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技術 増幅核酸検出方法及び検出デバイス

出願人 株式会社カネカ
発明者 高橋孝治宮本重彦直原啓明友野潤
出願日 2019年3月4日 (5ヶ月経過) 出願番号 2019-038624
公開日 2019年5月30日 (2ヶ月経過) 公開番号 2019-080581
状態 特許登録済
技術分野 酵素、微生物を含む測定、試験 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード 着色ライン 親子判定 グラスファイバー製 カルボキシル基修飾 多孔質メンブレン 検査費用 スペーサー構造 左巻きの
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (9)

課題

ハイブリダイゼーション法特異性の高さを活用し、かつ、PCR産物の検出工程に要する時間と工程を減らし、特殊な装置を必要とすることなく、簡便かつ高精度に、目視にて検出する核酸検出方法、および核酸検出デバイスまたはキットを提供することを課題とする。

解決手段

試料中の標的核酸を検出する方法において、標的核酸配列増幅する際に、その両末端一本鎖領域を付加した部分的に二本鎖構造を有する増幅産物を合成する工程、該増幅産物の1本鎖領域展開媒体に結合した核酸配列、および標識化合物に結合した核酸配列とでサンドイッチハイブリダイゼーション複合体を形成する工程からなる標的核酸の検出法および検出デバイスを提供する。

概要

背景

分子生物学研究分野遺伝子検査等の臨床応用分野において、標的核酸配列を特異的に増幅する方法は非常に重要な技術となっている。核酸増幅法により得られた増幅産物を特異的に検出する方法の一つとして、標的配列を含む核酸断片固相に固定して検出する方法がある。この方法では、標的核酸を特異的に固相に捕捉することで、洗浄等により非特異的な核酸配列を容易に除去し、検出特異性を上げることが可能である。

この際、標的核酸を固相に捕捉する方法としては、特異的な結合を形成し得る抗原−抗体の組合せ、あるいは、リガンドレセプターの組合せを利用する方法が挙げられる。例えば、非特許文献1では、一方のプライマー末端ビオチン修飾し、他方のプライマーを蛍光物質修飾したプライマーを用いて増幅したPCR産物検出法が開示されている。この方法では、PCR産物をストレプトアビジンアガロースからなる固相と接触させ、ストレプトアビジン−ビオチン複合体を形成させることにより固相に結合させ、その蛍光を測定することで目的の増幅産物の検出が可能である。

しかし、標識に使用可能な抗原/抗体やリガンド/レセプターの組合せには制限があるため、同時に多数の標的核酸を検出することは実質的には困難である。また、蛍光標識核酸は高価であるといったコスト面の問題も有する。

標的核酸を固相に捕捉する別の方法として、標的核酸に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブを固相上に固定化し、標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションを介して、標的核酸を固相に間接的に固定化する方法がある。この方法ではハイブリッド形成によるシグナル強度の検出を行う。このような核酸解析法は、プローブ配列を変えることで複数の標的配列を一度に解析することが可能である。

しかし、固定化したプローブと標的核酸とを固相上でハイブリダイゼーションさせるには、一般にPCR法で増幅した二本鎖核酸を、熱処理により一本鎖変性する工程が必要であるが、加熱処理は煩雑であるだけでなく、再アニーリングによるハイブリダイゼーション効率の低下が問題である。また、一本鎖DNA球状化し易く、検出感度に劣るという問題も有している。特許文献1では、加熱処理を行わず、ヌクレアーゼ処理によって一本鎖核酸を増幅する方法が開示されているが、これも操作は煩雑であり、一本鎖の球状化の問題がある。

核酸の検出方法の中でも、操作性に優れ、迅速、簡便な標的核酸の検出方法として、特許文献2に記載のクロマトグラフィーに基づいた方法がある。この方法は、細胞ウイルスまたは細菌から遺伝子を抽出する工程、任意抽出された遺伝子の断片化工程、および検出工程が、単一の遺伝子検出装置上で、任意抽出された遺伝子またはその断片を含む液体試料キャピラリー作用によって移動させる事により連続して行われる遺伝子検出方法である。目的遺伝子存否を判断し、さらにその種類を同定する事が可能になる。

ただし、特許文献2でもNASBA法により一本鎖核酸を増幅している。一本鎖核酸の使用上の課題は前述の通りである。

上記の問題を解決するために、特許文献3及び特許文献4では、プライマー領域の5’側にDNAポリメラーゼによる核酸合成阻害する非天然型核酸タグ、ヘアピン構造、またはシューノット構造を有することで、PCR反応後も二本鎖核酸の片方一本鎖領域を残している。特殊なプライマーを用いてPCR反応を行うだけで、二本鎖DNAの片方の末端にハイブリダイゼーション可能な一本鎖領域を有する増幅産物を作製可能であるという点で優れている。しかし、検出には蛍光標識や、表面プラズモン共鳴イメージングによる検出が必要であるため、高価な専用の装置が必要であり、迅速性、簡便性の面で問題がある。

概要

ハイブリダイゼーション法の特異性の高さを活用し、かつ、PCR産物の検出工程に要する時間と工程を減らし、特殊な装置を必要とすることなく、簡便かつ高精度に、目視にて検出する核酸検出方法、および核酸検出デバイスまたはキットを提供することを課題とする。試料中の標的核酸を検出する方法において、標的核酸配列を増幅する際に、その両末端に一本鎖領域を付加した部分的に二本鎖構造を有する増幅産物を合成する工程、該増幅産物の1本鎖領域展開媒体に結合した核酸配列、および標識化合物に結合した核酸配列とでサンドイッチハイブリダイゼーション複合体を形成する工程からなる標的核酸の検出法および検出デバイスを提供する。なし

目的

本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであって、その目的はハイブリダイゼーション法の特異性の高さを活用し、かつ、PCR産物の検出工程に要する時間と工程を減らし、特殊な装置を必要とすることなく、簡便かつ高精度に、目視にて検出する核酸検出方法、および核酸検出デバイスまたはキットを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

下記(1)〜(3)の工程:(1)核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域を有するプライマーを用いて、PCR法により標的核酸増幅し、天然ヌクレオチドを含む一本鎖領域を有する二本鎖DNA増幅断片を得る工程、(2)前記二本鎖DNA増幅断片を含む液体を、一本鎖化処理を行うことなくクロマトグラフィー担体の配置領域に配置する工程、(3)前記二本鎖DNA増幅断片を含む液体をクロマトグラフィー担体上で拡散させ、前記二本鎖DNA増幅断片を、温度制御せずにクロマトグラフィー上の前記配置領域とは異なる領域に固定した第1のオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイズさせる工程を含む、核酸検出方法

請求項2

天然のヌクレオチドを含む一本鎖領域の長さが20塩基長以上である、請求項1に記載の核酸検出方法

請求項3

ハイブリダイズを室温で行うことを特徴とする、請求項1または2に記載の核酸検出方法。

請求項4

さらに、前記二本鎖DNA増幅断片と標識物質を結合させ、前記標識物質を目視検出する工程を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の核酸検出方法。

請求項5

前記天然のヌクレオチドを含む一本鎖領域が、二本鎖DNA領域と同一方向からなる配列であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の核酸検出方法。

請求項6

プライマーが、標的核酸の鋳型にハイブリダイズ可能な配列とタグ領域との間に、ポリメラーゼ反応阻害領域からなるスペーサー構造を有する請求項5に記載の核酸検出方法。

請求項7

前記工程(1)が、標的核酸の鋳型にハイブリダイズ可能な配列、及び、該鋳型にハイブリダイズ不可能な共通配列を有するプライマーを含む第1プライマーセット、並びに、上記共通配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列、及び核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域を有するプライマーを含む第2プライマーセットを用いて、PCR法により標的核酸を増幅する工程である、請求項1〜6のいずれかに記載の核酸検出方法。

請求項8

前記核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域が、天然のヌクレオチドからなり、共通配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列と同一方向からなる配列である請求項7に記載の核酸検出方法。

請求項9

第2プライマーセットに含まれるプライマーが、共通配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列と、核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域との間に、ポリメラーゼ反応阻害領域からなるスペーサー構造を有する、請求項7または8に記載の核酸検出方法。

技術分野

0001

本発明は、増幅核酸の簡便な検出方法、およびそのデバイスに関する。

背景技術

0002

分子生物学研究分野遺伝子検査等の臨床応用分野において、標的核酸配列を特異的に増幅する方法は非常に重要な技術となっている。核酸増幅法により得られた増幅産物を特異的に検出する方法の一つとして、標的配列を含む核酸断片固相に固定して検出する方法がある。この方法では、標的核酸を特異的に固相に捕捉することで、洗浄等により非特異的な核酸配列を容易に除去し、検出特異性を上げることが可能である。

0003

この際、標的核酸を固相に捕捉する方法としては、特異的な結合を形成し得る抗原−抗体の組合せ、あるいは、リガンドレセプターの組合せを利用する方法が挙げられる。例えば、非特許文献1では、一方のプライマー末端ビオチン修飾し、他方のプライマーを蛍光物質修飾したプライマーを用いて増幅したPCR産物検出法が開示されている。この方法では、PCR産物をストレプトアビジンアガロースからなる固相と接触させ、ストレプトアビジン−ビオチン複合体を形成させることにより固相に結合させ、その蛍光を測定することで目的の増幅産物の検出が可能である。

0004

しかし、標識に使用可能な抗原/抗体やリガンド/レセプターの組合せには制限があるため、同時に多数の標的核酸を検出することは実質的には困難である。また、蛍光標識核酸は高価であるといったコスト面の問題も有する。

0005

標的核酸を固相に捕捉する別の方法として、標的核酸に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブを固相上に固定化し、標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションを介して、標的核酸を固相に間接的に固定化する方法がある。この方法ではハイブリッド形成によるシグナル強度の検出を行う。このような核酸解析法は、プローブ配列を変えることで複数の標的配列を一度に解析することが可能である。

0006

しかし、固定化したプローブと標的核酸とを固相上でハイブリダイゼーションさせるには、一般にPCR法で増幅した二本鎖核酸を、熱処理により一本鎖変性する工程が必要であるが、加熱処理は煩雑であるだけでなく、再アニーリングによるハイブリダイゼーション効率の低下が問題である。また、一本鎖DNA球状化し易く、検出感度に劣るという問題も有している。特許文献1では、加熱処理を行わず、ヌクレアーゼ処理によって一本鎖核酸を増幅する方法が開示されているが、これも操作は煩雑であり、一本鎖の球状化の問題がある。

0007

核酸の検出方法の中でも、操作性に優れ、迅速、簡便な標的核酸の検出方法として、特許文献2に記載のクロマトグラフィーに基づいた方法がある。この方法は、細胞ウイルスまたは細菌から遺伝子を抽出する工程、任意抽出された遺伝子の断片化工程、および検出工程が、単一の遺伝子検出装置上で、任意抽出された遺伝子またはその断片を含む液体試料キャピラリー作用によって移動させる事により連続して行われる遺伝子検出方法である。目的遺伝子存否を判断し、さらにその種類を同定する事が可能になる。

