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技術 シクロアルキルカルボキサミド−インドール化合物の製造方法

出願人 バーテックスファーマシューティカルズインコーポレイテッド
発明者 ジェラルド・ジェイ・タノウリークリスチャン・ハリソンベンジャミン・ジョセフ・リトラーピーター・ジャミソン・ローズロバート・マイケル・ヒューズチョン・ヨンチュンデイビッド・アンドリュー・シーセルエレーヌ・チュンミン・リーダニエル・ティー・ベルモントウィリアム・エイ・ニュージェント
出願日 2018年11月9日 (1年7ヶ月経過) 出願番号 2018-210982
公開日 2019年2月28日 (1年4ヶ月経過) 公開番号 2019-031570
状態 未査定
技術分野 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 インドール系化合物 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 固体アルコール 低域フィルター 切り出し後 ガウシアン関数 液体処理システム 活性化粉末 時間拡散 工程制御
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課題

本発明は、嚢胞性線維症などのCFTRに媒介される疾患の処置に有用な化合物の製造方法の提供。

解決手段

本発明は、嚢胞性線維症などのCFTRに媒介される疾患の処置に有用な、(R)−1−(2,2−ジフルオロベンゾ[d][1,3]ジオキソール−5−イル)−N−(1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)−6−フルオロ−2−(1−ヒドロキシ2−メチルプロパン−2−イル)−1H−インドール−5−イル)シクロプロパンカルボキサミド(化合物1)などの化合物の製造方法を特徴とする。

概要

背景

本発明の背景
CFTRは、吸収性および分泌性上皮細胞を含む様々な細胞タイプ発現される、cAMPATPに媒介される陰イオンチャネルであり、それは、膜を介する陰イオンの流動および他のイオンチャネルおよびタンパク質活性を制御する。上皮細胞では、正常なCFTRの機能は、呼吸および消化組織を含む体全体の電解輸送の維持に決定的である。CFTRは、各々6個の膜貫通らせんおよびヌクレオチド結合ドメインを含む膜貫通ドメイン縦列反復からなるタンパク質をコードする約1480個のアミノ酸で構成される。2個の膜貫通ドメインは、チャネルの活性および細胞内輸送を制御する複数のリン酸化部位を有する大型で極性制御性(R)−ドメインにより連結されている。

CFTRをコードする遺伝子は、同定され、配列決定された(非特許文献1; 非特許文献2), (非特許文献3参照)。この遺伝子の欠陥は、CFTRに突然変異を引き起こし、ヒトの最も一般的な致死性遺伝疾患である嚢胞性線維症(「CF」)をもたらす。嚢胞性線維症は、米国で約2,500人の新生児につき1人を冒している。一般的な米国の集団内で、1千万人に上る人々が明白な病的作用を伴わずに欠陥遺伝子の単一コピーを有する。対照的に、2つのコピーのCF関連遺伝子を有する個体は、慢性肺疾患を含むCFの衰弱性かつ致死性の作用に苦しんでいる。

嚢胞性線維症の患者において、呼吸上皮内在性に発現されるCFTRにおける突然変異は、頂端の陰イオン分泌の減少を導き、イオンおよび流体の輸送に不均衡をもたらす。結果的な陰イオン輸送の減少は、における粘液蓄積の増強およびそれに伴う微生物感染に貢献し、それは、最終的にCF患者の死亡を引き起こす。呼吸器疾患に加えて、CFの患者は、典型的には胃腸の問題および膵臓機能不全罹患し、それは、処置されなければ、死亡を招く。加えて、嚢胞性線維症の男性の大部分は不妊であり、嚢胞性線維症の女性の間では妊孕性は低い。2コピーのCF関連遺伝子の重篤な作用とは対照的に、単一コピーのCF関連遺伝子を有する個体は、コレラおよび下痢による脱水症に対する耐性の上昇を示し、おそらくこれが集団内でのCF遺伝子の比較的高い頻度説明となる

CF染色体CFTR遺伝子配列分析は、様々な病原性突然変異を明らかにした(非特許文献4; 非特許文献5; および非特許文献6; 非特許文献7)。今日までに、CF遺伝子中に>1000個の病原性突然変異が同定された(非特許文献8)。最も優勢な突然変異は、CFTRアミノ酸配列の508番目フェニルアラニン欠失であり、一般的にΔF508−CFTRと呼ばれる。この突然変異は、嚢胞性線維症の症例の約70%に生じており、重篤な疾患と関連する。他の突然変異には、R117HおよびG551Dが含まれる。

ΔF508−CFTRにおける残基508の欠失は、新生タンパク質の正しい折り畳みを妨げる。これは、この突然変異タンパク質ERから出られなくし、細胞膜に輸送されなくする。結果的に、膜に存在するチャネルの数は、野生型CFTRを発現する細胞で観察されるものよりも遙かに少ない。輸送の障害に加えて、この突然変異は、チャネル開閉の欠陥をもたらす。膜のチャネル数の減少および開閉の欠陥が、一体となって上皮を介する陰イオン輸送の減少を導き、イオンおよび流体の輸送に欠陥を導く(非特許文献9)。しかしながら、研究は、たとえ野生型CFTRよりも低くても、膜中の数が減少したΔF508−CFTRは機能性であることを示した(非特許文献10; Denning et al., supra; 非特許文献11)。ΔF508−CFTRに加えて、輸送、合成および/またはチャネル開閉の欠陥をもたらすCFTRの他の病原性突然変異は、上方または下方制御されて陰イオン分泌を変化させ得、疾患の進行および/または重篤度を改変し得る。

CFTRは陰イオンに加えて様々な分子を輸送するが、この役割(陰イオンの輸送)が、上皮を介するイオンおよび水の輸送の重要なメカニズムにおける1つの要素に相当する。他の要素には、上皮Na+チャネル、ENaC、Na+/2Cl−/K+共輸送体、Na+−K+−ATPaseポンプおよび側底膜K+チャネルが含まれ、これらは細胞への塩素の取り込みを担う。

これらの要素は、一体となって作用し、それらの選択的発現および細胞内での局在により、上皮を介する定方向輸送を達成する。塩素吸収は、頂端膜に存在するENaCおよびCFTR、並びに、細胞の側底表面に発現されるNa+−K+−ATPaseポンプおよびCl−チャネルの協調的活動により起こる。管腔側からの塩素の二次的能動輸送は、細胞内塩素の蓄積を導き、それは、Cl−チャネルを介して受動的に細胞を離れることができ、方向性の輸送をもたらす。側底面のNa+/2Cl−/K+共輸送体、Na+−K+−ATPaseポンプおよび側底膜K+チャネル、並びに、管腔側のCFTRの配置が、管腔側のCFTRを介する塩素の分泌を調和させる。水自体はおそらく決して能動輸送されないので、その上皮を介する流動は、ナトリウムと塩素の総体流により生成される小さい経上皮浸透圧勾配に依存する。

上記の通り、ΔF508−CFTRの残基508の欠失は、新生タンパク質が正しく折り畳まれるのを妨げ、これは、この突然変異タンパク質をERから出られなくし、細胞膜に輸送されなくすると考えられる。結果的に、不十分な量の成熟タンパク質が細胞膜に存在し、上皮組織内の塩素輸送は有意に減少する。実際に、ER機構によるABC輸送体のERプロセシングの欠陥の細胞現象は、CF疾患のみならず、幅広い他の単独疾患(isolated disease)および遺伝疾患の根底にある基礎であると示された。ER機構が機能不全になり得る2つの道筋は、タンパク質のER排出への共役の喪失が分解を導くもの、または、これらの欠陥のある/誤って折り畳まれたタンパク質のER蓄積によるものである[非特許文献12; 非特許文献13; 非特許文献14; 非特許文献15; 非特許文献16]。

(R)−1−(2,2−ジフルオロベンゾ[d][1,3]ジオキソール−5−イル)−N−(1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)−6−フルオロ−2−(1−ヒドロキシ2−メチルプロパン−2−イル)−1H−インドール−5−イル)シクロプロパンカルボキサミドは、特許文献1(該刊行物の全体を出典明示により本明細書の一部とする)に、CFTR活性のモジュレーターとして、従って嚢胞性線維症などのCFTRに媒介される疾患の処置に有用であると開示された。しかしながら、本明細書に記載のシクロアルキルカルボキサミドインドール化合物経済的な製造方法に対する必要性が残っている。

概要

本発明は、嚢胞性線維症などのCFTRに媒介される疾患の処置に有用な化合物の製造方法の提供。本発明は、嚢胞性線維症などのCFTRに媒介される疾患の処置に有用な、(R)−1−(2,2−ジフルオロベンゾ[d][1,3]ジオキソール−5−イル)−N−(1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)−6−フルオロ−2−(1−ヒドロキシ−2−メチルプロパン−2−イル)−1H−インドール−5−イル)シクロプロパンカルボキサミド(化合物1)などの化合物の製造方法を特徴とする。なし

目的

本発明の要旨
本明細書に記載の通り、本発明は、嚢胞性線維症などのCFTRに媒介される疾患の処置に有用なCFTR矯正物質(corrector)の製造方法を提供する

効果

実績

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請求項1

式I:[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキルヘテロシクロアルキルアリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、mは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物の製造方法であって、a)第1の有機溶媒中、式IA[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、Halはハライドである]の化合物を、式IB:(式中、RJは、水素またはC1−6脂肪族である)の化合物と反応させ、式IC:[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、mは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物を形成させる;および、b)第2の有機溶媒中、化合物ICから−CO2RJ基を除去し、式Iの化合物を形成させる、の各段階を含む、方法。

請求項2

環Aが融合したヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールである、請求項1に記載の方法。

請求項3

環Aが、である、請求項1に記載の方法。

請求項4

XがCNである、請求項1に記載の方法。

請求項5

XがCO2Etである、請求項1に記載の方法。

請求項6

RJがC1−6脂肪族である、請求項1ないし請求項5のいずれかに記載の方法。

請求項7

HalがBrである、請求項1ないし請求項6のいずれかに記載の方法。

請求項8

第1の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項1ないし請求項7のいずれかに記載の方法。

請求項9

第1の有機溶媒がトルエンである、請求項1ないし請求項8のいずれかに記載の方法。

請求項10

段階a)がパラジウム触媒の存在下で実施される、請求項1ないし請求項9のいずれかに記載の方法。

請求項11

段階a)が、酢酸パラジウム(II)、Pd(dppf)Cl2、Pd(dba)2、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)またはトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)から選択されるパラジウム触媒の存在下で実施される、請求項1ないし請求項10のいずれかに記載の方法。。

請求項12

段階a)がPd(dba)2の存在下で実施される、請求項1ないし請求項11のいずれかに記載の方法。

請求項13

段階a)が約50℃ないし90℃で実施される、請求項1ないし請求項12のいずれかに記載の方法。

請求項14

段階a)が約70℃で実施される、請求項1ないし請求項13のいずれかに記載の方法。

請求項15

第2の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項1ないし請求項14のいずれかに記載の方法。

請求項16

第2の有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項1ないし請求項15のいずれかに記載の方法。

請求項17

段階b)が無機酸の存在下で実施される、請求項1ないし請求項16のいずれかに記載の方法。

請求項18

段階b)が約55℃ないし95℃で実施される、請求項1ないし請求項17のいずれかに記載の方法。

請求項19

段階b)が約75℃で実施される、請求項1ないし請求項18のいずれかに記載の方法。

請求項20

式II:[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;Halは、ハライドであり;R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、nは、両端を含めて1ないし4の整数である]の化合物の製造方法であって、a)第1の有機溶媒中、式IIA[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、Halはハライドである]の化合物を、式IIB:[式中、Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、RJは、水素またはC1−6脂肪族である]の化合物と反応させ、式IIC:[式中、各々独立して:環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、mは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物を形成させる、b)第2の有機溶媒中、化合物IICから−CO2RJ基を除去し、式I:[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、mは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物を形成させる、c)塩基の存在下で、式Iの化合物を、式IID[式中、各々独立して、Halはハライドであり;そして、qは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物と反応させ、式IIE:[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、nは、両端を含めて1ないし4の整数である]の化合物を生成させる、d)式IIEの化合物を、水酸化物塩基および酸と連続的に反応させ、式IIF:[式中、各々独立して:環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、nは、両端を含めて1ないし4の整数である]の化合物を生成させる、および、e)式IIFの化合物を、ハロゲン化剤と、第3の有機溶媒中で反応させ、式IIの化合物を形成させる、の各段階を含む方法。

請求項21

段階a)において、第1の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項20に記載の方法。

請求項22

段階a)において、第1の有機溶媒がトルエンである、請求項20または請求項21に記載の方法。

請求項23

段階a)において、HalがBrである、請求項20ないし請求項22のいずれかに記載の方法。

請求項24

段階a)において、環Aが融合した複素環またはヘテロアリール環である、請求項20ないし請求項23のいずれかに記載の方法。

請求項25

段階a)において、環Aがである、請求項20ないし請求項24のいずれかに記載の方法。

請求項26

段階a)において、XがCNである、請求項20ないし請求項25のいずれかに記載の方法。

請求項27

段階a)において、XがCO2Etである、請求項20ないし請求項26のいずれかに記載の方法。

請求項28

段階a)において、RJがEtである、請求項20ないし請求項27のいずれかに記載の方法。

請求項29

式IICにおいて、環Aがであり、mが0であり、XがCNであり、RJがEtである、請求項20ないし請求項28のいずれかに記載の方法。

請求項30

段階b)において、第2の溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項20ないし請求項29のいずれかに記載の方法。

請求項31

段階b)において、第2の溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項20ないし請求項30のいずれかに記載の方法。

請求項32

式I中、環Aがであり、mが0であり、XがCNである、請求項20ないし請求項31のいずれかに記載の方法。

請求項33

段階c)において、塩基が無機塩基である、請求項20ないし請求項32のいずれかに記載の方法。

請求項34

式IIDにおいて、一方のHalがClであり、他方のHalがBrである、請求項20ないし請求項33のいずれかに記載の方法。

請求項35

段階d)において、塩基がNaOHである、請求項20ないし請求項34のいずれかに記載の方法。

請求項36

段階d)において、酸がHClである、請求項20ないし請求項35のいずれかに記載の方法。

請求項37

段階d)において、水酸化物塩基との反応を約60℃ないし100℃で行う、請求項20ないし請求項36のいずれかに記載の方法。

請求項38

式IIEにおいて、環Aがであり、mが0であり、nが1であり、XがCNである、請求項20ないし請求項37のいずれかに記載の方法。

請求項39

段階e)において、第3の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項20ないし請求項38のいずれかに記載の方法。

請求項40

段階e)において、第3の有機溶媒がトルエンである、請求項20ないし請求項39のいずれかに記載の方法。

請求項41

段階e)において、ハロゲン化剤がSOCl2である、請求項20ないし請求項40のいずれかに記載の方法。

請求項42

段階e)を約40℃ないし80℃で行う、請求項20ないし請求項41のいずれかに記載の方法。

請求項43

式IIFにおいて、環Aがであり、mが0であり、nが1である、請求項20ないし請求項42のいずれかに記載の方法。

請求項44

式IIにおいて、環Aがであり、mが0であり、nが1であり、HalがClである請求項20ないし請求項43のいずれかに記載の方法。

請求項45

式III[式中、各々独立して、R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;R3は、OH、OP、−O−C1−6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、−O−アリールまたは−O−ヘテロアリールにより置換されていることもあるC1−6脂肪族であり;Pは、保護基であり;そして、oは、0ないし3の整数である]の化合物の製造方法であって、a)式IIIA:[式中、各々独立して、R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;そして、oは、0ないし3の整数である]の化合物を、ハロゲン化剤と、第1の有機溶媒中で反応させ、式IIIB:[式中、各々独立して、R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;oは、0ないし3の整数であり;そして、Halはハライドである]の化合物を形成させる、b)式IIIBの化合物を、第2の有機溶媒中、式IIIC:[式中、Pは保護基である]の化合物と反応させ、続いて、還元および酸処理により、式IIID:[式中、R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;oは、0ないし3の整数であり;Halはハライドであり;Pは保護基であり;そして、は陰イオンである]の化合物を形成させる、c)式IIIDの化合物を、塩基の存在下で中和し、式IIID−a:[式中、R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;oは、0ないし3の整数であり;Halはハライドであり;そして、Pは保護基である]の化合物を形成させる、d)式IIID−aの化合物を、第3の溶媒中で、式IIIE:[式中、各々独立して:R3は、OH、OP、−O−C1−6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、−O−アリールまたは−O−ヘテロアリールにより置換されていることもあるC1−6脂肪族である]の化合物と、触媒の存在下で反応させ、式IIIの化合物を形成させる、の各段階を含む、方法。

請求項46

式IIIAにおいて、oが1であり、R2がFである、請求項45に記載の方法。

請求項47

段階a)において、ハロゲン化剤がN−ブロモスクシンイミドである、請求項45または請求項46に記載の方法。

請求項48

段階a)において、第1の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項45ないし請求項47のいずれかに記載の方法。

請求項49

段階a)において、第1の有機溶媒が酢酸エチルである、請求項45ないし請求項48のいずれかに記載の方法。

請求項50

段階a)を約2℃ないし42℃で行う、請求項45ないし請求項49のいずれかに記載の方法。

請求項51

式IIIBにおいて、oが1であり、R2がFであり、HalがBrである、請求項45ないし請求項50のいずれかに記載の方法。

請求項52

式IIICにおいて、Pがベンジルである、請求項45ないし請求項51のいずれかに記載の方法。

請求項53

段階b)において、第2の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項45ないし請求項52のいずれかに記載の方法。

