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課題

AGR2発現促進剤を提供する。

解決手段

ベツリン酸又はその塩を有効成分とするAGR2発現促進剤。

概要

背景

AGR2(Anterior gradient homolog 2)は、Protein disulfide isomerase(PDIファミリーに属しているタンパク質である。AGR2は、チオレドキシンドメイン(CXXS)を1つ持っており、タンパク質のS−S結合部位に結合して、タンパク質のフォールディング成熟関与すると考えられている(非特許文献1、2)。そして、AGR2は、腸においてムチンに結合してムチンの成熟・放出に関与し、腸の粘膜保護に必須であること(非特許文献3)、また、AGR2は気道において発現し、喘息発現誘導されムチンを過剰分泌すること(非特許文献4)、喘息モデルマウスの気道では、AGR2の発現が高く、ムチン(MUC5)を過剰分泌すること(非特許文献5)が報告されている。したがって、AGR2の発現が促進されればムチンの放出が促進されると考えられる。

一方、眼科領域において、分泌型ムチンの放出はドライアイを改善すること(非特許文献6)、また、においては、胃の粘液(ムチン)放出が促進されることによって胃酸刺激から胃粘膜を保護し、胃炎胃潰瘍を予防できると考えられている。また、ムチンを含む気道の液は、外来からの微生物粉塵を防ぐ役割をしており、ムチンの分泌が低下した場合には、防御機能が低下し、様々な疾病に感染する可能性が増大することから、気道においてムチンの放出を促進することは感染防御に有用である。したがって、AGR2の発現促進は、ムチンの分泌低下に起因して発症する斯かる疾患の予防、治療又は改善に役立つと考えられる。

ベツリン酸(betulinic acid)はシラカバ樹皮センブリチョウジブドウ果皮チャーガカバノアナタケ)などに存在するルパントリテルペン化合物の1種である。ベツリン酸には、制癌作用抗炎症作用抗菌作用、抗作用、抗ウイルス作用(非特許文献7)の他、コラーゲン合成促進作用(特許文献1)、皮膚のシワシミ改善作用(特許文献2)等、種々の薬理作用があることが報告されている。

しかしながら、ベツリン酸がAGR2の発現を促進すること、またムチンの放出を促進することについては知られていない。

概要

AGR2発現促進剤を提供する。ベツリン酸又はその塩を有効成分とするAGR2発現促進剤。なし

目的

本発明は、AGR2発現促進剤を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

ベツリン酸又はその塩を有効成分とするAGR2発現促進剤

請求項2

ベツリン酸又はその塩を有効成分とするムチン放出促進剤

請求項3

ベツリン酸又はその塩を有効成分とするAGR2発現促進食品

請求項4

ベツリン酸又はその塩を有効成分とするムチン放出促進用食品。

請求項5

ムチンが分泌型ムチンである請求項2記載の剤、又は請求項4記載の食品。

技術分野

0001

本発明は、AGR2の発現を促進するAGR2発現促進剤に関する。

背景技術

0002

AGR2(Anterior gradient homolog 2)は、Protein disulfide isomerase(PDIファミリーに属しているタンパク質である。AGR2は、チオレドキシンドメイン(CXXS)を1つ持っており、タンパク質のS−S結合部位に結合して、タンパク質のフォールディング成熟関与すると考えられている(非特許文献1、2)。そして、AGR2は、腸においてムチンに結合してムチンの成熟・放出に関与し、腸の粘膜保護に必須であること(非特許文献3)、また、AGR2は気道において発現し、喘息発現誘導されムチンを過剰分泌すること(非特許文献4)、喘息モデルマウスの気道では、AGR2の発現が高く、ムチン(MUC5)を過剰分泌すること(非特許文献5)が報告されている。したがって、AGR2の発現が促進されればムチンの放出が促進されると考えられる。

0003

一方、眼科領域において、分泌型ムチンの放出はドライアイを改善すること(非特許文献6)、また、においては、胃の粘液(ムチン)放出が促進されることによって胃酸刺激から胃粘膜を保護し、胃炎胃潰瘍を予防できると考えられている。また、ムチンを含む気道の液は、外来からの微生物粉塵を防ぐ役割をしており、ムチンの分泌が低下した場合には、防御機能が低下し、様々な疾病に感染する可能性が増大することから、気道においてムチンの放出を促進することは感染防御に有用である。したがって、AGR2の発現促進は、ムチンの分泌低下に起因して発症する斯かる疾患の予防、治療又は改善に役立つと考えられる。

