概して
約10,000反応部位/cm2よりも少ない密度である。

0094

様々な反応成分のうち任意な反応成分を電荷センサに付着させることができる。反応成
分としては、例えば、抗体又はレクチンのような受容体、ヌクレオチド、エピトープ、炭
化物、又は薬剤候補のようなリガンド、標的核酸、テザー核酸、又は本明細書記載の反
応セットにつき上述した他の核酸セットのような核酸、ポリメラーゼ若しくは他の核酸結
合酵素、キナーゼ、リン酸塩、エキソヌクレアーゼ、プロテアーゼ、又は代謝酵素のよう
な酵素がある。他の有用な反応成分としては、限定しないが、本明細書に記載した又は分
生物学若しくは生化学の分野で既知の反応成分がある。

0095

例えば、単一タイプの反応成分を各電荷センサに付着させるよう構成することができる
電荷センサアレイを採用する実施形態を含む複数の実施形態がある。例えば、複数の実施
形態におけるほぼすべての電荷センサにポリメラーゼを付着させることができる。さらに
、同一種のポリメラーゼを各電荷センサに付着させることができる。この形態は各電荷セ
ンサから期待される均一出力を得ることができるが、各対応の電荷センサに接触すること
になる他の反応成分では相違する出力となる。このような構成は、ポリメラーゼを電荷セ
ンサに付着させるとき、単一タイプのポリメラーゼを有することに関して均質な流体を供
給することによって得ることができる。

0096

様々なポリメラーゼのうち任意なものを本明細書に記載した方法又は組成に使用するこ
とができ、例えば、生体系から単離したタンパク質ベースの酵素及びその機能的変異体
含めて使用することができる。以下に例示するような特定ポリメラーゼに対する言及は、
他に明示しない限り、それらの機能的変異体も含むと理解されたい。ポリメラーゼの特に
有用な機能は、既存核酸を鋳型として使用して、核酸ストランドの重合化(ポリメリゼー
ション)を触媒する点である。有用な他の機能は、本明細書のいたるところに記載されて
いる。有用なポリメラーゼの例としては、DNAポリメラーゼ及びRNAポリメラーゼ
ある。例示的DNAポリメラーゼとしては、構造的ホモロジーによってA,B,C,D,
X,Y,及びRTとして示す族に分類されるものがある。A族におけるDNAポリメラー
ゼとしては、例えば、T7DNAポリメラーゼ、真核生物ミトコンドリアDNAポリメラ
ーゼγ、大腸菌DNAPolI、サーマスアクアチクスPolI、及び枯草菌ステア好熱性
PolIがある。B族におけるDNAポリメラーゼとしては、例えば、真核生物DNAポリ
メラーゼα、δ及びε、DNAポリメラーゼζ、T4DNAポリメラーゼ、ファイ29D
NAポリメラーゼ、及びRB69バクテリオファージDNAポリメラーゼがある。C族と
しては、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼIIIαサブユニットがある。D族としては、
例えば、古細菌におけるユリ古細菌門サブドメイン由来のポリメラーゼがある。X族にお
けるDNAポリメラーゼとしては、例えば、真核生物DNAポリメラーゼPolβ、Polσ、
Polλ及びPolμ、並びに出芽酵母Pol4がある。Y族におけるDNAポリメラーゼとして
は、例えば、Polη、Polイオータ、Polκ、大腸菌Pol IV(DINB)、及び大腸菌PolV(Um
uD’2C)がある。DNAポリメラーゼのRT族としては、例えば、レトロウイルス逆転写
酵素及び真核生物テロメラーゼがある。典型的なRNAポリメラーゼとしては、限定しな
いが、T7RNAポリメラーゼのようなウイルスRNAポリメラーゼ;RNAポリメラー
ゼI、RNAポリメラーゼII、RNAポリメラーゼIII、RNAポリメラーゼIV、及びR
NAポリメラーゼVのような真核生物RNAポリメラーゼ;及び古細菌RNAポリメラー
ゼがある。

0097

上述の分類は説明目的のために提示するものである。分類系の変形例もあり得ることを
理解されたい。例えば、少なくとも1つの分類系C族ポリメラーゼはX族のサブカテゴリ
として分類されていた。さらに、ポリメラーゼは、機能的か又は構造的か、すなわち、上
述のように例示した構造的特徴とオーバーラップするかしないかの他の特徴に基づいて分
類することができる。幾つかの典型的特徴を以下に詳細に説明する。

0098

固有の3'-5'校正エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、幾つかの実施形態
に有用であり得る。実質的に3'-5'校正エキソヌクレアーゼ活性を持たないポリメラーゼ
も、幾つかの実施形態において、例えば、多くのシークエンシング実施形態において有用
である。エキソヌクレアーゼ活性がないことは、野生タイプ特徴、又は変異型若しくは人
改変型ポリメラーゼ構造によって与えられる特徴であり得る。例えば、外部マイナス
レノウ断片は、3'-5'校正エキソヌクレアーゼ活性を持たないクレノウ断片の突然変異型
である。クレノウ断片及びその外部マイナス変異体は、本明細書に記載の方法又は組成に
有用であり得る。他方、枯草菌(Bsu)DNAポリメラーゼI(Bsu-LF)のようなA族
DNAポリメラーゼの大きい断片は、天然では3'-5'エキソヌクレアーゼ機能を持たない

0099

3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、例えば、Lamichhane et al. J
. Am. Chem. Soc. 135:4735-4742 (2013) に記載のような分子内スイッチング及び分子間
スイッチングを受け、この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。幾
つかの実施形態において、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を持たないポリメラーゼを使用
するのが望ましい。例えば、幾つかの実施形態において、スイッチングは、ポリメラーゼ
活性に起因して生ずる1つ以上の立体配座変化を区別するのが困難であり、またシーク
シング又は他の解析に利用される立体配座変化を生ずることができる。3'-5'エキソ
クレアーゼ活性は、3'-5'エキソヌクレアーゼ領域の全て若しくは一部を除去することに
よって、又は3'-5'エキソヌクレアーゼ領域に機能喪失変異を導入することによって除去
することができる。

0100

枯草菌(Bsu)DNAポリメラーゼI(Bsu-LF)のようなA族DNAポリメラーゼは
、さらに、本明細書に記載の方法に使用するために修飾することができる。天然Bsu-LFは
システイン(Cys)残基を持たない。1つ又はそれ以上(複数)のCys残基は、Bsu-
LFの表面アクセスが可能な場所で人工改変して、テザー又はスルフヒドリル反応部分を有
する他のリンカーのための都合のよい付着部位許容することができる。Cys変異を導
入するための候補部位は、Bsu-LF又はA族における他の同族ポリメラーゼの結晶構造を視
察することによって決定することができる。