請求項54

段階b)において、第2の有機溶媒がトルエンである、請求項45ないし請求項53のいずれかに記載の方法。

請求項55

段階b)において、式IIICの化合物との反応を約60℃ないし100℃で行う、請求項45ないし請求項54のいずれかに記載の方法。

請求項56

段階b)において、還元を水素で実施する、請求項45ないし請求項55のいずれかに記載の方法。

請求項57

段階b)において、酸がp−トルエンスルホン酸である、請求項45ないし請求項56のいずれかに記載の方法。

請求項58

式IIIDにおいて、oが1であり、R2がFであり、HalがBrであり、がTos−であり、Pがベンジルである、請求項45ないし請求項57のいずれかに記載の方法。

請求項59

式IIIEにおいて、R3がC(CH3)2CH2O(ベンジル)である、請求項45ないし請求項58のいずれかに記載の方法。

請求項60

段階c)において、塩基が無機塩基である、請求項45ないし請求項59のいずれかに記載の方法。

請求項61

段階d)において、第3の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項45ないし請求項60のいずれかに記載の方法。

請求項62

段階d)において、第3の有機溶媒がアセトニトリルである、請求項45ないし請求項61のいずれかに記載の方法。

請求項63

段階d)を約60℃ないし100℃で行う、請求項45ないし請求項62のいずれかに記載の方法。

請求項64

段階d)において、触媒がパラジウム触媒である、請求項45ないし請求項63のいずれかに記載の方法。

請求項65

段階dにおいて、触媒が、酢酸パラジウム(II)、Pd(dppf)Cl2、Pd(dba)2、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)、(MeCN)2PdCl2またはトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)から選択される、請求項45ないし請求項64のいずれかに記載の方法。

請求項66

段階dにおいて、触媒が酢酸パラジウム(II)である、請求項45ないし請求項65のいずれかに記載の方法。

請求項67

式IV[式中、各々独立して、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1およびR2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;R3は、OH、OP、−O−C1−6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、−O−アリールまたは−O−ヘテロアリールで置換されていることもあるC1−6脂肪族であり;Pは保護基であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;nは、両端を含めて1ないし4の整数であり;そして、oは、両端を含めて1ないし3の整数である]の化合物の製造方法であって、a)式IIIA:[式中、各々独立して、R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;そして、oは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物を、ハロゲン化剤と、第1の有機溶媒中で反応させ、式IIIB:[式中、各々独立して:R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;oは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、Halはハライドである]の化合物を形成させる、b)式IIIBの化合物を、第2の有機溶媒中、式IIIC:[式中、Pは保護基である]の化合物と反応させ、続いて、還元および酸処理により、式IIID:[式中、R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;oは、両端を含めて0ないし3の整数であり;Halはハライドであり;Pは保護基であり;そしては陰イオンである]の化合物を形成させる、c)式IIIDの化合物を、塩基の存在下で中和し、式IIID−a:[式中、R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;oは、両端を含めて0ないし3の整数であり;Halはハライドであり;そして、Pは保護基である]の化合物を形成させる、d)式IIIDの化合物を、第3の有機溶媒中、式IIIE:[式中、各々独立して、R3は、OH、OP、−O−C1−6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、−O−アリールまたは−O−ヘテロアリールで置換されていることもあるC1−6脂肪族である]の化合物と、触媒の存在下で反応させ、式III:[式中、各々独立して:R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;R3は、OH、OP、−O−C1−6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、−O−アリールまたは−O−ヘテロアリールで置換されていることもあるC1−6脂肪族であり;Pは保護基であり;そして、oは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物を形成させる、e)式IIIの化合物を、第4の有機溶媒中、式II:[式中、各々独立して:環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;Halはハライドであり;R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、nは、両端を含めて1ないし4の整数である]の化合物と反応させ、式IVの化合物を形成させる、の各段階を含む、方法。

請求項68

式IVにおいて、環Aが、である、請求項67に記載の方法。

請求項69

式IVにおいて、oが1であり、R2がFである、請求項67または請求項68に記載の方法。

請求項70

式IVにおいて、Pがベンジルである、請求項67ないし請求項69のいずれかに記載の方法。

請求項71

式IVにおいて、R3がOPにより置換されていることもあるC4脂肪族である、請求項67ないし請求項70のいずれかに記載の方法。

請求項72

式IVにおいて、R3がである、請求項67ないし請求項71のいずれかに記載の方法。

請求項73

式IVにおいて、R3がである、請求項67ないし請求項72のいずれかに記載の方法。

請求項74

式IVにおいて、環Aがであり、mが0であり、nが1であり、oが1であり、R2がFであり、Pがベンジルであり、R3がである、請求項67ないし請求項73のいずれかに記載の方法。

請求項75

段階a)において、ハロゲン化剤がN−ブロモスクシンイミドである、請求項67ないし請求項74のいずれかに記載の方法。

請求項76

段階a)において、第1の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項67ないし請求項75のいずれかに記載の方法。

請求項77

段階a)において、第1の有機溶媒が酢酸エチルである、請求項67ないし請求項76のいずれかに記載の方法。

請求項78

段階a)を、約2℃ないし42℃で行う、請求項67ないし請求項77のいずれかに記載の方法。

請求項79

式IIIBにおいて、oが1であり、R2がFであり、HalがBrである、請求項67ないし請求項78のいずれかに記載の方法。

請求項80

式IIICにおいて、Pがベンジルである、請求項67ないし請求項79のいずれかに記載の方法。

請求項81

段階b)において、第2の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項67ないし請求項80のいずれかに記載の方法。

請求項82

段階b)において、第2の有機溶媒がトルエンである、請求項67ないし請求項81のいずれかに記載の方法。

請求項83

段階b)において、式IIICの化合物との反応を約60℃ないし100℃で行う、請求項67ないし請求項82のいずれかに記載の方法。

請求項84

段階b)において、還元を水素で実施する、請求項67ないし請求項83のいずれかに記載の方法。

請求項85

段階b)において、酸がp−トルエンスルホン酸である、請求項67ないし請求項84のいずれかに記載の方法。

請求項86

式IIIDにおいて、oが1であり、R2がFであり、HalがBrであり、がTos−であり、Pがベンジルである、請求項67ないし請求項85のいずれかに記載の方法。

請求項87

式IIIEにおいて、R3がC(CH3)2CH2O(ベンジル)である、請求項67ないし請求項86のいずれかに記載の方法。

請求項88

段階c)において、塩基が無機塩基である、請求項67ないし請求項87のいずれかに記載の方法。

請求項89

段階dにおいて、第3の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項67ないし請求項88のいずれかに記載の方法。

請求項90

段階dにおいて、第3の有機溶媒がアセトニトリルである、請求項67ないし請求項89のいずれかに記載の方法。

請求項91

段階dを約60℃ないし100℃で行う、請求項67ないし請求項90のいずれかに記載の方法。

請求項92

段階dにおいて、触媒がパラジウム触媒である、請求項67ないし請求項91のいずれかに記載の方法。

請求項93

段階dにおいて、触媒が、酢酸パラジウム(II)、Pd(dppf)Cl2、Pd(dba)2、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)、(MeCN)2PdCl2またはトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)から選択される、請求項67ないし請求項92のいずれかに記載の方法。

請求項94

段階dにおいて、触媒が酢酸パラジウム(II)である、請求項67ないし請求項93のいずれかに記載の方法。

請求項95

段階eにおいて、環Aがであり、mが0であり、nが1であり、HalがClである、請求項67ないし請求項94のいずれかに記載の方法。

請求項96

段階eにおいて、第4の有機溶媒が非プロトン性溶媒である、請求項67ないし請求項95のいずれかに記載の方法。

請求項97

段階eにおいて、第4の有機溶媒がジクロロメタンである、請求項67ないし請求項96のいずれかに記載の方法。

請求項98

段階eを約−20℃ないし20℃で行う、請求項67ないし請求項97のいずれかに記載の方法。

請求項99

段階eにおいて、式IIの化合物を、酸前駆物質ハロゲン化することによりインサイチュで製造し、単離せずに式IIIの化合物と反応させる、請求項67ないし請求項98のいずれかに記載の方法。

請求項100

2個の保護基を式IVの化合物から除去し、式IVAの化合物を形成させることをさらに含む、請求項67ないし請求項99のいずれかに記載の方法。

請求項101

保護基を水素化により除去する、請求項100に記載の方法。

請求項102

化合物1:の製造方法であって、a)化合物2:を、ブロム化剤と反応させ、化合物3:を形成させる、b)化合物3を化合物4:と反応させ、続いて還元し、化合物5:を形成させ、続いて、化合物5を塩基で中和し、化合物5a:を得る、c)化合物5aを化合物6:と、触媒の存在下で反応させ、化合物7:を形成させる、d)化合物7を、化合物8:と反応させ、化合物9:を形成させる、および、e)2個のBn保護基を除去し、化合物1を形成させる、の各段階を含む、方法。

請求項103

段階a)において、ブロム化剤がN−ブロモスクシンイミドである、請求項102に記載の方法。

請求項104

段階b)において、還元を水素で実施する、請求項102または請求項103に記載の方法。

請求項105

段階c)において、触媒がパラジウム触媒である、請求項102ないし請求項104のいずれかに記載の方法。

請求項106

段階c)において、触媒が、酢酸パラジウム(II)、Pd(dppf)Cl2、Pd(dba)2、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)、(MeCN)2PdCl2またはトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)から選択される、請求項102ないし請求項105のいずれかに記載の方法。

請求項107

段階c)において、触媒が酢酸パラジウム(II)である、請求項102ないし請求項106のいずれかに記載の方法。

請求項108

段階d)において、酸前駆物質を単離せずにハロゲン化することにより、化合物8をインサイチュで製造する、請求項102ないし請求項107のいずれかに記載の方法。

請求項109

段階e)において、Bn保護基を水素化により除去する、請求項102ないし請求項108のいずれかに記載の方法。

請求項110

式23:[式中、環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;Xは、CNまたはCO2Rであり;Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、mは、両端を含めて0ないし3の整数である]の化合物。

請求項111

環Aが、融合したヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールである、請求項110に記載の化合物。

請求項112

環Aが、である、請求項110または請求項111に記載の化合物。

請求項113

XがCNである、請求項110ないし請求項112のいずれかに記載の化合物。

請求項114

XがCO2Etである、請求項110ないし請求項113のいずれかに記載の化合物。

請求項115

RJがC1−6脂肪族である、請求項110ないし請求項114のいずれかに記載の化合物。

請求項116

化合物。

請求項117

化合物。

技術分野

0001

関連出願への相互参照
本願は、2012年5月12日出願の米国仮出願番号61/333,870;2010年4月22日出願の61/327,095;2010年4月22日出願の61/327,057;2010年4月29日出願の61/329,493;2010年4月22日出願の61/327,091;2010年4月29日出願の61/329,510;2010年4月22日出願の61/327,099;および2010年4月29日出願の61/329,500に優先権を主張し、全出願の全内容を出典明示により本明細書の一部とする。

0002

本発明の技術分野
本発明は、嚢胞性線維症などのCFTRに媒介される疾患の処置に有用な化合物の製造方法を特徴とする。

背景技術

0003

本発明の背景
CFTRは、吸収性および分泌性上皮細胞を含む様々な細胞タイプ発現される、cAMPATPに媒介される陰イオンチャネルであり、それは、膜を介する陰イオンの流動および他のイオンチャネルおよびタンパク質活性を制御する。上皮細胞では、正常なCFTRの機能は、呼吸および消化組織を含む体全体の電解輸送の維持に決定的である。CFTRは、各々6個の膜貫通らせんおよびヌクレオチド結合ドメインを含む膜貫通ドメイン縦列反復からなるタンパク質をコードする約1480個のアミノ酸で構成される。2個の膜貫通ドメインは、チャネルの活性および細胞内輸送を制御する複数のリン酸化部位を有する大型で極性制御性(R)−ドメインにより連結されている。

0004

CFTRをコードする遺伝子は、同定され、配列決定された(非特許文献1; 非特許文献2), (非特許文献3参照)。この遺伝子の欠陥は、CFTRに突然変異を引き起こし、ヒトの最も一般的な致死性遺伝疾患である嚢胞性線維症(「CF」)をもたらす。嚢胞性線維症は、米国で約2,500人の新生児につき1人を冒している。一般的な米国の集団内で、1千万人に上る人々が明白な病的作用を伴わずに欠陥遺伝子の単一コピーを有する。対照的に、2つのコピーのCF関連遺伝子を有する個体は、慢性肺疾患を含むCFの衰弱性かつ致死性の作用に苦しんでいる。

0005

嚢胞性線維症の患者において、呼吸上皮内在性に発現されるCFTRにおける突然変異は、頂端の陰イオン分泌の減少を導き、イオンおよび流体の輸送に不均衡をもたらす。結果的な陰イオン輸送の減少は、における粘液蓄積の増強およびそれに伴う微生物感染に貢献し、それは、最終的にCF患者の死亡を引き起こす。呼吸器疾患に加えて、CFの患者は、典型的には胃腸の問題および膵臓機能不全罹患し、それは、処置されなければ、死亡を招く。加えて、嚢胞性線維症の男性の大部分は不妊であり、嚢胞性線維症の女性の間では妊孕性は低い。2コピーのCF関連遺伝子の重篤な作用とは対照的に、単一コピーのCF関連遺伝子を有する個体は、コレラおよび下痢による脱水症に対する耐性の上昇を示し、おそらくこれが集団内でのCF遺伝子の比較的高い頻度説明となる

0006

CF染色体CFTR遺伝子配列分析は、様々な病原性突然変異を明らかにした(非特許文献4; 非特許文献5; および非特許文献6; 非特許文献7)。今日までに、CF遺伝子中に>1000個の病原性突然変異が同定された(非特許文献8)。最も優勢な突然変異は、CFTRアミノ酸配列の508番目フェニルアラニン欠失であり、一般的にΔF508−CFTRと呼ばれる。この突然変異は、嚢胞性線維症の症例の約70%に生じており、重篤な疾患と関連する。他の突然変異には、R117HおよびG551Dが含まれる。

0007

ΔF508−CFTRにおける残基508の欠失は、新生タンパク質の正しい折り畳みを妨げる。これは、この突然変異タンパク質ERから出られなくし、細胞膜に輸送されなくする。結果的に、膜に存在するチャネルの数は、野生型CFTRを発現する細胞で観察されるものよりも遙かに少ない。輸送の障害に加えて、この突然変異は、チャネル開閉の欠陥をもたらす。膜のチャネル数の減少および開閉の欠陥が、一体となって上皮を介する陰イオン輸送の減少を導き、イオンおよび流体の輸送に欠陥を導く(非特許文献9)。しかしながら、研究は、たとえ野生型CFTRよりも低くても、膜中の数が減少したΔF508−CFTRは機能性であることを示した(非特許文献10; Denning et al., supra; 非特許文献11)。ΔF508−CFTRに加えて、輸送、合成および/またはチャネル開閉の欠陥をもたらすCFTRの他の病原性突然変異は、上方または下方制御されて陰イオン分泌を変化させ得、疾患の進行および/または重篤度を改変し得る。

0008

CFTRは陰イオンに加えて様々な分子を輸送するが、この役割(陰イオンの輸送)が、上皮を介するイオンおよび水の輸送の重要なメカニズムにおける1つの要素に相当する。他の要素には、上皮Na+チャネル、ENaC、Na+/2Cl−/K+共輸送体、Na+−K+−ATPaseポンプおよび側底膜K+チャネルが含まれ、これらは細胞への塩素の取り込みを担う。

0009

これらの要素は、一体となって作用し、それらの選択的発現および細胞内での局在により、上皮を介する定方向輸送を達成する。塩素吸収は、頂端膜に存在するENaCおよびCFTR、並びに、細胞の側底表面に発現されるNa+−K+−ATPaseポンプおよびCl−チャネルの協調的活動により起こる。管腔側からの塩素の二次的能動輸送は、細胞内塩素の蓄積を導き、それは、Cl−チャネルを介して受動的に細胞を離れることができ、方向性の輸送をもたらす。側底面のNa+/2Cl−/K+共輸送体、Na+−K+−ATPaseポンプおよび側底膜K+チャネル、並びに、管腔側のCFTRの配置が、管腔側のCFTRを介する塩素の分泌を調和させる。水自体はおそらく決して能動輸送されないので、その上皮を介する流動は、ナトリウムと塩素の総体流により生成される小さい経上皮浸透圧勾配に依存する。

0010

上記の通り、ΔF508−CFTRの残基508の欠失は、新生タンパク質が正しく折り畳まれるのを妨げ、これは、この突然変異タンパク質をERから出られなくし、細胞膜に輸送されなくすると考えられる。結果的に、不十分な量の成熟タンパク質が細胞膜に存在し、上皮組織内の塩素輸送は有意に減少する。実際に、ER機構によるABC輸送体のERプロセシングの欠陥の細胞現象は、CF疾患のみならず、幅広い他の単独疾患(isolated disease)および遺伝疾患の根底にある基礎であると示された。ER機構が機能不全になり得る2つの道筋は、タンパク質のER排出への共役の喪失が分解を導くもの、または、これらの欠陥のある/誤って折り畳まれたタンパク質のER蓄積によるものである[非特許文献12; 非特許文献13; 非特許文献14; 非特許文献15; 非特許文献16]。

