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課題

ヘミセルロース(植物の細胞壁の主要成分)を分解する方法および処理工程の提供。さらにまた、新規キシラナーゼマンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを設計する方法、およびその使用方法の提供。

解決手段

特定の変異を含む、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、および、その核酸によってコードされるポリペプチドを利用した方法および工程。前記ポリペプチドは特定のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含み、該アミノ酸配列の特定のアミノ酸残基が特定のアミノ酸残基へ変化する変異を含む。

概要

背景

キシラナーゼ(例えばエンド-1,4-ベータ-キシラナーゼ、EC3.2.1.8)は、キシランの内部β-1,4-キシロシド結合を加水分解して、より小さな分子量のキシロース及びキシロオリゴマーを生成する。キシランは、1,4-β-グリコシド結合D-キシロピラノースから形成される多糖類である。キシラナーゼは産業的価値が高く、食品工業で焼成並びに果実及び野菜の加工のために、動物用飼料の製造並びにパルプ及び紙の製造で農業廃棄物の分解のために用いられる。キシラナーゼは菌類および細菌によって生成される。
アラビノキシラン穀類の主要な非デンプン多糖類であり、種類及び生長条件により2.5−7.1%w/wを占める。この多糖類の物理化学的特性は、酸化条件下粘稠溶液または場合によってゲルを生じるようなものである。さらにまた、アラビノキシランは水と高い結合能力を有し、タンパク質の泡の安定性役割を果たす。これらの特徴のいずれも、醸造、焼成、動物飼料および紙の製造を含むいくつかの産業に対し問題を与えている。醸造で用いられる場合、キシランの存在は、麦汁ろ過性及び混濁の形成に関する問題をもたらす。焼成用途(特にクッキー及びクラッカー)では、これらのアラビノキシランは粘着性生地を生じ、このような生地は機械製造が困難でありビスケットのサイズを低下させる。さらにまた、この炭水化物焼成生成物の急速な再水和関与し、ぱりっとした硬さを失わせ保存期間を短くする。穀物飼料を用いる単胃動物用飼料の用途の場合、アラビノキシランは、腸内容物粘性に対する主要な関与因子であり、したがって飼料の消化及び動物成長速度に悪影響を及ぼす。反芻動物の場合、これらの多糖類は繊維摂取の実質的成分であり、アラビノキシランのより完全な消化はより高い飼料変換効率をもたらすであろう。
紙パルプ工業(例えば酵素は65℃から75℃およびほぼpH10で活性を有する産業)では、キシラナーゼの使用がなお希求されている。さらにまた、紙パルプ工業で有用な酵素は、漂白化学物質(例えば二酸化塩素)の必要性を低下させよう。
さらにまた、バイオアルコールおよび/またはバイオ燃料(例えばバイオエタノールプロパノールブタノールおよび/またはメタノール)のバイオマス変換による効率的で低コストの処理工程および組成物の提供が希求されている。酵素または酵素“カクテル”は、バイオマスを糖(前記は続いて発酵によりバイオ燃料に生成される)に変換するルートを提供しよう。

概要

ヘミセルロース(植物の細胞壁の主要成分)を分解する方法および処理工程の提供。さらにまた、新規なキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを設計する方法、およびその使用方法の提供。特定の変異を含む、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、および、その核酸によってコードされるポリペプチドを利用した方法および工程。前記ポリペプチドは特定のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有する配列を含み、該アミノ酸配列の特定のアミノ酸残基が特定のアミノ酸残基へ変化する変異を含む。なし

目的

本発明はさらに、本発明の“カクテル”を用いて、セルロースおよび/またはヘミセルロースを含む植物材料を分解するための方法および処理工程を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であって、前記核酸が配列番号1の配列において、配列番号2のアミノ酸残基73をコードする核酸コドンがGGCからTACに変化し、残基73のアミノ酸グリシン(G)からチロシン(Y)へ変化している配列、を含み、前記ポリペプチドが、0.6mg/gセルロースという同一の酵素ローディングにおいて配列番号2のポリペプチドによって63%のキシロース遊離を示すアッセイと比較して68%を超える改善されたキシロース遊離率を示し、より少ない酵素ローディングにおいて配列番号2のポリペプチドによるアッセイと比較して改善されたキシロース遊離率を示す、前記核酸。

請求項2

異種核酸配列または異種ポリペプチド配列をコードする異種核酸配列をさらに含む、請求項1記載の核酸であって、前記異種ポリペプチド配列がi)異種シグナル配列、異種炭水化物結合モジュール(CBM)、異種ドッケリンドメイン、異種触媒ドメイン(CD)、またはその組合せ、を含む、または、それらからなる、ii)前記異種シグナル配列、炭水化物結合モジュールまたは触媒ドメイン(CD)が異種酵素に由来するi)の配列、を含む、または、それらからなる、または、iii)タグ、エピトープ、標的誘導ペプチド切断性配列、検出性部分または酵素、を含む、または、それらからなり、前記炭水化物結合モジュール(CBM)が、キシラン結合モジュール、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナン結合モジュール、キシログルカン特異的モジュールおよび/またはアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含む、またはそれらからなり、または、前記異種シグナル配列が、コードされたタンパク質空胞小胞体葉緑体またはデンプン顆粒誘導する、前記核酸であって、0.6mg/gセルロースという同一の酵素ローディングにおいて配列番号2のポリペプチドによって63%のキシロース遊離を示すアッセイと比較して68%を超える改善されたキシロース遊離率を示し、より少ない酵素ローディングにおいて配列番号2のポリペプチドによるアッセイと比較して改善されたキシロース遊離率を示すポリペプチドをコードする、前記核酸。

請求項3

請求項1または2記載の核酸の配列と完全に相補的な配列を有する核酸。

請求項4

請求項1〜3のいずれか1項記載の核酸を含む発現カセットベクターまたはクローニングビヒクル

請求項5

ウイルスベクタープラスミドファージファージミドコスミドフォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体を含む、請求項4記載のクローニングビヒクル。

請求項6

ウイルスベクターがアデノウイルスベクターレトロウイルスベクター、またはアデノ関連ウイルスベクターを含む、請求項5記載のクローニングビヒクル。

請求項7

人工染色体が、細菌人工染色体(BAC)、バクテリオファージP1-由来ベクター(PAC)、酵母人工染色体(YAC)または哺乳動物人工染色体(MAC)を含む、請求項5記載のクローニングビヒクル。

請求項8

請求項1から3のいずれかに記載の核酸を含むか、請求項4〜7のいずれか1項に記載の発現カセット、ベクターまたはクローニングビヒクルを含む形質転換細胞

請求項9

細胞が、細菌細胞哺乳動物細胞菌類細胞、酵母細胞昆虫細胞または植物細胞である、請求項8記載の形質転換細胞。

請求項10

請求項1〜3のいずれかに記載の核酸を含むか、請求項4〜7のいずれか1項に記載の発現カセット、ベクターまたはクローニングビヒクル、または請求項8または9に記載の形質転換細胞を含む、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物部分若しくはトランスジェニック植物種子、またはトランスジェニック非ヒト動物

請求項11

植物が、トウモロコシ植物体ソルガム植物体、ジャガイモ植物体、トマト植物体コムギ植物体、オイルシード植物体アブラナ植物体、ダイズ植物体イネ植物体オオムギ植物体牧草ワタ植物体、ヤシ植物体、ゴマ植物体、落花生植物体、ヒマワリ植物体またはタバコ植物体である、請求項10記載のトランスジェニック植物、植物の部分または植物の種子。

請求項12

トランスジェニック非ヒト動物が、マウスラットウサギヒツジブタニワトリヤギイヌまたは乳牛である、請求項10記載のトランスジェニック非ヒト動物。

請求項13

キシラナーゼ活性を有するポリペプチド若しくはペプチドであって、配列番号2の配列においてアミノ酸残基73がグリシン(G)からチロシン(Y)へ変化している配列、を含み、0.6mg/gセルロースという同一の酵素ローディングにおいて配列番号2のポリペプチドによって63%のキシロース遊離を示すアッセイと比較して68%を超える改善されたキシロース遊離率を示し、より少ない酵素ローディングにおいて配列番号2のポリペプチドによるアッセイと比較して改善されたキシロース遊離率を示す、前記ポリペプチド若しくはペプチド。

請求項14

請求項1記載の核酸によってコードされる、請求項13記載のポリペプチド若しくはペプチド。

請求項15

更に異種アミノ酸配列または異種ポリペプチド配列または異種ペプチド配列を含む請求項13記載のポリペプチド若しくはペプチドであって、前記異種アミノ酸配列または異種ポリペプチド配列または異種ペプチド配列が、異種シグナル配列、異種炭水化物結合モジュール(CBM)、異種ドッケリンドメイン、異種触媒ドメイン(CD)、またはその組合せを含む、またはそれからなる、前記異種シグナル配列、炭水化物結合モジュールまたは触媒ドメイン(CD)が異種酵素に由来する、または、前記異種アミノ酸配列または異種ポリペプチド配列または異種ペプチド配列が、タグ、エピトープ、標的誘導ペプチド、切断性配列、検出性部分または酵素の配列を含む、または、それからなり、前記異種炭水化物結合モジュール(CBM)がキシラン結合モジュール、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナン結合モジュール、キシログルカン特異的モジュールおよび/またはアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含む、またはこれからなる、または、前記異種シグナル配列が、コードされたタンパク質を空胞、小胞体、葉緑体またはデンプン顆粒へ誘導する、前記ポリペプチドまたはペプチドであって、0.6mg/gセルロースという同一の酵素ローディングにおいて配列番号2のポリペプチドによって63%のキシロース遊離を示すアッセイと比較して68%を超える改善されたキシロース遊離率を示し、より少ない酵素ローディングにおいて配列番号2のポリペプチドによるアッセイと比較して改善されたキシロース遊離率を示す、前記ポリペプチドまたはペプチド。

請求項16

請求項13記載のポリペプチドまたはペプチドを含む、液体固体またはゲルを含むタンパク質調製物、または、請求項13項記載のポリペプチドまたはペプチドを含む固定化ポリペプチド。

請求項17

請求項13項記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。

請求項18

モノクローナルまたはポリクローナル抗体または単鎖抗体である、請求項17記載の抗体。

請求項19

キシラナーゼ活性を有するポリペプチドを利用する方法であって、前記ポリペプチドが請求項13記載のポリペプチドまたはペプチドを含む、または、前記ポリペプチドが請求項1または2記載の核酸によってコードされるか、または酵素的活性なそのフラグメントを含み、(a)キシラン-、セルロース-、またはヘミセルロース-含有組成物加水分解液化、分解または破壊する条件下で前記ポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントをキシラン-、セルロース-、またはヘミセルロース-含有組成物と接触させる工程を含む、キシラン-、セルロース-、またはヘミセルロース-含有組成物を加水分解、液化、分解または破壊する方法;(b)組成物が、植物細胞または細菌細胞を含む、(a)の方法(c)紙もしくは紙製品、木材、木材パルプもしくは木材製品、またはリサイクル木材もしくは紙組成物を前記ポリペプチドまたはそれらの酵素的に活性な断片と接触させることを含む、紙もしくは紙製品、紙廃棄物、木材、木材パルプもしくは木材製品、またはリサイクル木材もしくは紙組成物中のリグニン量を減少(脱リグニン化)させるかまたはリグニンを可溶化する方法;(d)バイオマス、木材、木材製品、紙パルプ、紙製品または紙廃棄物を前記ポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントと接触させることを含む、バイオマス、木材、木材製品、紙パルプ、紙製品または紙廃棄物中のセルロース、ヘミセルロースまたはキシランを加水分解する方法;(e)紙、または亜麻パルプを、前記ポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメント、および脱色剤、と接触させることを含む、紙、麻または亜麻パルプを酵素的に脱色する方法;(f)脱色剤が酸素または過酸化水素を含む、(e)の方法;(g)リグノセルロースパルプを前記ポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントと接触させることを含む、リグノセルロースパルプを脱色する方法;(h)紙、紙廃棄物、リサイクル紙製品非接触印刷された紙廃棄物または接触印刷された紙廃棄物を、前記ポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントと接触させることを含む、紙、紙廃棄物、リサイクル紙製品の酵素的脱インク、非接触印刷された紙廃棄物または非接触印刷された紙廃棄物と接触印刷された紙廃棄物の混合物トーナーの酵素的脱インク方法;(i)新聞紙をポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントと接触させることを含む、新聞紙を脱色または脱インクする方法;または、(j)木材若しくは木材製品、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプから選ばれる組成物中のリグニンを減少させる方法であって、前記ポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントを前記組成物と接触させることを含む、前記方法、を含む、前記方法。

請求項20

請求項13記載のポリペプチドの少なくとも1つまたは請求項1または2記載の核酸によってコードされるポリペプチドの少なくとも1つ、および1つ以上の他の酵素を含む酵素混合物またはカクテルであって、前記1以上の他の酵素が、別のキシラナーゼマンナナーゼおよび/またはグルカナーゼセルラーゼリパーゼエステラーゼプロテアーゼ、またはエンドグリコシダーゼエンド-ベータ-1,4-グルカナーゼ、ベータ-グルカナーゼ、エンド-ベータ-1,3(4)-グルカナーゼ、クチナーゼペルオキシダーゼカタラーゼラッカーゼアミラーゼグルコアミラーゼペクチナーゼレダクターゼオキシダーゼフェノールオキシダーゼリグニナーゼプルラナーゼアラビナナーゼ、ヘミセルラーゼキシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼラムガラクツロナーゼガラクタナーゼペクチンリアーゼペクチンメチルエステラーゼセロビオヒドロラーゼおよび/またはトランスグルタミナーゼである、前記酵素混合物またはカクテル。

請求項21

請求項13記載の少なくとも1つのポリペプチドまたは請求項1または2記載の核酸によってコードされるポリペプチド若しくは酵素的に活性なそのフラグメント、請求項20記載の酵素混合物またはカクテル、またはこれらの組み合わせ、の使用を含む、任意の有機化合物、植物または木材もしくは木材製品もしくは副産物木材廃棄物、紙パルプ、紙製品もしくは紙廃棄物もしくは副産物中のキシラン、セルロースまたはヘミセルロースを加水分解する方法。

請求項22

(i)アルコール、および、(ii)請求項13記載の少なくとも1つのポリペプチドまたは請求項1または2記載の核酸によってコードされるポリペプチド若しくは酵素的に活性なそのフラグメント、請求項20記載の酵素混合物またはカクテル、またはこれらの組み合わせ、を含む液体組成物であって、前記アルコールが、エタノールプロパノールブタノールおよび/またはメタノールである前記液体組成物、または、燃料バイオ燃料合成液体または気体または合成ガスに含まれる、前記液体組成物。

請求項23

エンドグルカナーゼオリゴメラーゼI(ベータ-グルコシダーゼ)、CBH1(GHファミリー7)、CBH2(GHファミリー6)、キシラナーゼ(GHファミリー11)、アラビノフラノシダーゼ、キシラナーゼ(GHファミリー10)、およびオリゴメラーゼII(ベータ-キシロシダーゼ)を含む、請求項20記載の酵素混合物またはカクテル。

技術分野

0001

連邦政府支援研究で得られた発明の権利に関する記載
本発明は、エネルギー局により提供された契約番号DOE1435-04-03-CA-70024により部分的に政府の支援を受けて達成された。政府は本発明において一定の権利を有しえる。
関連出願の相互引用
本出願は、仮出願US Serial No. 60/977,348(2007年10月3日出願)の優先権を主張する。前記文書の内容は引用により本明細書に含まれる。
EFS-WEBにより提出した配列表に関する照会
本出願は、MPEP§1730 II.B.2.(a)(A)で認可および規定されたUSPTO EFS-WEBサーバーを介して電子出願され、本電子出願は電子提出の配列表を含む(前記配列表の全内容は参照により本明細書に含まれる)。配列表は、電子出願テキストファイルで確認される:

0002

本発明は、一般的には酵素、前記酵素をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用に関し、より具体的には、キシラナーゼ活性(例えばエンドグルカナーゼ活性)を有するか、および/または内部β-1,4-キシロシド結合またはエンド-β-1,4-グルカナーゼ結合の加水分解触媒する酵素;および/または直鎖多糖類ベータ-1,4-キシランキシロースに分解する酵素;またはグルカナーゼ活性(例えばエンドグルカナーゼ活性)を有する、例えば内部エンド-β-1,4-および/または1,3-グルカナーゼ結合の加水分解を触媒する酵素、キシラナーゼ活性および/またはマンナナーゼ活性を有する酵素に関する。したがって、本発明は、ヘミセルロース植物細胞壁の主要成分)の分解のための方法および処理工程を提供し、前記方法および処理工程は、任意の有機化合物、植物または木材もしくは木材製品もしくは副産物木材廃棄物紙パルプ紙製品もしくは紙廃棄物もしくは副産物中のヘミセルロースの加水分解のための方法および処理工程を含む。本発明はさらに、本発明の“カクテル”を用いて、セルロースおよび/またはヘミセルロースを含む植物材料を分解するための方法および処理工程を提供する。

背景技術

0003

キシラナーゼ(例えばエンド-1,4-ベータ-キシラナーゼ、EC3.2.1.8)は、キシランの内部β-1,4-キシロシド結合を加水分解して、より小さな分子量のキシロース及びキシロオリゴマーを生成する。キシランは、1,4-β-グリコシド結合D-キシロピラノースから形成される多糖類である。キシラナーゼは産業的価値が高く、食品工業で焼成並びに果実及び野菜の加工のために、動物用飼料の製造並びにパルプ及び紙の製造で農業廃棄物の分解のために用いられる。キシラナーゼは菌類および細菌によって生成される。
アラビノキシラン穀類の主要な非デンプン多糖類であり、種類及び生長条件により2.5−7.1%w/wを占める。この多糖類の物理化学的特性は、酸化条件下粘稠溶液または場合によってゲルを生じるようなものである。さらにまた、アラビノキシランは水と高い結合能力を有し、タンパク質の泡の安定性役割を果たす。これらの特徴のいずれも、醸造、焼成、動物飼料および紙の製造を含むいくつかの産業に対し問題を与えている。醸造で用いられる場合、キシランの存在は、麦汁ろ過性及び混濁の形成に関する問題をもたらす。焼成用途(特にクッキー及びクラッカー)では、これらのアラビノキシランは粘着性生地を生じ、このような生地は機械製造が困難でありビスケットのサイズを低下させる。さらにまた、この炭水化物焼成生成物の急速な再水和関与し、ぱりっとした硬さを失わせ保存期間を短くする。穀物飼料を用いる単胃動物用飼料の用途の場合、アラビノキシランは、腸内容物粘性に対する主要な関与因子であり、したがって飼料の消化及び動物成長速度に悪影響を及ぼす。反芻動物の場合、これらの多糖類は繊維摂取の実質的成分であり、アラビノキシランのより完全な消化はより高い飼料変換効率をもたらすであろう。
紙パルプ工業(例えば酵素は65℃から75℃およびほぼpH10で活性を有する産業)では、キシラナーゼの使用がなお希求されている。さらにまた、紙パルプ工業で有用な酵素は、漂白化学物質(例えば二酸化塩素)の必要性を低下させよう。
さらにまた、バイオアルコールおよび/またはバイオ燃料(例えばバイオエタノールプロパノールブタノールおよび/またはメタノール)のバイオマス変換による効率的で低コストの処理工程および組成物の提供が希求されている。酵素または酵素“カクテル”は、バイオマスを糖(前記は続いて発酵によりバイオ燃料に生成される)に変換するルートを提供しよう。

