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技術 枯草菌の単離方法、その枯草菌、枯草菌を含む微生物製剤、枯草菌単離用培地セット

出願人 水ing株式会社
発明者 仲田弘明
出願日 2018年10月29日 (1年11ヶ月経過) 出願番号 2018-202508
公開日 2019年6月27日 (1年3ヶ月経過) 公開番号 2019-103491
状態 未査定
技術分野 微生物、その培養処理
主要キーワード 他社品 ラボ試験 毒物混入 枯れ葉 保持担体 ブロムクレゾールパープル 油脂分解酵素 クロスチェック
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (6)

課題

枯草菌を環境中から単離する簡易、迅速及び安価な方法及び同方法により単離された新規枯草菌菌株の提供。

解決手段

(A)枯草菌を含むサンプルを芽胞菌が残存するように殺菌する工程、(B)レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない第1の培地を使用して前記殺菌済みサンプル中の細菌を培養し、培養細菌の中からバチルス属細菌を取得する第1培養工程、及び(C)レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液の少なくとも1種を含み、前記糖が含まれる場合はpH指示薬を更に含む第2の培地を使用して第1培養工程からのバチルス属細菌を培養し、培養細菌の中から枯草菌を取得する第2培養工程、を含む枯草菌の単離方法。同方法により活性汚泥から単離された新規枯草菌菌株。

概要

背景

従来から、排水を処理するために様々な薬品が使用されている。そのような薬品の一つとして、バチルス(Bacillus)属細菌を用いた微生物製剤がある。バチルス属細菌は、プロテアーゼタンパク質分解酵素)やリパーゼ油脂分解酵素)などを多量に分泌するため、高濃度タンパク質や油脂が曝気槽に流入した際、バチルス属細菌を含有する微生物製剤を添加することで、これらの負荷が低減される。

また、バチルス属細菌はpH変動、温度変化溶存酸素低下、毒物混入栄養源枯渇などの環境変化の際に芽胞の形態を取り、死滅することなく環境変化に耐えることが可能であるため、微生物製剤に適していると考えられている。

特許文献1では、バチルス属細菌の単離に関する技術ではないが、多くの細菌の中から所定の細菌を単離する方法として記載された方法が開示されている。特許文献2では、微生物顕微鏡により拡大観察し、増殖パターンから判断してマニュピレーターによりバチルス属などの微生物を単離する手法が開示されている。

また、微生物種の同定に関する従来技術として、例えば環境中から取得されたサンプルを標準寒天培地上に塗抹して単一コロニー釣菌し、PCR(Polymerase Chain Reaction)装置による16SリボソームDNAの増幅シークエンサーによる遺伝子配列解析国際塩基配列データベース等での相同性検索を順次行う方法があり、これにより、微生物種(例えばバチルス属であれば、枯草菌炭疽菌セレウス菌など)が同定されることが知られている。

一方、活性汚泥土壌植物体動物体水域し尿発酵食品などの環境中にはバチルス属細菌が存在する。バチルス属細菌は約300種が知られており、代表的な種としては、納豆などの発酵食品の製造に使用され、病原性を有さない点で安全性が確立している枯草菌(Bacillus subtilis)がある。

概要

枯草菌を環境中から単離する簡易、迅速及び安価な方法及び同方法により単離された新規枯草菌菌株の提供。(A)枯草菌を含むサンプルを芽胞菌が残存するように殺菌する工程、(B)レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない第1の培地を使用して前記殺菌済みサンプル中の細菌を培養し、培養細菌の中からバチルス属細菌を取得する第1培養工程、及び(C)レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液の少なくとも1種を含み、前記糖が含まれる場合はpH指示薬を更に含む第2の培地を使用して第1培養工程からのバチルス属細菌を培養し、培養細菌の中から枯草菌を取得する第2培養工程、を含む枯草菌の単離方法。同方法により活性汚泥から単離された新規枯草菌菌株。

目的

また、この方法は、バチルス属細菌の中でも枯草菌を選択的に単離することが出来ない手法であり、大掛かりな設備機器を必要とせず、簡単な手法で、枯草菌を選択的に単離できる手法が望まれていた

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

環境中から採取された枯草菌を含むサンプルから前記枯草菌を単離する方法であって、(A)前記サンプルを、前記サンプル中に含まれる芽胞菌が残存するように殺菌する殺菌工程、(B)レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない第1の培地を使用して、前記殺菌されたサンプルに含まれる細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を含むバチルス属細菌を取得する第1培養工程、及び(C)レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、および血液のうちの少なくとも1種を含み、前記枯草菌によって分解されて酸を生成する糖が含まれる場合はpH指示薬を更に含む第2の培地を使用して、第1培養工程から取得された枯草菌を含むバチルス属細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を取得する第2培養工程、を含む枯草菌の単離方法