0101

さらに、Bsu-LFを人工改変して、電荷センサと好ましい相互作用する帯電残基を導入す
るのが望ましい場合がある。例えば、有益な修飾は、クレノウ断片のO-螺旋フィンガ領
域からの1つ又は複数の残基をBsu-LFの同等位置に導入することであり、この最終結果と
して、より多く帯電したアミノ酸を変異Bsu-LFに導入することができる。クレノウ断片(
図におけるPolIxx0)のO-螺旋フィンガ領域の位置及びBsu-LF(図におけるBsuxxx1)に
おける置換すべき位置を示す図7を参照されたい。同様の変化を、TaqDNAポリメラー
ゼ又はBstDNAポリメラーゼのような他のA族ポリメラーゼでも行わせることができる

0102

ポリメラーゼはその処理能力に基づいて特徴付けすることができる。ポリメラーゼは、
少なくとも約50個のヌクレオチド、100個のヌクレオチド、1,000個のヌクレオ
チド、10,000個のヌクレオチド、100,000個のヌクレオチド、又はそれ以上
平均処理能力を有することができる。代替的又は付加的に、本明細書に記載のように使
用されるポリメラーゼの平均処理能力は、例えば、多くとも100万個のヌクレオチド、
100,000個のヌクレオチド、10,000個のヌクレオチド、1,000個のヌク
レオチド、100個のヌクレオチド、又は50個のヌクレオチドであり得る。ポリメラー
ゼは、さらに、処理速度又はヌクレオチド取込み速度に基づいて特徴付けすることができ
る。例えば、多くの天然ポリメラーゼは、1秒あたり少なくとも1,000個のヌクレオ
チドの速度でヌクレオチドを取り込むことができる。幾つかの実施形態において、それよ
り遅い速度が望ましい場合があり得る。例えば、適正なポリメラーゼ及び反応条件を使用
して、最大でも1秒あたり500個のヌクレオチド、1秒あたり100個のヌクレオチド
、1秒あたり10個のヌクレオチド、1秒あたり1個のヌクレオチド、10秒あたり1個
のヌクレオチド、1分あたり1個のヌクレオチド、又はそれより遅い平均速度となるよう
にすることができる。本明細書の他の箇所でさらに詳細に説明するように、取込み速度が
天然で発生するヌクレオチドよりも遅い又は速いヌクレオチド類似体を使用することがで
きる。様々なソースのうち任意なものからのポリメラーゼは、平均処理能力又は平均処理
速度(例えば、ヌクレオチド取込み平均速度)又はその双方を増加又は減少するよう修飾
することができる。したがって、望ましい反応速度は、適切なポリメラーゼ、ヌクレオチ
ド類似体、核酸鋳型、及び他の反応条件を使用して得ることができる。

0103

使用する実施形態に基づいて、ポリメラーゼは好熱性又は熱失活性のいずれかとするこ
とができる。好熱性ポリメラーゼは、一般的に高温条件又はポリメラーゼ連鎖反応(PC
R)技術に採用されるような熱サイクリング条件に有用である。好熱性ポリメラーゼとし
ては、9oNDNAポリメラーゼに限定することなく、Taq DNAポリメラーゼ、phusion
(登録商標)DNAポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、RB69 DNAポリメラーゼ
、KODDNAポリメラーゼ、及びVentR(登録商標)DNAポリメラーゼがある。非好熱
性有機物から単離した多くのポリメラーゼは熱失活性である。例としては、ファージから
のDNAポリメラーゼである。様々なソースのうち任意なものからのポリメラーゼは、高
温条件に対する耐性を増加又は低下するよう修飾することができる。ヒートスパイク(す
なわち、短期間の上昇した温度)を使用して、アレイ内の1つ又はそれ以上の熱失活性ポ
リメラーゼは不活化するとともに、好熱性ポリメラーゼは、シークエンシング反応の後続
反応又は後続サイクルを行うために、活性状態のままにする。

0104

代替的実施形態において、数種の異なるタイプの反応成分は電荷センサの多重集合体に
わたり付着することができる。例えば、アレイにおける電荷センサの第1サブセットには
第1の種であるポリメラーゼを付着させ、またアレイにおける電荷センサの第2サブセッ
トには第2の種であるポリメラーゼを付着させることができる。2つ、3つ、又はそれ以
上の種であるポリメラーゼを使用することができる。異なる種のポリメラーゼを使用する
ことは、異なるタイプのヌクレオチド又は異なる鋳型配列に対する異なる選択性特異度
)又は感度を有するときに有用であり得る。例えば、異なるタイプのポリメラーゼは、同
一タイプのヌクレオチドを核酸の新生ストランド内に取り込むとき、電荷センサが検出可
能な相互に区別可能なシグナルを生成することができる。他の実施例において、異なるタ
イプのポリメラーゼは、少なくとも1個のDNAポリメラーゼ及び少なくとも1個のRN
Aポリメラーゼを含むことができる。このような構成は、ポリメラーゼを電荷センサに付
着させるとき、複数タイプのポリメラーゼを有することに関して非均質な流体を準備する
ことによって得ることができる。

0105

幾つかの形態において、電荷センサは、特定タイプの反応成分を1つより多く付着させ
る容量を有する。例えば、電荷センサは、ポリメラーゼを1つより多く付着させる容量を
有することができる。電荷センサのサイズ及びポリメラーゼが占有する容積空間に基づい
て、電荷センサは、少なくとも2,3,4,5,10,15,25個又はそれ以上のポリ
メラーゼを付着させる容量を有することができる。このことは、アレイに複数個の電荷セ
ンサがある場合にあり得る。以下にさらに詳細に説明するように、電荷センサの容量を減
少する、又はポリメラーゼの立体バルクを増加させる、又はそれ以外に単一ポリメラーゼ
(又は他の反応成分)の付着を助成する、という条件を、個別の電荷センサに一時的に課
すことができる。さらに、これら条件は電荷センサアレイにも適用することができる。

0106

反応成分は、従来既知の様々な化学物質のうち任意なものを使用して電荷センサに付着
することができる。例えば、化学的リンカーを使用することができる。多くの実施形態に
おいて、電荷センサの表面は、SiO2、Al2O3、HfO2、Ta2O5のうち1つ
とする。他の酸化物、例えばランタニド系元素のグループからの酸化物を使用することも
できる。リンカーに対する付着は、表面水酸基により都合よく行うことができる。特別な
実施形態において、リンカー分子は、少なくとも第1及び第2の官能基を含む。概して、
第1官能基は電荷センサと相互作用し、また第2官能基は反応成分と相互作用する。例示
的な第1官能基としては、ピレン、ベンゼンシクロヘキサン、及び2,3-ジクロロ-5,6-
ジシアノ-1,4-ベンゾキノンがある。例示的な第2官能基としては、マレイミドがある。
タンパク質を表面又は他の部分に共有結合的に結合することが知られている他の化学物質
は、サーモフィッシャー社(マサチューセッツウォルサム)又はシグマアルドリ
チ社(ミズーリ州セントルイス)によって販売されているものを使用することができる。
テザーに付着されるポリメラーゼにおける化学基は、チオール、アミン又はカルボキシル
基とすることができる。導電チャネルがSWNTである若干の実施形態において、SWN
Tの表面は、厚さがおよそ原子1個分のグラファイト層である。リンカー分子は、1個又
は数個の炭素原子に共有結合的に結合することができる、又はSWNTの側壁にπ-πス
タッキングによって相互作用することができる。