0008

ただし、特許文献2でもNASBA法により一本鎖核酸を増幅している。一本鎖核酸の使用上の課題は前述の通りである。

0009

上記の問題を解決するために、特許文献3及び特許文献4では、プライマー領域の5’側にDNAポリメラーゼによる核酸合成阻害する非天然型核酸タグ、ヘアピン構造、またはシューノット構造を有することで、PCR反応後も二本鎖核酸の片方一本鎖領域を残している。特殊なプライマーを用いてPCR反応を行うだけで、二本鎖DNAの片方の末端にハイブリダイゼーション可能な一本鎖領域を有する増幅産物を作製可能であるという点で優れている。しかし、検出には蛍光標識や、表面プラズモン共鳴イメージングによる検出が必要であるため、高価な専用の装置が必要であり、迅速性、簡便性の面で問題がある。

0010

特開平5−252998号公報
特開2006−201062号公報
国際公開第2006/095550号パンフレット
特開2009−296948号公報

先行技術

0011

Analytical biochemistry, 193, 231-235, (1991)

発明が解決しようとする課題

0012

臨床現場における遺伝子診断検査においては、検査装置が大型かつ高価であること、及び、検査時間を要することで、患者検査費用や数回の通院での手間や負担を要することが多い。そこで、検査の正確性を保ちつつも患者及び検査者の負担を軽減する必要があるという理由から、簡便、迅速かつ特異性の高い方法、低コストで特殊な装置を必要としない方法が求められる。本発明は、前記問題に鑑みてなされたものであって、その目的はハイブリダイゼーション法の特異性の高さを活用し、かつ、PCR産物の検出工程に要する時間と工程を減らし、特殊な装置を必要とすることなく、簡便かつ高精度に、目視にて検出する核酸検出方法、および核酸検出デバイスまたはキットを提供することを課題とする。さらには、これまでは高価な標識タグを標的核酸ごとに作製する必要があり、手間とコスト面で改善の余地があった。

課題を解決するための手段

0013

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、標的核酸を、両末端それぞれに一本鎖領域を有する二本鎖核酸として増幅し、当該増幅断片を、前記一本鎖領域の一方とハイブリダイゼーションし得るオリゴヌクレオチドプローブを有する固相と結合させ、これを検出することにより、特殊な装置を必要とすることなく、前記DNA増幅断片を簡便かつ高精度に検出できることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。

0014

すなわち、本発明は、両末端に天然ヌクレオチドを含む一本鎖領域を有する二本鎖DNA増幅断片の一方の一本鎖領域と、固相上に固定した第1のオリゴヌクレオチドプローブとを、ハイブリダイズさせる工程を含む核酸検出方法に関する。

0015

前記DNA増幅断片の他方の一本鎖領域と、標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブとを、ハイブリダイズさせる工程をさらに含むことが好ましい。

0016

標識物質が着色担体からなり、前記DNA増幅断片を目視検出できることが好ましい。

0017

前記DNA増幅断片を核酸検出デバイス上で検出する工程を含むことが好ましい。

0018

クロマトグラフィーにて前記DNA増幅断片を検出することが好ましい。

0019

下記工程(a)〜(c):
(a)前記核酸検出デバイス上の、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域とは異なる領域に、前記DNA増幅断片を配置する工程、
(b)溶媒を用いて、前記DNA増幅断片を、前記第1オリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域の方向に、上記デバイス上で拡散させる工程、及び
(c)前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域において、前記第1オリゴヌクレオチドプローブと、前記DNA増幅断片とを、ハイブリダイズさせる工程、
を含むことが好ましい。

0020

前記工程(c)の前に、前記DNA増幅断片と、前記標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせる工程をさらに含むことが好ましい。

0021

(d)前記核酸検出デバイス上の、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域とは各々異なる領域に、前記DNA増幅断片、および前記標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ配置し、
(e)溶媒を用いて、前記DNA増幅断片を、前記標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブが配置されている領域の方向に拡散させ、
(f)前記標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブが配置されている領域において、前記DNA増幅断片と、標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせ、
(g)工程(f)でハイブリダイズした複合体を前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが配置されている方向に、展開媒体上で拡散させ、
(h)前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域において、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブと前記複合体とをハイブリダイズさせることが好ましい。

0022

前記天然のヌクレオチドを含む一本鎖領域が、二本鎖DNA領域と同一方向からなる配列であることが好ましい。

0023

前記DNA増幅断片は、核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域を有する2つのプライマーを用いて核酸増幅法により得られた産物であることが好ましい。

0024

前記DNA増幅断片が、標的核酸の鋳型にハイブリダイズ可能な配列、及び、該鋳型にハイブリダイズ不可能な共通配列を有するプライマーを含む第1プライマーセット、並びに、上記共通配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列、及び核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域を有するプライマーを含む第2プライマーセットを用いて、核酸増幅法により得られた産物であることが好ましい。

0025

前記核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域が、天然のヌクレオチドからなり、第2プライマーセットのプライマー全長が同一方向からなる配列であることが好ましい。

0026

また、本発明は、前記核酸検出方法に用いる核酸検出デバイスであって、前記DNA増幅断片を配置する領域、前記DNA増幅断片と結合する前記第1のオリゴヌクレオチドプローブを保持したクロマトグラフィー担体、及び、標識物質が結合した前記第2のオリゴヌクレオチドプローブとを具備してなる検出デバイスに関する。

0027

また、本発明は、核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域を有する2つのプライマーを用いて核酸増幅法により得られる、両末端に天然のヌクレオチドを含む一本鎖領域を有する二本鎖DNA増幅断片に関する。

0028

プライマーの核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域が、天然のヌクレオチドからなり、プライマー全長が同一方向からなる配列であることが好ましい。

発明の効果

0029

本発明によれば、DNA増幅産物の一本鎖領域を利用して特異的に固相と結合させることができ、更にもう一方の一本鎖領域を利用して標識化合物との複合体を形成することができ、特殊な装置を用いることなくDNA増幅産物を簡便、迅速に目視判定することが可能となる。さらに、構造的に安定な二本鎖DNAを検出することによって、全長1本鎖の検出と比較して検出感度が向上される。また、固相に結合させるための増幅産物の一本鎖領域と、これに相補的な固相上のオリゴヌクレオチドプローブの組み合わせを複数種用意することで、試料中に存在する2種以上の標的核酸を同時に判別することも可能となる。さらに、本発明の別態様を用いて安価なジョイントプライマーを介することによりあらゆる標的核酸に同一の一本鎖領域を付加することが可能となる。その同一の一本鎖領域を利用して、同一の標識タグおよびデバイスを用いて検出が可能となる。この場合、高価な標識タグを標的核酸ごとに作製する必要がなく、手間とコストを大幅に改善することができる。

図面の簡単な説明

0030

本発明のPCR用プライマー概念図である。
本発明のPCR用第1プライマーの概念図である。
本発明のPCR用第2プライマーの概念図である。
本発明における部分二本鎖核酸合成法の概念図である。
本発明における部分二本鎖核酸の合成法の別様態の概念図である。
本発明の核酸クロマトグラフィーデバイスの一例を示す概略図である。
本発明におけるPCR産物検出原理の概念図である。
本発明のマイクロアレイDNAチップ)の一例を示す概略図である。
本発明のビーズ担体の一例を示す概略図である。

0031

本発明は、両末端に天然のヌクレオチドを含む一本鎖領域を有する二本鎖DNA増幅断片の一方の一本鎖領域と、固相上に固定した第1のオリゴヌクレオチドプローブとを、ハイブリダイズさせる工程を含む核酸検出方法に関する。

0032

二本鎖DNA増幅断片は、鋳型となる試料DNAに対して、特定のプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うことにより得られる。

0033

試料DNAは特に限定されず、核酸増幅反応の鋳型として用いることができればよい。具体的には、血液、体液組織口腔内粘膜毛髪、爪、培養細胞動物、植物、微生物等のあらゆる生物試料由来のDNAを用いることができる。また、上記試料DNAはゲノムDNA、cDNAミトコンドリアDNA、および葉緑体DNAなどでもよい。また、RNAを鋳型に逆転写後に得られたcDNAを用いることもできる。これらDNAは、増幅させるDNA断片に応じて、適時選択すればよい。また、試料DNAは精製されたDNAである必要はなく、試料DNAを含む細胞や組織を、精製処理することなく、そのまま核酸増幅反応に適用することができる。

0034

両末端に一本鎖領域を有する二本鎖DNA増幅断片は、核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域を有する2つのプライマーを用いて核酸増幅法により得られた産物であることが好ましい。この場合において、二本鎖DNA増幅断片の両末端の一本鎖領域は、核酸増幅反応に使用するプライマーのうち、核酸増幅反応により二本鎖化されないタグ領域に由来する領域である。

0035

図1核酸増幅用プライマーを示す。このプライマーは、プライマー本体領域1と、前記プライマー本体部の5’側に核酸増幅反応により二本鎖化されないタグ領域2からなる。また、プライマー本体領域とタグ領域との間に、ポリメラーゼ反応阻害領域3からなるスペーサー構造を有していても良い。

0036

また、二本鎖DNA増幅断片は、標的核酸の鋳型にハイブリダイズ可能な配列、及び、該鋳型にハイブリダイズ不可能な共通配列を有するプライマーを含む第1プライマーセット、並びに、上記共通配列の相補配列とハイブリダイズ可能な配列、及び核酸増幅反応において二本鎖化されないタグ領域を有するプライマーを含む第2プライマーセットを用いて、核酸増幅法により得られた産物であることが好ましい。図2にPCR用第1プライマーセットを構成するプライマーを示す。PCR用第1プライマー(ジョイントプライマー)は、標的核酸の鋳型にハイブリダイズ可能なプライマー本体領域4と、前記プライマー本体領域の5’側に第2プライマーと共通の配列からなる共通領域5からなることを特徴とする。図3にPCR用第2プライマーセットを構成するプライマーを示す。第2プライマーは、前記第1プライマーと共通の配列を有するプライマー本体領域6と、本体領域6の5’側に核酸増幅反応により二本鎖化されないタグ領域7からなることを特徴とする。第2プライマー本体領域とタグ領域との間に、ポリメラーゼ反応阻害領域8からなるスペーサー構造を有していてもよい。

0037

プライマー本体領域とは、核酸増幅反応におけるプライマーとして機能し得る塩基配列を有するオリゴヌクレオチド領域を意味する。具体的には、標的核酸の標的塩基配列における5’末端側又は3’末端側とハイブリダイズし得る配列であり、一般的には、標的塩基配列の5’末端側または、3’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列である。これらのプライマー本体領域は、標的核酸と特異的に結合可能であれば、塩基欠損や挿入、およびミスマッチ部位を有していても良い。プライマー本体領域の長さは、8塩基以上であることが好ましく、12塩基以上であることがより好ましく、15塩基以上であることがさらに好ましい。また、プライマーの鎖長には特に上限はないが、その合成のコストなどの観点から、通常は50塩基以下、あるいは40塩基以下のものが好適である。