請求項2

前記殺菌工程は前記サンプルを加熱することにより行う、請求項1に記載の単離方法。

請求項3

前記第1の培地が、水1Lに対して、ペプトン1〜10g、酵母エキス1〜5g、グルコース0.1〜5g、及び寒天5〜30gを含み、前記第2の培地が、水1Lに対して、肉エキス0.1〜5g、ペプトン1〜20g、D−マンニトール0.5〜20g、塩化ナトリウム1〜20g、フェノールレッド0.01〜0.1g、寒天5〜30g、卵黄液(50%)1〜100mL、ポリミキシンB10,000〜500,000単位を含む、請求項1または2に記載の単離方法。

請求項4

前記環境中から採取された枯草菌を含むサンプルが、活性汚泥である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離方法。

請求項5

第1培養工程及び第2培養工程を平板培養法で行う、請求項1〜4のいずれか1項に記載の単離方法。

請求項6

請求項1〜5のいずれか1項に記載の単離方法により単離された枯草菌。

請求項7

請求項6に記載の枯草菌を含む微生物製剤

請求項8

レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、および血液を実質的に含まないバチルス属細菌培養用の第1の培地と、レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、および血液のうちの少なくとも1種を含み、前記枯草菌によって分解されて酸を生成する糖が含まれる場合はpH指示薬を更に含む枯草菌培養用の第2の培地と、を含む、枯草菌単離用培地セット。

請求項9

受託番号NITEP−02795で寄託されているバチルスサブティリス(Bacillussubtilis)B−1−2株である枯草菌。

請求項10

受託番号NITEP−02796で寄託されているバチルス・サブティリス(Bacillussubtilis)B−6−1株である枯草菌。

請求項11

受託番号NITEP−02797で寄託されているバチルス・サブティリス(Bacillussubtilis)B−10−1株である枯草菌。

請求項12

受託番号NITEP−02798で寄託されているバチルス・サブティリス(Bacillussubtilis)B−11−3株である枯草菌。

請求項13

請求項9〜12のいずれか1項に記載の枯草菌を含む微生物製剤。

技術分野

0001

本発明は、活性汚泥土壌植物体動物体水域などの環境中から取得した微生物分離源を用い、迅速・簡便・低コストで安全性の高い枯草菌を単離する方法に関する。

背景技術

0002

従来から、排水を処理するために様々な薬品が使用されている。そのような薬品の一つとして、バチルス(Bacillus)属細菌を用いた微生物製剤がある。バチルス属細菌は、プロテアーゼタンパク質分解酵素)やリパーゼ油脂分解酵素)などを多量に分泌するため、高濃度タンパク質や油脂が曝気槽に流入した際、バチルス属細菌を含有する微生物製剤を添加することで、これらの負荷が低減される。

0003

また、バチルス属細菌はpH変動、温度変化溶存酸素低下、毒物混入栄養源枯渇などの環境変化の際に芽胞の形態を取り、死滅することなく環境変化に耐えることが可能であるため、微生物製剤に適していると考えられている。

0004

特許文献1では、バチルス属細菌の単離に関する技術ではないが、多くの細菌の中から所定の細菌を単離する方法として記載された方法が開示されている。特許文献2では、微生物顕微鏡により拡大観察し、増殖パターンから判断してマニュピレーターによりバチルス属などの微生物を単離する手法が開示されている。

0005

また、微生物種の同定に関する従来技術として、例えば環境中から取得されたサンプルを標準寒天培地上に塗抹して単一コロニー釣菌し、PCR(Polymerase Chain Reaction)装置による16SリボソームDNAの増幅シークエンサーによる遺伝子配列解析国際塩基配列データベース等での相同性検索を順次行う方法があり、これにより、微生物種(例えばバチルス属であれば、枯草菌、炭疽菌セレウス菌など)が同定されることが知られている。

0006

一方、活性汚泥、土壌、植物体、動物体、水域、し尿発酵食品などの環境中にはバチルス属細菌が存在する。バチルス属細菌は約300種が知られており、代表的な種としては、納豆などの発酵食品の製造に使用され、病原性を有さない点で安全性が確立している枯草菌(Bacillus subtilis)がある。

