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技術 単一ホルモンのインスリン陽性細胞へのヒト胚性幹細胞の分化

出願人 ヤンセンバイオテツク,インコーポレーテツド
発明者 レザニア,アリレザ
出願日 2018年11月21日 (2年3ヶ月経過) 出願番号 2018-218327
公開日 2019年3月28日 (1年10ヶ月経過) 公開番号 2019-047810
状態 拒絶査定
技術分野 微生物、その培養処理
主要キーワード 後続ステージ 中間ステージ ノナエン 体系内 PF1 再プログラム化 再生性 生理学的システム
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年3月28日)のものです。
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図面 (20)

課題

多能性幹細胞分化を促進する方法の提供。

解決手段

多能性細胞の段階的分化から得られる、膵臓内胚葉細胞インビトロ分化集団であって、分化の各段階の細胞が、5mM〜20mMのグルコースを含む培地中で培養される、膵臓内胚葉細胞の分化集団、及び膵臓内胚葉系統の細胞の集団への多能性細胞の段階的分化のためのインビトロの方法であって、5mM〜20mMのグルコースを含む培地中での分化の各段階で細胞を培養する工程を含む、方法。

概要

背景

I型糖尿病細胞置換療法の進歩及び移植可能ランゲルハンス島不足により、生着
に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞供給源の開発に注目が集まっている。1つ
の手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成する
ことがある。

脊椎動物胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、3つ
胚葉外胚葉中胚葉、及び内胚葉)を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺
胸腺膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。こ
のプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞(defini
tive endoderm cell)は、HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4、及びSO
X17などの多数のマーカー発現する。

原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマ
ークする因子パネルの発現によって認識することができる前部−後部ドメインに分割さ
れる。例えば、Hhex及びSox2は内胚葉の前領域を特定し、Cdx1、2及び4は
後半分を特定する。

内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる
。これは、例えば、FGF、Wnt、TGF−B、レチノイン酸(RA)、及びBMPリ
ガンド、並びにそれらのアンタゴニストのような多数の分泌された因子によって達成され
る。例えば、FGF4及びBMPは推定後腸内胚葉においてCdx2の発現を促進し、前
方の遺伝子Hhex及びSOX2の発現を阻害する(Development 2000
,127:1563〜1567)。WNTシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前
腸の運命を阻害するために、FGFシグナル伝達と平行して作用することが示されている
(Development 2007,134:2207〜2217)。最後に、間葉
よって分泌されるレチノイン酸は、前腸−後腸の境界を調節する(Curr Biol
2002,12:1215〜1220)。

特異的転写因子発現レベルは、組織のアイデンティティを指定するために使用できる
可能性がある。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現
ターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。例えば、
腸管で領域化された膵臓ドメインは、PDX−1の非常に高い発現及びCDX2並びにS
OX2の非常に低い発現を示す。同様に、Foxe1の高レベルの存在は、食道組織の指
標である。肺組織において高度に発現されるのはNKX2.1である。SOX2/Odd
1(OSR1)は胃組織において高度に発現される。PROX1/Hhex/AFPの発
現は肝組織において高い。SOX17は胆管構造の組織で高度に発現される。PDX1、
NKX6.1/PTf1a、及びNKX2.2は膵臓組織において高度に発現される。C
DX2の発現は、腸組織において高い。上記要約は、Dev Dyn 2009,238
:29〜42及びAnnu Rev Cell Dev Biol 2009,25:2
21〜251からの引用である。

膵臓の形成は、膵臓内胚葉への胚体内胚葉の分化から生じる(Annu Rev Ce
ll Dev Biol 2009,25:221〜251;Dev Dyn 2009
,238:29〜42)。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。また、前
腸は、食道気管、甲状腺、、肝臓、膵臓、胆管系を生じさせる。

膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子PDX1を発現する。PDX
1が存在しない場合、膵臓は、腹側及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって
、PDX1の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟した膵臓は、
他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、
膵臓内胚葉の分化によって生じる。

D’Amourらは、高濃度アクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹細胞由来
の胚体内胚葉の濃縮培地生産記述している(Nature Biotechnol
2005,23:1534〜1541;U.S.Patent No.7,704,73
8)。マウス腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植は、内胚葉組織の特徴を有する、より
成熟した細胞への分化をもたらした(米国特許第7,704,738号)。ヒト胚性
由来の胚体内胚葉細胞は、FGF−10及びレチノイン酸の添加後、PDX1陽性細胞
に更に分化することができる(米国特許公開第2005/0266554A1号)。免疫
不全マウスの腎臓被膜下でのこれらの膵臓前駆細胞のその後の移植は、3〜4ヶ月の成熟
期の後に、機能的膵内分泌細胞の形成をもたらした(米国特許第7,993,920号及
び米国特許第7,534,608号)。

Fiskらは、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のためのシステム報告している
(米国特許第7,033,831号)。この場合、分化経路は3つの段階に分割された。
ヒト胚性幹細胞は、最初に、酪酸ナトリウムとアクチビンとの組み合わせを用いて内胚葉
に分化された(米国特許第7,326,572号)。次に細胞をノギンなどのBMPアン
タゴニストと共に、EGF又はベータセルリンと組み合わせて培養して、PDX1陽性
胞を生成した。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。

分子阻害剤もまた、膵内分泌前駆細胞誘導のために使用されている。例えば、TG
F−B受容体及びBMP受容体の小分子阻害剤(Development 2011,1
38:861〜871;Diabetes 2011,60:239〜247)は、有意
に膵内分泌細胞の数を増すために使用されている。加えて、小分子活性化剤もまた、胚体
内胚葉細胞又は膵臓前駆細胞を生成するために使用されている(Curr Opin C
ell Biol 2009,21:727〜732;Nature Chem Bio
l 2009,5:258〜265)。

ヒト胚性幹細胞からの膵臓前駆細胞の誘導におけるこれまでの試みは、膵臓内胚葉の正
しい同定におけるPDX−1及びNKX6.1の共発現重要性を明らかにした。しかし
、当該技術分野は、PDX−1及びNKX6の発現において陽性の細胞の集団はCDX2
の発現が低い又は発現しないものと同定してきたが、これまでの報告は、発達中の膵臓の
すぐ前方のマーカーの存在を試験するに至っていない。前方の内胚葉を印すSOX2は、
成人の島では発現されず、発達中の膵臓において非常に低レベルで発現される。(Dia
betes 2005,54:3402〜4309)。対照的に、本願の実施例のいくつ
かは、ヒト胚性幹細胞から生成された膵臓内胚葉細胞の少なくとも30%がPDX−1及
びNKX6.1の発現について陽性であり、かつCDX2及びSOX2の発現に陰性であ
細胞集団を開示する。

機能的膵臓β細胞を生成するための以前のあらゆる試みは、成熟したβ細胞の特徴を有
する細胞を得るまでに至っていない。成熟したβ細胞の特徴としては、単一ホルモンのイ
スリンの発現、プロインスリンからインスリン及びC−ペプチドへの正しい処理、PD
X−1及びNKX6.1の強発現、グルコース応答した適切なインスリン放出グルコ
ース輸送体の発現、及びグルコキナーゼの高発現が含まれる。以前の報告の全ては、2つ
以上の膵臓ホルモンを産生する内分泌細胞をもたらしている。例えば、D’Amourら
(Nature Biotech 2006,24:1392〜1401)は、シナプト
フィジンによる測定で10%までのインスリン陽性細胞及び20%までの内分泌細胞を含
む細胞集団の生成を報告している。その他の同様の報告(Cell Res 2009,
19:429〜438;Stem Cells 2007,25:1940〜1953;
Diabetes Obes Metab 2008,10:186〜194)もまた、
多能性細胞から非機能的インスリン陽性細胞への分化を示している。実際に、最近の研究
は、重症複合免疫不全(SCID)マウスにおける多ホルモン細胞の移植が、機能的β細
胞の生成をもたらさなかったことを明確に示した(Diabetes 2011,60:
239〜247;Nature Biotech 2011,29:750〜756)。
ヒト胎児の膵臓では内分泌細胞の一部(10〜20%まで)が多ホルモン細胞であるが、
多ホルモン細胞は成人のヒトの膵臓では消失している(Histochem Cell
Biol 1999,112:147〜153;J Histochem Cytoch
em 2009,57:811〜824)。

再生医療の急成長分野が成熟し続けるにつれて、最終分化した、適切に調節された
分泌細胞の形成のための方法が強く望まれている。適切でありかつ定義された培養条件
操作、及び様々な経路の活性剤阻害剤の添加の正確なタイミングを用いて、ヒト胚性幹
細胞をインビトロで機能的膵臓β細胞に分化させることができることが、本明細書で実証
される。具体的には、BMP阻害の正確なタイミング、ビタミンCの使用とともにレチノ
イン酸の勾配を用いることが、単一ホルモンの膵内分泌細胞の生成に有効であることが証
明された。

概要

多能性幹細胞の分化を促進する方法の提供。多能性細胞の段階的分化から得られる、膵臓内胚葉細胞のインビトロ分化集団であって、分化の各段階の細胞が、5mM〜20mMのグルコースを含む培地中で培養される、膵臓内胚葉細胞の分化集団、及び膵臓内胚葉系統の細胞の集団への多能性細胞の段階的分化のためのインビトロの方法であって、5mM〜20mMのグルコースを含む培地中での分化の各段階で細胞を培養する工程を含む、方法。なし

目的

本発明は、段階的分化の各工程で
定義された条件を用いて、多能性幹細胞から分化した単一ホルモンのインスリン産生細胞
を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

多能性細胞の段階的分化から得られる、膵臓内胚葉細胞インビトロ分化集団であって、分化の各段階の細胞が、5mM〜20mMのグルコースを含む培地中で培養される、膵臓内胚葉細胞の分化集団。

請求項2

前記分化された膵臓内胚葉細胞の30%超が、PDX−1+NKX6.1+、SOX2−、及びCDX2−である、請求項1に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。

請求項3

前記分化集団の細胞の10%超が単一ホルモンインスリン陽性細胞である、請求項1又は2に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。

請求項4

前記段階的分化が、未分化ヒト胚性幹細胞をTGF−Bリガンドが更に追補された培地中で培養する工程を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。

請求項5

前記段階的分化が、未分化のヒト胚性幹細胞をWNT活性化剤が更に追補された培地中で培養する工程を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。

請求項6

前記段階的分化が、胚体内胚葉細胞をFGFリガンドが更に追補された培地中で培養する工程を含む、請求項1に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。

請求項7

前記段階的分化が、shh阻害剤、FGFリガンド、PKC活性化剤、TGF−Bリガンド、レチノイド、及びBMP阻害剤の勾配が更に追補された培地中で腸管細胞を培養する工程を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。

請求項8

前記段階的分化が、PKC活性化剤、shh阻害剤、レチノイド、及びBMP阻害剤が更に追補された培地中で後方前腸細胞を培養する工程を含む、請求項5に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。

請求項9

前記段階的分化が、アスコルビン酸が更に追補された培地中で細胞を培養する工程を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。

請求項10

膵臓内胚葉系統の細胞の集団への多能性細胞の段階的分化のためのインビトロの方法であって、5mM〜20mMのグルコースを含む培地中での分化の各段階で細胞を培養する工程を含む、方法。

請求項11

TGF−Bリガンド及びWNT活性化剤を追補した培地中で前記多能性細胞を培養することによって、前記多能性細胞を胚体内胚葉(DE)細胞に分化する工程を更に含む、請求項10に記載のインビトロの方法。

請求項12

FGFリガンドを追補した培地中で前記DE細胞を培養することによって、前記DE細胞を腸管細胞に分化する工程を更に含む、請求項11に記載のインビトロの方法。

請求項13

shh阻害剤、FGFリガンド、PKC活性化剤、TGF−Bリガンド、レチノイド、及びBMP阻害剤を追補した培地中で腸管細胞を培養することによって、前記腸管細胞を後方前腸内胚葉細胞に分化する工程を更に含む、請求項12に記載のインビトロの方法。

請求項14

PKC活性化剤、shh阻害剤、レチノイド、及びBMP阻害剤を追補した培地中で後方前腸内胚葉細胞を培養することによって、前記後方前腸内胚葉細胞を膵臓前腸細胞に分化する工程を更に含む、請求項13に記載のインビトロの方法。

請求項15

shh阻害剤、TGF−B阻害剤、及びレチノイドを追補した培地中で前記膵臓前腸細胞を培養することによって、前記膵臓前腸細胞を膵臓内胚葉細胞に分化する工程を更に含む、請求項14に記載のインビトロの方法。

請求項16

前記膵臓内胚葉細胞を膵臓β細胞集団に分化する工程を更に含む、請求項15に記載のインビトロの方法。

請求項17

少なくとも一工程において前記培地にアスコルビン酸を更に追補する、請求項10〜16のいずれか一項に記載のインビトロの方法。

請求項18

前記分化集団の細胞の10%超が単一ホルモンのインスリン陽性細胞である、請求項10〜17のいずれか一項に記載のインビトロの方法。

請求項19

培養物の膵臓内胚葉細胞の30%超がPDX−1+、NKX6.1+、SOX2−、及びCDX2−である、請求項18に記載のインビトロの方法。

請求項20

ヒト胚性幹細胞を膵臓β細胞に分化するためのインビトロの方法であって、a)胚体内胚葉(DE)細胞の集団を生成するために、未分化のヒト胚性幹細胞を、グルコース、TGF−Bリガンド、及びWNT活性化剤を追補した培地中で培養する工程と、b)腸管細胞の集団を生成するために、前記DE細胞を、グルコース及びFGFリガンドを追補した培地中で培養する工程と、c)PDX−1及びSOX2を発現する後方前腸内胚葉細胞の集団を生成するために、グルコース、shh阻害剤、FGFリガンド、PKC活性化剤、TGF−Bリガンド、レチノイド、及びBMP阻害剤の勾配を追補した培地中で前記腸管細胞を培養する工程と、d)PDX−1及びNKX6.1を発現し、かつ前記後方前腸細胞と比較して低いレベルのSOX2を発現する膵臓前腸細胞の集団を生成するために、グルコース、PKC活性剤、shh阻害剤、レチノイド、及びBMP阻害剤を追補した培地中で前記後方前腸細胞を培養する工程と、e)PDX−1及び膵臓前腸細胞と比較して高いレベルのNKX6.1並びに低いレベルのSOX2を発現する膵臓内胚葉細胞の集団を得るために、グルコース、shh阻害剤、TGF−B阻害剤、及びレチノイドを追補した培地中で前記膵臓前腸細胞を培養する工程と、f)前記膵臓内胚葉細胞を膵臓β細胞集団に分化する工程と、を含む、方法。

