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技術 EPAS1関連疾患を治療するための有機組成物

出願人 アローヘッドファーマシューティカルズインコーポレイテッド
発明者 ベッテンコートブライアンガネシュシャンティジョージエリザベスヒュースケンディエターミルスタインステュワートソロモンジョナサントーマスエミリートードジャルスカイヴァンカトゥライジェニファーウェイラージャン
出願日 2019年2月21日 (1年4ヶ月経過) 出願番号 2019-028972
公開日 2019年6月13日 (1年0ヶ月経過) 公開番号 2019-089836
状態 未査定
技術分野 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 医薬品製剤 突然変異または遺伝子工学 化合物または医薬の治療活性 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬
主要キーワード 中断部分 フェネチルイソチオシアネート 明らかな矛盾 初期解 酸素呼吸 部分範囲 タイル化 内部セグメント
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年6月13日)のものです。
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図面 (2)

課題

PAS1関連疾患、例えば、癌、転移星細胞腫膀胱癌乳癌軟骨肉腫結腸直腸癌胃癌神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌肝細胞癌肺腺癌神経芽腫非小細胞肺癌黒色腫多発性骨髄腫卵巣癌直腸癌腎癌明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎乾癬カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス子癇前症(preemclampsia)、炎症、慢性炎症血管新生性疾患、および関節リウマチなどの治療法の提供。

解決手段

センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、アンチセンス鎖が、EPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、組成物を用いる。

概要

背景

発明の背景
EPAS1は、HIF(低酸素誘導因子遺伝子ファミリーメンバーである。EPAS1はHif2αとしても知られており、酸素によって調節される遺伝子の誘導関与する転写因子の半分をコードし、酸素レベルが低下(低酸素症として知られる状態)すると誘導される。

この遺伝子のある種の変異体は、高地で生活する人々に防御を与えている。しかし、低高度では、野生型(WT)EPAS1の過剰発現は、高血圧および脳卒中の増加、ならびに高山病に類似した症状と関連している。また、この遺伝子における突然変異は、家族性赤血球増加症4型および肺高血圧症とも関連している。EPAS1はまた、赤血球過剰産生を引き起こし、生殖能力阻害またはさらには死亡につながることもある。

EPAS1はまた、腫瘍進行を含む多種多様な疾患に関与するさまざまな遺伝子の発現のためにも必要であり、またはそれを強化する。例えば、EPAS1はブドウ膜黒色腫の進行に重要な役割を果たすが、これはおそらくオートクリンループVEGF-pVEGFR2/KDRを促進し、かつLDHAの発現を強化して、それによって増殖を優位にすることによると考えられる。

EPAS1はまた、以下のものを含む多くの因子の発現にも関与するか、またはそれをアップレギュレートする:c-Myc(細胞増殖形質転換新形成および腫瘍形成を助長し、かつほとんどの癌で高度に発現される);インターロイキン8(歯肉炎および乾癬などにおける炎症誘発性メディエーター);SP-1(IL-8調節に関与する転写因子であり、かつc-Mycのコアクチベーターでもある);LDH5(腫瘍壊死および腫瘍サイズ増大と関連性がある);およびLANA(潜伏期関連核抗原、これはカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスと関連している)。加えて、HIF(低酸素誘導因子)活性は、癌腫瘍の成長のために必要な血管新生(angiogensis)にも関与する。EPAS1はまた、慢性炎症を含む炎症、血管新生性疾患関節リウマチ腎癌明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、軟骨肉腫、および多発性骨髄腫を含む、いくつかの他の疾患にも関与する。

したがって、これらのEPAS1関連疾患および他のEPAS1関連疾患に関する治療の必要性が存在する。

概要

EPAS1関連疾患、例えば、癌、転移、星細胞腫膀胱癌乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌胃癌神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌肝細胞癌肺腺癌神経芽腫非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症(preemclampsia)、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、および関節リウマチなどの治療法の提供。センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、アンチセンス鎖が、EPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、組成物を用いる。

目的

本開示は、EPAS1の阻害のための特異的RNAi剤、および、対象、例えばヒトなどの哺乳動物におけるEPAS1レベルを低下させるために有用な方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、アンチセンス鎖が、表1〜5のいずれかに提供されるEPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、組成物。

請求項2

EPAS1に対する第2のRNAi剤をさらに含む、請求項1記載の組成物。

請求項3

アンチセンス鎖が約30個またはそれ未満のヌクレオチドの長さである、請求項1記載の組成物。

請求項4

センス鎖およびアンチセンス鎖が、約15〜約30ヌクレオチド対の長さである二重鎖領域を形成する、請求項1記載の組成物。

請求項5

アンチセンス鎖およびセンス鎖がいずれも約19〜約23ヌクレオチド長である、請求項1記載の組成物。

請求項6

RNAi剤が、ホスホロチオエート結合を含む改変された糖骨格、または2'-改変ヌクレオチドを含む、請求項1記載の組成物。

請求項7

RNAi剤が、2'-デオキシ、2'-デオキシ-2'-フルオロ、2'-O-メチル、2'-O-メトキシエチル(2'-O-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、および2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)からなる群より選択される2'-改変を含む、請求項1記載の組成物。

請求項8

RNAi剤が平滑末端を含む、請求項1記載の組成物。

請求項9

RNAi剤が、対合していない1〜4個のヌクレオチドを有するオーバーハングを含む、請求項1記載の組成物。

請求項10

請求項11

RNAi剤が、ヌードマウスの786-O腫瘍において、EPAS1の発現を少なくとも約50%阻害することができる、請求項1記載の組成物。

請求項12

RNAi剤が、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約80%阻害することができる、請求項1記載の組成物。

請求項13

RNAiが約0.1nMを上回らないEC50を有する、請求項1記載の組成物。

請求項14

RNAiが約0.001nMを上回らないEC50を有する、請求項1記載の組成物。

請求項15

センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、センス鎖およびアンチセンス鎖が、表1〜5のいずれかに提供されるEPAS1に対するRNAi剤の、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、組成物。

請求項16

個体におけるEPAS1の発現を阻害する方法であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物の治療的有効量を個体に投与する段階を含み、アンチセンス鎖が、表1〜5のいずれかに提供されるEPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、方法。

請求項17

個体がEPAS1関連疾患に罹患しているか、または罹患しやすい、請求項16記載の方法。

請求項18

EPAS1関連疾患が、癌、転移星細胞腫膀胱癌乳癌軟骨肉腫結腸直腸癌胃癌神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌肝細胞癌肺腺癌神経芽腫非小細胞肺癌黒色腫多発性骨髄腫卵巣癌直腸癌腎癌明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎乾癬カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス子癇前症(preemclampsia)、炎症、慢性炎症血管新生性疾患、または関節リウマチである、請求項16記載の方法。

請求項19

EPAS1関連疾患が癌である、請求項16記載の方法。

請求項20

さらなる疾患治療を投与する段階をさらに含む、請求項16記載の方法。

請求項21

さらなる疾患治療を投与する段階をさらに含み、RNAi剤を含む組成物およびさらなる疾患治療の投与が、同時、同時並行的、別々または逐次的である、請求項16記載の方法。

請求項22

EPAS1関連疾患が、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、または関節リウマチである、請求項16記載の方法。

請求項23

EPAS1関連疾患が癌である、請求項16記載の方法。

請求項24

さらなる疾患治療を投与する段階をさらに含む、請求項16記載の方法。

請求項25

さらなる疾患治療を投与する段階をさらに含み、RNAi剤を含む組成物およびさらなる疾患治療の投与が、同時、同時並行的、別々または逐次的である、請求項16記載の方法。

請求項26

EPAS1関連疾患が、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、または関節リウマチである、請求項16記載の方法。

請求項27

EPAS1関連疾患が癌である、請求項16記載の方法。

請求項28

組成物が、EPAS1に対する第2のRNAi剤をさらに含む、請求項16記載の方法。

請求項29

請求項1記載の組成物の治療的有効量を個体に投与する段階を含む、個体におけるEPAS1関連疾患を治療する方法に用いるための、請求項1記載の組成物。

請求項30

請求項1記載の組成物の治療的有効量を個体に投与する段階を含む、個体におけるEPAS1の発現を阻害するための方法に用いるための、請求項1記載の組成物。

請求項31

EPAS1関連疾患の治療のための医薬の製造における、請求項1記載の組成物の使用。

請求項32

EPAS1関連疾患が、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、または関節リウマチである、請求項31記載の使用。

請求項33

EPAS1関連疾患の治療に用いるための、請求項1記載の組成物。

請求項34

EPAS1関連疾患が癌である、請求項33記載の使用。

背景技術

0001

発明の背景
EPAS1は、HIF(低酸素誘導因子遺伝子ファミリーメンバーである。EPAS1はHif2αとしても知られており、酸素によって調節される遺伝子の誘導関与する転写因子の半分をコードし、酸素レベルが低下(低酸素症として知られる状態)すると誘導される。

0002

この遺伝子のある種の変異体は、高地で生活する人々に防御を与えている。しかし、低高度では、野生型(WT)EPAS1の過剰発現は、高血圧および脳卒中の増加、ならびに高山病に類似した症状と関連している。また、この遺伝子における突然変異は、家族性赤血球増加症4型および肺高血圧症とも関連している。EPAS1はまた、赤血球過剰産生を引き起こし、生殖能力阻害またはさらには死亡につながることもある。

0003

EPAS1はまた、腫瘍進行を含む多種多様な疾患に関与するさまざまな遺伝子の発現のためにも必要であり、またはそれを強化する。例えば、EPAS1はブドウ膜黒色腫の進行に重要な役割を果たすが、これはおそらくオートクリンループVEGF-pVEGFR2/KDRを促進し、かつLDHAの発現を強化して、それによって増殖を優位にすることによると考えられる。

0004

EPAS1はまた、以下のものを含む多くの因子の発現にも関与するか、またはそれをアップレギュレートする:c-Myc(細胞増殖形質転換新形成および腫瘍形成を助長し、かつほとんどの癌で高度に発現される);インターロイキン8(歯肉炎および乾癬などにおける炎症誘発性メディエーター);SP-1(IL-8調節に関与する転写因子であり、かつc-Mycのコアクチベーターでもある);LDH5(腫瘍壊死および腫瘍サイズ増大と関連性がある);およびLANA(潜伏期関連核抗原、これはカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスと関連している)。加えて、HIF(低酸素誘導因子)活性は、癌腫瘍の成長のために必要な血管新生(angiogensis)にも関与する。EPAS1はまた、慢性炎症を含む炎症、血管新生性疾患関節リウマチ腎癌明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、黒色腫、ブドウ膜黒色腫、軟骨肉腫、および多発性骨髄腫を含む、いくつかの他の疾患にも関与する。

0005

したがって、これらのEPAS1関連疾患および他のEPAS1関連疾患に関する治療の必要性が存在する。

0006

本開示は、EPAS1の阻害のための、かつ、EPAS1関連疾患、例えば、癌、転移、星細胞腫膀胱癌乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌胃癌神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌肝細胞癌肺腺癌神経芽腫非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症(preemclampsia)、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、および関節リウマチなどの治療において有用である、EPAS1(Hif2α)に対するRNAi剤を範囲に含む。

0007

本開示はまた、EPAS1発現によって少なくとも部分的に媒介される病的状態を有するヒト対象を治療する方法であって、EPAS1に対するRNAi剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む方法も範囲に含む。

0008

本方法はまた、任意で、第2の薬剤を投与する段階をさらに含む。いくつかの局面において、この第2の薬剤は、EPAS1に対するもう1つのRNAi剤(例えば、EPAS1標的内部の異なる配列を標的とするRNAi剤)である。他の局面において、第2の薬剤は、その病的状態において同じく活動が亢進している、突然変異している、および/または過剰発現されている、別の標的を対象とするものなどの別の治療である。

0009

本開示は、EPAS1の阻害のための特異的RNAi剤、および、対象、例えばヒトなどの哺乳動物におけるEPAS1レベルを低下させるために有用な方法を提供する。本開示は具体的には、EPAS1の少なくとも15個または19個またはそれを上回る連続したヌクレオチドを含む二本鎖RNAi剤を提供する。特に、本開示は、例えば、本明細書中のいずれかの表、例えば表1〜5(表5Aから5Eまでの表5のすべての部分を含む)などにおいて提供されるRNAi剤の任意のものとの違いが0、1、2または3個である、15個またはそれを上回る連続したヌクレオチドの配列を含む薬剤を提供する。RNAi剤は特に、1つの局面において、1つの鎖当たり30個未満のヌクレオチド、例えば、17〜23個のヌクレオチド、15〜19個、18〜22個および/もしくは19〜21個のヌクレオチドなど、ならびに/または例えば表1〜5に提供されるものなど、ならびにそれらの改変または非改変変異体(例えば、センス鎖および/もしくはアンチセンス鎖または第1および/もしくは第2の鎖が改変されているか、または改変されていない)を含みうる。本開示はまた、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む薬剤であって、センス鎖および/またはアンチセンス鎖が、例えば表1〜5に提供されるRNAi剤のものとの違いが0、1、2または3個である、19個またはそれを上回る連続したヌクレオチドの配列、およびそれらの改変または非改変変異体を含む、薬剤も提供する。センス鎖およびアンチセンス鎖は連続していてもよく、または、例えば共有結合、ループもしくはリンカーによって物理的に接続されていてもよい。

0010

二本鎖RNAi剤は、3'および/または5'末端の一方または両方からの、0、1もしくは2個の平滑末端、および/または1、2、3もしくは4ヌクレオチド(すなわち、1〜4nt)のオーバーハングを有しうる。二本鎖RNAi剤はまた、任意で、1つもしくは2つの3'キャップおよび/または1つもしくは複数の改変ヌクレオチドも含みうる。本明細書に提供される配列の改変変異体には、対応する改変ヌクレオチドの天然ヌクレオチドによる置換を含むこと以外は同一であるものが含まれる。

0011

さらに、RNAi剤は、天然リボヌクレオチドサブユニットのみを含むこともでき、または、置き換えヌクレオチドサブユニットの1つもしくは複数の糖、リン酸もしくは塩基に対する1つもしくは複数の改変を、それらがリボヌクレオチドサブユニットもしくはデオキシリボヌクレオチドサブユニットのいずれを含むかにかかわらず、含むこともできる。1つの局面において、開示されるRNAi剤の改変変異体は、ウリジンを置き換えるチミジン(RNA、もしくは好ましくはDNAとして)を有するか、またはイノシン塩基を有する。いくつかの局面において、開示されるRNAi剤の改変変異体は、パッセンジャー鎖中のニックガイド鎖とパッセンジャー鎖との間のミスマッチ、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方のRNAの一部分(例えば、シード領域)を置き換えるDNA、ならびに/または短縮されたパッセンジャー鎖(例えば、13、14、15、16、17または18nt)を有しうる。ひとたび機能的ガイド鎖が同定されれば、RNAi剤の改変体および変異体を容易に作製することができる。相互排他的でない任意の2つまたはそれを上回る改変を組み合わせることができる(例えば、塩基改変と短縮されたパッセンジャー鎖との;またはニック入りパッセンジャー鎖と塩基改変との;またはシード領域の一部もしくは全体を置き換えるDNAと残りのRNAにおける塩基改変との組み合わせ、など)。本明細書に開示される任意の配列またはその任意の部分(例えば、19個の[またはそれを上回る]連続したnt;15個の[またはそれを上回る]連続したnt;0、1、2または3個のntに違いがある15個の[またはそれを上回る]連続したnt)を、本明細書に開示される任意の改変または改変スキームとともに、それらが相互排他的でないこと(例えば、長さの異なる鎖のことを指す)を条件として用いることができる。RNAi剤の配列(およびその任意の部分)は、本明細書に記載の任意の改変、一連の改変(例えば、改変スキーム)、媒体組成物、方法、治療などとともに、それらが相互排他的でないことを条件として用いることができる。