先行技術

0007

特開2008−271786号公報
特開平10−136973号公報

発明が解決しようとする課題

0008

前述した微生物種を同定する手法では、機器試薬が極めて高額であり、また作業手順も煩雑で試験日数も長期間となる。さらに、環境中にはバチルス属細菌以外の雑菌が圧倒的多数を占めており、加熱処理等でバチルス属細菌に絞り込んだとしても、300種ものバチルス属が存在する中で相同性検索後に枯草菌に的中する確率は決して高くはない。

0009

一方で、病原性を有するバチルス属細菌の種もいくつか存在し、例えば病原性を有する炭疽菌(Bacillus anthracis)やセレウス菌(Bacillus cereus)などが該当する。このため、バチルス属細菌に属する300種の全ての種が病原性に対し安全であるとは言えない。

0010

また、炭疽菌やセレウス菌はあくまでヒトに対する病原性が証明された種であって、今後、ヒト以外の動植物に病原性を示す菌種が新たに提言される可能性が無いとは言い難く、そのような危険性を孕む可能性のある菌種を微生物製剤として水処理工程に使用し、環境中に放出することは好ましくない。

0011

上記の経緯により、病原性に対し安全性が確立された枯草菌を環境中から単離する手法を開発することが可能となれば、微生物製剤のみならず発酵食品などにも広く応用可能である。

0012

前述した特許文献1の方法では、単離のために集積培養を行う手順が必要とされるが、集積培養では培養に長期間(3〜4週間)を有する手間と時間がかかる問題があるため、さらなる簡素化が求められていた。

0013

前述した特許文献2の方法では、顕微鏡、マニュピレーター、温度制御装置コンピューター画像処理装置など高額な機器を多数必要とするため、単離には設備投資が必要であり、コストのかかるものであった。

0014

また、この方法は、バチルス属細菌の中でも枯草菌を選択的に単離することが出来ない手法であり、大掛かりな設備機器を必要とせず、簡単な手法で、枯草菌を選択的に単離できる手法が望まれていた。

0015

従って、本発明の目的は、簡易、迅速及び安価な方法で、病原性に対し安全性の高い枯草菌を環境中から単離する方法を提供することにある。また、本発明の目的は、その単離方法により単離された安全性の高い枯草菌を提供することにある。さらに、本発明の目的は、その枯草菌を使用した安全性の高い微生物製剤を提供することにある。

0016

また更に本発明の目的は、枯草菌を単離するための枯草菌単離用培地セットを提供することにある。

課題を解決するための手段

0017

上記課題を解決するために、本発明は以下の構成とすることができる。
(1)環境中から採取された枯草菌を含むサンプルから前記枯草菌を単離する方法であって、
(A)前記サンプルを、前記サンプル中に含まれる芽胞菌が残存するように殺菌する殺菌工程、
(B)レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない第1の培地を使用して、前記殺菌されたサンプルに含まれる細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を含むバチルス属細菌を取得する第1培養工程、及び
(C)レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液のうちの少なくとも1種を含み、前記枯草菌によって分解されて酸を生成する糖が含まれる場合はpH指示薬を更に含む第2の培地を使用して、第1培養工程から取得された枯草菌を含むバチルス属細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を取得する第2培養工程、
を含む。
(2)前記殺菌工程は前記サンプルを加熱することにより行う。
(3)前記第1の培地が、水1Lに対して、ペプトン1〜10g、酵母エキス1〜5g、グルコース0.1〜5g、及び寒天5〜30gを含み、前記第2の培地が、水1Lに対して、肉エキス0.1〜5g、ペプトン1〜20g、D−マンニトール0.5〜20g、塩化ナトリウム1〜20g、フェノールレッド0.01〜0.1g、寒天5〜30g、卵黄液(50%)1〜100mL、ポリミキシンB10,000〜500,000単位を含む。
(4)前記環境中から採取された枯草菌を含むサンプルが、活性汚泥である。
(5)第1培養工程及び第2培養工程を平板培養法で行う。
(6)上記の単離方法により単離された枯草菌。
(7)その枯草菌を含む微生物製剤。
(8)レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まないバチルス属細菌培養用の第1の培地と、レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液のうちの少なくとも1種を含み、前記枯草菌によって分解されて酸を生成する糖が含まれる場合はpH指示薬を更に含む枯草菌培養用の第2の培地と、を含む、枯草菌単離用培地セット。
(9)受託番号NITEP−02795で寄託されているバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)B−1−2株である枯草菌。
(10)受託番号NITE P−02796で寄託されているバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)B−6−1株である枯草菌。
(11)受託番号NITE P−02797で寄託されているバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)B−10−1株である枯草菌。
(12)受託番号NITE P−02798で寄託されているバチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)B−11−3株である枯草菌。
(13)(9)〜(12)のいずれか1項に記載の枯草菌を含む微生物製剤。