0004

ベツリン酸(betulinic acid)はシラカバ樹皮センブリチョウジブドウ果皮チャーガカバノアナタケ)などに存在するルパントリテルペン化合物の1種である。ベツリン酸には、制癌作用抗炎症作用抗菌作用、抗作用、抗ウイルス作用(非特許文献7)の他、コラーゲン合成促進作用(特許文献1)、皮膚のシワシミ改善作用(特許文献2)等、種々の薬理作用があることが報告されている。

0005

しかしながら、ベツリン酸がAGR2の発現を促進すること、またムチンの放出を促進することについては知られていない。

0006

特開平8−208424号公報
特開平9−87156号公報

先行技術

0007

Mol Phylogenet Evol, 36(3), 734-740(2005).
J Immunol Methods, 378(1-2), 20-32(2012).
Proc Natl Acad Sci, 106(17), 6950-6955(2009).
Am J Respir Cell Mol Biol., 47(2), 178-185(2012).
J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci., 33(1), 33-6(2013).
京府医大誌 122(8),549〜558(2013).
Nat. Prod. Rep., 23, 919-942(2006).

発明が解決しようとする課題

0008

本発明は、AGR2発現促進剤を提供することに関する。

課題を解決するための手段

0009

本発明者らは、天然由来の成分について種々検討した結果、ベツリン酸が優れたAGR2発現促進作用を有し、AGR2発現促進剤及びムチン放出促進剤として有用であることを見出した。

0010

すなわち、本発明は、以下の1)〜4)に係るものである。
1)ベツリン酸又はその塩を有効成分とするAGR2発現促進剤。
2)ベツリン酸又はその塩を有効成分とするムチン放出促進剤。
3)ベツリン酸又はその塩を有効成分とするAGR2発現促進用食品
4)ベツリン酸又はその塩を有効成分とするムチン放出促進用食品。

発明の効果

0011

本発明によれば、AGR2の発現を促進することにより、ムチンの分泌低下に起因して発症する疾患の予防や治療、例えばドライアイの予防又は改善、胃炎や胃潰瘍の予防、気道感染症の予防に有用な、医薬品、食品が提供される。

0012

本発明において、「ベツリン酸」は、下記式で示される3β−ヒドロキシルパ−20(29)−エン−28−酸である。

0013

0015

ベツリン酸は、それを含有する植物、例えばシラカバの樹皮、チャーガ等から分離精製して取得できる他(中国特許出願公開第101485703号明細書)、化学合成することも可能である(特表2003−519674号公報)。また、市販品を使用することも可能である。

0016

後記実施例に示すように、ベツリン酸は、ヒト正常表皮細胞におけるAGR2遺伝子及びAGR2タンパク質の発現促進作用を有する。AGR2は、腸においてムチンに結合してムチンの成熟・放出に関与し、腸の粘膜保護に必須であること(前記非特許文献3)、また、AGR2は気道において発現し、喘息で発現誘導されムチンを過剰分泌すること(前記非特許文献4)、喘息モデルマウスの気道では、AGR2の発現が高く、ムチン(MUC5)を過剰分泌すること(前記非特許文献5)が報告されていることから、AGR2の発現が促進されればムチンの放出が促進されると考えられる。
従って、ベツリン酸又はその塩は、AGR2発現促進剤、ムチン放出促進剤(以下、「AGR2発現促進剤等」とも称する)となり得、AGR2の発現を促進するため、ムチンの放出を促進するために使用することができ、またAGR2発現促進剤、ムチン放出促進剤を製造するために使用することができる。
ここで、「使用」は、ヒト若しくは非ヒト動物への投与又は摂取であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。

0017

本発明において、AGR2の発現促進には、遺伝子レベルでの発現促進及びタンパク質レベルでの発現促進が包含される。遺伝子レベルでの発現促進にはmRNAの発現促進、好ましくはmRNAへの転写促進が挙げられ、タンパク質レベルでの発現促進には翻訳における促進が含まれる。ここで、「AGR2(Anterior gradient homolog 2)」とは、NCBIのデータベース(Protein)[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/]において、「AGR2」として登録されているタンパク質を意味する。