0107

反応成分は、例えば、受容体とリガンドとの間に形成されるような非共有結合性の結合
によって電荷センサに付着することができる。特に有用な結合は、ストレプトアビジン
又はその変異体若しくは類似体)とビオチン(又はその類似体)との間における結合、相
補的核酸相互間における結合、抗体とエピトープとの間における結合、等々である。上述
の対要素は、反応成分及び電荷センサにそれぞれ結合することができ、反応成分を含む流
体が、電荷センサを有する固体支持体に接触する結果として、反応成分を電荷センサにテ
ザー係留する非共有結合性の結合を成立させる。

0108

幾つかの実施形態において、流体からの反応成分は電荷センサに付着して導電性テザー
を形成する。例示的導電性テザーとしては、ドープしたポリチオフェン、ポリ(3,4-エチ
レンジオキシチオフェン)、ポリアセチレン、ポリピロール、ポリアニリン、ポリフルオ
レン、ポリフェニレン、ポリピレン、ポリアズレン、ポリナフタレン、ポリカルバゾール
、ポリインドール、又はポリアゼピンの構造がある。これらテザー構造の電荷ドーピング
は、ポリマーの酸化によって得ることができる。導電性テザー及びそれらを生成する例示
的な方法は、それぞれ参照によって本明細書に組み入れられる以下の文献に記載されてい
る。すなわち、Vernitskaya et al. Russ. Chem. Rev. 66:443ff (1997)、MacDiarmid, A
ngew. Chem., Int. Ed. 40:2581-2590 (2001)又はMcNeill et al., Aust. J. Chem. 16:1
056-75 (1963) 参照。

0109

特別な実施形態において、固体支持体は、ウェル、チューブチャンネルキュベット
、ペトリプレートボトル等のような容器内又は容器の一部とすることができる。特に有
用な容器は、例えば、米国特許出願公開第2010/0111768号又はBentley et a
l., Nature 456:53-59 (2008)に記載のようなフローセルであり、これら文献は参照によ
って本明細書に組み入れられるものとする。代表的なフローセルは、イルミナ社(カリフ
ォルニアサンディエゴ)から市販されているものがある。フローセルは、反応成分の電
荷センサへの付着中、又は電荷センサ上での反応成分で生ずるその後の反応中にバルク試
薬を電荷センサのアレイに送給するのに都合がよい。核酸シークエンシング反応のような
循環プロセスは、フローセルデバイスに特に適している。特に有用な他の容器は、多重ウ
ェルプレート又はマイクロタイタープレートにおけるウェルである。

0110

本明細書に記載の方法は、複数個の電荷センサを、複数の特定タイプの反応成分を含む
流体に接触させるステップであって、この接触は、前記複数の特定タイプの反応成分が前
記複数個の電荷センサに流体連通し、また前記反応成分が電荷センサに付着するという条
件の下で行う、該ステップを有することができる。この結果は、流体内における反応成分
の数が、流体と接触する電荷センサの数よりも多いときでも、各電荷センサに単一の反応
成分が付着することになり得る。特定タイプの反応成分のうち1つ、かつ唯一の反応成分
が付着する電荷センサの割合は、ポアソン分布に従うと期待される。ポアソン分布は、反
応成分がバルク流体内で電荷センサに送給されたとき、特定タイプの反応成分のうち単一
に1つの反応成分が付着する電荷センサの割合を最大37%占有率に設定する。しかし、
本明細書に記載の方法によれば、特定タイプの反応成分のバルク流体送給により、特定タ
イプの単一反応成分が占有する電荷センサは、電荷センサ個数の35%、40%、50%
、75%、90%、95%、又は99%より多い結果となり得る。

0111

本発明方法の幾つかの実施形態において、反応成分は、例えば、拡散又は他の受動的
ロセスによって、バルク溶液から電荷センサに輸送される。反応成分の電荷センサに対す
る付着は、例えば、本明細書に記載した又は従来既知の化学物質によって生ずることがで
きる。代案として、反応成分は、例えば、電界(e-場)支援輸送により、電荷センサに
能動的に輸送することができる。さらに、反応成分の電荷センサに対する付着は、本明細
書に記載した又は従来既知の化学物質を使用する結果として生ずることができる。

0112

本明細書に記載した上述の方法は、電荷センサを含む部位への反応成分の電界(e-場
)支援輸送を使用するよう変更することができる。例えば、固体支持体上の各電荷センサ
を、電源に電気的に接続した部位に存在させ、ポリメラーゼ又は他の反応成分をその部位
引き付ける、又はその部位における電荷センサの近傍に引き付ける電荷を生ずることが
できる。検体をアレイ部位に引き付けるようe-場を使用する代表的な方法及び装置は、
参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2009/0032401号
に記載されている。e-場支援は、例えば、複数の異なるポリメラーゼ(又は他の反応成
分)が溶液内に存在し、これによりこれらポリメラーゼが複数個の電荷センサと流体連通
するという条件の下で、本発明方法に使用することができる。各電荷センサ部位における
電荷は、ポリメラーゼ(又は任意な他の特定タイプの反応成分)の所望輸送速度又は輸送
量を達成するよう調整することができる。

0113

e-場支援輸送を使用する特別な実施形態において、e-場は、ポリメラーゼ(又は任意
な特定タイプの反応成分)を電荷センサに付着させるのに使用される反応の全行程にわた
り一定に印加することができる。代案として、e-場は、付着反応が進行し、また電荷セ
ンサがポリメラーゼ(又は任意な他の特定タイプの反応成分)で充填されるにつれて変化
させる(増加又は減少する)ことができる。例えば、e-場増加は、ポリメラーゼが付着
する電荷センサの数を増加する利点をもたらすことができる。e-場が増加する割合、及
びこの増加のための強度範囲は、時間とともに増加する電荷センサへの反応成分の輸送速
度と、同一時間の期間にわたりポリメラーゼが付着することになった増加する電荷センサ
の数とのバランスをとるよう選択することができる。e-場の変化割合は、ポリメラーゼ
付着の予想される又は期待される割合に基づくようにすることができる。代案として、e
-場は、本明細書でさらに詳細に説明するように、電荷センサに対するポリメラーゼ付着
の経験上の検出に応じて変化させることができる。