発明の効果

0018

本発明によれば、簡易で、迅速及び安価な方法で、病原性に対し安全性の高い枯草菌を環境中から単離することができる。
また、本発明の手法を用いて活性汚泥より分離した枯草菌から、有機物デンプン、タンパク質、及び油脂)の高い分解活性を有する新規菌株であるBacillus subtilis B−1−2株(受託番号NITEP−02795)、B−6−1株(受託番号NITE P−02796)、B−10−1株(受託番号NITE P−02797)、B−11−3株(受託番号NITE P−02798)をそれぞれ単離した。これら新規菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2018年10月16日付けで寄託した。

図面の簡単な説明

0019

本発明の方法の概要を示している。
実施例における各工程を示している。
工程(B)において培養されたバチルス属細菌の不定形コロニーを示す写真である。
工程(C)において培養された枯草菌のコロニーを示す写真である。
工程(C)において培養された枯草菌以外の細菌のコロニーを示す写真である。

0020

以下、本発明を具体的に説明する。図1は、本発明の方法の概要を示す図である。
上述したように、本発明の単離方法は、環境中から採取された枯草菌を含むサンプルから前記枯草菌を単離する方法であって、
(A)前記サンプルを、前記サンプル中に含まれる芽胞菌が残存するように殺菌する殺菌工程、
(B)レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない第1の培地を使用して、前記殺菌されたサンプルに含まれる細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を含むバチルス属細菌を取得する第1培養工程、及び
(C)レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液のうちの少なくとも1種を含み、前記枯草菌によって分解されて酸を生成する糖が含まれる場合はpH指示薬を更に含む第2の培地を使用して、第1培養工程から取得された枯草菌を含むバチルス属細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を取得する第2培養工程、
を含む。

0021

枯草菌は芽胞を形成し、様々なストレスに対して耐性を有することから、土壌や植物など環境中のあらゆる場所に普遍的に存在する。本発明は、環境中から採取された枯草菌を含むサンプルから枯草菌を単離するためのものである。以下、各工程について詳細に説明する。

0022

[工程(A)(殺菌工程)]
工程(A)では、環境中から採取されたサンプルを、そのサンプル中に含まれる芽胞菌が残存するように殺菌する。ここで、環境とは、自然的環境及び人工的環境の両方を含む。具体的には、例えば、自然界の土壌(土、腐葉土砂礫コンポストなど)、植物体(草本木本花卉、枯れ草、枯れ葉など)、動物体(表皮臓器排泄物など)、水域(河川水湖沼水海水など)、及び大気や、人為的な介入を経た環境下にある活性汚泥、発酵食品、台所配管などのヌメリバイオフィルム)、ヒトし尿など、枯草菌が生息し得る全ての環境が挙げられる。本発明では、環境中から採取された枯草菌を含むサンプル(以下、「環境サンプル」とも称する)を使用する。

0023

環境サンプル中には、枯草菌だけでなく、枯草菌以外の雑菌も極めて多く含まれる。殺菌するための方法としては、環境サンプルに含まれる芽胞菌が残るように殺菌することができればどのような手法でもよいが、好ましい殺菌方法として、加熱や酸処理塩基処理アルコール処理次亜塩素酸ナトリウムなどの消毒剤処理、UV照射、乾燥、嫌気状態などが挙げられる。特に加熱が好ましい。

0024

加熱の条件は、芽胞菌が残存し、耐熱性のない細菌を除外することができればどのような条件でもよい。加熱温度は、例えば、60℃〜100℃、好ましくは70℃〜90℃である。加熱時間は、例えば、1分〜3時間、好ましくは20分〜2時間、より好ましくは30分〜90分である。加熱時の圧力は、例えば、0.8〜1.2気圧、好ましくは大気圧下及びこれに近い圧力下(例えば、0.9〜1.1気圧)で行うことが好ましい。

0025

酸処理に使用される酸としては、塩酸硫酸などの無機酸や有機酸が挙げられる。塩基処理に使用される塩基としては、水酸化ナトリウム水酸化カリウムなどが挙げられる。これらの酸及び塩の使用については、芽胞菌が残存し、それ以外の殺菌を除去することができる条件が当業者により適宜選択される。

0026

[工程(B)(第1培養工程)]
工程(B)では、レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない第1の培地を使用して、工程(A)で殺菌されたサンプルに含まれる細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を含むバチルス属細菌を取得する。