0012

1つの局面において、開示されるRNAi剤の改変変異体には、ヌクレオチドサブユニットの1つまたは複数のうち糖またはリン酸の1つまたは複数に対する1つまたは複数の改変を有する点を除いて、表1〜5のいずれかに開示されているRNAi剤のいずれかと同じ配列(例えば、同じ塩基の配列)を有するRNAi剤が含まれる。1つの局面において、改変は、RNAi剤の有効性、安定性(例えば、血清もしくは腸液などの中でのヌクレアーゼに対する)を改善する、かつ/または免疫原性を低下させる。本開示の1つの局面は、少なくとも1つの非天然核酸塩基を含む二本鎖オリゴヌクレオチドに関する。これらには、汎用的な塩基類似体、例えば、Loakes 2001 Nucl. AcidsRes. 29: 2437-2447によって記載されたものが含まれる。ある局面において、非天然核酸塩基は、ジフルオロトリルニトロインドリル、ニトロピロリル、またはニトロイミダゾリルである。1つの特定の局面において、非天然核酸塩基はジフルオロトリルである。ある局面においては、2つのオリゴヌクレオチド鎖の一方のみが非天然核酸塩基を含む。ある局面においては、オリゴヌクレオチド鎖の両方が非天然核酸塩基を含む。

0013

RNAi剤は、任意で、薬剤の1つまたは複数の特性、例えば、安定性、分布および/または細胞内取り込みなどを改善するように選択されたリガンド、例えば、コレステロールまたはその誘導体と結びつけることができる。RNAi剤は単離されていてもよく、または本明細書に記載の方法のために用いられる薬学的組成物の一部であってもよい。特に、薬学的組成物は、特定組織(例えば、EPAS1関連疾患に罹患したもの)への送達のために製剤化することもでき、または非経口的投与のために製剤化することもできる。薬学的組成物は任意で、それぞれのものがEPAS1mRNAの同じ、重なり合う、または異なるセグメントを対象とする、2つまたはそれを上回るRNAi剤を含むことができる。任意で、薬学的組成物は、任意のEPAS1関連疾患に対する任意の公知の治療をさらに含んでもよく、またはそれとともに用いてもよい。

0014

本開示はさらに、細胞内のEPAS1mRNAのレベルを、特にEPAS1の過剰発現または過剰活性によって特徴づけられる疾患の場合に、低下させるための方法を提供する。EPAS1の突然変異、過剰発現および/または過剰活性といった変化を含む細胞は、「EPAS1に欠陥のある」細胞と呼ばれる。そのような方法は、以下にさらに説明するように、本開示のRNAi剤の1つまたは複数を、EPAS1に欠陥のある細胞に対して投与する段階を含む。本方法は、細胞内の標的RNAを選択的に分解するRNA干渉に関与する細胞機構を利用し、細胞を本開示のRNAi剤の1つと接触させる段階を含む。

0015

本開示はまた、EPAS1発現によって少なくとも部分的に媒介される病的状態を有するヒト対象を治療する方法であって、対象に対してRNAi剤EPAS1の治療的有効量を投与する段階を含む方法も範囲に含む。さらなる方法は、疾患進行(例えば、腫瘍成長)にEPAS1が必要であるが、EPAS1が増幅されることも過剰発現されることもない病的状態を予防する、治療する、モジュレートする、および/または改善することを伴う。そのような方法は、以下にさらに説明するように、本開示のRNAi剤の1つを対象に投与する段階を含む。そのような方法は、細胞に対して直接行うこともでき、または哺乳動物対象に対して、対象に本開示のRNAi剤/薬学的組成物の1つを投与することによって行うこともできる。細胞内の標的EPAS1 RNAの減少は、産生される、コードされるEPAS1タンパク質の量の減少をもたらす。生物体において、このことは、EPAS1が関与する経路バランス回復、ならびに/またはEPAS1蓄積の防止、ならびに/またはEPAS1活性および/もしくは発現の低下、ならびに/または他の遺伝子のEPAS1媒介性活性化の防止、ならびに/またはEPAS1関連疾患の改善、治療および/もしくは予防をもたらすことができる。1つの局面において、EPAS1の発現、レベルまたは活性の低下は、腫瘍成長を制限することができる。

0016

本開示の方法および組成物、例えば、方法およびEPAS1RNAi剤組成物は、本明細書に記載されるかまたは当技術分野において公知である任意の適切な投与量および/または製剤で、ならびに本明細書に記載されるかまたは当技術分野において公知である任意の適した投与経路で用いることができる。

0017

本開示の1つまたは複数の局面の詳細は、添付の図面および以下の説明において示される。相互排他的でない、本明細書に開示されるかまたは当技術分野において公知であるさまざまな局面の要素(例えば、配列またはその部分[例えば、0、1、2または3ntに違いのある15個またはそれを上回る連続したnt]、長さ、改変、末端ジヌクレオチドエンドキャップ、RNAi剤の組み合わせ、EPAS1 RNAi剤と別の薬剤とを伴う併用療法、他の構成要素との結合体化、送達のための組成物または方法、疾患治療など)を、その1つまたは複数の薬剤が依然としてRNA干渉を媒介しうることを条件として、互いに組み合わせることができる。例えば、本明細書に開示される任意のRNAi剤配列を、本明細書に開示される改変またはエンドキャップの任意のセットと組み合わせることができる。同様に、改変、5'末端キャップ、および/または3'末端キャップの任意の組み合わせを、本明細書に開示される任意のRNAi剤配列とともに用いることができる。本明細書に開示される任意のRNAi剤(改変もしくはエンドキャップの任意の組み合わせを有するか、または改変もしくはエンドキャップのいずれも有しない)を、本明細書に開示される任意の他のRNAi剤または他の治療組成物または方法と組み合わせることができる。

0018

[本発明1001]
センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、アンチセンス鎖が、表1〜5のいずれかに提供されるEPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1002]
EPAS1に対する第2のRNAi剤をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
アンチセンス鎖が約30個またはそれ未満のヌクレオチドの長さである、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
センス鎖およびアンチセンス鎖が、約15〜約30ヌクレオチド対の長さである二重鎖領域を形成する、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
アンチセンス鎖およびセンス鎖がいずれも約19〜約23ヌクレオチド長である、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
RNAi剤が、ホスホロチオエート結合を含む改変された糖骨格、または2'-改変ヌクレオチドを含む、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
RNAi剤が、2'-デオキシ、2'-デオキシ-2'-フルオロ、2'-O-メチル、2'-O-メトキシエチル(2'-O-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、および2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)からなる群より選択される2'-改変を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1008]
RNAi剤が平滑末端を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1009]
RNAi剤が、対合していない1〜4個のヌクレオチドを有するオーバーハングを含む、本発明1001の組成物。
[本発明1010]
RNAi剤が、1つまたは複数の診断用化合物レポーター基架橋剤、ヌクレアーゼ耐性を付与するモイエティー、天然または特異な核酸塩基、親油性分子、コレステロール、脂質、レクチンステロイド、ウバオール、ヘコゲニン(hecigenin)、ジオスゲニンテルペントリテルペンサルササポゲニンフリーリンエピフリーデラノル誘導体リトコール酸ビタミン糖質デキストランプルランキチンキトサン、合成糖質、オリゴラクテート15mer、天然ポリマー、低分子量もしくは中間分子量ポリマーイヌリンシクロデキストリンヒアルロン酸、タンパク質、タンパク質結合剤インテグリン標的指向性分子ポリカチオン性物質ペプチドポリアミンペプチド模倣物、および/またはトランスフェリンと連結されている、本発明1001の組成物。
[本発明1011]
RNAi剤が、ヌードマウスの786-O腫瘍において、EPAS1の発現を少なくとも約50%阻害することができる、本発明1001の組成物。
[本発明1012]
RNAi剤が、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約80%阻害することができる、本発明1001の組成物。
[本発明1013]
RNAiが約0.1nMを上回らないEC50を有する、本発明1001の組成物。
[本発明1014]
RNAiが約0.001nMを上回らないEC50を有する、本発明1001の組成物。
[本発明1015]
センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、センス鎖およびアンチセンス鎖が、表1〜5のいずれかに提供されるEPAS1に対するRNAi剤の、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、組成物。
[本発明1016]
個体におけるEPAS1の発現を阻害する方法であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物の治療的有効量を個体に投与する段階を含み、アンチセンス鎖が、表1〜5のいずれかに提供されるEPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、方法。
[本発明1017]
個体がEPAS1関連疾患に罹患しているか、または罹患しやすい、本発明1016の方法。
[本発明1018]
EPAS1関連疾患が、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症(preemclampsia)、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、または関節リウマチである、本発明1016の方法。
[本発明1019]
EPAS1関連疾患が癌である、本発明1016の方法。
[本発明1020]
さらなる疾患治療を投与する段階をさらに含む、本発明1016の方法。
[本発明1021]
さらなる疾患治療を投与する段階をさらに含み、RNAi剤を含む組成物およびさらなる疾患治療の投与が、同時、同時並行的、別々または逐次的である、本発明1016の方法。
[本発明1022]
EPAS1関連疾患が、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、または関節リウマチである、本発明1016の方法。
[本発明1023]
EPAS1関連疾患が癌である、本発明1016の方法。
[本発明1024]
さらなる疾患治療を投与する段階をさらに含む、本発明1016の方法。
[本発明1025]
さらなる疾患治療を投与する段階をさらに含み、RNAi剤を含む組成物およびさらなる疾患治療の投与が、同時、同時並行的、別々または逐次的である、本発明1016の方法。
[本発明1026]
EPAS1関連疾患が、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、または関節リウマチである、本発明1016の方法。
[本発明1027]
EPAS1関連疾患が癌である、本発明1016の方法。
[本発明1028]
組成物が、EPAS1に対する第2のRNAi剤をさらに含む、本発明1016の方法。
[本発明1029]
本発明1001の組成物の治療的有効量を個体に投与する段階を含む、個体におけるEPAS1関連疾患を治療する方法に用いるための、本発明1001の組成物。
[本発明1030]
本発明1001の組成物の治療的有効量を個体に投与する段階を含む、個体におけるEPAS1の発現を阻害するための方法に用いるための、本発明1001の組成物。
[本発明1031]
EPAS1関連疾患の治療のための医薬の製造における、本発明1001の組成物の使用。
[本発明1032]
EPAS1関連疾患が、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、または関節リウマチである、本発明1031の使用。
[本発明1033]
EPAS1関連疾患の治療に用いるための、本発明1001の組成物。
[本発明1034]
EPAS1関連疾患が癌である、本発明1033の使用。
本開示のその他の特徴、目的および利点は、本記載、図面および特許請求の範囲から明らかであると考えられる。

図面の簡単な説明

0019

EPAS1RNAi剤の改変変異体において用いられてきたか、または用いることができる、さまざまな例示的な改変ヌクレオチド:U002、U003、U004、U005、C004、C005、A004、A005、G005およびG004を図示しており、これらは本明細書に開示されるRNAi剤において用いることができる。U002は、DNAである2'-デオキシ-チミジンを指し示している。U003は、2'-デオキシウリジンを指し示している。U004は、2'-O-メチル改変を有するウリジン(「U」)塩基を有するヌクレオチドを指し示している。U005は、2'-O-メトキシエチル(MOE)改変を有するU塩基を指し示している。C004は、2'-O-メチル改変を有するシトシン(「C」)塩基を指し示している。C005は、2'-O-メトキシエチル改変を有するC塩基を指し示している。A004は、2'-O-メチル改変を有するアデノシン(「A」)塩基を指し示している。A005は、2'-O-メトキシエチル改変を有するA塩基を指し示している。G005は、2'-O-メチル改変を有するグアノシン(「G」)塩基を指し示している。G004は、2'O-メチル改変を有するG塩基を指し示している。

0020

発明の詳細な説明
本開示は、EPAS1関連疾患(例えば、EPAS1の突然変異ならびに/または発現、レベルおよび/もしくは活性の変化と関連のある疾患、EPAS1を必要とする疾患、EPAS1によって発現、過剰発現もしくは過剰活性が直接的もしくは間接的に影響される因子による影響を受ける疾患、ならびに/またはEPAS1の発現、レベルおよび/もしくは活性をモジュレートすることによって治療しうる疾患)の治療に有用である、EPAS1の標的化および阻害のための、EPAS1に対するRNAi剤を範囲に含む。そのようなEPAS1関連疾患には、以下のものが含まれる:癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、および関節リウマチ。本開示はまた、EPAS1の発現、過剰発現もしくは過剰活性によって少なくとも部分的に媒介されるか、またはEPAS1を必要とする病的状態を有するヒト対象を治療する方法であって、EPAS1に対するRNAi剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む方法も提供する。

0021

本開示のさまざまな局面には、以下のものが含まれる。

0022

本明細書に記載されるRNAi剤のアンチセンス鎖を含むRNAi剤
1つの局面において、本開示の1つの局面は、アンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物に関し、ここでアンチセンス鎖は、本明細書において提供される任意の配列(例えば、表1〜5のうち任意の1つまたは複数などにおけるもの)から選択される、EPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチド(nt)を含む。もう1つの局面において、本開示は、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含む組成物に関し、ここで第一鎖は、本明細書において提供される任意の配列によるEPAS1に対するRNAi剤の第一鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。もう1つの局面において、本開示は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物に関し、ここでセンス鎖は、すぐ上に列記したEPAS1に対するRNAi剤のセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖はそのアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。もう1つの局面において、本開示は、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含む組成物に関し、ここで第一鎖の配列は、本明細書において提供される任意の配列の第一鎖の配列を含む。もう1つの局面において、本開示は、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含む組成物に関し、ここで第一鎖の配列は、本明細書において提供される任意の配列の第一鎖の配列である。さまざまな局面において、第一鎖および第二鎖は、本明細書に開示される任意のRNAi剤の、それぞれアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。さまざまな局面において、第一鎖および第二鎖は、本明細書に開示される任意のRNAi剤の、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖である。

0023

具体的な二重鎖には、表1に列記された非改変(例えば、「一般的」)変異体および例示的改変変異体が含まれる;これらのRNAi剤に関するそのほかの配列およびデータは以後の表に提示されている。記載された例示的改変のほかに、提供されるヌクレオチド配列を用いて、他の改変変異体を作製することもできる。さまざまな局面において、第一鎖および/または第二鎖は、改変されているかまたは改変されていない。

0024


表1には、EPAS1RNAi剤の名称(ヒトEPAS1遺伝子配列NM 001430におけるそれらの位置に由来する)が、DNA配列、非改変配列、および例示的改変配列(A51 S26およびA85 S26の例示的改変配列の両方を伴う)を表すSEQID NOとともに提供されている。これらの表には、センス配列およびアンチセンス(AS)配列の両方が提示されている。

0025

表2は、DNA配列を提供している。

0026

表3は、RNAi剤の非改変配列を提供している。

0027

表4は、特定のRNAi剤配列(ヒトに由来する)が、マウス(Muまたはmm)、ラット(Raまたはrn)およびアカゲザル[mmuまたはMacaca mulatta]由来のものにも対応するか否かを指し示している。

0028

表5(表5A〜5Eを含む)は、例示的な改変RNAi剤配列を列記している。

0029

表6〜8は、さまざまなEPAS1RNAi剤のインビトロおよびインビボでの有効性を示している。

0030

表9は、これらのEPAS1RNAi剤の重なり合う群を示している。

0031

(表1)さまざまなEPAS1RNAi剤に関するSEQID NO
提示されているのは、DNA配列、非改変配列および例示的改変配列(A51 S26およびA85 S26の例示的改変配列の両方を伴う)を表すSEQ ID NOである。