発明が解決しようとする課題

0004

本発明は、キシラナーゼ活性(例えばエンドグルカナーゼ活性)を有するか、および/または内部β-1,4-キシロシド結合またはエンド-β-1,4-グルカナーゼ結合の加水分解を触媒する酵素;および/またはグルカナーゼ活性(例えばエンドグルカナーゼ活性)を有する、例えば内部エンド-β-1,4-および/または1,3-グルカナーゼ結合の加水分解を触媒する酵素、キシラナーゼ活性、および/またはマンナナーゼ活性を有する酵素、並びにそれらをコードする核酸、それらを含むベクターおよび細胞、これらキシラナーゼコード核酸の増幅および識別のためのプローブ、並びにこれらポリペプチドおよびペプチドを製造および使用する方法を提供する。
例えば、本発明はキシラナーゼ活性(例えばエンドキシラナーゼ活性)を有する酵素、ならびにそれらを含む組成物および方法を、内部β-1,4-キシロシド結合もしくはエンド-β-1,4-グルカナーゼ結合の加水分解、または木材、木材製品、紙パルプ、紙製品または紙廃棄物中のヘミセルロースの加水分解のために提供する。ある特徴では、キシラナーゼ活性は、キシランの加水分解を触媒する活性、例えば直鎖多糖類ベータ-1,4-キシランのキシロースへの分解を含む。したがって、本発明は、キシラン含有組成物および/またはヘミセルロース(植物の細胞壁の主要成分)を分解する方法および処理工程を提供する。

課題を解決するための手段

0005

ある特徴では、本発明のポリペプチドまたはペプチド(本発明の核酸によってコードされるタンパク質またはペプチドを含む)のグルカナーゼ活性は、エンドグルカナーゼ活性、例えばエンド-1,4-および/または1,3-ベータ-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼ活性を含む。ある特徴では、エンドグルカナーゼ活性は1,4-ベータ-D-グリコシド結合の加水分解を触媒する活性を含む。ある特徴では、グルカナーゼ(例えばエンドグルカナーゼ)活性は、エンド-1,4-および/または1,3-ベータ-エンドグルカナーゼ活性またはエンド-β-1,4-グルカナーゼ活性を含む。ある特徴では、グルカナーゼ活性(例えばエンド-1,4-ベータ-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼ活性)は、セルロース、セルロース誘導体(例えばカルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース)、リケニン中の1,4-ベータ-D-グリコシド結合、混合ベータ-1,3グルカン(例えば穀類のベータ-D-グルカン)およびセルロース部分を含む他の植物材料中のベータ-1,4結合の加水分解を含む。ある特徴では、グルカナーゼ、キシラナーゼ、またはマンナナーゼ活性は、グルカンまたは他の多糖類を加水分解してより小さな分子量の多糖類またはオリゴマーを生成することを含む。ある特徴では、グルカンはベータ-グルカン(例えば水溶性ベータ-グルカン)を含む。
本発明は、任意の有機材料(細胞、植物および/または木材もしくは木材製品、木材廃棄物、紙パルプ、紙製品もしくは紙廃棄物または副産物を含む)中のヘミセルロースを加水分解するための酵素、組成物、方法および処理工程を提供する。本発明はさらに、本発明の“カクテル”を用いて、セルロースおよび/またはヘミセルロースを含む植物材料を単純な糖に分解するための方法および処理工程を提供する。

0006

別の特徴では、本発明は、リグノセルロース分解活性リグノセルロース性活性)、例えばリグニン分解性およびセルロース分解性活性(例えばヒドロラーゼ活性、例えばグリコシルヒドロラーゼ活性(セルラーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼおよび/またはマンナナーゼ活性を含む)を有する活性を含む)を有するポリペプチド、ならびにそれらをコードする核酸、ならびにそれらを製造および使用する方法を提供する。本発明は、任意のバイオマス(例えばリグノセルロース性残留物)の発酵性糖または多糖類へのバイオ変換用酵素を提供し、さらにこれらの糖または多糖類を、アルコール(例えばエタノール、プロパノール、ブタノールおよび/またはメタノール)の製造、燃料(例えばバイオ燃料、例えば合成の液体または気体(例えば合成ガス))の製造、および他の発酵生成物(例えばコハク酸乳酸または酢酸)の製造のためのケミカルフィードストックとして用いることができる。本発明の酵素は、バイオ変換および他の工業的処理工程に持続的にバッチ法または補給バッチ法によって添加することができる。別の特徴では、本発明の酵素はバイオ変換および他の工業的処理工程で再生利用し、それによって酵素要求を削減することができる。
ある特徴では、本発明の酵素は高い触媒速度を有し、基質(例えばリグノセルロース性残留物、セルロース、バガス)の加水分解処理工程が改善される。触媒速度におけるこの効率の増加は糖または多糖類の製造効率の増加をもたらし、これは工業的、農業的または医学的利用で、例えばバイオ燃料またはアルコール(例えばエタノール、プロパノール、ブタノールおよび/またはメタノール)の製造で有用でありえる。ある特徴では、本発明の酵素を用いた加水分解によって製造された糖を、微生物によるアルコール(例えばエタノール、プロパノール、ブタノールおよび/またはメタノール)製造および/または燃料(例えばバイオ燃料)製造に用いることができる。さらにまた、本発明の酵素を用いた加水分解によって製造された糖を、微生物による他の発酵生成物(例えばコハク酸、乳酸または酢酸)の製造に用いることができる。

0007

本発明は、酵素コストの低い本発明の酵素を用いて、工業的、農業的または医学的な利用、例えばバイオマスからバイオ燃料への変換処理工程でコストが削減された、例えばバイオマスからバイオ燃料(例えばエタノール、プロパノール、ブタノールおよび/またはメタノール)への変換を提供する。したがって、本発明は、バイオアルコール、バイオ燃料および/またはバイオ燃料(例えばバイオエタノール、プロパノール、ブタノールおよび/またはメタノール)含有組成物(合成の液体または気体燃料(バイオアルコールを含む)を含む)を任意のバイオマスから製造するための効率的な処理工程を提供する。
ある特徴では、本発明の酵素(本発明の酵素“カクテル”を含む(“カクテル”は本発明の少なくとも1つの酵素を含む酵素の混合物を意味する))を用いて、リグノセルロース性バイオマスの主要成分またはセルロースおよび/またはヘミセルロースを含有する任意の組成物(リグノセルロース性バイオマスはまたリグニンを含む)を加水分解する。前記任意の組成物は例えば以下である:種子、穀粒塊茎植物廃棄物(例えば干し草またはわら(例えば稲わらまたは麦わら)、または任意の穀物植物の任意の乾燥)、または植物加工もしくは工業加工の副産物(例えば茎)、トウモロコシ穂軸、飼い葉用茎葉などを含む)、牧草(例えばインアングラス、例えばソルガスツルム・ヌータンス(Sorghastrum nutans)、またはスイッチグラス、例えばパニクム種、例えばパニクム・ヴィルガツム(Panicum virgatum))、木材(木材チップ、加工廃棄物、例えば木材廃棄物を含む)、紙、パルプ、リサイクル紙(例えば新聞紙)。前記にはまた以下が含まれる:単子葉類または双子葉類、または単子葉類のトウモロコシ、サトウキビもしくはその部分(例えば茎頭)、イネ、コムギオオムギ、スイッチグラスまたはミスカンタス(Miscanthus)、または単子葉類のオイルシード作物ダイズキャノーラアブラナ、アマ、ワタパームオイルサトウダイコン落花生樹木ポプラまたはルピナス、または木材もしくは木材加工副産物、例えば木材廃棄物(例えば木材加工、パルプおよび/または製紙工業織物製造並びに家庭用および工業用洗剤および/またはバイオマス廃棄物加工で使用される)。

0008

ある特徴では、本発明の酵素を用いて、直鎖のβ-1,4-結合グルコースを含むセルロース、および/または植物間で異なる複雑な構造としてのヘミセルロースが加水分解される。ある特徴では、本発明の酵素を用いて、アラビノースガラクトースグルクロン酸および/またはマンノース周期的な分枝を有するβ-1,4-結合キシロース分子の骨格を含むヘミセルロースが加水分解される。ある特徴では、本発明の酵素を用いて、非炭水化物の構成成分、例えばキシロースのアセチル基およびアラビノースのフェルラ酸エステルを含むヘミセルロースが加水分解される。ある特徴では、本発明の酵素を用いて、リグニンと共有結合したヘミセルロースおよび/またはジフェルレー架橋を介して他のヘミセルロースと共役したヘミセルロースが加水分解される。
ある特徴では、本発明の組成物および方法はバイオマスの酵素消化で用いられ、多くの種々の酵素(セルラーゼおよびヘミセルラーゼを含む)の使用が含まれえる。本発明の実施に用いるリグノセルロース性酵素は、セルロースをモノマー糖(グルコースを含む)に消化することができる。ある特徴では、本発明の実施に用いる組成物は酵素の混合物を含むことができ。前記酵素は、例えばグリコシルヒドロラーゼ、グルコースオキシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ(例えばβ-キシロシダーゼ)、セロビオヒドロラーゼおよび/またはアラビノフラノシダーゼ、またはヘミセルロースをモノマー糖に消化することができる他の酵素である。本発明の混合物は、本発明の酵素のみを含むか(または前記のみから成る)、または本発明の少なくとも1つの酵素および他の酵素(リグノセルロース性酵素でもおよび/または任意の他の酵素でもよい)を含むことができる。
ある特徴では、本発明の酵素は、グルカナーゼ活性、例えばエンドグルカナーゼ活性を有し、例えば内部エンド-β-1,4-および/またはβ-1,3-グルカナーゼ結合の加水分解を触媒する。ある特徴では、エンドグルカナーゼ活性(例えばエンド-β-1,4-β-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼ活性)は、セルロース、セルロース誘導体(例えばカルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース)、リケニン中の1,4-および/またはβ-1,3-ベータ-D-グリコシド結合、混合ベータ-1,3グルカン(例えば穀類のベータ-D-グルカンまたはキシログルカン)およびセルロース性部分を含む他の植物材料中のベータ-1,4結合の加水分解を含む。

0009

また別の実施態様では、本発明は、少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有し、さらにそのキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持するポリペプチド(およびそれらをコードする核酸)を提供するが、その場合に、前記少なくとも1つの保存的アミノ酸置換は同様な特性を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含むか;または保存的置換は、脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸による置換、セリンスレオニンによる置換またはその逆の置換、酸性残基の別の酸性残基による置換、アミド基を保有する残基のまた別のアミド基保有残基による置換、塩基性残基の別の塩基性残基との交換、または芳香族残基の別の芳香族残基による置換を含む。
また別の実施態様では、本発明は、キシラナーゼ(例えばエンドキシラナーゼ)、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するが、シグナル配列プレプロドメインドッケリンドメイン、および/または炭水化物結合モジュール(CBM)を欠くポリペプチド(およびそれらをコードする核酸)を提供し、さらにある特徴では、炭水化物結合モジュール(CBM)は、キシラン結合モジュール、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナンセ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュールおよび/またはアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含む(または前記から成る)。
また別の実施態様では、本発明は、キシラナーゼ(例えばエンドキシラナーゼ)、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有しさらに異種配列を含むポリペプチド(およびそれらをコードする核酸)を提供し、ある特徴では、前記異種配列は、(i)異種シグナル配列、異種炭水化物結合モジュール、異種ドッケリンドメイン、異種触媒ドメイン(CD)、またはその組合せをコードする配列;(ii)(ii)の配列で、前記異種シグナル配列、炭水化物結合モジュールまたは触媒ドメイン(CD)が異種酵素に由来する前記配列;または(iii)タグ、エピトープ、標的誘導ペプチド切断性配列、検出性部分または酵素を含み(または前記から成り)、さらにある特徴では、前記異種炭水化物結合モジュール(CBM)は、キシラン結合モジュール、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナンセ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュールおよび/またはアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含み(または前記から成り)、さらにある特徴では、前記異種シグナル配列は、コードされたタンパク質を空胞小胞体葉緑体またはデンプン顆粒誘導する。

0010

本発明は、以下を含む単離、合成または組換え核酸を提供する:
(a)少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記核酸が、以下の(i)または(ii)と少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは前記を超えるか、または完全な(100%)配列同一性を有する配列を含み、ここで(i)または(ii)の核酸は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードするか、またはキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ特異的抗体を生成することができるポリペプチドまたはペプチド(エピトープまたは免疫原として機能するポリペプチドまたはペプチド)をコードする、前記核酸:
(i)表1に示す1つまたは2つ以上のヌクレオチド残基変化(またはその等価物)を有するか、または以下の括弧内のヌクレオチド残基変化(アミノ酸残基4をコードするコドンACCからAACに変化;アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからCGCに変化;アミノ酸残基4をコードするコドンACCからCACに変化;アミノ酸残基9をコードするコドンがCCCからGACに変化;アミノ酸残基17をコードするコドンがTTCからGTCに変化;アミノ酸残基21をコードするコドンがTTCからTACに変化;アミノ酸残基33をコードするコドンがCTGからGCGに変化;アミノ酸残基38をコードするコドンがCGTからCACに変化;アミノ酸残基44をコードするコドンがAGCからACGに変化;アミノ酸残基63をコードするコドンがATCからGTCに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからTACに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからGAGに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからGTCに変化;アミノ酸残基108をコードするコドンがTTCからAAGに変化;アミノ酸残基125をコードするコドンがCAGからTACに変化;アミノ酸残基150をコードするコドンがGTAからGCCに変化;アミノ酸残基188をコードするコドンがAGCからGAGに変化;および/またはアミノ酸残基189をコードするコドンがTCCからCAGに変化)の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、もしくは18個、または前記残基変化のいくつかもしくは全部を有する配列番号:1の核酸(ポリヌクレオチド)配列;または
(ii)配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21または配列番号:23の核酸(ポリヌクレオチド)配列;
(b)(a)の核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記配列同一性が、(A)配列比較アルゴリズムを用いる分析または目視精査によって、(B)cDNA転写物mRNA)または遺伝子の少なくとも約20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150もしくはそれより大きい残基または完全長にわたって決定される、前記核酸;
(c)(a)または(b)の核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記配列比較アルゴリズムがBLASTヴァージョン2.2.2アルゴリズムであり、フィルタリングの設定がblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、さらに他の全てのオプション規定値に設定される、前記核酸;
(d)少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記核酸は、ストリンジェントな条件下で、表1に示す1つまたは2つ以上のヌクレオチド残基変化(またはその等価物)を有するか、または以下の括弧内のヌクレオチド残基変化(アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからAACに変化;アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからCGCに変化;アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからCACに変化;アミノ酸残基9をコードするコドンがCCCからGACに変化;アミノ酸残基17をコードするコドンがTTCからGTCに変化;アミノ酸残基21をコードするコドンがTTCからTACに変化;アミノ酸残基33をコードするコドンがCTGからGCGに変化;アミノ酸残基38をコードするコドンがCGTからCACに変化;アミノ酸残基44をコードするコドンがAGCからACGに変化;アミノ酸残基63をコードするコドンがATCからGTCに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからTACに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからGAGに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからGTCに変化;アミノ酸残基108をコードするコドンがTTCからAAGに変化;アミノ酸残基125をコードするコドンがCAGからTACに変化;アミノ酸残基150をコードするコドンがGTAからGCCに変化;アミノ酸残基188をコードするコドンがAGCからGAGに変化;および/またはアミノ酸残基189をコードするコドンがTCCからCAGに変化)の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、もしくは18個、またはいくらかもしくは全部を有する、配列番号:1の核酸(ポリヌクレオチド)配列を含む核酸とハイブリダイズする配列を含み、ここで、前記ポリペプチドまたはペプチドはキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するか、またはキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ特異的抗体を生成することができ(ポリペプチドまたはペプチドはエピトープまたは免疫原として機能する)、さらに前記ストリンジェントな条件は、0.2 XSSCにて約65℃の温度で約15分間の洗浄を含む洗浄工程を含む、前記核酸;
(e)少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記核酸がストリンジェントな条件下で、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21または配列番号:23とハイブリダイズする配列を含み、さらに前記ストリンジェントな条件は、0.2 X SSCにて約65℃の温度で約15分間の洗浄を含む洗浄工程を含む、前記核酸;
(f)遺伝子または転写物の少なくとも約20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150もしくはそれより大きいヌクレオチド残基の長さまたは完全長を有する(a)から(d)のいずれかの核酸(ポリヌクレオチド);
(g)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記ポリペプチドが配列番号:2の配列またはその酵素的に活性なフラグメントを含み、以下のアミノ酸残基変化の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、もしくは18個、またはいくらかもしくは全部を有する、前記核酸;
(h)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記ポリペプチドが配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24またはその酵素的に活性なフラグメントの配列を含む、前記核酸;
(i)(A)(a)から(h)のいずれかの核酸(ポリヌクレオチド)であって、少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有し、さらにキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持するポリペプチドをコードする、前記核酸(ポリヌクレオチド);または(B)(i)(A)の核酸であって、前記少なくとも1つの保存的アミノ酸置換が、同様な特性を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含むか、または保存的置換が、脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸による置換、セリンのスレオニンによる置換またはその逆の置換、酸性残基の別の酸性残基による置換、アミド基を保有する残基のまた別のアミド基保有残基による置換、塩基性残基の別の塩基性残基との交換、または芳香族残基の別の芳香族残基による置換を含む、前記核酸;
(j)(a)から(i)のいずれかであって、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するが、シグナル配列、プレプロドメイン、ドッケリンドメイン、および/または炭水化物結合モジュール(CBM)を欠くポリペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド);
(k)(j)の核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記炭水化物結合モジュール(CBM)が、キシラン結合モジュール、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナンセ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュールおよび/またはアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含む(または前記から成る)、前記核酸;
(l)(a)から(k)のいずれかであって、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有し、さらに異種配列を含むポリペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド);
(m)(l)の核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記異種配列が、(A)異種シグナル配列、異種炭水化物結合モジュール、異種ドッケリンドメイン、異種触媒ドメイン(CD)、またはその組合せをコードする配列を含む(または前記から成る)か、;(B)(l)の配列であって、前記異種シグナル配列、炭水化物結合モジュールまたは触媒ドメイン(CD)が異種酵素に由来するか;または(C)前記異種配列がタグ、エピトープ、標的誘導ペプチド、切断性配列、検出性部分または酵素を含む(または前記から成る)、前記核酸;
(n)(l)の核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記異種炭水化物結合モジュール(CBM)が、キシラン結合モジュール、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナンセ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュールおよび/またはアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含む(または前記から成る)、前記核酸;
(o)(l)の核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記異種シグナル配列が、コードされたタンパク質を空胞、小胞体、葉緑体またはデンプン顆粒へ誘導する、前記核酸;または
(p)(a)から(o)のいずれかの配列と十分に(完全に)相補的である核酸配列(ポリヌクレオチド)。

0011

本発明は、キシラナーゼ(例えばエンドキシラナーゼ)、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチド(前記ポリペプチドは、本明細書および表1に記載の1つまたは2つ以上の変化を有する、配列番号:2に示す配列を有する)またはその酵素的に活性なフラグメントをコードする核酸を含む単離、合成または組換え核酸を提供し、前記には、本明細書および表1および配列表に記載の配列(これらの配列のいずれも“本発明の例示的酵素/ポリペプチド”である)、および酵素的に活性なその部分配列(フラグメント)および/またはその免疫学的に活性な部分配列(例えばエピトープまたは免疫原)(いずれも“本発明のペプチド”)、およびその変種が含まれる(これらの配列の全てが本発明のポリペプチドおよびペプチド配列包含する)(または以下では本発明の例示的ポリペプチド配列と称される)。
本発明は、本発明のこれら全ての核酸配列に対して相補的な配列を含む単離、合成または組換え核酸を提供する(相補的な(非コード)配列およびコード配列はまた以下ではひとまとめにして本発明の核酸配列と称される)。
ある特徴では、配列同一性は、少なくとも約51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の(完全な)配列同一性(相同性)である。ある特徴では、配列同一性は、遺伝子または転写物の少なくとも約150、175、200、225、250、275、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150もしくはそれより大きい残基、または完全長に及ぶ。例えば、本発明は、本明細書に記載された(例えば表1に記載された)1つまたは2つ以上の変異を有する、配列番号:1の核酸配列(本発明の例示的ヌクレオチド配列)を含む単離、合成または組換え核酸を提供する。本発明は、本明細書に記載された(例えば表1に示された)1つまたは2つ以上のアミノ酸変化を有する、配列番号:2の配列を含むポリペプチド(本発明の例示的ポリペプチド配列)およびその酵素的に活性なフラグメントをコードする単離、合成または組換え核酸を提供する。

