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課題

特定の条件及び使用に好適である改変プロテアーゼを提供する。

解決手段

親プロテアーゼの単離されたプロテアーゼ変異体であって、前記変異体は、X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S及びX217L/Qからなる群から選択される3つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有し、前記変異体の各アミノ酸位置は、ある特定のアミノ酸配列のアミノ酸配列と前記変異体のアミノ酸配列とのアラインメントによって決定される、ある特定のアミノ酸配列のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる、変異体。前記親プロテアーゼはスブチリシンプロテアーゼであることができる。

概要

背景

プロテアーゼ工業用酵素の技術分野において長きにわたって周知であるが、特定の条
件及び使用に好適である改変プロテアーゼ(engineered proteases)が依然として必要と
されている。本発明は、これらのニーズ及び他のニーズを満たす。

概要

特定の条件及び使用に好適である改変プロテアーゼを提供する。親プロテアーゼの単離されたプロテアーゼ変異体であって、前記変異体は、X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S及びX217L/Qからなる群から選択される3つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有し、前記変異体の各アミノ酸位置は、ある特定のアミノ酸配列のアミノ酸配列と前記変異体のアミノ酸配列とのアラインメントによって決定される、ある特定のアミノ酸配列のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる、変異体。前記親プロテアーゼはスブチリシンプロテアーゼであることができる。なし

目的

本発明は、プロテアーゼ変異体、プロテアーゼ変異体を含む組成物、並びに、このよう
なプロテアーゼ変異体及びこれらの組成物を使用する方法を提供する

効果

実績

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請求項1

親プロテアーゼの単離されたプロテアーゼ変異体であって、前記変異体は、X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S及びX217L/Qからなる群から選択される3つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記変異体はタンパク質分解活性を有し、前記変異体の各アミノ酸位置は、配列番号2のアミノ酸配列と前記変異体のアミノ酸配列とのアラインメントによって決定される、配列番号2のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる、変異体。

請求項2

前記変異体のアミノ酸配列が、X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S及びX217L/Qからなる群から選択される4つのアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の変異体。

請求項3

前記変異体のアミノ酸配列が、X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S及びX217L/Qからなる群から選択される5つのアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の変異体。

請求項4

前記変異体のアミノ酸配列が、X024G/R、X053G、X078N、X101N、X128A/S及びX217L/Qからなる群から選択される6つのアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の変異体。

請求項5

前記変異体のアミノ酸配列がアミノ酸置換X097Aを更に含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の変異体。

請求項6

前記変異体のアミノ酸配列がアミノ酸置換X024G/R+X053G+X078N+X101N+X128A/S+X217L/Q又はX097A+X128A/S+X217L/Qを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の変異体。

請求項7

前記変異体のアミノ酸配列がアミノ酸置換S024G/R+S053G+S078N+S101N+G128A/S+Y217L/Q又はG097A+G128A/S+Y217L/Qを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の変異体。

請求項8

前記変異体のアミノ酸配列がアミノ酸置換S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q又はS024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q、を含み、選択的に、N109G、N076D、S033T、N243V、S248A、A088T、及びS063Gからなる群から選択される置換を更に含む、請求項7に記載の変異体。

請求項9

前記変異体のアミノ酸配列が、以下のもの:A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、S033T+N076D、S009T+N109G+K141R+N243V、S162G+K256R、N109G+A116T、N109G+L257G、S162G+L257G、N061G+N109G+N243V、N109G+N243V+S248A、S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R、N109G+A116T+N243V+K256R、A088T+N109G+A116T+G131H+N243V、A088T+N109G、N109G+N243V、T158S+L257G、N061S+N109G+N243V、P040A+N109G+N243V+S248N+K256R、S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R、A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、N109G+K256R、N109G+N243V+K256R、S063G+K256R、S063G+N109G、S063G、S063G+N076D、S033T+N076D+N218S、及びN076D+N218Sからなる群から選択される1組のアミノ酸置換を更に含む、請求項7に記載の変異体。

請求項10

前記変異体のアミノ酸配列がアミノ酸置換S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Qを含み、以下のもの:A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、S033T+N076D、S009T+N109G+A128S+K141R+N243V、S162G+K256R、N109G+A116T、N109G+L257G、S162G+L257G、N061G+N109G+N243V、N109G+A128S+N243V+S248A、S033T+N076D+N109G+A128S+N218S+N243V+S248N+K256R、N109G+A116T+N243V+K256R、A088T+N109G+A116T+G131H+N243V、A088T+N109G、N109G+N243V、T158S+L257G、N061S+N109G+N243V、P040A+N109G+A128S+N243V+S248N+K256R、S009T+S018T+Y021N+N109G+A128S+K141R、A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、N109G+K256R、N109G+A128S+N243V+K256R、S063G+K256R、S063G+N109G、S063G+A128S、S063G+N076D、S033T+N076D+A128S+N218S、及びN076D+N218Sからなる群から選択される1組のアミノ酸置換を更に含む、請求項7に記載の変異体。

請求項11

前記変異体のアミノ酸配列が、配列番号2又は配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の変異体。

請求項12

前記変異体のアミノ酸配列が、配列番号2又は配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の変異体。

請求項13

前記変異体が、前記親プロテアーゼと比較して向上したタンパク質分解活性及び/又はクリーニング活性を有するか、あるいは、配列番号2の配列を有するBPN’プロテアーゼのタンパク質分解活性と比較して向上したタンパク質分解活性及び/又はクリーニング活性を有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の変異体。

請求項14

前記変異体が、配列番号4の配列を有するプロテアーゼのタンパク質分解活性と比較して向上したタンパク質分解活性を有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の変異体。

請求項15

前記変異体が、配列番号6の配列を有するプロテアーゼのタンパク質分解活性と比較して向上したタンパク質分解活性を有する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の変異体。

請求項16

前記親プロテアーゼがスブチリシンプロテアーゼである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の変異体。

請求項17

前記親プロテアーゼが、配列番号2のアミノ酸配列を有するバチルスアミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)スブチリシンプロテアーゼBPN’に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項16に記載の変異体。

請求項18

前記親プロテアーゼが、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有する、請求項16に記載の変異体。

請求項19

前記変異体が配列番号6のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の変異体。

請求項20

親プロテアーゼの単離されたプロテアーゼ変異体であって、前記プロテアーゼ変異体はタンパク質分解活性を有し、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される配列番号2のアミノ酸位置に対応する1つ以上のアミノ酸位置にて変異を含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記変異の少なくとも1つは独立して、(i)前記位置を占めるアミノ酸残基上流又は下流における1つ以上のアミノ酸残基の挿入、(ii)前記位置を占めるアミノ酸残基の欠失、又は(iii)異なるアミノ酸残基による、前記位置を占めるアミノ酸残基の置換、であり、ここで、各アミノ酸位置は、配列番号2のアミノ酸配列と変異体のアミノ酸配列とのアラインメントによって決定される配列番号2に記載のバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンプロテアーゼBPN’のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる、変異体。

請求項21

前記変異体が、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される2つのアミノ酸位置における変異を含むアミノ酸配列を含む、請求項20に記載の変異体。

請求項22

前記変異体が、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される3つのアミノ酸位置における変異を含むアミノ酸配列を含む、請求項21に記載の変異体。

請求項23

前記変異体が、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される4つのアミノ酸位置における変異を含むアミノ酸配列を含む、請求項22に記載の変異体。

請求項24

前記変異体が、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される5つのアミノ酸位置における変異を含むアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の変異体。

請求項25

前記変異体が、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される6つのアミノ酸位置における変異を含むアミノ酸配列を含む、請求項24に記載の変異体。

請求項26

前記変異体が、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される配列番号2の位置に対応するアミノ酸位置のそれぞれにおける変異を含むアミノ酸配列を含む、請求項25に記載の変異体。

請求項27

前記変異体が、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される位置における異なるアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項20〜26のいずれか一項に記載の変異体。

請求項28

前記変異体が、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される2つの位置のそれぞれにおける異なるアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の変異体。

請求項29

前記変異体が、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される4つの位置のそれぞれにおける異なるアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項28に記載の変異体。

請求項30

前記変異体が、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される5つの位置のそれぞれにおける異なるアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の変異体。

請求項31

前記変異体が、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される6つの位置のそれぞれにおける異なるアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項30に記載の変異体。

請求項32

前記変異体が、位置24、53、78、101、128及び217のそれぞれにおける異なるアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列を含み、ここで、各位置が配列番号2における位置と対応させることにより番号付けされる、請求項31に記載の変異体。

請求項33

前記変異体が、X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S及びX217Q/Lからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項20〜32のいずれか一項に記載の変異体。

請求項34

前記変異体が、X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S及びX217Q/Lからなる群から選択される少なくとも2つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の変異体。

請求項35

前記変異体が、X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S及びX217Q/Lからなる群から選択される少なくとも3つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項34に記載の変異体。

請求項36

前記変異体が、X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S及びX217Q/Lからなる群から選択される少なくとも4つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項35に記載の変異体。

請求項37

前記変異体が、X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S及びX217Q/Lからなる群から選択される少なくとも5つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項36に記載の変異体。

請求項38

前記変異体が、X024G/R、X053G、X078N、X097A、X101N、X128A/S及びX217Q/Lからなる群から選択される少なくとも6つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項37に記載の変異体。

請求項39

前記変異体が、(a)X128A/S及び/又はX217L/Q、(b)G128A/S及び/又はY217L/Q、並びに、(c)G097A、G128A/S及び/又はY217L/Qからなる群から選択される置換の組を含むアミノ酸配列を含む、請求項20〜38のいずれか一項に記載の変異体。

請求項40

前記変異体が、アミノ酸置換X024G/R+X053G+X078N+X101N+X128A/S+X217Q/Lを含むアミノ酸配列を含む、請求項20〜39のいずれか一項に記載の変異体。

請求項41

前記変異体が、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項20〜40のいずれか一項に記載の変異体。

請求項42

前記変異体が、配列番号2に対して少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項41に記載の変異体。

請求項43

前記変異体のアミノ酸配列がS024G、S053G、S078N、S101N、G128A/S及びY217Qの群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項20〜42のいずれか一項に記載の変異体。

請求項44

前記変異体のアミノ酸配列がアミノ酸置換S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Qを含む、請求項20〜43のいずれか一項に記載の変異体。

請求項45

前記変異体が、前記親プロテアーゼと比較して向上したタンパク質分解活性及び/又はクリーニング活性を有するか、あるいは、配列番号2に記載のプロテアーゼのタンパク質分解活性と比較して向上したタンパク質分解活性及び/又はクリーニング活性を有する、請求項20〜44のいずれか一項に記載の変異体。

請求項46

前記変異体が、配列番号4に記載のプロテアーゼのタンパク質分解活性と比較して向上したタンパク質分解活性を有する、請求項20〜44のいずれか一項に記載の変異体。

請求項47

前記変異体が、配列番号6に記載のプロテアーゼのタンパク質分解活性と比較して向上したタンパク質分解活性を有する、請求項20〜44のいずれか一項に記載の変異体。

請求項48

前記親プロテアーゼがスブチリシンプロテアーゼである、請求項20〜47のいずれか一項に記載の変異体。

請求項49

前記親プロテアーゼが、配列番号2のアミノ酸配列を有するバチルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)スブチリシンプロテアーゼBPN’に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項48に記載の変異体。

請求項50

前記親プロテアーゼが、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有する、請求項49に記載の変異体。

請求項51

親プロテアーゼの単離されたプロテアーゼ変異体であって、(a)前記プロテアーゼ変異体は、(i)配列番号2の配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列であって、(ii)位置24及び53におけるグリシンの置換、位置78及び101におけるアスパラギンの置換、位置128におけるアラニン又はセリンの置換、及び位置217におけるグルタミンの置換を含む、アミノ酸配列を含み、(b)前記親プロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、(c)前記変異体の各アミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされ、並びに(d)前記変異体は、親プロテアーゼと比較してタンパク質分解活性及び/又はクリーニング活性が増大している、変異体。

請求項52

前記変異体が成熟型である、請求項1〜51のいずれか一項に記載の変異体。

請求項53

タンパク質分解活性を有する単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、a)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、b)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S033T+N076D、c)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S009T+N109G+K141R+N243V、d)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S162G+K256R、e)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+A116T、f)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+L257G、g)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S162G+L257G、h)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061G+N109G+N243V、i)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+S248A、j)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R、k)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+A116T+N243V+K256R、l)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V、m)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G、n)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+N243V、o)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+T158S+L257G、p)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N061S+N109G+N243V、q)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+P040A+N109G+N243V+S248N+K256R、r)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R、s)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、t)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、u)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N109G+K256R、v)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+N109G+N243V+K256R、w)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+K256R、x)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N109G、y)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S063G、z)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+S063G+N076D、aa)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q+S033T+N076D+N218S、bb)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q+N076D+N218S及びcc)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Q、からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記変異体の各アミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる、変異体。

請求項54

請求項1〜52のいずれか一項に記載の変異体又は請求項53に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列あるいはその相補的ポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸

請求項55

配列番号3若しくは配列番号5に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。

請求項56

請求項54又は55に記載の少なくとも1つの核酸を含む発現ベクター

請求項57

前記少なくとも1つの核酸がプロモーターに作用可能に連結されている、請求項56に記載の発現ベクター。

請求項58

(a)請求項64又は65に記載の核酸、あるいは、(b)請求項56又は57に記載の発現ベクター、を含む、組み換え宿主細胞

請求項59

前記宿主細胞細菌細胞である、請求項58に記載の組み換え宿主細胞。

請求項60

前記宿主細胞がバチルス細胞である、請求項59に記載の組み換え宿主細胞。

請求項61

前記宿主細胞が枯草菌(Bacillus subtilis)細胞である、請求項70に記載の組み換え宿主細胞。

請求項62

(a)請求項54又は55に記載の核酸、あるいは、(b)請求項56又は57に記載の発現ベクター、を含む、細胞培養物

請求項63

プロテアーゼ変異体の製造方法であって、前記方法が、前記変異体の生産を促進する条件下で請求項58〜61のいずれか一項に記載の組み換え宿主細胞を培養することを含む、方法。

請求項64

前記細胞培養物から前記変異体を回収することを更に含む、請求項63に記載の方法。

請求項65

プロテアーゼ変異体の製造方法であって、前記方法が、(a)請求項56又は57に記載の組み換え発現ベクター細胞集団に導入することと、(b)前記発現ベクターによりコードされるプロテアーゼ変異体の生産を促進する条件下で培地内で前記細胞を培養することと、を含む、方法。

請求項66

(c)前記細胞から又は前記培地から前記変異体を単離又は回収することを更に含む、請求項65に記載の方法。

請求項67

組成物布地ケア製品及びホームケア製品ではない、請求項1〜52のいずれか一項に記載の変異体又は請求項53に記載のポリペプチドを含む組成物。

請求項68

少なくとも1つの添加剤成分又は担体を含む、請求項67に記載の組成物。

請求項69

前記組成物が追加の酵素を含む、請求項67又は68に記載の組成物。

請求項70

請求項71

前記組成物が、コンタクトレンズをクリーニングするための洗剤組成物である、請求項67〜70のいずれか一項に記載の組成物。

請求項72

前記組成物が、パーソナルケア用途において有用であるクリーニング組成物である、請求項67〜70のいずれか一項に記載の組成物。

請求項73

少なくとも1つのビルダー及び/又は少なくとも1つの界面活性剤を更に含む、請求項67〜72のいずれか一項に記載の組成物。

請求項74

クリーニングの必要のある物品又は表面をクリーニングするための方法であって、前記方法が、前記物品又は表面を、請求項1〜52のいずれか一項に記載の変異体、請求項53に記載のポリペプチド又は請求項67〜73のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。

請求項75

前記物品又は表面を水ですすぐことを更に含む、請求項74に記載の方法。

請求項76

表面又は物品をクリーニングするための方法であって、前記物品又は表面を所望の程度までクリーニング又は洗浄するのに、充分な時間にわたって並びに/又は充分な若しくは有効な条件下で、請求項1〜52のいずれか一項に記載の変異体、請求項53に記載のポリペプチド又は請求項67〜73のいずれか一項に記載の組成物と、洗浄すべき前記物品又は表面の少なくとも一部分を接触させることを含む、方法。

