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技術 プライマー及び木の実の検出方法

出願人 日清食品ホールディングス株式会社
発明者 伊藤美奈溝田泰生大野克利
出願日 2017年10月17日 (2年1ヶ月経過) 出願番号 2017-200861
公開日 2019年5月16日 (6ヶ月経過) 公開番号 2019-071836
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード 二次検査 品質管理検査 食品製造設備 並列配列 確認検査 ドングリ ヤマモガシ科 原料生
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (3)

課題

アレルギーを引き起こす恐れのある木の実が食品原料製品等に含まれていた場合に、その量が微量であっても高感度で検出する。

解決手段

アレルギーを引き起こす恐れのある木の実(アーモンドビーチナッツブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツクリ、チンカピンココナッツ銀杏ヘーゼルナッツヒッコリーナッツ、ライチマカダミアナッツピーカンナッツ、の実、ピリナッツ、ピスチオシアナッツ、クルミ)を検出対象とし、それぞれの対象物に特異的であり、同一条件下で検査可能なPCRプライマーを提供する。また、主要8種(アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミ)について、マルチプレックスPCRにより特定4種ずつの同時検出を可能とする。

概要

背景

食物アレルギーを引き起こす恐れのある食品のうち、特にその患者数の多い乳、甲殻類小麦大豆落花生、木の実の8品目は、「The Big-8」とも言われ、アメリカカナダシンガポール、EU等、世界の多くの国や地域において、共通して含有食品への表示が義務付けられている。

アレルギーを引き起こす恐れのある食品は、生産流通加工段階での意図しない微量の混入も起こり得るため、食品原料ないし製品提供者としては、それらが混入しているか否かの品質管理を行うことが重要となる。

乳、卵については、それぞれに特徴的な蛋白質を検出する方法(ELISA法ウェスタンブロット法、及びイムノクロマト法)が、魚については、それぞれに特徴的なDNA塩基配列を検出する方法(PCR法)が、また、甲殻類、小麦、大豆、落花生については、その両方の検出方法が、各々確立されており、検査キットとして商用的に入手利用可能となっている。一方、木の実とは総称であり、生物学的に非常に幅広生物種が含まれるため、木の実としてまとめて検出する方法は確立されていない。

木の実表示義務のある各国において、表示対象となる木の実とは、例えば、EU、シンガポールでは、アーモンドクルミピーカナッツヘーゼルナッツマカダミアナッツブラジルナッツ、カシューナッツピスチオの8種、カナダではさらにの実を加えた9種が挙げられている。アメリカでは最も多く、上記の9種に加え、ビーチナッツ、バターナッツ、クリ、チンカピンココナッツ銀杏ヒッコリーナッツ、ライチピリナッツ、シアナッツの計19種が挙げられている。

日本は諸外国とは異なり、木の実を一括した表示対象とせず、クルミとカシューナッツを「特定原材料に準ずるもの」として個別に表示することが推奨されている(アレルギー物質を含む食品に関する表示について、平成25年9月20日、消食表第257号)。近年、日本人の食生活の欧米化に伴って、木の実摂取量は増加しており、今後クルミ、カシューナッツ以外の木の実に対する食物アレルギー患者数の増加や、それに伴う「特定原材料に準ずるもの」への追加も大いにあると考えられる。

木の実混入の有無を検査するためには、個々の木の実に対する検出法複数組み合わせることになるが、ELISA法やウェスタンブロット法を複数回行うことは、膨大な手間と費用がかかる。一方PCR法の場合、PCR条件が同一であれば、複数セット試薬を調製し、一斉に検査することが可能となるため、木の実検出法として有用であると考えられる。また、一般に、蛋白質は、DNAと比べて、食品製造工程における様々な加工処理に対する安定性が低いため、蛋白質を検出する方法は、高度に加工された被験食品に対しては適用できない可能性が高い。そのため、蛋白質よりも加工処理に比較的強いとされるDNAの塩基配列を標的としたPCR法は、様々な加工処理工程を経た食品原料や製品中からの検出法に適していると考えられる。

現在、アーモンド、クルミ、ピーカンナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ピスタチオの8種については、PCR法を用いた個別の検出法が確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっている。該キットはTaqManプローブを用いたリアルタイムPCR法を採用することによって検出特異性を確保しているが、リアルタイムPCR用機器、試薬を必要とするため、プローブを用いない通常のPCR法と比較すると費用がかかる。また、前述の通り、食物アレルギーを引き起こす恐れのある木の実には少なくとも19種が存在し、該キットでは検出不可能な木の実が多く存在する。

個別の木の実検出法としては他にも、アーモンド、ヘーゼルナッツ、カシューナッツ、クルミについて、PCR法による検出方法が報告されている(特許文献1、2、3、4)が、いずれも単一種の木の実を検出する方法であり、複数種の木の実を検出することはできない。

また、クリの品種解析を目的として、SSRマーカーを用いた方法が報告されている(非特許文献1)が、被験試料が単一種の植物である場合に使用することを前提としており、複数の植物種が混合する試料の場合、使用するPCRプライマーは、他の植物DNAとも反応する可能性が非常に高いために、クリを特異的に検出することは困難となる。それ故に、複数の植物を含む食品中のクリDNAを特異的に検出するために使用することはできない。

また、ココナッツの検出法としては、ココナッツ特異的蛋白質標的としたイムノクロマト法を用いた検出法が確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっているが、DNA塩基配列を標的とした検出法に関する報告はない。

ビーチナッツ、バターナッツ、チンカピン、銀杏、ヒッコリーナッツ、ライチ、ピリナッツ、松の実、シアナッツについては、これまでに検出法に関する報告はない。

上述したように、食物アレルギーを引き起こす恐れのある木の実(アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ)を同一条件で簡便に検出する方法は報告されておらず、これらの木の実が食品原料や製品に混入しているか否かを科学的に検証可能な手法が、食品の品質管理手法として待望されている。

概要

アレルギーを引き起こす恐れのある木の実が食品原料や製品等に含まれていた場合に、その量が微量であっても高感度で検出する。 アレルギーを引き起こす恐れのある木の実(アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ)を検出対象とし、それぞれの対象物に特異的であり、同一条件下で検査可能なPCRプライマーを提供する。また、主要8種(アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミ)について、マルチプレックスPCRにより特定4種ずつの同時検出を可能とする。

目的

本発明は、アレルギーを引き起こす恐れのある木の実(アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ)を、食品原料や製品中から特異的に、一斉に検出できる方法に用いるPCRプライマーセットを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

配列表の配列番号1における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるアーモンド検出用PCRプライマーセット。

請求項2

配列表の配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるビーチナッツ検出用PCRプライマーセット。

請求項3

配列表の配列番号5における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号6における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるブラジルナッツ検出用PCRプライマーセット。

請求項4

配列表の配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるカシューナッツ検出用PCRプライマーセット。

請求項5

配列表の配列番号9における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるクリ検出用PCRプライマーセット。

請求項6

配列表の配列番号11における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号12における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるココナッツ検出用PCRプライマーセット。

請求項7

配列表の配列番号13における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号14における塩基番号13〜27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなる銀杏検出用PCRプライマーセット。

請求項8

配列表の配列番号15における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号16における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるヘーゼルナッツ検出用PCRプライマーセット。

請求項9

配列表の配列番号17における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号18における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるヒッコリーナッツ検出用PCRプライマーセット。

請求項10

配列表の配列番号19における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号20における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるライチ検出用PCRプライマーセット。

請求項11

配列表の配列番号21における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号22における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるマカダミアナッツ検出用PCRプライマーセット。

請求項12

配列表の配列番号23における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号24における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるピーカンナッツ検出用PCRプライマーセット。

請求項13

配列表の配列番号25における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号26における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるの実検出用PCRプライマーセット。

請求項14

配列表の配列番号27における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号28における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるピリナッツ検出用PCRプライマーセット。

請求項15

配列表の配列番号29における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号30における塩基番号15〜29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるピスチオ検出用PCRプライマーセット。

請求項16

配列表の配列番号31における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号32における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるシアナッツ検出用PCRプライマーセット。

請求項17

配列表の配列番号33における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号34における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるクルミ検出用PCRプライマーセット。

請求項18

請求項9記載のプライマーセット、請求項17記載のプライマーセット、請求項15に記載のプライマーセット及び請求項4に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したピーカンナッツ、クルミ、ピスタチオ及びカシューナッツの同時PCR検出方法

請求項19

請求項1記載のプライマーセット、請求項8記載のプライマーセット、請求項11に記載のプライマーセット及び請求項3に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したアーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時PCR検出方法。

請求項20

請求項9記載のプライマーセット、請求項17記載のプライマーセット、請求項8に記載のプライマーセット及び請求項4に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したピーカンナッツ、クルミ、ヘーゼルナッツ及びカシューナッツの同時PCR検出方法。

請求項21

請求項1記載のプライマーセット、請求項15記載のプライマーセット、請求項11に記載のプライマーセット及び請求項3に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したアーモンド、ピスタチオ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時PCR検出方法。

請求項22

請求項9記載のプライマーセット、請求項17記載のプライマーセット、請求項11に記載のプライマーセット及び請求項3に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したピーカンナッツ、クルミ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時PCR検出方法。

請求項23

請求項1記載のプライマーセット、請求項8記載のプライマーセット、請求項15に記載のプライマーセット及び請求項4に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したアーモンド、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ及びカシューナッツの同時PCR検出方法。

技術分野

0001

本発明は、アレルギーを引き起こす恐れのある木の実(アーモンドビーチナッツブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツクリ、チンカピンココナッツ銀杏ヘーゼルナッツヒッコリーナッツ、ライチマカダミアナッツピーカンナッツ、の実、ピリナッツ、ピスチオシアナッツ、クルミ)を検出対象とし、当該木の実が食品原料製品等に含まれていた場合に、その量が微量であっても高感度で検出することを可能とする木の実の検出方法、並びにその方法に使用するPCRプライマープライマーセット、及びキットに関するものである。

背景技術

0002

食物アレルギーを引き起こす恐れのある食品のうち、特にその患者数の多い乳、甲殻類小麦大豆落花生、木の実の8品目は、「The Big-8」とも言われ、アメリカカナダシンガポール、EU等、世界の多くの国や地域において、共通して含有食品への表示が義務付けられている。

0003

アレルギーを引き起こす恐れのある食品は、生産流通加工段階での意図しない微量の混入も起こり得るため、食品原料ないし製品の提供者としては、それらが混入しているか否かの品質管理を行うことが重要となる。

0004

乳、卵については、それぞれに特徴的な蛋白質を検出する方法(ELISA法ウェスタンブロット法、及びイムノクロマト法)が、魚については、それぞれに特徴的なDNA塩基配列を検出する方法(PCR法)が、また、甲殻類、小麦、大豆、落花生については、その両方の検出方法が、各々確立されており、検査キットとして商用的に入手利用可能となっている。一方、木の実とは総称であり、生物学的に非常に幅広生物種が含まれるため、木の実としてまとめて検出する方法は確立されていない。

0005

木の実表示義務のある各国において、表示対象となる木の実とは、例えば、EU、シンガポールでは、アーモンド、クルミ、ピーカンナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ピスタチオの8種、カナダではさらに松の実を加えた9種が挙げられている。アメリカでは最も多く、上記の9種に加え、ビーチナッツ、バターナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヒッコリーナッツ、ライチ、ピリナッツ、シアナッツの計19種が挙げられている。

0006

日本は諸外国とは異なり、木の実を一括した表示対象とせず、クルミとカシューナッツを「特定原材料に準ずるもの」として個別に表示することが推奨されている(アレルギー物質を含む食品に関する表示について、平成25年9月20日、消食表第257号)。近年、日本人の食生活の欧米化に伴って、木の実摂取量は増加しており、今後クルミ、カシューナッツ以外の木の実に対する食物アレルギー患者数の増加や、それに伴う「特定原材料に準ずるもの」への追加も大いにあると考えられる。

0007

木の実混入の有無を検査するためには、個々の木の実に対する検出法複数組み合わせることになるが、ELISA法やウェスタンブロット法を複数回行うことは、膨大な手間と費用がかかる。一方PCR法の場合、PCR条件が同一であれば、複数セット試薬を調製し、一斉に検査することが可能となるため、木の実検出法として有用であると考えられる。また、一般に、蛋白質は、DNAと比べて、食品製造工程における様々な加工処理に対する安定性が低いため、蛋白質を検出する方法は、高度に加工された被験食品に対しては適用できない可能性が高い。そのため、蛋白質よりも加工処理に比較的強いとされるDNAの塩基配列を標的としたPCR法は、様々な加工処理工程を経た食品原料や製品中からの検出法に適していると考えられる。