0114

特別な実施形態において、e-場は、電荷センサを有するアレイの部位全体にわたりほ
ぼ均一に印加することができる。従って、溶液内に存在するポリメラーゼ(又は他の反応
成分)は、任意な所定電荷センサに輸送される確率が等しくなる。代替的実施形態におい
て、e-場は、アレイが存在する電荷センサ部位のサブセットにのみ印加することができ
る。このようにして、e-場支援は、ポリメラーゼ(又は他の反応成分)を他の電荷セン
サよりも幾つかの電荷センサに選択的に付着させるのに使用することができる。さらに、
所望である場合、ポリメラーゼを電荷センサ部位の第1サブセットに輸送するため、吸引
電荷を電荷センサ部位の第1サブセットに付与するとともに、忌避電荷を電荷センサ部位
の第2サブセットに付与して、それら部位にポリメラーゼが輸送されるのを抑制する、又
はポリメラーゼを第2サブセットの部位から排除する(例えば、脱離又は減成によって)
することができる。同様に、忌避電荷を、電荷センサを含まないアレイの格子間領域に付
与し、ポリメラーゼが格子間領域に輸送されるのを抑制する、又は格子間領域からポリメ
ラーゼを排除する(例えば、脱離又は減成によって)することができる。

0115

多くの実施形態において、電荷センサに使用する増幅器センサ自体よりも相当大きい
空間を占有する。例えば、読出し回路は、検出デバイスにおけるいずれかの箇所における
2×2ミクロン〜20×20ミクロンの面積を占有するとともに、単一ナノワイヤトラン
ジスタは100×500ナノメートルほどの小さい面積を占有することができる。電荷セ
ンサアレイのサイズ及び寸法は、幾つかの実施形態において、例えば、増幅器が各電荷セ
ンサに対して存在する場合、多重増幅器が占有する空間によって制限され得る。この制限
は、本発明装置及び方法の特別な実施形態において、各増幅器が数個の電荷センサに動作
可能に接続されるよう電荷センサのアレイを構成することによって克服することができる
。例えば、2,3,4,5,6,8,10個又はそれより多い個数の電荷センサを同一増
幅器に接続することができる。このようにして、増幅器と電荷センサ間に1対1の接続が
ある形態よりも、電荷センサが高密度にアレイ上に存在することができる。動作にあたり
、増幅器は、増幅器に接続されている(又は一度に接続された)多くの電荷センサのうち
1つのみの電荷センサからの信号を増幅するよう割り当てることができる。例えば、電荷
センサアレイは、複数の特定タイプの反応成分を含む流体に接触することによって装填
ることができる。この装填技術の結果、相当多くの数の電荷センサに1つ以上の特定タイ
プの反応成分が付着し、その他の電荷センサにはそのタイプの反応成分装填が全くない結
果となる。共通増幅器に接続した数個の電荷センサのうち、単一反応成分のみが付着する
単一センサは、過装填又は無装填状態の他のセンサから区別することができ、また増幅器
は、単一の装填があった電荷センサからの信号を捕捉するとともに、増幅器に接続されて
いる(又は一度に接続された)他の電荷センサからの信号は捕捉しないよう割り当てるこ
とができる。

0116

幾つかの実施形態において、個別の電荷センサは、1つより多い特定タイプの反応成分
に対する容量を有する。ポリメラーゼを例にとると、各電荷センサは、一度に数個のポリ
メラーゼ分子を付着する容量を有することができる。このような場合、ポリメラーゼは、
他の忌避部分に結合する1つより多いポリメラーゼが個々の電荷センサに付着するのを立
体的に阻害する空間容積部を占める忌避部分に付着することができる。同様に、忌避部分
は、他の忌避部分に結合する1つより多いポリメラーゼが同一電荷センサに付着するのを
静電的に阻害する電荷極性を有することができる。

0117

特に有用な忌避部分は核酸である。忌避核酸は、立体的及び静電的な双方の阻害をもた
らし、占有を制限することができる。忌避核酸は、ポリメラーゼ、核酸酵素及び核酸に対
する結合親和性を有する他の反応成分によく適合する。しかし、このタイプの親和性は必
ずしも必要ではなく、これはすなわち、例えば、リンカー、テザー、及び本明細書に記載
の又は従来既知の付着用の化学物質を用いて、忌避核酸を反応成分に付着させる合成方法
を使用できるからである。忌避核酸の長さ、配列組成、又は二次構造は、所望占有度を得
るために調節することができる。例えば、電荷センサに付着する反応成分に対する比較的
大きな容量を電荷センサが有するとき、より大きな核酸を使用することができる。より小
さい核酸は、より小さい電荷センサに対する装填を制限するのに(又は比較的大きな反応
成分又は高度に帯電した反応成分を使用し、したがって、忌避特性には僅かな増加だけで
済むとき)十分であり得る。核酸は、さらに忌避部分として有用であり、これはすなわち
、核酸の配列は、ポリメラーゼ又は他の核酸酵素に対する所望結合特性が得られるよう選
択することができるからである。

0118

幾つかの実施形態において、忌避核酸は、ナノボール構造に圧密化することができる。
核酸圧密化方法は、従来既知であり、例えば、Bloomfield, Curr. Opin. Struct. Biol.
6(3): 334-41 (1996)、及び米国特許出願公開第2007/0099208号に記載され
ており、これら文献は、参照によって本明細書に組み入れられるものとする。例えば、ア
ルコール、又はスペルミン若しくはスペルミジンのようなポリアミンを使用することがで
きる。圧密化された核酸は、圧密化剤又は圧密化条件がない核酸構造よりもずっと密に締
め固められた構造を有し、この構造は、一般的にボール又は小球に類似する。このように
圧密化した核酸ボールの作成は、忌避部分を生成するのに有用である。種々の方法を使用
して所望サイズのボールを作成することができ、この作成は、例えば種々の圧密化技術を
使用して及び/又は単位複製配列における複製の数を変化させることによって行うことが
できる。概して、圧密化した単位複製配列は、約0.1μm〜約5μmの範囲にわたる、
例えば、約0.1μm、約0.2μm、約0.5μm、約1μm、約2μm、約3μm、約
4μm、及び約5μmの平均直径又は幅を有する。

0119

他のポリマー分子も忌避部分として有用であり、例えば、限定しないが、ポリエチレン
グリコール、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、テフロン(登録商標)
ナイロン(登録商標)、ポリアミドポリアセタールポリエステルブナゴム、ポ
リアクリレート、ポリスチレン、及びポリクロトリフルオロエテンがある。固体支持体
材料で形成したビード若しくは粒子、又はゲルも忌避部分として機能することができる。