0027

第1の培地は、枯草菌を含むバチルス属細菌を培養することができるものである。したがって、第1の培地は、通常、少なくともゲル化剤及びアミノ酸源を含む。
ゲル化剤の例としては、特に限定されないが、例えば、寒天、ゲランガムキサンタンガムローカストビーンガムポリビニルアルコールアルキルセルロースカルボキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルセルロースなどが挙げられる。特に寒天が好ましい。

0028

アミノ酸源としては、ペプトンやトリプトンエキス類などが挙げられる。ペプトンとしては、例えば、カゼイン製ペプトン、大豆製ペプトンなどが挙げられる。エキス類の例としては、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキスポテトエキスなどが挙げられる。

0029

第1の培地は、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、糖類、エキス類(ビタミンミネラル等の供給のため)、塩化ナトリウムなどが挙げられる。糖類の例としては、グルコース、スクロースなどが挙げられる。エキス類の例としては、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ポテトエキスなどが挙げられる。

0030

第1の培地の各種成分の含有量は、バチルス属細菌を培養することができれば特に限定されないが、例えば、ゲル化剤は1〜30g、アミノ酸源は1〜10g、エキス類は1〜5g、糖類は1〜5g、塩化ナトリウムは1〜10gである(これらの含有量は精製水1Lに対するものである)。

0031

第1の培地のpHは7.0±0.1であることが好ましい。
好ましい第1の培地の具体的な組成は、水(精製水など)1Lに対して、カゼイン−ペプトン1〜10g、好ましくは3〜7g、酵母エキス1〜5g、好ましくは1.5〜4g、グルコース0.1〜5g、好ましくは0.5〜3g、及び、寒天5〜30g、好ましくは10〜20gのものであり、pHは7.0±0.1である。

0032

特に好ましい第1の培地としては、例えば、標準寒天培地を使用することができる。標準寒天培地とは、一般細菌の培養に使用可能な非選択培地であって、例えば、水道法関連省令日本薬局方等で定義、利用されている。

0033

上述したように、第1の培地は、レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液を実質的に含まない。「実質的に含まない」とは、レシチン含有物質または血液の場合、第1の培地において、レシチン含有物質または血液の含有量が精製水1Lに対して、0.5mL未満であることを意味し、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖の場合、第1の培地において、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖の含有量が、精製水1Lに対して、0.5g未満であることを意味する。

0034

第1の培地は抗生物質を実質的に含まないことが好ましい。抗生物質を実質的に含まないとは、第1の培地において、抗生物質の含有量が、精製水1Lに対して、1単位未満のことをいう。

0035

工程(B)の培養は、通常、好気条件下において平板培養法で行う。培養温度は、例えば、20〜40℃である。培養時間は、例えば、12〜72時間である。
工程(B)において第1の培養工程を行うと、バチルス属細菌のコロニーの他、バチルス属以外の芽胞菌のコロニーや、工程(A)の殺菌工程において生き残った雑菌のコロニーが一定数培養される。これらの中から、バチルス属細菌に特有の粗大・不定形コロニーを釣菌することにより、バチルス属細菌(枯草菌を含む)を取得することができる。

0036

[工程(C)(第2培養工程)]
工程(C)では、レシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液のうちの少なくとも1種を含み、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖が含まれる場合はpH指示薬を更に含む第2の培地を使用して、第1培養工程から取得された枯草菌を含むバチルス属細菌を培養し、培養された細菌の中から枯草菌を取得する。

0037

レシチン含有物質としては、卵黄大豆レシチン魚類レシチンが挙げられる。卵黄が好ましい。枯草菌によって分解されて酸を生成する糖としては、マンニトール、アラビノースキシロースなどが挙げられる。マンニトールが好ましい。血液としては、ヒツジ血液、ウマ血液、ヒト血液などが挙げられる。血液は脱繊維の形態であることが好ましい。pH指示薬の例としては、フェノールレッドやブロムクレゾールパープルが挙げられる。

0038

第2の培地は、枯草菌を培養することができるものである。したがって、第2の培地は、上記のレシチン含有物質、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖、及び血液のうちの1種の他に、通常、少なくともゲル化剤及びアミノ酸源を含む。