EPAS1 RNAi剤のそのほかの改変変異体は、表5C〜5Eに示されている。

0032

表1はしたがって、非改変および例示的改変EPAS1RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のSEQID NO識別子を提示している。例えば、この表において、RNAi剤842の非改変センス配列およびアンチセンス配列は、それぞれSEQ ID NO:39および58によって表されている。このRNAi剤の改変変異体は、SEQ ID NO:145および126によって表されている;別の例示的改変変異体は、SEQ ID NO:77および96によって表されている。また、名称(例えば、842)が、ヒトEPAS1遺伝子配列NM 001430における位置番号に由来することにも留意されたい。これらの名称は時に、「EPAS1」または「EPAS1_」を接頭辞として有する(例えば、「EPAS1 842」またはEPAS1_842」)。また、接頭辞「AD」は、時折、「ND」によって置き換えられる。RNAi剤の名称はまた、時に、.1などの接尾辞を有する。これは特定の変異体を指し示す。したがって、「842」および「EPAS1_842」などはすべて、同じ配列のRNAi剤を指し示すが、それらは改変の点では異なる可能性がある。

0033

表5の中の配列において、小文字(例えば、c、u)は改変ヌクレオチドを指し示し、一方、大文字(例えば、C、U、A、G)は非改変ヌクレオチドを指し示す。この表には、配列のそれぞれの例示的な改変バージョンが示されている。しかし、本開示はまた、これらの配列の非改変バージョン、および追加的または代替的な改変を含む他のバージョンも想定しており、範囲に含む。

0034

表の中の配列において、改変または非改変変異体は、任意で、配列「TT」、「dTdT」、「dTsdT」または「UU」を、3'末端にある一本鎖オーバーハングとしてさらに含むことができ、これらは本明細書において末端ジヌクレオチドまたは3'末端ジヌクレオチドとも呼ばれる。dTは2'-デオキシ-チミジン-5'-リン酸であり、sdTは2'-デオキシチミジン5'-ホスホロチオエートである。開示される配列において、末端ジヌクレオチド「UU」はUUまたは2'-OMe-U 2'-OMe-Uであり、末端TTおよび末端UUが逆方向/逆の向きにあってもよい。末端ジヌクレオチド(例えば、UU)は、EPAS1標的配列の一部ではないが、siRNAの末端をヌクレアーゼから保護するためにオーバーハングとして一般的に配置されるジチミジンジヌクレオチドの改変変異体である(例えば、Elbashir et al. 2001 Nature 411: 494-498;Elbashir et al. 2001EMBO J. 20: 6877-6888;およびKraynack et al. 2006 RNA 12:163-176)。末端ジヌクレオチドは、これらの参考文献により、ヌクレアーゼ耐性を強化させるものの、標的認識には寄与しないことが知られている。したがって、本開示はまた、本明細書に開示される任意の改変変異体または任意の非改変変異体であって、改変変異体が、逆位/逆の向きにあるかまたは二重鎖におけるEPAS1特異的配列と同じ5'から3'への向きにあってもよい末端TT、dTdT、sdT、dTsdT、sdTsdT、sdTdTなどを含む変異体も範囲に含む。加えて、「RNAi剤配列のEPAS1部分」などを指して本明細書で用いられる用語は、EPAS1に由来するRNAi剤の配列の部分を指し示す(したがって、「RNAi剤配列のEPAS1部分」は、例えば、末端dTdT、TT、UU、U(2'-OMe)dT、U(2'-OMe)U(2'-OMe)、T(2'-OMe)T(2'-OMe)、T(2'-OMe)dTなどを含まないが、EPAS1遺伝子配列またはmRNA配列の一部分と対応するかまたはそれに対して相補的であるRNAi剤の部分を含む)。1つの局面において、組成物は第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含み、ここで第一鎖の配列および第二鎖の配列は、3'末端ジヌクレオチド(3'末端に2ntを含む一本鎖オーバーハング)をさらに含む、本明細書に提供される任意のRNAi剤の、それぞれ第一鎖および第二鎖の配列である。1つの局面において、組成物は、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含み、ここで第一鎖の配列および第二鎖の配列は、TT、UU、U(2'-OMe)dT、U(2'-OMe)U(2'-OMe)、T(2'-OMe)T(2'-OMe)、T(2'-OMe)dT、dTdT、sdT、dTsdT、sdTsdTおよびsdTdTから選択される3'末端ジヌクレオチドをさらに含む、本明細書に提供される任意のRNAi剤の、それぞれ第一鎖および第二鎖の配列である。1つの局面において、組成物は、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含み、ここで第一鎖の配列および第二鎖の配列は、3'末端UUジヌクレオチドをさらに含む、本明細書に提供される任意のRNAi剤の、それぞれ第一鎖および第二鎖の配列である。

0035

任意の改変変異体または非改変変異体に対して、当技術分野において公知であるように、末端をヌクレアーゼ分解から安定化するために、3'末端キャップを末端ジヌクレオチドの代わりに、または末端ジヌクレオチドに加えて用いることができるが、ただし3'末端キャップがRNAi剤を安定化すること(例えば、ヌクレアーゼに対して)およびsiRNA活性に過度に干渉しないことが可能であることを条件とする。したがって、本開示はまた、改変変異体が末端3'末端キャップをさらに含む、本明細書に開示される任意の改変変異体または任意の非改変変異体を範囲に含む。

0036

本明細書に記載のRNAi剤のアンチセンス鎖を含むRNAi剤
1つの特定の具体的な局面において、本開示は、アンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、アンチセンス鎖が、上記に提供され、表1に列記された通りの具体的な二重鎖におけるアンチセンス鎖から選択される、EPAS1に対するRNAi剤との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む組成物に関する。

0037

この局面のさまざまな特定の具体的な局面を、以下に説明する。

0038

1つの局面において、組成物は、EPAS1に対する第2のRNAi剤をさらに含む。さまざまな局面において、第2のRNAi剤は、第1のものから物理的に分かれているか、またはこの2つが物理的に接続されている(例えば、共有結合性に連結されているか、または他の様式でコンジュゲートされている)。

0039

1つの局面において、組成物は第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含み、ここで第一鎖の配列および第二鎖の配列は、本明細書に提供される任意のRNAi剤の、それぞれ第一鎖および第二鎖の配列である。1つの局面において、組成物は第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含み、ここで第一鎖の配列および第二鎖の配列は、一方または両方の鎖に約6〜20個のさらなるヌクレオチド(例えば、約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20nt)をさらに含む、本明細書に提供される任意のRNAi剤の、それぞれ第一鎖および第二鎖の配列である。1つの局面において、組成物は第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含み、ここで第一鎖の配列および第二鎖の配列は、3'末端ジヌクレオチドをさらに含む、本明細書に提供される任意のRNAi剤の、それぞれ第一鎖および第二鎖の配列である。1つの局面において、組成物は第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含み、ここで第一鎖の配列および第二鎖の配列は、TT、UU、U(2'-OMe)dT、U(2'-OMe)U(2'-OMe)、T(2'-OMe)T(2'-OMe)、T(2'-OMe)dT、dTdT、sdT、dTsdT、sdTsdTおよびsdTdTから選択される3'末端ジヌクレオチドをさらに含む、本明細書に提供される任意のRNAi剤の、それぞれ第一鎖および第二鎖の配列である。1つの局面において、組成物は第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含み、ここで第一鎖の配列および第二鎖の配列は、3'末端UUジヌクレオチドをさらに含む、本明細書に提供される任意のRNAi剤の、それぞれ第一鎖および第二鎖の配列である。さまざまな局面において、第一鎖および第二鎖は、本明細書中の表に列記されている、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖である。さまざまな局面において、第一鎖および第二鎖は、本明細書中の表に列記されている、それぞれアンチセンス鎖およびセンス鎖である。

0040

1つの局面において、センス鎖は、約30個またはそれ未満のヌクレオチド(nt)の長さである。

0041

1つの局面において、アンチセンス鎖は、約30個またはそれ未満のヌクレオチドの長さである。

0042

1つの局面において、アンチセンス鎖はセンス鎖と二重鎖領域を形成し、二重鎖領域は約15〜30ヌクレオチド対の長さである。

0043

1つの局面において、アンチセンス鎖は、約19〜約23ヌクレオチドの長さを含む、約15〜約30ヌクレオチドの長さである。1つの局面において、アンチセンス鎖は少なくとも、約15ヌクレオチド、約16ヌクレオチド、約17ヌクレオチド、約18ヌクレオチド、約19ヌクレオチド、約20ヌクレオチド、約21ヌクレオチド、約22ヌクレオチド、約23ヌクレオチド、約24ヌクレオチド、約25ヌクレオチド、約26ヌクレオチド、約27ヌクレオチド、約28ヌクレオチド、約29ヌクレオチドおよび30ヌクレオチドから選択される長さを有する。

0044

1つの局面において、RNAi剤は、生物試料または環境(例えば、細胞質間質液、血清、またはもしくは腸の洗浄液)における安定性の増大をRNAi剤が有するようにさせる改変を含む。

0045

1つの局面において、RNAi剤は、少なくとも1つの糖骨格改変(例えば、ホスホロチオエート結合)または少なくとも1つの2'-改変ヌクレオチドを含む。

0046

1つの局面において、RNAi剤は以下のものを含む:ウリジンが2'-改変ヌクレオチドである少なくとも1つの5'-ウリジン-アデニン-3'(5'-ua-3')ジヌクレオチド;5'-ウリジンが2'-改変ヌクレオチドである少なくとも1つの5'-ウリジン-グアニン-3'(5'-ug-3')ジヌクレオチド;5'-シチジンが2'-改変ヌクレオチドである少なくとも1つの5'-シチジン-アデニン-3'(5'-ca-3')ジヌクレオチド;または5'-ウリジンが2'-改変ヌクレオチドである少なくとも1つの5'-ウリジン-ウリジン-3'(5'-uu-3')ジヌクレオチド。これらのジヌクレオチドモチーフは、血清ヌクレアーゼ分解(例えば、RNアーゼA)を特に受けやすい。モチーフ中の第1のピリミジンヌクレオチドの2'位置での化学的改変は、そのような切断を防止するかまたは減速させる。この改変方法は、「エンドライト(endo light)」という用語でも知られている。

0047

1つの局面において、RNAi剤は、2'-デオキシ、2'-デオキシ-2'-フルオロ、2'-O-メチル(2'-OMeまたは2'OMe)、2'-O-メトキシエチル(2'-O-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、および2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)からなる群より選択される2'-改変を含む。1つの局面において、ピリミジン(ウリジンおよびシチジン)はすべて、2' O-メチル改変ヌクレオシドである。

0048

もう1つの局面において、RNAi剤は、以下のものからなる群より選択される2'-改変を含む。

0049

1つの局面において、RNAi剤は、少なくとも1つの平滑末端を含む。

0050

1つの局面において、RNAi剤は、対合していない1nt〜4ntを有するオーバーハングを含む。

0051

1つの局面において、RNAi剤は、RNAi剤のアンチセンス鎖の3'末端にオーバーハングを含む。

0052

1つの局面において、RNAi剤は、1つまたは複数の診断用化合物、レポーター基、架橋剤、ヌクレアーゼ耐性を付与するモイエティー、天然または特異な核酸塩基、親油性分子、コレステロール、脂質、レクチン、ステロイド、ウバオール(uvaol)、ヘコゲニン(hecigenin)、ジオスゲニン、テルペン、トリテルペン、サルササポゲニン、フリーデリン(Friedelin)、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸、ビタミン、糖質、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、合成糖質、オリゴラクテート15mer、天然ポリマー、低分子量もしくは中間分子量ポリマー、イヌリン、シクロデキストリン、ヒアルロン酸、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的指向性分子、ポリカチオン性物質、ペプチド、ポリアミン、ペプチド模倣物、および/またはトランスフェリンと連結されている。

0053

1つの局面において、RNAi剤は、ヌードマウスの786-O腫瘍において、EPAS1の発現を少なくとも約50%阻害することができる。

0054

1つの局面において、RNAi剤は、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約70%阻害することができる。

0055

1つの局面において、RNAi剤は、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約75%阻害することができる。

0056

1つの局面において、RNAi剤は、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約80%阻害することができる。

0057

1つの局面において、RNAi剤は、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約90%阻害することができる。

0058

1つの局面において、RNAi剤は、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約95%阻害することができる。

0059

1つの局面において、RNAi剤は、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約99%阻害することができる。

0060

1つの局面において、RNAiは、インビトロでの786-O細胞において、約0.1nM nMを上回らないEC50を有する。EC50は、遺伝子発現を50%減少させるために有効な濃度のことである。

0061

1つの局面において、RNAiは、インビトロでの786-O細胞において、約0.01nM nMを上回らないEC50を有する。

0062

1つの局面において、インビトロでの786-O細胞において、約0.001nM nMを上回らないEC50を有する。

0063

本明細書に記載のRNAiのセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤
1つの特定の具体的な局面において、本開示は、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、第一鎖および/または第二鎖の配列が、本明細書において提供され、例えば本明細書中のいずれかの表に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤の第一鎖および/または第二鎖の配列との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む組成物に関する。1つの特定の具体的な局面において、本開示は、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、第一鎖および/または第二鎖の配列が、本明細書において提供され、例えば本明細書中のいずれかの表に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤の第一鎖および/または第二鎖の配列からの少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む組成物に関する。1つの特定の具体的な局面において、本開示は、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、第一鎖および/または第二鎖の配列が、本明細書において提供され、例えば本明細書中のいずれかの表に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤の第一鎖および/または第二鎖の配列からの、少なくとも19個の連続したヌクレオチド(例えば、nt 1〜19、nt 2〜20、nt 3〜21など)を含む組成物に関する。

0064

1つの特定の具体的な局面において、本開示は、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、第一鎖および/または第二鎖の配列が、本明細書において提供され、例えば本明細書中のいずれかの表に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤の、それぞれ第一鎖および/または第二鎖の配列を含む組成物に関する。

0065

1つの特定の具体的な局面において、本開示は、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、第一鎖および/または第二鎖の配列が、本明細書において提供され、例えば本明細書中のいずれかの表に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤の、それぞれ第一鎖および/または第二鎖の配列である組成物に関する。

0066

1つの特定の具体的な局面において、本開示は、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、第一鎖および/または第二鎖の配列が、本明細書において提供され、例えば本明細書中のいずれかの表に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤の、それぞれ第一鎖および/または第二鎖の配列であり、第一鎖および/または第二鎖の配列が末端ジヌクレオチドをさらに含む組成物に関する。

0067

1つの特定の具体的な局面において、本開示は、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、第一鎖および/または第二鎖の配列が、本明細書において提供され、例えば本明細書中のいずれかの表に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤の、それぞれ第一鎖および/または第二鎖の配列であり、第一鎖および/または第二鎖の配列が末端UUジヌクレオチドをさらに含む組成物に関する。

0068

1つの特定の具体的な局面において、本開示は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、センス鎖およびアンチセンス鎖が、上記に提供され、表1に列記された通りの具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤の、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む組成物に関する。1つの特定の具体的な局面において、本開示は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、センス鎖およびアンチセンス鎖が、上記に提供され、表1に列記された通りの具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤の、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖からの少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む組成物に関する。1つの特定の具体的な局面において、本開示は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物であって、センス鎖およびアンチセンス鎖が、上記に提供され、表1に列記された通りの具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤の、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖からの少なくとも19個の連続したヌクレオチド(例えば、nt 1〜19、nt 2〜20またはnt 3〜21)を含む組成物に関する。