請求項77

表面若しくは布地の処理及び/又はクリーニング方法であって、選択的に前記表面若しくは布地を洗浄する及び/又はすすぐ工程、前記表面若しくは布地を請求項1〜52のいずれか一項に記載の変異体、請求項52に記載のポリペプチド又は請求項67〜73のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程、次いで、選択的に前記表面若しくは布地を洗浄する及び/又はすすぐ工程を含む、方法。

請求項78

請求項1〜52のいずれか一項に記載の変異体であって、前記親プロテアーゼがスブチリシンプロテアーゼであり、前記変異体が、前記親スブチリシンプロテアーゼと比較したときに洗剤において向上した洗浄性能又は向上したクリーニング性能を有するスブチリシンプロテアーゼ変異体、又は、請求項53に記載のポリペプチドであって、配列番号2、配列番号4又は配列番号6のプロテアーゼと比較したときに洗剤において向上した洗浄性能又は向上したクリーニング性能を有するポリペプチド。

技術分野

0001

(関連出願の相互参照
本出願は、米国特許仮出願番号61/285,127(2009年12月9日出願)及
び同61/392,373(2010年10月12日出願)の優先権及び利益を主張し、
これら各々の開示は全ての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるも
のとする。

0002

(発明の分野)
本発明は、プロテアーゼ変異体、プロテアーゼ変異体を含む組成物、並びに、このよう
なプロテアーゼ変異体及びこれらの組成物を使用する方法を提供する。

背景技術

0003

プロテアーゼ工業用酵素の技術分野において長きにわたって周知であるが、特定の条
件及び使用に好適である改変プロテアーゼ(engineered proteases)が依然として必要と
されている。本発明は、これらのニーズ及び他のニーズを満たす。

課題を解決するための手段

0004

第一態様では、本発明は、親プロテアーゼ酵素の単離されたプロテアーゼ変異体を提供
し、このプロテアーゼ変異体はタンパク質分解活性を有し、位置24、53、78、97
、101、128及び217からなる群から選択される配列番号2のアミノ酸位置に対応
する1つ以上のアミノ酸位置において変異を含むアミノ酸配列を含み、ここで、変異の少
なくとも1つは独立して、(i)この位置を占めるアミノ酸残基上流又は下流における
1つ以上のアミノ酸残基の挿入、(ii)この位置を占めるアミノ酸残基の欠失、又は(
iii)異なるアミノ酸残基による、この位置を占めるアミノ酸残基の置換、であり、こ
こで、各アミノ酸位置は、配列番号2のアミノ酸配列と変異体のアミノ酸配列とのアラ
ンメントによって決定される配列番号2に記載のバチルスアミロリケファシエンス(Ba
cillus amyloliquefaciens)スブチリシンプロテアーゼBPN’のアミノ酸配列における
アミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる。

0005

第二態様では、本発明は、親プロテアーゼの単離されたプロテアーゼ変異体を提供し、
この変異体は、X024G/R、X053G,X078N,X101N,X128A/S
及びX217L/Qからなる群から選択される3つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を
含み、ここで、この変異体はタンパク質分解活性を有し、この変異体の各アミノ酸位置は
、配列番号2のアミノ酸配列と変異体のアミノ酸配列とのアラインメントによって決定さ
れる配列番号2のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対応させることにより番号付けさ
れる。

0006

第三態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離されたポリペプチドを提供
し、上記ポリペプチドは、
a)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、
b)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+S033T+N076D、
c)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+S009T+N109G+K141R+N243V、
d)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+S162G+K256R、
e)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N109G+A116T、
f)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N109G+L257G、
g)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+S162G+L257G、
h)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N061G+N109G+N243V、
i)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+N109G+N243V+S248A、
j)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+
K256R、
k)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N109G+A116T+N243V+K256R、
l)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V、
m)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+A088T+N109G、
n)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N109G+N243V、
o)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+T158S+L257G、
p)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N061S+N109G+N243V、
q)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+P040A+N109G+N243V+S248N+K256R、
r)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R、
s)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、
t)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、
u)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N109G+K256R、
v)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+N109G+N243V+K256R、
w)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+S063G+K256R、
x)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+S063G+N109G、
y)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+S063G、
z)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+S063G+N076D、
aa)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y
217Q+S033T+N076D+N218S、
bb)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y
217Q+N076D+N218S、及び
cc)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y
217Q,からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも85%の配列
同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、この変異体の各アミノ酸位置は、配列番号
2の配列のアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる。

0007

第四態様では、本発明は、(a)配列番号6のポリペプチド配列に対して少なくとも9
5%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリ
ペプチド、(b)少なくとも厳密度の高い条件下で(i)配列番号5のポリヌクレオチド
配列と、又は(ii)(i)の相補的ポリヌクレオチド配列と、ハイブリッド形成するポ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、並びに(c)配列番号5のポリヌクレ
オチド配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、からなる群から選択されるプロテア
ゼ活性を有する単離されたポリペプチドを提供する。

0008

第五態様では、本発明は、親プロテアーゼの単離されたプロテアーゼ変異体を提供し、
ここで、(a)この変異体は親プロテアーゼと比較して20以下、15以下又は10以下
の変異を有するアミノ酸配列を含み、ここで、(i)これらの変異は、挿入、欠失又は置
換から独立して選択され、(ii)これらの変異は、位置24及び53におけるグリシン
の置換、位置78及び101におけるアスパラギンの置換、位置128におけるアラニン
又はセリンの置換、及び位置217におけるグルタミンの置換を包含し、(b)親プロテ
アーゼは、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、(c)配列番号2
のアミノ酸配列は、位置番号付けを決定するために使用され、並びに(d)この変異体は
、親プロテアーゼと比較してタンパク質分解活性が増大しており、ここで、各アミノ酸位
置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる。

0009

第六態様では、本発明は、親プロテアーゼの単離されたプロテアーゼ変異体を提供し、
ここで、(a)この変異体は、(i)配列番号2の配列に対して少なくとも85%の同一
性を有するアミノ酸配列であって、(ii)位置24及び53におけるグリシンの置換、
位置78及び101におけるアスパラギンの置換、位置128におけるアラニン又はセリ
ンの置換、及び位置217におけるグルタミンの置換を含む、アミノ酸配列を含み、(b
)この親プロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも85%の配列同一性を有し、(
c)この変異体の各アミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置に対応させること
により番号付けされ、並びに(d)この変異体は、親プロテアーゼと比較してタンパク質
分解活性が増大している。

0010

別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも1つのポリペプチド変異体(例えば、プ
ロテアーゼ変異体)をコードするポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド
配列を含む、単離された又は組み換え核酸を提供する。

0011

別の態様では、本発明は、配列番号3若しくは配列番号5に記載のポリヌクレオチド又
はその相補的ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリ
ヌクレオチド配列を含む、単離された又は組み換え核酸を提供する。

0012

別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも1つの核酸を含む発現ベクターを提供す
る。本発明の少なくとも1つの核酸又は発現ベクターを含む組み換え宿主細胞又は細胞
養物も提供される。

0013

別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも1つのポリペプチド(例えば、プロテア
ーゼ変異体)の製造方法を提供し、この方法は、(a)本発明のポリペプチド(例えば、
プロテアーゼ変異体)をコードする本発明の組み換え発現ベクター細胞集団に導入する
ことと、(b)この発現ベクターによりコードされるポリペプチド(例えば、プロテアー
ゼ変異体)の生産を促進する条件下で培地内でこの細胞を培養することと、選択的に(c
)細胞又は培地から変異体を単離又は回収することと、を含む。

0014

別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも1つのプロテアーゼ変異体又はポリペプ
チドを、選択的に別の酵素と組み合わせて含む組成物を提供する。このような組成物は、
界面活性剤及び/又はビルダー又は担体などの添加剤成分を含んでもよい。このような組
成物は、クリーニング組成物又は洗剤組成物であってもよく、本明細書の他の箇所に記載
クリーニング方法において有用であり得る。このような組成物は布地ケア製品及びホー
ムケア製品であってもよく、又は、このような組成物は、布地ケア製品及びホームケア
品でなくてもよい。

0015

別の態様では、本発明は、クリーニングする必要のある物品、対象又は表面をクリーニ
ングするための方法を提供し、この方法は、物品、対象又は表面を、本発明のポリペプチ
ド若しくはプロテアーゼ変異体又は本発明の組成物と接触させることと、選択的にこの物
品、対象又は表面を水ですすぐことと、を含む。

0016

別の態様では、本発明は、物品又は表面(例えば、硬質表面)をクリーニングするため
の方法を提供し、この方法は、物品又は表面(例えば、硬質表面)を充分な時間にわたっ
て又は所望される程度までクリーニング若しくは洗浄するのに十分な若しくは有効な条件
下で本発明のポリペプチド又はプロテアーゼ変異体又は本発明の組成物に、クリーニング
すべき物品又は表面(例えば、硬質表面)の少なくとも一部を接触させることを含み、選
択的にこの物品又は表面(例えば、硬質表面)を水ですすぐことを含む。

0017

本発明の他の態様は、下記に記載される。

図面の簡単な説明

0018

pHPLT−BPN’−v3のプラスミドマップ
pHPLT−BPN’−v3+S78Nのプラスミドマップ。
pHPLT−BPN’partial optのプラスミドマップ。
pHPLT−BPN’−v36のプラスミドマップ。
BPN’(配列番号2)及びGG36(配列番号755)を含む成熟参照スブチリシンプロテアーゼのアラインメント。各冷水プロテアーゼ(cold water protease)変異体を含む本明細書に記載の各プロテアーゼ変異体の各アミノ酸位置は、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンプロテアーゼBPN’アミノ酸配列とプロテアーゼ変異体のアミノ酸配列のアラインメントにより決定される図5に示すようなバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンプロテアーゼBPN’(配列番号2)のアミノ酸配列内の対応するアミノ酸位置の番号付けに従って番号付けされる。したがって、本明細書において特に指定しない限り、置換位置は、BPN’に対する関係で与えられる。
pHPLT−GG36のマップ。
pRA68のマップ。
pRA96のマップ。

0019

定義
特に指定しない限り、本発明の実施は、当該技術分野内の分子生物学タンパク質工学
微生物学及び組み換えDNAにおいて通常使用される従来技術を伴う。このような技術
は、当業者既知であり、当業者に周知の数多くのテキスト及び参考文献に記載されてい
る。上記及び下記の両方で本明細書で言及される全ての特許、特許出願、論文及び刊行物
は、これによって本明細書に参照により明示的に組み込まれるものとする。

0020

本明細書で特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は
、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。多くの技術
用語辞書が当業者に既知である。本明細書に記載されているものと類似した又は等価な任
意の方法及び部材の使用が発明の実施において見出されるが、一部の好適な方法及び部材
を本明細書に記載するものとする。したがって、すぐ下に定義される用語は、概して本明
細書を参照することにより、より完全に説明される。数的範囲は、範囲を画定する数を包
含するものとする。特に示さない限り、それぞれ、核酸は左から右に5’→3’の向きで
記述され、アミノ酸は左から右にアミノカルボキシの向きで記述される。本発明は、記
載される特定の方法、プロトコル及び試薬に限定されるものではなく、当業者によりこれ
らが使用される文脈に依存して変更されてもよいことが理解されよう。

0021

本発明の実施は、特に示さない限り、タンパク質精製、分子生物学、微生物学、組み換
えDNA技術及びタンパク質配列決定の従来技術を採用し、これらの全ては、当該技術分
野内のものである。

0022

更に、本明細書で提供される見出しは、概して本明細書を参照することにより有するこ
とができる本発明の様々な態様を限定するものではない。したがって、すぐ下に定義され
る用語は、概して本明細書を参照することにより、より完全に定義される。しかしながら
、本発明の理解を促進するために、多くの用語を以下に定義する。

0023

本明細書で使用するとき、用語、「プロテアーゼ」及び「プロテイナーゼ」は、他のタ
ンパク質を分解する能力を有する酵素タンパク質を指す。プロテアーゼは、「タンパク質
分解」を行う能力を有し、タンパク質を形成するペプチド又はポリペプチド鎖内でアミノ
酸を一緒に連結するペプチド結合加水分解することによりタンパク質異化反応を開始す
る。タンパク質消化酵素としてのプロテアーゼのこの活性は、「タンパク質活性」と呼ば
れる。タンパク質分解活性を測定するための多くの周知の手順が存在する(例えば、Ka
lisZ,「Microbial Proteinases,」In:Fiechter
(ed.),Advances in Biochemical Engineerin
g/Biotechnology(1988)を参照されたい)。例えば、タンパク質分
解活性は、それぞれのプロテアーゼが市販の基質を加水分解する能力を解析する比較アッ
セイにより確定され得る。プロテアーゼ又はタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な
基質としては、ジメチルカゼイン(Sigma C−9801)、ウシコラーゲン(S
igma C−9879)、ウシのエラスチン(Sigma E−1625)及びウシの
ケラチン(ICN Biomedical 902111)が挙げられるが、これらに限
定されない。これらの基質を利用する比色分析アッセイが当該技術分野において周知であ
る(例えば、国際公開第99/34011号及び米国特許第6,376,450号、これ
らはどちらも参照により本明細書に組み込まれる)。pNAアッセイ(例えば、Del
Mar et al.,Anal.Biochem.99:316〜320[1979]
を参照されたい)もまた、勾配溶出時に回収される画分の活性酵素濃度を定量するのに使
用され得る。このアッセイは、酵素が可溶性合成基質スクシニル−アラニン−アラニン
プロリンフェニルアラニン−p−ニトロアニリド(suc−AAPF−pNA)を加
水分解する際にp−ニトロアニリンが放出される速度を判定する。加水分解反応により黄
色味が生成される速度は、分光光度計で410nmにて測定され、この速度は活性酵素濃
度に比例する。加えて、280ナノメートル(nm)での吸光度測定を使用して、総タン
パク質濃度を定量することができる。活性濃度総タンパク質比は、酵素純度を与える。

0024

本明細書で使用するとき、用語、「スブチリシン」は、MEROPS−ぺプチダーゼデ
タベースに記載のS8セリンプロテアーゼファミリーの任意のメンバーを指す(Raw
lings et al.,MEROPS:the peptidase databa
se,Nucl.AcidsRes.,34 Database issue,D27
0−272[2006]を参照されたい)。そこに記載のように、ぺプチダーゼファミリ
ーS8は、セリンエンドペプチダーゼスブチリシン及びその相同体を含有する(Rawl
ings and Barrett,Biochem.J.290:205〜218,[
1993])。ファミリーS8は、サブチラーゼファミリーとしても知られ、セリンペプ
チダーゼの二番目に大きなファミリーである。ファミリーS8の第三の構造は、今回判定
された。典型的なS8タンパク質構造は三層からなり、七本鎖βシート二層のへリック
スの間に挟まれている。スブチリシン(S08.001)は、クランSB(SB)の類型
構造である。異なる構造であるにもかかわらず、スブチリシンの活性部位とキモトリプシ
ン(S01.001)の活性部位は重ね合わせることができ、これは、類似性分岐進化
よりも収斂の結果であることを示唆する。

0025

「プロテアーゼ変異体」(又は「変異プロテアーゼ」)は、そのアミノ酸配列において
、少なくとも1つのアミノ酸残基が参照プロテアーゼ又は親プロテアーゼのアミノ酸配列
とは異なるプロテアーゼを指し得る。親プロテアーゼ又は参照プロテアーゼは、野生型
ロテアーゼである必要はなく、しかしながらそれ自体が野生型プロテアーゼの変異体であ
ってもよい。参照又は親プロテアーゼがいずれかの特定のアミノ酸配列に限定されること
は意図しない。参照又は親プロテアーゼのプロテアーゼ変異体は、親プロテアーゼ又は参
照プロテアーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、9
0%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の
同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、親プロテアーゼ又は参照プロテアーゼのア
ミノ酸配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換、挿入又は欠失を含んでもよい。一
態様では、本発明は、セリンプロテアーゼの変異体を含み、ここで、この変異体は、セリ
ンプロテアーゼと比較して少なくとも1つの変異を有する。一態様では、本発明は、配列
番号2の成熟BPN’配列と比較して1つ以上の変異を含むアミノ酸配列を含む「BPN
’変異体」(又は「BPN’スブチリシン変異体」)を含む。

