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技術 顆粒状簡易平板培地組成物

出願人 日水製薬株式会社
発明者 水落慎吾細川修平小高秀正菓子田充明
出願日 2019年4月26日 (1年7ヶ月経過) 出願番号 2019-086282
公開日 2019年7月18日 (1年5ヶ月経過) 公開番号 2019-115371
状態 特許登録済
技術分野 微生物、その培養処理 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード 多孔質顆粒 粉粒状物 使用時濃度 平板塗抹法 塗抹培養 微生物測定 水溶性ゲル化剤 微生物栄養
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この項目の情報は公開日時点(2019年7月18日)のものです。
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図面 (1)

課題

短時間かつ簡便な操作で、少量の試料でも長期間培養可能な培地を形成できる手段の提供。

解決手段

(A)粒子径150μm以上1000μm以下のゲル化剤顆粒状物と(B)微生物栄養成分を含有する顆粒状組成物を、ゲル化剤濃度として50〜100g/Lになるように、水又は水溶液に添加し混合することを特徴とする、ゲル状培地の製造方法。

概要

背景

食品、環境、病院などにおいて微生物を検出、同定するにあたり、従来から平板塗抹法混釈法、液体培地法などによる微生物の培養が行なわれている。これらの方法における培地の調製は、加温溶解、滅菌保温などの温度管理を厳密に行わなければならず、熟練と時間が必要であった。

かかる観点から、微生物検査簡易化が要望され、吸水性シートに栄養成分、ゲル化剤等を予め担持させたシート簡易培地が開発され、使用されている(特許文献1〜6)。

概要

短時間かつ簡便な操作で、少量の試料でも長期間培養可能な培地を形成できる手段の提供。 (A)粒子径150μm以上1000μm以下のゲル化剤顆粒状物と(B)微生物栄養成分を含有する顆粒状組成物を、ゲル化剤濃度として50〜100g/Lになるように、水又は水溶液に添加し混合することを特徴とする、ゲル状培地の製造方法。なし

目的

本発明の課題は、短時間かつ簡便な操作で、少量の試料でも長期間培養可能な培地を形成できる手段を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

(A)粒子径150μm以上1000μm以下のゲル化剤顆粒状物と(B)微生物栄養成分を含有する顆粒状組成物を、ゲル化剤濃度として50〜100g/Lになるように、水又は水溶液に添加し混合することを特徴とする、ゲル状培地の製造方法。

請求項2

顆粒状組成物が、粒子径150μm以上1000μm以下のゲル化剤顆粒状物と、粒子径1μm以上1000μm以下の微生物栄養成分含有粉粒状物との混合物である請求項1記載の製造方法。

請求項3

顆粒状組成物が、ゲル化剤と微生物栄養成分含有組成物との混合物の顆粒化物であって、粒子径150μm以上1000μm以下の顆粒化物である請求項1記載の製造方法。

請求項4

顆粒状組成物が、さらに(C)微生物検出用成分を含有する請求項1〜3のいずれかに記載の製造方法。

請求項5

顆粒状組成物を、水又は水溶液に添加後10秒以内に混合してゲル状培地を形成する請求項1〜4のいずれかに記載の製造方法。

請求項6

顆粒状組成物における(A)ゲル化剤と(B)微生物栄養成分の含有質量比(A/B)が、0.1〜50である請求項1〜5のいずれかに記載の製造方法。

請求項7

水又は水溶液の使用量が1〜250mLである請求項1〜6のいずれかに記載の製造方法。

技術分野

0001

本発明は、簡易平板培地組成物に関する。

背景技術

0002

食品、環境、病院などにおいて微生物を検出、同定するにあたり、従来から平板塗抹法混釈法、液体培地法などによる微生物の培養が行なわれている。これらの方法における培地の調製は、加温溶解、滅菌保温などの温度管理を厳密に行わなければならず、熟練と時間が必要であった。

0003

かかる観点から、微生物検査の簡易化が要望され、吸水性シートに栄養成分、ゲル化剤等を予め担持させたシート簡易培地が開発され、使用されている(特許文献1〜6)。

先行技術

0004

特開平9−19282号公報
特開2000−325072号公報
特開昭57−502200号公報
特開平6−181741号公報
特開2001−169772号公報
特開2013−236553号公報