0069

この局面のさまざまな特定の具体的な局面を、以下に説明する。

0070

1つの局面において、組成物は、EPAS1に対する第2のRNAi剤を含む。さまざまな局面において、第2のRNAi剤は、第1のものから物理的に分かれているか、またはこの2つが物理的に接続されている(例えば、共有結合性に連結されているか、または他の様式でコンジュゲートされている)。いくつかの局面において、第1および第2のRNAi剤は、同じ組成物の中で(例えば、両方が同じ脂質ナノ粒子中で)組み合わされる。

0071

1つの局面において、アンチセンス鎖は約30個またはそれ未満のヌクレオチドの長さである。

0072

1つの局面において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、約15〜約30ヌクレオチド対の長さである二重鎖領域を形成する。

0073

1つの局面において、アンチセンス鎖は、約18〜約23ntの長さを含み、かつ約19〜約21ntの長さおよび約19〜約23ntの長さを含む、約15〜約36ntの長さである。1つの局面において、アンチセンス鎖は、少なくとも、約15nt、約16nt、約17nt、約18nt、約19nt、約20nt、約21nt、約22nt、約23nt、約24nt、約25nt、約26nt、約27nt、約28nt、約29ntおよび約30ntから選択される長さを有する。

0074

1つの局面において、RNAi剤は、生物試料または環境における安定性の増大をRNAi剤が有するようにさせる改変を含む。

0075

1つの局面において、RNAi剤は、改変された糖骨格、例えばホスホロチオエート結合などを含むか、または2'-改変ヌクレオチドを含む。

0076

1つの局面において、RNAi剤は以下のものを含む:ウリジンが2'-改変ヌクレオチドである少なくとも1つの5'-ウリジン-アデニン-3'(5'-ua-3')ジヌクレオチド;5'-ウリジンが2'-改変ヌクレオチドである少なくとも1つの5'-ウリジン-グアニン-3'(5'-ug-3')ジヌクレオチド;5'-シチジンが2'-改変ヌクレオチドである少なくとも1つの5'-シチジン-アデニン-3'(5'-ca-3')ジヌクレオチド;または5'-ウリジンが2'-改変ヌクレオチドである少なくとも1つの5'-ウリジン-ウリジン-3'(5'-uu-3')ジヌクレオチド。

0077

1つの局面において、RNAi剤は、以下のものからなる群より選択される2'-改変を含む:2'-デオキシ、2'-デオキシ-2'-フルオロ、2'-O-メチル、2'-O-メトキシエチル(2'-O-MOE)、2'-O-アミノプロピル(2'-O-AP)、2'-O-ジメチルアミノエチル(2'-O-DMAOE)、2'-O-ジメチルアミノプロピル(2'-O-DMAP)、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル(2'-O-DMAEOE)、および2'-O-N-メチルアセトアミド(2'-O-NMA)。1つの局面において、ピリミジン(ウリジンおよびシチジン)はすべて、2'O-メチル改変ヌクレオシドである。

0078

1つの局面において、RNAi剤は、少なくとも1つの平滑末端を含む。

0079

1つの局面において、RNAi剤は、対合していない1nt〜4ntを有するオーバーハングを含む。

0080

1つの局面において、RNAi剤は、RNAi剤のアンチセンス鎖の3'末端にオーバーハングを含む。

0081

1つの局面において、RNAi剤は、1つまたは複数の診断用化合物、レポーター基、架橋剤、ヌクレアーゼ耐性を付与するモイエティー、天然または特異な核酸塩基、親油性分子、コレステロール、脂質、レクチン、ステロイド、ウバオール、ヘコゲニン、ジオスゲニン、テルペン、トリテルペン、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸、ビタミン、糖質、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、合成糖質、オリゴラクテート15mer、天然ポリマー、低分子量もしくは中間分子量ポリマー、イヌリン、シクロデキストリン、ヒアルロン酸、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的指向性分子、ポリカチオン性物質、ペプチド、ポリアミン、ペプチド模倣物、および/またはトランスフェリンと連結されている。

0082

1つの局面において、RNAi剤は、ヌードマウスの786-O腫瘍において、EPAS1の発現を少なくとも約50%阻害することができる。

0083

1つの局面において、RNAi剤は、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約75%阻害することができる。

0084

1つの局面において、RNAi剤は、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約80%阻害することができる。

0085

1つの局面において、RNAi剤は、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約90%阻害することができる。

0086

1つの局面において、RNAi剤は、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約95%阻害することができる。

0087

1つの局面において、RNAi剤は、10nMの濃度で、インビトロでの786-O細胞におけるEPAS1の発現を少なくとも約99%阻害することができる。

0088

1つの局面において、RNAiは、インビトロでの786-O細胞において、約0.1nMを上回らないEC50を有する。

0089

1つの局面において、RNAiは、インビトロでの786-O細胞において、約0.01nMを上回らないEC50を有する。

0090

1つの局面において、RNAiは、インビトロでの786-O細胞において、約0.001nMを上回らないEC50を有する。

0091

本明細書に記載のRNAi剤を含む組成物を用いる治療の方法
1つの特定の具体的な局面において、本開示は、個体におけるEPAS1関連疾患を治療する方法であって、個体に対してアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物の治療的有効量を投与する段階を含み、アンチセンス鎖が、上記に提供され、表1に列記された通りの具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む方法に関する。1つの局面において、EPAS1に対するRNAi剤は、センス鎖と二重鎖を形成したアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖およびアンチセンス鎖は、表1〜5のいずれかに提供される配列の1つまたは複数から選択される。

0092

この局面のさまざまな特定の具体的な局面を、以下に説明する。相互排他的でない、本明細書に開示される任意の局面を組み合わせることができる。

0093

1つの局面において、本開示は、組成物が、センス鎖をさらに含むRNAi剤を含み、センス鎖が、本明細書において提供され、例えば本明細書中のいずれかの表に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤のセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、そのような方法に関する。

0094

本方法の1つの局面において、RNAi剤は、少なくともアンチセンス鎖を含み、かつ/またはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列は、本明細書において提供され、例えば表1に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列であり、組成物は薬学的に有効な製剤をさらに含む。

0095

本方法の1つの局面において、RNAi剤は、少なくともアンチセンス鎖を含み、かつ/またはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列は、本明細書において提供され、例えば表1に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列を含み、組成物は薬学的に有効な製剤をさらに含む。

0096

1つの局面において、EPAS1関連疾患は、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、および関節リウマチである。

0097

1つの局面において、EPAS1関連疾患は癌である。

0098

1つの局面において、本方法は、さらなる治療を投与する段階をさらに含む。

0099

1つの局面において、さらなる治療は、方法(または手順)である。1つの局面において、さらなる治療は、治療的有効量の組成物である。

0100

1つの局面において、さらなる治療およびRNAi剤は、任意の順序で投与することもでき、または同時に投与することもできる。

0101

1つの局面において、本方法は、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、および関節リウマチに対するさらなる治療を投与する段階をさらに含む。

0102

1つの局面において、本方法は、さらなる治療を投与する段階をさらに含む。EPAS1に対するRNAi剤は、疾患に対して適切である、本明細書に開示される任意のさらなる治療とともに、任意で、EPAS1に対する1つまたは複数のさらなるRNAi剤とさらに組み合わせて用いることができる。

0103

任意のさらなる治療への言及が、活性物質のいずれかの薬学的に許容される塩も含むことを意味することは理解されるであろう。構成要素(a)および/または(b)を含む活性物質が、例えば、少なくとも1つの塩基中心を有する場合、それらは酸付加塩を形成することができる。また、対応する酸付加塩を、所望であれば、さらに存在する塩基中心を有して形成することもできる。酸性基、例えばCOOHを有する活性物質は、塩基と塩を形成することができる。構成要素(a)および/または(b)またはそれらの薬学的に許容される塩を含む活性物質は、水和物の形態で用いてもよく、または結晶化のために用いられる他の溶媒を含んでもよい。

0104

1つの局面において、組成物は、EPAS1に対する第2のRNAi剤を含む。さまざまな局面において、第2のRNAi剤は、第1のものから物理的に分かれているか、またはこの2つが物理的に接続されている(例えば、共有結合性に連結されているか、または他の様式でコンジュゲートされている)。いくつかの局面において、第1および第2のRNAi剤は、同じ組成物の中で(例えば、両方が同じ脂質ナノ粒子中で)組み合わされる。

0105

本明細書に記載のRNAi剤を含むRNAiを用いてEPAS1の発現を阻害する方法
1つの特定の具体的な局面において、本開示は、個体におけるEPAS1の発現を阻害する方法であって、個体に対して本開示のRNAi剤を含む組成物の治療的有効量を投与する段階を含む方法に関する。1つの局面において、RNAiはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、上記に提供され、表1に列記された通りの具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。

0106

本方法の1つの局面において、RNAi剤は、少なくともアンチセンス鎖を含み、かつ/またはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列は、本明細書において提供され、例えば表1に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列であり、組成物は薬学的に有効な製剤中にある。

0107

本方法の1つの局面において、RNAi剤は、少なくともアンチセンス鎖を含み、かつ/またはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列は、本明細書において提供され、例えば表1に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列を含み、組成物は薬学的に有効な製剤中にある。

0108

この局面のさまざまな特定の具体的な局面を、以下に説明する。

0109

1つの局面において、個体は、EPAS1関連疾患に罹患しているか、または罹患しやすい。

0110

1つの局面において、EPAS1関連疾患は、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、および関節リウマチである。

0111

1つの局面において、EPAS1関連疾患は癌である。

0112

1つの局面において、本方法は、さらなる治療を投与する段階をさらに含む。

0113

1つの局面において、さらなる治療およびRNAi剤は、任意の順序で投与することもでき、または同時に投与することもできる。

0114

1つの局面において、本方法は、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、および関節リウマチに対するさらなる治療を投与する段階をさらに含む。

0115

1つの局面において、組成物は、EPAS1に対する第2のRNAi剤を含む。さまざまな局面において、第2のRNAi剤は、第1のものから物理的に分かれているか、またはこの2つが物理的に接続されている(例えば、共有結合性に連結されているか、または他の様式でコンジュゲートされている)。いくつかの局面において、第1および第2のRNAi剤は、同じ組成物の中で(例えば、両方が同じ脂質ナノ粒子中で)組み合わされる。

0116

1つの局面において、本方法は、本明細書において提供され、例えば本明細書中のいずれかの表に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、さらなるRNAi剤を投与する段階をさらに含む。

0117

EPAS1に対するRNAi剤の薬学的組成物
1つの特定の具体的な局面において、本開示は、本開示のRNAi剤を含む組成物に関する。1つの局面において、RNAi剤は、少なくともアンチセンス鎖を含み、かつ/またはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、本明細書において提供され、例えば表1に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、組成物は薬学的に有効な製剤中にある。

0118

1つの局面において、RNAi剤は、少なくともアンチセンス鎖を含み、かつ/またはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列は、本明細書において提供され、例えば表1に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列であり、組成物は薬学的に有効な製剤中にある。

0119

1つの局面において、RNAi剤は、少なくともアンチセンス鎖を含み、かつ/またはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列は、本明細書において提供され、例えば表1に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列を含み、組成物は薬学的に有効な製剤中にある。

0120

1つの局面において、本開示は、EPAS1関連疾患の治療のための医薬の製造におけるRNAi剤の使用に関し、ここでRNAi剤はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、本明細書において提供され、例えば本明細書中のいずれかの表に列記されている具体的な二重鎖から選択されるEPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。

0121

開示される配列からのミスマッチを含む、EPAS1に対するRNAi剤の具体的な局面
EPAS1に対するRNAi剤のさまざまな具体的な局面が、本明細書に開示される。本開示は、表1〜5に提供される例示的な改変変異体、ならびに対応する非改変配列および他の改変変異体を範囲に含む。本開示の具体的な局面は、表1に列記されているRNAi剤、ならびにそれらの改変変異体または非改変変異体のいずれかとの違いが0、1、2または3nt(ヌクレオチド)またはbp[塩基対](例えば、0、1、2または3個のミスマッチを有する)である配列を含むRNAi剤を含む。以下にさらに詳細に説明するように、ミスマッチは、本明細書において、2つの配列を最大限整列させて比較した場合の、塩基配列(例えば、Gの代わりにAなど)または長さの違いと定義される。加えて、以下にさらに詳細に説明するように、「非改変変異体」は、塩基配列は同一であるが、どの塩基も改変されていない変異体である;これには例えば、野生型EPAS1mRNAまたは遺伝子の対応する部分と同一な配列が含まれる。「改変変異体」は、ヌクレオチド、糖、リン酸または骨格に対する1つまたは複数の改変(または1つもしくは複数のより少数のもしくは異なる改変)、および/または1つもしくは複数のモイエティーの付加を含むが、塩基配列に対する変化、置換、付加および欠失は有しない。特定の配列およびその改変変異体または非改変変異体は、それらの間に0個のミスマッチを有する。

0122

1つの特定の局面において、本開示は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含み、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、表1〜5に列記されているRNAi剤、およびそれらの改変変異体または非改変変異体のいずれかのセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の配列との違いが0、1、2または3ntである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む。

0123

もう1つの特定の局面において、RNAi剤は、表1〜5に列記されているRNAi剤、およびそれらの改変変異体または非改変変異体のいずれかのセンス鎖との違いが0、1、2または3ntである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。

0124

その他の局面
本開示のさまざまな特定の具体的な局面を、以下に説明する。相互排他的でない、本明細書に開示される任意の局面を組み合わせることができる。

0125

1つの局面において、本開示は、個体におけるEPAS1関連疾患を治療する方法であって、個体に対して、特許請求の範囲のいずれかによる組成物の治療的有効量を投与する段階を含む方法に用いるための、上記の局面のいずれかによる組成物に関する。

0126

この局面のさまざまな特定の具体的な局面を、以下に説明する。

0127

1つの局面において、本開示は、個体におけるEPAS1の発現を阻害する方法であって、個体に対して、上記の局面のいずれかによる組成物の治療的有効量を投与する段階を含む方法に用いるための、上記の局面のいずれかによる組成物に関する。

0128

本開示の1つの局面は、EPAS1関連疾患の治療のための医薬の製造における、上記の局面のいずれかによる組成物の使用である。

0129

1つの局面において、EPAS1関連疾患は、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、および関節リウマチから選択される。

0130

1つの局面において、本開示は、EPAS1関連疾患の治療に用いるための、上記の局面のいずれかの組成物に関する。

0131

1つの局面において、EPAS1関連疾患は癌である。

0132

1つの局面において、本開示は、細胞におけるEPAS1の発現を阻害する方法であって、アンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物を細胞内に導入する段階を含み、アンチセンス鎖が、本明細書に開示されるEPAS1 siRNAから選択されるEPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む方法に関する。

0133

1つの局面において、本開示は、細胞におけるEPAS1の発現を阻害する方法であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む組成物を細胞内に導入する段階を含み、アンチセンス鎖が、本明細書に開示されるEPAS1 siRNAから選択されるEPAS1に対するRNAi剤のアンチセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含み、センス鎖が、本明細書に開示されるEPAS1 siRNAから選択されるEPAS1に対するRNAi剤のセンス鎖との違いが0、1、2または3ヌクレオチドである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含む、方法に関する。

0134

定義
便宜のために、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において用いられる、ある特定の用語および語句の意味を、以下に提供する。本明細書の他の部分における用語の使用法と、この項におけるその定義との間に明らかな矛盾がある場合には、この項における定義が優先されるものとする。