0026

親プロテアーゼ又は参照プロテアーゼは、例えば、既知のプロテアーゼ(例えば、BP
N’が挙げられるがこれに限定されない)又は市販のプロテアーゼ又は市販のプロテアー
ゼの変異体であり得るが、これに限定されない。親プロテアーゼ又は参照プロテアーゼは
、それ自体が既知又は市販のプロテアーゼの変異体であってもよい。プロテアーゼ変異体
は、市販されている親プロテアーゼから、又は、このような市販の親プロテアーゼの変異
体から、誘導することができる。市販のプロテアーゼとしては、例えば、商品名SAVI
ASE登録商標)、POLARZYME(登録商標)、KANNASE(登録商標)
、LIQUANASE(登録商標)、LIQUANASE ULTRA(登録商標)、S
AVINASE ULTRA(登録商標)、OVOZYME(登録商標)(NovoZy
mes A/Sによる)、MAXACAL(登録商標)、PROPERASE(登録商標
)、PURAFECT(登録商標)、FN3(登録商標)、FN4(登録商標)及びPU
RAFECT OXP(登録商標)、PURAFAST(商標)、PURAFECT(登
録商標)PRIME、PURAMAX(登録商標)(Danisco US Inc.(
元Genencor International,Inc.)による)で販売されてい
るプロテアーゼ、並びにHenkel/Kemiraから入手可能なもの、すなわちBL
AP(以下の変異S99D+S101R+S103A+V104I+G159S,を有す
る米国特許第5,352,604号の表29に示されているアミノ酸配列、以降ではBL
APと呼ぶ)及びBLAP X(S3T+V4I+V205Iを有するBLAP)が挙げ
られるが、これらに限定されない。

0027

本明細書で使用するとき、「冷水プロテアーゼ」は、以下の四つの基準のうちの1つ以
上を呈する酵素である:(a)本明細書のパートI実施例1に記載の「試験方法」に定義
したようにPURAFECT(登録商標)Prime(アミノ酸置換Y217Lを有する
配列番号2)と比較したときにpH 8及び16℃(60°F)におけるBMIで、性能
指数が少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、少
なくとも1.5、少なくとも1.6、少なくとも1.7、少なくとも1.8、少なくとも
1.9、少なくとも2、1.1〜約10、1.1〜約8、又は更には1.1〜約5、(b
)本明細書のパートI実施例1に記載の「試験方法」に定義したようにBPN’(配列番
号2)と比較したときにpH 8及び16℃(60°F)におけるBMIで、性能指数
少なくとも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5、少なくとも1.6、少なくと
も1.7、少なくとも1.8、少なくとも1.9、少なくとも2、1.3〜約8、又は更
には1.3〜約5、(c)本明細書のパートI実施例1に記載の「試験方法」に定義した
ようにBPN’−v3(配列番号4)と比較したときにpH 8及び16℃(60°F)
におけるBMIで、性能指数が少なくとも0.9、少なくとも1.0、少なくとも1.1
、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5、少なく
とも1.6、少なくとも1.7、少なくとも1.8、少なくとも1.9、少なくとも2、
0.9〜約10、0.9〜約8、又は更には0.9〜約5、並びに/あるいは(d)本明
細書のパートI実施例1に記載の「試験方法」に定義したようにBPN’−v36(配列
番号6)と比較したときにpH 8及び16℃(60°F)におけるBMIで、性能指数
が少なくとも0.9、少なくとも1.0、少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なく
とも1.3、少なくとも1.4、少なくとも1.5、少なくとも1.6、少なくとも1.
7、少なくとも1.8、少なくとも1.9、少なくとも2、0.9〜約10、0.9〜約
8、0.9〜約5、1.0〜約10、1.0〜約8、又は更には1.0〜約5。

0028

一部の好適な冷水プロテアーゼはスブチリシンから誘導され、特にスブチリシンBPN
’(配列番号2)から誘導される。冷水プロテアーゼは、配列番号2のアミノ酸配列を有
するBPN’の変異体であり得る(例えば、「BPN’変異体」又は「BPN’スブチ
シン変異体」)。一部のこのような冷水プロテアーゼは、本明細書に記載のアミノ酸置換
を1つ以上含む。

0029

本明細書で使用するとき、バチルス属は、当業者に既知であるように、バチルス属内の
全ての種を含み、例えば、枯草菌(B. subtilis)、バチルス・リケニホルミス(B. lich
eniformis)、バチルス・レンタス(B. lentus)、バチルス・ブレビス(B. brevis)、
バチルス・ステアロサーモフィラス(B. stearothermophilus)、バチルス・アルカロフ
ラス(B. alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefacien
s)、バチルス・クラウジイ(B. clausii)、バチルス・ハロデュランス(B. halodurans
)、バチルス・メガテリウム(B. megaterium)、バチルス・コアグランス(B. coagulan
s)、バチルス・サーキュランス(B. circulans)、バチルス・ロータス(B. lautus)及
びバチルス・チューリンゲンシス(B. thuringiensis)が挙げられるが、これらに限定さ
れない。バチルス属が引き続き分類再編中であることが認識される。したがって、この属
が、例えば、現在では「ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearoth
ermophilus)」という名称であるバチルス・ステアロサーモフィラス(B. stearothermop
hilus)などの生物が挙げられるがこれに限定されない、再分類された種を含むことが意
図される。酸素の存在下での耐性内生胞子の形成は、バチルス属を定義する特徴と考えら
れるが、この特徴は、近年名付けられたアリシクロバチルス(Alicyclobacillus)、アン
フィバチルス(Amphibacillus)、アネウリニバチルス(Aneurinibacillus)、アノキシ
バチルス(Anoxybacillus)、ブレビバチルス(Brevibacillus)、フィロバチルス(Filo
bacillus)、グラリバチルス(Gracilibacillus)、ハロバチルス(Halobacillus)、
パエニバチルス(Paenibacillus)、サリバチルス(Salibacillus)、サーモバチルス(T
hermobacillus)、ウレイバチルス(Ureibacillus)及びバージバチルス(Virgibacillus
)にも当てはまる

0030

用語、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書において互換的に使用され、鎖
中で任意の長さのヌクレオチドモノマー共有結合しているポリマーを指す。DNA(デ
オキシリボ核酸)、デオキシリボヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、RNA(リボ
酸)、リボ核酸のポリマーは、互いに異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチド又は
核酸の例である。ポリヌクレオチド又は核酸としては、一本鎖二本鎖若しくは三本鎖D
NA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA−RNAハイブリッド、あるいは、プリ
塩基及びピリミジン塩基を含むポリマー、天然ヌクレオチド塩基、化学的に修飾された
ヌクレオチド塩基生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基
、又は誘導されたヌクレオチド塩基が挙げられるが、これらに限定されない。以下は、ポ
リヌクレオチドの非限定例である:遺伝子、遺伝子断片染色体断片発現配列標識(E
ST)、エキソンイントロンメッセンジャーRNAmRNA)、運搬RNA(tR
NA)、リボソームRNArRNA)、リボザイム相補的DNA(cDNA)、組み
換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の
単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ及びプライマー。一部
のポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾された
ヌクレオチド、ウラシル、他の糖、並びに、フルオロリボース及びチオアートなどの連結
基、並びにヌクレオチド分枝を含む。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により
割り込まれてもよい。

0031

本明細書で使用するとき、用語、「ベクター」は、核酸又はポリヌクレオチドを標的細
胞又は組織の中に導入又は運搬するために使用される核酸コンストラクト又はポリヌクレ
オチドコストラクトを指す。ベクターは、典型的には、外来DNAを別の細胞又は組織
の中に導入するために使用される。ベクターは、一般に、導入遺伝子であるDNA配列
、ベクターの「骨格鎖」として働くより大きなポリヌクレオチド配列と、を含む。このベ
クターは、典型的には、挿入された導入遺伝子などの遺伝子情報標的細胞又は組織に運
搬するよう働き、それにより、標的細胞又は組織において挿入遺伝子を単離、複製又は発
現する。ベクターとしては、プラスミド、クローニングベクターバクテリオファージ
ウイルス(例えば、ウイルスベクター)、コスミド、発現ベクター、シャトルベクター
カセット及びこれらに類するものが挙げられる。ベクターは、典型的には、複製起点、マ
チクロニングイト及び選択マーカーを含む。ベクターを標的細胞の中に挿入するプ
ロセスは、典型的には、細菌及び酵母菌における形質転換として、並びに、哺乳類細胞
おけるトランスフェクションとして、示される。本発明は、好適な宿主においてDNA配
列が発現されるよう機能し得る好適なプロ配列(例えば、分泌配列、シグナルペプチド
列など)に作用可能に連結されているプロテアーゼ変異体(例えば、前駆体又は成熟プロ
テアーゼ変異体)をコードするDNA配列を含むベクターを含む。

0032

本明細書で使用するとき、用語、「発現カセット」又は「発現ベクター」は、標的細胞
において所望の核酸(例えば、外来核酸又は導入遺伝子)を発現させるために組み換え
より又は合成により調製された核酸コンストラクト又はベクターを指す。この所望の核酸
は、典型的には、所望のタンパク質を発現する。発現ベクター又は発現カセットは、典型
的には、外来核酸の発現を駆動する又は促進するプロモーターヌクレオチド配列を含む。
この発現ベクター又はカセットはまた、典型的には、標的細胞において特定の核酸の転写
を可能にする任意の他の特定の核酸要素を含む。組み換え発現カセットは、プラスミド、
染色体ミトコンドリアDNA色素体DNA、ウイルス、又は核酸断片の中に組み込む
ことができる。一部の発現ベクターは、宿主細胞において非相同DNA断片を組み込み
発現させる能力を有する。多くの原核細胞及び真核細胞発現ベクターは、市販されている
。適切な発現ベクターの選択は、当業者であれば既知である。発現ベクターの中に組み込
まれた核酸配列からタンパク質を発現させるための適切な発現ベクターの選択は、当業者
であれば既知である。

0033

DNAコンストラクトは、標的細胞又は組織の中に導入され得る核酸の人工的に構築
れた断片である。DNAコンストラクトは、典型的には、ベクターの中にサブクローニン
グされた所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNA挿入断片を含む。
このベクターは、細菌を増殖させるための細菌耐性遺伝子、並びに、生物で所望のタンパ
ク質を発現させるためのプロモーターを含有してもよい。このDNAは、PCR又は当業
者に既知の任意の他の技術によりインビトロで生産され得る。このDNAコンストラクト
は、所望の核酸配列を含み得る。一態様では、この配列は、選択的に、対照配列(例えば
、プロモーターなど)などの追加の配列に作用可能に連結される。このDNAコンスト
クトは、好適な選択マーカーを更に含んでもよく、ホモロジーボックスに隣接した組み込
み配列(incoming sequence)を更に含んでもよい。このコンストラクトは、末端部に加
えられた他の非相同配列を含んでもよい(例えば、スタッファー配列又は隣接配列)。配
列の末端部は、DNAコンストラクトが閉環構造を形成するように閉じられてもよい。当
該技術分野において周知の技術を用いてDNAコンストラクトの中に組み込まれる、この
所望の核酸配列は、野生型、変異又は修飾された核酸であり得る。このDNAコンストラ
クトは、宿主細胞染色体と相同な核酸配列を1つ以上含んでもよい。このDNAコンスト
ラクトは、1つ以上の非相同ヌクレオチド配列を含んでもよい。このDNAコンストラク
トは、一度インビトロで組み立てられると、例えば、1)宿主細胞の所望の標的配列の中
非相同的な配列を挿入するために、及び/又は2)宿主細胞染色体の一領域に変異を誘
導する(すなわち、内在性配列を非相同性配列で置換する)ために、3)標的遺伝子を欠
失させるために、4)複製プラスミドを宿主の中に導入するために、使用され得る。「D
NAコンストラクト」は、本明細書では「発現カセット」と互換的に使用される。

0034

本明細書で使用するとき、「プラスミド」は、染色体DNAとは独立して複製可能であ
染色体外DNA分子を指す。プラスミドは、二本鎖(ds)であり、環状であっても
よく、典型的にはクローニングベクターとして使用される。

0035

本明細書において、細胞の中に核酸配列を導入する文脈で使用するとき、用語、「導入
された」は、細胞の中に核酸配列を運搬するのに好適な任意の方法を指す。このような導
入のための方法としては、原形質融合、トランスフェクション、形質転換、エレクトロ
レーション、接合及び形質導入が挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Fer
rari et al.,「Genetics,」in Hardwood et al
.(eds.),Bacillus,Plenum Publishing Corp.
,pp.57〜72[1989]を参照されたい)。

0036

形質転換は、細胞の遺伝的な変更を指し、遺伝子材料(例えば、DNA)の取り込み、
遺伝子組み込み及び発現により生じる。

0037

本明細書で使用するとき、核酸は、別の核酸配列と機能的に関連を持つよう配置された
場合に、別の核酸配列と「作用可能に連結」される。例えば、プロモーター又はエンハン
サーは、このプロモーターがヌクレオチドコーディング配列の転写に影響する場合、ヌク
レオチドコーディング配列に作用可能に連結される。リボソーム結合部位は、コーディン
グ配列の翻訳を促進するように配置された場合に、コーディング配列に作用可能に連結さ
れ得る。典型的には、「作用可能に連結されている」DNA配列は、隣接している。しか
しながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位で連結
することにより達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチド
アダプター又はリンカーを従来の実践方法に従って使用してもよい。

0038

本明細書で使用するとき、細胞を参照して使用する場合の「組み換え」は、典型的には
、その細胞が非相同な核酸配列の導入により改変されていること、あるいは、その細胞が
そのように改変された細胞から誘導されていることを指す。例えば、組み換え細胞は、ネ
ティブ(非組み換え)な形態の細胞内では同一形態で見られない遺伝子を含み得、ある
いは、組み換え細胞は、ネイティブな形態の細胞で見られるものの改変されて細胞の中に
再導入されたネイティブな遺伝子を含み得る。組み換え細胞は、細胞から核酸を除去する
ことなく改変された、細胞にとって内在性の核酸を含んでもよく、このような改変として
は、遺伝子置換部位特異的変異、及び当業者に既知の関連技術により得られるものが挙
げられる。組み換えDNA(rDNA)は、遺伝子スプライシングのプロセスにより、通
常同時に生じ得ない2つ以上のヌクレオチド配列を組み合わせることにより作られる、人
工DNAの一形態である。組み換えDNA技術としては、インビトロでの組み換えDNA
の製造及び細胞の中への組み換えDNAの運搬についての技術が挙げられ、組み換えDN
Aは細胞中で発現又は増殖させることができ、これにより組み換えポリペプチドが製造さ
れる。

0039

本明細書で使用するとき、用語、核酸又は遺伝子の「増幅」は、特異的なDNA配列が
偏って複製されるプロセスを指し、その結果、増幅された核酸又は遺伝子は、遺伝子中に
元々存在していたものよりも多い複製数で存在するようになる。薬剤(例えば、抑制され
得る酵素に関する阻害物質)の存在下で増殖させることによる細胞の選別は、薬剤の存在
下での増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする内在性遺伝子の増幅、あるいは、この
核酸又は遺伝子産物又はその両方をコードする外来性(すなわち、投与された)配列の増
幅のいずれかにより得られ得る。

0040

本明細書で使用するとき、用語、「プライマー」は、制限酵素による消化物精製物
a purified restriction digest)として自然に生じるか又は合成により調製されるかの
いずれかのオリゴヌクレオチドを指し、これは、核酸鎖に対して相補的であるプライマー
伸長産物の合成が誘導される条件下(すなわち、ヌクレオチド及び、DNAポリメラーゼ
などの誘導剤の存在下、並びに好適な温度及びpH下)に置かれると合成の開始点として
機能し得る。プライマーは増幅における最大効率のために一本鎖であることが好ましいが
、代わりに二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するた
めに使用される前に、その鎖を単離するように最初に処理される。このプライマーは、オ
リゴデオキシリボヌクレオチドを含み得る。このプライマーは、導入剤の存在下において
、伸長産物の合成を開始するのに十分に長くなくてはならない。プライマーの正確な長さ
は、温度、プライマーの供給源、及びどの方法をどのように使用するかなどの様々な要因
に依存する。

0041

本明細書で使用するとき、用語、「プローブ」は、制限酵素による消化物の精製物とし
て自然に生じるか又は合成により、組み換えにより若しくはPCR増幅により製造される
かのいずれかのオリゴヌクレオチドを指し、これは、典型的には、別の所望のオリゴヌク
レオチドに対してハイブリッド形成することができる。プローブは、一本鎖又は二本鎖で
あり得る。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定及び単離に有用である。本発明で
使用される任意のプローブは、任意の「リポーター分子」で標識されることが想到され、
その結果、酵素(例えば、ELISA並びに酵素に基づく組織化学的アッセイ)、蛍光
放射活性及び発光システムが挙げられるがこれらに限定されない任意の検出システムで検
出可能である。本発明が任意の特定の検出システム又は標識に限定されることは、意図さ
れていない。