0011

(R)−1−(2,2−ジフルオロベンゾ[d][1,3]ジオキソール−5−イル)−N−(1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)−6−フルオロ−2−(1−ヒドロキシ2−メチルプロパン−2−イル)−1H−インドール−5−イル)シクロプロパンカルボキサミドは、特許文献1(該刊行物の全体を出典明示により本明細書の一部とする)に、CFTR活性のモジュレーターとして、従って嚢胞性線維症などのCFTRに媒介される疾患の処置に有用であると開示された。しかしながら、本明細書に記載のシクロアルキルカルボキサミドインドール化合物経済的な製造方法に対する必要性が残っている。

0012

米国特許出願公開第20090131492号明細書

先行技術

0013

Gregory, R. J. et al. (1990) Nature 347:382-386
Rich, D. P. et al. (1990) Nature 347:358-362
Riordan, J. R. et al. (1989) Science 245:1066-1073
Cutting, G. R. et al. (1990) Nature 346:366-369
Dean, M. et al. (1990) Cell 61:863:870
Kerem, B-S. et al. (1989) Science 245:1073-1080
Kerem, B-S et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8447-8451
http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/
Quinton, P. M. (1990),FASEB J. 4: 2709-2727
Dalemans et al. (1991), Nature Lond. 354: 526-528
Pasyk and Foskett (1995), J. Cell. Biochem. 270: 12347-50
Aridor M, et al., Nature Med., 5(7), pp 745- 751 (1999)
Shastry, B.S., et al., Neurochem. International, 43, pp 1-7 (2003)
Rutishauser, J., et al., Swiss Med Wkly, 132, pp 211-222 (2002)
Morello, JP et al., TIPS, 21, pp. 466- 469 (2000)
Bross P., et al., Human Mut., 14, pp. 186-198 (1999)

0014

本発明の要旨
本明細書に記載の通り、本発明は、嚢胞性線維症などのCFTRに媒介される疾患の処置に有用なCFTR矯正物質(corrector)の製造方法を提供する。そのような化合物には、下記の構造:




を有する(R)−1−(2,2−ジフルオロベンゾ[d][1,3]ジオキソール−5−イル)−N−(1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)−6−フルオロ−2−(1−ヒドロキシ−2−メチルプロパン−2−イル)−1H−インドール−5−イル)シクロプロパンカルボキサミド(以後「化合物1」)が含まれる。

0015

化合物1およびその医薬的に許容し得る組成物は、例えば嚢胞性線維症などのCFTRに媒介される疾患の処置またはその重篤度の低減に有用である。化合物1は、実質的な結晶形または無定形などの、いくつかの異なる固体の形態で存在し得る。

0016

本発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用するとき、断りのない限り、以下の定義を適用する。
本明細書で使用する用語「CFTR」は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子または制御活性のあるその突然変異を意味し、ΔF508 CFTRおよびG551D CFTRを含むがこれらに限定されない(例えば、CFTR突然変異には、http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/ 参照)。
本明細書で使用する用語「調節する」は、例えば活性を、測定可能な量で増加または減少させることを意味する。

0017

本明細書で使用する用語「化学的に安定」は、化合物1の固体の形態が、特定の条件、例えば、40oC/75%相対湿度に、特定の期間、例えば、1日間、2日間、3日間、1週間、2週間またはそれ以上にわたり付されたときに、1つまたはそれ以上の異なる化合物に分解しないことを意味する。いくつかの実施態様では、化合物1の固体の形態の25%未満が分解し、いくつかの実施態様では、化合物1の形態の約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約3%未満、約1%未満、約0.5%未満が特定の条件下で分解する。いくつかの実施態様では、検出可能な量の化合物1の固体の形態は分解しない。

0018

本明細書で使用する用語「物理的に安定」は、化合物1の固体の形態が、特定の条件、例えば、40oC/75%相対湿度に、特定の期間、例えば、1日間、2日間、3日間、1週間、2週間またはそれ以上にわたり付されたときに、1つまたはそれ以上の異なる化合物1の物理的形態(例えば、XRPD、DSCなどで測定して異なる固体の形態)に変化しないことを意味する。いくつかの実施態様では、化合物1の固体の形態の25%未満が、特定の条件に付されたときに、1つまたはそれ以上の異なる物理的形態に変化する。いくつかの実施態様では、化合物1の形態の約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約3%未満、約1%未満、約0.5%未満が、特定の条件に付されたときに、1つまたはそれ以上の化合物1の異なる物理的形態に変化する。いくつかの実施態様では、検出可能な量の化合物1の固体の形態は、1つまたはそれ以上の化合物1の異なる物理的形態に変化しない。

0019

本明細書で使用する用語「約」および「およそ」は、組成物または投与形の成分の用量、量または重量パーセントと関連して使用されるとき、特定された用量、量または重量パーセントから得られるものと同等の薬理効果を提供すると当業者により認識される用量、量または重量パーセントを意味する。特に、用語「約」および「およそ」は、当業者により決定される、特定の値に対して許容し得る誤差を意味し、それは、その値がどのように測定または決定されたかに部分的に依存する。ある種の実施態様では、用語「約」および「およそ」は、1、2、3または4の標準偏差を意味する。ある種の実施態様では、用語「約」および「およそ」は、所定の値または範囲の30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%または0.05%以内を意味する。

0020

断りのない限り、本明細書に記載の構造は、その構造のすべての異性体も含むと意図する(例えば、エナンチオマー、ジアスレテオマーおよび幾何(または立体構造));例えば、各不斉中心に対するRおよびS配置、(Z)および(E)二重結合異性体、および、(Z)および(E)立体構造異性体。従って、本化合物の単一の立体化学異性体並びにエナンチオマー、ジアスレテオマーおよび幾何(または立体構造)の混合物は、本発明の範囲内にある。化合物1のすべての互変異性体は、本発明に含まれる。例えば、化合物1は、その両方が本発明に含まれる互変異性体として存在し得る:

0021

加えて、断りのない限り、本明細書に記載の構造は、1個またはそれ以上の同位体的富化された原子の存在によってのみ異なる化合物も含むと意図する。例えば、1個またはそれ以上の水素原子ジュウテリウムまたはトリチウムで置き換えられている、または、1個またはそれ以上の炭素原子が13C−または14C−富化炭素で置き換えられている化合物1は、本発明の範囲内にある。そのような化合物は、例えば、分析ツール生物学的アッセイにおけるプローブ、または、改善された治療プロフィールを有する化合物として有用である。

0022

Pと略される用語「保護基」は、本明細書で使用するとき、後続化学反応における化学選択性を得るために、官能基化学修飾により分子に導入される任意の化学基を表す。アルコール保護基の非限定的な例には、アセチル(Ac)、ベンゾイル(Bz)、ベンジル(Bn)、β−メトキシエトキシメチルエーテルMEM)、ジメトキシトリチルDMT)、メトキシメチルエーテル(MOM)、メトキシトリチル(MMT)、p−メトキシベンジルエーテル(PMB)、ピバロイル(Piv)、テトラヒドロピラニルTHP)、トリチル(Tr)およびトリメチルシリルTMS)が含まれる。ある実施態様では、保護基は、構造−CH2C6H5を有するBnである。

0023

略号「DCM」は、ジクロロメタンを表す。略号「IPA」は、イソプロピルアルコールを表す。略号「DMSO」は、ジメチルスルホキシドを表す。略号「MTBE」は、メチルt−ブチルエーテルを表す。略号「THF」は、テトラヒドロフランを表す。略号「TEA」は、トリエチルアミンを表す。Pd(dba)2中にあるような略号「dba」は、ジベンジリデンアセトンを表す。Pd(dppf)Cl2中にあるような略号「dppf」は、1,1'−ビスジフェニルホスフィノフェロセンを表す。

0024

ある態様では、本発明は、式I:



[式中、各々独立して、
環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアリールまたはヘテロアリール環であり;
R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
Xは、CNまたはCO2Rであり;
Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、
mは、両端を含めて0ないし3の整数である]
の化合物の製造方法を特徴とし、それは、
a)第1の有機溶媒中、式IA



[式中、各々独立して、
環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;
R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、
Halはハライドである]
の化合物を、式IB:



(式中、RJは、水素またはC1−6脂肪族である)
の化合物と反応させ、式IC:



[式中、各々独立して、
環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;
R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
Xは、CNまたはCO2Rであり;
Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、
mは、両端を含めて0ないし3の整数である]
の化合物を形成させる;および、
b)第2の有機溶媒中、化合物ICから−CO2RJ基を除去し、式Iの化合物を形成させる、
の各段階を含む。

0025

他の実施態様では、本発明は、環Aが融合したヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールである上記方法を特徴とする。他の実施態様では、環Aは、



から選択される。他の実施態様では、環Aは、



である。

0026

他の実施態様では、本発明は、XがCNである上記方法を特徴とする。他の実施態様では、XはCO2Etである。
他の実施態様では、本発明は、mが0である上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、RJがC1−6脂肪族である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、RJは−CH2CH3である。
他の実施態様では、本発明は、HalがBrである上記方法を特徴とする。

0027

他の実施態様では、本発明は、第1の有機溶媒が非プロトン性溶媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、第1の有機溶媒は、1,2−ジメトキシエタンジオキサンアセトニトリルトルエンベンゼンキシレン類、メチルt−ブチルエーテル、メチルエチルケトンメチルイソブチルケトンアセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジノン酢酸エチル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドから選択される。他の実施態様では、第1の有機溶媒は、アセトニトリル、トルエン、ベンゼンまたはキシレン類から選択される。他の実施態様では、第1の有機溶媒はトルエンである。

0028

他の実施態様では、本発明は、段階a)が遷移金属触媒の存在下で実施される上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階a)は、パラジウム触媒の存在下で実施される。他の実施態様では、段階a)は、酢酸パラジウム(II)、Pd(dppf)Cl2、Pd(dba)2、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(0)またはトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)から選択されるパラジウム触媒の存在下で実施される。他の実施態様では、段階a)は、Pd(dba)2の存在下で実施される。

0029

他の実施態様では、本発明は、段階a)が約50℃ないし90℃で実施される上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階a)は、約60℃ないし80℃で実施される。他の実施態様では、段階a)は、約70℃で実施される。

0030

他の実施態様では、本発明は、第2の有機溶媒が非プロトン性溶媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、第2の有機溶媒は、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、ベンゼン、キシレン類、メチルt−ブチルエーテル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジノン、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドから選択される。他の実施態様では、第2の有機溶媒はジメチルスルホキシドである。

0031

他の実施態様では、本発明は、段階b)が無機酸の存在下で実施される上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階b)は、塩酸硫酸硝酸リン酸またはホウ酸から選択される無機酸の存在下で実施される。他の実施態様では、段階b)は、塩酸の存在下で実施される。

0032

他の実施態様では、本発明は、段階b)が約55℃ないし95℃で実施される上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階b)は、約65℃ないし85℃で実施される。他の実施態様では、段階b)は、約75℃で実施される。

0033

他の態様では、本発明は、式II:



[式中、各々独立して、
環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;
Halは、ハライドであり;
R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、
nは、両端を含めて1ないし4の整数である]
の化合物の製造方法を特徴とし、それは、
a)第1の有機溶媒中、式IIA



[式中、各々独立して、
環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;
R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、
Halはハライドである]
の化合物を、式IIB:



[式中、
Xは、CNまたはCO2Rであり;
Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、
RJは、水素またはC1−6脂肪族である]
の化合物と反応させ、式IIC:



[式中、各々独立して:
環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;
R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
Xは、CNまたはCO2Rであり;
Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、
mは、両端を含めて0ないし3の整数である]
の化合物を形成させる、
b)第2の有機溶媒中、化合物IICから−CO2RJ基を除去し、式I:



[式中、各々独立して、
環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;
R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
Xは、CNまたはCO2Rであり;
Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、
mは、両端を含めて0ないし3の整数である]
の化合物を形成させる、
c)塩基の存在下で、式Iの化合物を、式IID



[式中、各々独立して、
Halはハライドであり;そして、
qは、両端を含めて0ないし3の整数である]
の化合物と反応させ、式IIE



[式中、各々独立して、
環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;
R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;
Xは、CNまたはCO2Rであり;
Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、
nは、両端を含めて1ないし4の整数である]
の化合物を生成させる、
d)式IIEの化合物を、水酸化物塩基および酸と連続的に反応させ、式IIF:



[式中、各々独立して:
環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;
R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、
nは、両端を含めて1ないし4の整数である]
の化合物を生成させる、および、
e)式IIFの化合物を、ハロゲン化剤と、第3の有機溶媒中で反応させ、式IIの化合物を形成させる、
の各段階を含む。

0034

他の実施態様では、本発明は、段階a)において、第1の有機溶媒が非プロトン性溶媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、第1の有機溶媒は、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、ベンゼン、キシレン類、メチルt−ブチルエーテル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジノン、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドから選択される。他の実施態様では、第1の有機溶媒はトルエンである。

0035

他の実施態様では、本発明は、段階a)において、mが0である上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、段階a)において、HalがBrである上記方法を特徴とする。

0036

他の実施態様では、本発明は、段階a)において、環Aが融合した複素環またはヘテロアリール環である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、環Aは、



から選択される。他の実施態様では、環Aは、



である。

0037

他の実施態様では、本発明は、段階a)において、XがCNである上記方法を特徴とする。他の実施態様では、XはCO2Etである。
他の実施態様では、本発明は、段階a)において、RJがEtである上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、式IICにおいて、環Aが



であり、mが0であり、XがCNであり、そして、RJがEtである上記方法を特徴とする。

0038

他の実施態様では、本発明は、段階b)において、第2の溶媒が非プロトン性溶媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、第2の溶媒は、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、ベンゼン、キシレン類、メチルt−ブチルエーテル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジノン、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドから選択される。他の実施態様では、第2の溶媒は、ジメチルスルホキシドである。

0039

他の実施態様では、本発明は、式I中、環Aが



であり、mが0であり、XがCNである、上記方法を特徴とする。

0040

他の実施態様では、本発明は、段階c)において、塩基が無機塩基である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、塩基は、水酸化物である。他の実施態様では、塩基は、NaOHである。

0041

他の実施態様では、本発明は、式IIDにおいて、qが1である上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、式IIDにおいて、一方のHalがClであり、他方のHalがBrである、上記方法を特徴とする。

0042

他の実施態様では、本発明は、段階d)において、塩基がNaOHである上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階d)において、酸はHClである。
他の実施態様では、本発明は、段階d)において、水酸化物塩基との反応を約60℃ないし100℃で行う上記方法を特徴とする。他の実施態様では、水酸化物との反応は、約70℃ないし90℃で行う。他の実施態様では、水酸化物との反応は、約80℃で行う。

0043

他の実施態様では、本発明は、式IIEにおいて、環Aが



であり、mが0であり、nが1であり、XがCNである、上記方法を特徴とする。

0044

他の実施態様では、本発明は、段階e)において、第3の有機溶媒が非プロトン性溶媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階e)において、第3の有機溶媒は、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、ベンゼン、キシレン類、メチルt−ブチルエーテル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジノン、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドから選択される。他の実施態様では、段階e)において、第3の有機溶媒はトルエンである。

0045

他の実施態様では、本発明は、段階e)において、ハロゲン化剤がSOCl2である上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、段階e)を約40℃ないし80℃で行う上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階e)は、約50℃ないし70℃で行う。他の実施態様では、段階e)は、約60℃で行う。

0046

他の実施態様では、本発明は、式IIFにおいて、環Aが



であり、mが0であり、nが1である上記方法を特徴とする。

0047

他の実施態様では、本発明は、式IIにおいて、環Aが



であり、mが0であり、nが1であり、HalがClである上記方法を特徴とする。

0048

他の態様では、本発明は、式III



[式中、各々独立して、
R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
R3は、OH、OP、−O−C1−6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、−O−アリールまたは−O−ヘテロアリールにより置換されていることもあるC1−6脂肪族であり;
Pは、保護基であり;そして、
oは、0ないし3の整数である]
の化合物の製造方法を特徴とし、それは、
a)式IIIA:



[式中、各々独立して、
R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;そして、
oは、0ないし3の整数である]
の化合物を、ハロゲン化剤と、第1の有機溶媒中で反応させ、式IIIB:



[式中、各々独立して、
R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
oは、0ないし3の整数であり;そして、
Halはハライドである]
の化合物を形成させる、
b)式IIIBの化合物を、第2の有機溶媒中、式IIIC:



[式中、Pは保護基である]
の化合物と反応させ、続いて、還元および酸処理により、式IIID:



[式中、
R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
oは、0ないし3の整数であり;
Halはハライドであり;
Pは保護基であり;そして、



は陰イオンである]
の化合物を形成させる、
c)式IIIDの化合物を、塩基の存在下で中和し、式IIID−a:



[式中、
R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
oは、0ないし3の整数であり;
Halはハライドであり;そして、
Pは保護基である]
の化合物を形成させる、
d)式IIID−aの化合物を、第3の溶媒中で、式IIIE:



[式中、各々独立して:
R3は、OH、OP、−O−C1−6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、−O−アリールまたは−O−ヘテロアリールにより置換されていることもあるC1−6脂肪族である]
の化合物と、触媒の存在下で反応させ、式IIIの化合物を形成させる、
の各段階を含む。

0049

他の実施態様では、本発明は、式IIIAにおいて、oが1である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、oは1であり、R2はFである。

0050

他の実施態様では、本発明は、段階a)において、ハロゲン化剤がN−ブロモスクシンイミドである上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、段階a)において、第1の有機溶媒が非プロトン性溶媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、第1の有機溶媒は、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、ベンゼン、キシレン類、メチルt−ブチルエーテル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジノン、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドから選択される。他の実施態様では、第1の有機溶媒は酢酸エチルである。