0135

EPAS1
「EPAS1」とは、内皮PASドメインタンパク質1としても知られ、EPAS-1、HIF-2α;Hif2α;HIF2;HLF;MOP2;ECYT4;HIF2A;PASD2;bHLHe73;HGNC:3374;遺伝子ID:2034としても知られる、遺伝子またはタンパク質のことを意味する。いくつかの参考文献は、この遺伝子をHIF-2aと、対応するタンパク質をEPAS1と名づけていることに留意されたい(例えば、van Patot et al. 2011 High Alt. Med. Biol. 12: 157-167);他の文書では、同じ用語を遺伝子およびタンパク質の両方を指して用いている。Ema et al. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4273-4278;Flamme et al. 1997 Mech. Dev. 63: 51-60;and Hogenesch et al. 1997 J. Biol. Chem. 272: 8581-8593を参照。文献中に、例えば、van Patot et al. 2011 High Alt. Med. Biol. 12: 157-67;Ke et al. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2011 Oct;28(5):583-8;PMID: 21983741に記載されているように、EPAS1のさまざまな多型が知られている。

0136

この遺伝子は、酸素レベルが低下した時に誘導される、酸素によって調節される遺伝子の誘導に関与する転写因子をコードする。

0137

EPAS1は、HIFファミリーのメンバーである。低酸素誘導因子(HIF)は、細胞環境における利用可能な酸素の変化、特に酸素の減少または低酸素症に応答する転写因子である。Smith et al. 2008 Br. J. Haematol. 141: 325-34を参照。

0138

酸素呼吸種のすべてではないもののほとんどは、αサブユニットおよびβサブユニットで構成されるヘテロ二量体であり、このうち後者が構成性に発現される芳香族炭化水素受容体輸送体(ARNT)である、高度に保存された転写複合体HIF-1を発現する。Wang et al. 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 5510-14;Jiang et al. 1996 J. Biol. Chem. 271: 17771-8。

0139

HIFファミリーのメンバーには、最も特徴づけられている2つのHIFαサブユニットである、Hif1αおよびEPAS1(Hif 2α)の両方が含まれる。これらの2つの遺伝子は非常に類似していて、多くの同じ標的と結合してそれらを媒介するが、それらは機能の点では時間的にも空間的にも異なる。HIF1αはインターロイキン-8(IL-8)の発現を減弱させるものの、EPAS1の過剰発現はIL-8の発現を増大させる(Florczyk et al. 2011 Free Radic. Biol. Med. 51: 1882-92)。

0140

EPAS1(Hif2α)は、酸素レベルが低下した時(低酸素症)に誘導される、酸素によって調節される遺伝子の誘導に関与する転写因子の半数をコードする。コードされるタンパク質は、塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスドメイン、タンパク質二量体化ドメイン、ならびに酸素レベルに応答するシグナル伝達経路におけるタンパク質に認められるドメインを含む。EPAS1は、心臓の発生に関与し、臍帯における血管の壁の内層をなす内皮細胞において発現される。これは、カテコールアミン恒常性および初期胚発生時における心不全に対する保護の維持に必須である。カテコールアミンには、エピネフリンおよびノルエピネフリンなどのタンパク質が含まれる。これは、損傷を受けやすい胚心臓および成体心臓の両方が自らを過度に働かせず、心不全を誘導しないように恒常性状態を維持するためのカテコールアミンの産生のために重要である。胚におけるカテコールアミン産生は、胚心拍数を増加させることによる心拍出量の制御に関係している。

0141

この遺伝子における突然変異は、家族性赤血球増加症4型、肺高血圧症および慢性高山病とも関連している。この遺伝子のある種の変異体が、高地で生活する人々に防御を与えているという証拠もある。EPAS1は、高地において短期的な適応応答として有用である。しかし、EPAS1はまた、死亡および生殖能力の抑制につながりうる慢性高山病につながる、赤血球の過剰生成も引き起こすことがある。その発現を増大させるいくつかの突然変異は、高山病に類似した症状を伴う、低高度での高血圧および脳卒中の増加と関連している。高地で永続的に生活する人々は、過剰な赤血球生成による適合の結果を減少させるためにEPAS1の選択を経験している可能性がある。

0142

EPAS1関連疾患
EPAS1に対するsiRNAは、EPAS1関連疾患を治療するために用いることができる。「EPAS1関連疾患」とは、EPAS1、ならびに/または野生型および/もしくは突然変異型EPAS1の突然変異および/もしくは過剰発現、ならびに/または疾患進行がEPAS1、ならびに/または野生型および/もしくは突然変異型EPAS1の突然変異および/もしくは過剰発現の存在によって強化されるか、または予後が悪化する疾患と関連している、任意の疾患のことである。EPAS1関連疾患の非限定的な例には、癌、転移、星細胞腫、膀胱癌、乳癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、胃癌、神経膠芽細胞腫、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌、肺腺癌、神経芽腫、非小細胞肺癌、黒色腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸癌、腎癌、腎明細胞癌(ならびにこの癌および他の癌の転移)、歯肉炎、乾癬、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、子癇前症、炎症、慢性炎症、血管新生性疾患、および関節リウマチが含まれる。Bangoura et al. 2004 World J. Gastroenterol. 10: 525;Cleven et al. 2007 Analyt. Cell. Path. 29: 229-240;Covello et al. 2006 Genes Dev. 20: 557-570;Florczyk et al. 2011 Free Radic. Biol. Med. 51: 1882-92;Giatromanolaki et al. 2003 Melanoma Res. 13: 493-501;Giatromanolaki et al. 2006 App. Imm. Mol. Morph. 14: 78-82;Giatromanolaki et al. 2012 Clin. Exp. Metastasis 29: 11-7;Griffiths et al. 2008 Br. J. Cancer 98: 965-973;Guo et al. J. Kanazawa Med. U. 31: 10-16;Holmquist-Mengelbier et al. 2006 Cancer Cell 10: 413-23;Ioachim et al. 2006 Urol. Int. 77: 255-263;Koh et al. 2011 cancer Res. 71: 4015-4027;Maynard et al. 2007 Cell. Mol. Life Sci. 64: 2170-2180;Mutter et al. 2008 Microvasc. Res. 75: 1-8;Nesbit et al. 1999 Oncogene Mol. Cell 3: 565-577;Osada et al. 2007 Human Pathol. 38: 1310-1320;Pelegaris et al. 2002 Nat. Re. Cancer 2: 764-776;Rasheed et al. 2009 Br. J. Cancer 100: 1666-1673;Tian et al. 1998 Genes Dev. 12:3320-3324;Veeranna et al. 2012 J. Virol. 86: 1097-708;Xu et al. 2012 Oncogene 31: 1065-72を参照。

0143

正常酸素状態におけるHIF誘導は、慢性炎症の要素を伴う疾患状況では重篤な結果となる可能性が高い。また、慢性炎症が永続的に継続しうること、およびそれが異常に活性な転写因子の結果として微小環境を歪めることも示されている。その結果として、増殖因子ケモカインサイトカインおよびROSバランスの変化が細胞環境内で起こり、それはひいては癌および転移のデノボ発生のために必要な増殖および生存機軸を与える。最近発表された研究の結果は、NF-κBおよびHIF-1が調節不全となる、関節リウマチおよび癌を含むいくつかの病態にとって数多くの意味を有する。このため、これらの2つの重要な転写因子、NF-κBとHIFとの間の相互干渉解明することにより、医薬品開発のプロセスは大きく向上すると考えられる。

0144

HIF活性は、癌腫瘍の成長のために必要な血管新生に関与しており、そのため、フェネチルイソチオシアネート(PEITC)などのHIF阻害薬抗癌効果のために用いることができる。腫瘍進行におけるEPAS1の役割の少なくとも一部は、さまざまな遺伝子のEPAS1媒介性アップレギュレーションにあるとされている。例えば、EPAS1はブドウ膜黒色腫の進行に重要な役割を果たすが、これはおそらくオートクリンループVEGF-pVEGFR2/KDRを促進し、かつLDHAの発現を強化して、それによって増殖を優位にすることによると考えられる;Giatromanolaki et al. 2012 Clin. Exp. Metastasis 29: 11-7を参照。

0145

EPAS1はまた、これらの因子の発現にも関与するか、またはそれをアップレギュレートする:c-Myc(細胞増殖、形質転換、新形成および腫瘍形成を助長し、かつほとんどの癌で高度に発現される;Pelegaris et al. 2002 Nat. Re. Cancer 2: 764-776;Nesbit et al. 1999 Oncogene Mol. Cell 3: 565-577;Florczyk et al. 2011 Free Radic. Biol. Med. 51: 1882-92を参照);インターロイキン8(歯肉炎および乾癬などにおける炎症誘発性メディエーター);SP-1(IL-8調節に関与する転写因子であり、かつc-Mycのコアクチベーターでもある;Florczyk et al. 2011 Free Radic. Biol. Med. 51: 1882-92を参照);LDH5(腫瘍壊死および腫瘍サイズ増大と関連性がある;Giatromanolaki et al. 2012 Clin. Exp. Metastasis 29: 11-7を参照);およびLANA(潜伏期関連核抗原、これはカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスと関連している;Veeranna et al. 2012 J. Virol. 86: 1097-708を参照)。c-Mycと協同的に働くことに加えて、EPAS1はEGFRおよびKRASとも協同的に働く;Holmquist-Mengelbier et al. 2006 Cancer Cell 10: 413-23;およびKoh et al. 2011 Cancer Res. 71: 4015-4027を参照。このため、c-Myc、EGFRおよびKRASの過剰発現および/または過剰活性と関係のあるあらゆる疾患は、EPAS1関連疾患であると見なすことができる。加えて、HIF(低酸素誘導因子)活性は、癌腫瘍の成長のために必要な血管新生(angiogensis)にも関与する。

0146

腎明細胞癌(RCC)(ccRCC)およびその転移を、EPAS1RNAi剤によって標的化することには根拠がある。第1に、ccRCC細胞の90%はVHL腫瘍抑制因子を発現しない。第2に、VHL腫瘍抑制因子の非存在下では、Hif転写因子は構成性に活性化される。第3に、発表されている諸研究によれば、Hif-2の発現はRCC異種移植片の成長のために必要かつ十分である。構成性Hif-2 shRNAのノックダウンにより、786-O細胞異種移植片の成長は阻止される。誘導性Hif-2 shRNAのノックダウンにより、Hif-2が786-O異種移植片の維持に必要であることが実証されている。Tian et al. 1998 Genes Dev. 12:3320-3324;Veeranna et al. 2012 J. Virol. 86: 1097-708;およびXu et al. 2012 Oncogene 31: 1065-72;Zimmer et al. 2004. Molecular Cancer Research 2:89-95;Kondo et al. 2002. Cancer Cell 1:237-246;およびKondo et al. 2003.PLoS Biology 1:439-444も参照のこと。

0147

したがって、本開示は、EPAS1RNAi剤、およびEPAS1関連疾患に対するその使用を範囲に含む。

0148

さまざまな種におけるEPAS1遺伝子配列
ヒトEPAS1遺伝子の配列は決定されている。Ema et al. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4273-4278;Flamme et al. 1997 Mech. Dev. 63: 51-60;およびHogenesch et al. 1997 J. Biol. Chem. 272: 8581-8593。文献中、例えば、van Patot et al. 2011 High Alt. Med. Biol. 12: 157-67;Ke et al. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2011 Oct;28(5):583-8;PMID: 21983741に記載されているように、EPAS1のさまざまな多型が知られている。

0149

カニクイザル(「Cyno」、またはMacaca fascicularis)のEPAS1配列(SEQID NO:125)を以下に提示する:カニクイザル_腎臓_NM_001430 EPAS1、内皮PASドメインタンパク質1コンセンサス--標的の長さ=5186、コンセンサス長=4636、9コンティグ(最長は2117)104ミスマッチ、1352リードカバレッジ:最大=84、平均=18.499;コンセンサスの一貫性=99.31%、標的/コンセンサスの保存 97.76%

0150

Nは、配列決定実験においてその位置でヌクレオチドが決定されなかったことを指し示している。

0151

1つの局面において、本開示のEPAS1RNAi剤は、ヒト、マウスおよびカニクイザルのEPAS1遺伝子において同一である配列を含む。この配列同一性は、ヒト試験の前に動物試験を行うことを容易にする。

0152

1つの局面において、EPAS1RNAi剤は、他のいずれの遺伝子のものとも合致しない配列を含む。1つの局面において、EPAS1 RNAi剤は、他のすべての公知の非EPAS1遺伝子との違いが少なくとも0、1、2または3ヌクレオチドである配列を含む。

0153

1つの局面において、EPAS1RNAi剤は、本明細書に開示されるいずれかのRNAi剤のものと同一な配列を含む。

0154

さまざまなEPAS1関連疾患の治療に用いるためのEPAS1RNAi剤
1つの局面において、本開示のEPAS1 RNAi剤は、本明細書に開示される配列を含み、それを必要とする患者(例えば、本明細書に開示されるかまたは文献で知られているEPAS1関連疾患に罹患した患者)に投与される。1つの局面において、本開示のEPAS1 RNAi剤は、それを必要とする患者に対して、その疾患に対して適切である1つまたは複数のさらなる薬学的物質とともに投与される。例えば、EPAS1関連疾患に罹患した患者に対して、1つまたは複数のEPAS1 RNAi剤の薬理学的有効量を、本明細書に列記されたあらゆるEPAS1関連疾患治療、および/または当技術分野において公知である他のあらゆるEPAS1関連疾患治療のうち1つもしくは複数の薬理学的有効量とともに投与することができる。

0155

EPAS1関連疾患に罹患した患者に対して、1つまたは複数のEPAS1に対するRNAi剤、および1つまたは複数のさらなるEPAS1関連疾患治療を投与することができる。このさらなる治療は、本明細書中に列記されたあらゆる疾患治療、および/または当技術分野において公知であるあらゆる抗EPAS1関連疾患治療のリストから選択することができる。

0156

患者に対して、EPAS1に対する複数のRNAi剤を投与することもできる。

0157

EPAS1関連疾患の場合には、RNAi剤およびさらなる疾患治療を、任意の順序で、同時もしくは逐次的に、または時間をかけて多回投与として、投与することができる。RNAi剤およびさらなる治療の投与は、例えば、同時、同時並行的、別々または逐次的であってよい。

0158

同時投与は、例えば、2つもしくはそれを上回る活性成分を伴う1つの固定された組み合わせの形態で、または別々に製剤化された2つもしくはそれを上回る活性成分を同時に投与することによって行うことができる。逐次的使用(投与)は、好ましくは、組み合わせの1つの(またはそれを上回る)構成要素を1つの時点で、他の構成要素を異なる時点で、すなわち長期的に時差をつけた様式で投与し、好ましくはその組み合わせが個々の化合物を独立に投与した場合を上回る有効性を示すように(特に相乗作用を示すように)投与することを意味する。別々の使用(投与)は、好ましくは、互いに独立した組み合わせの構成要素を異なる時点で投与することを意味し、好ましくは、構成要素(a)および(b)を、両方の化合物の測定可能な血中レベルの重なり合いが、重なり合う様式で(同じ時間に)存在しないように投与することを意味する。

0159

また、好ましくは、組み合わせ構成要素の薬物が、組み合わせ構成要素の薬物をそれらの治療有効性に対する相互作用が認められないほど長い時間間隔で独立に用いた場合に認められる効果を上回る連合治療効果、特に好ましくは相乗効果を示すような、逐次的投与、別々の投与および同時投与のうち2つまたはそれを上回る組み合わせも可能である。

0160

「進行の遅延」という用語は、本明細書で用いる場合、治療しようとする疾患の最初の症状発現または再発前段階または初期にある患者に対する組み合わせの投与を意味し、ここで患者は、例えば、対応する疾患の前形態(pre-form)と診断されているか、または患者は、例えば、医学的治療中の状態、もしくは対応する疾患が発症する可能性が高い、事故に起因する状態にある。