0038

プライマーのタグ領域は、天然のヌクレオチドを含むものであれば特に限定されない。天然のヌクレオチドとは、天然のアデニンチミングアニンシトシンウラシルの塩基、および、デオキシリボースリボースの糖部、および、リン酸基から構成されるヌクレオチドのことであり、各部分が人工的な修飾を受けていないヌクレオチドのことである。天然のヌクレオチドは、D型ヌクレオチドであってもよく、L型ヌクレオチドであってもよい。D型ヌクレオチドとは、D型のデオキシリボースもしくはリボースからなるヌクレオチドを示す。また、L型ヌクレオチドとは、L型のデオキシリボースもしくはリボースからなるヌクレオチドを示す。タグ領域が天然のヌクレオチドを含むことにより、合成が安価で容易になるという効果を奏する。また、プライマーのタグ領域における天然のヌクレオチドの割合は、5%以上であることが好ましく、20%以上であることがより好ましく、50%以上であることがさらに好ましく、70%以上であることがさらにより好ましく、90%以上であることが最も好ましい。タグ領域の長さは特に限定されず、相補鎖核酸とハイブリダイズするために十分な長さを有していればよい。通常、5塩基〜60塩基であり、好ましくは6塩基〜40塩基である。

0039

プライマーのタグ領域の核酸の向きはプライマー本体領域と同一方向に配列されていることが好ましい。プライマーのタグ領域の核酸の向きがプライマー本体領域と同一方向に配列されることにより、合成が安価で容易になるという効果を奏する。例えば、アゾベンゼンのような非天然の化合物がタグ領域とプライマー本体領域の間に入っている場合のように、タグ領域とプライマー本体領域が直接つながっていなくても、同一方向に配列されていることが好ましい。ここで、核酸が同一方向であるとは、隣り合うヌクレオチド同士が、ヌクレオチド中の糖の3’位同士や5’位同士ではなく、5’位と3’位の間でホスホジエステル結合していることをいう。例えば、タグ領域において、ヌクレオチド同士がホスホジエステル結合により糖の5’位と3’位の間で結合されている場合には、本体領域においても、ヌクレオチド同士が糖の5’位と3’位の間で形成されていることをいう。

0040

ポリメラーゼ反応阻害領域とは、ポリメラーゼによる核酸伸長反応を阻害し、当該領域を一本鎖構造に保つことが可能なら特に限定されない。このような構造には、強固なヘアピン構造やシュードノット構造のようにポリメラーゼの進行を阻害する立体構造を有する核酸配列や、L型核酸や人工核酸等の非天然型核酸や、RNA、および、脂肪鎖のような非核酸構造が含まれる。

0041

「ヘアピン構造」や「シュードノット構造」とは、同一分子内の他の1本鎖領域対合して形成される、安定なループ構造を意味する。L型DNAは、L型のデオキシリボースからなるDNAであり、一般的に使用されているDNAポリメラーゼに認識されないので、DNA伸長反応の鋳型として機能しない。さらに、L型DNAは左巻きの二重らせん構造を形成するので、天然に存在するD型核酸とハイブリッドを形成することはなく、L型核酸同士でのみハイブリッドを形成できる。人工核酸とは、天然の核酸配列中に存在しない化合物を人工的に挿入したものを意味する。例えば、ペプチド核酸(PNA)、架橋化核酸(BNAもしくはLNA)またはアゾベンゼン、Fluorescein、Cy3、Cy5等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

0042

PNAとは主鎖にペプチド構造を保持した、DNAやRNAに似た構造を持つ分子であり、N−(2−アミノエチルグリシンアミド結合で結合したものが主鎖となっている。そして、核酸塩基に相当するプリン環ピリミジン環が、メチレン基カルボニル基を介して主鎖に結合している。BNA(LNA)とは、DNAもしくはRNAの糖部構造を架橋修飾することによって人工的に合成した核酸を示す。

0043

タグ領域が天然のヌクレオチドのみからなり、タグ領域の核酸の向きがプライマー本体領域と同じ方向である場合には、通常、プライマー領域との間にポリメラーゼ反応阻害領域を要する。一方、タグ領域がL型核酸や人工核酸などのように、DNAポリメラーゼによる反応の鋳型にならず核酸増幅反応後も二本鎖化されない場合には、ポリメラーゼ反応阻害領域は省略することも可能である。また、本発明のプライマーは、ヘアピン構造、シュードノット構造などの安定なループ構造、L型核酸、人工核酸などの非天然核酸、および脂肪鎖などの非核酸構造等を単独で有するものであってもよく、複数を組み合わせて有するものであってもよい。

0044

プライマーは、オリゴヌクレオチドの標識に通常用いられる様々な分子により標識することも可能である。このような分子としては、酵素磁性粒子蛍光色素放射性同位元素等が挙げられる。これらを単独で使用してもよく、複数を組み合わせて使用してもよい。

0045

設計したプライマーを製造する方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法により製造することができる。具体的には、DNA合成装置を用いるか、受託合成サービスを利用することで、設計したプライマーを容易に得ることができる。

0046

核酸増幅法は、上述のプライマーを使用して、両末端に天然のヌクレオチドを含む一本鎖領域を有する二本鎖DNA増幅断片を得られる方法であれば特に限定されない。例えば、PCRが挙げられる。また、LAMP法ICAN法などの等温増幅法も用いることが出来る。

0047

核酸増幅法としてPCRを用いる場合、PCR反応に用いるリバースプライマーフォワードプライマーの組み合わせとしては、両方のプライマーに異なるポリメラーゼ反応阻害領域を用いても良いし、片方にポリメラーゼ反応阻害領域を用いて、もう片方にはポリメラーゼ反応阻害領域を導入せずビオチンなどの修飾を行っても良い。

0048

PCR条件は特に限定されるものではなく、上述した試料DNAを鋳型として、前記プライマーセットを用いてPCRを行ったときに、試料DNAの所望の領域が増幅される条件であればよい。具体的には、PCRに用いるポリメラーゼは、特に限定されるものではないが、耐熱性DNAポリメラーゼであることがより好ましく、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さない耐熱性DNAポリメラーゼであることがより好ましい。このような耐熱性DNAポリメラーゼとしては、Ex−Taq(タカラバイオ社製)等を挙げることができるが、これに限定されない。また、温度、時間、緩衝液組成等のPCRの反応条件も特に限定されるものではなく、選択したDNAポリメラーゼ、プライマーの配列、目的配列部分の長さ等に応じて、適宜設定すればよい。核酸増幅反応により増幅されるDNAの長さは、20塩基以上であることが好ましく、40塩基以上であることがより好ましい。20塩基未満であると非特異的増幅が増える傾向がある。

0049

前記プライマーセットを使用して、定法によりPCRを行うことで、標的核酸配列の両末端に1本鎖領域を付加した増幅産物を得ることができる。図4には、増幅反応の一例として、プライマー本体領域とタグ領域からなるプライマーを用いた場合の増幅反応の模式図を示す。フォワードプライマー10は標的核酸配列9の5’末端側の一部と同一の配列からなるプライマー本体領域11と、その5’末端側にタグ領域12を有する。リバースプライマー13は、標的核酸配列の3’末端側の一部と相補的な配列からなるプライマー本体領域14と、その5’末端側にタグ領域15を有する。両プライマーに結合するタグ領域の配列は通常、それぞれ異なる配列を有している。前記プライマーセットを使用してPCRを行うと、両プライマーに付加されたタグ領域は実質的にPCR反応に関与しないため、両末端に一本鎖領域を有するDNA増幅産物16が得られる。両末端に一本鎖領域を有するDNA増幅断片とは、図4で示すように標的DNA領域と同一の二本鎖DNA部、及び、その両側のそれぞれの5’末端にタグ部として一本鎖領域を有するDNA増幅産物を意味する。つまり、前記DNA増幅断片をより詳細に説明すると、両末端に修飾されていない核酸で構成される一本鎖領域を有する二本鎖DNA増幅断片を示しており、かつ、両末端の一本鎖領域はそれぞれ連続するDNA鎖と同一方向からなる配列を有している。

0050

図5には、増幅反応の一例として、ジョイントプライマーセットとしてプライマー本体領域と共通配列領域からなるプライマー、および、共通配列とタグ領域からなるプライマーを用いた場合の増幅反応の模式図を示す。第1、および、第2プライマーセットを使用して、定法によりPCRを行うことで、標的核酸配列の両末端に1本鎖領域を付加した増幅産物を得ることができる。

0051

フォワード第1プライマー18は標的核酸配列17の5’末端側の一部と同一の配列からなるプライマー本体領域19と、その5’末端側に共通配列領域20を有する。リバース第1プライマー21は、標的核酸配列の3’末端側の一部と相補的な配列からなるプライマー本体領域22と、その5’末端側に共通配列領域23を有する。両プライマーに付加する共通領域の配列は通常、それぞれ異なる配列を有している。前記第1プライマーセットを利用してPCR反応を行うと共通領域を有する2本鎖DNA増幅産物24が得られる。

0052

さらにDNA増幅産物24の両端の共通配列領域のフォワード第2プライマー25は前記共通領域を有する2本鎖DNA増幅産物24の5’末端側の一部と共通の配列からなるプライマー本体領域26と、その5’末端側にタグ領域27を有する。リバース第2プライマー28は、前記共通領域を有する2本鎖DNA増幅産物24の3’末端側の一部と共通の相補的な配列からなるプライマー本体領域29と、その5’末端側にタグ領域30を有する。両プライマーに結合するタグ領域の配列は通常、それぞれ異なる配列を有している。前記プライマーセットを使用してPCRを行うと、両プライマーに付加されたタグ領域は実質的にPCR反応に関与しないため、両末端に一本鎖領域を有するDNA増幅産物31が得られる。本態様においては、第1プライマーを用いたPCR反応、および、第2プライマーを用いたPCR反応を図5のように連続して行うが、その順番は、第1プライマーと第2プライマーを同時に加えてもよい。或いは、第2プライマーを後から加えてもよい。

0053

両末端に一本鎖領域を有するDNA増幅断片とは、図5の31で示すように標的DNA領域と同一の二本鎖DNA部、及び、その両側のそれぞれの5’末端にタグ部として一本鎖領域を有するDNA増幅産物を意味する。

0054

第1、および、第2プライマーセットを用いることにより、標的核酸を変更しても、共通配列を同一の配列にしておくことで、第2プライマーは同一のプライマーを使用でき、同一の1本鎖タグ配列を作り出すことが可能となる。前記DNA増幅断片をより詳細に説明すると、両末端に修飾されていない核酸で構成される一本鎖領域を有する二本鎖DNA増幅断片を示しており、かつ、両末端の一本鎖領域はそれぞれ連続するDNA鎖と同一方向からなる配列を有している。

0055

前記プライマーを使用して得られた、前記増幅産物の一本鎖領域を利用して、ハイブリダイゼーション複合体を形成する。ハイブリダイゼーションとは核酸を含む分子が相補的に複合体を形成することをいい、DNA/DNAのほか、DNA/RNA、DNA/PNA、L−DNA/L−DNAなどが含まれる。本発明の核酸検出方法ではDNA増幅断片が一本鎖領域を有するので、核酸増幅工程で得られたDNA増幅産物は、熱処理等の一本鎖化処理等を行うことなく、ハイブリダイゼーション反応に使用することができる。

0056

両末端に天然のヌクレオチドを含む一本鎖領域タグを有する二本鎖DNA増幅断片の一方の一本鎖領域と、捕捉用担体(固相)に固定した第1のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせることができる。さらに、二本鎖DNA増幅断片の他方の一本鎖領域と、標識物質が直接的又は間接的に結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズする工程を含むことが好ましい。二本鎖DNA増幅断片、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、及び第2のオリゴヌクレオチドプローブからなる3者複合体形成サンドイッチハイブリダイゼーションと呼ぶ。なお、三者のハイブリダイゼーションの順は特に限定されない。