0120

忌避部分は反応成分に付着したままの状態で、反応成分は、反応成分が付着した電荷セ
ンサによって検出すべき特定反応に関与することができる。例えば、ポリメラーゼが装填
され、また電荷センサに付着するとともに、ポリメラーゼに結合した忌避部分は、電荷セ
ンサが検出するその後のヌクレオチド付加反応でポリメラーゼに付着したままの状態とな
ることができる。代案として、この忌避部分は、反応成分が電荷センサに付着した後に、
反応成分から除去できる。再びポリメラーゼを例にとると、忌避核酸のような忌避部分は
、ポリメラーゼが検出される反応で標的核酸に関与した後にポリメラーゼから除去するこ
とができる。ポリメラーゼ又は他の反応成分に結合した忌避部分は、除去結果を得ること
が当業者に既知の技術によって除去することができる。例えば、非共有結合的に結合した
部分は、洗浄、又は反応成分に結合する他の部分を使用した競合的置換によって除去する
ことができる。共有結合的に結合した部分は、テザー開裂につき本明細書に記載したよう
な化学的又は物理的な手段によって除去することができる。反応成分から除去した忌避部
分は、反応成分が付着したままの電荷センサから洗い流すことができる。

0121

幾つかの実施形態において、1つより多い特定タイプの反応成分に対する容量を有する
電荷センサは過装填し、個別の電荷センサに数個の反応成分が付着し、またこの後反応成
分を電荷センサから除去(又は不活化若しくは分解)し、単一活性反応成分のみが個別の
電荷センサに付着した状態にすることができる。例えば、反応成分を電荷センサに付着さ
せる方法を実施して、各反応成分とその反応成分が付着する電荷センサとの間に開裂可能
テザーを生成できる。幾つかの場合において、流体で送給される反応成分が開裂可能テザ
ーの前駆体を含む、又は電荷センサが開裂可能テザーの前駆体を含む、又は反応成分及び
電荷センサの双方が、互いに反応して開裂可能テザーを形成する前駆体を含むことができ
る。

0122

開裂可能テザーは、物理的又は化学的プロセスに起因する結合破壊によって開裂するこ
とができる。例えば、本明細書に記載の方法は、光化学的開裂、電気化学的開裂、電界、
機械的撹拌、化学的開裂又は熱によって開裂可能テザーを開裂するステップを有すること
ができる。有用な開裂可能なテザー及びそれらの前駆体としては、タンパク質の変性に使
用するものがあり、また例えば、サーモ・フィッシャー社(マサチューセッツ州ウォルサ
ム)又はシグマ・アルドリッチ社(ミズーリ州セントルイス)によって販売されているも
のがある。

0123

他の方法を使用して1つ又はそれ以上の反応成分を電荷センサから除去することができ
る。例えば、この除去は、1つ又はそれ以上の反応成分を電荷センサから分解することに
より行うことができる。分解は、熱、光−酸化、超音波処理等のような物理的方法によっ
て行うことができる。化学的分解も可能であり、例えば、pH変化、化学的変性剤タン
パク質分解酵素(プロテアーゼ)等を使用して行う。幾つかの場合において、分解の程度
は、センサに付着した反応成分に保護部分を接触させることによって調節することができ
る。電荷センサアレイに塗布する保護部分の量は、電荷センサあたりの平均で単一反応成
分に結合する結果が得られるよう滴定することができる。分解を順次に行うとき、各電荷
センサに付着したすべての、しかし保護された反応成分が分解されるようにする。このこ
とにより、単一反応成分が各電荷センサに付着した状態のままとなる。保護部分は、電荷
センサによって検出される反応に関与するとき、反応成分に結合したままとなることがで
きる、又は保護部分を除去することができる。幾つかの場合において、分解は、ポリメラ
ゼ活性部位を化学的又は光化学的に活性のオリゴヌクレオチド類似体に結合することに
よって起こり得る。化学的又は光化学的な処理を加えて、オリゴヌクレオチド類似体をポ
リメラーゼに架橋することができる。この結果、これらポリメラーゼは、標的核酸又はプ
ライマーを受容不能となり得る、又はポリメラーゼは、電荷センサによって検出されるこ
とになる立体配座変化(例えば、開−閉立体配座変化)ができないようになり得る。

0124

有用な保護部分の例は、DNAナノボールのような核酸である。例えば、ポリメラーゼ
又は他の核酸酵素に結合するのに核酸を使用して、変性又は化学的修飾に対する安定性を
付与することができる。核酸は、さらに、プロテアーゼが電荷センサに付着したポリメラ
ーゼにアクセスするのを阻止する立体的ブロックをもたらす。他の例はプライマー交雑し
単一ストランドDNAであり、この場合、プライマーの3′末端がポリメラーゼの触媒
中心に結合し、反応性ポリメラーゼ失活部分の結合を阻止する。保護部分の他の例は、特
異的にポリメラーゼを標的にする構体のようなタンパク質である。タンパク質又は抗体は
化学修飾に対する保護を行う、又はプロテアーゼがポリメラーゼにアクセスするのを阻
止する立体的ブロックをもたらす。抗体を除去するのが望ましい場合、抗体は、例えば、
熱を用いて除去することができる。適切な温度は、抗体がもはや安定的にポリメラーゼに
結合せず、ただしポリメラーゼが安定するような温度である。忌避部分として使用するた
めの例示した材料とは別の材料を保護部分に供することができる。

0125

過剰な反応成分の電荷センサからの分解、不活化又は除去は、分解又は除去の程度を決
定する電荷センサのモニタリングを行って又は行わずに、実施することができる。例えば
、特別な実施形態において、特定タイプの1つ又は複数の反応成分を変容した電荷センサ
から除去するプロセスは、(i) 1つ又はそれ以上の反応成分を各変容した電荷センサから
除去するステップと、(ii) 複数反応成分の存在を単一反応成分の存在から区別するよう
電荷センサをモニタリングするステップと、(iii) 各変容した電荷センサに単に1つの反
応成分が残るよう除去を中断するステップと、を有する。電荷センサの状態は、電荷セン
サからの信号変化を検出することによってモニタリングできる。代替的に又は付加的に、
電荷センサ表面における反応成分の有無を検出する異なるセンサを使用することができる
。様々な検出モダリティのうち任意なものを使用することができ、例えば、反応成分にお
ける蛍光標識を検出する蛍光光度法光散乱方法発色団を検出する吸光法、並びにタン
パク質及び他の反応成分の検出に関与する従来既知である他の解析的検出方法を使用する
ことができる。

0126

本発明方法は、少なくとも1個の電荷センサを備える固体支持体に1つ又は複数の標的
核酸を供給するステップを有する。特別な実施形態において、電荷センサには、前もって
所望反応で核酸と反応する他の反応成分を付着させておき、この他の反応成分と例として
は、ポリメラーゼのような核酸酵素がある。他の実施形態において、標的核酸を電荷セン
サに送給することができ、この送給は、他の反応成分(例えば、核酸酵素又はポリメラー
ゼ)を電荷センサに送給する前又は同時に行うことができる。