請求項21

前記膵臓β細胞集団がPDX−1+、NKX6.1+、SOX2−、及びCDX2−である、請求項20に記載の方法。

請求項22

少なくとも一工程において前記培地にアスコルビン酸が更に追補される、請求項20又は21に記載の方法。

請求項23

前記膵臓β細胞が、NKX6.1+及びPDX−1+でもある単一ホルモンのインスリン産生細胞である、請求項22に記載の方法。

技術分野

0001

(関連出願の相互参照
本出願は、2011年12月22日に出願された、米国特許仮出願第61/579,3
51号の利益を主張するものであり、当該出願を、本明細書にその全容において、かつあ
らゆる目的について援用するものである。

0002

(発明の分野)
本発明は、細胞分化の分野にある。より具体的には、本発明は、段階的分化の各工程で
定義された条件を用いて、多能性幹細胞から分化した単一ホルモンインスリン産生細胞
を提供する。その集団において分化したインスリン産生細胞の10%以上は、単一ホルモ
ンの膵臓β細胞に特徴的なマーカー発現する。

背景技術

0003

I型糖尿病細胞置換療法の進歩及び移植可能ランゲルハンス島不足により、生着
に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞供給源の開発に注目が集まっている。1つ
の手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成する
ことがある。

0004

脊椎動物胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、3つ
胚葉外胚葉中胚葉、及び内胚葉)を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺
胸腺膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。こ
のプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞(defini
tive endoderm cell)は、HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4、及びSO
X17などの多数のマーカーを発現する。

0005

原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマ
ークする因子パネルの発現によって認識することができる前部−後部ドメインに分割さ
れる。例えば、Hhex及びSox2は内胚葉の前領域を特定し、Cdx1、2及び4は
後半分を特定する。

0006

内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる
。これは、例えば、FGF、Wnt、TGF−B、レチノイン酸(RA)、及びBMPリ
ガンド、並びにそれらのアンタゴニストのような多数の分泌された因子によって達成され
る。例えば、FGF4及びBMPは推定後腸内胚葉においてCdx2の発現を促進し、前
方の遺伝子Hhex及びSOX2の発現を阻害する(Development 2000
,127:1563〜1567)。WNTシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前
腸の運命を阻害するために、FGFシグナル伝達と平行して作用することが示されている
(Development 2007,134:2207〜2217)。最後に、間葉
よって分泌されるレチノイン酸は、前腸−後腸の境界を調節する(Curr Biol
2002,12:1215〜1220)。

0007

特異的転写因子発現レベルは、組織のアイデンティティを指定するために使用できる
可能性がある。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現
ターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。例えば、
腸管で領域化された膵臓ドメインは、PDX−1の非常に高い発現及びCDX2並びにS
OX2の非常に低い発現を示す。同様に、Foxe1の高レベルの存在は、食道組織の指
標である。肺組織において高度に発現されるのはNKX2.1である。SOX2/Odd
1(OSR1)は胃組織において高度に発現される。PROX1/Hhex/AFPの発
現は肝組織において高い。SOX17は胆管構造の組織で高度に発現される。PDX1、
NKX6.1/PTf1a、及びNKX2.2は膵臓組織において高度に発現される。C
DX2の発現は、腸組織において高い。上記要約は、Dev Dyn 2009,238
:29〜42及びAnnu Rev Cell Dev Biol 2009,25:2
21〜251からの引用である。

0008

膵臓の形成は、膵臓内胚葉への胚体内胚葉の分化から生じる(Annu Rev Ce
ll Dev Biol 2009,25:221〜251;Dev Dyn 2009
,238:29〜42)。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。また、前
腸は、食道気管、甲状腺、、肝臓、膵臓、胆管系を生じさせる。

0009

膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子PDX1を発現する。PDX
1が存在しない場合、膵臓は、腹側及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって
、PDX1の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟した膵臓は、
他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、
膵臓内胚葉の分化によって生じる。

0010

D’Amourらは、高濃度アクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹細胞由来
の胚体内胚葉の濃縮培地生産記述している(Nature Biotechnol
2005,23:1534〜1541;U.S.Patent No.7,704,73
8)。マウス腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植は、内胚葉組織の特徴を有する、より
成熟した細胞への分化をもたらした(米国特許第7,704,738号)。ヒト胚性
由来の胚体内胚葉細胞は、FGF−10及びレチノイン酸の添加後、PDX1陽性細胞
に更に分化することができる(米国特許公開第2005/0266554A1号)。免疫
不全マウスの腎臓被膜下でのこれらの膵臓前駆細胞のその後の移植は、3〜4ヶ月の成熟
期の後に、機能的膵内分泌細胞の形成をもたらした(米国特許第7,993,920号及
び米国特許第7,534,608号)。

0011

Fiskらは、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のためのシステム報告している
(米国特許第7,033,831号)。この場合、分化経路は3つの段階に分割された。
ヒト胚性幹細胞は、最初に、酪酸ナトリウムとアクチビンとの組み合わせを用いて内胚葉
に分化された(米国特許第7,326,572号)。次に細胞をノギンなどのBMPアン
タゴニストと共に、EGF又はベータセルリンと組み合わせて培養して、PDX1陽性
胞を生成した。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。

0012

分子阻害剤もまた、膵内分泌前駆細胞誘導のために使用されている。例えば、TG
F−B受容体及びBMP受容体の小分子阻害剤(Development 2011,1
38:861〜871;Diabetes 2011,60:239〜247)は、有意
に膵内分泌細胞の数を増すために使用されている。加えて、小分子活性化剤もまた、胚体
内胚葉細胞又は膵臓前駆細胞を生成するために使用されている(Curr Opin C
ell Biol 2009,21:727〜732;Nature Chem Bio
l 2009,5:258〜265)。

0013

ヒト胚性幹細胞からの膵臓前駆細胞の誘導におけるこれまでの試みは、膵臓内胚葉の正
しい同定におけるPDX−1及びNKX6.1の共発現重要性を明らかにした。しかし
、当該技術分野は、PDX−1及びNKX6の発現において陽性の細胞の集団はCDX2
の発現が低い又は発現しないものと同定してきたが、これまでの報告は、発達中の膵臓の
すぐ前方のマーカーの存在を試験するに至っていない。前方の内胚葉を印すSOX2は、
成人の島では発現されず、発達中の膵臓において非常に低レベルで発現される。(Dia
betes 2005,54:3402〜4309)。対照的に、本願の実施例のいくつ
かは、ヒト胚性幹細胞から生成された膵臓内胚葉細胞の少なくとも30%がPDX−1及
びNKX6.1の発現について陽性であり、かつCDX2及びSOX2の発現に陰性であ
細胞集団を開示する。

0014

機能的膵臓β細胞を生成するための以前のあらゆる試みは、成熟したβ細胞の特徴を有
する細胞を得るまでに至っていない。成熟したβ細胞の特徴としては、単一ホルモンのイ
スリンの発現、プロインスリンからインスリン及びC−ペプチドへの正しい処理、PD
X−1及びNKX6.1の強発現、グルコース応答した適切なインスリン放出グルコ
ース輸送体の発現、及びグルコキナーゼの高発現が含まれる。以前の報告の全ては、2つ
以上の膵臓ホルモンを産生する内分泌細胞をもたらしている。例えば、D’Amourら
(Nature Biotech 2006,24:1392〜1401)は、シナプト
フィジンによる測定で10%までのインスリン陽性細胞及び20%までの内分泌細胞を含
む細胞集団の生成を報告している。その他の同様の報告(Cell Res 2009,
19:429〜438;Stem Cells 2007,25:1940〜1953;
Diabetes Obes Metab 2008,10:186〜194)もまた、
多能性細胞から非機能的インスリン陽性細胞への分化を示している。実際に、最近の研究
は、重症複合免疫不全(SCID)マウスにおける多ホルモン細胞の移植が、機能的β細
胞の生成をもたらさなかったことを明確に示した(Diabetes 2011,60:
239〜247;Nature Biotech 2011,29:750〜756)。
ヒト胎児の膵臓では内分泌細胞の一部(10〜20%まで)が多ホルモン細胞であるが、
多ホルモン細胞は成人のヒトの膵臓では消失している(Histochem Cell
Biol 1999,112:147〜153;J Histochem Cytoch
em 2009,57:811〜824)。

0015

再生医療の急成長分野が成熟し続けるにつれて、最終分化した、適切に調節された
分泌細胞の形成のための方法が強く望まれている。適切でありかつ定義された培養条件
操作、及び様々な経路の活性剤阻害剤の添加の正確なタイミングを用いて、ヒト胚性幹
細胞をインビトロで機能的膵臓β細胞に分化させることができることが、本明細書で実証
される。具体的には、BMP阻害の正確なタイミング、ビタミンCの使用とともにレチノ
イン酸の勾配を用いることが、単一ホルモンの膵内分泌細胞の生成に有効であることが証
明された。

課題を解決するための手段

0016

本発明は、多能性細胞の段階的分化によってインビトロで得られる膵臓内胚葉系統(pa
ncreatic endoderm lineage)の細胞の集団を提供する。分化の各工程で使用する培地
は、グルコースを追補する。いくつかの実施形態では、分化の各工程で、5mM〜20m
Mのグルコースを含む培地中で細胞を培養する。

0017

いくつかの実施形態では、多能性幹細胞の分化が生成する膵臓内胚葉細胞集団において
、分化集団の細胞の10%超が、単一ホルモンの膵臓β細胞に特徴的なマーカーを発現す
る。

0018

いくつかの実施形態では、多能性幹細胞の分化が生成する膵臓内胚葉細胞集団において
、分化集団の30%超が、PDX−1及びNKX6.1の発現について陽性であるが、C
DX2及びSOX2の発現については陰性である。

0019

いくつかの実施形態では、段階的分化は、TGF−Bリガンドを更に追補した培地中で
未分化ヒト胚性幹細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、段階的分化は、
WNT活性化剤を更に追補した培地中で未分化ヒト胚性幹細胞を培養する工程を含む。い
くつかの実施形態では、段階的分化は、FGFリガンドを更に追補した培地中で胚体内
葉細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、段階的分化は、shh阻害剤、
FGFリガンド、PKC活性化剤、TGF−Bリガンド、レチノイド、及びBMP阻害剤
の勾配を更に追補した培地中で腸管細胞を培養する工程を含む。いくつかの実施形態では
、段階的分化は、PKC活性化剤、shh阻害剤、レチノイド、及びBMP阻害剤を更に
追補した培地中で後方前腸細胞(posterior foregut cell)を培養する工程を含む。いく
つかの実施形態では、段階的分化は、アスコルビン酸を更に追補した培地中で細胞を培養
する工程を含む。

0020

一実施形態において、本発明は、5mM〜20mMのグルコースを含む培地中での分化
の各段階で細胞を培養する工程を含む、多能性細胞を膵臓内胚葉系統の細胞集団に段階的
に分化するためのインビトロの方法を提供する。いくつかの実施形態では、多能性細胞の
段階的分化のためのインビトロの方法は、更に、TGF−Bリガンド及びWNT活性化剤
を追補した培地中で多能性細胞を培養することによって多能性細胞を胚体内胚葉(DE)
細胞に分化する工程を含む。いくつかの実施形態では、多能性細胞の段階的分化のための
インビトロの方法は、更に、FGFリガンドを追補した培地中でDE細胞を培養すること
によりDE細胞を腸管細胞に分化する工程を含む。いくつかの実施形態では、多能性細胞
の段階的分化のためのインビトロの方法は、更に、shh阻害剤、FGFリガンド、PK
C活性化剤、TGF−Bリガンド、レチノイド、及びBMP阻害剤を追補した培地中で腸
管細胞を培養することにより腸管細胞を後方前腸内胚葉細胞に分化する工程を含む。いく
つかの実施形態では、多能性細胞の段階的分化のためのインビトロの方法は、更に、sh
h阻害剤、FGFリガンド、PKC活性化剤、TGF−Bリガンド、レチノイド、及びB
MP阻害剤を追補した培地中で腸管細胞を培養することにより腸管細胞を後方前腸内胚葉
細胞に分化する工程を含む。いくつかの実施形態では、多能性細胞の段階的分化のための
インビトロの方法は、更に、PKC活性化剤、shh阻害剤、レチノイド、及びBMP阻
害剤を追補した培地中で後方前腸内胚葉細胞を培養することにより後方前腸内胚葉細胞を
膵臓前腸細胞に分化する工程を含む。いくつかの実施形態では、多能性細胞の段階的分化
のためのインビトロの方法は、更に、shh阻害剤、TGF−B阻害剤、及びレチノイド
を追補した培地中で膵臓前腸細胞を培養することにより膵臓前腸細胞を膵臓内胚葉細胞に
分化する工程を含む。いくつかの実施形態では、多能性細胞の段階的分化のためのインビ
トロの方法は、更に、膵臓内胚葉細胞を膵臓β細胞集団に分化する工程を含む。

0021

一実施形態では、多能性細胞の段階的分化のためのインビトロの方法の少なくとも一工
程において、培地には更にアスコルビン酸が追補される。いくつかの実施形態では、分化
集団の細胞の10%超が、単一ホルモンのインスリン陽性細胞である。いくつかの実施形
態では、本発明の方法によって生成された培養物中の膵臓内胚葉細胞の30%超は、PD
X−1+、NKX6.1+、SOX2−、及びCDX2−である。

0022

一実施形態において、本発明は、ヒト胚性幹細胞を膵臓β細胞に分化するためのインビ
トロの方法に関し、この方法は、a)胚体内胚葉(DE)の集団を生成するために、グル
コース、TGF−Bリガンド及びWNT活性化剤を追補した培地中で未分化ヒト胚性幹細
胞を培養する工程、b)腸管細胞の集団を生成するためにグルコース及びFGFリガンド
を追補した培地中でDE細胞を培養する工程、c)PDX−1及びSOX2を発現する後
方前腸内胚葉細胞の集団を生成するために、グルコース、shh阻害剤、FGFリガンド
、PKC活性化剤、TGF−Bリガンド、レチノイド及びBMP阻害剤の勾配を追補した
地中で腸管細胞を培養する工程、d)PDX−1及びNKX6.1を発現する膵臓前腸
細胞の集団を生成するために、グルコース、PKC活性化剤、shh阻害剤、レチノイド
及びBMP阻害剤を追補した倍地中で後方前腸細胞を培養する工程、e)PDX−1及び
膵臓前腸細胞と比較してより高いレベルのNKX6.1並びにより低いレベルのSOX2
を発現する膵臓内胚葉細胞の集団を得るために、グルコース、shh阻害剤、TGF−B
阻害剤及びレチノイドを追補した倍地中で膵臓前腸細胞を培養する工程、及びf)膵臓内
胚葉細胞を膵臓β細胞集団に分化する工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方
法により生成される膵臓β細胞集団は、PDX−1+、NKX6.1+、SOX2−、及
びCDX2−である。いくつかの実施形態では、段階的分化方法の少なくとも一工程にお
いて、培地に更にアスコルビン酸を追補する。いくつかの実施形態では、本発明の方法に
より得られる膵臓β細胞は、単一ホルモンのインスリン産生細胞であり、NKX6.1+
及びPDX−1+でもある。