0018

また、本発明において、「ムチン放出促進」とは、上皮細胞杯細胞におけるムチンの分泌を促進することを意味する。本発明において、ムチンはMUC2、MUC5AC,MUC5B、MUC6、MUC7等の分泌型ムチンであるのが好ましい。
前述したとおり、眼科領域において、分泌型ムチンの放出促進はドライアイの改善に有用であり(前記非特許文献6)、消化管においては、粘膜保護作用を有し、胃炎や胃潰瘍の予防又は改善に有用である。また、気道においてムチンの放出促進は細菌やウイルス感染防御に有用である。したがって、本発明のAGR2発現促進剤、ムチン放出促進剤は、ムチンの分泌低下に起因して発症する斯かる疾患の予防、治療又は改善に役立つと考えられる。

0019

本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
また、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、「治療」には、疾患の完全治癒に加えて、症状を改善させることが包含される。

0020

本発明の本発明のAGR2発現促進剤等は、それ自体、AGR2の発現を促進するため、ムチンの放出を促進するための医薬品、医薬部外品サプリメント又は食品であってもよく、或いは当該医薬品、医薬部外品、又は食品に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
当該食品には、AGR2の発現促進、ムチンの放出促進をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した食品(AGR2発現促進用食品、ムチン放出促進用食品)、例えば機能性食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品、サプリメントが包含される。これらの食品は機能表示許可された食品であるため、一般の食品と区別することができる。

0021

上記医薬品(医薬部外品も含む)の投与形態としては、例えば錠剤カプセル剤顆粒剤散剤シロップ剤等による経口投与、又は注射剤坐剤吸入薬等による非経口投与が挙げられる。また、このような種々の剤型の製剤は、本発明のベツリン酸又はその塩を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤結合剤増量剤崩壊剤界面活性剤滑沢剤分散剤緩衝剤保存剤、嬌味剤、香料被膜剤担体希釈剤、ベツリン酸又はその塩以外の薬効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与である。

0022

上記食品の形態としては、清涼飲料水茶系飲料コーヒー飲料果汁飲料炭酸飲料ゼリーウエハースビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品栄養食等の各種食品の他、さらには、上述した経口投与製剤と同様の形態(錠剤、カプセル剤、シロップ等)の栄養補給用組成物が挙げられる。

0023

種々の形態の食品は、本発明のベツリン酸又はその塩を単独で、又は他の食品材料や、溶剤軟化剤、油、乳化剤防腐剤酸味料甘味料苦味料、香科、安定剤、着色剤酸化防止剤保湿剤増粘剤クロロゲン酸類以外の有効成分等を適宜組み合わせて調製することができる。

0024

上記の医薬品(医薬部外品を含む)や食品中の本発明のベツリン酸又はその塩の含有量は、その使用形態により異なるが、通常、総量中ベツリン酸遊離体換算で、好ましくは0.00001質量%以上、より好ましくは0.0001質量%以上、更に好ましくは0.001質量%以上であり、また、好ましくは20質量%以下、より好ましくは10質量%以下、更に好ましくは1質量%以下である。また、好ましくは0.00001〜20質量%、より好ましくは0.0001〜10質量%、更に好ましくは0.001〜1質量%である。

0025

上記医薬品(医薬部外品も含む)及び食品の投与量又は摂取量は、適宜決定され得るが、通常、成人(60kg)に対して1日あたり、本発明のベツリン酸又はその塩として、ベツリン酸遊離体換算で、好ましくは0.001mg以上、より好ましくは0.01mg以上であり、また、好ましくは1000mg以下、より好ましくは100mg以下である。本発明では斯かる量を1回で投与又は摂取するのが好ましい。

0026

上記製剤は、任意の計画に従って投与又は摂取され、投与又は摂取期間は特に限定されないが、反復・連続して投与又は摂取することが好ましく、7日間以上連続して投与又は摂取することがより好ましく、28日間以上連続して投与又は摂取することが更に好ましい。

0027

投与又は摂取対象としては、例えばドライアイ又はその恐れのあるヒト、胃炎や胃潰瘍の予防又は改善を望むヒト、細菌やウイルスによる気道感染の予防を望むヒトが挙げられる。