0057

第1のオリゴヌクレオチドプローブの長さは、二本鎖DNA増幅断片の一本鎖領域とハイブリダイズできれば特に限定されないが、5〜60塩基長であることが好ましく、10〜40塩基長であることがより好ましい。

0058

第2のオリゴヌクレオチドプローブの長さは、二本鎖DNA増幅断片の一本鎖領域とハイブリダイズできれば特に限定されないが、5〜60塩基長であることが好ましく、10〜40塩基長であることがより好ましい。

0059

第2のオリゴヌクレオチドプローブに結合する標識物質は、二本鎖DNA増幅断片の検出を実現するものであれば特に限定されないが、着色担体であって二本鎖DNA増幅断片の目視検出を実現できるものであることが好ましい。このような着色担体としては、着色粒子や酵素、色素結合担体などが挙げられる。これらの中でも、着色粒子を用いることが好ましい。

0060

着色粒子としては、金、銀、銅、白金などの金属からなるコロイド粒子や、顔料染料などでラテックスを着色してなる着色ラテックス色素分子シリカ二酸化ケイ素粒子内部に固定化したシリカナノ粒子などが挙げられる。これらの中でも、金コロイド粒子や、青色、赤色等に着色された水分散型高分子重合体からなる着色ラテックス粒子を用いることが好ましい。このような着色粒子を用いることにより、DNA増幅断片の目視判定をより容易なものとすることができる。特に多項目を同時に検出する際には、項目ごとに異なる色の着色粒子を用いることにより、多数の項目を同時に目視判定することが容易となる。

0061

着色粒子を用いる場合、その粒径は、特に限定されるものではないが、サンドイッチハイブリダイゼーション複合体の形成、および、標的配列を含む増幅産物の固相への捕捉に悪影響が小さく、かつ、検出の際に発色のよいものであることが好ましい。着色粒子の粒径は、後述のクロマトグラフィー用媒体孔径より小さい粒径から選択される。具体的には、通常500nm以下が用いられ、中でも0.1nm〜100nmとすることが好ましく、1nm〜50nmとすることがより好ましい。着色担体として用いる酵素とは、発色、もしくは、発光する基質の反応を触媒するタンパク質のことである。例えば、ペルオキシダーゼアルカリホスファターゼルシフェラーゼなどが挙げられるが、肉眼で検出可能であればこれに限定されない。

0062

二本鎖DNA増幅断片の末端の一本鎖領域と、第1又は第2のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが起こる条件であれば特に限定されないが、室温下、10mMリン酸緩衝液中で反応させることが好ましい。このとき塩化ナトリウム等の塩を入れることで、ハイブリダイゼーションの効率は上昇する。

0063

捕捉用担体(固相)上の認識可能な位置に形成されたサンドイッチハイブリダイゼーション複合体に含まれる標識物質を検出することにより、標的核酸の有無を判定することができる。検出は、目視にて判別することが好ましい。本発明の検出法によれば、核酸増幅反応の増幅産物は熱変性等の一本鎖化処理を行うことなく、そのままハイブリダイゼーション反応に使用することが可能である。また、特殊な装置を必要とすることなく、標的核酸の有無を簡便、迅速に目視にて判別することが可能である。

0064

上記のサンドイッチハイブリダイゼーション複合体の形成による核酸検出方法は、核酸検出デバイス上で行われることが好ましい。また、クロマトグラフィーにてDNA増幅核酸が検出されることが好ましい。

0065

図6の核酸クロマトグラフィーデバイスは、基材となる部材36の上に、サンプルパッド32(DNA増幅産物を添加するための担体)、コンジュゲートパッド33(着色担体結合オリゴヌクレオチドを配置した担体)、捕捉用オリゴヌクレオチドを保持した担体34(クロマトグラフィー用媒体)、及び吸収パッド35を、粘着剤等を用いて貼り合わせたものである。担体34の上には、捕捉用オリゴヌクレオチドを塗布したテストライン37、および、コントロールライン38が設けられている。着色担体結合オリゴヌクレオチドを展開溶液に混合する場合は、コンジュゲートパッド33が無くても良い。

0066

クロマトグラフィーでは、下記工程(a)〜(c):(a)核酸検出デバイス上の、第1のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域とは異なる領域に、DNA増幅断片を配置する工程、(b)溶媒を用いて、DNA増幅断片を、第1オリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域の方向に、デバイス上で拡散させる工程、及び(c)第1のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域において、第1オリゴヌクレオチドプローブとDNA増幅断片とをハイブリダイズさせる工程、を含む方法により、二本鎖DNA増幅断片が検出されることが好ましい。

0067

例えば、図6の核酸クロマトグラフィーデバイスの場合、工程(a)ではサンプルパッド32にDNA増幅断片を配置する。工程(b)では矢印方向にDNA増幅断片を拡散させる。工程(c)ではテストライン37において、固定された第1のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイズにより、DNA増幅断片を捕捉する。

0068

工程(c)の前に、DNA増幅断片と、標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせる工程をさらに含むことが好ましい。例えば、図6の核酸クロマトグラフィーデバイスの場合、コンジュゲートパッド33において、DNA増幅断片と第2のオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせる。

0069

また、クロマトグラフィーでは、(d)核酸検出デバイス上の、第1のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域とは各々異なる領域に、DNA増幅断片、および標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブをそれぞれ配置し、(e)溶媒を用いて、DNA増幅断片を、標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブが配置されている領域の方向に拡散させ、(f)標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブが配置されている領域において、DNA増幅断片と、標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブとをハイブリダイズさせ、(g)工程(f)でハイブリダイズした複合体を第1のオリゴヌクレオチドプローブが配置されている方向に、展開媒体上で拡散させ、(h)前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが固定されている領域において、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブと前記複合体とをハイブリダイズさせることが好ましい。

0070

例えば、図6の核酸クロマトグラフィーデバイスの場合、工程(d)ではサンプルパッド32にDNA増幅断片を配置し、コンジュゲートパッド33に第2のオリゴヌクレオチドプローブを配置する。工程(e)では、DNA増幅断片を、サンプルパッド32から矢印方向に拡散させる。工程(f)ではコンジュゲートパッド33において、DNA増幅断片と、第2のオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする。工程(g)ではDNA増幅断片と、標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイズによる複合体を、矢印方向に拡散させる。工程(h)ではテストライン37において第1のオリゴヌクレオチドプローブと複合体とをハイブリダイズさせる。

0071

メンブレン上のテストラインには前記DNA増幅断片の一方のタグ領域と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが、捕捉用の第1のオリゴヌクレオチドプローブとして固定化されている。捕捉用の第1のオリゴヌクレオチドプローブは、直接メンブレンに結合しても良く、官能基を介して結合していても良く、何らかの物質を介してメンブレンに結合していても良い。その仲介となる物質は、ペプチド、タンパク質、核酸などが挙げられるが限定されない。仲介となる物質がアビジンの場合は、捕捉用オリゴヌクレオチドにビオチン修飾が必要となる。

0072

メンブレン上のコントロールラインには、着色担体捕捉用のオリゴヌクレオチドプローブが固定化されている。コントロールライン用のオリゴヌクレオチドプローブは、標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブと相補的な配列を有しており、溶液展開すると必ず標識物質が捕捉されるようになっている。コントロールライン用のオリゴヌクレオチドプローブに関しても前述と同様に直接メンブレンに結合しても良いし、官能基を介して、結合していても良いし、何らかの物質を介してメンブレンに結合していても良い。その仲介となる物質は、ペプチド、タンパク質、核酸などが挙げられるが、限定されない。仲介となる物質がアビジンの場合は、捕捉用オリゴヌクレオチドにビオチン修飾が必要となる。

0073

テストラインにおける呈色により、試料中のターゲット核酸の存在を目視で判別することが可能である。一方、コントロールラインにおける呈色により、正常な展開と呈色反応が行えていることを目視で判別することが可能である。ここで、目視とは肉眼で観察して色を判断することをいう。

0074

クロマトグラフィー用媒体としては、定性濾紙、定量濾紙、分液濾紙、硝子繊維濾紙、シリカ繊維濾紙、複合繊維濾紙よりなる濾紙などが挙げられる。また、ニトロセルロースなどのセルロースよりなる濾紙や、ポリエーテルスルフォンメンブレンなどの合成樹脂の膜や、シリカゲル、アガロース、デキストランゼラチンなどの多孔質ゲルも使用することができる。また、ナイロンメンブレンも好適に使用できる。実際の使用に際して、このクロマトグラフ媒体の形態および大きさは特に制限されるものではなく、操作および反応結果の観察において適切であればよい。

0075

これらの担体は、親水性や化合物の結合性を向上させるために様々な修飾を施すことも可能である。操作をより簡便にするためには、反応部位が表面に形成されているクロマトグラフィー媒体の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。

0076

デバイス内の展開方向としては、図6に示すように水平方向でも良いし、垂直方向でも良く特に限定されない。展開溶媒としては、核酸増幅反応における溶媒を使用することができるので、核酸増幅反応後の反応液をそのまま、図6におけるサンプルパッド32に滴下することができる。または、増幅反応後の反応液に、別途展開溶液を添加しサンプルパッドに添加することも可能である。展開溶媒としては、液体であれば特に限定されないが、リン酸緩衝液や、Tris緩衝液などのグッド緩衝液が使用可能である。また、溶媒には塩、界面活性剤、タンパク質、もしくは、核酸を溶解しておいても良い。

0077

図7にて、本発明の実施形態の一例として、クロマト担体上でのサンドイッチハイブリダイゼーション複合体の形成を例にとって説明する。核酸増幅工程で得られたDNA増幅断片16は、熱処理等の一本鎖化処理等を行うことなく次の複合体形成工程に使用する。前記DNA断片の一方のタグ領域12と特異的に結合可能な核酸配列39及び着色担体40を含むオリゴヌクレオチドプローブと、DNA増幅断片16との間のハイブリダイゼーションにより、第1の複合体41が形成される。複合体41は、PCRの反応容器のように、展開媒体にアプライ前に形成してもよいし、DNA増幅断片を担体上にアプライし、毛細管現象で移動中に前記標識分子結合オリゴヌクレオチドを塗布、乾燥させた担体を通過させて形成することも可能である。

0078

複合体41は、多孔質メンブレン等からなるクロマトグラフィー用媒体42上の識別可能な位置に予め結合した捕捉用オリゴヌクレオチドプローブ43と、展開媒体上で接触する。前記捕捉用のオリゴヌクレオチド43は、前記DNA増幅断片のもう一方のタグ配列15と相補的な配列を有しており、複合体41と捕捉用オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、サンドイッチハイブリダイゼーション複合体が形成される。

0079

サンドイッチハイブリダイゼーション複合体を形成する順序は特に限定されない。DNA増幅断片と標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドプローブとの複合体41を形成後、捕捉用の第2のオリゴヌクレオチドプローブとの複合体を形成するのが好ましいが、DNA増幅断片を捕捉用の第1のオリゴヌクレオチドプローブで展開媒体上で濃縮後、標識物質が結合した第2のオリゴヌクレオチドを展開し、サンドイッチハイブリダイゼーション複合体を形成することも可能である。