0161

「連合的な治療活性がある」または「連合治療効果」とは、化合物を、それらが好ましくは、治療しようとする温血動物、特にヒトにおいて、(好ましくは相乗的)相互作用(連合治療効果)を依然として示すような時間間隔で、別々に(長期的に時差をつけた様式、特に順序特異的な様式で)投与してもよいことを意味する。これがそうであるかは、中でも、血中レベルを追跡して、両方の化合物が、治療しようとするヒトの血液中に少なくともある特定の時間間隔にわたって存在することを示すことによって決定することができる。

0162

そのほかの定義
便宜のために、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において用いられる、ある特定の用語および語句の意味を、以下に提供する。本明細書の他の部分における用語の使用法と、この項におけるその定義との間に明らかな矛盾がある場合には、この項における定義が優先されるものとする。

0163

本開示を通じて用いられる、「1つの(a)」および「1つの(an)」などの詞は、冠詞の1つまたは複数の(少なくとも1つの)文法目的語のことを指す。

0164

RNAi剤
1つの局面において、本開示は、少なくともEPAS1核酸(もしくはその一部)に対して相補的なアンチセンス核酸配列を含む、EPAS1 RNAi剤もしくは他の組成物に関し、または以下に定義するRNAiとして機能しうるアンチセンス核酸を含むshRNAもしくは組成物をコードする組換え発現ベクターに関する。本明細書で用いる場合、「アンチセンス」核酸は、EPAS1タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的な(例えば、二本鎖DNAのコード鎖に対して相補的な、mRNAに対して相補的な、またはEPAS1遺伝子もしくは核酸のコード鎖に対して相補的な)ヌクレオチド配列を含む。

0165

RNAi剤には、非限定的な例として、siRNA(低分子干渉RNA)、dsRNA(二本鎖RNA)、shRNA(低分子ヘアピンRNA)およびmiRNA(マイクロRNA)が含まれる。RNAi剤にはまた、さらなる非限定的な例として、ロックド核酸(LNA)、モルホリノ、UNA、トレオース核酸(TNA)、またはグリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)およびFANAも含まれる。RNAi剤にはまた、1つまたは複数の鎖が、RNA、DNA、LNA、モルホリノ、UNA(アンロックド核酸)、TNA、GNA、および/またはFANAなどの混合物である分子も含まれる。非限定的な例として、RNAi剤の一方または両方の鎖が、例えば、1つまたは複数のRNAヌクレオチドがDNA、LNA、モルホリノ、UNA(アンロックド核酸)、TNA、GNA、および/またはFANAなどによって置き換えられている点を除いて、RNAであってもよいと考えられる。さまざまな局面において、RNAi剤の一方または両方の鎖はニック入りであってよく、両方の鎖が同じであってもよく、または一方(例えば、パッセンジャー鎖)がもう一方よりも短くてもよい。

0166

さまざまな局面において、本開示は、本明細書に開示されるRNA配列および/または本明細書に開示される任意のDNA配列に対応するRNA配列(例えば、DNAヌクレオチドが対応するRNAヌクレオチドによって置き換えられる、例えば、DNA中のTがRNA中のUによって置き換えられる、および糖-リン酸骨格におけるデオキシリボースの代わりにリボースを有する)を含むあらゆるRNAi剤に関する。

0167

本開示のRNAi剤は、EPAS1mRNAを標的とする(例えば、それと結合する、アニールする、ハイブリダイズする、など)。EPAS1に対して特異的なRNAi剤の使用は、EPAS1の活性、レベルおよび/または発現の低下、例えば、標的遺伝子または標的配列の「ノックダウン」(KD)または「ノックアウト」をもたらす。1つの局面において、EPAS1の過剰発現または過剰活性によって特徴づけられる疾患状態の場合に、EPAS1に対するRNAi剤の投与は、より正常なまたは治療的なレベルのEPAS1活性または発現が得られるのに十分な程度にEPAS1標的をノックダウンさせる。EPAS1-/-マウスは、多臓器病変生化学的異常および遺伝子発現の変化を示している;Scortegagna et al. Nat. Genet. 35: 331-340を参照。このことからみて、正常組織におけるEPAS1の発現がわずかであることが有益な可能性がある。本開示のさまざまな局面において、患者または個体は、EPAS1が過度に高いレベルであることによって特徴づけられる疾患状態を有し、RNAi剤は正常レベルに回復させることができる。本開示の1つの局面において、EPAS1の全身でのレベルは、1つの領域(例えば、EPAS1関連疾患に罹患した領域)におけるEPAS1レベルが正常EPAS1レベルよりも低く、疾患に罹患していない身体領域が正常EPAS1レベルに近いようにモジュレートされている。本開示の1つの局面において、RNAi剤は、罹患領域の外側のEPAS1のレベルができるだけ正常近くに維持されるように、局所的に(例えば、腫瘍などの疾患部位に対して)送達される。もう1つの局面において、体内のEPAS1のレベルを、疾患状態を改善するのに十分な程度に低い(例えば、腫瘍成長を抑止するのに十分な程度に低い)が、臓器病変が生じるほどには低くないようにモジュレートすることができる。

0168

1つの局面において、RNAiは一本鎖を含む。この一本鎖RNAi剤であるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、Sioud 2005 J. Mol. Biol. 348: 1079-1090およびその中の参考文献によって記載されているように、センス鎖またはアンチセンス鎖を含む。したがって、本開示は、本明細書に記載のRNAi剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを含む一本鎖を有するRNAi剤を範囲に含む。本開示はまた、一本鎖を含むRNAi剤であって、一本鎖が本明細書に開示される任意のRNAi剤のアンチセンス鎖およびセンス鎖の両方を含み、例えば、鎖が連続している、ループによって接続されている、または他の様式で連結されている、RNAi剤も範囲に含む。そのような分子の例には、センス配列とアンチセンス配列との間にヘアピンを有するもの(例えば、shRNA)が含まれる。

0169

さまざまな局面において、一方または両方の鎖は、少なくとも1つのヌクレオチドサブユニットが、任意の所与の配列において隣接ヌクレオチドサブユニットと共有結合性に連結されていないように、リン酸骨格中に1つまたは複数のニック、すなわち、切れ目または結合欠損部を含む。いくつかの局面において、パッセンジャー鎖はニック入りである(例えば、WO 2007/107162号を参照)。さまざまな局面において、一方または両方の鎖は、1つまたは複数のギャップを含み、例えば、この場合、少なくとも1つのヌクレオチドサブユニット全体が開示される配列に存在しない。センス配列またはアンチセンス配列がギャップを含む場合、その鎖は2つの別々なオリゴヌクレオチドを含むと想定される。

0170

特に有用なsiRNAには、以下の特質の1つまたは複数を有するEPAS1mRNAの領域と特異的に結合しうるものが含まれる:EPAS1のコードセグメントにおいて結合する;5'非翻訳領域とコードセグメントの開始部との接合部またはその付近で結合する;mRNAの翻訳開始部位または付近で結合する;エクソンイントロンの接合部で、接合部を横切って、または付近で結合するう;他の遺伝子のmRNAまたは転写物とはほとんどまたは全く結合しない(「オフターゲット効果」がほとんどまたは全くない);二本鎖でもステム領域でもない1つまたは複数の領域、例えば、ループまたは一本鎖部分にあるものの中および付近でEPAS1 mRNAと結合する;免疫原性をほとんどまたは全く誘発しない;保存された配列の存在により、さまざまな実験動物を用いる試験が容易になるため、さまざまな動物種(ヒト、マウス、ラット、カニクイザルなど)の間で保存されているEPAS1mRNA配列のセグメントで結合する;mRNAの二本鎖領域と結合する;ATリッチ領域(例えば、少なくとも約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59または60% ATリッチ)と結合する;ならびに/または、siRNA活性を低下させることが知られているかもしくはその疑いのある特定の配列、例えば、siRNAの二本鎖部分の分離を低下させることのある5'末端でのGG配列の存在を欠く。1つの局面において、EPAS1に対して特異的なRNAi剤は、これらの特質の任意の1つまたは複数を有する二本鎖RNAであってよい。

0171

「二本鎖RNA」または「dsRNA」という用語は、本明細書で用いる場合、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤;例えば、標的RNAに対して「センス」および「アンチセンス」の向きを有すると称されるであろう、2つの逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含むハイブリダイズした二重鎖領域を(すなわち、第一鎖および第二鎖からのヌクレオチド塩基が対合する領域)を有するRNA分子または分子の複合体を含む組成物のことを指す。アンチセンス鎖は、mRNA標的に対して「ガイド」鎖とも呼ばれ、センス鎖は「パッセンジャー」または「アンチガイド」鎖とも呼ばれる。パッセンジャー鎖は、以下のもののうち少なくとも1つまたは複数を含みうる:他の鎖と比較して1つまたは複数の余分なヌクレオチド(例えば、バルジまたは1ntループ)、および/または他の鎖と比較したニック、ギャップ、ミスマッチなど。さまざまな局面において、RNAi剤は第一鎖および第二鎖を含む。さまざまな局面において、本明細書で用いる場合および文脈によって明らかである場合、本明細書のいずれかに列記されているように、第一鎖に言及する用語はセンス鎖を指し、第二鎖はアンチセンス鎖のことを指す。他の局面において、本明細書で用いる場合および文脈によって明らかである場合、本明細書中のいずれかの表に列記されているように、第一鎖はアンチセンス鎖のことを指し、第二鎖はセンス鎖のことを指す。

0172

二重鎖領域は、RISC経路を通しての所望の標的RNAの特異的分解を可能にする任意の長さであってよいが、典型的は9〜36塩基対(「bp」)の長さ、例えば、15〜30bpの長さの範囲にわたる。9〜36bpの間の二重鎖を考慮すると、二重鎖は、この範囲内にある任意の長さ、例えば、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36bp、および、15〜30bp、15〜26bp、15〜23bp、15〜22bp、15〜21bp、15〜20bp、15〜19bp、15〜18bp、15〜17bp、18〜30bp、18〜26bp、18〜23bp、18〜22bp、18〜21bp、18〜20bp、19〜30bp、19〜26bp、19〜23bp、19〜22bp、19〜21bp、19〜20bp、19bp、20〜30bp、20〜26bp、20〜25bp、20〜24bp、20〜23bp、20〜22bp、20〜21bp、20塩基対、21〜30bp、21〜26bp、21〜25bp、21〜24bp、21〜23bp、21〜22bp、21bp、22bp、または23bpを非限定的に含む、それらの間の任意の部分範囲であってよい。ダイサーおよび類似の酵素によるプロセシングによって細胞内で生成されるdsRNAは、一般に約19〜約22bpの長さの範囲にあるが、人工的dsRNAの鎖はそれよりも短くてもよく、または長くてもよい。一方または両方の鎖が16または15ntと短いsiRNAでも、依然としてRNA干渉活性が実証される。Chu and Rana 2008 RNA 14: 1714-1719。dsRNAの二重鎖領域の一方の鎖は、標的RNAの領域に対して実質的に相補的な配列を含む。二重鎖構造を形成する2つの鎖は、少なくとも1つの自己相補的な二重鎖領域を有する単一のRNA分子に由来してもよく、またはハイブリダイズして二重鎖を形成する2つもしくはそれを上回る別々RNA分子から形成されてもよい。二重鎖領域が単一分子の2つの自己相補的な領域から形成される場合、分子は、一方の鎖の3'末端と二重鎖構造を形成する各々の他の鎖の5'末端との間に、ヌクレオチドの一本鎖によって隔てられた二重鎖領域を有しうる(本明細書において「ヘアピンループ」と称され、例えば、shRNA構築物に認められるものなど)。ヘアピンループは少なくとも1つの非対合ヌクレオチドを含みうる;いくつかの局面において、ヘアピンループは、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも23個またはそれを上回る非対合ヌクレオチドを含みうる。dsRNAの2つの実質的に相補的な鎖が別々のRNA分子に含まれる場合、そのような分子は、その必要はないものの、共有結合性に接続されうる。2つの鎖がヘアピンループによって共有結合性に接続されている場合、構築物は一般に、本明細書および当技術分野において「shRNA」と称される。2つの鎖がヘアピンループ以外の手段によって共有結合性に接続されている場合、接続構造は「リンカー」と称される。

0173

開示される配列からのミスマッチを含む、EPAS1に対するRNAi剤
EPAS1に対するRNAi剤のさまざまな具体的な局面が、本明細書に開示される;例示的な配列は表に提供されている。本開示の具体的な局面は、表1〜5に列記されているRNAi剤、およびそれらの改変変異体または非改変変異体のいずれかとの違いが0、1、2または3nt(ヌクレオチド)またはbp[塩基対](例えば、0、1、2または3個のミスマッチを有する)である配列を含むRNAi剤を含む。

0174

ミスマッチは、本明細書において、2つの配列を最大限に整列させて比較した場合の、塩基配列または長さの違いと定義される。ミスマッチは、一方の配列の塩基がもう一方の配列の塩基と合致しない位置として定義される。したがって、ミスマッチは、例えば、一方の配列中のある位置が特定の塩基(例えば、A)を有し、もう一方の配列上の対応する位置が異なる塩基(例えば、G)を有する場合にカウントされる。例えば、T、C、GまたはUによるAの置換はミスマッチを構成すると考えられる。T、A、CまたはUによるGの置換もミスマッチを構成すると考えられる。また、T、G、AまたはUによるCの置換もミスマッチを構成すると考えられる。A、CまたはGによるUの置換はミスマッチを構成すると考えられる。しかし、ある所与の鎖に対して、UをTによって置き換えることができるが(RNA、または好ましくはDNA、例えば、2'-デオキシ-チミジンとして);TによるUの置き換えは本明細書で用いるミスマッチではなく、これはUまたはTがいずれも逆鎖上のAと対合しうるためであることにも留意されたい。RNAi剤はしたがって、1つまたは複数のDNA塩基、例えば、Tを含みうる。場合によっては、RNAi剤の1つまたは複数の部分において、RNAの代わりにDNAを用いて(例えば、シード領域において)、DNA-RNAハイブリッドを形成さえることができる。例えば、Yamato et al. 2011 cancer Gene Ther. 18: 587-597を参照。塩基対合が起こった場合に、RNAi剤のDNA部分と対応する標的mRNAとの間(例えば、DNA部分におけるA、G、CまたはTと、mRNAにおけるそれぞれ対応するU、C、GまたはAとの間)にミスマッチはカウントされない。

0175

ミスマッチはまた、例えば、一方の配列における位置が塩基(例えば、A)を有し、もう一方の配列上の対応する位置が塩基を有しない場合(例えば、その位置が、リン酸-糖骨格を含むが塩基は含まない脱塩基ヌクレオチドである場合)にもカウントされる。いずれかの配列(またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖)における一本鎖ニックは、ミスマッチとしてカウントされない。したがって、非限定的な例として、一方の配列が配列AGを含むが、もう一方の配列がAとGとの間に一本鎖ニックを有する配列AGを含むならば、ミスマッチは全くカウントされないと考えられる。また、糖またはリン酸におけるヌクレオチド改変もミスマッチとは見なされない。したがって、一方の配列がCを含み、もう一方の配列が改変C(例えば、2'-改変)を同じ位置に含むならば、ミスマッチは全くカウントされないと考えられる。

0176

したがって、改変が、塩基を改変することなくRNAi剤の糖、リン酸または骨格に対して加えられた場合には、ミスマッチは全くカウントされない。したがって、RNAとして

の配列を有する鎖は、PNAとして;またはモルホリノ;またはLNA;またはTNA;またはGNA;またはFANA;またはRNAおよびDNA、TNA、GNA、FANA、モルホリノ、UNA、LNA、および/もしくはPNAの混合物もしくはキメラなどとして同じ配列を有する別の鎖からのミスマッチを0個しか有しないと考えられる。