0042

本明細書で使用するとき、用語、「ポリメラーゼ連鎖反応」(PCR)は、米国特許第
4,683,195号、同第4,683,202号及び同第4,965,188号(参照
により本明細書に組み込まれる)の方法を指し、これらは、クローニング又は精製を行わ
ずに遺伝子DNAの混合物中で標的配列の断片濃度を増加させる方法を含む。標的配列を
増幅するためのこのプロセスは、当該技術分野において周知である。

0043

本明細書で使用するとき、用語、「増幅試薬」は、プライマー、核酸テンプレート及び
増幅酵素を除いて、増幅に必要とされる試薬(例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン
酸、緩衝剤など)を指す。典型的には、増幅試薬は、他の反応成分と共に、反応槽試験
管、マイクロウェルなど)内に配置及び収容する。

0044

本明細書で使用するとき、用語、「制限エンドヌクレアーゼ」又は「制限酵素」は、制
限部位として既知のヌクレオチドの特異的部位にて又はその近傍にて二本鎖又は一本鎖D
NAを切断できる酵素(例えば、細菌由来の酵素)を指す。この制限部位を含むヌクレオ
チド配列は、所与の制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素により認識及び切断され、多く
の場合、DNA断片を挿入される部位になる。制限部位は、発現ベクター又はDNAコン
ストラクトの中に設計することができる。

0045

当該技術分野において、DNA配列をRNAポリメラーゼにより転写することでRNA
配列を製造することができる一方、RNA配列逆転写酵素により逆転写することでDN
A配列を製造することができる。

0046

「宿主株」又は「宿主細胞」は、所望のDNA配列を含む発現ベクターのために好適な
宿主を指す。所望のDNA配列は、宿主株又は宿主細胞において所望のタンパク質を発現
し得る。

0047

「タンパク質」又は「ポリペプチド」又は「ペプチド」は、アミノ酸残基の高分子配列
である。1つのアミノ酸のカルボキシル基は、別のアミノ酸のアミノ基に連結される。用
語、「タンパク質」及び「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、本明細書では互換的に使
用され得る。ペプチドは、2つ以上のアミノ酸を含む。ペプチドは、典型的には、ポリペ
プチド又はタンパク質が含有するアミノ酸よりも少ないアミノ酸を含有する。IUPAC
−IUB Joint Commission on Biochemical Nom
enclature(JCBN)に従って定義されるアミノ酸についての一文字コード及
び三文字コードは、本開示全体にわたって使用される。一文字のXは、20種のアミノ酸
のうちのいずれかを指す。ポリペプチドは、遺伝子コード縮重に起因して、1を超える
ヌクレオチド配列によりコードされ得る。

0048

酵素変異体を説明する際、参照を容易にするために典型的には以下の命名法を使用する
:元のアミノ酸(1つ又は複数):位置(1つ又は複数):置換されたアミノ酸(1つ又
は複数)。公認のIUPAC一文字又は三文字アミノ酸略記を採用する。一文字「X」は
、任意のアミノ酸残基を指す。しかしながら、アミノ酸置換の文脈の場合(例えば、「X
003C」)、「X」は、置換から生じるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を指す(例え
ば、Xは、C以外のアミノ酸残基である)。変異は、典型的には、親アミノ酸についての
一文字コード、続いて、アミノ酸配列における3又は2又は1桁のアミノ酸位置番号、次
に、置換アミノ酸についての一文字コードにより名付けられる。例えば、グリシン(G)
をアミノ酸セリン(S)に置換することによりアミノ酸位置87においてアミノ酸グリ
ン(G)を変異させることは、「G087S」又は「G87S」と表される。典型的には
トレオニンによる位置2におけるグリシンの置換はG002Tと表されるが、このよう
な置換はG02T又はG2Tとも表され得る。1又は2個のゼロ(「0」)は、単に各ア
ミノ酸位置に対して便宜上三つの数での表記を提供するために含まれ得る。アミノ酸位置
「001」は「1」と同じであり、したがって、「A001C」は「A1C」と同じであ
る。「X001G」はアミノ酸配列中のアミノ酸位置1におけるグリシン(G)による置
換を表し、ここで、グリシンにより置換されることになるアミノ酸は任意のアミノ酸であ
る。複数の変異は、変異間に「−」を挿入することにより、あるいは、変異間にプラス(
+)記号を用いることにより、示される。例えば、アミノ酸配列中のアミノ酸残基位置8
7及び90におけるアミノ酸置換は、「G087S−A090Y」若しくは「G87S−
A90Y」又は「G87S+A90Y」若しくは「G087S+A090Y」のいずれか
で表される。欠失については、一文字コード「Z」を使用する。親配列に対する挿入につ
いては、一文字コード「Z」は位置番号の左側にある。欠失については、一文字コード「
Z」は位置番号の右側にある。挿入については、位置番号は、挿入されるアミノ酸の前の
位置番号であり、各アミノ酸に対して0.01を加える。例えば、位置87と88の間に
三つのアミノ酸、アラニン(A)、セリン(S)及びチロシン(Y)を挿入することは、
「Z087.01A−Z087.02S−Z087.03Y」と表される。したがって、
上記全ての変異に位置100における欠失を加えると、「G087S−Z087.01A
−Z087.02S−Z087.03Y−A090Y−A100Z」となる。

0049

「プロ配列」又は「プロペプチド配列」は、プロテアーゼの分泌に必要とされる、シグ
ナルペプチド配列と成熟型プロテアーゼ配列の間のアミノ酸配列を指す。プロ配列又はプ
ロペプチド配列が切断されると、成熟型の活性プロテアーゼが生じる。

0050

用語、「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、成熟型若しくは前駆体形態のタ
ンパク質の分泌又は直接輸送関与し得るアミノ酸残基の配列を指す。

0051

シグナル配列は、典型的には、前駆体又は成熟タンパク質の配列に対してN末端に位置
する。このシグナル配列は、リーダー配列とも示され得る。このシグナル配列は、内在性
又は外来性であり得る。一つの代表的な外来性シグナル配列は、枯草菌(Bacillus subti
lis)スブチリシンのシグナル配列の最初の七個のアミノ酸残基を、バチルス・レンタス
(Bacillus lentus)のシグナル配列(ATCC21536)の最初の七個以外の部分
に融合したものを含む。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質には存在しない。シグナ
ル配列は、典型的には、タンパク質の輸送後にシグナルペプチダーゼによりタンパク質か
ら切断される。

0052

用語、「ハイブリッドシグナル配列」は、配列の一部が、発現されることになる遺伝子
のシグナル配列に融合した発現宿主から得られる、配列を指す。合成配列を利用すること
ができる。

0053

用語、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの「成熟型」形態は、シグナルペプチド
配列及びプロぺプチド配列を持たないタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの機能的形
態を指す。

0054

用語、タンパク質又はペプチドの「前駆体」形態は、タンパク質のアミノ又はカルボ
末端に作用可能に連結したプロ配列を有する成熟型タンパク質を指す。この前駆体はま
た、プロ配列のアミノ末端に作用可能に連結した「シグナル」配列を有し得る。この前駆
体はまた、翻訳後の活性に関与する追加のポリヌクレオチドを有し得る(例えば、成熟型
タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを残してそこから切断されるポリヌクレオチド)

0055

アミノ酸配列又は核酸配列に関する用語、「野生型」は、そのアミノ酸配列又は核酸配
列がネイティブの又は自然発生の配列であることを示す。本明細書で使用するとき、用語
、「自然発生」は、自然に見られる(例えば、組み換え法又は化学的方法により操作され
ていない)任意のもの(例えば、タンパク質、アミノ酸又は核酸配列)を指す。本明細書
で使用するとき、用語、「非自然発生」は、自然には見られない任意のものを指す(例え
ば、実験室で作製された、組み換え又は化学合成された核酸)。

0056

特定のアミノ酸配列中のアミノ酸残基は、参照アミノ酸配列の位置におけるアミノ酸残
基と対応させることにより番号付けされ得る。参照アミノ酸配列のアミノ酸残基の位置「
と対応する」又は「と対応している」又は「と対応した」位置にある所望のアミノ酸配列
のアミノ酸残基は、所望の配列のアミノ酸残基が、参照アミノ酸配列中のアミノ酸残基の
位置と等しい又は相同である位置に配置されていることを示す。当業者は、ポリペプチド
中の特定の残基位置が相同な参照配列の位置に対応するかどうかを判定することができる
。例えば、プロテアーゼ変異体は、既知の技術を用いて参照配列のもの(例えば、配列番
号2のBPN’配列)とアラインメントされ得る。参照配列中のアミノ酸残基の位置は、
所望の配列中のアミノ酸残基の番号付けに使用される。したがって、プロテアーゼ変異体
のアミノ酸残基は、参照配列の対応するアミノ酸残基位置の番号付けに従って番号付けさ
れ得る。例えば、配列番号2の参照配列中のアミノ酸残基は、所望のプロテアーゼ変異体
の各アミノ酸残基のアミノ酸残基位置番号付けを決定するために使用され得る。

0057

本明細書で使用するとき、「相同性」は、配列類似性又は同一性を指し、同一性が好ま
しい。相同性は、当該技術分野において既知の標準技術を用いて判定され得る(例えば、
Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482[1
981]、Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:
443[1970];Pearson and Lipman,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 85:2444[1988]、Wisconsin Gene
tics Software PackageにおけるGAP、BESTFIT、FA
TA及びTFASTAなどのソフトウェアプログラム(Genetics Comput
er Group(Madison,WI))、並びにDevereux et al.
,Nucl.Acid Res.12:387〜395[1984]を参照されたい)。
有用なアルゴリズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、ペアワイズアライ
ンメントのプログレッシブ法を用いて、一群の関連する配列から複数の配列のアライン
ントを行う。PILEUPは、アラインメントを行うのに使用されるクラスタリング関係
を示す系統樹プロットすることもできる。PILEUPは、Feng及びDoolit
tleのプログレッシブアラインメントを単純化させて用いる(Feng and Do
olittle,J.Mol.Evol.35:351〜360[1987]を参照され
たい)。この方法は、Higgins及びSharpにより説明されるものと同様である
(Higgins and Sharp,CABIOS 5:151〜153[1989
]を参照されたい)。有用なPILEUPパラメーターとしては、3.00のデフォルト
ギャップ重みづけ(default gap weight)、0.10のデフォルトギャップ伸長重みづけ
(default gap length weight)及び重みつき末端ギャップ(weighted end gaps)が挙げ
られる。有用なアルゴリズムの別の例は、Altschul et al.により説明さ
れているBLASTアルゴリズムである(Altschul et al.,J.Mol
.Biol.215:403〜410[1990];及びKarlin and Alt
schul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873〜578
7[1993]を参照されたい)。特に有用なBLASTプログラムWU−BLAST
−2プログラムである(Altschul et al.,Meth.EnZymol.
266:460〜480[1996]を参照されたい)。WU−BLAST−2は、複数
検索パラメーターを使用し、これらのうちのほとんどはデフォルト値に設定される。調
製可能なパラメーターは以下の値に設定される:overlap span=1、ove
rlap fraction=0.125、word threshold(T)=11
。HSP S及びHSP S2パラメーターは動的な値であり、特定の配列の構成及び、
所望の配列を検索する特定のデータベースの構成に依存してプログラム自体により確立
れる。しかしながら、これらの値は、感度を上昇させるように調整することができる。

0058

対象ポリペプチド配列と参照ポリペプチド配列の間の配列同一性パーセント(配列同一
性%又は単に同一性%)は、対象アミノ酸配列が、例えば、アミノ酸配列比較アルゴリズ
ム又は目視点検により、これらの配列が最適にアラインメントされたときの比較長さにわ
たる参照ポリペプチド配列に対する特定の百分率の分だけ、アミノ酸残基同士の比較に基
づいて同一であることを意味する。対象核酸配列と参照核酸配列の間の配列同一性パーセ
ントは同様に、対象ヌクレオチド配列が、これらの配列が最適にアラインメントされたと
きの比較長さにわたる参照ヌクレオチドに対する特定の百分率の分だけ、核酸残基同士の
比較に基づいて同一であることを意味する。

0059

参照配列と所望の対象配列の間の配列同一性パーセント(同一性パーセント又は配列同
一性%又は同一性%)は、当業者により容易に判定され得る。2つのポリペプチド配列が
共有する同一性パーセントは、例えば、類似性が最大限になるようそれぞれの配列の残基
のアラインメントを行い、当該技術分野において既知の配列比較アルゴリズムを用いるこ
とにより又は目視点検により配列間の同一のアミノ酸残基の数を判定することにより、各
配列中のアミノ酸残基を直接比較することによって、判定することができる。2つの最適
にアラインメントされたポリペプチド配列は比較長さにわたって比較することができ、両
方のポリペプチド鎖中に同一のアミノ酸残基が生じる最適アラインメントの位置の数を判
定することができ、これにより、一致した位置の数を提供することができ、次に、一致し
た位置の数は比較長さにわたって含まれる位置の合計数除算される。得られた数に10
0を乗じて、参照(又はクエリー)ポリペプチド配列に対する対象ポリペプチド配列の同
一性パーセントを得る。2つの核酸配列が共有する同一性パーセントは、最大限の類似性
に対してそれぞれの配列の残基のアラインメントを行い、配列比較アルゴリズムを用いる
ことにより又は目視点検により核酸配列間の同一の核酸残基の数を判定することにより、
核酸配列中のヌクレオチド残基を直接比較することによって、判定することができる。2
つ以上の配列間の同一性パーセントはまた、これらの配列が特定の同一性パーセントであ
るというように記載されてもよい。

0060

配列同一性を判定するのに好適であるアルゴリズムの例は、BLASTアルゴリズムで
ある(Altschul,et al.,J.Mol.Biol.,215:403〜4
10[1990]を参照されたい)。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、米国
国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)を通じ
て公に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワ
ードとアラインメントを行ったときに一致するか又はある程度ポジティブであると評価さ
れた(positive-valued)閾値スコアTを満たすかのいずれかである問い合わせ配列中の
長さWの短いワードを同定することにより、高スコア配列ペア(HSP)を同定する。
これらの最初にヒットした隣接ワードは、これらを含有するより長いHSPを見つけるた
めの開始点として働く。ワードのヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り
比較されている2つの配列の各々に沿って両方向に拡張される。ワードのヒットの拡張は
、次の場合に止まる:累積アラインメントスコアが最大達成値から量Xだけ減少する、累
積スコアがゼロ以下になる、又は、いずれかの配列の末端に到達する。BLASTアルゴ
リズムパラメーターW、T及びXは、感度及びアラインメントの速度を決定する。BLA
STプログラムは、デフォルトとして、11のワード長さ(W)、50のBLOSUM6
スコアリングマトリックス(Henikoff and Henikoff,Proc
.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915[1992]を参照されたい
)アラインメント(B)、10の期待値(expectation)(E)、M’5、N’−4及び
両方の鎖の比較を用いる。

0061

次に、BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計分析を行う(例えば、
上記Karlin and Altschulを参照されたい)。BLASTアルゴリズ
ムにより提供される類似性の一つの尺度は、最小和確率(smallest sum probability)(
P(N))であり、これは、2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然により
生じ得る確率の指標を提供する。例えば、プロテアーゼをコードする核酸に対する試験核
酸の比較において最小和確率が約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ま
しくは約0.001未満である場合、核酸は、本発明のプロテアーゼをコードする核酸と
同様であると考えられる。試験核酸プロテアーゼポリペプチドをコードする状況では、
比較が約0.5未満、より好ましくは約0.2未満の最小和確率をもたらす場合、試験核
酸は特定のプロテアーゼをコードする核酸と同様であると考えられる。

0062

「最適アラインメント」又は「最適アラインメントを行った」は、最高の同一性パーセ
ントスコアを与える2つ(以上)の配列のアラインメントを指す。例えば、2つのポリペ
プチド配列の最適アラインメントは、各配列中の同一のアミノ酸残基の最大数が共にアラ
インメントされているように手動で配列のアラインメントを行うことにより、あるいは、
本明細書に記載の又は当該技術分野において既知の、ソフトウェアプログラム又は手順を
用いることにより、達成することができる。2つの核酸配列の最適アラインメントは、各
配列中の同一のヌクレオチド残基の最大数が共にアラインメントされているように手動で
配列のアラインメントを行うことにより、あるいは、本明細書に記載の又は当該技術分野
において既知の、ソフトウェアプログラム又は手順を用いることにより、達成することが
できる。