0008

現在、アーモンド、クルミ、ピーカンナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ピスタチオの8種については、PCR法を用いた個別の検出法が確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっている。該キットはTaqManプローブを用いたリアルタイムPCR法を採用することによって検出特異性を確保しているが、リアルタイムPCR用機器、試薬を必要とするため、プローブを用いない通常のPCR法と比較すると費用がかかる。また、前述の通り、食物アレルギーを引き起こす恐れのある木の実には少なくとも19種が存在し、該キットでは検出不可能な木の実が多く存在する。

0009

個別の木の実検出法としては他にも、アーモンド、ヘーゼルナッツ、カシューナッツ、クルミについて、PCR法による検出方法が報告されている(特許文献1、2、3、4)が、いずれも単一種の木の実を検出する方法であり、複数種の木の実を検出することはできない。

0010

また、クリの品種解析を目的として、SSRマーカーを用いた方法が報告されている(非特許文献1)が、被験試料が単一種の植物である場合に使用することを前提としており、複数の植物種が混合する試料の場合、使用するPCRプライマーは、他の植物DNAとも反応する可能性が非常に高いために、クリを特異的に検出することは困難となる。それ故に、複数の植物を含む食品中のクリDNAを特異的に検出するために使用することはできない。

0011

また、ココナッツの検出法としては、ココナッツ特異的蛋白質標的としたイムノクロマト法を用いた検出法が確立されており、検査キットとして商用的に入手、利用可能となっているが、DNA塩基配列を標的とした検出法に関する報告はない。

0012

ビーチナッツ、バターナッツ、チンカピン、銀杏、ヒッコリーナッツ、ライチ、ピリナッツ、松の実、シアナッツについては、これまでに検出法に関する報告はない。

0013

上述したように、食物アレルギーを引き起こす恐れのある木の実(アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ)を同一条件で簡便に検出する方法は報告されておらず、これらの木の実が食品原料や製品に混入しているか否かを科学的に検証可能な手法が、食品の品質管理手法として待望されている。

先行技術

0014

CN 101643786A
CN 101643787A
CN 101792815A
特開2009-279000、プライマー及び特定植物の検出方法
井上栄一, 山本俊哉, 阮樹安,松木裕美, 安西弘行, 原弘道,ニホングリSSRマーカーによる半島由来のクリ7品種の解析; 園学研, 7(4):475-480, 2008

発明が解決しようとする課題

0015

本発明は、アレルギーを引き起こす恐れのある木の実(アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ)を、食品原料や製品中から特異的に、一斉に検出できる方法に用いるPCRプライマーセットを提供することを、主目的とした

0016

また、段落[0005]に記載しているが、木の実表示義務のある各国において、表示対象となる木の実の具体例が挙げられており、例えばEUやシンガポールでは8種、カナダでは9種、アメリカでは19種記載されている。ここで、これらに共通して含まれるアーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミの8種については、食品原料として使用される頻度が高く、生産、流通、加工段階での意図しない微量の混入を検査するニーズが高いと考えられる。そこで、これらの8種のうち、特定の4種の組み合わせについて、一回のPCRで同時に検出することが可能な同時PCR(マルチプレックスPCR)の方法についても提供することを課題とした。

課題を解決するための手段

0017

上記課題を達成するために、本発明者らは、分子生物学的観点から、検出対象とする木の実及びその他の生物の遺伝子配列における共通性と特異性に着目し、食物アレルギー原因食物である木の実(アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ)を高感度に検出することができる方法を鋭意研究した。その結果、アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、あるいはクルミの各々に特徴的な塩基配列を見いだし、これらの塩基配列を利用してPCR法などの核酸分析を行うことで、アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、あるいはクルミをそれぞれ簡便に検出し得ることを見いだし、更に鋭意検討を重ねて、それらを同一条件のもとで検出できるよう工夫し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の木の実検出用PCRプライマーセットに関する。すなわち、本願発明はまず
以下の項に関するものである。

0018

項1.配列表の配列番号1における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるアーモンド検出用PCRプライマーセット。
項2. 配列表の配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるビーチナッツ検出用PCRプライマーセット。
項3. 配列表の配列番号5における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号6における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるブラジルナッツ検出用PCRプライマーセット。
項4. 配列表の配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるカシューナッツ検出用PCRプライマーセット。
項5. 配列表の配列番号9における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるクリ検出用PCRプライマーセット。
項6. 配列表の配列番号11における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号12における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるココナッツ検出用PCRプライマーセット。
項7. 配列表の配列番号13における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号14における塩基番号13〜27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなる銀杏検出用PCRプライマーセット。
項8. 配列表の配列番号15における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号16における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるヘーゼルナッツ検出用PCRプライマーセット。
項9. 配列表の配列番号17における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号18における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるヒッコリーナッツ検出用PCRプライマーセット。
項10. 配列表の配列番号19における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号20における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるライチ検出用PCRプライマーセット。
項11. 配列表の配列番号21における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号22における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるマカダミアナッツ検出用PCRプライマーセット。
項12. 配列表の配列番号23における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号24における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるピーカンナッツ検出用PCRプライマーセット。
項13. 配列表の配列番号25における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号26における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなる松の実検出用PCRプライマーセット。
項14. 配列表の配列番号27における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号28における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるピリナッツ検出用PCRプライマーセット。
項15. 配列表の配列番号29における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号30における塩基番号15〜29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるピスタチオ検出用PCRプライマーセット。
項16. 配列表の配列番号31における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号32における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるシアナッツ検出用PCRプライマーセット。
項17. 配列表の配列番号33における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列表の配列番号34における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとからなるクルミ検出用PCRプライマーセット。

0019

さらに、上記木の実のうち、アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミについては、これらのうちの特定の4種の組合せについて、これらを検出可能な上記各プライマーセットを混合して一回のPCR試験によって同時に検出する同時PCR(マルチプレックスPCR)が可能である。すなわち、本願発明は以下の項に関するものも意図している。

0020

項18. 請求項9記載のプライマーセット、請求項17記載のプライマーセット、請求項15に記載のプライマーセット及び請求項4に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したピーカンナッツ、クルミ、ピスタチオ及びカシューナッツの同時PCR検出方法。
項19. 請求項1記載のプライマーセット、請求項8記載のプライマーセット、請求項11に記載のプライマーセット及び請求項3に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したアーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時PCR検出方法。
項20. 請求項9記載のプライマーセット、請求項17記載のプライマーセット、請求項8に記載のプライマーセット及び請求項4に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したピーカンナッツ、クルミ、ヘーゼルナッツ及びカシューナッツの同時PCR検出方法。
項21. 請求項1記載のプライマーセット、請求項15記載のプライマーセット、請求項11に記載のプライマーセット及び請求項3に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したアーモンド、ピスタチオ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時PCR検出方法。
項22. 請求項9記載のプライマーセット、請求項17記載のプライマーセット、請求項11に記載のプライマーセット及び請求項3に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したピーカンナッツ、クルミ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの同時PCR検出方法。
項23. 請求項1記載のプライマーセット、請求項8記載のプライマーセット、請求項15に記載のプライマーセット及び請求項4に記載のプライマーセットを含むプライマーセットを利用したアーモンド、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ及びカシューナッツの同時PCR検出方法。

発明の効果

0021

本発明によれば、PCR等を用いた核酸分析によって、木の実(アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ)由来DNAの検出を可能とし、被験食品原料や被験食品中に、上記木の実が混入しているか否か、又は、使用されているか否かといった品質管理検査の実施を可能にするという効果を奏する。また、アレルギーの未然防止、アレルギー症状が生じた際の原因物質調査等にも寄与することができる。

0022

また、アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミに関しては、これらの木の実を検出するプライマーを混合して同時PCR(マルチプレックスPCR)することにより、これらのうちの4種を同時に検出することが可能となる。

図面の簡単な説明

0023

本発明におけるプライマーセットを用いた場合のDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(A)配列番号1及び配列番号2を用いたPCRにおけるアーモンドDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(B)配列番号3及び配列番号4を用いたPCRにおけるビーチナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(C)配列番号5及び配列番号6を用いたPCRにおけるブラジルナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(D)配列番号7及び配列番号8を用いたPCRにおけるカシューナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(E)配列番号9及び配列番号10を用いたPCRにおけるクリDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(F)配列番号11及び配列番号12を用いたPCRにおけるココナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(G)配列番号13及び配列番号14を用いたPCRにおける銀杏DNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(H)配列番号15及び配列番号16を用いたPCRにおけるヘーゼルナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(I)配列番号17及び配列番号18を用いたPCRにおけるヒッコリーナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(J)配列番号19及び配列番号20を用いたPCRにおけるライチDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(K)配列番号21及び配列番号22を用いたPCRにおけるマカダミアナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(L)配列番号23及び配列番号24を用いたPCRにおけるピーカンナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(M)配列番号25及び配列番号26を用いたPCRにおける松の実DNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(N)配列番号27及び配列番号28を用いたPCRにおけるピリナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(O)配列番号29及び配列番号30を用いたPCRにおけるピスタチオDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(P)配列番号31及び配列番号32を用いたPCRにおけるシアナッツDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。(Q)配列番号33及び配列番号34を用いたPCRにおけるクルミDNAの検出感度を示した電気泳動後の写真である。
(A)ピーカンナッツ、クルミ、ピスタチオ、カシューナッツの4種についてのマルチプレックスPCRの結果を示した電気泳動後の写真である。(B)アーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの4種についてのマルチプレックスPCRの結果を示した電気泳動後の写真である。(C)ピーカンナッツ、クルミ、ヘーゼルナッツ及びカシューナッツの4種についてのマルチプレックスPCRの結果を示した電気泳動後の写真である。(D)アーモンド、ピスタチオ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの4種についてのマルチプレックスPCRの結果を示した電気泳動後の写真である。(E)ピーカンナッツ、クルミ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの4種についてのマルチプレックスPCRの結果を示した電気泳動後の写真である。(F)アーモンド、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、カシューナッツの4種についてのマルチプレックスPCRの結果を示した電気泳動後の写真である。

実施例

0024

以下、本発明を詳細に説明する。
木の実検出用PCRプライマーセット
本発明者等は、上記の目的に従い、以下の17種の木の実検出用PCRプライマーセットを開発した。本発明の木の実検出用PCRプライマーセットには、アーモンドに特徴的な塩基配列を有するもの、ビーチナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ブラジルナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、カシューナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、クリに特徴的な塩基配列を有するもの、ココナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ヘーゼルナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、銀杏に特徴的な塩基配列を有するもの、ヒッコリーナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ライチに特徴的な塩基配列を有するもの、マカダミアナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ピーカンナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、ピリナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、松の実に特徴的な塩基配列を有するもの、ピスタチオに特徴的な塩基配列を有するもの、シアナッツに特徴的な塩基配列を有するもの、及びクルミに特徴的な塩基配列を有するものがある。

0025

それぞれのプライマーセットは以下のようにして設計した。標的とする塩基配列は、感度向上の観点から、1細胞あたりのコピー数が多いものが望ましく、クロプラストのrbcL(large subunit gene for ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)遺伝子配列、matk(maturase-encoding gene)遺伝子配列、rRNA遺伝子の内部転写スペーサー領域1(ITS1)塩基配列、及び内部転写スペーサー領域2(ITS2)塩基配列を候補として選定した。各種植物のそれらの配列を既知のDNAデータベースGenBanknucleotide sequence database)から取得、あるいは、一部の植物については独自に解析することによって取得し、それらの膨大な塩基配列の多重並列配列図を作成した。その中でも、ITS領域進化速度が速く、より近縁の種の識別が可能となるため、各種木の実特異的プライマー標的配列として好適であった。

0026

アーモンド検出用プライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をアーモンド(バラ目バラ科サクラ属ヘントウ(Prunus dulcis))に設定し、アーモンドと、その近縁種である同属モモ(Prunus percica)、プルーン(Prunus domestica)、ウメ(Prunus mume)、スモモ(Prunus salicina)、アンズ(Prunus armeniaca)、サクランボ(Prunus avium)のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、アーモンド特異的な塩基配列を選出することは困難であったが、多重並列配列図を詳細に比較検討したところ、アーモンドに特異的な塩基配列領域を選出することができ、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。設計の際には、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0027

ビーチナッツ検出用プライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をビーチナッツ(ブナブナ科ブナ属(Fagus spp.))に設定し、ビーチナッツと、その近縁種である同科クリ属のクリ(Castanea spp.)、シイ属のシイ(Castanopsis spp.)、コナラ属ドングリ(Quercus spp.)、同目クルミ科ペカン属のヒッコリーナッツ(Carya spp.)、ピーカンナッツ(Carya illinoinensis)、クルミ科クルミ属のクルミ(Juglans spp.)、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ(Corylus spp.)のITS領域の塩基配列を比較した。ビーチナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0028

ブラジルナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をブラジルナッツ(ツツジ目ガリバナ科ブラジルナッツノキ属ブラジルナッツノキ(Bertholletia excelsa))に設定し、ブラジルナッツと、その近縁種である同目アカテツ科シアーバターノキ属のシアナッツ(Vitellaria paradoxa)、アカテツ科フルクリコ属のミラクルフルーツ(Synsepalum dulcificum)、カキノキ科カキノキ属のカキ(Diospyros kaki)、カキノキ科ツバキ属の(Camellia sinensis)、マタタビ科マタタビ属キウイフルーツ(Actinidia deliciosa)、ツツジ科スノキ属ブルーベリー(Vaccinium spp.)のITS領域の塩基配列を比較した。ブラジルナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0029

また、カシューナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をカシューナッツ(ムクロジ目ウルシ科カシューナットノキ属カシューナットノキ(Anacardium occidentale))に設定し、カシューナッツと、その近縁種である同科カイノキ属のピスタチオ(Pistacia vera)、マンゴー属のマンゴー(Mangifera indica)、サンショウモドキ属のピンクペッパー(Schinus molle)のITS領域の塩基配列を比較した。カシューナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0030

また、クリ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をクリ(ブナ目ブナ科クリ属(Castanea spp.))に設定した。チンカピン(Castanea pumila)もクリ属の一種であるため、検出対象とした。クリと、近縁種である同科ブナ属のビーチナッツ(Fagus spp.)、シイ属のシイ(Castanopsis spp.)、コナラ属のドングリ(Quercus spp.)、同目クルミ科ペカン属のヒッコリーナッツ(Carya spp.)、ピーカンナッツ(Carya illinoinensis)、クルミ科クルミ属のクルミ(Jugrans spp.)、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ(Corylus spp.)のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、クリ特異的な塩基配列を選出することは難しかったが、多重並列配列図を詳細に比較検討し、センスプライマー用の領域をヒッコリーナッツ、ピーカンナッツと相同性が高い領域から選出し、アンチセンスプライマー用の領域をヒッコリーナッツ、ピーカンナッツと相同性が低いが、ドングリとは相同性が高い領域を選出し、検出目的のクリ以外の生物種(ヒッコリーナッツ、ピーカンナッツ)に対して交錯性を示すセンスプライマーと、それらとはまた別の生物種(ドングリ)に対する交錯性を示すアンチセンスプライマーを互いに組み合わせることで、検出目的とするクリの当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないPCRプライマーセットを創意工夫して、新規に設計した。

0031

また、ココナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をココナッツ(ヤシ目ヤシ科ココヤシ属ココヤシ(Cocos nucifera))に設定し、ココナッツと、その近縁種である同科ナツメヤシ属のナツメヤシ(Phoenix dactylifera)、エウテルペ属のアサイー(Euterpe oleracea)のITS領域の塩基配列を比較した。ココナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0032

また、銀杏検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種を銀杏(イチョウ目イチョウ科イチョウ属イチョウ(Ginko biloba))に設定し、銀杏と、その他裸子植物のクロロプラストmatK遺伝子配列を比較した。銀杏に特異的な遺伝子配列領域を選定し、当該遺伝子配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該遺伝子配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0033

また、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をヘーゼルナッツ(ブナ目カバノキ科ハシバミ属(Corylus spp.))に設定し、ヘーゼルナッツと、その近縁種である同目クルミ科ペカン属のヒッコリーナッツ(Carya spp.)、ピーカンナッツ(Carya illinoinensis)、クルミ科クルミ属のクルミ(Jugrans spp.)、クリ科クリ属のクリ(Castanea spp.)、ブナ科ブナ属のビーチナッツ(Fagus spp.)、ブナ科シイ属のシイ(Castanopsis spp.)、ブナ科コナラ属のドングリ(Quercus spp.)のITS領域の塩基配列を比較した。ヘーゼルナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0034

また、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をヒッコリーナッツ(ブナ目クルミ科ペカン属(Carya spp.))に設定し、ヒッコリーナッツと、その近縁種である同目クルミ科クルミ属のクルミ(Juglans spp.)、クリ科クリ属のクリ(Castanea spp.)、ブナ科ブナ属のビーチナッツ(Fagus spp.)、ブナ科シイ属のシイ(Castanopsis spp.)、ブナ科コナラ属のドングリ(Quercus spp.)、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ(Corylus spp.)のITS領域の塩基配列を比較した。ヒッコリーナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0035

また、ライチ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をライチ(ムクロジ目ムクロジ科レイシ属レイシ(Litchi chinensis))に設定し、ライチとその近縁種である同科ランブータン属のランブータン(Nephelium lappaceum)のITS領域の塩基配列を比較した。ライチに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0036

また、マカダミアナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をマカダミアナッツ(ヤマモガシ目ヤマモガシ科マカダミア属(Macadamia spp.))に設定し、マカダミアナッツと、その近縁種である同目ハス科ハス属のレンコン(Nelumbo nucifera)のITS領域の塩基配列を比較した。マカダミアナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0037

また、ピーカンナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をピーカンナッツ(ブナ目クルミ科ペカン属ペカン(Carya illinoinensis))に設定した。ピーカンナッツは前述のヒッコリーナッツ(ペカン属)の一種であるが、ヒッコリーナッツの中で最も多く市場に流通していることから、ピーカンナッツをその他のヒッコリーナッツと識別する必要があると考えた。ピーカンナッツと、その近縁種である同属のヒッコリーナッツ(Carya ovata、Carya laciniosa)、同目クルミ科クルミ属のクルミ(Juglans spp.)、クリ科クリ属のクリ(Castanea spp.)、ブナ科ブナ属のビーチナッツ(Fagus spp.)、ブナ科シイ属のシイ(Castanopsis spp.)、ブナ科コナラ属のドングリ(Quercus spp.)、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ(Corylus spp.)のITS領域の塩基配列を比較した。ITS領域の塩基配列は近縁種との相同性が高く、ピーカンナッツ特異的な塩基配列を選出することは難しかったが、多重並列配列図を詳細に比較検討したところ、ピーカンナッツに特異的な塩基配列領域を選出することができ、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0038

また、松の実検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種を松の実(マツ目マツ科マツ属(Pinus spp.))に設定し、松の実と、その他裸子植物のITS領域の塩基配列を比較した。松の実に特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0039

また、ピリナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をピリナッツ(ムクロジ目カンラン科カンラン属ピリナッツ(Canarium ovatum))に設定し、ピリナッツと、その近縁種である同目ウルシ科カシューナットノキ属のカシューナッツ(Anacardium occidentale)、ウルシ科カイノキ属のピスタチオ(Pistacia vera)、ウルシ科マンゴー属のマンゴー(Mangifera indica)、ウルシ科サンショウモドキ属のピンクペッパー(Schinus molle)、ムクロジ科レイシ属のライチ(Litchi chinensis)、ムクロジ科ランブータン属のランブータン(Nephelium lappaceum)、ミカン科ミカン属のオレンジCitrus sinensis)のITS領域の塩基配列を比較した。ピリナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0040

また、ピスタチオ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をピスタチオ(ムクロジ目ウルシ科カイノキ属ピスタチオ(Pistacia vera))に設定し、ピスタチオと、その近縁種である同科カシューナットノキ属のカシューナッツ(Anacardium occidentale)、マンゴー属のマンゴー(Mangifera indica)、サンショウモドキ属のピンクペッパー(Schinus molle)のITS領域の塩基配列を比較した。ピスタチオに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0041

また、シアナッツ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をシアナッツ(ツツジ目アカテツ科シアーバターノキ属シアーバターノキ(Vitellaria paradoxa))に設定し、近縁種である同科フルクリコ属のミラクルフルーツ(Synsepalum dulcificum)、同目サガリバナ科ブラジルナッツノキ属のブラジルナッツ(Bertholletia excelsa)、カキノキ科カキノキ属のカキ(Diospyros kaki)、カキノキ科ツバキ属の茶(Camellia sinensis)、マタタビ科マタタビ属のキウイフルーツ(Actinidia deliciosa)、ツツジ科スノキ属のブルーベリー(Vaccinium spp.)のITS領域の塩基配列を比較した。シアナッツに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0042

また、クルミ検出用PCRプライマーセットの開発に際しては、検出目的とする生物種をクルミ(ブナ目クルミ科クルミ属(Juglans spp.))に設定した。バターナッツ(Juglans cinerea)もクルミ属の一種であるため、検出対象とした。クルミと、その近縁種である同科ペカン属のヒッコリーナッツ(Carya ovata、Carya laciniosa)、ピーカンナッツ(Carya illinoinensis)、同目クリ科クリ属のクリ(Castanea spp.)、ブナ科ブナ属のビーチナッツ(Fagus spp.)、ブナ科シイ属のシイ(Castanopsis spp.)、ブナ科コナラ属のドングリ(Quercus spp.)、カバノキ科ハシバミ属のヘーゼルナッツ(Corylus spp.)のITS領域の塩基配列を比較した。クルミに特異的な塩基配列領域を選定し、当該塩基配列領域からPCRプライマーセットを新規に設計した。その際、検出目的とした生物種の当該塩基配列領域とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、検出目的としない生物種とはハイブリダイズしないように創意工夫して、設計した。

0043

なお、センスプライマーとアンチセンスプライマーのハイブリダイズや、個々のプライマー自身によるハイブリダイズを生じないように、すなわち、いわゆるプライマーダイマーの形成を極力回避するような工夫を施して、各々のプライマーを設計した。例えば、プライマーダイマーの形成を回避させるために、プライマーの検出特異性及び検出感度の低下を導かないような塩基置換をプライマーに施している。アーモンド検出用プライマーのセンスプライマーである配列番号1における塩基番号3及び4の塩基は、本来、Aであるが、センスプライマー自身によるプライマーダイマーの形成を回避するために、プライマーの検出特異性及び検出感度の低下を導かないような塩基置換として、Aの代わりにTを採用している。同様に、配列番号10における塩基番号8の塩基をCからAに、配列番号15における塩基番号6の塩基をGからAに、配列番号21における塩基番号3の塩基をCからAに、配列番号24における塩基番号4の塩基をCからAに、塩基番号7の塩基をAからTに置換している。

0044

さらに、上記17種のプライマーセットによるPCR反応条件を同一にするため、PCR反応において、その反応条件を最も左右するアニーリング条件アニーリング温度アニーリング時間)が同一になるよう各PCRプライマーを設計した。複数種のPCRプライマーのアニーリング条件を同一にすることは非常に困難であったが、PCRプライマーの塩基数、プライマー自身の塩基配列を詳細に検討することにより、各々の検出特異性を損なうことなく、アニーリング条件が同一となるよう設計した。

0045

本発明が提供するプライマーの塩基配列について網羅的に述べてきたが、理論上は首尾よく設計されたプライマーであっても、意図する性能(検出特異性等)を保有しえないプライマーが設計される場合がある。例えば、本発明の研究段階において、配列番号69と配列番号70とからなるピーカンナッツ検出用PCRプライマーセットを用いたPCRでは、ピーカンナッツに特有の塩基配列を用いたにも関わらず、ピーカンナッツDNAだけでなく、ヒッコリーナッツ(オーバータヒッコリー)DNAも検出し、意図した検出特異性を示さなかった。このように、単に論理的にプライマーを設計すれば、意図する性能(検出特異性等)を取得できるとは限らず、必要な性能を保有しない場合も生じうるために、その設計の際には、論理的設計だけでなく、さらなる工夫とその性能評価試験が重要となる。本発明が提供するプライマーは、論理的設計の上に、さらなる工夫を施して設計したものであり、最終的には性能評価試験をクリアーしたものである。

0046

従って、本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCR法などの核酸分析の手法を用いて、各種食品中に含まれる木の実(アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、バターナッツ、カシューナッツ、クリ、チンカピン、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、あるいはクルミ)由来DNAを高感度かつ特異的に、一斉に検出することができる。

0047

ここで、核酸分析とは、生物分類における、個々の種、属、あるいは、グループによって特徴的な塩基配列が存在することを利用して、その特徴的な塩基配列の有無を分析することによって、その生物の種、属、あるいは、グループを把握するために有効な手段であって、特定の微生物の検出や生物種の同定などに有用に用いられる方法である。

