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図面 (20)

課題

多数の病状で観察されるRNFL変性のRGMAに結合できる抗体の提供。

解決手段

網膜神経線維層(RNFL)変性の治療に使用するためのRGMAに結合し、RGMタンパク質のRGM A受容体及び他のRGM A結合タンパク質に対する結合を妨げ、よってRGM Aの機能を中和する能力を有するRGM A結合タンパク質、特にモノクローナル抗体、とりわけそのCDRグラフト化ヒト化バージョン、並びにRNFL変性を防ぐために哺乳動物を治療上または予防上治療する方法を提供する。

概要

背景

哺乳動物中枢神経系(CNS)内の損傷、炎症発作または神経変性疾患後の軸索再生はたいてい不可能である。結果は、CNS中の神経線維再成長する固有能力病変またはダメージ部位の微環境中に局在し、損傷された線維路の再成長、よって再生を積極的に妨げるCNS内の阻害因子との間のバランスに依存する。

乏突起膠細胞より生ずるCNSミエリン及び病変瘢痕インビトロ及びインビボ成長円錐退縮及び神経突起成長阻害を引き起こし、これにより軸索再成長を直接阻害することにより損傷の早期における軸索成長に対する最も適切な非許容構造であることは確立されている。CNSミエリン及び瘢痕組織上の主要阻害因子であるRGMタンパク質は同定されている(Monnierら,Nature,419:392−395,2002;Schwabら,Arch.Neurol.,62:1561−8,2005a;Schwabら,Eur.J.Neurosci.,21:1569−76,2005b;Hataら,J.Cell Biol.,173:47−58,2006;概説については、Muellerら,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513−29,2006;Yamashitaら,Curr.Opin.Neurobiol.,17:29−34,2007を参照されたい)。RGMタンパク質は脳外傷または虚血性発作で死にかけている人のダメージまたは病変部位アップレギュレートされており(Schwabら,Arch.Neurol.,62:1561−8,2005a)、脊髄損傷を有するラットの病変部位でアップレギュレートされている(Schwabら,Eur.J.Neurosci.,21:1569−76,2005b;Hataら,J.Cell Biol.,173:47−58,2006;概説については、Muellerら,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513−29,2006;Yamashitaら,Curr.Opin.Neurobiol.,17:29−34,2007を参照されたい)。加えて、多発性硬化症患者及び健康人からの臨床サンプルを用いた最初のデータから、ヒトRGMAがMSを患っている患者脳脊髄液においてアップレギュレートされていることが示唆された(データ示さず)。

RGMA特異的ポリクローナル抗体の再生促進ポテンシャルを評価するために、胸部ベル9/10で脊髄の約60%が横に切開されている脊髄損傷の中〜重症モデルに抗体を投与した。組織学的検査で、前記病変が皮質脊髄路のすべての背側及び外側線維を切断していたことが明らかとなった。RGM A特異的ポリクローナル抗体をポンプを介して2週間局所投与すると、損傷された神経線維の長距離再生が誘導された(Hataら,J.Cell Biol.,173:47−58,2006)。

数百の神経線維が病変部位を超えて伸長し、最長繊維は病変部を超えて10mm以上再生されたのに対して、対照抗体処理動物では再生線維が病変部から離れて存在しなかった。抗RGMA処理したラットの機能回復は対照抗体処理した脊髄損傷ラットと比較して有意に改善され、これによりRGM Aが強力な神経再生阻害剤及び軸索損傷または神経線維損傷により特徴づけられる適応症における回復刺激するための有用な標的であることが立証された(Hataら,J.Cell Biol.,173:47−58,2006;Kyotoら,Brain Res.,1186:74−86,2007)。加えて、RGM Aタンパク質を機能遮断ポリクローナル抗体で中和すると、脊髄損傷ラットにおけるダメージを受けた神経線維の再成長が刺激されるだけでなく、シナプス形成強化され、これによりダメージを受けたニューロン回路再形成または修復できた(Kyotoら,Brain Res.,1186:74−86,2007)。

rgm遺伝子ファミリーは3つの異なる遺伝子を包含し、そのうちの2つのrgm a及びbはRGMA及びRGM Bタンパク質を起源とする哺乳動物CNSにおいて発現され、第3のメンバーのrgm cは末梢において発現され(Muellerら,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513−29,2006)、RGM Cは鉄代謝において重要な役割を発揮する。インビトロで、RGM Aは、RGM受容体として同定されているネオゲニンに結合することにより神経突起伸長を阻害する(Rajagopalanら,Nat.Cell Biol.,6(8),756−62,2004)。ネオゲニンは最初ネトリン結合タンパク質として記載された(Keino−Masuら,Cell,87(2):175−85,1996)。ネトリン−1がネオゲニンまたはその均密に関連する受容体DCC(大腸癌欠失している)へ結合すると神経突起成長が阻害されるよりむしろ刺激されると報告されているので(Braistedら,J.Neurosci.,20:5792−801,2000)、このことは重要な所見である。従って、RGM Aをブロックすると、ネオゲニンがその神経突起成長刺激リガンドのネトリンに結合できることによりRGM媒介成長阻害解除される。これらの所見に基づいて、RGM Aを中和することがヒト脊髄損傷のモデルでネオゲニンを中和することより優れていると推測され得る。RGM Aのネオゲニンへの結合及び神経突起成長阻害の誘導に加えて、RGM AまたはBの骨形態形成タンパク質BMP−2及びBMP−4に対する結合は神経再生及び機能回復の成功に対する別の障害に相当し得る(Muellerら,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513−29,2006)。

RNFL網膜の最内層であり、主に視神経を構成する神経節細胞ニューロンからの軸索を構成する。RNFL内の軸索は眼の篩板を通過するまでミエリン形成されない。RNFLの厚さがミエリン変性に可能性ある構造的影響を与えることなく軸索の寄与を反映するので、RNFLのこの構造の特徴によりRNFLはCNS内の神経変性プロセスを調べるための理想組織となる(Frohmanら,Arch.Neurol.,65(1):26−35,2008)(図19も参照されたい)。

Frisen,L.及びHoyl,W.F.は多発性硬化症(MS)患者におけるRNFLの減少を初めて報告した(Frisen,L. and Hoyl,W.F.,Arch.Opthalmol.,92:91−97,1974)。

健康な個人の場合、RNFLは15まで約110〜120μmの厚さしかなく、多くの正常な個人では網膜の厚さが約0.017%/年ずつ減少、網膜の厚さは60才を超えると約10〜20μmに等しい(Kanamori.A.ら,Ophthalmologica,217:273−278,2003)。これに反して、急性視神経炎(AON)を経験したMS患者の約75%が最初の炎症発症からたった約3〜6ヶ月以内に10〜40μmのRNFL厚さの損失を示した。RNFLが約75μmのレベル以下に減少すると視覚機能減衰が生ずる(Costelloら,Ann.Neurol.,59:963−969,2006)。MS治療応答して神経保護モデル化する目的のRNFLの可能性ある有用性はFrohmanらが示唆しており、彼らはRNFL厚さを測定できる再生可能イメージング技術として光干渉断層法(OTC)も記載している(上記したFrohmanらを参照されたい;Frohmanら,Nature Clinical Practice Neurology,4:12,664−675,2008)。

RNFLの変性は、糖尿病性網膜症虚血性視神経症X染色体連鎖性網膜分離症、薬物誘発性視神経症網膜ジストロフィー加齢黄斑変性視神経乳頭ドルーゼンにより特徴づけられる眼病、光受容器変性の遺伝的決定因子により特徴づけられる眼病、常染色体劣性錐体ジストロフィー、視神経症を伴うミトコンドリア疾患、すなわちフリードライヒ運動失調症アルツハイマー病軽度認知機能障害(MCI)、パーキンソン病、及びプリオン病、すなわちクロイツフェルトヤコブ病スクレイピーBSEのような多数の他の疾患の過程でも観察されている(Sakata LM,ら,Clin.Experiment Ophtalmol.,2009,37:90−99;Morris RWら,Optometry,2009,80,83−100;Kallenbach K. & Frederiksen J.,Eur.J.Neurol.,2007,14:841−849;Trickら,J.Neuroophtthalmol.,2006,26:284−295;Tantri A.ら,Surv.Ophtalmol.,49:214−230も参照されたい)。

当業界ではRNFL変性を直接治療できる治療アプローチに対する要望がある。従って、本発明により解決すべき問題は直接的治療、特に複数の病状で観察されるRNFL変性の神経保護治療を与える手段を提供することである。

概要

多数の病状で観察されるRNFL変性のRGMAに結合できる抗体の提供。網膜神経線維層(RNFL)変性の治療に使用するためのRGM Aに結合し、RGMタンパク質のRGM A受容体及び他のRGM A結合タンパク質に対する結合を妨げ、よってRGM Aの機能を中和する能力を有するRGM A結合タンパク質、特にモノクローナル抗体、とりわけそのCDRグラフト化ヒト化バージョン、並びにRNFL変性を防ぐために哺乳動物を治療上または予防上治療する方法を提供する。なし

目的

本発明により解決すべき問題は直接的治療、特に複数の病状で観察されるRNFL変性の神経保護治療を与える手段を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

網膜神経線維層(RNFL変性治療に使用するためのヒトRGMAに対する結合タンパク質

請求項2

前記治療は治療上または予防上の、神経再生的または神経保護的、局所または全身治療である請求項1に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項3

前記治療の結果として、a)網膜ニューロンが観察される;及び/またはb)網膜中のRGC網膜神経節細胞軸索が変性から保護される;請求項1または2に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項4

RNFL変性は糖尿病性網膜症虚血性視神経症X染色体連鎖性網膜分離症、薬物誘発性視神経症網膜ジストロフィー加齢黄斑変性視神経乳頭ドルーゼンにより特徴づけられる眼病、光受容器変性の遺伝的決定因子により特徴づけられる眼病、常染色体劣性錐体ジストロフィー及び視神経症を伴うミトコンドリア障害から選択される疾患に関連する請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項5

両方とも表面プラズモン共鳴により測定して、1×10−7M以下のKD及び1×10−2s−1以下のkoff速度定数でヒトRGMAから解離する請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項6

標準インビトロアッセイで測定して、ヒトRGMAに結合し、ヒトRGMAの神経突起伸長阻害活性中和する請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項7

ヒト化抗体である請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項8

RGM分子エピトープに結合し得、a)配列番号59及び65、及び前記配列の1つに対して少なくとも50%の配列同一性を有する修飾CDRアミノ酸配列から構成されるCDR−H3グループアミノ酸配列;及び/またはb)配列番号62及び68、及び前記配列の1つに対して少なくとも50%の配列同一性を有する修飾CDRアミノ酸配列から構成されるCDR−L3グループアミノ酸配列;からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む抗原結合ドメインを含む請求項1〜7のいずれか1項に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項9

更に、a)配列番号57及び63から構成されるアミノ酸配列のCDR−H1グループ;及び/またはb)配列番号60及び66から構成されるアミノ酸配列のCDR−L1グループ;及び/またはc)配列番号58及び64から構成されるアミノ酸配列のCDR−H2グループ;及び/またはd)配列番号61及び67から構成されるアミノ酸配列のCDR−L2グループ、並びに前記配列の1つに対して少なくとも50%の配列同一性を有する修飾CDRアミノ酸配列から選択される少なくとも1つのCDRを含む請求項1〜8のいずれか1項に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項10

から構成される可変ドメインCDR組から選択される少なくとも3つのCDR、または前記した少なくとも3つのCDRの少なくとも1つが親配列に対して少なくとも50%の配列同一性を有する修飾CDRアミノ酸配列である可変ドメイン組を含む請求項9に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項11

少なくとも2つの可変ドメインCDR組を含む請求項10に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項12

少なくとも2つの可変ドメインCDR組はVH5F9組とVL5F9組;及びVH8D1組とVL8D1組;からなる群から選択される請求項11に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項13

更に、ヒトアクセプターフレームワークを含む請求項1〜12のいずれか1項に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項14

配列番号35、36、37、38、39、40、41、42及び43から選択される少なくとも1つの重鎖可変ドメイン及び/または配列番号44、45及び46から選択される少なくとも1つの軽鎖可変ドメインを含む請求項1〜13のいずれか1項に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項15

ヒトアクセプターフレームワークはキー残基での少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、前記キー残基は(重鎖配列位置):1、5、37、48、49、88、98;(軽鎖配列位置):2、4、41、51;からなる群から選択される請求項13および14のいずれか1項に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項16

結合タンパク質は(重鎖配列)配列番号47、48、49、50;及び(軽鎖配列)配列番号51、52、53及び54;からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの(フレームワーク突然変異した)可変ドメインを含む請求項1〜15のいずれか1項に記載の結合タンパク質。

請求項17

5F9及び8D1から選択される抗体である請求項1〜16のいずれか1項に記載の使用するための結合タンパク質。

請求項18

治療を要する哺乳動物に対して有効量の請求項1〜17のいずれか1項に記載の単離結合タンパク質を含む組成物投与するステップを含むRNFL変性の治療方法

請求項19

治療は治療上または予防上の、神経再生的または神経保護的、局所または全身治療である請求項18に記載の方法。

技術分野

0001

本出願は、網膜神経線維層(RNFL変性治療に使用するためのRGMAに結合し、RGMタンパク質のRGM A受容体及び他のRGM A結合タンパク質への結合を妨げ、従ってRGM Aの機能を中和する能力を有するRGM A結合タンパク質、特にモノクローナル抗体、とりわけそのCDRグラフト化ヒト化バージョン、並びにRNFL変性を防ぐために哺乳動物を治療上または予防上治療する方法を記載している。

背景技術

0002

哺乳動物中枢神経系(CNS)内の損傷、炎症発作または神経変性疾患後の軸索再生はたいてい不可能である。結果は、CNS中の神経線維再成長する固有の能力と病変またはダメージ部位の微環境中に局在し、損傷された線維路の再成長、よって再生を積極的に妨げるCNS内の阻害因子との間のバランスに依存する。