0012

本発明は、キシラナーゼ(例えばエンドキシラナーゼ)、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離、合成または組換え核酸を提供し、ここで、前記核酸は、本発明の例示的配列または本発明の任意の配列の少なくとも1つの配列改変を有する。
本発明は、キシラナーゼ(例えばエンドキシラナーゼ)、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離、合成または組換え核酸を提供し、ここで、前記核酸は本発明の例示的核酸の少なくとも1つの配列改変を有し、ある特徴では前記改変(変化)は表1に示される。
ある特徴では、本発明はまた、それらがキシラナーゼの新規サブセット(またはクレード)をコードするという点で共通の新規性を有する、“X14モジュール”を含む、酵素コード核酸を提供する(J Bacteriol, 2002 August, 184(15):4121-4133)。ある特徴では、本発明はまた、それらがキシラナーゼの新規なサブセット(またはクレード)をコードするという点で共通の新規性を有する、“X14モジュール”を含む、酵素コード核酸を提供する。したがって、ある特徴では、本発明は、本明細書(例えば表1)に記載の1つまたは2つ以上の変異を有する配列番号:2のキシラナーゼメンバーを含む、キシラナーゼの新規な属を提供する。
ある特徴では(場合によって)、本発明の単離、合成または組換え核酸は、キシラナーゼ(例えばエンドキシラナーゼ)、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有し、例えばこの場合、キシラナーゼ活性は内部β-1,4-キシロシド結合の加水分解を触媒する活性を含み;エンド-1,4-ベータ-キシラナーゼ活性を含み;より小さな分子量のキシロースおよびキシロオリゴマーを生成するキシランまたはアラビノキシランの加水分解活性を含み; 1,4-β-グリコシド-結合D-キシロピラノースを含む多糖類の加水分解活性を含み;セルロースまたはヘミセルロースの加水分解活性を含み;木材、木材製品、紙パルプ、紙製品または紙廃棄物中のセルロースまたはヘミセルロースの加水分解活性を含み;飼料または食品中のキシランまたはアラビノキシランの加水分解を触媒する活性を含み:または微生物細胞または植物細胞中のキシランまたはアラビノキシランの加水分解を触媒する活性を含む。ある特徴では、キシラナーゼ活性は、1,4-β-グリコシド-結合D-キシロピラノースを含む多糖類の加水分解活性、またはヘミセルロースの加水分解活性、例えば木材、木材製品、紙パルプ、紙製品または紙廃棄物中のヘミセルロースの加水分解活性を含む。ある特徴では、アラビノキシランは穀類のアラビノキシラン、例えばコムギのアラビノキシランである。

0013

ある特徴では、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は、飼料または食品、例えば穀類系動物飼料、麦芽汁もしくはビール、乳もしくは乳製品、果実または野菜中の多糖類(例えばマンナンまたはキシラン)の加水分解を触媒する活性を含む。ある特徴では、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は、微生物細胞または植物細胞中の多糖類(例えばマンナンまたはキシラン)の加水分解を触媒する活性を含む。
ある特徴では、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は熱安定性であり、例えばこの場合、ポリペプチドは、以下の温度範囲を含む条件下でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持する:約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃、またはそれより高い温度。いくつかの実施態様では、本発明の熱安定性ポリペプチドは、上記に記載の範囲の温度で、約pH3.0、約pH3.5、約pH4.0、約pH4.5、約pH5.0、約pH5.5、約pH6.0、約pH6.5、約pH7.0、約pH7.5、約pH8.0、約pH8.5、約pH9.0、約pH9.5、約pH10.0、約pH10.5、約pH11.0、約pH11.5、約pH12.0、またはそれより高いpHで活性(例えばキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性)を保持する。

0014

ある特徴では、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は耐熱性であり、例えばこの場合、ポリペプチドは、以下の範囲の温度に暴露された後でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持する:約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃、またはそれより高い温度。本発明の耐熱性ポリペプチドは、以下の範囲の温度に暴露された後で、活性(例えばキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性)を保持することができる:約-100℃から約-80℃、約-80℃から約-40℃、約-40℃から約-20℃、約-20℃から約0℃、約0℃から約5℃、約5℃から約15℃、約15℃から約25℃、約25℃から約37℃、約37℃から約45℃、約45℃から約55℃、約55℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約105℃、約105℃から約110℃、約110℃から約120℃、または95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃、111℃、112℃、113℃、114℃、115℃、またはそれより高い温度。いくつかの実施態様では、本発明の耐熱性ポリペプチドは、上記に記載の範囲の温度に暴露された後で、約pH3.0、約pH3.5、約pH4.0、約pH4.5、約pH5.0、約pH5.5、約pH6.0、約pH6.5、約pH7.0、約pH7.5、約pH8.0、約pH8.5、約pH9.0、約pH9.5、約pH10.0、約pH10.5、約pH11.0、約pH11.5、約pH12.0、またはそれより高いpHで活性(例えばキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性)を保持する。

0015

ある特徴では、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドのキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0またはそれより低い(より酸性の)pHを含む酸性条件下で活性を保持するか、または約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5、pH4.0、pH3.5、pH3.0またはそれより低い(より酸性の)pHを含む酸性条件に暴露された後で、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持するか、または約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH10、pH10.5、pH11、pH11.5、pH12、pH12.5またはそれより高い(より塩基性の)pHを含む塩基性条件下で活性を保持するか、または約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH10、pH10.5、pH11、pH11.5、pH12、pH12.5またはそれより高い(より塩基性の)pHを含む塩基性条件に暴露された後で、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持する。ある特徴では、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドのキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は、少なくとも約80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃、110℃またはそれより高い温度、および少なくとも約pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11、pH11.5、pH12、pH12.5またはそれより高い(より塩基性の)pHで活性を保持する。

0016

本発明は、本発明の配列を含む核酸を含む、発現カセットクローニングビヒクルまたはベクター(例えば発現ベクター)を提供する。クローニングビヒクルは、ウイルスベクタープラスミドファージファージミドコスミドフォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体を含むことができる。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターレトロウイルスベクター、またはアデノ関連ウイルスベクターを含むことができる。クローニングビヒクルは、細菌人工染色体(BAC)、バクテリオファージP1-由来ベクター(PAC)、酵母人工染色体(YAC)または哺乳動物人工染色体(MAC)を含む人工染色体を含むことができる。
本発明は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を識別するための核酸プローブを提供し、この場合、前記プローブは、本発明の例示的配列または(本明細書で規定した)本発明の任意の配列を含む核酸の少なくとも約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、またはそれより大きい連続する塩基を含み、ある特徴では(場合によって)、前記プローブは、少なくとも約10から300、約25から250、約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、約60から100、約50から150、またはそれより大きい連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む。
本発明は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅するための増幅プライマー対を提供し、この場合、前記プライマー対は、本発明の例示的配列もしくは(本明細書で規定した)本発明の任意の配列またはその部分配列を含む核酸を増幅することができ、場合によって増幅プラーマー配列対のメンバーは、前記配列の少なくとも約10から50の連続する塩基、または前記配列の10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35またはそれより大きい連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含む。本発明は増幅プライマー対を提供し、この場合、前記プライマー対は、本発明の例示的配列または(本明細書で規定した)本発明の任意の配列の最初の(5’側の)約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35またはそれより大きい残基によって示される配列を有する第一のメンバー、および第一のメンバーの相補鎖の最初の(5’側の)約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35またはそれより大きい残基によって示される配列を有する第二のメンバーを含む。

0017

本発明は、本発明の増幅プライマー対を用いるポリヌクレオチドの増幅によって生成されたキシラナーゼおよび/またはグルカナーゼコード核酸を提供し、この場合、場合によって前記増幅はポリメラーゼ連鎖反応PCR)による。ある特徴では、前記核酸は遺伝子ライブラリーの増幅によって生成され、ある特徴では(場合によって)、前記遺伝子ライブラリーは環境ライブラリーである。本発明は、本発明の増幅プライマー対を用いるポリヌクレオチドの増幅によって生成されたキシラナーゼおよび/またはグルカナーゼコード核酸によってコードされた単離、合成または組換えキシラナーゼおよび/またはグルカナーゼを提供する。本発明は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅する方法を提供し、前記方法は、本発明の例示的配列もしくは(本明細書で規定した)本発明の任意の配列またはその部分配列を増幅することができる増幅プライマー対配列を用いて鋳型核酸を増幅する工程を含む。
本発明は、本発明の配列を含む核酸を含む、発現カセット、ベクターまたはクローニングビヒクルを提供し、場合によって、前記クローニングビヒクルは、ウイルスベクター、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド、バクテリオファージまたは人工染色体を含む。前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノ関連ウイルスベクターを含むことができ、または人工染色体は、細菌人工染色体(BAC)、バクテリオファージP1-由来ベクター(PAC)、酵母人工染色体(YAC)または哺乳動物人工染色体(MAC)を含む。
本発明は、本発明の核酸もしくはベクター、または本発明の発現カセットもしくはクローニングビヒクルを含む形質転換細胞を提供する。前記形質転換細胞は、細菌細胞でも哺乳動物細胞でも菌類細胞でも、酵母細胞でも、昆虫細胞でもまたは植物細胞でもよい。

0018

本発明は、本発明の配列を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。前記トランスジェニック非ヒト動物は、マウスラットウサギヒツジブタニワトリヤギイヌまたは乳牛でもよい。本発明は、本発明の配列を含むトランスジェニック植物を提供し、例えばこの場合、前記植物はトウモロコシ植物体ソルガム植物体、ジャガイモ植物体、トマト植物体コムギ植物体、オイルシード植物体、アブラナ、ダイズの植物、イネ、オオムギ植物体、牧草またはタバコ植物体である。本発明は、本発明の配列を含むトランスジェニック種子を提供し、例えばこの場合、前記種子はトウモロコシの種子、コムギの穀粒、オイルシードの種子、ナタネ、ダイズ、ヤシの実、ヒマワリの種子、ゴマ、コメ、オオムギ、落花生またはタバコの種子である。
本発明は、本発明の配列(例えば本発明の例示的配列を含む)またはその部分配列と相補的であるか、または前記とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、場合によって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが約10から50、約20から60、約30から70、約40から80、または約60から100塩基であり、ある特徴では(場合によって)、前記ストリンジェントな条件は、0.2 XSSCにて約65℃の温度で約15分間の洗浄を含む洗浄工程を含む。
本発明は、細胞内のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼメッセージ翻訳阻害する方法を提供する。前記方法は、本発明の配列(例えば本発明の例示的配列を含む)と相補的であるかまたは前記配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に投与するか、または細胞で発現させる工程を含む。
本発明は、本発明の配列(例えば本発明の例示的配列を含む)の部分配列を含む、二本鎖阻害性RNA(RNAi)分子を提供する。前記二本鎖の阻害性RNA(RNAi)分子は、長さが約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29もしくは30、またはそれより大きい二重鎖ヌクレオチドでありえる。本発明は、細胞でのキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼメッセージの発現を阻害する方法を提供する。前記方法は、二本鎖の阻害性RNA(RNAi)を細胞に投与するか、または細胞で発現させる工程を含み、ここで前記RNAは本発明の配列(例えば本発明の例示的配列を含む)の部分配列を含む。

0019

本発明は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する単離、合成または組換えポリペプチド、またはキシラナーゼ(例えばエンドキシラナーゼ)、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼに特異的な免疫応答を生じることができるポリペプチド(例えばエピトープ)を提供し、その中のまた別の特徴では、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、以下の配列を含む:
(a)以下の(i)または(ii)と少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは前記より高いか、または100%の(完全な)配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで(i)または(ii)のポリペプチドまたはペプチドは、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するか、または前記ポリペプチドまたはペプチドは、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ特異的抗体を生成することができる(エピトープまたは免疫原として機能するポリペプチドまたはペプチド)、前記配列:
(i)配列番号:2または酵素的に活性なそのフラグメントのアミノ酸配列であって、表1に示す少なくとも1つのアミノ酸残基変化(またはその等価物)を有するか、または以下の括弧内のアミノ酸残基変化(アミノ酸残基4がT(またはthrまたはスレオニン)からN(またはasnまたはアスパラギン)に変化;アミノ酸残基4がT(またはthrまたはスレオニン)からR(またはargまたはアルギニン)に変化;アミノ酸残基4がT(またはthrまたはスレオニン)からH(またはhisまたはヒスチジン)に変化;アミノ酸残基9がP(またはproまたはプロリン)からD(またはaspまたはアスパラギン酸)に変化;アミノ酸残基17がF(またはpheまたはフェニルアラニン)からV(またはvalまたはバリン)に変化;アミノ酸残基21がF(またはpheまたはフェニルアラニン)からY(またはvalまたはバリン)に変化;アミノ酸残基33がL(またはleuまたはロイシン)からA(またはalaまたはアラニン)に変化;アミノ酸残基38がR(またはargまたはアルギニン)からH(またはhisまたはヒスチジン)に変化;アミノ酸残基44がS(またはserまたはセリン)からT(またはthrまたはスレオニン)に変化;アミノ酸残基63がI(またはileまたはイソロイシン)からV(またはvalまたはバリン)に変化;アミノ酸残基73がG(またはglyまたはグリシン)からY(またはtyrまたはチロシン)に変化;アミノ酸残基73がG(またはglyまたはグリシン)からV(またはvalまたはバリン)に変化;アミノ酸残基73がG(またはglyまたはグリシン)からE(またはgluまたはグルタミン酸)に変化;アミノ酸残基108がF(またはpheまたはフェニルアラニン)からK(またはlysまたはリジン)に変化;アミノ酸残基125がQ(またはglnまたはグルタミン)からY(またはtyrまたはチロシン)に変化;アミノ酸残基150がV(またはvalまたはバリン)からA(またはalaまたはアラニン)に変化;アミノ酸残基188がS(またはserまたはセリン)からE(またはgluまたはグルタミン酸)に変化;および/またはアミノ酸残基189がS(またはserまたはセリン)からQ(またはglnまたはグルタミン)に変化)の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、もしくは18個、またはいくらかもしくは全部を有する前記アミノ酸配列;または
(ii)配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22または配列番号:24のアミノ酸配列;
(b)(a)のポリペプチドまたはペプチドであって、配列同一性が、(A)配列比較アルゴリズムを用いる分析または目視精査によって、(B)前記ポリペプチドもしくはペプチドまたは酵素および/または酵素的に活性なその部分配列(フラグメント)の少なくとも約20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、150、200、250、300もしくはそれより大きいアミノ酸残基の領域にわたって、または完全長にわたって決定される、前記ポリペプチドまたはペプチド;
(c)(a)または(b)のポリペプチドまたはペプチドであって、配列同一性が配列比較アルゴリズムを用いる分析または目視精査によって決定され、さらに場合によって、前記配列比較アルゴリズムがBLASTヴァージョン2.2.2アルゴリズムであり、フィルタリングの設定がblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、さらに他の全てのオプションが規定値に設定される、前記ポリペプチドまたはペプチド;
(d)(1)の核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、前記ポリペプチドが、(i)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するか、または(ii)(a)の配列を有するポリペプチドおよび/またはその酵素的に活性なその部分配列(フラグメント)と特異的に結合する抗体を生成することができるという点で免疫原性活性を有する、前記アミノ酸配列;
(e)(a)から(d)のいずれかのアミノ酸配列であって、少なくとも1つのアミノ酸残基の保存的置換を含み、さらに前記ポリペプチドまたはペプチドがキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持する、前記アミノ酸配列;
(e)(e)のアミノ酸配列であって、保存的置換が脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸による置換、セリンのスレオニンによる置換またはその逆の置換、酸性残基の別の酸性残基による置換、アミド基を保有する残基のまた別のアミド基保有残基による置換、塩基性残基の別の塩基性残基との交換、または芳香族残基の別の芳香族残基による置換、または前記の組合せを含む、前記アミノ酸配列;
(f)(e)のアミノ酸配列であって、脂肪族残基がアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、または前記の合成等価物を含み、酸性残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、または前記の合成等価物を含み、アミド基を含む残基がアスパラギン酸、グルタミン酸、または前記の合成等価物を含み、塩基性残基がリジン、アルギニン、または前記の合成等価物を含み、芳香族残基がフェニルアラニン、チロシン、または前記の合成等価物を含む、前記アミノ酸配列;
(g)(a)から(f)のいずれかのポリペプチドであって、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するが、シグナル配列、プレプロドメイン、ドッケリンドメイン、および/または炭水化物結合モジュール(CBM)を欠く、前記ポリペプチド;
(h)(g)のポリペプチドであって、炭水化物結合モジュール(CBM)が、キシラン結合モジュール、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナンセ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュールおよび/またはアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含む(または前記から成る)、前記ポリペプチド;
(i)(a)から(h)のいずれかのポリペプチドであって、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有し、さらに異種配列を含む、前記ポリペプチド; (j)(i)のポリペプチドであって、異種配列が、(A)異種シグナル配列、異種炭水化物結合モジュール、異種ドッケリンドメイン、異種触媒ドメイン(CD)、またはその組合せを含む(または前記から成る)、前記ポリペプチド;(B)(A)の配列で、前記異種シグナル配列、炭水化物結合モジュールまたは触媒ドメイン(CD)が異種リグノセルロース性酵素に由来する前記ポリペプチド;または(C)前記異種配列がタグ、エピトープ、標的誘導ペプチド、切断性配列、検出性部分または酵素を含む(または前記から成る)、前記ポリペプチド;
(k)(i)または(j)のポリペプチドであって、前記異種配列または異種炭水化物結合モジュール(CBM)がキシラン結合モジュール、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナンセ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュールおよび/またはアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含む(または前記から成る)、前記ポリペプチド;
(l)(i)のポリペプチドであって、前記異種シグナル配列が、コードされたタンパク質を空胞、小胞体、葉緑体またはデンプン顆粒へ誘導する、前記ポリペプチド;
(m)本発明のいずれかの核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチド。

0020

ある特徴では、本発明の単離、合成または組換えペプチドはキシラナーゼ活性を有し、例えばこの場合、キシラナーゼ活性は、内部β-1,4-キシロシド結合の加水分解を触媒する活性を含み、エンド-1,4-ベータ-キシラナーゼ活性を含み、キシランまたはアラビノキシランを加水分解してより小さな分子量のキシロースおよびキシロオリゴマーを生成する作用を含み、1,4-β-グリコシド結合D-キシロピラノースを含む多糖類の加水分解を含み、セルロースまたはヘミセルロースの加水分解を含み、木材、木材製品、紙パルプ、紙製品または紙廃棄物中のセルロースまたはヘミセルロースの加水分解を含み、飼料または食品中のキシランまたはアラビノキシランの加水分解を触媒する活性を含み、または微生物細胞または植物細胞中のキシランまたはアラビノキシランの加水分解を触媒する活性を含む。
ある特徴では、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は、多糖類(例えば1,4-β-グリコシド結合D-キシロピラノースを含む)の加水分解、またはヘミセルロースの加水分解、例えば木材、木材製品、紙パルプ、紙製品または紙廃棄物中のヘミセルロースの加水分解を含む。
ある特徴では、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は、飼料または食品、例えば穀類系動物飼料、麦芽汁もしくはビール、乳もしくは乳製品、果実または野菜中の多糖類(例えばキシラン)の加水分解を触媒する活性を含む。ある特徴では、キシラナーゼ活性は、微生物細胞または植物細胞中のキシランの加水分解を触媒する活性を含む。
本発明は、本発明のポリペプチドを含み、シグナル配列またはプレプロ配列を欠く単離、合成または組換えポリペプチドを提供する。本発明は、本発明のポリペプチドを含み、さらに異種シグナル配列または異種プレプロ配列を有する単離、合成または組換えポリペプチドを提供する。

0021

ある特徴では、本発明のポリペプチドはキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有し、約37℃で約100から約1000単位/mgタンパク質、約500から約750単位/mgタンパク質、約500から約1200単位/mgタンパク質、または約750から約1000単位/mgタンパク質の範囲の比活性を含む。ある特徴では、単位は、0.1から20単位/gパルプと規定され、この場合1単位は、下記で詳細に記載するNelson Somogyiアッセイで記載されているように、基質としてアラビノキシランを用いたとき、酵素1mgにつき1分間に放出されるキシロースのμmolに等しい。また別の特徴では、本発明のポリペプチドは、約0.05から20単位/gパルプ、または0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20単位/gパルプ、または前記を超える単位/gパルプ(1単位は、Nelson Somogyiアッセイで記載されているように、基質としてアラビノキシランを用いたとき、酵素1mgにつき1分間に放出されるキシロースのμmolに等しい)の範囲のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する。
ある特徴では、耐熱性は、上昇温度、例えば約0℃から約20℃、約20℃から約37℃、約37℃から約50℃、約50℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約80℃、約80℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約110℃またはそれより高い温度に加熱した後で、37℃でのキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼの比活性の少なくとも半分が保持されることを含む。耐熱性は、上昇温度、例えば約0℃から約20℃、約20℃から約37℃、約37℃から約50℃、約50℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約80℃、約80℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約110℃またはそれより高い温度に加熱した後で、約500から約1200単位/mgタンパク質の範囲で37℃の比活性が保持されることを含むことができる。