0051

他の実施態様では、本発明は、段階a)を約2℃ないし42℃で行う上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階a)は、約12℃ないし32℃で行う。他の実施態様では、段階a)は、約22℃で行う。

0052

他の実施態様では、本発明は、式IIIBにおいて、oが1であり、R2がFであり、HalがBrである上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、式IIICにおいて、Pがベンジルである上記方法を特徴とする。

0053

他の実施態様では、本発明は、段階b)において、第2の有機溶媒が非プロトン性溶媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階b)において、第2の有機溶媒は、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、ベンゼン、キシレン類、メチルt−ブチルエーテル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジノン、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドから選択される。他の実施態様では、段階b)において、第2の有機溶媒はトルエンである。

0054

他の実施態様では、本発明は、段階b)において、式IIICの化合物との反応を約60℃ないし100℃で行う上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階b)において、式IIICの化合物との反応は、約70℃ないし90℃で行う。他の実施態様では、段階b)において、式IIICの化合物との反応は約80℃で行う。

0055

他の実施態様では、本発明は、段階b)において、還元を水素で実施する上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、段階b)において、酸がp−トルエンスルホン酸である上記方法を特徴とする。

0056

他の実施態様では、本発明は、式IIIDにおいて、oが1であり、R2がFであり、HalがBrであり、A−がTos−であり、Pがベンジルである上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、式IIIEにおいて、R3がC(CH3)2CH2O(ベンジル)である上記方法を特徴とする。

0057

他の実施態様では、本発明は、段階c)において、塩基が無機塩基である上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、段階c)において、塩基がNaHCO3である上記方法を特徴とする。

0058

他の実施態様では、本発明は、段階d)において、第3の有機溶媒が非プロトン性溶媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階d)において、第3の有機溶媒は、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、ベンゼン、キシレン類、メチルt−ブチルエーテル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジノン、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドから選択される。他の実施態様では、段階d)において、第3の有機溶媒はアセトニトリルである。

0059

他の実施態様では、本発明は、段階d)を約60℃ないし100℃で行う上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階d)は、約70℃ないし90℃で行う。他の実施態様では、段階d)は約80℃で行う。

0060

他の実施態様では、本発明は、段階d)において、触媒がパラジウム触媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階d)において、触媒は、酢酸パラジウム(II)、Pd(dppf)Cl2、Pd(dba)2、(MeCN)2PdCl2、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)またはトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)から選択される。他の実施態様では、段階d)において、触媒は酢酸パラジウム(II)である。

0061

他の態様では、本発明は、式IV



[式中、各々独立して、
環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;
R1およびR2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
R3は、OH、OP、−O−C1−6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、−O−アリールまたは−O−ヘテロアリールで置換されていることもあるC1−6脂肪族であり;
Pは保護基であり;
mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;
nは、両端を含めて1ないし4の整数であり;そして、
oは、両端を含めて1ないし3の整数である]
の化合物の製造方法を特徴とし、それは、
a)式IIIA:



[式中、各々独立して、
R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;そして、
oは、両端を含めて0ないし3の整数である]
の化合物を、ハロゲン化剤と、第1の有機溶媒中で反応させ、式IIIB:



[式中、各々独立して:
R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
oは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、
Halはハライドである]
の化合物を形成させる、
b)式IIIBの化合物を、第2の有機溶媒中、式IIIC:



[式中、Pは保護基である]
の化合物と反応させ、続いて、還元および酸処理により、式IIID:



[式中、
R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
oは、両端を含めて0ないし3の整数であり;
Halはハライドであり;
Pは保護基であり;そして



は陰イオンである]
の化合物を形成させる、
c)式IIIDの化合物を、塩基の存在下で中和し、式IIID−a:



[式中、
R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
oは、両端を含めて0ないし3の整数であり;
Halはハライドであり;そして、
Pは保護基である]
の化合物を形成させる、
d)式IIIDの化合物を、第3の有機溶媒中、式IIIE:



[式中、各々独立して、
R3は、OH、OP、−O−C1−6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、−O−アリールまたは−O−ヘテロアリールで置換されていることもあるC1−6脂肪族である]
の化合物と、触媒の存在下で反応させ、式III:



[式中、各々独立して:
R2は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJであり;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
R3は、OH、OP、−O−C1−6脂肪族、アリール、ヘテロアリール、−O−アリールまたは−O−ヘテロアリールで置換されていることもあるC1−6脂肪族であり;
Pは保護基であり;そして、
oは、両端を含めて0ないし3の整数である]
の化合物を形成させる、
e)式IIIの化合物を、第4の有機溶媒中、式II:



[式中、各々独立して:
環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;
Halはハライドであり;
R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
mは、両端を含めて0ないし3の整数であり;そして、
nは、両端を含めて1ないし4の整数である]
の化合物と反応させ、式IVの化合物を形成させる、
の各段階を含む。

0062

他の実施態様では、本発明は、式IVにおいて、環Aが、



から選択される上記方法を特徴とする。他の実施態様では、式IVにおいて、環Aは、



である。

0063

他の実施態様では、本発明は、式IVにおいて、mが0である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、式IVにおいて、nは1である。他の実施態様では、式IVにおいて、oは1であり、R2はFである。
他の実施態様では、本発明は、式IVにおいて、Pがベンジルである上記方法を特徴とする。

0064

他の実施態様では、本発明は、式IVにおいて、R3がOPにより置換されていることもあるC4脂肪族である、上記方法を特徴とする。他の実施態様では、式IVにおいて、R3は



である。他の実施態様では、式IVにおいて、R3は



である。

0065

他の実施態様では、本発明は、式IVにおいて、環Aが



であり、mが0であり、nが1であり、oが1であり、R2がFであり、Pがベンジルであり、R3が



である、上記方法を特徴とする。

0066

他の実施態様では、本発明は、段階a)において、ハロゲン化剤がN−ブロモスクシンイミドである上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、段階a)において、第1の有機溶媒が非プロトン性溶媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階a)において、第1の有機溶媒は、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、ベンゼン、キシレン類、メチルt−ブチルエーテル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジノン、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドから選択される。他の実施態様では、段階a)において、第1の有機溶媒は酢酸エチルである。

0067

他の実施態様では、本発明は、段階a)を、約2℃ないし42℃で行う上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階a)は、約12℃ないし32℃で行う。他の実施態様では、段階a)は、約22℃で行う。

0068

他の実施態様では、本発明は、式IIIBにおいて、oが1であり、R2がFであり、HalがBrである上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、式IIICにおいて、Pがベンジルである上記方法を特徴とする。

0069

他の実施態様では、本発明は、段階b)において、第2の有機溶媒が非プロトン性溶媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階b)において、第2の有機溶媒は、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、ベンゼン、キシレン類、メチルt−ブチルエーテル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジノン、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドから選択される。他の実施態様では、段階b)において、第2の有機溶媒はトルエンである。

0070

他の実施態様では、本発明は、段階b)において、式IIICの化合物との反応を約60℃ないし100℃で行う上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階b)において、式IIICの化合物との反応は、約70℃ないし90℃で行う。他の実施態様では、段階b)において、式IIICの化合物との反応は、約80℃で行う。

0071

他の実施態様では、本発明は、段階b)において、還元を水素で実施する上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、段階b)において、酸がp−トルエンスルホン酸である上記方法を特徴とする。

0072

他の実施態様では、本発明は、式IIIDにおいて、oが1であり、R2がFであり、HalがBrであり、A−がTos−であり、Pがベンジルである上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、式IIIEにおいて、R3がC(CH3)2CH2O(ベンジル)である上記方法を特徴とする。

0073

他の実施態様では、本発明は、段階c)において、塩基が無機塩基である上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、段階c)において、塩基がNaHCO3である上記方法を特徴とする。

0074

他の実施態様では、本発明は、段階d)において、第3の有機溶媒が非プロトン性溶媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階d)において、第3の有機溶媒は、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、ベンゼン、キシレン類、メチルt−ブチルエーテル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジノン、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドから選択される。他の実施態様では、段階d)において、第3の有機溶媒はアセトニトリルである。

0075

他の実施態様では、本発明は、段階d)を約60℃ないし100℃で行う上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階d)は、約70℃ないし90℃で行う。他の実施態様では、段階d)は、約80℃で行う。

0076

他の実施態様では、本発明は、段階d)において、触媒がパラジウム触媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階d)において、触媒は、酢酸パラジウム(II)、Pd(dppf)Cl2、Pd(dba)2、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)またはトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)から選択される。他の実施態様では、段階d)において、触媒は酢酸パラジウム(II)である。

0077

他の実施態様では、本発明は、段階e)において、環Aが



であり、mが0であり、nが1であり、HalがClである上記方法を特徴とする。

0078

他の実施態様では、本発明は、段階e)において、第4の有機溶媒が非プロトン性溶媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階e)において、第4の有機溶媒は、1,2−ジメトキシエタン、ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、ベンゼン、キシレン類、メチルt−ブチルエーテル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、アセトン、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリジノン、酢酸エチル、ジクロロメタンまたはジメチルスルホキシドから選択される。他の実施態様では、段階e)において、第4の有機溶媒はジクロロメタンである。

0079

他の実施態様では、本発明は、段階e)を約−20℃ないし20℃で行う上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階e)は、約−10℃ないし10℃で行う。他の実施態様では、段階e)は、約0℃で行う。

0080

他の実施態様では、本発明は、段階e)において、式IIの化合物を、酸前駆物質ハロゲン化することによりインサイチュ(in situ)で製造し、単離せずに式IIIの化合物と反応させる、上記方法を特徴とする。

0081

他の実施態様では、本発明は、2個の保護基を式IVの化合物から除去し、式IVA



の化合物を形成させることをさらに含む、上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、保護基を水素化により除去する。

0082

他の態様では、本発明は、化合物1:



の製造方法を特徴とし、それは、
a)化合物2:



を、ブロム化剤と反応させ、化合物3:



を形成させる、
b)化合物3を化合物4:



と反応させ、続いて還元し、化合物5:



を形成させ、続いて、化合物5を塩基で中和し、化合物5a:



を得る、
c)化合物5aを化合物6:



と、触媒の存在下で反応させ、化合物7:



を形成させる、
d)化合物7を、化合物8:



と反応させ、化合物9:



を形成させる、および、
e)2個のBn保護基を除去し、化合物1を形成させる、
の各段階を含む。

0083

他の実施態様では、本発明は、段階a)において、ブロム化剤がN−ブロモスクシンイミドである上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、段階b)において、還元を水素で実施する上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、段階b)において、塩基が無機塩基である上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、段階b)において、塩基がNaHCO3である上記方法を特徴とする。

0084

他の実施態様では、本発明は、段階c)において、触媒がパラジウム触媒である上記方法を特徴とする。他の実施態様では、段階c)において、触媒は、酢酸パラジウム(II)、Pd(dppf)Cl2、Pd(dba)2、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)またはトリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)から選択される。他の実施態様では、段階c)において、触媒は酢酸パラジウム(II)である。

0085

他の実施態様では、本発明は、段階d)において、酸前駆物質を単離せずにハロゲン化することにより、化合物8をインサイチュで製造する、上記方法を特徴とする。
他の実施態様では、本発明は、段階e)において、Bn保護基を水素化により除去する上記方法を特徴とする。

0086

他の態様では、本発明は、式23:



[式中、
環Aは、融合したシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール環であり;
R1は、−RJ、−ORJ、−N(RJ)2、−NO2、ハロゲン、−CN、−C1−4ハロアルキル、−C1−4ハロアルコキシ、−C(O)N(RJ)2、−NRJC(O)RJ、−SORJ、−SO2RJ、−SO2N(RJ)2、−NRJSO2RJ、−CORJ、−CO2RJ、−NRJSO2N(RJ)2、−COCORJから独立して選択され;
RJは、水素またはC1−6脂肪族であり;
Xは、CNまたはCO2Rであり;
Rは、C1−6脂肪族またはアリールであり;そして、
mは、両端を含めて0ないし3の整数である]
の化合物を特徴とする。

0087

他の実施態様では、本発明は、式23の化合物およびこれに付随する定義を特徴とし、ここで、環Aは、融合したヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールである。他の実施態様では、環Aは、



から選択される。他の実施態様では、環Aは、



である。

0088

他の実施態様では、本発明は、式23の化合物およびそれに付随する定義を特徴とし、ここで、XはCNである。他の実施態様では、XはCO2Etである。
他の実施態様では、本発明は、式23の化合物およびそれに付随する定義を特徴とし、ここで、mは0である。
他の実施態様では、本発明は、式23の化合物およびそれに付随する定義を特徴とし、ここで、RJはC1−6脂肪族である。他の実施態様では、RJは−CH2CH3である。

0089

他の態様では、本発明は、化合物



を特徴とする。

0090

他の態様では、本発明は、化合物



を特徴とする。

0091

式I、II、IIIおよびIVの化合物の製造方法
式I、II、IIおよびIVの化合物は、スキーム1−3の方法により製造し得る。
スキーム1. 式IおよびIIの化合物



a=Pd(0)触媒;b=酸;c=塩基;d=水酸化物塩基;e=酸;f=ハロゲン化剤;
式中、環A、R1、m、X、RJ、Hal、qおよびnは、上記定義の通りである。

0092

スキーム1中、ハロゲン化アリールIAを、エステルIBと、遷移金属触媒の存在下、適する溶媒(例えば、トルエン)中で反応させ、エステルICを製造する。エステルIBおよびIC中、Xは、CNまたはCO2Rであり得る。ICを適する溶媒(例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO))中、酸で処理し、Iを製造する。Iをジハロゲン化物IIDと塩基の存在下で反応させ、シクロアルキリデンIIEを得る。シアン化物または残っているエステル基(Xの実体による)の加水分解により、カルボン酸IIFを得、それをハロゲン化し、酸ハロゲン化物IIを得る。

0093

ある実施態様では、IAは購入できる。ある実施態様では、環Aは、5員のジオキシル環である。ある実施態様では、IA中のHalはBrである。ある実施態様では、IAおよびIIBの反応は、トルエン中、Pd(0)触媒、例えばPd(dba)2の存在下で行う。さらなる実施態様では、この反応は、アルキルホスフィン、例えばt−Bu3P、および、リン酸塩、例えばNa3PO4の存在下で行う。他の実施態様では、IAおよびIIBの反応は、約70℃で行う。他の実施態様では、RJはEtである。

0094

ある実施態様では、ICのIへの脱エステル化は、無機酸を用いて行う。さらなる実施態様では、無機酸はHClである。この変換は、適当な非プロトン性溶媒(例えば、DMSO)中、約75℃で行う。

0095

ある実施態様では、IをNaOHおよびジハロゲンアルキルと反応させ、シクロアルキリデンを適する溶媒(例えばMTBE)中に得る。この方法は、適当なジハロゲン化アルキルを選択することにより、いくつかのスピロ環式環に適用できる。例えば、Iを、例えば1−ブロモ−3−クロロプロパンと反応させることにより、スピロ環ブタン環を製造できる。反応の熱力学がより好ましいと考えられるので、混合されたブロモおよびクロロジハロゲン化物が、経済的スケールで最も良好に機能することが見出された。

0096

ある実施態様では、IIEは、水および塩基(例えばNaOH)の存在下、適する溶媒(例えば、エタノール)中、カルボン酸IIFに加水分解される。続いて、HClなどの酸による処理により、IIFを得る。他の実施態様では、IIFを、トルエンから再結晶することにより後処理する。

0097

ある実施態様では、IIFをIIに変換するハロゲン化剤は、塩化チオニルである。他の実施態様では、塩化チオニルを、トルエン中、約60℃でIIFに添加する。ある実施態様では、この段階はIIとアミンIIIのカップリング(下記参照)に直接進み、同じ反応容器中で実施される。

0098

スキーム1および上記または本願の他の箇所に記載の実施態様に従ってIIを形成させることには、いくつかの非限定的な利点がある。これらの利点は、IIを経済的スケールで製造するときに一層明白であり、以下のものを含む。総合的反応に5段階しか要さず、これは、以前に報告されたもの(即ち、アリールカルボン酸から出発し、メチルアルコールに還元し、塩化メチルに変換し、NaCNと反応させる)よりも少ない。この合成経路は、CNまたはエステル基(即ち、X)を、別個塩素化反応を伴わずに導入する。IIEのIIFへの加水分解の共溶媒としてエタノールを使用することは、均一な反応混合物をもたらし、反応のサンプリングおよびモニタリングをより容易にする。IIFをトルエンから再結晶することは、以前に報告されたようにジシクロヘキシルアミン(DCA)塩を形成する必要性を排除する。

0099

スキーム2. 式IIIの化合物



a=ハロゲン化剤;b=Zn(II)触媒;c=H2、Pt;d=酸;e=塩基;f=Pd(II)触媒;
式中、R2、o、Hal、



およびPは、上記定義の通りである。

0100

ある実施態様では、IIIA中、R2はFであり、アミン基に対してメタである。他の実施態様では、IIIAを、N−ブロモスクシンイミドで、適する溶媒(例えば酢酸エチル)中、約22℃でブロム化する。