0048

本発明が提供するプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
塩基番号12345678901234567890123456789
配列番号1 (アーモンドS) AGTTCTAGTTTCAAAGCGGGGGC
配列番号2 (アーモンドAS)ACGACGGGCAACCGAGGTC
配列番号3 (ビーチナッツS) GCCTTTCGTCCCCAAACGGTC
配列番号4 (ビーチナッツAS)TGCCACGGTCGCTTCGAATG
配列番号5 (ブラジルナッツS) GACGAGTGGTGGATCACGACACG
配列番号6 (ブラジルナッツAS) TCGATGCCTTGCCGCTTCG
配列番号7 (カシューナッツS) TGGCGTTCGGAACGAACCCG
配列番号8 (カシューナッツAS) GCGATGCGGGCGGGCATAG
配列番号9 (クリS) GGAACGCGCCAAGGAAATCA
配列番号10(クリAS) TCCGCCCAGCCCCGAACC
配列番号11(ココナッツS) GACGCTCCGCCCCCTCGA
配列番号12(ココナッツAS) GTGCGGCACGCACCTGGG
配列番号13(銀杏S) GGTGCTCACTCCCCAGTCAGG
配列番号14(銀杏AS)CATCTAGCATTTTGATCCTAACCACGG
配列番号15(ヘーゼルナッツS) ATGCCAGGGGCGAATCTTGTG
配列番号16(ヘーゼルナッツAS) GCTACAGGGTCACAGAGCACAAGAC
配列番号17(ヒッコリーナッツS) TGGGAGGGCACGATGAAAGC
配列番号18(ヒッコリーナッツAS) CGACGCAATAGGGTCGAGGAGAG
配列番号19(ライチS) GAGGCGTGGGGATGCGTTATC
配列番号20(ライチAS)CGAGAGCCTTACGCCGACCG
配列番号21(マカダミアナッツS) GCACCCCGTGTCTCTGTTCG
配列番号22(マカダミアナッツAS) CGATGTCCGAACAATGGCAAAG
配列番号23(ピーカンナッツS) ACGGTTGGGAGGGCACGA
配列番号24(ピーカンナッツAS) TGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
配列番号25(松の実S) CAGGCGATGTTTCGTGGCG
配列番号26(松の実AS)CCCTACCCAATGGGAGGACAAG
配列番号27(ピリナッツS) TGGTCGTAACGAACCTCGGTGC
配列番号28(ピリナッツAS) CGTCACGGCGGCGCTTTC
配列番号29(ピスタチオS) GGTGTCGGTCGTATGCTTCTGCAT
配列番号30(ピスタチオAS) GTCGTTATTGATAATGAAAGAAGGCTACC
配列番号31(シアナッツS) GCGTTGCCTCGGCTAAAAACTC
配列番号32(シアナッツAS) GCGGTCAAGGCTCCGCAA
配列番号33(クルミS) GGTTGGGAGGGCACGTTGAG
配列番号34(クルミAS)CGACGGGTCACGAGGGTTTC
また、本発明が提供する30塩基のDNAからなるプライマーとしては、例えば以下の塩基配列のものを上げることができる。
配列番号35(アーモンドS) cgacccgAGTTCTAGTTTCAAAGCGGGGGC
配列番号36(アーモンドAS) gacgaacgcacACGACGGGCAACCGAGGTC
配列番号37(ビーチナッツS) ggcttcgcgGCCTTTCGTCCCCAAACGGTC
配列番号38(ビーチナッツAS) cggacgaggtTGCCACGGTCGCTTCGAATG
配列番号39(ブラジルナッツS) acggcacGACGAGTGGTGGATCACGACACG
配列番号40(ブラジルナッツAS) tggggtcgcggTCGATGCCTTGCCGCTTCG
配列番号41(カシューナッツS) cgacggtcggTGGCGTTCGGAACGAACCCG
配列番号42(カシューナッツAS) ggggtcgcgacGCGATGCGGGCGGGCATAG
配列番号43(クリS) accccggcgcGGAACGCGCCAAGGAAATCA
配列番号44(クリAS) gggaggccaactTCCGCCCAGCCCCGAACC
配列番号45(ココナッツS) atcatgccaagcGACGCTCCGCCCCCTCGA
配列番号46(ココナッツAS) ccgatggctgggGTGCGGCACGCACCTGGG
配列番号47(銀杏S) gctctgaagGGTGCTCACTCCCCAGTCAGG
配列番号48(銀杏AS) aatCATCTAGCATTTTGATCCTAACCACGG
配列番号49(ヘーゼルナッツS) acggcgtgcATGCCAGGGGCGAATCTTGTG
配列番号50(ヘーゼルナッツAS) gcgcaGCTACAGGGTCACAGAGCACAAGAC
配列番号51(ヒッコリーナッツS) caaaaacggtTGGGAGGGCACGATGAAAGC
配列番号52(ヒッコリーナッツAS) gcaagaaCGACGCAATAGGGTCGAGGAGAG
配列番号53(ライチS) gcctcggacGAGGCGTGGGGATGCGTTATC
配列番号54(ライチAS)gcttcagggtCGAGAGCCTTACGCCGACCG
配列番号55(マカダミアナッツS) gcgaagattgGCACCCCGTGTCTCTGTTCG
配列番号56(マカダミアナッツAS) cacgcacaCGATGTCCGAACAATGGCAAAG
配列番号57(ピーカンナッツS) cccctcccaaaaACGGTTGGGAGGGCACGA
配列番号58(ピーカンナッツAS) cgggaggccaTGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
配列番号59(松の実S) ctgaaatgtggCAGGCGATGTTTCGTGGCG
配列番号60(松の実AS)taaatccgCCCTACCCAATGGGAGGACAAG
配列番号61(ピリナッツS) accttcggTGGTCGTAACGAACCTCGGTGC
配列番号62(ピリナッツAS) gtgcgggcgccgCGTCACGGCGGCGCTTTC
配列番号63(ピスタチオS) tcgtcgGGTGTCGGTCGTATGCTTCTGCAT
配列番号64(ピスタチオAS) aGTCGTTATTGATAATGAAAGAAGGCTACC
配列番号65(シアナッツS) cctgaattGCGTTGCCTCGGCTAAAAACTC
配列番号66(シアナッツAS) tgacctggggtcGCGGTCAAGGCTCCGCAA
配列番号67(クルミS) cccaaaaaacGGTTGGGAGGGCACGTTGAG
配列番号68(クルミAS)gggcaacacaCGACGGGTCACGAGGGTTTC

0049

本発明の研究段階において、意図した検出特異性を示さなかったプライマーの塩基配列は、以下の通りである。
配列番号69(ピーカンナッツS) CCCCAACACCTCGTATGATGTGTA
配列番号70(ピーカンナッツAS) TGTAGTTGCGCTCGTCGCCC
( Sはセンスプライマーを表し、ASはアンチセンスプライマーを表す。)

0050

本発明は、第1のプライマーセットとして、配列表の配列番号1における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、アーモンド検出用に好適に使用できる。

0051

本発明は、第2のプライマーセットとして、配列表の配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ビーチナッツ検出用に好適に使用できる。

0052

本発明は、第3のプライマーセットとして、配列表の配列番号5における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号6における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ブラジルナッツ検出用に好適に使用できる。

0053

本発明は、第4のプライマーセットとして、配列表の配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、カシューナッツ検出用に好適に使用できる。

0054

本発明は、第5のプライマーセットとして、配列表の配列番号9における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、クリ検出用に好適に使用できる。

0055

本発明は、第6のプライマーセットとして、配列表の配列番号11における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号12における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ココナッツ検出用に好適に使用できる。

0056

本発明は、第7のプライマーセットとして、配列表の配列番号13における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号14における塩基番号13〜27の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、銀杏検出用に好適に使用できる。

0057

本発明は、第8のプライマーセットとして、配列表の配列番号15における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号16における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ヘーゼルナッツ検出用に好適に使用できる。

0058

本発明は、第9のプライマーセットとして、配列表の配列番号17における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号18における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ヒッコリーナッツ検出用に好適に使用できる。

0059

本発明は、第10のプライマーセットとして、配列表の配列番号19における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号20における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ライチ検出用に好適に使用できる。

0060

本発明は、第11のプライマーセットとして、配列表の配列番号21における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号22における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、マカダミアナッツ検出用に好適に使用できる。

0061

本発明は、第12のプライマーセットとして、配列表の配列番号23における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号24における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ピーカンナッツ検出用に好適に使用できる。

0062

本発明は、第13のプライマーセットとして、配列表の配列番号25における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号26における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、松の実検出用に好適に使用できる。

0063

本発明は、第14のプライマーセットとして、配列表の配列番号27における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号28における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ピリナッツ検出用に好適に使用できる。

0064

本発明は、第15のプライマーセットとして、配列表の配列番号29における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号30における塩基番号15〜29の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、ピスタチオ検出用に好適に使用できる。

0065

本発明は、第16のプライマーセットとして、配列表の配列番号31における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号32における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、シアナッツ検出用に好適に使用できる。

0066

本発明は、第17のプライマーセットとして、配列表の配列番号33における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをセンスプライマーとし、配列表の配列番号34における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最短15最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーをアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは、クルミ検出用に好適に使用できる。

0067

前記各プライマーにおいて、塩基配列の長さを15から30とするのは、PCR用プライマーとしての塩基配列の適切な長さが15〜30程度であること、また、3´末端側15個の塩基配列を特定するのは、3´末端側15個程度がPCRの特異的な増幅反応において重要であって、5´末端側の塩基配列が若干異なっていたり、配列の長さが多少違っていたりしても、PCRの反応自体への悪影響が、たいていの場合、小さいためである。

0068

本発明においては、さらに、第1のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(1´)(最も好ましくは配列番号1の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(2´)(最も好ましくは配列番号2の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはアーモンド検出用に好適に使用でき、配列番号1のプライマーと配列番号2のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(1´)の具体例としては配列番号35のプライマー、(2´)の具体例としては配列番号36のプライマーを例示できる。

0069

本発明においては、さらに、第2のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(3´)(最も好ましくは配列番号3の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(4´)(最も好ましくは配列番号4の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはビーチナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号3のプライマーと配列番号4のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(3´)の具体例としては配列番号37のプライマー、(4´)の具体例としては配列番号38のプライマーを例示できる。

0070

本発明においては、さらに、第3のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(5´)(最も好ましくは配列番号5の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(6´)(最も好ましくは配列番号6の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはブラジルナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号5のプライマーと配列番号6のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(5´)の具体例としては配列番号39のプライマー、(6´)の具体例としては配列番号40のプライマーを例示できる。

0071

本発明においては、さらに、第4のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(7´)(最も好ましくは配列番号7の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(8´)(最も好ましくは配列番号8の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはカシューナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号7のプライマーと配列番号8のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(7´)の具体例としては配列番号41のプライマー、(8´)の具体例としては配列番号42のプライマーを例示できる。

0072

本発明においては、さらに、第5のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(9´)(最も好ましくは配列番号9の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(10´)(最も好ましくは配列番号10の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはクリ検出用に好適に使用でき、配列番号9のプライマーと配列番号10のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(9´)の具体例としては配列番号43のプライマー、(10´)の具体例としては配列番号44のプライマーを例示できる。

0073

本発明においては、さらに、第6のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(11´)(最も好ましくは配列番号11の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(12´)(最も好ましくは配列番号12の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはココナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号11のプライマーと配列番号12のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(11´)の具体例としては配列番号45のプライマー、(12´)の具体例としては配列番号46のプライマーを例示できる。

0074

本発明においては、さらに、第7のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(13´)(最も好ましくは配列番号13の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(14´)(最も好ましくは配列番号14の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは銀杏検出用に好適に使用でき、配列番号13のプライマーと配列番号14のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(13´)の具体例としては配列番号47のプライマー、(14´)の具体例としては配列番号48のプライマーを例示できる。

0075

本発明においては、さらに、第8のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(15´)(最も好ましくは配列番号15の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(16´)(最も好ましくは配列番号16の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはヘーゼルナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号15のプライマーと配列番号16のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(15´)の具体例としては配列番号49のプライマー、(16´)の具体例としては配列番号50のプライマーを例示できる。

0076

本発明においては、さらに、第9のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(17´)(最も好ましくは配列番号17の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(18´)(最も好ましくは配列番号18の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはヒッコリーナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号17のプライマーと配列番号18のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(17´)の具体例としては配列番号51のプライマー、(18´)の具体例としては配列番号52のプライマーを例示できる。

0077

本発明においては、さらに、第10のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(19´)(最も好ましくは配列番号19の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(20´)(最も好ましくは配列番号20の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはライチ検出用に好適に使用でき、配列番号19のプライマーと配列番号20のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(19´)の具体例としては配列番号53のプライマー、(20´)の具体例としては配列番号54のプライマーを例示できる。

0078

本発明においては、さらに、第11のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(21´)(最も好ましくは配列番号21の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(22´)(最も好ましくは配列番号22の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはマカダミアナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号21のプライマーと配列番号22のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(21´)の具体例としては配列番号55のプライマー、(22´)の具体例としては配列番号56のプライマーを例示できる。

0079

本発明においては、さらに、第12のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(23´)(最も好ましくは配列番号23の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(24´)(最も好ましくは配列番号24の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはピーカンナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号23のプライマーと配列番号24のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(23´)の具体例としては配列番号57のプライマー、(24´)の具体例としては配列番号58のプライマーを例示できる。

0080

本発明においては、さらに、第13のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(25´)(最も好ましくは配列番号25の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(26´)(最も好ましくは配列番号26の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットは松の実検出用に好適に使用でき、配列番号25のプライマーと配列番号26のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(25´)の具体例としては配列番号59のプライマー、(26´)の具体例としては配列番号60のプライマーを例示できる。