0039

ゲル化剤及びアミノ酸源は、第1の培地について上述したものと同様のものを使用することができる。
第2の培地は、他の成分を更に含んでいてもよい。他の成分としては、糖類、エキス類、塩化ナトリウム、抗生物質などが挙げられる。糖類、エキス類は第1の培地について上述したものと同様のものを使用することができる。抗生物質としては、枯草菌が非感受性の抗生物質、例えば、ポリミキシンBが挙げられる。なお、本発明において、第1の培地および第2の培地において、列挙した成分は1種を単独で使用してもよく、2種以上を組み合わせてしてもよい。

0040

第2の培地の各種成分の含有量は、例えば、レシチン含有物質は0.5〜50mL、枯草菌によって分解されて酸を生成する糖は0.5〜20g、血液は0.5〜100mL、ゲル化剤は1〜30g、アミノ酸源は1〜10g、エキス類は1〜5g、糖類は1〜5g、塩化ナトリウムは1〜10gである(これらの含有量は精製水1Lに対するものである)。

0041

第2の培地のpHは7.0〜7.4の範囲が好ましく、特に7.1〜7.3の範囲が好ましい。
好ましい第2の培地の具体的な組成は、水(精製水など)1Lに対して、肉エキス0.1〜5g、好ましくは0.5〜2g、ペプトン1〜20g、好ましくは5〜15g、D−マンニトール0.5〜20g、好ましくは5〜15g、塩化ナトリウム1〜20g、好ましくは5〜15g、フェノールレッド0.01〜0.1g、好ましくは0.02〜0.05g、寒天5〜30g、好ましくは10〜20g、卵黄液(50%)1〜100mL、好ましくは1〜80mL、更に好ましくは10mL〜70mL、ポリミキシンB10,000〜500,000単位、好ましくは50,000〜200,000単位のものであり、pHは7.0〜7.4である。

0042

工程(C)の培養は、通常、好気条件下において平板培養法で行う。培養温度は、例えば、20〜40℃である。培養時間は、例えば、12〜72時間である。
第2の培地に枯草菌によって分解されて酸を生成する糖及びpH指示薬としてのフェノールレッドが含まれる場合、枯草菌はその糖を分解して酸を発生し、pH指示薬が酸性を示す(すなわち、コロニーは黄色を呈する)。一方で、他のバチルス属細菌(セレウス菌、炭疽菌など)はその糖を分解せず、そのコロニーは黄色を呈さない。したがって、工程(C)において培養を終えた後、黄色を呈するコロニーが枯草菌のコロニーであると判別することができる。

0043

一方、第2の培地にレシチン含有物質が含まれる場合、枯草菌はレシチン含有物質と反応しない一方で、他のバチルス属細菌、特に病原性バチルス属細菌(セレウス菌、炭疽菌など)はレシチン含有物質とレシチナーゼ反応を起こす。レシチナーゼ反応を起こしたコロニーはその周りに不透明帯を呈することから、不透明帯を有するコロニーは枯草菌以外のバチルス属細菌であり、不透明帯を有しないコロニーが枯草菌のコロニーであると判別することができる。

0044

第2の培地は枯草菌によって分解されて酸を生成する糖(及びpH指示薬)ならびにレシチン含有物質の両方を含んでいてもよく、この場合、不透明帯を有しない黄色コロニーが枯草菌のコロニーであると判別することができる。なお、本手法により、環境サンプル中から極めて高い確率で枯草菌を単離可能となるが、枯草菌ではない菌株を単離してしまう可能性もゼロではないと推測されるため、適宜遺伝子解析等のクロスチェックを行うことが望ましい。

0045

また、第2の培地に血液が含まれる場合(血液寒天培地)は、溶血性の有無の観点から培養された菌の中から枯草菌を判別可能である。枯草菌では溶血性が認められるので、培養されたコロニーは同心円状の溶血帯を有するコロニーとなる。

0046

[枯草菌、微生物製剤、培地セット]
本発明は、本発明の単離方法により得られた枯草菌も提供する。また、本発明は、本発明の枯草菌を含む微生物製剤も提供する。さらに、本発明は、上記の第1の培地と第2の培地とを含む枯草菌単離用培地セットを提供する。

0047

上述したように、本発明によれば、簡易、迅速及び安価な方法で、病原性に対し安全性の高い枯草菌を環境中から単離することができる。単離された枯草菌は、水処理工程などで用いられる微生物製剤はもとより、土壌改良剤、コンポスト発酵促進剤微生物農薬消臭剤、納豆などの発酵食品、酵素製造、サプリメントラボ試験、菌株コレクションなどに適宜使用可能である。以下、本発明を実施例により説明する。

