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技術 インターロイキン−21ムテイン及び治療方法

出願人 アムジエン・インコーポレーテツド
発明者 ハレド・エム・ケイ・ゼット・アリニーラジ・ジャグディシュ・アグラワルグナセカラン・カナンイアン・フォルツジュウルン・ワンダレン・ベイツマリッサ・モック岳中俊介
出願日 2018年8月3日 (1年3ヶ月経過) 出願番号 2018-146505
公開日 2019年3月7日 (8ヶ月経過) 公開番号 2019-033743
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 医薬品製剤 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 参照センサー 標準機器 自動フロー ソフトウェアオプション 設計検討 HMX サンプルチップ 最大サンプル
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題

疾患を治療する方法において使用されるIL−21ムテイン、及び、前記IL−21ムテインを含む融合タンパク質の提供。

解決手段

特定の配列を有するIL−21ムテイン、及び/又は、前記IL−21ムテインがリンカーを介して抗PD−1抗体と結合されている融合タンパク質又はコンジュゲート

概要

背景

PD−1/PD−L1軸は、がんにおいて、T細胞免疫応答の抑制に関与している。この経路アンタゴニストは、固形腫瘍の多くの適応症に対して、臨床的に検証されている。ニボルマブ及びペンブロリズマブは、このような阻害薬の2つであり、PD−1経路を標的にし、転移性黒色腫治療に対して、それぞれ米国食品医薬品局FDA)から承認されている。最近、研究者らは、他の腫瘍種の環境でのチェックポイント阻害パラダイム試験している。ある程度の進歩があったが、チェックポイント阻害療法は、依然として、他の癌治療選択肢の影に隠れたままである。

他の薬剤と組み合わせたチェックポイント阻害薬の研究は、進行中のものもあれば、最近、終了したものもある。例えば、ニボルマブと、イピリムマブ(CTLA−4受容体遮断抗体)の組み合わせが、切除不能ステージIIIまたはIVの黒色腫患者に対する第3相臨床試験で試験された。当該試験において、完全奏効に達した患者パーセンテージは、ニボルマブとイピリムマブの組み合わせを投与した患者で最も高く、いずれかの薬物のみを投与した群が示した結果を凌駕した。他の組み合わせも現在探究されている。

インターロイキン−21(IL−21)は、T細胞由来する多機能性サイトカインであり、自然免疫細胞及び適応免疫細胞の両方の活性を制御する。IL−21は、T細胞の生存及びエフェクター機能を高めることができる。IL−21は、自己免疫疾患及び炎症性疾患発症につながる炎症応答に大きな影響を及ぼすことに加え、抗腫瘍応答及び抗ウイルス応答において重要な役割を果たすことから、いくつかの治療法にとって、魅力的ターゲットとなっている。

しかしながら、IL−21をベースにした治療法の開発は複雑である。複数の研究で、わかりづらいことに、IL−21の作用を増強しても、阻害しても、治療効果がもたらされることが示されているために、研究が複雑になっている。また、IL−21受容体(IL−21R)が広範に発現していることにより、更なる課題がある。IL−21Rは、T細胞だけでなく、B細胞NK細胞及び骨髄細胞上にも発現している。したがって、白血球における広範なIL−21活性化を制限し、毒性に対する可能性を回避するように注意払う必要がある。IL−21シグナル伝達の制限は、均衡が取れたものであり、選択的である必要がある。IL−21の作用誘発は、適切な時間と場所で生じるように設計する必要がある。

実際、いかなる成功も示されておらず、特に、単剤療法またはチェックポイント阻害薬との併用としてのIL−21部分による臨床上の成功は、示されていない。したがって、IL−21を利用した治療モダリティが、IL−21部分とチェックポイント阻害薬とを組み合わせたモダリティを含め、依然として必要とされている。また、免疫チェックポイント阻害と組み合わせたIL−21療法も依然として必要とされている。

概要

疾患を治療する方法において使用されるIL−21ムテイン、及び、前記IL−21ムテインを含む融合タンパク質の提供。特定の配列を有するIL−21ムテイン、及び/又は、前記IL−21ムテインがリンカーを介して抗PD−1抗体と結合されている融合タンパク質又はコンジュゲート。なし

目的

したがって、一態様において、本開示はまた、配列番号1として本明細書に記載される野生型IL−21アミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換を1つのみ含む、IL−21ムテインを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

列番号2QGQDXHMXXMXXXXXXVDXLKNXVNDLVPEFLPAPEDVENCEWSAFSCFQKAQLKSANTNNEXXIXXXXXXLXXXXXXTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLXXFXXLLXXMXXQHXSSRTHGSEDS(配列番号2)のアミノ酸配列を含む、IL−21ムテインであって、配列中、「X」は、任意のアミノ酸を表し、前記IL−21ムテインアミノ酸配列は、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と少なくとも1アミノ酸異なる、前記IL−21ムテイン。

請求項2

ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と7アミノ酸を超えない異なるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のIL−21ムテイン。

請求項3

ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と3、4、5または6アミノ酸異なるアミノ酸配列を含む、請求項2に記載のIL−21ムテイン。

請求項4

ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と1または2アミノ酸異なるアミノ酸配列を含む、請求項3に記載のIL−21ムテイン。

請求項5

前記IL−21ムテインのアミノ酸配列と配列番号1のアミノ酸配列との間の相違複数可)が、配列番号2のアミノ酸10〜15(両端を含む)またはアミノ酸105〜123(両端を含む)内に存在し、任意選択により、前記相違(複数可)は、配列番号2のアミノ酸11、14、15、109、110、112、113、116、119、120及び/または123に存在する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のIL−21ムテイン。

請求項6

前記IL−21ムテインのアミノ酸配列と配列番号1のアミノ酸配列との間の相違(複数可)が、配列番号2のアミノ酸5〜25(両端を含む)またはアミノ酸65〜80(両端を含む)内にあり、任意選択により、前記相違(複数可)は、配列番号2のアミノ酸5、8、9、12、13、16、19、23、65、66、69、70、72、73、75、76、77、78、79及び/または80に存在する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のIL−21ムテイン。

請求項7

ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と比較して、1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載のIL−21ムテイン。

請求項8

前記アミノ酸置換が、配列番号1の位置5、8、9、11、12、13、14、15、16、19、23、65、66、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、79、80、109、110、112、113、116、117、119、120または123に存在する、請求項7に記載のIL−21ムテイン。

請求項9

前記アミノ酸置換が、配列番号1の位置5、8、9、11、12、13、14、15、16、19、23、65、66、68、69、70、72、73、75、76、77、78、79、80、109、110、112、113、116、117、119、120または123に存在する、請求項8に記載のIL−21ムテイン。

請求項10

a.配列番号1の位置5、8、9、12、14、15、65、66、69、70、72、73、75、76、77、80、116もしくは119にアミノ酸置換を含み、前記置換アミノ酸は、脂肪族アミノ酸であるか、b.配列番号1の位置5、8、9、11、12、13、14、15、16、19、23、65、66、69、70、72、73、75、76、77、78、79、110、112、116、117、119、120もしくは123にアミノ酸置換を含み、前記置換アミノ酸は、酸性アミノ酸であるか、c.配列番号1の位置5、9、73、76、109、113もしくは116にアミノ酸置換を含み、前記置換アミノ酸は、塩基性アミノ酸であるか、d.配列番号1の位置5、8、9、70もしくは76にアミノ酸置換を含み、前記置換アミノ酸は、芳香族アミノ酸であるか、e.配列番号1の位置5、8、9、12、15、73、76、116もしくは119にアミノ酸置換を含み、前記置換アミノ酸は、側鎖アミドを含有するアミノ酸であるか、f.配列番号1の位置5、8、9、11、12、14、15、73、76、116もしくは119にアミノ酸置換を含み、前記置換アミノ酸は、側鎖ヒドロキシルを含む非芳香族アミノ酸であるか、g.配列番号1の位置65、66、69、70、72、73、75、76、77もしくは80にアミノ酸置換を含み、前記置換アミノ酸は、イミノ酸であるか、h.配列番号1の位置5、9、15、76、116もしくは119にアミノ酸置換を含み、前記置換アミノ酸は、イオウ含有側鎖を含むアミノ酸であるか、i.これらの組み合わせのアミノ酸置換を含む、請求項9に記載のIL−21ムテイン。

請求項11

前記置換アミノ酸が天然アミノ酸である、請求項10に記載のIL−21ムテイン。

請求項12

表Aに従った位置にアミノ酸によるアミノ酸置換を含む、請求項7に記載のIL−21ムテイン。

請求項13

配列番号3〜21、23〜56、58〜112、114〜198、249〜254及び283のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、IL−21ムテイン。

請求項14

ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と比較して、2つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載のIL−21ムテイン。

請求項15

前記アミノ酸置換が、配列番号1の位置5、8、9、11、12、13、14、15、16、19、23、65、66、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、79、80、109、110、112、113、116、117、119、120または123のうちの2つに存在する、請求項14に記載のIL−21ムテイン。

請求項16

前記アミノ酸置換が、配列番号1の位置5、9、15、70、71、72、73及び76のうちの2つに存在する、請求項15に記載のIL−21ムテイン。

請求項17

前記アミノ酸置換が、配列番号1の位置5、9、73及び76のうちの2つに存在する、請求項16に記載のIL−21ムテイン。

請求項18

前記置換のうちの1つが、配列番号1の位置76に存在する、請求項17に記載のIL−21ムテイン。

請求項19

配列番号1の位置76の前記置換アミノ酸が、脂肪族アミノ酸または酸性アミノ酸である、請求項18に記載のIL−21ムテイン。

請求項20

配列番号1の位置5、9または73にアミノ酸置換を含み、前記置換アミノ酸は、脂肪族アミノ酸または酸性アミノ酸である、請求項15〜19のいずれか一項に記載のIL−21ムテイン。

請求項21

配列番号1の位置5にアミノ酸置換を含み、前記置換アミノ酸は、側鎖アミドを含むアミノ酸である、請求項15〜19のいずれか一項に記載のIL−21ムテイン。

請求項22

前記脂肪族アミノ酸がアラニンである、請求項19または20に記載のIL−21ムテイン。

請求項23

前記酸性アミノ酸がグルタミン酸である、請求項19または20に記載のIL−21ムテイン。

請求項24

側鎖アミドを含む前記アミノ酸がグルタミンである、請求項21に記載のIL−21ムテイン。

請求項25

配列番号199〜208、210〜222、224〜248及び255からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、IL−21ムテイン。

請求項26

IL−21受容体に対する野生型IL−21の親和性と比較して低い親和性で前記IL−21受容体に結合する、先行請求項のいずれか一項に記載のIL−21ムテイン。

請求項27

配列番号256のアミノ酸配列を有するIL−21受容体に結合する、先行請求項のいずれか一項に記載のIL−21ムテイン。

請求項28

配列番号257のアミノ酸配列を有するIL−21受容体γ鎖に結合する、先行請求項のいずれか一項に記載のIL−21ムテイン。

請求項29

0.04nMよりも高いKd、または約0.04nMのKdで、ヒトIL−21受容体に結合する、先行請求項のいずれか一項に記載のIL−21ムテイン。

請求項30

先行請求項のいずれか一項に記載のIL−21ムテインと、異種部分とを含む、コンジュゲート

請求項31

前記IL−21ムテインが、前記異種部分に直接結合されている、請求項30に記載のコンジュゲート。

請求項32

前記IL−21ムテインが、前記異種部分にリンカーを介して結合されている、請求項30に記載のコンジュゲート。

請求項33

前記リンカーがペプチドを含む、請求項32に記載のコンジュゲート。

請求項34

前記ペプチドが、Gly−Gly−Gly−Gly−Serのアミノ酸配列(配列番号262)を含む、請求項33に記載のコンジュゲート。

請求項35

前記異種部分がポリペプチドである、請求項30〜34のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

請求項36

前記ポリペプチドが抗原結合タンパク質である、請求項35に記載のコンジュゲート。

請求項37

前記抗原結合タンパク質が、抗体またはその抗原結合抗体断片である、請求項36に記載のコンジュゲート。

請求項38

前記抗体が抗PD−1抗体である、請求項37に記載のコンジュゲート。

請求項39

前記抗PD−1抗体が、配列番号265〜267、282、284〜311のいずれか1つのアミノ酸配列を含む定常領域を含む、請求項30〜38のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

請求項40

前記IL−21ムテインが、前記抗体のFcに直接結合されている、請求項30〜39のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

請求項41

前記IL−21ムテインが、前記抗体のFcにリンカーを介して結合されている、請求項40に記載のコンジュゲート。

請求項42

単一のIL−21ムテインを含み、前記単一のIL−21ムテインは、2つの抗体重鎖のうちの一方のC末端に連結されている、請求項40または41に記載のコンジュゲート。

請求項43

2つのIL−21ムテインを含み、第1のIL−21ムテインは、第1の抗体重鎖のC末端に連結され、第2のIL−21ムテインは、第2の抗体重鎖のC末端に連結されている、請求項40または41に記載のコンジュゲート。

請求項44

前記第1のIL−21ムテインが、前記第2のIL−21ムテインと同じアミノ酸配列を有する、請求項43に記載のコンジュゲート。

請求項45

前記第1のIL−21ムテインが、前記第2のIL−21ムテインと異なるアミノ酸配列を有する、請求項43に記載のコンジュゲート。

請求項46

前記抗体重鎖が電荷対変異を含む、請求項30〜45のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

請求項47

前記IL−21ムテインが、配列番号1の位置5、9、73及び76のうちの2つにアミノ酸置換を含む、請求項30〜46のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

請求項48

配列番号1のアミノ酸配列を含むIL−21ムテインと、抗PD−1抗体とを含み、ただし、前記IL−21ムテインは、配列番号1の位置5、9、73及び76のうちの任意の2つにアミノ酸置換を含み、前記IL−21ムテインは、前記抗PD−1抗体のC末端に連結されている、コンジュゲート。

請求項49

前記抗PD−1抗体が、配列番号265〜267、282、284〜311のいずれか1つのアミノ酸配列を含む定常領域を含む、請求項48に記載のコンジュゲート。

請求項50

先行請求項のいずれか一項に記載のIL−21ムテインと、異種ポリペプチドまたはペプチドとを含む、融合ポリペプチドまたは融合タンパク質

請求項51

免疫グロブリンまたはその抗原結合抗体断片を含む、請求項50に記載の融合ポリペプチドまたは融合タンパク質。

請求項52

先行請求項のいずれか一項に記載のIL−21ムテインをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸

請求項53

請求項52に記載の核酸を含む、ベクター

請求項54

請求項52に記載の核酸または請求項53に記載のベクターを含む、宿主細胞

請求項55

先行請求項のいずれか一項に記載のIL−21ムテイン、核酸、ベクター、宿主細胞、コンジュゲート、融合ペプチドもしくは融合タンパク質、またはこれらの組み合わせと、容器とを含む、キット

請求項56

先行請求項のいずれか一項に記載のIL−21ムテイン、核酸、ベクター、宿主細胞、コンジュゲート、融合ポリペプチドもしくは融合タンパク質、またはこれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体賦形剤または希釈剤とを含む、医薬組成物

請求項57

IL−21ムテインの作製方法であって、請求項54に記載の宿主細胞を、前記IL−21ムテインを発現するように培養することと、前記発現されたIL−21ムテインを回収することとを含む、前記方法。

請求項58

治療を必要とする対象を治療する方法であって、前記治療を必要とする対象に、請求項56に記載の医薬組成物を、前記対象を治療するのに有効な量で投与することを含む、前記方法。

請求項59

前記対象が、固形腫瘍を有し、前記医薬組成物が、前記対象の前記固形腫瘍を治療するのに有効な量で、前記対象に投与される、請求項58に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
米国特許法第119条(e)に基づき、2017年8月3日に出願された米国仮特許出願第62/540,692号、及び2018年1月12日に出願された米国仮特許出願第62/616,733号の利益が主張され、その開示は、参照により本明細書に援用される。

0002

電子的に提出された書面の参照による援用
本明細書とともに同時に提出されたコンピュータ読み取り可能なヌクレオチドアミノ酸配列表は、2018年7月25日に「51633_Seqlisting.txt」という名称で作成された975,000バイトのASCIIテキストファイルであり、その全体が参照により援用される。

背景技術

0003

PD−1/PD−L1軸は、がんにおいて、T細胞免疫応答の抑制に関与している。この経路アンタゴニストは、固形腫瘍の多くの適応症に対して、臨床的に検証されている。ニボルマブ及びペンブロリズマブは、このような阻害薬の2つであり、PD−1経路を標的にし、転移性黒色腫治療に対して、それぞれ米国食品医薬品局FDA)から承認されている。最近、研究者らは、他の腫瘍種の環境でのチェックポイント阻害パラダイム試験している。ある程度の進歩があったが、チェックポイント阻害療法は、依然として、他の癌治療選択肢の影に隠れたままである。

0004

他の薬剤と組み合わせたチェックポイント阻害薬の研究は、進行中のものもあれば、最近、終了したものもある。例えば、ニボルマブと、イピリムマブ(CTLA−4受容体遮断抗体)の組み合わせが、切除不能ステージIIIまたはIVの黒色腫患者に対する第3相臨床試験で試験された。当該試験において、完全奏効に達した患者パーセンテージは、ニボルマブとイピリムマブの組み合わせを投与した患者で最も高く、いずれかの薬物のみを投与した群が示した結果を凌駕した。他の組み合わせも現在探究されている。

0005

インターロイキン−21(IL−21)は、T細胞由来する多機能性サイトカインであり、自然免疫細胞及び適応免疫細胞の両方の活性を制御する。IL−21は、T細胞の生存及びエフェクター機能を高めることができる。IL−21は、自己免疫疾患及び炎症性疾患発症につながる炎症応答に大きな影響を及ぼすことに加え、抗腫瘍応答及び抗ウイルス応答において重要な役割を果たすことから、いくつかの治療法にとって、魅力的ターゲットとなっている。

0006

しかしながら、IL−21をベースにした治療法の開発は複雑である。複数の研究で、わかりづらいことに、IL−21の作用を増強しても、阻害しても、治療効果がもたらされることが示されているために、研究が複雑になっている。また、IL−21受容体(IL−21R)が広範に発現していることにより、更なる課題がある。IL−21Rは、T細胞だけでなく、B細胞NK細胞及び骨髄細胞上にも発現している。したがって、白血球における広範なIL−21活性化を制限し、毒性に対する可能性を回避するように注意払う必要がある。IL−21シグナル伝達の制限は、均衡が取れたものであり、選択的である必要がある。IL−21の作用誘発は、適切な時間と場所で生じるように設計する必要がある。

0007

実際、いかなる成功も示されておらず、特に、単剤療法またはチェックポイント阻害薬との併用としてのIL−21部分による臨床上の成功は、示されていない。したがって、IL−21を利用した治療モダリティが、IL−21部分とチェックポイント阻害薬とを組み合わせたモダリティを含め、依然として必要とされている。また、免疫チェックポイント阻害と組み合わせたIL−21療法も依然として必要とされている。

0008

本開示は、配列番号2のアミノ酸配列を含むIL−21ムテインを提供し、ここで、配列番号2は、
QGQDXHMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPEFLPAPEDVENCEWSAFSCF QKAQLKSANTNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGRRQKHRLTCPSCDSYE KKPPKEFLXX FXXLLXXMXX QHXSSRTHGS EDS(配列番号2)であり、Xは、任意のアミノ酸であり、IL−21ムテインアミノ酸配列は、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と少なくとも1アミノ酸異なる。

0009

したがって、一態様において、本開示はまた、配列番号1として本明細書に記載される野生型IL−21アミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換を1つのみ含む、IL−21ムテインを提供する。例示的な態様において、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸位ナンバリングに従って、5、8、9、11、12、13、14、15、16、19、23、65、66、68、69、70、72、73、75、76、77、78、79、80、109、110、112、113、116、117、119、120または123からなる群から選択される1つのアミノ酸位置に位置する。

0010

本開示は、更に、配列番号1と比較してアミノ酸置換を2つのみ含む、IL−21ムテインを提供する。例示的な態様において、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸位置ナンバリングに従って、5、9、15、70、71、72、73及び76からなる群から選択される2つのアミノ酸位置に位置する。