図面の簡単な説明

0023

実施例1に従って分化された細胞におけるアイソタイプコントロールのマーカーのS3の2日目のFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化された細胞におけるクロモグラニンのマーカーのS3の2日目のFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化された細胞におけるKI−67のマーカーのS3の2日目のFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化された細胞におけるNKX6.1のマーカーのS3の2日目のFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化された細胞におけるSOX2のマーカーのS3の2日目のFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化された細胞におけるCDX2のマーカーのS3の2日目のFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化された細胞におけるPDX−1のマーカーのS3の2日目のFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S4の2日目に収穫した細胞におけるアイソタイプコントロールのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S4の2日目に収穫した細胞におけるクロモグラニンのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S4の2日目に収穫した細胞におけるKI−67のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S4の2日目に収穫した細胞におけるNKX6.1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S4の2日目に収穫した細胞におけるSOX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S4の2日目に収穫した細胞におけるCDX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S4の2日目に収穫した細胞におけるPDX−1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の2日目に収穫した細胞におけるアイソタイプコントロールのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の2日目に収穫した細胞におけるクロモグラニンのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の2日目に収穫した細胞におけるKI−67のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の2日目に収穫した細胞におけるNKX6.1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の2日目に収穫した細胞におけるSOX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の2日目に収穫した細胞におけるCDX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の2日目に収穫した細胞におけるPDX−1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の7日目に収穫した細胞のアイソタイプコントロールのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の7日目に収穫した細胞のクロモグラニンのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の7日目に収穫した細胞のKI−67のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の7日目に収穫した細胞のNKX6.1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の7日目に収穫した細胞のSOX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の7日目に収穫した細胞のCDX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の7日目に収穫した細胞のPDX−1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の2日目に収穫した細胞のクロモグラニン(y軸)及びCDX2(x軸)のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各プロットの共発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の2日目に収穫した細胞のクロモグラニン(y軸)及びSOX2(x軸)のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各プロットの共発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化され、S5の2日目に収穫した細胞のクロモグラニン(y軸)及びNKX6.1(x軸)のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各プロットの共発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるCDX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるCD142の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるFOXE1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるHNF4−アルファの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX2.1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX2.2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX6.1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるOSR1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPDX−1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPROX1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPTF1aの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるSOX17の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるSOX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるイヌリンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるZIC1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるクロモグラニンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるグルカゴンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNgn3の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNeuroDの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例1に従って分化し、S2、S3、S4及びS5で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるソマトスタチンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例2に従って分化し、S2、S3、又はS4の3日目に収穫したH1細胞株の細胞におけるNKX6.1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例2に従って分化し、S2、S3、又はS4の3日目に収穫したH1細胞株の細胞におけるPDX−1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例2に従って分化し、S2、S3、又はS4の3日目に収穫したH1細胞株の細胞におけるクロモグラニンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例2に従って分化し、S2、S3、又はS4の3日目に収穫したH1細胞株の細胞におけるNGN3の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例2に従って分化し、S2、S3、又はS4の3日目に収穫したH1細胞株の細胞におけるCDX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例2に従って分化し、S2、S3、又はS4の3日目に収穫したH1細胞株の細胞におけるアルブミンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例2に従って分化し、S2、S3、又はS4の3日目に収穫したH1細胞株の細胞におけるSOX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例3に従って分化し、S2、S3、S4、又はS5で収穫したH1細胞におけるNKX6.1のマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例3に従って分化し、S2、S3、S4、又はS5で収穫したH1細胞におけるPDX−1のマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例3に従って分化し、S2、S3、S4、又はS5で収穫したH1細胞におけるNGN3のマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例3に従って分化し、S2、S3、S4、又はS5で収穫したH1細胞におけるNeuroDのマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例3に従って分化し、S2、S3、S4、又はS5で収穫したH1細胞におけるクロモグラニンのマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例3に従って分化し、S2、S3、S4、又はS5で収穫したH1細胞におけるCDX2のマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例3に従って分化し、S2、S3、S4、又はS5で収穫したH1細胞におけるSOX2のマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例4に従って分化し、S3及びS4の4日目に収穫したH1細胞におけるNKX6.1のマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例4に従って分化し、S3及びS4の4日目に収穫したH1細胞におけるPDX−1のマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例4に従って分化し、S3及びS4の4日目に収穫したH1細胞におけるクロモグラニンのマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例4に従って分化し、S3及びS4の4日目に収穫したH1細胞におけるNGN3のマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例4に従って分化し、S3及びS4の4日目に収穫したH1細胞におけるNeuroDのマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例4に従って分化し、S3及びS4の4日目に収穫したH1細胞におけるCDX2のマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例4に従って分化し、S3及びS4の4日目に収穫したH1細胞におけるアルブミンのマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例4に従って分化し、S3及びS4の4日目に収穫したH1細胞におけるSOX2のマーカーの発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例5に従って分化し、第4段階で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX6.1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例5に従って分化し、第4段階で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPDX−1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例5に従って分化し、第4段階で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるクロモグラニンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例5に従って分化し、第4段階で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNGN3の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例5に従って分化し、第4段階で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNeuroDの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例5に従って分化し、第4段階で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるCDX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例5に従って分化し、第4段階で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるアルブミンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例5に従って分化し、第4段階で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるSOX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例6に従って分化し、S3又はS6の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX6.1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例6に従って分化し、S3又はS6の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPDX−1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例6に従って分化し、S3又はS6の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるクロモグラニンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例6に従って分化し、S3又はS6の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNGN3の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例6に従って分化し、S3又はS6の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNeuroDの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例6に従って分化し、S3又はS6の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるCDX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例6に従って分化し、S3又はS6の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるアルブミンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例6に従って分化し、S3又はS6の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるSOX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例7に従って分化し、S3、S4、又はS5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX6.1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例7に従って分化し、S3、S4、又はS5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPDX−1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例7に従って分化し、S3、S4、又はS5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるクロモグラニンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例7に従って分化し、S3、S4、又はS5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNGN3の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例7に従って分化し、S3、S4、又はS5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNeuroDの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例7に従って分化し、S3、S4、又はS5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるCDX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例7に従って分化し、S3、S4、又はS5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるSOX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例8に従って分化し、S3、S4、S5、又はS6で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX6.1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例8に従って分化し、S3、S4、S5、又はS6で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPDX−1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例8に従って分化し、S3、S4、S5、又はS6で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるクロモグラニンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例8に従って分化し、S3、S4、S5、又はS6で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNGN3の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例8に従って分化し、S3、S4、S5、又はS6で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNeuroDの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例8に従って分化し、S3、S4、S5、又はS6で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるCDX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例8に従って分化し、S3、S4、S5、又はS6で収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるSOX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例9に従って分化された細胞のS3の4日目のアイソタイプコントロールのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS3の4日目のクロモグラニンのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS3の4日目のKI−67のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS3の4日目のNKX6.1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS3の4日目のSOX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS3の4日目のHNF3BのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS3の4日目のCDX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS3の4日目のPDX−1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の2日目のアイソタイプコントロールのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の2日目のNKX6.1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の2日目のKI−67のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の2日目のクロモグラニンのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の2日目のSOX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の2日目のCDX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の2日目のPDX−1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の4日目のアイソタイプコントロールのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の4日目のNKX6.1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の4日目のクロモグラニンのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の4日目のSOX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の4日目のCDX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化された細胞のS4の4日目のPDX−1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例9に従って分化し、S1D3、S2D3、S3D4、S4D2、及びS4D4に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるCDX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例9に従って分化し、S1D3、S2D3、S3D4、S4D2、及びS4D4に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるHHexの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例9に従って分化し、S1D3、S2D3、S3D4、S4D2、及びS4D4に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるFOXE1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例9に従って分化し、S1D3、S2D3、S3D4、S4D2、及びS4D4に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるIPF1(PDX−1)の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例9に従って分化し、S1D3、S2D3、S3D4、S4D2、及びS4D4に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX2.1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例9に従って分化し、S1D3、S2D3、S3D4、S4D2、及びS4D4に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX2.2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例9に従って分化し、S1D3、S2D3、S3D4、S4D2、及びS4D4に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX6.1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例9に従って分化し、S1D3、S2D3、S3D4、S4D2、及びS4D4に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPROX1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例9に従って分化し、S1D3、S2D3、S3D4、S4D2、及びS4D4に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるSOX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例9に従って分化し、S1D3、S2D3、S3D4、S4D2、及びS4D4に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるSOX9の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例10に従って分化された細胞のS3の3日目のアイソタイプコントロールのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS3の3日目のNKX6.1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS3の3日目のクロモグラニンのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS3の3日目のSOX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS3の3日目のCDX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS3の3日目のKI−67のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS3の3日目のPDX−1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS4の5日目のアイソタイプコントロールのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS4の5日目のNKX6.1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS4の5日目のクロモグラニンのマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS4の5日目のSOX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS4の5日目のCDX2のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS4の5日目のKI−67のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例10に従って分化された細胞のS4の5日目のPDX−1のマーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。
実施例11に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるソマトスタチンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例11に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPDX1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例11に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPax6の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例11に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPax4の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例11に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX6.1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例11に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNGN3の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例11に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるグルカゴンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例11に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNeuroDの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例11に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるインスリンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例11に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるクロモグラニンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例12に従って分化し、S4の2日目、S5の2日目、及びS5の9日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるソマトスタチンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例12に従って分化し、S4の2日目、S5の2日目、及びS5の9日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPDX1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例12に従って分化し、S4の2日目、S5の2日目、及びS5の9日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPax6の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例12に従って分化し、S4の2日目、S5の2日目、及びS5の9日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPax4の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例12に従って分化し、S4の2日目、S5の2日目、及びS5の9日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX6.1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例12に従って分化し、S4の2日目、S5の2日目、及びS5の9日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNGN3の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例12に従って分化し、S4の2日目、S5の2日目、及びS5の9日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNeuroDの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例12に従って分化し、S4の2日目、S5の2日目、及びS5の9日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるインスリンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例12に従って分化し、S4の2日目、S5の2日目、及びS5の9日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるグルカゴンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例12に従って分化し、S4の2日目、S5の2日目、及びS5の9日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるクロモグラニンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPax4の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPax6の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPDX1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるPTF1aの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるグルカゴンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるインスリンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNeuroDの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるngn3の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるZic1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるCDX2の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるアルブミンの遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。
実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけるNKX6.1の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。

0024

開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形
態」を本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を、説明又は例示する下記の小項目に分
割する。

0025

定義
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化
細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む
子孫細胞を生成することができる。幹細胞はまた、複数の胚葉(内胚葉、中胚葉及び外胚
葉)から様々な細胞系統機能性細胞へとインビトロで分化する能力を特徴とする。幹細
胞はまた、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞注入後、実質的に(全てでは
ないとしても)ほとんどの組織に寄与する。

0026

幹細胞は、発生能によって、(1)全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能
性、(2)全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、(3)細胞系統の小集合を生じる
が、すべて特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じる能力を意味する複能性(
例えば、造血幹細胞(HSC)は、HSC(自己再生)、血液細胞に限定された寡能性前
駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素(例えば、血小板)を含む
後代を産生できる)、(4)複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系統の小集合
を生じる能力を意味する寡能性、並びに(5)1つの細胞系統(例えば、精子形成幹細胞
)を生じる能力を意味する単能性分類される。

0027

分化は、特殊化されていない(「中立の」)又は比較特殊化されていない細胞が、例え
ば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。「分
化した細胞」又は「分化誘導された細胞」とは、細胞の系統内でより特殊化した(「コミ
ットした」)状況にある細胞である。分化プロセスに適用された際の用語「コミットした
」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ通常の環境
下で異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ったりすることができない地点
で、分化経路において進行した細胞を指す。「脱分化」は、細胞が細胞系統内で比較的特
殊化されて(又は拘束されて)いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される
場合、細胞系統は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞
を生じ得るかを規定する。ある細胞の系統とは、所定の発生及び分化の遺伝体系内にその
細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型
と特異的に関連した特徴を指し、分化決定されていない細胞の、対象とする系統への分化
を評価するために使用することができる。

0028

本明細書で言うところの「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸
又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベ
ルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチド
検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低い
ことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞
を他の細胞から識別及び区別することが可能である。

0029

本明細書で使用する細胞は、特異的マーカーが細胞内で検出されたとき、特異的マーカ
ー「について陽性」又は「陽性」である。同様に、細胞は、特異的マーカーが細胞内で検
出されないとき、特異的マーカー「について陰性」又は「陰性」である。

0030

本明細書で使用する「ステージ1」及び「S1」は、胚体内胚葉(DE)に特徴的なマ
ーカーを発現する細胞を同定するために互換的に使用される。

0031

本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸
管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を有する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下の
マーカーの少なくとも1つを発現する:HNF3β、GATA4、SOX17、CXCR
4、ケルベロス、OTX2、グースコイド、C−Kit、CD99、及びMIXL1。

0032

本明細書で使用するとき、「腸管」は、以下のマーカーのうちの少なくとも一つを発現
する胚体内胚葉に由来する細胞を指す:HNF3−β、HNF1−β、又はHNF4−α
。腸管細胞は、肺、肝臓、膵臓、胃、及び腸などの全ての内胚葉臓器を生じさせ得る。

0033

本明細書で使用するとき、原腸管に特徴的なマーカーを発現する細胞を特定する「ステ
ージ2」及び「S2」は互換的に使用される。

0034

「前腸内胚葉」とは、食道、肺、胃、肝臓、膵臓、胆嚢、及び十二指腸の一部を生じさ
せる内胚葉細胞を指す。

0035

「後方前腸」は、後方胃、膵臓、肝臓、及び十二指腸の一部を生じさせることができる
内胚葉細胞を指す。

0036

中腸内胚葉」は、腸、十二指腸の一部、虫垂、及び上行結腸を生じさせることができ
る内胚葉細胞を指す。

0037

「後腸内胚葉」は、横行結腸遠位3分の1、下行結腸S状結腸、及び直腸を生じさ
せることができる内胚葉細胞を指す。

0038

「ステージ3」及び「S3」の双方は、前腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞
を特定するために互換的に使用される。「前腸系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」
は、本明細書で使用するとき、以下のマーカーの少なくとも1つを発現する細胞を指す:
PDX−1、FOXA2、CDX2、SOX2、及びHNF4 α。