0048

[1]実施例1
実施例1は図2に示す通りの順序で行った。まず、環境(土壌、枯れ葉、枯れ草、苔、活性汚泥)中から採取されたサンプル90mgを9mlの滅菌水に懸濁させた。懸濁後のサンプルについて、まず段階希釈を行い、下水試験方法に順じて標準寒天培地(ペプトン5g/L、酵母エキス2.5g/L、グルコース1g/L、寒天15g/L、pH7.0±0.1)により混釈を行った。

0049

次に、35℃で24時間静置培養した後、一般細菌数を算出した(参考値、下記表1)。この一般細菌数は、サンプル中に含まれる一般細菌(標準寒天培地上で生育する全ての中温性好気性細菌)を示し、例えば土壌の125,000CFU/mlとは、懸濁後の滅菌水1ml中に125,000個の生きた細菌が存在することを示している。

0050

その後、懸濁液を80℃のウォーターバス容器ごと浸漬し、1時間の加熱処理を行った(工程(A))。これにより、芽胞菌(バチルス属細菌など)以外の雑菌を殺菌した。
次に、殺菌後の懸濁液を段階希釈した後、第1の培地としての標準寒天培地(ペプトン5g/L、酵母エキス2.5g/L、グルコース1g/L、寒天15g/L、pH7.0±0.1)に塗抹し30℃で24時間静置して平板培養を行った。培養後、芽胞菌及び工程(A)の加熱殺菌で生き残った微生物の中からバチルス属細菌に特有の粗大・不定形コロニー(図3の矢印で示すコロニー)を取得した(工程(B))。

0051

表1の通り、土壌より2株、枯れ葉より1株、枯れ草より3株、苔より5株、活性汚泥より16株のバチルス属細菌のコロニーを取得した。
取得したバチルス属細菌のコロニーについて、それぞれを第2の培地としてのMYP寒天培地(肉エキス1g/L、ペプトン10g/L、D−マンニトール10g/L、塩化ナトリウム10g/L、フェノールレッド0.025g/L、寒天15g/L、卵黄液(50%)50ml/L、ポリミキシンB100,000units/L、pH7.2±0.1)に画線塗抹し、30℃で24時間静置培養した後、培養されたバチルス属細菌の中から不透明帯の無い黄色コロニー(図4)を枯草菌と判別し、取得した(工程(C))。

0052

表1の通り、土壌より1株、枯れ草より1株、活性汚泥より4株の枯草菌が取得された。これら計6株について、遺伝子解析により相同性検索を実施したところ、いずれも既知の枯草菌配列と100%一致した。土壌、枯れ葉、枯れ草、苔、活性汚泥のうち、活性汚泥から最も効率良く単離することが可能であった。なお、図5に示すように、黄色を呈さず不透明帯を有するコロニーは枯草菌以外のバチルス属細菌である。

0053

本実施例で用いた標準寒天培地とMYP寒天培地を培地セットとして構成し、塗抹用の白金耳滅菌希釈水などを付属品として同することで、特段大掛かりな設備が無くても、場所を問わず、誰でも簡単且つ迅速に、枯草菌を単離することが可能となる。

0054

0055

[2]比較例1
比較例1として、実施例1と同様に環境サンプルの懸濁液を調製した後、1.加熱(実施例と同じ条件)による環境サンプルの殺菌工程の後に上記のMYP寒天培地で殺菌されたサンプルを培養(30℃で24時間)した場合、2.殺菌工程を行わずに最初から上記の標準寒天培地で環境サンプルを培養(30℃で24時間)した場合、3.殺菌工程を行わずに最初から上記のMYP寒天培地で環境サンプルを培養(30℃で24時間)した場合の結果を表2〜4に示す。いずれの場合も雑菌が旺盛に繁殖してしまい、次の工程に進むことが出来ず枯草菌を単離することができなかった。

0056

0057

0058

0059

[3]実施例2
実施例1と同様にして、複数の活性汚泥源から、40株程度の枯草菌菌株を単離した。これらの枯草菌菌株について、それぞれの菌株を栄養培地ポリペプトン10g/L、酵母エキス2g/L、硫酸マグネシウム七水和物1g/L、pH7.0)にて培養し、菌体洗浄遠心回収したのち、保持担体と共に凍結乾燥機にて粉末化し、微生物製剤を製造した。この微生物製剤を用い、有機物(デンプン、タンパク質、及び油脂)の分解活性を評価した。また。取得菌株の他に、対照区として他社の枯草菌含有微生物製剤(他社品A)も同様の試験に供することとした。なお、製造した微生物製剤および他社品Aの枯草菌菌数は、どちらも108CFU/gであった。