0011

例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、IL−21受容体に対する野生型IL−21の親和性と比較して低い親和性でIL−21受容体(IL−21R)に結合する。例示的な態様において、IL−21ムテインは、0.04nMよりも高いKD、または約0.04nMのKDで、ヒトIL−21Rに結合する。例示的な態様において、IL−21ムテインは、0.055nMよりも高いKD、または約0.055nMのKDで、カニクイザルIL−21Rに結合する。

0012

本開示はまた、異種部分に連結された本開示のIL−21ムテインを含む、コンジュゲートを提供する。例示的な態様において、異種部分は、ポリペプチドであり、そのため、コンジュゲートは、融合タンパク質である。したがって、本開示は、本開示のIL−21ムテインを含む融合タンパク質を提供する。例示的な態様において、融合タンパク質は、抗体などの抗原結合タンパク質またはその抗原結合抗体断片に連結された本開示のIL−21ムテインを含む。

0013

特定の実施形態において、融合タンパク質は、本開示のPD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)に連結されたIL−21ムテインを含む。

0014

本開示はまた、PD−1抗原結合タンパク質及びコンジュゲート及びPD−1抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。

0015

本開示は、本開示のIL−21ムテイン、PD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)、またはIL−21ムテインとPD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)とを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を更に提供する。例示的な態様において、核酸分子は、本開示のコンジュゲートまたは融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。本開示の核酸を含むベクター及び本開示の核酸を含む宿主細胞もまた更に、本明細書で提供される。

0016

本開示は、本開示のIL−21ムテイン、PD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)、コンジュゲート、融合タンパク質(例えば、IL−21ムテイン及びPD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)を含む融合タンパク質)、核酸、ベクターもしくは宿主細胞、またはこれらの組み合わせを含むキットを更に提供する。

0017

本開示のIL−21ムテイン、PD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)、コンジュゲート、融合タンパク質(例えば、IL−21ムテインとPD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)とを含む融合タンパク質)、核酸、ベクターもしくは宿主細胞、またはこれらの組み合わせを含む、医薬組成物が本明細書で提供される。

0018

IL−21ムテイン、PD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)、及びIL−21ムテインとPD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)とを含む融合タンパク質を作製する方法が本明細書で提供される。例示的な実施形態において、当該方法は、本開示の宿主細胞を培養して、IL−21ムテイン、PD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)またはIL−21ムテインとPD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)とを含む融合タンパク質を発現させることと、発現されたIL−21ムテイン、PD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)、またはIL−21ムテインとPD−1抗原結合タンパク質(例えば、PD−1抗原結合抗体)とを含む融合タンパク質を回収することとを含む。

0019

治療方法が本開示によって更に提供される。例示的な実施形態において、当該方法は、治療を必要とする対象を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、本開示の医薬組成物を、当該対象を治療するのに有効な量で投与することを含む、方法である。例示的な態様において、対象は、腫瘍(例えば、固形腫瘍、血液悪性腫瘍またはリンパ系悪性腫瘍)を有し、医薬組成物は、対象の腫瘍を治療するのに有効な量で、対象に投与される。他の例示的な態様において、腫瘍は、非小細胞肺癌(NSCLC)(例えば、ステージIIIまたはIVのNSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、頭頸部癌腎癌乳癌黒色腫卵巣癌肝癌膵癌大腸癌前立腺癌胃癌膀胱癌肝細胞癌マイクロサテライト不安定性の高いがん(すなわち、高MSIがん)、リンパ腫または白血病である。

図面の簡単な説明

0020

図1Aは、CT26/3E5結腸癌細胞移植したBALB/cマウス腫瘍体積(mm3)を時間(日数)に対して示すグラフである。12日目に腫瘍を測定し、12、15及び18日目にアイソタイプ対照抗体(mIgG1)300μgの腹腔内(IP)注射をマウスに投与した。図1Bは、CT26/3E5結腸癌細胞を移植したBALB/cマウスの腫瘍体積(mm3)を時間(日数)に対して示すグラフである。12日目に腫瘍を測定し、12、15及び18日目に抗PD−1抗体300μgのIP注射をマウスに投与した。図1Cは、CT26/3E5結腸癌細胞を移植したBALB/cマウスの腫瘍体積(mm3)を時間(日数)に対して示すグラフである。12日目に腫瘍を測定し、組み換えマウスIL−21(rmIL−21)50μgを週3回、3週間、マウスに投与した。33日目に投薬を終了した。図1Dは、CT26/3E5結腸癌細胞を移植したBALB/cマウスの腫瘍体積(mm3)を時間(日数)に対して示すグラフである。12日目に腫瘍を測定し、12、15及び18日目に抗PD−1抗体300μgと、rmIL−21 50μgを週3回、3週間、マウスに投与した。33日目に投薬を終了した。
CT26/3E5結腸癌細胞を移植したBALB/cマウス4群の生存率を示すグラフである。群1のマウスには、12、15及び18日目に、アイソタイプ対照抗体(mIgG1)300μgの腹腔内(IP)注射を投与した。群2のマウスには、12、15及び18日目に、抗PD−1抗体300μgのIP注射を投与した。群3のマウスには、rmIL−21 50μgを週3回、3週間、投与した。群4のマウスには、12、15及び18日目に、抗PD−1抗体300μgと、rmIL−21 50μgを週3回、3週間、投与した。抗PD−1とrmIL−21の組み合わせの投与は、rmIL−21または抗PD−1の単剤療法と比較して、生存を大幅に延長する。
IL−21ムテインに融合されたPD−1阻害抗体を含む融合タンパク質(αPD−1:IL−21ムテイン)の作用機序仮説を示す図である。特定の理論に束縛されるものではないが、融合体は、CD8+T細胞上のIL−21Rに結合しつつ、PD−1とPD−L1との間のシグナル伝達を同時に阻害すると考えられる。
図4Aは、IL−21ムテインホモ二量体に融合された抗PD−1抗体を含む融合タンパク質を示す図である。この融合タンパク質は、リンカーを有しない。抗体は、Fc関連エフェクター結合及びその機能を低下または排除する定常領域を含み得る(例えば、Fcγ受容体(例えば、SEFL2−2)と相互作用する能力欠く)。図4Bは、IL−21ムテインホモ二量体に融合された抗PD−1抗体を含む融合タンパク質を示す図である。この融合タンパク質は、抗体の重鎖定常領域とIL−21ムテインとの間にGGGGS(G4S)リンカーを含み得る。抗体はまた、SEFL2−2修飾を含み得る。図4Cは、IL−21ムテインホモ単量体に融合された抗PD−1抗体を含む融合タンパク質を示す図である。この融合タンパク質は、抗体の重鎖定常領域とIL−21ムテインとの間にG4Sリンカーを含み得る。抗体重鎖は、ヘテロ二量体Fc領域優先会合を助けるために、電荷対変異(cpm;例えば、V1、V4、V103またはV131)を含む。抗体はまた、SEFL2−2修飾を含み得る。
図5Aは、(i)組み換えヒトIL−21(rhIL−21)単独(黒丸の付いた実線)、(ii)抗PD−1 mAb単独(黒い菱形の付いた実線)、(iii)リンカーを含まない、IL−21ホモ二量体に融合された抗PD−1 mAb、(黒い三角の付いた実線)、(iv)リンカーを含む、IL−21ホモ二量体に融合された抗PD−1 mAb、(白い三角の付いた破線)、(v)リンカーを含まない、IL−21単量体に融合された抗PD−1 mAb、(黒い四角の付いた実線)、または(vi)リンカーを含む、IL−21単量体に融合された抗PD−1 mAb(白い四角の付いた破線)に曝露されたPD−1陰性Hut78T細胞におけるSTAT3シグナル伝達を示すグラフである。図5Bは、(i)組み換えヒトIL−21(rhIL−21)単独(黒丸の付いた実線)、(ii)抗PD−1 mAb単独(黒い菱形の付いた実線)、(iii)リンカーを含まない、IL−21ホモ二量体に融合された抗PD−1 mAb、(黒い三角の付いた実線)、(iv)リンカーを含む、IL−21ホモ二量体に融合された抗PD−1 mAb、(白い三角の付いた破線)、(v)リンカーを含まない、IL−21単量体に融合された抗PD−1 mAb、(黒い四角の付いた実線)、または(vi)リンカーを含む、IL−21単量体に融合された抗PD−1 mAb(白い四角の付いた破線)に曝露されたPD−1陽性Hut78T細胞におけるSTAT3シグナル伝達を示すグラフである。
低用量(250μg/kg)または高用量(1000μg/kg)のいずれかで6匹の動物静脈内投与した、抗PD−1 mAbに融合されたWT IL−21を含むホモ二量体融合タンパク質の血清中濃度を示すグラフである。対照として、IgG抗体ドメイン(150μg/kg)を使用した。
IL−21Rαに対する親和性が低減したIL−21ムテインに曝露された、PD−1陰性Hut78細胞(白い棒)またはPD−1陽性Hut78細胞(黒い棒)によるIL−21活性の減少倍数(rhIL−21活性を基準とする)を示すグラフである。
IL−21Rγに対する親和性が低減したIL−21ムテインに曝露された、PD−1陰性Hut78細胞(白い棒)またはPD−1陽性Hut78細胞(黒い棒)によるIL−21活性の減少倍数(rhIL−21活性を基準とする)を示すグラフである。
図9Aは、(i)組み換えヒトIL−21(rhIL−21)単独(黒丸の付いた実線)、(ii)WT IL−21ホモ二量体に融合された抗PD−1 mAb(白丸の付いた破線)、(iii)WT IL−21単量体に融合された抗PD−1 mAb(黒丸の付いた破線)、及び(iv)IL−21ムテイン51ホモ二量体(R65P)に融合された抗PD−1 mAb(黒い三角の付いた点線)に曝露されたPD−1陰性Hut78T細胞におけるSTAT3シグナル伝達を示すグラフである。図9Bは、(i)組み換えヒトIL−21(rhIL−21)単独(黒丸の付いた実線)、(ii)WT IL−21ホモ二量体に融合された抗PD−1 mAb(白丸の付いた破線)、(iii)WT IL−21単量体に融合された抗PD−1 mAb(黒丸の付いた破線)、及び(iv)IL−21ムテイン51ホモ二量体(R65P)に融合された抗PD−1 mAb(黒い三角の付いた点線)に曝露されたPD−1陽性Hut78T細胞におけるSTAT3シグナル伝達を示すグラフである。
(i)IL−21 R76Eムテインホモ二量体に融合された抗PD−1 mAb(黒丸の付いた点線)、(ii)IL−21 R76Aムテインホモ二量体に融合された抗PD−1 mAb(黒い三角の付いた破線)、(iii)IL−21 D15Nムテインホモ二量体に融合された抗PD−1 mAb(Xの付いた破線)、(iv)抗PD−1抗体(8.25mg/kg;白い菱形の付いた破線)、及び(v)WT IL−21ムテインホモ二量体に融合された抗PD−1 mAb(黒い四角の付いた実線)を含む融合タンパク質の血清中濃度を示すグラフである。
(i)抗PD−1抗体(黒丸の付いた実線)、(ii)IL−21 R5Q/R76Eダブルムテインホモ二量体を含む融合タンパク質(白丸の付いた破線)、(iii)抗PD−1 mAbとrhIL−21の組み合わせ(白い四角の付いた点線)、(iv)IL−21 R76Eシングルムテインホモ二量体を含む融合タンパク質(黒い四角)、(v)IgG対照(白い菱形の付いた点線)、及び(vi)rhIL−21(白い三角の付いた破線)の抗体濃度に対する、混合リンパ球反応の細胞によって分泌されたIL−2(pg/mL)を示すグラフである。
図12Aは、(i)IL−21 R5E/R76Aダブルムテインを含む融合タンパク質(白い三角の付いた線)、(ii)IgG1対照(黒い菱形の付いた点線)、(iii)rhIL−21(白い四角の付いた破線)、(iv)抗PD−1 mAb(白い楕円の付いた実線)、(v)rhIL−21と抗PD−1 mAbの組み合わせ(黒い楕円の付いた破線)、または(vi)IL−21 R76Eシングルムテインを含む融合タンパク質(白い菱形の付いた線)に曝露された細胞のSTAT3活性の平均蛍光強度MFI)に対する倍数変化を示すグラフである。図12Bは、(i)IL−21 R5Q/R76Eダブルムテインを含む融合タンパク質(白い三角の付いた線)、(ii)IgG1対照(黒い菱形の付いた点線)、(iii)rhIL−21(白い四角の付いた破線)、(iv)抗PD−1 mAb(白い楕円の付いた実線)、(v)rhIL−21と抗PD−1 mAbの組み合わせ(黒い楕円の付いた破線)、または(vi)IL−21 R76Eシングルムテインを含む融合タンパク質(白い菱形の付いた線)に曝露された細胞のSTAT3活性のMFIに対する倍数変化を示すグラフである。図12Cは、(i)IL−21 R9E/R76Aダブルムテインを含む融合タンパク質(白い三角の付いた線)、(ii)IgG1対照(黒い菱形の付いた点線)、(iii)rhIL−21(白い四角の付いた破線)、(iv)抗PD−1 mAb(白い楕円の付いた実線)、(v)rhIL−21と抗PD−1 mAbの組み合わせ(黒い楕円の付いた破線)、または(vi)IL−21 R76Eシングルムテインを含む融合タンパク質(白い菱形の付いた線)に曝露された細胞のSTAT3活性のMFIに対する倍数変化を示すグラフである。
図13Aは、(i)rhIL−21(黒丸の付いた実線)、(ii)hIgG4対照抗体(白丸の付いた破線)、(iii)抗PD−1 mAb(黒い三角の付いた破線)、(iv)rhIL−21と抗PD−1 mAbの組み合わせ(白い三角の付いた点線)、または(v)IL−21 R5E/R76Aを含む融合タンパク質(Xの付いた破線)に曝露されたCTLによる特異的溶解率(%)(y軸)をエフェクター細胞標的細胞比(x軸)に対して示すグラフである。図13Bは、(i)rhIL−21(黒丸の付いた実線)、(ii)hIgG4対照抗体(白丸の付いた破線)、(iii)抗PD−1 mAb(黒い三角の付いた破線)、(iv)rhIL−21と抗PD−1 mAbの組み合わせ(白い三角の付いた点線)、または(v)IL−21 R5Q/R76Eを含む融合タンパク質(Xの付いた破線)に曝露されたCTLによる特異的溶解率(%)を示すグラフである。図13Cは、(i)rhIL−21(黒丸の付いた実線)、(ii)hIgG4対照抗体(白丸の付いた破線)、(iii)抗PD−1 mAb(黒い三角の付いた破線)、(iv)rhIL−21と抗PD−1 mAbの組み合わせ(白い三角の付いた点線)、または(v)IL−21 R9E/R76Aを含む融合タンパク質(Xの付いた破線)に曝露されたCTLによる特異的溶解率(%)を示すグラフである。
(i)抗PD−1 mAb(黒い四角の付いた実線)、(ii)抗PD−1 mAb及びIL−21 R5Q/R76Eホモ二量体を含む融合タンパク質(黒丸の付いた実線)、(iii)抗PD−1 mAb及びIL−21 R76Eホモ二量体を含む融合タンパク質(実線)、(iv)抗PD−1 mAb及びIL−21 R5E/R76Aホモ二量体を含む融合タンパク質(Xの付いた破線)、(v)抗PD−1 mAb及びIL−21 R76Aホモ二量体を含む融合タンパク質(黒い菱形の付いた破線)、または(vi)抗PD−1 mAb及びIL−21 R76E単量体を含む融合タンパク質(黒い三角の付いた実線)の血清中濃度を表す。
図15Aは、細胞サンプリング(白矢印)及び投与(黒矢印)の時系列を示す。図15Bは、ある用量の(i)抗PD−1 mAb及びIL−21 R76Eムテインを含む融合タンパク質(横線の付いた棒)、(ii)抗PD−1 mAb及びIL−21 R76Eシングルムテイン単量体を含む融合タンパク質(縦線の付いた棒)、または(iii)抗PD−1 mAb及びIL−21 R5Q/R76Eダブルムテインホモ二量体を含む融合タンパク質(白い棒)を投与した動物(それぞれ0日目に投与)において、7日目に測定したときのPD−1+/CD4+細胞の倍数変化(−5日目と比較)を示すグラフである。図15Cは、ある用量の(i)抗PD−1 mAb及びIL−21 R76Eムテインを含む融合タンパク質(横線の付いた棒)、(ii)抗PD−1 mAb及びIL−21 R76Eシングルムテイン単量体を含む融合タンパク質(縦線の付いた棒)、または(iii)抗PD−1 mAb及びIL−21 R5Q/R76Eダブルムテインホモ二量体を含む融合タンパク質(白い棒)を投与した動物(それぞれ0日目に投与)において、7日目に測定したときのPD−1+/CD8+細胞の倍数変化(−5日目と比較)を示すグラフである。図15Dは、(i)抗PD−1 mAb及びIL−21 R76Eムテインを含む融合タンパク質(横線の付いた棒)、(ii)抗PD−1 mAb及びIL−21 R76Eシングルムテイン単量体を含む融合タンパク質(縦線の付いた棒)、または(iii)抗PD−1 mAb及びIL−21 R5Q/R76Eダブルムテインホモ二量体を含む融合タンパク質(白い棒)の初回用量を投与した動物(初回用量を0日目に投与し、2回目の用量を8日目に投与)において、21日目に測定したときのPD−1+/CD8+細胞の倍数変化(−5日目と比較)を示すグラフである。
PD−1+/CD8+細胞の増大(−5日目と比較)をPD−1+/CD8+細胞のPD−1受容体占有率(RO)に対して示すグラフである。IL−21単一変異体(801、802、807及び808)は、青色の円内に示され、IL−21二重変異体(803、804、805及び806)は、ピンク色の円内に示されている。これらのデータは、PD−1+標的集団の増大によって測定したとき、二重変異体の優れた薬物動態特性により良好な標的範囲が可能となり、良好な薬力学応答と相関することを示している。青線は、単一変異体と二重変異体との大まかな線引きを示す。
単一変異体ホモ二量体構築物(動物801及び802)、二重変異体ホモ二量体構築物(動物803〜806)、または単一変異体単量体構築物(動物807及び808)のいずれかで処置した個々の動物のフロープロットを示す。PD−1+T細胞を非競合検出抗体または競合検出抗体によって検出した。標的範囲パーセントは、競合PD−1抗体と非競合PD−1抗体との間の比率として算出している。データは、全ての構築物が、反復投与後の21日目に、強力な標的範囲を表すことを示している。
図18Aは、10個の異なる抗PD−1 mAbのうちの1つと、IL−21 R5Q/R76Eムテインホモ二量体とを含む融合タンパク質に曝露されたPD−1陰性Hut78T細胞のSTAT3活性の倍数変化(rhIL−21(円中にXの付いた実線)と比較)を示すグラフである。10個の抗PD−1 mAbには、20A2.003(菱形の付いた線)、20C1.006(赤い四角)、20C1.009(三角の付いた線)及び22D4.006(白丸の付いた線)が含まれた。図18Bは、10個の異なる抗PD−1 mAbのうちの1つと、IL−21 R5Q/R76Eムテインホモ二量体とを含む融合タンパク質に曝露されたPD−1陽性Hut78T細胞のSTAT3活性の倍数変化(rhIL−21(円中にXの付いた実線)と比較)を示すグラフである。10個の抗PD−1 mAbには、20A2.003(菱形の付いた線)、20C1.006(赤い四角)、20C1.009(三角の付いた線)及び22D4.006(白丸の付いた線)が含まれた。図18Aと図18Bを比較すると、pSTAT3シグナル伝達にはPD−1標的化が必要であり、ムテインの活性は、異なる抗PD−1 mAbに融合された場合、同様であることが示される。
図19Aは、7個の異なる抗PD−1 mAbのうちの1つと、IL−21 R9E/R76Aムテインホモ二量体とを含む融合タンパク質に曝露されたPD−1陰性Hut78T細胞のSTAT3活性の倍数変化(rhIL−21(円中にXの付いた実線)と比較)を示すグラフである。7個の抗PD−1 mAbには、20A2.003(白い三角の付いた線)、20C1.006(白い四角の付いた線)、20C1.009(白い菱形の付いた線)及び22D4.006(白丸の付いた線)が含まれた。図19Bは、7個の異なる抗PD−1 mAbのうちの1つと、IL−21 R9E/R76Aムテインホモ二量体とを含む融合タンパク質に曝露されたPD−1陽性Hut78T細胞のSTAT3活性の倍数変化(rhIL−21(円中にXの付いた実線)と比較)を示すグラフである。図19Aと図19Bを比較すると、pSTAT3シグナル伝達にはPD−1標的化が必要であり、ムテインの活性は、異なる抗PD−1 mAbに融合された場合、同様であることが示される。7個の抗PD−1 mAbには、20A2.003(白い三角の付いた線)、20C1.006(白い四角の付いた線)、20C1.009(白い菱形の付いた線)及び22D4.006(白丸の付いた線)が含まれた。
図20A〜20Dは、いくつかの抗PD−1 mAb−IL−21単量体または二量体ダブルムテイン融合体を用いて観察されたpSTAT3シグナル伝達の量を示す。黒丸の付いた実線(グラフ上部)は、rhIL−21であり、白丸の付いた破線(グラフ下部)は、IgG1対照であり、Xの付いた線(グラフ下部)は、IgG2対照であり、黒い四角の付いた点線(グラフ下部)は、IL−21ムテイン融合体に使用された22D4.006抗PD−1 mAbであり(mAbとして存在;すなわち、融合体ではない)、白い四角の付いた破線及び白い菱形の付いた点線(グラフ下部)は、対照抗PD−1 mAbであり、残りの線は、抗PD−1 mAb(22D4.006)−IL−21単量体または二量体ダブルムテイン融合体(各種電荷対変異を含む)である(二重変異体は、R5E/R76A;R9E/R76A;R5A/R76EまたはR5Q/R76Eである)。rhIL−21は、PD−1陰性細胞とPD−1陽性細胞の両方の細胞で活性を示し、単量体及びホモ二量体ダブルムテイン融合体は、PD−1陰性細胞では、pSTAT3活性(IL−21に基づく)を示すことができず、単量体及びホモ二量体ダブルムテイン融合体は、PD−1陽性細胞において、pSTAT3活性(IL−21に基づく)を示すことができる。したがって、IL−21二重変異体を含む単量体融合体のPD−1陰性細胞におけるIL−21活性の減衰レベルは、対応する二量体融合体と同様のレベルを示し、IL−21活性は、対応する二量体融合体と同様に、PD−1陽性細胞で救済される。図20A及び20Bは、PD−1陰性細胞におけるpSTAT3アッセイの2連実験である。図20C及び20Dは、PD−1陽性細胞におけるpSTAT3アッセイの2連実験である。
図21A〜21Dは、図20A〜20Dで評価したものと同じ抗PD−1 mAb(22D4.006)−IL−21単量体または二量体ダブルムテイン融合体を用いた、PD−1レポーター遺伝子アッセイ(RGA;図21A及び21B)及びMLRアッセイ(図21C及び21D)の結果を示す。図21A〜21Dは、抗PD−1 mAb(22D4.006)−IL−21単量体及び二量体ダブルムテイン融合体がPD−1活性を誘導できることを実証している。黒丸の付いた実線(グラフ下部)は、rhIL−21であり、白丸の付いた線(グラフ下部)は、IgG1対照であり、Xの付いた線(グラフ下部)は、IgG2対照であり、黒い四角の付いた破線(グラフ上部)は、IL−21ムテイン融合体に使用された22D4.006抗PD−1 mAbであり(mAbとして存在;すなわち、融合体ではない)、白い四角の付いた破線及び白い菱形の付いた点線(グラフ上部)は、対照抗PD−1 mAbであり、残りの線は、抗PD−1 mAb−IL−21単量体または二量体ダブルムテイン融合体である。図21A及び21Bは、PD−1 RGAアッセイの2連実験である。図20C及び20Dは、MLRアッセイの2連実験である。
図21A〜21Dは、図20A〜20Dで評価したものと同じ抗PD−1 mAb(22D4.006)−IL−21単量体または二量体ダブルムテイン融合体を用いた、PD−1レポーター遺伝子アッセイ(RGA;図21A及び21B)及びMLRアッセイ(図21C及び21D)の結果を示す。図21A〜21Dは、抗PD−1 mAb(22D4.006)−IL−21単量体及び二量体ダブルムテイン融合体がPD−1活性を誘導できることを実証している。黒丸の付いた実線(グラフ下部)は、rhIL−21であり、白丸の付いた線(グラフ下部)は、IgG1対照であり、Xの付いた線(グラフ下部)は、IgG2対照であり、黒い四角の付いた破線(グラフ上部)は、IL−21ムテイン融合体に使用された22D4.006抗PD−1 mAbであり(mAbとして存在;すなわち、融合体ではない)、白い四角の付いた破線及び白い菱形の付いた点線(グラフ上部)は、対照抗PD−1 mAbであり、残りの線は、抗PD−1 mAb−IL−21単量体または二量体ダブルムテイン融合体である。図21A及び21Bは、PD−1 RGAアッセイの2連実験である。図20C及び20Dは、MLRアッセイの2連実験である。
図22A〜22Dは、抗PD−1 mAb−IL−21単量体及び二量体ダブルムテイン融合体に異なる抗PD−1 mAb(20A2.003)を使用した点を除き、図20A〜20Dの構築物と同じ構築物を試験したpSTAT3アッセイの結果を表す。図22A〜22Dの結果は、図20A〜20Dで認められた結果と同様である。黒丸の付いた実線(グラフ上部)は、rhIL−21であり、白丸の付いた破線(グラフ下部)は、IgG1対照であり、Xの付いた線(グラフ下部)は、IgG2対照であり、黒い四角の付いた点線(グラフ下部)は、IL−21ムテイン融合体に使用された22D4.003抗PD−1 mAbであり(mAbとして存在;すなわち、融合体ではない)、白い四角の付いた破線及び白い菱形の付いた点線(グラフ下部)は、対照抗PD−1 mAbであり、残りの線は、抗PD−1 mAb(22D4.003)−IL−21単量体または二量体ダブルムテイン融合体(各種電荷対変異を含む)である(二重変異体は、R5E/R76A;R9E/R76A;R5A/R76EまたはR5Q/R76Eである)。図22A及び22Bは、PD−1陰性細胞におけるpSTAT3アッセイの2連実験である。図22C及び22Dは、PD−1陽性細胞におけるpSTAT3アッセイの2連実験である。
図23A〜23Dは、抗PD−1 mAb−IL−21単量体及び二量体ダブルムテイン融合体に異なる抗PD−1 mAb(20A2.003)を使用した点を除き、図21A〜21Dの構築物と同じ構築物を試験した、PD−1レポーター遺伝子アッセイ(図23A及び23B)及びMLRアッセイ(図23C及び23D)の結果を示す。図23A〜23Dの結果は、図21A〜21Dで認められた結果と同様である。黒丸の付いた実線(グラフ下部)は、rhIL−21であり、白丸の付いた破線(グラフ下部)は、IgG1対照であり、Xの付いた線(グラフ下部)は、IgG2対照であり、点線(グラフ上部)は、IL−21ムテイン融合体に使用された20A2.003抗PD−1 mAbであり(mAbとして存在;すなわち、融合体ではない)、白い四角の付いた破線及び白い菱形の付いた点線(グラフ上部)は、対照抗PD−1 mAbであり、残りの線は、抗PD−1 mAb(20A2.003)−IL−21単量体または二量体ダブルムテイン融合体である。図23A及び23Bは、PD−1 RGAアッセイの2連実験である。図23C及び23Dは、MLRアッセイの2連実験である。
図23A〜23Dは、抗PD−1 mAb−IL−21単量体及び二量体ダブルムテイン融合体に異なる抗PD−1 mAb(20A2.003)を使用した点を除き、図21A〜21Dの構築物と同じ構築物を試験した、PD−1レポーター遺伝子アッセイ(図23A及び23B)及びMLRアッセイ(図23C及び23D)の結果を示す。図23A〜23Dの結果は、図21A〜21Dで認められた結果と同様である。黒丸の付いた実線(グラフ下部)は、rhIL−21であり、白丸の付いた破線(グラフ下部)は、IgG1対照であり、Xの付いた線(グラフ下部)は、IgG2対照であり、点線(グラフ上部)は、IL−21ムテイン融合体に使用された20A2.003抗PD−1 mAbであり(mAbとして存在;すなわち、融合体ではない)、白い四角の付いた破線及び白い菱形の付いた点線(グラフ上部)は、対照抗PD−1 mAbであり、残りの線は、抗PD−1 mAb(20A2.003)−IL−21単量体または二量体ダブルムテイン融合体である。図23A及び23Bは、PD−1 RGAアッセイの2連実験である。図23C及び23Dは、MLRアッセイの2連実験である。
精製された抗PD−1抗体のNFATルシフェラーゼ活性をmAb濃度に対して示すグラフである。
図25Aは、融合タンパク質[22D4.017]−[R9E:R76A](単量体)または抗PD−1抗体[22D4.017]に曝露された際のKi67+/CD3+/CD4+細胞の数のベースラインに対する倍数変化を示すグラフである。図25Bは、融合タンパク質[22D4.017]−[R9E:R76A](単量体)または抗PD−1抗体[22D4.017]に曝露された際のKi67+/CD3+/CD8+細胞の数のベースラインに対する倍数変化を示すグラフである。図25Cは、融合タンパク質[22D4.017]−[R9E:R76A](単量体)または抗PD−1抗体[22D4.017]に曝露された際のpSTAT3+/CD3+/CD4+細胞の数のベースラインに対する倍数変化を示すグラフである。図25Dは、融合タンパク質[22D4.017]−[R9E:R76A](単量体)または抗PD−1抗体[22D4.017]に曝露された際のpSTAT3+/CD3+/CD8+細胞の数のベースラインに対する倍数変化を示すグラフである。図25Eは、融合タンパク質[22D4.017]−[R9E:R76A](単量体)または抗PD−1抗体[22D4.017]に曝露された際のCD3+/CD4+細胞の数のベースラインに対する倍数変化を示すグラフである。図25Fは、融合タンパク質[22D4.017]−[R9E:R76A](単量体)または抗PD−1抗体[22D4.017]に曝露された際のCD3+/CD8+細胞の数のベースラインに対する倍数変化を示すグラフである。図25Gは、融合タンパク質[22D4.017]−[R9E:R76A](単量体)または抗PD−1抗体[22D4.017]に曝露された際のPD−1+/CD3+/CD4+細胞の数のベースラインに対する倍数変化を示すグラフである。図25Hは、融合タンパク質[22D4.017]−[R9E:R76A](単量体)または抗PD−1抗体[22D4.017]に曝露された際のPD−1+/CD3+/C84+細胞の数のベースラインに対する倍数変化を示すグラフである。図25Iは、融合タンパク質[22D4.017]−[R9E:R76A](単量体)または抗PD−1抗体[22D4.017]への72時間の曝露における血清パーフォリンの量のベースラインに対する倍数変化を示すグラフである。図25Jは、融合タンパク質[22D4.017]−[R9E:R76A](単量体)または抗PD−1抗体[22D4.017]への72時間曝露における、ベースラインに対するパーフォリンの倍数増加の関数としてのKi67+細胞(%)を示すグラフである。
図26Aは、ヒトPD−1抗原に対する抗体22D4.017について指定されたKDを決定するために使用した、時間(秒)の関数としての吸光度(nm)を示すグラフである。図26Bは、ヒトPD−1抗原に対する抗体20C1.009について指定されたKDを決定するために使用した、時間(秒)の関数としての吸光度(nm)を示すグラフである。図26Cは、ヒトPD−1抗原に対する抗体20A2.003について指定されたKDを決定するために使用した、時間(秒)の関数としての吸光度(nm)を示すグラフである。図26Dは、ヒトPD−1抗原に対するIgG1抗PD−1 mAbについて指定されたKDを決定するために使用した、時間(秒)の関数としての吸光度(nm)を示すグラフである。図26Eは、ヒトPD−1抗原に対するIgG4 PD−1 mAbについて指定されたKDを決定するために使用した、時間(秒)の関数としての吸光度(nm)を示すグラフである。図26Fは、カニクイザルPD−1抗原に対する22D4.017について指定されたKDを決定するために使用した、時間(秒)の関数としての吸光度(nm)を示すグラフである。図26Gは、カニクイザルPD−1抗原に対する抗体20C1.009について指定されたKDを決定するために使用した、時間(秒)の関数としての吸光度(nm)を示すグラフである。図26Hは、カニクイザルPD−1抗原に対する抗体20A2.003について指定されたKDを決定するために使用した、時間(秒)の関数としての吸光度(nm)を示すグラフである。図26Iは、カニクイザルPD−1抗原に対するIgG1抗PD−1 mAbについて指定されたKDを決定するために使用した、時間(秒)の関数としての吸光度(nm)を示すグラフである。図26Jは、カニクイザルPD−1抗原に対するIgG4抗PD−1 mAbについて指定されたKDを決定するために使用した、時間(秒)の関数としての吸光度(nm)を示すグラフである。
抗PD−1抗体22D4.017及び20C1.009のCp(kcal/mole/℃)を温度の関数として示すグラフである。
抗PD−1抗体22D4.017及び20C1.009について、剪断速度に対してプロットした粘度を示すグラフである。
図29A〜29Dは、(図29A)PD−1陽性であるバリアントHut78 T細胞株、(図29B)TIGIT陽性であるバリアントHut78 T細胞株、(図29C)LAG3陽性であるバリアントHut78 T細胞株、及び(図29D)PD−1、TIGITまたはLAG3を内因的に発現しない親のHut78 T細胞株の抗体濃度の関数としてシグナルをプロットした一連のグラフである。