0022

ある特徴では、本発明のポリペプチドは少なくとも1つのグリコシル化部位を含むか、さらに1つの多糖類を含む。前記グリコシル化はN-結合グリコシル化であってもよく、例えばこの場合、ポリペプチドはP.パストリス(pastoris)またはS.ポンベ(pombe)で発現された後でグリコシル化される。
ある特徴では、本発明のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は、約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5もしくはpH4または前記未満(より酸性)を含む酸性条件下で活性を保持するか、または約pH6.5、pH6、pH5.5、pH5、pH4.5もしくはpH4または前記未満(より酸性)を含む酸性条件に暴露された後でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持するか、または約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11、pH11.5、pH12、pH12.5またはそれより高いpH(より塩基性)を含む塩基性条件下で活性を保持するか、または約pH7、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11、pH11.5、pH12、pH12.5またはそれより高いpH(より塩基性)を含む塩基性条件に暴露された後でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持する。ある特徴では、本発明のポリペプチドのキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は、少なくとも約80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃または90℃の温度、および少なくとも約pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9、pH9.5、pH10、pH10.5、pH11、pH11.5、pH12、pH12.5またはそれより高い(より塩基性の)pHで活性を保持する。
本発明は、本発明のポリペプチドを含むタンパク質調製物を提供し、この場合、前記タンパク質調製物は液体、スラリーまたはゲルを含む。本発明は、本発明のポリペプチドおよび第二のドメインを含むヘテロダイマーを提供する。第二のドメインはエピトープまたはタグでもよい。本発明は、本発明のポリペプチドを含むホモダイマーまたはヘテロダイマーを提供する。本発明は固定化ポリペプチドを提供し、この場合、前記ポリペプチドは、本発明の配列もしくはその部分配列、または本発明の核酸によってコードされたポリペプチド、または本発明のポリペプチドおよび第二のドメインを含むポリペプチドを含み、例えばこの場合、前記ポリペプチドは、細胞、小胞リポソームフィルムメンブレン、金属、樹脂ポリマーセラミックガラス微小電極石墨粒子ビーズ、ゲル、プレートアレイキャピラリーチューブ結晶錠剤ピルカプセル粉末集塊、表面、多孔性構造物、または例えば木材チップ、ブラウンストック、パルプ、紙のような素材、およびそれらに由来する物質上にまたは前記の内部に固定される。

0023

本発明のキシラナーゼおよび/またはグルカナーゼは単独で、またはキシラナーゼおよび/またはグルカナーゼおよび他の加水分解酵素(例えばセルラーゼ、マンナナーゼ、プロテアーゼリパーゼアミラーゼ)またはレドックス酵素(例えばラッカーゼペルオキシダーゼカタラーゼオキシダーゼまたはレダクターゼ)の混合物(“カクテル”)として使用もしくは処方することができる。それらは、固体形(例えば粉末、凍結乾燥調製物顆粒、錠剤、バー、結晶、カプセル、ピル、ペレット)または液状形(例えば水溶液エーロゾル、ゲル、ペースト、スラリー、水性油性エマルジョンクリーム、カプセル)、または小胞もしくはミセル懸濁物として処方して用いることができる。本発明の処方物は、以下の成分のいずれかまたは組合せを含むことができる:ポリオール(例えばポリエチレングリコールポリビニルアルコールグリセロール)、糖(例えばシュクロースソルビトールトレハロース、グルコース、フラクトースマルトース、マンノース)、ゲル化剤(例えばグアゴム、カラギーナンアルギネートデキストラン、セルロース誘導体、ペクチン)、塩(例えば塩化ナトリウム硫酸ナトリウム硫酸アンモニウム塩化カルシウム塩化マグネシウム塩化亜鉛硫酸亜鉛脂肪酸および脂肪酸誘導体の塩)、金属キレート剤(例えばEDTA、EGTA、クエン酸ナトリウム)、抗菌剤(例えば脂肪酸または脂肪酸誘導体、パラベンソルベートベンゾエート)、酵素(例えばプロテアーゼ)の影響を阻止するためのまた別の調節化合物かさ上げタンパク質(例えばBSA、コムギの加水分解物ホウ酸化合物、アミノ酸またはペプチド)、適切なpHまたは温度の調節化合物、乳化剤(例えば非イオン性および/またはイオン性洗剤)、レドックス剤(例えばシスチンシステイングルタチオン酸化グルタチオン還元または抗酸化化合物(例えばアスコルビン酸)、または分散剤。架橋およびタンパク質改変(例えばPEG化)、脂肪酸改変、グリコシル化もまた酵素の安定性の改善のために用いることができる。

0024

本発明は、本発明の固定化ポリペプチドおよび/または核酸を含むアレイを提供し、さらにアレイは本発明の固定オリゴヌクレオチドを含む。酵素、そのフラグメントおよび前記酵素をコードする核酸、または本発明のプローブおよびそのフラグメントは、固体支持体に固定することができ、このような実施態様は、工業、医学、研究、製薬、食品および飼料並びに食品および飼料サプリメント加工、並びに他の適用および処理工程で本発明の酵素および核酸を使用するとき経済的および効率的でありえる。例えば、酵素(またはその活性フラグメント)のコンソーチウムまたはカクテル(特定の化学反応で用いられる)を固体支持体に付着させて、処理工程バット浸すことができ、酵素反応が発生しえる。
続いて、反復使用のために、前記固体支持体を固体支持体に固定させた酵素とともにバットから取り出すことができる。本発明のある実施態様では、単離核酸は固体支持体に固定される。本発明の別の実施態様では、固体支持体は、ゲル、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極および前記の任意の組合せの群から選択される。
例えば、本発明で有用な固体支持体にはゲルが含まれる。ゲルのいくつかの例には、セファロースゼラチングルタルアルデヒドキトサン処理グルタルアルデヒド、アルブミン-グルタルアルデヒド、キトサン-キサンタントヨパールゲルポリマーゲル)、アルギネート、アルギネート-ポリリジン、カラギーナン、アガロースグリオキシルアガロース、磁性アガロース、デキストラン-アガロース、ポリ(カルボニルスルホネート)ヒドロゲル、BSA-PEGヒドロゲルリン酸化ポリビニルアルコール(PVA)、モノアミノエチル-N-アミノエチルMANA)、アミノまたは前記の任意の組合せが含まれる。本発明で有用な別の固体支持体は樹脂またはポリマーである。樹脂またはポリマーのいくつかの例には、セルロース、アクリルアミドナイロンレーヨンポリエステル陰イオン交換樹脂、AMBERLITETM XAD-7、AMBERLITETM XAD-8、AMBERLITETM IRA-94、AMBERLITETM IRC-50、ポリビニルポリアクリルポリメタクリレート、または前記の組合せが含まれる。本発明で有用な固体支持体のまた別のタイプはセラミックである。いくつかの例には、無孔性セラミック、多孔性セラミック、SiO2、Al2O3が含まれる。本発明で有用な固体支持体のまた別のタイプはガラスである。いくつかの例には、無孔性ガラス、多孔性ガラスアミノプロピルガラス、または前記の任意の組合せが含まれる。用いることができるまた別のタイプの固体支持体は微小電極である。例はポリエチレンイミン被覆マグネタイトである。石墨粒子も固体支持体として用いることができる。固体支持体のまた別の例は細胞、例えば赤血球である。

0025

業者には公知と思われる、酵素またはそのフラグメントを固体支持体に固定するための多くの方法が存在する。そのような方法のいくつかの例には、静電気滴生成、電気化学的手段、吸着、共有結合、架橋、化学反応または処理工程、被包化、捕捉アルギン酸カルシウム、またはポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)を介するものが含まれる。同様な方法が以下に記載されている:Methodsin Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Part C. 1987. Academic Press. Edited by S.P. Colowick and N.O. Kaplan. Vol. 136;およびImmobilization of Enzymes and Cells. 1997. Humana Press. Edited by G.F. Bickerstaff. Series: Methods in Biotechnology, Edited by J.M. Walker。
本発明は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する単離、合成または組換え抗体を提供する。前記抗体はモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、または単鎖抗体でありえる。本発明は、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を含むハイブリドーマを提供する。
本発明は、以下の工程を含む、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを単離または同定する方法を提供する:(a)本発明の抗体を提供する工程;(b)ポリペプチドを含むサンプルを提供する工程;および(c)工程(b)のサンプルを工程(a)の抗体と、抗体がポリペプチドと特異的に結合することができる条件下で接触させ、それによってキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを単離または同定する工程。本発明は、抗キシラナーゼおよび/または抗グルカナーゼ抗体を作製する方法を提供する。前記方法は、非ヒト動物に本発明の核酸またはその部分配列を、液性免疫応答を発生させるために十分な量で投与し、それによって抗キシラナーゼおよび/または抗グルカナーゼ抗体を作製する工程を含む。本発明は、抗キシラナーゼおよび/または抗グルカナーゼ抗体を作製する方法を提供する。前記方法は、非ヒト動物に本発明の核酸またはその部分配列を、液性免疫応答を発生させるために十分な量で投与し、それによって抗キシラナーゼおよび/または抗グルカナーゼ抗体を作製する工程を含む。
本発明は、以下の工程を含む、組換えポリペプチドを製造する方法を提供する:(a)プロモータに作動できるように連結された核酸を提供する工程(ここで前記核酸は本発明の配列を含む);および(b)工程(a)の核酸を、ポリペプチドの発現を許容する条件下で発現させ、それによって組換えポリペプチドを製造する工程。前記方法はさらに、工程(a)の核酸で宿主細胞形質転換し、続いて工程(a)の核酸を発現させ、それによって形質転換細胞内で組換えポリペプチドを製造する工程を含むことができる。

0026

本発明は、以下の工程を含む、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを同定する方法を提供する:(a)本発明のポリペプチドを提供する工程;(b)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ基質を提供する工程;および(c)前記ポリペプチドを工程(b)の基質と接触させ、基質の量の減少または反応生成物の量の増加を検出する工程、ここで基質量が減少または反応生成物量が増加すればキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが検出される。
本発明は、以下の工程を含む、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ基質を同定する方法を提供する:(a)本発明のポリペプチドを提供する工程;(b)試験基質を提供する工程;および(c)工程(a)のポリペプチドを工程(b)の試験基質と接触させ、基質の量の減少または反応生成物の量の増加を検出する工程、ここで基質量が減少または反応生成物量が増加すれば、前記試験基質がキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ基質として同定される。
本発明は、以下の工程を含む、試験化合物がポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する方法を提供する:(a)核酸または核酸を含むベクターを、前記核酸のポリペプチドへの翻訳に許容的な条件下で発現させる工程(前記核酸は本発明の配列を有する);(b)試験化合物を提供する工程;(c)ポリペプチドを試験化合物と接触させる工程;および(d)工程(b)の試験化合物が前記ポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する工程。
本発明は、以下の工程を含む、試験化合物がポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する方法を提供する:(a)本発明のポリペプチドを提供する工程;(b)試験化合物を提供する工程;(c)ポリペプチドを試験化合物と接触させる工程;および(d)工程(b)の試験化合物が前記ポリペプチドと特異的に結合するか否かを決定する工程。

0027

本発明は、以下の工程を含む、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性の調節物質を同定する方法を提供する:(a)本発明のポリペプチドを提供する工程;(b)試験化合物を提供する工程;(c)工程(a)のポリペプチドを工程(b)の試験化合物と接触させて、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼの活性を測定する工程、この場合、前記試験化合物の非存在下での活性と比較して、前記試験化合物の存在下で測定されるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性が変化すれば、前記試験化合物はキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を調節するという決定がなされる。キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ基質を提供し、基質量の減少もしくは反応生成物量の増加、または基質量の増加もしくは反応生成物量の減少を検出することによって測定することができる。ある特徴では、試験化合物の非存在下での基質または反応生成物の量と比較して、前記試験化合物の存在下で基質量が減少または反応生成物量が増加すれば、前記試験化合物はキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性の活性化物質として同定される。ある特徴では、試験化合物の非存在下での基質または反応生成物の量と比較して、前記試験化合物の存在下で基質量が増加または反応生成物量が減少すれば、前記試験化合物はキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性の阻害物質として同定される。

0028

本発明は、プロセッサーおよびデータ保存装置を含むコンピュータシステムを提供する。前記データ保存装置にはポリペプチド配列または核酸配列が保存され、前記ポリペプチド配列は本発明の配列、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む。前記コンピュータシステムはさらに配列比較アルゴリズム、および少なくとも1つの参照配列が保存されたデータ保存装置を含むことができる。別の特徴では、前記配列比較アルゴリズムは多型性を表示するコンピュータプログラムを含む。ある特徴では、前記コンピュータシステムはさらに、前記配列における1つまたは2つ以上の特徴を識別するアイデンティファイアーを含むことができる。本発明はコンピュータ読み出し可媒体を提供し、前記媒体には、本発明のポリペプチド配列または核酸配列が保存されている。本発明は、以下の工程を含む配列の特徴を識別する方法を提供する:(a)配列内の1つまたは2つ以上の特徴を識別するコンピュータプログラムを用いて配列を読み取る工程(前記配列は本発明のポリペプチド配列または核酸配列を含む);および、(b)前記コンピュータプログラムにより配列の1つまたは2つ以上の特徴を識別する工程。本発明は、以下の工程を含む第一の配列と第二の配列を比較する方法を提供する:(a)配列を比較するコンピュータプログラムを用いて第一の配列および第二の配列を読み取る工程(前記第一の配列は本発明のポリペプチド配列または核酸配列を含む);および、(b)第一の配列と第二の配列との間の相違を前記コンピュータプログラムにより決定する工程。第一の配列と第二の配列との間の相違を決定する工程はさらに多型性を識別する工程を含むことができる。ある特徴では、前記方法はさらに、配列内の1つまたは2つ以上の特徴を識別するアイデンティファイヤーを含むことができる。ある特徴では、前記方法は、コンピュータプログラムを用いて第一の配列を読み取り、さらに配列内の1つまたは2つ以上の特徴を識別する工程を含むことができる。

0029

本発明は、以下の工程を含む、環境サンプルからキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を増幅するための増幅プライマー配列対を提供する工程(前記プライマー対は本発明の核酸を増幅することができる);(b)前記環境サンプルから核酸を単離するか、または前記サンプル内の核酸がハイブリダイゼーションのために前記増幅プライマー対に接近できるように前記環境サンプルを処理する工程;および、(c)工程(b)の核酸を工程(a)の増幅プライマー対と一緒にして前記環境サンプルの核酸を増幅し、それによって環境サンプルからキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する工程。
前記増幅プライマー配列対の一方または各メンバーは、本発明の配列の少なくとも約10から50の連続する塩基を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。ある特徴では、前記増幅プライマー配列対は本発明の増幅対である。
本発明は、以下の工程を含む、環境サンプルからキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する方法を提供する:(a)本発明の核酸配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドプローブを提供する工程;(b)前記環境サンプルから核酸を単離するか、または前記サンプル内の核酸がハイブリダイゼーションのために工程(a)のポリヌクレオチドに接近できるように前記環境サンプルを処理する工程;(c)工程(b)の単離された核酸または処理された環境サンプルを工程(a)のポリヌクレオチドプローブと一緒にし;さらに(d)工程(a)のポリヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズする核酸を単離し、それによって環境サンプルからキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を単離または回収する工程。前記環境サンプルは水サンプル液体サンプル土壌サンプル空気サンプルまたは生物学的サンプルを含むことができる。ある特徴では、前記生物学的サンプルは、細菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、菌類細胞または哺乳動物細胞に由来することができる。

0030

本発明は、以下の工程を含むキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸の変種を作製する方法を提供する:(a)本発明の核酸を含む鋳型核酸を提供する工程;(b)前記鋳型配列内の1つまたは2つ以上のヌクレオチドの改変、欠失もしくは付加、または前記の組合せを実施して前記鋳型核酸の変種を作製する工程。ある特徴では、前記方法はさらに、変種核酸を発現させて変種キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼポリペプチドを生成する工程を含むことができる。前記改変、付加または欠失は、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入アッセンブリPCR、セクシアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ(例えばGeneReassembly;例えば米国特許6,537,776号を参照されたい)、遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)、合成連結再アッセンブリ(SLR)またはそれらの組合せを含む方法により導入することができる。また別の特徴では、前記改変、付加または欠失は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学的変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限-選択変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマー生成、またはそれらの組合せを含む方法によって導入される。

0031

ある特徴では、前記方法は、鋳型核酸によってコードされるポリペプチドの活性または安定性とは変異したもしくは異なる活性または変異したもしくは異なる安定性を有するキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼが得られるまで繰り返し反復することができる。ある特徴では、前記変種キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼポリペプチドは耐熱性であり、上昇温度に暴露された後ある程度の活性を保持する。また別の特徴では、前記変種キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼポリペプチドは、鋳型核酸によってコードされるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼと比較して高度にグリコシル化されている。あるいは、前記変種キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼポリペプチドは高温下でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するが、鋳型核酸によってコードされるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは高温下で活性をもたない。ある特徴では、前記方法は、鋳型核酸のコドン使用頻度とは変異したコドン使用頻度を示すキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼコード配列が得られるまで繰り返し反復することができる。別の特徴では、前記方法は、鋳型核酸のメッセージ発現レベルまたは安定性レベルより高いまたは低いメッセージ発現レベルまたは安定性レベルを有するキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ遺伝子が得られるまで前記方法を繰り返し反復することができる。また別の特徴では、最終的なキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ生成物を処方することによって、製品中のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼの性能の向上または改変が可能になる。

0032

本発明は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変して宿主細胞におけるその発現を高める方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供する工程;および、(b)工程(a)の核酸の非優先コドンまたは低優先コドンを識別し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドンまたは中立的に使用されるコドンに置換し、それによって核酸を改変して宿主細胞における前記の発現を増加させる工程(前記優先コドンとは宿主細胞の遺伝子内のコード配列において高頻度提示されるコドンであり、前記非優先コドンまたは前記低優先コドンとは宿主細胞の遺伝子内のコード配列において低頻度で提示されるコドンである)。
本発明は、以下の工程を含む、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変する方法を提供する:(a)本発明の核酸を提供する工程;および、(b)工程(a)の核酸のコドンを識別し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする異なるコドンで置換し、それによってキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼをコードする核酸内のコドンを改変する工程。
本発明は、以下の工程を含む、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変して宿主細胞でその発現を高める方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼポリペプチドをコードする本発明の核酸を提供する工程;および、(b)工程(a)の核酸内の非優先コドンまたは低優先コドンを識別し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする優先コドンまたは中立的に使用されるコドンで置換し(優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度で提示されるコドンであり、前記非優先または前記低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度で提示されるコドンである)、それによって前記核酸を改変して宿主細胞におけるその発現を高める工程。
本発明は、以下の工程を含む、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸内のコドンを改変して宿主細胞でその発現を低下させる方法を提供する:(a)本発明の核酸を提供する工程;さらに(b)工程(a)の核酸内の少なくとも1つの優先コドンを識別し、前記コドンを置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする非優先コドンまたは低優先コドンで置換し(前記優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において高頻度提示されるコドンであり、前記非優先または前記低優先コドンは宿主細胞の遺伝子のコード配列において低頻度提示されるコドンである)、それによって前記核酸を改変して宿主細胞におけるその発現を低下させる工程。ある特徴では、前記宿主細胞は細菌細胞、菌類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞または哺乳動物細胞でありえる。