0101

他の実施態様では、IIIBをエポキシドIIICと反応させ、開環反応をIIIBのアミン基で実施し、IIIDを形成させる。ある実施態様では、IIIC中の保護基Pはベンジル(Bn)である。他の実施態様では、エポキシドIIICはキラルである。ある実施態様では、IIICは(R)IIICである。他の実施態様では、IIICは(S)IIICである。ある実施態様では、開環反応は、適当な溶媒(例えばトルエン)中、約80℃で実施する。他の実施態様では、開環反応は、Zn(II)触媒(例えばZn(ClO4)2)の存在下で実施する。他の実施態様では、IIIBからIIIDへの変換は、エポキシドIIICによる開環反応と、続く水素化、および、その後のIIIDを形成させる酸処理を含む。さらなる実施態様では、水素化は、H2/Pt(S)/Cを用いて実施する。さらなる実施態様では、



トシレート陰イオンであるように、酸はトルエンスルホン酸である。

0102

他の実施態様では、アルキンIIIEを、IIIDと、適する溶媒(例えばアセトニトリル)中、約80℃でカップリングする。他の実施態様では、このカップリング反応は、Pd(II)触媒、例えばPd(OAc)2の存在下で行う。最初の反応は閉環をもたらさず、IIID上のハライドを置き換えるのみである。閉環は、別のPd(II)触媒、例えば(MeCN)2PdCl2を、適する溶媒(例えばアセトニトリル)中で用いる反応を介して達成される。ある実施態様では、閉環は、約80℃で行う。ある実施態様では、アルキンIIIE中のR3は、−C(CH3)2CH2OBnである。ある実施態様では、カップリング反応の生成物を単離せず、アセトニトリルに取り、(MeCN)2PdCl2と反応させる。

0103

スキーム2および上記および本願の他の箇所に記載の実施態様に従って化合物IIIを形成させることには、いくつかの非限定的な利点がある。これらの利点は、IIIを経済的スケールで製造するときに一層明白であり、以下のものを含む。総合的な段階の数が、以前に開示されたものと比較して、ほんの3段階に減らされた。他の利点には、クロマトグラフィーおよび保護基由来副生成物の排除が含まれる。

0104

スキーム3. 式IVの化合物



a=ハロゲン化剤;b=非プロトン性溶媒;
式中、環A、R1、m、n、hal、R2、o、PおよびR3は、上記定義の通りである。

0105

適当な溶媒(例えばジクロロメタン(DCM))中でのIIとIIIの酸−塩基反応は、化合物1の保護されたアナログをもたらす。ある実施態様では、酸ハロゲン化物IIを、スキーム1に記載の通りに同じ反応容器中でIIFから製造し、単離しない。他の実施態様では、酸をベースとする反応を、トリエチルアミン(TEA)などの塩基の存在下で実施する。ある実施態様では、TEAの量は、IIに対して2当量である。ある実施態様では、約0℃で約4時間の反応時間、そして、室温に終夜温めた後、水を混合物に添加し、さらに30分間撹拌する。有機相を分離し、反応溶媒を留去することによりIVを単離する。ある実施態様では、IVをシリカパッドでの濾過により回収する。

0106

他の実施態様では、スキーム4に従い、式IVの化合物を脱保護し、式IVaの化合物を形成し得る。
スキーム4. 式IVの化合物の脱保護



a=H2/Pd/C;
式中、環A、R1、m、n、R2、o、R3およびPは、上記定義の通りである。

0107

ある実施態様では、水素加圧は3Barである。他の実施態様では、水素化の撹拌速度を800rpmに高める。他の実施態様では、急速な水素取り込みが静まった後、水素化容器を約50℃に2日間加熱する。他の実施態様では、この2日間の後、さらなる触媒を添加し、水素化をさらに4日間継続する。他の実施態様では、IVを適する溶媒(例えばTHF)に溶解する。

0108

他の実施態様では、スキーム5に従い、酸ハロゲン化物部分7を、アミン部分8とカップリングし、化合物9を形成させ、続いて脱保護することにより、化合物1を製造し得る。
スキーム5. 化合物1の製造

0109

ここで、化合物7は、スキーム6に従い製造する。
スキーム6

0110

ここで、化合物8は、スキーム7に従い製造する。
スキーム7

0111

使用、製剤および投与
医薬的に許容し得る組成物
本発明の他の態様では、医薬的に許容し得る組成物が提供され、これらの組成物は、本明細書に記載の化合物1形態Aまたは無定形の化合物1を含み、医薬的に許容し得る担体補助剤または媒体を含むこともある。ある種の実施態様では、これらの組成物は、1種またはそれ以上のさらなる治療剤をさらに含むこともある。

0112

上記の通り、本発明の医薬的に許容し得る組成物は、医薬的に許容し得る担体、補助剤または媒体をさらに含み、これらは、本明細書で使用するとき、所望の特定の投与形に適するように、任意かつすべての溶媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散または懸濁助剤界面活性剤等張化剤増粘剤または乳化剤保存料固体結合剤滑沢剤などを含む。Remington's Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) は、医薬的に許容し得る組成物の製剤化において使用される様々な担体およびそれを製造するための既知技法を開示している。例えば、望まれない生物学的作用を奏することにより、または、その他の方法で医薬的に許容し得る組成物の任意の他の成分と有害に相互作用することにより、任意の従来の担体媒体が本発明の化合物と不適合でない限り、その使用は本発明の範囲内にあると企図される。医薬的に許容し得る担体として供し得る物質の例には、イオン交換剤アルミナステアリン酸アルミニウムレシチン血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンバッファー物質、例えば、リン酸塩、グリシンソルビン酸またはソルビン酸カリウム飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミンリン酸水素二ナトリウムリン酸水素カリウム塩化ナトリウム亜鉛塩コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウムポリビニルピロリドンポリアクリレートワックスポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー羊毛脂、糖、例えば、ラクトースグルコースおよびスクロースデンプン、例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプンセルロースおよびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロースエチルセルロースおよび酢酸セルロース粉末トラガカント麦芽ゼラチンタルク賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤用ワックス;油、例えば、落下精油綿実油ベニバナ油ゴマ油オリーブ油トウモロコシ油およびダイズ油グリコール;例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール;エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルアガー緩衝化剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムアルギン酸パイロジェン含水等張塩水;リンガー液エチルアルコールおよびリン酸緩衝溶液が含まれるが、これらに限定されず、他の非毒性の適合性の滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、並びに、着色剤離型剤(releasing agent)、被覆剤甘味料香味料、保存料および抗酸化剤も、製剤化する者の判断に従って、組成物中に存在できる。

0113

化合物および医薬的に許容し得る組成物の使用
また他の態様では、本発明は、CFTRに関係する症状、疾患または障害の処置方法を提供する。ある実施態様では、本発明は、CFTR活性の欠損に関係する症状、疾患または障害の処置方法を提供し、その方法は、本明細書に記載の化合物1を含む組成物を、それを必要としている対象、好ましくは哺乳動物に投与することを含む。

0114

本明細書で使用する「CFTRに媒介される疾患」は、嚢胞性線維症、喘息喫煙誘起されるCOPD、慢性気管支炎副鼻腔炎便秘症膵炎膵機能不全精管先天性両側性欠如(CBAVD)に起因する男性の不妊症、軽度の肺疾患特発性膵炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA)、肝疾患遺伝性肺気腫遺伝性ヘモクロマトーシス凝固線維素溶解の欠損、例えば、プロテインC欠乏症I型遺伝性血管浮腫、脂質処理の欠損、例えば、家族性高コレステロール血症、I型カイロミクロン血症無βリポタンパク質血症リソソーム蓄積症、例えば、I細胞病偽性ハーラー、ムコ多糖症サンドホフ病/テイサックス病、クリグラー・ナジャー症候群II型多腺性内分泌障害高インスリン血症糖尿病、ラロン低身長症ミエロペルオキシダーゼ欠損症原発性副甲状腺機能低下症メラノーマ、I型グリカノシス(glycanosis)CDS、先天性甲状腺機能亢進症骨形成不全症、遺伝性低フィブリノーゲン血症、ACT欠乏症、尿崩症(DI)、神経骨端軟骨性(neurophyseal)DI、腎性DI、シャルコー・マリー・トゥース症候群、ペリツェウスメルツバッヘル病、神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病パーキンソン病筋萎縮性側索硬化症進行性核上性麻痺ピック病、いくつかのポリグルタミン神経障害、例えば、ハンチントン病脊髄小脳失調症1型球脊髄性筋萎縮症歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症および筋緊張性ジストロフィー、並びに、海綿状脳症、例えば、遺伝性クロイツフェルトヤコブ病プリオンタンパク質処理の欠陥による)、ファブリー病、シュトロイスラー・シャインカー症候群、COPD、ドライアイ症またはシェーグレン症、骨粗鬆症骨減少症、骨の治癒および骨の成長(骨の修復骨再生骨吸収の減少および骨沈着の増加を含む)、ゴーハム(Gorham)症候群、塩素チャネル病、例えば、先天性筋強直症トムソンおよびベッカー型(Thomson and Becker forms))、III型バーター症候群デント病、過剰驚愕症、てんかん、過剰驚愕症、リソソーム蓄積症、アンジェルマン症候群、および、原発性線毛機能不全(PCD)(内臓逆位を伴うPCD(カルタゲナー症候群としても知られる)、内臓逆位を伴わないPCDおよび繊毛形成不全を含む、繊毛の構造および/または機能の遺伝性障害の用語)から選択される疾患である。他の実施態様では、CFTRに媒介される疾患は、嚢胞性線維症、肺気腫、COPDまたは骨粗鬆症である。他の実施態様では、CFTRに媒介される疾患は、嚢胞性線維症である。

0115

ある実施態様では、本発明は、有効量の本明細書に記載の化合物1を含む組成物をヒトに投与する段階を含む、ヒトのCFTRに媒介される疾患の処置方法を提供する。

0116

本発明によると、化合物1形態Aまたは無定形の化合物1またはその医薬的に許容し得る組成物の「有効量」は、上記の疾患のいずれかを処置するか、またはその重篤度を低減するのに有効な量である。

0117

化合物1またはその医薬的に許容し得る組成物は、上記の疾患の1つまたはそれ以上を処置するか、またはその重篤度を低減するのに有効な任意の量および任意の投与経路を使用して投与し得る。

0118

ある実施態様では、本明細書に記載の化合物1またはその医薬的に許容し得る組成物は、呼吸および非呼吸上皮の頂端膜の残存CFTR活性を示す患者における、嚢胞性線維症の処置またはその重篤度の低減に有用である。上皮表面の残存CFTR活性の存在は、当分野で知られている方法、例えば、標準的な電気生理学生化学または組織化学的技法をを使用して、容易に検出できる。そのような方法は、インビボまたはエクスビボ電気生理学的技法、または唾液のCl−濃度の測定、または、細胞表面密度をモニタリングするエクスビボの生化学または組織化学的技法を使用して、CFTR活性を同定する。最も一般的な突然変異であるΔF508についてヘテロ接合型またはホモ接合型の患者を含む、様々な異なる突然変異についてヘテロ接合型またはホモ接合型の患者において、そのような方法を使用して、残存CFTR活性を容易に検出できる。

0119

ある実施態様では、本明細書に記載の化合物1またはその医薬的に許容し得る組成物は、残存CFTR活性を示すある種の遺伝子型、例えば、クラスIII突然変異(制御または開閉の障害)、クラスIV突然変異(コンダクタンスの変化)またはクラスV突然変異(合成の減少)(Lee R. Choo-Kang, Pamela L., Zeitlin, Type I, II, III, IV, and V cystic fibrosis Tansmembrane Conductance Regulator Defects and Opportunities of Therapy; Current Opinion in Pulmonary Medicine 6:521 - 529, 2000)の患者における、嚢胞性線維症の処置またはその重篤度の低減に有用である。残存CFTR活性を示す他の患者の遺伝子型には、これらのクラスの1つについてホモ接合型、または、クラスI突然変異、クラスII突然変異またはクラス分類のない突然変異を含む任意の他のクラスの突然変異とのヘテロ接合型の患者が含まれる。

0120

ある実施態様では、本明細書に記載の化合物1またはその医薬的に許容し得る組成物は、ある種の臨床的表現型、例えば、上皮の頂端膜における残存CFTR活性の量に典型的に相関する中度ないし軽度の臨床的表現型の患者における、嚢胞性線維症の処置またはその重篤度の低減に有用である。そのような表現型には、膵機能不全を示す患者、または、特発性膵炎および精管の先天性両側性欠如または軽度の肺疾患と診断された患者が含まれる。

0121

正確な必要量は、種、齢および対象の全般的状態、感染の重篤度、特定の物質、その投与様式などに応じて、対象毎に異なる。本発明の化合物は、好ましくは、投与の容易さおよび投与量の均一さのために、投与単位形に製剤化される。本明細書で使用する「投与単位形」という表現は、処置される患者に適当な、物理的に別個の物質の単位を表す。しかしながら、本発明の化合物および組成物の1日の総使用量は、正常な医学的判断の範囲内で、担当医により決定されることが理解されよう。特定の患者または生物のための特定の有効用量レベルは、処置される障害および障害の重篤度;用いる特定の化合物の活性;用いる特定の組成物;患者の齢、体重、全般的健康、性別および食餌;投与の時間、投与の経路、および、用いる特定の化合物の排出速度;処置の期間;用いる特定の化合物と組み合わせて、または、同時に使用される薬物、および、医学分野で周知の類似の要因を含む、様々な要因に依存する。本明細書で使用する用語「患者」または「対象」は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。

0122

本発明の医薬的に許容し得る組成物は、処置される感染の重篤度に応じて、経口で、直腸に、非経腸で、大槽内に、腟内に、腹腔内に、局所に(粉末、軟膏またはドロップ剤(drop)として)、頬側に、口内または鼻腔スプレーとしてなど、ヒトおよび他の動物に投与できる。ある実施態様では、本発明の化合物を、1日当たり対象の体重の約0.01mg/kgないし約50mg/kgおよび好ましくは約1mg/kgないし約25mg/kgの投与量レベルで、1日に1回またはそれ以上の回数で、経口または非経腸で投与し、所望の治療効果を達成し得る。

0123

ある実施態様では、単位投与形における化合物1の投与量は、100mgないし1,000mgである。他の実施態様では、化合物1の投与量は、200mgないし900mgである。他の実施態様では、化合物1の投与量は300mgないし800mgである。他の実施態様では、化合物1の投与量は、400mgないし700mgである。他の実施態様では、化合物1の投与量は、500mgないし600mgである。

0124

注射可能製剤、例えば、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁剤は、適する分散または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、既知の技術に従って製剤化し得る。無菌注射可能製剤は、非毒性の非経腸的に許容し得る希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な液剤、懸濁剤または乳剤、例えば、1,3−ブタンジオール中の液剤であってもよい。許容し得る媒体および溶媒の中で、用い得るものは、水、リンガー液、U.S.P.および等張塩化ナトリウム溶液である。加えて、無菌の固定油は、慣習的に、溶媒または懸濁媒として用いられる。この目的で、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の刺激性の低い固定油を用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸を、注射可能製剤の製造に使用する。

0125

注射可能製剤は、例えば、細菌を保持するフィルターでの濾過により、または、使用前に無菌水または他の無菌注射可能媒体に溶解または分散できる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことにより、滅菌できる。

0126

直腸または投与用の組成物は、好ましくは、本発明の化合物を適する非刺激性の補助剤または担体、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、または、外界温度では固体であるが、体温では液体であり、従って直腸または膣腔内融解し、活性化合物を放出する坐剤ワックスと混合することにより製造できる坐剤である。

0127

経口投与用固体投与形には、カプセル剤錠剤丸剤散剤および顆粒剤が含まれる。そのような固体投与形では、活性化合物を少なくとも1種の不活性の医薬的に許容し得る補助剤または担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムおよび/またはa)賦形剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、b)結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロースアルギン酸類、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロースおよびアカシア、c)保水剤、例えば、グリセロール、d)分散剤、例えば、寒天−寒天、炭酸カルシウムジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩および炭酸ナトリウム、e)溶解遅延剤、例えば、パラフィン、f)吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、g)湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよび一ステアリン酸グリセロール、h)吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ、および、i)滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物と混合する。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、投与形は緩衝剤も含み得る。

0128

類似のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖並びに高分子量ポリエチレングリコールなどの補助剤を使用して、ソフトおよびハードゼラチンカプセル充填物としても用い得る。錠剤、糖衣錠(dragees)、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体投与形は、腸溶性被覆および医薬製剤の分野で周知の他の被覆などの被覆および殻を用いて製造できる。それらは、場合により、乳白剤(opacifying agents)を含有してもよく、腸管のある部分でのみ、または、そこで優先的に、場合により遅延して、有効成分を放出する組成物であり得る。使用できる包埋組成物の例には、重合性物質およびワックスが含まれる。類似のタイプの固体組成物は、ラクトースまたは乳糖並びに高分子量ポリエチレングリコールなどの補助剤を使用して、ソフトおよびハードゼラチンカプセルの充填物としても用い得る。

0129

活性化合物は、1種またはそれ以上の上記の補助剤を含むマイクロカプセル化形態であってもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体投与形は、腸溶性被覆、放出制御被覆および医薬製剤の分野で周知の他の被覆などの被覆および殻を用いて製造できる。そのような固体投与形では、活性化合物を少なくとも1種の不活性希釈剤、例えば、スクロース、ラクトースまたはデンプンと混合し得る。そのような投与形は、また、通常の実務の通り、不活性希釈剤以外のさらなる物質、例えば、打錠の滑沢剤および他の打錠助剤、例えばステアリン酸マグネシウムおよび結晶セルロースを含み得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、投与形は、緩衝剤も含み得る。それらは、場合により、乳白剤を含有してもよく、腸管のある部分でのみ、または、そこで優先的に、場合により遅延して、有効成分を放出する組成物であり得る。使用できる包埋組成物の例には、重合性物質およびワックスが含まれる。