0003

乏突起膠細胞より生ずるCNSミエリン及び病変瘢痕インビトロ及びインビボ成長円錐退縮及び神経突起成長阻害を引き起こし、これにより軸索再成長を直接阻害することにより損傷の早期における軸索成長に対する最も適切な非許容構造であることは確立されている。CNSミエリン及び瘢痕組織上の主要阻害因子であるRGMタンパク質は同定されている(Monnierら,Nature,419:392−395,2002;Schwabら,Arch.Neurol.,62:1561−8,2005a;Schwabら,Eur.J.Neurosci.,21:1569−76,2005b;Hataら,J.Cell Biol.,173:47−58,2006;概説については、Muellerら,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513−29,2006;Yamashitaら,Curr.Opin.Neurobiol.,17:29−34,2007を参照されたい)。RGMタンパク質は脳外傷または虚血性発作で死にかけている人のダメージまたは病変部位アップレギュレートされており(Schwabら,Arch.Neurol.,62:1561−8,2005a)、脊髄損傷を有するラットの病変部位でアップレギュレートされている(Schwabら,Eur.J.Neurosci.,21:1569−76,2005b;Hataら,J.Cell Biol.,173:47−58,2006;概説については、Muellerら,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513−29,2006;Yamashitaら,Curr.Opin.Neurobiol.,17:29−34,2007を参照されたい)。加えて、多発性硬化症患者及び健康人からの臨床サンプルを用いた最初のデータから、ヒトRGMAがMSを患っている患者脳脊髄液においてアップレギュレートされていることが示唆された(データ示さず)。

0004

RGMA特異的ポリクローナル抗体の再生促進ポテンシャルを評価するために、胸部ベル9/10で脊髄の約60%が横に切開されている脊髄損傷の中〜重症モデルに抗体を投与した。組織学的検査で、前記病変が皮質脊髄路のすべての背側及び外側線維を切断していたことが明らかとなった。RGM A特異的ポリクローナル抗体をポンプを介して2週間局所投与すると、損傷された神経線維の長距離再生が誘導された(Hataら,J.Cell Biol.,173:47−58,2006)。

0005

数百の神経線維が病変部位を超えて伸長し、最長繊維は病変部を超えて10mm以上再生されたのに対して、対照抗体処理動物では再生線維が病変部から離れて存在しなかった。抗RGMA処理したラットの機能回復は対照抗体処理した脊髄損傷ラットと比較して有意に改善され、これによりRGM Aが強力な神経再生阻害剤及び軸索損傷または神経線維損傷により特徴づけられる適応症における回復刺激するための有用な標的であることが立証された(Hataら,J.Cell Biol.,173:47−58,2006;Kyotoら,Brain Res.,1186:74−86,2007)。加えて、RGM Aタンパク質を機能遮断ポリクローナル抗体で中和すると、脊髄損傷ラットにおけるダメージを受けた神経線維の再成長が刺激されるだけでなく、シナプス形成強化され、これによりダメージを受けたニューロン回路再形成または修復できた(Kyotoら,Brain Res.,1186:74−86,2007)。

0006

rgm遺伝子ファミリーは3つの異なる遺伝子を包含し、そのうちの2つのrgm a及びbはRGMA及びRGM Bタンパク質を起源とする哺乳動物CNSにおいて発現され、第3のメンバーのrgm cは末梢において発現され(Muellerら,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513−29,2006)、RGM Cは鉄代謝において重要な役割を発揮する。インビトロで、RGM Aは、RGM受容体として同定されているネオゲニンに結合することにより神経突起伸長を阻害する(Rajagopalanら,Nat.Cell Biol.,6(8),756−62,2004)。ネオゲニンは最初ネトリン結合タンパク質として記載された(Keino−Masuら,Cell,87(2):175−85,1996)。ネトリン−1がネオゲニンまたはその均密に関連する受容体DCC(大腸癌欠失している)へ結合すると神経突起成長が阻害されるよりむしろ刺激されると報告されているので(Braistedら,J.Neurosci.,20:5792−801,2000)、このことは重要な所見である。従って、RGM Aをブロックすると、ネオゲニンがその神経突起成長刺激リガンドのネトリンに結合できることによりRGM媒介成長阻害解除される。これらの所見に基づいて、RGM Aを中和することがヒト脊髄損傷のモデルでネオゲニンを中和することより優れていると推測され得る。RGM Aのネオゲニンへの結合及び神経突起成長阻害の誘導に加えて、RGM AまたはBの骨形態形成タンパク質BMP−2及びBMP−4に対する結合は神経再生及び機能回復の成功に対する別の障害に相当し得る(Muellerら,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513−29,2006)。

0007

RNFLは網膜の最内層であり、主に視神経を構成する神経節細胞ニューロンからの軸索を構成する。RNFL内の軸索は眼の篩板を通過するまでミエリン形成されない。RNFLの厚さがミエリン変性に可能性ある構造的影響を与えることなく軸索の寄与を反映するので、RNFLのこの構造の特徴によりRNFLはCNS内の神経変性プロセスを調べるための理想組織となる(Frohmanら,Arch.Neurol.,65(1):26−35,2008)(図19も参照されたい)。

0008

Frisen,L.及びHoyl,W.F.は多発性硬化症(MS)患者におけるRNFLの減少を初めて報告した(Frisen,L. and Hoyl,W.F.,Arch.Opthalmol.,92:91−97,1974)。

0009

健康な個人の場合、RNFLは15まで約110〜120μmの厚さしかなく、多くの正常な個人では網膜の厚さが約0.017%/年ずつ減少、網膜の厚さは60才を超えると約10〜20μmに等しい(Kanamori.A.ら,Ophthalmologica,217:273−278,2003)。これに反して、急性視神経炎(AON)を経験したMS患者の約75%が最初の炎症発症からたった約3〜6ヶ月以内に10〜40μmのRNFL厚さの損失を示した。RNFLが約75μmのレベル以下に減少すると視覚機能減衰が生ずる(Costelloら,Ann.Neurol.,59:963−969,2006)。MS治療に応答して神経保護モデル化する目的のRNFLの可能性ある有用性はFrohmanらが示唆しており、彼らはRNFL厚さを測定できる再生可能イメージング技術として光干渉断層法(OTC)も記載している(上記したFrohmanらを参照されたい;Frohmanら,Nature Clinical Practice Neurology,4:12,664−675,2008)。

0010

RNFLの変性は、糖尿病性網膜症虚血性視神経症X染色体連鎖性網膜分離症、薬物誘発性視神経症網膜ジストロフィー加齢黄斑変性視神経乳頭ドルーゼンにより特徴づけられる眼病、光受容器変性の遺伝的決定因子により特徴づけられる眼病、常染色体劣性錐体ジストロフィー、視神経症を伴うミトコンドリア疾患、すなわちフリードライヒ運動失調症アルツハイマー病軽度認知機能障害(MCI)、パーキンソン病、及びプリオン病、すなわちクロイツフェルトヤコブ病スクレイピーBSEのような多数の他の疾患の過程でも観察されている(Sakata LM,ら,Clin.Experiment Ophtalmol.,2009,37:90−99;Morris RWら,Optometry,2009,80,83−100;Kallenbach K. & Frederiksen J.,Eur.J.Neurol.,2007,14:841−849;Trickら,J.Neuroophtthalmol.,2006,26:284−295;Tantri A.ら,Surv.Ophtalmol.,49:214−230も参照されたい)。

0011

当業界ではRNFL変性を直接治療できる治療アプローチに対する要望がある。従って、本発明により解決すべき問題は直接的治療、特に複数の病状で観察されるRNFL変性の神経保護治療を与える手段を提供することである。

先行技術

0012

Monnierら,Nature,419:392−395,2002
Schwabら,Arch.Neurol.,62:1561−8,2005a
Schwabら,Eur.J.Neurosci.,21:1569−76,2005b
Hataら,J.Cell Biol.,173:47−58,2006
Muellerら,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513−29,2006
Yamashitaら,Curr.Opin.Neurobiol.,17:29−34,2007
Kyotoら,Brain Res.,1186:74−86,2007)。
Rajagopalanら,Nat.Cell Biol.,6(8),756−62,2004
Keino−Masuら,Cell,87(2):175−85,1996
Braistedら,J.Neurosci.,20:5792−801,2000
Frohmanら,Arch.Neurol.,65(1):26−35,2008
Frisen,L. and Hoyl,W.F.,Arch.Opthalmol.,92:91−97,1974
Kanamori.A.ら,Ophthalmologica,217:273−278,2003
Costelloら,Ann.Neurol.,59:963−969,2006
Frohmanら,Nature Clinical Practice Neurology,4:12,664−675,2008
Sakata LM,ら,Clin.Experiment Ophtalmol.,2009,37:90−99
Morris RWら,Optometry,2009,80,83−100
Kallenbach K. & Frederiksen J.,Eur.J.Neurol.,2007,14:841−849
Trickら,J.Neuroophtthalmol.,2006,26:284−295
Tantri A.ら,Surv.Ophtalmol.,49:214−230

発明が解決しようとする課題

0013

本発明の実施形態は、多数の病状で観察されるRNFL変性のRGMAに結合できる抗体を用いる神経保護治療に関する。

0014

別の実施形態は、RGMAをブロックし、RGM Aとその受容体及び/または結合タンパク質、すなわちネオゲニン及びBMP−2、BMP−4間の相互作用を妨げるモノクローナル抗体のRNFL変性の治療のための使用に関する。

0015

別の実施形態は、治療を要する哺乳動物に対して有効量のRGMAに結合できる抗体を含む組成物を投与するステップを含むRNFL変性の治療方法である。

図面の簡単な説明

0016

Aは、ELISAアッセイにおけるhRGMAに対するモノクローナル抗体の結合を示す。Bは、HEK 293細胞で発現させたhRGM Aに対するモノクローナル抗体結合を示す。CはHEK 293細胞で発現させたラットRGM Aに対するモノクローナル抗体結合を示す。
ネオゲニンに対する完全長RGM A結合を示す。MAB 5F9は完全長のfc結合したhRGM Aのネオゲニンに対する結合を阻害する。
BMP−4に対する完全長RGM A結合を示す。MAB 5F9はfc結合した完全長hRGM A断片(47−422)のBMP−4に対する結合を阻害する。
BMP−4に対するRGM A断片0結合を示す。MAB 5F9はfc結合したhRGM A断片0(47−168)のBMP−4に対する結合を阻害する。
BMP−2に対する完全長RGM A結合を示す。MAB 5F9はfc結合した完全長hRGM A断片(47−422)のBMP−2に対する結合を阻害する。
NTera細胞神経突起伸長アッセイにおけるRGM A断片のmAb 5F9中和を示す顕微鏡写真組合せである。MAB 5F9は、ヒトNtera凝集物を用いる神経突起成長アッセイにおいてfcコンジュゲートした強力なhRGM A阻害剤断片の伸長阻害活性を中和する。A:対照培養物ラミニン上のNteraニューロンの成長、B:ラミニン−hRGM A断片(47−168)基質上、C〜E:0.1μg/mlのMAB 5F9(C)、1μg/mlのMAB 5F9(D)、10μg/mlのMAB 5F9(E)の存在下でのラミニン−hRGM A断片(47−168)基質上。
NTera 2アッセイ結果定量分析を示す。MAB 5F9は、ヒトNtera凝集物を用いる神経突起成長アッセイにおいてfcコンジュゲートした強力なhRGM A阻害剤断片(断片0,47−168)の伸長阻害活性を用量依存的に中和する。
SH−SY5Yストライプアッセイの定量分析を示す。MAB 5F9は、ストライプ膜カーペットにおいてヒトSH−SY5Yニューロン細胞の完全長ヒトRGM Aから構成されるストライプにより誘導される反発を中和する。MAB 5F9(A)の非存在下または低MAB濃度の存在下で、SH−SY5YニューロンはRGM Aストライプを避けることを選択する。この挙動はMAB 5F9の濃度を増加させることにより後退する(B〜D)。最高のMAB濃度(10μg/ml)(E)で、SH−SY5YニューロンはコラーゲンIストライプに比してRGM Aストライプに対して強い選択を示す。
mAB 5F9及び8D1結合特性の定量分析を要約する。MAB 5F9及び8D1を異なる濃度でhRGM A−ネオゲニン、hRGM A−BMP−2及びhRGM A−BMP−4結合アッセイで評価する。
SH−SY5Y走化性アッセイにおいてヒト化5F9抗体(h5F9.21、h5F9.23、h5F9.25)のhRGM Aの化学反発活性に対する中和活性を示す。
視神経損傷の動物モデルにおける局所5F9適用のインビボ神経再生活性を示す。視神経挫滅のラット動物モデルにおいてMAB 5F9を局所適用すると、RGM Aは中和され、ダメージを受けた視神経軸索の再生成長が刺激される。5F9処理動物(A)では、多くのGAP−43ポジティブ線維がラットRGM Aを結合していない対照MAB 8D1(B)に比して挫滅部位を超えて伸長している。
視神経損傷の動物モデルにおける局所5F9適用の定量分析を示す。(A)対照MAB 8D1ではなく、5F9は再生GAP−43ポジティブ線維の数を有意に増加させた。5F9で処理した動物では距離200μm、400μm及び600μmで有意により多くの線維(p<0.05)が観察され、1200μmでは線維は5F9処理動物でのみ見られ、対照動物では見られなかった。(B)5F9は対照抗体8D1及びビヒクル対照PBSと比較して視神経病変部位でGAP−43ポジティブ面積を有意に増加させた。再生成長の面積(GAP−43ポジティブ面積)はAxiovisionソフトウェア(Zeiss)を用いて測定した。
視神経損傷の動物モデルにおける局所5F9適用の定量分析を示す。(A)対照MAB 8D1ではなく、5F9は再生GAP−43ポジティブ線維の数を有意に増加させた。5F9で処理した動物では距離200μm、400μm及び600μmで有意により多くの線維(p<0.05)が観察され、1200μmでは線維は5F9処理動物でのみ見られ、対照動物では見られなかった。(B)5F9は対照抗体8D1及びビヒクル対照PBSと比較して視神経病変部位でGAP−43ポジティブ面積を有意に増加させた。再生成長の面積(GAP−43ポジティブ面積)はAxiovisionソフトウェア(Zeiss)を用いて測定した。
視神経損傷の動物モデルにおける5F9の全身適用のインビボ神経再生活性を示す。動物を0及び21日目にそれぞれ2mg/kg及び10mg/kgの5F9で処理した。抗体またはビヒクは腹腔内または静脈内投与した。ラット視神経の複合画像。5F9処理動物(A)では、多くのGAP−43ポジティブ線維がPBSで処理した対照動物(B)と対照的に挫滅部位を超えて伸長している。挫滅部位は左マージンに位置し、再生線維をGAP−4に対する抗体3で染色する。PBS動物ではなく、5F9処理動物において多くの繊維が視神経の上縁及び下縁で観察される。
視神経損傷の動物モデルにおいて5F9の全身適用の定量分析を示す。
視神経損傷の動物モデルにおいて5F9の全身適用の定量分析を示す。
視神経損傷の動物モデルにおける5F9の全身適用のインビボ再ミエリン形成活性を示す。動物を0及び21日目にそれぞれ2mg/kg及び10mg/kgの5F9で処理した。抗体またはビヒクルを腹腔内または静脈内投与した。ラット視神経の複合画像。ミエリン形成をミエリンマーカーミエリン塩基性タンパク質MBPに対する抗体を用いて可視化する。挫滅部位は複数の神経の中間に位置し、その域はビヒクル処理対照動物(A及びB)にはない。5F9処理動物(C及びD)では、多くのMBPポジティブ構造が視神経の中間域(挫滅中心)で観察される。
視神経損傷の動物モデルにおける5F9の全身投与の再ミエリン形成の定量効果を示す。
視神経挫滅を有する動物の眼由来のRNFLに対する抗体5F9の優れた保護効果を示す。5F9で全身処理した動物の網膜で有意に高密度神経線維束が観察される。
視神経挫滅を有する動物の眼由来の網膜内ニューロンに対する抗体5F9の影響を示す。5F9抗体で全身処理した動物の網膜で有意に多数の発網膜内ニューロンが観察される。
硝子球に直接隣接する層である網膜神経線維層(RNFL)を示す。網膜神経節細胞の軸索により形成されている。他の層は、アマクリン及び双極ニューロンが網膜神経節細胞とのシナプス接触を形成している内網状層(IPL)である。光受容器、水平ニューロン及び双極ニューロンが外網状層(OPL)においてシナプスを構成する。光受容器(棒及び円錐)は光受容器層(PRL)中に位置している。RPEは網膜色素上皮である(スキームはFrohmanら,Arch.Neurol.,65,26−35,2008から)。