0033

本発明は、複数の改変キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性部位または基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製する方法を提供する(前記改変活性部位または基質結合部位は、第一の活性部位または第一の基質結合部位をコードする配列を含む第一の核酸に由来する)。前記方法は以下の工程を含む:(a)第一の活性部位または第一の基質結合部位をコードする第一の核酸を提供する工程(前記第一の核酸配列は本発明の配列またはその部分配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含み、前記核酸はキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性部位またはキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ基質結合部位をコードする);(b)天然に存在するアミノ酸変種をコードする一組の変異導入オリゴヌクレオチドを前記第一の核酸の複数の標的コドンに対して提供する工程;(c)前記一組の変異導入オリゴヌクレオチドを用いて、アミノ酸コドンの各々において一連のアミノ酸変種をコードする、変異導入された一組の活性部位コード変種核酸または基質結合部位コード変種核酸を生成し、それによって複数の改変キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性部位または基質結合部位をコードする核酸のライブラリーを作製する工程。ある特徴では、前記方法は、最適化定方向進化ステム、遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)、または合成連結再アッセンブリ(SLR)を含む方法によって、工程(a)の第一の核酸に変異導入する工程を含む。ある特徴では、前記方法は、変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ(GeneReassembly;米国特許6,537,776号)、遺伝子部位飽和変異導入(GSSM)、合成連結再アッセンブリ(SLR)およびそれらの組合せを含む方法によって、工程(a)の第一の核酸または変種に変異導入する工程を含む。ある特徴では、前記方法は、組換え、再帰的配列組換え、ホスホチオエート-修飾DNA変異導入、ウラシル含有鋳型変異導入、ギャップ含有二重鎖変異導入、点ミスマッチ修復変異導入、修復欠損宿主株変異導入、化学的変異導入、放射性変異導入、欠失変異導入、制限-選択変異導入、制限-精製変異導入、人工遺伝子合成、アンサンブル変異導入、キメラ核酸マルチマー生成およびそれらの組合せを含む方法によって、工程(a)の第一の核酸または変種に変異導入する工程を含む。

0034

本発明は、以下の工程を含む小分子の製造方法を提供する:(a)小分子を合成または改変することができる複数の生合成酵素を提供する工程(前記酵素の1つは本発明の核酸によってコードされるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素を含む);(b)工程(a)の酵素の少なくとも1つに対する基質を提供する工程;および(c)複数の生体触媒反応を促進する条件下で工程(b)の基質を前記酵素と反応させて一連の生体触媒反応により小分子を生成する工程。本発明は、以下の工程を含む小分子の改変方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素を提供する工程(前記酵素は本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチド、またはそれらの部分配列を含む);(b)小分子を提供する工程;および、(c)前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素によって触媒される酵素反応が促進される条件下で工程(a)の酵素を工程(b)の小分子と反応させ、それによってキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素反応により小分子を改変する工程。ある特徴では、前記方法は、工程(a)の酵素に対する複数の小分子基質を提供し、それによってキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素により触媒される少なくとも1つの酵素反応によって生成される改変小分子のライブラリーを作製することを含むことができる。ある特徴では、前記方法は、前記酵素による複数の生体触媒反応を促進する条件下で複数の酵素を追加して、複数の酵素反応によって生成される改変小分子のライブラリーを作製することを含むことができる。別の特徴では、前記方法はさらに、所望の活性を示す特定の小分子がライブラリー内に存在するか否かを決定するために前記ライブラリーを試験する工程を含むことができる。前記ライブラリーの試験工程はさらに、所望の活性を有する特定の改変小分子の有無について改変小分子の一部分を試験することによってライブラリー内の複数の改変小分子の前記一部分を生成するために用いられた生体触媒反応の1つ以外の全てを系統的に排除し、所望の活性をもつ特定の改変小分子を生成する少なくとも1つの特異的な生体触媒反応を識別する工程を含むことができる。

0035

本発明は、以下の工程を含むキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素の機能的フラグメントを決定する方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素を提供する工程(前記酵素は本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドまたはそれらの部分配列を含む);および(b)工程(a)の配列から複数のアミノ酸残基を欠失させ、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性について残余の配列を試験し、それによってキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素の機能的フラグメントを決定する工程。ある特徴では、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ基質を提供し、さらに基質の量の減少または反応生成物の量の増加を検出することによって測定される。
本発明は、リアルタイム代謝フラックス分析によって新規または改変表現型のための全細胞操作方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む:(a)細胞の遺伝的構成を改変することによって改変細胞を作製する工程(前記遺伝的構成は本発明の核酸を細胞に導入することによって改変される);(b)前記改変細胞を培養して複数の改変細胞を生成する工程;(c)工程(b)の細胞培養をリアルタイムでモニターすることによって前記細胞の少なくとも1つの代謝パラメーターを測定する工程;および、(d)工程(c)のデータを分析して、前記測定パラメーターが類似の条件下で未改変細胞の対応する測定値と異なるか否かを決定し、それによって細胞の操作された表現型をリアルタイム代謝フラックス分析により識別する工程。ある特徴では、細胞の遺伝的構成は、細胞内の配列の欠失もしくは配列の改変または遺伝子発現ノックアウトを含む方法によって改変することができる。ある特徴では、前記方法はさらに、新規に操作された表現型を含む細胞の選別を含むことができる。別の特徴では、前記方法は、選別された細胞を培養し、それによって新規に操作された表現型を含む新規な細胞株を作製することを含むことができる。

0036

本発明は、本発明のポリペプチド(本発明の例示的ポリペプチド配列を含む)の残基1から12、1から13、1から14、1から15、1から16、1から17、1から18、1から19、1から20、1から21、1から22、1から23、1から24、1から25、1から26、1から27、1から28、1から29、1から30、1から31、1から32、1から33、1から34、1から35、1から36、1から37、1から38、1から39、1から40、1から41、1から42、1から43、または1から44に示される配列から成る(または前記を含む)単離、合成または組換えシグナル配列を提供する。
本発明は、シグナルペプチド(SP)を含む少なくとも第一のドメイン、および本発明の配列またはその部分配列を含む異種ポリペプチドまたはペプチドを含む少なくとも第二のドメインを含むキメラポリペプチドを提供し、この場合、前記異種ポリペプチドまたはペプチドは前記シグナルペプチド(SP)と天然では結合していない。ある特徴では、前記シグナルペプチド(SP)はキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼに由来しない。前記異種ポリペプチドまたはペプチドは、シグナルペプチド(SP)またはキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ触媒ドメイン(CD)のアミノ末端側、カルボキシ末端側、または両末端に存在することができる。本発明は、キメラポリペプチドをコードする単離、合成または組換え核酸を提供し、この場合、前記キメラポリペプチドは、シグナルペプチド(SP)を含む少なくとも第一のドメイン、および本発明の配列またはその部分配列を含む異種ポリペプチドまたはペプチドを含む少なくとも第二のドメインを含み、前記異種ポリペプチドまたはペプチドは前記シグナルペプチド(SP)と天然では結合していない。

0037

本発明は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼポリペプチドの耐熱性または熱安定性を高める方法を提供する。前記方法は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼポリペプチド(前記ポリペプチドは本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドの連続する少なくとも30のアミノ酸を含む)をグリコシル化し、それによって前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼポリペプチドの耐熱性または熱安定性を高めることを含む。ある特徴では、前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼの比活性は、約0℃から約20℃、約20℃から約37℃、約37℃から約50℃、約50℃から約70℃、約70℃から約75℃、約75℃から約80℃、約80℃から約85℃、約85℃から約90℃、約90℃から約95℃、約95℃から約100℃、約100℃から約110℃、またはそれより高い範囲の温度で熱安定性または耐熱性でありえる。
本発明は、細胞で組換えキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼポリペプチドを過剰発現させる方法を提供する。前記方法は、本発明の核酸または本発明の核酸配列(前記配列の同一性は配列比較アルゴリズムによる分析または目視精査によって決定される)を含む核酸を含むベクターを発現させることを含み、ここで過剰発現は、高活性プロモータの使用、二シストロンベクターの使用によって、またはベクターの遺伝子増幅によって達成される。
本発明は以下の工程を含むトランスジェニック植物および種子の製造方法を提供する:(a)異種核酸配列を細胞に導入し(前記異種核酸配列は本発明の核酸配列を含む)、それによって形質転換植物または種子細胞を作製する工程;および(b)前記形質転換細胞または種子からトランスジェニック植物を作出する工程。ある特徴では、工程(a)はさらに、植物細胞プロトプラストエレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションにより異種核酸配列を導入することを含むことができる。別の特徴では、工程(a)はさらに、DNA粒子ボンバードメントによって植物組織に直接異種核酸配列を導入する工程を含むことができる。あるいは、工程(a)はさらに、アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)宿主を用いて植物細胞DNAに異種核酸配列を導入する工程を含むことができる。ある特徴では、前記植物細胞はジャガイモ、トウモロコシ、イネ、コムギ、タバコまたはオオムギ細胞でありえる。

0038

本発明は、以下の工程を含む、植物細胞で異種核酸配列を発現させる方法を提供する:(a)プロモータに作動できるように連結した異種核酸配列で植物細胞を形質転換する工程(前記異種核酸配列は本発明の核酸を含む);(b)前記異種核酸配列が前記植物細胞で発現する条件下で前記植物を生長させる工程。本発明は、以下の工程を含む、植物細胞で異種核酸配列を発現させる方法を提供する:(a)プロモータに作動できるように連結した異種核酸配列で植物細胞を形質転換する工程(前記異種核酸配列は本発明の配列を含む);(b)前記異種核酸配列が前記植物細胞で発現する条件下で前記植物を生長させる工程。
本発明は、以下の工程を含む、キシラン含有組成物を加水分解、分解または破壊する方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを提供する工程;(b)キシランを含む組成物を提供する工程;および(c)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼが前記キシラン含有組成物を加水分解、分解または破壊する条件下で工程(a)のポリペプチドを工程(b)の組成物と接触させる工程。ある特徴では、前記組成物は、植物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または動物細胞を含む。したがって、前記組成物は、任意の植物もしくは植物部分、任意のキシラン含有食品もしくは飼料、廃棄物などを含むことができる。
本発明は、以下の工程を含む、キシラン含有組成物を液化または除去する方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチド提供する工程;(b)キシランを含む組成物を提供する工程;および(c)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼが前記キシラン含有組成物を除去、軟化または液化する条件下で工程(a)のポリペプチドを工程(b)の組成物と接触させる工程。

0039

本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸配列によってコードされるポリペプチドを含む洗剤組成物を提供し、ここで前記ポリペプチドはキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する。前記キシラナーゼは非表面活性キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ、または表面活性キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼでありえる。前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは、非水性液体組成物鋳造固形物、顆粒形、粒子形、圧縮錠剤、ゲル形、ペーストまたはスラリー形として処方することができる。本発明は以下の工程を含む対象物洗浄方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する工程;(b)対象物を提供する工程;および、(c)工程(a)のポリペプチドを工程(b)の対象物と前記組成物が前記対象物を洗浄することができる条件下で接触させる工程。
本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む布地または織物(例えば糸を含む)を提供する。ある特徴では、前記布地または織物はキシラン含有繊維を含む。本発明は、以下の工程を含む、布地または織物を処理する(例えば組成物から汚れを除去する)方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチド、または本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する工程;(b)キシランを含む布地または織物を提供する工程;および(c)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼが前記布地または織物を処理する(例えば汚れを除去する)ことができる条件下で工程(a)ポリペプチドを工程(b)の組成物と接触させる工程。本発明は、以下の工程を含む、織物の仕上がりを改善する方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチド、または本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む組成物を提供する工程;(b)織物を提供する工程;および(c)前記ポリペプチドが前記織物を処理し、それによって織物の仕上がりを改善することができる条件下で工程(a)のポリペプチドを工程(b)の織物と接触させる工程。ある特徴では前記織物はウールまたはである。別の特徴では、前記織物はセルロース性繊維または天然繊維合成繊維の混合物である。

0040

本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む飼料または食品を提供する。本発明は、以下の工程を含む、動物による消費に先立って飼料または食品中のキシランを加水分解する方法を提供する:(a)本発明のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ、または本発明の核酸によってコードされるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含む飼料材料を得る工程;および(b)工程(a)のポリペプチドを前記飼料または食品材料に、キシランの加水分解および処理された食品または飼料の生成をもたらすために十分な時間、十分な量で添加し、それによって動物による消費に先立って食品または飼料中のキシランを加水分解する工程。ある特徴では、本発明は、以下の工程を含む、動物による消費の後で飼料または食品中のキシランを加水分解する方法を提供する:(a)本発明のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ、または本発明の核酸によってコードされるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含む飼料材料を得る工程;(b)工程(a)のポリペプチドを前記飼料または食品材料に添加する工程;および(c)前記飼料または食品材料を動物に与える工程(この場合、消費後に、前記動物の消化管の中でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼが前記飼料または食品中のキシランを加水分解する)。前記食品または飼料は例えば穀物、穀粒、トウモロコシなどでありえる。
本発明は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチド(前記ポリペプチドは本発明の配列を含むか、または本発明の配列を含む核酸によってコードされる)または酵素的に活性なそのフラグメントを含む生地またはパン製品を提供する。本発明は生地をコンディショニングする方法を提供する。前記方法は、生地またはパン製品を、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチド(前記ポリペプチドは本発明の配列を含むか、または本発明の配列を含む核酸によってコードされる)または酵素的に活性なそのフラグメントと、生地のコンディショニングに十分な条件下で接触させることを含む。
本発明は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチド(前記ポリペプチドは本発明の配列を含むか、または本発明の配列を含む核酸によってコードされる)を含む飲料を提供する。本発明は飲料を製造する方法を提供する。
前記方法は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチド(前記ポリペプチドは本発明の配列を含むか、または本発明の配列を含む核酸によってコードされる)または酵素的に活性なそのフラグメントを、飲料または飲料前駆材料に、飲料の粘性を低下させるために十分な条件下で添加することを含み、ある特徴では(場合によって)、前記飲料または飲料前駆材料は麦芽汁またはビールである。

0041

本発明は、本発明のポリペプチド(例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチド)を含む動物用食品または栄養サプリメントを提供する。ある特徴では、前記食品または栄養サプリメント中のポリペプチドはグリコシル化することができる。本発明は、本発明のポリペプチド(例えば本発明の核酸によってコードされるポリペプチド)を含む食用酵素デリバリーマトリックスを提供する。ある特徴では、前記デリバリーマトリックスはペレットを含む。ある特徴では、前記ポリペプチドはグリコシル化することができる。
ある特徴では、前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は耐熱性である。別の特徴では、前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性は熱安定性である。
本発明は、本発明のポリペプチドを含む食品、飼料または栄養サプリメントを提供する。本発明は、以下の工程を含む、動物の常用飼料の栄養サプリメントとしてキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを利用する方法を提供する:本発明のポリペプチドの連続する少なくとも30アミノ酸を含むキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素を含む栄養サプリメントを調製する工程;および前記栄養サプリメントを動物に与え、前記動物が摂取する飼料または食品中に含まれるキシランの利用を増進させる工程。キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素は、細菌、酵母、植物、昆虫、菌類および動物から成る群から選択される生物で、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることによって調製することができる。前記生物は、S.ポンベ(pombe)、S.セレビシアエ(cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、シュードモナス(Pseudomonas)種、大腸菌(E. coli)、ストレプトミセス種バチルス種及びラクトバチルス種からなる群から選択することができる。

0042

本発明は、熱安定性組換えキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素(例えば本発明のポリペプチド)を含む食用酵素デリバリーマトリックスを提供する。
本発明は、以下の工程を含む、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼサプリメントを動物にデリバーする方法を提供する:顆粒状の食用担体および熱安定性の組換えキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素を含むペレットの形状の食用酵素デリバリーマトリックスを調製する工程(ここで前記ペレットはその中に含まれるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素を容易に水性媒体中に分散させる)、および前記食用酵素デリバリーマトリックスを動物に与える工程。前記組換えキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素は本発明のポリペプチドを含むことができる。前記顆粒状食用担体は、穀類の胚芽脱油した(spent of oil)穀類の胚芽、干し草、アルファルファチモシー、ダイズ外皮、ヒマワリのひき割り種子およびコムギのミッド(midd)から成る群から選択される担体を含むことができる。前記食用担体は脱油した穀類の胚芽を含むことができる。キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ酵素はグリコシル化されて、ペレット化条件下で熱安定性を提供することができる。デリバリーマトリックスは、穀類の胚芽およびキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含む混合物をペレット化することによって形成することができる。前記ペレット化条件は、蒸気を当てることを含むことができる。前記ペレット化条件は約80℃を超える温度を約5分適用することを含むことができ、前記酵素は、酵素1ミリグラムにつき少なくとも350から約900単位の比活性を保持する。

0043

本発明は、以下の工程を含む、乳製品の触感および風味を改善する方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチド、または本発明の核酸によってコードされるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを提供する工程;(b)乳製品を提供する工程;(c)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼが前記乳製品の触感または風味を改善することができる条件下で、工程(a)のポリペプチドを工程(b)の乳製品と接触させる工程。
ある特徴では、前記乳製品はチーズまたはヨーグルトを含む。本発明は、本発明のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼまたは本発明の核酸によってコードされるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含む乳製品を提供する。
本発明は、以下の工程を含む、油の豊富な植物材料の油の抽出を改善する方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチド、または本発明の核酸によってコードされるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを提供する工程;(b)油の豊富な植物材料を提供する工程;および(c)工程(a)のポリペプチドを前記油の豊富な植物材料と接触させる工程。ある特徴では、前記油の豊富な植物材料は油の豊富な種子を含む。前記油はダイズ油オリーブ油、ナタネ(キャノーラ)油またはヒマワリ油などでありえる。
本発明は、以下の工程を含む、フルーツ若しくは野菜ジュースシロップピューレまたは抽出物を調製する方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチド、または本発明の核酸によってコードされるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを提供する工程;(b)果実または野菜材料を含む組成物または液体を提供する工程;および(c)工程(a)のポリペプチドおよび前記組成物を接触させ、それによってフルーツ若しくは野菜ジュース、シロップ、ピューレまたは抽出物を調製する工程。
本発明は、本発明のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼまたは本発明の核酸によってコードされるポリペプチドを含む紙もしくは紙製品、または紙パルプを提供する。本発明は、以下の工程を含む、バイオマス(例えば任意の紙または紙もしくは木材パルプ)を処理する方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチド、または本発明の核酸によってコードされるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを提供する工程;(b)組成物、例えばバイオマス(紙または紙もしくは木材パルプを含む)を提供する工程;および(c)工程(a)のポリペプチドおよび工程(b)の組成物を、前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼが前記紙または紙もしくは木材パルプを処理することができる条件下で接触させる工程。

0044

本発明は、紙もしくは紙製品、木材、木材パルプもしくは木材製品、またはリサイクル木材もしくは紙組成物を本発明のポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントと接触させることを含む、紙もしくは紙製品、紙廃棄物、木材、木材パルプもしくは木材製品、またはリサイクル木材もしくは紙組成物中のリグニン量を減少またはリグニンを可溶化する方法を提供する。
本発明は、木材、木材製品、紙パルプ、紙製品または紙廃棄物を本発明のポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントと接触させることを含む、木材、木材製品、紙パルプ、紙製品または紙廃棄物中のヘミセルロースを加水分解する方法を提供する。
本発明は、紙、または亜麻パルプをキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼおよび脱色剤(例えば漂白剤)と接触させることを含む、紙、麻または亜麻パルプを酵素的に脱色(例えば漂白)する方法を提供する。この場合、前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは、本発明のポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントを含む。前記脱色剤(例えば漂白剤)は酸素または過酸化水素を含むことができる。
本発明は、リグノセルロースパルプをキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ(前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは本発明のポリペプチドを含む)または酵素的に活性なそのフラグメントと接触させることを含む、リグノセルロースパルプを脱色(例えば漂白)する方法を提供する。
本発明は、紙、紙廃棄物、リサイクル紙製品の酵素的脱インク非接触印刷された紙廃棄物または非接触および接触印刷された紙廃棄物の混合物のトーナーの脱インクのための方法を提供する。前記方法は、紙、紙廃棄物、リサイクル紙製品、非接触印刷紙廃棄物または接触印刷紙廃棄物を、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ(前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは本発明のポリペプチドを含む)または酵素的に活性なそのフラグメントと接触させることを含む。