0127

本発明方法又は装置に使用する標的核酸は、DNA、RNA又はそれらの類似体から成
るものとする。標的核酸のソースは、ゲノムDNA、メッセンジャーRNA、又は天然ソ
ースからの他の核酸とすることができる。幾つかの場合において、このようなソース由来
の標的核酸は、本発明方法又は組成に使用する前に増幅することができる。様々な既知の
増幅技術、例えば、限定しないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR:polymerase chain r
eaction)、ローリング・サークル増幅(RCA:rolling circle amplification)、多
置換増幅(MDA:multiple displacement amplification)、又はランダムプライム
幅(RPA:random prime amplification)を使用することができる。本明細書に記載の
方法又は装置で使用する前の標的核酸の増幅は随意的なものである。このように、標的核
酸は、本明細書に記載の方法及び組成の幾つかの実施形態においては、使用前に増幅しな
いこともある。標的核酸は、随意的に合成ライブラリから抽出することができる。合成核
酸は、天然のDNA若しくはRNA組成を有することができ、又はそれらの類似体とする
ことができる。

0128

標的核酸を抽出できる代表的生物サンプルとしては、例えば、齧歯類マウスラット
ウサギモルモット有蹄動物ヤギ霊長類、ヒト若しく
非ヒト動物のような哺乳動物シロイヌナズナトウモロコシソルガムオート麦
小麦、米、菜種、若しくは大豆のような植物;緑藻クラミドモナスのような藻類シノ
ブディス・エレガンスのような線形動物キイロショウジョウバエミバエミツバ
チ若しくは蜘蛛のような昆虫ゼブラフィッシュのような魚類は虫類カエル若しくは
アフリカツメガエルのような両生類キイタマホコリカビニューモシスティスカリ
ニ、トラフグ酵母サッカロマイセスセレビシア若しくはシゾサッカロミセスポン
ベのような菌類;又は熱帯熱マラリア原虫からのものがある。標的核酸は、さらに、バク
テリア、大腸菌、ブドウ球菌若しくは肺炎マイコプラズマのような原核生物;古細菌;C
型肝炎ウイルスエボラウイルス若しくはヒト免疫不全ウイルスのようなウイルス;又は
ウイロイドから抽出することもできる。標的核酸は、上述した生物の均質な培養物若しく
個体群から、又は代案的に、例えば、群落若しくは生態系における数種の異なる生物の
集合体から抽出することができる。

0129

標的核酸は、天然のソースから抽出する必要はなく、その代わりに既知の技術を用いて
合成することができる。例えば、遺伝子発現プローブ又は遺伝子型決定プローブを合成し
、また本明細書に記載の方法及び装置に使用することができる。

0130

幾つかの実施形態において、標的核酸は、1つ又は複数のより大きい核酸の断片として
得ることができる。断片化は、例えば、噴霧化、超音波処理、化学的開裂、酵素開裂、又
は物理的剪断を含めて、従来既知の様々な技術のうち任意なものを用いて実施することが
できる。さらに、断片化は、より大きい核酸の一部のみを複製することにより単位複製配
列を生成する特別な増幅技術を使用する結果として得ることもできる。例えば、PCR増
幅は、増幅中に側面にあるプライマーが交雑する位置間の原鋳型におけるヌクレオチド配
列の長さによって規定されるサイズを有する断片を生成する。

0131

標的核酸又はその単位複製配列の母集合は、平均ストランド長さを有することができ、
この長さは、本明細書に記載の方法又は装置の特定用途にとって望ましい又は適切なもの
とする。例えば、平均ストランド長さは、約100,000個未満のヌクレオチド、50
,000個未満のヌクレオチド、10,000個未満のヌクレオチド、5,000個未満
のヌクレオチド、1,000個未満のヌクレオチド、500個未満のヌクレオチド、10
0個未満のヌクレオチド、又は50個未満のヌクレオチドとすることができる。代替的又
は付加的に、平均ストランド長さは、10個より多いヌクレオチド、50個より多いヌク
レオチド、100個より多いヌクレオチド、500個より多いヌクレオチド、1,000
個より多いヌクレオチド、5,000個より多いヌクレオチド、10,000個より多い
ヌクレオチド、50,000個より多いヌクレオチド、又は約100,000個より多い
ヌクレオチドとすることができる。標的核酸又はその単位複製配列の母集合における平均
ストランド長さは、上述の最大値及び最小値セットの間の範囲にあるものとすることがで
きる。

0132

幾つかの場合において、標的核酸の母集合は、ある条件の下で生成することができる、
又はその集合要素に対する最大長さを有するよう構成することができる。例えば、本明細
書に記載の方法の1つ又は複数のステップに使用される集合要素の最大長さは、約100
,000個未満のヌクレオチド、50,000個未満のヌクレオチド、10,000個未
満のヌクレオチド、5,000個未満のヌクレオチド、1,000個未満のヌクレオチド
、500個未満のヌクレオチド、100個未満のヌクレオチド、又は50個未満のヌクレ
オチドとすることができる。代替的又は付加的に、標的核酸又はその単位複製配列の母集
合は、ある条件の下で生成することができる、又はその集合要素に対する最小長さを有す
るよう構成することができる。例えば、本明細書に記載の方法の1つ又は複数のステップ
に使用され、特定組成に存在する集合要素の最小長さは、約10個より多いヌクレオチド
、50個より多いヌクレオチド、100個より多いヌクレオチド、500個より多いヌク
レオチド、1,000個より多いヌクレオチド、5,000個より多いヌクレオチド、1
0,000個より多いヌクレオチド、50,000個より多いヌクレオチド、又は約10
0,000個より多いヌクレオチドとすることができる。集合における標的核酸の最大ス
トランド長さ及び最小ストランド長さは、上述の最大値及び最小値セットの間の範囲にあ
るものとすることができる。

0133

本発明は、核酸を検出する方法を提供する。本発明方法は、(a)固体支持体型の電荷セ
ンサにテザー係留した、ヌクレオチドに結合するタンパク質(例えば、ポリメラーゼ)を
準備するステップと、(b) ヌクレオチドの存在を電荷センサによって検出できるよう1つ
又は複数の標識付けしたヌクレオチドを準備するステップであって、標識が電荷センサの
近傍にあるとき標識の存在を電荷センサが検出できるようにするステップと、及び(c) 電
荷センサを使用して標識付けしたヌクレオチドのタンパク質に対する結合を検出するステ
ップと、を有することができる。