0028

上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
<1>ベツリン酸又はその塩を有効成分とするAGR2発現促進剤。
<2>ベツリン酸又はその塩を有効成分とするムチン放出促進剤。
<3>ベツリン酸又はその塩を有効成分とするAGR2発現促進用食品。
<4>ベツリン酸又はその塩を有効成分とするムチン放出促進用食品。
<5>AGR2発現促進剤を製造するための、ベツリン酸又はその塩の使用。
<6>ムチン放出促進剤を製造するための、ベツリン酸又はその塩の使用。
<7>AGR2発現促進に使用するための、ベツリン酸又はその塩。
<8>ムチン放出促進に使用するための、ベツリン酸又はその塩。
<9>ベツリン酸又はその塩を対象に投与するか又は摂取させることを含む、AGR2発現促進方法。
<10>ベツリン酸又はその塩を対象に投与するか又は摂取させることを含む、ムチン放出促進方法。
<11><2>、<4>、<6>、<8>において、ムチンは分泌型ムチンである。
<12>ベツリン酸又はその塩を有効成分とする消化管粘膜保護剤
<13>ベツリン酸又はその塩を有効成分とするドライアイ予防又は改善剤
<14>ベツリン酸又はその塩を有効成分とする気道感染防御剤

0029

実施例1 AGR2遺伝子発現量促進作用の解析
ヒト正常表皮細胞(NHEK)はEpiLife(登録商標)(Kuraboより購入)を用い、37℃、5%CO2条件下で培養した。細胞を12穴プレートに1×105個で播種し、24時間培養後、培地血清添加培地交換するとともに、被験物質最終濃度(100nM〜1μM)なるように調製し、培地に添加した。1日培養後、細胞からMaxwell 16LEV simplyRNA kit(Promega)を用いてtotal RNAを抽出した。Total RNAの濃度を測定し、一定量のtotal RNAを用いて逆転写反応を行った。逆転写反応にはHigh capacity RNA−to−cDNAkit(life technologies)を用いた。

0030

得られたcDNAから、Real−TimePCRにより、AGR2の遺伝子発現の定量を行った。定量は、Taqman(登録商標)Probe(AGR2:Hs00180702_m1、life technologies)を用い、PRISM7500(life technologies)で検出定量した。20μLの反応系にて、増幅条件は95℃、15秒の変性反応、60℃、1分のアニーリング伸長反応にて行った。遺伝子発現量はRPLP0(Hs99999902_m1、life technologies)発現量により補正し、試料無添加溶媒のみ)コントロールにおけるAGR2の発現量を1とした場合の相対値として示した。結果を表1に示す。

0031

0032

実施例2 AGR2蛋白質発現量促進作用の解析
ヒト正常表皮細胞(NHEK)はEpiLife(登録商標)(Kuraboより購入)を用い、37℃、5%CO2条件下で培養した。細胞を12穴プレートに1×105個で播種し、24時間培養後、培地を血清無添加培地に交換するとともに、被験物質を最終濃度(10μM)なるように調製し、培地に添加した。1日培養後、細胞を可溶化液〔RIPA Buffer (Sigma)〕を用いて蛋白抽出液を作製した。蛋白質量の濃度を測定し、一定量蛋白質量分のサンプルにSample Buffer(Themo Scientific社)、100mM DTTを加え、熱処理(95℃5min)を行った。4−20%Gradient gel(Bio−Rad社)で電気泳動を行い、Trans−Blot Turbo(Bio−Rad社)でPVDF膜に転写した。5%スキムミルク溶液で1時間Blockingした後、1次抗体(anti−AGR2、abcam)で反応させた(4℃、O/N)。2次抗体(anti−RabbitIgGHRP conjugate、GE Healthcare)で1時間反応させた後、Clarity WesternECLSubstrate(Bio−Rad)で発光させた。検出は、LAS−4000(Fujifilm社)を用いた。その後、Restore Western Blot StrippingBuffer(Themo Scientific社)で抗体を除去し、再度1次抗体(anti−Actin、Santacruz、)、2次抗体(anti−Goat IgG HRP conjugate、GE Healthcare)で反応させ、検出を行った。蛋白質発現量はActinの発現量により補正し、試料無添加(溶媒のみ)コントロールにおけるAGR2の発現量を1とした場合の相対値として示した。結果を表2に示す。

実施例

0033

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