0081

本発明においては、さらに、第14のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(27´)(最も好ましくは配列番号27の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号28の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(28´)(最も好ましくは配列番号28の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはピリナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号27のプライマーと配列番号28のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(27´)の具体例としては配列番号61のプライマー、(28´)の具体例としては配列番号62のプライマーを例示できる。

0082

本発明においては、さらに、第15のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(29´)(最も好ましくは配列番号29の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(30´)(最も好ましくは配列番号30の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはピスタチオ検出用に好適に使用でき、配列番号29のプライマーと配列番号30のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(29´)の具体例としては配列番号63のプライマー、(30´)の具体例としては配列番号64のプライマーを例示できる。

0083

本発明においては、さらに、第16のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号31の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(31´)(最も好ましくは配列番号31の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号32の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(32´)(最も好ましくは配列番号32の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはシアナッツ検出用に好適に使用でき、配列番号31のプライマーと配列番号32のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(31´)の具体例としては配列番号65のプライマー、(32´)の具体例としては配列番号66のプライマーを例示できる。

0084

本発明においては、さらに、第17のプライマーセットの好ましい態様としては、配列表の配列番号33の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(33´)(最も好ましくは配列番号33の塩基配列のDNAからなるプライマー)をセンスプライマーとし、配列表の配列番号34の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマー(34´)(最も好ましくは配列番号34の塩基配列のDNAからなるプライマー)をアンチセンスプライマーとするプライマーセットを提案する。本プライマーセットはクルミ検出用に好適に使用でき、配列番号33のプライマーと配列番号34のプライマーとをセットで用いることが最も好ましい。なお、(33´)の具体例としては配列番号67のプライマー、(34´)の具体例としては配列番号68のプライマーを例示できる。

0085

木の実検出法
本発明の木の実検出方法は、試料からDNAを抽出する工程と、このDNAを鋳型として、本発明のプライマーセットを用いてPCRを行う工程と、増幅されたDNAを検出することにより試料中に木の実(アーモンド、ビーチナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、クリ、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミ)が存在しているか否かを検出する工程とを含む方法である。

0086

即ち、上記本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを用いて、試料中のDNAをPCR等で核酸分析することにより、試料中の木の実を特異的に検出することが可能となる。このとき、アーモンドを検出する場合には、アーモンド検出用PCRプライマーセットを使用し、同様にビーチナッツ、ブラジルナッツ、カシューナッツ、クリ、ココナッツ、銀杏、ヘーゼルナッツ、ヒッコリーナッツ、ライチ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ、シアナッツ、クルミを検出する場合には、それぞれビーチナッツ検出用PCRプライマーセット、ブラジルナッツ検出用PCRプライマーセット、カシューナッツ検出用PCRプライマーセット、クリ検出用PCRプライマーセット、ココナッツ検出用PCRプライマーセット、銀杏検出用PCRプライマーセット、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマーセット、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマーセット、ライチ検出用PCRプライマーセット、マカダミアナッツ検出用PCRプライマーセット、ピーカンナッツ検出用PCRプライマーセット、松の実検出用PCRプライマーセット、ピリナッツ検出用PCRプライマーセット、ピスタチオ検出用PCRプライマーセット、シアナッツ検出用PCRプライマーセット、クルミ検出用PCRプライマーセットを使用すればよい。

0087

検出法(核酸分析)の種類は、特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、PCRプライマーを用いてPCR増幅する方法やPCR増幅産物をプローブで検出する方法等を例示することができる。

0088

PCRプライマーを用いてPCR増幅する方法としては、検出目的に応じて選択した上記本発明の木の実検出用プライマーセットを用いて、試料中のDNAにおける標的塩基配列を選択的に増幅させ、PCR増幅産物の有無を測定する方法が挙げられる。PCR増幅産物の有無の確認は、通常、PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドサイバーグリーンIなどの核酸染色によって行うことができる。リアルタイムPCR装置を用いてPCRを行う場合は、その装置の検出システムにより自動的にPCR増幅産物の有無を確認することができる。例えば、PCR反応液中にサイバーグリーンIを添加した場合、サイバーグリーンIが二本鎖DNAに結合したときに発する蛍光量に依存したPCR増幅産物量をサイクル毎にモニターすることができる。蛍光量によりPCR増幅が見られた場合には、先述のアガロースゲル電気泳動によって増幅産物の有無とそのサイズを確認すればよい。

0089

具体的には、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約515 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にアーモンドが存在していたことを示唆する。

0090

具体的には、配列番号3記載のプライマーと配列番号4記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約75 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にビーチナッツが存在していたことを示唆する。

0091

具体的には、配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約91 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にブラジルナッツが存在していたことを示唆する。

0092

具体的には、配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約102 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にカシューナッツが存在していたことを示唆する。

0093

具体的には、配列番号9記載のプライマーと配列番号10記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約293 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にクリが存在していたことを示唆する。

0094

具体的には、配列番号11記載のプライマーと配列番号12記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約224 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にココナッツが存在していたことを示唆する。

0095

具体的には、配列番号13記載のプライマーと配列番号14記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約186 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に銀杏が存在していたことを示唆する。

0096

具体的には、配列番号15記載のプライマーと配列番号16記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約361 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にヘーゼルナッツが存在していたことを示唆する。

0097

具体的には、配列番号17記載のプライマーと配列番号18記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約543 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にヒッコリーナッツが存在していたことを示唆する。

0098

具体的には、配列番号19記載のプライマーと配列番号20記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約162 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にライチが存在していたことを示唆する。

0099

具体的には、配列番号21記載のプライマーと配列番号22記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約111 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にマカダミアナッツが存在していたことを示唆する。

0100

具体的には、配列番号23記載のプライマーと配列番号24記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約468 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にピーカンナッツが存在していたことを示唆する。
尚、ピーカンナッツはヒッコリーナッツの一種であるため、前述のヒッコリーナッツの検出プライマーによってもピーカンナッツを検出可能である。

0101

具体的には、配列番号25記載のプライマーと配列番号26記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約139 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に松の実が存在していたことを示唆する。

0102

具体的には、配列番号27記載のプライマーと配列番号28記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約83 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にピリナッツが存在していたことを示唆する。

0103

具体的には、配列番号29記載のプライマーと配列番号30記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約163 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にピスタチオが存在していたことを示唆する。

0104

具体的には、配列番号31記載のプライマーと配列番号32記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約518 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にシアナッツが存在していたことを示唆する。

0105

具体的には、配列番号33記載のプライマーと配列番号34記載のプライマーを用いたPCR増幅産物のサイズは約501 bpである。アガロース電気泳動において当該サイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中にクルミが存在していたことを示唆する。

0106

さらに、上記のプライマーセットのうち、主要8種(アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミ)について特定の4種の組み合わせについてはマルチプレックス法による検出が可能である。具体的な組合せは以下である。
尚、マルチプレックスPCRとは、1回のPCR反応系に複数のプライマーを同時に使用することによって複数の遺伝子領域を同時に増幅する方法をいう。マルチプレックスPCRを実施することによって、PCR試薬の節約ができ、同時検出によってPCR実験作業の煩雑さを回避するとともに、検出対象である鋳型DNAを節約して有効利用できるというメリットがある。

0107

(1)ピーカンナッツ、クルミ、ピスタチオ、カシューナッツの4種については、配列番号17記載のプライマーと配列番号18記載のプライマー(ヒッコリーナッツ用)、配列番号33記載のプライマーと配列番号34記載のプライマー(クルミ用)、配列番号29記載のプライマーと配列番号30記載のプライマー(ピスタチオ用)及び配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマー(カシューナッツ用)の全てのプライマーが混合された状態でPCR試験に供することにより(マルチプレックス)、ピーカンナッツのPCR増幅産物(約543bp)、クルミのPCR増幅産物(約501bp)、ピスタチオのPCR増幅産物(約163bp)及びカシューナッツのPCR増幅産物(約102bp)を同時に検出することができ、これらのいずれかのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実が存在していたことを示唆する。

0108

尚、ピーカンナッツはヒッコリーナッツの一種であるため、前述のヒッコリーナッツの検出プライマーによってもピーカンナッツを検出可能である。本マルチプレックスPCRにおいては、ピーカンナッツの検出については、ヒッコリーナッツの検出プライマーを利用する。
また、例えば、これらの全てのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実のいずれも存在していたことを示唆する。
また、マルチプレックスによって検出対象とする木の実の増幅産物が検出された場合、二次検査として個別のプライマーを利用して再度確認検査を行うことが好ましい。

0109

尚、本マルチプレックスでのPCRの場合、ピーカンナッツ用、クルミ用、ピスタチオ用及びカシューナッツ用の各プライマーのPCRに供するプライマー濃度比率については特に限定されるものではないが、好ましくは、ピーカンナッツ検出用のプライマーについて、他の三種(クルミ、ピスタチオ、カシューナッツ)がそれぞれ1の割合に対して、0.9以下の割合で使用することが好ましい。また、さらに好ましくは、0.1〜0.7の割合で使用することが好ましい。さらに、最も好ましくは、0.2〜0.4の割合で使用することが好ましい。
このような割合にすることで4種のいずれについても好適に検出することが可能である。

0110

(2)アーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの4種については、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマー(アーモンド用)、配列番号15記載のプライマーと配列番号16記載のプライマー(ヘーゼルナッツ用)、配列番号21記載のプライマーと配列番号22記載のプライマー(マカダミアナッツ用)及び配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマー(ブラジルナッツ用)の全てのプライマーが混合された状態でPCR試験に供することにより(マルチプレックス)、アーモンドのPCR増幅産物(約515bp)、ヘーゼルナッツのPCR増幅産物(約361bp)、マカダミアナッツのPCR増幅産物(約111bp)及びブラジルナッツのPCR増幅産物(約91bp)を同時に検出することができ、これらのいずれかのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実が存在していたことを示唆する。

0111

また、例えば、これらの全てのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実のいずれも存在していたことを示唆する。
また、マルチプレックスによって検出対象とする木の実の増幅産物が検出された場合、二次検査として個別のプライマーを利用して再度確認検査を行うことが好ましい。

0112

尚、本マルチプレックスでのPCRの場合、アーモンド用、ヘーゼルナッツ用、マカダミアナッツ用及びブラジルナッツ用の各プライマーのPCRに供するプライマー濃度の比率については特に限定されるものではないが、好ましくは、アーモンド検出用のプライマーについて、他の三種(ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ)がそれぞれ1の割合に対して、2以上の割合で使用することが好ましい。また、さらに好ましくは、4〜8の割合で使用することが好ましい。さらに、最も好ましくは、5〜7の割合で使用することが好ましい。

0113

このような割合にすることで4種のいずれについても好適に検出することが可能である。さらに、(1)及び(2)の試験の両方を実施することにより、主要8種(アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミ)全てを検出することが可能である。
このように(1)及び(2)の4種×2回実施することで網羅的に上記8種全ての検出が可能となるような方法についても提供することができる。

0114

(3)ピーカンナッツ、クルミ、ヘーゼルナッツ、カシューナッツの4種については、配列番号17記載のプライマーと配列番号18記載のプライマー(ヒッコリーナッツ用)、配列番号33記載のプライマーと配列番号34記載のプライマー(クルミ用)、配列番号15記載のプライマーと配列番号16記載のプライマー(ヘーゼルナッツ用)及び配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマー(カシューナッツ用)の全てのプライマーが混合された状態でPCR試験に供することにより(マルチプレックス)、ピーカンナッツのPCR増幅産物(約543bp)、クルミのPCR増幅産物(約501bp)、ヘーゼルナッツのPCR増幅産物(約361bp)及びカシューナッツの増幅産物(約102bp)を同時に検出することができ、これらのいずれかのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実が存在していたことを示唆する。

0115

尚、ピーカンナッツはヒッコリーナッツの一種であるため、前述のヒッコリーナッツの検出プライマーによってもピーカンナッツを検出可能であり、本マルチプレックスPCRにおいては、ピーカンナッツの検出については、ヒッコリーナッツの検出プライマーを利用する。

0116

また、例えば、これらの全てのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実のいずれも存在していたことを示唆する。
また、マルチプレックスによって検出対象とする木の実の増幅産物が検出された場合、二次検査として個別のプライマーを利用して再度確認検査を行うことが好ましい。

0117

尚、本マルチプレックスでのPCRの場合、ピーカンナッツ用、クルミ用、ヘーゼルナッツ用及びカシューナッツ用の各プライマーのPCRに供するプライマー濃度の比率については特に限定されるものではないが、好ましくは、ピーカンナッツ検出用のプライマーについて、他の三種(クルミ、ヘーゼルナッツ、カシューナッツ)がそれぞれ1の割合に対して、0.9以下の割合で使用することが好ましい。また、さらに好ましくは、0.1〜0.7の割合で使用することが好ましい。さらに、最も好ましくは、0.2〜0.4の割合で使用することが好ましい。
このような割合にすることで4種のいずれについても好適に検出することが可能である。