0039

「ステージ4」及び「S4」は、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞
を特定するために互換的に使用される。本明細書で使用するとき、「膵臓前腸前駆細胞系
統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、以下のマーカーの少なくとも1つを発現する
細胞を指す:PDX−1、NKX6.1、HNF6、FOXA2、PTF1a、Prox
1、及びHNF4 α。

0040

本明細書で使用するとき、「ステージ5」及び「S5」は、膵臓内胚葉及び膵内分泌前
駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を特定するために互換的に使用される。本明細
書で使用するとき、「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、以下のマ
ーカーの少なくとも1つを発現する細胞を指す:PDX1、NKX6.1、HNF1 β
、PTF1 α、HNF6、HNF4 α、SOX9、HB9、又はPROX1。膵臓内
胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、CDX2又はSOX2を実質的に発現し
ない。

0041

本明細書で使用するとき、「ステージ6」及び「S6」は、膵内分泌細胞が濃縮された
細胞を特定するために互換的に使用される。

0042

本明細書で使用するとき、「膵内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」又は「膵内
分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のホルモンの少なくとも1つを
発現することが可能な細胞を指す:インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓
ポリペプチド。

0043

「膵内分泌前駆細胞」又は「膵内分泌前駆細胞」は、細胞を発現する膵臓ホルモンにな
り得る膵臓内胚葉細胞を指す。そのような細胞は、以下のマーカーの少なくとも1つを発
現し得る:NGN3、NKX2.2、NeuroD、ISL−1、Pax4、Pax6、
又はARX。

0044

本明細書で使用する「機能的膵臓β細胞」は、グルコース応答性でありかつPDX−1
及びNKX6.1について陽性となり得る単一ホルモンのインスリン陽性細胞を指す。

0045

本明細書では、「d1」、「d 1」、及び「1日目」、「d2」、「d 2」、及び
「2日目」、「d3」、「d 3」及び「3日目」等は互換的に使用される。これらの数
字の組み合わせは、本願の段階的分化プロトコル中の異なるステージにおけるインキュ
ションの日を特定する。

0046

「アスコルビン酸」及び「ビタミンC」は、本明細書で互換的に使用され、ヒト及び他
動物種のための必須栄養素に関する。

0047

「グルコース」及び「D−グルコース」は、本明細書で互換的に使用され、天然に一般
に見出される糖、デキストロースを指す。

0048

特定のマーカーについて「陽性」又はマーカー「+」(すなわちPDX−1+)の細胞
は、その特定のマーカーが検出され得る細胞である。特定のマーカーについて「陰性」又
はマーカー「−」(すなわちNKX6.1−)の細胞は、本明細書において教示される方
法によってそのマーカーが検出されない細胞である。

0049

本願では、「クロモグラニン」及び「CHGN」は、酸性の分泌糖タンパク質クロモグ
ラニンをコードする遺伝子を特定するために互換的に使用される。

0050

膵内分泌前駆細胞において発現されるタンパク質及びそれをコードする遺伝子を特定す
る「NeuroD」及び「NeuroD1」は、本明細書で互換的に使用される。

0051

「LDN」及び「LDN−193189」は本明細書で互換的に使用され、米国カリフ
ォルニア州のStemgentから入手可能なBMP受容体を示す。

0052

多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原SSEA)3及び4、並びにTra−1−6
0及びTra−1−81と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの1つ以上を
発現している(Thomsonら、Science 282:1145,1998)。イ
ビトロでの多能性幹細胞の分化は、SSEA−4、Tra−1−60、及びTra−1
−81の発現の消失をもたらす。未分化多能性幹細胞は、一般にアルカリホスファターゼ
活性を有し、これは、製造業者(米国カリフォルニア州Vector Laborato
ries)により説明されているように、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定した後
基質としてVector Redを使用して現像することにより検出することができる
。未分化の多能性幹細胞はまた、RT−PCRにより検出されるように、一般にOCT
及びTERTも発現する。

0053

増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、3つの胚葉のすべて、すなわち、内
胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば
細胞をSCIDマウスに注入し、4%パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇形
腫を固定した後、それらを3つの胚葉からの細胞型の痕跡に関して組織学的に検査するこ
とにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を3
つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。

0054

増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なGバンド法を使用し、対応する霊長類種発表
されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は「正常な核型」
を有することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がす
べて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性細胞は、様々なフィーダ
ー層を用いて、又はマトリックスタンパク質被覆した容器を用いて、容易に培養で増殖さ
せることができる。あるいは、mTesr(商標)1培地(カナダ、Vancouver
のStemCell Technologies)のような定義された培地と組み合わせ
化学的に定義された表面を、細胞のルーチン増殖に用いてもよい。多能性細胞は、酵素
で、若しくは機械的に、又はEDTAエチレンジアミン四酢酸)など様々なカルシウム
キレート剤を用いて、培養プレートから容易に取り出すことができる。あるいは、多能性
細胞は、マトリックスタンパク質又はフィーダー層非存在下で、懸濁液中で増殖させて
もよい。

0055

多能性幹細胞の供給源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期(必ずしもではな
いが、通常は妊娠約10〜12週よりも前)に採取した前胚性組織(例えば胚盤胞など)
、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立
が含まれる。非限定的な例は、ヒト胚性幹細胞(hESCs)又はヒト胚生殖細胞の樹立
株であり、例えば、ヒト胚性幹細胞株H1、H7、及びH9(米国ウィスコシン州Ma
disonのWiCell Research Institute)などである。フィ
ーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。
また、OCT4、Nanog、Sox2、KLF4、及びZFP42など多数の多能性に
関係する転写因子の強制発現を用いて、成体体細胞から誘導することができる誘導性多能
性細胞(IPS)又は再プログラム化された多能性細胞も好適である(Annu Rev
Genomics Hum Genet,2011,12:165〜185)。本発明
の方法に使用されるヒト胚性幹細胞は、Thomsonらによって記述されたように調製
してもよい(米国特許第5,843,780号;Science,1998,282:1
145;Curr.Top.Dev.Biol.,1998,38:133;Proc.
Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1995:92:7844)。

0056

多能性幹細胞からの、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同
定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、すなわち、ABC
G2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OC
T4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA−3、SS
EA−4、Tra 1−60、Tra 1−81の1つ以上の発現が挙げられる。

0057

本発明で用いるのに好適な多能性幹細胞としては、例えば、ヒト胚性幹細胞株H9(N
IHコード:WA09)、ヒト胚性幹細胞株H1(NIHコード:WA01)、ヒト胚性
幹細胞株H7(NIHコード:WA07)、及びヒト胚性幹細胞株SA002(Cell
artis,Sweden)が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、すな
わち、ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、CONNEXIN43、CON
NEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42
、SSEA−3、SSEA−4、Tra 1−60、及びTra 1−81のうちの少な
くとも1つを発現する細胞も本発明で用いるのに好適である。

0058

胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、SOX17、GATA4、HNF3 β、GSC
、CER1、Nodal、FGF8、短尾奇形、Mix様ホメオボックスタンパク質、F
GF4、CD48、エオメソダーミン(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA
6、CXCR4、C−Kit、CD99、及びOTX2からなる群から選択される。胚体
内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも1つを発現している細胞は本発明での使
用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している
細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発
現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカ
ーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。

0059

膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、PDX1、NKX6.1、HNF1 β、PTF
1 α、HNF6、HNF4 α、SOX9、HB9、及びPROX1からなる群から選
択される。膵臓内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも1つを発現する
細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内胚葉系統に特徴的
なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞であり、PDX−1及びNKX6.1の発
現はCDX2及びSOX2の発現より実質的に高い。

0060

膵内分泌系統に特徴的なマーカーは、NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、
NKX6.1、PAX4、ARX、NKX2.2、及びPAX6からなる群から選択され
る。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカ
ゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも1つを発現することが
できる。本発明で使用するに好適なものは、膵内分泌系統の特徴を示すマーカーを少なく
とも1つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系統に特徴的なマーカ
ーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞
であってよい。あるいは、膵内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。

0061

本発明の一態様では、膵内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現している
細胞である。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、PDX1と、以下の転写
因子、すなわち、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF3 β
、MAFA、PAX4、及びPAX6のうちの少なくとも1つを発現する。本発明の一態
様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞である。

0062

本発明は、PDX−1及びNKX6.1陽性でもある単一ホルモンのインスリン陽性細
胞を生成し得るインビトロの方法及び細胞集団を説明する。本発明で使用される方法は、
以下の中間ステージを経てヒト多能性細胞から単一ホルモンの細胞への分化を段階的に導
一連のステージを含む。
a)グルコース、TGF−Bリガンド、及びWNT活性化剤を含む培地中で多能性細胞
を培養する工程を含む、未分化ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉(DE)細胞の生成。
b)グルコース、ビタミンC、及びFGFリガンドを含む培地中でDE細胞を培養する
工程を含む、腸管細胞へのDE細胞の分化。
c)PDX−1及びSOX2を発現する後方前腸内胚葉細胞への腸管細胞の分化。この
分化は、shh阻害剤、BMP阻害剤、TGF−Bリガンド、FGFリガンド、レチノイ
ン酸、ビタミンC、及びPKC活性化剤の存在下で腸管細胞を培養することによって達成
される。
d)後方前腸細胞を、PDX−1及びNKX6.1を発現し、かつ後方前腸細胞と比較
して低いレベルのSOX2を発現する膵臓前腸細胞に分化する工程。この分化は、shh
阻害剤、BMP阻害剤、低用量のレチノイン酸、ビタミンC、及びPKC活性化剤の存在
下で後方前腸細胞を培養することによって達成される。
e)膵臓前腸細胞を、PDX−1及び、膵臓前腸細胞と比較して高いレベルのNKX6
.1並びに低いレベルのSOX2を発現する膵臓内胚葉細胞に分化する工程。この分化は
、shh阻害剤、TGF−B阻害剤、低用量のレチノイン酸、及びビタミンCを追補した
倍地中で膵臓前腸細胞を培養することにより達成される。
f)膵臓内胚葉細胞を、膵内分泌前駆細胞に分化し、続いて、単一ホルモンの膵内分泌
細胞に分化する工程。この分化は、shh阻害剤、低用量のレチノイン酸、及びビタミン
Cを追補した倍地中で膵臓内胚葉細胞を培養することにより達成される。

0063

一実施形態では、段階的分化の全ステージにおいて、細胞は、25mM未満のグルコー
スを含有する培地製剤において培養される。いくつかの実施形態では、グルコース濃度
、約8mM〜約20mMのグルコースの範囲内である。

0064

いくつかの実施形態では、腸管ステージの細胞を生成するための及びその後の全ての工
程に使用される培地製剤は、アスコルビン酸(ビタミンCとしても知られる)を含有する
。一実施形態では、アスコルビン酸の濃度は約0.01mM〜約1mMである。一実施形
態では、アスコルビン酸の濃度は約0.1mM〜約0.5mMである。

0065

本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定さ
れるものではない。

0066

(実施例1)
ウシ胎児血清の非存在下での、膵内分泌前駆細胞への細胞株H1のヒト胚性幹細胞の分
化−BMP/TGF−B経路の調節は膵臓内胚葉集団の産生の改善及びSOX2+集団の
百分率の低下をもたらす。
この実施例は、CDX2及びSOX2の低レベルの発現を有する一方でPDX−1及び
NKX6.1の非常に高い発現レベルを有する膵臓内胚葉培養物が生成され得ることを示
すために実施した。

0067

ヒト胚性幹細胞株H1(hESCH1)は、多様な継体(継体40〜継体52)で収
穫し、10μMのY27632(Rock阻害剤、カタログ番号Y0503、米国ミズー
リ州のSigmaAldrich)を追補したmTeSR(登録商標)1培地(カナダ、
VancouverのStemCell Technologies)において、単一細
胞として、1cm2当たり細胞100,000個の濃度で、MATRIGEL(商標)(
1:30希釈、米国ニュージャージー州のBD Biosciences)で被覆された
皿上に播種した。播種の48時間後に、培養物を不完全PBS(Mg又はCaを含まな
リン酸緩衝生理食塩水)中で約30秒間洗浄し、インキュベートした。培養物は、以下
のようにして膵内分泌系統に分化させた。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−3日):ステージ1の培地(0.1%の無脂肪
BSA(カタログ番号68700、米国アイオワ州のProliant)、0.001
2g/mLの重炭酸ナトリウム(カタログ番号S3187、米国ミズーリ州のSigma
Aldrich)、1X GlutaMax(商標)(カタログ番号35050−079
、Invitrogen)、5mMのD−グルコース(カタログ番号G8769、米国ミ
ズーリ州のSigmaAldrich)が追補された、100ng/mLのGDF8(米
ミネソタ州R&D Systems)及び1μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤、
14−Prop−2−エン−1−イル−3,5,7,14,17,23,27−ヘプタ
テトラシクロ[19.3.1.1〜2,6〜.1〜8,12〜]ヘプタコサ−1(25
),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23−ノナエン−16−オン
米国特許出願第12/494,789号、参照によりその全容が本明細書に援用される)
を含有するMCDB−131培地(カタログ番号10372−019、米国カリフォルニ
ア州のInvitrogen)中で、細胞を1日培養した。次いで、0.1%の無脂肪酸
BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、
5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、及び100nMのMCX化合物
を追補したMCDB−131倍地中で細胞を1日培養した。次いで、0.1%の無脂肪酸
BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、
5mMのD−グルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131
倍地中で細胞を1日培養した。
b.ステージ2(原腸管−2日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、
0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMの
D−グルコース、及び25ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で2日
間処理した。
c.ステージ3(前腸−2日):ステージ2の細胞を、ステージ3の培地(ITS−X
(Invitrogen)の1:200希釈液)、2.5mMのグルコース、1X Gl
utaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BS
A、25ng/mLのFGF7、10ng/mLのアクチビン−A(R & D sys
tems)、0.25μMのSANT−1(shh阻害剤、SigmaAldrich)
、1μMのレチノイン酸(RA)(SigmaAldrich)、及び200nMのTP
B(PKC活性化剤、カタログ番号565740;米国ニュージャージー州のEMD)を
追補した、100nMのLDN−193189(BMP受容体阻害剤;カタログ番号04
−0019;米国カリフォルニア州のStemgent)を含有するMCDB−131倍
地)中で、1日培養した。次いで、それらの細胞を、10nMのLDN−193189を
追補したステージ3の培地中で更に1日培養した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−2日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:
200希釈、2.5mMのグルコース、1XのGlutaMax(商標)、0.0015
g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、5
0nMのRA、200nMのTPB、及び50nMのLDN−193189を追補したM
CDB−131倍地中で2日培養した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉−2〜7日):ステージ4の細胞を、ITS−Xの1:2
00希釈、2.5mMのグルコース、1XのGlutaMax(商標)、0.0015g
/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、及び
50nMのRAを追補したMCDB−131倍地中で2〜7日培養した。