0063

2つの配列(例えば、ポリペプチド配列)が、規定のアミノ酸置換マトリックスギャ
ップ存在ペナルティ(ギャップオープンペナルティとも呼ばれる)及びギャップ伸張ペナ
ルティなどの規定パラメーターを用い、このペアの配列について最高の同一性スコアが得
られるようアラインメントされた場合、「最適アラインメントが行われた」とみなされ得
る。BLOSUM62スコアリングマトリックス(上記Henikoff and He
nikoffを参照されたい)は、多くの場合、ポリペプチド配列アラインメントアルゴ
リズム(例えば、BLASTP)においてデフォルトのスコアリング置換マトリックス
して使用される。ギャップ存在ペナルティはアラインメントされた配列の1つにアミノ酸
ギャップが1つ導入された際に課せられ、ギャップ伸張ペナルティはギャップ中の各残基
位置に対して課される。用いられる代表的なアラインメントは以下のものである:BLO
SUM62スコアリングマトリックス、ギャップ存在ペナルティ=11、及びギャップ伸
張ペナルティ=1。アラインメントスコアは、アラインメントが開始及び終了する各配列
のアミノ酸位置により(例えば、アラインメントウィンドウ)、並びに、場合によっては
可能な限り最高の類似性スコアを達成するように一方若しくは両方の配列の中に1つ若し
くは複数のギャップを挿入することにより、決定される。

0064

2つ以上の配列間の最適アラインメントは、目視点検により手動で、あるいは、コンピ
ュータ(例えば、アミノ酸配列に対するBLASTPプログラム及び核酸に対するBLA
STNプログラム(例えば、Altschul et al.,Nucleic Aci
dsRes.25(17):3389〜3402(1997)を参照されたい。米国国
立生物工学情報センター(NCBI)のウェブサイトも参照されたい。)又はCLUST
LWプログラムが挙げられるがこれらに限定されない)を使用することにより、判定す
ることができる。

0065

所望のポリペプチドが参照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約60%、
70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97%、98%、99%又は99.5%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
む場合、所望のポリペプチドは参照ポリペプチドに対して「実質的に同一」であると言わ
れてもよい。2つのこのようなポリペプチドの間の同一性パーセントは、最適アラインメ
ントを行われた2つのポリペプチド配列の検査により手動で、又は、標準的なパラメータ
ーを用いるソフトウェアプログラム若しくはアルゴリズム(例えば、BLAST、ALI
GN、CLUSTAL)を使用することにより、判定することができる。2つのポリペプ
チドが実質的に同一であることの一指標は、第一ポリペプチドが第二ポリペプチドと免疫
交差反応性であることである。典型的には、保存的なアミノ酸置換により異なるポリペプ
チドは、免疫交叉反応性である。したがって、ポリペプチドは、例えば、2つのペプチド
が1つの保存的アミノ酸置換又は1つ以上の保存的アミノ酸置換のみで異なる場合、第二
ポリペプチドに対して実質的に同一である。

0066

所望の核酸が参照核酸のヌクレオチド配列と少なくとも約60%、70%、75%、8
0%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、9
8%、99%又は99.5%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む場合、所望の
核酸は、参照核酸に対して「実質的に同一」であると言われてもよい。2つのこのような
核酸の間の同一性パーセントは、2つの最適アラインメントを行った核酸配列の検査によ
り手動で、又は、標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム若しくはアルゴ
リズム(例えば、BLAST、ALIGN、CLUSTAL)を使用することにより、判
定することができる。2つの核酸配列が実質的に同一であることの一指標は、2つの核酸
分子が厳密な条件下で(例えば、中度〜高度に厳密な範囲内で)互いにハイブリッド形成
することである。

0067

本明細書で使用するとき、所望の特定成分に関する「単離された」は、成分が他の成分
を本質的に又は実質的に含まないことを意味する。例えば、「単離された」ポリペプチド
は、例えば、他のポリペプチド及び細胞成分が挙げられるがこれらに限定されない他の成
分を本質的に又は実質的に含まないことを意味する。「単離された」核酸は、核酸が、例
えば他の核酸又は細胞成分が挙げられるがこれらに限定されない他の成分を本質的に又は
実質的に含まないことを意味する。この用法の目的のために、「単離された」は、ライブ
ラリ(例えば、スクリーニングライブラリ)の一部ではない核酸又はポリペプチドを指す

0068

純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマ
グラフィーなどの分析化学技術を用いて判定される。調製液中に存在する主要なタンパ
ク質又は核酸が実質的に精製される。用語、「精製された」は、核酸又はタンパク質が、
電気泳動ゲルクロマトグラフ溶出液、及び/又は密度勾配遠心分離にかけた媒質におい
て、本質的に1つのバンドを生じることを示す。具体的には、「精製された」は、単離さ
れた場合に、単離体が、単離体の少なくとも85重量%、90重量%、91重量%、92
重量%、93重量%、94重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、
99重量%、99.5重量%又はそれ以上の核酸又はタンパク質を含有することを意味す
る。精製されたポリぺプチドは、例えば、実験室合成、クロマトグラフィー(例えば、高
液体クロマトグラフィー)調製電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動後に着色し
ながらの視覚化遠心分離沈殿親和性精製などが挙げられるがこれらに限定されない
多くの方法により入手され得る(一般的には、R Scopes,Protein Pu
rification,Springer−Verlag,N.Y.(1982),De
utscher,Methodsin EnZymol.,Vol.182:Guid
e to Protein Purification,Academic Press
,Inc.N.Y.(1990)を参照されたい)。本発明は、単離又は精製されたポリ
ペプチド(例えば、本発明の単離されたプロテアーゼ変異体又はスブチリシン変異体)及
び単離又は精製された核酸(例えば、本発明のプロテアーゼ変異体又はスブチリシン変異
体をコードする核酸)を含む。

0069

関連する意味において、本発明は、本発明の1つ以上のポリペプチド(例えば、本発明
の1つ以上のプロテアーゼ変異体)又は本発明の1つ以上の核酸(例えば、本発明の1つ
以上のプロテアーゼ変異体をコードする1つ以上の核酸)などの本発明の1つ以上の分子
について組成物を濃縮する方法を提供する。組成物は、精製又は濃縮技術の適用後に分子
の濃度が実質的に増加するとき、分子について濃縮される。実質的に純粋なポリペプチド
又は核酸は、典型的には、特定の組成物中で全ての分子種の少なくとも約60重量%、7
0重量%、80重量%、85重量%、90重量%、91重量%、92重量%、93重量%
、94重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、99重量%、99.
5重量%又はそれ以上を構成する。

0070

本明細書で使用するとき、用語、「コンビナトリアル変異誘発」は、参照核酸配列の核
酸変異体のライブラリが作製される方法を指す。これらのライブラリでは、変異体は、予
め確定された変異セットから選択される1つ又は複数の変異を含有する。この方法はまた
、予め確定された変異セットのメンバーではないランダム変異を導入するための手段も提
供する。一部のこのような方法としては、米国特許第6,582,914号に記載のもの
が挙げられ、本明細書に参照により組み込まれる。一部のこのようなコンビナトリアル変
異誘発方法は、市販のキット(例えば、QUIKCHANGE(登録商標)Multi
Site−Directed Mutagenesis Kit(Stratagene
))に実体化された方法を含む及び/又は包含する。

0071

本明細書で使用するとき、プロテアーゼ変異体に関連して使用される「改善された特性
」を有するとは、プロテアーゼ変異体が参照又は親プロテアーゼと比較して改善された特
性を有することを指す。本発明のプロテアーゼ変異体は、以下の特性のうちの1つ以上を
呈し得る:向上した又は改善されたタンパク質分解活性、向上した又は改善された安定性
、向上した又は改善された表面若しくは物品のクリーニング性能、向上した又は改善され
たクリーニング性能、向上した又は改善された布地若しくは洗濯物クリーニング性能又は
洗浄性能、向上した又は改善された手洗い性能、向上した又は改善された手若しくは手動
での食器洗浄性能、向上した又は改善された自動食器洗浄性能、参照プロテアーゼ又は所
望の親プロテアーゼと比較して向上した又は改善された洗濯性能

0072

本明細書で使用するとき、用語、「機能アッセイ」は、タンパク質の活性の指標を提供
するアッセイである。この用語は、典型的には、タンパク質がその通常の能力で機能し得
るかについて解析されるアッセイシステムを指す。例えば、酵素の場合、機能アッセイは
、反応を触媒することにおける酵素の有効性を判定することを含む。

0073

分子に関する文脈における用語、「特性」又はその文法的に等価な表現は、選択又は検
出され得る分子の任意の特徴若しくは特質を指し得る。例えば、ポリペプチドの文脈では
、特性は、酵素活性(例えば、タンパク質分解活性)、安定性又は他の特性であり得る。

0074

「変異」核酸配列は、典型的には、宿主細胞の野生型配列に生じる少なくとも1つのコ
ドンにおける変異を有し、その結果、変異核酸配列発現産物が、野生型タンパク質と比
較して改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質になる、核酸配列を指す。発現産物は
、改変された機能的能力(例えば、向上した酵素活性)を有し得る。

0075

本明細書で使用するとき、用語、「正味電荷」は、分子内に存在する全ての電荷の和と
して定義される。「正味電荷の変化」は、親タンパク質分子の正味電荷とは異なる正味
荷を有するタンパク質変異体を得るために親タンパク質分子に対して生じさせることがで
きる(すなわち、この変異体は、親分子の正味電荷と同じではない正味電荷を有する)。
例えば、タンパク質の中性アミノ酸を負に帯電しているアミノ酸で置換すること、又は、
タンパク質の正に帯電しているアミノ酸を中性アミノ酸で置換することにより、非改変タ
ンパク質に対して−1の正味電荷が生じる。タンパク質の正に帯電したアミノ酸を負に帯
電したアミノ酸に置換することにより、非改変タンパク質に対して−2の正味電荷が生じ
る。タンパク質の中性アミノ酸を正に帯電しているアミノ酸で置換すること、又は、タン
パク質の負に帯電しているアミノ酸を中性アミノ酸で置換することにより、親タンパク質
に対して+1の正味電荷が生じる。タンパク質の負に帯電したアミノ酸を正に帯電したア
ミノ酸に置換することにより、非改変タンパク質に対して+2の正味電荷が生じる。親タ
ンパク質の正味電荷はまた、1つ以上の帯電したアミノ酸の欠失及び/又は挿入により変
えることができる。

0076

ポリペプチドに関する用語、「熱的に安定」及び「熱安定」及び「熱安定性」は、その
ポリペプチドが例えば、高温への曝露を介するといった、熱のみにより引き起こされるそ
の活性における恒久的変化に対して耐性であることを示す。例えば、熱的に安定な酵素は
、その酵素が高温への曝露によるものなどの、熱のみにより引き起こされる、酵素活性の
恒久的な変化に対して耐性であることを意味する。典型的には、熱的に安定であるプロテ
アーゼは、例えば、少なくとも約60分、120分、180分、240分、300分など
といった所与の時間にわたって高温に曝露された後でも、そのタンパク質分解活性の少な
くとも約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、
96%、97%、98%又は99%を保持することができる。

0077

ポリペプチド又はプロテアーゼのクリーニング活性は、プロテアーゼにより達成される
クリーニング性能を指し得る。クリーニング活性は、対象、物品又は表面における様々な
酵素反応性シミ(例えば、食品、植物、血液、インク、血液/ミルク/インク、ミルク
/油/色素卵黄、ミルク、油、及び/又は卵タンパク質)のうちの1つ以上のクリーニ
ングについての様々なアッセイを使用することにより、判定され得る。ポリペプチド(例
えば、本発明のポリペプチド(プロテアーゼ変異体など)又は参照ポリペプチド(例えば
、参照プロテアーゼ))のクリーニング性能は、対象、物品又は表面にあるシミを標準的
洗浄条件にかけ、様々なクロマトグラフィー、分光光度法又は他の定量的方法を用いる
ことによりシミが除去された程度を評価することによって、判定され得る。代表的なクリ
ーニングアッセイ及び方法は当該技術分野において既知である、例えば、国際公開第99
/34011号及び米国特許第6,605,458号に記載のものが挙げられるがこれら
に限定されず、これらの特許はどちらも参照により本明細書に組み込まれ、並びに、これ
らのクリーニングアッセイ及び方法は、下記に提供されるパートIの実施例及びパートI
Iの実施例に含まれる。

0078

用語、プロテアーゼ変異体又は参照プロテアーゼの「クリーニング有効量」は、特定の
クリーニング組成物において所望されるレベルの酵素活性を達成するプロテアーゼの量を
指す。このような有効量は、使用される具体的なプロテアーゼ、クリーニング用途、クリ
ーニング組成物の特定の組成液体又は乾燥(例えば、顆粒タブレット、バー)組成物
のいずれが必要とされるか、などのような多くの要因に基づき、当業者により容易に確か
められる。

0079

用語、「クリーニング添加材料」は、クリーニング組成物中に含まれる本発明のプロテ
アーゼ変異体以外の任意の液体、固体ガス状材料を指す。本発明のクリーニング組成物
は、1つ以上のクリーニング添加材料を含み得る。各クリーニング添加材料は、典型的に
は、クリーニング組成物の具体的な型及び形態(例えば、液体、顆粒、粉末、バー、ペー
スト、スプレー、タブレット、ゲルフォーム又は他の組成)に基づいて選択される。好
ましくは、各クリーニング添加材料は、本組成物中で使用されるプロテアーゼ酵素と混合
可能である。

0080

クリーニング活性の文脈における用語、「向上した性能」は、標準的な洗浄サイクル
び/又は複数の洗浄サイクル後の通常の評価により判定されるような、、ミルク、植物
、インク、油及び/又は血液などの特定の酵素反応性シミにおける酵素による、上昇した
又はより大きなクリーニング活性を指す。

0081

クリーニング活性の文脈における用語、「減少した性能」は、標準的な洗浄サイクル後
の通常の評価により判定されるような、卵、ミルク、植物又は血液などの特定の酵素反応
性シミにおける酵素による、低下した又はより小さなクリーニング活性を指す。

0082

本明細書で使用するとき、用語、「施設用クリーニング組成物」は、学校、病院工場
商店、企業、ビルレストランオフィス複合施設及びビル、加工及び/又は製造工場
動物病院ファクトリー農場、ファクトリー牧場が挙げられるがこれらに限定されない
施設における使用に好適な製品を指す。

0083

本明細書で使用するとき、「布地ケア製品及びホームケア製品」は、それが販売されて
いる形態で使用又は消費されることが通常意図され、布地、硬質表面並びに布地ケア及び
ホームケアの領域内の任意の他の表面を処理するためのものである製品又はデバイスを指
し、例えば、エアフレッシュナー及び香料送達系などの空気ケア自動車ケア、食器洗浄
、布地コンディショニング(柔軟化及び/又はフレッシュニング)、洗濯洗浄性、洗濯及
びすすぎ添加剤及び/又はケア、床及び便器クリーナーなどの硬質表面クリーニング及び
/又は処理、並びに消費者及び施設用途のための他のクリーニング製品が挙げられる。