0017

1.用語の定義
明細書中別途定義されていない限り、本発明に関連して使用されている科学用語及び技術用語は当業者が通常理解している意味を有する。用語の意味及び範囲は明らかでなければならないが、潜在的意味不明の場合には本明細書中に与えられている定義が辞書または外部の定義に優先する。更に、別の文脈が要求されない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。本明細書中、「または」の使用は別段の記述がない限り「及び/または」を意味する。更に、用語「含む(including)」及び「includes」及び「included」のような他の形は限定的でない。また、「エレメント」または「成分」のような用語は、別段具体的に記述されていない限り、1つの単位を含むエレメント及び成分、並びに2つ以上のサブユニットを含むエレメント及び成分の両方を包含する。

0018

一般的に、本明細書中に記載されている細胞及び組織培養分子生物学免疫学微生物学遺伝学、タンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用されている命名法及びそれらの技術は当業界で公知であり、一般的に使用されている。本発明の方法及び技術は、別段の指示がない限り、通常当業界で公知であり、各種一般文献並びに本明細書中に引用、検討されているより具体的な文献に記載されている慣用方法に従って実施される。酵素反応及び精製技術は当業界で通常実施されているかまたは本明細書中に記載されているように製造業者仕様書に従って実施される。本明細書中に記載されている分析化学、合成有機化学、並びに医化学及び医薬としての化学に関連して使用されている命名法並びにそれらの実験手順及び技術は当業界で公知であり、通常使用されているものである。化学合成化学分析、医薬品、処方、デリバリー及び患者の治療のためには標準技術が使用される。

0019

本明細書及び添付されている特許請求の範囲を通じて、以下の用語は次の意味を有する:
用語「アクセプター」及び「アクセプター抗体」は、1つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%を与えるまたはエンコードする抗体または核酸配列を指す。幾つかの実施形態では、用語「アクセプター」は1つ以上の定常領域を与えるまたはエンコードする抗体アミノ酸または核酸配列を指す。更に別の実施形態では、用語「アクセプター」は、1つ以上のフレームワーク領域及び1つ以上の定常領域を与えるまたはエンコードする抗体アミノ酸または核酸配列を指す。特定実施形態では、用語「アクセプター」は、1つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列の少なくとも80%、特に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%を与えるまたはエンコードするヒト抗体アミノ酸または核酸配列を指す。この実施形態によれば、アクセプターはヒト抗体の1つ以上の特定位置に存在しないアミノ酸残基を少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも10個含み得る。アクセプターフレームワーク領域及び/またはアクセプター定常領域は、例えば生殖細胞系抗体遺伝子成熟抗体遺伝子、機能抗体(例えば、当業界で公知の抗体、開発中の抗体または市販されている抗体)から誘導または入手し得る。

0020

本明細書中で使用されている用語「抗体」は、広義には免疫グロブリンIg分子の本質的エピトープ結合特徴を保持している2本の重(H)鎖と2本の軽(L)鎖の4本のポリペプチド鎖からなるIg分子、或いはその機能的断片ミュータントバリアントまたは誘導体を指す。前記したミュータント、バリアントまたは誘導体抗体フォーマットは当業界で公知である。その非限定的実施形態を以下に検討する。抗体が分子と特異的に反応して、これにより分子を抗体に結合し得るならば、抗体は分子に「結合し得る」と言われている。

0021

用語「抗体コンジュゲート」は、第2化学部分(例えば、治療薬または細胞傷害薬)に化学的に連結している結合タンパク質(例えば、抗体)を指す。用語「剤(薬、物質)」は化合物、化合物の混合物生物学的マクロ分子、または生物学的材料から作成される抽出物を指す。特に、治療薬または細胞傷害薬には、百日咳毒素タキソールサイトカラシンBグラミシジンD、臭化エチジウムエメチンマイトマイシンエトポシド、テノポシド、ビンクリスチンビンブラスチンコルヒチンドキソルビシンダウノルビシンジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロンミトラマイシンアクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロングルココルチコイドプロカインテトラカインリドカインプロプラノロール及びピューロマイシン、並びにそのアナログまたはホモログが含まれるが、これらに限定されない。

0022

本明細書中で使用されている用語「抗体構築物」は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインに連結されている本発明の1つ以上の抗原結合部分を含むポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドはペプチド結合により連結されている2つ以上のアミノ酸残基を含み、1つ以上の抗原結合部分を連結するために使用されている。リンカーポリペプチドは当業界で公知である(例えば、Holliger,P.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444−6448;Poljak,R.J.ら(1994)Structure,2:1121−1123を参照されたい)。免疫グロブリン定常ドメインは重鎖または軽鎖定常ドメインを指す。ヒトIgG重鎖及び軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は当業界で公知であり、表1に示す。

0023

0024

更に、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分の1つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有結合により形成される大きな免疫接着分子の一部であり得る。前記免疫接着分子の例には、テトラマーscFv分子を作成するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov,S.M.ら(1995)Human Antibodies and Hybridomas,6:93−101)、及び二価ビオチニル化scFv分子を作成するためのシステイン残基マーカーペプチド及びC末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov,S.M.ら(1994)Mol.Immunol.,31:1047−1058)が含まれる。抗体部分、例えばFab及びF(ab’)2断片は、全抗体の一般的技術(例えば、それぞれパパインまたはペプシン消化)を用いて全抗体から作成され得る。更に、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は本明細書中に記載されている標準組換えDNA技術を用いて得ることができる。

0025

本明細書中で使用されている用語抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」(または、単に「抗体部分」または「抗体断片」)は、抗原(例えば、hRGMA)に対して特異的に結合する能力を保持している抗体の1つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片により果たされ得ることは判明している。抗体の実施形態は、2つ以上の異なる抗原に対して特異的に結合する双特異性二重特異性または多重特異性フォーマットであり得る。用語抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例には、(i)VL、VH、CL及びCH1ドメインから構成される一価断片であるFab断片;(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結されている2つのFab断片からなる二価断片であるF(ab’)2断片;(iii)VH及びCH1ドメインから構成されるFd断片;(iv)抗体のシングルアームのVL及びVHドメインから構成されるFv断片;(v)単一可変ドメインを含むdAb断片(参照により本明細書に組み入れるWardら(1989)Nature,341:544−546;Winterら,PCT公開WO 90/05144 A1);及び(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。更に、Fv断片の2つのドメインVL及びVHは別の遺伝子によりコードされるが、これらは組換え方法を用いて、VL及びVH領域が対になって一価分子(一本鎖Fv(scFv)として公知;例えば、Birdら(1988)Science,242:423−426;及びHustonら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879−5883)を参照されたい)を形成する単一タンパク質鎖として作成できる合成リンカーにより連結され得る。一本鎖抗体も用語抗体の「抗原結合部分」に包含されると意図される。ダイアボディのような他の形態の一本鎖抗体も包含される。ダイアボディは、VH及びVLドメインが単一ポリペプチド鎖上で発現されるが、同一鎖上の2つのドメイン間で対を形成するには余りに短いリンカーを用いてドメインは別の鎖の相補性ドメインと対を形成し、2つの抗原結合部位を形成する二価の双特異性抗体である(例えば、Holliger,P.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444−6448;Poljak、R.J.ら(1994)Structure,2:1121−1123を参照されたい)。前記抗体結合部分は当業界で公知である(Kontermann and Dubel編,Antibody Engineering(2001)Springer−Verlag,New York,790pp.(ISBN 3−540−41354−5)。

0026

用語「抗原決定基」または「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に対して特異的に結合し得るポリペプチド決定基を含む。ある実施形態では、エピトープ決定基は分子の化学的に活性な表面基(例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル)を含み、ある実施形態では特定の3次元構造特性及び/または特定の電荷特性を有し得る。エピトープは抗体により結合される抗原の領域である。ある実施形態では、抗体はタンパク質及び/またはマクロ分子の複合混合物中のその標的抗原を優先的に認識するとき抗原に特異的に結合すると言われている。

0027

用語「生物活性」は本明細書中に記載されているRGMAのすべての固有生物特性を指す。

0028

用語「カノニカル残基」は、Chothiaら(いずれも参照により本明細書に組み入れるJ.Mol.Biol.,196:901−907(1987);Chothiaら,J.Mol.Biol.,227:799(1992))により定義されている特定のカノニカルCDR構造を規定するCDRまたはフレームワーク中の残基を指す。Chothiaらによれば、多くの抗体のCDRの重要な部分は、アミノ酸配列のレベルで多種多様であるにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンフォメーションを有している。各カノニカル構造は主にループを形成するアミノ酸残基の連続セグメントに対して1組のペプチド骨格ねじれ角を特定する。

0029

用語「キメラ抗体」は、1つの種由来の重鎖及び軽鎖可変領域配列及び別の種由来の定常領域配列を含む抗体、例えばヒト定常領域に連結されているマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体を指す。キメラ抗体は組換え分子生物学的技術により産生され得、または物理的に一緒にコンジュゲートされ得る。

0030

用語「CDR」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域の各々の中に、その可変領域の各々に対してCDR1、CDR2及びCDR3と称されている3つのCDRがある。本明細書中で使用されている用語「CDR組」は、抗原に結合し得る単一可変領域中に存在する3つのCDRのグループを指す。これらのCDRの正確な境界は各種システムに従って異なるように規定される。カバットが記載しているシステム(Kabatら,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md(1987)及び(1991))は、抗体の可変領域に対して適用可能な明白な残基ナンバリングシステムを与えるだけでなく、3つのCDRを規定する正確な残基境界も与える。これらのCDRはカバットCDRと称され得る。Chothia及び同僚(Chothia & Lesk,J.Mol.Biol.,196:901−917(1987)及びChothiaら,Nature,342:877−883(1989))は、アミノ酸配列のレベルで多種多様であるにもかかわらず、カバットCDR内のあるサブ部分はほぼ同一のペプチド骨格コンフォメーションを採用していることを知見した。これらのサブ部分はL1、L2及びL3、またはH1、H2及びH3と称され、ここで“L”及び“H”はそれぞれ軽鎖及び重鎖領域を指す。これらの領域はコチアCDRと称され得、カバットCDRと重複する境界を有している。カバットCDRと重複するCDRを規定する他の境界は、Padlan(FASEB J.,9:133−139(1995))及びMacCallum(J.Mol.Biol.,262(5):732−45(1996))により記載されている。さらに他のCDR境界規定は上記システムの1つに厳密に従わなくてもよいが、それでもカバットCDRと重複しており、特定の残基、残基のグループ、または全CDRすら抗原結合に有意な影響を与えないという予想または実験所見にてらして短縮または延長され得る。特定実施形態はカバットまたはコチア定義のCDRを使用しているが、本明細書中で使用される方法はこれらのシステムのいずれかに従って規定されるCDRを利用し得る。

0031

用語「CDRグラフト化抗体」は、1つの種由来の重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、VH及び/またはVLのCDR領域の1つ以上の配列が別の種のCDR配列置換されている抗体、例えばマウスCDRの1つ以上(例えば、CDR3)がヒトCDR配列で置換されているマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有している抗体を指す。

0032

用語「結晶」及び「結晶化されている」は、結晶の形態で存在している抗体またはその抗原結合部分を指す。結晶は非晶質固体状態または液晶状態のような他の形態と区別される物質の固体状態の1つの形態である。結晶は原子イオン、分子(例えば、抗体のようなタンパク質)または分子アセンブリ(例えば、抗原/抗体複合体)の規則的な反復三次元アレーから構成される。これらの三次元アレーは当分野で十分理解されている特定の数学的関係に従って配置される。結晶中で反復される基本的単位、すなわち構成ブロックは非対称単位と呼ばれる。所与の十分に規定された結晶学的対称に一致する配置中の非対称単位の反復により、結晶の「単位セル」が与えられる。すべての三次元での規則的平行移動による単位セルの反復により、結晶が生ずる。Giege,R. and Ducruix,A.Barrett,Crystallization of Nucleic Acidsand Proteins,a Practical Approach,2nd ea.,p.20,1−16,Oxford University Press,New York,New York(1999)を参照されたい。

0033

用語「ドナー」及び「ドナー抗体」は1つ以上のCDRを与える抗体を指す。特定実施形態では、ドナー抗体はそこからフレームワーク領域が得られるまたは誘導される抗体とは異なる種由来の抗体である。ヒト化抗体に関連して、用語「ドナー抗体」は1つ以上のCDRを与える非ヒト抗体を指す。

0034

用語「有効量」は、障害またはその1つ以上の症状の重症度及び/または期間を軽減または改善させる、障害の進行を予防する、障害を後退させる、障害に関連する1つ以上の症状の再発、発生、発症または進行を予防する、障害を検出する、或いは別の治療(例えば、予防薬または治療薬)の1つ以上の予防または治療効果を強化または向上させるのに十分な治療の量を指す。