発明が解決しようとする課題

0005

しかしながら、従来の簡易培地においては、1mL程度の少量の試料を35℃で24〜48時間培養するには水の蒸発を防ぐために特殊な容器フィルムが必要であり、製造方法も複雑であった。一方、生培地は保存可能期間が比較的短かく、混釈培養のように1mL程度の少量の試料を検査できないという欠点があった。
従って、本発明の課題は、短時間かつ簡便な操作で、少量の試料でも長期間培養可能な培地を形成できる手段を提供することにある。

課題を解決するための手段

0006

そこで本発明者は、水に添加するだけでゲル化させて平板培地を形成させる手段について検討してきたが、ゲル化剤が均一に溶解する前に一部でゲル化が生じたり、ゲル化剤を含む粉体ダマになって均一なゲルが形成できないことが判明した。そこで、さらに検討したところ、ゲル化剤及び/又は微生物栄養成分を含有する組成物を一定の粒子径を有する顆粒状とし、かつ含有するゲル化剤の量を特定の範囲とすれば、水に添加したときゲル化剤がダマにならず、簡便な混合操作で均一な平板ゲル培地が形成できるため、特殊な容器や特殊なフィルムを使用する必要がなくなることを見出し、本発明を完成した。

0007

すなわち、本発明は、次の〔1〕〜〔7〕を提供するものである。

0008

〔1〕(A)使用時濃度が30〜100g/Lになる量の粒子径150μm以上1000μm以下のゲル化剤顆粒状物と(B)微生物栄養成分を含有する顆粒状組成物であって、当該顆粒状組成物を水又は水溶液に添加し混合してゲル状培地を形成して使用する顆粒状簡易平板培地組成物。
〔2〕顆粒状組成物が、粒子径150μm以上1000μm以下のゲル化剤顆粒状物と、粒子径1μm以上1000μm以下の微生物栄養成分含有粉粒状物との混合物である〔1〕記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
〔3〕顆粒状組成物が、ゲル化剤と微生物栄養成分含有組成物との混合物の顆粒化物であって、粒子径150μm以上1000μm以下の顆粒化物である〔1〕記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
〔4〕さらに、(C)微生物検出用成分を含有する〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
〔5〕水又は水溶液に添加後10秒以内に混合してゲル状培地を形成して使用するものである〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
〔6〕(A)ゲル化剤と(B)微生物栄養成分の含有質量比(A/B)が、0.1〜50である〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の顆粒状簡易平板培地組成物。
〔7〕水又は水溶液の使用量が1〜250mLである〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の顆粒状簡易平板培地組成物。

発明の効果

0009

本発明の顆粒状組成物を用いれば、微生物検査を行おうとする現場で、組成物を水に添加して短時間混合するだけで均一な平板ゲル培地が形成でき、少量の試料接種により長時間の培養が可能になる。また、形成された平板培地上にシートを載置すれば画線培養も可能である。

図面の簡単な説明

0010

本発明簡易培地組成物の操作手順の例を示す。

0011

本発明の顆粒状簡易平板培地組成物は、(A)使用時濃度が30〜100g/Lになる量の粒子径150μm以上1000μm以下のゲル化剤顆粒状物と、(B)微生物栄養成分を含有する顆粒状組成物であって、当該顆粒状組成物を検査試料を含む水又は水溶液に添加し混合してゲル状培地を形成して使用するものである。

0012

前記顆粒状組成物は、(A)使用時濃度が30〜100g/Lになる量のゲル化剤と、(B)微生物栄養成分を含有し、かつ少なくともゲル化剤又は全体の粒子径が150μm以上1000μm以下であればよく、(1)粒子径150μm以上1000μm以下のゲル化剤顆粒状物と、粒子径1μm以上1000μm以下の微生物栄養成分含有粉粒状物との混合物である形態、又は(2)ゲル化剤と微生物栄養成分含有組成物との混合物の顆粒化物であって、粒子径150μm以上1000μm以下の顆粒化物である形態のいずれでもよい。