0080

その他の核酸検出デバイス形態としては、図8で示すようなマイクロアレイ(DNAチップ)が挙げられる。マイクロアレイ44上の捕捉用オリゴヌクレオチドを固定したウェル内に、サンドイッチハイブリダイゼーションにより3者複合体を形成させることが可能である。

0081

また、図9で示すようなビーズ形態が挙げられる。捕捉用オリゴヌクレオチドを保持したビーズ担体45上で、サンドイッチハイブリダイゼーションによる3者複合体を形成させることが可能である。

0082

本発明の核酸検出方法、および核酸検出デバイスは、核酸増幅工程を含むあらゆる技術に用いることができる。換言すれば、核酸増幅法によるDNA増幅断片(例えば、PCR産物)を検出することを含むあらゆる分野の技術に用いることができる。具体的には、例えば、分子生物学の研究分野、病原体の検出、アレルゲンなど食品中の混入物の検出、食品の品質管理偽装表示食品、遺伝子組み換え食品などの検査)、家畜管理、塩基多型(以下、「SNP」ともいう)の検出、ガンなどの疾患検査等に用いることができる。したがって、本発明には、本発明にかかる核酸検出方法を一工程として含む、病原体による感染症の検出方法、食品中の混合物(例えば、アレルゲン)の検出方法、食品の品質管理、家畜の管理方法、および塩基多型の検出方法等も含まれる。

0083

ここで、本発明の利用の一実施形態として、本発明にかかる病原体の検出方法、およびアレルゲンの検出方法、について詳細に説明する。

0084

本発明にかかる病原体の検出方法は、本発明にかかる核酸検出方法を用いて、病原体が特異的に有する遺伝子を検出する工程を含んでいればよい。上記病原体は、特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、病原性細菌病原性ウィルス食中毒細菌院内感染原因細菌およびウィルス等を挙げることができる。より具体的には、例えば、C型肝炎ウィルス(HCV)、サイトメガロウィルス(CMV)、エプスタインーバーウィルス(EBV)、ヘルペスウィルス、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)等のウイルス、0157等の大腸菌結核菌チフス菌サルモネラ菌もしくは腸炎ビブリオ菌等の細菌、またはマイコプラズマ等の微生物を例示することができる。

0085

本発明にかかる病原体の検出方法について、より具体的に説明すると、例えば、病原体の有無を検査する対象となる試料から調製したDNA試料に、上記病原体が特異的に有する遺伝子が含まれるか否かを上記核酸検出方法を用いて判定する。また、DNA試料を調製することなく、病原体の有無を検査する対象となる試料をそのまま核酸増幅法の鋳型として使用することもできる。例えば、病原体として大腸菌等の細菌を検出する場合に、細菌のコロニーの懸濁液を鋳型として使用することができる。その結果、病原体が特異的に有する遺伝子が検出された場合には、該試料には病原体が含まれていると判定する。これにより、特殊な装置を必要とすることなく、簡便に、かつ、高精度に、試料中に病原体が含まれているか否かを判定することができる。すなわち、本発明にかかる病原体の検出方法は、微生物の感染症の診断に用いることができる。

0086

本発明にかかるアレルゲンの検出方法は、本発明にかかる核酸検出方法を用いて、アレルゲンをコードする遺伝子を検出する工程を含んでいればよい。上記アレルゲンは特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、食品中に含まれるアレルゲンを挙げることができる。より具体的には、卵白アレルゲン乳アレルゲン小麦アレルゲン、そばアレルゲン、および落花生アレルゲン等を挙げることができる。本発明にかかるアレルゲンの検出方法について、より具体的に説明すると、例えば、食品から調製したDNA試料に、、乳、小麦、そば、落花生などのアレルゲンをコードする遺伝子が含まれるか否かを上記核酸検出方法を用いて判定する。その結果、このような遺伝子が検出された場合には、該食品には、アレルゲンを含有する原料が含まれていると判定する。

0087

これにより、特殊な装置を必要とすることなく、簡便に、かつ、高精度に食品等の試料中に、アレルゲンを含有する原料が含まれているか否かを判定することができる。なお、アレルゲンの由来は、上記例示したものに限定されるものではなく、例えば、穀類を例に取れば、イネ、トウモロコシアワキビヒエソバ、およびマメ類のすべてが含まれまた、DNAは、熱に安定であり、加工食品中でも微量に検出される。したがって、本発明にかかるアレルゲンの検出方法により得られたデータは、食品の表示に利用したり、食品のアレルギー情報として利用したりすることに加えて、加工助剤キャリーオーバー食品添加物のごく微量の残存、あるいは製造ライン問の相互汚染の有無等の生産者の意図していない物質の混入の検出に用いることができる。

0088

そのほか、本発明は、ヒトを含む哺乳動物親子鑑定、家畜の血統の特定、農産物品種の特定、SNP検出、遺伝子の変異による疾患(癌など)の検出等に用いることができる。具体的には、例えば、家畜についていえば、血統登録個体識別親子判定病原遺伝子キャリア個体の除去などの目的に利用することができる。なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示した技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

0089

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。

0090

<実施例1>
(1)L−DNAタグ付きプライマーの合成
本実施例では、鋳型としてpUC19(タカラバイオ社製)を用い、PCR増幅により約330塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(F)およびリバースプライマー(R)を設計した。さらにそれぞれの5’末端側に非天然型(L型)DNA鎖からなるタグ配列T1およびT2を導入したL−DNAタグ付きプライマー、T1−FおよびT2−Rを設計した。L−DNAタグ付きプライマーの合成は、0.2μMスケールカラムを用いて、一般的なホスホロアミダイト法に基づいて、DNA自動合成機(H−8−SE:Gene World)で合成した。

0091

本検討で作製したプライマーセットを示す。
プライマーF:5’−Dd(GGAAACAGCTATACCATGA)−3’(配列番号1)
プライマーR:5’−Dd(CTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号2)
タグ配列T1:5’−Ld(GACAACGGAGACAGAGCCAA)−3’(配列番号3)
タグ配列T2:5’−Ld(ATGCTACCGTATGCCCAGTG)−3’(配列番号4)
プライマーT1−F:5’−Ld(GACAACGGAGACAGAGCCAA)−Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号5)
プライマーT2−R:5’−Ld(ATGCTACCGTATGCCCAGTG)−Dd(CTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号6)。

0092

(2)L−DNAタグ付きプライマーセットを用いたPCR反応
前記工程(1)で実施し作製したプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーFとプライマーRを各15pmolと、10ngのpUC19とを0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを35回行い、目的の約330bpを増幅した。また、pUC19を添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。

0093

(3)ラテックス結合L型オリゴヌクレオチドプローブの作製
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有L型オリゴヌクレオチドプローブ(配列番号7、配列番号3の相補鎖)を、水溶性カルボジイミド必要量添加したMES緩衝液中で混合し、結合後モノエタノールアミンブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むHEPES緩衝液再懸濁し、グラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
ヌクレオチドプローブ1:5’−Ld(TTGGCTCTGTCTCCGTTGTC)−NH2−3’(配列番号7)。

0094

(4)L型オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
カルボキシル基修飾ナイロンメンブレン(日本ポール社製、6mmx60mm)を水溶性カルボジイミドにより処理し、脱イオン水で洗浄した。活性化したメンブレンの一端から30mmの箇所に、配列番号4に対して相補的な配列(配列番号8)を有するアミノ基含有L型オリゴヌクレオチドプローブを、ディスペンサーを用いてライン上に塗布し、15分間風乾した。その後、メンブレンをTris緩衝液で処理し、ブロッキング後、メンブレンを水洗、乾燥した。
ヌクレオチドプローブ2:5’−Ld(CACTGGGCATACGGTAGCAT)−NH2−3’(配列番号8)。

0095

(5)核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したナイロンメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、L型DNAタグ付きプライマーセットを用いたPCR増幅産物検出用テストストリップを作製した。

0096

(6)テストストリップによるPCR産物の検出
工程(2)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(5)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。工程(2)で検体としてpUC19を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。

0097

<実施例2>
(1)ヘアピンタグ付きプライマーの合成
実施例1の工程(1)と同様に、鋳型としてpUC19(タカラバイオ社製)を用い、PCR増幅により約330塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(F)およびリバースプライマー(R)を設計した。その5’末端側にヘアピン構造を有するポリメラーゼ反応阻害領域(H)、およびタグ配列T3およびT4を導入したタグ付きプライマー、T3−H−FおよびT4−H−Rを合成した。

0098

本検討で作製したプライマーセットを示す。
ポリメラーゼ反応阻害配列H:5’−Dd(AGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGCGCTCGCGACCTC GCCT)−3’(配列番号9)
タグ配列T3:5’−Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)−3’(配列番号10)
タグ配列T4:5’−Dd(TGCTCTGTACACTTGCTCAAT)−3’(配列番号11)
プライマーT3−H−F:5’− Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAATAGGCGAGGTCGCGAGCGCACATG TGCGCTCGCGACCTCGCCTGGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号12)
プライマーT4−H−R:5’− Dd(TGCTCTGTACACTTGCTCAATAGGCGAGGTCGCGAGCGCACATGTGC GCTCGCGACCTCGCCTCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号13)。

0099

(2)ヘアピンタグ付きプライマーセットを用いたPCR反応
前記工程(1)で実施し作製したプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーFとプライマーRを各15pmolと、10ngのpUC19とを0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを35回行い、目的の約330bpを増幅した。また、pUC19を添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。

0100

(3)ラテックス結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ(配列番号14、配列番号10の相補鎖)を、水溶性カルボジイミドを必要量添加したMES緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むHEPES緩衝液に再懸濁し、グラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ3:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)−NH2−3’(配列番号14)。

0101

(4)オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
カルボキシル基修飾ナイロンメンブレン(日本ポール社製、6mmx60mm)を水溶性カルボジイミドにより処理し、脱イオン水で洗浄した。活性化したメンブレンの一端から30mmの箇所に、配列番号11の相補的な配列(配列番号15)を有するアミノ基含有L型オリゴヌクレオチドプローブを、ディスペンサーを用いてライン上に塗布し、15分間風乾した。その後、メンブレンをTris緩衝液で処理し、ブロッキング後、メンブレンを水洗、乾燥した。
オリゴヌクレオチドプローブ4: 5’−Dd(ATTGAGCAAGTGTACAGAGCA)−NH2−3’(配列番号15)。

0102

(5)核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したナイロンメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、ヘアピンタグ付きプライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

0103

(6)テストストリップによるPCR産物の検出
工程(2)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(5)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。工程(2)で検体としてpUC19を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。

0104

<実施例3>
(1)人工核酸(アゾベンゼン)挿入プライマーの合成
実施例1の工程(1)と同様に、鋳型としてpUC19(タカラバイオ社製)を用い、PCR増幅により約330塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(F)およびリバースプライマー(R)を設計した。それぞれの5’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域(X)、およびタグ配列T5およびT6を導入したタグ付きプライマー、T5−X−FおよびT6−X−Rを合成した。この2種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。本検討で作製したプライマーセットを示す。