0068

特定のステージで、リアルタイムPCR、免疫組織化学、又は蛍光活性細胞選別(F
ACS)により試料収集し、解析した。

0069

FACS解析については、hESC由来の細胞をTrypLEExpress(カタ
ログ番号12604、Invitrogen)にて37℃で3〜5分間インキュベートす
ることによって単一細胞懸濁液中に放出した。次いで、細胞を染色緩衝液(0.2%無脂
肪酸BSAを含有するPBS)(カタログ番号554657、米国ニュージャージー州の
BD Biosciences)において2回洗浄した。細胞内抗体染色については、細
胞を最初にGreen Fluorescent LIVE/DEAD細胞染料(Inv
itrogenカタログ番号L23101)にて4℃で20分間インキュベートして、解
析中の生/死の区別を可能にし、次いで、冷たいPBSにて一回洗浄した。細胞を250
μLのCytofix/Cytoperm Buffer(BD Bioscience
sカタログ番号554722)にて4℃で20分間固定し、次いで、BD Perm/W
ash Buffer Solution(BD Biosciencesカタログ番号
554723)で2回洗浄した。細胞を、(二次抗体の適切な種の)2%正常血清を追補
したPerm/Wash緩衝液からなる染色/ブロッキング溶液100μL中に再懸濁
た。次いで、経験的に予め決定した希釈で一次抗体を用いて細胞を4℃で30分間インキ
ュベートし、次いで、Perm/Wash緩衝液にて2回洗浄した。最後に、適切な二次
抗体を用いて細胞を4℃で30分間インキュベートし、次いで、Perm/Wash緩衝
液で2回洗浄してから、BD FACS Canto IIで解析した。

0070

以下の希釈の一次抗体を使用した。ウサギ抗インスリン(1:100;カタログ番号C
27C9、米国マサチューセッツ州のCell Signaling)、マウス抗インス
リン(1:100;カタログ番号ab6999、米国マサチューセッツ州のAbcam)
、マウス抗グルカゴン(1:1250;カタログ番号G2654;Sigma−Aldr
ich)、ウサギ抗シナプトフィジン(1:100;カタログ番号A0010、米国カリ
フォルニア州のDako)、ウサギ抗クロモグラニンA(1:800;Dako)、マウ
ス抗NKX6.1(1:50;DSHB、米国アイオワ州のUniversity of
Iowa)、マウス抗CDX2(1:250;Invitrogen)、ヤギ抗Neu
roD(1:500;R&D Systems)、マウス抗SOX2(米国カリフォルニ
ア州のBD)、マウス抗NKX2.2(DSHB)、マウス抗Pax6(米国カリフォル
ニア州のBD)、マウス抗PDX−1(米国カリフォルニア州のBD)。以下の希釈で二
次抗体を使用した。ヤギ抗マウスAlexa 647(1:500;Invitroge
n)、ヤギ抗ウサギPE(1:200;Invitrogen)、ロバ抗ヤギ(1:80
0;Invitrogen)。二次抗体を添加後に、試料を4℃で30分間インキュベー
トし、次いで、Perm/Wash緩衝液にて最終洗浄した。BDFACSDiva
ソフトウェアを使用して細胞をBD FACS Canto IIで解析し、少なくとも
30,000イベントを獲得した。

0071

図1A図1Gは、実施例1に従って分化し、S3の2日目に解析した細胞のアイソタ
イプコントロール(図1A)、クロモグラニン(図1B)、KI−67(図1C)、NK
X6.1(図1D)、SOX2(図1E)、CDX2(図1F)、PDX−1(図1G
のFACSヒストグラム発現プロファイルを図示する。各マーカーの発現百分率を各ヒス
グラムに示す。ステージ3の2日目に、細胞の95%以上がPDX−1(図1G)の発
現について陽性であり、集団の細胞の約60%がSOX2(図1E)の発現について陽性
であったが、CDX2(図1F)若しくはNKX6.1(図1D)、又はクロモグラニン
図1B)について陽性であったのは細胞の10%未満であった。KI−67陽性細胞の
百分率の高さによって示されているように、ステージ3では、有意な百分率の細胞が活性
細胞周期にあった(図1C)。

0072

図2A図2Gは、実施例1に従って分化し、S4の2日目に収穫した細胞の、FA
S染色により決定したアイソタイプコントロール(図2A)、クロモグラニン(図2B
、KI−67(図2C)、NKX6.1(図2D)、SOX2(図2E)、CDX2(図
2F)、PDX−1(図2G)の発現プロファイルを図示する。各マーカーの発現百分率
を各ヒストグラムに示す。ステージ3と同様に、細胞の95%以上がPDX−1(図2G
)の発現について陽性であったが、CDX2の発現(図2F)については細胞の約10%
が陽性であり、NKX6.1の発現(図2D)については細胞の約40%が陽性であった
。SOX2の発現(図2E)については細胞の約45%が陽性であり、これはS3より6
0%低い。クロモグラニンの発現は約3%であった(図2B)。KI−67陽性細胞(図
2C)の百分率の高さによって示されているように、ステージ4では、有意な百分率の細
胞が活性細胞周期にあった。

0073

図3A図3Gは、本実施例に概略を記載した分化プロトコルに続いて、ステージ5の
2日目に収穫した細胞のFACS解析により決定した相対発現プロファイルを図示する。
図3A:アイソタイプコントロール;図3B:クロモグラニン;図3C:KI−67;図
3D:NKX6.1;図3E:SOX2;図3F:CDX2;図3G:PDX−1。各マ
ーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。ステージ3及び4と同様に、細胞の95%
以上がPDX−1の発現について陽性であったが、CDX2の発現については細胞の約1
0%が陽性であり、NKX6.1の発現については細胞の約67%以上が陽性であった。
SOX2の発現は約50%であり、ステージ3と比較すると低いが、S4での発現と同様
であった。

0074

図4A図4Gは、本実施例に概略を記載したプロトコルに従った分化のステージ5の
7日目に収穫し解析した細胞のFACS染色により測定したときのPDX−1(図4G
、NKX6.1(図4D)、CDX2(図4F)、SOX2(図4E)、Ki−67(増
殖マーカー;図4C)、及びクロモグラニン(膵内分泌腺マーカー;図4B)の発現を図
示する。ステージ3及び4と同様に、細胞の>90%がPDX−1について陽性であった
が、CDX2の発現は10%未満であり、NKX6.1の発現は>70%に有意に増加し
、SOX2の発現は約2%に劇的に減少した。

0075

更に、SOX2、CDX2、及びNKX6.1を発現する細胞の大部分は、クロモグラ
ニンの発現について陰性であった(図5A図5Cを参照)。したがって、本実施例に概
略を記載したプロトコルに従って調製されたS5の培養物がもたらす細胞の集団において
、細胞の少なくとも50%はPDX−1及びNKX6.1を発現するが、CDX−2、S
OX2、及びクロモグラニンについては陰性である。表Iは、S3〜S5の様々な内胚葉
マーカーの発現百分率をまとめたものである。

0076

*分化開始以降の総日数

0077

図6A図6Tは、本実施例で概説したプロトコルに従って分化したS2、S3、S4
、及びS5の細胞のリアルタイムPCRによって測定し、未分化H1細胞における発現の
倍数変化として報告したmRNA発現プロファイルを図示する。ステージ3で、FOXe
1(図6C)及びNKX2.1(図6E)のような前方前腸マーカーの非常に低い発現が
認められた。しかし、腸管の胃領域をマークするSOX2(図6M)及びOSR1(図6
H)はステージ3で有意に上方調節され、それらの発現はS4〜S5で低下した。PTF
1a(図6K)、NKX6.1(図6G)、及びPDX−1(図6I)のような膵臓内胚
葉マーカーは、培養のS5の2日目に最大発現レベルに達した。PDRデータは、細胞が
ステージ3でPDX−1+ SOX2+集団を通じた移行を経てからS4〜S5でPDX
−1+ NKX6.1+ SOX2− CDX2−になることを示している(図6I、図
6G、図6M、及び図6Aを参照)。内分泌マーカー(クロモグラニン、インスリン、グ
カゴン、及びソマトステイン)の発現は、S5の終わりに最大発現レベルに達した。膵
内分泌前駆細胞マーカーNKX2.2、NeuroD、及びNGN3の発現は、S4〜S
5で最大発現レベルに達した。ZIC1及びSOX17のような他の系統のマーカーの発
現は、S4〜S5で低いままであった。

0078

結論として、本実施例で概説したプロトコルに従って分化したステージ5の2日目の細
胞は、CDX2及びSOX2を低レベルで発現する一方で、NKX6.1及びPDX−1
の高い発現レベルを維持する。タイムリーなBMP阻害、S4〜S5での低用量RAの使
用、及びS1〜S2での高グルコースの使用という独特の組み合わせが、実施例1に記載
の細胞集団を結果的にもたらしたと考えられる。

0079

(実施例2)
BMPの阻害及びPKC活性化がS3〜S4でSOX2の発現に与える影響
本実施例で概説したプロトコルは、BMPの阻害、FGF7の添加、及びPKCの活性
化がS3〜S4でのSOX2の発現に与える影響を明らかにするために行った。

0080

ヒト胚性幹細胞株H1の細胞は、多様な継体(継体40〜継体52)で収穫し、10μ
MのY27632を追補したmTesr(登録商標)1培地において、単一細胞として、
1cm2当たり細胞100,000個の濃度で、MATRIGEL(商標)(1:30希
釈)で被覆された皿上に播種した。播種から48時間後に、培養物を以下のように膵内分
泌系統の細胞に分化した。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−3日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、
不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1
の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性
幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X
GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF
8、1.5μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で
1日処理した。次いで、2日目〜3日目にかけて、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、
0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5m
Mのグルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で処
理した。
b.ステージ2(原腸管−3日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、
0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5m
MのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で
3日間処理した。
c.ステージ3(前腸−3日):ステージ2の細胞を、50ng/mLのFGF7、5
0nM又は200nMのLDN−193189、及び/又は200nMのTPBの存在下
若しくは非存在下で、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X G
lutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸B
SA、0.25μMのSANT−1、20ng/mLのアクチビン−A、2μMのRAを
追補したMCDB−131倍地で処理した。下の表IIに記載した組み合わせを用いた培
地にて細胞を3日間インキュベートした。

0081

0082

d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−3日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:
200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015
g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、2
00nMのTPB、400nMのLDN−193189、2μMのALk5阻害剤(SD
−208、Molecular Pharmacology 2007,72:152〜
161に開示されている)、及び100nMのCYP26A阻害剤(N−{4−[2−エ
チル−1−(1H−1,2,4−トリアゾル−1−イル)ブチルフェニル}−1,3−
ベンゾチアゾール−2−アミン、ベルギー、Janssen)を追補したMCDB−13
1倍地で3日間処理した。

0083

上記の全ての条件に関し、mRNAをS2〜S4で収集し、リアルタイムPCRを用い
て解析した。S3の対照条件は、FGF7、AA、SANT、RA、及び200nMのL
DN−193189を上記の工程cに記載されている濃度で用いた培養物を指す。図7A
図7Gに示したPCRデータにより明らかなように、S3でのLDN−193189の
除去は、NGN3のような内分泌マーカー(図7D)及びクロモグラニンのような膵内分
泌マーカー(図7Cを参照)の有意な減少をもたらした。S3でのPKC活性化剤の添加
及びLDN−193189の除去は、内分泌マーカーを更に減少させる一方でNKX6.
1の発現を高めた(図7A図7Gを参照)。更に、50nMのLDN−193189の
添加は、内分泌マーカー(クロモグラニン及びNGN3)の誘導において200nMのL
DN−193189に匹敵する有効性を有した。S3でのLDN−193189の除去及
びTPBの添加は、CDX2(図7E)及びアルブミン(図7F)の発現を高める一方で
SOX2(図7G)の発現を抑制した。更に、FGF7及びLDN−193189の両方
の除去は、LDN−193189を除去しFGF7を保持した培養物と比較して、有意に
SOX2(図7G)の発現を高め、アルブミン(図7F)の発現を低下させた。これらの
データは、BMPの阻害、FGFの活性化、及びPKCの活性化の正確な調節が、PDX
−1及びNKX6.1が豊富な一方でCDX2、SOX2及びアルブミンが低い内胚葉ド
メインをもたらし得ることを実証している。最後に、S3〜S4でのBMPの持続的な阻
害は、プロ内分泌遺伝子の発現及びSOX2発現の上方調節を高めた。このことは、膵内
分泌遺伝子を増す一方で、膵臓の発達においては欠如しているか又は低いが胃のような前
方前腸内胚葉臓器に存在するSOX2の発現を上方調節しないように、BMPの阻害を正
確に調整する必要があることを裏付けている。

0084

(実施例3)
続いて内分泌マーカーを誘導するには、前腸ステージでのBMPの早期阻害が必要であ
る。
本実施例は、続いて内分泌マーカーを誘導するにはS3でBMPシグナル伝達を早期に
阻害する必要があることを示す。しかし、ステージ3でのBMPの持続的な阻害もまた、
SOX2の強発現を結果としてもたらす。内分泌マーカーの高発現及びSOX2の低発現
の両方を得るためには、SXO2及びCDX2の低発現を有する一方でプロ膵内分泌マー
カーを誘導するBMP阻害の勾配が必要である。

0085

ヒト胚性幹細胞株H1の細胞は、多様な継体(継体40〜継体52)で、10μMのY
27632を追補したmTesr(商標)1培地において、単一細胞として、1cm2当
たり細胞100,000個の濃度で、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)で被覆
された皿上に播種した。播種から48時間後に、培養物を以下のように膵内分泌系統の細
胞に分化した。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):DEの開始の前に、細胞を洗浄し、不
完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、S1の培地に
てインキュベートした。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒ
ト胚性幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム
、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLの
GDF8、1.5μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131
培地で1日処理した。次いで、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/m
Lの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのグルコース、及
び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で2日間(2〜4日目)
処理した。
b.ステージ2(原腸管−3日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、
0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5m
MのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で
3日間処理した。
c.ステージ3(前腸−3日):ステージ2の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、
2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重
炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、20ng/mL
のアクチビン−A、2μMのRA、50ng/mLのFGF7、100nMのLDN−1
93189(1日目のみ又はステージ3の期間中)、及び200nMのTPBを追補した
MCDB−131倍地で処理した。いくつかの培地では、LDN−193189をステー
ジ3から除去した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−3日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:
200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015
g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、1
00nMのTPB、200nMのLDN−193189、2μMのALk5阻害剤、及び
100nMのCYP26A阻害剤を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉/内分泌−4日):ステージ4の細胞を、ITS−Xの1
:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.001
5g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、200nMのLDN−1931
89、及び2μMのALk5阻害剤を追補したMCDB−131倍地で4日間処理した。