0084

本明細書で使用するとき、用語、「クリーニング組成物」及び「クリーニング配合物
は、例えば、布地、洗濯、食器食卓食器、コンタクトレンズ、他の固体基材毛髪(ヒ
ト又は動物の毛髪を含む)(シャンプー)、皮膚(石鹸化粧品及びクリーム)、歯(マ
ウスウォッシュ練り歯磨き)、非布地及びホームケア対象物フィルター、膜(例えば
限外濾過膜が挙げられるがこれに限定されない濾過膜)、硬質表面、並びに、例えば、
(机の上又は脚)、壁、別の家具物品又は対象、床、天井などの硬質表面が挙げられる
がこれらに限定されない他の表面、が挙げられるがこれらに限定されない、クリーニング
すべき物品から、望まれない化合物を除去するのに使用が見出される組成物を指す。クリ
ーニング組成物又はクリーニング配合物は、例えば、シャンプー(ヒト又は動物の毛髪の
クリーニング用)、石鹸、クリーム又は化粧品(皮膚クリーニング及び/又はスキンケア
用)、マウスウォッシュ口腔ケア用)、練り歯磨き(歯クリーニング及び/又は口腔
ア用)が挙げられるがこれらに限定されないパーソナルケア用途及び/又はパーソナル
ア物品に有用であり得る。これらの用語は、この組成物又は配合物が、組成物又は配合物
において使用されるプロテアーゼ及び/又は他の酵素と混合可能である限り、所望される
特定のタイプのクリーニング組成物又は配合物及び製品の形態(例えば、液体、ゲル、顆
粒又はスプレー組成物)について選択される任意の材料/化合物を包含する。クリーニン
グ組成物又は配合物材料の具体的な選択は、クリーニングすべき表面、対象又は物品(例
えば、布地)及び使用中のクリーニング条件のために所望される組成物又は配合物の形態
を考慮することにより、容易に行われる。一態様では、クリーニング組成物又は配合物は
、布地ケア製品及びホームケア製品(例えば、洗濯物をクリーニングするためのクリーニ
ング組成物)であり得る。別の態様では、クリーニング組成物又は配合物は、布地ケア製
品及びホームケア製品ではない(例えば、コンタクトレンズ、毛髪、歯又は皮膚をクリー
ニングするための、あるいは、パーソナルケア用途及び/又はパーソナルケア物品に有用
な、クリーニング組成物)。

0085

クリーニング組成物及びクリーニング配合物は、任意の対象、物品及び/又は表面を、
クリーニング、漂白消毒及び/又は殺菌するのに好適である任意の組成物を含む。この
ような組成物及び配合物としては、例えば、クリーニング又は洗剤組成物(例えば、液体
、タブレット、ゲル、バー、顆粒及び/又は固体の、洗濯物クリーニング又は洗剤組成物
、並びに微細布地洗剤組成物)、硬質表面クリーニング組成物及び配合物(例えば、ガラ
ス、木、セラミック及び金属の、カウンタートップ及び窓、カーペットクリーナー、オー
ブンクリーナー、布地フレッシュナー、布地柔軟剤)、並びに、繊維、洗濯促進クリーニ
ング又は洗剤組成物、洗濯時添加クリーニング組成物、及び洗濯シミ抜きクリーニング組
成物、食器洗浄組成物、例えば、手又は手動での食器洗浄組成物(例えば、「手」又は「
手動」食器洗浄洗剤)及び自動食器洗浄組成物(例えば、「自動食器洗浄洗剤」)が挙げ
られるが、これらに限定されない。

0086

本明細書で使用するとき、特に示さない限り、クリーニング組成物又はクリーニング配
合物は、顆粒又は粉末形態汎用又は強力洗浄剤、特にクリーニング洗剤、液体、顆粒、
ゲル、固体、タブレット又はペースト形態の汎用洗浄剤、特にいわゆる強力液体(HDL
)洗剤又は強力粉末洗剤(HDD)タイプ、液体微細布地洗剤、手又は手動の食器洗浄剤
(高発泡タイプのものなど)、手又は手動の食器洗浄、自動食器洗浄又は食卓食器若しく
食卓用器具洗浄剤、例えば、家庭用途及び施設用途のための様々なタブレット、粉末、
固体、顆粒、液体、ゲル及びすすぎ補助タイプの剤、液体クリーニング及び消毒剤、例え
ば、抗菌手洗いタイプ、クリーニングバー、マウスウォッシュ、義歯クリーナー、自動車
用シャンプー、カーペットシャンプー、浴室クリーナー、パーソナルケア物品(例えば、
ヒト(及び他の動物)用毛髪シャンプー及び/又は毛髪リンスシャワージェル及び発泡
入浴剤スキンケア物品、化粧品、クリーム、浴用及びパーソナルのヒト向け石鹸)、金
属クリーナー、並びに、漂白添加剤及び「ステインスティック(stain-stick)」又は前
処理タイプなどのクリーニング補助剤を含む。一部の顆粒組成物は「コンパクト」形態で
あり、一部の液体組成物は「濃縮」形態である。

0087

一態様では、本発明は、本発明の少なくとも1つのプロテアーゼ変異体又はポリペプチ
ドを含む、クリーニング組成物又は洗剤組成物を提供し、ここで、このクリーニング組成
物又は洗剤組成物は、コンタクトレンズのクリーニングに有用である。別の態様では、本
発明は、本発明の少なくとも1つのプロテアーゼ変異体又はポリペプチドを含む、クリー
ニング組成物又は洗剤組成物を提供し、ここで、このクリーニング組成物又は洗剤組成物
は、パーソナルケア用途に有用である。別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも1
つのプロテアーゼ変異体又はポリペプチドを含む、クリーニング組成物又は洗剤組成物を
提供し、ここで、このクリーニング組成物又は洗剤組成物は、ヒトの毛髪及び/又は動物
の毛髪などの、毛髪のクリーニング又はすすぎに有用である(例えば、毛髪シャンプー及
び/又は毛髪リンス)。別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも1つのプロテアー
ゼ変異体又はポリペプチドを含む、クリーニング組成物又は洗剤組成物を提供し、ここで
、このクリーニング組成物又は洗剤組成物は、皮膚(例えば、ヒト及び/又は動物の皮膚
)のクリーニング又は処理に有用である(例えば、シャワージェル、発泡入浴剤スキン
ケアクリーナー、化粧品、クリーム及び/又は浴用石鹸)。別の態様では、本発明は、本
発明の少なくとも1つのプロテアーゼ変異体又はポリペプチドを含む、クリーニング組成
物又は洗剤組成物を提供し、ここで、このクリーニング組成物又は洗剤組成物は、歯及び
/若しくは義歯のクリーニングに、並びに/又は口腔ケアに、有用である。このようなク
リーニング組成物又は洗剤組成物は、少なくとも1つの添加剤成分又は担体、少なくとも
1つの追加酵素、少なくとも1つのビルダー、及び/又は少なくとも1つの界面活性剤を
含み得、並びに、これらの使用に適した形態で配合され得る。このようなクリーニング又
は洗剤組成物はリン酸塩を含有してもよく、あるいは、リン酸塩を含まなくてもよい。本
発明の組成物に関する更なる詳細は、本明細書において他箇所で提供される。

0088

本明細書で使用するとき、「布地クリーニング組成物」は、洗濯添加組成物、並びに、
シミの付いた布地(例えば、衣類リネン、及び他の織物材料)の浸漬及び/又は前処理
での使用に好適な組成物などの、手及び機械での洗濯洗剤組成物を含む。

0089

本明細書で使用するとき、「非布地クリーニング組成物」は、例えば、手による又は手
動又は自動食器洗浄洗剤組成物、口腔クリーニング組成物、義歯クリーニング組成物及び
パーソナルクレンジング組成物が挙げられるがこれらに限定されない非繊維(すなわち、
非布地)表面クリーニング組成物を含む。

0090

本明細書で使用するとき、用語、「洗剤組成物」又は「洗剤配合物」は、特定の布地及
び/又は非布地対象又は物品などの、汚れた若しくは汚い対象のクリーニングのために洗
媒質中で使用することを意図された組成物に関して、使用される。本発明のこのような
組成物は、任意の特定の洗剤組成物又は配合物に限定されない。実際、本発明の洗剤は、
本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも1つ含み得、加えて、1つ以上の界面活性剤、
トランスフェラーゼ加水分解酵素ペルヒドロラーゼオキシドレダクターゼビルダ
ー(例えば、ビルダー塩)、漂白剤漂白活性剤青味剤蛍光染料凝固阻害剤、マス
キング剤、酵素活性剤抗酸化剤及び/又は安定化剤を含み得る。場合によっては、ビル
ダー塩は、シリケート塩ホスフェート塩の混合物であり、好ましくはケイ酸塩(例えば
メタケイ酸ナトリウム)がリン酸塩(例えば、トリポリリン酸ナトリウム)よりも多い
。クリーニング組成物又は洗剤組成物が挙げられるがこれらに限定されない本発明の一部
の組成物は、リン酸塩(例えば、リン酸塩又はリン酸塩ビルダー)を全く含有しない。

0091

本明細書で使用するとき、「食器洗浄組成物」は、カトラリーなどの食卓食器をクリー
ニングするためのすべての形態の組成物を指し、顆粒及び液体形態が挙げられるがこれら
に限定されない。一部の態様では、食器洗浄組成物は、自動食器洗浄機において使用を見
出される「自動食器洗浄」組成物である。本発明が任意の特定のタイプの食卓食器組成物
に限定されることは意図されない。実際、本発明は、セラミックスプラスチック、金属
陶器ガラスアクリルなどが挙げられるがこれらに限定されない任意の材料の食卓食
器(例えば、皿、コップグラスボウルなどが挙げられるがこれらに限定されない食器
)及びカトラリー(例えば、スプーンナイフフォーク給仕器具などが挙げられる
がこれらに限定され得ない器具)のクリーニングにおいて使用を見出される。用語、「食
卓食器」は、本明細書では食器及びカトラリーの両方に関して使用される。

0092

本明細書で使用するとき、用語、「漂白」は、十分な長さの時間にわたって及び/又は
適切なpHで及び/又は増白をもたらす(すなわち、白くする)温度条件で、材料(例え
ば、布地、洗濯物、パルプなど)又は表面を処理すること、並びに/あるいは、材料をク
リーニングすることを指す。漂白に好適な化学物質の例としては、例えば、ClO2、H
2O2、過酸、NO2などが挙げられるが、これらに限定されない。

0093

本明細書で使用するとき、プロテアーゼ(例えば、本発明のプロテアーゼ変異体)の「
洗浄性能」は、組成物にプロテアーゼ変異体を添加しない洗剤と比較して洗剤に追加のク
リーニング性能をもたらす、洗浄に対するプロテアーゼ変異体の寄与を指す。洗浄性能は
、関連する洗浄条件下で比較される。一部の試験システムでは、洗剤組成、泡濃度、水硬
度、洗浄機構、時間、pH及び/又は温度などの他の関連する要因は、特定の市場区分
例えば、手による又は手動食器洗浄、自動食器洗浄、食卓食器クリーニング、食卓用器具
クリーニング、布地クリーニングなど)における家庭向け用途に典型的な条件を模倣する
ようなやり方で制御することができる。

0094

用語、「関連する洗浄条件」は、本明細書では、特に洗浄温度、時間、洗浄機構、泡濃
度、洗剤のタイプ及び水硬度といった、手による食器洗浄、自動食器洗浄又は洗濯洗剤
場区分において実際に家庭で使用される条件を示すために使用される。

0095

用語、「改善された洗浄性能」は、関連する洗浄条件下でシミ除去においてより良好な
仕上がりが得られることを示すために、あるいは、対応する野生型又は出発親プロテアー
ゼと比較して同じ仕上がりを得るために必要とされるプロテアーゼ変異体が重量に基づい
てより少量であることを示すために、使用される。

0096

本明細書で使用するとき、用語、「消毒」は、汚染物質を表面から除去すること、並び
に、物品の表面上の細菌を阻害又は殺すことを指す。本発明は、任意の特定の表面、物品
又は、除去されるべき汚染物質若しくは細菌に限定されることを意図しない。

0097

本明細書のクリーニング組成物の「コンパクト」形態は、密度により最も反映され、組
成の点では、無機充填剤塩の量により最もよく反映される。無機充填剤塩は、粉末形態の
洗剤組成物の従来成分である。従来の洗剤組成物では、充填剤塩は、典型的には組成物全
体の約17〜約35重量%の実質量で存在する。対照的に、コンパクト組成物では、充填
剤塩は、組成物全体の約15%を超えない量で存在する。充填剤塩は、組成物の約10重
量%又はより好ましくは約5重量%を超えない量で存在し得る。無機充填剤塩は、硫酸
及び塩化物アルカリ及びアルカリ土類金属塩から選択することができる。この充填剤塩
は、硫酸ナトリウムであってもよい。

0098

所与のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置は、典型的には、配列番号2に示されるバ
チルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)スブチリシンBPN’アミノ
酸配列の対応するアミノ酸残基の位置の番号付けを用いて、番号付けされる。したがって
、配列番号2のバチルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)スブチリシ
ンBPN’アミノ酸配列は、参照配列として機能する。本明細書に記載のプロテアーゼ変
異体のアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列は、本明細書に記載のようにアラインメン
トアルゴリズムを用いてBPN’配列(配列番号2)とアラインメントを行うことができ
、BPN’配列中のアミノ酸残基とアラインメントする(好ましくは最適にアライメント
する)所与のアミノ酸配列中のアミノ酸残基は、スブチリシンBPN’配列中の対応する
アミノ酸残基を参照することにより、便宜上番号付けすることができる。

0099

一般に、本明細書で使用される命名法、並びに、下記の細胞培養分子遺伝学、分子生
物学、核酸化学及びタンパク質化学における実験室手順の多くは周知であり、当業者によ
り一般的に採用されている。組み換え核酸の製造及び操作方法核酸合成方法、細胞培養
方法及び導入遺伝子組み込み(例えば、トランスフェクション、電気穿孔)方法は、当業
者に既知であり、数多くの標準テキストに記載されている。オリゴヌクレオチドの合成及
び精製工程は、典型的には、仕様に従って実行される。技術及び手順は、一般に、当該技
術分野で周知の従来方法に従って、並びに、この文書全体にわたって提供される様々な一
般的参照文献に従って、実行される。文献中の手順は、当業者に周知であると考えられ、
読み手の便宜のために提供される。

0100

本発明の1つ以上のプロテアーゼ変異体などのプロテアーゼ(プロテアーゼ変異体を含
む)、並びに、香料を含む封入体色調剤両親媒性クリーニングポリマー及びこれらの
混合物からなる群から選択される物質を含んでもよく、上記組成物の任意の態様の残部が
1つ以上の添加剤物質からなる布地ケア製品及びホームケア製品が開示される。上記布地
ケア製品及びホームケア製品の一態様では、上記布地ケア製品及びホームケア製品は、布
地ケア製品及びホームケア製品の総重量に基づいて、約0.005重量パーセント(0.
0005重量%)〜約0.1重量%、約0.001重量%〜約0.05重量%、又は更に
は約0.002重量%〜約0.03重量%の上記プロテアーゼを含んでもよい。上記布地
ケア製品及びホームケア製品の一態様では、上記布地ケア製品及びホームケア製品は、布
地ケア製品及びホームケア製品の総重量に基づいて、約0.00003重量%〜約0.1
重量%、約0.00008重量%〜約0.05重量%、又は更には約0.0001重量%
〜約0.04重量%の布地色調剤を含んでもよい。上記布地ケア製品及びホームケア製品
の一態様では、上記布地ケア製品及びホームケア製品は、布地ケア製品及びホームケア製
品の総重量に基づいて、約0.001重量%〜約5重量%、約0.01重量%〜約2重量
%、又は更には約0.03重量%〜約0.5重量%の香料カプセルを含んでもよい。上記
布地ケア製品及びホームケア製品の一態様では、上記布地ケア製品及びホームケア製品は
、布地ケア製品及びホームケア製品の総重量に基づいて、約0.1重量%〜約5重量%、
約0.25重量%〜約2.5重量%、又は更には約0.3重量%〜約1.5重量%の両親
媒性クリーニングポリマーを含んでもよい。

0101

本発明のポリぺプチド
本発明は、新規ポリペプチドを提供し、これは「本発明のポリペプチド」と集合的に呼
ばれ得る。本発明のポリぺプチドは、単離された、組み換え体である、実質的に純粋な又
は非自然発生型のプロテアーゼ変異体を含み、例えば、スブチリシンプロテアーゼ変異体
ポリペプチドが挙げられ、これは酵素活性(例えば、タンパク質分解活性)及び/又は本
明細書の他箇所でより詳細に説明されている追加の特性(例えば、クリーニング活性、安
定性など)を有する。本発明のポリペプチドは、単離された、組み換え体である、実質的
に純粋な又は自然発生した冷水プロテアーゼを含み、タンパク質分解活性、クリーニング
活性、安定性、本明細書の他箇所で説明されている他の特性を有する。冷水プロテアーゼ
などの本発明のこのようなポリペプチドは、既知のプロテアーゼと比較して向上した性能
(例えば、向上したタンパク質分解活性、向上したクリーニング性能又は活性、向上した
安定性など)を有し得る。本発明のポリぺプチドは、クリーニング用途に有用であり、ク
リーニングする必要のある(例えば、物品の表面の)物品又は表面をクリーニングする方
法において有用であるクリーニング組成物中に組み込まれ得る。タンパク質分解活性を有
する本発明のポリぺプチドは、例えば、布地ケアクリーニング組成物及びホームケアクリ
ーニング組成物などの布地ケア製品及びホームケア製品で有用である。タンパク質活性を
有する本発明の一部のポリペプチドは、パーソナルケア組成物で有用である。タンパク質
活性を有する本発明のポリぺプチドはまた、非布地ケア製品及び非ホームケア製品で有用
である(すなわち、布地ケア製品でもホームケア製品でもない製品が本明細書に記載され
る)。本発明のプロテアーゼ変異体は、スブチリシンプロテアーゼ変異体であり得る。本
発明は、バチルス種プロテアーゼ変異体及びバチルス種スブチリシンプロテアーゼ変異体
を含む。