0105

タグ配列T5:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)−3’(配列番号16)
タグ配列T6:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)−3’(配列番号17)
プライマーT5−X−F:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG X GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号18)
プライマーT6−X−R:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号19)
なお、プライマーに挿入されたアゾベンゼンは下記式(1)で表される。

0106

0107

(2)アゾベンゼン挿入プライマープセットを用いたPCR反応
前記工程(1)で実施し作製したプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーT5−X−FとプライマーT6−X−Rを各15pmolと、10ngのpUC19とを0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを35回行い、目的の約330bpを増幅した。また、pUC19を添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。

0108

(3)ラテックス結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ(配列番号20、配列番号16の相補鎖)を、水溶性カルボジイミドを必要量添加したMES緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むHEPES緩衝液に再懸濁し、グラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ5:5’−Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)−NH2−3’(配列番号20)。

0109

(4)オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
カルボキシル基修飾ナイロンメンブレン(日本ポール社製、6mmx60mm)を水溶性カルボジイミドにより処理し、脱イオン水で洗浄した。活性化したメンブレンの一端から30mmの箇所に、配列番号17の相補的な配列(配列番号21)を有するアミノ基含有D型オリゴヌクレオチドプローブを、ディスペンサーを用いてライン上に塗布し、15分間風乾した。その後、メンブレンをTris緩衝液で処理し、ブロッキング後、メンブレンを水洗、乾燥した。
オリゴヌクレオチドプローブ6:5’−Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)−NH2−3’(配列番号21)。

0110

(5)核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したナイロンメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

0111

(6)テストストリップによるPCR産物の検出
工程(2)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(5)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。工程(2)で検体としてpUC19を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。

0112

<実施例4>
(1)金コロイド結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
Gold Colloid(40nm、9.0×1010(粒子数/ml)、British BioCell International社製)とチオール基含有オリゴヌクレオチドプローブ(配列番号22、配列番号16の相補鎖)を混合し、50℃で16時間インキュベートした。6000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去、0.05M塩化ナトリウム、5mMリン酸バッファー、pH7を添加し混和後、再度50℃で40時間インキュベートした。

0113

インキュベート後、遠心(6000rpm、15分間)を行い、上清を除去し、5mMリン酸バッファー(pH7)を添加した。このバッファー置換を再度行った。

0114

調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。

0115

オリゴヌクレオチドプローブ7:5’−Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)−SH−3’(配列番号22)。

0116

(2)オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号17に相補的な配列(配列番号23)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブを、ストレプトアビジンと混合する。その混合液ニトロセルロースメンブレン商品名:Hi−Flow 180、ミリポア社製)にディスペンサーを用いてライン上に塗布し、40℃で30分間風乾した。
オリゴヌクレオチドプローブ8:5’−Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)−Biotin−3’(配列番号23)。

0117

(3)核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

0118

(4)テストストリップによるPCR産物の検出
実施例3の工程(2)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(3)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。実施例3の工程(2)で検体としてpUC19を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。

0119

<実施例5>
(1)オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号17に相補的な配列(配列番号24)を有するオリゴヌクレオチドプローブをUltraBindアフィニティメンブレン(日本ポール社製)にディスペンサーを用いてライン上に塗布し、80℃で1時間風乾した。
オリゴヌクレオチドプローブ9:5’−Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)−3’(配列番号24)。

0120

(2)核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したUltraBindアフィニティメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

0121

(3)テストストリップによるPCR産物の検出
実施例3の工程(2)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(2)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。実施例3の工程(2)で検体としてpUC19を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。

0122

<実施例6>
(1)人工核酸(アゾベンゼン)挿入プライマーの合成
本実施例では、標的核酸の鋳型としてはpUC19(タカラバイオ社製)、EcoRIメチラーゼ遺伝子、および、BamHIメチラーゼ遺伝子の3種類をテンプレートとして用い、PCR増幅により約330塩基対、約200塩基対、および、約100塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(F1)とリバースプライマー(R1)、フォワードプライマー(F2)とリバースプライマー(R2)、および、フォワードプライマー(F3)とリバースプライマー(R3)の3組のプライマーをそれぞれ設計した。それぞれの5’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域(X)、およびタグ配列T10とT11、タグ配列T12とT13、および、タグ配列T14とT15を導入したタグ付きプライマー、T10−X−F1とT11−X−R1、T12−X−F2とT13−X−R2、および、T14−X−F3とT15−X−R3を合成した。この6種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。以下に本検討で作製した3組のプライマーセットを示す。

0123

タグ配列T10:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)−3’(配列番号25)
タグ配列T11:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)−3’(配列番号26)
プライマーT10−X−F1:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG X GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号27)
プライマーT11−X−R1:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号28)
タグ配列T12:5’−Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT)−3’(配列番号29)
タグ配列T13:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)−3’(配列番号30)
プライマーT12−X−F2:5’−Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT X AGCATTATGAATTATATGGT)−3’(配列番号31)
プライマーT13−X−R2:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA X TTGTTTACATTTATAGCATC)−3’(配列番号32)
タグ配列T14:5’−Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA)−3’(配列番号33)
タグ配列T15:5’−Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)−3’(配列番号34)
プライマーT14−X−F3:5’−Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA X TGGTTTTAAAACTCTGATAC)−3’(配列番号35)
プライマーT15−X−R3:5’−Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG X AGTATGATGAGGGTGTAACA)−3’(配列番号36)

0124

(2)アゾベンゼン挿入プライマーセット3組を用いたPCR反応
前記工程(1)で実施し作製した3組のプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーT10−X−F1、プライマーT11−X−R1、プライマーT12−X−F2、プライマーT13−X−R2、プライマーT14−X−F3、および、プライマーT15−X−R3を各15pmolと、各テンプレート10ngを0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。反応液は次の5種類を用意した。
(i)テンプレートとしてpUC19(タカラバイオ社製)を添加、
(ii)テンプレートとしてEcoRIメチラーゼ遺伝子を添加、
(iii)テンプレートとしてBamHIメチラーゼ遺伝子を添加、
(iv)テンプレートとしてpUC19(タカラバイオ社製)、EcoRIメチラーゼ遺伝子、および、BamHIメチラーゼ遺伝子の3種類全て添加、そして、
(v)テンプレートなし。

0125

これら反応液を調製後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmpPCRSystem、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを30回行い、それぞれ目的の配列を有するDNA断片を次のように得た。(i)約330bp、(ii)約200bp、(iii)約100bp、および、(iv)約330bp、約200bp、約100bpの3種類、(v)増幅DNA断片なし(ネガティブコントロールとする)を増幅した。

0126

(3)ラテックス結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(青色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ16(配列番号37、配列番号25の相補鎖)、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(オレンジ色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ17(配列番号38、配列番号29の相補鎖)、および、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(緑色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ18(配列番号39、配列番号33の相補鎖)を、それぞれ水溶性カルボジイミドを必要量添加したMES緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むHEPES緩衝液に再懸濁し、オリゴヌクレオチドプローブ16結合ラッテクス(青色)、オリゴヌクレオチドプローブ17結合ラテックス(オレンジ色)、オリゴヌクレオチドプローブ18結合ラテックス(緑色)を作製した。

0127

この3種のラテックスをグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ16:5’−Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)−NH2−3’(配列番号37)。
オリゴヌクレオチドプローブ17:5’−Dd(TTGCTCTGTACACTTGCTCAATGCG)−NH2−3’(配列番号38)
オリゴヌクレオチドプローブ18:5’−Dd(TTACACATGGACATGCGCAATT)−NH2−3’(配列番号39)
(4)3種のオリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号26に相補的な配列(配列番号40)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ、配列番号30に相補的な配列(配列番号41)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ、および、配列番号34に相補的な配列(配列番号42)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブを、それぞれストレプトアビジンと混合する。それらの混合液をニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow 135、ミリポア社製)上の3箇所にディスペンサーを用いて、上流側から順に互いに離れた位置でライン上に塗布し、40℃で30分間風乾した。3本の検出ラインを作製した。
オリゴヌクレオチドプローブ19:5’−Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)−Biotin−3’(配列番号40)。
オリゴヌクレオチドプローブ20:5’−Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)−Biotin−3’(配列番号41)。
オリゴヌクレオチドプローブ21:5’−Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)−Biotin−3’(配列番号42)。

0128

(5)核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、工程(3)で作製したコンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

0129

(6)テストストリップによるPCR産物の検出
工程(2)で作製した(i)〜(v)のPCR産物をそれぞれ変性することなく、直ちに工程(5)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。その結果は以下に示す。
(i):1本目の検出ラインのみ青色に着色。
(ii):2本目の検出ラインのみオレンジ色に着色。
(iii):3本目の検出ラインのみ緑色に着色。
(iv):1本目の検出ラインが青色に、2本目の検出ラインがオレンジ色に、3本目の検出ラインが緑色にそれぞれ着色。
(v):どの検出ラインも着色は認められなかった。
この結果から、それぞれの標的遺伝子特異的に検出が可能であり、3種類の同時検出も確認できた。
また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。

0130

<実施例7>
(1)ジョイントプライマーの合成
本実施例では、標的核酸の鋳型としてはpUC19(タカラバイオ社製)、EcoRIメチラーゼ遺伝子、および、BamHIメチラーゼ遺伝子の3種類をテンプレートとして用い、PCR増幅により約330塩基対、約200塩基対、および、約100塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(Fj1)とリバースプライマー(Rj1)、フォワードプライマー(Fj2)とリバースプライマー(Rj2)、および、フォワードプライマー(Fj3)とリバースプライマー(Rj3)の3組のプライマーをそれぞれ設計した。それぞれの5’末端側に共通配列KF1とKR1、共通配列KF2とKR2、および、共通配列KF3とKR3を導入した共通配列付加プライマー、KF1−Fj1とKR1−Rj1、KF2−Fj2とKR2−Rj2、および、KF3−Fj3とKR3−Rj3を合成した。この6種の共通配列付加プライマー(ジョイントプライマー)はつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。以下に本検討で作製した3組のプライマーセットを示す。

0131

共通配列KF1:5’−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)−3’(配列番号43)
共通配列KR1:5’−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)−3’(配列番号44)
プライマーKF1−Fj1:5’−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号45)
プライマーKR1−Rj1:5’−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号46)
共通配列KF2:5’−Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)−3’(配列番号47)
共通配列KR2:5’−Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA)−3’(配列番号48)
プライマーKF2−Fj2:5’−Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT AGCATTATGAATTATATGGT)−3’(配列番号49)
プライマーKR2−Rj2:5’−Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA TTGTTTACATTTATAGCATC)−3’(配列番号50)
共通配列KF3:5’−Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)−3’(配列番号51)
共通配列KR3:5’−Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC)−3’(配列番号52)
プライマーKF3−Fj3:5’−Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC TGGTTTTAAAACTCTGATAC)−3’(配列番号53)
プライマーKR3−Rj3:5’−Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC AGTATGATGAGGGTGTAACA)−3’(配列番号54)

0132

(2)人工核酸(アゾベンゼン)挿入プライマーの合成
本実施例では、工程1で作成したジョイントプライマーセットがそれぞれ増幅する3種類のPCR増幅断片に結合できるように、それぞれのジョイントプライマーと同一の共通配列を有するプライマーを3組設計した。それぞれのプライマーは、5’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域(X)、およびタグ配列T22とT23、タグ配列T24とT25、および、タグ配列T26とT27を導入したタグ付きプライマー、T22−X−KF1とT23−X−KR1、T24−X−KF2とT25−X−KR2、および、T26−X−KF3とT27−X−KR3を合成した。この6種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。以下に本検討で作製した3組のプライマーセットを示す。