0013

本発明に用いられる(A)ゲル化剤としては、水溶性ゲル化剤、すなわち水に容易に分散してゲル化する高分子が挙げられ、具体的にはペクチングアーガムキサンタンガムタマリンドガムローカストビーンガムジェランガムアラビアガムタラガムカラギーナンカルボキシメチルセルロース等が挙げられる。このうち、水に対する分散性、ゲルの安定性等の点から、ペクチン、グアーガム、キサンタンガムがより好ましく、キサンタンガムが特に好ましい。

0014

本発明に用いる(A)ゲル化剤は、顆粒状物の混合物の形態(1)の場合、水に速やかに分散し、容易に均一なゲルを形成させる点から、粒子径150μm以上1000μm以下の顆粒状物であることが重要である。粒子径が150μm未満の粉末状ゲル化剤を用いた場合には、水への分散性が悪く、ダマになったり、均一にゲル化せず、局所的にゲル化するため、簡便な操作でゲル状培地が得られない。また、粒子径が1000μmを超えると、凸凹の大きな固まりのまま残存することとなる。
好ましい顆粒状物の粒子径は150μm以上850μm以下であり、より好ましくは180μm以上850μm以下である。

0015

本発明の組成物における(A)ゲル化剤の使用量は、均一なゲルの形成性ゲル強度の点から、使用時濃度(形成された培地中の濃度)が30〜100g/Lとなる量が好ましく、30〜80g/Lとなる量がより好ましく、40〜80g/Lとなる量がさらに好ましく、50〜60g/Lとなる量がさらに好ましい。

0016

本発明に使用される(B)微生物栄養成分としては、一般的な水溶性栄養培地成分であればよく、例えばペプトン大豆ペプトン酵母エキス肉エキスブドウ糖無機塩等が挙げられる。無機塩としては、リン酸塩塩化ナトリウム等が挙げられる。
(B)微生物栄養成分は、顆粒状物の混合物の形態(1)の場合、水に速やかに分散し、容易に均一なゲルを形成させる点から、粒子径1μm以上1000μm以下の粉粒状物が好ましい。粒子径が1μm未満では水への分散性が低下し、又は1000μmを超えると凸凹の大きな固まりのまま残存することとなる。好ましい粉粒状物の粒子径は1μm以上850μm以下であり、より好ましくは1μm以上850μm以下である。
(B)微生物栄養成分の含有量は、特に制限されないが、使用時濃度(形成された培地中の濃度)として、1〜150g/Lとなる量が好ましく、3〜100g/Lとなる量がさらに好ましい。

0017

(A)ゲル化剤と(B)微生物栄養成分の含有質量比(A/B)は、(A)ゲル化剤の水分散性を向上させる点から、0.1〜50が好ましく、1〜10がより好ましく、1.5〜8がさらに好ましく、1.5〜5がさらに好ましい。(A/B)をこれらの範囲とすることにより、(A)ゲル化剤単独の場合に比べて、(A)ゲル化剤の水分散性が向上する。

0018

また、本発明の組成物には、必要に応じて、(C)微生物検出用成分を含有させることができる。微生物検出用成分としては、抗生物質合成抗菌剤等の抗菌剤発色剤界面活性剤、無機塩等が挙げられる。抗菌剤としては、検出すべき微生物は生育し、他の微生物の生育は抑制するものが選択される。発色剤としては、微生物が産生する酵素により発色する発色性基質色素酸化還元指示薬等が挙げられる。界面活性剤としては、ドデシル硫酸塩等、タウロコール酸胆汁酸塩デオキシコール酸塩が挙げられる。無機塩としては、亜セレン酸塩亜テルル酸塩亜硫酸塩窒化ナトリウム等が挙げられる。なお、これらの成分も、顆粒状物の混合物の形態(1)の場合、粒子径1μm以上1000μm以下、より好ましくは1μm以上850μm以下、さらに好ましくは1μm以上850μm以下であるのが好ましい。

0019

本発明の顆粒状組成物は、水に速やかに分散し、容易に均一なゲルを形成させる点から、少なくともゲル化剤が、あるいは全体顆粒が粒子径150μm以上1000μm以下の顆粒状物であることが重要である。粒子径が150μm未満の場合には、水への分散性が悪く、ダマになったり、均一にゲル化せず、局所的にゲル化するため、簡便な操作でゲル状培地が得られない。また、粒子径が1000μmを超えると、凸凹の大きな固まりのまま残存することとなる。
好ましい顆粒状物の粒子径は150μm以上850μm以下であり、より好ましくは180μm以上850μm以下である。