0021

現在の免疫療法アプローチ少数の患者にしか有効でなく、重大かつしばしば予測不可能な毒性を有することがあるという事実を特に鑑み、がん細胞に対して安全かつ有効に免疫系を展開することができる、新しい免疫強化アプローチが依然として必要とされている。一態様において、本明細書で開示される操作された親和性減衰型インターロイキン−21ムテインに融合された、PD−1/PD−L1相互作用を遮断することができるPD−1標的抗体を含む、新しい種類の二機能性融合分子は、この必要性に対処するものである。本明細書に記載される抗体/サイトカイン融合体は、サイトカイン療法に付随する大きな障壁を克服するものであり、とりわけ、PD−1を標的にしたIL−21サイトカインの抗体と同様の投与及び選択的送達を可能にする。IL−21ムテインは、抗PD−1抗体に融合された場合、PD−1発現T細胞をin vivoで選択的に活性化させ、増殖させることができる。したがって、本明細書に記載される抗体/サイトカイン融合体は、現在臨床で試験が行われている抗PD−1療法を改善し、その有用性を広げることができる。

0022

サイトカインと共阻害性受容体アゴニストまたはアンタゴニストとの組み合わせは、毒性が増大するリスクがあり、複雑な臨床試験設計を要することから、依然として困難である(例えば、Ott et al.,J ImmunotherCancer 5,16(2017)、及びHermel et al.,Cancer Metastasis Rev 36,43−50(2017)参照)。サイトカインに関しては、免疫抑制つながり得る阻害性フィードバック経路の活性化の可能性もある(例えば、Portielje et al,Clin Cancer Res 9,76−83(2003);Wan et al.,Immunity 38,514−527(2013);及びMooradian et al.,Oncoimmunology 7,e1423172(2018)参照)。インターロイキン−21(IL−21)は、I型サイトカインであり、共通サイトイン受容体γ鎖(cg鎖)サイトカインファミリーメンバーであり、がん治療に対する有望な免疫療法として浮上してきている。IL−21は、活性化CD4 T細胞及びナチュラルキラーT(NKT)細胞によって産生され、共通γ鎖と会合する別個のIL−21受容体(IL−21R)サブユニットからなるヘテロ二量体受容体複合体を介してシグナルを伝達する(例えば、Spolski et al.,Nat Rev Drug Discov 13,379−395(2014)参照)。IL−21R複合体の活性化は、JAK/STATシグナル伝達経路の活性化につながる。IL−21Rは、Tリンパ球及びBリンパ球を含む造血細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞ならびに骨髄細胞で広く発現している。IL−21は、必須の成長因子または分化因子ではないが、NK細胞及び活性化T細胞にとって、強力なマイトジェンであり、生存因子である。IL−21は、CD4(+)Tヘルパー17(Th17)及び濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh)の分化支援することができ、制御性T細胞(Treg)の分化に拮抗することができる。更に、IL−21は、CD8 T細胞の生存を増強し、活性化の程度は低いがより持続的なT細胞表現型を維持することができ、これにより、高度な腫瘍制御及びウイルス制御が可能となる。

0023

サイトカイン免疫療法の難しい側面は、免疫応答強化するために免疫細胞を活性化するだけでなく、同じサイトカインが逆の抑制性経路も同様に活性化し得ることである。例えば、IL−2及びIFNγは、防御免疫応答ならびに制御性T細胞応答及び抑制性経路(PD−L1経路)をそれぞれ活性化することができる。樹状細胞(DC)において、IL−21は、DCの成熟と活性化の両方を阻害することができ、通常型DCのアポトーシスを誘導することができ、混合培養物中のT細胞のプライミングを強力に阻害することができ、耐性の誘導に役割を果たす可能性がある。ヒトにおいて、IL−21は、いくつかのがんの適応症で標的化されていないフリーのサイトカインとして試験されているが、このアプローチの開発は、有望な前臨床データ及び初期第I相臨床データにもかかわらず、第II相試験以降進んでいない。(例えば、Thompson et al.,J Clin Oncol 26,2034−2039(2008);及びDavis et al.,Clin Cancer Res 15,2123−2129(2009)参照)。より最近の前臨床モデルでは、組み換えIL−21サイトカインと共抑制性受容体アンタゴニスト(例えば、抗CTLA−4及び抗PD−1)とを組み合わせると、IL−21により、これらの治療の有効性が拡大し得ることが示された。かかる組み合わせは、現在、臨床試験中であるが、臨床的有効性は未だ示されていない(Lewis et al.,Oncoimmunology 7,e1377873(2017))。

0024

理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載される抗体/サイトカイン融合体は、IL−21の免疫強化活性を利用して有効性を最大にし(毒性及びオフターゲット免疫抑制に対応するために必要不可欠であり得る)、診療所での投与の実行可能性を改善するように設計される。

0025

IL−21及びIL−21ムテイン
インターロイキン−21(IL−21)は、T細胞、B細胞、NK細胞及び骨髄細胞によって発現されるサイトカインであり、自然免疫細胞及び適応免疫細胞の両方の活性を制御し、T細胞の生存及びエフェクター機能を改善する。いくつかの第I相及び第II相臨床試験は、黒色腫、腎細胞癌急性骨髄性白血病非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、大腸癌、全身性エリテマトーデスクローン病及び関節リウマチを含む、がん、炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療に対する治験薬として、IL−21を含んでいる。

0026

IL−21は、4ヘリックスバンドル構造を有し、単量体として存在する。ヒトにおいて、IL−21には、2つのアイソフォームが知られており、そのそれぞれは、1つの前駆体分子に由来する。第1のIL−21アイソフォームは、162アミノ酸(aa)を含み、そのうちの最初の29アミノ酸がシグナルペプチドを構成し、第2のIL−21アイソフォームは、153アミノ酸を含み、第1のアイソフォームと同様に、そのうちの最初の29アミノ酸がシグナルペプチドを構成する。第1及び第2のIL−21アイソフォームのアミノ酸配列(シグナルペプチドを含む)は、それぞれ、配列番号258及び配列番号259として本明細書に記載される。

0027

IL−21は、T細胞、B細胞及びNK細胞の表面上に発現されるヘテロ二量体IL−21受容体(IL−21R)に結合する。IL−21Rは、IL−2受容体及びIL−15受容体と類似の構造であり、これは、これらのサイトカイン受容体のそれぞれが共通γ鎖(γc)を含むという点で類似している。γcに加えて、IL−21Rは、IL−21への結合に重要なα鎖を含む。ヒトIL−21受容体α鎖には、アイソフォーム1とアイソフォーム2の2つのアイソフォームがある。アイソフォーム1及びアイソフォーム2のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号256及び261として本明細書に記載される。ヒト共通γ鎖のアミノ酸配列は、配列番号257として本明細書に記載される。