0035

用語「フレームワーク」または「フレームワーク配列」は、可変領域からCDRを差し引いた残りの配列を指す。CDR配列の正確な規定は各種システムにより決定され得るので、フレームワーク配列の意味は対応して異なって解釈される。6つのCDR(軽鎖のCDR−L1、−L2及び−L3、並びに重鎖のCDR−H1、−H2及び−H3)は軽鎖及び重鎖上のフレームワーク領域を各々の鎖上の4つのサブ領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)に分割し、CDR1はFR1とFR2の間に位置し、CDR2はR2とFR3の間に位置し、CDR3はFR3とFR4の間に位置する。特定のサブ領域をFR1、FR2、FR3またはFR4と特定しないが、他の方法により称されるフレームワーク領域は単一の天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内の合わさったFRを表す。本明細書中で使用されているFRは4つのサブ領域の1つを表し、FRはフレームワーク領域を構成する4つのサブ領域の2つ以上を表す。

0036

ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は当業界で公知である。本発明の1つの実施形態では、ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は表2及び表3に記載されている配列から選択される。ヒトフレームワーク配列FR1〜FR4についての各種組合せがこれらの表に記載されている。

0037

0038

0039

用語「生殖細胞系抗体遺伝子」または「遺伝子断片」は、特定免疫グロブリンの発現のために遺伝子再配列及び成熟をもたらす成熟プロセスを受けていない非リンパ様細胞によりエンコードされる免疫グロブリン配列を指す(例えば、Shapiroら,Crit.Rev.Immunol.,22(3):183−200(2002);Marchalonisら,Adv.Exp.Med.Biol.,484:13−30(2001)を参照されたい)。本発明の各種実施形態により与えられる作用効果の1つは、生殖細胞系抗体遺伝子は成熟抗体遺伝子よりも種の中の個体の必須アミノ酸配列構造特性をより保存しそうであり、よってその種において治療のために使用する場合外来ソース由来と認識されにくいという認識から生ずる。

0040

本明細書中で使用されている用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される可変及び定常領域を有する抗体を含むと意図される。本発明のヒト抗体は、例えばCDR、特にCDR3中のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列(例えば、インビトロでランダムまたは部位特異的変異誘発により、またはインビボで体細胞突然変異により導入される突然変異)によりエンコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、本明細書中で使用されている用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種(例えば、マウス)の生殖細胞系から誘導されるCDR配列がヒトフレームワーク配列にグラフト化されている抗体を含むと意図されない。

0041

用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種(例えば、マウス)由来の重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、VH及び/またはVL配列の少なくとも一部がより「ヒト様」であるように、すなわちヒト生殖細胞系可変配列により類似するように改変されている抗体を指す。ヒト化抗体の1つのタイプは、対応する非ヒトCDR配列を置換するためにヒトCDR配列が非ヒトVH及びVL配列に導入されているCDRグラフト化抗体である。ヒト化抗体には、対象抗原免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク(FR)領域及び実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)を含む抗体、或いはそのバリアント、誘導体、アナログまたは断片である。CDRの関連で、本明細書中で使用されている用語「実質的に」は、非ヒト抗体CDRのアミノ酸配列に対して少なくとも50、55、60、65、70、75または80%、特に少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を有するCDRを指す。ヒト化抗体は、CDR領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリン(すなわち、ドナー抗体)のものに相当し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメイン(Fab、Fab’、F(ab’)2、FabC、Fv)の実質的にすべてを含む。特に、ヒト化抗体は免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくも一部をも含む。幾つかの実施形態では、ヒト化抗体は軽鎖及び重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含む。抗体は重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3及びCH4領域をも含み得る。幾つかの実施形態では、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含む。幾つかの実施形態では、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含む。特定実施形態では、ヒト化抗体は軽鎖のヒト化可変ドメイン及び/またはヒト化重鎖のみを含む。

0042

ヒト化抗体は、IgY、IgM、IgG、IgDIgA及びIgEを含めた免疫グロブリンのクラス、及び非限定的にIgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含めたイソタイプから選択され得る。ヒト化抗体は1つ以上のクラスまたはイソタイプ由来の配列を含み得、特定定常ドメインは当業界で公知の技術を用いて所望のエフェクター機能を最適化するために選択され得る。

0043

ヒト化抗体のフレームワーク及びCDR領域は親配列と正確に対応していなくてもよい。例えば、部位のCDRまたはフレームワーク残基がドナー抗体またはコンセンサスフレームワークに対応しないようにドナー抗体CDRまたはコンセンサスフレームワークが少なくとも1つのアミノ酸残基の置換、挿入及び/または欠失により突然変異されていてもよい。しかしながら、特定実施形態では、突然変異は大規模でない。ヒト化抗体残基の通常少なくとも50、55、60、65、70、75または80%、特に少なくとも85%、より特に少なくとも90%、最も特に少なくとも95%が親FR及びCDR配列の残基に対応している。本明細書中で使用されている用語「コンセンサスフレームワーク」はコンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。本明細書中で使用されている用語「コンセンサス免疫グロブリン配列」は、関連する免疫グロブリン配列のファミリー中に最も頻繁に存在しているアミノ酸(または、ヌクレオチド)から形成される配列を指す(例えば、Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany,1987を参照されたい)。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列中の各位置は前記ファミリー中のその位置に最も頻繁に存在しているアミノ酸で占められている。2つのアミノ酸がしばしば等しく存在しているならば、コンセンサス配列中にいずれかが含まれ得る。

0044

用語「ヒトRGMA」(本明細書中、hRGM Aと略す)は、450アミノ酸を有するグリコシルホスファチジルイノシトール(gpi)アンカー糖タンパク質を指し、最初トポグラフィック投射発生過程中の神経突起成長忌避剤または神経突起成長阻害剤として記載された(Stahlら,Neuron,5:735−43,1990;Mueller,Molecular Basis of Axon Growth and Nerve Pattern Formation,H.Fujisawa編,Japan Scientific Societies Press,215−229,1997)。rgm遺伝子ファミリーは3つの異なる遺伝子を包含し、このうちの2つrgm a及びbは哺乳動物CNSにおいて発現され、第3メンバーのrgm cは末梢において発現され、そこで鉄代謝において重要な役割を果たす(Muellerら,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513−29,2006)。ヒトRGMタンパク質は43%〜50%の配列同一性を有する。ヒト及びラットRGM Aのアミノ酸相同性は89%である。ヒトRGMタンパク質は他の公知のタンパク質と有意な配列相同性を共有していない。ヒトRGMタンパク質はRGD領域を含む富プロリンタンパク質であり、ヴァン・ヴィレブランド因子ドメインに対して構造相同性を有し、N末端アミノ酸168で未知プロテアーゼにより開裂されて機能活性タンパク質を生ずる(Muellerら,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513−29,2006)。

0045

インビトロで、RGMAはRGM受容体として同定されたネオゲニンに対して結合することによりピコモル濃度で神経突起伸長を阻害する(Rajagopalanら,Nat Cell Biol.,6(8),756−62,2004)。ネオゲニンは最初ネトリン結合タンパク質として記載されていた(Keino−Masuら,Cell,87(2):175−85,1996)が、ネトリンに対するその親和性(Kd=2nM)はRGMに対する親和性(Kd=0.2nm)よりも1桁低い(Rajagopalanら,Nat.Cell Biol.,6(8),756−62,2004)。ネトリン−1のネオゲニンまたはその均密に関連する受容体DCC(大腸癌で欠失している)に対する結合が神経突起成長を阻害するよりもむしろ刺激すると報告されているので(Braistedら,J.Neurosci.,20:5792−801,2000)、このことは重要な所見である。

0046

RGMAのネオゲニンに対する結合及び神経突起成長阻害の誘導に加えて、RGM AまたはBの骨形態形成タンパク質BMP−2及びBMP−4に対する結合はうまくいく神経再生及び機能回復に対する別の障害に相当する(Muellerら,Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.,361:1513−29,2006)。両クラスのタンパク質(ネオゲニン及びBMP)は2つの完全に異なる独立のシグナル伝達経路を介してRGM Aの神経突起成長阻害シグナルを伝達すると報告されている。通常、これらのBMPタンパク質の発現は成体CNSの多くの領域で比較的低いが、幾つかのBMP(例えば、BMP−2、BMP−6、BMP−7)の発現及び蓄積が損傷及び傷害に応答して急速に増加すると報告されている(Laiら,Neuroreport,8:2691−94,1997;Martinezら,Brain Res.,894:1−11,2001;Hall and Miller,J.Neurosci.Res.,76:1−8,2004;Setoguchiら,Exp.Neurol.,189:33−44,2004)。加えて、多発性硬化症のモデルの実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおいて、BMP−4、BMP−6及びBMP−7はマウス脊髄でアップレギュレートされた(Araら,J.Neurosci.Res.,86:125−35,2008)。BMP−2は、細胞表面RGM A、BMP受容体I及びIIに対して結合させることより及びLIMキナーゼを直接活性化することにより神経突起成長を阻害すると報告されており(Matsuuraら,Biochem Biophys Res Commun.,360:868−73,2007)、従ってRGM A−BMP−2相互作用をブロックするとCNS損傷後の機能回復が更に向上すると期待される。

0047

上記したように、脊髄損傷されているラット及び脳損傷のヒトは損傷部位に細胞RGMの大量蓄積を示し、ラットにおける脊髄病変部位のRGM Aの染色パターンはヒトにおけるpan RGM抗体染色に非常に類似している。このことから、ヒトにおけるpan RGM染色の多くはRGM A局在化に関連しているが、RGMB局在化に関連していないことが示唆される(Schwabら,Arch.Neurol.,62:1561−8,2005a;Schwabら,Eur.J.Neurosci.,21:1569−76,2005b;Hataら,J.Cell Biol.,173:47−58,2006)。健康なヒトの脳では、pan RGM染色(RGM A及びB免疫反応性)が白質線維、乏突起神経膠細胞、幾つかのニューロンの核周部、幾つかの血管平滑筋及び数個内皮細胞で検出された。星状膠細胞の染色は観察されなかった。健康な成人脳でのRGM染色パターンは成体ラット脊髄で観察された染色パターンに非常に類似している(Schwabら,Eur.J.Neurosci.,21:1569−76,2005b;Hataら,J.Cell Biol.,173:47−58,2006)。

0048

脳及び脊髄損傷の病変部位でのRGMAの蓄積に基づいて、その細胞神経突起成長阻害活性のために、タンパク質は神経突起成長阻害活性を示し、そのヒトRGM Aの少なくとも1つのエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片による中和により、損傷された神経線維の改良された再成長及び神経線維損傷及びRGM蓄積により特徴づけられる適応症での機能回復の強化が生ずると予想される。

0049

用語「RGMA」は他の種(例えば、マウスまたはラットのような齧歯類)から単離または得られるRGM A分子をも包含し、特にラット誘導分子は本明細書中「ラットRGM A」と呼称される。

0050

0051

用語「RGMのその受容体の1つに対する結合の阻害」は、受容体結合活性の部分的(例えば、約20%、40%、60%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上)または完全低下を包含する。「結合の阻害」は当業界で利用可能な適当な方法により、特に本明細書中に例示されている方法(例えば、ELISAに基づく結合アッセイ)により調べられ得る。

0052

本明細書中で使用されている「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体(例えば、hRGMAに特異的に結合する単離抗体はhRGM A以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)を指すと意図される。しかしながら、hRGM Aに特異的に結合する単離抗体は他の種由来のRGM A分子のような他の抗原に対して交差反応性を有することがある。更に、単離抗体は他の細胞材料及び/または化学物質を実質的に含まなくてもよい。

0053

用語「単離ポリヌクレオチド」は、(例えば、ゲノムcDNAまたは合成起源、或いはその幾つかの組合せの)ポリヌクレオチドを意味し、その起源により「単離ポリヌクレオチド」は「単離ポリヌクレオチド」が天然で存在するポリヌクレオチドの全部または一部と結合しておらず;天然で連結していないポリヌクレオチドに機能し得る形で連結しており;または、大きな配列の一部として天然に存在していない。

0054

用語「単離タンパク質」または「単離ポリペプチド」は、誘導のその起源またはソースによって天然状態付随している天然結合成分と結合しておらず;同一種由来の他のタンパク質を実質的に含まず;異なる種由来の細胞により発現され;または天然に存在しないタンパク質またはポリペプチドである。よって、化学的に合成されるかまたは本来の起源の細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは天然結合成分から単離されている。タンパク質は当業界で公知のタンパク質精製技術を用いて単離することにより天然結合成分を実質的に含まないようにし得る。

0055

用語「カバットナンバリング」、「カバット定義」及び「カバットラベリング」は本明細書中で互換可能に使用されている。当業界で認識されているこれらの用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域中の他のアミノ酸残基よりもより可変性(すなわち、高度可変性)であるアミノ酸残基をナンバリングするシステムを指す(Kabatら(1971)Ann.NY Acad.Sci.,190:382−391及びKabat,E.A.ら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91−3242)。重鎖可変領域の場合、高度可変領域はCDR1についてアミノ酸位置31−35、CDR2についてアミノ酸位置50−65、及びCDR3についてアミノ酸位置95−102の範囲である。軽鎖可変領域の場合、高度可変領域はCDR1についてアミノ酸位置24−34、CDR2についてアミノ酸位置50−56、及びCDR3についてアミノ酸位置89−97の範囲である。

0056

用語「Kd」は当業界で公知のように特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指す。

0057

用語「キー残基」は、可変領域内の、抗体(特に、ヒト化抗体)の結合特異性及び/または親和性に対してより多くの影響を有するある残基を指す。キー残基には、CDRに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位(N−またはO−グリコシル化部位であり得る)、レア残基、抗原と相互作用し得る残基、CDRと相互作用し得る残基、カノニカル残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基、バーニアゾーン内の残基、及び可変重鎖CDR1のクロチア定義と第1重鎖フレームワークのカバット定義間で重複する領域中の残基の1つ以上が含まれるが、これらに限定されない。

0058

用語「kon」は、当業界で公知のように抗体/抗原複合体を形成するための抗体の抗原に対する会合に対するオン速度定数を指す。

0059

用語「k0ff」は、当業界で公知のように抗体/抗原複合体からの抗体の解離に対するオフ速度定数を指す。

0060

用語「標識された結合タンパク質」は、結合タンパク質の同定を与える組み込んだ標識を有するタンパク質を指す。特に、標識は検出可能なマーカー、例えば放射標識されたアミノ酸の取り込みまたはマークしたアビジン(例えば、光学または比色方法により検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン)により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合である。ポリペプチドに対する標識の例には、放射性同位元素または放射性核種(例えば、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Hoまたは153Sm);蛍光標識(例えば、FITCローダミンランタニド燐光体)、酵素標識(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼルシフェラーゼアルカリホスファターゼ);化学発光マーカー;ビオチニル基;第2リポーターにより認識される前決定したポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、第2抗体に対する結合部位金属結合ドメインエピトープタグ);及び磁気物質(例えば、ガドリニウムキレート)が含まれるが、これらに限定されない。