0045

本発明は、織物、編物糸、服地、布地をキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ(前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは本発明のポリペプチドを含む)または酵素的に活性なそのフラグメントと接触させることを含む、糸、織物、編物糸、服地または布地を脱色(例えば漂白)する方法を提供する。前記糸、織物、編物糸、服地または布地は、非木綿系セルロースの糸、織物、編物糸、服地または布地を含むことができる。本発明は、本発明の配列を有するポリペプチド、または本発明の配列を含む核酸によってコードされるポリペプチド、または酵素的に活性なそのフラグメントを含む織物、編物糸、服地または織物を提供し、ある特徴では(場合によって)、前記織物、編物糸、服地または織物は、非木綿系セルロースの織物、編物糸、服地または布地を含む。
本発明は、新聞紙をキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ(前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは本発明のポリペプチドを含む)または酵素的に活性なそのフラグメントと接触させることを含む、新聞紙を脱色(例えば漂白)または脱インクする方法を提供する。
本発明は、本発明のポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントを含む、木材、木材チップ、木材パルプ、木材製品、紙パルプ、紙製品、新聞紙または紙廃棄物を提供する。本発明は、本発明のポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントを含む、糸、織物、編物糸、服地または布地を提供する。
本発明は、木材または木材製品を、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチド(前記ポリペプチドは本発明の配列を有するか、または前記ポリペプチドは本発明の配列を含む核酸によってコードされる)または酵素的に活性なそのフラグメントと接触させることを含む、木材または木材製品中のリグニン量を減少させる方法を提供する。

0046

本発明は、バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)中のリグニンを、高温および塩基性pH下で減少させる方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントを提供する工程(この場合、前記ポリペプチドは、少なくとも約80℃、85℃、90℃またはそれより高い温度および少なくとも約pH10.5、pH11、pH12、pH12.5またはそれより高い(塩基性)pHを含む条件下でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持し、前記ポリペプチドは本発明の配列を有するキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含むか、または前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは本発明の配列を含む核酸によってコードされる);(b)リグニン含有バイオマス(例えばリグニン含有木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)を提供する工程;および(c)前記木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプを工程(a)のポリペプチドと、少なくとも約80℃、85℃、90℃またはそれより高い温度および少なくとも約pH10.5、pH11、pH12、pH12.5またはそれより高い(塩基性)pHを含む条件下で接触させる工程(この場合、前記ポリペプチドは、リグニン含有バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)中のリグニンを減少させる)。

0047

本発明は、リグニン含有バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)を高温および塩基性pHの条件下で処理する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントを提供する工程(この場合、前記ポリペプチドは、少なくとも約80℃、85℃、90℃またはそれより高い温度および少なくとも約pH10.5、pH11、pH12、pH12.5またはそれより高い(塩基性)pHを含む条件下でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持し、前記ポリペプチドは本発明の配列を有するキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含むか、または前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは本発明の配列を含む核酸によってコードされる);(b)リグニン含有バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)を提供する工程;および(c)前記木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプを工程(a)のポリペプチドと、少なくとも約80℃、85℃、90℃またはそれより高い温度および少なくとも約pH10.5、pH11、pH12、pH12.5またはそれより高い(塩基性)pHを含む条件下で接触させる工程。この場合、前記ポリペプチドは、リグニン含有バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)中の化合物の加水分解を触媒し、さらにある特徴では(場合によって)、前記木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプは軟木および硬木を含むか、または前記木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプは軟木および硬木に由来し、さらにある特徴では(場合によって)、処理後にパルプは少なくとも約10%または少なくとも約32%の粘性を有する。

0048

本発明は、バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)を高温および塩基性pHの条件下で脱色する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントを提供する工程(この場合、前記ポリペプチドは、少なくとも約80℃、85℃、90℃またはそれより高い温度および少なくとも約pH10.5、pH11、pH12、pH12.5またはそれより高い(塩基性)pHを含む条件下でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持し、前記ポリペプチドは本発明の配列を有するキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含むか、または前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは本発明の配列を含む核酸によってコードされる);(b)バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)を提供する工程;および(c)前記木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプを工程(a)のポリペプチドと、少なくとも約80℃、85℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃、110℃またはそれより高い温度、および少なくとも約pH9.5、pH10.0、pH10.5、pH11、pH12、pH12.5またはそれより高い(より塩基性の)pHを含む条件下で接触させる工程。この場合、前記ポリペプチドは、バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)中の化合物の加水分解を触媒し、それによってバイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)を脱色(例えば漂白)する。

0049

本発明は、高温および塩基性pHの条件下におけるバイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)の脱色(例えば漂白)処理工程で、脱色(例えば漂白)剤の使用を減らす方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントを提供する工程(この場合、前記ポリペプチドは、少なくとも約80℃、85℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃もしくは110℃またはそれより高い温度および少なくとも約pH10.5、pH11、pH12、pH12.5またはそれより高い(塩基性)pHを含む条件下でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持し、前記ポリペプチドは本発明の配列を有するキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含むか、または前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは本発明の配列を含む核酸によってコードされる);(b)バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)を提供する工程;および(c)前記木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプを工程(a)のポリペプチドと、少なくとも約80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃もしくは110℃またはそれより高い温度、および少なくとも約pH10.5、pH11、pH12、pH12.5またはそれより高い(塩基性)pHを含む条件下で接触させる工程。この場合、前記ポリペプチドは、バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)中の化合物の加水分解を触媒し、それによってバイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)を生物漂白し、さらに脱色(例えば漂白)処理工程での脱色(例えば漂白)剤の使用を減らし、ある特徴では(場合によって)、前記脱色(例えば漂白)剤は、塩素、二酸化塩素、焼灼剤、過酸化物または前記の任意の組合せを含む。

0050

本発明は、以下の工程を含む、高温および塩基性pHの条件下で紙またはパルプを脱インクする方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントを提供する工程(この場合、前記ポリペプチドは、少なくとも約80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃もしくは110℃またはそれより高い温度および少なくとも約pH11の塩基性pHを含む条件下でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持し、前記ポリペプチドは本発明の配列を有するキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含むか、または前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは本発明の配列を含む核酸によってコードされる);(b)インク含有バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)を提供する工程;および(c)前記バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)を工程(a)のポリペプチドと、少なくとも約85℃および少なくとも約pH11の塩基性pHを含む条件下で接触させる工程。この場合、前記ポリペプチドは、バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)中の化合物の加水分解を触媒し、それによってバイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)の脱インクを促進する。

0051

本発明は、高温および塩基性pHの条件下でバイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)からリグニンを遊離させる方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントを提供する工程(この場合、前記ポリペプチドは、少なくとも約80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃もしくは110℃またはそれより高い温度および少なくとも約pH11の塩基性pHを含む条件下でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持し、前記ポリペプチドは本発明の配列を有するキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含むか、または前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは本発明の配列を含む核酸によってコードされる);(b)リグニン含有バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)を提供する工程;および(c)工程(b)の木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプを工程(a)のポリペプチドと、少なくとも約80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃もしくは110℃またはそれより高い温度、および少なくとも約pH11の塩基性pHを含む条件下で接触させる工程。この場合、前記ポリペプチドは、木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ中の化合物の加水分解を触媒し、それによってバイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)からリグニンの遊離を促進し、ある特徴では(場合によって)、処理後に、パルプは約10%の粘性を有する。

0052

本発明は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチド(前記ポリペプチドは本発明の配列を有するか、または前記ポリペプチドは本発明の配列を含む核酸によってコードされる)または酵素的に活性なそのフラグメントを含むバイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)を含む組成物を提供し、ある特徴では(例えば場合によって)、前記バイオマス(例えば木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ)は、軟木および硬木を含むか、または前記木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプは軟木および硬木に由来する。
本発明は、デンプン含有組成物を、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチド(この場合、前記ポリペプチド本発明の配列を有するか、または前記ポリペプチドは本発明の配列を含む核酸によってコードされる)、または酵素的に活性なそのフラグメントと接触させる工程を含む、エタノールの製造方法を提供する。本発明は、エタノールおよびキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチド(前記ポリペプチドは本発明の配列を有するか、または前記ポリペプチドは本発明の配列を含む核酸によってコードされる)、または酵素的に活性なそのフラグメントを含む組成物を提供する。本発明は、以下の工程を含む、高温および塩基性pHの条件下でエタノールを製造する方法を提供する:(a)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドまたは酵素的に活性なそのフラグメントを提供する工程(この場合、前記ポリペプチドは、少なくとも約80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃もしくは110℃またはそれより高い温度および少なくとも約pH11の塩基性pHを含む条件下でキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持し、前記ポリペプチドは本発明の配列を有するキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含むか、または前記キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは本発明の配列を含む核酸によってコードされる);(b)木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプを含むデンプン含有組成物を提供する工程;および(c)工程(b)の組成物を工程(a)のポリペプチドと、少なくとも約80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、103.5℃、104℃、105℃、107℃、108℃、109℃もしくは110℃またはそれより高い温度、および少なくとも約pH11の塩基性pHを含む条件下で接触させる工程。この場合、前記ポリペプチドは、木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ中の化合物の加水分解を触媒し、それによって、木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプからエタノールを生成する。

0053

本発明は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するポリペプチド(前記ポリペプチドは本発明の配列を有するか、または前記ポリペプチドは本発明の配列を含む核酸によってコードされる)、または酵素的に活性なそのフラグメントを含む医薬組成物を提供する。ある特徴では、本発明は、本発明のポリペプチドを投与する工程を含む、微生物を除去するかまたは前記微生物から動物を保護する方法を提供する。
前記微生物は、キシランを含む細菌、例えばサルモネラでありえる。
ある特徴では、前記医薬組成物は消化促進剤または抗菌剤(例えば抗サルモネラ剤)として機能する。ある特徴では、前記処置は予防的である。ある特徴では、本発明は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチド、または本発明の核酸によってコードされるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含む口腔手入れ用製品を提供する。前記口腔手入れ用製品は、歯磨きペースト歯磨きクリーム、ゲルまたは歯磨き粉、歯洗浄液口内洗浄液、歯磨き前もしくは歯磨き後リンス処方物、チューインガムロゼンジまたはキャンデーを含むことができる。本発明は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチド、または本発明の核酸によってコードされるキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを含むコンタクトレンズ洗浄組成物を提供する。
本発明は、本発明のポリペプチド(例えばキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ)配列および少なくとも1つの異種炭水化物結合モジュール(CBM)を含むキメラグリコシダーゼ、キシラナーゼおよび/またはグルカナーゼを提供し、ある特徴では(場合によって)、前記CBMは、CBM3a、CBM3b、CBM4、CBM6、CBM22もしくはX14、または以下で列挙および考察されるCBMを含む。本発明はまた、少なくとも1つの異種炭水化物結合モジュール(CBM)を含むキメラグリコシダーゼ、キシラナーゼおよび/またはグルカナーゼを提供し、この場合、前記CBMは、本発明のキシラナーゼ配列の炭水化物結合部分配列、またはX14を含む炭水化物結合部分配列を含む。本発明は、新規な炭水化物結合特異性または強化された炭水化物結合特異性を有するキメラグリコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを設計する方法を提供する。前記方法は、異種または追加の内因性炭水化物結合モジュール(CBM)をグリコシダーゼ、キシラナーゼおよび/またはグルカナーゼに挿入する工程(この場合、前記CBMは、本発明のグリコシダーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ配列の炭水化物結合部分配列、またはX14を含む炭水化物結合部分配列を含む)を含むか、また前記とは別に、異種CBMまたは追加の内因性CBMは本発明のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ配列に挿入される。

0054

本発明は、少なくとも1つの本発明の酵素および1つまたは2つ以上の他の酵素を含む、酵素混合物または“カクテル”を提供する。前記酵素は、また別のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼでも、または任意の他の酵素でもよい。例えば、本発明の“カクテル”は、本発明の少なくとも1つの酵素に加えて、任意の他の酵素、例えばほんのいくつかの例を挙げれば、キシラナーゼ(本発明のキシラナーゼではない)、セルラーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、またはエンドグリコシダーゼ、エンド-ベータ-1,4-グルカナーゼ、ベータ-グルカナーゼ、エンド-ベータ-1,3(4)-グルカナーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼリグニナーゼプルラナーゼアラビナナーゼ、ヘミセルラーゼ、マンナナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼラムガラクツロナーゼガラクタナーゼペクチンリアーゼペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼおよび/またはトランスグルタミナーゼを含むことができる。また別の実施態様では、本発明の少なくとも1つの酵素を含むこれらの酵素混合物または“カクテル“は、本発明の任意の処理工程もしくは方法で、または本発明の組成物で、例えば食品もしくは飼料、食品もしくは飼料サプリメント、布地、紙、加工木材などで、さらに前記を製造する方法で、さらに紙、パルプ、木材、紙、パルプもしくは木材廃棄物または副産物などを処理する方法で、さらに前記の最終製品で用いることができる。
本発明の1つまたは2つ以上の実施態様の詳細が、添付の図面および以下の記述で説明される。本発明の他の特徴、目的および利点は下記の記述および図面、ならびに特許請求の範囲から明白となろう。
本明細書に引用した全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank配列、およびATCC寄託物は参照により本明細書に含まれる。

0055

特に本発明は、以下を含む単離、合成または組換え核酸、それらにコードされるポリペプチド、およびそれらの利用方法を提供する:
(a)少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記核酸が、以下の(i)または(ii)と少なくとも約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%もしくは99%を超えるか、または完全な(100%)配列同一性を有する配列を含み、ここで(i)または(ii)の核酸は、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードするか、またはキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ特異的抗体を生成することができるポリペプチドまたはペプチド(エピトープまたは免疫原として機能するポリペプチドまたはペプチド)をコードする、前記核酸:
(i)表1に示す1つまたは2つ以上のヌクレオチド残基変化(またはその等価物)を有するか、または以下の括弧内のヌクレオチド残基変化(アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからAACに変化;アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからCGCに変化;アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからCACに変化;アミノ酸残基9をコードするコドンがCCCからGACに変化;アミノ酸残基17をコードするコドンがTTCからGTCに変化;アミノ酸残基21をコードするコドンがTTCからTACに変化;アミノ酸残基33をコードするコドンがCTGからGCGに変化;アミノ酸残基38をコードするコドンがCGTからCACに変化;アミノ酸残基44をコードするコドンがAGCからACGに変化;アミノ酸残基63をコードするコドンがATCからGTCに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからTACに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからGAGに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからGTCに変化;アミノ酸残基108をコードするコドンがTTCからAAGに変化;アミノ酸残基125をコードするコドンがCAGからTACに変化;アミノ酸残基150をコードするコドンがGTAからGCCに変化;アミノ酸残基188をコードするコドンがAGCからGAGに変化;および/またはアミノ酸残基189をコードするコドンがTCCからCAGに変化)の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、もしくは18個、または前記残基変化のいくつかもしくは全部を有する配列番号:1の核酸(ポリヌクレオチド)配列;または
(ii)配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21または配列番号:23の核酸(ポリヌクレオチド)配列;
(b)(a)の核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記配列同一性が、(A)配列比較アルゴリズムを用いる分析または目視精査によって、または(B)cDNA、転写物(mRNA)または遺伝子の少なくとも約20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150もしくはそれより大きい残基または完全長にわたって決定される、前記核酸;
(c)(a)または(b)の核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記配列比較アルゴリズムがBLASTヴァージョン2.2.2アルゴリズムであり、フィルタリングの設定がblastall -p blastp -d “nr pataa” -F Fに設定され、さらに他の全てのオプションが規定値に設定される、前記核酸;
(d)少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記核酸が、ストリンジェントな条件下で、表1に示す1つまたは2つ以上のヌクレオチド残基変化(またはその等価物)を有するか、または以下の括弧内のヌクレオチド残基変化(アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからAACに変化;アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからCGCに変化;アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからCACに変化;アミノ酸残基9をコードするコドンがCCCからGACに変化;アミノ酸残基17をコードするコドンがTTCからGTCに変化;アミノ酸残基21をコードするコドンがTTCからTACに変化;アミノ酸残基33をコードするコドンがCTGからGCGに変化;アミノ酸残基38をコードするコドンがCGTからCACに変化;アミノ酸残基44をコードするコドンAGCからACGに変化;アミノ酸残基63をコードするコドンがATCからGTCに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからTACに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからGAGに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからGTCに変化;アミノ酸残基108をコードするコドンがTTCからAAGに変化;アミノ酸残基125をコードするコドンがCAGからTACに変化;アミノ酸残基150をコードするコドンがGTAからGCCに変化;アミノ酸残基188をコードするコドンがAGCからGAGに変化;および/またはアミノ酸残基189をコードするコドンがTCCからCAGに変化)の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、もしくは18個、または前記残基変化のいくつかもしくは全部を有する、配列番号:1の核酸(ポリヌクレオチド)配列を含む核酸とハイブリダイズする配列を含み、ここで、前記ポリペプチドまたはペプチドはキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するか、またはキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ特異的抗体を生成することができ(ポリペプチドまたはペプチドはエピトープまたは免疫原として機能する)、さらに前記ストリンジェントな条件は、0.2 XSSCにて約65℃の温度で約15分間の洗浄を含む洗浄工程を含む、前記核酸;
(e)少なくとも1つのポリペプチドまたはペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記核酸がストリンジェントな条件下で、配列番号:1、配列番号:3、配列番号:5、配列番号:7、配列番号:9、配列番号:11、配列番号:13、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:19、配列番号:21または配列番号:23とハイブリダイズする配列を含み、さらに前記ストリンジェントな条件は、0.2 X SSCにて約65℃の温度で約15分間の洗浄を含む洗浄工程を含む、前記核酸;
(f)遺伝子または転写物の少なくとも約20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150もしくはそれより大きいヌクレオチド残基の長さまたは完全長を有する(a)から(d)のいずれかの核酸(ポリヌクレオチド);
(g)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記ポリペプチドが配列番号:2の配列またはその酵素的に活性なフラグメントを含み、さらに、表1に示す少なくとも1つのアミノ酸残基変化(またはその等価物)を有するか、または以下の括弧内のアミノ酸残基変化(アミノ酸残基4がT(またはthrまたはスレオニン)からN(またはasnまたはアスパラギン)に変化;アミノ酸残基4がT(またはthrまたはスレオニニン)からR(またはargまたはアルギニン)に変化;アミノ酸残基4がT(またはthrまたはスレオニン)からH(またはhisまたはヒスチジン)に変化;アミノ酸残基9がP(またはproまたはプロリン)からD(またはaspまたはアスパラギン酸)に変化;アミノ酸残基17がF(またはpheまたはフェニルアラニン)からV(またはvalまたはバリン)に変化;アミノ酸残基21がF(またはpheまたはフェニルアラニン)からY(またはvalまたはバリン)に変化;アミノ酸残基33がL(またはleuまたはロイシン)からA(またはalaまたはアラニン)に変化;アミノ酸残基38がR(またはargまたはアルギニン)からH(またはhisまたはヒスチジン)に変化;アミノ酸残基44がS(またはserまたはセリン)からT(またはthrまたはスレオニン)に変化;アミノ酸残基63がI(またはileまたはイソロイシン)からV(またはvalまたはバリン)に変化;アミノ酸残基73がG(またはglyまたはグリシン)からY(またはtyrまたはチロシン)に変化;アミノ酸残基73がG(またはglyまたはグリシン)からV(またはvalまたはバリン)に変化;アミノ酸残基73がG(またはglyまたはグリシン)からE(またはgluまたはグルタミン酸)に変化;アミノ酸残基108がF(またはpheまたはフェニルアラニン)からK(またはlysまたはリジン)に変化;アミノ酸残基125がQ(またはglnまたはグルタミン)からY(またはtyrまたはチロシン)に変化;アミノ酸残基150がV(またはvalまたはバリン)からA(またはalaまたはアラニン)に変化;アミノ酸残基188がS(またはserまたはセリン)からE(またはgluまたはグルタミン酸)に変化;および/またはアミノ酸残基189がS(またはserまたはセリン)からQ(またはglnまたはグルタミン)に変化)の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、もしくは18個、または前記残基変化のいくつかもしくは全部を有する、前記核酸;
(h)キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記ポリペプチドが配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:24またはその酵素的に活性なフラグメントの配列を含む、前記核酸;
(i)(A)(a)から(h)のいずれかの核酸(ポリヌクレオチド)であって、少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有し、さらにキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を保持するポリペプチドをコードする、前記核酸(ポリヌクレオチド);または(B)(i)(A)の核酸であって、前記少なくとも1つの保存的アミノ酸置換が、同様な特性を有する別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を含むか、または保存的置換が、脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸による置換、セリンのスレオニンによる置換またはその逆の置換、酸性残基の別の酸性残基による置換、アミド基を保有する残基のまた別のアミド基保有残基による置換、塩基性残基の別の塩基性残基との交換、または芳香族残基の別の芳香族残基による置換を含む、前記核酸;
(j)(a)から(i)のいずれかであって、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有するが、シグナル配列、プレプロドメイン、ドッケリンドメイン、および/または炭水化物結合モジュール(CBM)を欠くポリペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド);
(k)(j)の核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記炭水化物結合モジュール(CBM)が、キシラン結合モジュール、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナンセ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュールおよび/またはアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含む(または前記から成る)、前記核酸;
(l)(a)から(k)のいずれかであって、キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を有し、さらに異種配列を含むポリペプチドをコードする核酸(ポリヌクレオチド);
(m)(l)の核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記異種配列が、(A)異種シグナル配列、異種炭水化物結合モジュール、異種ドッケリンドメイン、異種触媒ドメイン(CD)、またはその組合せをコードする配列を含む(または前記から成る)か、;(B)(l)の配列であって、前記異種シグナル配列、炭水化物結合モジュールまたは触媒ドメイン(CD)が異種酵素に由来するか;または(C)前記異種配列がタグ、エピトープ、標的誘導ペプチド、切断性配列、検出性部分または酵素を含む(または前記から成る)、前記核酸;
(n)(l)の核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記異種炭水化物結合モジュール(CBM)が、キシラン結合モジュール、セルロース結合モジュール、リグニン結合モジュール、キシロース結合モジュール、マンナンセ結合モジュール、キシログルカン特異的モジュールおよび/またはアラビノフラノシダーゼ結合モジュールを含む(または前記から成る)、前記核酸;
(o)(l)の核酸(ポリヌクレオチド)であって、前記異種シグナル配列が、コードされたタンパク質を空胞、小胞体、葉緑体またはデンプン顆粒へ誘導する、前記核酸;または
(p)(a)から(o)のいずれかの配列と十分に(完全に)相補的である核酸配列(ポリヌクレオチド)。