0133

タグ配列T22:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)−3’(配列番号55)
タグ配列T23:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)−3’(配列番号56)
プライマーT22−X−KF1:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG X TGGGCTGACCTAGAGGTCTT )−3’(配列番号57)
プライマーT23−X−KR1:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X ATGAAATGCAGGCCATTCGG )−3’(配列番号58)
タグ配列T24:5’−Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT)−3’(配列番号59)
タグ配列T25:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)−3’(配列番号60)
プライマーT24−X−KF2:5’−Dd(CGCATTGAGCAAGTGTACAGAGCAT X CCGGAACAGACACCAGGTTT)−3’(配列番号61)
プライマーT25−X−KR2:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA X GAAGCTGTACCGTCACATGA)−3’(配列番号62)
タグ配列T26:5’−Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA)−3’(配列番号63)
タグ配列T27:5’−Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)−3’(配列番号64)
プライマーT26−X−KF3:5’−Dd(AATTGCGCATGTCCATGTGTAA X ATACCGATGAGTGTGCTACC)−3’(配列番号65)
プライマーT27−X−KR3:5’−Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG X TGGCCTGTGTGACACTATGC)−3’(配列番号66)

0134

(3)ジョイントプライマー、および、アゾベンゼン挿入プライマーを用いたPCR反応
前記工程(1)および(2)で実施し作製した6組のプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーKF1−Fj1、プライマーKR1−Rj1、プライマーKF2−Fj2、プライマーKR2−Rj2、プライマーKF3−Fj3、プライマーKR3−Rj3、プライマーT22−X−KF1、プライマーT23−X−KR1、プライマーT24−X−KF2、プライマーT25−X−KR2、プライマーT26−X−KF3、プライマーT27−X−KR3を各8pmolと、各テンプレート10ngを0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。反応液は次の5種類を用意した。
(i)テンプレートとしてpUC19(タカラバイオ社製)を添加、
(ii)テンプレートとしてEcoRIメチラーゼ遺伝子を添加、
(iii)テンプレートとしてBamHIメチラーゼ遺伝子を添加、
(iv)テンプレートとしてpUC19(タカラバイオ社製)、EcoRIメチラーゼ遺伝子、および、BamHIメチラーゼ遺伝子の3種類全て添加、そして、
(v)テンプレートなし。

0135

これら反応液を調製後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmpPCRSystem、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを30回行い、それぞれ目的の配列を有するDNA断片を次のように得た。(i)約360bp、(ii)約230bp、(iii)約130bp、および、(iv)約360bp、約230bp、約130bpの3種類、(v)増幅DNA断片なし(ネガティブコントロールとする)を増幅した。

0136

(4)ラテックス結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(青色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ28(配列番号67、配列番号55の相補鎖)、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(オレンジ色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ29(配列番号68、配列番号59の相補鎖)、および、カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(緑色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とアミノ基含有オリゴヌクレオチドプローブ30(配列番号69、配列番号63の相補鎖)を、それぞれ水溶性カルボジイミドを必要量添加したMES緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むHEPES緩衝液に再懸濁し、オリゴヌクレオチドプローブ28結合ラッテックス(青色)、オリゴヌクレオチドプローブ29結合ラテックス(オレンジ色)、オリゴヌクレオチドプローブ30結合ラテックス(緑色)を作製した。

0137

この3種のラテックスをグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ28:5’−Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)−NH2−3’(配列番号67)。
オリゴヌクレオチドプローブ29:5’−Dd(TTGCTCTGTACACTTGCTCAATGCG)−NH2−3’(配列番号68)
オリゴヌクレオチドプローブ30:5’−Dd(TTACACATGGACATGCGCAATT)−NH2−3’(配列番号69)

0138

(5)3種のオリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号56に相補的な配列(配列番号70)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ、配列番号60に相補的な配列(配列番号71)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ、および、配列番号64に相補的な配列(配列番号72)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブを、それぞれストレプトアビジンと混合する。それらの混合液をニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow 135、ミリポア社製)上の3箇所にディスペンサーを用いて、上流側から順に互いに離れた位置でライン上に塗布し、40℃で30分間風乾した。3本の検出ラインを作製した。

0139

オリゴヌクレオチドプローブ31:5’−Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)−Biotin−3’(配列番号70)。
オリゴヌクレオチドプローブ32:5’−Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)−Biotin−3’(配列番号71)。
オリゴヌクレオチドプローブ33:5’−Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)−Biotin−3’(配列番号72)。

0140

(6)核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、工程(4)で作製したコンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

0141

(7)テストストリップによるPCR産物の検出
工程(3)で作製した(i)〜(v)のPCR産物をそれぞれ変性することなく、直ちに工程(6)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。その結果は以下に示す。
(i):1本目の検出ラインのみ青色に着色。
(ii):2本目の検出ラインのみオレンジ色に着色。
(iii):3本目の検出ラインのみ緑色に着色。
(iv):1本目の検出ラインが青色に、2本目の検出ラインがオレンジ色に、3本目の検出ラインが緑色に着色。
(v):どの検出ラインも着色は認められなかった。
この結果から、それぞれの標的遺伝子特異的に検出が可能であり、3種類の検出も確認できた。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。

0142

<実施例8>
(1)ジョイントプライマーの合成
本実施例では、標的核酸の鋳型としてはpUC19(タカラバイオ社製)をテンプレートとして用い、PCR増幅により約330塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(F)とリバースプライマー(R)を設計した。それぞれの5’末端側に共通配列KFとKRを導入した共通配列付加プライマー、KF−FとKR−Rを合成した。この2種の共通配列付加プライマー(ジョイントプライマー)はつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。以下に本検討で作製したプライマーセットを示す。

0143

共通配列KF:5’−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)−3’(配列番号73)
共通配列KR:5’−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)−3’(配列番号74)
プライマーKF−F:5’−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号75)
プライマーKR−R:5’−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号76)

0144

(2)ビオチン修飾プライマーおよびFITC修飾プライマーの合成
本実施例では、工程(1)で作成したジョイントプライマーセットが増幅するPCR増幅断片に結合できるように、それぞれのジョイントプライマーと同一の共通配列を有するプライマーをそれぞれ設計した。一方のプライマーは、5’末端側にビオチン修飾したものを合成し、もう一方のプライマーは5’末端側にFITC修飾したものを合成した。この2種の修飾プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。以下に本検討で作製したプライマーセットを示す。
プライマーKF2:5’−Biotin−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)−3’(配列番号77)
プライマーKR2:5’−FITC−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)−3’(配列番号78)

0145

(3)ジョイントプライマー、および、修飾プライマーを用いたPCR反応
前記工程(1)および(2)で実施し作製したプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーKF−F、プライマーKR−R、プライマーKF2、プライマーKR2を各8pmol、および、テンプレートとして10ngのpUC19を0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。反応液を調製後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを30回行い、約360bpの目的配列を有するDNA断片を増幅した。

0146

(4)ラテックス結合ストレプトアビジンの作製
カルボキシル基含有ポリスチレンラテックス(青色)(固形分10%(w/w)、Bangs社製)とストレプトアビジン(和光純薬工業社製)を、水溶性カルボジイミドを必要量添加したMES緩衝液中で混合し、結合後、モノエタノールアミンでブロッキングを行った。前記反応液を遠心分離後、上清を除去し、得られた沈殿を水洗した。洗浄後、界面活性剤を含むHEPES緩衝液に再懸濁し、ストレプトアビジン結合ラッテックス(青色)を作製した。このラテックス溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。

0147

(5)抗FITC(フルオロセイイソチオシアネート)抗体の固相への固定化
抗FITC抗体(インビトロジェン社製)を5mMトリスバッファー(pH 7.5)に溶解し、ニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow 135、ミリポア社製)上にディスペンサーを用いて、ライン上に塗布し、40℃で30分間風乾した。検出ラインを作製した。

0148

(6)核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、工程(4)で作製したコンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、ビオチン修飾プライマーとFITC修飾プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

0149

(7)テストストリップによるPCR産物の検出
工程(3)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(6)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。その結果、工程(3)で検体としてpUC19を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして水を添加した場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。

0150

<実施例9>
(1)ジョイントプライマーの合成
本実施例では、標的核酸の鋳型としてはpUC19(タカラバイオ社製)、EcoRIメチラーゼ遺伝子、および、BamHIメチラーゼ遺伝子の3種類をテンプレートとして用い、PCR増幅により約330塩基対、約200塩基対、および、約100塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(Fj1)とリバースプライマー(Rj1)、フォワードプライマー(Fj2)とリバースプライマー(Rj2)、および、フォワードプライマー(Fj3)とリバースプライマー(Rj3)の3組のプライマーをそれぞれ設計した。それぞれの5’末端側に共通配列KF1とKR1、共通配列KF2とKR2、および、共通配列KF3とKR3を導入した共通配列付加プライマー、KF1−Fj1とKR1−Rj1、KF2−Fj2とKR2−Rj2、および、KF3−Fj3とKR3−Rj3を合成した。この6種の共通配列付加プライマー(ジョイントプライマー)はつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。以下に本検討で作製した3組のプライマーセットを示す。

0151

共通配列KF1:5’−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)−3’(配列番号79)
共通配列KR1:5’−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG)−3’(配列番号80)
プライマーKF1−Fj1:5’−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号81)
プライマーKR1−Rj1:5’−Dd(ATGAAATGCAGGCCATTCGG TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号82)
共通配列KF2:5’−Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)−3’(配列番号83)
共通配列KR2:5’−Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA)−3’(配列番号84)
プライマーKF2−Fj2:5’−Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT AGCATTATGAATTATATGGT)−3’(配列番号85)
プライマーKR2−Rj2:5’−Dd(GAAGCTGTACCGTCACATGA TTGTTTACATTTATAGCATC)−3’(配列番号86)
共通配列KF3:5’−Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)−3’(配列番号87)
共通配列KR3:5’−Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC)−3’(配列番号88)
プライマーKF3−Fj3:5’−Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC TGGTTTTAAAACTCTGATAC)−3’(配列番号89)
プライマーKR3−Rj3:5’−Dd(TGGCCTGTGTGACACTATGC AGTATGATGAGGGTGTAACA)−3’(配列番号90)

0152

(2)人工核酸(アゾベンゼン)挿入プライマー、および、ビオチン修飾プライマーの合成
本実施例では、工程(1)で作成したジョイントプライマーセットがそれぞれ増幅する3種類のPCR増幅断片に結合できるように、それぞれのジョイントプライマーと同一の共通配列を有するプライマーを3組設計した。3組のそれぞれの一方のプライマーとして5’末端をビオチン化修飾したプライマー、KF1、KF2、および、KF3を合成した。また、3組のそれぞれのもう一方のプライマーとして、5’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域(X)、およびタグ配列T34、タグ配列T35、および、タグ配列T36を導入したタグ付きプライマー、T34−X−KR1、T35−X−KR2、および、T36−X−KR3を合成した。この6種の修飾プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。作製した3組のプライマーセットを以下に示す。