0028

IL−21がIL−21Rに結合すると、Jak/STATシグナル伝達経路が活性化されて、標的遺伝子を活性化する。IL−21により誘導されるシグナル伝達は、治療上望ましいものであり得るが、IL−21が広範な発現プロファイルを有し、IL−21がCD8 T細胞応答を強化する能力と、抗原提示及びT細胞プライミングを抑制する能力とを有するという事実から、シグナル伝達のタイミングと場所に対する熟慮が必要である。本明細書で初めて記載されるデータは、適切な時間と場所でIL−21シグナル伝達を達成するように慎重に設計されたIL−21ムテインの使用を支持するものである。

0029

本開示は、配列番号1として本明細書に記載される野生型IL−21アミノ酸配列と比較して、少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、IL−21ムテインを提供する。例えば、IL−21ムテインは、少なくとも1つ、かつ34を超えないアミノ酸置換を含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、少なくとも1つ、かつXを超えないアミノ酸置換を含み、ここで、Xは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33または34である。例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と10アミノ酸を超えない、15アミノ酸を超えない、20アミノ酸を超えないまたは25アミノ酸を超えない異なるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と7アミノ酸を超えないまたは5アミノ酸を超えない異なるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と3、4、5または6アミノ酸異なるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と3〜6アミノ酸または1〜5アミノ酸異なるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と1または2アミノ酸異なるアミノ酸配列を含む。

0030

例示的な態様において、IL−21ムテインは、配列番号2のアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号2は、
QGQDXHMXXM XXXXX XVDXL KNXVN DLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCF QKAQLKSANTGNNEX XIXXX XXXLX XXXXX TNAGRRQKHRLTCPSCDSYE KKPPKEFLXX FXXLLXXMXX QHXSSRTHGS EDS(配列番号2)であり、配列中、Xは、任意のアミノ酸を表し、IL−21ムテインアミノ酸配列は、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と少なくとも1アミノ酸異なる。

0031

したがって、例示的な態様において、IL−21ムテインは、配列番号2の配列を含み、ここで、配列番号2は、配列番号2中Xで指定される位置の少なくとも1つのアミノ酸が配列番号1と異なる。例示的な態様において、配列番号2を含むIL−21ムテインは、配列番号1に対して、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有する。例示的な態様において、IL−21ムテインは、配列番号1に対して、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0032

例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、野生型IL−21アミノ酸配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換(複数可)は、アミノ酸配列のN末端の半分以内に存在する。例えば、アミノ酸置換(複数可)は、配列番号1のアミノ酸位置ナンバリングに従って、位置5〜25または8〜23(両端点を含む)以内の位置に存在する。

0033

例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、野生型IL−21アミノ酸配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換(複数可)は、アミノ酸配列のC末端の半分以内に存在する。例えば、アミノ酸置換(複数可)は、配列番号1のアミノ酸位置ナンバリングに従って、位置100〜133または109〜123(両端点を含む)以内の位置に存在する。

0034

例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、野生型IL−21アミノ酸配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換(複数可)は、アミノ酸配列の中央の1/3に存在する。例えば、アミノ酸置換(複数可)は、配列番号1のアミノ酸位置ナンバリングに従って、位置55〜85または65〜80(両端点を含む)以内の位置に存在する。

0035

本開示はまた、配列番号1として本明細書に記載される野生型IL−21アミノ酸配列と比較して、アミノ酸置換を1つのみ含む、IL−21ムテインを提供する。例示的な態様において、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸位置ナンバリングに従って、5、8、9、11、12、13、14、15、16、19、23、65、66、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、79、80、109、110、112、113、116、117、119、120または123からなる群から選択される1つのアミノ酸位置に位置する。他の例示的な態様において、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸位置ナンバリングに従って、5、8、9、11、12、13、14、15、16、19、23、65、66、68、69、70、72、73、75、76、77、78、79、80、109、110、112、113、116、117、119、120または123からなる群から選択される1つのアミノ酸位置に位置する。更に他の例示的な態様において、IL−21ムテインは、配列番号3〜21及び23〜37のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

0036

本開示は、更に、配列番号1と比較してアミノ酸置換を2つのみ含む、IL−21ムテインを提供する。例示的な態様において、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸位置ナンバリングに従って、5、8、9、11、12、13、14、15、16、19、23、65、66、68、69、70、71、72、73、75、76、77、78、79、80、109、110、112、113、116、117、119、120または123からなる群から選択される2つのアミノ酸位置に位置する。他の例示的な態様において、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸位置ナンバリングに従って、5、9、15、70、71、72、73及び76からなる群から選択される2つのアミノ酸位置に位置する。更に他の例示的な態様において、アミノ酸置換は、配列番号1のアミノ酸位置ナンバリングに従って、5、9、73及び76からなる群から選択される2つのアミノ酸位置に位置する。例示的な態様において、2つのアミノ酸置換のうちの少なくとも1つは、配列番号1のアミノ酸位置ナンバリングに従って、位置76に位置する。例示的な態様において、IL−21ムテインは、配列番号199〜208及び210〜212のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。

0037

例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、野生型IL−21アミノ酸配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換(複数可)は、保存的アミノ酸置換(複数可)である。本明細書で使用されるとき、「保存的アミノ酸置換」という用語は、あるアミノ酸を、類似した性質(例えば、大きさ、電荷疎水性親水性及び/または芳香族性)を有する、別のアミノ酸で置換することを指し、次の5つの群のうちの1つのなかでの入れ替えを含む。
I.非極性またはわずかに極性の小さな脂肪族残基:Ala、Ser、Thr、Pro、Gly;
II.負の電荷を持つ極性残基ならびにそれらのアミド及びエステル:Asp、Asn、Glu、Gln、システイン酸及びホモシステイン酸
III.正の電荷を持つ極性残基:His、Arg、Lys;オルニチン(Orn)
IV.非極性の大きな脂肪族残基:Met、Leu、Ile、Val、Cys、ノルロイシン(Nle)、ホモシステイン
V.大きな芳香族残基:Phe、Tyr、Trp、アセチルフェニルアラニン

0038

例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、野生型IL−21アミノ酸配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換(複数可)は、非保存的アミノ酸置換(複数可)である。本明細書で使用されるとき、「非保存的アミノ酸置換」という用語は、本明細書中、あるアミノ酸を、異なる性質(例えば、大きさ、電荷、疎水性、親水性及び/または芳香族性)を有する、別のアミノ酸で置換することと定義され、上の5つの群から外れる入れ替えを含む。

0039

例示的な態様において、IL−21ムテインは、野生型IL−21アミノ酸配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、置換アミノ酸は、天然アミノ酸である。「天然アミノ酸」または「標準アミノ酸」または「カノニカルアミノ酸」とは、真核生物で認められる、普遍的遺伝暗号コドンによって直接コードされる20個のαアミノ酸(Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Arg、His、Lys、Asp、Glu)のうちの1つを意味する。例示的な態様において、IL−21ムテインは、野生型IL−21アミノ酸配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、置換アミノ酸は、非標準アミノ酸であるか、翻訳中にタンパク質に組み込まれないアミノ酸である。非標準アミノ酸には、セレノシステインピロリシン、オルニチン、ノルロイシン、β−アミノ酸(例えば、β−アラニンβ−アミノイソ酪酸、β−フェニルアラニン、β−ホモフェニルアラニン、β−グルタミン酸、β−グルタミン、β−ホモトリプトファン、β−ロイシン、β−リシン)、ホモアミノ酸(例えば、ホモフェニルアラニン、ホモセリンホモアルギニンモノシステインホモシスチン)、N−メチルアミノ酸(例えば、L−アブリン、N−メチル−アラニン、N−メチル−イソロイシン、N−メチル−ロイシン)、2−アミノカプリル酸、7−アミノセファロスポラン酸、4−アミノケイ皮酸、α−アミノシクロヘキサンプロピオン酸、アミノ−(4−ヒドロキシフェニル酢酸、4−アミノ−ニコチン酸、3−アミノフェニル酢酸などが挙げられるが、これらに限定されない。

0040

例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、8、9、12、14、15、65、66、69、70、72、73、75、76、77、80、116及び119のうちの1つ以上にあり、置換アミノ酸(複数可)は、脂肪族アミノ酸である。例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、配列番号1と比較してアミノ酸置換を1つのみ含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、8、9、12、14、15、65、66、69、70、72、73、75、76、77、80、116または119にあり、置換アミノ酸は、脂肪族アミノ酸である。

0041

例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、8、9、11、12、13、14、15、16、19、23、65、66、69、70、72、73、75、76、77、78、79、110、112、116、117、119、120または123のうちの1つ以上にあり、置換アミノ酸(複数可)は、酸性アミノ酸である。例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、配列番号1と比較してアミノ酸置換を1つのみ含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、8、9、11、12、13、14、15、16、19、23、65、66、69、70、72、73、75、76、77、78、79、110、112、116、117、119、120または123にあり、置換アミノ酸は、酸性アミノ酸である。

0042

例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、9、73、76、109、113または116のうちの1つ以上にあり、置換アミノ酸(複数可)は、塩基性アミノ酸である。例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、配列番号1と比較してアミノ酸置換を1つのみ含むアミノ酸配列を含み、配列番号1の位置5、9、73、76、109、113または116のアミノ酸は、塩基性アミノ酸である。

0043

例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、8、9、70または76のうちの1つ以上にあり、置換アミノ酸(複数可)は、芳香族アミノ酸である。例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、配列番号1と比較してアミノ酸置換を1つのみ含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、8、9、70または76にあり、置換アミノ酸は、芳香族アミノ酸である。

0044

例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、8、9、12、15、73、76、116または119のうちの1つ以上にあり、置換アミノ酸(複数可)は、側鎖アミドを含むアミノ酸である。例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、配列番号1と比較してアミノ酸置換を1つのみ含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、8、9、12、15、73、76、116または119にあり、置換アミノ酸は、側鎖アミドを含むアミノ酸である。

0045

例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、8、9、11、12、14、15、73、76、116または119のうちの1つ以上にあり、置換アミノ酸(複数可)は、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸である。例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、配列番号1と比較してアミノ酸置換を1つのみ含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、8、9、11、12、14、15、73、76、116または119にあり、置換アミノ酸は、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸である。

0046

例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置65、66、69、70、72、73、75、76、77または80のうちの1つ以上にあり、置換アミノ酸(複数可)は、イミノ酸である。例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、配列番号1と比較してアミノ酸置換を1つのみ含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置65、66、69、70、72、73、75、76、77または80にあり、置換アミノ酸は、イミノ酸を含むアミノ酸である。

0047

例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、9、15、76、116または119のうちの1つ以上にあり、置換アミノ酸(複数可)は、イオウ含有側鎖を含むアミノ酸である。例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、配列番号1と比較してアミノ酸置換を1つのみ含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、配列番号1の位置5、9、15、76、116または119にあり、置換アミノ酸は、イオウ含有側鎖を含むアミノ酸を含むアミノ酸である。

0048

例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、ヒトIL−21のアミノ酸配列(配列番号1)と比較して少なくとも1つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、少なくとも1つのアミノ酸置換は、表Aに示されるものである。

0049

例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、配列番号1と比較してアミノ酸置換を1つのみ含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、表Aに示されるものである。他の実施形態において、本開示のIL−21ムテインは、配列番号1と比較して2つのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は、表Aに示されるもののうちの2つである。

0050

例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、表Bに示されるアミノ酸配列を含む。

0051

例示的な実施形態において、本開示のIL−21ムテインは、配列番号47、48、51、61、62、64〜67、69、71〜112、114〜198、249〜254または283のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、配列番号47、48、51、61、62、64〜67、69、71〜112、114〜198、249〜254または283のうちの1つに対して、少なくとも少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性であるか、90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0052

本開示は、配列番号1と比較してアミノ酸置換を2つのみ含むIL−21ムテインを更に提供し、2つのアミノ酸置換は、配列番号1の位置5、9、15、70、71、72、73及び76のうちの2つに存在する。例示的な態様において、IL−21ムテインは、配列番号1と比較してアミノ酸置換を2つのみ含み、2つの置換は、5と76;9と76;15と70;15と71;15と72;15と73;70と73;70と76;71と73;71と76;72と73;72と76;及び73と76からなる群から選択されるアミノ酸位置の対に存在する。例示的な態様において、IL−21は、配列番号199〜208及び210〜212のアミノ酸配列のいずれか1つを含む。他の態様において、本開示は、配列番号1と比較してアミノ酸置換を2つのみ含むIL−21ムテインを更に提供し、2つのアミノ酸置換は、位置5、9、73及び76または配列番号1のうちの2つに存在する。例示的な態様において,置換のうちの1つは、配列番号1の位置76に存在する。例示的な態様において、配列番号1の位置76の置換アミノ酸は、脂肪族アミノ酸または酸性アミノ酸である。例示的な態様において、脂肪族アミノ酸は、アラニンである。例示的な態様において、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。例示的な態様において、酸性アミノ酸は、グルタミン酸である。例示的な態様において、IL−21ムテインは、配列番号1の位置76にある置換アミノ酸と、位置5、9または73にある脂肪族アミノ酸または酸性アミノ酸とを含む。例示的な態様において、位置5、9または73にある置換アミノ酸は、脂肪族アミノ酸、酸性アミノ酸、または側鎖アミドを含むアミノ酸である。例示的な態様において、脂肪族アミノ酸は、アラニンであり、酸性アミノ酸は、グルタミン酸であり、側鎖アミドを含むアミノ酸は、グルタミンである。例示的な態様において、IL−21ムテインは、配列番号1の位置76にある置換アミノ酸(任意選択により脂肪族アミノ酸または酸性アミノ酸)と、位置5または9にある置換アミノ酸とを含む(配列番号1のナンバリングに従う)。

0053

例示的な態様において、本開示のIL−21ムテインは、表Cに示される配列番号のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。

0054

例示的な態様において、IL−21ムテインは、配列番号213〜219及び227〜248からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、IL−21は、配列番号213〜219及び227〜248のうちの1つに対して、少なくとも少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性であるか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0055

ペプチド
本明細書に記載されるIL−21ムテインは、任意数のアミノ酸ペプチド骨格を含むことができ、すなわち、任意のペプチド長であってよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるペプチドは、配列番号1とほぼ同じ長さであり、すなわち、133(±約1〜約20、±約1〜約15、±約1〜約10または±約1〜約5)アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、本開示のペプチドは、本明細書に更に記載されるように、別のポリペプチド鎖、例えば、約400〜約600アミノ酸を含む抗体重鎖、約150〜約300アミノ酸を含む抗体軽鎖に融合されることにより、133アミノ酸長よりも長い。

0056

追加のペプチド修飾
本開示の代替的または追加的実施形態において、IL−21ムテインは、本明細書に更に記載されるように、脂質化(例えば、ミリトイル化、パルミトイル化)、グリコシル化アミド化カルボキシル化リン酸化エステル化アシル化アセチル化環化もしくは酸付加塩への変換、かつ/または任意選択により二量体化もしくは重合体化もしくはコンジュゲート化される。

0057

薬学的に許容される塩
例示的な態様において、IL−21ムテインは、塩、例えば、薬学的に許容される塩の形態である。そのような塩は、IL−21ムテインの最終的な単離及び精製中にin situで調製することもできるし、遊離塩基官能基を適切な酸と反応させることによって別々に調製することもできる。薬学的に許容される酸付加塩を形成するために利用することができる酸の例には、例えば、無機酸(例えば、塩酸臭化水素酸硫酸及びリン酸)及び有機酸(例えば、シュウ酸マレイン酸コハク酸及びクエン酸)が挙げられる。

0059

塩基性付加塩もまた、IL−21ムテインの最終的な単離及び精製中にin situで調製することもできるし、カルボン酸含有部分を、薬学的に許容される金属カチオン水酸化物炭酸塩もしくは炭酸水素塩などの好適な塩基と、またはアンモニアもしくは有機一級二級もしくは三級アミンと反応させることによって調製することもできる。薬学的に許容される塩には、とりわけ、リチウムナトリウムカリウムカルシウムマグネシウム及びアルミニウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類金属、ならびにアンモニウムテトラメチルアンモニウムテトラエチルアンモニウムメチルアンモニウムジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウムトリエチルアンモニウムジエチルアンモニウム及びエチルアンモニウムを含む、非毒性四級アンモニア及びアミンカチオンに基づくカチオンが挙げられるが、これらに限定されない。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンには、例えば、エチレンジアミンエタノールアミンジエタノールアミンピペリジンピペラジンなどが挙げられる。

0060

更に、塩基性窒素含有基は、塩化、臭化及びヨウ化メチルエチルプロピル及びブチルなどのハロゲン化低級アルキル;塩化、臭化及びヨウ化デシルラウリルミリスチル及びステアリルなどの長鎖ハロゲン化物臭化ベンジル及び臭化フェネチルなどのハロゲン化アリールアルキルなどの活性化剤で四級化することができる。これにより、水溶性または油溶性または分散性生成物が得られる。

0061

精製
本開示のIL−21ムテインは、精製することができる。本明細書で使用される「精製された」という用語は、純度が高められたことを意味し、「純度」は、相対的な用語であり、必ずしも完全に純粋であると解釈されるものではない。例示的な態様において、化合物の純度(例えば、組成物内)は、少なくとも50%もしくは約50%、少なくとも60%もしくは約60%、少なくとも70%もしくは約70%、少なくとも80%もしくは約80%、少なくとも90%もしくは約90%、少なくとも95%もしくは約95%、または少なくとも98%もしくは約98%であるか、約100%である。

0062

ペプチド模倣物
いくつかの態様において、IL−21ムテインは、ペプチド模倣物であるか、ムテインの少なくとも一部は、ペプチド模倣物である。ペプチド模倣物及びその作製方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Advances in Amino Acid Mimetics and Peptidomimetics,Volumes 1 and 2,ed.,Abell,A.,JAIPress Inc.,Greenwich,CT,2006を参照されたい。いくつかの態様において、ペプチド模倣物は、D−異性体アミノ酸を含むD−ペプチドのペプチド模倣物である。いくつかの態様において、ペプチド模倣物は、アミノ酸の側鎖がペプチド骨格のα窒素原子に接続している、ペプトイドである。ペプトイドの作製方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Zuckermann et al.,JACS 114(26):10646−10647(1992)及びDesign,Synthesis,and Evaluation of Novel Peptoids,Fowler,Sarah,University of Wisconsin−Madison,2008を参照されたい。いくつかの態様において、ペプチド模倣物は、α炭素ではなくβ炭素に結合したアミノ基を有するβアミノ酸を含む、β−ペプチドである。β−ペプチドの作製方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Seebach et al.,Helvetica Chimica Acta 79(4):913−941(1996)を参照されたい。

0063

結合特性
例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、IL−21受容体(IL−21R)に対する野生型IL−21の親和性と比較して低い親和性でIL−21Rに結合する。例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、ヒトIL−21Rに対する野生型ヒトIL−21の親和性と比較して低い親和性でヒトIL−21Rに結合する。例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、ヒトIL−21Rのα鎖に対する野生型ヒトIL−21の親和性と比較して低い親和性でヒトIL−21Rのα鎖に結合する。具体的な実施形態において、ヒトIL−21Rのα鎖に対する野生型ヒトIL−21の親和性と比較して低い親和性でヒトIL−21Rのα鎖に結合するIL−21ムテインは、配列番号1のアミノ酸位置ナンバリングに従って、5、8、9、12、13、16、19、23、65、66、69、70、72、73、75、76、77、78、79及び80からなる群から選択されるアミノ酸位置に位置する1つ、2つまたはそれ以上の置換を含有する。当該位置に行うことができる具体的なアミノ酸置換は、本明細書で記載されている(例えば、表A、B及びC参照)。