0056

以下の図面は本発明の特徴を説明するものであり、特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を制限することを意図しない。種々の図面中の同じ参照記号は同じ構成要素を表示する。

図面の簡単な説明

0057

コンピュータシステムのブロック図である。
新規なヌクレオチドまたはタンパク質配列データベースの配列を比較し、前記新規配列とデータベース配列との間の相同性レベルを決定する方法の1つの特徴を示す流れ図である。
2つの配列が相同であるか否かを決定するためのコンピュータ処理の1つの特徴を示す流れ図である。
配列中に特徴が存在するか否かを検出するためのアイデンティファイヤープロセス300の1つの特徴を示す流れ図である。
下記実施例3で詳細に説明ように、本発明のキシラナーゼが紙パルプの前処理で有用であるか否かを決定するための例示的な日常スクリーニングプロトコルの模式的流れ図である。
下記実施例5で詳細に説明するように、本発明の工業的生物漂白処理工程の図解である。

0058

本発明は、グリコシルヒドロラーゼ(キシラナーゼ(例えばエンドキシラナーゼ)および/またはグルカナーゼを含む)、およびそれらをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらを製造および使用する方法を提供する。本発明のポリペプチドのグリコシルヒドロラーゼ(キシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性を含む)は、ヒドロラーゼ活性を有する酵素、例えば多糖類中のグリコシド結合(例えばキシランに存在するグリコシド結合)を加水分解することができる、例えば内部β-1,4-キシロシド結合の加水分解を触媒する酵素を包含する。本発明のキシラナーゼおよび/またはグルカナーゼを用いて、食品、飼料、栄養サプリメント、布地、洗剤などを製造および加工することができる。本発明のキシラナーゼおよび/またはグルカナーゼは医薬組成物および食事用補助物質において用いることができる。
本発明のキシラナーゼおよび/またはグルカナーゼは、焼成、動物飼料、飲料および木材、木材パルプ、クラフトパルプ、紙、紙製品または紙パルプ加工で有用である。ある特徴では、本発明の酵素は、耐熱性、および/または、高温および/または低pH条件に対し耐性を有する。例えば、ある特徴では、本発明のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼは、少なくとも約80℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃、106℃、107℃、108℃、109℃もしくは110℃またはそれより高い温度、および少なくとも約pH11またはそれより高い塩基性pHを含む条件下で活性を保持する。
本発明は、キシラナーゼ(例えばエンドキシラナーゼ)、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性、または本明細書に記載する他の活性を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸を含む、単離、合成または組換え核酸を提供する。この場合、前記核酸は、表1に示され、さらに本明細書に記載される1つまたは2つ以上のヌクレオチド残基変化(改変、変異)を有する配列番号:1と、cDNA、転写物(mRNA)または遺伝子の約10から2500の領域もしくはそれより大きい残基または完全長にわたって、少なくとも約50%から99%もしくは前記を超えるか、または完全な(100%)配列同一性(相同性)を有する配列を含む。本発明の核酸には本発明のポリペプチドをコードする核酸が含まれ、前記ポリペプチドには、例えば、表1に示され、さらに本明細書に記載される1つまたは2つ以上のアミノ酸残基変化(変異)を有する配列番号:2が含まれ、さらに、例示的な配列番号:2、配列番号:4、配列番号:6、配列番号:8、配列番号:10、配列番号:12、配列番号:14、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:20、配列番号:22または配列番号:24を基準にして種々の配列同一性を有するポリペプチド類もまた含まれる。

0059

0060

本発明は本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種を提供する。前記変種は、1つまたは2つ以上の塩基対、コドン、イントロンエクソンまたはアミノ酸残基において(それぞれ)改変された配列を含み、それでもなお本発明のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼの生物学的活性を保持する。変種は任意の多数の手段によって製造することができ、前記手段には、例えば変異性PCR、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的変異導入、アッセンブリPCR、セクシュアルPCR変異導入、in vivo変異導入、カセット変異導入、再帰的アンサンブル変異導入、エクスポネンシャルアンサンブル変異導入、部位特異的変異導入、遺伝子再アッセンブリ(例えばGeneReassembly(例えば米国特許6,537,776号を参照されたい))、GSSMおよび前記の任意の組合せが含まれる。
“飽和変異導入”、“遺伝子部位飽和変異導入”または“GSSM”という用語は、下記で詳細に述べるように、縮退オリゴヌクレオチドを用いてポリヌクレオチドに点変異を導入する方法を含む。
“最適化定方向進化システム”または“最適化定方向進化”という用語は、関連核酸配列、例えば関連遺伝子のフラグメントを再アッセンブリングする方法を含み、下記で詳細に説明する。
“合成連結再アッセンブリ”または“SLR”という用語は、非確率的態様でオリゴヌクレオチドフラグメントを連結する方法を含み、下記で詳細に説明する。

0061

核酸の作製および操作
本発明は、核酸、例えば、グリコシルヒドロラーゼ活性(例えばキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ活性)を有するポリペプチドコードする核酸(本発明のポリペプチドをコードする発現カセット(例えば発現ベクター)を含む)を提供し、前記ポリペプチドは、少なくとも1つの配列改変を有する本発明の例示的核酸配列(上記で規定)の酵素を含み、前記配列改変は、表1に示される1つまたは2つ以上のヌクレオチド残基変化(またはその等価物)、または以下のカッコ内のヌクレオチド残基変化(アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからAACに変化;アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからCGCに変化;アミノ酸残基4をコードするコドンがACCからCACに変化;アミノ酸残基9をコードするコドンがCCCからGACに変化;アミノ酸残基17をコードするコドンがTTCからGTCに変化;アミノ酸残基21をコードするコドンがTTCからTACに変化;アミノ酸残基33をコードするコドンがCTGからGCGに変化;アミノ酸残基38をコードするコドンがCGTからCACに変化;アミノ酸残基44をコードするコドンがAGCからACGに変化;アミノ酸残基63をコードするコドンがATCからGTCに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからTACに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからGAGに変化;アミノ酸残基73をコードするコドンがGGCからGTCに変化;アミノ酸残基108をコードするコドンがTTCからAAGに変化;アミノ酸残基125をコードするコドンがCAGからTACに変化;アミノ酸残基150をコードするコドンがGTAからGCCに変化;アミノ酸残基188をコードするコドンがAGCからGAGに変化;および/またはアミノ酸残基189をコードするコドンがTCCからCAGに変化)の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、もしくは18個、または前記残基変化のいくつかもしくは全部を含む。

0062

本発明はまた、本発明の核酸を用いて新規なキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ配列を発見する方法を含む。本発明はまた、本発明の核酸を用いてキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ遺伝子、転写物およびポリペプチドの発現を阻害する方法を含む。さらにまた、合成連結再アッセンブリ、最適化定方向進化システムおよび/または飽和変異誘導によって本発明の核酸を改変する方法が提供される。
本発明の核酸は、例えばcDNAライブラリーのクローニングおよび発現、PCRによるメッセージまたはゲノムDNAの増幅などによって作製、単離および/または操作することができる。
ある特徴では、本発明はまた、キシラナーゼ-および/またはグルカナーゼ-コード核酸を提供し、それら核酸は、それらが環境性供給源または細菌性供給源または古細菌性供給源に由来するという点で共通の新規性を有する。
本発明の方法の実施では、本明細書で述べるように、鋳型核酸を操作することによって相同な遺伝子を改変することができる。本発明の方法は、当分野で公知の任意の方法またはプロトコルまたは装置(それら学術文献および特許文献に詳しく記載されている)を併用して実施することができる。
本発明のある特徴は、本発明の配列、および前記と実質的に同一の配列、前記と相補的な配列、または本発明の配列(またはそれと相補的な配列)の配列の1つの連続する少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400または500塩基を含むフラグメントの1つを含む単離された核酸である。前記単離核酸は、DNA(cDNA、ゲノムDNAおよび合成DNAを含む)を含む。前記DNAは二本鎖および一本鎖DNAを含み、一本鎖の場合はコード鎖でも非コード鎖でもよい。あるいは前記単離核酸はRNAを含むことができる。

0063

したがって、本発明の別の特徴は、本発明のポリペプチドの1つ、または本発明のポリペプチドの1つの連続する少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100または150アミノ酸を含むフラグメントをコードする単離核酸である。これら核酸のコード配列は、本発明の核酸の1つのコード配列の1つ、またはそのフラグメントと同一であってもよいが、また、遺伝暗号重複性または縮退性の結果として、本発明のポリペプチドの1つ、前記と実質的に同一の配列、および本発明のポリペプチドの1つの連続する少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100または150アミノ酸を有するフラグメントをコードする種々のコード配列であってもよい。遺伝暗号は当業者には周知であり、例えばB. Lewinの著書”Genes VI”(Oxford University Press, 1997)の214ページ入手することができる。
本発明のポリペプチドおよび前記と実質的に同一の配列をコードする単離核酸は、もっぱら本発明の核酸のコード配列およびそれらと実質的に同一の配列並びに追加のコード配列(例えばリーダー配列またはプレプロテイン配列)および非コード配列(例えばイントロンまたはコード配列の5’および/または3’非コード配列)を含むことができるが、ただし前記に限定されない。したがって、本明細書で用いられる、“ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド”という用語は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドとともに、追加のコードおよび/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
また別には、本発明の核酸配列および前記と実質的に同一の配列は、通常の技術、例えば位置特異的変異導入、または当業者に周知の他の技術を用いて変異させ、本発明のポリヌクレオチドおよび前記と実質的に同一の配列にサイレント変異を導入することができる。本明細書で用いられる、“サイレント変異”には、例えば当該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を変更させない変異が含まれる。そのような変異は、宿主生物で頻繁に存在するコドンまたはコドン対を導入することによって、当該ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞によって生成されるポリペプチドのレベルを増加させるために所望することができる。

0064

本発明はまた、本発明のポリペプチドおよびそれらと実質的に同一の配列にアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切端をもたらすヌクレオチド変異を有するポリヌクレオチドに関する。そのようなヌクレオチド変異は、例えば位置特異的変異導入、化学物質によるランダム変異導入、エキソヌクレアーゼIIIによる欠失および他の組換えDNA技術のような技術を用いて導入することができる。あるいは、そのようなヌクレオチド変異は天然に存在する対立遺伝子変種であってもよい。前記変種は、本発明の配列および前記と実質的に同一の配列(または前記と相補的な配列)の1つの連続する少なくとも10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400または500塩基を含むプローブと、本明細書で提供する高、中等度または低ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする核酸を同定することによって単離される。
一般的技術:
本発明の実施に用いられる核酸は、RNA、iRNA、アンチセンス核酸、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、ウイルス又は前記のハイブリッドのいずれであっても、種々の供給源から単離、遺伝的に操作、増幅、及び/又は組換えにより発現/作製することができる。これらの核酸から作製された組換えポリペプチド(例えば本発明のグリコシルヒドロラーゼ)は個々に単離またはクローニングし、所望の活性について試験することができる。任意の組換え発現系(細菌、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含む)を用いることができる。
あるいは、これら核酸は周知の化学的合成技術によってin vitroで合成することができる。前記技術は例えば以下に記載されている:Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic AcidsRes. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (9179) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22:1859; US Patent No. 4,458,066。
核酸操作のための技術、例えばサブクローニング、プローブの標識(例えばクレノーポリメラーゼニックトランスレーション、増幅を用いるランダムプライマー標識)、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは学術文献および特許文献に詳しく記載されている。
例えば以下を参照されたい:Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acids Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)。

0065

本発明の方法の実施に用いられる核酸を入手および操作するために有用なまた別の手段は、ゲノムサンプルからのクローニング、および所望の場合には、例えばゲノムクローンもしくはcDNAクローンから単離または増幅した挿入物のスクリーニングおよび再クローニングである。本発明の方法で用いられる核酸の供給源には、哺乳動物人工染色体(MAC)(例えば米国特許5,721,118号、同6,025,155号を参照されたい)、ヒト人工染色体(Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC)、P1人工染色体(Woon (1998) Genomics 50:306-316)、P1誘導ベクター(PAC)(Kern (1997) Biotechniques 23:120-124)、コスミド、組換えイルス、ファージまたはプラスミドに含まれるゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーが含まれる。
ある特徴では、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチドまたはそのフラグメントの分泌を誘導することができるリーダー配列とともに適切な位相でアッセンブリングされる。
本発明は融合タンパク質およびそれらをコードする核酸を提供する。本発明のポリペプチドは異種ペプチドまたはポリペプチド、例えば所望の特性(例えば安定性増強または精製の簡便化)を付与するN-末端識別ペプチドと融合させることができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、例えばより強い免疫原性をもつペプチドを製造するため、組換えにより合成されたペプチドをより容易に単離するため、抗体および抗体発現B細胞を識別および単離するためなどの目的のために、前記と結合した1つまたは2つ以上の追加のドメインを有する融合タンパク質として合成および発現させることができる。検出および精製を容易にするドメインには、例えば金属キレートペプチド(例えばポリヒスチジン鎖およびヒスチジン-トリプトファンモジュール(固定化金属上での精製を可能にする)、プロテインAドメイン(固定化免疫グロブリン上での精製を可能にする)、およびFLAGS伸長/アフィニティー精製系(Immune Corp, Seatle WA)で利用されるドメインが含まれる。精製ドメインおよびモチーフ構成ペプチドまたはポリペプチド間の切断可能リンカー配列(例えばXa因子またはエンテロキナーゼ(Invitrogen, San Diego CA))の挿入は精製を容易にする。例えば、発現ベクターは、6つのヒスチジン残基とそれに続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位に連結されたエピトープコード核酸配列を含むことができる(例えば以下を参照されたい:Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414)。前記ヒスチジン残基は検出および精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質の残りの部分からエピトープを精製するための手段を提供する。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の利用に関する技術は学術文献および特許文献に詳しく記載されている(例えば以下を参照されたい:Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53)。

0066

本明細書で用いられる“核酸”または“核酸配列”という語句は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または前記のいずれかのフラグメント、ゲノム由来もしくは合成起源のDNAまたはRNA(これらは一本鎖でも二本鎖でもよく、センスまたはアンチセンス鎖を表していてもよい)、ペプチド核酸(PNA)または任意のDNA様もしくはRNA様物質(天然または合成起源)を指す。“核酸”または“核酸配列”という語句は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または前記のいずれかのフラグメント、ゲノムもしくは合成起源のDNAまたはRNA(例えばmRNA、rRNAtRNA、iRNA)(これらは一本鎖でも二本鎖でもよく、センスまたはアンチセンス鎖を表していてもよい)、ペプチド核酸(PNA)または任意のDNA様もしくはRNA様物質、(天然または合成起源)(例えばiRNA、リボヌクレオタンパク質(例えば二本鎖iRNA、例えばiRNP)を含む)を指す。
前記用語は、天然のヌクレオチドの既知類似体を含む核酸(すなわちオリゴヌクレオチド)を包含する。前記用語はまた合成骨格をもつ核酸様構造物を包含する(例えば以下を参照されたい:Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156)。“オリゴヌクレオチド”は一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは2つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のどちらかを含み、前記は化学的に合成することができる。そのような合成オリゴヌクレオチドは5’リン酸基をもたず、したがってキナーゼの存在下でATPを用いてリン酸基を付加されなければ別のオリゴヌクレオチドと連結されない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていないフラグメントと連結することができる。

0067

具体的なポリペプチドまたはタンパク質の“コード配列”または前記を“コードするヌクレオチド配列”は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ポリペプチドまたはタンパク質に転写および翻訳される核酸配列である。
“遺伝子”という用語は、ポリペプチド鎖の生成に必要とされるDNAセグメントを意味し、コード領域に先行する領域および後続する領域(リーダーおよびトレイラー)を含み、適切な場合には個々のコードセグメント(エクソン)の間に介在する配列(イントロン)も同様に含む。本明細書で用いられる“作動できるように連結される”とは、2つまたは3つ以上の核酸(例えばDNA)セグメント間における機能的関係を指す。典型的には、前記用語は、転写される配列に対する転写調節配列の機能的関係を指す。例えば、プロモータが適切な宿主細胞または他の発現系でコード配列の転写を刺激または調節する場合、前記プロモータは前記コード配列と作動できるように連結されている。一般的には、転写される配列と作動できるように連結されているプロモータ転写調節配列は、前記転写される配列と物理的に連続している。すなわち、それらはcis-作動性である。しかしながら、いくつかの転写調節配列、例えばエンハンサーは、それらが転写を強化しようとするコード配列と物理的に連続していること、または前記と接近して配置されることを必ずしも必要としない。
本明細書で用いられる“発現カセット”という用語は、構造遺伝子(すなわちタンパク質コード配列、例えば本発明のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ)の発現に対して、当該配列と適合する宿主内で影響を与えることのできるヌクレオチド配列を指す。発現カセットは、ポリペプチドコード配列(およびある特徴では他の配列、例えば転写終了シグナル)と作動できるように連結された少なくとも1つのプロモーターを含む。発現の実施に必要なまたは有用なさらに別の因子(例えばエンハンサー)もまた用いることができる。したがって、発現カセットはまた、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え“のDNA”ベクターなどを含む。“ベクター”は、細胞に感染、トランスフェクト一過性もしくは永久的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは、裸の核酸またはタンパク質もしくは脂質と複合体を形成した核酸でもよいことは理解されよう。ベクターはある特徴ではウイルスまたは細菌の核酸および/またはタンパク質および/または膜(例えば細胞膜、ウイルスの脂質エンベロープなど)を含む。ベクターには、DNAフラグメントが結合し複製できるようになったレプリコン(例えばRNAレプリコン、バクテリオファージ)が含まれるが、ただし前記に限定されない。したがって、ベクターには、自律自己複製性環状もしくは直線状DNAまたはRNA(例えばプラスミド、ウイルスなど、例えば米国特許出願第5,217,879号参照)が含まれ(ただし前記に限定されない)、さらに発現および非発現プラスミドが含まれる。組換え微生物または培養細胞が“発現ベクター”を宿主として受け入れていると記述されている場合には、染色体外環状および直鎖状DNA並びに宿主染色体に取り込まれたDNAの両方が含まれる。ベクターが宿主細胞により維持されている場合は、前記ベクターは自律性構造物として有糸分裂時に細胞によって安定的に複製されていても、または宿主のゲノム内に取り込まれていてもよい。