0061

用語「局所治療」は、本発明の結合タンパク質または該タンパク質を含む処方物を所望の神経保護または神経再生作用を誘導することが意図されている治療対象の哺乳動物の身体の意図する領域に直接投与する形態を指す。

0062

用語「モジュレートする」及び「調節する」は互換可能に使用されており、対象分子の活性(例えば、hRGMAの生物活性)の変化または改変を指す。モジュレーションは対象分子のある活性または機能の大きさの増加または低下であり得る。分子の活性及び機能の例には、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化及びシグナル伝達が含まれるが、これらに限定されない。

0063

相応して、用語「モジュレーター」は対象分子の活性または機能(例えば、hRGMAの生物活性)を変化または改変させることができる化合物である。例えば、モジュレーターは、分子のある活性または機能の大きさをモジュレーターの非存在下で観察される該活性または機能の大きさと比較して増加または低下させ得る。本明細書中で使用されている用語「アゴニスト」は、対象分子と接触したとき分子のある活性または機能の大きさをアゴニストの非存在下で観察される該活性または機能の大きさと比較して増加させるモジュレーターを指す。特定の対象アゴニストには、hRGM A、或いはhRGM Aに結合するポリペプチド、核酸、炭水化物または他の分子が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で使用されている用語「アンタゴニスト」は、対象分子と接触したとき分子のある活性または機能の大きさをアンタゴニストの非存在下で観察される該活性または機能の大きさと比較して低下させるモジュレーターを指す。アンタゴニストの例には、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物または小さい有機分子が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディは、例えばWO 01/83525に記載されている。

0064

特定の対象アンタゴニストには、hRGMAの生物学的または免疫学的活性をブロックまたはモジュレートするものが含まれる。hRGM Aのアンタゴニストには、hRGM Aに結合するタンパク質、核酸、炭水化物または他の分子(例えば、RGM A分子と相互作用するモノクローナル抗体)が含まれるが、これらに限定されない。RGM Aとの相互作用により他のリガンド細胞膜コンポーネントの結合及び中和が生じ、複数の疾患を防ぐために相和的または相乗的に機能させるために有用であり得ることに注目すべきである。

0065

用語「モノクローナル抗体」は、異なる抗体の混合物を含む「ポリクローナル抗体」調製物とは対照的に、共通の重鎖及び共通の軽鎖アミノ酸配列を共有する抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、ファージ、細菌、酵母またはリボソームディスプレーのような幾つかの新規テクノロジー、並びにハイブリドーマ−誘導抗体(例えば、標準のKohler and Milsteinハイブリドーマテクノロジー((1975)Nature,256:495−497)のようなハイブリドーマテクノロジーにより作成されるハイブリドーマより分泌される抗体)により例示される古典的方法により作成され得る。

0066

完全長抗体において、各重鎖は重鎖可変領域(本明細書中、HCVRまたはVHと略す)及び重鎖定常領域から成る。重鎖定常領域は3つのドメインCH1、CH2及びCH3から成る。各軽鎖は軽鎖可変領域(本明細書中、LCVRまたはVLと略す)及び軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は1つのドメインCLから成る。VH及びVL領域は更に相補性決定領域(CDR)と称される高度可変性の領域に分割され得、CDRにはフレームワーク領域(FR)と称されるより保存性の領域が点在している。VH及びVLの各々は、アミノ末端からカルボキシ末端にFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順で配置されている3つのCDR及び4つのFRから構成されている。免疫グロブリン分子は任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)またはサブクラスを有し得る。

0067

用語「神経保護的」または「神経保護」は、ニューロン細胞、特にRNFLの細胞からなる細胞をダメージまたは変性から保護する治療(網膜中のRGC(網膜神経節細胞)軸索の変性からの保護、または上に規定したRNFL厚さの低下から測定可能な「異常な」RNFL変性の阻害を観察することにより分析可能である)を指す。

0068

用語「神経再生的」または「神経再生」は、ニューロン細胞、特にダメージを受けたRNFLの細胞を含む細胞の修復または再成長(例えば、視神経の拡散テンソル画像法である網膜の光干渉断層法(OCT)により分析可能である)、網膜ニューロン発芽をもたらす本発明に従う治療を指す。

0069

用語「中和する」は、結合タンパク質が標的タンパク質に特異的に結合するときの標的タンパク質の生物活性の中和を指す。中和するは、結合タンパク質の標的への各種様式の結合の結果であり得る。例えば、中和するは、標的分子への受容体結合に影響を与えない標的の領域での結合タンパク質の結合により生じ得る。或いは、結合タンパク質の結合により、標的に対する受容体結合の阻止が生じ得、この阻止は最終的に標的タンパク質活性を中和する。中和結合タンパク質は、そのhRGMAへの結合によりhRGM Aの生物活性を中和させる中和抗体である。特に、中和結合タンパク質はhRGM Aに結合し、hRGM Aの生物活性を少なくとも約20%、40%、60%、80%、85%、またはそれ以上低下させる。hRGMの生物活性の中和結合タンパク質による中和は当業界で公知のhRGM A生物活性の1つ以上の指標を測定することにより評価され得る。例えば、hRGM Aを中和すると、Nteraニューロン伸長アッセイにおいて阻害が逆転する(以下の実施例3を参照されたい)。Ntera神経突起成長アッセイは神経突起伸長の阻害を検討する。阻害性RGM Aタンパク質または断片の非存在下及び伸長刺激基質ラミニンの存在下で、ニューロンNTera凝集物は伸長している神経突起広範囲の濃密なネットワークを示す。RGM AまたはRGM A断片は神経突起伸長を阻害し、それにより神経突起の長さ及び数が減少する。機能阻止性RGM AアンタゴニストまたはMAB(例えば、mAb 5F9)は、分化したヒトNTeraニューロンの凝集物を用いる神経突起成長アッセイにおいてヒトRGM Aタンパク質の強力なfcコンジュゲートしたhRGM A軽鎖断片(アミノ酸47−168)の神経突起伸長阻害活性を中和し、これにより神経突起の長さ及び数は大きく増加する。

0070

用語「中和モノクローナル抗体」は、特定抗原に結合すると該抗原に対する天然リガンドの結合と競合し、阻害することができる抗体分子の調製物を指す。本発明の特定実施形態では、本発明の中和抗体は、ネオゲニン及び/またはBMP−2及び/またはBMP−4に対する結合についてRGMAと競合し、RGM A生物活性または機能を妨げることができる。特に、本発明の中和抗体は、ネオゲニン及び/またはBMP−2及び/またはBMP−4に対する結合を妨げ、RGM A生物活性または機能を妨げるためにRGM Aと結合することができる。用語「活性」には、活性、例えば抗原に対する抗体(例えば、RGM A抗原に結合する抗hRGM A抗体)の結合特異性/親和性、及び/または抗体(例えば、実験セクションに下記されているhRGM A−ネオゲニン結合アッセイ、hRGM A−BMP−2結合アッセイまたはhRGM A−BMP−4結合アッセイで測定されるようなhRGM Aに対するその結合がhRGM Aの生物活性を阻害する抗hRGM A抗体)の中和力価が含まれる。

0071

RGMAの生物活性は細胞遊走の調節として記載され得る。細胞遊走の具体例は、RGM Aタンパク質により妨害または阻害される神経突起成長である。加えて、RGMタンパク質がBMPタンパク質の活性をモジュレートすることは判明している。今まで公表されている例は、片側のBMP経路に対するRGMタンパク質の活性の相乗的強化活性及びBMP経路に対するRGMタンパク質の阻害活性を記載し、これは鉄代謝の調節、骨及び軟骨再生のために重要であり、再ミエリン形成及び再生のためにCNSにおいて重要である。

0072

用語「機能し得る形で連結された」は、記載されているコンポーネントが意図する様式で機能し得る関係にある並置を指す。コード配列に「機能し得る形で連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合し得る条件下で達成されるように連結されている。「機能し得る形で連結された」配列には、対象遺伝子に連続する発現制御配列及び対象遺伝子を制御するようにトランスでまたは少し離れて作用する発現制御配列が含まれる。本明細書中で使用されている用語「発現制御配列」は、連結されているコード配列の発現及びプロセッシング生起するために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列には、適切な転写開始終結プロモーター及びエンハンサー配列;効率的なRNAプロセッシングシグナル、例えばスプライシング及びポリアデニル化シグナル細胞質mRNAを安定化させる配列;翻訳効率を高める配列(すなわち、コザックのコンセンサス配列);タンパク質安定性を高める配列;及び所望ならば、タンパク質分泌を高める配列が含まれる。制御配列の種類は宿主生物に依存して異なる。原核生物では、制御配列は通常プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含む。真核生物では、制御配列は通常プロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」はその存在が発現及びプロセッシングのために必須であるコンポーネントを含むと意図され、その存在が有利である追加のコンポーネント、例えばリーダー配列及び融合パートナー配列をも含み得る。

0073

用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかの2つ以上のヌクレオチドのポリマー形態、または各タイプのヌクレオチドの修飾形態を意味する。この用語はDNAの一本鎖及び二本鎖形態を含むが、特に二本鎖DNAである。

0074

用語「ポリペプチド」はアミノ酸のポリマー鎖を指す。用語「ペプチド」及び「タンパク質」は用語「ポリペプチド」と互換可能に使用されており、アミノ酸のポリマー鎖を指す。用語「ポリペプチド」は天然または人工タンパク質タンパク質断片、及びタンパク質配列ポリペプチドアナログを包含する。ポリペプチドはモノマーまたはポリマーであり得る。

0075

用語「組換え宿主細胞」(または、単に「宿主細胞」)は、外来性DNAが導入されている細胞を指すと意図される。この用語は特定の被験者細胞だけでなく、前記細胞の子孫を指すと意図されると理解されるべきである。突然変異または環境的影響のためにある修飾は次世代で起こり得るので、子孫は実際親細胞と同一でないことがあるが、なお本明細書中で使用されている用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。特に、宿主細胞には生物界から選択される原核及び真核細胞が含まれる。具体的真核細胞には、原生生物真菌、植物及び動物細胞が含まれる。最も特に、宿主細胞には原核細胞大腸菌哺乳動物細胞株CHO、HEK 293及びCOS;昆虫細胞株Sf9;及び真菌細胞サッカロミセスセレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)が含まれるが、これらに限定されない。

0076

組換えDNAオリゴヌクレオチド合成、組織培養及び形質転換(例えば、エレクトロポレーションリポフェクション)のために標準技術を使用し得る。酵素反応及び精製技術は製造業者の仕様書に従って、または当業界で通常実施されているかまたは本明細書中に記載されているように実施され得る。前記した技術及び手順は通常当業界で公知の慣用方法に従って、本明細書中に引用され、検討されている各種一般文献及びより具体的な文献に記載されているように実施され得る。例えば、参照により本明細書に組み入れるSambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))を参照されたい。

0077

本明細書中で使用されている用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段により産生、発現、作成または単離されるすべてのヒト抗体、例えば宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体(以下のセクションIIに更に記載されている);組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体(Hoogenboom H.R.(1997)TIB Tech.,15:62−70;Azzazy H. and Highsmith W.E.(2002)Clin.Biochem.,35:425−445;Gavilondo J.V. and Larrick J.W.(2002)BioTechniques,29:128−145;Hoogenboom H. and Chames P.(2000)Immunology Today,21:371−378);ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックな動物(例えば、マウス)から単離した抗体(例えば、Taylor,L.D.ら(1992)Nucl.AcidsRes.,20:6287−6295;Kellermann S−A. and Green L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology,13:593−597;Little M.ら(2000)Immunology Today,21:364−370を参照されたい);またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のDNA配列へのスプライシングを含む他の手段により作成、発現、作成または単離される抗体を含むと意図される。組換えヒト抗体はヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される可変及び定常領域を有する。しかしながら、ある実施形態では、組換えヒト抗体をインビトロ変異誘発にかけ(または、ヒトIg配列に対してトランスジェニックな動物を使用するときにはインビボ体細胞変異誘発)、よって組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列はヒト生殖細胞系VH及びVL配列から誘導され、関連しているが、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に本来存在していないことがある配列である。

0078

用語「回収する」は、ポリペプチドのような化学種を単離により、例えば当業界で公知のタンパク質精製技術を用いて天然結合成分を実質的に含まないようにするプロセスを指す。

0079

用語「RNFL」は網膜の最内層であり、主に視神経を構成する神経節細胞ニューロン由来の軸索から構成されている。網膜層構造は最内RNFL、次いで内網状層(IPL)、外網状層(OPL)、光受容器層(PRL)及び網膜色素上皮(RPE)からなる。健康な個人の場合、RNFLは15才まで約110〜120μmの厚さしかなく、多くの正常な個人では網膜の厚さが約0.017%/年ずつ低下し、60才を超えると約10〜20μmに等しい厚さになる(RNFLの厚さの変化は、例えば上掲のFrohmanらに記載されているOCT方法により測定され得る)。こうした厚さの低下は「正常な」RNFL変性とも称され得る。

0080

「正常な」変性を超えるまたはそれ以上の変性または厚さの低下は「異常な」または「病気に関連する」RNFL変性とも称され得る。特に、厚さの異常な低下は1年あたり0.017%を超える(例えば、1年あたり0.02%を超える、0.1%を超える、1%を超える、5%を超える、10%を超える、または20%を超える)、例えば1月あたり1〜10%または2〜5%であり得る。

0081

用語「RNFL変性」は、RNFLの正常な及び特に異常な病気に関連する厚さの低下を包含する。

0082

用語「サンプル」は広義に使用されている。本明細書中で使用されている「生体サンプル」には、ある量の生き物または以前生きていた物由来の物質が含まれるが、これらに限定されない。生き物には、ヒト、マウス、ラット、サルイヌ家兎及び他の動物が含まれるが、これらに限定されない。前記物質には、血液、血清、尿、滑液、細胞、臓器、組織、骨髄リンパ節及び脾臓が含まれるが、これらに限定されない。

0083

抗体、タンパク質またはペプチドの第2化学種との相互作用に関連して本明細書中で使用されている用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、相互作用が化学種上の特定構造物(例えば、以下に定義する「抗原決定基」または「エピトープ」)の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は一般的にタンパク質よりもむしろ特定のタンパク質構造物を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ“A”に対して特異的であるならば、標識“A”及び抗体を含む反応においてエピトープA(すなわち、遊離非標識A)を含有する分子が存在すると抗体に結合した標識Aの量が減少する。