0064

例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、ヒトIL−21Rのγ鎖に対する野生型ヒトIL−21の親和性と比較して低い親和性でヒトIL−21Rのγ鎖に結合する。具体的な実施形態において、ヒトIL−21Rのγ鎖に対する野生型ヒトIL−21の親和性と比較して低い親和性でヒトIL−21Rのγ鎖に結合するIL−21ムテインは、配列番号1のアミノ酸位置ナンバリングに従って、11、14、15、109、110、112、113、116、117、119、120及び123からなる群から選択されるアミノ酸位置に位置する1つ、2つまたはそれ以上の置換を含有する。当該位置に行うことができる具体的なアミノ酸置換は、本明細書で記載されている(例えば、表A、B及びC参照)。

0065

例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、ヒトIL−21Rのα鎖に対する野生型ヒトIL−21の親和性と比較して低い親和性でヒトIL−21Rのγ鎖に結合する。例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、カニクイザルIL−21Rに対する野生型カニクイザルIL−21の親和性と比較して低い親和性でカニクイザルIL−21Rに結合する。例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、カニクイザルIL−21Rのα鎖に対する野生型カニクイザルIL−21の親和性と比較して低い親和性でカニクイザルIL−21Rのα鎖に結合する。例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、カニクイザルIL−21Rのγ鎖に対する野生型カニクイザルIL−21の親和性と比較して低い親和性でカニクイザルIL−21Rのγ鎖に結合する。例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、カニクイザルIL−21Rのα鎖に対する野生型カニクイザルIL−21の親和性と比較して低い親和性でカニクイザルIL−21Rのγ鎖に結合する。

0066

本明細書で提供されるIL−21ムテインは、非共有結合的かつ可逆的にIL−21Rに結合する。例示的な実施形態において、IL−21Rに対するムテインの結合の強さは、その親和性、すなわち、ムテインの結合部位とIL−21Rとの間の相互作用の強さの尺度で表すことができる。例示的な態様において、本明細書で提供されるIL−21ムテインは、IL−21Rに対して高親和性を有し、したがって、低親和性のIL−21ムテインよりも短い時間でより多量のIL−21Rに結合する。例示的な態様において、本明細書で提供されるIL−21ムテインは、IL−21Rに対して低親和性を有し、したがって、高親和性IL−21ムテインよりも長い時間でより少量のIL−21Rに結合する。例示的な態様において、IL−21ムテインは、少なくとも105M−1、少なくとも106M−1、少なくとも107M−1、少なくとも108M−1、少なくとも109M−1、または少なくとも1010M−1である平衡結合定数KAを有する。当業者によって理解されるように、KAは、pH、温度及び緩衝液組成などの因子による影響を受け得る。

0067

例示的な実施形態において、IL−21Rに対するIL−21ムテインの結合の強さは、感度で表すことができる。KDは、IL−21ムテイン及びIL−21Rとの間のkoff/konの比である平衡解離定数である。KD及びKAは、逆の関係にある。KD値は、ムテインの濃度(特定の実験に必要とされるムテインの量)に関係することから、KD値が小さいほど(必要とされる濃度が低いほど)ムテインの親和性は高くなる。例示的な態様において、IL−21Rに対するIL−21ムテインの結合の強さは、KDで記述することができる。例示的な態様において、本明細書で提供されるIL−21ムテインのKDは、約10−1M、約10−2M、約10−3M、約10−4M、約10−5M、約10−6Mまたはそれ以下である。例示的な態様において、本明細書で提供されるIL−21ムテインのKDは、マイクロモルナノモルピコモルまたはフェムトモルである。例示的な態様において、本明細書で提供されるIL−21ムテインのKDは、約10−4〜10−6M、または10−7〜10−9M、または10−10〜10−12M、または10−13〜10−15Mの範囲内である。例示的な態様において、IL−21ムテインは、0.04nMよりも高いKD、または約0.04nMのKDで、ヒトIL−21Rに結合する。例示的な態様において、IL−21ムテインは、約0.01nM〜約20nM、0.02nM〜20nM、0.05nM〜20nM、0.05nM〜15nM、0.1nM〜15nM、0.1nM〜10nM、1nM〜10nM、または5nM〜10nMのKDでヒトIL−21Rに結合する。例示的な態様において、IL−21ムテインは、0.055nMよりも高いKD、または約0.055nMのKDで、カニクイザルIL−21Rに結合する。例示的な態様において、IL−21ムテインは、約0.01nM〜約20nM、0.02nM〜20nM、0.05nM〜20nM、0.05nM〜15nM、0.1nM〜15nM、0.1nM〜10nM、1nM〜10nM、または5nM〜10nMのKDでカニクイザルIL−21Rに結合する。

0068

例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、IL−21Rα鎖に対する結合親和性の低下を示す。例示的な態様において、IL−21ムテインは、IL−21Rα鎖に対する結合親和性が約2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975倍、1000倍またはそれ以上の低下を示すムテイン(例えば、シングルまたはダブル)である。例示的な態様において、IL−21ムテインは、IL−21Rα鎖に対する結合親和性の低下を示す、ダブルムテインである。

0069

例示的な態様において、上記のIL−21ムテイン(例えば、シングルまたはダブルムテイン)の結合親和性の低下は、IL−21Rα鎖に対する野生型ヒトIL−21の約0.025nMの親和性と比較して、IL−21Rα鎖に対する親和性の低下をもたらす。したがって、上に記載した2倍の親和性の低下は、IL−21Rα鎖に対するIL−21ムテインの親和性が約0.05nMになることとなる。そのため、例示的な実施形態において、IL−21ムテイン(例えば、シングルまたはダブル)は、IL−21Rα鎖に対して、約0.05、0.125、0.25、0.375、0.5、0.625、0.75、0.875、1.0、1.125、1.25、1.375、1.5、1.625、1.75、1.875、2.0、2.125、2.25、2.375、2.5、2.625、2.75、2.875、3.0、3.125、3.25、3.375、3.5、3.625、3.75、4.375、5、5.625、6.25、6.875、7.5、8.125、8.75、9.375、10.0、10.625、11.25、11.875、12.5、13.125、13.75、14.375、15.0、15.625、16.25、16.875、17.5、18.125、18.75、19.375、20.0、20.625、21.25、21.875、22.5、23.125、23.75、24.375、25nM、またはそれ以上の親和性を有する。例示的な態様において、IL−21ムテインは、IL−21Rα鎖に対する結合親和性の低下を示す、ダブルムテインである。

0070

例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、in vitro STAT3リン酸化アッセイによって測定したとき、活性の低下を示す。例示的な態様において、IL−21ムテインは、STAT3リン酸化アッセイによって測定したとき、約2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975倍、1000倍またはそれ以上の活性の低下を示すムテイン(例えば、シングルまたはダブル)である。例示的な態様において、IL−21ムテインは、STAT3リン酸化アッセイによって測定したとき、活性の低下を示す、ダブルムテインである。

0071

IL−21ムテインコンジュゲート
本開示はまた、異種部分に連結された本開示のIL−21ムテインのうちの1つ以上を含む、コンジュゲートを提供する。本明細書で使用されるとき、「異種部分」という用語は、「コンジュゲート部分」という用語と同義であり、本明細書に記載されるIL−21ムテインとは異なる任意の分子化学的もしくは生化学的、天然または非コード分子)を指す。本明細書に記載されるIL−21ムテインのいずれかに連結することができる例示的なコンジュゲート部分には、異種ペプチドもしくはポリペプチド(例えば、免疫グロブリンまたはその一部(例えば、可変領域、CDRまたはFc領域)を含む)、標的化因子診断標識(放射性同位体フルオロフォアまたは酵素標識など)、水溶性ポリマーを含むポリマー、または他の治療薬もしくは診断薬が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本開示のIL−21ムテインと、免疫グロブリンとを含むコンジュゲートが提供される。コンジュゲートは、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるIL−21ムテインのうちの1つ以上と、ペプチド(本明細書に記載されるIL−21ムテインとは別のもの)、ポリペプチド、核酸分子、抗体またはその断片、ポリマー、量子ドット、小分子、毒素、診断薬、炭水化物、アミノ酸のうちの1つ以上とを含む。

0072

例示的な実施形態において、本開示のコンジュゲートは、本明細書に記載されるIL−21ムテインと、ポリペプチド(例えば、本明細書に記載されるIL−21ムテインのいずれとも異なるポリペプチド)である異種部分とを含み、コンジュゲートは、融合ポリペプチドもしくは融合タンパク質またはキメラタンパク質もしくはキメラポリペプチドである。このようなコンジュゲートについての更なる記載は、「融合タンパク質」以下に本明細書で提供される。

0073

いくつかの実施形態において、異種部分は、非共有結合または共有結合を介して、本開示のIL−21ムテインに結合される。例示的な態様において、IL−21ムテインと異種部分との間の連結は、共有化学結合、例えば、ペプチド結合ジスルフィド結合などを介して、または物理的な力、静電気、水素イオンファンデルワールスもしくは疎水性もしくは親水性相互作用を介して、達成される。例えば、ビオチンアビジンリガンド/受容体、酵素基質、核酸/核酸結合タンパク質、脂質/脂質結合タンパク質細胞接着分子パートナー;または互いに親和性を有する任意の結合パートナーもしくはその断片を含む、様々な非共有結合型の結合系を使用することができる。

0074

IL−21ムテインは、例示的な実施形態において、IL−21ムテインの標的アミノ酸残基を、これらの標的アミノ酸のうちの選択された側鎖またはN末端もしくはC末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによる、直接的な共有結合を介して、コンジュゲート部分に連結される。IL−21ムテインまたはコンジュゲート部分上の反応性基には、例えば、アルデヒド基、アミノ基、エステル基チオール基、α−ハロアセチル基マレイミド基またはヒドラジノ基が挙げられる。誘導体化剤には、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介するコンジュゲート)、N−ヒドロキシスクシンイミドリシン残基を介する)、グルタルアルデヒド無水コハク酸または当該技術分野において知られている他の剤が挙げられる。あるいは、コンジュゲート部分は、多糖担体またはポリペプチド担体などの中間担体を介して間接的にIL−21ムテインに連結することができる。多糖担体の例には、アミノデキストランが挙げられる。好適なポリペプチド担体の例には、ポリリシンポリグルタミン酸ポリアスパラギン酸、これらのコポリマー、及びこれらのアミノ酸と他のアミノ酸(例えば、セリン)との混合ポリマーが挙げられ、得られる担持担体に望ましい溶解特性を与える。

0075

システイニル残基は、クロロ酢酸クロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート(及び対応するアミン)と最も一般的に反応して、カルボキシメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−(5−イミドイル)プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、N−アルキルマレイミド、3−ニトロ−2−ピリジルジスルフィド、メチル2−ピリジルジスルフィド、p−クロ安息香酸水銀、2−クロロ水銀−4−ニトロフェノール、またはクロロ−7−ニトロベンゾ−2−オキサ−1,3−ジアゾールとの反応により誘導体化される。

0076

ヒスチジル残基は、pH5.5〜7.0でジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化される。これは、この剤がヒスチジル側鎖に対して比較的に特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシブロミドもまた有用であり、この反応は、好ましくは、0.1Mカコジル酸ナトリウム中pH6.0で実施される。

0077

リシニル残基及びアミノ端末残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果がある。α−アミノ含有残基を誘導体化するのに好適な他の試薬には、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル、ピリドキサールリン酸ピリドキサール、クロロボロヒドリドトリニトロベンゼンスルホン酸、O−メチルイソ尿素、2,4−ペンタンジオン、及びグリオキシル酸とのアミノ基転移酵素触媒反応が挙げられる。

0078

アルギニル残基は、1つまたは複数の従来の試薬、とりわけ、フェニルグリオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のpKaが高いので、反応をアルカリ条件で実施する必要がある。更に、これらの試薬は、リシンの各基及びアルギニンのε−アミノ基と反応し得る。

0079

チロシル残基に対して特定の修飾を行ってもよく、特に興味深いものは、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、チロシル残基にスペクトル標識を導入することである。最も一般的には、O−アセチルチロシル種及び3−ニトロ誘導体を形成するために、N−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンがそれぞれ使用される。

0080

カルボキシル側基アスパルチルまたはグルタミル)は、カルボジイミド(R−N=C=N−R’)(式中、R及びR’は、異なるアルキル基、例えば、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニル−4−エチル)カルボジイミドまたは1−エチル−3−(4−アゾニア−4,4−ジメチルペンチル)カルボジイミドなど)との反応によって、選択的に修飾される。更に、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。

0081

他の修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化セリル残基もしくはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,pp.79−86(1983))、アスパラギンもしくはグルタミンの脱アミド化、N末端アミンのアセチル化、ならびに/またはC末端カルボン酸基のアミド化もしくはエステル化が挙げられる。

0082

共有結合修飾の別の種類は、グリコシドをIL−21ムテインに化学的または酵素的カップリングすることを伴う。糖(複数可)は、(a)アルギニン及びヒスチジン、(b)遊離カルボキシル基、(c)遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのものなど、(d)遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニンもしくはヒドロキシプロリンのものなど、(e)芳香族残基、例えば、チロシンもしくはトリプトファンのものなど、または(f)グルタミンのアミド基に結合され得る。これらの方法は、1987年9月11日に公開されたWO87/05330及びAplin and Wriston,CRCCrit.Rev.Biochem.,pp.259−306(1981)に記載されている。

0083

例示的な態様において、異種部分は、本開示のIL−21ムテインにリンカーを介して結合される。いくつかの態様において、リンカーは、1〜約60個、または1〜30個より長い原子、2〜5個の原子、2〜10個の原子、5〜10個の原子、または10〜20個の長さの原子の原子鎖を含む。いくつかの実施形態において、鎖原子は、全て炭素原子である。いくつかの実施形態において、リンカー主鎖中の鎖原子は、C、O、N及びSからなる群から選択される。鎖原子及びリンカーは、溶解性のより高いコンジュゲートをもたらすように、予想される溶解性(親水性)に従って選択することができる。いくつかの実施形態において、リンカーは、標的の組織または器官または細胞で認められる、酵素または他の触媒または加水分解条件による切断を受ける官能基を提供する。いくつかの実施形態において、リンカーの長さは、立体障害となる可能性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合またはペプチジル結合であり、コンジュゲートがポリペプチドである場合、そのコンジュゲート全体は、融合タンパク質であり得る。そのようなペプチジルリンカーは、任意の長さであってよい。例示的なペプチジルリンカーは、約1〜50アミノ酸長、5〜50、3〜5、5〜10、5〜15、または10〜30アミノ酸長であり、柔軟性または剛直性である。例示的な態様において、リンカーは、約2〜約20アミノ酸を含むペプチドである。例示的な態様において、リンカーは、約2〜約15アミノ酸、約2〜約10アミノ酸、または約2〜約5アミノ酸を含むペプチドである。好適なペプチドリンカーは、当該技術分野において知られている。例えば、Chen et al.,Adv Drug Delivery Reviews 65(10):1357−1369(2013);Arai et al.,Protein Eng Des Sel 14(8):529−532(2001);及びWriggers et al.,Curr Trendsin Peptide Science 80(6):736−746(2005)を参照されたい。例示的な態様において、リンカーは、アミノ酸配列GGGGS(配列番号262)を含むペプチドである。

0084

融合タンパク質
例示的な実施形態において、IL−21ムテインは、本明細書に記載されるIL−21ムテインのいずれとも異なるポリペプチドに連結され、コンジュゲートは、融合ポリペプチドもしくは融合タンパク質またはキメラタンパク質もしくはキメラポリペプチドである。したがって、本開示は、本開示のIL−21ムテインと、異種ポリペプチドまたはペプチドとを含む、融合ポリペプチドまたは融合タンパク質を提供する。例示的な態様において、本開示の融合タンパク質は、抗原結合タンパク質に連結された本開示のIL−21ムテインを含む。例示的な態様において、抗原結合タンパク質は、抗体もしくは免疫グロブリン、またはその抗原結合抗体断片、または抗体タンパク質生成物である。

0085

集合的に、抗体は、免疫グロブリンとして知られる血漿タンパク質ファミリーを形成し、免疫グロブリンドメインから構成される(Janeway et al.,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,4th ed.,Elsevier Science Ltd./Garland Publishing,1999。本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖を含み、かつ可変領域及び定常領域を含む、従来の免疫グロブリン型を有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、2つの同一のポリペプチド鎖の対である「Y型」構造であり、各対が1つの「軽鎖」(典型的に約25kDaの分子量を有する)と、1つの「重鎖」(典型的に約50〜70kDaaの分子量を有する)とを有する、IgGであってよい。抗体は、可変領域及び定常領域を有する。IgG型において、可変領域は、一般に、約100〜110またはそれ以上のアミノ酸であり、3つの相補性決定領域(CDR)を含み、抗原認識を主に担い、異なる抗原に結合する他の抗体とは実質的に異なっている。定常領域は、抗体が免疫系の細胞及び分子を動員するのを可能にする。可変領域は、軽鎖及び重鎖のそれぞれのN末端領域からなり、定常領域は、重鎖及び軽鎖のそれぞれのC末端部分からなる(Janeway et al.,“Structure of the Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes”,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,4th ed.Elsevier Science Ltd./Garland Publishing,(1999))。

0086

抗体のCDRの一般構造及び性質は、当該技術分野において記載されている。簡潔に述べれば、抗体足場中、CDRは、重鎖及び軽鎖可変領域フレームワーク内に埋め込まれ、抗原結合及び抗原認識を主に担う領域を構成する。可変領域は、典型的に、フレームワーク領域内に少なくとも3つの重鎖または軽鎖CDRを含む(Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,Md.、また、Chothia and Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901−917;Chothia et al.,1989,Nature 342:877−883も参照のこと)(フレームワーク領域は、Kabat et al.,1991によりフレームワーク領域1〜4、FR1、FR2、FR及びFR4と命名されている;上掲のChothia and Lesk,1987も参照のこと)。

0087

抗体は、当該技術分野において知られる任意の定常領域を含み得る。ヒト軽鎖は、κ軽鎖及びλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεに分類され、それぞれ、IgMIgD、IgG、IgA及びIgEという抗体アイソタイプを定義する。IgGは、限定するものではないが、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含む複数のサブクラスを有する。IgMは、限定するものではないが、IgM1及びIgM2を含むサブクラスを有する。本開示の実施形態は、抗体のそのようなクラスまたはアイソタイプを全て含む。軽鎖定常領域は、例えば、κ型またはλ型の軽鎖定常領域、例えば、ヒトκ型またはλ型の軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、α型、δ型、ε型、γ型またはμ型の重鎖定常領域、例えば、ヒトα型、δ型、ε型、γ型またはμ型の重鎖定常領域であり得る。したがって、例示的な実施形態において、抗体は、アイソタイプIgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMの抗体であり、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のいずれか1つを含む。

0088

抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態において、抗体は、哺乳動物、例えば、マウス、ウサギヤギウマニワトリハムスター、ヒトなどによって産生される天然抗体に実質的に類似する配列を含む。この点に関して、抗体は、哺乳動物抗体、例えば、マウス抗体ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ヒト抗体などとみなすことができる。ある特定の態様において、抗体は、ヒト抗体である。ある特定の態様において、抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。「キメラ抗体」という用語は、2つ以上の異なる抗体に由来するドメインを含有する抗体を指す。キメラ抗体は、例えば、1つの種に由来する定常ドメインと、第2の種に由来する可変ドメインとを含有することができ、あるいは、より一般的には、少なくとも2つの種に由来するアミノ酸配列のストレッチを含有することができる。キメラ抗体はまた、同じ種内の2つ以上の異なる抗体のドメインを含有することができる。「ヒト化」という用語は、抗体に関して使用される場合、元の供給源の抗体よりも本物のヒト抗体に類似した構造及び免疫機能を有するように操作された、非ヒト供給源に由来するCDR領域を少なくとも有する抗体を指す。例えば、ヒト化は、マウス抗体などの非ヒト抗体に由来するCDRをヒト抗体にグラフト化することを伴い得る。ヒト化はまた、非ヒト配列がヒト配列により類似するようにアミノ酸置換を選択することを伴い得る。