0086

図8A図8Gに示すPCRの結果により明らかなように、ステージ3からのLDN−
193189(BMP阻害剤)の除去は、ステージ4及びステージ5でのプロ内分泌遺伝
子NGN3(図8C)、NeuroD(図8D)、クロモグラニン(図8E)の発現を止
める。しかし、PDX−1(図8B)及びNKX6.1(図8A)の発現は、ステージ4
〜5でのNGN3及びNeuroDと比較して有意に下方調節されない。更に、ステージ
3でのLDN−193189の完全な除去は、CDX2の発現の有意な増加をもたらす(
図7F)。ステージ3の初日のLDN−193189の添加の後、ステージ3の2〜3日
目にそれを除去することは、NGN3及びNeuroDの発現を有意に高める一方で、ス
テージ4でのCDX2及びSOX2の発現を減少させた。ステージ3の期間中LDN−1
93189を保持した培養物は、S3〜S4でSOX2の非常に高い発現を示した(図8
G)。このデータは、ステージ3の1日目のBMPの阻害が、膵内分泌マーカーをトリ
する一方でSOX2及びCDX2の発現を抑制するのに十分であることを示している。

0087

要約すると、ステージ4〜5に内分泌前駆細胞の形成を誘導し、かつPDX−1及びN
KX6.1の発現を維持し、その一方でSOX2の発現を抑制するために、BMPの阻害
はステージ3の1日目に必要である。更に、ステージ3でのPKC活性剤の添加は、PD
X−1及びNKX6.1の発現を更に高めた。

0088

(実施例4)
ステージ3の1日目でのBMPシグナル伝達の阻害は、ステージ4で膵臓前駆細胞を生
成するために十分であり、一方、ステージ3の最終日でのBMPシグナル伝達の阻害は、
内分泌マーカーの発現の有意な低下をもたらす。
本実施例は、ステージ3でのBMPシグナル伝達の早期阻害が、膵内分泌前駆細胞マー
カーの誘導を可能にし、一方、ステージ3の後期でのBMPシグナル伝達の阻害が、ステ
ージ4での内分泌前駆細胞マーカーの発現レベルを有意に低下させることを示している。

0089

多様な継体(継体40〜継体52)のヒト胚性幹細胞株H1の細胞を、10μMのY2
7632を追補したmTesr(商標)1培地において、単一細胞として、1cm2当た
り細胞100,000個の濃度で、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)で被覆さ
れた皿上に播種した。播種から48時間後に、培養物を以下のように膵内分泌系統の細胞
に分化した。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、
不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1
の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性
幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X
GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF
8、及び1.5μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培
地で1日処理した。次いで、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mL
の重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのグルコース、及び
100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
b.ステージ2(原腸管−3日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、
0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5m
MのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で
3日間処理した。
c.ステージ3(前腸−3日):ステージ2の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、
2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重
炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mL
のFGF7、2μMのRA、及び下の表IIIに記載した混合物を追補したMCDB−1
31倍地で3日間処理した。

0090

0091

d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−3日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:
200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015
g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、1
00nMのTPB、200nMのLDN−193189、2μMのALk5阻害剤、及び
100nMのCYP26A阻害剤を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。

0092

図9A図9Hは、上記の培養条件の組み合わせに関しての膵臓内胚葉、内分泌前駆細
胞、及び前腸内胚葉マーカーの遺伝子発現プロファイルを図示する。前述の実施例と同じ
く、ステージ3の1日目のBMP経路の遮断は、膵内分泌マーカー、クロモグラニンの発
現による測定でのその後の内分泌プログラムの誘導のために重要である(図9Cを参照)
。しかし、ステージ3の1日目でのBMP阻害剤の添加は、後続ステージでの内分泌マー
カーの発現をトリガする。更に、ステージ3の1日目でのBMP阻害剤の添加はまた、ス
テージ3〜4で、前腸マーカーであるSOX2の発現を減少させた(図9H)。しかし、
ステージ3の最終日でのみBMP阻害剤を添加することは、ステージ3の1日目でのみB
MP阻害剤で処理した細胞と比較して、ステージ3の終わりに、SOX2の有意により高
い発現を示す。図9A図9Hに示す発現レベルは、SOX2の非常に高い発現レベルを
有する未分化H1細胞の発現レベルに相対している。前方前腸のマーカーであることに加
えて、SOX2は、ES細胞の多能性の維持において重要な周知の転写因子である。本実
施例は、BMPシグナル伝達の持続期間及び動力学に対するステージ3培養物の感度並び
にその後のSOX2の膵内分泌誘導及び発現への影響を明らかにした前述の結果を更に裏
付けている。

0093

(実施例5)
膵臓前腸ステージ(ステージ4)でのBMP阻害の最適用量
前述の実施例では、ステージ3でのBMP阻害の最適な期間について説明した。本実施
例では、S4の培地でのBMP阻害剤の最適な用量を特定する。

0094

多様な継体(継体40〜継体52)のヒト胚性幹細胞株H1の細胞を、mTesr(商
標)1培地において、10μMのY27632と、1cm2当たり細胞100,000個
の濃度で、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)で被覆された皿上に単一細胞とし
て播種した。播種から48時間後に、培養物を以下のように膵内分泌系統の細胞に分化し
た。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、
不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1
の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性
幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X
GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF
8、1μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日
処理した。次いで、2日目〜4日目にかけて、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.
0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMの
グルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で処理し
た。
b.ステージ2(原腸管−3日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、
0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5m
MのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で
3日間処理した。
c.ステージ3(前腸−4日):ステージ2の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、
2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重
炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mL
のFGF7、2μMのRA、20ng/mLのアクチビン−A、100nMのLDN−1
93189、及び100nMのTPBを追補したMCDB−131倍地で1日処理した。
次いで、細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X Glu
taMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA
、0.25μMのSANT−1、50ng/mLのFGF7、2μMのRA、20ng/
mLのアクチビン−A、及び100nMのTPBを追補したMCDB−131倍地中で3
日間処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−4日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:
200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015
g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、200nMのLDN−19318
9、2μMのALk5阻害剤、100nMのCYP26A阻害剤、及び表IV(下記)に
記載した濃度のLDN−193189(LDN-193189-193189)を追補したMCDB−13
1倍地で、ステージ4の1〜4日目にかけて処理した。

0095

0096

d.ステージ5(膵臓内胚葉/内分泌前駆細胞−3日):ステージ4の細胞を、ITS
−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0
.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、50nMのLDN−1
93189、及び1μMのALk5阻害剤を追補したMCDB−131倍地で3日間処理
した。

0097

上記の処理後に収穫した細胞のリアルタイムPCR解析の結果を図10A図10H
示す。この図は、50nM又は100nMのLDN−193189をS4の1日目又は2
日目又は3日目又は4日目に添加することが、内分泌マーカーの発現を延長する一方でS
4〜S5でのSOX2の低発現を維持することができることを示している(図10A〜図
10Hを参照)。

0098

(実施例6)
前腸ステージ(ステージ3)でのBMP阻害の最適用量
本実施例は、ステージ3でのBMP阻害の最適用量、及びその後のステージ6での内分
泌マーカーへの影響を特定する。

0099

ヒト胚性幹細胞株H1の細胞は、多様な継体(継体40〜継体52)で、10μMのY
27632を追補したmTesr(商標)1培地において、単一細胞として、1cm2当
たり細胞100,000個の濃度で、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)で被覆
された皿上に播種した。播種から48時間後に、培養物を以下のように膵内分泌系統の細
胞に分化した。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、
不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1
の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性
幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X
GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF
8、及び1.5μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培
地で1日処理した。次いで、2日目〜4日目にかけて、細胞を、0.1%の無脂肪酸BS
A、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.
5mMのグルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地
で処理した。
b.ステージ2(原腸管−3日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、
0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5m
MのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で
3日間処理した。
c.ステージ3(前腸−3日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、
2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重
炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mL
のFGF7、2μMのRA、20ng/mLのアクチビン−A、100nMのTPB、及
び10〜50nMのLDN−193189を追補したMCDB−131倍地で1日処理し
た。次いで、細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X G
lutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸B
SA、0.25μMのSANT−1、50ng/mLのFGF7、2μMのRA、20n
g/mLのアクチビン−A、及び100nMのTPBを追補したMCDB−131倍地で
2日間処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−3日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:
200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015
g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、20nMのLDN−193189
、2μMのALk5阻害剤、100nMのCYP26A阻害剤、及び100nMのTPB
を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉/内分泌前駆細胞−3日):ステージ4の細胞を、ITS
−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0
.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、+/−25nMのLD
N−193189、及び/又は2μMのALk5阻害剤を追補したMCDB−131倍地
で3日間処理した。
f.ステージ6(膵内内分泌ホルモン生成−3日):ステージ5の細胞を、ITS−X
の1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0
015g/mLの重炭酸ナトリウム、及び2%の無脂肪酸BSAを追補したMCDB−1
31倍地で3日間処理した。

0100

図11A図11Hは、内分泌マーカーの発現をトリガする一方でSOX2の低発現を
維持するには、ステージ3の1日目のBMPの低〜中等度の阻害が必要であることを示し
ている。更に、内分泌マーカーを高めながらステージ5でBMPを阻害することもまた、
SOX2の発現の上方調節につながった。

0101

本実施例のデータは、これまでの実施例で提示した結果を更に確定する。このデータは
、SOX2の発現を抑制しながら膵内分泌マーカーの誘導をトリガするにはステージ3〜
5でのBMP経路の正確な調整が必要であることを裏付けている。

0102

(実施例7)
S3(前腸ステージ)でのBMP阻害の最適な時間枠
本実施例は、後のステージでの内分泌の誘導を保持しかつSOX2の発現を減少させな
がら、BMPシグナル伝達を阻害するための、ステージ3における最適な時間枠を特定す
る。

0103

多様な継体(継体40〜継体52)のヒト胚性幹細胞株H1の細胞を、mTesr(商
標)1培地において、10μMのY27632と、1cm2当たり細胞100,000個
の濃度で、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)で被覆された皿上に単一細胞とし
て播種した。播種から48時間後に、培養物を以下のように膵内分泌系統の細胞に分化し
た。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、
不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1
の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性
幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X
GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF
8、及び1.5μMのMCX化合物を追補したMCDB−131培地で1日処理した。次
いで、2日目〜4日目にかけて、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/
mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5mMのグルコース、
及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で処理した。
b.ステージ2(原腸管−3日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、
0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5m
MのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で
3日間処理した。
c.ステージ3(前腸−3日):ステージ2の細胞を、ステージ3の最初の2時間のみ
又は6時間のみ又は24時間のみ、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコー
ス、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%
の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mLのFGF7、2μMの
RA、20ng/mLのアクチビン−A、及び100nMのTPBを追補した、100n
MのLDN−193189を含有するMCDB−131倍地で処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−3日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:
200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015
g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、25nMのLDN−193189
、2μMのALk5阻害剤、100nMのCYP26A阻害剤、及び100nMのTPB
を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉/内分泌前駆細胞−3日):ステージ4の細胞を、ITS
−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0
.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、及び2μMのALk5
阻害剤を追補したMCDB−131倍地で3日間処理した。

0104

図12A図12Gは、本実施例で収集したデータのリアルタイムPCR解析を示す。
ステージ3で少なくとも2時間BMP阻害剤で処理することは、Ngn3(図12D)及
びNeuroD(図12E)のようなプロ内分泌転写因子の発現をトリガする一方で、S
OX2(図12G)の非常に低い発現を維持することができ、S4〜S5でのNKX6.
1(図12A)及びPDX−1(図12B)の発現を有意に増加させる。しかし、ステー
ジ5の3日目に、CDX2の発現は、BMP阻害剤で24時間処理した細胞よりも、その
阻害剤で2時間又は6時間処理した細胞においての方が高かった(図12F)。

0105

本実施例のデータは、CDX2の発現及びSOX2の発現を低レベルに維持するために
、及び膵臓内胚葉マーカーの高発現を維持する一方で内分泌の分化を開始するために、B
MP経路の24時間の阻害が最適であることを示唆している。

0106

(実施例8)
ステージ3(前腸段階)及びステージ4(膵臓前腸前駆細胞ステージ)の最適な期間
本実施例は、膵内分泌系統の細胞集団への多能性細胞の段階的分化におけるS3及びS
4の最適な期間を決定するために実施した。

0107

多様な継体(継体40〜継体52)のヒト胚性幹細胞株H1の細胞を、10μMのY2
7632を追補したmTesr(商標)1培地において、単一細胞として、1cm2当た
り細胞100,000個の濃度で、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)で被覆さ
れた皿上に播種した。播種から48時間後に、培養物を以下のように膵内分泌系統の細胞
に分化した。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−4日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、
不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1
の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性
幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X
GlutaMax(商標)、2.5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF
8、1.5μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で
1日処理した。次いで、2日目〜4日目にかけて、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、
0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5m
Mのグルコース、及び100ng/mLのGDF8を追補したMCDB−131倍地で処
理した。
b.ステージ2(原腸管−2日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、
0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、2.5m
MのD−グルコース、及び50ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で
2日間処理した。
c.ステージ3(前腸−2〜3日):ステージ2の細胞を、ITS−Xの1:200希
釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mL
の重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/
mLのFGF7、2μMのRA、20ng/mLのアクチビン−A、100nMのTPB
を追補した、100nMのLDN−193189を含有するMCDB−131倍地で1日
処理した。次いで、細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1
X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂
肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50ng/mLのFGF7、2μMのRA、
20ng/mLのアクチビン−A、及び100nMのTPBを追補したMCDB−131
倍地で処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−2〜3日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの
1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.00
15g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、25nMのLDN−1931
89、100nMのCYP26A阻害剤、及び100nMのTPBを追補したMCDB−
131倍地で2〜3日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉/内分泌前駆細胞−2日):ステージ4の細胞を、ITS
−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0
.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、及び1μMのALk5
阻害剤を追補したMCDB−131倍地で2日間処理した。
f.ステージ6(膵内分泌前駆細胞/ホルモン−2日):ステージ5の細胞を、ITS
−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0
.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、及び2%の無脂肪酸BSAを追補したMCDB
−131倍地で2日間処理した。