0177

また、表におけるRNAi剤の配列は、表5に詳細に示されているように、改変を含む配列を含むことにも留意されたい。dTdT(2'-デオキシ-チミジン-5'-リン酸および2'-デオキシ-チミジン-5'-リン酸)、または場合によってはTTもしくはUUを、一方または両方の3'末端に対して末端ジヌクレオチドキャップまたは延長として加えることができるが、このキャップまたは延長はミスマッチの総数の計算には含まれず、標的配列の一部とは見なされないことにも留意されたい。これは、末端ジヌクレオチドが末端をヌクレアーゼ分解から保護するものの、標的特異性には寄与しないためである(Elbashir et al. 2001 Nature 411: 494-498;Elbashir et al. 2001EMBO J. 20: 6877-6888;およびKraynack et al. 2006 RNA 12: 163-176)。

0178

加えて、表5におけるように、改変変異体は、対応する非改変配列からの1つまたは複数の改変も有しうる。この場合に、小文字「c」は2'-O-メチルシチジン-5'-リン酸を表し、小文字「u」は2'-O-メチルウリジン-5'-リン酸を表す。大文字「A」、「C」、「G」および「U」は、それぞれ非改変のアデノシン-5'-リン酸、シチジン-5'-リン酸、グアノシン-5'-リン酸、およびウリジン-5'-リン酸を表す。さまざまな改変を図1に示している。例えば、非改変Cの改変cへの置換は、配列間の0、1、2または3個のミスマッチの番号付けにおいて、ミスマッチとはカウントされない。この命名法は、表1〜6の中のすべての配列に対して用いられる。したがって、(a)被験配列と別のRNAi剤のものとの間、および(b)同じ被験配列とEPAS1遺伝子由来の対応する非改変配列との間、および(c)同じ塩基配列を有する改変配列と異なるように改変された配列との間には、同数のミスマッチが算定されると考えられる。

0179

1つの特定の局面において、本開示は、表1〜6に列記されたRNAi剤、およびそれらの改変変異体または非改変変異体のいずれかのアンチセンス鎖の配列との違いが0、1、2または3ntである少なくとも15〜19個の連続したヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含むRNAi剤を含む。

0180

本開示は、開示される配列の「改変変異体または非改変変異体」を含む。

0181

特定の配列の「非改変変異体」は、いかなる改変も有しない、EPAS1の対応する部分のことである。例示的な改変配列は表3に列記されている。表の配列の「非改変変異体」は、塩基改変も末端dTdTも有しない同一の配列を有する。ある所与の配列とその「非改変変異体」との違いは0ntである(かつミスマッチを全く有しない)。

0182

特定の配列の「改変変異体」は、骨格、糖、リン酸もしくは塩基に対する1つもしくは複数の(または1つもしくはより少数の)改変、および/または末端ジヌクレオチド(例えば、TT、dTdT、TsTまたはUU)の付加を含むが、いかなる塩基置換(例えば、CからGへの、またはGからAへの)も有しない;このため、ある所与の配列とその改変変異体との違いは0ntである(かつミスマッチを全く有しない)。もう1つの例として、RNAとしての所与の配列およびPNAとしての同じ配列は、互いに改変変異体であり、違いは0ntである(かつミスマッチを全く有しない)。同様に、ロックド核酸(LNA)、モルホリノ、UNA(アンロックド核酸)、トレオース核酸(TNA)またはグリコール核酸(GNA)としての同じ配列(塩基置換を全く有しない)も、0個のミスマッチを有する改変変異体であると考えられる。加えて、同じ配列を、RNA、DNA、LNA、モルホリノ、TNA、GNA、および/またはFANAなどの混合物である鎖に用いることもできると考えられる。非限定的な例として、一方または両方の鎖が、例えば、1つまたは複数のヌクレオチドがDNA、LNA、モルホリノ、UNA,TNA、GNA、および/またはFANAなどによって置き換えられている点を除いて、RNAであってもよいと考えられる。

0183

以下に詳述するように、所与の位置にある単一のヌクレオチドを、同じヌクレオチドの改変バージョンに置換することによって、改変変異体(ミスマッチが0個である)が生成されると考えられる。

0184

もう1つの特定の局面において、RNAi剤は、表に列記されたRNAi剤、およびそれらの改変変異体または非改変変異体ののいずれかのセンス鎖との違いが0、1、2または3ntである少なくとも15個の連続したヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。

0185

本開示のEPAS1に対するRNAi剤を、RNA干渉に用いることができる。

0186

RNAi剤の改変
本開示は、表に開示されたものなどの非改変RNAi剤および例示的な改変RNAi剤を範囲に含む。

0187

本開示は、開示されるRNAi剤(例えば、改変変異体)の任意の他の改変をさらに範囲に含む。

0188

例えば、本開示は、所与の位置に、単一ヌクレオチドの同じヌクレオチドの改変バージョンによる置換を有するRNAi剤を範囲に含む。すなわち、ヌクレオチド(A、G、CまたはU)を、対応する5-フルオロウラシル5-ブロモウラシル、5-クロロウシル、5-ヨードウラシルヒポキサンチンキサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシルジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキュエオシンイノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキュエオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、または2,6-ジアミノプリンによって置き換えることができる。

0189

そのほかの改変変異体には、RNAi剤に対する任意の他のモイエティー(例えば、放射性標識または他のタグもしくは結合体)の付加が含まれる;ただし、塩基配列が同一であり、他のモイエティーの付加によって「改変変異体」(ミスマッチを全く有しない)が生成されることを条件とする。

0190

改変のさまざまなセットを用いることができる。これらには、本明細書に開示されるさまざまなスクリーニングに用いられる以下の形式が含まれる。

0191

そのような改変セットの2つには、A51 S26およびA85S26が含まれる;これらの改変セットを有するEPAS1RNAi剤は、表5に提示されている。

0192

A51S53
ガイド鎖:位置1、2および14を除くすべてのUおよびCが2'-OMeである。
センス鎖:すべてのUが2'-OMe-Uとなっている。

0193

A85S26(「新規」)
ガイド鎖:位置1、2および14を除くすべてのUが2'-OMeである。
センス鎖:すべてのCおよびUが改変されている(2'-OMe)。

0194

しかし、本明細書に開示されるEPAS1RNAi剤配列の他の改変を調製することもできると考えられる。これらには、非限定的な例として、以下のものが含まれる。

0195

A51 S26
A51:ガイド鎖では、位置1、2および14を除き、すべてのUが2'-OMe-Uとなっており、かつすべてのCが2'-OMe-Cとなっている;3'オーバーハングは2'-OMe-U 2'-OMe-Uとなっている。
S26:センス鎖では、すべてのUが2'-OMe-Uとなっており、かつすべてのCが2'-OMe-Cとなっている;3'オーバーハングは2'-OMe-U 2'-OMe-Uとなっている。

0196

A22S26
A22は、すべてのUAが2'-OMe-U Aとなっており、かつすべてのCAが2'-OMe-C Aとなっていることを指し示している。
S26は、すべてのUが2'-OMe-Uとなっており、かつすべてのCが2'-OMe-Cとなっていることを指し示している。
3'オーバーハングすべて2'-OMe-U 2'-OMe-Uとなっている。

0197

これらの改変および改変に関するパターン(例えば、形式)に加えて、提供される配列の他の改変または改変セットを、核酸改変の一般的な知識を用いて作製することもできる。本開示のEPAS1に対するRNAi剤のこれらのさまざまな局面を、RNA干渉に用いることができる。

0198

RNA干渉
RNA干渉(RNAi)とは、二本鎖RNA(dsRNA)と同じ配列を含むメッセンジャーRNA(mRNA)を分解するためにdsRNAを用いる、転写後の標的化遺伝子サイレンシング手法である。RNAiのプロセスは、リボヌクレアーゼIII(ダイサー)が、より長いdsRNAを、siRNAと呼ばれるより短い断片へと切断する時に起こる。ダイサーによって生成されるsiRNA(低分子干渉RNA)は、典型的には約21〜23ヌクレオチド長であり、約19塩基対の二重鎖を含む(しかし、人工的siRNAまたはRNAi剤は、より短くてもまたはより長くてもよく、かつ/または平滑末端であってもよく、かつ/または1つもしくは複数のエンドキャップを含む)。より小さなRNAセグメントが、続いて標的mRNAの分解を媒介する。ダイサーはまた、翻訳制御に関与するとされる保存された構造の前駆体RNAからの21および22ヌクレオチドの小分子RNA(stRNA)の切り出しにも関与するとされる。Hutvagner et al. 2001 Science 293: 834。RNAi応答は、RNAi剤のアンチセンス鎖に対して相補的な一本鎖mRNAの切断を媒介する、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)と一般的に呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体も特徴とする。標的RNAの切断は、siRNA二重鎖のアンチセンス鎖に対して相補的な領域の中ほどで生じる。

0199

1つの局面において、RNA干渉性薬剤は、標的RNA配列と相互作用して標的RNAの切断を導く一本鎖RNAを含む。理論に拘束されることは望まないが、本開示は、ダイサーとして知られるIII型エンドヌクレアーゼによってsiRNAへと分解される、植物および無脊椎動物細胞に導入される長い二本鎖RNAを想定している。Sharp et al. 2001 Genes Dev. 15:485。リボヌクレアーゼ-III様酵素の1つであるダイサーは、dsRNAを、特徴的な2塩基の3'オーバーハングを有する19〜23塩基対の低分子干渉RNAにプロセシングする。Bernstein, et al. 2001 Nature 409:363。siRNAは続いて、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)の中に組み入れられ、そこで1つまたは複数のヘリカーゼがsiRNA二重鎖を解きほぐし、今や対合していないsiRNA鎖の1つが、標的認識を手引きする「ガイド」鎖として作用する。Nykanen, et al. 2001 Cell 107:309。アンチセンスガイド鎖と適切な標的mRNAとの結合により、RISC内の1つまたは複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する。Elbashir, et al. 2001 Genes Dev. 15:188。したがって、1つの局面において、本開示は、RISC複合体の形成を促進して標的遺伝子のサイレンシングを生じさせる、一本鎖RNAに関する。

0200

RNAi合成のためのキットは、例えば、New England BiolabsおよびAmbionから販売されている。

0201

適したRNAi剤は、当技術分野において公知であるかまたは当業者想像しうる任意のプロセスによって選択することができる。例えば、選択基準は、以下の段階の1つまたは複数を含むことができる:EPAS1遺伝子配列の初期解析、およびRNAi剤の設計;この設計は、種間(ヒト、カニクイザル、マウスなど)にわたる配列類似性および他の(非EPAS1)遺伝子との非類似性を考慮に入れることができる;インビトロでのRNAi剤のスクリーニング(例えば、RKO細胞において10nMで);RKO細胞におけるEC50の決定;生存のためにEPAS1を必要としない非感受性細胞、または生存のためにEPAS1を必要とする感受性細胞を含む、RNAi剤で処理した細胞の生存度の決定;例えば、免疫刺激配列があまり望まれない、免疫原性を推定するためのTNF-αのレベルの試験のためにヒトPBMC末梢血単核細胞)を用いる試験;免疫刺激配列があまり望まれない、新鮮ヒト血液をRNAi剤で処理してサイトカイン/ケモカインレベル[例えば、TNF-α(腫瘍壊死因子-α)および/またはMCP1(単球走化性タンパク質1)]を決定する、ヒト全血アッセイにおける試験;被験動物において皮下腫瘍を用いるインビボでの遺伝子ノックダウンの決定;例えば、薬力学的(PD)マーカー、例えば発現がEPAS1によって影響される他の因子を用いるEPAS1標的遺伝子モジュレーション分析、ここでEPAS1ノックダウンはそのような構成要素の存在量の用量依存的減少につながる;ならびにRNAi剤の特定の改変の最適化。

0202

本明細書に記載のdsRNA分子(RNAi剤)は、このように、EPAS1のRNA干渉において有用である。

0203

RNAi剤の特徴:センス鎖、アンチセンス鎖および(任意での)オーバーハング
さまざまな局面において、RNAi剤は、第一鎖および第二鎖、例えばセンス鎖およびアンチセンス鎖(またはアンチセンス鎖およびセンス鎖)を含み、任意で、いずれかまたは両方の鎖のいずれかまたは両方の末端は、非対合ヌクレオチド(本明細書において「オーバーハング」と称する)を含む。

0204

「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に対して実質的に相補的な領域を含むRNAi剤の鎖のことを指す。本明細書で用いる場合、「相補性の領域」という用語は、本明細書において定義するように、配列、例えば標的配列に対して実質的に相補的な、アンチセンス鎖上の領域のことを指す。相補性の領域が標的配列に対して完全に相補的でない場合には、ミスマッチが分子の内部領域または末端領域に存在することがある。一般に、最も許容されるミスマッチは、末端領域、例えば、5'および/または3'末端の5、4、3または2ヌクレオチド以内にある。

0205

「センス鎖」という用語は、本明細書で用いる場合、本明細書において定義される用語であるアンチセンス鎖の領域に対して実質的に相補的な領域を含む、RNAi剤の鎖のことを指す。

0206

遺伝子の配列は個体ごとに差異があり、特にコードセグメント内のゆらぎ位置、または非翻訳領域においてそうである;個体はまた、コード配列においても互いに異なることがあり、その結果、mRNAにおけるさらなる違いがもたらされる。RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列は、このため、必要であるならば、および必要な場合には、個々の患者のものに対応するように設計することができる。また、免疫原性、望ましくないmRNAとの結合(例えば、「オフターゲット効果」)を低下させるため、または血液中での安定性を高めるために、RNAi剤を配列の点で改変することもできる。これらの配列変異体は、RNAi剤の塩基の、または5'もしくは3'もしくは他のエンドキャップの化学的改変から独立している。

0207

RNAi剤はまた、0、1または2オーバーハングのオーバーハングを有することもできる;0ntオーバーハングの場合、それらは平滑末端である。RNAi剤はこのため、0、1または2個の平滑末端を有しうる。「平滑末端RNAi剤」において、両方の鎖は塩基対で終結する;このため、平滑末端分子は3'または5'のいずれかの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを欠いている。

0208

RNAi剤は、オーバーハング、平滑末端、ならびに/または5'および3'末端キャップを含みうる。

0209

本明細書で用いる場合、「オーバーハング」または「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、RNAi剤の二重鎖構造の2つの鎖の少なくとも1つの末端から突出している、少なくとも1つの非対合ヌクレオチドのことを指す。例えば、dsRNAの一方の鎖の3'末端が他の鎖の5'末端を越えて伸びるか、またはその逆である場合に、これはヌクレオチドオーバーハングを形成し、例えば、非対合ヌクレオチドがオーバーハングを形成する。dsRNAは、少なくとも1ヌクレオチドのオーバーハングを含みうる;または、オーバーハングは、少なくとも2ヌクレオチド、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも4ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチドまたはそれを上回るものを含むことができる。オーバーハングは、デオキシヌクレオチド/ヌクレオシドを含むヌクレオチド/ヌクレオシド類似体を含むか、またはそれらからなることができる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖またはそれらの任意の組み合わせの上にあってよい。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、dsRNAのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの5'末端、3'末端または両方の末端に存在することができる。RNAi剤はまた、任意でキャップを含むこともできる。「キャップ」などの用語は、二本鎖ヌクレオチド二重鎖の末端に結びついた化学的モイエティーを含むが、本明細書ではヌクレオチドまたはヌクレオシドである化学的モイエティーは除外して用いられる。「3'キャップ」は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの3'末端に結びつき、例えば、血清または腸液中のものなどのヌクレアーゼによる分解から分子を保護する。非ヌクレオチド性3'キャップは、ヌクレオチドではなく、平滑末端RNAi剤の末端でTTまたはUUジヌクレオチドを置き換えることができる。1つの局面において、非ヌクレオチド性3'末端キャップは、例えば、WO 2005/021749号およびWO 2007/128477号;ならびに米国特許第8,097,716号;米国特許第8,084,600号;および米国特許第8,344,128号に開示されている通りである。「5'キャップ」は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5'末端に結びついている。キャップは、RNAi活性と干渉(または過度に干渉)すべきではない。