0130

本明細書に記載の化合物1またはその医薬的に許容し得る組成物は、併用療法に用いることができる、即ち、化合物1を、1種またはそれ以上の他の所望の治療剤または医学的処置と同時に、それに先立ち、またはそれに続いて投与できることも、理解されよう。併用レジメンで用いる特定の療法(治療剤または処置)の組合せについて、所望の治療剤および/または処置の適合性および達成されるべき所望の治療効果を考慮に入れる。用いる療法は、同じ障害に所望の効果を達成し得るか(例えば、本発明の化合物は、同じ障害の処置に使用される他の物質と同時に投与され得る)、または、それらは異なる効果を達成し得る(例えば、有害作用の制御)ことも理解されよう。本明細書で使用するとき、特定の疾患または症状を処置または予防するために通常投与されるさらなる治療剤は、「処置される疾患または症状に適切である」ものとして知られている。

0131

ある実施態様では、さらなる物質は、粘液溶解薬気管支拡張薬抗生物質感染症治療薬抗炎症薬、本発明の化合物以外のCFTRモジュレーター、または、栄養剤から選択される。

0132

ある実施態様では、さらなる治療剤は抗生物質である。本発明で有用な例示的な抗生物質には、トブラマイシン(トブラマイシン吸入用粉末(TIP)を含む)、アジスロマイシンアズトレオナム(アズトレオナムのエアロゾル化形態を含む)、アミカシン(そのリポソーム製剤を含む)、シプロフロキサシン(その吸入投与に適する製剤を含む)、レボフロキサシン(そのエアロゾル化形態を含む)および2種の抗生物質の組合せ、例えば、ホスホマイシンおよびトブラマイシンが含まれる。

0133

他の実施態様では、さらなる物質は、粘液溶解薬(mucolyte)である。本発明で有用な例示的粘液溶解薬には、プルモザイム(Pulmozyme)(登録商標)が含まれる。

0134

他の実施態様では、さらなる物質は、気管支拡張薬である。例示的な気管支拡張薬には、アルブテロール硫酸メタプロテレノール酢酸ピルブテロールサルメテロールまたは硫酸テトラブリン(tetrabuline)が含まれる。

0135

他の実施態様では、さらなる物質は、肺気道表面の液体を回復するのに有効である。っそのような物質は、細胞内外の塩の動きを改善し、肺気道の粘液の水分を多くし、従って、より容易に除去されるようにする。例示的には、そのような物質には、高張食塩水、デヌホソル四ナトリウム([[(3S,5R)−5−(4−アミノ−2−オキソピリミジン−1−イル)−3−ヒドロキシオキソラン−2−イル]メトキシ−ヒドロキシホスホリル][[[(2R,3S,4R,5R)−5−(2,4−ジオキソピリミジン−1−イル)−3,4−ジヒドロキシオキソラン−2−イル]メトキシ−ヒドロキシホスホリル]オキシ−ヒドロキシホスホリル]リン酸水素塩)またはブロンチトール(bronchitol)(マンニトールの吸入用製剤)が含まれる。

0136

他の実施態様では、さらなる物質は、抗炎症薬、即ち、肺の炎症を低減できる物質である。本発明で有用な例示的なそのような物質には、イブプロフェンドコサヘキサエン酸(DHA)、シルデナフィル吸入用グルタチオンピオグリタゾンヒドロキシクロロキンまたはシンバスタチンが含まれる。

0137

他の実施態様では、さらなる物質は、化合物1以外のCFTRモジュレーター、即ち、CFTR活性を調節する作用を有する物質である。例示的なそのような物質には、アタルレン(ataluren)(「PTC124(登録商標)」;3−[5−(2−フルオロフェニル)−1,2,4−オキサジアゾール−3−イル]安息香酸)、シナプルチド(sinapultide)、ランコブチド(lancovutide)、デペレスタット(depelestat)(ヒト組換え好中球エラスターゼ阻害剤)、コビプロストン(cobiprostone)(7−{(2R,4aR,5R,7aR)−2−[(3S)−1,1−ジフルオロ−3−メチルペンチル]−2−ヒドロキシ−6−オキソオクタヒドロシクロペンタ[b]ピラン−5−イル}ヘプタン酸)およびN−(5−ヒドロキシ−2,4−ジ−tert−ブチルフェニル)−4−オキソ−1H−キノリン−3−カルボキサミドが含まれる。

0138

他の実施態様では、さらなる物質は栄養剤である。例示的な栄養剤には、パンクレアーゼ(登録商標)、パンクレアカルブ(Pancreacarb)(登録商標)、ウルトラーゼ(Ultrase)(登録商標)またはクレオン(登録商標)を含むパンクレリパーゼ(膵臓の酵素の補充)、リプロトマーゼ(Liprotomase)(登録商標)(以前のトリジテク(Trizytek)(登録商標))、アクデクス(Aquadeks)(登録商標)または吸入用グルタチオンが含まれる。ある実施態様では、さらなる栄養剤はパンクレリパーゼである。

0139

他の実施態様では、さらなる物質は、ゲンタマイシンクルクミンシクロホスファミド、4−フェニルブチレート、ミグルスタットフェロジピンニモジピンフィロキシンB(Philoxin B)、ゲニステインアピゲニン、cAMP/cGMPモジュレーター、例えば、ロリプラム、シルデナフィル、ミルリノンタダラフィルアムリノンイソプロテレノール、アルブテロールおよびアルテロール(almeterol)、デオキシスパガリン、HSP90阻害剤、HSP70阻害剤、プロテアソーム阻害剤、例えば、エポキソミシンラクタシスチンなどから選択される化合物である。

0140

他の実施態様では、さらなる物質は、WO2004028480、WO2004110352、WO2005094374、WO2005120497またはWO2006101740に開示されている化合物である。

0141

他の実施態様では、さらなる物質は、CFTR調節活性を示すベンゾ(c)キノリジニウム(quinolizinium)誘導体またはCFTR調節活性を示すベンゾピラン誘導体である。

0142

他の実施態様では、さらなる物質は、US7202262、US6992096、US20060148864、US20060148863、US20060035943、US20050164973、WO2006110483、WO2006044456、WO2006044682、WO2006044505、WO2006044503、WO2006044502またはWO2004091502に開示されている化合物である。

0143

他の実施態様では、さらなる物質は、WO2004080972、WO2004111014、WO2005035514、WO2005049018、WO2006099256、WO2006127588またはWO2007044560に開示されている化合物である。

0144

これらの組合せは、嚢胞性線維症を含む本明細書に記載の疾患の処置に有用である。これらの組合せは、本明細書に記載のキットにおいても有用である。

0145

本発明の組成物中に存在するさらなる治療剤の量は、その治療剤を唯一の有効成分として含む組成物で通常投与される量を超えない。好ましくは、本明細書に開示される組成物におけるさらなる治療剤の量は、その治療剤を唯一の有効成分として含む組成物中に通常存在する量の約50%ないし100%の範囲にある。

0146

本明細書に記載の本発明がより詳細に理解され得るために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示目的だけのためであると理解されるべきであり、本発明をいかようにも限定するものとして解釈されるべきではない。

0147

実施例
方法と材料
ビトリド(Vitride)(登録商標)(ナトリウムビス(2−メトキシエトキシ)アルミニウムヒドリド[またはNaAlH2(OCH2CH2OCH3)2]、65wgt%溶液、トルエン中)は、Aldrich Chemicals から購入した。3−フルオロ−4−ニトロアニリンは Capot Chemicals から購入した。5−ブロモ−2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソールは、AlfaAesar から購入した。2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−カルボン酸は、Saltigo(Lanxess Corporation の提携会社)から購入した。
本願中のどこでも、化合物の名称が化合物の構造を正しく記載していない場合、構造が名称に取って代わり、基準となる。

0148

化合物1の合成
酸部分
(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−1−酢酸エチル−アセトニトリルの合成



リアクター窒素パージし、トルエン900mLを入れた。溶媒を16時間以上窒素で拡散して脱気した。次いで、リアクターにNa3PO4(155.7g、949.5mmol)を入れ、続いてビス(ジベンジリデンアセトン)パラジウム(0)(7.28g、12.66mmol)を入れた。ヘキサン中のtert−ブチルホスフィンの10%w/w溶液(51.23g、25.32mmol)を、窒素パージした滴下漏斗から10分間かけて23℃で加えた。混合物を50分間撹拌し、そのとき、5−ブロモ−2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール(75g、316.5mmol)を1分間かけて添加した。さらに50分間撹拌した後、混合物にエチルシアノアセテート(71.6g、633.0mmol)を5分間かけて加え、水(4.5mL)を一度に加えた。混合物を40分間かけて70℃に加熱し、反応体から生成物への変換割合をHPLCで1−2時間毎分析した。完全な変換が観察された後(典型的には、5−8時間後に完全な変換)、混合物を20−25℃に冷却し、セライトパッドで濾過した。セライトパッドをトルエン(2X450mL)ですすぎ、併せた有機物を、減圧下、60−65℃で300mLに濃縮した。濃縮物にDMSO225mLを加え、減圧下、70−80℃で、溶媒の活発蒸留が終わるまで濃縮した。溶液を20−25℃に冷却し、段階2に備えてDMSOで900mLに希釈した。1H NMR(500MHz, CDCl3) δ 7.16 - 7.10 (m, 2H), 7.03 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.63 (s, 1H), 4.19 (m, 2H), 1.23 (t, J = 7.1 Hz, 3H).

0149

(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−アセトニトリルの合成



上記からの(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−1−酢酸エチル−アセトニトリルのDMSO溶液に、3N HCl(617.3mL、1.85mol)を、20分間かけて加え、その間に内部温度を<40℃に維持した。次いで、混合物を75℃に1時間かけて加熱し、HPLCにより1−2時間毎に%変換を分析した。>99%の変換が観察されたとき(典型的には、5−6時間後)、反応を20−25℃に冷却し、MTBE(2X525mL)で抽出し、抽出中に完全な相分離が可能になるように十分な時間をかけた。合わせた有機抽出物を5%NaCl(2X375mL)で洗浄した。次いで、冷却したレシーバーフラスコを備えた、1.5−2.5Torrの真空蒸留に適する設備に溶液を移した。溶液を真空下、<60℃で濃縮し、溶媒を除去した。次いで、得られた油状物から(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−アセトニトリルを、125−130℃(オーブン温度)および1.5−2.0Torrで蒸留した。(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−アセトニトリルを澄んだ油状物として、5−ブロモ−2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール(2段階)から収率66%で、HPLC純度91.5%AUC(95%のw/wアッセイに相当する)で単離した。1H NMR(500MHz,DMSO) δ 7.44 (br s, 1H), 7.43 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 8.2, 1.8 Hz, 1H), 4.07 (s, 2H).

0150

(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボニトリルの合成



50%w/w NaOHの原液を、窒素で拡散して16時間以上脱気した。適量のMTBEを同様に数時間脱気した。窒素でパージしたリアクターに、脱気したMTBE(143mL)を入れ、続いて(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−アセトニトリル(40.95g、207.7mmol)およびテトラブチルアンモニウムブロミド(2.25g、10.38mmol)を入れた。混合物の体積を記録し、混合物を窒素で拡散して30分間脱気した。十分に脱気したMTBEを加え、混合物を脱気前の元の体積に戻した。23.0℃で撹拌中の混合物に、脱気した50%w/w NaOH(143mL)を10分間かけて加え、続いて1−ブロモ−2−クロロエタン(44.7g、311.6mmol)を30分間かけて加えた。反応をHPLCで1時間間隔で%変換について分析した。試料採取する前に、撹拌を止め、相を分離させた。上部の有機相を分析用試料採取した。>99%の%変換が観察されたとき(典型的には2.5−3時間後)、反応混合物を10℃に冷却し、温度を<−25℃に維持する速度で水(461mL)を加えた。温度を20−25℃に調節し、相を分離した。注釈:完全な相分離のために十分な時間が許されるべきである。水相をMTBE(123mL)で抽出し、合わせた有機相を1N HCl(163mL)および5%NaCl(163mL)で洗浄した。MTBE中の(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボニトリルの溶液を真空下、40−50℃で164mLに濃縮した。溶液にエタノール(256mL)を加え、真空下、50−60℃で再度164mLに濃縮した。エタノール(256mL)を加え、混合物を真空下、50−60℃で164mLに濃縮した。得られた混合物を20−25℃に冷却し、次の段階に備えてエタノールで266mLに希釈した。1H NMR(500MHz,DMSO) δ 7.43 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.30 (dd, J = 8.4, 1.9 Hz, 1H), 1.75 (m, 2H), 1.53 (m, 2H).

0151

1−(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボン酸の合成



先の段階からのエタノール中の(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボニトリルの溶液に、6N NaOH(277mL)を20分間かけて加え、77−78℃の内部温度に45分間かけて加熱した。反応の進行をHPLCにより16時間後に監視した。注釈:(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボニトリルおよび(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボニトリルの部分的加水分解に由来する第一級アミドの両方の消費が監視された。>99%の%変換が観察されたとき(典型的には、16時間後に100%の変換)、反応混合物を25℃に冷却し、エタノール(41mL)およびDCM(164mL)を加えた。溶液を10℃に冷却し、6N HCl(290mL)を<25℃の温度を維持する速度で加えた。20−25℃に温めた後、相を分離させた。下部の有機相を回収し、上部の水相をDCM(164mL)で逆抽出した。注釈:水相は高濃度無機塩のために抽出の前後にいくらか濁った。有機物を合わせ、真空下で164mLに濃縮した。トルエン(328mL)を加え、混合物を164mLに70−75℃で濃縮した。混合物を45℃に冷却し、MTBE(364mL)を加え、60℃で20分間撹拌した。溶液を25℃に冷却し、仕上げ(polish)濾過し、残存する無機塩を除去した。MTBE(123mL)を使用してリアクターをすすぎ、固体を回収した。次の段階に備えて、合わせた有機物をきれいなリアクターに移した。

0152

1−(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボン酸の単離



先の段階からの1−(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボン酸の溶液を、真空下で164mLに濃縮し、トルエン(328mL)を加え、70−75℃で164mLに濃縮した。次いで、混合物を100−105℃に加熱し、均一な溶液を得た。この温度で30分間撹拌した後、2時間かけて溶液を5℃に冷却し、5℃で3時間維持した。次いで、混合物を濾過し、リアクターおよび回収した固体を冷1:1トルエン/n−ヘプタン(2X123mL)で洗浄した。物質を真空下、55℃で17時間乾燥させ、1−(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボン酸をオフホワイト色結晶性固体として提供した。1−(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボン酸を、(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−アセトニトリル(単離を含む3段階)からの収率79%、HPLC純度99.0%AUCで単離した。ESI-MS m/z計算値242.04,実測値241.58 (M+1)+; 1H NMR(500MHz,DMSO) δ 12.40 (s, 1H), 7.40 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.17 (dd, J = 8.3, 1.7 Hz, 1H), 1.46 (m, 2H), 1.17 (m, 2H).

0153

酸部分の代替的合成
(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−メタノールの合成



購入できる2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−カルボン酸(1.0当量)を、トルエン(10体積)中でスラリー化する。ビトリド(登録商標)(2当量)を、滴下漏斗で、温度を15−25℃に維持する速度で添加する。添加の終了時に、温度を40℃に2時間高め、次いで10%(w/w)aq.NaOH(4.0当量)を、温度を40−50℃に維持しながら、添加漏斗注意深く添加する。さらに30分間撹拌した後、層を40℃で分離させる。有機相を20℃に冷却し、次いで水(2x1.5体積)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、濃縮し、粗製(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−メタノールを得、それを次の段階で直接使用する。

0154

5−クロロメチル−2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソールの合成



(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−メタノール(1.0当量)を、MTBE(5体積)に溶解する。触媒量のDMAP(1mol%)を添加し、SOCl2(1.2当量)を滴下漏斗で添加する。リアクターの温度を15−25℃に維持する速度でSOCl2を添加する。温度を30℃に1時間高め、次いで20℃に冷却し、次いで水(4体積)を滴下漏斗で添加し、温度を30℃未満に維持する。さらに30分間撹拌した後、層を分離させる。有機層を撹拌し、10%(w/v)aq. NaOH(4.4体積)を添加する。15ないし20分間撹拌した後、層を分離させる。次いで、有機相を乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、濃縮し、粗製5−クロロメチル−2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソールを得、それを次の段階で直接使用する。

0155

(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−アセトニトリルの合成



DMSO(1.25体積)中の5−クロロメチル−2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール(1当量)の溶液を、DMSO(3体積)中のNaCN(1.4当量)のスラリーに、温度を30−40℃に維持しながら添加する。混合物を1時間撹拌し、次いで水(6体積)を添加し、続いてMTBE(4体積)を添加する。30分間撹拌した後、層を分離する。水層をMTBE(1.8体積)で抽出する。合わせた有機層を水(1.8体積)で洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、濃縮し、粗製(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−アセトニトリル(95%)を得、それを次の段階で直接使用する。
残りの段階は、酸部分の合成について上記したのと同じである。

0156

アミン部分
2−ブロモ−5−フルオロ−4−ニトロアニリンの合成



フラスコに3−フルオロ−4−ニトロアニリン(1.0当量)を入れ、続いて酢酸エチル(10体積)を入れ、撹拌し、全ての固体を溶解した。N−ブロモスクシンイミド(1.0当量)を、22℃の内部温度を維持するように少しずつ添加した。反応終了時に、反応混合物をロータリーエバポレーターで、真空で濃縮した。残渣を蒸留水(5体積)でスラリー化し、スクシンイミドを溶解し除去した。(スクシンイミドは、水での後処理によっても除去できる。)水をデカンタし、固体を2−プロパノール(5体積)中で終夜スラリー化した。得られたスラリーを濾過し、湿ったケーキを2−プロパノールで洗浄し、真空オーブン中、50℃で、終夜、N2流で、一定重量に達するまで乾燥させた。黄色がかった褐色の固体を単離した(50%収率、97.5%AUC)。他の不純物は、ブロモ−位置異性体(1.4%AUC)およびジ−ブロモ付加体(1.1%AUC)であった。1H NMR(500MHz,DMSO)
δ 8.19 (1 H, d, J = 8.1 Hz), 7.06 (br. s, 2 H), 6.64 (d, 1 H, J = 14.3 Hz).