0084

用語「表面プラズモン共鳴」は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を例えばBIAcore(登録商標)システム(Pharmacia Biosensor AB,スウェーデン国ウプサラ及びニュージャージーピスカタウェイ)を用いて検出することによりリアルタイム生物特異的相互作用を分析することができる光学現象を指す。更なる説明のために、Jonsson,U.ら(1993)Ann.Biol.Clin.,51:19−26;Jonsson,U.ら(1991)Biotechniques,11:620−627;Johnsson,B.ら(1995)J.Mol.Recognit.,8:125−131;及びJohnnson,B.ら(1991)Anal.Biochem.,198:268−277を参照されたい。

0085

用語「全身治療」は、本発明の結合タンパク質を血流を介して神経保護または神経再生作用の意図する場所に到達させるための本発明の結合タンパク質または該タンパク質を含有する処方物の治療対象の哺乳動物の身体への任意の形態の投与を指す。例えば、全身投与は本発明の結合タンパク質または該タンパク質を含有する処方物の注入または注射を包含する。

0086

「形質転換」は、外来性DNAを宿主細胞に入れるプロセスを指す。形質転換は当業界で公知の各種方法を用いて自然または人工条件下で起こり得る。形質転換は外来核酸配列を原核または真核宿主細胞に挿入するための公知方法に頼り得る。方法は形質転換しようとする宿主細胞に基づいて選択され、その中にはウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション及び粒子衝突が含まれるが、これらに限定されない。「形質転換された」細胞には、挿入されたDNAが自律複製プラスミドとしてまたは宿主染色体の一部として複製することができる安定的に形質転換された細胞が含まれる。挿入されたDNAまたはRNAを限られた期間一時的に発現している細胞も含まれる。

0087

用語「トランスジェニック生物」は、トランスジーンを含む細胞を有する生物を指し、生物(または、生物の先祖)に導入されたトランスジーンは生物では本質的に発現しないポリペプチドを発現する。「トランスジーン」は、トランスジェニック生物の1つ以上の細胞型または組織におけるコード化遺伝子産物の発現を指向すべくトランスジェニック生物を発生させる細胞のゲノムに安定的に機能し得る形で組み込まれるDNA構築物である。

0088

用語「RNFL変性の治療」は、RNFL変性の治療上(すなわち、急性)及び予防上治療の両方を指す、治療は「神経再生的」または「神経保護的」であり得る。治療は「局所」または「全身」治療の形態であり得る。

0089

用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。1つのタイプのベクターは、追加DNAセグメントが連結され得る環状二本鎖DNAループを指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、追加のDNAセグメントがウイルスゲノムに連結され得るウイルスベクターである。あるベクターは、該ベクターが導入されている宿主細胞において自律複製し得る(例えば、複製の細菌起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は宿主細胞に導入したときその宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、よって宿主細胞ゲノムと共に複製される。更に、あるベクターは機能し得る形で連結された遺伝子の発現を指向させることができる。前記ベクターを本明細書では「組換え発現ベクター」(または、単に「発現ベクター」)と称する。通常、組換えDNA技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態を有している。プラスミドは最も一般的に使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」及び「ベクター」は本明細書中互換可能に使用され得る。しかしながら、本発明は、均等の機能を発揮する他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター(例えば、複製欠陥レトロウイルスアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)を含むと意図される。

0090

用語「バーニアゾーン」は、Foote and Winter(参照により本明細書に組み入れる1992,J.Mol.Biol.,224:487−499)に記載されているようにCDR構造に隣接し、抗原への適合を微調節し得るフレームワーク残基の部分集合を指す。バーニアゾーン残基はCDRの下にある層を形成し、CDRの構造及び抗体の親和性に影響を与え得る。

0091

2.RGMA抗体の使用
RGM Aに対する中和モノクローナル抗体は、RGM Aのその受容体ネオゲニンに対する結合及びRGM Aの骨形態形成タンパク質2及び4(BMP−2、BMP−4)に対する結合を選択的に阻害する。中和モノクローナル抗体は、視神経損傷のインビボラットモデルにおいて損傷またはダメージを受けた神経線維の再成長及び再生神経線維の機能的シナプスの形成を刺激し、視長距離再生を誘導し、また病変及び再生神経線維の再ミエリン形成を強化する(PCT/EP2009/001437を参照されたい)。

0092

驚くことに、RGMAに対する抗体は追加のまだ認識されていないRNFLに対する直接治療効果に関連することが観察された。特に、RNFL変性を伴うまたはRNFL変性のリスクを有する眼病を患っている患者を本明細書中に記載されている抗体分子で治療し得る。本発明は、全身投与した本発明の抗体は網膜中に局在化し、眼の患部に直接有益な効果を発揮するという驚くべき所見にも基づいている。

0093

よって、本発明では、RNFL変性からの保護を目的とし、または既に変性されているRNFLの再生を目的とする患者の特定群をRGMAに結合できる抗体を用いて直接治療する方法が初めて提供される。

0094

別の実施形態は、複数の病状で見られるRNFL変性のRGMAに結合できる抗体を用いる神経保護的治療に関する。

0095

別の実施形態は、RNFL変性の治療のためのRGMAをブロックし、RGM Aとその受容体及び/または結合タンパク質(すなわち、ネオゲニン及びBMP−2、BMP−4)間の相互作用を妨げるモノクローナル抗体の使用に関する。

0096

本発明の別の実施形態は、RNFL変性の治療において使用するためのヒトRGMAに対する結合タンパク質に関する。

0097

別の実施形態では、治療は治療上または予防上の神経再生的または神経保護的局所または全身治療である。

0098

別の実施形態では、治療の結果として、
a)網膜ニューロン発芽が観察される;及び/または
b)網膜中のRGC(網膜神経節細胞)軸索が変性から保護される。

0099

1つの態様によれば、本発明は、RNFL変性の治療に使用するための、両方とも表面プラズモン共鳴により測定して1×10−7M以下のKD及び1×10−2s−1以下のkoff速度定数でヒトRGMA(hRGM A)から解離する結合タンパク質を提供する。

0100

別の態様によれば、本発明は、RNFL変性の治療に使用するための、標準インビトロアッセイ(例えば、下記実施例3に例示されているNteraニューロン伸長アッセイ)で測定してヒトRGMAに結合し、ヒトRGM Aの神経突起伸長阻害活性を中和する結合タンパク質、例えば上記カイネティック特徴を示す結合タンパク質に関する。

0101

別の実施形態は、次の追加の機能特性
ラットRGMAに対する結合;
ヒトRGM Cに対する結合;及び
ラットRGM Cに対する結合;
の少なくとも1つを有する上に規定した使用のための結合タンパク質にも関する。

0102

別の実施形態では、本明細書中に規定されている結合タンパク質はRGMのその受容体の少なくとも1つに対して結合する能力をモジュレートする。前記結合タンパク質はヒトRGM Aの受容体結合ドメインに結合する。RGM Aの場合、N及びC末端受容体結合ドメインは同定されている。本発明の結合タンパク質の特定実施形態は、N末端hRGM A断片(例えば、47−168)と受容体分子(例えば、ネオゲニン及びBMP−4)間の結合の阻害により例示されるようにRGM AのN末端受容体結合ドメインに結合する。N末端hRGM A断片は約30〜約150または約30〜約122アミノ酸残基の全長を有し得る。非限定例として、本明細書中に記載されているhRGM Aの断片0(N末端残基47−168に対応する)またはより短い受容体結合断片を挙げ得る。

0103

別の実施形態では、前記結合タンパク質は、次の相互作用:
ヒトRGMAのヒトBMP−4に対する結合;
hRGM Aのヒトネオゲニンに対する結合;
hRGM Cのヒトネオゲニンに対する結合;
ヒトRGM AのヒトBMP−2に対する結合;
の少なくとも1つをモジュレートまたは阻害する。

0104

特定実施形態によれば、本明細書中に規定されている結合タンパクはヒト化抗体である。

0105

上記した結合タンパク質は抗原結合ドメインを有し得、前記結合タンパク質はRGM分子のエピトープに結合することができ、前記抗原結合ドメインは
GTTPDY(配列番号59);
QATHDPLT(配列番号62);
RRNEYYGSSFFDY(配列番号65);
LQGYIPPRT(配列番号68);及び
前記配列の1つに対して少なくとも50%の配列同一性を有する修飾CDRアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む。別の実施形態では、本発明は抗原結合ドメインを含む結合タンパク質に関し、前記結合タンパク質はRGM分子のエピトープに結合することができ、前記抗原結合ドメインは
GTTPDY(配列番号59);
FQATHDPLT(配列番号62);
ARRNEYYGSSFFDY(配列番号65);
LQGYIPPRT(配列番号68);及び
前記配列の1つに対して少なくとも50%の配列同一性(例えば、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95%の同一性)を有する修飾CDRアミノ酸配列;
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む。

0106

例えば、結合タンパク質は前記CDRの2つ(例えば、配列番号59と62、または配列番号65と68)を含み得、前記CDRの少なくとも1つは前記配列の1つに対して少なくとも50%の配列同一性(例えば、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95%の同一性)を有し、修飾されていてもよい。

0107

結合タンパク質は、更に配列番号57、58、60、61、63、64、66、67、及び前記配列の1つに対して少なくとも50%の配列同一性(例えば、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95%の同一性)を有する修飾CDRアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む。

0108

別の実施形態では、少なくとも1つのCDRは、

0109

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

0110

別の実施形態では、結合タンパク質は、

0111

から構成される可変ドメインCDR組から選択される少なくとも3つのCDR、或いは前記した3つのCDRの少なくとも1つが親配列に対して少なくとも50%の配列同一性(例えば、少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95%の同一性)を有する修飾CDRアミノ酸配列である可変ドメイン組を含む。

0112

上記修飾の各々は、1つまたは複数のアミノ酸付加、欠失、または特に置換、或いはその組合せにより生じ得る。

0113

別の実施形態では、結合タンパク質は少なくとも2つの可変ドメインCDR組を含む。

0114

前記した少なくとも2つの可変ドメインCDR組は
VH 5F9組とVL 5F9組;及び
VH 8D1組とVL 8D1組;
からなる群から選択される。

0115

本発明の別の実施形態に従って使用される結合タンパク質は更にヒトアクセプターフレームワークを含む。

0116

ヒトアクセプターフレームワークは、配列番号15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32及び33からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含み得る。

0117

本発明の結合タンパク質は、以下の組:
(1)各々がJH3(配列番号18)、JH4(配列番号19)、JH6(配列番号20)から選択される更なるフレームワーク配列と組み合わされている
VH3−48組(配列番号15、16及び17)
VH3−33組(配列番号21、22及び23)
VH3−23組(配列番号24、25及び26);
または
(2)各々がJK2(配列番号2)から選択される更なるフレームワーク配列と組み合わされている
A18組(配列番号27、28及び29)
A17組(配列番号31、32及び33);
からなる群から選択される少なくとも1組のフレームワークを含み得る。

0118

上に規定されている結合タンパク質は、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42及び43から選択される少なくとも1つのCDRグラフト化重鎖可変ドメイン及び/または配列番号44、45及び46から選択される少なくとも1つのCDRグラフト化軽鎖可変ドメインを含む。

0119

本発明の別の実施形態に従って使用される結合タンパク質は2つの可変ドメインの組合せを含み、前記した2つの可変ドメインは
配列番号35と44、36と44、37と44、38と44、39と44、40と44、41と44、42と44、43と44;
配列番号35と45、36と45、37と45、38と45、39と45、40と45、41と45、42と45、43と45;
配列番号35と46、36と46、37と46、38と46、39と46、40と46、41と46、42と46、43と46;
から選択されるアミノ酸配列を有する。

0120

本発明の別の実施形態では、本発明に従って使用される結合タンパク質のヒトアクセプターフレームワークはキー残基での少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、前記キー残基は
CDRに隣接する残基;
グリコシル化部位残基;
レア残基;
RGMエピトープと相互作用し得る残基;
CDRと相互作用し得る残基;
標準的な残基;
重鎖可変領域と軽鎖可変領域間の接触残基;
バーニアゾーン内の残基;
パラグルタメートを形成することができるN末端残基;及び
コチア定義されている可変重鎖CDR1とカバット定義されている第1重鎖フレームワーク間で重複している領域中の残基;
からなる群から選択される。
キー残基は、
重鎖配列位置):1、5、37、48、49、88、98
軽鎖配列位置):2、4、41、51
からなる群から選択される。

0121

特定実施形態では、本発明の別の実施形態に従って使用される結合タンパク質はコンセンサスヒト可変ドメインであり、またはそれを含む。

0122

本発明の別の実施形態に従って使用される結合タンパク質の別の実施形態によれば、ヒトアクセプターフレームワークは少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列はヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも65%(例えば、少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98または99%)同一であり、ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも70アミノ酸残基(例えば、少なくとも75、80または85残基)を含む。

0123

特定実施形態によれば、本発明の別の実施形態に従って使用される結合タンパク質は、配列番号47、48、49、50(VHドメイン)からなる群から選択されるアミノ酸配列及び/または配列番号51、52、53及び54(VLドメイン)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのフレームワーク突然変異した可変ドメインを含む。

0124

特に、結合タンパク質は2つの任意にフレームワーク突然変異した可変ドメインを含み、前記した2つの可変ドメインは
配列番号47と44、47と45、47と46、47と51、47と52、47と53、47と54;
配列番号48と44、48と45、48と46、48と51、48と52、48と53、48と54;
配列番号49と44、49と45、49と46、49と51、49と52、49と53、49と54;
配列番号50と44、50と45、50と46、50と51、50と52、50と53、50と54;
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

0125

本発明の別の実施形態に従って使用される本明細書中に記載されている結合タンパク質はRGM分子から選択される少なくとも1つの標的に結合することができる。結合タンパク質はヒトRGM A及び場合によりヒトを起源とするまたはカニクイザル、ラット、ひよこ、カエル及び魚類を起源とする少なくとも1つの更なるRGM分子に結合することができる。例えば、結合タンパク質は追加的にラットRGM A、ヒトRGM C及び/またはラットRGM Cに結合し得る。

0126

本発明の別の実施形態に従って使用される結合タンパク質は、上に規定したRGM分子から選択される標的の生物学的機能をモジュレートすることができ、特に中和または阻害することができる。