0118

(4)アーモンド、ピスタチオ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの4種については、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマー(アーモンド用)、配列番号29記載のプライマーと配列番号30記載のプライマー(ピスタチオ用)、配列番号21記載のプライマーと配列番号22記載のプライマー(マカダミアナッツ用)及び配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマー(ブラジルナッツ用)のすべてのプライマーが混合された状態でPCR試験に供することにより(マルチプレックス)、アーモンドのPCR増幅産物(約515bp)、ピスタチオのPCR増幅産物(約163bp)、マカダミアナッツのPCR増幅産物(約111bp)及びブラジルナッツのPCR増幅産物(約91bp)を同時に検出することができ、これらのいずれかのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実が存在していたことを示唆する。

0119

また、例えば、これらの全てのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実のいずれも存在していたことを示唆する。また、マルチプレックスによって検出対象とする木の実の増幅産物が検出された場合、二次検査として個別のプライマーを利用して再度確認検査を行うことが好ましい。

0120

尚、本マルチプレックスでのPCRの場合、アーモンド用、ピスタチオ用、マカダミアナッツ用及びブラジルナッツ用の各プライマーのPCRに供するプライマー濃度の比率については特に限定されるものではないが、好ましくは、アーモンド検出用のプライマーについて、他の三種(ピスタチオ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ)がそれぞれ1の割合に対して、2以上の割合で使用することが好ましい。また、さらに好ましくは、4〜8の割合で使用することが好ましい。さらに、最も好ましくは、5〜7の割合で使用することが好ましい。
このような割合にすることで4種のいずれについても好適に検出することが可能である。

0121

さらに、(3)及び(4)の試験の両方を実施することにより、主要8種(アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミ)全てを検出することが可能である。
このように(3)及び(4)の4種×2回実施することで網羅的に上記8種全ての検出が可能となるような方法についても提供することができる。

0122

(5)ピーカンナッツ、クルミ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの4種については、配列番号17記載のプライマーと配列番号18記載のプライマー(ヒッコリーナッツ用)、配列番号33記載のプライマーと配列番号34記載のプライマー(クルミ用)、配列番号21記載のプライマーと配列番号22記載のプライマー(マカダミアナッツ用)及び配列番号5記載のプライマーと配列番号6記載のプライマー(ブラジルナッツ用)の全てのプライマーが混合された状態でPCR試験に供することにより(マルチプレックス)、ピーカンナッツのPCR増幅産物(約543bp)、クルミのPCR増幅産物(約501bp)、マカダミアナッツのPCR増幅産物(約111bp)及びブラジルナッツのPCR増幅産物(約91bp)を同時に検出することができ、これらのいずれかのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実が存在していたことを示唆する。

0123

尚、ピーカンナッツはヒッコリーナッツの一種であるため、前述のヒッコリーナッツの検出プライマーによってもピーカンナッツを検出可能であり、本マルチプレックスPCRにおいては、ピーカンナッツの検出については、ヒッコリーナッツの検出プライマーを利用する。また、例えば、これらの全てのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実のいずれも存在していたことを示唆する。

0124

また、マルチプレックスによって検出対象とする木の実の増幅産物が検出された場合、二次検査として個別のプライマーを利用して再度確認検査を行うことが好ましい。
尚、本マルチプレックスでのPCRの場合、ピーカンナッツ用、クルミ用、マカダミアナッツ用及びブラジルナッツ用の各プライマーのPCRに供するプライマー濃度の比率については特に限定されるものではないが、好ましくは、ピーカンナッツ検出用のプライマーについて、他の三種(クルミ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ)がそれぞれ1の割合に対して、0.9以下の割合で使用することが好ましい。また、さらに好ましくは、0.1〜0.7の割合で使用することが好ましい。さらに、最も好ましくは、0.2〜0.4の割合で使用することが好ましい。
このような割合にすることで4種のいずれについても好適に検出することが可能である。

0125

(6)アーモンド、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、カシューナッツの4種については、配列番号1記載のプライマーと配列番号2記載のプライマー(アーモンド用)、配列番号15記載のプライマーと配列番号16記載のプライマー(ヘーゼルナッツ用)、配列番号29記載のプライマーと配列番号30記載のプライマー(ピスタチオ用)及び配列番号7記載のプライマーと配列番号8記載のプライマー(カシューナッツ用)の全てのプライマーが混合された状態でPCR試験に供することにより(マルチプレックス)、アーモンドのPCR増幅産物(約515bp)、ヘーゼルナッツのPCR増幅産物(約361bp)、ピスタチオのPCR増幅産物(約163bp)及びカシューナッツの増幅産物(約102bp)を同時に検出することができ、これらのいずれかのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実が存在していたことを示唆する。

0126

また、例えば、これらの全てのサイズの増幅産物を検出した場合、被験試料中に当該木の実のいずれも存在していたことを示唆する。
また、マルチプレックスによって検出対象とする木の実の増幅産物が検出された場合、二次検査として個別のプライマーを利用して再度確認検査を行うことが好ましい。
尚、本マルチプレックスでのPCRの場合、アーモンド用、ヘーゼルナッツ用、ピスタチオ用及びカシューナッツ用の各プライマーのPCRに供するプライマー濃度の比率については特に限定されるものではないが、好ましくは、アーモンド検出用のプライマーについて、他の三種(ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、カシューナッツ)がそれぞれ1の割合に対して、2以上の割合で使用することが好ましい。また、さらに好ましくは、4〜8の割合で使用することが好ましい。さらに、最も好ましくは、5〜7の割合で使用することが好ましい。

0127

このような割合にすることで4種のいずれについても好適に検出することが可能である。さらに、(5)及び(6)の試験の両方を実施することにより、主要8種(アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミ)全てを検出することが可能である。
このように(5)及び(6)の4種×2回実施することで網羅的に上記8種全ての検出が可能となるような方法についても提供することができる。

0128

PCR増幅産物をプローブで検出する方法としては、Taq Man法に代表されるように、PCR増幅産物の内部塩基配列とハイブリダイズするような蛍光物質標識プローブ反応液に添加し、該プローブがPCR増幅産物にハイブリダイズ後、該プローブが分解されるときに生じる蛍光量をリアルタイムPCR装置で自動的に検出することによって、PCR増幅産物の有無を確認する方法が挙げられる。なお、PCR増幅産物をプローブで検出するその他の方法としては、Molecular Beacon法、CycleavePCR法、ハイブリプローブを利用する方法等が挙げられる。これらの方法で使用するPCRプライマーは、本発明の木の実検出用PCRプライマーセットの何れかを使用すればよく、各々のPCRプライマーセットで増幅されるPCR増幅産物の内部塩基配列から標的とする生物種に共通な塩基配列領域を別途選択し、その領域に基づいたプローブを使用すればよい。

0129

本発明の木の実の検出法において、対象となる被験試料の種類は、特に限定されない。例えば、被験試料としては、食品原料や加工食品等が挙げられる。食品原料としては、木の実を取り扱う食原料生工場において、別途生産される木の実を意図的に含まない食品原料が挙げられる。加工食品としては、菓子類麺類粉末スープ液体スープ熱風乾燥又は凍結乾燥した具材、あるいは、これらの加工食品を含有する各種調理食品等が挙げられる。また、木の実を取り扱う食品製造工場において、別途生産される木の実を意図的に含まない加工食品が挙げられる。また、木の実を含む加工食品を製造後、木の実を含まない加工食品を製造する際には、木の実残渣の除去を念頭においた食品製造設備の入念な清掃作業が必須となる。この清掃作業方法の有効性、並びに、食品製造設備の木の実残渣の有無を確認する観点から、当該製造設備の拭き取り試料も被験試料として挙げられる。

0130

また、試料の形態も特に限定されず、一般的な既知のDNA抽出法消費者次長通知、アレルギー物質を含む食品の検査方法について、平成26年3月26日、消食表第36号)や市販の各種DNA抽出キット[例えば、Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits(GE Healthcare Biosciences Corp., USA)、DNA Extraction IsoplantII kit(Nippon Gene Co. Ltd., Japan)、DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)等]によって、DNAの回収が可能な試料であれば、上記の検出法に適用することができる。上記のDNA抽出法によって、ゲノムDNA及び細胞小器官由来DNA(ミトコンドリアDNAやクロロプラストDNA)を、通常、試料から抽出することができる。

0131

木の実検出用キット
本発明は、また、木の実検出キットとして利用することも可能である。当該キットは、上記本発明の木の実検出用PCRプライマーセットの少なくとも1セットを含んで成るものであれば、その構成は特に限定されない。
具体的には、配列番号1における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号2における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号3における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号4における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号5における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号6における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号7における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号8における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号9における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号10における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号11における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号12における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号13における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号14における塩基番号13〜27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号15における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号16における塩基番号11〜25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号17における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号18における塩基番号9〜23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号19における塩基番号7〜21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号20における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号21における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号22における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列表の配列番号23における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号24における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号25における塩基番号5〜19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号26における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号27における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号28における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号29における塩基番号10〜24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号30における塩基番号15〜29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号31における塩基番号8〜22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号32における塩基番号4〜18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号33における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号34における塩基番号6〜20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;の1セット以上を含む木の実検出キットが挙げられる。

0132

そして、好ましいものとして、配列番号1の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号2の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号3の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号4の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号5の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号6の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号7の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号8の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号9の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号10の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号11の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号12の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号13の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号14の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号15の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号16の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号17の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号18の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号19の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号20の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号21の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号22の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列表の配列番号23の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号24の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号25の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号26の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号27の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号28の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号29の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号30の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号31の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号32の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセット;
配列番号33の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーと、配列番号34の塩基配列を3´末端側に含む最大30塩基のDNAからなるPCRプライマーとのセットの1セット以上を含む木の実検出キットが挙げられる。

0133

その中でも、特に好ましいものとして、配列番号1の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号2の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号3の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号4の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号5の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号6の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号7の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号8の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号9の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号10の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号11の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号12の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号13の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号14からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号15の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号16の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号17の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号18の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号19の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号20の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号21の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号22の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列表の配列番号23の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号24の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号25の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号26の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号27の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号28の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号29の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号30の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号31の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号32の塩基配列からなるPCRプライマーとのセット;
配列番号33の塩基配列からなるPCRプライマーと、配列番号34の塩基配列からなるPCRプライマーとのセットの1セット以上を含む木の実検出キットが挙げられる。
また、上記の各々のプライマーセット、及び当該の各々のプライマーセットで増幅されるPCR増幅産物を検出するためのプローブ等を含む木の実検出キットなども挙げられる。

0134

当該キットには、使用目的等に応じて、適当な試薬や各種容器等を含めることができる。具体的には、PCRプライマー伸長生成物を合成するための重合用試薬、例えば、耐熱性DNAポリメラーゼデオキシリボヌクレオチドマグネシウム及び、PCR反応用緩衝液、並びに、それらの品質を適切に保持可能な保存容器等を含めることができる。

0135

実施例
以下に、本発明について実施例を用いて、さらに、詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定して解釈されるものではない。また、本発明の要旨を逸脱することなく、適宜変更することが可能である。

0136

実施例1
各種動物、植物、真菌、及び細菌由来DNAに対する木の実検出用PCRプライマーセットの検出特異性の確認
本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを使用したPCR分析法の有効性を確認するために、各種生物由来DNAに対するPCRの検出特異性を調べる実験を、下記のように実施した。

0137

ヒトの精製DNAは、セマイン社(CeMines,LLC, USA)から購入したものを使用した。

0138

ウシブタニワトリシロエビタラガニコウイカ、ベニザケ、及びマサバの精製DNAは、商店から購入した各々の試料の(筋)肉質部分を凍結後、マルチビーズショッカー(安井器械、大阪)で破砕した試料からNucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits(GE Healthcare Biosciences Corp., USA)、DNA Extraction IsoplantII kit(Nippon Gene Co. Ltd., Japan)、またはDNeasy Blood&Tissue kit(Qiagen GmbH, Germany)を用いて調製したものを使用した。

0139

コショウナガイモネギ、ココナッツ、ナツメヤシ、アサイー、バナナ、マカダミアナッツ(オーストラリア産、ケニア産)、レンコン、ラッカセイダイズ、アーモンド(アメリカ産、スペイン産)、モモ、プルーン、ウメ、スモモ、アンズ、サクランボ、リンゴビワイチゴカボチャ、ピーカンナッツ、クルミ(アメリカ産、フランス産)、ヘーゼルナッツ、ピリナッツ、カシューナッツ(インド産、ベトナム産)、ピスタチオ(イラン産、アメリカ産)、マンゴー、ピンクペッパー、ライチ、ランブータン、キャベツ、ブラジルナッツ、シアナッツ、ミラクルフルーツ、カキ、茶、キウイフルーツ、ブルーベリー、ゴマジャガイモニンジン、銀杏、松の実は、商店から購入し、イネは国内栽培農家から入手した。これらの精製DNAは、各々の試料の一部(種子、果皮部、葉部、塊茎部)を70%エタノール洗浄し、さらに、TE緩衝液で素早く洗浄後、マルチビーズショッカー(安井器械、大阪)で破砕した試料からGenomic-tip 20/G(Qiagen GmbH, Germany)、DNeasy plant Mini kits(Qiagen GmbH, Germany)、Nucleon PhytoPure, plant and fungal DNA extraction kits、または、DNA Extraction IsoplantII kitを用いて調製したものを使用した。