0157

(R)−1−((4−アミノ−2−ブロモ−5−フルオロフェニル)アミノ)−3−(ベンジルオキシプロパン−2−オールのp−トルエンスルホン酸塩の合成



徹底的に乾燥させたフラスコに、N2下で、以下のものを入れた:活性化粉末状4Aモレキュラーシーブ(2−ブロモ−5−フルオロ−4−ニトロアニリンを基準として50wt%)、2−ブロモ−5−フルオロ−4−ニトロアニリン(1.0当量)、過塩素酸亜鉛二水和物(20mol%)およびトルエン(8体積)。混合物を室温で30分間以下で撹拌した。最後に、トルエン(2体積)中の(R)−ベンジルグリシジルエーテル(2.0当量)を、定常流で添加した。反応を80℃(内部温度)に加熱し、約7時間、または、2−ブロモ−5−フルオロ−4−ニトロアニリンが<5%AUCになるまで撹拌した。

0158

反応を室温に冷却し、セライト(50wt%)を添加し、続いて酢酸エチル(10体積)を添加した。得られた混合物を濾過し、セライトおよびを除去し、酢酸エチル(2体積)で洗浄した。濾液塩化アンモニウム溶液(4体積、20%w/v)で洗浄した。有機層を重炭酸ナトリウム溶液(4体積x2.5%w/v)で洗浄した。有機層を真空で、ロータリーエバポレーターで濃縮した。得られたスラリーをイソプロピルアセテート(10体積)に溶解し、この溶液を Buchi の水素化反応器(hydrogenator)に移した。

0159

水素化反応器に5wt%Pt(S)/C(1.5mol%)を入れ、混合物をN2下、30℃(内部温度)で撹拌した。反応にN2を、続いて水素を流した。水素化反応器の圧力を水素1Barに合わせ、混合物を迅速に(>1200rpm)撹拌した。反応終了時に、触媒をセライトのパッドで濾過し、ジクロロメタン(10体積)で洗浄した。濾液を真空で濃縮した。残っているイソプロピルアセテートをジクロロメタン(2体積)で追い出し、ロータリーエバポレーターで乾燥するまで濃縮した。

0160

得られた残渣をジクロロメタン(10体積)に溶解した。p−トルエンスルホン酸一水和物(1.2当量)を添加し、終夜撹拌した。生成物を濾過し、ジクロロメタン(2体積)で洗浄し、吸引乾燥させた。湿ったケーキを乾燥トレーに移し、真空オーブンに入れ、45℃で、N2流で、一定重量に達するまで乾燥させた。(R)−1−((4−アミノ−2−ブロモ−5−フルオロフェニル)アミノ)−3−(ベンジルオキシ)プロパン−2−オールのp−トルエンスルホン酸塩をオフホワイト色固体として単離した。
キラル純度は、>97%eeと測定された。

0161

(3−クロロ−3−メチルブト−1−イニルトリメチルシランの合成



プロパルギルアルコール(1.0当量)を容器に入れた。水性塩酸(37%、3.75体積)を添加し、撹拌を始めた。固体アルコールの溶解中に、穏やかな吸熱(5−6℃)が観察される。得られた混合物を終夜(16時間)撹拌すると、ゆっくりと暗赤色になった。30Lのジャケット付き容器に水(5体積)を入れ、次いでそれを10℃に冷却した。反応混合物をゆっくりと吸引により水に移し、混合物の内部温度を25℃より低く維持した。ヘキサン(3体積)を添加し、得られた混合物を0.5時間撹拌した。相を分離させ、水相(pH<1)を流し出し、廃棄した。ロータリーエバポレーターを使用して有機相を真空で濃縮し、生成物を赤色油状物としてもたらした。

0162

(4−(ベンジルオキシ)−3,3−ジメチルブト−1−イニル)トリメチルシランの合成



方法A
この部分のすべての当量と体積の記述は、250gの反応を基準とする。削り屑マグネシウム(69.5g、2.86mol、2.0当量)を、3Lの4口リアクターに入れ、磁気スターラーで、窒素下、0.5時間撹拌した。リアクターを氷水浴に浸した。THF(1.8L、7.2体積)中の塩化プロパルギル(250g、1.43mol、1.0当量)の溶液を、内部発熱(約10℃)が観察されるまで、ゆっくりと撹拌しながらリアクターに添加した。グリニャール試薬形成を、1H−NMR分光法を使用するIPCにより確認した。一旦発熱が鎮まったら、残りの溶液をゆっくりと添加し、<15℃のバッチ温度を維持した。添加は約3.5時間を要した。得られた暗緑色の混合物を、2Lの蓋付ビンにデカンタした。

0163

この部分のすべての当量と体積の記述は、500gの反応を基準とする。22Lのリアクターに、THF(1.5L、3体積)中のベンジルクロロメチルエーテル(95%、375g、2.31mol、0.8当量)の溶液を入れた。リアクターを氷水浴で冷却した。上記の通りに製造した2つのグリニャール試薬のバッチを合わせ、次いで、ベンジルクロロメチルエーテル溶液にゆっくりと滴下漏斗で添加し、バッチ温度を25℃より低く維持した。添加は1.5時間を要した。反応混合物を終夜(16時間)撹拌した。

0164

この部分のすべての当量と体積の記述は、1kgの反応を基準とする。15%塩化アンモニウム溶液を、30Lジャケット付きリアクターで準備した(水8.5kg中1.5kg、10体積)。溶液を5℃に冷却した。上記の通りに製造した2個のグリニャール反応混合物を合わせ、次いで、ヘッダー容器を介して塩化アンモニウム溶液に移した。発熱がこのクエンチにおいて観察され、それを、内部温度を25℃より低く維持するように実施した。一度移動が完了したら、容器のジャケットの温度を25℃に設定した。ヘキサン(8L、8体積)を添加し、混合物を0.5時間撹拌した。相分離後、水相(pH9)を流し出し、廃棄した。残っている有機相を水(2L、2体積)で洗浄した。22Lロータリーエバポレーターを使用して有機相を真空で濃縮し、粗生成物を橙色油状物として提供した。

0165

方法B
削り屑状マグネシウム(106g、4.35mol、1.0当量)を22Lリアクターに入れ、次いで、THF(760mL、1体積)に懸濁した。バッチ温度が2℃に達するように、容器を氷水浴中で冷却した。THF(4.5L,6体積)中の塩化プロパルギル(760g、4.35mol、1.0当量)の溶液をゆっくりとリアクターに添加した。100mLを添加した後、添加を止め、グリニャール試薬の開始を示す13℃の発熱が観察されるまで混合物を撹拌した。一旦発熱が鎮まったら、さらに500mLの塩化プロパルギル溶液をゆっくりと添加し、バッチ温度を<20℃に維持した。グリニャール試薬形成をIPCにより1H−NMR分光法を使用して確認した。残りの塩化プロパルギル溶液をゆっくりと添加し、バッチ温度を<20℃に維持した。添加は約1.5時間を要した。得られた暗緑色の溶液を0.5時間撹拌した。グリニャール試薬形成をIPCにより1H−NMR分光法を使用して確認した。未希釈のベンジルクロロメチルエーテルをリアクターの滴下漏斗に入れ、次いで、滴下してリアクターに添加し、バッチ温度を25℃より低く維持した。添加は1.0時間を要した。反応混合物を終夜撹拌した。方法Aと同じ手順および相対的な量の物質を使用して水性の後処理および濃縮を実施し、生成物を橙色油状物として得た。

0166

4−ベンジルオキシ−3,3−ジメチルブト−1−インの製造



30Lのジャケット付きリアクターにメタノール(6体積)を入れ、次いで5℃に冷却した。水酸化カリウム(85%、1.3当量)をリアクターに添加した。水酸化カリウムが溶解する際に、15−20℃の発熱が観察された。ジャケットの温度を25℃に設定した。メタノール(2体積)中の4−ベンジルオキシ−3,3−ジメチル−1−トリメチルシリルブト−1−イン(1.0当量)の溶液を添加し、得られた混合物を、HPLCで監視して反応が完了するまで撹拌した。25℃での典型的な反応時間は3−4時間である。反応混合物を水(8体積)で希釈し、次いで0.5時間撹拌した。ヘキサン(6体積)を添加し、得られた混合物を0.5時間撹拌した。相を分離させ、次いで水相(pH10−11)を流しだし、廃棄した。有機相を水(8体積)中のKOH(85%、0.4当量)の溶液で、続いて水(8体積)で洗浄した。次いで、ロータリーエバポレーターを使用して有機相を濃縮し、表題物質を黄色−橙色の油状物として得た。この物質の典型的な純度は80%の範囲であり、主として単一の不純物が存在した。1H NMR(400MHz, C6D6) δ 7.28 (d, 2 H, J = 7.4 Hz), 7.18 (t, 2 H, J = 7.2 Hz), 7.10 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 4.35 (s, 2 H), 3.24 (s, 2 H), 1.91 (s, 1 H), 1.25 (s, 6 H).

0167

N−ベンジルグリコール化−5−アミノ−2−(2−ベンジルオキシ−1,1−ジメチルエチル)−6−フルオロインドールの合成
方法A
(R)−1−((4−アミノ−2−(4−(ベンジルオキシ)−3,3−ジメチルブト−1−イン−1−イル)−5−フルオロフェニル)アミノ)−3−(ベンジルオキシ)プロパン−2−オールの合成



(R)−1−((4−アミノ−2−ブロモ−5−フルオロフェニル)アミノ)−3−(ベンジルオキシ)プロパン−2−オールのp−トルエンスルホン酸塩を、固体をジクロロメタン(5体積)および飽和NaHCO3溶液(5体積)中で澄んだ有機層が得られるまで撹拌することにより、遊離塩基化した。得られた層を分離し、有機層を飽和NaHCO3溶液(5体積)で、続いて塩水で洗浄し、真空で濃縮し、(R)−1−((4−アミノ−2−ブロモ−5−フルオロフェニル)アミノ)−3−(ベンジルオキシ)プロパン−2−オール遊離塩基を油状物として得た。

0168

酢酸パラジウム(0.01当量)、dppb(0.015当量)、CuI(0.015当量)および炭酸カリウム(3当量)をアセトニトリル(1.2体積)に懸濁した。15分間撹拌した後、アセトニトリル(0.2体積)中の4−ベンジルオキシ−3,3−ジメチルブト−1−イン(1.1当量)の溶液を添加する。混合物に窒素ガスを1時間拡散させ、次いでアセトニトリル(4.1体積)中の(R)−1−((4−アミノ−2−ブロモ−5−フルオロフェニル)アミノ)−3−(ベンジルオキシ)プロパン−2−オール遊離塩基(1当量)の溶液を添加する。混合物に窒素ガスをさらに1時間拡散させ、次いで80℃に加熱する。反応の進行をHPLCにより監視し、反応は通常3−5時間で完了する。混合物を室温に冷却し、次いでセライトで濾過する。ケーキをアセトニトリル(4体積)で洗浄する。合わせた濾液を乾燥するまで共沸させ、次いで混合物を次のリアクターに仕上げ濾過する。かくして得られた(R)−1−((4−アミノ−2−(4−(ベンジルオキシ)−3,3−ジメチルブト−1−イン−1−イル)−5−フルオロフェニル)アミノ)−3−(ベンジルオキシ)プロパン−2−オールのアセトニトリル溶液を、さらに加工せずに次の手順(環状化)に直接使用する。

0169

N−ベンジルグリコール化−5−アミノ−2−(2−ベンジルオキシ−1,1−ジメチルエチル)−6−フルオロインドールの合成



ビス−アセトニトリルジクロロパラジウム(0.1当量)およびCuI(0.1当量)をリアクターに入れ、次いでアセトニトリル(全部で9.5体積)中の上記で得られる(R)−1−((4−アミノ−2−(4−(ベンジルオキシ)−3,3−ジメチルブト−1−イン−1−イル)−5−フルオロフェニル)アミノ)−3−(ベンジルオキシ)プロパン−2−オール(1当量)の溶液に懸濁する。混合物を窒素ガスで1時間拡散させ、次いで80℃に加熱する。反応の進行をHPLCにより監視し、反応は、典型的には1−3時間で完了した。混合物をセライトで濾過し、ケーキをアセトニトリルで洗浄する。酢酸エチル(7.5体積)への溶媒交換を実施する。酢酸エチル溶液をNH3−NH4Cl水溶液(2x2.5体積)で、続いて10%塩水(2.5体積)で洗浄する。次いで、酢酸エチル溶液をシリカゲル(1.8wt当量)およびSi−TMT(0.1wt当量)と6時間撹拌する。濾過後、得られる溶液を濃縮する。残った油状物をDCM/ヘプタン(4体積)に溶解し、次いでカラムクロマトグラフィーにより精製する。次いで、かくして得られる油状物を25%EtOAc/ヘプタン(4体積)から結晶化する。結晶性(R)−1−(5−アミノ−2−(1−(ベンジルオキシ)−2−メチルプロパン−2−イル)−6−フルオロ−1H−インドール−1−イル)−3−(ベンジルオキシ)プロパン−2−オールは、典型的には収率27−38%で得られる。1H NMR-(400MHz,DMSO) δ 7.38-7.34 (m, 4 H), 7.32-7.23 (m, 6 H), 7.21 (d, 1 H, J = 12.8 Hz), 6.77 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 6.06 (s, 1 H), 5.13 (d, 1H, J = 4.9 Hz), 4.54 (s, 2 H), 4.46 (br. s, 2 H), 4.45 (s, 2 H), 4.33 (d, 1 H, J = 12.4 Hz), 4.09-4.04 (m, 2 H), 3.63 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 3.56 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 3.49 (dd, 1H, J = 9.8, 4.4 Hz), 3.43 (dd, 1H, J = 9.8, 5.7 Hz), 1.40 (s, 6 H).

0170

N−ベンジルグリコール化−5−アミノ−2−(2−ベンジルオキシ−1,1−ジメチルエチル)−6−フルオロインドールの合成
方法B



酢酸パラジウム(33g、0.04当量)、dppb(94g、0.06当量)および炭酸カリウム(1.5kg、3.0当量)をリアクターに入れる。遊離塩基の油状物ベンジルグリコール化4−アンモニウム−2−ブロモ−5−フルオロアニリン(1.5kg、1.0当量)をアセトニトリル(8.2L、4.1体積)に溶解し、次いでリアクターに添加した。混合物を窒素ガスで1時間以上拡散した。アセトニトリル中の4−ベンジルオキシ−3,3−ジメチルブト−1−イン(70%、1.1kg、1.05当量)の溶液を混合物に添加し、次いで、それを窒素ガスで1時間以上拡散させた。混合物を80℃に加熱し、次いで終夜撹拌した。HPLCによるIPCを実施し、反応は16時間後に完了すると判定された。混合物を環境温度に冷却し、次いでセライトパッド(228g)で濾過した。リアクターおよびセライトパッドをアセトニトリル(2x2L、2体積)で洗浄した。合わせた相を溶媒8Lが回収されるまで22Lロータリーエバポレーターで濃縮し、アセトニトリル7L(3.5体積)中に粗生成物を残す。

0171

ビス−アセトニトリルジクロロパラジウム(144g、0.15当量)をリアクターに入れた。粗製の溶液をリアクターに戻し、ロータリーエバポレーターのバルブをアセトニトリル(4L、2体積)で洗浄した。合わせた溶液を窒素ガスで1時間以上拡散させた。反応混合物を16時間以上80℃に加熱した。HPLCによる工程制御は、出発物質の完全な消費を示す。反応混合物をセライト(300g)で濾過した。リアクターおよびフィルターケーキをアセトニトリル(3L、1.5体積)で洗浄した。合わせた濾液を回転蒸発により油状物に濃縮した。油状物を酢酸エチル(8.8L、4.4体積)に溶解した。溶液を20%塩化アンモニウム(5L、2.5体積)で、続いて5%塩水(5L、2.5体積)で洗浄した。シリカゲル(3.5kg、1.8wt.eq.)を有機相に添加し、それを終夜撹拌した。DeloxanTHPII金属捕捉剤(358g)およびヘプタン(17.6L)を添加し、得られた混合物を3時間以上撹拌した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過した。フィルターケーキをヘプタン(25L)中の30%酢酸エチルで洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮し、N−ベンジルグリコール化−5−アミノ−2−(2−ベンジルオキシ−1,1−ジメチルエチル)−6−フルオロインドールを色のペーストとして得た(1.4kg)。