0068

本明細書で用いられる“プロモーター”という用語には、細胞(例えば植物細胞)内でコード配列の転写を駆動させることができる全ての配列が含まれる。したがって、本発明の構築物で用いられるプロモーターには、遺伝子の転写のタイミングおよび/または速度の調節または調整に必要とされるcis-作動性転写制御エレメントおよび調節配列が含まれる。例えば、プロモーターは、cis-作動性転写制御エレメント(エンハンサー、プロモーター、転写ターミネータ複製起点染色体組み込み配列、5’および3’非翻訳領域またはイントロン配列が含まれ、転写調節に必要である)であろう。これらのcis-作動性配列は、典型的にはタンパク質または他の生物学的分子相互作用して転写を実行する(ON/OFF切り替え、調節または調整など)。“構成的”プロモータは、大部分の環境条件下および生育または細胞分化の状態で持続的に発現を駆動するプロモーターである。“誘導性”または“調節性”プロモーターは環境条件または生育条件の影響下で本発明の核酸の発現を誘導する。例えば誘導性プロモーターによって転写に影響を与えることができる環境条件の例には、嫌気的条件、上昇温度、乾燥または光の存在が含まれる。
組織特異的”プロモーターは、例えば植物または動物の特定の細胞または組織または器官でのみ活性を有する転写制御エレメントである。組織特異的調節は、ある組織に特異的なタンパク質をコードする遺伝子の発現を担保するある種の固有の因子によって達成できる。そのような因子は哺乳動物および植物に存在し、特定の組織を発達させることが知られている。
本明細書で用いられる、“単離”という用語は、材料(例えば核酸、ポリペプチド、細胞)がその本来の環境(例えば、材料が天然に存在する場合は当該天然の環境)から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に出現するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系に一緒に存在する物質のいくつかまたは全てから分離されている前記と同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの部分であってもよいし、および/またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、それでもなおそのようなベクターまたは組成物は前記の天然の環境の一部分ではないという点で、それらのポリヌクレオチドは単離されたものである。本明細書で用いられる、“精製される”という用語は完全な純度を要求せず、むしろ相対的な定義と考えられている。ライブラリーから得られる個々の核酸は電気泳動による均質度まで通常的に精製されている。これらのクローンから得られる配列は、ライブラリーからもまたは人間の全DNAからも直接入手することはできないであろう。本発明の精製核酸はその生物体のゲノムDNAの残余のものから少なくとも104−106倍精製されてある。しかしながら、“精製される”という用語はまた、ゲノムDNAの残余のものから、またはライブラリー若しくは他の環境中の他の配列から少なくとも1桁、典型的には2または3桁、より典型的には4または5桁精製された核酸を含む。

0069

本明細書で用いられる、“組換え体”という用語は、その天然の環境では近傍にない“骨格”核酸に当該核酸が近接することを意味する。さらにまた、“濃縮される”ためには、当該核酸は、核酸骨格分子集団において核酸挿入物の数の5%以上を占めるであろう。
本発明の骨格分子には、核酸、例えば発現ベクター、自己複製核酸、ウイルス、対象の核酸挿入物を維持または操作するために用いられる組み込み用核酸および他のベクターまたは核酸が含まれる。典型的には、濃縮された核酸は、組換え骨格分子集団において核酸挿入物の数の15%以上を占める。より典型的には、濃縮された核酸は、組換え骨格分子集団において核酸挿入物の数の50%以上を占める。ある特徴では、濃縮された核酸は、組換え骨格分子集団において核酸挿入物の数の90%以上を占める。
“プラスミド”は、先行する小文字“p”及び/又は後続する大文字及び/又は数字によって示される。本明細書では出発プラスミドは市販または無制限に公開されているか、または発表された方法にしたがって利用可能なプラスミドから構築することができる。さらにまた、本明細書に記載したプラスミドと等価のものが当分野では知られており、当業者には明白であろう。“プラスミド”は、市販されているか、または無制限に公開されているか、または発表された方法にしたがって利用可能なプラスミドから構築することができる。さらにまた、本明細書に記載したプラスミドと等価のものが当分野では知られており、当業者には明白であろう。
DNAの“消化”は、DNA内の一定の配列でのみ作用する制限酵素によるDNAの触媒的切断を指す。本明細書で用いられる種々の制限酵素は市販されてあり、それらの反応条件補助因子および他の要件は、当業者に公知のとおり用いられる。分析目的のためには、典型的には1μgのプラスミドまたはDNAフラグメントが約2ユニットの酵素とともに約20μLの緩衝溶液中で用いられる。プラスミドの構築のためにDNAフラグメントを単離する目的の場合には、典型的には5から50μgのDNAが20から250ユニットの酵素とともにより大きな体積で消化される。具体的な制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は製造業者によって特定される。37℃で約1時間のインキュベーション時間が一般的に用いられるが、供給業者の指示にしたがって変動しえる。消化後に、ゲル電気泳動を実施して所望のフラグメントを単離することができる。

0070

“ハイブリダイゼーション”は、核酸鎖が相補的な鎖と塩基対形成によって結合する過程を指す。ハイブリダイゼーション反応鋭敏選択性があり、低い濃度でしか存在しないサンプルにおいてさえ対象の特定の配列を識別することができる。適切にストリンジェントな条件は、例えば前ハイブリダイゼーション溶液またはハイブリダイゼーション溶液中の塩もしくはホルムアミドの濃度によって、またはハイブリダイゼーション温度によって規定することができ、当業界でよく知られている。特に、ストリンジェンシーは、塩濃度の減少、ホルムアミド濃度の増加、またはハイブリダイゼーション温度の上昇によって高めることができる。また別の特徴では、本発明の核酸は、本明細書に示す種々の(例えば高度、中等度および低度の)ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするその能力によって定義される。
例えば、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、約37℃から42℃で約50%のホルムアミドで生じえる。ハイブリダイゼーションは、約30℃から35℃で約35%から25%のホルムアミドの低ストリンジェンシー条件下で起こりえる。特にハイブリダイゼーションは、約50%のホルムアミド、5XのSSPE、0.3%SDSおよび200μg/mLのせん断変性サケ精子DNA中で約42℃の高ストリンジェンシー条件下で起こりえる。ハイブリダイゼーションは、上記のような(しかしながら35℃の低温で35%のホルムアミドの)低ストリンジェンシー条件下で起こりえる。個々のストリンジェンシーレベルに対応する温度範囲は、対象の核酸のプリンピリミジン比を算出し、それにしたがって温度を調整することによってさらに狭めることができる。上記の範囲および条件についての変動例は当業界で周知である。

0071

転写および翻訳制御配列:
本発明は、RNA合成/発現を誘導または調節するために発現(例えば転写または翻訳)制御配列(例えばプロモータまたはエンハンサー)に作動できるように連結された本発明の核酸(例えばDNA)配列を提供する。前記発現制御配列は発現ベクター内に存在しえる。例示的な細菌プロモーターにはlacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PLおよびtrpが含まれる。例示的な真核細胞プロモータにはCMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40レトロウイルスLTRおよびマウスのメタロチオネインIが含まれる。プロモータ配列は、当該プロモータで転写を開始させるRNAポリメラーゼがコード配列をmRNAに転写するとき、前記コード配列に“作動できるように連結”されている。細菌でのポリペプチド発現に適したプロモーターには、大腸菌のlacまたはtrpプロモータ、lacIプロモータ、lacZプロモータ、T3プロモータ、T7プロモータ、gptプロモータ、ラムダPRプロモータ、ラムダPLプロモータ、糖分解酵素(例えば3-ホスホグリセレートキナーゼPGK))をコードするオペロン由来のプロモータ、および酸性ホスファターゼプロモータが含まれる。真核細胞プロモータには、CMV前初期プロモータ、HSVチミジンキナーゼプロモータ、熱ショックプロモータ、初期および後期SV40プロモータ、レトロウイルスのLTRおよびマウスのメタロチオネインIプロモータが含まれる。原核細胞または真核細胞またはそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモータもまた用いることができる。細菌でポリペプチドまたはそのフラグメントを発現するために適切なプロモータには、大腸菌のlacまたはtrpプロモータ、lacIプロモータ、lacZプロモータ、T3プロモータ、T7プロモータ、gptプロモータ、ラムダPRプロモータ、ラムダPLプロモータ、糖分解酵素(例えば3-ホスホグリセレートキナーゼ(PGK))をコードするオペロン由来のプロモータおよび酸性ホスファターゼプロモーターが含まれる。真菌のプロモーターには、∀因子プロモーターが含まれる。真核細胞プロモータには、CMV前初期プロモータ、HSVチミジンキナーゼプロモータ、熱ショックプロモータ、初期および後期SV40プロモータ、レトロウイルスのLTRおよびマウスのメタロチオネインIプロモータが含まれる。原核細胞または真核細胞またはそれらのウイルスで遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモータもまた用いることができる。

0072

組織特異的植物プロモータ:
本発明は、組織特異的態様で発現させることができる、例えば組織特異的態様で本発明のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを発現させることができる発現カセットを提供する。本発明はまた、本発明のキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼを組織特異的態様で発現する植物または種子を提供する。前記組織特異性は、種子特異的、茎特異的、葉特異的、根特異的、果実特異的などでありえる。
ある特徴では、構成的プロモーター(例えばCaMV35Sプロモータ)を植物若しくは種子の特定の部分又は植物全体における発現に用いることができる。例えば、過剰発現のためには、植物のいくつかの組織または全ての組織(例えば再生植物)で核酸の発現を指令する植物プロモータフラグメントを用いることができる。そのようなプロモータは、本明細書では“構成的”プロモータと称され、ほとんどの環境条件下および生育または細胞分化状態で活性を示す。構成的プロモータの例には、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S転写開始領域、アグロバクテリア・ツメファシエンス(Agrobacteria tumefaciens)のT‐DNA由来1’-または2’-プロモータ、および当業者に公知の種々の植物遺伝子のその他の転写開始領域が含まれる。そのような遺伝子には、例えばアラビドプシス(Arabidopsis)のACT11(Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33:125-139);アラビドプシスのCat3(GenBankNo. U43147、Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251:196-203);ブラシカ・ナプス(Brassica napus)のステアロイル-アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子(GenBank No. X74782、Solocombe (1994) Plant Physiol. 104:1167-1176);トウモロコシのGPc1(GenBank No. X15596、Martinez (1989) J. Mol. Biol. 208:551-565);トウモロコシのGpc2(GenBank No. U45855、Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112);米国特許4,962,028号、同5,633,440号に記載された植物プロモーターが含まれる。
本発明は、ウイルス由来の組織特異的または構成的プロモータを用いる。これらには、例えばトバモウイルスサブゲノムプロモータ(Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1679-1683);イネのツングロ杆状ウイルス(RTBV)(感染したイネの師部細胞でのみ複製し、強力な師部特異的レポータ遺伝子発現を駆動するプロモータを有する);キャッサバ葉脈モザイクウイルス(CVMV)プロモータ(維管束エレメント、葉の葉肉細胞および根の先端でもっとも強い活性を有する)(Verdaguer(1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-1139)が含まれえる。
あるいは、植物プロモータは、特定の組織、器官または細胞タイプでキシラナーゼ-および/またはグルカナーゼ-発現核酸の発現を指令するか(すなわち組織特異的プロモータ)、またはそうでなければより厳密な環境もしくは生育制御下に置くか、または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。転写に影響を与えることができる環境条件の例には、嫌気性条件、上昇温度、光の存在、化学物質/ホルモン噴霧が含まれる。例えば、本発明は、トウモロコシの乾燥誘導プロモータ(Busk (1997)上掲書);ジャガイモの低温、乾燥および高塩誘導プロモーター(Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33:897-909)を取り込んでいる。

0073

組織特異的プロモータは、その組織内の一定の時間枠内の生育段階内でのみ転写を促進することができる。例えば以下を参照されたい:Blazquez (1998) Plant Cell 10:791-800(アラビドプシスのLEAFY遺伝子のプロモーターの特性を明らかにする)。さらにまた例えば以下を参照されたい:Cardon (1997) Plant J 12:367-377(A.サリアナ(thaliana)の花の分裂組織同一性遺伝子AP1のプロモータ領域中の保存配列モチーフを認識する転写因子SPL3について記載している);およびMandel (1995) Plant Molecular Biology, vol 29, pp995-1004(分裂組織プロモータeIF4について記載している)。特定の組織のライフサイクルの全体を通して活性を有する組織特異的プロモータを用いることができる。ある特徴では、本発明の核酸は、主としてワタの繊維細胞でのみ活性を示すプロモーターに作動できるように連結される。ある特徴では、本発明の核酸は、例えば上掲書(Rinehart (1996))に記載されたように、主としてワタの繊維細胞の伸張期間に活性を示すプロモータに作動できるように連結される(例えば上掲書(Rinehart (1996))に記載されている)。核酸は、ワタの繊維細胞で優先的に発現されるように、Fbl2A遺伝子プロモータに作動できるように連結することができる(上掲書)。さらに以下を参照されたい:John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5769-5773;John et al., US Patent No. 5,608,148, 5,602,321(ワタの繊維特異的プロモータおよびトランスジェニックな綿植物を構築する方法が記載されている)。根特異的プロモータもまた本発明の核酸の発現に用いられる。根特異的プロモータの例には、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータが含まれる(DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123:39-60)。本発明の核酸の発現に用いることができる他のプロモータには、例えば胚珠特異的、特異的、内胚葉特異的、珠皮特異的、種子外皮特異的プロモータ、またはこれらのいくつかの組合せ;葉特異的プロモータ(例えば以下を参照されたい:Busk (1997) Plant J. 11:1285-1295、前記にはトウモロコシの葉特異的プロモータが記載されている);アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)のORF13プロモータ(根で高い活性を示す(上掲書(Hansen, 1997)を参照されたい));トウモロコシの花粉特異的プロモータ(例えば以下を参照されたい:Guerrero (1990) Mol. Gen. Gnet. 224:161-168);果実成熟時、葉の(前記より低頻度で花の)老化および離脱時に活性を示すトマトのプロモータ(例えば以下を参照されたい:Blume (1997) Plant J. 12:731-746);ジャガイモのSK2遺伝子のめしべ特異的プロモータ(例えば以下を参照されたい:Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35:425-431);エンドウマメのBlec4遺伝子(トランスジェニックアルファルファの栄養および生殖茎頂表皮組織で活性を示し、活発に生長しているシュートまたは繊維の表皮層外来遺伝子を発現させるために有用である);珠皮特異的BEL1遺伝子(例えば以下を参照されたい:Reiser (1995) Cell 83:735-742,GenBankNo. U39944);および/または米国特許第5,589,583号(Klee)(分裂組織および/または急速に分裂している細胞で高レベルの転写を付与することができる植物プロモータについて記載)のプロモータが含まれる。

0074

あるいは、本発明の核酸を発現させるために、植物ホルモン(例えばオーキシン)への暴露に際して誘導されえる植物プロモータが用いられる。例えば、本発明は以下を用いることができる:ダイズ(Glycine max L.)のオーキシン応答エレメントE1プロモータフラグメント(AuxRE)(Liu (1997) Plant Physiol. 115:397-407);オーキシン応答性アラビドプシスGST6プロモータ(サリチル酸および過酸化水素にも反応性である)(Chen (1996) Plant J. 10:955-966);タバコのオーキシン誘導性parCプロモータ(Sakai (1996) 37:906-913);植物ビオチン応答エレメント(Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:933-937);およびストレスホルモンアブシジン酸応答するプロモータ(Sheen (1996) 274:1900-1902)。
本発明の核酸はまた、植物に適用可能な化学試薬(例えば除草剤または抗生物質)の暴露に際して誘導することができる植物プロモータに作動できるように連結することもできる。例えば、トウモロコシのIn2-2プロモータ(ベンゼンスルホンアミド除草剤の毒性緩和剤によって活性化される)を用いることができる(De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577)。種々の除草剤の毒性緩和剤の適用によって、根、排水組織茎頂分裂組織での発現を含む別個遺伝子発現パターンが誘導される。コード配列は、例えばテトラサイクリン誘導プロモータ(例えばアヴェナ・サティヴァL.(エンバク)のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子(Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473)を含むタバコのトランスジェニック植物で開示されたとおり)、またはサリチル酸応答エレメント(Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324)の制御下に置くことができる。化学的に(例えばホルモンまたは殺虫剤によって)誘導されるプロモータ(すなわち野外でトランスジェニック植物に適用することができる化学物質に対し応答するプロモータ)を用いて、本発明のポリペプチドの発現を植物の生育の特定の段階で誘導することができる。したがって、本発明はまた、その宿主域標的植物種(例えば、トウモロコシ、イネ、オオムギ、コムギ、ジャガイモまたはその他の作物類)に限定される、作物の任意の生育段階で誘導可能な本発明のポリペプチドをコードする誘導性遺伝子を含むトランスジェニック植物を提供する。

0075

当業者には、組織特異的植物プロモータは標的組織以外の組織で作動できるように連結された配列の発現を駆動することができることは理解されよう。このように、組織特異的プロモータは、標的組織または細胞タイプで優先的に発現を駆動させることができるが、他の組織でもまた同様にある程度の発現を誘導することができる。
本発明の核酸はまた、化学試薬に暴露されたときに誘導される植物プロモータに作動できるように連結することができる。そのような試薬には、例えば除草剤、合成オーキシンまたは抗生物質が含まれる。これらはトランスジェニック植物に適用、例えば噴霧することができる。本発明のキシラナーゼ-および/またはグルカナーゼ-生成核酸の誘導性発現によって、栽培者は最適なキシラナーゼ、マンナナーゼおよび/またはグルカナーゼ発現および/または活性を有する植物を選別することができる。植物の部分の生育はしたがって制御可能である。このようにして、本発明は、植物および植物の部分の収穫を促進する手段を提供する。例えば、種々の実施態様では、トウモロコシのIn2-2プロモータ(ベンゼンスルホンアミド除草剤の毒性緩和剤によって活性化される)が用いられる(De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38:568-577)。種々の除草剤の毒性緩和剤の適用によって、根、排水組織、茎頂分裂組織での発現を含む別個の遺伝子発現パターンが誘導される。本発明のコード配列は、例えばテトラサイクリン誘導性プロモータ(例えばアヴェーナ・サティヴァL.(エンバク)のアルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子(Masgrau (1997) Plant J. 11:465-473)を含むタバコのトランスジェニック植物で開示されたとおり)、またはサリチル酸応答エレメント(Stange (1997) Plant J. 11:1315-1324)の制御下にある。
いくつかの特徴では、適切なポリペプチド発現には、コード領域の3’末端のポリアデニル化領域が必要かもしれない。前記ポリアデニル化領域は、天然の遺伝子、種々の他の植物(または動物またその他の)遺伝子、またはアグロバクテリウムのT-DNAの遺伝子に由来するものでよい。
“植物”という用語(例えば本発明のトランスジェニック植物もしくは植物の種子または本発明のベクターで用いられる植物プロモータの場合)には、植物の全体、植物の部分(例えば葉、茎、花、根など)、植物のプロトプラスト、種子および植物細胞並びに前記の子孫が含まれる。本発明の方法で用いることができる植物の種類は高等植物の種類と同程度に広く、形質転換技術を施しやすい植物(裸子植物と同様に被子植物単子葉および双子葉植物)を含む)が含まれる。前記用語には多様な倍数性レベルを有する植物(倍数体二倍体半数体および半接合状態を含む)が含まれる。本明細書で用いられる“トランスジェニック植物”には、異種核酸配列(例えば本発明の核酸および種々の組換え構築物(例えばベクターのような発現カセット))が挿入された植物または植物細胞が含まれる。本発明のトランスジェニック植物は下記でまた考察される。

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