0153

タグ配列T34:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)−3’(配列番号91)
プライマーKF1:5’−Biotin−Dd(TGGGCTGACCTAGAGGTCTT)−3’(配列番号92)
プライマーT34−X−KR1:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X ATGAAATGCAGGCCATTCGG)−3’(配列番号93)
タグ配列T35:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA)−3’(配列番号94)
プライマーKF2:5’−Biotin−Dd(CCGGAACAGACACCAGGTTT)−3’(配列番号95)
プライマーT35−X−KR2:5’−Dd(ATTATGCGTGGAGAAGCATATCATA X GAAGCTGTACCGTCACATGA)−3’(配列番号96)
タグ配列T36:5’−Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG)−3’(配列番号97)
プライマーKF3:5’−Biotin−Dd(ATACCGATGAGTGTGCTACC)−3’(配列番号98)
プライマーT36−X−KR3:5’−Dd(TACTTTAGAGGAAACTGCTGAG X TGGCCTGTGTGACACTATGC)−3’(配列番号99)

0154

(3)ジョイントプライマー、および、アゾベンゼン挿入プライマーを用いたPCR反応
前記工程(1)および(2)で実施し作製した6組のプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーKF1−Fj1、プライマーKR1−Rj1、プライマーKF2−Fj2、プライマーKR2−Rj2、プライマーKF3−Fj3、プライマーKR3−Rj3、プライマーKF1、プライマーT34−X−KR1、プライマーKF2、プライマーT35−X−KR2、プライマーKF3、プライマーT36−X−KR3を各8pmolと、各テンプレート10ngを0.2 mlのPCR用チューブに入れ、ExTaq PCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、100μlのPCR反応液を調製した。反応液は次の5種類を用意した。
(i)テンプレートとしてpUC19(タカラバイオ社製)を添加、
(ii)テンプレートとしてEcoRIメチラーゼ遺伝子を添加、
(iii)テンプレートとしてBamHIメチラーゼ遺伝子を添加、
(iv)テンプレートとしてpUC19(タカラバイオ社製)、EcoRIメチラーゼ遺伝子、および、BamHIメチラーゼ遺伝子の3種類全て添加、そして、
(v)テンプレートなし。
これら反応液を調製後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを30回行い、それぞれ目的の配列を有するDNA断片を次のように得た。(i)約360bp、(ii)約230bp、(iii)約130bp、および、(iv)約360bp、約230bp、約130bpの3種類、(v)増幅DNA断片なし(ネガティブコントロールとする)を増幅した。

0155

(4)金コロイド結合ストレプトアビジンの作製
Gold Colloid(粒径40nm、British BioCell International社製)とストレプトアビジンを混合し、50℃で16時間インキュベートした。6000rpmで15分間遠心分離し、上清を除去、0.05M塩化ナトリウム、5mMリン酸バッファー、pH7を添加し混和後、再度50℃で40時間インキュベートした。
インキュベート後、遠心(6000rpm、15分間)を行い、上清を除去し、5mMリン酸バッファー(pH7)を添加した。このバッファー置換を再度行った。
調製した金コロイド溶液をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲーションパッドとした。

0156

(5)3種のオリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号91に相補的な配列(配列番号100)を有するオリゴヌクレオチドプローブ、配列番号94に相補的な配列(配列番号101)を有するオリゴヌクレオチドプローブ、および、配列番号97に相補的な配列(配列番号102)を有するオリゴヌクレオチドプローブを合成する。それらのプローブ溶液をニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow 135、ミリポア社製)上の3箇所にディスペンサーを用いて、上流側から順に互いに離れた位置でライン上に塗布し、40℃で30分間風乾した。3本の検出ラインを作製した。

0157

オリゴヌクレオチドプローブ37:5’−Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)−3’(配列番号100)。
オリゴヌクレオチドプローブ38:5’−Dd(TATGATATGCTTCTCCACGCATAAT)−3’(配列番号101)。
オリゴヌクレオチドプローブ39:5’−Dd(CTCAGCAGTTTCCTCTAAAGTA)−3’(配列番号102)。

0158

(6)核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、工程(4)で作製したコンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、ビオチン修飾プライマーとアゾベンゼン挿入プライマーのセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストリップを作製した。

0159

(7)テストストリップによるPCR産物の検出
工程(3)で作製した(i)〜(v)のPCR産物をそれぞれ変性することなく、直ちに工程(6)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にそれぞれアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。その結果は以下に示す。
(i):1本目の検出ラインのみ着色。
(ii):2本目の検出ラインのみ着色。
(iii):3本目の検出ラインのみ着色。
(iv):1本目、2本目、3本目の検出ラインがそれぞれ着色。
(v):どの検出ラインも着色は認められなかった。
この結果から、それぞれの標的遺伝子特異的に検出が可能であり、3種類の検出も確認できた。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。

0160

<実施例10>
(1)人工核酸(アゾベンゼン)挿入プライマーの合成
本実施例では、標的としてプラスミドpUC19を導入した大腸菌(E.coli DH5α)を用いる。pUC19が鋳型となるときに、PCR増幅により約330塩基対が増幅するようにフォワードプライマー(F)およびリバースプライマー(R)を設計した。それぞれの5’末端側に人工核酸であるアゾベンゼンを含むポリメラーゼ反応阻害領域(X)、およびタグ配列T37およびT38を導入したタグ付きプライマー、T37−X−FおよびT38−X−Rを合成した。この2種のアゾベンゼン挿入プライマーはつくばオリゴサービス株式会社にて受託合成を行い購入した。本検討で作製したプライマーセットを示す。
タグ配列T37:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG)−3’(配列番号103)
タグ配列T38:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA)−3’(配列番号104)
プライマーF:5’−Dd(GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号105)
プライマーR:5’−Dd(TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号106)
プライマーT37−X−F:5’−Dd(TGGCAACATTTTTCACTGGGTTTATAG X GGAAACAGCTATGACCATGA)−3’(配列番号107)
プライマーT38−X−R:5’−Dd(GGTTAGCTTCCAACCACGTGTAGATCA X TCTATGCGGCATCAGAGCAG)−3’(配列番号108)

0161

(2)アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR反応
プラスミドpUC19を導入した大腸菌(E.coli DH5α)のコロニーを取り、1ml水中に混和した。前記工程(1)で作製したプライマーセットを用いたPCR反応を行った。プライマーFとプライマーRを各5pmolと、前記大腸菌のけん濁液1μlとを0.2mlのPCR用チューブに入れ、ExTaqPCRデバイス(タカラバイオ社製)の説明書に従い、25μlのPCR反応液を調製した。その後、チューブをサーマルサイクラー(GeneAmp PCR System、アプライドバイオシステム社製)にセットし、95℃で5分間熱処理後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒のサイクルを30回行い、目的の約330bpを増幅した。また、けん濁液を添加しないで同様の反応を行い、ネガティブコントロールとした。

0162

(3)金コロイド結合オリゴヌクレオチドプローブの作製
Gold Colloid(10nm、5.7×1012(粒子数/ml)、British BioCell International社製)と抗FITC抗体溶液(5mMリン酸バッファー、pH7)を混合し、20分、室温で静置した。1%BSA、0.1%PEG溶液を1/2量添加し、10000rpmで25分間遠心分離し、上清を除去、1%BSA、0.1%PEG溶液を添加し混和後、10000rpmで25分間遠心分離した。遠心後に上清を除去し、5mMリン酸バッファー(pH7)を添加した。このバッファー置換を再度行った。

0163

調製した金コロイド溶液に3’末端FITC修飾オリゴヌクレオチドプローブ40(配列番号109、配列番号103の相補鎖)を混合し、グラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、コンジュゲートパッドとした。
オリゴヌクレオチドプローブ40:5’−Dd(CTATAAACCCAGTGAAAAATGTTGCCA)−FITC−3’(配列番号109)。

0164

(4)オリゴヌクレオチドプローブの固相への固定化
配列番号104に相補的な配列(配列番号110)を有する3’末端ビオチン修飾オリゴヌクレオチドプローブ41を、ストレプトアビジンと混合する。その混合液をニトロセルロースメンブレン(商品名:Hi−Flow 180、ミリポア社製)にディスペンサーを用いてライン上に塗布し、40℃で30分間風乾した。
オリゴヌクレオチドプローブ41:5’−Dd(GATCATACACGTGGTTGGAAGCTAACC)−Biotin−3’(配列番号110)。

0165

(5)核酸クロマトグラフィー様テストストリップの作製
バッキングシートから成る基材に、上記で作成したニトロセルロースメンブレンからなるクロマトグラフィー媒体、コンジュゲーションパッド、試料添加部である汎用性のサンプルパッド、展開した試料や標識物質を吸収するための吸収パッドを図6に示す様に貼り合わせ、アゾベンゼン挿入プライマーセットを用いたPCR増幅産物の検出用テストストリップを作製した。

実施例

0166

(6)テストストリップによるPCR産物の検出
工程(2)で作製したPCR産物を変性することなく、直ちに工程(5)で作製したテストストリップ上の試料添加部位にアプライし、クロマトグラフィーによる検出を行った。工程(2)で検体として大腸菌を添加した場合、テストライン上に標的核酸特異的な着色ラインが検出された。一方、ネガティブコントロールとして大腸菌を添加しない場合、ラインの検出は認められなかった。また、クロマトグラフィーによる検出に要した時間は、10〜15分と短時間であった。

0167

1.プライマー領域
2.タグ領域
3.ポリメラーゼ反応阻害領域(スペーサー領域
4.第1プライマー(ジョイントプライマー)のプライマー領域
5.第1プライマー(ジョイントプライマー)の共通領域
6.第2プライマーの共通領域
7.第2プライマーのタグ領域
8.第2プライマーのポリメラーゼ反応阻害領域(スペーサー領域)
9.標的核酸配列
10.フォワードプライマー
11.フォワードプライマーのプライマー領域
12.フォワードプライマーのタグ領域
13.リバースプライマー
14.リバースプライマーのプライマー領域
15.リバースプライマーのタグ領域
16.部分二本鎖核酸構造をもつPCR産物
17.標的核酸配列
18.フォワード第1プライマー
19.フォワード第1プライマーのプライマー領域
20.フォワード第1プライマーのタグ領域
21.リバース第1プライマー
22.リバース第1プライマーのプライマー領域
23.リバース第1プライマーのタグ領域
24.第1プライマーによる二本鎖PCR産物
25.フォワード第2プライマー
26.フォワード第2プライマーのプライマー領域
27.フォワード第2プライマーのタグ領域
28.リバース第2プライマー
29.リバース第2プライマーのプライマー領域
30.リバース第2プライマーのタグ領域
31.部分二本鎖核酸構造をもつPCR産物
32.サンプルパッド
33.コンジュゲートパッド
34.捕捉用オリゴヌクレオチドを保持した担体
35.吸収パッド
36.基材
37.テストライン
38.コントロールライン
39.標識分子結合用オリゴヌクレオチド
40.標識分子
41.PCR産物−標識分子複合体
42.多孔質メンブレン
43.捕捉用オリゴヌクレオチド
44.捕捉用オリゴヌクレオチドを各ウェルに保持した担体(マイクロアレイ)
45.捕捉用オリゴヌクレオチドを保持したビーズ担体

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