0210

本開示はしたがって、EPAS1に対して特異的なRNAi剤を想定している。RNAi剤中にアンチセンス鎖(これは連続していてもよく、またはリンカーもしくはループを介して接続されてもよい)を含む。1つのより具体的な局面において、RNAi剤はアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、それらが一緒になることで二本鎖領域または相補的領域を含む。1つの局面において、それはまた、任意で、1つもしくは2つのオーバーハングおよび/または1つもしくは2つのキャップも含みうる。RNAi剤は、標的遺伝子であるEPAS1のRNA干渉を誘導するために用いられる。

0211

標的および相補的配列
本開示のRNAi剤は、EPAS1をコードするmRNAを標的とする(例えば、それと特異的に結合する、アニールする、など)。EPAS1に対して特異的なRNAi剤の使用は、EPAS1の活性、レベルおよび/または発現の低下をもたらす。特に1つの局面において、EPAS1の過剰発現または過剰活性によって特徴づけられる疾患状態の場合に、EPAS1に対するRNAi剤の投与は、EPAS1の活性または発現の正常レベルを回復させるのに十分な程度にEPAS1遺伝子をノックダウンさせる。

0212

1つの局面において、RNAiの第一鎖または第二鎖は、標的核酸であるEPAS1のものに対して相補的な配列を含む。

0213

本明細書で用いる場合、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて言及される配列によって記載されるヌクレオチドの連鎖を含むオリゴヌクレオチドのことを指す。

0214

本明細書で用いる場合、「標的配列」または「標的遺伝子」とは、一次転写産物のRNAプロセシングの産物であるmRNAを含む遺伝子、例えばEPAS1遺伝子の転写時に形成されるmRNA分子のヌクレオチド配列の連続した部分のことを指す。配列の標的部分は、少なくとも、その部位またはその付近でのRNAiにより指定される切断のための基質として働くのに十分な程度に長いと考えられる。例えば、標的配列は一般に、それらの間のすべての部分範囲を含め、9〜36ヌクレオチド(「nt」)の長さ、例えば15〜30ntの長さである。非限定的な例として、標的配列は、15〜30nt、15〜26nt、15〜23nt、15〜22nt、15〜21nt、15〜20nt、15〜19nt、15〜18nt、15〜17nt、18〜30nt、18〜26nt、18〜23nt、18〜22nt、18〜21nt、18〜20nt、19〜30nt、19〜26nt、19〜23nt、19〜22nt、19〜21nt、19〜20nt、19nt、20〜30nt、20〜26nt、20〜25nt、20〜24nt、20〜23nt、20〜22nt、20〜21nt、20nt、21〜30nt、21〜26nt、21〜25nt、21〜24nt、21〜23nt、または21〜22nt、21nt、22nt、または23ntであってよい。RNAiのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、標的核酸であるEPAS1のものに対して相補的な配列を含む。

0215

本明細書で用いる場合、別に指示する場合を除き、「相補的な」という用語は、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、ある特定の条件下で、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力のことを指す。そのような条件は、例えば、ストリンジェントであってよく、例えば、400mM NaCl、40mMPIPESpH 6.4、1mMEDTA、50℃または70℃で12〜16時間、およびその後の洗浄であってよい。生物体の内部で遭遇しうるような生理的に妥当な条件などの、他の条件を適用することもできる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な用途に応じて、2つの配列の相補性の試験のために最も適切な条件のセットを決定することができるであろう。

0216

RNAi剤、例えば、本明細書に記載のdsRNA相補的配列における相補的配列には、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対合した、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが含まれる。そのような配列は、本明細書において、互いに対して「完全に相補的な」と称することができる。しかし、本明細書において、第1の配列が第2の配列に対して「実質的に相補的な」と称される場合、2つの配列は完全に相補的であってもよく、またはそれらが、それらの最終的な用途、例えばRISC経路を介する遺伝子発現の阻害にとって最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保ちながら、最大30塩基対の二重鎖のためのハイブリダイゼーション時に、1つまたは複数の、しかし一般には5、4、3または2つを上回らないミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかし、2つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション時に1つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは相補性の決定に関してミスマッチと見なされるべきではない。例えば、21ヌクレオチドの長さである1つのオリゴヌクレオチドおよび23ヌクレオチドの長さであるもう1つのオリゴヌクレオチドを含むdsRNAであって、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である21ヌクレオチドの配列を含むdsRNAは、本明細書に記載の目的にとって「完全に相補的な」とまだ称してもよい。「オーバーハング」という用語は、上記のように、二本鎖ヌクレオチド二重鎖の3'または5'末端にある非対合ヌクレオチドを述べている。1つの局面において、オーバーハングは1〜4ntの長さであり、3'末端にある。

0217

「相補的」配列は、本明細書で用いる場合、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン-クリック塩基対および/または非天然の改変ヌクレオチドから形成される塩基対を含んでもよく、または完全にそれらから形成されてもよい。そのような非ワトソン-クリック塩基対には、ゆらぎ(Wobble)またはフーグスティーン(Hoogstein)塩基対合が非限定的に含まれる。本明細書における「相補的な」、「完全に相補的な」および「実質的に相補的な」という用語は、それらの使用の文脈から理解されるように、dsRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはRNAi剤のアンチセンス鎖と標的配列との塩基マッチングに関してさらに用いてもよい。本明細書で用いる場合、メッセンジャーRNA(mRNA)の「少なくとも一部に対して実質的に相補的な」ポリヌクレオチドとは、関心対象のmRNA(例えば、EPAS1をコードするmRNA)の連続した部分に対して実質的に相補的なポリヌクレオチドのことを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がEPAS1をコードするmRNAの非中断部分に対して実質的に相補的であるならば、EPAS1 mRNAの少なくとも一部に対して相補的である。

0218

したがって、本開示のRNAi剤は、標的EPAS1における標的配列に対して相補的(complimentary)または実質的に相補的であり、センス鎖およびアンチセンス鎖(これは連続していてもよく、またはリンカーもしくはループを介して接続されてもよい)を含む二本鎖であり、ここで二本鎖領域は9〜36bpの長さ(特に、例えば、19〜22bpまたは19〜23bpの長さ)であってよく、さらに任意で3'または5'オーバーハングを含んでもよく、RNAi剤は3'キャップをさらに含んでもよい。RNAi剤は、RNA干渉、EPAS1のレベル、発現および/もしくは活性のダウンレギュレーションもしくは阻害、ならびに/またはEPAS1および/もしくはEPAS1活性もしくはEPAS1と関係のある他の生物学的機能のほぼ正常なレベルの確立もしくは再確立を媒介する。

0219

したがって、本開示のRNAi剤は、標的EPAS1における標的配列に対して相補的または実質的に相補的であり、センス鎖およびアンチセンス鎖(これは連続していてもよく、またはリンカーもしくはループを介して接続されてもよい)を含む二本鎖であり、ここで二本鎖領域は9〜36bpの長さ(特に、例えば、19〜22bpまたは19〜23bpの長さ)であってよく、さらに任意で3'または5'オーバーハングを含んでもよく、RNAi剤は3'キャップをさらに含んでもよい。RNAi剤は、RNA干渉、EPAS1のレベル、発現および/もしくは活性のダウンレギュレーションもしくは阻害、ならびに/または、EPAS1活性もしくは発現のほぼ正常なレベルの確立もしくは再確立を媒介する。

0220

「二本鎖RNA」または「dsRNA」という用語は、本明細書で用いる場合、第一鎖および第二鎖を含むRNAi剤;例えば、標的RNAに対して「センス」および「アンチセンス」の向きを有すると称されるであろう、2つの逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含むハイブリダイズした二重鎖領域を有するRNA分子または分子の複合体を含む組成物のことを指す。アンチセンス鎖は、mRNA標的に対して「ガイド」鎖とも呼ばれ、センス鎖は「パッセンジャー」または「アンチガイド」鎖とも呼ばれる。本明細書で用いる場合、文脈に応じて、「第一」鎖はガイド鎖またはアンチセンス鎖であってよく、「第二」鎖はパッセンジャー鎖またはセンス鎖であってよい。また、本明細書で用いる場合、同じく文脈に応じて、「第一」鎖がパッセンジャー鎖またはセンス鎖であってもよく、「第二」鎖がガイドまたはアンチセンスであってもよい。パッセンジャー鎖は、以下のもののうち少なくとも1つまたは複数を含みうる:他の鎖と比較して1つまたは複数の余分なヌクレオチド(例えば、バルジまたは1ntループ)、他の鎖と比較したニック、ギャップなど。さまざまな局面において、第一鎖はセンス鎖であり、第二鎖はアンチセンス鎖である。他の局面において、第一鎖はアンチセンス鎖であり、第二鎖はセンス鎖である。

0221

二重鎖領域は、RISC複合体への装入、およびRISC経路を通しての所望の標的RNAのその後の特異的分解を可能にする任意の長さであってよいが、典型的は9〜36塩基対(「bp」)の長さ、例えば、15〜30bpの長さの範囲にわたると考えられる。9〜36bpの間の二重鎖を考慮すると、二重鎖は、この範囲内にある任意の長さ、例えば、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36bp、および、15〜30bp、15〜26bp、15〜23bp、15〜22bp、15〜21bp、15〜20bp、15〜19bp、15〜18bp、15〜17bp、18〜30bp、18〜26bp、18〜23bp、18〜22bp、18〜21bp、18〜20bp、19〜30bp、19〜26bp、19〜23bp、19〜22bp、19〜21bp、19〜20bp、19bp、20〜30bp、20〜26bp、20〜25bp、20〜24bp、20〜23bp、20〜22bp、20〜21bp、20塩基対、21〜30bp、21〜26bp、21〜25bp、21〜24bp、21〜23bp、21〜22bp、21bp、22bp、または23bpを非限定的に含む、それらの間の任意の部分範囲であってよい。

0222

ダイサーおよび類似の酵素によるプロセシングによって細胞内で生成されるdsRNAは、一般に約19〜約22bpの長さの範囲にあるが、当技術分野において公知の任意の方法によって人工的RNAi剤を合成または作製することもできる。dsRNAの二重鎖領域の一方の鎖は、標的RNAの領域に対して実質的に相補的な配列を含む。二重鎖構造を形成する2つの鎖は、少なくとも1つの自己相補的な二重鎖領域を有する単一のRNA分子に由来してもよく、またはハイブリダイズして二重鎖を形成する2つもしくはそれを上回る別々RNA分子から形成されてもよい。二重鎖領域が単一分子の2つの自己相補的な領域から形成される場合、分子は、一方の鎖の3'末端と二重鎖構造を形成する各々の他の鎖の5'末端との間に、ヌクレオチドの一本鎖によって隔てられた二重鎖領域を有しうる(本明細書において「ヘアピンループ」と称され、例えば、shRNA構築物に認められるものなど)。ヘアピンループは少なくとも1つの非対合ヌクレオチドを含みうる;いくつかの局面において、ヘアピンループは、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも23個またはそれを上回る非対合ヌクレオチドを含みうる。dsRNAの2つの実質的に相補的な鎖が別々のRNA分子に含まれる場合、そのような分子は、その必要はないものの、共有結合性に接続されうる。2つの鎖がヘアピンループによって共有結合性に接続されている場合、構築物は一般に、本明細書および当技術分野において「shRNA」と称される。2つの鎖がヘアピンループ以外の手段によって共有結合性に接続されている場合、接続構造は「リンカー」と称される。「siRNA」という用語は、本明細書において、上記のようなdsRNAを指すためにも用いられる。

0223

EPAS1のレベル、発現および/または活性を低下させるかまたは正常化するRNAi剤
EPAS1を標的化するためのRNAi剤には、本明細書に提供されるEPAS1配列と結合して、RNAi機構を通してEPAS1を減少させるように働くものが含まれる。EPAS1に対する例示的なRNAi剤(例えば、siRNA)は、例えば、表1に提供されている。

0224

当技術分野において公知の任意の方法を用いて、EPAS1RNAi剤によって誘導される、EPAS1の活性、レベル、および/または発現の変化を測定することができる。測定を、RNAi剤の投与の前、投与中および投与後という複数の時点に行って、RNAi剤の効果を決定することができる。

0225

本開示のRNAi剤は、ほぼ正常レベルのEPAS1の活性または発現が回復するように、EPAS1をサイレンシングし、その発現を阻害し、その発現をダウンレギュレートし、かつ/またはその発現を抑制する。

0226

加えて、さまざまな局面において、疾患状態および生物学的状況に応じて、望まれる治療成績に依存して、本開示のRNAi剤を用いて、EPAS1の発現、活性のレベル、および/または正常レベル未満であるかもしくは正常レベルを上回るレベルを確立することも許容される。

0227

当技術分野において公知の任意の方法を用いて、EPAS1 siRNAによって誘導される、EPAS1の活性、レベルおよび/または発現変化を測定することができる。測定を、siRNAの投与の前、投与中および投与後という複数の時点に行って、siRNAの効果を決定することができる。

0228

「サイレンシングする」、「の発現を阻害する」、「の発現をダウンレギュレートする」などの用語は、それらがEPAS1遺伝子に言及している限り、本明細書において、第1の細胞または細胞群と実質的に同一であるがそのように処理されていない第2の細胞または細胞群(対照細胞)と比較して、EPAS1遺伝子が転写され、かつEPAS1遺伝子の発現が阻害されるように処理された第1の細胞または細胞群から単離されるかまたはその中で検出されうるEPAS1mRNAの量の減少によって明らかになるような、EPAS1遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制のことを指す。阻害の度合いは、通常、

によって表される。

0229

または、阻害の度合いを、EPAS1遺伝子発現と機能的な結びつきのあるパラメーター、例えば、EPAS1遺伝子によってコードされるタンパク質の量、発現がEPAS1に依存するタンパク質の発現の変化などによって示すこともできる。原則的に、EPAS1遺伝子サイレンシングは、EPAS1を構成性にまたはゲノム工学によって発現する任意の細胞において、任意の適切なアッセイによって決定することができる。しかし、所与のRNAi剤がEPAS1の発現をある度合いで阻害し、それ故に本開示の範囲に含まれるか否かを判定するために参照または対照が必要な場合には、以下の実施例に提供されるアッセイが、そのような参照として役立つであろう。

0230

例えば、場合によっては、EPAS1の発現は、本開示の特徴であるRNAi剤の投与によって、少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%抑制される。いくつかの局面において、EPAS1は、本開示の特徴であるRNAi剤の投与によって、少なくとも約60%、70%、または80%抑制される。いくつかの局面において、本明細書に記載するように、EPAS1は、RNAi剤の投与によって、少なくとも約85%、90%、または95%またはそれを上回って抑制される。1つの局面において、EPAS1抑制の度合いは、非処理細胞と比較した、処理細胞における完全長EPAS1mRNAの喪失によって決定される。1つの局面において、EPAS1抑制の度合いは、増殖活性の喪失および/または細胞死モニターする表現型アッセイによって決定される。その他の局面は、実施例において提供される通りである。

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