0140

ソバ及びコムギの精製DNAは、商店から購入したそば粉及び小麦粉からGenomic-tip 20/Gを用いて調製したものを使用した。

0141

トウモロコシの精製DNAは、バイオチェインインスティテュート社(BioChain Institute, Inc., USA)から購入したものを使用した。

0142

ヒッコリーナッツ(オーバータヒッコリー)の精製DNAは、東京大学大学院理学系研究科属植物園から分譲された葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。

0143

クリ(和チュウゴクグリヨーロッパグリ)の精製DNAは、独立行政法人農業食品産業技術総合研究機構果樹研究所から提供された葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。

0144

クリ(チンカピン)の精製DNAは、独立行政法人森林総合研究所多摩森林科学園から分譲された葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。

0145

ビーチナッツ(ブナ、イヌブナ)、シイ、ドングリ(シラカシ)の精製DNAは、自然界より入手した葉からDNeasy Plant Mini Kitを用いて調製したものを使用した。

0146

ピキアアノマラ(Pichia anomala IFO 0144)、及びバチルスセレウス菌(Bacillus cereusATCC11950)の精製DNAは、各々の菌株を適切な培地で培養後、その培養液からPuregene Yeast and Gram-Positive DNA Isolation kit(Gentra Systems Inc., USA)を用いて調製したものを使用した。
なお、いずれの精製DNAもRNA分解酵素によるRNAの除去操作を実施してある。

0147

配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、及び34に記載の各々のPCRプライマーは、ユーロフィンジェノミクス社で合成されたものを、以下のPCRで使用した。

0148

上述したように準備した各種動物、植物、真菌、及び細菌DNA量を測定後、滅菌水を用いて、DNA濃度を10 ng/μLに調製した。調製した5 μLのDNA試料液を含む20 μL容量の反応液は、タカラバイオ社のSYBR Premix Ex Taq (TliRNaseH Plus)(Takara Bio Inc., Japan)を用いて調製した。この試薬は、TaKaRa Ex Taq HS(ホットスタートタイプ)、dNTP Mixture、Mg2+およびSYBR Green Iを溶液中に含んでいる。反応液は、SYBR Premix Ex Taqをベースとし、250 nMセンスプライマー、250 nMアンチセンスプライマーを含む組成として、調製した。PCR反応は、LightCycler(Roche Diagnostics GmbH, Germany)で行い、増幅反応条件は以下の通りである。

0149

95℃で1分間のサイクルを一回実施後、20℃/秒の速度で95℃まで昇温後、5秒間同温度で保温、次に20℃/秒の速度で68℃まで降温後、10秒間同温度で保温、さらに10℃/秒の速度で72℃まで昇温後、30秒間同温度で保温する3つのステップからなる増幅サイクルを35回実施した。PCR増幅産物は、SYBR Green I依存性の蛍光量として、各々のサイクルの最終ステップに記録した。蛍光量から増幅が確認された場合は、2%(wt/vol)アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物(反応液の5 μL)を分離し、GelDOC EZ(Bio Rad)を用いて増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとしてOneMARK 100(GeneDireX)を使用した。電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出された場合を、PCR反応陽性と判定した。これらのPCRの結果を表1に記載した。表中の+(プラス)はPCR反応陽性を示し、−(マイナス)はPCR反応陰性を示す。

0150

アーモンド検出用PCRプライマー(配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、アーモンド(アメリカ産、スペイン産)DNAを使用した場合のみ515bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるモモDNA、プルーンDNA、ウメDNA、スモモDNA、アンズDNA、サクランボDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0151

また、ビーチナッツ検出用PCRプライマー(配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、ビーチナッツ(ブナ、イヌブナ)DNAを使用した場合のみ75bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるクリ(和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン)DNA、シイDNA、ドングリ(シラカシ)DNA、ピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツDNA、クルミ(アメリカ産、フランス産)DNA、ヘーゼルナッツDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0152

また、ブラジルナッツ検出用PCRプライマー(配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、ブラジルナッツDNAを使用した場合のみ91bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるシアナッツDNA、ミラクルフルーツDNA、カキDNA、茶DNA、キウイフルーツDNA、ブルーベリーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0153

また、カシューナッツ検出用PCRプライマー(配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、カシューナッツ(インド産、ベトナム産)DNAを使用した場合のみ102bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるピスタチオ(イラン産、アメリカ産)DNA、マンゴーDNA、ピンクペッパーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0154

また、クリ検出用PCRプライマー(配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、クリ(和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン)DNAを使用した場合のみ293bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるビーチナッツ(ブナ、イヌブナ)DNA、シイDNA、ドングリ(シラカシ)DNA、ピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツDNA、クルミ(アメリカ産、フランス産)DNA、ヘーゼルナッツDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0155

また、ココナッツ検出用PCRプライマー(配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、ココナッツDNAを使用した場合のみ224bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるナツメヤシDNA、アサイーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0156

また、銀杏検出用PCRプライマー(配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、銀杏DNAを使用した場合のみ186bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0157

また、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマー(配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、ヘーゼルナッツDNAを使用した場合のみ361bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツDNA、クルミ(アメリカ産、フランス産)DNA、クリ(和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン)DNA、ビーチナッツ(ブナ、イヌブナ)DNA、シイDNA、ドングリ(シラカシ)DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0158

また、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマー(配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、ヒッコリーナッツ(オーバータヒッコリー)DNA、ピーカンナッツDNAを使用した場合のみ543bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるクルミ(アメリカ産、フランス産)DNA、クリ(和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン)DNA、ビーチナッツ(ブナ、イヌブナ)DNA、ヘーゼルナッツDNA、シイDNA、ドングリ(シラカシ)DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0159

また、ライチ検出用PCRプライマー(配列番号19及び20からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、ライチDNAを使用した場合のみ162bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるランブータンDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0160

また、マカダミアナッツ検出用PCRプライマー(配列番号21及び22からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、マカダミアナッツ(オーストラリア産、ケニア産)DNAを使用した場合のみ111bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるレンコンDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0161

また、ピーカンナッツ検出用PCRプライマー(配列番号23及び24からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、ピーカンナッツDNAを使用した場合のみ468bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるヒッコリーナッツ(オーバータヒッコリー)DNA、クルミ(アメリカ産、フランス産)DNA、クリ(和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン)DNA、ビーチナッツ(ブナ、イヌブナ)DNA、ヘーゼルナッツDNA、シイDNA、ドングリ(シラカシ)DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0162

また、松の実検出用PCRプライマー(配列番号25及び26からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、松の実DNAを使用した場合のみ139bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0163

また、ピリナッツ検出用PCRプライマー(配列番号27及び28からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、ピリナッツDNAを使用した場合のみ83bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるカシューナッツ(インド産、ベトナム産)DNA、ピスタチオ(イラン産、アメリカ産)DNA、マンゴーDNA、ピンクペッパーDNA、ライチDNA、ランブータンDNA、オレンジDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0164

また、ピスタチオ検出用PCRプライマー(配列番号29及び30からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、ピスタチオ(イラン産、アメリカ産)DNAを使用した場合のみ163bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるカシューナッツ(インド産、ベトナム産)DNA、マンゴーDNA、ピンクペッパーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0165

また、シアナッツ検出用PCRプライマー(配列番号31及び32からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、シアナッツDNAを使用した場合のみ518bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるミラクルフルーツDNA、ブラジルナッツDNA、カキDNA、茶DNA、キウイフルーツDNA、ブルーベリーDNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0166

また、クルミ検出用PCRプライマー(配列番号33及び34からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、クルミ(アメリカ産、フランス産)DNAを使用した場合のみ501bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された(表1)。近縁種であるピーカンナッツDNA、ヒッコリーナッツ(オーバータヒッコリー)DNA、クリ(和栗、チュウゴクグリ、ヨーロッパグリ、チンカピン)DNA、ビーチナッツ(ブナ、イヌブナ)DNA、ヘーゼルナッツDNA、シイDNA、ドングリ(シラカシ)DNAや、他の植物を含むその他の生物種DNAを使用した場合には、陰性であった(表1)。

0167

0168

実施例2
木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度の確認
実施例1で使用した木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCRの検出感度を調べるために、下記のような実験を実施した。
実施例1で調製したアーモンド(アメリカ産)、ビーチナッツ(ブナ)、ブラジルナッツ、カシューナッツ(インド産)、クリ(チュウゴクグリ)、ココナッツ、ヘーゼルナッツ、銀杏、ライチ、マカダミアナッツ(オーストラリア産)、ピーカンナッツ、松の実、ピリナッツ、ピスタチオ(アメリカ産)、シアナッツ、及びクルミ(アメリカ産)の各DNAを滅菌水で希釈し、1 fg/μl、10 fg/μl、100 fg/μl、1 pg/μl、10 pg/μl、100 pg/μl のDNA溶液希釈系列を作製し、これらの希釈した被験DNA液の1 μLを、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCRに供した。PCR反応後、増幅産物の有無をアガロースゲル電気泳動によって確認した。

0169

図1に示すように、アーモンド検出用PCRプライマー(配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ビーチナッツ検出用PCRプライマー(配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であり、ブラジルナッツ検出用PCRプライマー(配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、カシューナッツ検出用PCRプライマー(配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、クリ検出用PCRプライマー(配列番号9及び10からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、1 pg DNA/分析であり、ココナッツ検出用PCRプライマー(配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、100 pg DNA/分析であり、銀杏検出用PCRプライマー(配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマー(配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマー(配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ライチ検出用PCRプライマー(配列番号19及び20からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、マカダミアナッツ検出用PCRプライマー(配列番号21及び22からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ピーカンナッツ検出用PCRプライマー(配列番号23及び24からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であり、松の実検出用PCRプライマー(配列番号25及び26からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ピリナッツ検出用PCRプライマー(配列番号27及び28からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、ピスタチオ検出用PCRプライマー(配列番号29及び30からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、100 fg DNA/分析であり、シアナッツ検出用PCRプライマー(配列番号31及び32からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、10 fg DNA/分析であり、クルミ検出用PCRプライマー(配列番号33及び34からなるPCRプライマーセット)を使用した場合の検出感度は、1 fg DNA/分析であった。

0170

実施例3
木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCRによる木の実含有食品中の木の実由来DNAの検出
各種木の実を原料として含有する市販食品等に対する本発明の木の実検出用PCRプライマーセットを用いたPCR分析を下記のように行い、本発明の実用性を検討した。

0171

各種木の実を原料として含有することが明記されている市販食品(表2)を準備し、10〜100 gをマルチビーズショッカーで粉砕した。その混合破砕物の2 gから各々のDNAをGenomic-tip 20/G kitを用いて抽出した。抽出時には、RNA分解酵素によるRNAの除去操作も実施した。抽出した食品試料DNA量を測定後、滅菌水を用いて、食品試料DNAの濃度を10 ng/μLに調製した。なお、ビーチナッツ、ヒッコリーナッツ、およびシアナッツを原料として含有する市販食品の入手が困難であったため、代替試料として、ココナッツサブレ(日清シスコ)DNA溶液(10 ng/μL)に各DNAを10 pg/μLの濃度で添加したものを使用した。これらの調製DNA液の5 μLを、実施例1で使用した木の実検出用PCRプライマーセットを用い、実施例1に記載したPCR反応条件で、PCRに供した。蛍光量から増幅が確認された場合は、2%(wt/vol)アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物(反応液の5 μL)を分離し、GelDOC EZ(Bio Rad)を用いて増幅産物を視覚化することによって、増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとしてOneMARK 100(GeneDireX)を使用した。電気泳動により標的サイズの増幅産物が検出された場合を、PCR反応陽性と判定した。これらのPCRの結果を表2に記載した。表中の+(プラス)はPCR反応陽性を示し、−(マイナス)はPCR反応陰性を示す。
さらに、食品試料DNAから増幅されたPCR増幅産物を、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems社)を用いて、両方向からダイレクトシーケンス後、Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社)によって塩基配列を分析した。分析した塩基配列データをGenBanknucleotide sequence database(BLASTsearch)もしくは、発明者らが保有するDNAデータベースと比較解析し、その塩基配列の類似性に基づいて、PCR増幅産物由来DNAの生物種を帰属・同定した。