0108

ステージ3、ステージ4、ステージ5、又はステージ6で収穫した試料のリアルタイム
PCR解析のデータを図13A図13Gに示す。このデータは、S3及びS4が2日間
である培養と比較して、S3及びS4を3日間に延長することがNKX6.1の発現を高
めることを示す(図13A)。ステージ3で3日間処理した細胞は、S3及びS4の期間
が2日間だけである培養と比較したとき、プロ内分泌マーカーの発現の下方調節を示す(
図13D及び図13E)。更に、ステージ4を3日間に延長することは、SOX2の発現
を有意に高めた(図13G)。

0109

本実施例で得たデータは、これまでの実施例で生成されたデータと同じく、延長された
BMP阻害が前腸をSOX2の高い集団の方へ促すことを示している。本実施例及び前述
の実施例からのデータに基づき、ステージ3及びステージ4の最適な期間は2日間である
と結論することができる。理想的なプロトコルは、プロ内分泌マーカーの高レベルの発現
、NKX6.1の高発現、CDX2の低発現、及びSOX2の低発現を伴う分化された細
胞をもたらすであろう。

0110

(実施例9)
高グルコース及びB27サプリメントの存在下での、BMPの阻害への長時間の曝露
、S3及びS4のSOX2の発現を有意に増加させる。
このプロトコルは、ホルモン産生細胞への多能性細胞の段階的分化の間にS3及びS4
でのSOX2の発現に影響を与える因子を決定するために行った。

0111

ヒト胚性幹細胞株H1の細胞は、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)被覆皿上
で培養し、mTesr(商標)1培地で70%のコンフルエンスまで培養し、以下のよう
に分化した。
a.未分化細胞を、0.2% FBS、100ng/mLのアクチビンA、20ng/
mLのWNT−3aが追補されたRPMI培地(Invitrogen)中で1日培養し
た。次いで、細胞を、0.5% FBS、100ng/mLのアクチビンAが追補された
RPMI培地で更に2日間処理した(ステージ1)。
b.ステージ1の細胞を、2%FBS、50ng/mLのFGF7を添加したDMEM
/F12培地で3日間処理した(ステージ2)。
c.ステージ2の細胞を、1%のB27、0.25%のSANT−1、2μMのRA、
100ng/mLのノギン(米国ミネソタ州のR & D systems)が追補され
たDMEM−高グルコース培地中で4日間培養した(ステージ3)。
d.ステージ3の細胞を、1%のB27、100ng/mLのノギン、1μMのALK
5阻害剤II(米国カリフォルニア州のAxxora)、及び50nMのTPBが追補さ
れたDMEM−高グルコース培地にて4日間処理した(ステージ4)。

0112

図14A図14Hは、以下のマーカーに関して得られたステージ3の4日目に収穫し
た細胞のFACSヒストグラムを図示する:アイソタイプコントロール(図14A)、ク
ロモグラニン(図14B)、KI−67(図14C)、NKX6.1(図14D)、SO
X2(図14E)、HNF3B(図14F)、CDX2(図14G)、PDX−1(図1
4H)。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。ステージ3での細胞の大部分
は、PDX−1(図14H)及びHNF3B(図14F)の発現について陽性であり、N
KX6.1(図14D)の発現について陰性であり、クロモグラニン(図14B)及びC
DX2(図14G)について低発現を示した。しかし、90%を超える細胞が、SOX2
図14E)についてもまた強陽性であった。これは、ステージ3では細胞の大部分がP
DX−1及びSOX2について陽性かつNKX6.1について陰性であり、膵臓のPDX
−1ドメインに前方の前腸集団と一貫した内胚葉集団の確立を示唆している。

0113

更に、本実施例で概要を述べたプロトコルを用いて生成した細胞集団において、ステー
ジ3でSOX2+であった細胞の百分率は、実施例1に概要を述べたプロトコルを用いて
生成した細胞集団においてSOX2+であった細胞の百分率より有意に高かった。この差
は、本実施例のステージ3での培養培地における、BMPアンタゴニスト(ノギン)への
長時間の曝露並びにFGF7及びPKC活性化剤の欠如に起因し得る。

0114

図15A図15Gは、実施例9に従って分化した、S4の2日目の以下のマーカーの
FACSヒストグラム発現プロファイルを示す。図15A:アイソタイプコントロール、
図15B:NKX6.1、図15C:KI−67、図15D:クロモグラニン、図15E
:SOX2、図15F:CDX2、図15G:PDX−1。各マーカーの発現百分率を各
ヒストグラムに示す。

0115

図16A図16Fは、実施例9に従って分化された細胞のS4の4日目の以下のマー
カーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。図16A:アイソタイプコントロ
ール、図16B:NKX6.1、図16C:クロモグラニン、図16D:SOX2、図1
6E:CDX2、図16F:PDX−1。各マーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示
す。

0116

下の表Vは、本実施例に概要を述べたプロトコルに従って分化した細胞のS3及びS4
での内胚葉マーカーの発現率(%)について得られたデータをまとめたものである。

0117

0118

図17A図17Jは、実施例9に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞におけ
る以下の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析の結果を示す。図17A:CDX2、図
17B:HHex、図17C:FOXE1、図17D:IPF1(PDX−1)、図17
E:NKX2.1、図17F:NKX2.2、図17G:NKX6.1、図17H:PR
OX1、図17I:SOX2、図17J:SOX9。

0119

図14〜図17及び表Vに見られるように、ステージ4の2日目から4日目に、NKX
6.1の有意な増加があり、一方、PDX−1の高発現は維持された。ステージ3からス
テージ4にかけてSOX2の発現は低下したが、75%までの細胞がなおSOX2+であ
った。図5と同じく、CDX2+細胞、SOX2+細胞、及びNKX6.1+細胞は、ク
ロモグラニン集団から相互排他的であった。これは、実施例9に概要を述べたプロトコル
を用いて生成したステージ4の4日目の細胞集団のNKX6.1+ SOX2+ PDX
−1+ CDX2−クロモグラニン陰性の割合が50%までであることを示唆している。
これは、S4〜S5にPDX−1+ NKX6.1+ SOX2−、CDX2−、クロモ
グラニン陰性の割合が約40〜70%で、PDX−1+ NKX6.1+ SOX2+が
2〜25%であった実施例1で生成された細胞集団と対照的である。明らかに、実施例1
のプロトコルを用いて生成された細胞は、PDX−1+かつNXK6.1+でありながら
も実施例9で生成された細胞と比較してSOX2及びCDX2について低い又は陰性の集
団として定義されたように、はるかに高い膵臓内胚葉の百分率を有していた。

0120

本実施例で得たデータは、高グルコース及びB27サプリメントの存在下でのBMP阻
害への長時間の曝露がステージ3及び4の分化でのSOX2の発現を有意に増加させるこ
との裏付けを提供するものである。

0121

(実施例10)
これまでに公開されたプロトコルは、ステージ3〜4で有意な数のSOX2+の集団の
形成をもたらす。
Kroonらは、ヒト胚性幹細胞からの膵臓内胚葉系統の細胞を調製するためのプロト
コルを公開している(Nature Biotech 2008,26:443〜452
、これ以降においては「Kroon」)。本明細書において提供される実施例においては
、ヒト胚性幹細胞は、Kroonのプロトコルに従って分化させ、分化の異なる段階に特
徴的なマーカーの発現についてアッセイした。

0122

ヒト胚性幹細胞株H1の細胞をMATRIGEL(商標)(1:30希釈)被覆皿上に
播種し、70%のコンフルエンスまでmTesr(商標)培地中で培養し、Kroonに
よりこれまでに公開されているプロトコルを用いて以下のように分化した。
a)未分化細胞を、0.2%のFBS、100ng/mLのアクチビンA、20ng/
mLのWNT−3aが追補されたRPMI培地に1日曝露した後、0.5%のFBS、1
00ng/mLのアクチビンAが追補されたRPMI培地にて更に2日間処理した(ステ
ージ1)。
b)ステージ1の細胞を、2%のFBS、50ng/mLのFGF7を添加したRPM
I培地で3日間処理した(ステージ2)。
c)ステージ2の細胞を、1%のB27、0.25μMのSANT−1、2μMのRA
、50ng/mLのノギン(ミネソタ州のR & D systems)が追補されたD
MEM−高グルコース培地にて3日間処理した(ステージ3)。
d)ステージ3の細胞を、1%のB27が追補されたDMEM−高グルコース培地中で
3日間培養した(ステージ4)。
e)ステージ4の細胞をウェルから掻き取り、1%のB27が追補されたDMEM−高
グルコース培地中にクラスターとして2日間再懸濁した。

0123

図18A図18Gは、実施例10に従って分化した、S3の3日目の以下のマーカー
のFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。アイソタイプコントロール(図18A
)、NKX6.1(図18B)、クロモグラニン(図18C)、SOX2(図18D)C
DX2(図18E)、KI−67(図18F)、PDX−1(図18G)。各マーカーの
発現百分率を各ヒストグラムに示す。

0124

図19A図19Gは、実施例10に従って分化された細胞のS4の5日目の以下のマ
ーカーのFACSヒストグラム発現プロファイルを示す。アイソタイプコントロール(図
19A)、NKX6.1(図19B)、クロモグラニン(図19C)、SOX2(図19
D)、CDX2(図19E)、KI−67(図19F)、PDX−1(図19G)。各マ
ーカーの発現百分率を各ヒストグラムに示す。

0125

図18及び図19に示されるように、ステージ4の終わり(5日目)までに、懸濁液中
の細胞のクラスターの20%までがNKX6.1+ PDX−1+SOX2−であり、
かつ20%までがPDX−1+ NKX6.1+ SOX2+であった。これらの結果は
、実施例10に従って生成された細胞集団の有意な割合がステージ4でNKX6.1+か
つSOX2+であったことを示している。

0126

下の表VIは、本実施例で生成された細胞のS3〜S4での内胚葉マーカーの百分率を
まとめたものである。

0127

*懸濁培養物中での最後の2日

0128

(実施例11)
アスコルビン酸の添加は、多ホルモン細胞数を有意に減少させ、単一ホルモンのインス
リン陽性細胞数を同時に増加させた。

0129

ホルモン生成細胞への多能性細胞の分化中のマーカーの発現にアスコルビン酸が与える
影響をテストした。以下のように、分化の全ての段階でグルコースを追補し、ステージ3
、4及び5の形成でアスコルビン酸を追補した培地中で細胞を培養した。

0130

多様な継体(継体40〜継体52)のヒト胚性幹細胞株H1の細胞を、mTesr(商
標)1培地において、10μMのY27632と、1cm2当たり細胞100,000個
の濃度で、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)被覆皿上に単一細胞として播種し
た。播種から48時間後に、培養物を以下のように膵内分泌系統の細胞に分化した。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−3日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、
不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1
の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性
幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X
GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、
及び1μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日
処理した。次いで、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸
ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのグルコース、100ng/mL
のGDF8、及び100nMのMCX化合物が追補されたMCDB−131倍地で2日目
に処理し、続いて、更に1日、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭
酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのグルコース、及び100ng
/mLのGDF8が追補されたMCDB−131倍地にて処理した。
b.ステージ2(原腸管−2日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、
0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMの
D−グルコース、及び25ng/mLのFGF7を追補したMCDB−131倍地で2日
間処理した。
c.ステージ3(前腸−2日):ステージ2の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、
2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重
炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、10ng/mLのアクチビン−A、25ng/
mLのFGF7、0.25μMのSANT−1、1μMのRA、200nMのTPB(P
KC活性剤)、100nMのLDN−193189(BMP受容体阻害剤)を追補したM
CDB−131倍地で1日処理した。次いで、細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2
.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭
酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、10ng/mLのアクチビン−A、25ng/m
LのFGF7、0.25μMのSANT−1、1μMのRA、200nMのTPB(PK
C活性剤)、10nMのLDN−193189を追補したMCDB−131倍地で更に1
日処理した。いくつかの培養物は、ステージ3の期間中、0.25mMのアスコルビン酸
(カタログ番号A4544、Sigma、米国ミズーリ州)で処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−2日):ステージ3の細胞を、0.25mMのア
スコルビン酸あり又はなしで、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、
1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無
脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50nMのRA、200nMのTPB、5
0nMのLDN−193189を追補したMCDB−131倍地で2日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉−2〜7日):ステージ4の細胞を、0.25mMのアス
コルビン酸あり又はなしで、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコース、1
X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂
肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50nMのRAを追補したMCDB−131
倍地で2〜7日間処理した。

0131

図20A図20Jは、実施例11に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞にお
ける以下の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析を示す。図20A:ソマトスタチン、
図20B:PDX1、図20C:Pax6、図20D:Pax4、図20E:NKX6.
1、図20F:NGN3、図20G:グルカゴン、図20H:NeuroD、図20I
インスリン、図20J:クロモグラニン。この図は、ステージ3、又はステージ3及び4
でのアスコルビン酸の添加が、ステージ4〜5でソマトスタチン及びグルカゴンの発現を
有意に減少させる一方で、インスリンの発現を増加させることを示している(図20A
図20G、及び図20Iを参照)。更に、ステージ4〜5で、PDX−1及びNKX6.
1のような膵臓内胚葉マーカーの発現は、0.25mMのアスコルビン酸の添加によって
有意に変化しなかった(図20B及び図20Dを参照)。ステージ4〜5で、Pax6の
発現は下方調節され、Pax4の発現は維持された(図20C及び図20Dを参照)。S
3〜S5で+/−アスコルビン酸で処理した培養物は、ステージ5の終わりにインスリン
、グルカゴン、及びソマトスタチンホルモンに対して免疫染色された。表VIIは、イン
スリン陽性細胞、グルカゴン及びソマトスタチン陽性細胞、並びに多ホルモン細胞(1つ
の細胞内で2つ以上のホルモンを発現)の平均百分率をまとめたものである。

0132

0133

(実施例12)
ステージ3でのアスコルビン酸の最適用量
本実施例は、単一ホルモン、PDX−1陽性、かつNKX6.1陽性のインスリン陽性
細胞を生成するために使用するアスコルビン酸の最適用量を決定するために実行した。