0134

ポリメラーゼのような核酸結合酵素に対するヌクレオチドの結合は、酵素が付着する電
荷センサ周りの電界(場)における検出可能な撹乱を生ずることになる酵素に対する電荷
標識の漸増に基づいて検出することができる。代表的電荷標識は本明細書で既に記載して
ある。特別な実施形態において、電荷標識は、ヌクレオチドのβ又はγ-リン酸塩位置に
付着する。ヌクレオチドのβ又はγ-リン酸塩位置での標識付着の利点は、ヌクレオチド
を新生ストランドに取り込むとき、ポリメラーゼの触媒活性によって標識を除去できる点
である。しかし、標識は、必ずしもポリメラーゼ活性によって除去する必要はない。した
がって、標識は、例えば、リンカーを介在させることを含めてヌクレオチドにおける様々
な位置のうち任意な位置でヌクレオチドの塩基部分に付着することができる(例えば、参
照によって本明細書に組み入れられるものとする、米国特許第7,427,673号、同
第7,414,116号、及び同第7,057,026号、並びに国際公開第91/06
678号及び同第07/123744号参照)。標識は、さらに、ヌクレオチドのα-リ
ン酸塩位置、又はヌクレオチドのリボース部分に付着することもできる。ヌクレオチドの
様々な部分のうち任意な部分に付着した標識は、随意的に、検出された後に、例えば、電
荷リンカーの開裂によってヌクレオチドから開裂することができる。

0135

本明細書に記載の方法又は装置に使用する標識は、さらに、オリゴヌクレオチド部分を
含むことができる。代表的オリゴヌクレオチド部分としては、上述したように、DNA、
RNA、及びPNAがある。本明細書において先に例示したように、オリゴヌクレオチド
部分は、核酸テザー又は他の核酸と交雑して、電荷センサの所望距離で生ずる電界撹乱を
限局するのに有用であり得る。オリゴヌクレオチド部分は、ヌクレオチドと帯電した部分
との間の中間構造として生ずることができる。しかし、電荷部分は随意的なものであり、
ヌクレオチドに対する付着ポイントの遠位にあるオリゴヌクレオチド部分の末端に位置す
る必要はない。数種類の実施形態を、核酸テザーと相互作用するオリゴヌクレオチド部分
を有するヌクレオチド類似体に関連して例示したが、ヌクレオチド類似体は、オリゴヌク
レオチド部分の代わりに他のリンカー成分を有することができる。リンカー成分は、結合
対の一方の要素を備え、この一方の要素は、テザーの一部である他方の要素と相互作用す
る。

0136

幾つかの場合において、異なるヌクレオチドタイプに異なる標識を付着することができ
る。したがって、標識から生ずる信号の差を使用して、異なるヌクレオチドタイプを区別
することができる。このことは、核酸シークエンシング方法に特に有用であり、この核酸
シークエンシング方法では、数種類の異なるタイプのヌクレオチドをポリメラーゼに送給
し、検出イベント中に数種類の異なるタイプのヌクレオチドが並列的に存在する。例えば
、4つの異なる電荷部分を有する4つの異なるヌクレオチドを、図2及び図3につき既に
例示したように使用することができる。代替的又は付加的に、標識部分は、異なるテザー
配列と交雑して、電荷センサで相互に明確に異なる信号を生成するオリゴヌクレオチド部
分を含むことができる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載した方法に使用する
数種類の標識付けしたヌクレオチドは、それぞれ異なる電荷標識を有するが、各標識付け
したヌクレオチドそれぞれは、同一の不動化されたテザー配列に対して交雑できるオリゴ
ヌクレオチド部分を有する。上述したように、異なるヌクレオチド類似体は、異なる長さ
のオリゴヌクレオチド部分を有することができ、又は代案として、2つ又はそれ以上のヌ
クレオチド類似体は、同一長さのオリゴヌクレオチド部分を有することができる。

0137

異なるヌクレオチドは必ずしも異なる標識を持つ必要はない。異なるヌクレオチドは、
反応に対して別個に送給することができ、この送給は、送給される時点及び場所に対する
知識に基づいてヌクレオチドが区別されるように行う。例えば、シークエンシング反応は
、1サイクル毎に4つの個別ヌクレオチドの順次添加を含み、ヌクレオチド添加相互間で
の洗浄を伴うことができる。この個別ヌクレオチド送給は、異なるヌクレオチドが一意的
な標識付けか、又は一様な標識付けかに基づいて行うことができる。

0138

特別な実施形態において、核酸シークエンシング(塩基配列決定)方法は、(a)固体支
持体型の電荷センサにテザー係留したポリメラーゼを準備するステップと、(b) 標識の存
在を電荷センサによって検出できるよう1つ又は複数の標識付けしたヌクレオチドを準備
するステップであって、標識が電荷センサの近傍にあるとき標識の存在を電荷センサが検
出できるようにするステップと、及び(c) 電荷センサを使用して鋳型核酸に相補的な新生
ストランドへの標識付けしたヌクレオチドの取り込みを検出するステップと、によって行
うことができる。複数回の取込みイベントは、順次に検出して配列を決定することができ
る。代案として、単一取込みイベントのみを各新生ストランドに対して検出し、この情報
を新生ストランドの配列に対する知識を組み合わせて配列に到達する。

0139

複数の実施形態において、固体支持体は、ポリメラーゼにテザー係留した複数個の電荷
センサを備え、本発明方法は、複数のポリメラーゼにおける各ポリメラーゼの位置で鋳型
核酸に対して相補的な新生ストランドへの標識付けしたヌクレオチドの取り込みを検出す
るステップを含む。複数の実施形態に使用する複数のポリメラーゼは、随意的に、少なく
とも2つの異なるタイプのポリメラーゼを含むことができる。異なるタイプのポリメラー
ゼは、同一タイプのヌクレオチドを新生核酸ストランドに取り込むとき、前記電荷センサ
が検出可能な相互に区別できるシグナルを生成するよう選択することができる。このよう
にして、異なる付着ポリメラーゼ(各電荷センサあたり1個のポリメラーゼ)を有する電
荷センサアレイは、より多くの様々な核酸配列を区別することができ、又は電荷センサに
単に1つのタイプのポリメラーゼを有するアレイを使用して得られるよりも大きい感度を
得ることができる。例えば、2つの異なるポリメラーゼの作用によってシークエンシング
するとき、同一鋳型は2つの異なる一連の信号列を生成する。2つの信号列を比較する又
は組み合わせて使用し、単に1つのタイプのみのポリメラーゼからの単一信号列に基づい
て導き出すことができるよりも正確なヌクレオチド配列を得ることができる。

0140

例えば、本明細書に記載した方法によって得られる本発明のアレイは、多様な用途の任
意なものに使用することができる。特に有用な用途は、核酸シークエンシングである。そ
の一例は、シークエンシング・バイ・シンセシス(SBS)である。SBSにおいて、核
酸鋳型に沿う核酸プライマーの拡張をモニタリングして、鋳型におけるヌクレオチド配列
を決定する。その根底の化学的プロセスは重合(例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒
されるときの)であり得る。特別なポリメラーゼに基づくSBS実施形態において、ヌク
レオチドを鋳型依存でプライマーに添加し(従って、プライマーを拡張し)、プライマー
に添加されるヌクレオチドの順序及びタイプの検出を使用して、鋳型の配列を決定するこ
とができる。上述のアレイにおける異なる電荷センサでの複数の異なる鋳型は、或る条件
の下でSBS技術を受けることができ、異なる鋳型で発生する事象(イベント)は、アレ
イにおける特定電荷センサの位置により区別することができる。