0127

特に、本発明の別の実施形態に従って使用される結合タンパク質は、RGMが少なくとも1つのその受容体(例えば、ネオゲニン、及びBMP−2やBMP−4のようなBMP)に結合する能力をモジュレートし、特に阻害する。例えば、結合タンパク質は、次の相互作用:
ヒトRGM AのヒトBMP−4に対する結合;
hRGM Aのヒトネオゲニンに対する結合;
hRGM Cのヒトネオゲニンに対する結合;
ヒトRGM AのヒトBMP−2に対する結合;
の少なくとも1つをモジュレートし、特に減衰し、とりわけ阻害する。

0128

本明細書中に開示されている機能的特徴の各種組合せを有し、従って異なる機能的プロフィールを示す結合タンパクも本発明の範囲内である。前記プロフィールの非限定例を以下にリストする。

0129

0130

例えば、プロフィール1は本発明により提供される抗体5F9及び本明細書中に記載されているその誘導体により満たされる。

0131

例えば、プロフィール2は本発明により提供される抗体8D1及び本明細書中に記載されているその誘導体により満たされる。

0132

本発明の別の実施形態に従って使用される結合タンパク質は、RGM、特にヒト、カニクイザル、ラット、ひよこ、カエル及び魚類から選択されるRGM Aの少なくとも1つの生物学的活性を阻害することができる。

0133

本発明の別の実施形態に従って使用される結合タンパク質は、次のカイネティック特徴:
(a)標的に対して、表面プラズモン共鳴により測定して少なくとも約102M−1s−1、少なくとも約103M−1s−1、少なくとも約104M−1s−1、少なくとも約105M−1s−1、少なくとも約106M−1s−1、及び少なくとも約107M−1s−1からなる群から選択されるオン速度定数(kon);
(b)標的に対して、表面プラズモン共鳴により測定して多くとも約10−2s−1、多くとも約10−3s−1、多くとも約10−4s−1、多くとも約10−5s−1、及び多くとも約10−6s−1からなる群から選択されるオフ速度定数(koff);または
(c)標的に対して多くとも約10−7M、多くとも約10−8M、多くとも約10−9M、多くとも約10−10M、多くとも約10−11M、多くとも約10−12M、及び多くとも10−13Mからなる群から選択される解離定数(KD);
の1つ以上を有している。

0134

更なる態様によれば、本発明は上記した結合タンパク質を含む抗体構築物を使用し、前記抗体構築物は更にリンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインを含む。

0135

抗体構築物または結合タンパク質は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDRグラフト化抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体、二重可変ドメイン免疫グロブリン及び双特異性抗体からなる群から選択され得る。

0136

本発明の別の実施形態に従って使用される抗体構築物では、結合タンパク質は、
ヒトIgM定常ドメイン;
ヒトIgG1定常ドメイン;
ヒトIgG2定常ドメイン;
ヒトIgG3定常ドメイン;
ヒトIgG4定常ドメイン;
ヒトIgE定常ドメイン;
ヒトIgD定常ドメイン;
ヒトIgAl定常ドメイン;
ヒトIgA2定常ドメイン;
ヒトIgY定常ドメイン;及び
対応する突然変異定常ドメイン;
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。

0137

本発明の別の実施形態に従って使用される抗体構築物は、配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン定常ドメインを含む。

0138

別の態様によれば、本発明は本明細書中に記載されている抗体構築物を含む抗体コンジュゲートを使用し、前記抗体コンジュゲートは更に免疫接着分子、イメージング剤、治療薬及び細胞傷害剤からなる群から選択される物質を含み、前記物質は結合タンパク質に対してコンジュゲートされており、例えば共有結合されている。

0139

例えば、前記物質は放射性標識酵素、蛍光標識、発光標識生物発光標識、磁気標識及びビオチンからなる群から選択される。特に、イメージング剤は3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho及び153Smからなる群から選択される放射性標識である。

0140

例えば、前記物質は代謝拮抗物質アルキル化剤抗生物質増殖因子サイトカイン抗血管新生薬抗有糸分裂剤アントラサイクリン毒素及びアポトーシス剤からなる群から選択される治療薬または細胞傷害薬である。

0141

別の実施形態によれば、本発明の別の実施形態に従って使用される結合タンパク質はヒトグリコシル化パターンを有している。

0142

更に、本発明の別の実施形態に従って使用される結合タンパク質、抗体構築物及び抗体コンジュゲートは結晶として(結晶質形態で)、特に生物活性を保持している結晶として(結晶質形態で)存在し得る。前記結晶は担体を含まない医薬徐放性結晶である。結晶形態のために、結合タンパク質、抗体または抗体コンジュゲートは対応する可溶性相当物に比して長いインビボ半減期を有する。

0143

別の態様で、本発明は、本明細書中に記載されている結合タンパク質アミノ酸配列、抗体構築物アミノ酸配列及び抗体コンジュゲートアミノ酸配列をエンコードする単離核酸を提供する。

0144

本発明の別の実施形態は、本明細書中に記載されている単離核酸を含むベクターにも関する。特に、ベクターはpcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV及びpBJからなる群から選択される。

0145

本発明の別の実施形態は、前記ベクターを含む宿主細胞にも関する。特に、前記宿主細胞は原核細胞(例えば、大腸菌)であり、または真核細胞であり、原生生物、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択され得る。特に、真核細胞は哺乳動物細胞鳥類細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である。宿主細胞はHEK細胞CHO細胞、COS細胞及び酵母細胞から選択される。酵母細胞はサッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)であり得、昆虫細胞はSf9細胞であり得る。

0146

本発明の別の実施形態は、本明細書中に規定されている宿主細胞をRGMに結合することができる結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で培養培地中で培養することを含むRGMに結合することができるタンパク質の産生方法をも提供する。

0147

本発明の別の実施形態は、前記方法により産生されるタンパク質にも関する。

0148

別の実施形態は、
(a)本明細書中に規定されている結晶化産物タンパク質及び成分を含む処方物;及び
(b)少なくとも1つのポリマー担体
を含む結合タンパク質を放出するための組成物を提供する。

0149

前記ポリマー担体は、ポリアクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)すなわちPLGA、ポリ(b−ヒドロキシブチレート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン)、ホリ(エチレングリコール)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリ[(有機ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸アルキルビニルエーテルコポリマープルーロニックポリオールアルブミンアルギネートセルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリンゼラチンヒアルロン酸オリゴ糖グリカミノグリカン、硫酸化多糖、そのブレンド及びコポリマーからなる群の1つ以上から選択されるポリマーである。

0150

前記成分は、アルブミン、スクローストレハロースラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンメトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択され得る。

0151

別の態様によれば、本発明は、哺乳動物に対して有効量の本明細書中に規定されている組成物を投与するステップを含む哺乳動物の治療方法を提供する。

0152

別の態様によれば、本発明は、産物(特に、本明細書中に上記されている結合タンパク質、構築物またはコンジュゲート)及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。

0153

医薬的に許容され得る担体は、結合タンパク質の吸収または分散を向上させるために有用なアジュバントとして機能し得る。

0154

例えば、アジュバントはヒアルロニダーゼである。

0155

別の実施形態によれば、医薬組成物は更に、RGM活性が有害な障害を治療するための少なくとも1つの追加治療薬を含む。例えば、前記物質は、治療薬、イメージング剤、細胞傷害薬、血管形成インヒビターキナーゼ阻害剤共刺激分子ブロッカー接着分子ブロッカー、抗サイトカイン抗体またはその機能性断片メトトレキセートシクロスポリンラパマイシン、FK506、検出可能標識またはレポーターTNFアンタゴニスト抗リウマチ薬筋弛緩薬麻薬非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、鎮痛薬麻酔薬鎮静薬局所麻酔薬神経筋ブロッカー、抗微生物剤、抗乾癬薬、コルチコステロイドタンパク同化ステロイドエリスロポエチン免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制薬成長ホルモンホルモン補充薬、放射線医薬品抗うつ薬抗精神病薬興奮薬喘息薬物療法、β−アゴニスト、吸入ステロイドエピネフリンまたはアナログ、サイトカイン及びサイトカインアンタゴニストからなる群から選択される。

0156

本発明は、本発明の産物(特に、本明細書中に上記されている結合タンパク質、構築物またはコンジュゲート)を単独でまたは他の治療薬と一緒に投与するステップを含むRNFL変性を伴う障害のために被験者を治療するための方法にも関する。

0157

前記障害は、特に糖尿病性網膜症、虚血性視神経症、X染色体連鎖性網膜分離症、薬物誘発性視神経症、網膜ジストロフィー、加齢黄斑変性、視神経乳頭ドルーゼンを特徴とする眼病、光受容器変性の遺伝的決定因子を特徴とする眼病、常染色体劣性錐体−桿性ジストロフィー及び視神経症を有するミトコンドリア疾患からなる群から選択される疾患からなる。

0158

本明細書中に開示されている配列番号34の教示または参照は配列番号9に対しても同様に当てはまる

0159

3.hRGMAに結合するポリペプチドの使用
本発明の別の実施形態は、RGM Aタンパク質の少なくとも1つのエピトープに対して特異的に結合する単離タンパク質またはポリペプチドの上に同定した使用を含む。RGM Aタンパク質の少なくとも1つのエピトープに対して特異的に結合する単離タンパク質またはポリペプチドは、RGM Aのその受容体ネオゲニン及び/または骨形態形成タンパク質2及び4(BMP−2、BMP−4)、特にRGM Aまたはその抗原結合部分もしくは断片に結合する抗体に対する結合を阻害し得る。

0160

本発明の抗RGMA抗体は、例えば当業界で公知であるかまたは以下に記載されている幾つかのインビトロ及びインビボアッセイの1つにより評価してRGM A活性を低下または中和する高い能力を示す。

0161

本発明は、特にRGMAのその受容体ネオゲニン及び骨形態形成タンパク質2及び4(BMP−2、BMP−4)に対する結合を選択的に妨げるRGM Aに対する中和モノクローナル抗体、並びにRGM Aのその補助受容体骨形態形成タンパク質2及び4(BMP−2、BMP−4)に対する結合を選択的に妨げるRGM Aに対する中和モノクローナル抗体の作成を使用する。

0162

特に、本発明のモノクローナル中和抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に対応するまたはヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される可変及び定常領域を有する抗体を指す(例えば、Kabatら.Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication,No.91−3242,1991を参照されたい)。しかしながら、本発明のヒト抗体は、例えばCDR、特にCDR3中にヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりエンコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでランダムまたは部位特異的変異誘発により、またはインビボで体細胞変異により導入される突然変異)を含むことがある。

0163

各種実施形態では、抗体は組換え抗体またはモノクローナル抗体である。本発明の中和抗体の例を本明細書中ではmAb 5F9及びmAb 8Dl及びその機能的抗体断片と称し、低い解離カイネティック及び高い中和能力でのRGMAに対する高い親和性結合のようなmAb5 F9及びmAb 8Dlと均等な特性を有する他の抗体及び機能性抗体断片が本発明の一部として意図される。本発明の抗RGM A抗体の免疫原性RGMポリペプチドまたはその断片に対する結合親和性及び解離速度は当業界で公知の方法により測定され得る。例えば、結合親和性は競合LISA、cRIA、BIAcoreまたはKinExAテクノロジーにより測定され得る。解離速度もBIAcoreまたはKinExAテクノロジーにより測定され得る。結合親和性及び解離速度は、例えばBIAcoreを用いる表面プラズモン共鳴により測定される。

0164

本発明のモノクローナル抗体の1つのmAb 5F9抗体は、配列番号9または34の配列を含む重鎖可変領域(VH領域)及び配列番号10の配列を含む軽鎖可変領域(VL領域)を含む配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有している。

0165

本発明のRGMAと相互作用する単離モノクローナル抗体は抗体またはその抗原結合部分が1つ以上の炭水化物残基を含むグリコシル化結合タンパク質であり得るとも意図される。新生インビボタンパク質産生翻訳後修飾として公知の更なるプロセッシングを受け得る。特に、糖(グリコシル)残基をグリコシル化として公知のプロセスで酵素的に付加し得る。生じた共有結合したオリゴ糖側鎖を有するタンパク質はグリコシル化タンパク質または糖タンパク質として公知である。タンパク質グリコシル化対象タンパク質のアミノ酸配列及びタンパク質を発現させる宿主細胞に依存する。生物が異なると、異なるグリコシル化酵素(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ)が生じ得、利用し得る基質(クレオチド糖)も異なり得る。これらの要因のために、タンパク質グリコシル化パターン及びグリコシル残基組成特定タンパク質を発現させる宿主細胞に応じて異なり得る。本発明において有用なグリコシル残基には、グルコースガラクトースマンノースフコース、n−アセチルグルコサミン及びシアル酸が含まれ得るが、これらに限定されない。特に、グリコシル化結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトであるようにグリコシル残基を含む。

0166

本発明に従って使用される抗体は重鎖定常領域、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgYまたはIgD定常領域を含む。更に、抗体はκ軽鎖定常領域またはλ軽鎖定常領域のいずれかの軽鎖定常領域を含み得る。抗体はκ軽鎖定常領域を含む。或いは、抗体部分は、例えばFab断片または一本鎖Fv断片であり得る。抗体エフェクター機能を改変するためのFc部分中のアミノ酸残基の置換は当業界で公知である(Winterらの米国特許Nos.5,648,260及び5,624,821)。抗体のFc部分は幾つかの重要なエフェクター機能、例えば抗体及び抗原−抗体複合体のサイトカイン誘導、ADCC食作用補体依存性細胞傷害性(CDC)及び半減期クリアランス速度を媒介する。幾つかの場合には、これらのエフェクター機能は治療用抗体にとって望ましいが、他の場合には治療目的に応じて不必要であり有害なことさえあり得る。あるヒトIgGイソタイプ、特にIgG1及びIgG3はそれぞれFcγ Rs及び補体Clqに対する結合を介してADCC及びCDCを媒介する。新生Fc受容体(FcRn)は抗体の循環半減期を決定する重要なコンポーネントである。更に別の実施形態では、抗体のエフェクター機能が改変されるように抗体の定常領域(例えば、抗体のFc領域)中の少なくとも1つのアミノ酸残基を置換する。

0167

3.抗hRGMA抗体の作成
3.1概説
本発明の抗体は、適当な宿主(例えば、ヒトを含めた脊椎動物、マウス、ラット、ヒツジヤギブタウシウマ爬虫類、魚類、両生類、並びに鳥類、爬虫類及び魚類の)の免疫化により作成され得る。本発明の抗体を作成するためには、宿主を本発明の免疫原性RGMポリペプチドまたはその断片で免疫化する。本明細書中、用語「免疫化」は、免疫レパートリーが天然の遺伝子改変されていない生物、または人工ヒト免疫レパートリー提示するために修飾されている物を含めたトランスジェニック生物中に存在しているかどうか抗原を免疫レパートリーに提示するプロセスを指す。同様に、「免疫原性調製剤」はアジュバントまたは抗原の免疫原性を強化する他の添加物を含有している抗原の処方物である。