0089

抗体は、例えば、パパイン及びペプシンなどの酵素によって断片に切断することができる。パパインは、2つのFab断片及び1つのFc断片を与えるように抗体を切断する。ペプシンは、F(ab’)2断片及びpFc’断片を与えるように抗体を切断する。本開示の例示的な態様において、本開示の融合タンパク質は、抗原結合抗体断片を含む。本明細書で使用されるとき、「抗原結合抗体断片」という用語は、抗体の抗原に結合することができる抗体分子の一部を指し、「抗原結合断片」または「抗原結合部分」としても知られる。例示的な場合において、抗原結合抗体断片は、Fab断片またはF(ab’)2断片である。

0090

抗体の構造は、少なくとも約12〜150kDaの分子量範囲に及び、単量体(n=1)から二量体(n=2)、三量体(n=3)、四量体(n=4)まで、また場合によっては更に高次の価数(n)範囲を有する、広範な代替形態創出するために利用されており、このような代替形態は、本明細書中、「抗体タンパク質生成物」と呼ばれる。抗体タンパク質生成物には、完全な抗体構造をベースにするもの、及び完全な抗原結合能力を保持する抗体断片模倣するもの、例えば、scFv、Fab及びVHH/VH(後述)が挙げられる。完全な抗原結合部位を保持する最小の抗原結合抗体断片は、可変(V)領域から完全になるFv断片である。分子を安定化させるには、柔軟性のある可溶性アミノ酸ペプチドリンカーを使用して各V領域を接続してscFv(一本鎖可変部)にするか、定常(C)ドメインをV領域に付加してFab断片[抗原結合断片]を生成する。scFv断片とFab断片はいずれも、宿主細胞、例えば、原核生物の宿主細胞で容易に産生することができる。他の抗体タンパク質生成物には、ジスルフィド結合により安定化されたscFv(ds−scFv)、一本鎖Fab(scFab)、ならびにダイアボディトリアディ及びテトラボディのような二量体及び多量体抗体の形態、またはオリゴマー形成ドメインに連結されたscFvからなる異なる形態を含むミニボディ(miniAb)が挙げられる。最小断片は、ラクダ化重鎖AbのVHH/VH及び単一ドメインAb(sdAb)である。新規抗体フォーマットを創出するために最も頻繁に使用される構成単位は、一本鎖可変(V)ドメイン抗体断片(scFv)であり、この断片は、約15アミノ酸残基のペプチドリンカーによって連結された、重鎖及び軽鎖に由来するVドメイン(VH及びVLドメイン)を含む。ペプチボディまたはペプチドFc融合体は、更に、別の抗体タンパク質生成物である。ペプチボディの構造は、Fcドメインにグラフト化された生物学的に活性なペプチドから構成される。ペプチボディは、当該技術分野において十分に記載されている。例えば、Shimamoto et al.,mAbs 4(5):586−591(2012)を参照されたい。

0091

他の抗体タンパク質生成物には、一本鎖抗体SCA)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性抗体または三重特異性抗体などが含まれる。二重特異性抗体は、5つの主要なクラス、すなわちBsIgG、付加IgG、BsAb断片、二重特異性融合タンパク質及びBsAbコンジュゲートに分けることができる。例えば、Spiess et al.,Molecular Immunology 67(2)Part A:97−106(2015)を参照されたい。

0092

例示的な態様において、本開示の融合タンパク質は、これらの抗体タンパク質生成物のいずれか1つを含む。例示的な態様において、本開示の融合タンパク質は、scFv、FabVHH/VH、Fv断片、ds−scFv、scFab、二量体抗体、多量体抗体(例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ)、miniAb、ペプチボディラクダ化重鎖抗体のVHH/VH、sdAb、ダイアボディ;トリアボディ;テトラボディ;二重特異性抗体または三重特異性抗体、BsIgG、付加IgG、BsAb断片、二重特異性融合タンパク質及びBsAbコンジュゲートのいずれか1つを含む。

0093

例示的な場合において、本開示の融合タンパク質は、単量体、または高分子体オリゴマー体もしくは多量体である抗体タンパク質生成物を含む。抗体が2つ以上の異なる抗原結合領域断片を含むある特定の実施形態において、抗体は、抗体によって認識され、結合される別個のエピトープの数に応じて、二重特異性、三重特異性もしくは多重特異性、または二価三価もしくは多価とみなされる。

0094

例示的な実施形態において、抗体、抗原結合抗体断片または抗体タンパク質生成物は、腫瘍抗原に結合する。例示的な態様において、腫瘍抗原は、ウイルスタンパク質に由来する抗原、点変異に由来する抗原、またはがん生殖細胞遺伝子によってコードされる抗原である。例示的な態様において、腫瘍抗原は、p53、KRAS、NRAS、MAGEA、MAGEB、MAGEC、BAGE、GAGE、LAGE/NY−ESO1、SSX、チロシナーゼ、gp100/pmel17、Melan−A/MART−1、gp75/TRP1、TRP2、CEA、RAGE−1、HER2/NEU、WT1である。例示的な態様において、本開示の融合タンパク質の抗体、抗原結合抗体断片または抗体タンパク質生成物は、本明細書に記載される免疫療法薬に結合するか、免疫療法薬である。例示的な態様において、本開示の融合タンパク質の抗体、抗原結合抗体断片または抗体タンパク質生成物は、本明細書に記載されるサイトカイン、リンフォカイン、成長因子または造血因子に結合する。

0095

例示的な実施形態において、本開示の融合タンパク質は、サイトカイン(例えば、本明細書に記載されるIL−21ムテイン)と、免疫チェックポイント経路のタンパク質、腫瘍抗原、サイトカイン、リンフォカイン、成長因子または他の造血因子(限定するものではないが、本明細書に記載されるもののいずれかが挙げられる)に結合する抗体、その抗原結合抗体断片または抗体タンパク質生成物とを含む。例示的な実施形態において、本開示の融合タンパク質は、サイトカイン(例えば、本明細書に記載されるIL−21ムテイン)と、CTLA−4、PD−1、PD−L1、PD−L2、B7−H3、B7−H4、CEACAM−1、TIGIT、LAG3、CD112、CD112R、CD96、TIM3、BTLAまたは共刺激受容体:ICOS、OX40、41BB、CD27、GITRからなる群から選択される免疫チェックポイント経路のタンパク質に結合する抗体、その抗原結合抗体断片または抗体タンパク質生成物とを含む。

0096

他の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、サイトカインと、免疫チェックポイント経路のタンパク質に結合する抗体(または抗原結合抗体その断片)とを含む。好適なサイトカインには、例えば、TH−1型応答を高めるサイトカイン;及びSTAT1、3、4または5を活性化するサイトカインが挙げられる。いくつかの実施形態において、サイトカインは、インターロイキンである。他の実施形態において、サイトカインは、例えば、IL−2、IL−7、IL−10、IL−12、IL−15またはIL−21などのT細胞の活性を高めるインターロイキンである。そのようなサイトカインは、修飾され(例えば、変異により)、対応する受容体に対する親和性を弱めることができる。そのようなムテインは、オフターゲット及び不要な相互作用を低減させることによって、安全性プロファイルの改善を示し得る。したがって、サイトカインを修飾することで、IL−2、IL−7、IL−10、IL−12、IL−15またはIL−21ムテインを生成することができる。特定の実施形態において、サイトカインは、本明細書に記載されるIL−21ムテインである。免疫チェックポイント経路のタンパク質に結合する好適な抗体(またはその抗原結合抗体断片)には、例えば、CTLA−4、PD−1、PD−L1、PD−L2、B7−H3、B7−H4、TIGIT、LAG3、CD112、TIM3、BTLAまたは共刺激受容体:ICOS、OX40、41BBもしくはGITRに結合するものが挙げられる。特定の実施形態において、抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、PD−1(例えば、ヒトPD−1)に結合する。

0097

他の実施形態において、本開示の融合タンパク質は、サイトカインと、抗体(またはその抗原結合抗体断片)と、少なくとも1つの追加の標的化部分とを含む、多重特異性融合タンパク質である。例えば、本開示の融合タンパク質は、サイトカインと、抗体(またはその抗原結合抗体断片)と、1つの追加の標的化部分とを含む、三重特異性融合タンパク質であり得る。

0098

例示的な実施形態において、本開示の融合タンパク質は、本明細書に記載されるIL−21ムテインと、PD−1結合アンタゴニストとを含む。「PD−1結合アンタゴニスト」という用語は、PD−1と、その結合パートナー(PD−L1、PD−L2など)のうちの1つ以上との相互作用から生じるシグナル伝達を減少、遮断、阻害、無効または妨害する分子を指す。いくつかの実施形態において、PD−1結合アンタゴニストは、PD−1のその結合パートナーのうちの1つ以上への結合を阻害する分子である。具体的な態様において、PD−1結合アンタゴニストは、PD−1がPD−L1及び/またはPD−L2に結合するのを阻害する。例えば、PD−1結合アンタゴニストには、PD−1と、PD−L1及び/またはPD−L2との相互作用から生じるシグナル伝達を減少、遮断、阻害、無効または妨害する、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド及び他の分子が挙げられる。一実施形態において、PD−1結合アンタゴニストは、PD−1を介したシグナル伝達により媒介される、Tリンパ球上に発現された細胞表面タンパク質によって、または当該タンパク質を介して媒介される、負の共刺激シグナルを低減させるものであり、これにより、正常に機能していないT細胞の機能障害を小さくする(例えば、抗原認識に対するエフェクター反応を高める)。いくつかの実施形態において、PD−1結合アンタゴニストは、抗PD−1抗体である。抗PD−1抗体の例には、ニボルマブ(BMS−936558)、ペンブロリズマブ(MK−3475)、BMS936558、BMS−936559、TSR−042(Tesaro)、ePDR001(Novartis)及びピジリズマブ(CT−011)が挙げられる。PD−1結合アンタゴニストの更なる具体例は、以下に記載される。

0099

例示的な実施形態において、PD−1結合アンタゴニストは、PD−1に結合する抗原結合タンパク質を含むか、当該タンパク質から実質的になるか、当該タンパク質からなる。例示的な態様において、抗原結合タンパク質は、PD−1に結合する、抗体、その抗原結合抗体断片または抗体タンパク質生成物である。

0100

例示的な態様において、本開示の融合タンパク質は、本明細書に記載されるIL−21ムテインと、抗PD−1抗体(本明細書に記載されるもの)、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物とを含む。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、モノクローナルIgGである。例示的な場合において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、一価または二価である。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、配列番号263のアミノ酸配列を有するヒトPD−1に結合する。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、配列番号264のアミノ酸配列を有するカニクイザルPD−1に結合する。例示的な場合において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、ヒトPD−1とカニクイザルPD−1の両方に結合する。例示的な場合において、本開示の融合タンパク質は、IL−21ムテイン(本明細書に記載されるもの)と、抗PD−1抗体(本明細書に記載されるもの)とを含む。

0101

例示的な実施形態において、PD−1に対する抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物の結合の強さは、KDで記述することができる。例示的な態様において、本明細書で提供される抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物のKDは、約10−1M、約10−2M、約10−3M、約10−4M、約10−5M、約10−6M、約10−7M、約10−8M、約10−9Mまたはそれ以下である。例示的な態様において、本明細書で提供される抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物のKDは、マイクロモル、ナノモル、ピコモルまたはフェムトモルである。例示的な態様において、本明細書で提供される抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物のKDは、約10−4〜10−6M、または10−7〜10−9M、または10−10〜10−12M、または10−13〜10−15Mの範囲内である。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、ヒトPD−1、カニクイザルPD−1またはその両方に対して、高い親和性を有する。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、ヒトPD−1に対して、100pM未満、任意選択により約1pM〜約50pMのKDを有する。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、ヒトPD−1に対して、約1pM〜約20pM以内、または約10pM未満のKDを有する。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、カニクイザルPD−1に対して、100pM未満、任意選択により約1pM〜約75pMのKDを有する。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、カニクイザルPD−1に対して、約1pM〜約20pM以内、または10pM未満のKDを有する。

0102

例示的な場合において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、PD−1と、その結合パートナー(PD−L1、PD−L2など)のうちの1つ以上との相互作用から生じるシグナル伝達を減少、遮断、阻害、無効または妨害するPD−1結合アンタゴニストである。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、PD−1がそのリガンドPD−L1またはPD−L2に結合するのを遮断する。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、PD−1とPD−L1またはPD−L2との間の結合相互作用の少なくとも50%を阻害する。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、PD−1とPD−L1またはPD−L2との間の結合相互作用の少なくとも約50%、少なくとも約60%、または少なくとも約70%の阻害を示す。

0103

例示的な場合において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、混合リンパ球反応(MLR)において、T細胞によるPD−1を介したIL−2産生を阻害する。例示的な態様において、MLRにおける抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物のIC50は、約0.1nM〜約5nM以内である。例示的な態様において、MLRにおける抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物のIC50は、2nM未満または1nM未満である。例示的な態様において、MLRにおける抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物のIC50は、約0.5nM〜約2nMである。

0104

例示的な場合において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)配列番号312、322、332、342、352、362、372及び382からなる群から選択される重鎖(HC)相補性決定領域(CDR)1アミノ酸配列(表D参照)、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(b)配列番号313、323、333、343、353、363、373及び383からなる群から選択されるHC CDR2アミノ酸配列(表D参照)、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(c)配列番号314、324、334、344、3545、364、374及び384からなる群から選択されるHC CDR3アミノ酸配列(表D参照)、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(d)315、325、335、345、355、365、375及び385からなる群から選択される軽鎖(LC)CDR1アミノ酸配列(表D参照)、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(e)316、326、336、346、356、366、376及び386からなる群から選択されるLC CDR2アミノ酸配列(表D参照)、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(f)317、327、337、347、357、367、377及び387からなる群から選択されるLC CDR3アミノ酸配列(表D参照)、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(g)(a)〜(f)のいずれか2つ、3つ、4つ、5つまたは6つの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体タンパク質生成物は、そのようなCDRを含む。



番号は、関係する配列番号を表す。

0105

例示的な態様において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、表Dに記載されるLCCDR1アミノ酸配列、LC CDR2アミノ酸配列及びLC CDR3アミノ酸配列と、表Dに記載されるHCCDRアミノ酸配列のうちの少なくとも1つまたは2つとを含む。例示的な態様において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、表Dに記載されるHC CDR1アミノ酸配列、HC CDR2アミノ酸配列及びHC CDR3アミノ酸配列と、表Dに記載されるLC CDRアミノ酸配列のうちの少なくとも1つまたは2つとを含む。いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体タンパク質生成物は、そのようなCDRを含む。

0106

例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、表Dの1つの縦列中に配列番号で指定されるアミノ酸配列のうちの3つ、4つ、5つまたは6つ全てを含む。例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、表Dの1つの縦列中に配列番号で指定されるLCCDRアミノ酸配列のそれぞれと、表Dの同じ1つの縦列中または別の縦列中に配列番号で指定されるHC CDRアミノ酸配列のうちの少なくとも1つまたは2つとを含む。例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、表Dの1つの縦列中に配列番号で指定されるHC CDRアミノ酸配列のそれぞれと、表Dの同じ1つの縦列中または別の縦列中に配列番号で指定されるLC CDRアミノ酸配列のうちの少なくとも1つまたは2つとを含む。例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)配列番号312〜317、(b)配列番号322〜327、(c)配列番号332〜337、(d)配列番号342〜347、(e)配列番号352〜357、(f)配列番号362〜367、(g)配列番号372〜377、及び(h)配列番号382〜387からなる群から選択される6つのCDRアミノ酸配列を含む。具体的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、表D中の20A2、20C1、22D4、20C1.006、20C1.009、20A2.003、22D4.006または22D4.017抗体のいずれか1つのCDRアミノ酸配列のうちの6つ全てを含む。いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体タンパク質生成物は、そのようなCDRを含む。

0107

例示的な場合において、表Dのアミノ酸配列は、少なくとも1つまたはそれ以上(例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上)の介在アミノ酸(複数可)によって隔てられる。例示的な場合において、LCCDR1とLC CDR2の配列間に約10〜約20アミノ酸があり、LC CDR2とLC CDR3の配列間に約25〜約40アミノ酸がある。例示的な場合において、LC CDR1とLC CDR2の配列間に約14〜約16アミノ酸があり、LC CDR2とLC CDR3の配列間に約30〜約35アミノ酸がある。例示的な場合において、HC CDR1とHC CDR2の配列間に約10〜約20アミノ酸があり、HC CDR2とHC CDR3の配列間に約25〜約40アミノ酸がある。例示的な場合において、HC CDR1とHC CDR2の配列間に約14〜約16アミノ酸があり、HC CDR2とHC CDR3の配列間に約30〜約35アミノ酸がある。

0108

例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)318、328、338、348、358、368、378及び388からなる群から選択される重鎖可変領域アミノ酸配列(表E参照)、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(b)319、329、339、349、359、369、379及び389からなる群から選択される軽鎖可変領域アミノ酸配列(表E参照)、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(c)(a)と(b)の両方を含む。いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体タンパク質生成物は、そのような可変領域を含む。



番号は、関係する配列番号を表す。

0109

例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)配列番号318と319、(b)配列番号328と329、(c)配列番号338と339、(d)配列番号348と349、(e)配列番号358と359、(f)配列番号368と369、(g)配列番号378と379、及び(h)配列番号388と389からなる群から選択されるアミノ酸配列対を含む。

0110

例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)320、330、340、350、360、370、380、及び390からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列(表E参照)、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(b)321、331、341、351、361、371、381及び391からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列(表E参照)、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(c)(a)と(b)の両方を含む。いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体タンパク質生成物は、そのような可変領域を含む。

0111

例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)配列番号320と321、(b)配列番号330と331、(c)配列番号340と341、(d)配列番号350と351、(e)配列番号360と361、(f)配列番号370と371、(g)配列番号380と381、及び(h)配列番号390と391からなる群から選択されるアミノ酸配列対を含む。いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体タンパク質生成物は、そのような領域を含む。

0112

例示的な態様において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)重鎖アミノ酸配列は、本明細書に記載される電荷対変異セットを含む。特定の態様において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)重鎖アミノ酸配列は、V1、V103及びV131の電荷対変異から選択される電荷対変異を含む。

0113

例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、上述のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を含むが、その抗原結合タンパク質は、その生物学的機能、例えば、PD−1(例えば、ヒトPD−1、カニクイザルPD−1)に結合する能力、またはPD−1と、その結合パートナー(PD−L1またはPD−L2など)のうちの1つ以上との相互作用から生じるシグナル伝達を減少、遮断、阻害、無効もしくは妨害する能力を実質的に保持している。

0114

例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、上記のアミノ酸配列(複数可)と比較して、1、2、3、4、5、6アミノ酸のみまたはそれ以上異なるアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、参照配列のバリアント配列を含み、バリアント配列は、参照配列と比較して、1または2アミノ酸のみ異なる。例示的な態様において、抗原結合タンパク質は、CDR以外に存在する1つ以上のアミノ酸置換を含み、例えば、1つ以上のアミノ酸置換は、重鎖または軽鎖のフレームワーク領域(複数可)内に存在する。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、1つ以上のアミノ酸置換を含むが、その抗原結合タンパク質は、6つのCDRのアミノ酸配列を保持している。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、上述のアミノ酸配列(複数可)と比較して、1、2、3、4、5、6つのみまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。

0115

例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、上述のアミノ酸配列(複数可)に対して、30%超もしくは約30%、50%超もしくは約50%、または70%超もしくは約70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、抗原結合タンパク質は、上述のアミノ酸配列に対して、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%の配列同一性を有するか、90%を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、抗原結合タンパク質は、上述のアミノ酸配列の完全長に沿って、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%の配列同一性を有するか、90%を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、抗原結合タンパク質は、上述のアミノ酸配列の完全長に沿って、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0116

例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、参照配列のバリアント配列を含み、バリアント配列は、上述の配列と比較して、少なくとも70%または約70%の配列同一性を有する。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、参照配列のバリアント配列を含み、バリアント配列は、上述の配列と比較して、少なくとも80%または約80%の配列同一性を有する。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、参照配列のバリアント配列を含み、バリアント配列は、上述の配列と比較して、少なくとも90%または約90%の配列同一性を有する。例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、参照配列のバリアント配列を含み、バリアント配列は、上述の配列と比較して、少なくとも95%または約95%の配列同一性を有する。