0020

なお、本発明の顆粒状組成物のゲル化剤あるいは全体顆粒においては、150μm以上1000μm以下の粒子径を有する顆粒状物が含まれていればよいので、粒子径150μm未満の粒子の含有を妨げるものではない。しかし、150μm未満及び1000μm超の粒子の含有量は、水への分散性、均一なゲルの形成性の点から、顆粒状組成物全体中の20質量%以下であるのが好ましく、10質量%以下であるのがより好ましい。

0021

また、本発明の顆粒状組成物は顆粒状物であることが水分散性及び均一なゲル形成性の点で重要である。当該顆粒状物は、かさ密度が小さい造粒物がより好ましく、かさ密度が800kg/m3以下であるのが好ましく、300kg/m3以上800kg/m3以下であるのがさらに好ましい。

0022

本発明の顆粒状組成物は、顆粒状物の混合物の形態(1)の場合は、前記の一定の粒子径の顆粒状ゲル化剤と(B)成分の粉粒状物を混合することにより製造できる。一方、前記顆粒化物の形態(2)の場合は、ゲル化剤と微生物栄養成分含有組成物とを混合して、通常の顆粒化手段により顆粒化すればよい。ここで、前記(C)微生物検出用成分等の任意成分は、(B)微生物栄養成分含有組成物中に添加するのが好ましい。

0023

本発明において、顆粒又は顆粒状物とは、粒子の造粒物又は粒子の凝集物であればよく、結合剤なしに造粒されたものを含む。従って顆粒化方法にも、結合剤なしに造粒する方法が含まれる。好ましい顆粒化方法としては、必要に応じてポリビニルピロリドン等の結合剤を混合し、撹拌造粒流動層造粒押し出し造粒等を行えばよい。
また、本発明の顆粒又は顆粒状物は、水に速やかに分散し、容易に均一なゲルを形成するものであれば、その製法や成分を問わないが、例えば低水分で造粒した顆粒、マンニトールエリスリトール等の糖アルコールを配合して造粒した多孔質顆粒、糖やアルコール等を混合した液を乾燥した多孔質顆粒、クロスポビドンカルメロースカルシウムクロスカルメロースナトリウム低置換度ヒドロキシプロピルセルロース結晶セルロース等の崩壊剤を配合して得られた顆粒等が挙げられる。
なお、粒子径の調整は、ふるいを用いればよい。

0024

本発明の顆粒状組成物は、γ線などの滅菌後、水又は水溶液に添加し混合してゲル状培地を形成して使用される。

0025

顆粒状組成物を添加する水又は水溶液は、平板培養に適した容器に入れておくのが好ましい。当該容器としては、培地用のシャーレであればよい。当該容器に使用する水は滅菌精製水であればよい。また、水溶液としては、緩衝液等が挙げられる。

0026

本発明の組成物は簡易平板培地の形成に使用されるものであることから、使用される水又は水溶液の量は1mL〜250mL程度が好ましく、マルチウェルプレートでは1〜2mL、直径5cmシャーレでは5mL、直径9cmシャーレでは15mL程度が好ましい。

0027

容器中の水又は水溶液に本発明の顆粒状組成物を添加し、すぐに混合して、組成物を水又は水溶液中に分散溶解させて、ゲル状培地を形成する。ゲル化剤を速やかに水中に分散させる点から、組成物添加後は、すぐに、好ましくは10秒以内、より好ましくは5秒以内に混合、例えば容器を振動させて混合するのが好ましい。本発明の組成物が水に均一に分散した後、数分間放置すれば均一な平板ゲル培地が形成される。

0028

本発明の滅菌済み顆粒状組成物は微生物測定に用いる混釈培養用培地として使用できるが、試料を塗抹して使用する場合には、形成された平板培地上にシートを載置し、そのシートの上から試料を塗抹して培養すればよい。