0102

本発明のポリぺプチドは、本明細書全体にわたって開示され、これには下記に提供され
るパートI実施例及びパートII実施例が挙げられるがこれらに限定されない。本発明は
、タンパク質分解活性を有する単離された、組み換え体である、実質的に純粋な又は非自
然発生型のプロテアーゼ変異体(例えば、スブチリシン変異体)を含み、このポリペプチ
ドは、下記のパートI及びパートII実施例のいずれかに記載の特定のプロテアーゼ変異
体のアミノ酸配列に対して少なくとも約60%、70%、80%、85%、86%、87
%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97
%、98%、99%、99.5%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む
。一態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離された、組み換え体である、
実質的に純粋な又は非自然発生型のスブチリシンポリペプチドを含み、このポリペプチド
は、配列番号2のBPN’配列のプロテアーゼ変異体であり、上記ポリペプチドは、配列
番号2に対して少なくとも約60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%
、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98
%の配列同一性及びパートI実施例のいずれかに記載のアミノ酸置換の組を有するアミノ
酸配列を含む。一態様では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離された、組み換
え体である、実質的に純粋な又は非自然発生型のスブチリシンポリペプチドを含み、この
ポリペプチドは、配列番号755のGG36配列のプロテアーゼ変異体であり、上記ポリ
ペプチドは、配列番号755に対して少なくとも約60%、70%、80%、85%、8
6%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、9
6%、97%又は98%の配列同一性及びパートII実施例のいずれかに記載のアミノ酸
置換の組を有するアミノ酸配列を含む。

0103

第一態様では、本発明は、親プロテアーゼ酵素の単離された又は非自然発生型のポリペ
プチドプロテアーゼ変異体を提供し、この変異体はタンパク質分解活性を有し、位置24
、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される配列番号2の
アミノ酸位置に対応する1つ以上のアミノ酸位置において変異を含むアミノ酸配列を含み
、ここで、変異の少なくとも1つは独立して、(i)この位置を占めるアミノ酸残基の上
流又は下流における1つ以上のアミノ酸残基の挿入、(ii)この位置を占めるアミノ酸
残基の欠失、又は(iii)異なるアミノ酸残基による、この位置を占めるアミノ酸残基
の置換、であり、ここで、各アミノ酸位置は、配列番号2のアミノ酸配列と変異体のアミ
ノ酸配列とのアラインメントによって決定される配列番号2に記載のバチルス・アミロ
ファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)スブチリシンプロテアーゼBPN’のア
ミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる。本発明の第一
態様によるプロテアーゼ酵素の変異体は、プロテアーゼ変異体と呼ばれ得る。本発明の第
一態様による変異体は、非自然発生型プロテアーゼであり得る。本発明の第一態様による
変異体は、単離又は精製され得る。本発明の第一態様による変異体は、スブチリシン変異
体であり得る。本発明の第一態様による変異体は、タンパク質分解活性を有し得る。本発
明の第一態様による変異体は、配列番号2に記載のBPN’アミノ酸配列のタンパク質分
解活性と比較して向上したタンパク質分解活性を有し得る。

0104

本発明の第一態様による変異体は、スブチリシンプロテアーゼである親プロテアーゼの
変異体であり得、スブチリシンプロテアーゼは、バチルス種プロテアーゼであり得る。本
発明の第一態様による親バチルスプロテアーゼは、バチルス・アミロリケファシエンス(
B. amyloliquefaciens)スブチリシンプロテアーゼBPN’(配列番号2)、バチルス・
ステアロサーモフィラス(B. stearothermophilus)、枯草菌(B. subtilis)、バチルス
・リケニホルミス(B. licheniformis)、バチルス・レンタス(B. lentus)、バチルス
・ブレビス(B. brevis)、バチルス・ステアロサーモフィラス(B. stearothermophilus
)、バチルス・アルカロフィラス(B. alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエ
ンス(B. amyloliquefaciens)、バチルス・クラウジイ(B. clausii)、バチルス・ハロ
デュランス(B. halodurans)、バチルス・メガテリウム(B. megaterium)、バチルス・
コアグランス(B. coagulans)、バチルス・サーキュランス(B. circulans)、バチルス
・ロータス(B. lautus)、B.species TS−23、バチルス・チューリンゲ
ンシス(B. thuringiensis)、BPN’−v3(配列番号4)及びBPN’−v36(配
列番号6)からなる群から選択され得る。本発明の第一態様による親プロテアーゼは、配
列番号2、配列番号4又は配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、70%
、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%
、98%、99%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

0105

本発明の第一態様による変異体は、成熟型を有するプロテアーゼ変異体であり得る。本
発明の第一態様による変異体は、成熟型を有するプロテアーゼ変異体であり得る。

0106

本発明の第一態様による変異体は、位置24、53、78、97、101、128及び
217からなる群から選択される2つのアミノ酸位置における変異を含むアミノ酸配列を
含み得る。本発明の第一態様による変異体は、位置24、53、78、97、101、1
28及び217からなる群から選択される3つのアミノ酸位置における変異を含むアミノ
酸配列を含み得る。本発明の第一態様による変異体は、位置24、53、78、97、1
01、128及び217からなる群から選択される4つのアミノ酸位置における変異を含
むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第一態様による変異体は、位置24、53、78、
97、101、128及び217からなる群から選択される5つのアミノ酸位置における
変異を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第一態様による変異体は、位置24、53
、78、97、101、128及び217からなる群から選択される6つのアミノ酸位置
における変異を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第一態様による変異体は、位置2
4、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択される配列番号2
の位置に対応するアミノ酸位置のそれぞれにおける変異を含むアミノ酸配列を含み得る。
本発明の第一態様による変異は、位置24、53、78、97、101、128及び21
7からなる群から選択される位置における異なるアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換
を含むアミノ酸配列を含み得る。

0107

本発明の第一態様による変異は、位置24、53、78、97、101、128及び2
17からなる群から選択される2つ又は3つの位置のそれぞれにおける異なるアミノ酸残
基によるアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第一態様による変
異は、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群から選択され
る4つの位置のそれぞれにおける異なるアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含むア
ミノ酸配列を含み得る。本発明の第一態様による変異は、位置24、53、78、97、
101、128及び217からなる群から選択される5つの位置のそれぞれにおける異な
るアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第一
態様による変異は、位置24、53、78、97、101、128及び217からなる群
から選択される6つ又は7つの位置のそれぞれにおける異なるアミノ酸残基によるアミノ
酸残基の置換を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第一態様による変異体は、位置2
4、53、78、101、128及び217のそれぞれにおける異なるアミノ酸残基によ
るアミノ酸残基の置換を含むアミノ酸配列を含み得、ここで、各位置は配列番号2におけ
る位置と対応させることにより番号付けされる。

0108

本発明の第一態様による変異体は、X024G/R、X053G,X078N,X09
7A,X101N,X128A/S及びX217Q/Lからなる群から選択される少なく
とも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第一態様による変異体
は、X024G/R、X053G,X078N,X097A,X101N,X128A/
S及びX217Q/Lからなる群から選択される少なくとも2つのアミノ酸置換を含むア
ミノ酸配列を含み得る。本発明の第一態様による変異体は、X024G/R、X053G
,X078N,X097A,X101N,X128A/S及びX217Q/Lからなる群
から選択される少なくとも3つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の
第一態様による変異体は、X024G/R、X053G,X078N,X097A,X1
01N,X128A/S及びX217Q/Lからなる群から選択される少なくとも4つの
アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第一態様による変異体は、X02
4G/R、X053G,X078N,X097A,X101N,X128A/S及びX2
17Q/Lからなる群から選択される少なくとも5つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列
を含み得る。本発明の第一態様による変異体は、X024G/R、X053G,X078
N,X097A,X101N,X128A/S及びX217Q/Lからなる群から選択さ
れる少なくとも6つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第一態様に
よる変異体は、(a)X128A/S及び/又はX217L/Q、(b)G128A/S
及び/又はY217L/Q、並びに(c)G097A,G128A/S及び/又はY21
7L/Qからなる群から選択される置換の組を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第
一態様による変異体は、アミノ酸置換X024G/R+X053G+X078N+X10
1N+X128A/S+X217Q/Lを含むアミノ酸配列を含み得、ここで、この変異
体はタンパク質分解活性を有し、選択的にこの変異体は、配列番号2、配列番号4又は配
列番号6に記載のプロテアーゼと比較して向上したタンパク質分解活性又は向上したクリ
ーニング活性を有し、あるいは、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に記載のプロテ
アーゼのものを超えるタンパク質分解アッセイ(例えば、AAPFアッセイ)又はクリー
ニングアッセイ(例えば、BMI、植物又は卵の微小標本(microswatch)アッセイ)の
性能指数を有する。

0109

本発明の第一態様による変異体は、S024G,S053G,S078N,S101N
,G128A/S及びY217Qからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置
換を含み得る。本発明の第一態様による変異体は、アミノ酸置換S024G+S053G
+S078N+S101N+G128A+Y217Qを含むアミノ酸配列を含み得る。

0110

本発明の第一態様による変異体は、配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも60
%、65%、70%、80%又は85%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
本発明の第一態様による変異体は、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を
有するアミノ酸配列を含み得る。本発明の第一態様による変異体は、配列番号2に対して
少なくとも91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99
%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。本発明の第一態様による変異体は、配列番
号2に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

0111

本発明の第一態様による変異体は、配列番号2に記載のプロテアーゼのタンパク質分解
活性と比較して向上したタンパク質分解活性を有し得る。本発明の第一態様による変異体
は、配列番号4に記載のプロテアーゼのタンパク質分解活性と比較して向上したタンパク
質分解活性を有し得る。本発明の第一態様による変異体は、配列番号6に記載のプロテア
ーゼのタンパク質分解活性と比較して向上したタンパク質分解活性を有し得る。本発明の
第一態様による変異体は、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に記載のプロテアーゼ
のクリーニング活性と比較して向上したクリーニング活性を有し得る。本発明の第一態様
による変異体は、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に記載のプロテアーゼのものを
超える、タンパク質分解活性(例えば、AAPFアッセイ)又はクリーニングアッセイ(
例えば、BMI、植物又は卵の微小標本アッセイ)における性能指数を有し得る。

0112

第二態様では、本発明は、親プロテアーゼの単離された又は非自然発生のポリペプチド
プロテアーゼ変異体を提供し、この変異体は、X024G/R、X053G,X078N
,X101N,X128A/S及びX217L/Qからなる群から選択される3つのアミ
ノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、ここで、この変異体はタンパク質分解活性を有し、
この変異体の各アミノ酸位置は、配列番号2のアミノ酸配列と変異体のアミノ酸配列との
アラインメントによって決定される配列番号2のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対
応させることにより番号付けされる。本発明の第一態様による変異体は、配列番号2、配
列番号4又は配列番号6に記載のプロテアーゼと比較して向上したタンパク質分解活性又
は向上したクリーニング活性を有し得る。本発明の第一態様による変異体は、配列番号2
、配列番号4又は配列番号6に記載のプロテアーゼのものを超える、タンパク質分解活性
(例えば、AAPFアッセイ)又はクリーニングアッセイ(例えば、BMI、植物又は卵
の微小標本アッセイ)における性能指数を有し得る。

0113

本発明の第二態様による変異体は、X024G/R、X053G,X078N,X10
1N,X128A/S及びX217L/Qからなる群から選択される3つのアミノ酸置換
を含むアミノ酸配列を含み、ここで、この変異体はタンパク質分解活性を有し、この変異
体の各アミノ酸位置は、配列番号2のアミノ酸配列と変異体のアミノ酸配列とのアライン
メントによって決定される配列番号2のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対応させる
ことにより番号付けされる。本発明の第二態様による変異体は、X024G/R、X05
3G,X078N,X101N,X128A/S及びX217L/Qからなる群から選択
される少なくとも4つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第二態様
による変異体は、X024G/R、X053G,X078N,X101N,X128A/
S及びX217L/Qからなる群から選択される少なくとも5つのアミノ酸置換を含むア
ミノ酸配列を含み得る。本発明の第二態様による変異体は、X024G/R、X053G
,X078N,X101N,X128A/S及びX217L/Qからなる群から選択され
る少なくとも6つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第二態様によ
る変異体は、アミノ酸置換X097Aを更に含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第二
態様による変異体は、アミノ酸置換X024G/R+X053G+X078N+X101
N+X128A/S+X217L/Q又はX097A+X128A/S+X217L/Q
を含むアミノ酸配列を含み得る。

0114

本発明の第二態様による変異体は、アミノ酸置換S024G/R+S053G+S07
8N+S101N+G128A/S+Y217L/Q又はG097A+G128A/S+
Y217L/Qを含むアミノ酸配列を含み得る。本発明の第二態様による変異体は、アミ
ノ酸置換S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y217Q又
はS024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y217Qを含むア
ミノ酸配列を含み得る。

0115

本発明の第二態様による変異体のアミノ酸配列は、置換N109Gを更に含み得る。本
発明の第二態様による変異体のアミノ酸配列は、置換N076Dを更に含み得る。本発明
の第二態様による変異体のアミノ酸配列は、置換S033Tを更に含み得る。本発明の第
二態様による変異体のアミノ酸配列は、置換N243Vを更に含み得る。本発明の第二態
様による変異体のアミノ酸配列は、置換S248Aを更に含み得る。本発明の第二態様に
よる変異体のアミノ酸配列は、置換A088Tを更に含み得る。本発明の第二態様による
変異体のアミノ酸配列は、置換S063Gを更に含み得る。本発明の第二態様による変異
体のアミノ酸配列は、N109G,N076D,S033T,N243V,S248A,
A088T,及びS063Gからなる群から選択される2つ以上の置換を更に含み得る。

0116

本発明の第二態様による変異体のアミノ酸配列は、アミノ酸置換S024G+S053
G+S078N+S101N+G128S+Y217Q又はS024G+S053G+S
078N+S101N+G128A+Y217Qを含むアミノ酸配列を含み得、A088
T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G,S033T+N0
76D,S009T+N109G+K141R+N243V,S162G+K256R,
N109G+A116T,N109G+L257G,S162G+L257G,N061
G+N109G+N243V,N109G+N243V+S248A,S033T+N0
76D+N109G+N218S+N243V+S248N+K256R,N109G+
A116T+N243V+K256R,A088T+N109G+A116T+G131
H+N243V,A088T+N109G,N109G+N243V,T158S+L2
57G,N061S+N109G+N243V,P040A+N109G+N243V+
S248N+K256R,S009T+S018T+Y021N+N109G+K141
R,A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R,A0
88T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G,N109G+
K256R,N109G+N243V+K256R,S063G+K256R,S063
G+N109G,S063G,S063G+N076D,S033T+N076D+N2
18S,及びN076D+N218Sからなる群から選択されるアミノ酸置換の組を更に
含み得る。