0117

例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、表Dの1つの縦列中の配列番号のうちの1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの配列と、配列番号312〜387のいずれに対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有する少なくとも1つのバリアント配列とを含む。例示的な実施形態において、抗PD〜1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)配列番号312〜317、(b)配列番号322〜327、(c)配列番号332〜337、(d)配列番号342〜347、(e)配列番号352〜357、(f)配列番号362〜367、(g)配列番号372〜377、及び(h)配列番号382〜387から選択される一連の配列のうちの1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの配列を含み、抗体またはその断片は、一連の配列のうちの少なくとも1つに対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有する、少なくとも1つのバリアント配列を更に含む。例えば、例示的な態様において、抗PD〜1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、配列番号312〜317のうちの4つの配列、すなわち、配列番号312〜315を含み、抗体またはその断片は、2つのバリアント配列、すなわち配列番号316に対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%)の配列同一性を有する1つのバリアント配列と、配列番号317に対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有するもう1つのバリアント配列とを含む。いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体タンパク質生成物は、そのような領域を含む。

0118

例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)生成物は、配列番号318、319、328、329、338、339、348、349、358、359、368、369、378、379、388及び389のいずれかに対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有するバリアント配列対を含む。例示的な場合において、抗体またはその断片は、(a)配列番号318と319、(b)配列番号328と329、(c)配列番号338と339、(d)配列番号348と349、(e)配列番号358と359、(f)配列番号368と369、(g)配列番号378と379、及び(h)配列番号388と389に対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有するバリアント配列対を含む。例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、表Eのうちの1つの配列と、配列番号318、319、328、329、338、339、348、349、358、359、368、369、378、379、388及び389のいずれかに対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有するバリアント配列であるもう1つの配列との配列対を含む。例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)配列番号318と319、(b)配列番号328と329、(c)配列番号338と339、(d)配列番号348と349、(e)配列番号358と359、(f)配列番号368と369、(g)配列番号378と379、及び(h)配列番号388と389から選択される1つの配列と、(a)〜(u)の1つの配列に対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有するバリアント配列であるもう1つの配列との配列対を含む。例えば、例示的な態様において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、配列番号318の配列を含み、更に、配列番号319に対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有するバリアント配列を含む。いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体タンパク質生成物は、そのような領域を含む。

0119

例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、配列番号320、321、330、331、340、341、350、351、360、361、370、371、380、381、390及び391のいずれかに対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有するバリアント配列対を含む。例示的な場合において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)配列番号320と321、(b)配列番号330と331、(c)配列番号340と341、(d)配列番号350と351、(e)配列番号360と361、(f)配列番号370と371、(g)配列番号380と381、及び(h)配列番号390と391に対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有するバリアント配列対を含む。例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、表Eのうちの1つの配列と、配列番号320、321、330、331、340、341、350、351、360、361、370、371、380、381、390及び391のいずれかに対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有するバリアント配列であるもう1つの配列との配列対を含む。例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)配列番号320と321、(b)配列番号330と331、(c)配列番号340と341、(d)配列番号350と351、(e)配列番号360と361、(f)配列番号370と371、(g)配列番号380と381、及び(h)配列番号390と391から選択される1つの配列と、(a)〜(u)の1つの配列に対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有するバリアント配列であるもう1つの配列との配列対を含む。例えば、例示的な態様において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、配列番号320の配列を含み、更に、配列番号321に対して、少なくとも70%または約70%(例えば、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%)の配列同一性を有するバリアント配列を含む。いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体タンパク質生成物は、そのような領域を含む。

0120

追加の例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、天然の同等物と比較して、半減期/安定性を向上させるか、抗体の発現/製造性をより適切なものにするため(例えば、IL−21ムテインを含む融合タンパク質として)の、1つ以上のアミノ酸修飾を含む。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、抗PD−1抗体とFc受容体との間の相互作用を妨害または低減させるように設計される。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、定常領域を含むが、Fcγ受容体と相互作用する能力に欠く、エフェクター機能不含安定(SEFL)抗体である。SEFL抗体は、当該技術分野において知られている。例えば、Liu et al.,J Biol Chem 292:1876−1883(2016);及びJacobsen et al.,J.Biol.Chem.292:1865−1875(2017)を参照されたい。例示的な態様において、SEFL抗体は、次の変異のうちの1つ以上を含む(EUシステムに従ったナンバリング):L242C、A287C、R292C、N297G、V302C、L306C及び/またはK334C。例示的な態様において、SEFL抗体は、N297Gを含む。例示的な態様において、SEFL抗体は、A287C、N297G及びL306Cを含む。他の例示的な態様において、SEFL抗体は、R292C、N297G及びV302C(すなわち、SEFL2−2)を含む。

0121

抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、他の半減期延長(HLE)修飾を含み得る。例示的な場合において、HLE修飾は、重鎖定常領域内に存在し、次の変異のうちの1つ以上を含む(EUシステムに従ったナンバリング):M252Y、S254T及びT256E。例示的な場合において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、M252Y、S254T及びT256Eのうちの1つまたは2つを含む。例示的な場合において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、M252Y、S254T及びT256Eのうちの3つ全てを含む。例示的な態様において、重鎖定常領域は、配列番号545もしくは配列番号547もしくは配列番号549のアミノ酸配列、または配列番号545もしくは配列番号547もしくは配列番号549に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な場合において、HLE修飾は、重鎖定常領域内に存在し、次の変異のうちの1つ以上を含む(EUシステムに従ったナンバリング):L309D、Q311H及びN434S。例示的な場合において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、L309D、Q311H及びN434Sのうちの1つ、2つまたは3つ全てを含む。例示的な場合において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、L309D、Q311H及びN434Sのうちの3つ全てを含む。例示的な態様において、重鎖定常領域は、配列番号544もしくは配列番号546もしくは配列番号548のアミノ酸配列、または配列番号544もしくは配列番号546もしくは配列番号548に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0122

例示的な態様において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、SEFL2−2修飾及びHLE修飾を含む。いくつかの場合において、HLE修飾は、M252Y、S254T及びT256Eのうちの1つまたは2つまたは3つ全てを含む。例示的な態様において、重鎖定常領域は、配列番号551もしくは配列番号553もしくは配列番号555のアミノ酸配列、または配列番号551もしくは配列番号553もしくは配列番号555に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合において、HLE修飾は、L309D、Q311H及びN434Sのうちの1つまたは2つまたは3つ全てを含む。例示的な態様において、重鎖定常領域は、配列番号550もしくは配列番号552もしくは配列番号554のアミノ酸配列、または配列番号550もしくは配列番号552もしくは配列番号554に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、重鎖は、以下に記載される電荷対変異を追加で含む。

0123

真核細胞では、(1)グリカン認識配列Asn−X−Thr/Ser(配列中、「X」は、プロリンを除く任意のアミノ酸)のアスパラギンに結合する、N−結合グリコシル化と、(2)グリカンがセリンまたはトレオニンに結合する、O−結合グリコシル化の2つの種類のグリコシル化反応が生じる。N−結合グリコシル化は、小胞体ER)で開始し、ERにおける一連の複雑な反応により、2つのGlcNAc残基及び3つのMan残基から本質的になるコアグリカン構造が結合される。ERで形成されるグリカン複合体は、ゴルジ体において、酵素作用によって修飾される。糖が酵素に比較的接近できない場合、その糖は、典型的に、元のHM型のままである。酵素が糖に接近できる場合には、Man残基の多くが切断され、糖が更に修飾されて、複合型N−グリカン構造が生じる。例えば、シスゴルジ体に位置するマンノシダーゼ−1は、HMグリカンを切断または加水分解できるのに対し、中間ゴルジ体に位置するフコシルトランスフェラーゼUT−8は、グリカンをフコシル化する(Hanrue Imai− Nishiya(2007),BMCBiotechnology,7:84)。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、N−グリコシル化され、例えば、重鎖の特定のアミノ酸に共有結合された1つ以上の糖部分(例えば、グリカン、糖)を含む。代替的態様において、抗PD−1抗体は、グリコシル化されないか、重鎖の特定のアミノ酸に共有結合された任意の糖部分(例えば、グリカン、糖)を含まない。

0124

例示的な態様において、抗PD−1抗体は、配列番号284のアミノ酸配列、または配列番号284に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域を含む。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、配列番号284のアミノ酸配列、または配列番号284に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域を含み、更にリンカーを含む。例示的な場合において、リンカーは、配列番号262のアミノ酸配列を含む。したがって、いくつかの例示的な態様において、抗PD−1抗体は、配列番号287の重鎖定常領域アミノ酸配列、または配列番号287に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、配列番号284のアミノ酸配列、または配列番号284に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域を含み、C末端Lysは、クリッピングまたは除去される。この点に関して、いくつかの態様において、抗PD−1抗体は、C末端Lysを欠く重鎖定常領域を含み、配列番号285のアミノ酸配列、または配列番号285に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一般に、抗体のC末端リシンは、発現中、カルボキシペプチダーゼによる切断を受ける。C末端Lysを欠く重鎖定常領域は、有利には、抗PD−1抗体の重鎖にカルボキシペプチダーゼが作用するのを防ぐ。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、C末端Lysを欠く重鎖定常領域を含み、更にリンカーを含む。例示的な場合において、リンカーは、配列番号262のアミノ酸配列を含む。したがって、いくつかの例示的な態様において、抗PD−1抗体は、配列番号286の重鎖定常領域アミノ酸配列、または配列番号286に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、配列番号284のアミノ酸配列、または配列番号284に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、重鎖定常領域を含み、抗PD−1抗体とFc受容体と間の相互作用を妨害または低減させる1つ以上のSEFL変異を含み、この変異には、L242C、A287C、R292C、N297G、V302C、L306C及び/またはK334Cが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な態様において、SEFL変異は、SEFL2−2変異:R292C、N297G及びV302Cであり、したがって、抗PD−1抗体は、配列番号265の重鎖定常領域アミノ酸配列、または配列番号265に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、SEFL2−2変異を有し、C末端Lysがクリッピングまたは除去された重鎖定常領域を含む。そのような重鎖定常領域は、配列番号266の配列を含み得る。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、SEFL2−2変異を有し、C末端Lysがクリッピングまたは除去され、リンカーを含む重鎖定常領域を含む。そのような重鎖定常領域は、配列番号267の配列を含み得る。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、SEFL2−2変異及びリンカーを有し、C末端Lysがクリッピングされていない重鎖定常領域を含む。そのような重鎖定常領域は、配列番号282の配列を含み得る。

0125

例示的な態様において、IL−21ムテインは、抗PD−1抗体のFcに結合される。例示的な態様において、IL−21ムテインは、抗体の2つの重鎖のうちの一方に結合される。例示的な態様において、IL−21ムテインは、抗体の2つの重鎖のうちの一方のC末端に結合される。

0126

例示的な態様において、融合タンパク質は、IL−21ムテインを1つしか含まない(すなわち、融合タンパク質は、IL−21ムテイン単量体を含む)。例示的な態様において、IL−21ムテインは、抗体の2つの重鎖のうちの一方のC末端に結合される。例示的な態様において、融合タンパク質がIL−21ムテインを1つのみ含む場合、抗体のFcは、2つの重鎖(IL−21ムテインに融合された1つの重鎖と、IL−21ムテインを欠く1つの重鎖)のヘテロ二量体化をもたらすように設計された修飾を含む。そのような修飾には、ノブ・イントゥホール、DuoBody、Azymetric、電荷対、HA−TF、SEEDbody、及び異なるプロテインA親和性を有する修飾などのFc変異が挙げられる。例えば、Spiess et al.,Molecular Immunology,67(2,Part A),2015,pp.95−106を参照されたい。ノブ・イントゥ・ホール変異は、第1の重鎖中のT366Wと、第2の重鎖中のT366S、L368A及び/またはY407Vとを含む。例えば、Ridgway et al.,Protein Eng.,9(1996),pp.617−621;及びAtwell et al.,J.Mol.Biol.,270(1997),pp.26−35を参照されたい。DuoBody変異は、第1の重鎖中のF405Lと、第2の重鎖中のK409Rとを含む。例えば、Labrijn et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,110(2013),pp.5145−5150を参照されたい。Azymetric変異は、第1の重鎖中のT350V、L351Y、F405A及び/またはY407Vと、第2の重鎖中のT350V、T366L、K392L及び/またはT394Wとを含む。例えば、Von Kreudenstein et al.,mAbs,5(2013),pp.646−654を参照されたい。HA−TF変異は、第1の重鎖中のS364H及び/またはF405Aと、第2の重鎖中のY349T及び/またはT394Fとを含む。例えば、Moore et al.,mAbs,3(2011),pp.546−557を参照されたい。SEEDbody変異は、第1の重鎖中のIgG/Aキメラ変異と、第2の重鎖中のIgG/Aキメラ変異とを含む。例えば、Davis et al.,Protein Eng.Des.Sel.,23(2010),pp.195−202を参照されたい。プロテインA親和性が異なる変異は、一方の重鎖中にH435Rを含み、他方の重鎖には変異がない。例えば、米国特許第8,586,713号を参照されたい。

0127

特定の例において、変異は、電荷対変異である。このような電荷対変異の例は、次のとおりである(EUシステムのナンバリングに従う)。電荷対変異は、第1の重鎖中のK409Dと第2の重鎖中のD399K、第1の重鎖中のK392Dと第2の重鎖中のE356K、または第1の重鎖中のK409D及びK392Dの両方と第2の重鎖中のD399K及びE356Kの両方を含む(後者は、本明細書中、「V1」と称される)。例えば、Gunasekaran et al.,J Biol Chem 285:19637−19646(2010)を参照されたい。別の特定の例において、電荷対変異は、第1の重鎖中のK439D、K392D及びK409Dと、第2の重鎖中のE356K及びD399Kとを含む(本明細書中、「V103」と称される)。更に別の特定の例において、電荷対変異は、第1の重鎖中のK360E、K370E、K392E及びK409Dと、第2の重鎖中のE357K及びD399Kとを含む(本明細書中、「V131」と称される)。電荷対変異は、第1の重鎖中のK370Dと第2の重鎖中のE357K、または第1の重鎖中のK409D、K392D及びK370Dの3つ全てと第2の重鎖中のD399K、E357K及びE356Kの3つ全てを含んでもよい(後者は、本明細書中、「V4」と称される)。更なる電荷対変異は、第1の重鎖中のD221E、P228E及び/またはL368Eと、第2の重鎖中のD221R、P228R及び/またはK409Rとをも含む。例えば、Strop et al.,J.Mol.Biol.,420(2012),pp.204−219を参照されたい。

0128

融合タンパク質がIL−21ムテインを1つのみ含み(すなわち、融合タンパク質は、IL−21ムテイン単量体を含む)、重鎖がV1電荷対変異を含有する、実施形態において、IL−21ムテインは、K409D及びK392D変異を含有する重鎖に結合され得る(例えば、IL−21ムテインは、配列番号294、296または298を含む重鎖に結合される)か、D399K及びE356K変異を含有する重鎖に結合され得る(例えば、IL−21ムテインは、配列番号295、297または299を含む重鎖に結合される)。具体的な実施形態において、IL−21ムテインは、D399K及びE356K変異を含有する重鎖に結合される。

0129

融合タンパク質がIL−21ムテインを1つのみ含み(すなわち、融合タンパク質は、IL−21ムテイン単量体を含む)、重鎖がV4電荷対変異を含有する、実施形態において、IL−21ムテインは、K409D、K392D及びK370D変異を含有する重鎖に結合され得る(例えば、IL−21ムテインは、配列番号288、290または292を含む重鎖に結合される)か、D399K、E357K及びE356K変異を含有する重鎖に結合され得る(例えば、IL−21ムテインは、配列番号289、291または293を含む重鎖に結合される)。具体的な実施形態において、IL−21ムテインは、D399K、E357K及びE356K変異を含有する重鎖に結合される。

0130

融合タンパク質がIL−21ムテインを1つのみ含み(すなわち、融合タンパク質は、IL−21ムテイン単量体を含む)、重鎖がV103電荷対変異を含有する、実施形態において、IL−21ムテインは、K439D、K392D及びK409D変異を含有する重鎖に結合され得る(例えば、IL−21ムテインは、配列番号472、474または476を含む重鎖に結合される)か、E356K及びD399K変異を含有する重鎖に結合され得る(例えば、IL−21ムテインは、配列番号473、475または477を含む重鎖に結合される)。具体的な実施形態において、IL−21ムテインは、E356K及びD399K変異を含有する重鎖に結合される。

0131

融合タンパク質がIL−21ムテインを1つのみ含み(すなわち、融合タンパク質は、IL−21ムテイン単量体を含む)、重鎖がV131電荷対変異を含有する、実施形態において、IL−21ムテインは、K360E、K370E、K392E及びK409D変異を含有する重鎖に結合され得る(例えば、IL−21ムテインは、配列番号478、480または482を含む重鎖に結合される)か、E357K及びD399K変異を含有する重鎖に結合され得る(例えば、IL−21ムテインは、配列番号479、481または483を含む重鎖に結合される)。具体的な実施形態において、IL−21ムテインは、E357K及びD399K変異を含有する重鎖に結合される。

0132

したがって、例示的な態様において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、本明細書に記載される電荷対変異セットを含む。特定の態様において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、V1、V103及びV131の電荷対変異から選択される電荷対変異を含む。

0133

例示的な態様において、抗PD−1抗体は、配列番号284のアミノ酸配列、または配列番号284に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、1つ以上の電荷対変異、例えば、V1、V4、V103またはV131の電荷対変異を含む、重鎖定常領域を含む。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、配列番号284のアミノ酸配列、または配列番号284に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、V1電荷対変異を含む、重鎖定常領域を含み、第1の重鎖定常領域は、K409及びK392D変異を含み、第2の重鎖定常領域は、D399K及びE356K変異を含む。そのような第1の重鎖定常領域は、配列番号294の配列を含み得、そのような第2の重鎖定常領域は、配列番号295の配列を含み得る。そのような第1及び第2の重鎖定常領域は、C末端Lysがクリッピングまたは除去されてもよく、これにより、第1及び第2の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号296及び297を含み得る。そのような第1及び第2の重鎖定常領域は、C末端Lysがクリッピングまたは除去され、かつリンカーを有してもよく、これにより、第1及び第2の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号298及び299を含み得る。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、V1電荷対変異及びSEFL2−2変異を含む、重鎖定常領域を含む。V1電荷対変異及びSEFL2−2変異を含むそのような第1の重鎖定常領域は、配列番号306の配列を含み得、V1電荷対変異及びSEFL2−2変異を含むそのような第2の重鎖定常領域は、配列番号307の配列を含み得る。そのような第1及び第2の重鎖の更なる変形形態、例えば、C末端Lysがクリッピングまたは除去された重鎖(配列番号308及び309)及びC末端Lysがクリッピングまたは除去され、かつリンカーを含む重鎖(配列番号310及び311)も企図される。

0134

例示的な態様において、抗PD−1抗体は、配列番号284のアミノ酸配列、または配列番号284に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、V4電荷対変異を含む、重鎖定常領域を含み、第1の重鎖定常領域は、K409、K392D及びK370D変異を含み、第2の重鎖定常領域は、D399K、E356K及びE357K変異を含む。そのような第1の重鎖定常領域は、配列番号288の配列を含み得、そのような第2の重鎖定常領域は、配列番号289の配列を含み得る。そのような第1及び第2の重鎖定常領域は、C末端Lysがクリッピングまたは除去されてもよく、これにより、第1及び第2の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号290及び291を含み得る。そのような第1及び第2の重鎖定常領域は、C末端Lysがクリッピングまたは除去され、かつリンカーを有してもよく、これにより、第1及び第2の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号292及び293を含み得る。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、V4電荷対変異及びSEFL2−2変異を含む、重鎖定常領域を含む。V4電荷対変異及びSEFL2−2変異を含むそのような第1の重鎖定常領域は、配列番号300の配列を含み得、V4電荷対変異及びSEFL2−2変異を含むそのような第2の重鎖定常領域は、配列番号301の配列を含み得る。そのような第1及び第2の重鎖の更なる変形形態、例えば、C末端Lysがクリッピングされた重鎖(配列番号302及び303)及びC末端Lysがクリッピングまたは除去され、かつリンカーを含む重鎖(配列番号304及び305)も企図される。