0141

フローセルは、本発明方法によって得られ、また各サイクルにおける繰り返しの試薬送
給を含むSBS又は他の検出を受けるアレイを収容する都合のよいフォーマットを提供す
る。例えば、第1SBSサイクルを開始するため、1つ又はそれ以上(複数)のヌクレオ
チドを、電荷センサのアレイを収容するフローセルに流入/通過させることができ、各電
荷センサは付着したポリメラーゼを有し、このポリメラーゼには核酸鋳型が結合すること
ができる。アレイにおけるプライマーの拡張がヌクレオチドの取込みを生ぜしめる部位を
検出することができる。随意的に、ヌクレオチドは、さらに、ヌクレオチドをプライマー
に添加した後にプライマーの拡張を終端させる可逆的終端特性を有することができる。例
えば、可逆的終端部分を有するヌクレオチド類似体は、ブロック解除剤を送給して可逆的
終端部分を除去するまで、その後の拡張を生ずることができなくなるよう、プライマーに
添加することができる。このようにして、可逆的終端部を使用する実施形態に対しては、
ブロック解除剤をフローセルに送給する(検出を行う前又は後に)ことができる。種々の
送給ステップ相互間で洗浄を行うことができる。この後、サイクルをn回繰り返し、n個
のヌクレオチド分だけプライマーを拡張し、長さnの配列を検出することができる。本発
明方法で得られるアレイの使用に容易に適合できる代表的SBS手順及び流体系としては
、以下の文献、すなわち、Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)、国際公開第04
/018497号、米国特許第7,057,026号、国際公開第91/06678号、
同第07/123744号、米国特許第7,329,492号、同第7,211,414
号、同第7,315,019号、同第7,405,281号、及び米国特許出願公開第2
008/0108082号に記載されており、これら文献は参照により本明細書に組み入
れられるものとする。

0142

シークエンシング・バイ・ライゲーション(連結)反応も有用であり、これは以下の文
献、すなわち、Shendure et al. Science 309:1728-1732 (2005)、米国特許第5,599
,675号、及び同第5,750,341号に記載されており、これら文献は参照により
本明細書に組み入れられるものとする。幾つかの実施形態において、例えば、以下の文献
、すなわち、Bains et al., Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988) 、
Drmanac et al., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998) 、Fodor et al., Science 25
1(4995), 767-773 (1995) 、及び国際公開第1989/10977号に記載されている、
シークエンシング・バイ・ハイブリダイゼーション(交雑)手順を含むことができ、これ
ら文献は参照により本明細書に組み入れられるものとする。シークエンシング・バイ・ラ
イゲーション手順及びシークエンシング・バイ・ハイブリダイゼーション手順の双方にお
いて、標的核酸(又はそれらの単位複製配列)はオリゴヌクレオチドの送給及び検出の繰
り返しサイクルを受ける。このような方法は、文献に公表された方法に記載の光標識によ
蛍光検出の代わりに、リガーゼ立体配座変化を検出するよう、又は電荷標識付けしたオ
リゴヌクレオチドを検出するよう、容易に変更することができる。

0143

例えば、本明細書に記載の方法によって得られた本発明のアレイに関する他の有用な用
途は、遺伝子発現解析である。遺伝子発現は、RNAシークエンシング技術、例えば、デ
タルRNAシークエンシングと称される技術を用いて検出又は定量化することができる
。RNAシークエンシング技術は、本明細書で上述した従来既知のシークエンシング方法
論を用いて実施することができ、ただし、光標識付けヌクレオチドの蛍光検出は、本明細
書記載の電荷に基づく方法に置き換えることができる。遺伝子発現は、さらに、アレイに
対する直接ハイブリダイゼーションで行うハイブリダイゼーション技術を用いて、又は生
成物がアレイ上で検出される多重分析を用いて検出又は定量化することができる。アレイ
に基づく発現及び遺伝子型決定解析に使用できる代表的分子生物学的解析は、以下の、す
なわち、米国特許第7,582,420号、同第6,890,741号、同第6,913
,884号、同第6,355,431号、米国特許出願公開第2005/0053980
号、同第2009/0186349号、又は同第2005/0181440号に記載され
ており、これら文献は参照によって本明細書に組み入れられるものとする。これら方法は
、光標識及び蛍光検出を、電荷に基づく検出技術、及び本明細書記載の電荷標識に置き換
えることによって容易に適合させることができる。

0144

本発明によって提供される核酸シークエンシング方法は、(a)固体支持体型の電荷セン
サにテザー係留したポリメラーゼを準備するステップと、(b)可逆的ターミネーター部分
を有する1つ又は複数の標識付けしたヌクレオチドを準備して、標識が前記電荷センサ近
傍にあるとき前記標識の存在を前記電荷センサによって検出できるようにするステップと
、(c)前記電荷センサを用いて、鋳型核酸に対して相補的な新生ストランドへの前記1つ
又は複数の標識付けしたヌクレオチドの取り込み、及びこれによる可逆的に終端した新生
ストランドの形成を検出する検出ステップと、(d) 前記可逆的に終端した新生ストランド
を変容させて、前記新生ストランドがヌクレオチドを一層取り込めるようにするステップ
と、及び(e)前記ステップ(b) 〜(d) を繰り返して前記鋳型核酸の配列を取得するステッ
プと、を有することができる。

0145

シークエンシング反応に可逆的に終端したヌクレオチドを使用することは、そうしない
場合には連続することになるポリメラーゼ拡張プロセスのステップ制御の利点をもたらす
。このステップ制御は、新たに拡張した核酸ストランドが検出可能な状態で費やす時間量
を増大するのに有用であり得る。例えば、可逆的に終端したヌクレオチドにおける電荷標
識は、ポリメラーゼによって添加された後に、所望量の信号が電荷センサに蓄積されるま
で新生ストランドに維持することができる。このことは、信号集積を増加することができ
る。この後、シークエンシング処理は、ブロック解除剤の添加に進み、これに後続のヌク
レオチド添加サイクルが続く。

0146

可逆的に終端したヌクレオチドの使用によってもたらされるステップ制御の他の利点は
同一反応を受ける反応成分の集団に同期する能力である。このようにして、本明細書に
記載のシークエンシング方法は、電荷センサが位置する部位(例えば、複数ポリメラーゼ
単一電荷センサに付着することができる)で複数ポリメラーゼに結合した同一核酸のた
めに実施することができる。ポリメラーゼ活性の各サイクル中に添加されるヌクレオチド
を同定するのに使用される検出ステップは、可逆的に終端したヌクレオチドの使用により
、効果的に同期をとることができる。可逆的に終端したヌクレオチドは集団的検出の利点
をもたらすが、可逆的に終端したヌクレオチドを用いるシークエンシング方法は、単一ポ
リメラーゼが個別の電荷センサに付着するときにも使用できることを理解されたい。

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