0029

容器への水の注入から、組成物の添加、混釈培養まで、また必要に応じてシートを載置して塗抹培養までの手順の例を図1に示す。

0030

本発明の顆粒状組成物を用いれば、従来複雑な操作が必要であった培地が、簡便な操作で数分間で作製できる。
従って、検査センター食品メーカー消毒メーカー水産メーカー等において、緊急の検査が必要になった場合、数分間で混釈培養または平板ゲル培地を作製し、速やかな微生物検査が可能となる。

0031

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

0032

実施例1
(1)粒子径が10μmのものが多いキサンタンガム粉体と培地成分(表1記載の培地:E.coli検出用ブルーライト培地)を混合した顆粒状組成物を用いて、5φcmシャーレ中の5mLの水に対する分散性を検討した。分散性は、図1のように、組成物を水に添加後軽く振動させて検討した。その結果、ダマが生じ、均一なゲルが形成できなかった。

0033

0034

(2)次に、キサンタンガム顆粒の粒子径を変化させて、キサンタンガム顆粒(0.25g/5mL)及び培地成分(表1)(0.087g/5mL)の混合物の水への分散性(均一なゲル形成性)を検討した。
その結果、表2及び表3に示すように、キサンタンガム顆粒の粒子径が大きい程、水への分散性がよく、均一なゲルが形成できることが判明した。

0035

0036

0037

実施例2
キサンタンガムの顆粒をを用いて分級し、粒子径の相違による水への分散性、ゲル形成法を検討した。キサンタンガム顆粒単独(0.25g/5mL)の水への分散性、ゲル形成性、及びキサンタンガム顆粒(0.25g/5mL)と培地成分((表1)のブルーライト培地)(0.087g/5mL)との混合物の水への分散性、ゲル形成性を検討した。検討方法は、実施例1(1)と同様にして行った。

0038

その結果、表4に示すように、キサンタンガム顆粒単独では、その粒子径が212μm以上で水への分散性、均一なゲル形成性が良好であった。また、キサンタンガム顆粒に培地成分粒子を混合すると、水への分散性が顕著に向上し、キサンタンガム顆粒の粒子径150μm以上で水分散性及び均一なゲル形成性が良好となった。

0039

0040

実施例3
粒子径180μm以上1000以下のキサンタンガム顆粒と培地成分(ブルーライト培地(表1))とを混合し、その混合比率を変化させて、水分散性、ゲル形成性及びコロニー形成を検討した。

0041

その結果、表5に示すように、キサンタンガム顆粒と培地成分顆粒との含有比が2.8〜3.5の範囲で、水への分散性、均一なゲル形成性及びコロニー形成性が良好であった。

0042

0043

なお、キサンタンガム顆粒以外のゲル化剤の混合は、良好なゲル化剤と培地成分との含有比はこの範囲でなく、1.5〜5であった。

0044

実施例4
本発明の簡易培地〔キサンタンガム顆粒(180〜850μm)0.25g/L+ブルーライト培地17.4g/L〕と、標準寒天培地(表6)との混合物をγ線滅菌後に用い、表7記載の供試菌株発育性を評価した。本発明の簡易培地は、実施例1(1)と同様の操作で培地を作製した。

0045

0046

0047

0048

0049

その結果、表8及び表9に示すように、本発明の簡易培地は、標準寒天培地と同様の菌の発育性が確認できた。

0050

実施例5(混合物の顆粒化)
表1のブルーライト培地組成17.4g/Lにキサンタンガム顆粒(180〜850μm)50.0g/Lを混合し、少量のポリビニルピロリドン、エタノール及び水を加えて、流動層装置Glatt-powrex WSG−5型を用いて培地の顆粒化を行った。
得られた顆粒の粒子径と水への分散性との関係を検討した。
その結果、表10に示すように、150μm以上の顆粒の水への分散性が良好であった。

0051

0052

また、150μm以上の顆粒に150μm未満の顆粒を添加して水への分散性を検討したところ、10質量%以下の添加では水への分散性はあまり低下しなかった。

0053

実施例6
顆粒状組成物(実施例5)0.337gを直径5cmのシャーレ中の水5mLに添加した後、手で軽く揺すって溶解させた。顆粒を添加後、振動させるまでの時間と、分散性との関係を検討した。
その結果、顆粒添加後10秒以内、好ましくは5秒以内であれば水への分散性が良好であった(表11)。

実施例

0054

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