0135

例示的な態様において、抗PD−1抗体は、配列番号284のアミノ酸配列、または配列番号284に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、V103電荷対変異を含む、重鎖定常領域を含み、第1の重鎖定常領域は、配列番号484の配列を含み、第2の重鎖定常領域は、配列番号485の配列を含む。そのような第1及び第2の重鎖定常領域は、C末端Lysがクリッピングまたは除去されてもよく、これにより、第1及び第2の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号486及び487を含み得る。そのような第1及び第2の重鎖定常領域は、C末端Lysがクリッピングまたは除去され、かつリンカーを有してもよく、これにより、第1及び第2の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号488及び489を含み得る。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、V103電荷対変異及びSEFL2−2変異を含む、重鎖定常領域を含む。V103電荷対変異及びSEFL2−2変異を含むそのような第1の重鎖定常領域は、配列番号484の配列を含み得、V103電荷対変異及びSEFL2−2変異を含むそのような第2の重鎖定常領域は、配列番号485の配列を含み得る。そのような第1及び第2の重鎖の更なる変形形態、例えば、C末端Lysがクリッピングされた重鎖(配列番号486及び487)及びC末端Lysがクリッピングまたは除去され、かつリンカーを含む重鎖(配列番号488及び489)も企図される。

0136

例示的な態様において、抗PD−1抗体は、配列番号284のアミノ酸配列、または配列番号284に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、V131電荷対変異を含む、重鎖定常領域を含み、第1の重鎖定常領域は、配列番号478の配列を含み、第2の重鎖定常領域は、配列番号479の配列を含む。そのような第1及び第2の重鎖定常領域は、C末端Lysがクリッピングまたは除去されてもよく、これにより、第1及び第2の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号480及び481を含み得る。そのような第1及び第2の重鎖定常領域は、C末端Lysがクリッピングまたは除去され、かつリンカーを有してもよく、これにより、第1及び第2の重鎖定常領域は、それぞれ配列番号482及び483を含み得る。例示的な態様において、抗PD−1抗体は、V131電荷対変異及びSEFL2−2変異を含む、重鎖定常領域を含む。V131電荷対変異及びSEFL2−2変異を含むそのような第1の重鎖定常領域は、配列番号490の配列を含み得、V131電荷対変異及びSEFL2−2変異を含むそのような第2の重鎖定常領域は、配列番号491の配列を含み得る。そのような第1及び第2の重鎖の更なる変形形態、例えば、C末端Lysがクリッピングされた重鎖(配列番号492及び493)及びC末端Lysがクリッピングまたは除去され、かつリンカーを含む重鎖(配列番号494及び495)も企図される。

0137

代替的態様において、融合タンパク質は、2つ以上のIL−21ムテインを含む(すなわち、融合タンパク質は、IL−21ムテイン二量体またはIL−21ムテイン多量体を含む)。例示的な代替的態様において、融合タンパク質は、2、3または4つ(またはそれ以上)のIL−21ムテインを含む。例示的な態様において、融合タンパク質が2つ以上のIL−21ムテインを含む場合、各IL−21ムテインは、同じ構造、例えば、同じアミノ酸配列を含む。例示的な場合において、融合タンパク質は、IL−21ホモ二量体またはIL−21ホモ多量体を含む。代替的態様において、融合タンパク質の各IL−21ムテインは、異なる構造、例えば、異なるアミノ酸配列を含む。例示的な場合において、融合タンパク質は、IL−21ヘテロ二量体またはIL−21ヘテロ多量体を含む。例示的な場合において、融合タンパク質は、2つのIL−21ムテインを含み、第1のIL−21ムテインは、第1の抗体重鎖のC末端に連結され、第2のIL−21ムテインは、第2の抗体重鎖のC末端に連結される。例示的な態様において、各IL−21ムテインは、同じアミノ酸配列を有する(例えば、IL−21ムテインホモ二量体である)。例示的な態様において、第1のIL−21ムテインは、第2のIL−21ムテインと比較して異なるアミノ酸配列を有する(例えば、IL−21ムテインヘテロ二量体である)。

0138

1つ以上のIL−21ムテインを含む融合タンパク質に関して、各IL−21ムテインは、リンカーありまたはリンカーなしで、抗体の重鎖のうちの1つに結合され得る。例示的な態様において、IL−21ムテインは、抗体重鎖のうちの1つのC末端にリンカーを介して結合され、リンカーは、ペプチドである。例示的な場合において、ペプチドは、GGGGSのアミノ酸配列(配列番号262)を含む。代替的態様において、IL−21ムテインは、リンカーなしで、抗体の重鎖のうちの1つのC末端に直接結合される。

0139

例示的な態様において、融合タンパク質は、抗PD−1抗体の重鎖のうちの1つのC末端に直接結合されたIL−21ムテインを1つのみ含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、表4に列挙されるアミノ酸置換または表4に列挙される配列番号の配列を含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、表5に列挙されるアミノ酸置換または表5に列挙される配列番号の配列を含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、表7に列挙されるアミノ酸置換または表7に列挙される配列番号の配列を含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、表6及び8〜14のいずれか1つに列挙されるアミノ酸置換またはこれらの表に列挙される配列番号の配列を含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、配列番号159、161、238、241、242または244のいずれかのアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、抗PD−1抗体に直接結合され、ペプチドリンカーを含まない。

0140

例示的な態様において、融合タンパク質は、2つのIL−21ムテインを含み、そのそれぞれは、抗PD−1抗体の重鎖のC末端に直接結合され、そのそれぞれは、同じアミノ酸配列を有する。例示的な態様において、IL−21ムテインは、表4に列挙されるアミノ酸置換または表4に列挙される配列番号の配列を含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、表5に列挙されるアミノ酸置換または表5に列挙される配列番号の配列を含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、表7に列挙されるアミノ酸置換または表7に列挙される配列番号の配列を含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、表6及び8〜14のいずれか1つに列挙されるアミノ酸置換またはこれらの表に列挙される配列番号の配列を含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、配列番号159、161、237、238、241及び244のいずれかのアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、IL−21ムテインは、抗PD−1抗体に直接結合され、ペプチドリンカーを含まない。

0141

例示的な態様において、融合タンパク質は、本明細書に記載される任意のIL−21ムテインのアミノ酸配列に融合された、本明細書に記載される抗体定常領域のアミノ酸配列を含む。例示的な態様において、融合タンパク質は、本明細書に記載される任意のIL−21ムテインのアミノ酸配列に融合された、グリコシル化されていない、本明細書に記載される抗体定常領域のアミノ酸配列を含む。例示的な場合において、融合タンパク質は、配列番号3〜21、23〜56、58〜112、114〜208、210〜222、224〜255及び283のいずれか1つ、または配列番号3〜21、23〜56、58〜112、114〜208、210〜222、224〜255及び283に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、IL−21ムテインに融合された、配列番号265〜267、282、284〜311、472〜495及び544〜555のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号265〜267、282、284〜311、472〜495及び544〜555のいずれか1つに対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、定常領域を含む。例示的な態様において、融合タンパク質は、配列番号268〜281のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号268〜281に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0142

例示的な実施形態において、融合タンパク質は、図4A、4Bまたは4Cに記載される構築物を含む。例示的な実施形態において、融合タンパク質は、(i)本明細書に記載される抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)と、(ii)本明細書に記載されるIL−21ムテインとを含む。追加の例示的な実施形態において、融合タンパク質は、(i)本明細書に記載される抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)と、(ii)本明細書に記載される電荷対変異と、(iii)本明細書に記載されるIL−21ムテインとを含む(例えば、図4C参照)。他の例示的な実施形態において、融合タンパク質は、(i)本明細書に記載される抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)であって、当該抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)の重鎖配列は、C末端リシンを含まない抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)と、(ii)本明細書に記載される電荷対変異と、(iii)本明細書に記載されるIL−21ムテインとを含む。

0143

例示的な場合において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)表Dに記載される重鎖(HC)相補性決定領域(CDR)1アミノ酸配列、すなわち、配列番号312、322、332、342、352、362、372及び382からなる群から選択される配列、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(b)表Dに記載されるHC CDR2アミノ酸配列、すなわち、配列番号313、323、333、343、353、363、373及び383からなる群から選択される配列、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(c)表Dに記載されるHC CDR3アミノ酸配列、すなわち、配列番号314、324、334、344、3545、364、374及び384からなる群から選択される配列、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(d)表Dに記載される軽鎖(LC)CDR1アミノ酸配列、すなわち、315、325、335、345、355、365、375及び385からなる群から選択される配列、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(e)表Dに記載されるLC CDR2アミノ酸配列、すなわち、316、326、336、346、356、366、376及び386からなる群から選択される配列、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(f)表Dに記載されるLC CDR3アミノ酸配列、すなわち、317、327、337、347、357、367、377及び387からなる群から選択される配列、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(g)(a)〜(f)のうちの任意の2つまたはそれ以上の組み合わせを含む。例示的な態様において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、表Dに記載されるLC CDR1アミノ酸配列、LC CDR2アミノ酸配列及びLC CDR3アミノ酸配列と、表Dに記載されるHCCDRアミノ酸配列のうちの少なくとも1つまたは2つとを含む。例示的な実施形態において、抗原結合タンパク質は、表Dの1つの縦列中に配列番号で指定されるアミノ酸配列のうちの3つ、4つ、5つまたは6つを含む。例示的な実施形態において、抗PD−1抗体、その抗原結合抗体断片または抗PD−1抗体タンパク質生成物は、(a)配列番号312〜317、(b)配列番号322〜327、(c)配列番号332〜337、(d)配列番号342〜347、(e)配列番号352〜357、(f)配列番号362〜367、(g)配列番号372〜377、及び(h)配列番号382〜387からなる群から選択される6つのCDRアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗PD−1抗体タンパク質生成物は、そのような領域を含む。

0144

例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)表Eに記載される重鎖可変領域アミノ酸配列、すなわち、318、328、338、348、358、368、378及び388からなる群から選択される配列、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(b)表Eに記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列、すなわち、319、329、339、349、359、369、379及び389からなる群から選択される配列、または1アミノ酸もしくは2アミノ酸のみ異なるか、少なくとも70%もしくは約70%の配列同一性を有する、そのバリアント配列を含むか、(c)(a)と(b)の両方を含む。例示的な実施形態において、抗PD−1抗体(またはその抗原結合抗体断片)は、(a)配列番号318と319、(b)配列番号328と329、(c)配列番号338と339、(d)配列番号348と349、(e)配列番号358と359、(f)配列番号368と369、(g)配列番号378と379、及び(h)配列番号388と389からなる群から選択されるアミノ酸配列対を含む。例示的な場合において、抗体定常領域は、配列番号3〜21、23〜56、58〜112、114〜208、210〜222、224〜255及び283のいずれか1つ、または配列番号3〜21、23〜56、58〜112、114〜208、210〜222、224〜255及び283に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、IL−21ムテインに融合された、配列番号265〜267、282及び284〜311のいずれか1つのアミノ酸配列、または配列番号265〜267、282及び284〜311のいずれか1つに対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態において、抗原結合タンパク質は、(a)配列番号320と321、(b)配列番号330と331、(c)配列番号340と341、(d)配列番号350と351、(e)配列番号360と361、(f)配列番号370と371、(g)配列番号380と381、及び(h)配列番号390と391からなる群から選択されるアミノ酸配列対を含む。例示的な実施形態において、融合タンパク質は、(I)(a)配列番号320と321、(b)配列番号330と331、(c)配列番号340と341、(d)配列番号350と351、(e)配列番号360と361、(f)配列番号370と371、(g)配列番号380と381、及び(h)配列番号390と391からなる群から選択されるアミノ酸配列対と、(II)配列番号3〜21、23〜56、58〜112、114〜208、210〜222、224〜255及び283のいずれか1つ、または配列番号3〜21、23〜56、58〜112、114〜208、210〜222、224〜255及び283に対して、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%の配列同一性を有するか、約90%を超える(例えば、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%を超える)配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、IL−21ムテインとを含む。

0145

例示的な場合において、融合タンパク質は、図4Aに示されるホモ二量体を含み、抗PD−1抗体は、抗体20C1.009の3つの軽鎖CDR(配列番号355〜357)、抗体20C1.009の3つの重鎖CDR(配列番号352〜354)を含み、各重鎖は、SEFL2−2変異を含む定常領域配列(例えば、配列番号265または266)を含み、2つのIL−21ムテインのそれぞれは、アミノ酸置換R9E及びR76Aを含む(すなわち、どちらも配列番号244の配列を含む)。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、配列番号358の重鎖可変領域と、配列番号359の軽鎖可変領域とを含む。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、配列番号360の重鎖または配列番号361の軽鎖を含む。例示的な場合において、融合タンパク質は、配列番号361及び562または配列番号361及び563のアミノ酸配列を含む、ホモ二量体を含む。例示的な態様において、融合タンパク質は、2つの抗体軽鎖(いずれも配列番号361のアミノ酸配列を含む)と、2つの抗体重鎖(いずれもIL−21ムテインに融合され、各重鎖−IL−21ムテイン融合体は、配列番号562のアミノ酸配列を含む)とを含む、ホモ二量体を含む。例示的な態様において、融合タンパク質は、2つの抗体軽鎖(いずれも配列番号361のアミノ酸配列を含む)と、2つの抗体重鎖(いずれもIL−21ムテインに融合され、各重鎖−IL−21ムテイン融合体は、配列番号563のアミノ酸配列を含む)とを含む、ホモ二量体を含む。

0146

例示的な場合において、融合タンパク質は、図4Aに示されるホモ二量体を含み、抗PD−1抗体は、抗体20C1.009の3つの軽鎖CDR(配列番号355〜357)、抗体20C1.009の3つの重鎖CDR(配列番号352〜354)を含み、各重鎖は、SEFL2−2変異を含む定常領域配列(例えば、配列番号265または266)を含み、2つのIL−21ムテインのそれぞれは、アミノ酸置換R9E及びR76Eを含む(すなわち、どちらも配列番号245の配列を含む)。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、配列番号358の重鎖可変領域と、配列番号359の軽鎖可変領域とを含む。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、配列番号360の重鎖または配列番号361の軽鎖を含む。例示的な場合において、融合タンパク質は、配列番号361及び564または配列番号361及び565のアミノ酸配列を含む、ホモ二量体を含む。例示的な態様において、融合タンパク質は、2つの抗体軽鎖(いずれも配列番号361のアミノ酸配列を含む)と、2つの抗体重鎖(いずれもIL−21ムテインに融合され、各重鎖−IL−21ムテイン融合体は、配列番号564のアミノ酸配列を含む)とを含む、ホモ二量体を含む。例示的な態様において、融合タンパク質は、2つの抗体軽鎖(いずれも配列番号361のアミノ酸配列を含む)と、2つの抗体重鎖(いずれもIL−21ムテインに融合され、各重鎖−IL−21ムテイン融合体は、配列番号565のアミノ酸配列を含む)とを含む、ホモ二量体を含む。

0147

例示的な場合において、融合タンパク質は、図4Bに示されるホモ二量体を含み、抗PD−1抗体は、抗体20C1.009の3つの軽鎖CDR(配列番号355〜357)、抗体20C1.009の3つの重鎖CDR(配列番号352〜354)を含み、各重鎖は、SEFL2−2変異及びリンカーを含む定常領域配列(例えば、配列番号267)を含み、2つのIL−21ムテインのそれぞれは、アミノ酸置換R9E及びR76Aを含む(すなわち、どちらも配列番号244の配列を含む)。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、配列番号358の重鎖可変領域と、配列番号359の軽鎖可変領域とを含む。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、配列番号360の重鎖または配列番号361の軽鎖を含む。例示的な場合において、融合タンパク質は、配列番号361及び566のアミノ酸配列を含む、ホモ二量体を含む。例示的な態様において、融合タンパク質は、2つの抗体軽鎖(いずれも配列番号361のアミノ酸配列を含む)と、2つの抗体重鎖(いずれもIL−21ムテインに融合され、各重鎖−IL−21ムテイン融合体は、配列番号566のアミノ酸配列を含む)とを含む、ホモ二量体を含む。

0148

例示的な場合において、融合タンパク質は、図4Bに示されるホモ二量体を含み、抗PD−1抗体は、抗体20C1.009の3つの軽鎖CDR(配列番号355〜357)、抗体20C1.009の3つの重鎖CDR(配列番号352〜354)を含み、各重鎖は、SEFL2−2変異及びリンカーを含む定常領域配列(例えば、配列番号267)を含み、2つのIL−21ムテインのそれぞれは、アミノ酸置換R9E及びR76Eを含む(すなわち、どちらも配列番号245の配列を含む)。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、配列番号358の重鎖可変領域と、配列番号359の軽鎖可変領域とを含む。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、配列番号360の重鎖または配列番号361の軽鎖を含む。例示的な場合において、融合タンパク質は、配列番号361及び567のアミノ酸配列を含む、ホモ二量体を含む。例示的な態様において、融合タンパク質は、2つの抗体軽鎖(いずれも配列番号361のアミノ酸配列を含む)と、2つの抗体重鎖(いずれもIL−21ムテインに融合され、各重鎖−IL−21ムテイン融合体は、配列番号567のアミノ酸配列を含む)とを含む、ホモ二量体を含む。

0149

例示的な場合において、融合タンパク質は、図4Cに示されるIL−21ムテイン単量体を含み、抗PD−1抗体は、抗体20C1.009の3つの軽鎖CDR(配列番号355〜357)と、抗体20C1.009の3つの重鎖CDR(配列番号352〜354)と、SEFL2−2変異及びV1電荷対変異を含む定常領域配列を含む重鎖対(例えば、配列番号306と307または配列番号308と309)とを含み、IL−21ムテイン単量体は、E356K及びD399K V1電荷対変異を含有する重鎖に結合され(例えば、IL−21ムテイン単量体は、配列番号309のいずれか1つを含む重鎖に結合される)、IL−21ムテインは、アミノ酸置換R9E及びR76Aを含む(すなわち、配列番号244の配列を含む)。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、配列番号358の重鎖可変領域と、配列番号359の軽鎖可変領域とを含む。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、配列番号360の重鎖または配列番号361の軽鎖を含む。例示的な場合において、融合タンパク質は、配列番号361及び568のアミノ酸配列を含む、単量体を含む。例示的な態様において、融合タンパク質は、2つの抗体軽鎖(いずれも配列番号361のアミノ酸配列を含む)と、2つの異なる抗体重鎖(一方は、IL−21ムテインに融合され、配列番号568のアミノ酸配列を含み、他方は、IL−21ムテインに融合しておらず、配列番号574のアミノ酸配列を含む)とを含む、単量体を含む。

0150

例示的な場合において、融合タンパク質は、図4Cに示されるIL−21ムテイン単量体を含み、抗PD−1抗体は、抗体20C1.009の3つの軽鎖CDR(配列番号355〜357)と、抗体20C1.009の3つの重鎖CDR(配列番号352〜354)と、SEFL2−2変異及びV103電荷対変異を含む定常領域配列を含む重鎖対(例えば、配列番号484と485または配列番号486と487)とを含み、IL−21ムテイン単量体は、E356K及びD399K V103電荷対変異を含有する重鎖に結合され(例えば、すなわち、IL−21ムテイン単量体は、配列番号487を含む重鎖に結合される)、IL−21ムテインは、アミノ酸置換R9E及びR76Aを含む(すなわち、配列番号244の配列を含む)。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、配列番号358の重鎖可変領域と、配列番号359の軽鎖可変領域とを含む。例示的な場合において、抗PD−1抗体は、配列番号360の重鎖または配列番号361の軽鎖を含む。例示的な場合において、融合タンパク質は、配列番号361及び569のアミノ酸配列を含む、単量体を含む。例示的な態様において、融合タンパク質は、2つの抗体軽鎖(いずれも配列番号361のアミノ酸配列を含む)と、2つの異なる抗体重鎖(一方は、IL−21ムテインに融合され、配列番号569のアミノ酸配列を含み、他方は、IL−21ムテインに融合しておらず、配列番号575のアミノ酸配列を含む)とを含む、単量体を含む。

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