0172

化合物1の合成
ベンジル保護化合物1の合成



1−(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボン酸(1.3当量)をトルエン(2.5体積、1−(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボン酸を基準として)でスラリー化した。塩化チオニル(SOCl2、1.7当量)を滴下漏斗で添加し、混合物を60℃に加熱した。得られた混合物を2時間撹拌した。トルエンおよび過剰のSOCl2をロータリーエバポレーターで留去した。さらなるトルエン(2.5体積、1−(2,2−ジフルオロ−1,3−ベンゾジオキソール−5−イル)−シクロプロパンカルボン酸を基準として)を添加し、混合物を1体積のトルエンまで蒸留した。DCM(4体積)中の(R)−1−(5−アミノ−2−(1−(ベンジルオキシ)−2−メチルプロパン−2−イル)−6−フルオロ−1H−インドール−1−イル)−3−(ベンジルオキシ)プロパン−2−オール(1当量)およびトリエチルアミン(3当量)の溶液を0℃に冷却した。トルエン(1体積)中の酸塩化物溶液を、バッチ温度を10℃より低く維持しながら添加する。反応の進行をHPLCにより監視し、反応は、通常数分で完了する。25℃に温めた後、反応混合物を5%NaHCO3(3.5体積)、1M NaOH(3.5体積)および1M HCl(5体積)で洗浄する。メタノール(2体積)への溶媒交換を実施し、得られるメタノール中の(R)−N−(1−(3−(ベンジルオキシ)−2−ヒドロキシプロピル)−2−(1−(ベンジルオキシ)−2−メチルプロパン−2−イル)−6−フルオロ−1H−インドール−5−イル)−1−(2,2−ジフルオロベンゾ[d][1,3]ジオキソール−5−イル)シクロプロパンカルボキサミドの溶液を、さらに加工せずに次の段階(水素化分解)に使用する。

0173

化合物1の合成



5%パラジウム/チャコール(約50%乾重量、0.01当量)を、適切な水素化容器に入れる。上記で得られるメタノール(2体積)中の(R)−N−(1−(3−(ベンジルオキシ)−2−ヒドロキシプロピル)−2−(1−(ベンジルオキシ)−2−メチルプロパン−2−イル)−6−フルオロ−1H−インドール−5−イル)−1−(2,2−ジフルオロベンゾ[d][1,3]ジオキソール−5−イル)シクロプロパンカルボキサミド溶液を注意深く添加し、続いてメタノール中の3M HCl溶液を添加する。容器を窒素ガスで、次いで水素ガスでパージする。HPCL分析で測定して反応が完了するまで、混合物を激しく撹拌する。典型的な反応時間は3−5時間である。反応混合物をセライトで濾過し、ケーキをメタノール(2体積)で洗浄する。イソプロパノール(3体積)への溶媒交換を実施する。粗製のVX−661を75%IPA−ヘプタン(4体積、即ち、1体積のヘプタンを3体積のIPAに添加する)で結晶化し、得られる結晶を50%IPA−ヘプタン(即ち、2体積のヘプタンを混合物に添加する)で成熟させる。2段階のアシル化/水素化分解手順からの典型的な化合物4の収率は、68%ないし84%の範囲である。直前に記載したのと同じ手順に従って、化合物4をIPA−ヘプタンから再結晶できる。

0174

化合物1は、出典明示により本明細書の一部とする米国公開特許出願US20090131492に記載のいくつかの合成経路の1つによっても製造し得る。

0175

下記の表10は、化合物1の分析データを記載する。
表10

0176

アッセイ
化合物のΔF508−CFTR矯正(correction)特性を検出および測定するためのアッセイ
化合物のΔF508−CFTR調節特性をアッセイするための光学的膜電位方法
光学的膜電位アッセイは、蛍光変化の測定装置、例えば電位差/イオンプローブリーダー(VIPR)(Gonzalez, J. E., K. Oades, et al. (1999) “Cell−based assays and instrumentation for screening ion−channel targets” Drug Discov Today 4(9): 431−439を参照のこと)と組み合わせて、GonzalezおよびTsienに記載の膜電位感受性FRETセンサーを利用した(Gonzalez, J. E. and R. Y. Tsien (1995) “Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer in single cells” Biophys J 69(4): 1272-80、およびGonzalez, J. E. and R. Y. Tsien (1997) “Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescence resonance energy transfer” Chem Biol 4(4): 269-77を参照のこと)。

0177

これらの電位感受性アッセイは、膜可溶性電位感受性色素であるDiSBAC2(3)と、蛍光リン脂質であるCC2−DMPE(それは、原形質膜外側膜に結合して、FRET供与体として作用する)の間の、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)における変化に基づく。膜電位(Vm)の変化は、負電荷のDiSBAC2(3)が原形質膜を通過して再分布するのを誘発し、それによってCC2−DMPEからのエネルギー伝達量が変化する。蛍光放射の変化を、96または384ウェルマイクロタイタープレートにおいて細胞をベースとするスクリーニングを行うよう設計された、統合された液体処理システム(handler)および蛍光検出器であるVIPR(登録商標)IIを使用して監視した。

0178

1.矯正化合物の同定
ΔF508−CFTRと関係する輸送障害を矯正する小分子を同定するために、単一付加(single−addition)HTSアッセイフォーマットを開発した。細胞を、試験化合物の存在または非存在ネガティブコントロール)下、37℃で16時間、血清不含培地中でインキュベートした。ポジティブコントロールとして、384ウェルプレートに播いた細胞を、27℃で16時間インキュベートし、“温度−矯正”ΔF508−CFTRとした。その後、細胞をクレブスリンゲル溶液で3回すすぎ、電位感受性色素を添加した。ΔF508−CFTRを活性化するために、10μMフォルスコリンおよびCFTR増強剤、ゲニステイン(20μM)を、各ウェルにCl−不含有媒体と共に添加した。Cl−不含有媒体の添加は、ΔF508−CFTR活性化に応答してCl−排出を促進し、その結果の膜脱分極を、FRETをベースとする電位感受性色素を使用して光学的に監視した。

0179

2.増強化合物の同定
ΔF508−CFTRの増強剤を同定するために、二重付加(double−addition)HTSアッセイフォーマットを開発した。最初の添加中、試験化合物を含むか、または含まないCl−不含有培地を各ウェルに添加した。22秒後、2−10μMフォルスコリンを含むCl−不含有培地の2回目の添加を行い、ΔF508−CFTRを活性化した。両方の添加後の細胞外Cl−濃度は28mMであって、それは、ΔF508−CFTR活性化に応答してCl−排出を促進し、結果としての膜脱分極を、FRETをベースとする電位感受性色素を使用して光学的に監視した。

0180

3.溶液
浴溶液#1:NaCl 160mM、KCl 4.5mM、CaCl2 2mM、MgCl2 1mM、HEPES10mM、NaOHでpH7.4。
塩化物不含有浴溶液:浴溶液#1中の塩化物塩を、グルコン酸塩で置き換える。
CC2−DMPE:DMSO中、10mM原液として製造し、−20℃で貯蔵した。
DiSBAC2(3):DMSO中、10mM原液として製造し、−20℃で貯蔵した。

0181

4.細胞培養
ΔF508−CFTRを安定に発現するNIH3T3マウス線維芽細胞を、膜電位の光学的測定に使用する。細胞を、175cm2培養フラスコ中、2mMグルタミン、10%ウシ胎仔血清、1×NEAA、β−ME、1×pen/strep、および25mMHEPESを添加したダルベッコの改変イーグルス培地中で、37℃、5%CO2中、湿度90%で維持する。全ての光学的アッセイのために、細胞を、384ウェルのマトリゲル被覆プレート中、30,000/ウェルで播種し、37℃で2時間培養し、その後、増強剤アッセイのために27℃で24時間培養した。矯正アッセイのために、細胞を16−24時間、化合物有りおよび無しで、27℃または37℃で培養する。

0182

化合物のΔF508−CFTR調節特性をアッセイするための電気生理的アッセイ
1.ウッシング(Ussing)チャンバーアッセイ
ウッシングチャンバー実験を、ΔF508−CFTRを発現する分極上皮細胞で行い、光学的アッセイで同定したΔF508−CFTRモジュレーターをさらに特徴解析した。Costar Snapwell細胞培養インサート上に増殖したFRTΔF508−CFTR上皮細胞を、ウッシングチャンバー(Physiologic Instruments, Inc., San Diego, CA)にマウントし、単層を、電位固定ステム(Department of Bioengineering, University of Iowa, IA および Physiologic Instruments, Inc., San Diego, CA)を用いて継続的に短絡させた。2mVパルスを適用して経上皮電気抵抗を測定した。これらの条件下で、FRT上皮細胞は、4KΩ/cm2またはそれ以上の抵抗を示した。溶液を27℃に維持し、空気をバブリングさせた。電極オフセット電位および流体抵抗を、無細胞インサートを使用して矯正した。これらの条件下で、電流は、頂端膜で発現されるΔF508−CFTRを介したCl−の流動を反映する。MP100A−CEインターフェースおよびAcqKnowledgeソフトウェア(v3.2.6; BIOPAC Systems, Santa Barbara, CA)を使用して、ISCをデジタル方式で得た。

0183

2.矯正化合物の同定
典型的なプロトコールは、基底側から頂端膜へのCl−濃度勾配を利用した。この勾配を設定するため、通常のリンゲル溶液を基底側膜に使用し、一方、頂端NaClを、等モルグルコン酸ナトリウムで置き換え(NaOHを用いてpH7.4に滴定)、上皮を横切る大きなCl−濃度勾配を得た。全ての実験を、無傷の単層で行った。ΔF508−CFTRを完全に活性化するために、フォルスコリン(10μM)、PDE阻害剤、IBMX(100μM)を添加し、次いでCFTR増強剤、ゲニステイン(50μM)を添加した。

0184

他の細胞タイプで観察されるように、△F508−CFTRを安定に発現するFRT細胞の低温でのインキュベートは、細胞膜でのCFTRの機能的密度を増大する。矯正化合物の活性を決定するために、細胞を10μMの試験化合物と共に24時間37℃でインキュベートし、その後、3回洗浄して、記録した。化合物処理した細胞におけるcAMPおよびゲニステインに媒介されるISCを、27℃および37℃の対照に対して標準化し、活性%として表した。細胞と矯正化合物のプレインキュベーションは、37℃対照と比較して、cAMPおよびゲニステインに媒介されるISCを顕著に増大させた。

0185

3.増強化合物の同定
典型的なプロトコールは、基底側から頂端膜へのCl−濃度勾配を利用した。この勾配を設定するために、通常のリンゲル溶液を基底側膜に使用し、ナイスタチン(360μg/ml)で透過性にし、一方、頂端側NaClを等モルの(NaOHでpH7.4に滴定された)グルコン酸ナトリウムで置き換え、上皮を横切る大きなCl−濃度勾配を得た。全ての実験をナイスタチン透過処理の30分後に行った。フォルスコリン(10μM)および全ての試験化合物を、細胞培養インサートの両側に添加した。推定上のΔF508−CFTR増強剤の有効性を、公知の増強剤ゲニステインのそれと比較した。

0186

4.溶液
側底溶液(mM):NaCl(135)、CaCl2(1.2)、MgCl2(1.2)、K2HPO4(2.4)、KHPO4(0.6)、N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N'−2−エタンスルホン酸(HEPES)(10)、およびデキストロース(10)。NaOHを使用して溶液をpH7.4に滴定した。
頂端溶液(mM):側底溶液と同じ。ただし、NaClをグルコン酸Na(135)で置き換えた。

0187

5.細胞培養
ΔF508−CFTRを発現するFisherラット上皮(FRT)細胞(FRTΔF508−CFTR)を、我々の光学的アッセイから同定された推定ΔF508−CFTRモジュレーターのウッシングチャンバー実験に使用した。細胞をCostar Snapwell細胞培養インサート上で培養し、5%ウシ胎仔血清、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを添加したCoonの改変Ham F−12培地中で37℃および5%CO2で5日間培養した。化合物の増強剤活性を特徴解析するのに使用する前に、細胞を27℃で16〜48時間インキュベートし、ΔF508−CFTRを矯正した。矯正化合物の活性を決定するために、細胞を、27℃または37℃で化合物の有無下、24時間インキュベートした。

0188

6.全細胞(Whole−cell)記録
ΔF508−CFTRを安定に発現する、温度および試験化合物で矯正されたNIH3T3細胞における巨視的ΔF508−CFTR電流(IΔF508)を、穿孔パッチホールセル記録を使用して監視した。簡潔に述べると、IΔF508の電位固定記録を、Axopatch 200Bパッチクランプ増幅器(Axon Instruments Inc., FosterCity, CA)を使用して室温で実施した。全ての記録をサンプリング周波数10kHzで取得し、1kHzの低域フィルターにかけた。ピペットは、細胞内液で満たすと5〜6MΩの抵抗を有した。これらの記録条件下で、室温でのCl−の計算逆転電位(ECl)は−28mVであった。すべての記録は、シール抵抗>20GΩおよび直列抵抗<15MΩであった。パルス発生データ取得および分析を、Clampex 8 に接続された Digidata 1320 A/Dインターフェースを備えたPC(Axon Instruments Inc.)を使用して行った。浴は、食塩水<250μlを含み、重力駆動の潅流システムを使用して速度2ml/分で連続的に洗い流した。

0189

7.矯正化合物の同定
細胞膜中の機能的ΔF508−CFTRの密度を増加させる矯正化合物の活性を求めるために、我々は、上記の穿孔パッチ記録技術を使用して、矯正化合物で24時間処理した後の電流密度を測定した。ΔF508−CFTRを十分に活性化するために、10μMフォルスコリンおよび20μMゲニステインを細胞に添加した。我々の記録条件下では、27℃で24時間インキュベートした後の電流密度は、37℃で24時間インキュベートした後に観察された電流密度より高かった。これらの結果は、細胞膜中のΔF508−CFTRの密度に対する低温インキュベーションの公知の効果と一致する。CFTR電流密度に対する矯正化合物の効果を決定するために、細胞を10μM試験化合物と共に37℃で24時間インキュベートし、電流密度を27℃および37℃の対照と比較した(%活性)。記録前に、細胞を細胞外記録培地で3回洗浄して、残留試験化合物を除去した。10μM矯正化合物と共にプレインキュベートすると、cAMPおよびゲニステインに依存した電流が37℃の対照に比べて有意に増加した。

0190

8.増強剤化合物の特定
ΔF508−CFTRを安定に発現するNIH3T3細胞において巨視的ΔF508−CFTR Cl−電流(IΔF508)を増加させるΔF508−CFTR増強剤の能力もまた、穿孔パッチ記録技術を使用して調べた。光学的アッセイから特定された増強剤は、光学的アッセイにおいて観察された類似の作用強度および効力でIΔF508の用量依存的増加を惹起した。試験したすべての細胞において、増強剤の適用前および適用中の逆転電位は、約−30mVであった。約−30mVは、計算したECl(−28mV)である。

0191

9.溶液
細胞内液(mM):アスパラギン酸Cs(90)、CsCl(50)、MgCl2(1)、HEPES(10)及び240μg/mlアンホテリシンB(CsOHを用いてpH7.35に調節した)。
細胞外液(mM):N−メチル−D−グルカミン(NMDG)−Cl(150)、MgCl2(2)、CaCl2(2)、HEPES(10)(HClを用いてpH7.35に調節した)。

0192

10.細胞培養
ΔF508−CFTRを安定に発現するNIH3T3マウス線維芽細胞を全細胞記録に使用する。細胞を、175cm2培養フラスコ中の2mMグルタミン、10%ウシ胎仔血清、1×NEAA、β−ME、1×pen/strepおよび25mMHEPESを補充したダルベッコの改変イーグル培地中で37℃、5%CO2および湿度90%で維持する。全細胞記録の場合、2,500〜5,000細胞をポリ−L−リジンコートしたカバーガラス上に播き、27℃で24〜48時間培養した後、増強剤の活性を試験するのに使用した。さらに、矯正化合物の活性を測定するために、矯正化合物の有無下、37℃でインキュベートした。

0193

11.単一チャネル記録
NIH3T3細胞中で安定に発現された温度−矯正ΔF508−CFTRの単一チャネル活性、および増強剤化合物の活性を、切り出したインサイドアウト膜パッチを使用して観察した。簡潔に述べると、単一チャネル活性の電位固定記録を、Axopatch 200Bパッチクランプ増幅器(Axon Instruments Inc.)を用いて室温で行った。全ての記録をサンプリング周波数10kHzで取得し、400Hzの低域フィルターにかけた。パッチピペットは、Corning Kovar Sealing #7052ガラス(World Precision Instruments,Inc., Sarasota,FL)から作製され、細胞外液で満たすと5〜8MΩの抵抗を有した。切り出し後に1mM Mg−ATPおよび75nMcAMP依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットPKA;Promega Corp. Madison, WI)を添加することによってΔF508−CFTRを活性化した。チャネル活性が安定化された後、重力駆動微小潅流システムを使用してパッチを洗い流した。流入液をパッチに隣接して置き、1〜2秒以内に溶液を完全に交換した。急速な洗い流し中にΔF508−CFTR活性を維持するために、非特異的ホスファターゼ阻害剤F−(10mM NaF)を浴溶液に添加した。これらの記録条件下で、チャネル活性は、パッチ記録の期間(最高60分間)を通して一定のままであった。細胞内液から細胞外液に移動する陽電荷(反対方向に移動する陰イオン)によって生成される電流を正電流として示す。ピペット電位(Vp)を80mVで維持した。

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