0134

多様な継体(継体40〜継体52)のヒト胚性幹細胞株H1の細胞を、mTesr(商
標)1培地において、10μMのY27632と、1cm2当たり細胞100,000個
の濃度で、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)被覆皿上に単一細胞として播種し
た。播種から48時間後に、培養物を以下のように膵内分泌系統の細胞に分化した。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−3日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、
不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1
の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性
幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X
GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコース、及び100ng/mLのGDF
8と1μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日
処理した。次いで、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸
ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのグルコース、100ng/mL
のGDF8、及び100nMのMCX化合物が追補されたMCDB−131倍地で2日目
に処理し、続いて、更に1日、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭
酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのグルコース、及び100ng
/mLのGDF8が追補されたMCDB−131倍地にて処理した。
b.ステージ2(原腸管−2日):ステージ1の細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、
0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMの
D−グルコースが追補されたMCDB−131倍地で、0.25mMのアスコルビン酸及
び25ng/mLのFGF7あり又はなしで、2日間処理した。
c.ステージ3(前腸−2日):ステージ2の細胞を、ITS−Xの1:200希釈、
2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重
炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、10ng/mLのアクチビンA、25ng/m
LのFGF7、0.25μMのSANT−1、+/−0.25mMのアスコルビン酸、1
μMのRA、及び200nMのTPB、並びに1日目については100nMのLDN−1
93189が追補されたMCDB−131倍地で処理し、続いて、ITS−Xの1:20
0希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/
mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、10ng/mLのアクチビンA、25
ng/mLのFGF7、0.25μMのSANT−1、+/−0.25mMのアスコルビ
ン酸、1μMのRA、及び200nMのTPB、並びに更に1日は10nMのLDN−1
93189が追補されたMCDB−131倍地で処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−2日):ステージ3の細胞を、ITS−Xの1:
200希釈、2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015
g/mLの重炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、5
0nMのRA、200nMのTPB、及び50nMのLDN−193189を追補したM
CDB−131倍地にて、0.25mM〜1mMのアスコルビン酸の添加あり又はなしで
、2日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉−2〜9日):ステージ4の細胞を、0.25mMのアス
コルビン酸の添加あり又はなしで、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグルコー
ス、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、2%
の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、及び50nMのRAを追補したMCD
B−131倍地で2〜9日間処理した。

0135

図21A図21Jは、実施例12に従って分化したヒト胚性幹細胞株H1の細胞にお
ける以下の遺伝子の発現のリアルタイムPCR解析のデータを示す。図21A:ソマトス
タチン、図21B:PDX1、図21C:Pax6、図21D:Pax4、図21E:N
KX6.1、図21F:NGN3、図21G:NeuroD、図21H:インスリン、図
21I:グルカゴン、図21J:クロモグラニン。実施例10からのデータと一貫し、ス
テージ2〜4でのアスコルビン酸の添加は、ソマトスタチン、グルカゴン、及びPax6
の発現を有意に低減する一方で、ステージ5でのインスリン及びPax4の発現を維持し
た。更に、0.25mMのアスコルビン酸と比較して、S4で0.5〜1mMのアスコル
ビン酸を使用することに有意な利益はなかった。最後に、ステージ2でのアスコルビン酸
の添加もまた、ステージS3〜5でグルカゴン及びソマトスタチンの発現を低下する一方
でインスリンの発現を維持することに有効であることが証明された。したがって、アスコ
ルビン酸は、ステージ特定のやり方で単一ホルモン細胞の発現の調節のために作用する。
アスコルビン酸の添加は分化プロトコルの早期ステージで重要であるが、後期ステージで
は多ホルモン細胞数を減少するのに有効であると証明されなかった。

0136

(実施例13)
レチノイン酸及びアスコルビン酸の組み合わせは、単一ホルモンのインスリン陽性細胞
を生成するために必要である。
この実施例は、多能性細胞の分化中に単一ホルモンのインスリン陽性細胞を生成するた
めの要件を明らかにするために実施した。

0137

多様な継体(継体40〜継体52)のヒト胚性幹細胞株H1の細胞を、mTesr(商
標)1培地において、10μMのY27632と、1cm2当たり細胞100,000個
の濃度で、MATRIGEL(商標)(1:30希釈)被覆皿上に単一細胞として播種し
た。播種から48時間後に、培養物を以下のように膵内分泌系統の細胞に分化した。
a.ステージ1(胚体内胚葉(DE)−3日):DEの開始の前に、培養物を洗浄し、
不完全なPBS(Mg又はCaなし)で30秒間インキュベートし、次いで、ステージ1
の培地を加えた。MATRIGEL(商標)被覆皿上で単一細胞として培養したヒト胚性
幹細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X
GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコース、100ng/mLのGDF8、
1μMのMCX化合物(GSK3B阻害剤)を追補したMCDB−131培地で1日処理
した。次いで、細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、重炭酸ナトリウム、GlutaMa
x(商標)、更に5mMのグルコース、100ng/mLのGDF8、及び100nMの
MCX化合物が追補されたMCDB−131倍地で2日目に処理し、続いて、更に1日、
0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012g/mLの重炭酸ナトリウム、1X Glut
aMax(商標)、5mMのグルコース、及び100ng/mLのGDF8が追補された
MCDB−131倍地にて処理した。
b.ステージ2(原腸管−2日):細胞を、0.1%の無脂肪酸BSA、0.0012
g/mLの重炭酸ナトリウム、1X GlutaMax(商標)、5mMのD−グルコー
ス、0.25mMのアスコルビン酸、及び25ng/mLのFGF7が追補されたMCD
B−131倍地で2日間処理した。
c.ステージ3(前腸−2日):細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMの
グルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウ
ム、2%の無脂肪酸BSA、10ng/mLのアクチビンA、25ng/mLのFGF7
、0.25mMのアスコルビン酸、0.25μMのSANT−1、1μMのRA、200
nMのTPB、及び1日目については100nMのLDN−193189が追補されたM
CDB−131倍地で処理し、続いて、ITS−Xの1:200希釈、2.5mMのグル
コース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナトリウム、
2%の無脂肪酸BSA、10ng/mLのアクチビンA、25ng/mLのFGF7、0
.25mMのアスコルビン酸、0.25μMのSANT−1、1μMのRA、及び200
nMのTPB、並びに更に1日については10nMのLDN−193189が追補された
MCDB−131倍地で処理した。
d.ステージ4(膵臓前腸前駆細胞−2日):細胞を、ITS−Xの1:200希釈、
2.5mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重
炭酸ナトリウム、2%の無脂肪酸BSA、0.25μMのSANT−1、50nMのRA
、200nMのTPB、50nMのLDN−193189、及び0.1mMのアスコルビ
ン酸が追補されたMCDB−131倍地で2日間処理した。
e.ステージ5(膵臓内胚葉−3日):細胞を、ITS−Xの1:200希釈、2.5
mMのグルコース、1X GlutaMax(商標)、0.0015g/mLの重炭酸ナ
トリウム、及び2%の無脂肪酸BSAを追補したMCDB−131倍地にて、以下の培養
条件で3日間処理した。
・+0.1mMのアスコルビン酸
・0.1mMのアスコルビン酸+50nMのRA
・0.1mMのアスコルビン酸+50nMのRA+0.25μMのSANT−1
・0.1mMのアスコルビン酸+50nMのRA+0.25μMのSANT−1+5
0nMのLDN−193189
・0.1mMのアスコルビン酸+50nMのRA+0.25μMのSANT−1+1
μMのAlk5 inh
・0.1mMのアスコルビン酸+50nMのRA+0.25μMのSANT−1+1
μMのAlk5 inh+50nMのLDN−193189

0138

図22A図22Lは、実施例13に従って分化し、S5の3日目に収穫した胚性幹細
胞株H1の細胞における、Pax4(図22A)、Pax6(図22B)、PDX1(図
22C)、PTF1a(図22D)、グルカゴン(図22E)、インスリン(図22F
、NeuroD(図22G)、ngn3(図22H)、Zic1(図22I)、CDX2
図22J)、アルブミン(図22K)、NKX6.1(図22L)の発現のリアルタイ
ムPCR解析からのデータを示している。

0139

上記の組み合わせで処理した培養物は、ステージ5の終わりに、インスリン、グルカゴ
ン、及びソマトスタチンホルモンに対して免疫染色された。表VIIIは、インスリン陽
性細胞、グルカゴン及びソマトスタチン陽性細胞、並びに多ホルモン細胞(1つの細胞内
で2つ以上のホルモンを発現)の平均百分率をまとめたものである。

0140

図22及び下記の表VIIIに示されるように、ステージ5での低用量のレチノイン酸
とアスコルビン酸の添加は、S5でビタミンCのみで処理された培養物と比較して、ホル
モン陽性細胞の総数を有意に減少させる一方で、単一ホルモンのインスリン陽性細胞の百
分率を増加させた。更に、レチノイン酸、アスコルビン酸、ソニックヘッジホッグ阻害剤
、及びALK5阻害剤の組み合わせは、アスコルビン酸(ビタミンC)のみで処理された
培養物と比較して、単一ホルモンのインスリン陽性細胞の数を更に増加させた。このデー
タは、単一ホルモンのインスリン陽性細胞を生成するには因子の独特の組み合わせが必要
であることを示している。

実施例

0141

本発明は、以下の態様を包含し得る。
[1]
多能性細胞の段階的分化から得られる、膵臓内胚葉細胞のインビトロ分化集団であって
、分化の各段階の細胞が、5mM〜20mMのグルコースを含む培地中で培養される、膵
臓内胚葉細胞の分化集団。
[2]
前記分化された膵臓内胚葉細胞の30%超が、PDX−1+NKX6.1+、SOX2
−、及びCDX2−である、上記[1]に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[3]
前記分化集団の細胞の10%超が単一ホルモンのインスリン陽性細胞である、上記[1
]又は[2]に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[4]
前記段階的分化が、未分化のヒト胚性幹細胞をTGF−Bリガンドが更に追補された培
地中で培養する工程を含む、上記[1]〜[3]のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞
の分化集団。
[5]
前記段階的分化が、未分化のヒト胚性幹細胞をWNT活性化剤が更に追補された培地中
で培養する工程を含む、上記[1]〜[4]のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分
化集団。
[6]
前記段階的分化が、胚体内胚葉細胞をFGFリガンドが更に追補された培地中で培養す
る工程を含む、上記[1]に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[7]
前記段階的分化が、shh阻害剤、FGFリガンド、PKC活性化剤、TGF−Bリガ
ンド、レチノイド、及びBMP阻害剤の勾配が更に追補された培地中で腸管細胞を培養す
る工程を含む、上記[1]〜[4]のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[8]
前記段階的分化が、PKC活性化剤、shh阻害剤、レチノイド、及びBMP阻害剤が
更に追補された培地中で後方前腸細胞を培養する工程を含む、上記[5]に記載の膵臓内
胚葉細胞の分化集団。
[9]
前記段階的分化が、アスコルビン酸が更に追補された培地中で細胞を培養する工程を含
む、上記[1]〜[6]のいずれか一項に記載の膵臓内胚葉細胞の分化集団。
[10]
膵臓内胚葉系統の細胞の集団への多能性細胞の段階的分化のためのインビトロの方法で
あって、5mM〜20mMのグルコースを含む培地中での分化の各段階で細胞を培養する
工程を含む、方法。
[11]
TGF−Bリガンド及びWNT活性化剤を追補した培地中で前記多能性細胞を培養する
ことによって、前記多能性細胞を胚体内胚葉(DE)細胞に分化する工程を更に含む、上
記[10]に記載のインビトロの方法。
[12]
FGFリガンドを追補した培地中で前記DE細胞を培養することによって、前記DE細
胞を腸管細胞に分化する工程を更に含む、上記[11]に記載のインビトロの方法。
[13]
shh阻害剤、FGFリガンド、PKC活性化剤、TGF−Bリガンド、レチノイド、
及びBMP阻害剤を追補した培地中で腸管細胞を培養することによって、前記腸管細胞を
後方前腸内胚葉細胞に分化する工程を更に含む、上記[12]に記載のインビトロの方法

[14]
PKC活性化剤、shh阻害剤、レチノイド、及びBMP阻害剤を追補した培地中で後
方前腸内胚葉細胞を培養することによって、前記後方前腸内胚葉細胞を膵臓前腸細胞に分
化する工程を更に含む、上記[13]に記載のインビトロの方法。
[15]
shh阻害剤、TGF−B阻害剤、及びレチノイドを追補した培地中で前記膵臓前腸細
胞を培養することによって、前記膵臓前腸細胞を膵臓内胚葉細胞に分化する工程を更に含
む、上記[14]に記載のインビトロの方法。
[16]
前記膵臓内胚葉細胞を膵臓β細胞集団に分化する工程を更に含む、上記[15]に記載
のインビトロの方法。
[17]
少なくとも一工程において前記培地にアスコルビン酸を更に追補する、上記[10]〜
[16]のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
[18]
前記分化集団の細胞の10%超が単一ホルモンのインスリン陽性細胞である、上記[1
0]〜[17]のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
[19]
培養物の膵臓内胚葉細胞の30%超がPDX−1+、NKX6.1+、SOX2−、及
びCDX2−である、上記[18]に記載のインビトロの方法。
[20]
ヒト胚性幹細胞を膵臓β細胞に分化するためのインビトロの方法であって、
a)胚体内胚葉(DE)細胞の集団を生成するために、未分化のヒト胚性幹細胞を、グ
ルコース、TGF−Bリガンド、及びWNT活性化剤を追補した培地中で培養する工程と

b)腸管細胞の集団を生成するために、前記DE細胞を、グルコース及びFGFリガン
ドを追補した培地中で培養する工程と、
c)PDX−1及びSOX2を発現する後方前腸内胚葉細胞の集団を生成するために、
グルコース、shh阻害剤、FGFリガンド、PKC活性化剤、TGF−Bリガンド、レ
チノイド、及びBMP阻害剤の勾配を追補した培地中で前記腸管細胞を培養する工程と、
d)PDX−1及びNKX6.1を発現し、かつ前記後方前腸細胞と比較して低いレベ
ルのSOX2を発現する膵臓前腸細胞の集団を生成するために、グルコース、PKC活性
剤、shh阻害剤、レチノイド、及びBMP阻害剤を追補した培地中で前記後方前腸細胞
を培養する工程と、
e)PDX−1及び膵臓前腸細胞と比較して高いレベルのNKX6.1並びに低いレベ
ルのSOX2を発現する膵臓内胚葉細胞の集団を得るために、グルコース、shh阻害剤
、TGF−B阻害剤、及びレチノイドを追補した培地中で前記膵臓前腸細胞を培養する工
程と、
f)前記膵臓内胚葉細胞を膵臓β細胞集団に分化する工程と、を含む、方法。
[21]
前記膵臓β細胞集団がPDX−1+、NKX6.1+、SOX2−、及びCDX2−で
ある、上記[20]に記載の方法。
[22]
少なくとも一工程において前記培地にアスコルビン酸が更に追補される、上記[20]
又は[21]に記載の方法。
[23]
前記膵臓β細胞が、NKX6.1+及びPDX−1+でもある単一ホルモンのインスリ
ン産生細胞である、上記[22]に記載の方法。

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