0117

本発明の第二態様による変異体は、アミノ酸置換S024G+S053G+S078N
+S101N+G128A+Y217Qを含むアミノ酸配列を含み得、A088T+N1
09G+A116T+G131H+N243V+L257G,S033T+N076D,
S009T+N109G+A128S+K141R+N243V,S162G+K256
R,N109G+A116T,N109G+L257G,S162G+L257G,N0
61G+N109G+N243V,N109G+A128S+N243V+S248A,
S033T+N076D+N109G+A128S+N218S+N243V+S248
N+K256R,N109G+A116T+N243V+K256R,A088T+N1
09G+A116T+G131H+N243V,A088T+N109G,N109G+
N243V,T158S+L257G,N061S+N109G+N243V,P040
A+N109G+A128S+N243V+S248N+K256R,S009T+S0
18T+Y021N+N109G+A128S+K141R,A088T+N109G+
A116T+T158S+N243V+K256R,A088T+N109G+A116
T+T158S+N218S+L257G,N109G+K256R,N109G+A1
28S+N243V+K256R,S063G+K256R,S063G+N109G,
S063G+A128S,S063G+N076D,S033T+N076D+A128
S+N218S,及びN076D+N218S,からなる群から選択されるアミノ酸置換
の組を更に含み得、ここで、この変異体はタンパク質分解活性を有し、この変異体の各ア
ミノ酸位置は、配列番号2のアミノ酸配列と変異体のアミノ酸配列とのアラインメントに
よって決定される配列番号2のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対応させることによ
り番号付けされる。特に、例えば、置換S024G+S053G+S078N+S101
N+G128A+Y217Q,を含む配列を含み、並びに置換の組S009T+N109
G+A128S+K141R+N243V,を更に含む、本発明の第二態様による変異体
は、位置128のアラニン(すなわち、G128A置換)がSで置換される(A128S
置換)ことから位置128においてセリン(S)を有する。

0118

本発明の第二態様による変異体のアミノ酸配列は、配列番号2、配列番号4又は配列番
号6のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、65%又は70%の配列同一性を有し得
る。本発明の第二態様による変異体のアミノ酸配列は、配列番号2、配列番号4又は配列
番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも80%又は85%の配列同一性を有し得る。本
発明の第二態様による変異体のアミノ酸配列は、配列番号2、配列番号4又は配列番号6
のアミノ酸配列に対して少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97%又は98%の配列同一性を有し得る。

0119

本発明の第二態様による特許プロテアーゼは、スブチリシンプロテアーゼであり得る。
本発明の第二態様による親プロテアーゼは、配列番号2、配列番号4又は配列番号6のア
ミノ酸配列に対して少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、91%、92
%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一
性を有するアミノ酸配列を含み得る。本発明の第二態様による変異体は、成熟型を有する
プロテアーゼ変異体であり得る。本発明の第一態様による変異体は、成熟型を有するプロ
テアーゼ変異体であり得る。

0120

本発明はまた、配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%
、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は10
0%の配列同一性を有するアミノ酸を含み、並びに、以下のもの:
A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G,
S033T+N076D,
S009T+N109G+A128S+K141R+N243V,
S162G+K256R,
N109G+A116T,
N109G+L257G,
S162G+L257G,
N061G+N109G+N243V,
N109G+A128S+N243V+S248A,
S033T+N076D+N109G+A128S+N218S+N243V+S24
8N+K256R,
N109G+A116T+N243V+K256R,
A088T+N109G+A116T+G131H+N243V,
A088T+N109G,
N109G+N243V,
T158S+L257G,
N061S+N109G+N243V,
P040A+N109G+A128S+N243V+S248N+K256R,
S009T+S018T+Y021N+N109G+A128S+K141R,
A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R,
A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G,
N109G+K256R,
N109G+A128S+N243V+K256R,
S063G+K256R,
S063G+N109G,
S063G+A128S,
S063G+N076D,
S033T+N076D+A128S+N218S,及び
N076D+N218S,からなる群から選択されるアミノ酸置換の組を含む、本発明
の第二態様による単離されたポリペプチド(例えば、プロテアーゼ変異体)を提供し、
ここで、この変異体は、タンパク質分解活性を有し、変異体の各アミノ酸位置は、配列
番号2のアミノ酸配列と変異体のアミノ酸配列とのアラインメントによって決定される配
列番号2のアミノ酸配列におけるアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる。
このようなポリぺプチドは、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に記載のプロテアー
ゼと比較して向上したタンパク質分解活性又は向上したクリーニング活性を有し得る。こ
のようなポリぺプチドは、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に記載のプロテアーゼ
のものを超える、タンパク質分解活性(例えば、AAPFアッセイ)又はクリーニングア
ッセイ(例えば、BMI、植物又は卵の微小標本アッセイ)における性能指数を有し得る
。本発明の第二態様による変異体は、配列番号2の配列を有するBPN’プロテアーゼの
タンパク質分解活性と比較して向上したタンパク質分解活性を有し得る。本発明の第二態
様による変異体は、配列番号4又は配列番号6の配列を有するプロテアーゼのタンパク質
分解活性と比較して向上したタンパク質分解活性を有し得る。本発明の第二態様による変
異体の親プロテアーゼは、スブチリシンプロテアーゼであり得、選択的にスブチリシンプ
ロテアーゼはバチルス種であり得る。本発明の第二態様による変異体の親スブチリシンプ
ロテアーゼは、バチルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)スブチリシ
ンプロテアーゼBPN’(配列番号2)、バチルス・ステアロサーモフィラス(B. stear
othermophilus)、枯草菌(B. subtilis)、バチルス・リケニホルミス(B. licheniform
is)、バチルス・レンタス(B. lentus)、バチルス・ブレビス(B. brevis)、バチルス
・ステアロサーモフィラス(B. stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィラス(B
. alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、バチ
ルス・クラウジイ(B. clausii)、バチルス・ハロデュランス(B. halodurans)、バチ
ルス・メガテリウム(B. megaterium)、バチルス・コアグランス(B. coagulans)、バ
チルス・サーキュランス(B. circulans)、バチルス・ロータス(B. lautus)、B.s
pecies TS−23、バチルス・チューリンゲンシス(B. thuringiensis)、BP
N’−v3(配列番号4)及びBPN’−v36(配列番号6)からなる群から選択され
得る。本発明の第二態様による親プロテアーゼは、配列番号2、配列番号4又は配列番号
6のアミノ酸配列に対して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%
、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%
又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

0121

本発明の第二態様による変異体は、成熟型を有するプロテアーゼ変異体であり得る。本
発明の第二態様による親プロテアーゼは、成熟型を有するプロテアーゼであり得る。

0122

本発明の第二態様による変異体は配列番号2、配列番号6又は配列番号4に対して少な
くとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、9
3%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含み得る。

0123

第三態様では、本発明は、プロテアーゼ活性を有する単離された又は非自然発生型ポリ
ペプチドを提供し、上記ポリペプチドは、
a)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V+L257G、
b)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+S033T+N076D、
c)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+S009T+N109G+K141R+N243V、
d)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+S162G+K256R、
e)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N109G+A116T、
f)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N109G+L257G、
g)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+S162G+L257G、
h)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N061G+N109G+N243V、
i)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+N109G+N243V+S248A、
j)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+S033T+N076D+N109G+N218S+N243V+S248N+
K256R、
k)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N109G+A116T+N243V+K256R、
l)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+A088T+N109G+A116T+G131H+N243V、
m)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+A088T+N109G、
n)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N109G+N243V、
o)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+T158S+L257G、
p)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N061S+N109G+N243V、
q)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+P040A+N109G+N243V+S248N+K256R、
r)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R、
s)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N243V+K256R、
t)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+A088T+N109G+A116T+T158S+N218S+L257G、
u)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+N109G+K256R、
v)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+N109G+N243V+K256R、
w)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+S063G+K256R、
x)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+S063G+N109G、
y)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y2
17Q+S063G、
z)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y2
17Q+S063G+N076D、
aa)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128S+Y
217Q+S033T+N076D+N218S、
bb)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y
217Q+N076D+N218S、及び
cc)BPN’−S024G+S053G+S078N+S101N+G128A+Y
217Q,からなる群から選択されるポリペプチド配列に対して少なくとも80%、85
%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99
%又は100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、この変異体の各アミ
ノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置に対応させることにより番号付けされる。
本発明の第三態様による変異体は、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に記載のプロ
テアーゼと比較して向上したタンパク質分解活性又は向上したクリーニング活性を有し得
る。本発明の第三態様による変異体は、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に記載の
プロテアーゼのものを超える、タンパク質分解活性(例えば、AAPFアッセイ)又はク
リーニングアッセイ(例えば、BMI、植物又は卵の微小標本アッセイ)における性能指
数を有し得る。

0124

本発明の第三態様によるポリペプチドは、上記a)〜cc)のいずれか又はタンパク質
分解活性を有するこれらのいずれかの断片を含み得る、あるいは、これらからなり得る。
本発明の第三態様による変異体又は親プロテアーゼは、成熟型であり得る。

0125

第四態様では、本発明は、(a)配列番号6のポリペプチド配列に対して少なくとも8
5%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)少なくとも厳密度の高い条件下で(i)配
列番号5のポリヌクレオチド配列と、又は(ii)(i)の相補的ポリヌクレオチド配列
と、ハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、並びに(
c)配列番号5のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90%、95%、96%、9
7%、98%、99%又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌ
クレオチドによりコードされるポリペプチド、からなる群から選択されるプロテアーゼ活
性を有する単離された又は非自然発生型のポリペプチドを提供する。本発明の第四態様に
よるポリペプチドは、配列番号6のアミノ酸配列又はタンパク質分解活性を有するこれら
の断片を含み得る、あるいは、これらからなり得る。本発明の第四態様による変異体は、
成熟BPN’(配列番号2)のものと比較して増大したタンパク質分解活性及び/又はク
リーニング性能若しくは活性を有し得る。本発明の第四態様による変異体は、配列番号4
若しくは配列番号6のものと比較して増大したタンパク質分解活性及び/又はクリーニン
グ性能若しくは活性を有し得る。本発明の第四態様による変異体又は親プロテアーゼは、
成熟型であり得る。

0126

第五態様では、本発明は、親プロテアーゼの単離された又は非自然発生型のプロテアー
ゼ変異体を提供し、ここで、(a)この変異体は親プロテアーゼと比較して25以下、2
0以下、15以下又は10以下の変異を有するアミノ酸配列を含み、ここで、(i)これ
らの変異は、挿入、欠失又は置換から独立して選択され、(ii)これらの変異は、位置
24及び53におけるグリシンの置換、位置78及び101におけるアスパラギンの置換
、位置128におけるアラニン又はセリンの置換、及び位置217におけるグルタミンの
置換を包含し、(b)親プロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同
一性を有し、(c)配列番号2のアミノ酸配列は、位置番号付けを決定するために使用さ
れ、並びに(d)この変異体は、親プロテアーゼと比較してタンパク質分解活性が増大し
ており、ここで、各アミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置に対応させること
により番号付けされる。本発明の第五態様による変異体のアミノ酸配列は、配列番号2、
配列番号4又は配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、85%、90%、
91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%又は98%の配列同一性を有
し得る。

0127

本発明の第五態様による親プロテアーゼは、配列番号2、配列番号4又は配列番号6の
配列に対して少なくとも80%、85%、95%、96%、97%、98%、99%又は
100%の配列同一性を有し得る。本発明の第五態様による親プロテアーゼは、配列番号
2のアミノ酸配列を有するプロテアーゼであり得る。本発明の第五態様による変異体又は
親プロテアーゼは、成熟型であり得る。

0128

本発明の第五態様による変異体のアミノ酸配列は、置換N109Gを更に含み得る。本
発明の第五態様による変異体のアミノ酸配列は、置換N076Dを更に含み得る。本発明
の第五態様による変異体のアミノ酸配列は、置換S033Tを更に含み得る。本発明の第
五態様による変異体のアミノ酸配列は、置換N243Vを更に含み得る。本発明の第五態
様による変異体のアミノ酸配列は、置換S248Aを更に含み得る。本発明の第五態様に
よる変異体のアミノ酸配列は、置換A088Tを更に含み得る。本発明の第五態様による
変異体のアミノ酸配列は、置換S063Gを更に含み得る。

0129

本発明の第五態様による変異体のアミノ酸配列は、A088T+N109G+A116
T+G131H+N243V+L257G,S033T+N076D,S009T+N1
09G+K141R+N243V,S162G+K256R,N109G+A116T,
N109G+L257G,S162G+L257G,N061G+N109G+N243
V,N109G+N243V+S248A,S033T+N076D+N109G+N2
18S+N243V+S248N+K256R,N109G+A116T+N243V+
K256R,A088T+N109G+A116T+G131H+N243V,A088
T+N109G,N109G+N243V,T158S+L257G,N061S+N1
09G+N243V,P040A+N109G+N243V+S248N+K256R,
S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R,A088T+N109
G+A116T+T158S+N243V+K256R,A088T+N109G+A1
16T+T158S+N218S+L257G,N109G+K256R,N109G+
N243V+K256R,S063G+K256R,S063G+N109G,S063
G,S063G+N076D,S033T+N076D+N218S,及びN076D+
N218Sからなる群から選択されるアミノ酸置換の組を更に含み得る。

0130

本発明の第五態様による親プロテアーゼは、スブチリシンプロテアーゼであり得る。本
発明の第五態様による親プロテアーゼは、配列番号2に記載のBPN’であり得る。本発
明の第五態様による変異体は、配列番号4若しくは配列番号6のものと比較して増大した
タンパク質分解活性及び/又はクリーニング性能若しくは活性を有し得る。

0131

第六態様では、本発明は、親プロテアーゼの単離された又は非自然発生プロテアーゼ変
異体を提供し、ここで、(a)この変異体は、(i)配列番号2の配列に対して少なくと
も80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%又は97
%の同一性を有し、並びに、(ii)位置24及び53におけるグリシンの置換、位置7
8及び101におけるアスパラギンの置換、位置128におけるアラニン又はセリンの置
換、及び位置217におけるグルタミンの置換を含む、アミノ酸配列を含み、(b)親プ
ロテアーゼは、配列番号2に対して少なくとも80%、85%、90%、91%、92%
、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の配列同一性
を有し、(c)この変異体の各アミノ酸位置は、配列番号2の配列のアミノ酸位置に対応
させることにより番号付けされ、並びに(d)この変異体は、親プロテアーゼと比較して
タンパク質分解活性が増大している。本発明の第六態様による親プロテアーゼ(protase
)は、スブチリシンプロテアーゼであり得る。本発明の第六態様による親プロテアーゼは
、配列番号2のアミノ酸配列を有するプロテアーゼであり得る。本発明の第六態様による
変異体は、親プロテアーゼのタンパク質分解活性及び/又はクリーニング活性とそれぞれ
比較して増大したタンパク質分解活性及び/又はクリーニング活性を有し得る。

0132

本発明の第六態様による変異体のアミノ酸配列は、置換N109Gを更に含み得る。本
発明の第六態様による変異体のアミノ酸配列は、置換N076Dを更に含み得る。本発明
の第六態様による変異体のアミノ酸配列は、置換S033Tを更に含み得る。本発明の第
六態様による変異体のアミノ酸配列は、置換N243Vを更に含み得る。本発明の第六態
様による変異体のアミノ酸配列は、置換S248Aを更に含み得る。本発明の第六態様に
よる変異体のアミノ酸配列は、置換A088Tを更に含み得る。本発明の第六態様による
変異体のアミノ酸配列は、置換S063Gを更に含み得る。

0133

本発明の第六態様による変異体のアミノ酸配列は、A088T+N109G+A116
T+G131H+N243V+L257G,S033T+N076D,S009T+N1
09G+K141R+N243V,S162G+K256R,N109G+A116T,
N109G+L257G,S162G+L257G,N061G+N109G+N243
V,N109G+N243V+S248A,S033T+N076D+N109G+N2
18S+N243V+S248N+K256R,N109G+A116T+N243V+
K256R,A088T+N109G+A116T+G131H+N243V,A088
T+N109G,N109G+N243V,T158S+L257G,N061S+N1
09G+N243V,P040A+N109G+N243V+S248N+K256R,
S009T+S018T+Y021N+N109G+K141R,A088T+N109
G+A116T+T158S+N243V+K256R,A088T+N109G+A1
16T+T158S+N218S+L257G,N109G+K256R,N109G+
N243V+K256R,S063G+K256R,S063G+N109G,S063
G,S063G+N076D,S033T+N076D+N218S,及びN076D+
N218Sからなる群から選択されるアミノ酸置換の組を更に含み得る。

0134

本発明の第六態様による変異体は、配列番号2、配列番号4若しくは配列番号6のもの
と比較して増大したタンパク質分解活性及び/又はクリーニング性能若しくは活性を有し
得る。本発明の第六態様による変異体は、配列番号2、配列番号4又は配列番号6に記載
のプロテアーゼのものを超える、タンパク質分解活性(例えば、AAPFアッセイ)又は
クリーニングアッセイ(例えば、BMI、植物又は卵の微小標本アッセイ)における性能
指数を有し得る。本発明の第六態様による変異体又は親プロテアーゼは、成熟型であり得
る。

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