0060

デンプン分解活性の評価は、以下の手法により実施した。200mL三角フラスコ模擬排水(酵母エキス0.5g/L、リン酸水素二アンモニウム0.5g/L、pH7.0)を100mL張りオートクレーブ滅菌した。オートクレーブ後、0.22μmフィルタで別滅菌済みのデンプン水溶液を加え、デンプン終濃度として0.2g/Lとなるよう調整した。調整後の培地に微生物製剤を100mg/L添加し、150rpm、30℃で往復振盪を行った。培養0h及び48hでサンプリングし、デンプン測定キット(Megazyme社製、K−TSTA−100A)によりデンプンの定量を行い、以下の式によりデンプン分解率を算出した:
(培養0h−培養48h)÷ 培養0h × 100=デンプン分解率(%)。

0061

タンパク質分解活性の評価は、以下の手法により実施した。200mL三角フラスコに前述の模擬排水を100mL張り、オートクレーブ滅菌した。オートクレーブ後、0.22μmフィルタで別滅菌済みのカゼインNa水溶液を加え、カゼインNa終濃度として2g/Lとなるよう調整した。調整後の培地に微生物製剤を100mg/L添加し、150rpm、30℃で往復振盪を行った。培養0h及び6hでサンプリングし、タンパク質測定キット(富士フィルム和光純薬株式会社製、プロテインアッセイラピッドキットワコーII)によりタンパク質の定量を行い、以下の式によりタンパク質分解率を算出した:
(培養0h−培養6h)÷ 培養0h × 100=タンパク質分解率(%)。

0062

油脂分解活性の評価は、以下の手法により実施した。200mL三角フラスコに前述の模擬排水を100mL張り、オートクレーブ滅菌した。オートクレーブ後、0.22μmフィルタで別滅菌済みのラードベル食品社製、純正ラード)を加え、ラード終濃度として1g/Lとなるよう調整した。調整後の培地に微生物製剤を100mg/L添加し、150rpm、30℃で往復振盪を行った。培養0h及び48hでサンプリングし、サンプル4mLに対してリパーゼ製剤(水ing社製、ユーサワー120)を30mg添加したのち、40℃で60分間酵素反応させてグリセリン遊離させた。その後、F−キット(JKインターナシナル社製、F−キットグリセロール)にて残存グリセリンを測定することで、油脂量の測定を行った。なおリパーゼ製剤による酵素反応前に存在していたグリセリンは、バチルス属細菌によって速やかに資化されることを事前確認済みである。得られた油脂量について、以下の式により油脂分解率を算出した:
(培養0h−培養48h)÷ 培養0h × 100=油脂分解率(%)。

0063

試験の結果を表5に示す。活性汚泥より取得された複数の菌株について試験を実施したが、その中でも特に分解活性の高かった4株の結果を示す。これら4株は、他社品Aと比較し有機物の分解活性が顕著に高い傾向にあった。

0064

0065

上記B−1−2株、B−6−1株、B−10−1株、B−11−3株と名付けた各菌株について、16SrDNAの塩基配列(約1,500bp)を解析し、国際塩基配列データベース(BLAST)による相同性検索を行った結果、いずれの菌株も既知の枯草菌(Basillus subtilis)の配列と99.9%一致した。相同性検索及び形態観察の結果から、これら菌株は、枯草菌(Basillus subtilis)に帰属することが確認された。これら菌株は自然界(活性汚泥)より独自に単離した新規菌株である。これら新規菌株は、公知の菌株(他社品A)と比較し、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼを高生産し、顕著に高いデンプン、タンパク質、及び油脂分解活性を有する。これら菌株のそれぞれを、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2018年10月16日付けで寄託した(受託番号は、それぞれ、NITEP−02795、NITE P−02796、NITE P−02797、NITE P−02798)。

0066

これら新規菌株の特徴は以下の通りである。
分離源:使用済み活性汚泥貯留槽から分離(採取地:日本)
単離方法:上記実施例1に記載の方法
細胞状、周毛を持つ、運動性を有する
コロニー:クリーム色、粗大、不定形
培養方法:通常の枯草菌の培養方法と同様の方法で培養可能
特徴:アミラーゼ、プロテアーゼ、及びリパーゼを高生産し、表5に示す通り、既存の枯草菌菌株に比べて、顕著に高いデンプン、タンパク質、及び油脂分解活性を有する。

実施例

0067

単離した枯草菌は、例えば、そのままで、あるいは任意の慣用される担体または栄養成分等と混合し、また、任意に慣用される方法で粉末化または顆粒化等するなどして、製剤化し、微生物製剤として用いることができる。

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