0168

動物の免疫化は当業界で公知の任意の方法により実施され得る。例えば、Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,New York:Cold Spring Harbor Press,1990を参照されたい。非ヒト動物(例えば、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ及びウマ)を免疫化するための方法は当業界で公知である。例えば、Harlow and Lane及び米国特許No.5,994,619を参照されたい。特定実施形態では、RGMA抗原を免疫応答を刺激するためにアジュバントと一緒に投与する。前記アジュバントには、完全または不完全フロイントアジュバントRIBI(ムラミルジペプチド)またはISCOM(免疫刺激複合体)が含まれる。アジュバントはポリペプチドを局所デポジット中で封鎖することにより急速分散から保護し得、またはアジュバントはマクロファージ及び免疫系の他のコンポーネントに対して化学走性ファクターを分泌するように宿主を刺激する物質を含み得る。特に、ポリペプチドを投与するならば、免疫化スケジュールは数週間にわたって2回以上のポリペプチドの投与を含む。

0169

動物宿主を無傷または破壊されている細胞の細胞膜に関連する抗原で免疫化し、本発明の免疫原性ポリペプチドに結合させることにより本発明の抗体を同定することが考えられる。動物宿主を抗原で免疫化した後、抗体はその動物から得られ得る。動物から血を抜いたり殺したりすることにより抗体含有血清を動物から得る。血清を動物から入手したまま使用しても、免疫グロブリン画分を血清から入手しても、または抗体を血清から精製してもよい。こうして得た血清または免疫グロブリンはポリクローナルであり、よって特性の不均質アレーを有している。

0170

3.2ハイブリドーマテクノロジーを用いる抗RGMAモノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体及びファージディスプレイテクノロジー、またはその組合せの使用を含めた当業界で公知の各種技術を用いて作成され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当業界で公知であり、例えばHarlowら,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988);Hammerlingら,Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas,563−681(Elsevier,N.Y.,1981)(これらの文献の全文を参照により組み入れる)に教示されているものを含めたハイブリドーマ技術を用いて作成され得る。本明細書中で使用されている用語「モノクローナル抗体」はハイブリドーマテクノロジーにより産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、産生する方法ではなく、真核、原核またはファージクローンを含めた単クローンから誘導される抗体を指す。

0171

ハイブリドーマテクノロジーを用いて特定抗体を産生し、スクリーニングするための方法はルーチンであり、当業界で公知である。1つの実施形態では、本発明は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む1つ以上のモノクローナル抗体を作成する方法およびその方法により産生される抗体を提供し、前記ハイブリドーマは本発明の抗原で免疫化したマウスから単離した脾細胞ミエローマ細胞と融合した後、融合により生じたハイブリドーマを本発明のポリペプチドに結合できる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすることにより作成される。簡単に説明すると、マウスをRGMA抗原で免疫化し得る。別の実施形態では、RGM A抗原を免疫応答を刺激するためにアジュバントと一緒に投与する。前記アジュバントには、完全または不完全フロイントアジュバント、RIBI(ムラミルジペプチド)またはISCOM(免疫刺激複合体)が含まれる。アジュバントはポリペプチドを局所デポジット中に封鎖することによりポリペプチドを急速分散から保護し得、またアジュバントはマクロファージ及び免疫系の他のコンポーネントに対して化学走性であるファクターを分泌するように宿主を刺激する物質を含み得る。ポリペプチドを投与する場合、免疫スケジュールは数週間にわたってポリペプチドの2回以上の投与を含む。

0172

免疫応答が検出されたら、例えば抗原RGMAに対して特異的な抗体がマウス血清中で検出されたなら、マウス脾臓を採取し、脾細胞を単離する。次いで、脾細胞を適当なミエローマ細胞、例えばATCCから入手し得る細胞株SP20由来の細胞と公知技術により融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によりクローン化する。次いで、ハイブリドーマクローンを当業界で公知の方法により、RGM Aに結合できる抗体を分泌する細胞についてアッセイする。通常高レベルの抗体を含有している腹水は、マウスをポジティブハイブリドーマクローンで免疫化することにより作成され得る。

0173

別の実施形態では、抗体を産生する不死化ハイブリドーマを免疫化した動物から作成し得る。免疫化後、動物を殺し、脾臓B細胞を当業界で公知のように不死化ミエローマ細胞に融合させる。例えば、上掲のHarlow and Laneを参照されたい。別の実施形態では、ミエローマ細胞は免疫グロブリンポリペプチド(非分泌性細胞株)を分泌しない。融合及び抗体選択後、ハイブリドーマをRGMAまたはその一部、或いはRGM Aを発現する細胞を用いてスクリーニングする。別の実施形態では、初期スクリーニングを酵素免疫測定法(ELISA)またはラジオイムノアッセイ(RIA)を用いて実施する。ELISAスクリーニングの例は、参照により本明細書に組み入れるWO 00/37504に記載されている。

0174

抗RGMA抗体産生ハイブリドーマを選択し、クローン化し、更にロバストなハイブリドーマ増殖、高い抗体産生、及び以下に更に検討する所望の抗体特性を含めた所望特性についてスクリーニングする。ハイブリドーマを培養し、インビボで同一遺伝子型動物で、免疫系を欠く動物(例えば、ヌードマウス)で、またはインビトロの細胞培養において増殖させ得る。ハイブリドーマを選択し、クローン化し、増殖させる方法は当業者に公知である。

0175

特定実施形態では、ハイブリドーマは上記したマウスハイブリドーマである。別の特定実施形態では、ハイブリドーマは非ヒト非マウス種(例えば、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマ)において産生される。別の実施形態では、ハイブリドーマは、ヒト非分泌性ミエローマが抗RGMA抗体を発現するヒト細胞と融合されているヒトハイブリドーマである。

0176

特定エピトープを認識する抗体断片は公知技術により作成され得る。例えば、本発明のFab及びF(ab’)2断片は、酵素、例えばパパイン(Fab断片を産生するために)またはペプシン(F(ab’)2断片を産生するために)を用いて免疫グロブリン分子をタンパク質分解開裂にかけることにより作成され得る。F(ab’)2断片は可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のCHIドメインを含んでいる。

0177

3.3SLAMを用いる抗RGMAモノクローナル抗体
本発明の別の態様では、組換え抗体は単一単離リンパ球から米国特許No.5,627,052、PCT公開WO 92/02551及びBabcock,J.S.ら(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:7843−7848に記載されている当業界で選択リンパ球抗体方法(SLAM)と称されている手順を用いて作成される。この方法では、対象抗体を分泌する単細胞、例えば上記した免疫化動物から誘導されるリンパ球を抗原RGM A、RGM Aのサブユニットまたはその断片をリンカー(例えば、ビオチン)を用いてヒツジ赤血球に結合させ、RGM Aに対して特異性を有する抗体を分泌する単細胞を同定するために使用する抗原特異的溶血プラークアッセイを用いてスクリーニングする。対象の抗体分泌細胞を同定した後、重鎖及び軽鎖可変領域cDNAを逆転写酵素PCRにより細胞からレスキューし、次いでこれらの可変領域を哺乳動物宿主細胞(例えば、COSまたはCHO細胞)において適切な免疫グロブリン定常領域(例えば、ヒト定常領域)に関連して発現させ得る。次いで、インビボ選択リンパ球から誘導される増幅免疫グロブリン配列をトランスフェクトした宿主細胞に、例えばRGM Aに対する抗体を発現する細胞を単離するためにトランスフェクトした細胞をパンニングすることによりインビトロで更なる分析及び選択を施し得る。増幅した免疫グロブリン配列は更に例えばPCT公開WO 97/29131及びPCT公開WO 00/56772に記載されているようなインビトロ親和性成熟方法によりインビトロで操作され得る。

0178

3.4トランスジェニック動物を用いる抗RGMAモノクローナル抗体
本発明の別の実施形態では、抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部または全部を含む非ヒト動物をRGM A抗原で免疫化することにより産生される。特定実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きい断片を含み、マウス抗体産生に欠け工学操作したマウス系統であるXENOMOUSEトランスジェニックマウスである。例えば、Greenら,Nature Genetics,7:13−21(1994)、並びに米国特許5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598及び6,130,364を参照されたい。また、1991年7月25日に公開されたWO 91/10741、1994年2月3日に公開されたWO 94/02602、いずれも1996年10月31日に公開されたWO 96/34096及びWO 96/33735、1998年4月23日に公開されたWO 98/16654、1998年6月11日に公開されたWO 98/24893、1998年11月12日に公開されたWO 98/50433、1999年9月10日に公開されたWO 99/45031、1999年10月21日に公開されたWO 99/53049、2000年2月24に公開されたWO 00/09560及び2000年6月29日に公開されたWO 00/037504も参照されたい。XENOMOUSEトランスジェニックマウスは完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトMabを生ずる。XENOMOUSEトランスジェニックマウスはヒト重鎖遺伝子座及びx軽鎖遺伝子座メガ塩基の大きさの生殖細胞系コンフィギュレーションYAC断片の導入によりヒト抗体レパートリーの約80%を含んでいる。その開示内容を参照により本明細書に組み入れるMendezら,Nature Genetics,15:146−156(1997);Green and Jakobovits,J.Exp.Med.,188:483−495(1998)を参照されたい。

0179

3.5組換え抗体ライブラリーを用いる抗RGMAモノクローナル抗体
本発明の抗体を産生するために、抗体ライブラリーをスクリーニングして、所望の結合特異性を有する抗体を同定するインビトロ方法も使用され得る。組換え抗体ライブラリーのスクリーニング方法は当業界で公知であり、例えばその各々の内容を参照により本明細書に組み入れるLadnerら,米国特許No.5,223,409;Kangら,PCT公開WO 92/18619;Dowerら,PCT公開WO 91/17271;Winterら,PCT公開WO 92/20791;Marklandら,PCT公開WO 92/15679;Breitlingら,PCT公開WO 93/01288;McCaffertyら,PCT公開WO 92/01047;Garrardら,PCT公開WO 92/09690;Fuchsら(1991)Bio/Technology,9:1370−1372;Hayら(1992)Hum.Antibod.Hybridomas,3:81−85;Huseら(1989)Science,246:1275−1281;McCaffertyら,Nature(1990)348:552−554;Griffithsら(1993)EMBO J.,12:725−734;Hawkinsら(1992)J.Mol.Biol.,226:889−896;Clacksonら(1991)Nature,352:624−628;Gramら(1992)PNAS,89:3576−3580;Garradら(1991)Bio/Technology,9:1373−1377;Hoogenboomら(1991)Nuc.Acid Res.,19:4133−4137;並びにBarbasら(1991)PNAS,88:7978−7982、米国特許出願公開20030186374及びPCT公開WO 97/29131に記載されている方法が含まれる。

0180

組換え抗体ライブラリーはRGMAまたはRGM Aの一部で免疫化した被験者由来であり得る。或いは、組換え抗体ライブラリーはナイーブ被験者(すなわち、RGM Aで免疫化されていない被験者)由来であり、例えばヒトRGM Aで免疫化されていないヒト被験者由来のヒト抗体ライブラリーである。本発明の抗体は、組換え抗体ライブラリーをヒトRGM Aを含むペプチドを用いてスクリーニングして、RGM Aを認識する抗体を選択することにより選択される。前記スクリーニング及び選択を実施するための方法は、前のパラグラフ中の文献に記載されているように当業界で公知である。ヒトRGM Aから特定のkoff速度定数で解離する抗体のようなhRGM Aに対して特定の結合親和性を有する本発明の抗体を選択するために、所望のkoff速度定数を有する抗体を選択するために表面プラズモン共鳴の当業界で公知の方法を使用し得る。特定のIC50を有している抗体のようなhRGM Aに対して特定の中和活性を有する本発明の抗体を選択するために、hRGM A活性の阻害を評価するための当業界で公知の標準方法を使用し得る。

0181

1つの態様で、本発明は、ヒトRGMAに結合する単離抗体またはその抗原結合部分に関する。特に、抗体は中和抗体である。各種実施形態では、抗体は組換え抗体またはモノクローナル抗体である。

0182

例えば、本発明の抗体は当業界で公知の各種ファージディスプレイ方法を用いても作成され得る。ファージディスプレイ方法では、機能性抗体ドメインをエンコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面上に機能性抗体ドメインを提示する。特に、前記ファージはレパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えば、ヒトまたはマウス)から発現させた抗原結合ドメインを提示させるために利用され得る。対象抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは抗原を用いて、例えば標識抗原、または固体表面またはビーズに結合または捕捉させた抗原を用いて選択または同定され得る。これらの方法で使用されるファージは、典型的にはファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかに対して組換え融合させたFab、Fvまたはジスルフィド安定化Fv抗体ドメインを有するファージから発現させたfd及びMl3結合ドメインを含めた繊維状ファージである。本発明の抗体を作成するために使用され得るファージディスプレイ方法の例には、各々の全文を参照により本明細書に組み入れるBrinkmanら,J.Immunol.Methods,182:41−50(1995);Amesら,J.Immunol.Methods,184:177−186(1995);Kettleboroughら,Eur.J.Immunol.,24:952−958(1994);Persicら,Gene,187,9−18(1997);Burtonら,Advances in Immunology,57:191−280(1994);PCT出願PCT/GB91/01134;PCT公開WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401;並びに米国特許Nos.5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780、225、5,658,727、5,733,743及び5,969,108に開示されている方法が含まれる。

0183

記文献に記載されているように、ファージ選択後、例えば以下に詳記されているようにファージ由来の抗体コード領域を単離し、ヒト抗体または他の所望抗原結合断片を含めた全抗体を作成するために使用し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及び細菌を含めた所望の宿主で発現させ得る。例えば、Fab、Fab’及びF(ab’)2断片を組換え産生するための技術は、例えばPCT公開WO 92/22324;Mullinaxら,BioTechniques,12(6):864−869(1992);Sawaiら,AJRI,34:26−34(1995);及びBetterら,Science,240:1041−1043(1988)(これらの文献の全文を参照により組み入れる)に開示されているような当業界で公知の方法を用いても使用され得る。一本鎖Fv及び抗体を産生するために使用され得る技術の例には、米国特許4,946,778及び5,258、498;Hustonら,Methodsin Enzymology,203:46−88(1991);Shuら,PNAS,90:7995−7999(1993);及びSkerraら,Science,240:1038−1040(1988)中に記載されているものが含まれる。

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