0172

その結果、アーモンド検出用PCRプライマー(配列番号1及び2からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、アーモンド含有食品である、リアリーナッティーミューズリー(ドーセットシリアル)及びプチチコリーフパイエル・マドロン)由来DNAにおいてのみ、515bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー(ドーセットシリアル)及びプチチョコリーフパイ(エル・マドロン)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、アーモンドのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、アーモンド非含有食品試料からアーモンド由来DNAやその他のDNAを検出しないが、アーモンド含有食品試料からアーモンド由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0173

また、ビーチナッツ検出用PCRプライマー(配列番号3及び4からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、ビーチナッツ含有食品の代替試料[50pgビーチナッツDNAを添加したココナッツサブレ(日清シスコ)]由来DNAにおいてのみ、75 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ビーチナッツ含有食品の代替試料由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ビーチナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ビーチナッツ非含有食品試料からビーチナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ビーチナッツ非含有食品中に添加された微量のビーチナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0174

また、ブラジルナッツ検出用PCRプライマー(配列番号5及び6からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、ブラジルナッツ含有食品である、リアリーナッティーミューズリー(ドーセットシリアル)由来DNAにおいてのみ、91bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー(ドーセットシリアル)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ブラジルナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ブラジルナッツ非含有食品試料からブラジルナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ブラジルナッツ含有食品試料からブラジルナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0175

また、カシューナッツ検出用PCRプライマー(配列番号7及び8からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、カシューナッツ含有食品である、リアリーナッティーミューズリー(ドーセットシリアル)及びトリプルナッツチョコレート(メリーチコレートカムニー)由来DNAにおいてのみ、102bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー(ドーセットシリアル)及びトリプルナッツチョコレート(メリーチョコレートカムパニー)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、カシューナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、カシューナッツ非含有食品試料からカシューナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、カシューナッツ含有食品試料からカシューナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0176

また、クリ検出用PCRプライマー(配列番号9、及び10からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、クリ含有食品である、栗饅頭(山久YK)由来DNAにおいてのみ、293bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、栗饅頭(山久YK)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、クリのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、クリ非含有食品試料からクリ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、含有食品試料からクリ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0177

また、ココナッツ検出用PCRプライマー(配列番号11及び12からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、ココナッツ含有食品である、トリプルナッツチョコレート(メリーチョコレートカムパニー)及びココナッツサブレ(日清シスコ)由来DNAにおいてのみ、224bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、トリプルナッツチョコレート(メリーチョコレートカムパニー)及びココナッツサブレ(日清シスコ)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ココナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ココナッツ非含有食品試料からココナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ココナッツ含有食品試料からココナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0178

また、銀杏検出用PCRプライマー(配列番号13及び14からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、銀杏含有食品である、ぎんなん羊羹(山モータース)由来DNAにおいてのみ、186bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ぎんなん羊羹(山岸モータース)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、銀杏のクロロプラストmatK遺伝子配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、銀杏非含有食品試料から銀杏由来DNAやその他のDNAを検出しないが、銀杏含有食品試料から銀杏由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0179

また、ヘーゼルナッツ検出用PCRプライマー(配列番号15及び16からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、ヘーゼルナッツ含有食品である、リアリーナッティーミューズリー(ドーセットシリアル)由来DNAにおいてのみ、361bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、リアリーナッティーミューズリー(ドーセットシリアル)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ヘーゼルナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ヘーゼルナッツ非含有食品試料からヘーゼルナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ヘーゼルナッツ含有食品試料からヘーゼルナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0180

また、ヒッコリーナッツ検出用PCRプライマー(配列番号17及び18からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、ヒッコリーナッツ含有食品の代替試料[50pgヒッコリーナッツDNAを添加したココナッツサブレ(日清シスコ)]由来DNA、及びピーカンナッツ含有食品であるトリプルナッツチョコレート(メリーチョコレートカムパニー)においてのみ、543 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、ヒッコリーナッツ含有食品の代替試料由来DNA及びトリプルナッツチョコレート(メリーチョコレートカムパニー)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ヒッコリーナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ヒッコリーナッツ非含有食品試料からヒッコリー由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピーカンナッツ含有食品試料、及びヒッコリーナッツ非含有食品中に添加された微量のヒッコリーナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0181

また、ライチ検出用PCRプライマー(配列番号19及び20からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、ライチ含有食品である、フルーツセラピーホワイトピーチ(フジッコ)由来DNAにおいてのみ、162bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、フルーツセラピー ホワイトピーチ(フジッコ)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ライチのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ライチ非含有食品試料からライチ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ライチ含有食品試料からライチ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0182

また、マカダミアナッツ検出用PCRプライマー(配列番号21及び22からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、マカダミアナッツ含有食品である、プチチョコリーフパイ(エル・マドロン)由来DNAにおいてのみ、111bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、プチチョコリーフパイ(エル・マドロン)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、マカダミアナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、マカダミアナッツ非含有食品試料からマカダミアナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、マカダミアナッツ含有食品試料からマカダミアナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0183

また、ピーカンナッツ検出用PCRプライマー(配列番号23及び24からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、ピーカンナッツ含有食品であるトリプルナッツチョコレート(メリーチョコレートカムパニー)においてのみ、468 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、トリプルナッツチョコレート(メリーチョコレートカムパニー)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ピーカンナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ピーカンナッツ非含有食品試料からピーカンナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピーカンナッツ含有食品試料からピーカンナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0184

また、松の実検出用PCRプライマー(配列番号25及び26からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、松の実含有食品であるまぜるだけのスパゲッティソースバジルエスビー食品)においてのみ、139 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、まぜるだけのスパゲッティソース バジル(エスビー食品)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、松の実のITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、松の実非含有食品試料から松の実由来DNAやその他のDNAを検出しないが、松の実含有食品試料から松の実由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0185

また、ピリナッツ検出用PCRプライマー(配列番号27及び28からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、ピリナッツ含有食品であるLA2PU CRISPY PILINUTwith Garlic(ロイヤルコンツェルン)においてのみ、83 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、LA2PU CRISPY PILINUT with Garlic(ロイヤルコンツェルン)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ピリナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ピリナッツ非含有食品試料からピリナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピリナッツ含有食品試料からピリナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0186

また、ピスタチオ検出用PCRプライマー(配列番号29及び30からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、ピスタチオ含有食品である、プチチョコリーフパイ(エル・マドロン)由来DNAにおいてのみ、163bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、プチチョコリーフパイ(エル・マドロン)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、ピスタチオのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、ピスタチオ非含有食品試料からピスタチオ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、ピスタチオ含有食品試料からピスタチオ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0187

また、シアナッツ検出用PCRプライマー(配列番号31及び32からなるPCRプライマーセット)を使用した場合は、シアナッツ含有食品の代替試料[50pgシアナッツDNAを添加したココナッツサブレ(日清シスコ)]由来DNAにおいてのみ、518 bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、シアナッツ含有食品の代替試料由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、シアナッツのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、シアナッツ非含有食品試料からシアナッツ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、シアナッツ非含有食品中に添加された微量のシアナッツ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0188

また、クルミ検出用PCRプライマー(配列番号33及び34からなるPCRプライマーセット)を使用した場合、クルミ含有食品である、あずきくるみデニッシュ(敷島製パン)由来DNAにおいてのみ、501bp前後の増幅産物が確認され、陽性と判定された。他の食品試料由来DNAを使用した場合には、陰性であった(表2)。なお、PCR増幅産物の塩基配列解析の結果、あずきくるみデニッシュ(敷島製パン)由来DNAから増幅されたPCR増幅産物の塩基配列は、クルミのITS塩基配列と一致した。すなわち、当該PCRプライマーを用いたPCRは、複数の市販食品において、クルミ非含有食品試料からクルミ由来DNAやその他のDNAを検出しないが、クルミ含有食品試料からクルミ由来DNAを特異的に検出できることを確認した。

0189

0190

実施例4
アーモンド、ブラジルナッツ、カシューナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ピーカンナッツ、ピスタチオ、及びクルミの8種について、特定の4種の組み合わせでのマルチプレックス法による検出

0191

実施例1で調製したアーモンド(アメリカ産)、ブラジルナッツ、カシューナッツ(インド産)、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ(オーストラリア産)、ピーカンナッツ、ピスタチオ(アメリカ産)及びクルミ(アメリカ産)の各DNAを滅菌水で希釈し、試料溶液を調製した。

0192

配列番号1、2、5、6、7、8、15、16、17、18、21、22、29、30、33、及び34に記載の各々のPCRプライマーは、ユーロフィンジェノミクス社で合成されたものを、以下のPCRで使用した。

0193

PCR反応液は、タカラバイオ社のSYBR Premix Ex Taq (TliRNaseH Plus)、1 pg/μLに調製した各DNA溶液1 μL、及び4種類のセンスプライマーとアンチセンスプライマーを含む組成として、20 μL容量に調製した。各々のプライマー濃度は、ピーカンナッツ検出用プライマーは100 nM、同反応系に用いるその他3種のプライマーは250 nMとした。また、アーモンド検出用プライマーは500 nM、同反応系に用いるその他3種のプライマーは100 nMとした。PCR反応は、Applied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステム(Thermo Fisher Scientific)で行い、増幅反応条件は以下の通りである。

0194

95℃で30秒間のサイクルを一回実施後、95℃まで昇温後、5秒間同温度で保温、次に70℃まで降温後、40秒間同温度で保温する2つのステップからなる増幅サイクルを35回実施した。4%(wt/vol)アガロースゲル電気泳動によってPCR増幅産物(反応液の5 μL)を分離し、エチジウムブロマイド染色後、ChemiDOC Touch(Bio Rad)を用いて増幅産物の有無を確認した。分子量マーカーとしてOneMARK 100(GeneDireX)を使用した。

0195

ピーカンナッツ、クルミ、ピスタチオ、カシューナッツの4種についてのマルチプレックス(同時検出)の場合、図2の(A)に示すように、検出対象木の実のいずれについても、検出することができた。
尚、図2(A)において1〜5の各レーン番号は、ピーカンナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン1)、クルミDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン2)、ピスタチオDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン3)、カシューナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン4)、全て(ピーカンナッツ、クルミ、ピスタチオ、カシューナッツ)のDNAを添加してPCR反応させたもの(レーン5)を示す。

0196

アーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ及びブラジルナッツの4種についてのマルチプレックス(同時検出)の場合、図2の(B)に示すように、検出対象木の実のいずれについても、検出することができた。

尚、図2(B)において1〜5の各レーン番号は、アーモンドDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン1)、ヘーゼルナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン2)、マカダミアナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン3)、ブラジルナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン4)、全て(アーモンド、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ)のDNAを添加してPCR反応させたもの(レーン5)を示す。

0197

ピーカンナッツ、クルミ、ヘーゼルナッツ及びカシューナッツの4種についてのマルチプレックス(同時検出)の場合、図2の(C)に示すように、検出対象木の実のいずれについても、検出することができた。
尚、図2(C)において1〜5の各レーン番号は、ピーカンナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン1)、クルミDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン2)、ヘーゼルナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン3)、カシューナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン4)、全て(ピーカンナッツ、クルミ、ヘーゼルナッツ、カシューナッツ)のDNAを添加してPCR反応させたもの(レーン5)を示す。

0198

アーモンド、ピスタチオ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの4種についてのマルチプレックス(同時検出)の場合、図2の(D)に示すように、検出対象木の実のいずれについても、検出することができた。
尚、図2(D)において1〜5の各レーン番号は、アーモンドDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン1)、ピスタチオDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン2)、マカダミアナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン3)、ブラジルナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン4)、全て(アーモンド、ピスタチオ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ)のDNAを添加してPCR反応させたもの(レーン5)を示す。

0199

ピーカンナッツ、クルミ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツの4種についてのマルチプレックス(同時検出)の場合、図2の(E)に示すように、検出対象木の実のいずれについても、検出することができた。
尚、図2(E)において1〜5の各レーン番号は、ピーカンナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン1)、クルミDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン2)、マカダミアナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン3)、ブラジルナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン4)、全て(ピーカンナッツ、クルミ、マカダミアナッツ、ブラジルナッツ)のDNAを添加してPCR反応させたもの(レーン5)を示す。

0200

アーモンド、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、カシューナッツの4種についてのマルチプレックス(同時検出)の場合、図2の(F)に示すように、検出対象木の実のいずれについても、検出することができた。
尚、図2(F)において1〜5の各レーン番号は、アーモンドDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン1)、ヘーゼルナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン2)、ピスタチオDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン3)、カシューナッツDNAのみを添加してPCR反応させたもの(レーン4)、全て(アーモンド、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ、カシューナッツ)のDNAを添加してPCR反応させたもの(レーン5)を示す。

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